知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ チンタオ エムジーアイ テック カンパニー リミテッドの特許一覧
特許7523526発光標識及び二次発光信号の光信号速度論に基づくポリヌクレオチドの配列決定方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-18
(45)【発行日】2024-07-26
(54)【発明の名称】発光標識及び二次発光信号の光信号速度論に基づくポリヌクレオチドの配列決定方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20240719BHJP
C12Q 1/66 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240719BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
C12Q1/66
C12N15/09 Z
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2022512310
(86)(22)【出願日】2019-08-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-26
(86)【国際出願番号】 CN2019101530
(87)【国際公開番号】W WO2021031109
(87)【国際公開日】2021-02-25
【審査請求日】2022-06-22
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】523435819
【氏名又は名称】チンタオ エムジーアイ テック カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＱＩＮＧＤＡＯ ＭＧＩ ＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100094112
【弁理士】
【氏名又は名称】岡部 讓
(74)【代理人】
【識別番号】100136799
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 亜希
(74)【代理人】
【識別番号】100128668
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 正巳
(74)【代理人】
【識別番号】100189474
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 修
(72)【発明者】
【氏名】チェン，シ
(72)【発明者】
【氏名】リャオ，シャ
(72)【発明者】
【氏名】チャン，ウェンウェイ
(72)【発明者】
【氏名】チェン，アオ
(72)【発明者】
【氏名】チャオ，ジエ
【審査官】中野 あい
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１２１５８７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／０４０６０７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５１２２０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５１１０５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５２９６３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２２－５３３９１６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程を含む、核酸分子を配列決定するための方法：（１）支持体に結合された配列決定されるべき核酸分子を提供すること、または支持体に配列決定されるべき核酸分子を結合すること；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼ、および４つのヌクレオチドを加えて、溶液相および固相を含む反応系を形成し、ここで、４つのヌクレオチドはそれぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、およびＧの誘導体であり、相補的塩基対形成能を有する；そして、４つのヌクレオチドのそれぞれのリボースまたはデオキシリボースの３’部位のヒドロキシル基（－ＯＨ）が保護基によって保護されている；４つのヌクレオチドのうち
第１のヌクレオチドは、切断可能な第２のリンカーを介して第１の分子標識に結合する、
第２のヌクレオチドは、切断可能な第１のリンカーを介して第１の分子標識に結合する、
第３のヌクレオチドは、切断可能な第３のリンカーを介して第２の分子標識に結合され、
第４のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない；
（３）配列決定されるべき核酸分子へのプライマーのアニーリング、最初の成長する核酸鎖として働くプライマー、および配列決定されるべき核酸分子は、共に、支持体に結合した二本鎖を形成する；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼにヌクレオチド重合反応を行わせ、それによって４つのヌクレオチドのうちの１つを成長する核酸鎖の３’末端に組み込む；
（５）前工程の二本鎖を２つの異なるルシフェラーゼと接触させて結合反応を行い、２つのルシフェラーゼは、それぞれ、第１の分子標識および第２の分子標識を特異的に結合することができ、次いで、基質の存在下でルシフェラーゼを蛍光反応させ、放出された蛍光シグナルを検出することができ、ここで、前記２つのルシフェラーゼは、フラッシュとグローから選択された異なる発光動態を誘導する；
（６）第２のリンカーを切断するための切断液を加え、基質の存在下でルシフェラーゼを再び蛍光反応させ、発光した蛍光シグナルを検出する；
（７）各ヌクレオチドの分子標識の除去；および
（８）核酸分子の配列情報を得るために工程 （３）～（７）を１回以上繰り返す；
前記第１のリンカーと前記第３のリンカーとは同一または異なるリンカーであり、前記第２のリンカーと前記第３のリンカーとは異なるリンカーであり、
前記４つのヌクレオチドは、それぞれ以下の構造式で表される、
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
ここで、リンカー１はアジド含有リンカーであり、リンカー２はジスルフィド結合を含有するリンカーである、または
リンカー１はアジド含有リンカーであり、リンカー２はシス－アコニット酸無水物を含有するリンカーである。
【請求項2】
前記．工程（５）の二本鎖が、一段階反応で２つの異なるルシフェラーゼと接触し、結合反応を有する、または、前記工程（５）の二本鎖は、それぞれ２つのルシフェラーゼと接触し、連鎖的に結合反応を起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（１）支持体に結合された配列決定されるべき核酸分子を提供すること、または支持体に配列決定されるべき核酸分子を結合すること；（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼ、および４つのヌクレオチドを加えて、溶液相および固相を含む反応系を形成し、ここで、４つのヌクレオチドはそれぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、およびＧの誘導体であり、相補的塩基対形成能を有する；そして、４つのヌクレオチドのそれぞれのリボースまたはデオキシリボースの３’部位のヒドロキシル基（－ＯＨ）が保護基によって保護されている；４つのヌクレオチドのうち
第１のヌクレオチドは、切断可能な第２のリンカーを介して第１の分子標識に結合する、
第２のヌクレオチドは、切断可能な第１のリンカーを介して第１の分子標識に結合する、
第３のヌクレオチドは、切断可能な第３のリンカーを介して第２の分子標識に結合され、
第４のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない；
（３）配列決定されるべき核酸分子へのプライマーのアニーリング、最初の成長する核酸鎖として働くプライマー、および配列決定されるべき核酸分子は、共に、支持体に結合した二本鎖を形成する；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼにヌクレオチド重合反応を行わせ、それによって４つのヌクレオチドのうちの１つを成長する核酸鎖の３’末端に組み込む；
（５）支持体に付着した二本鎖を残したまま、前の工程の反応系の溶液相を除去する；２つの異なるルシフェラーゼを添加して結合反応を行い、２つのルシフェラーゼは、それぞれ、第１の分子標識および第２の分子標識に特異的に結合することができる；
（６）溶出緩衝液により非結合ルシフェラーゼを除去する；
（７）ルシフェラーゼの基質を添加し、経時的に蛍光シグナルの曲線を検出する；
（８）前の反応段階の溶液を除去する；
（９）第２のリンカーを切断するための切断溶液を添加する；
（１０）ルシフェラーゼの基質を添加し、経時的に蛍光シグナルの曲線を検出する；
（１１）ヌクレオチドの第１のリンカー、第３のリンカーおよび３’保護基を除去する；
（１２）前の反応工程の溶液を除去すること；および
（１３）核酸分子の配列情報を得るために工程（３）～（１２）または工程（３）～（１０）を１回以上繰り返す；
前記第１のリンカーと前記第３のリンカーとは同一または異なるリンカーであり、前記第２のリンカーと前記第３のリンカーとは異なるリンカーであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
（１）支持体に結合された配列決定されるべき核酸分子を提供すること、または支持体に配列決定されるべき核酸分子を結合すること；（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼ、および４つのヌクレオチドを加えて、溶液相および固相を含む反応系を形成し、ここで、４つのヌクレオチドはそれぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、およびＧの誘導体であり、相補的塩基対形成能を有する；そして、４つのヌクレオチドのそれぞれのリボースまたはデオキシリボースの３’部位のヒドロキシル基（－ＯＨ）が保護基によって保護されている；４つのヌクレオチドのうち
第１のヌクレオチドは、切断可能な第２のリンカーを介して第１の分子標識に結合する、
第２のヌクレオチドは、切断可能な第１のリンカーを介して第１の分子標識に結合する、
第３のヌクレオチドは、切断可能な第３のリンカーを介して第２の分子標識に結合され、
第４のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない；
（３）配列決定されるべき核酸分子へのプライマーのアニーリング、最初の成長する核酸鎖として働くプライマー、および配列決定されるべき核酸分子は、共に、支持体に結合した二本鎖を形成する；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼにヌクレオチド重合反応を行わせ、それによって４つのヌクレオチドのうちの１つを成長する核酸鎖の３’末端に組み込む；
（５）支持体に付着した二本鎖を残したまま、前の工程の反応系の溶液相を除去する；そして、第１のルシフェラーゼを添加して結合反応を行い、第１のルシフェラーゼは、第１の分子標識に特異的に結合することができる；
（６）溶出緩衝液により非結合第１のルシフェラーゼを除去する；
（７）第１のルシフェラーゼの基質を添加し、経時的に蛍光シグナルの曲線を検出する；
（８）前の反応段階の溶液を除去する；
（９）第２のルシフェラーゼを添加して結合反応を行い、第２のルシフェラーゼは、第２の分子標識に特異的に結合することができる；
（１０）溶出緩衝液による非結合第２のルシフェラーゼを除去する；
（１１）第２のルシフェラーゼの基質を添加し、経時的に蛍光シグナルの曲線を検出する；
（１２）前の反応工程の溶液を除去すること；
（１３）第２のリンカーを切断するための切断溶液を添加する；
（１４）ルシフェラーゼの基質を添加し、経時的に蛍光シグナルの曲線を検出する；
（１５）ヌクレオチドの第１のリンカー、第３のリンカーおよび３’保護基を除去する；
（１６）前の反応工程の溶液を除去すること；および
（１７）工程（３）～（１６）または工程（３）～（１４）を１回以上繰り返して核酸分子の配列情報を取得し、
前記第１のリンカーと前記第３のリンカーとは同一または異なるリンカーであり、前記第２のリンカーと前記第３のリンカーとは異なるリンカーであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項5】
前記第１のルシフェラーゼおよび前記第２のルシフェラーゼが異なるルシフェラーゼを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記第１の分子標識がビオチンであり、前記第１のルシフェラーゼがストレプトアビジンで標識される；２つ目の分子標識はジゴキシンであり、２つ目のルシフェラーゼは抗ジゴキシン抗体で標識される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
ポリヌクレオチドを配列決定するためのキットであって、（ａ）４つのヌクレオチド、ここで、４つのヌクレオチドは、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、およびＧの誘導体であり、相補的な塩基対形成の能力を有する；そして、４つのヌクレオチドのそれぞれのリボースまたはデオキシリボースの３’部位のヒドロキシル基（－ＯＨ）が保護基によって保護されている；４つのヌクレオチドのうち
第１のヌクレオチドは、切断可能な第２のリンカーを介して第１の分子標識に結合される、
第２のヌクレオチドは、切断可能な第１のリンカーを介して第１の分子標識に結合する、
第３のヌクレオチドは、切断可能な第３のリンカーを介して第２の分子標識に結合され、
第４のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない；
（ｂ）第１および第２のルシフェラーゼ、ここで、２つのルシフェラーゼは、それぞれ、第１の分子標識および第２の分子標識に特異的に結合することができ、２つのルシフェラーゼは、フラッシュとグローから選択された異なる発光動態を誘導する；および
（ｃ）切断可能な第２のリンカーを切断するための切断液、
ここで、前記４つのヌクレオチドは、それぞれ以下の構造式で表される、
【化5】
【化6】
【化7】
【化8】
ここで、リンカー１はアジド含有リンカーであり、リンカー２はジスルフィド結合を含有するリンカーである、または
リンカー１はアジド含有リンカーであり、リンカー２はシス－アコニット酸無水物を含有するリンカーである、からなるキット。
【請求項8】
前記二つのルシフェラーゼが同じルシフェラーゼまたは異なるルシフェラーゼを含む、請求項７に記載のキット。
【請求項9】
前記第１のリンカーおよび前記第３のリンカーは同一または異なるリンカーであり、前記第２のリンカーおよび前記第３のリンカーは異なるリンカーである、請求項７に記載のキット。
【請求項10】
前記第１の分子標識がビオチンであり、前記第１のルシフェラーゼがストレプトアビジンで標識され、２つ目の分子標識はジゴキシンであり、２つ目のルシフェラーゼは抗ジゴキシン抗体で標識される、請求項７～９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項11】
試料から核酸分子を抽出するための試薬および／または装置；核酸分子を前処理するための試薬；配列決定される核酸分子に結合する支持体；配列決定されるべき核酸分子を、共有結合的または非共有結合的な方法で支持体に付着させるための試薬；ヌクレオチド重合反応を開始させるためのプライマー；ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼ；一つ以上の緩衝液；一つ以上の洗浄液；またはその組み合わせ、をさらに含む、請求項７～９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、核酸配列決定の分野に関する。特に、本開示は、発光標識および二次発光シグナルの光シグナル動態に基づいてポリヌクレオチドの配列を決定するための方法を提供し、ここで、異なる発光形態および発光タイミングを用いて、ポリヌクレオチドの配列決定を実現するために、異なるヌクレオチドの逐次的な取り込みを区別する。
【背景技術】
【0002】
ＤＮＡシークエンシング技術には、サンガー配列決定法に代表される第一世代のＤＮＡシークエンシング技術と、イルミナＨｉｓｅｑ ２５００、ロシュ４５４、ＡＢＩソリッド、ＢＧＩＳＥＱ－５００などに代表される第二世代のＤＮＡシークエンシング技術があり、１９７７年にサンガーは第一世代のシークエンシング技術の代表となるジデオキシ末端配列決定法を発明した。２００１年には、第一世代シークエンシング技術に基づき、ヒトゲノム地図が完成した。簡単な実験操作、直感的で正確な結果および短い実験サイクルを特徴とするサンガー配列決定法は、臨床遺伝子変異検出および遺伝子型決定のような検出結果の適時性に対する高い要求性を有する、このような分野で広い範囲の応用を有する。しかしながら、サンガーの配列決定法は、低処理量と高コストの欠点があり、これは大規模な遺伝子配列決定での応用を制限する。サンガー配列決定法の欠点を克服するために、第二世代の配列決定技術が生まれた。第一世代のＤＮＡ配列決定技術と比較して、第二世代のＤＮＡ配列決定技術は、大きな配列決定処理能力、低コスト、高度な自動化、および単一分子配列決定の特徴を有する。Ｈｉｓｅｑ ２５００ Ｖ ２のシークエンシング技術を例にとると、その１つの実験プロセスは１０～２００ Ｇの塩基のデータを生成することができる。塩基あたりの平均配列決定コストは、サンガー配列決定法の配列決定コストの１／１０００未満であり、得られた配列決定結果は、コンピュータによって直接処理し、分析することができる。したがって、第二世代ＤＮＡ配列決定技術は大規模配列決定に非常に適している。
【0003】
過去約１０年の間に、第二世代遺伝子配列決定技術は、新興技術から次第に主流の配列決定法に成長し、臨床分野での重要な試験ツールになった。感染症の予防や制御、遺伝性疾患の診断、非侵襲的出生前スクリーニングなどの分野でますます重要な役割を果たしている。シーケンシング市場をさらに拡大し、シーケンサを普及させるために、低コストで小型化したシーケンサの開発がシーケンサ分野での開発動向となっている。第二世代シークエンシング技術の古典的な方法として、４チャネル、２チャネルおよび単一チャネルのシークエンシング法にはそれぞれの利点がある。しかしながら、これらの３つの方法の比較を通して、単一チャネルシーケンシングは、より少ない消耗品、より低いコスト、および機器の小型化と携帯性のより容易な実現のような利点のために、シーケンシング分野において徐々に開発トレンドになっている。現在市場に出ている単色チャネル製品は、主にイルミナ社から発売されているイオントレントシリーズのシークエンサー、４５４シークエンサー、最新のＩｓｅｑ １００などである。
【0004】
単色シグナル配列決定は、塩基上の化学発光標識を使用して、特定の条件下で同じシグナルをオンデマンドで送信し、配列決定の目的を達成するために４種類の塩基を同定する方法である。簡単なシグナル同定、迅速な生化学反応および高い配列決定スループットを特徴とする、単色シグナル配列決定は、第二世代配列決定の主流になっている。単色蛍光イメージングに基づくイルミナの小型高速シークエンサーは、この技術に基づいている。しかしながら、種々のＤＮＡ濃縮方法の欠点及び環境及び装置条件に対するシグナル応答の感度の高い応答のために、ルミネセンス標識のシグナル強度は、試験プロセス中の時間次元及び空間次元における均一性を欠いている。単色信号配列法では、２つの検出を行い、発光状態を制御し、１／０、１／１、０／１、０／０の４つの発行モードを用いて４つの塩基を決定する。この検出モードは、光信号を周波数で区別するのではなく、信号強度と信号発生時間で区別するだけである。この方法が信号強度に過度に依存すると配列決定結果が拡散し、塩基同定の精度が低下する。
従って、より高いベース識別精度を有する単色信号に基づく配列決定方法のために、それが当該技術分野において必要とされる。
従って、より高いベース識別精度を有する単色信号に基づく配列決定方法のために、それが当該技術分野において必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者らは、上記の技術的課題の一つを解決するために、Ａ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、Ｇの４つの塩基を識別するために、異なる発光形態及び発光タイミングを適用する新規な配列決定方法を開発した。本発明の配列決定方法によれば、化学発光反応の反応速度曲線に基づいて、特定の塩基上の化学発光標識を選択的化学結合切断法により不活性化し、残りの発光標識の発光能により塩基を識別して二次発光判定を行う。化学ルミネセンスの速度論曲線にはフラッシュとグローの二つの特性だけが必要なので、速度論曲線の明白でない特性による混乱を大きく減らすことができた。一方、二次発光では、信号強度のみがバックグラウンド値を超えていればよく、反応曲線の特性を必要としないため、反応過程における副反応による信号同定への悪影響を低減でき、塩基同定の精度を向上させることができる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
１つの態様において、本開示は、核酸分子に相補的なヌクレオチドの逐次的取り込みをモニタリングすることを含む、核酸分子を配列決定するための方法を提供し、ここで、ヌクレオチドは、それぞれ、異なる発光速度論を有する発光を誘導する化学発光標識に結合され、ここで、各取り込まれたヌクレオチドは、化学発光標識が関与する化学発光反応の発光速度論を検出し、次いで、化学発光標識の一部を除去することによって同定される。
【0007】
特定の実施形態において、各ヌクレオチドのリボースまたはデオキシリボース部分は、２’または３’酸素原子を介して結合された保護基を含み、保護基は、３’－ＯＨ基を露出するように各ヌクレオチドの取り込み後に修飾されるかまたは除去される。
【0008】
特定の実施形態において、化学発光標識の一部は別々に除去され、化学発光標識の他の部分および保護基は同じ条件下で除去される。
【0009】
特定の実施形態では、ヌクレオチドはヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵから選択される。
【0010】
特定の実施形態では、化学発光標識が関与する化学発光反応のルミネセンスキネティクスの検出は、化学発光標識を適切な基質と接触させて化学発光反応を誘発すること、およびそこから放出される光のルミネセンスキネティクスを検出することを含む。
【0011】
特定の実施形態では、化学発光標識は、異なる発光速度論およびそれらの任意の組み合わせを誘導する生化学発光標識から選択される。
【0012】
特定の実施形態では、化学発光標識は、異なる発光動態を誘導するルシフェラーゼおよびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0013】
特定の実施形態では、化学発光標識は、異なる発光動態を誘導する2つのルシフェラーゼの組み合わせである。
【0014】
特定の実施形態では、発光は、閃光およびグローの形態である。
【0015】
１つの態様において、本開示は、以下を含む、核酸分子を配列決定するための方法を提供する。
（１）第１のヌクレオチドが第２のリンカーを介して第１の化学発光標識で標識され、第２のヌクレオチドが第１のリンカーを介して第１の化学発光標識で標識され、第３のヌクレオチドが第３のリンカーを介して第２の化学発光標識で標識され、第４のヌクレオチドがいずれの化学発光標識でも標識されない、４つのヌクレオチドを提供する；
（２）４つのヌクレオチドのうちの１つを核酸分子の相補鎖に組み込むこと；
（３）工程（２）におけるヌクレオチドの化学発光標識の検出；
（４）第二リンカーを切断するための切断試薬の添加；
（５）取り込まれたヌクレオチドの型を決定するための切断後のヌクレオチドの化学発光標識の検出；
（６）残りの化学発光標識の除去；および
必要に応じて、核酸分子の配列を決定するために、工程（２）～（５）または（２）～（６）を１回以上繰り返す。
（１）第１のヌクレオチドが第２のリンカーを介して第１の化学発光標識で標識され、第２のヌクレオチドが第１のリンカーを介して第１の化学発光標識で標識され、第３のヌクレオチドが第３のリンカーを介して第２の化学発光標識で標識され、第４のヌクレオチドがいずれの化学発光標識でも標識されない、４つのヌクレオチドを提供する；
（２）４つのヌクレオチドのうちの１つを核酸分子の相補鎖に組み込むこと；
（３）工程（２）におけるヌクレオチドの化学発光標識の検出；
（４）第二リンカーを切断するための切断試薬の添加；
（５）取り込まれたヌクレオチドの型を決定するための切断後のヌクレオチドの化学発光標識の検出；
（６）残りの化学発光標識の除去；および
必要に応じて、核酸分子の配列を決定するために、工程（２）～（５）または（２）～（６）を１回以上繰り返す。
【0016】
特定の実施形態では、工程（２）および（５）におけるヌクレオチドの化学発光標識を検出する工程は、化学発光標識を適切な基板と接触させて化学発光反応を誘発する工程と、そこから放出される光の発光動態を検出する工程とを含む。
【0017】
特定の実施形態では、化学発光標識は、異なる発光速度論およびそれらの任意の組み合わせを誘導する生化学発光標識から選択される。
【0018】
特定の実施形態では、化学発光標識は、異なる発光動態を誘導するルシフェラーゼおよびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【0019】
特定の実施形態では、化学発光標識は、異なる発光動態を誘導する２つのルシフェラーゼの組み合わせである。
【0020】
特定の実施形態において、各ヌクレオチドのリボースまたはデオキシリボース部分は、２’または３’酸素原子を介して結合された保護基を含み、保護基は、３’－ＯＨ基を露出するようにヌクレオチドの取り込み後に修飾されるかまたは除去される。
【0021】
特定の実施形態において、化学発光標識の一部は別々に除去され、化学発光標識の他の部分および保護基は同じ条件下で除去される。
【0022】
特定の実施形態では、第１のリンカーと第３のリンカーは同一又は異なるものであり、第２のリンカーは第３のリンカーとは異なるものである。
【0023】
特定の実施形態では、ヌクレオチドはヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵから選択される。
【0024】
種々の態様において、ヌクレオチドと化学発光標識との間の結合は、親和性相互作用によって媒介される結合を含む。
【0025】
特定の実施形態では、親和性相互作用は、抗原－抗体相互作用およびビオチン－アビジン（例えば、ストレプトアビジン）相互作用から選択される。
【0026】
具体的な実施形態では、親和性相互作用に関与するメンバーの一方に化学発光標識を付着させ、親和性相互作用に関与する他のメンバーにヌクレオチドを付着させることにより、メンバー間の親和性相互作用を介して化学発光標識をヌクレオチドに付着させる。
【0027】
特定の実施形態において、ヌクレオチドに結合したメンバーはビオチンであり、化学発光標識に結合したメンバーはアビジン（例えば、ストレプトアビジン）である。
【0028】
特定の実施形態において、ヌクレオチドに結合したメンバーはジゴキシンであり、化学発光標識に結合したメンバーは抗ジゴキシン抗体である。
【0029】
特定の実施形態において、ヌクレオチドに結合したメンバーはビオチンであり、化学発光標識に結合したメンバーはアビジン（例えば、ストレプトアビジン）であり、ここで、ジゴキシンおよびアビジンは、ビオチンに結合した抗ジゴキシン抗体との親和性によって結合される。
【0030】
特定の実施形態において、第１のヌクレオチドは、第２のリンカー（リンカー２）を介して第１のルシフェラーゼに結合され、第２のヌクレオチドは、第１のリンカー（リンカー１）を介して第１のルシフェラーゼに結合され、第３のヌクレオチドは、第３のリンカー（リンカー１）を介して第２のルシフェラーゼに結合され、第４のヌクレオチドは、いずれのルシフェラーゼにも結合されない。
第１のリンカーと第３のリンカーは同一または異なっており、第２のリンカーと第３のリンカーは異なっている。
第１のリンカーと第３のリンカーは同一または異なっており、第２のリンカーと第３のリンカーは異なっている。
【0031】
１つの局面において、本開示は、以下の工程を含む、核酸分子を配列決定するための方法を提供する。
（１）支持体に結合された配列決定されるべき核酸分子を提供すること、または支持体に配列決定されるべき核酸分子を結合すること；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼ、および４つのヌクレオチドを加えて、溶液相および固相を含む反応系を形成し、ここで、４つのヌクレオチドは、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、およびＧの誘導体であり、相補的な塩基対形成能を有する；そして、４つのヌクレオチドのそれぞれのリボースまたはデオキシリボースの３’部位のヒドロキシル基（－ＯＨ）が保護基によって保護されている；４つのヌクレオチドのうち
第１のヌクレオチドは、切断可能なリンカー２を介して第１の分子標識に結合される、
第２のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第１の分子標識に結合される、
第３のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第２の分子標識に結合され、
４番目のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない；
（３）配列決定されるべき核酸分子へのプライマーのアニーリング、最初の成長する核酸鎖として働くプライマー、および配列決定されるべき核酸分子は、共に、支持体に結合した二本鎖を形成する；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼにヌクレオチド重合反応を行わせ、それによって４つのヌクレオチドのうちの１つを成長する核酸鎖の３’末端に組み込む；
（５）前工程の二本鎖を２つの異なるルシフェラーゼと接触させて結合反応を行い、ここで、２つのルシフェラーゼは、それぞれ、第１の分子標識および第２の分子標識を特異的に結合することができ、次いで、基質の存在下でルシフェラーゼを蛍光反応させ、放出された蛍光シグナルを検出する；
（６）次に、切断液を添加してリンカー２を切断した後、基質の存在下でルシフェラーゼを再び蛍光反応させ、発光する蛍光信号を検出する。
（７）各ヌクレオチドの分子標識を除去する；および
（８）必要に応じて工程（３）～（７）を繰り返して核酸分子の配列情報を得る。
（１）支持体に結合された配列決定されるべき核酸分子を提供すること、または支持体に配列決定されるべき核酸分子を結合すること；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼ、および４つのヌクレオチドを加えて、溶液相および固相を含む反応系を形成し、ここで、４つのヌクレオチドは、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、およびＧの誘導体であり、相補的な塩基対形成能を有する；そして、４つのヌクレオチドのそれぞれのリボースまたはデオキシリボースの３’部位のヒドロキシル基（－ＯＨ）が保護基によって保護されている；４つのヌクレオチドのうち
第１のヌクレオチドは、切断可能なリンカー２を介して第１の分子標識に結合される、
第２のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第１の分子標識に結合される、
第３のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第２の分子標識に結合され、
４番目のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない；
（３）配列決定されるべき核酸分子へのプライマーのアニーリング、最初の成長する核酸鎖として働くプライマー、および配列決定されるべき核酸分子は、共に、支持体に結合した二本鎖を形成する；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼにヌクレオチド重合反応を行わせ、それによって４つのヌクレオチドのうちの１つを成長する核酸鎖の３’末端に組み込む；
（５）前工程の二本鎖を２つの異なるルシフェラーゼと接触させて結合反応を行い、ここで、２つのルシフェラーゼは、それぞれ、第１の分子標識および第２の分子標識を特異的に結合することができ、次いで、基質の存在下でルシフェラーゼを蛍光反応させ、放出された蛍光シグナルを検出する；
（６）次に、切断液を添加してリンカー２を切断した後、基質の存在下でルシフェラーゼを再び蛍光反応させ、発光する蛍光信号を検出する。
（７）各ヌクレオチドの分子標識を除去する；および
（８）必要に応じて工程（３）～（７）を繰り返して核酸分子の配列情報を得る。
【0032】
特定の実施形態では、第１の分子標識はビオチンであり、第１のルシフェラーゼはストレプトアビジンに結合し、ヌクレオチドはビオチンとストレプトアビジンの親和性を介して第１のルシフェラーゼに結合する。
【0033】
特定の実施形態では、第２の分子標識はジゴキシンであり、第２のルシフェラーゼは抗ジゴキシン抗体に結合され、ヌクレオチドはジゴキシンおよび抗ジゴキシン抗体の親和性を介して第２のルシフェラーゼに結合される。
【0034】
本開示の態様において、分子標識は、異なるリンカーを介してヌクレオチド誘導体に結合され、次いで、その分子標識に特異的に結合し得るルシフェラーゼが添加され、次いで、リンカーの切断の前および後にルシフェラーゼによって発せられる蛍光シグナルが検出されて、異なるヌクレオチドの逐次的取り込みを識別し、かくしてポリヌクレオチドの配列決定を実現する。特定の実施形態では、第１のヌクレオチドは、リンカー２を介して、またはリンカー１－リンカー２を介して、第１の分子標識に結合される。第２のヌクレオチドはリンカー１を介して第１の分子標識に結合する；３番目のヌクレオチドはリンカー１を介して２番目の分子標識に結合する；４番目のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない。第１および第２の分子標識それぞれおよびルシフェラーゼの対応する基質に特異的に結合することができるルシフェラーゼを添加して、第１の発光シグナルを検出する；必要に応じてリンカーが切断され、切断後の第２の発光シグナルが検出される；塩基は４つのヌクレオチドの発光によって同定できる。
【0035】
従って、例示的な実施形態において、本開示における核酸分子を配列決定する方法は、以下の工程を含む。
（１）支持体に結合された配列決定されるべき核酸分子を提供すること、または支持体に配列決定されるべき核酸分子を結合すること；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼ、および４つのヌクレオチドを加えて、溶液相および固相を含む反応系を形成し、ここで、４つのヌクレオチドは、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、およびＧの誘導体であり、相補的な塩基対形成能を有する；そして、４つのヌクレオチドのそれぞれのリボースまたはデオキシリボースの３’部位のヒドロキシル基（－ＯＨ）が保護基によって保護されている；４つのヌクレオチドのうち
第１のヌクレオチドは、切断可能なリンカー２を介して第１の分子標識に結合される、
第２のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第１の分子標識に結合される、
第３のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第２の分子標識に結合され、
４番目のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない；
（３）配列決定されるべき核酸分子へのプライマーのアニーリング、最初の成長する核酸鎖として働くプライマー、および配列決定されるべき核酸分子は、共に、支持体に結合した二本鎖を形成する；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼにヌクレオチド重合反応を行わせ、それによって４つのヌクレオチドのうちの１つを成長する核酸鎖の３’末端に組み込む；
（５）支持体に付着した二本鎖を残したまま、前の工程の反応系の溶液相を除去する；２つの異なるルシフェラーゼを添加して結合反応を行い、２つのルシフェラーゼは、それぞれ、第１の分子標識および第２の分子標識に特異的に結合することができる；
（６）溶出緩衝液により非結合ルシフェラーゼを除去する；
（７）ルシフェラーゼの基質を添加し、経時的に蛍光シグナルの曲線を検出する；
（８）前の反応段階の溶液を除去する；
（９）リンカー２を切断するための切断溶液を添加する；
（１０）ルシフェラーゼの基質を添加し、経時的に蛍光シグナルの曲線を検出する；
（１１）必要に応じて、各ヌクレオチドのリンカー１および３’保護基を除去する；
（１２）任意選択的に前の反応工程の溶液を除去すること；および
（１３）必要に応じて、工程（３）～（１２）または工程（３）～（１０）を１回以上繰り返して、核酸分子の配列情報を得る。
（１）支持体に結合された配列決定されるべき核酸分子を提供すること、または支持体に配列決定されるべき核酸分子を結合すること；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼ、および４つのヌクレオチドを加えて、溶液相および固相を含む反応系を形成し、ここで、４つのヌクレオチドは、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、およびＧの誘導体であり、相補的な塩基対形成能を有する；そして、４つのヌクレオチドのそれぞれのリボースまたはデオキシリボースの３’部位のヒドロキシル基（－ＯＨ）が保護基によって保護されている；４つのヌクレオチドのうち
第１のヌクレオチドは、切断可能なリンカー２を介して第１の分子標識に結合される、
第２のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第１の分子標識に結合される、
第３のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第２の分子標識に結合され、
４番目のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない；
（３）配列決定されるべき核酸分子へのプライマーのアニーリング、最初の成長する核酸鎖として働くプライマー、および配列決定されるべき核酸分子は、共に、支持体に結合した二本鎖を形成する；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼにヌクレオチド重合反応を行わせ、それによって４つのヌクレオチドのうちの１つを成長する核酸鎖の３’末端に組み込む；
（５）支持体に付着した二本鎖を残したまま、前の工程の反応系の溶液相を除去する；２つの異なるルシフェラーゼを添加して結合反応を行い、２つのルシフェラーゼは、それぞれ、第１の分子標識および第２の分子標識に特異的に結合することができる；
（６）溶出緩衝液により非結合ルシフェラーゼを除去する；
（７）ルシフェラーゼの基質を添加し、経時的に蛍光シグナルの曲線を検出する；
（８）前の反応段階の溶液を除去する；
（９）リンカー２を切断するための切断溶液を添加する；
（１０）ルシフェラーゼの基質を添加し、経時的に蛍光シグナルの曲線を検出する；
（１１）必要に応じて、各ヌクレオチドのリンカー１および３’保護基を除去する；
（１２）任意選択的に前の反応工程の溶液を除去すること；および
（１３）必要に応じて、工程（３）～（１２）または工程（３）～（１０）を１回以上繰り返して、核酸分子の配列情報を得る。
【0036】
特定の実施形態では、第１の分子標識はビオチンであり、第１のルシフェラーゼはストレプトアビジンに結合し、ヌクレオチドはビオチンとストレプトアビジンの親和性を介して第１のルシフェラーゼに結合する。
【0037】
特定の実施形態では、第２の分子標識はジゴキシンであり、第２のルシフェラーゼは抗ジゴキシン抗体に結合され、ヌクレオチドはジゴキシンおよび抗ジゴキシン抗体の親和性を介して第２のルシフェラーゼに結合される。
【0038】
特定の実施形態において、２つのルシフェラーゼのヌクレオチドへの結合は、別々に行うこともできる。例えば、第１の標識で標識された第１のルシフェラーゼを最初に添加して、第１の分子標識で標識されたヌクレオチドと結合反応させ、次いで、未結合の第１のルシフェラーゼを溶出緩衝液で洗浄し、次いで、第１のルシフェラーゼの基質を添加し、蛍光シグナルを検出することができる；次に、第２の標識で標識された第２のルシフェラーゼを添加して、第２の分子標識で標識されたヌクレオチドと結合反応させ、未結合の第２のルシフェラーゼを溶出緩衝液で洗浄した後、第２のルシフェラーゼの基質を添加し、蛍光シグナルを検出する。具体的には、本開示は、以下の工程を含む、核酸分子を配列決定するための方法を提供する。
【0039】
（１）支持体に結合された配列決定されるべき核酸分子を提供すること、または支持体に配列決定されるべき核酸分子を結合すること；
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼ、および４つのヌクレオチドを加えて、溶液相および固相を含む反応系を形成し、ここで、４つのヌクレオチドはそれぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、およびＧの誘導体であり、相補的塩基対形成能を有する；そして、４つのヌクレオチドのそれぞれのリボースまたはデオキシリボースの３’部位のヒドロキシル基（－ＯＨ）が保護基によって保護されている；４つのヌクレオチドのうち
第１のヌクレオチドは、切断可能なリンカー２を介して第１の分子標識に結合される、
第２のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第１の分子標識に結合される、
第３のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第２の分子標識に結合され、
４番目のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない；
（３）配列決定されるべき核酸分子へのプライマーのアニーリング、最初の成長する核酸鎖として働くプライマー、および配列決定されるべき核酸分子は、共に、支持体に結合した二本鎖を形成する；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼにヌクレオチド重合反応を行わせ、それによって４つのヌクレオチドのうちの１つを成長する核酸鎖の３’末端に組み込む；
（５）支持体に付着した二本鎖を残したまま、前の工程の反応系の溶液相を除去する；そして、第１のルシフェラーゼを添加して結合反応を行い、第１のルシフェラーゼは、第１の分子標識に特異的に結合することができる；
（６）溶出緩衝液により非結合第一ルシフェラーゼを除去する；
（７）第１のルシフェラーゼの基質を添加し、経時的に蛍光シグナルの曲線を検出する；
（８）前の反応段階の溶液を除去する；
（９）第２のルシフェラーゼを添加して結合反応を行い、第２のルシフェラーゼは、第２の分子標識に特異的に結合することができる；
（１０）溶出緩衝液により非結合第二ルシフェラーゼを除去する；
（１１）第２のルシフェラーゼの基質を添加し、経時的に蛍光シグナルの曲線を検出する；
（１２）任意選択的に前の反応工程の溶液を除去すること；
（１３）リンカー２を切断するための切断溶液を添加する；
（１４）ルシフェラーゼの基質を加え、蛍光シグナルの経時的な曲線を検出すること；
（１５）必要に応じて、各ヌクレオチドのリンカー１および３’保護基を除去する；
（１６）任意選択的に前の反応工程の溶液を除去すること；および
（１７）必要に応じて、工程（３）～（１６）または工程（３）～（１４）を１回以上繰り返して、核酸分子の配列情報を得る。
（２）ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマー、ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼ、および４つのヌクレオチドを加えて、溶液相および固相を含む反応系を形成し、ここで、４つのヌクレオチドはそれぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、およびＧの誘導体であり、相補的塩基対形成能を有する；そして、４つのヌクレオチドのそれぞれのリボースまたはデオキシリボースの３’部位のヒドロキシル基（－ＯＨ）が保護基によって保護されている；４つのヌクレオチドのうち
第１のヌクレオチドは、切断可能なリンカー２を介して第１の分子標識に結合される、
第２のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第１の分子標識に結合される、
第３のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第２の分子標識に結合され、
４番目のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない；
（３）配列決定されるべき核酸分子へのプライマーのアニーリング、最初の成長する核酸鎖として働くプライマー、および配列決定されるべき核酸分子は、共に、支持体に結合した二本鎖を形成する；
（４）ポリメラーゼがヌクレオチド重合反応を行うことを可能にする条件下で、ポリメラーゼにヌクレオチド重合反応を行わせ、それによって４つのヌクレオチドのうちの１つを成長する核酸鎖の３’末端に組み込む；
（５）支持体に付着した二本鎖を残したまま、前の工程の反応系の溶液相を除去する；そして、第１のルシフェラーゼを添加して結合反応を行い、第１のルシフェラーゼは、第１の分子標識に特異的に結合することができる；
（６）溶出緩衝液により非結合第一ルシフェラーゼを除去する；
（７）第１のルシフェラーゼの基質を添加し、経時的に蛍光シグナルの曲線を検出する；
（８）前の反応段階の溶液を除去する；
（９）第２のルシフェラーゼを添加して結合反応を行い、第２のルシフェラーゼは、第２の分子標識に特異的に結合することができる；
（１０）溶出緩衝液により非結合第二ルシフェラーゼを除去する；
（１１）第２のルシフェラーゼの基質を添加し、経時的に蛍光シグナルの曲線を検出する；
（１２）任意選択的に前の反応工程の溶液を除去すること；
（１３）リンカー２を切断するための切断溶液を添加する；
（１４）ルシフェラーゼの基質を加え、蛍光シグナルの経時的な曲線を検出すること；
（１５）必要に応じて、各ヌクレオチドのリンカー１および３’保護基を除去する；
（１６）任意選択的に前の反応工程の溶液を除去すること；および
（１７）必要に応じて、工程（３）～（１６）または工程（３）～（１４）を１回以上繰り返して、核酸分子の配列情報を得る。
【0040】
別の態様において、本開示は、ポリヌクレオチドを配列決定するためのキットに関し、以下を含む：
（ａ）４つのヌクレオチド、ここで、４つのヌクレオチドは、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、およびＧの誘導体であり、相補的な塩基対形成の能力を有する；そして、４つのヌクレオチドのそれぞれのリボースまたはデオキシリボースの３’部位のヒドロキシル基（－ＯＨ）が保護基によって保護されている；４つのヌクレオチドのうち
第１のヌクレオチドは、切断可能なリンカー２を介して第１の分子標識に結合される、
第２のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第１の分子標識に結合される、
第３のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第２の分子標識に結合され、
４番目のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない；
（ｂ）２つのルシフェラーゼ、ここで、２つのルシフェラーゼは、それぞれ、第１の分子標識および第２の分子標識に特異的に結合することができ、２つのルシフェラーゼは、同じルシフェラーゼの異なる変異体であるか、または異なるルシフェラーゼである；および
（ｃ）リンカー２を切断するための切断液。
（ａ）４つのヌクレオチド、ここで、４つのヌクレオチドは、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、およびＧの誘導体であり、相補的な塩基対形成の能力を有する；そして、４つのヌクレオチドのそれぞれのリボースまたはデオキシリボースの３’部位のヒドロキシル基（－ＯＨ）が保護基によって保護されている；４つのヌクレオチドのうち
第１のヌクレオチドは、切断可能なリンカー２を介して第１の分子標識に結合される、
第２のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第１の分子標識に結合される、
第３のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第２の分子標識に結合され、
４番目のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない；
（ｂ）２つのルシフェラーゼ、ここで、２つのルシフェラーゼは、それぞれ、第１の分子標識および第２の分子標識に特異的に結合することができ、２つのルシフェラーゼは、同じルシフェラーゼの異なる変異体であるか、または異なるルシフェラーゼである；および
（ｃ）リンカー２を切断するための切断液。
【0041】
いくつかの好ましい態様において、本開示のキットは、試料から核酸分子を抽出するための試薬および／または装置をさらに含む；核酸分子を前処理するための試薬；配列決定される核酸分子に結合する支持体；配列決定されるべき核酸分子を、例えば共有結合的または非共有結合的な方法で支持体に付着させるための試薬；ヌクレオチド重合反応を開始させるためのプライマー；ヌクレオチド重合反応を行うポリメラーゼ；一つ以上の緩衝液；一つ以上の洗浄液；またはその組み合わせ、を含む。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1】本開示による配列決定方法のフローチャートを示す。
【図2】本開示による配列決定方法の一例の配列決定結果を示し、各配列決定サイクルの配列決定シグナル曲線を示す。
【図3】本開示による配列決定方法の一例の配列決定結果を示し、各配列決定サイクルの配列決定シグナル曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【0043】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本開示が関係する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるすべての特許、出願および他の刊行物は、その全体が参照により援用される。本明細書に記載された定義が、特許、出願、および参照により本明細書に組み込まれる他の刊行物に記載された定義と矛盾する場合、本明細書に記載された定義が優先するものとする。
【0044】
本明細書中で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、または一本鎖および二本鎖の両方の配列を含むことができる。ポリヌクレオチド分子は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）形態（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲおよび増幅産物など。）に由来することができ、または一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）またはＲＮＡ形態に由来することができ、そしてｄｓＤＮＡ形態に変換することができ、その逆もまた同様である。ポリヌクレオチド分子の正確な配列は既知または未知である。以下は、ポリヌクレオチドの例示的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ、輸送ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、支持体、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、および上記の配列のいずれかの核酸プローブ、プライマーまたは増幅されたコピー。
【0045】
ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチドは通常、糖（リボースやデオキシリボースなど）、塩基、および少なくとも１つのリン酸基を含む。ヌクレオチドは塩基を含まなくてもよい（すなわち、塩基を欠く）。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、修飾されたペプチドヌクレオチド、修飾されたリン酸－糖骨格ヌクレオチドおよびそれらの混合物を含む。ヌクレオチドの例としては、例えば、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）。修飾された塩基を含むヌクレオチドアナログも、本明細書に記載される方法において使用することができる。天然骨格または同様の構造を用いて、ポリヌクレオチドに含めることができる例示的な修飾塩基は、例えば、イノシン、キサタニン、ヒポキサニン、イソシトシン、イソグアニン、２－アミノプリン、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、２－プロピルグアニン、２－プロピルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、２－チオシトシン、１５－ハロゲン化ウラシル、１５－ハロゲン化シトシン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル、４－チオウラシル、８－ハロゲン化アデニンまたはグアニン、８－アミノアデニンまたはグアニン、８－チオアデニンまたはグアニン、８－チオアルキルアデニンまたはグアニン、８－ヒドロキシアデニンまたはグアニン、５－ハロゲン置換ウラシルまたはシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニンなど。当技術分野で知られているように、特定のヌクレオチドアナログをポリヌクレオチドに組み込むことはできない。例えば、ヌクレオチド類似体はアデノシン５’－ホスホリル硫酸である。
【0046】
一般に、ヌクレオチドとは、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵを指す。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチドＡ」とは、アデニン（Ａ）またはその修飾誘導体またはアナログ（例えば、ＡＴＰおよびｄＡＴＰ）を含むヌクレオチドを指す。「ヌクレオチドＧ」とは、グアニン（Ｇ）またはその修飾誘導体またはアナログ（例えば、ＧＴＰおよびｄＧＴＰ）を含むヌクレオチドを指す。「ヌクレオチドＣ」とは、シトシン（Ｃ）またはその修飾誘導体またはアナログ（例えば、ＣＴＰおよびｄＣＴＰ）を含むヌクレオチドを指す。「ヌクレオチドＴ」とは、チミン（Ｔ）またはその修飾誘導体またはアナログ（例えば、ＴＴＰおよびｄＴＴＰ）を含むヌクレオチドを指す。「ヌクレオチドＵ」とは、ウラシル（Ｕ）またはその修飾誘導体またはアナログ（例えば、ＵＴＰおよびｄＵＴＰ）を含むヌクレオチドを指す。
【0047】
ヌクレオチド標識
本開示は、異なるリンカーによってヌクレオチドを標識するために異なる標識を使用し、それによって異なるルシフェラーゼをヌクレオチドに付着させることに関する。
本明細書中で使用される場合、用語「化学発光標識」とは、ヌクレオチドに結合することができ、かつそれが適切な基質との接触によって化学発光反応を誘発することができ、それによって励起光を必要とせずに検出可能な光シグナルを生成することができる任意の化合物を指す。一般に、化学発光反応に関与する任意の成分を、本明細書に記載の化学発光標識として使用することができる。同様に、化学発光反応に関与する他の成分は、本明細書では、化学発光標識の基質と呼ばれる。一般的に使用される適切な化学発光標識の例としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン、官能化鉄－ポルフィリン誘導体、ルミナール、ルミノール、イソルミノール、アクリジンエステル、スルホンアミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。化学発光標識の基質は、使用される特定の化学発光標識に依存する。例えば、アルカリホスファターゼの基質はＡＭＰＰＤ（アダマンチル１， ２－ジオキサン芳香族リン酸）であり得、ルシフェラーゼの基質はルシフェリンであり得、アクリジニウムエステルの基質は水酸化ナトリウムおよびＨ２Ｏ２およびその他のの混合物であり得る。化学発光標識およびそれらの対応する基質の詳細な説明については、例えば、Larry J.Kricka, Chemiluminescent and Bioluminescent Techniques, CLINを参照されたい。CHEM.37/9, 1472-1481 (1991) およびTsuji, A.et al. (2005) Bioluminescence and chemiluminescence:Progress and expectations。World Scientific: [sl] 。Isbn 978-981-256-118-3。596ページ。
本開示は、異なるリンカーによってヌクレオチドを標識するために異なる標識を使用し、それによって異なるルシフェラーゼをヌクレオチドに付着させることに関する。
本明細書中で使用される場合、用語「化学発光標識」とは、ヌクレオチドに結合することができ、かつそれが適切な基質との接触によって化学発光反応を誘発することができ、それによって励起光を必要とせずに検出可能な光シグナルを生成することができる任意の化合物を指す。一般に、化学発光反応に関与する任意の成分を、本明細書に記載の化学発光標識として使用することができる。同様に、化学発光反応に関与する他の成分は、本明細書では、化学発光標識の基質と呼ばれる。一般的に使用される適切な化学発光標識の例としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン、官能化鉄－ポルフィリン誘導体、ルミナール、ルミノール、イソルミノール、アクリジンエステル、スルホンアミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。化学発光標識の基質は、使用される特定の化学発光標識に依存する。例えば、アルカリホスファターゼの基質はＡＭＰＰＤ（アダマンチル１， ２－ジオキサン芳香族リン酸）であり得、ルシフェラーゼの基質はルシフェリンであり得、アクリジニウムエステルの基質は水酸化ナトリウムおよびＨ２Ｏ２およびその他のの混合物であり得る。化学発光標識およびそれらの対応する基質の詳細な説明については、例えば、Larry J.Kricka, Chemiluminescent and Bioluminescent Techniques, CLINを参照されたい。CHEM.37/9, 1472-1481 (1991) およびTsuji, A.et al. (2005) Bioluminescence and chemiluminescence:Progress and expectations。World Scientific: [sl] 。Isbn 978-981-256-118-3。596ページ。
【0048】
好ましい態様において、本明細書で使用される化学発光標識は生化学発光標識である。
本明細書中で使用される場合、用語「生化学発光標識」とは、ヌクレオチドに結合することができ、かつそれが適切な基質との接触によって生物発光反応を誘発することができ、それによって励起光を必要とせずに検出可能な光シグナルを生成することができる任意の化合物を指す。生物発光は化学発光の一種であり、ある種の生物の体内または分泌物で起こる化学反応の際の発光を指す。生化学発光標識の例としては、例えば、ルシフェラーゼ、エクオリン、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。生化学発光標識の基質は、使用される特定の生化学発光標識に依存する。例えば、ルシフェラーゼの基質がルシフェリンであってもよく、エクオリンの基質がカルシウムイオンであってもよい。化学発光標識およびそれらの対応する基質の詳細な説明については、例えば、Larry J.Kricka, Chemiluminescent and Bioluminescent Techniques, CLINを参照されたい。CHEM.37/9, 1472-1481 (1991) およびTsuji, A.et al. (2005) Bioluminescence and chemiluminescence:Progress and expectations。World Scientific: [sl] 。Isbn 978-981-256-118-3。596ページ。
本明細書中で使用される場合、用語「生化学発光標識」とは、ヌクレオチドに結合することができ、かつそれが適切な基質との接触によって生物発光反応を誘発することができ、それによって励起光を必要とせずに検出可能な光シグナルを生成することができる任意の化合物を指す。生物発光は化学発光の一種であり、ある種の生物の体内または分泌物で起こる化学反応の際の発光を指す。生化学発光標識の例としては、例えば、ルシフェラーゼ、エクオリン、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。生化学発光標識の基質は、使用される特定の生化学発光標識に依存する。例えば、ルシフェラーゼの基質がルシフェリンであってもよく、エクオリンの基質がカルシウムイオンであってもよい。化学発光標識およびそれらの対応する基質の詳細な説明については、例えば、Larry J.Kricka, Chemiluminescent and Bioluminescent Techniques, CLINを参照されたい。CHEM.37/9, 1472-1481 (1991) およびTsuji, A.et al. (2005) Bioluminescence and chemiluminescence:Progress and expectations。World Scientific: [sl] 。Isbn 978-981-256-118-3。596ページ。
【0049】
好ましい態様において、本明細書で使用される生化学発光標識はルシフェラーゼである。特定の実施形態では、ルシフェラーゼは、ガウシアルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ、渦鞭毛ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、真菌ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、およびバルグラルシフェラーゼから選択される。
【0050】
本明細書中で使用される場合、「化学発光標識でヌクレオチドを標識する」とは、化学発光標識をヌクレオチドに付着させることを意味する。化学発光標識をヌクレオチドに結合させる具体的な方法は、当業者に知られている。例えば、以下の文書における関連する説明を参照することができる:Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989年)、 Chapter 10;米国特許第4,581,333号、第5,283,174号、第5,547,842号、第5,656,207号および第5,658,737号。１つの実施形態において、化学発光標識は、共有結合を介してヌクレオチドに直接結合され得る。別の実施形態において、化学発光標識は、リンカーを介してヌクレオチドに結合され得る。
【0051】
本明細書中で用いる場合、ヌクレオチドを標識するための分子標識およびルシフェラーゼ上の標識は、互いに特異的に結合し得る任意の対の分子であり得る。対のメンバー間の特異的結合は、ルシフェラーゼへのヌクレオチドの結合を実現する。例示的な対形成メンバーとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）対応する抗体またはその結合部分または断片、例えば、ジゴキシン－ジゴキシン抗体、Ｎ ３ Ｇ－Ｎ ３ Ｇ抗体、ＦＩＴＣ－ＦＩＴＣ抗体；（ｂ）核酸アプタマー及びタンパク質；（ｃ）非免疫結合対（ビオチン－アビジン、ビオチン－ストレプトアビジン、ビオチン－ノイトラビジンなど）；（ｄ）ホルモン・ホルモン結合タンパク質；（ｅ）受容体作動薬又は拮抗薬；（ｆ）レクチン炭水化物；（ｇ）酵素－酵素補因子；（ｈ）酵素・酵素阻害剤；（ｉ）核酸二本鎖を形成することができる相補的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの対。
【0052】
特定の実施形態では、第１の分子標識および第２の分子標識は、ビオチン、ジゴキシン、Ｎ ３ ＧおよびＦＩＴＣから選択される小分子標識である。２つのルシフェラーゼは、それぞれ第１の分子標識および第２の分子標識に特異的に結合することができる。例えば、特定の実施形態において、第１の分子標識がビオチンである場合、第１のルシフェラーゼは、ストレプトアビジン標識ルシフェラーゼであり得る；第２の分子標識がジゴキシンである場合、第２のルシフェラーゼは、ジゴキシン抗体で標識され、第１のルシフェラーゼとは異なるルシフェラーゼであってもよく、第２のルシフェラーゼは、第１のルシフェラーゼと同様に、ジゴキシン抗体で標識されたルシフェラーゼの異なる突然変異体であってもよい。異なるルシフェラーゼは、基質と反応する２つの酵素の発光形態が異なる限り、同じ基質または異なる基質に対応することができる。同一のルシフェラーゼの異なる変異体は、基質と反応する異なる変異体の発光形態が異なる限り、同一の基質または異なる基質にも対応することができ、同一のルシフェラーゼの異なる変異体が同一の基質に対応することが好ましい。ルシフェラーゼの供給源は、限定されるものではないが、ホタル、ガウシア、レニラ、オプロホルスおよび他の生物を含む。例えば、ストレプトアビジン標識ルシフェラーゼは、アディビティーカンパニーからのＳＡ－Ｇｌｕｃ：ストレプトアビジン－Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼであり得る；またはプロメガカンパニーのｎａｎｏＫＡＺ；またはナノライトカンパニーのｎａｎｏＬｕｃ；または対応するＧｌｏｗ形態学的突然変異体またはＦｌａｓｈ形態学的突然変異体。ジゴキシン抗体で標識されたルシフェラーゼは、ジゴキシン抗体－Ｇｌｕｃまたはジゴキシン抗体－Ｎｌｕｃまたはジゴキシン抗体－ｎａｎｏＫＡＺ、および対応するグロー形態学的突然変異体またはフラッシュ形態学的突然変異体であり得る。その対応する基質は、コエレンテラジン、脱ヒドロキシル化コエレンテラジン、フッ素置換コエレンテラジン、フラン環置換コエレンテラジン、または他の類似の修飾コエレンテラジンであり得る。
【0053】
本開示の一実施形態において、第１の分子標識および第２の分子標識は、切断可能なリンカーを介してヌクレオチド誘導体に結合される。リンカーは、反応中に要求に応じて切断されることが保証される。例えば、特定の実施形態では、第１のヌクレオチドは、切断可能なリンカー２を介して第１の分子標識に結合されるか、または第１のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１－リンカー２を介して第１の分子標識に結合される。第２のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第１の分子標識に結合される；第３のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第２の分子標識に結合する；４番目のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない。ここに記載されたリンカーは、ジスルフィド結合、アジド、シス－アコニット酸無水物を含有するリンカーなどを含むが、これらに限定されない。
【0054】
ポリヌクレオチドの配列決定
好ましくは、異なるルシフェラーゼに結合した本開示のヌクレオチドは、合成による配列決定に適している。本明細書中で使用されるような合成による配列決定のための方法は、当該分野における合成による配列決定のための種々の周知の方法である。基本的に、合成による配列決定において、配列決定されるべき核酸分子は、最初に配列決定プライマーとハイブリダイズされ、次いで、ポリメラーゼの存在下で、配列決定されるべき核酸分子を鋳型として、本明細書中に記載されるような異なるルシフェラーゼと連結されたヌクレオチドは、配列決定プライマーの３’末端で重合される。重合後、ルシフェラーゼが発する蛍光シグナルを検出することによってヌクレオチドを同定する。ルシフェラーゼが標識ヌクレオチドから除去された後、次の重合配列決定サイクルが行われる。
好ましくは、異なるルシフェラーゼに結合した本開示のヌクレオチドは、合成による配列決定に適している。本明細書中で使用されるような合成による配列決定のための方法は、当該分野における合成による配列決定のための種々の周知の方法である。基本的に、合成による配列決定において、配列決定されるべき核酸分子は、最初に配列決定プライマーとハイブリダイズされ、次いで、ポリメラーゼの存在下で、配列決定されるべき核酸分子を鋳型として、本明細書中に記載されるような異なるルシフェラーゼと連結されたヌクレオチドは、配列決定プライマーの３’末端で重合される。重合後、ルシフェラーゼが発する蛍光シグナルを検出することによってヌクレオチドを同定する。ルシフェラーゼが標識ヌクレオチドから除去された後、次の重合配列決定サイクルが行われる。
【0055】
標的ポリヌクレオチドの配列を決定する方法は、標的ポリヌクレオチドが異なるヌクレオチドとそれぞれ接触して標的ポリヌクレオチドの相補体を形成するように標的ポリヌクレオチドの配列を変性させ、次いで該ヌクレオチドの取込みを検出するように行うことができる。ポリメラーゼにより、標的ポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチドが取り込まれ、相補鎖が伸長するように重合する。重合反応はまた、重合を開始するために特別なプライマーを必要とする。
【0056】
反応の各ラウンドについて、ヌクレオチドの取込みがポリメラーゼによって行われ、次いで取込み事象が測定される。多くの異なるポリメラーゼがあり、当業者にとって最適なポリメラーゼを決定することは容易である。好ましくは、酵素は、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｔ ４またはＴ ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼまたはベントポリメラーゼを含む。特定の特性を有するように操作されたポリメラーゼも使用され得る。
【0057】
配列決定方法は、好ましくは、固体支持体上に配置された標的ポリヌクレオチドに対して行われる。複数の標的ポリヌクレオチドは、アダプター分子を介して固体支持体上に固定化することができ、または、ミクロスフェアなどの粒子に結合することができ、粒子は、固体支持体材料に結合することができる。
【0058】
ポリヌクレオチドは、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用の使用を含む多くの方法で固体支持体に付着され得る。ポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化するための方法は、当該技術分野において周知であり、リソグラフィー技術と、各ポリヌクレオチドを固体支持体上の特定の位置にスポットすることとを含む。適切な固体支持体は、当該技術分野において周知であり、ガラススライドおよびビーズ、セラミックおよびシリコン表面、ならびにプラスチック材料を含む。支持部は通常平らである。マイクロビーズ（マイクロスフェア）も使用することができ、公知の方法によって他の固体支持体に付着させることができる。ミクロスフェアは、任意の適切なサイズを有することができ、その直径は、通常、１０から１００ナノメートルである。好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、平坦な表面、好ましくは平坦なガラス表面に直接付着される。結合は共有結合の形で行うことが好ましい。使用されるアレイは、例えば国際出願第ＷＯ ００／０６７７０号に記載されているような、ユニークな光学的に分解可能な領域に位置するポリヌクレオチドを含む単一分子アレイであることが好ましい。
重合に必要な条件は当業者には周知であるが、ポリメラーゼ反応を行うためには、通常、まずプライマー配列を標的ポリヌクレオチドにアニールしなければならない。プライマー配列はポリメラーゼによって同定され、相補鎖の引き続く伸長の開始部位として働く。プライマー配列は、標的ポリヌクレオチドに対して独立した成分として加えることができる。また、プライマーおよび標的ポリヌクレオチドは、それぞれ一本鎖分子の一部であってもよく、プライマー部分と標的の一部とによって分子内二本鎖、すなわちヘアピンループ構造が形成される。この構造は、分子の任意の部位で固体支持体上に固定化することができる。ポリメラーゼ反応を実施するために必要な他の条件は、当業者に周知であり、これらの条件には、温度、ｐＨ、および緩衝液組成物が含まれる。
重合に必要な条件は当業者には周知であるが、ポリメラーゼ反応を行うためには、通常、まずプライマー配列を標的ポリヌクレオチドにアニールしなければならない。プライマー配列はポリメラーゼによって同定され、相補鎖の引き続く伸長の開始部位として働く。プライマー配列は、標的ポリヌクレオチドに対して独立した成分として加えることができる。また、プライマーおよび標的ポリヌクレオチドは、それぞれ一本鎖分子の一部であってもよく、プライマー部分と標的の一部とによって分子内二本鎖、すなわちヘアピンループ構造が形成される。この構造は、分子の任意の部位で固体支持体上に固定化することができる。ポリメラーゼ反応を実施するために必要な他の条件は、当業者に周知であり、これらの条件には、温度、ｐＨ、および緩衝液組成物が含まれる。
【0059】
その後、本開示の標識ヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと接触して重合を行う。ヌクレオチドは連続的に添加することができ、すなわち、ヌクレオチドの各タイプ（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ／Ｕ）を別々に添加することができ、またはそれらを同時に添加することができる。
重合は、１つのヌクレオチドを取り込むのに十分な長さの期間にわたって行われた。
次いで、取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、前の工程で反応系から溶液相を除去し、支持体に付着した二本鎖を維持することによって除去される。
重合は、１つのヌクレオチドを取り込むのに十分な長さの期間にわたって行われた。
次いで、取り込まれていないヌクレオチドは、例えば、前の工程で反応系から溶液相を除去し、支持体に付着した二本鎖を維持することによって除去される。
【0060】
続いて、異なるルシフェラーゼを含む２つのルシフェラーゼを添加して結合反応を行うことができる。２つのルシフェラーゼは、ヌクレオチドを標識するための分子標識をそれぞれ特異的に結合することができ、それによって、組み込まれたヌクレオチドへのルシフェラーゼの結合を達成する。次に、ルシフェラーゼの対応する基質を添加し、蛍光シグナルを検出する。同じルシフェラーゼの異なる変異体を含む２つのルシフェラーゼを加えて結合反応を行ってもよい。ルシフェラーゼは、ヌクレオチドを標識するための分子標識にそれぞれ特異的に結合することができ、それによってルシフェラーゼを取り込まれたヌクレオチドに付着させる。次に、ルシフェラーゼの対応する基質を添加し、蛍光シグナルを検出する。
【0061】
次に、リンカー２を切断する切断液を添加して、リンカー２を介してヌクレオチドに付着した分子標識を除去する。次いで、溶離緩衝液を用いて開裂溶液を除去する；ルシフェラーゼの基質を再度加え、第２の発光シグナルをマイクロプレートリーダーで検出して塩基配列を決定する。
【0062】
特定の実施形態では、４つのデオキシリボヌクレオチドアナログは、ビオチン（略してＢ）およびジゴキシン（略してＤ）という異なる小分子標識で標識される。例えば、ヌクレオチドＡはリンカー１－リンカー２によってＢで標識され、ヌクレオチドＣはリンカー１によってＢで標識され、ヌクレオチドＴはリンカー１によってＤで標識され、ヌクレオチドＧは標識されない。異なる小分子で標識された４種類のデオキシリボヌクレオチドアナログの３’末端ヒドロキシル基はすべてブロックされており、各配列決定反応において１種類のデオキシリボヌクレオチドのみが結合するようになっている。配列決定反応の過程で、４つのデオキシヌクレオチドアナログおよび配列決定ポリメラーゼ混合物が最初に導入される。ポリメラーゼの作用下で、相補的塩基対形成の原理に従って、デオキシリボヌクレオチド類似体が伸長中の核酸鎖の３’末端に組み込まれる。非結合デオキシリボヌクレオチドアナログは、前の段階で反応系から溶液相を除去し、支持体に結合した二本鎖を維持することによって除去することができる。次に、異なるルシフェラーゼを含む２つのルシフェラーゼを添加する。第１のルシフェラーゼをストレプトアビジンで標識し、低分子Ｂで標識されたヌクレオチドＡ又はヌクレオチドＣと結合させ、第２のルシフェラーゼをジゴキシン抗体で標識し、低分子Ｄで標識されたヌクレオチドＴと結合させ、未結合のルシフェラーゼを溶出液で除去した後、ルシフェラーゼの基質を添加し、検出器でシグナル検出を行い、第１の蛍光シグナルを得る。次に、リンカー２を選択的に切断可能な切断液を添加する。リンカー２は切断されるが、リンカー１は切断されない。ルシフェラーゼの基質を再度添加し、検出器により信号検出を行い、第２の蛍光信号を得る。この２つの反応信号に基づいて塩基同定を行うことができる。
【0063】
特定の実施形態では、異なるルシフェラーゼを含む２つのルシフェラーゼ、または同じルシフェラーゼの異なる変異体を含む２つのルシフェラーゼのデオキシヌクレオチドアナログへの付着およびシグナル検出を別々に行うことができる。まず、ストレプトアビジンで標識された第１のルシフェラーゼを添加し、低分子Ｂで標識されたヌクレオチドＡまたはヌクレオチドＣと結合させる。未結合の第１のルシフェラーゼを溶出液で除去した後、第１のルシフェラーゼの基質を添加し、第１のルシフェラーゼに結合したヌクレオチドを発光させ、検出器で信号検出を行う。反応液を除去した後、ジゴキシン抗体で標識された第２のルシフェラーゼを添加し、低分子Ｄで標識されたヌクレオチドＴを結合させる。次いで、未結合の第２のルシフェラーゼを溶出溶液で除去する；第２のルシフェラーゼの基質を添加し、第２のルシフェラーゼに付着した塩基を発光させた後、検出器による信号検出を行い、第１の蛍光信号を得る。次に、リンカー２を選択的に切断可能な切断液を添加する。リンカー２は切断されるが、リンカー１は切断されない。第１のルシフェラーゼの基質を再度添加し、第１のルシフェラーゼに結合したヌクレオチドを発光させ、検出器により信号検出を行う。第２のルシフェラーゼの基質を添加し、第２のルシフェラーゼに結合したヌクレオシドを発光させた後、検出器による信号検出を行い、第２の蛍光信号を得る。この２つの反応信号に基づいて塩基同定を行うことができる。
【0064】
別の具体的な実施形態では、４つのデオキシリボヌクレオチドアナログは、ビオチン（略してＢ）およびジゴキシン（略してＤ）という異なる小分子標識で標識される。例えば、ヌクレオチドＡはリンカー１－リンカー２によってＢで標識され、ヌクレオチドＣはリンカー１によってＢで標識され、ヌクレオチドＴはリンカー１によってＤで標識され、ヌクレオチドＧは標識されない。異なる小分子で標識された４種類のデオキシリボヌクレオチドアナログの３’末端ヒドロキシル基はすべてブロックされており、各配列決定反応において１種類のデオキシリボヌクレオチドのみが結合するようになっている。配列決定反応の過程で、４つのデオキシヌクレオチドアナログおよび配列決定ポリメラーゼ混合物が最初に導入される。ポリメラーゼの作用下で、相補的塩基対形成の原理に従って、デオキシリボヌクレオチド類似体が伸長中の核酸鎖の３’末端に組み込まれる。非結合デオキシリボヌクレオチドアナログは、前の段階で反応系から溶液相を除去し、支持体に結合した二本鎖を維持することによって除去することができる。次に、同一のルシフェラーゼの異なる変異体を含む２つのルシフェラーゼを添加する。第１のルシフェラーゼをストレプトアビジンで標識し、低分子Ｂで標識されたヌクレオチドＡ又はヌクレオチドＣと結合させ、第２のルシフェラーゼをジゴキシン抗体で標識し、低分子Ｄで標識されたヌクレオチドＴと結合させ、未結合のルシフェラーゼを溶出液で除去した後、ルシフェラーゼの基質を添加し、検出器でシグナル検出を行い、第１の蛍光シグナルを得る。次に、リンカー２を選択的に切断可能な切断液を添加する。リンカー２は切断されるが、リンカー１は切断されない。ルシフェラーゼの基質を再度添加し、検出器により信号検出を行い、第２の蛍光信号を得る。この２つの反応信号に基づいて塩基同定を行うことができる。
【0065】
蛍光信号検出
蛍光信号を検出する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、蛍光の波長を検出するための装置によって実施することができる。このようなデバイスは、当技術分野で周知である。例えば、このデバイスは、配列決定されるべき核酸分子に直接結合したフルオロフォアを画像化するためにレーザーで固体支持体の表面を走査する共焦点走査顕微鏡であり得る。加えて、例えば、電荷結合検出器（ＣＣＤ）などの高感度２－Ｄ検出器を使用して、生成された各信号を観察することができる。例えば、走査近接場光学顕微鏡（ＳＮＯＭ）などの他の技術も使用することができる。
蛍光信号を検出する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、蛍光の波長を検出するための装置によって実施することができる。このようなデバイスは、当技術分野で周知である。例えば、このデバイスは、配列決定されるべき核酸分子に直接結合したフルオロフォアを画像化するためにレーザーで固体支持体の表面を走査する共焦点走査顕微鏡であり得る。加えて、例えば、電荷結合検出器（ＣＣＤ）などの高感度２－Ｄ検出器を使用して、生成された各信号を観察することができる。例えば、走査近接場光学顕微鏡（ＳＮＯＭ）などの他の技術も使用することができる。
【0066】
標識の除去
検出後、適切な条件を用いてヌクレオチド上の標識を除去することができる。
検出後、適切な条件を用いてヌクレオチド上の標識を除去することができる。
【0067】
特定の実施形態では、本開示のヌクレオチドアナログも３’保護基を有する。本開示のいくつかの態様において、保護基および標識は、通常、３’－ブロックされた標識ヌクレオチド上の２つの異なる基である。他の実施形態では、保護基と標識とは同じ基であってもよい。
【0068】
本明細書中で使用される場合、用語「保護基」とは、（その基を含むヌクレオチドの合成されるポリヌクレオチド鎖への取り込みを触媒する）ポリメラーゼが、その基を含むヌクレオチドを合成されるポリヌクレオチド鎖に取り込んだ後に、別のヌクレオチドの取り込みをさらに触媒するのを妨げる基を意味する。このような保護基は、本明細書では３’－ＯＨ保護基とも呼ばれる。このような保護基を含有するヌクレオチドは、本明細書では３’ブロックヌクレオチドとも呼ばれる。保護基は、ポリヌクレオチド鎖へのさらなるヌクレオチド分子の付加を防止することができ、ポリヌクレオチド鎖を損傷することなくヌクレオチドの糖部分から容易に除去することができる限り、ヌクレオチドに付加することができる任意の適切な基であり得る。さらに、保護基で修飾されたヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖に組み込むためのポリメラーゼまたは他の適切な酵素に対して耐性である必要がある。したがって、理想的な保護基は長期安定性を示し、ポリメラーゼの触媒作用によって効率的に取り込まれてヌクレオチドの二次的またはそれ以上の取込みを防止することができ、好ましくは、温和な条件下で、好ましくは水性条件下で、ポリヌクレオチドの構造を損傷することなく除去することができる。
【0069】
上記の説明を満たす種々の保護基が先行技術に記載されており、例えば、ＷＯ ９１／０６６７８に記載されているように、３’－ＯＨ保護基は、エステルおよびエーテル、－Ｆ、－ＮＨ２、－ＯＣＨ３、－Ｎ３，－ＯＰＯ３，－ＮＨＣＯＣＨ３、２－ニトロベンゼンカーボネート、２， ４－スルフェニルジニトロおよびテトラヒドロフランエーテルを含む。Ｍｅｔｚｋｅｒら（核酸研究、22 (20) :4259-4267、1994）は、８つの３’－修飾２－デオキシリボヌクレオシド５’－三リン酸（３’－修飾ｄＮＴＰ）の合成および適用を開示している。ＷＯ ２００２／０２９００３は、ポリメラーゼ反応における成長中のＤＮＡ鎖上の３’－ＯＨ基をキャップするアリル保護基の使用を記載している。好ましくは、国際出願公開ＷＯ ２０１４１３９５９６およびＷＯ ２００４／０１８４９７に報告されている様々な保護基を使用することができ、例えば、図１Ａに例示されている保護基およびＷＯ ２０１４１３９５９６のクレームに定義されている３’－ＯＨ保護基（すなわち、保護基）、ならびに例えば、図３および４に例示されている保護基およびＷＯ ２００４／０１８４９７のクレームに定義されている保護基を含む。上記の参考文献は全てその全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【0070】
当業者は、３’－ＯＨとの相互作用を遮断するために、適切な保護基をリボース環に付加する方法を理解するであろう。保護グループは、３’サイトに直接接続することも、２’サイトに接続することもできる（保護グループには、３’サイトでの相互作用をブロックするのに十分なサイズまたは電荷がある）。さらに、保護基を３’および２’部位に結合させることができ、切断して３’－ＯＨ基を露出させることができる。
【0071】
３’－ブロックされたヌクレオチドを成長中の核酸鎖にうまく取り込んだ後、保護基を除去して、連続的な鎖合成のための使用可能な３’－ＯＨ部位を作製する必要がある。本明細書で使用されるように、修飾ヌクレオチドから保護基を除去することができる試薬は、使用される保護基に大きく依存する。例えば、３’－ＯＨ官能基からの保護エステル基の除去は、通常、アルカリ加水分解によって達成される。保護基の除去の容易さには大きなばらつきがある；一般に、カルボニル炭素上の置換基の電気陰性度が大きいほど、保護基は容易に除去できる。例えば、電気陰性度の高いトリフルオロ酢酸基は、メタノール中、ｐＨ ７で３’－ＯＨから速やかに開裂することができる(Cramerら, 1963年)ので、このｐＨでの重合中、トリフルオロ酢酸基は不安定である。フェノキシ酢酸基は１分未満で切断されるが、例えばＮＨ－／メタノール(リース&スチュワード1968)中では有意に高いｐＨで切断される。種々のヒドロキシ保護基は、アルカリ加水分解以外の化学的方法を用いて選択的に切断することができる。２， ４－ジニトロフェニルチオ基はチオフェノールやチオ硫酸塩のような求核剤で処理すると速やかに開裂する(Letsingerら、1964年)。アリルエーテルはアセトン／水(Gigg and Warren, 1968年)中のＨｇ（ＩＩ）による処理によって開裂される。中性条件下(Cohen and Steele, 1966年;Cruseら、1978年)でＡｇ（Ｉ）またはＨｇ（ＩＩ）を用いてテトラヒドロチアピラニルエーテルを除去する。光化学的デブロッキングは、光化学的に開裂可能な保護基と共に使用することができる。この方法で使用できる保護基はいくつかある。リボヌクレオシドの２’－ヒドロキシル官能性保護基としてｏ－ニトロベンジルエーテルを使用することが知られ、証明されており(大塚、 1978)、保護基は２６０ｎｍの照射によって除去される。保護基のアルキルカーボネートｏ－ニトロベンジルカーボネートもまた、ｐＨ ７(カーマとクリステンセン、1978年)での照射によって除去される。３’－ＯＨ保護基の酵素分解脱ブロックも可能である。Ｔ ４ポリヌクレオチドキナーゼが３’－リン酸末端を３’－ＯＨ末端に変換し、ＤＮＡポリメラーゼＩのプライマーとして利用できることが証明されている(Hennerら、1983年)。保護基としてリン酸を含むこれらのｄＮＴＰ類似体の３’保護基は、３’－ホスファターゼの活性によって除去することができる。
【0072】
３’－ブロックヌクレオチドから保護基を除去することができる他の試薬としては、例えば、ヌクレオチドからアジド含有３’－ＯＨ保護基を除去することができるホスフィン類（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＰ））が挙げられる（ホスフィンのこの適用に関しては、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ ２０１４１３９５９６の記載を参照することができる。）。３’－ブロックヌクレオチドから保護基を除去することができる他の試薬には、例えば、ＷＯ ２００４／０１８４９７、１１４～１１６頁の説明に開示されているように、３’－ＯＨ保護基として働く３’－アリル、３， ４－ジメトキシベンジルオキシメチルまたはフルオロメトキシメチルを除去するための対応する試薬も含まれる。
【0073】
本開示の態様において、ヌクレオチド標識は、好ましくは、検出後に保護基と共に除去される。
いくつかの実施形態において、標識は保護基と共に取り込まれてもよく、それにより、３’－ブロックされたヌクレオチドが核酸鎖に取り込まれた後に、標識を保護基と共に除去することができる。
いくつかの実施形態において、標識は保護基と共に取り込まれてもよく、それにより、３’－ブロックされたヌクレオチドが核酸鎖に取り込まれた後に、標識を保護基と共に除去することができる。
【0074】
他の実施形態において、標識は、リンカーを使用することによって、保護基とは別にヌクレオチドに結合され得る。そのような標識は、例えば、ヌクレオチドのプリンまたはピリミジン塩基に結合され得る。いくつかの態様において、使用されるリンカーは切断可能である。切断可能なリンカーの使用は、検出後に標識が除去され得ることを確実にし、これにより、その後に取り込まれる標識ヌクレオチドとのシグナル干渉が回避される。他の態様において、非切断性リンカーを使用することができる。標識されたヌクレオチドが核酸鎖に取り込まれた後、その後のヌクレオチドの取り込みは必要ないので、標識をヌクレオチドから除去する必要はない。
【0075】
他の実施形態において、標識および／またはリンカーは、ポリヌクレオチド鎖（つまり、標識自体が保護基として機能することができる。）への他のヌクレオチドの取り込みをブロックするのに十分なサイズまたは構造を有し得る。ブロッキングは、立体障害、またはサイズ、電荷、および構造の組み合わせによって引き起こされ得る。
【0076】
切断可能なリンカーは当技術分野で周知であり、リンカーをヌクレオチド塩基および標識に結合させるために従来の化学的方法を使用することができる。リンカーは、ワトソン－クリック塩基対形成が依然として行われ得る場合には、ヌクレオチド塩基の任意の位置に結合され得る。プリン塩基については、リンカーの結合は、プリンの７位によって、好ましくはデアザプリン類似体によって、または８－修飾プリンによって、またはＮ－６修飾アデニンによって、またはＮ－２修飾グアニンによって実施されることが好ましい。ピリミジンについては、結合は好ましくはシトシン、チミンおよびウラシル上の５位およびシチジン上のＮ－４位によって実施される。
【0077】
用語「切断可能なリンカー」の使用は、リンカー全体を除去する必要があることを意味しない（例えば、ヌクレオチド塩基から）。標識が塩基に結合している場合、ヌクレオシド切断部位はリンカー上のある位置に位置することができ、その位置は、リンカーの一部が切断後もヌクレオチド塩基に結合したままであることを保証することができる。
【0078】
適切なリンカーとしては、ジスルフィドリンカー、酸不安定性リンカー（ジアルコキシベンジルリンカー、シーバーリンカー、インドールリンカー、ｔｅｒｔ－ブチルシーバーリンカーを含む）、求電子性切断可能リンカー、求核性切断可能リンカー、光切断可能リンカー、還元および酸化条件下で切断されるリンカー、安全捕捉リンカー、および脱離機構を介して切断されるリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。適切なリンカーは、Greene&Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley&Sonsに開示されているように、標準的な化学的保護基で修飾することができる。Guillierらは、固相合成のための他の適切な切断可能リンカー(ケム。改訂100:2092-2157, 2000)を開示した。
【0079】
リンカーは、酸、塩基、求核剤、求電子剤、フリーラジカル、金属、還元または酸化試薬、光、温度、酵素などへの暴露を含む任意の適切な方法によって切断することができ、種々の切断可能なリンカーの適切な切断方法は、以下に例示的に記載される。一般に、切断可能なリンカーは、保護基と同じ条件下で切断することができ、その結果、標識および保護基を１回の処理のみで除去することができる。
【0080】
求電子的切断可能なリンカーは典型的にはプロトンによって切断され、この切断には酸感受性切断が含まれる。好適な求電子的開裂可能なリンカーとしては、トリチル、ｐ－アルコキシベンジルエステル、およびｐ－アルコキシベンジルアミドなどの修飾されたベンジル系が挙げられる。他の適切なリンカーとしては、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基およびアセタール系が挙げられる。適切な連結分子を調製するために、チオアセタールまたは他の硫黄含有保護基の開裂におけるニッケル、銀または水銀のような親チオ性金属の使用も考慮される。求核性切断可能リンカーには、エステルのように水中で不安定な基（すなわち、アルカリ性のｐＨで簡単に開裂することができる）、および非水性求核剤に対して不安定な基が含まれる。フッ化物イオンを用いて、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）またはｔｅｒｔ－ブチルジメチルシラン（ＴＢＤＭＳ）のような基のケイ素－酸素結合を開裂することができる。光分解性リンカーは糖化学で広く使用されている。好ましくは、開裂を活性化するのに必要な光は、修飾されたヌクレオチド中の他の成分に影響を与えない。例えば、標識としてフルオロフォアを用いる場合、フルオロフォアは、結合分子を切断するのに必要な光とは異なる波長の光を吸収することが好ましい。適切なリンカーとしては、Ｏ－ニトロベンジル化合物およびニトロベラトリル化合物に基づくリンカーが挙げられる。ベンゾイン化学に基づくリンカーも使用できる(リーら、J.Org.Chem 64:3454-3460、1999)。還元的切断に感受性のある種々のリンカーが知られている。パラジウム系触媒を用いる接触水素化を用いてベンジル及びベンジルオキシカルボニル基を開裂した。ジスルフィド結合の還元もまた当技術分野において公知である。酸化に基づく方法は当技術分野において周知である。これらの方法には、アルコキシベンジルの酸化および硫黄およびセレンリンカーの酸化が含まれる。ジスルフィドおよび他の硫黄またはセレンベースのリンカーを切断するために水性ヨウ素を使用することも、本開示の範囲内である。セーフティキャッチリンカーとは、２段に切断されたものである。好ましい系では、第一段階は反応性求核中心の生成を含み、次の第二段階は分子内環化を含み、これは開裂をもたらす。例えば、レブリン酸結合をヒドラジンまたは光化学的方法で処理して活性アミンを放出し、次いで、アミンを環化して、分子内の他の場所(Burgessら、J.Org.Chem 62:5165 -5168、1997)でエステルを開裂させることができる。脱離反応を用いてリンカーを開裂することもできる。フルオレニルメチルオキシカルボニルおよびシアノエチルのような基の塩基触媒による脱離およびアリル系のパラジウム触媒による還元脱離を用いることができる。
【0081】
いくつかの実施形態において、リンカーはスペーサーユニットを含むことができる。標識がヌクレオチドと酵素との相互作用を妨げないようにヌクレオチドから十分な距離を保っている限り、リンカーの長さは重要ではない。
【0082】
いくつかの態様において、リンカーは、３’－ＯＨ保護基と同様の官能基から構成されてもよい。このように、標識および保護基を除去するのに必要な処理は１回だけである。特に好ましいリンカーは、ホスフィンによって切断可能なアジド含有リンカーである。
【0083】
本明細書で使用される修飾ヌクレオチドから標識を除去することができる試薬は、使用される標識に大きく依存する。例えば、保護基が含まれている場合には、上記の保護基除去用試薬を用いて標識を除去する。あるいは、標識が切断可能なリンカーを介してヌクレオチドの塩基に結合している場合、リンカーを切断する上記の試薬を用いて標識を除去する。好ましい実施形態では、例えばリンカーが３’－ＯＨ保護基と類似の官能基からなる場合に、修飾ヌクレオチドから標識および保護基を除去するために同じ試薬が使用される。
【0084】
キット
本開示はさらに、以下を含むポリヌクレオチドを配列決定するためのキットを提供する。
（ａ）４つのヌクレオチド、ここで、４つのヌクレオチドは、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、およびＧの誘導体であり、相補的な塩基対形成の能力を有する；そして、４つのヌクレオチドのそれぞれのリボースまたはデオキシリボースの３’部位のヒドロキシル基（－ＯＨ）が保護基によって保護されている；４つのヌクレオチドのうち
第１のヌクレオチドは、切断可能なリンカー２を介して第１の分子標識に結合される、
第２のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第１の分子標識に結合される、
第３のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第２の分子標識に結合され、
４番目のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない；
（ｂ）２つの異なるルシフェラーゼであって、２つのルシフェラーゼは、それぞれ、第１の分子標識および第２の分子標識に特異的に結合することができる；および
（ｃ）リンカー２を切断するための切断液。
本開示はさらに、以下を含むポリヌクレオチドを配列決定するためのキットを提供する。
（ａ）４つのヌクレオチド、ここで、４つのヌクレオチドは、それぞれヌクレオチドＡ、（Ｔ／Ｕ）、Ｃ、およびＧの誘導体であり、相補的な塩基対形成の能力を有する；そして、４つのヌクレオチドのそれぞれのリボースまたはデオキシリボースの３’部位のヒドロキシル基（－ＯＨ）が保護基によって保護されている；４つのヌクレオチドのうち
第１のヌクレオチドは、切断可能なリンカー２を介して第１の分子標識に結合される、
第２のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第１の分子標識に結合される、
第３のヌクレオチドは、切断可能なリンカー１を介して第２の分子標識に結合され、
４番目のヌクレオチドはどの分子標識にも結合していない；
（ｂ）２つの異なるルシフェラーゼであって、２つのルシフェラーゼは、それぞれ、第１の分子標識および第２の分子標識に特異的に結合することができる；および
（ｃ）リンカー２を切断するための切断液。
【0085】
特定の実施形態において、４つのヌクレオチドを標識するために使用される分子標識、および２つのルシフェラーゼを標識するために使用される標識は、上に定義されるとおりである。
いくつかの好ましい態様において、本開示のキットに含まれる２つの異なるルシフェラーゼは、それぞれ４つのヌクレオチドを特異的に結合することができる異なる標識を含み、２つの異なるルシフェラーゼは、異なるルシフェラーゼを含むことができ、またはそれらは、同じルシフェラーゼの異なる突然変異体を含むことができる。
いくつかの好ましい態様において、本開示のキットに含まれる２つの異なるルシフェラーゼは、それぞれ４つのヌクレオチドを特異的に結合することができる異なる標識を含み、２つの異なるルシフェラーゼは、異なるルシフェラーゼを含むことができ、またはそれらは、同じルシフェラーゼの異なる突然変異体を含むことができる。
【0086】
いくつかの好ましい態様において、本開示のキットは、試料から核酸分子を抽出するための試薬および／または装置；核酸分子を前処理するための試薬；配列決定される核酸分子に結合する支持体；配列決定されるべき核酸分子を、例えば、共有結合的または非共有結合的な方法で支持体に付着させるための試薬；ヌクレオチド重合反応を開始させるためのプライマー；ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼ；一つ以上の緩衝液；一つ以上の洗浄液；またはその組み合わせ、をさらに含む。
【0087】
いくつかの好ましい態様において、本開示のキットは、試料から核酸分子を抽出するための試薬および／または装置をさらに含む。試料から核酸分子を抽出するための方法は、当技術分野において周知であるので、細胞を破壊するための試薬、ＤＮＡを沈殿させるための試薬、ＤＮＡを洗浄するための試薬、ＤＮＡを溶解するための試薬、ＲＮＡを沈殿させるための試薬、ＲＮＡを洗浄するための試薬、ＲＮＡを溶解するための試薬、タンパク質を除去するための試薬、ＤＮＡを除去するための試薬（例えば、標的核酸分子がＲＮＡである場合）、ＲＮＡを除去するための試薬（例えば、標的核酸分子がＤＮＡである場合）、およびそれらの任意の組み合わせなどの、核酸分子を抽出するための様々な試薬および／またはデバイスを、必要に応じて、本開示のキットにおいて構成することができる。
【0088】
いくつかの好ましい態様において、本開示のキットは、核酸分子を前処理するための試薬をさらに含む。本開示のキットにおいて、核酸分子を前処理するために使用される試薬は、追加の制限を受けず、実際のニーズに応じて選択することができる。核酸分子を前処理するための試薬としては、例えば、核酸分子を断片化するための試薬、核酸分子の末端を相補するための試薬（例えば、Ｔ ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ）、アダプター分子、標識分子、アダプター分子を標的核酸分子に結合させるための試薬（例えば、Ｔ ４ ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼ）、核酸のニックを修復するための試薬（例えば、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を失うが５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を示すＤＮＡポリメラーゼ）、核酸分子を増幅するための試薬（ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰなど）、核酸分子を分離精製するための試薬（クロマトグラフィーカラムなど）、およびこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【0089】
いくつかの好ましい態様において、本開示のキットは、配列決定されるべき核酸分子に結合される支持体をさらに含む。支持体は、支持体に関して上記で詳細に説明した技術的特徴および技術的特徴の任意の組み合わせを有することができる。
【0090】
例えば、本開示では、支持体は、種々の適切な材料で作ることができる。このような材料には、例えば、無機材料、天然ポリマー、合成ポリマー、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。具体例としては、セルロース、セルロース誘導体（ニトロセルロースなど）、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルとアクリルアミドのコポリマー、ジビニルベンゼンで架橋されたポリスチレン（例えば、Merrifield Biochemistry 1964, 3, 1385-1390参照）、ポリアクリルアミド、ラテックス、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、天然スポンジ、金属プラスチック、架橋デキストラン（例、Sephadex TM）、セファロースＴＭ、および当業者に公知の他の支持体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0091】
いくつかの好ましい態様において、配列決定される核酸分子に結合される支持体は、不活性基質またはマトリックス（スライドガラス、ポリマービーズなど。）を含む固体支持体であり得る。不活性基質またはマトリックスは、例えば、ポリヌクレオチドなどの生体分子への共有結合を可能にする反応性基を含有する中間材料を適用することによって機能化されている。このような支持体の例としては、ガラスなどの不活性基板上に支持されたポリアクリルアミドヒドロゲル、特に、その内容物が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ ２００５／０６５８１４およびＵＳ ２００８／０２８０７７３に記載されたポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これらに限定されない。そのような実施形態では、生体分子（例えばポリヌクレオチド）は、中間材料（例えばヒドロゲル）に直接共有結合的に結合することができ、中間材料自体は、基板またはマトリックス（例えばガラス基板）に非共有結合的に結合することができる。いくつかの好ましい実施形態では、支持体は、表面上にアビジン、アミノ、アクリルアミドシランまたはアルデヒド基などの化学基の層で修飾されたスライドガラスまたはシリコンウエハである。
【0092】
本開示において、支持体または固体支持体は、そのサイズ、形状および構成によって制限されない。いくつかの実施形態では、支持体または固体支持体は、スライド、チップ、マイクロチップ、および／またはアレイなどの平面構造である。このような支持体の表面は、平面層の形態であってもよい。いくつかの実施態様において、支持体又はその表面は、チューブ又は容器の内側又は外側表面のような非平面である。いくつかの態様において、支持体または固体支持体は、ミクロスフェアまたはビーズを含む。特定の好ましい態様において、配列決定される核酸分子に結合される支持体は、ビーズまたはウェルのアレイである。
【0093】
いくつかの好ましい態様において、本開示のキットは、配列決定されるべき核酸分子を支持体に付着（例えば、共有結合的または非共有結合的に付着する）させるための試薬をさらに含む。このような試薬には、例えば、リン酸、チオール、アミン、カルボン酸、またはアルデヒドなどの核酸分子（その５’末端など）を活性化または修飾するための試薬が含まれる。アミノアルコキシシラン（アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、４－アミノブチルトリエトキシシラン等。）のような、支持体の表面を活性化または修飾するための試薬；無水コハク酸、フェニルジイソチオシアネート（Guoら、1994年）、無水マレイン酸（Yang et al., 1998）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、メタ－マレイミド安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－スクシンイミジル［４－ヨードアセチル］アミノベンゼンギ酸（ＳＩＡＢ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スクシンイミド（ＳＭＣＣ）、Ｎ－γ－マレイミドブチリルオキシ－スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、４－（ｐ－マレイミドフェニル）酪酸スクシンイミド（ＳＭＰＢ）などの架橋剤；およびその組み合わせ。
【0094】
いくつかの好ましい態様において、本開示のキットは、ヌクレオチド重合反応を開始するためのプライマーをさらに含む。本開示において、プライマーは、それが標的核酸分子の領域に特異的にアニーリングすることができる限り、追加の制限を受けない。いくつかの例示的な実施形態において、プライマーの長さは、５～５０ｂｐ、例えば、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、および４５～５０ｂｐであり得る。いくつかの例示的な実施形態において、プライマーは、天然に存在するヌクレオチドまたは非天然に存在するヌクレオチドを含み得る。いくつかの例示的な実施形態において、プライマーは、天然に存在するヌクレオチドを含むか、または天然に存在するヌクレオチドからなる。いくつかの例示的な実施形態において、プライマーは、ロックされた核酸（ＬＮＡ）などの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの好ましい態様において、プライマーは、ユニバーサルプライマー配列を含む。
【0095】
いくつかの好ましい態様において、本開示のキットは、ヌクレオチド重合反応を行うためのポリメラーゼをさらに含む。本開示では、種々の適切なポリメラーゼを使用することができる。いくつかの例示的な実施形態において、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、新しいＤＮＡ鎖を合成するためのテンプレートとしてＤＮＡを使用することができる。いくつかの例示的な実施形態において、ポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）は、新しいＤＮＡ鎖を合成するためのテンプレートとしてＲＮＡを使用することができる。いくつかの例示的な実施形態において、ポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）は、ＤＮＡまたはＲＮＡをテンプレートとして使用して、新しいＲＮＡ鎖を合成することができる。したがって、いくつかの好ましい態様において、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素から選択される。
【0096】
いくつかの好ましい実施形態では、本開示のキットは、１つ以上の緩衝液をさらに含む。このような緩衝液としては、デオキシリボヌクレアーゼＩ用緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液、リガーゼ用緩衝液、核酸分子溶出用緩衝液、核酸分子溶解用緩衝液、ヌクレオチド重合反応用緩衝液（例えば、ＰＣＲ）、およびライゲーション反応用緩衝液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本開示のキットは、上述の緩衝液のうちの任意の１つ以上を含むことができる。
【0097】
いくつかの好ましい実施形態において、本開示のキットは、１つ以上の洗浄液をさらに含む。このような洗浄溶液の例としては、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、酢酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液などが挙げられるが、これらに限定されない。本開示のキットは、上述の洗浄液のうちの任意の１つまたは複数を含むことができる。
【0098】
本開示の有益な効果
先行技術と比較して、本開示の技術的解決は、以下の有益な効果を有する。
本開示の方法において、分子標識およびヌクレオチド誘導体は、切断可能なリンカーを介して結合される。化学発光反応の反応速度曲線に基づいて、特定の塩基上の化学発光標識を選択的化学結合切断法によって不活性化し、残りの発光標識の発光能力によって二次発光判定を行い、塩基を同定する。化学ルミネセンスの速度論曲線にはフラッシュとグローの二つの特性だけが必要なので、速度論曲線の明白でない特性による混乱を大きく減らすことができた。一方、二次発光では、信号強度のみがバックグラウンド値を超えていればよく、反応曲線の特性を必要としないため、反応過程における副反応による信号同定への悪影響を低減でき、塩基同定の精度を向上させることができる。
先行技術と比較して、本開示の技術的解決は、以下の有益な効果を有する。
本開示の方法において、分子標識およびヌクレオチド誘導体は、切断可能なリンカーを介して結合される。化学発光反応の反応速度曲線に基づいて、特定の塩基上の化学発光標識を選択的化学結合切断法によって不活性化し、残りの発光標識の発光能力によって二次発光判定を行い、塩基を同定する。化学ルミネセンスの速度論曲線にはフラッシュとグローの二つの特性だけが必要なので、速度論曲線の明白でない特性による混乱を大きく減らすことができた。一方、二次発光では、信号強度のみがバックグラウンド値を超えていればよく、反応曲線の特性を必要としないため、反応過程における副反応による信号同定への悪影響を低減でき、塩基同定の精度を向上させることができる。
【0099】
本開示の特定の実施形態を詳細に説明したが、当業者であれば、開示されたすべての教示に従って詳細に様々な修正および変更を加えることができ、これらの変更は本開示の保護範囲内にあることを理解するであろう。開示の全範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によって与えられる。
実施例
実施例
【0100】
実施例１
１．配列決定ライブラリーの構築
（１）
［００１］ ＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＧＡＡＴＧＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＴＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＴＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡＴＧＡＴＴＡＴＡＧＡＴＡＴＡＴＴＡＡＧＧＡＡＴＡＡＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＣＣＴＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＴＡＡＧＧＧＧＧＴＴＡＡＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣのＤＮＡ配列を設計した。ライブラリーの構築の便宜のため、オリゴ配列（太字フォント）を配列の両端に加え、ＢＧＩＳＥＱ－５００のアダプター配列（網掛け部分）を中央に組み込んだ。斜体で示した太字の部分は、決定すべき配列の最初の１０ｂｐであった。上記の配列はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈによって合成された。配列を無制限に使用するために、合成した配列をｐＵＣ ５７ベクターに組み込み、大腸菌に形質転換した。
［００２］ （２）既知のライブラリーを含む適当量の大腸菌を培養し、プラスミドを抽出した。以下のプライマー対:ＧＡＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴ（プライマー１）、ＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡ（プライマー２）を設計し、既知の配列を以下のシステム（表１）およびプロセス（表２）に従って増幅し、ＰＣＲ産物を磁気ビーズで精製した。精製されたＰＣＲ産物をスプリットオリゴ（ＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡ）に加え、ＢＧＩＳＥＱ－５００ ＳＥ ５０環化ライブラリー構築キット（ＭＧＩ製）およびプロセスに従って環化ライブラリーを構築し、構築された環化ライブラリーは後の使用のためであった。
１．配列決定ライブラリーの構築
（１）
［００１］ ＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＧＡＡＴＧＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＴＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＴＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡＴＧＡＴＴＡＴＡＧＡＴＡＴＡＴＴＡＡＧＧＡＡＴＡＡＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＣＣＴＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＴＡＡＧＧＧＧＧＴＴＡＡＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣのＤＮＡ配列を設計した。ライブラリーの構築の便宜のため、オリゴ配列（太字フォント）を配列の両端に加え、ＢＧＩＳＥＱ－５００のアダプター配列（網掛け部分）を中央に組み込んだ。斜体で示した太字の部分は、決定すべき配列の最初の１０ｂｐであった。上記の配列はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈによって合成された。配列を無制限に使用するために、合成した配列をｐＵＣ ５７ベクターに組み込み、大腸菌に形質転換した。
［００２］ （２）既知のライブラリーを含む適当量の大腸菌を培養し、プラスミドを抽出した。以下のプライマー対:ＧＡＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴ（プライマー１）、ＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡ（プライマー２）を設計し、既知の配列を以下のシステム（表１）およびプロセス（表２）に従って増幅し、ＰＣＲ産物を磁気ビーズで精製した。精製されたＰＣＲ産物をスプリットオリゴ（ＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡ）に加え、ＢＧＩＳＥＱ－５００ ＳＥ ５０環化ライブラリー構築キット（ＭＧＩ製）およびプロセスに従って環化ライブラリーを構築し、構築された環化ライブラリーは後の使用のためであった。
【表1】
【表2】
【0101】
２．ライブラリー配列の増幅
ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートをThermo Fisher Companyから購入した。１００μｌの１μＭ ５’末端ビオチン修飾プライマーＧ ＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧを、ウェルの一つにおいて室温で３０分間インキュベートし、反応溶液を除去した；上記で構築したライブラリー６ｎｇおよびＢＧＩＳＥＱ－５００キット（ＭＧＩ製）中のＤＮＢ調製緩衝液Ｉ ２０ ｕｌを、上記のビオチン修飾プライマーとのプライマーハイブリダイゼーションのために６０°Ｃで５分間添加し、次いで、ＢＧＩＳＥＱ－５００配列決定キット（ＭＧＩ）中のＤＮＢポリメラーゼＩ ４０ ｕｌおよびＤＮＢポリメラーゼＩＩ ４ ｕｌを添加して、３０°Ｃで６０分間反応させた。その後、反応系を６５°Ｃに加熱して反応を終了し、反応液を慎重に除去した。１００μｌの５ｕＭ配列決定プライマーＧ Ｃ Ｔ ＣＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴＴを添加して、室温で３０分間ハイブリダイゼーション反応を行い、次いで、反応溶液を慎重に除去した。
ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートをThermo Fisher Companyから購入した。１００μｌの１μＭ ５’末端ビオチン修飾プライマーＧ ＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧを、ウェルの一つにおいて室温で３０分間インキュベートし、反応溶液を除去した；上記で構築したライブラリー６ｎｇおよびＢＧＩＳＥＱ－５００キット（ＭＧＩ製）中のＤＮＢ調製緩衝液Ｉ ２０ ｕｌを、上記のビオチン修飾プライマーとのプライマーハイブリダイゼーションのために６０°Ｃで５分間添加し、次いで、ＢＧＩＳＥＱ－５００配列決定キット（ＭＧＩ）中のＤＮＢポリメラーゼＩ ４０ ｕｌおよびＤＮＢポリメラーゼＩＩ ４ ｕｌを添加して、３０°Ｃで６０分間反応させた。その後、反応系を６５°Ｃに加熱して反応を終了し、反応液を慎重に除去した。１００μｌの５ｕＭ配列決定プライマーＧ Ｃ Ｔ ＣＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴＴを添加して、室温で３０分間ハイブリダイゼーション反応を行い、次いで、反応溶液を慎重に除去した。
【0102】
３．シークエンシング
（１）以下に示す４つのｄＮＴＰがＡｃｍｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成され、リンカー１はアジド含有リンカーであり、リンカー２はジスルフィド結合を含有するリンカーであった。
（１）以下に示す４つのｄＮＴＰがＡｃｍｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成され、リンカー１はアジド含有リンカーであり、リンカー２はジスルフィド結合を含有するリンカーであった。
【0103】
【化1】
【0104】
【化2】
【0105】
【化3】
【0106】
【化4】
【0107】
（２）試薬の調製
配列決定反応に必要な以下の試薬を調製した。
重合反応溶液：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ ｍｇ／ｍｌポリメラーゼＢＧ ９（ＢＧＩ）、３ ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、上記４つのｄＮＴＰのそれぞれ１ ｕＭ；
重合緩衝液：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；
溶出緩衝液：５ ＸＳＳＣ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；
自己発光酵素反応液：ＴＢＳＴ緩衝液、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、ＳＡ－ＮａｎｏＫＡＺ－ｇｌｏｗ（ｐｒｏｍｅｇａ）２ ｕｇ／ｍｌ、アンチジゴキシン－Ｇｌｕｃ（８９９０）－フラッシュ２ ｕｇ／ｍｌ；
発光基質溶液：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌおよび０．５ Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液を調製した；５０ Ｘコエレンテラジン（ナノライト）および５０ Ｘコエレンテラジン－ｆ（ナノライト）を１：１の比で混合し、次いで、混合溶液を２ Ｘに希釈した；
切断緩衝液：１０ ｍＭ ＤＴＴ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨを１０ Ｍ ＮａＯＨで９．０に調整した；
切除緩衝液：２０ ｍＭ ＴＨＰＰ、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；
配列決定反応に必要な以下の試薬を調製した。
重合反応溶液：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ ｍｇ／ｍｌポリメラーゼＢＧ ９（ＢＧＩ）、３ ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、上記４つのｄＮＴＰのそれぞれ１ ｕＭ；
重合緩衝液：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；
溶出緩衝液：５ ＸＳＳＣ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；
自己発光酵素反応液：ＴＢＳＴ緩衝液、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、ＳＡ－ＮａｎｏＫＡＺ－ｇｌｏｗ（ｐｒｏｍｅｇａ）２ ｕｇ／ｍｌ、アンチジゴキシン－Ｇｌｕｃ（８９９０）－フラッシュ２ ｕｇ／ｍｌ；
発光基質溶液：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌおよび０．５ Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液を調製した；５０ Ｘコエレンテラジン（ナノライト）および５０ Ｘコエレンテラジン－ｆ（ナノライト）を１：１の比で混合し、次いで、混合溶液を２ Ｘに希釈した；
切断緩衝液：１０ ｍＭ ＤＴＴ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨを１０ Ｍ ＮａＯＨで９．０に調整した；
切除緩衝液：２０ ｍＭ ＴＨＰＰ、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；
【0108】
（３）配列決定プロセスを図１に示す。
ａ．重合：１００μｌのポリメラーゼ反応溶液を増幅ライブラリーを含むウェルに添加し、マイクロプレートリーダーの温度を５５°Ｃに上昇させ、反応を３分間続けて４つのｄＮＴＰを増幅ライブラリーに重合させた。反応溶液を注意深く除去し、次いで溶出反応溶液１００ｕｌを加え、次いで反応溶液を数回穏やかにピペットで吸引し、次いで溶出反応溶液を除去した。
ｂ．発光標識結合：１００ｕｌの自己発光酵素反応溶液１を添加し、３５°Ｃで３０分間インキュベートして、ＳＡ－ＮａｎｏＫＡＺ－ｇｌｏｗをｄＡＴＰ－リンカー１－リンカー２－ビオチンおよびｄＣＴＰ－リンカー１－ビオチンに結合させ、抗ジゴキシン－Ｇｌｕｃ（８９９０）－フラッシュをｄＴＴＰ－リンカー１－ジゴキシンに結合させた。次いで、反応溶液を除去し、次いで溶離液を添加し、穏やかに数回ピペットで注入し、次いで除去した。
ｃ．自己発光検出１：マイクロプレートリーダーのパラメータを設定し、発光基板溶液を添加し、自己発光曲線を検出した。最初の信号の読み出しと記録は、信号曲線グラフに従って行った。２００ｕｌの溶離液を添加し、次いで反応溶液を数回穏やかにピペットで注入し、次いで溶離液を除去した。
ｄ．化学結合開裂：２００μｌの結合開裂緩衝液を添加して３分間反応させ、次いで結合開裂緩衝液を除去した；溶出緩衝液２００μｌで３回洗浄し、溶出液を除去した。
ｅ．自己発光検出２：マイクロプレートリーダのパラメータを設定した後、発光基板溶液を添加し、自己発光強度を試験した後、第２の信号の読み取り及び記録を行った。２００ｕｌの溶離液を添加し、次いで反応溶液を数回穏やかにピペットで注入し、次いで溶離液を除去した。
ｆ．切除：自己発光反応溶液を除去し、溶出緩衝液２００ｕｌを加え、穏やかに数回ピペットで採取した後、除去した。次いで、切除反応液１００μｌを添加して５５°Ｃで３分間反応させた後、切除反応液を除去した。溶出緩衝液２００μｌによる洗浄を３回実施した。
ｇ．ステップａ～ｆを、次の配列決定サイクルのために繰り返した。
ａ．重合：１００μｌのポリメラーゼ反応溶液を増幅ライブラリーを含むウェルに添加し、マイクロプレートリーダーの温度を５５°Ｃに上昇させ、反応を３分間続けて４つのｄＮＴＰを増幅ライブラリーに重合させた。反応溶液を注意深く除去し、次いで溶出反応溶液１００ｕｌを加え、次いで反応溶液を数回穏やかにピペットで吸引し、次いで溶出反応溶液を除去した。
ｂ．発光標識結合：１００ｕｌの自己発光酵素反応溶液１を添加し、３５°Ｃで３０分間インキュベートして、ＳＡ－ＮａｎｏＫＡＺ－ｇｌｏｗをｄＡＴＰ－リンカー１－リンカー２－ビオチンおよびｄＣＴＰ－リンカー１－ビオチンに結合させ、抗ジゴキシン－Ｇｌｕｃ（８９９０）－フラッシュをｄＴＴＰ－リンカー１－ジゴキシンに結合させた。次いで、反応溶液を除去し、次いで溶離液を添加し、穏やかに数回ピペットで注入し、次いで除去した。
ｃ．自己発光検出１：マイクロプレートリーダーのパラメータを設定し、発光基板溶液を添加し、自己発光曲線を検出した。最初の信号の読み出しと記録は、信号曲線グラフに従って行った。２００ｕｌの溶離液を添加し、次いで反応溶液を数回穏やかにピペットで注入し、次いで溶離液を除去した。
ｄ．化学結合開裂：２００μｌの結合開裂緩衝液を添加して３分間反応させ、次いで結合開裂緩衝液を除去した；溶出緩衝液２００μｌで３回洗浄し、溶出液を除去した。
ｅ．自己発光検出２：マイクロプレートリーダのパラメータを設定した後、発光基板溶液を添加し、自己発光強度を試験した後、第２の信号の読み取り及び記録を行った。２００ｕｌの溶離液を添加し、次いで反応溶液を数回穏やかにピペットで注入し、次いで溶離液を除去した。
ｆ．切除：自己発光反応溶液を除去し、溶出緩衝液２００ｕｌを加え、穏やかに数回ピペットで採取した後、除去した。次いで、切除反応液１００μｌを添加して５５°Ｃで３分間反応させた後、切除反応液を除去した。溶出緩衝液２００μｌによる洗浄を３回実施した。
ｇ．ステップａ～ｆを、次の配列決定サイクルのために繰り返した。
【0109】
（４）シークエンシング結果
ａ．１０ｂｐの配列決定シグナル曲線を図２に示す。
ｂ．シークエンシング結果の分析：
全サイクルの信号変化曲線を比較した。図に示すように、各サイクルの信号低下の形態に応じて、次のように決定することができる。
ヌクレオチドＡ：第２サイクル、第５サイクル、第８サイクル；
ヌクレオチドＴ：第１サイクル、第４サイクル、第７サイクル；
ヌクレオチドＣ：第３サイクル、第６サイクル、第９サイクル；
ヌクレオチドＧ：第１０サイクル；
配列決定すべきライブラリー：ＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧの最初の１０ｂｐ塩基配列と一致した。
ａ．１０ｂｐの配列決定シグナル曲線を図２に示す。
ｂ．シークエンシング結果の分析：
全サイクルの信号変化曲線を比較した。図に示すように、各サイクルの信号低下の形態に応じて、次のように決定することができる。
ヌクレオチドＡ：第２サイクル、第５サイクル、第８サイクル；
ヌクレオチドＴ：第１サイクル、第４サイクル、第７サイクル；
ヌクレオチドＣ：第３サイクル、第６サイクル、第９サイクル；
ヌクレオチドＧ：第１０サイクル；
配列決定すべきライブラリー：ＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧの最初の１０ｂｐ塩基配列と一致した。
【0110】
実施例２
１．配列決定ライブラリーの構築
（１）
［００３］ ＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＧＡＡＴＧＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＴＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＴＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡＴＧＡＴＴＡＴＡＧＡＴＡＴＡＴＴＡＡＧＧＡＡＴＡＡＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＣＣＴＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＴＡＡＧＧＧＧＧＴＴＡＡＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣのＤＮＡ配列を設計した。ライブラリーの構築の便宜のため、オリゴ配列（太字フォント）を配列の両端に加え、ＢＧＩＳＥＱ－５００のアダプター配列（網掛け部分）を中央に組み込んだ。斜体で示した太字の部分は、決定すべき配列の最初の１０ｂｐであった。上記の配列はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈによって合成された。配列を無制限に使用するために、合成した配列をｐＵＣ ５７ベクターに組み込み、大腸菌に形質転換した。
［００４］ （２）既知のライブラリーを含む適当量の大腸菌を培養し、プラスミドを抽出した。以下のプライマー対：ＧＡＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴ（プライマー１）、ＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡ（プライマー２）を設計し、既知の配列を以下のシステム（表１）およびプロセス（表２）に従って増幅し、ＰＣＲ産物を磁気ビーズで精製した。精製されたＰＣＲ産物をスプリットオリゴ（ＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡ）に加え、ＢＧＩＳＥＱ－５００ ＳＥ ５０環化ライブラリー構築キット（ＭＧＩ製）およびプロセスに従って環化ライブラリーを構築し、構築された環化ライブラリーは後の使用のためであった。
１．配列決定ライブラリーの構築
（１）
［００３］ ＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＧＡＡＴＧＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＴＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＴＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡＴＧＡＴＴＡＴＡＧＡＴＡＴＡＴＴＡＡＧＧＡＡＴＡＡＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＣＣＴＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＴＡＡＧＧＧＧＧＴＴＡＡＴＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣのＤＮＡ配列を設計した。ライブラリーの構築の便宜のため、オリゴ配列（太字フォント）を配列の両端に加え、ＢＧＩＳＥＱ－５００のアダプター配列（網掛け部分）を中央に組み込んだ。斜体で示した太字の部分は、決定すべき配列の最初の１０ｂｐであった。上記の配列はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈによって合成された。配列を無制限に使用するために、合成した配列をｐＵＣ ５７ベクターに組み込み、大腸菌に形質転換した。
［００４］ （２）既知のライブラリーを含む適当量の大腸菌を培養し、プラスミドを抽出した。以下のプライマー対：ＧＡＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴ（プライマー１）、ＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡ（プライマー２）を設計し、既知の配列を以下のシステム（表１）およびプロセス（表２）に従って増幅し、ＰＣＲ産物を磁気ビーズで精製した。精製されたＰＣＲ産物をスプリットオリゴ（ＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＡＴＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡ）に加え、ＢＧＩＳＥＱ－５００ ＳＥ ５０環化ライブラリー構築キット（ＭＧＩ製）およびプロセスに従って環化ライブラリーを構築し、構築された環化ライブラリーは後の使用のためであった。
【表3】
【表4】
【0111】
２．ライブラリー配列の増幅
ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートをThermo Fisher Companyから購入した。１００μｌの１μＭ ５’末端ビオチン修飾プライマーＧ ＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧを、ウェルの一つにおいて室温で３０分間インキュベートし、反応溶液を除去した；上記で構築したライブラリー６ｎｇおよびＢＧＩＳＥＱ－５００キット（ＭＧＩ製）中のＤＮＢ調製緩衝液Ｉ ２０ ｕｌを、上記のビオチン修飾プライマーとのプライマーハイブリダイゼーションのために６０°Ｃで５分間添加し、次いで、ＢＧＩＳＥＱ－５００配列決定キット（ＭＧＩ）中のＤＮＢポリメラーゼＩ ４０ ｕｌおよびＤＮＢポリメラーゼＩＩ ４ ｕｌを添加して、３０°Ｃで６０分間反応させた。その後、反応系を６５°Ｃに加熱して反応を終了し、反応液を慎重に除去した。１００μｌの５ｕＭ配列決定プライマーＧ Ｃ Ｔ ＣＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴＴを添加して、室温で３０分間ハイブリダイゼーション反応を行い、次いで、反応溶液を慎重に除去した。
ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートをThermo Fisher Companyから購入した。１００μｌの１μＭ ５’末端ビオチン修飾プライマーＧ ＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧを、ウェルの一つにおいて室温で３０分間インキュベートし、反応溶液を除去した；上記で構築したライブラリー６ｎｇおよびＢＧＩＳＥＱ－５００キット（ＭＧＩ製）中のＤＮＢ調製緩衝液Ｉ ２０ ｕｌを、上記のビオチン修飾プライマーとのプライマーハイブリダイゼーションのために６０°Ｃで５分間添加し、次いで、ＢＧＩＳＥＱ－５００配列決定キット（ＭＧＩ）中のＤＮＢポリメラーゼＩ ４０ ｕｌおよびＤＮＢポリメラーゼＩＩ ４ ｕｌを添加して、３０°Ｃで６０分間反応させた。その後、反応系を６５°Ｃに加熱して反応を終了し、反応液を慎重に除去した。１００μｌの５ｕＭ配列決定プライマーＧ Ｃ Ｔ ＣＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＴＴを添加して、室温で３０分間ハイブリダイゼーション反応を行い、次いで、反応溶液を慎重に除去した。
【0112】
（１）以下に示す４つのｄＮＴＰがＡｃｍｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成され、リンカー１はアジド含有リンカーであり、リンカー２はシス－アコニット酸無水物を含有するリンカーであった。
【0113】
【化5】
【0114】
【化6】
【0115】
【化7】
【0116】
【化8】
【0117】
（２）試薬の調製
配列決定反応に必要な以下の試薬を調製した。
重合反応溶液：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ ｍｇ／ｍｌポリメラーゼＢＧ ９ （ＢＧＩ） 、３ ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、上記４つのｄＮＴＰのそれぞれ１ ｕＭ；
重合緩衝液：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；
溶出緩衝液：５ ＸＳＳＣ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；
自己発光酵素反応液：ＴＢＳＴ緩衝液、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、ＳＡ－Ｇｌｕｃ（Ｍ ２）－ｇｌｏｗ（ナノライト）２ ｕｇ／ｍｌ、アンチジゴキシン－Ｇｌｕｃ（８９９０）－ｆｌａｓｈ；
発光基質溶液：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌおよび０．５ Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液を調製した；５０ Ｘコエレンテラジン（ナノライト）を緩衝液に溶解して３ Ｘ；
開裂緩衝液：ｐＨ ３．５、５０ ｍＭ ＰＢＳ緩衝液；
切除緩衝液：２０ ｍＭ ＴＨＰＰ、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；
配列決定反応に必要な以下の試薬を調製した。
重合反応溶液：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２ ｍｇ／ｍｌポリメラーゼＢＧ ９ （ＢＧＩ） 、３ ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、上記４つのｄＮＴＰのそれぞれ１ ｕＭ；
重合緩衝液：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；
溶出緩衝液：５ ＸＳＳＣ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；
自己発光酵素反応液：ＴＢＳＴ緩衝液、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、ＳＡ－Ｇｌｕｃ（Ｍ ２）－ｇｌｏｗ（ナノライト）２ ｕｇ／ｍｌ、アンチジゴキシン－Ｇｌｕｃ（８９９０）－ｆｌａｓｈ；
発光基質溶液：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌおよび０．５ Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液を調製した；５０ Ｘコエレンテラジン（ナノライト）を緩衝液に溶解して３ Ｘ；
開裂緩衝液：ｐＨ ３．５、５０ ｍＭ ＰＢＳ緩衝液；
切除緩衝液：２０ ｍＭ ＴＨＰＰ、０．５ Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０；
【0118】
（３）配列決定プロセスを図１に示す。
ａ．重合：１００μｌのポリメラーゼ反応溶液を増幅ライブラリーを含むウェルに添加し、マイクロプレートリーダーの温度を６０°Ｃに上昇させ、反応を３分間続けて４つのｄＮＴＰを増幅ライブラリーに重合させた。反応溶液を注意深く除去し、次いで溶出反応溶液１００ｕｌを加え、次いで反応溶液を数回穏やかにピペットで吸引し、次いで溶出反応溶液を除去した。
ｂ．発光標識結合：１００ｕｌの自己発光酵素反応溶液１を添加し、３５°Ｃで３０分間インキュベートして、ＳＡ－Ｇｌｕｃ（Ｍ ２）－ｇｌｏｗをｄＡＴＰ－リンカー１－リンカー２－ビオチンおよびｄＣＴＰ－リンカー１－ビオチンに結合させ、抗－ジゴキシン－Ｇｌｕｃ（８９９０）－ｆｌａｓｈをｄＴＴＰ－リンカー１－ジゴキシンに結合させた。次いで、反応溶液を除去し、次いで溶離液を添加し、穏やかに数回ピペットで注入し、次いで除去した。
ｃ．自己発光検出１：マイクロプレートリーダーのパラメータを設定し、発光基板溶液を添加し、自己発光曲線を検出した。最初の信号の読み出しと記録は、信号曲線グラフに従って行った。２００ｕｌの溶離液を添加し、穏やかに数回ピペットで注入し、次いで除去した。
ｄ．化学結合開裂：２００μｌの結合開裂緩衝液を添加して３０分間反応させ、次いで、結合開裂緩衝液を除去した；溶出緩衝液２００μｌで３回洗浄し、溶出液を除去した。
ｅ．自己発光検出２：マイクロプレートリーダのパラメータを設定した後、発光基板溶液を添加し、自己発光強度を試験した後、第２の信号の読み取り及び記録を行った。２００ｕｌの溶離液を添加し、次いで反応溶液を数回穏やかにピペットで注入し、次いで溶離液を除去した。
ｆ．切除：自己発光反応溶液を除去し、溶出緩衝液２００ｕｌを加え、穏やかに数回ピペットで採取した後、除去した。次いで、切除反応液１００μｌを添加して６０°Ｃで３分間反応させた後、切除反応液を除去した。溶出緩衝液２００μｌによる洗浄を３回実施した。
ｇ．ステップａ～ｆを、次の配列決定サイクルのために繰り返した。
ａ．重合：１００μｌのポリメラーゼ反応溶液を増幅ライブラリーを含むウェルに添加し、マイクロプレートリーダーの温度を６０°Ｃに上昇させ、反応を３分間続けて４つのｄＮＴＰを増幅ライブラリーに重合させた。反応溶液を注意深く除去し、次いで溶出反応溶液１００ｕｌを加え、次いで反応溶液を数回穏やかにピペットで吸引し、次いで溶出反応溶液を除去した。
ｂ．発光標識結合：１００ｕｌの自己発光酵素反応溶液１を添加し、３５°Ｃで３０分間インキュベートして、ＳＡ－Ｇｌｕｃ（Ｍ ２）－ｇｌｏｗをｄＡＴＰ－リンカー１－リンカー２－ビオチンおよびｄＣＴＰ－リンカー１－ビオチンに結合させ、抗－ジゴキシン－Ｇｌｕｃ（８９９０）－ｆｌａｓｈをｄＴＴＰ－リンカー１－ジゴキシンに結合させた。次いで、反応溶液を除去し、次いで溶離液を添加し、穏やかに数回ピペットで注入し、次いで除去した。
ｃ．自己発光検出１：マイクロプレートリーダーのパラメータを設定し、発光基板溶液を添加し、自己発光曲線を検出した。最初の信号の読み出しと記録は、信号曲線グラフに従って行った。２００ｕｌの溶離液を添加し、穏やかに数回ピペットで注入し、次いで除去した。
ｄ．化学結合開裂：２００μｌの結合開裂緩衝液を添加して３０分間反応させ、次いで、結合開裂緩衝液を除去した；溶出緩衝液２００μｌで３回洗浄し、溶出液を除去した。
ｅ．自己発光検出２：マイクロプレートリーダのパラメータを設定した後、発光基板溶液を添加し、自己発光強度を試験した後、第２の信号の読み取り及び記録を行った。２００ｕｌの溶離液を添加し、次いで反応溶液を数回穏やかにピペットで注入し、次いで溶離液を除去した。
ｆ．切除：自己発光反応溶液を除去し、溶出緩衝液２００ｕｌを加え、穏やかに数回ピペットで採取した後、除去した。次いで、切除反応液１００μｌを添加して６０°Ｃで３分間反応させた後、切除反応液を除去した。溶出緩衝液２００μｌによる洗浄を３回実施した。
ｇ．ステップａ～ｆを、次の配列決定サイクルのために繰り返した。
【0119】
（４）シークエンシング結果
ａ．１０ｂｐの配列決定シグナル曲線を図３に示す。
ｂ．シークエンシング結果の分析：
全サイクルの信号変化曲線を比較した。図に示すように、各サイクルの信号低下の形態に応じて、次のように決定することができる。
ヌクレオチドＡ：第２サイクル、第５サイクル、第８サイクル；
ヌクレオチドＴ：第１サイクル、第４サイクル、第７サイクル；
ヌクレオチドＣ：第３サイクル、第６サイクル、第９サイクル；
ヌクレオチドＧ：第１０サイクル；
配列決定すべきライブラリー：ＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧの最初の１０ｂｐ塩基配列と一致した。
ａ．１０ｂｐの配列決定シグナル曲線を図３に示す。
ｂ．シークエンシング結果の分析：
全サイクルの信号変化曲線を比較した。図に示すように、各サイクルの信号低下の形態に応じて、次のように決定することができる。
ヌクレオチドＡ：第２サイクル、第５サイクル、第８サイクル；
ヌクレオチドＴ：第１サイクル、第４サイクル、第７サイクル；
ヌクレオチドＣ：第３サイクル、第６サイクル、第９サイクル；
ヌクレオチドＧ：第１０サイクル；
配列決定すべきライブラリー：ＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧの最初の１０ｂｐ塩基配列と一致した。
【図1】
【図2】
【図3】
