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特許7523541生体内における持続時間が延長された多機能性多重特異性マルチマー生体分子重合体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-18
(45)【発行日】2024-07-26
(54)【発明の名称】生体内における持続時間が延長された多機能性多重特異性マルチマー生体分子重合体
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240719BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240719BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240719BHJP
C07K 14/76 20060101ALI20240719BHJP
C07K 14/79 20060101ALI20240719BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C07K14/47 ZNA
C12P21/02 C
C07K14/76
C07K14/79
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2022530933
(86)(22)【出願日】2020-11-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-07
(86)【国際出願番号】 KR2020017029
(87)【国際公開番号】W WO2021107660
(87)【国際公開日】2021-06-03
【審査請求日】2022-05-26
(31)【優先権主張番号】10-2019-0154945
(32)【優先日】2019-11-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】520468047
【氏名又は名称】ワンジーン バイオテクノロジー インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100154988
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 真知
(72)【発明者】
【氏名】パク ソンジン
(72)【発明者】
【氏名】イム デソン
(72)【発明者】
【氏名】キム リュリュン
(72)【発明者】
【氏名】キム ミンスム
(72)【発明者】
【氏名】チェ ジェヨン
【審査官】大西 隆史
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５２０７３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５１９７１６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００９／００９７７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１４－０９０７２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００３－５３５１６５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／０３０１３９３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】岩井 一宏，直鎖状ポリユビキチン鎖の発見とその機能，生化学，2012年，Vol. 84(11)，pp. 920-930
【文献】坂田 絵理 ほか，細胞の中の不要なタンパク質に目印をつける仕組み，日本結晶学会誌，Vol. 52，2010年，pp. 255-261
【文献】QIAN, Shu-Bing et al.，The Journal of Biological Chemistry，2002年10月11日，Vol. 277，No. 41，pp. 38818-38826，DOI: 10.1074/jbc.M205547200
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも２つのユビキチンが共有結合して形成されたポリユビキチン・スキャフォールド、及び異なる結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）に対する特異的な結合部分（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を有する２～１０個の生体分子を含む、多機能性多重特異性マルチマー生体分子複合体であって、前記生体分子が、他の生体分子と特異的に結合する活性部位（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ）を有し、前記ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に直接結合されるか、あるいはリンカーによって前記ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に結合され、
前記生体分子が、タンパク質であり、
前記生体分子の生体内における安定性及び持続時間を延長するキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）が、前記ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に直接結合されるか、あるいはリンカーによって前記ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に結合されており、
前記生体分子及び前記キャリアが、同じ末端に結合されておらず、
前記キャリアが、アルブミン、Ｆｃドメイン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ（ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｅｘａｃｔ ｒｅｐｅａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＣＴＰ（ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＰＡＳ（ｐｒｏｌｉｎｅ－ａｌａｎｉｎｅ－ｓｅｒｉｎｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）、ＥＬＫ（ｅｌａｓｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＨＡＰ（ｈｏｍｏ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｏｌｙｍｅｒ）、及びＧＬＫ（ｇｅｌａｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つである、多機能性多重特異性マルチマー生体分子複合体。
【請求項2】
前記リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＥＡＡＡＫが１～３０個繰り返し組み合わせられている、請求項１に記載の多機能性多重特異性マルチマー生体分子複合体。
【請求項3】
前記ユビキチンのＮ末端に結合された生体分子が、前記マルチマー生体分子複合体の遠位端（ｄｉｓｔａｌ ｅｎｄ）である、請求項１または２に記載の多機能性多重特異性マルチマー生体分子複合体。
【請求項4】
前記ユビキチンのＣ末端またはＮ末端、またはその両方に結合された生体分子が、マルチマー生体分子複合体の近位端（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｅｎｄ）である、請求項１または２に記載の多機能性多重特異性マルチマー生体分子複合体。
【請求項5】
前記ポリユビキチン・スキャフォールドは、ユビキチンの少なくとも１つのリジンが、アルギニンまたはアラニンを含む他のアミノ酸で置換されている供与体ユビキチンと、Ｎ末端から６番目、１１番目、２７番目、２９番目、３３番目、４８番目、または６３番目のリジンがアルギニンまたはアラニンを含む他のアミノ酸で置換されている受容体ユビキチンとが共有結合によって連結されて形成されている、請求項１または２に記載の多機能性多重特異性マルチマー生体分子複合体。
【請求項6】
前記ユビキチンのＮ末端から７３番目のロイシンが、プロリンを含む他のアミノ酸で置換されている、請求項１または２に記載の多機能性多重特異性マルチマー生体分子複合体。
【請求項7】
前記生体分子が、インスリン、インスリン類似体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類、ＧＬＰ－１及びグルカゴン二重アゴニスト、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ二重アゴニスト、ＧＬＰ－１及びグルカゴン及びＧＩＰ三重アゴニスト、エキセンディン－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）、エキセンディン－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）類似体、インスリン分泌ペプチド及びその類似体、ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、抗肥満ペプチド、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｌｐｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、レプチン、ＧＩＰ（Ｇａｓｔｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、インターロイキン結合タンパク質類、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α－１アンチトリプシン、アルブミン、α－ラクトアルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、赤血球生成因子（ＥＰＯ）、高グリコシル化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子及び第ＸＩＩＩ因子、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン－結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ－反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドジスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、神経成長因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、副腎皮質ホルモン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体、受容体拮抗物質、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、アディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、インターロイキン受容体拮抗薬（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片類からなる群から選択される、請求項１または２に記載の多機能性多重特異性マルチマー生体分子複合体。
【請求項8】
（ｉ）ユビキチンのＣ末端タグ（ｔａｇ）が融合またはリンカーによって結合された生体分子（ｂｉｏ－ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を原核細胞または真核細胞包含宿主細胞から組換え発現させること、及び（ｉｉ）前記宿主細胞の溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ）または精製産物に、ユビキチン化のためのＥ１、Ｅ２及びＥ３酵素、またはＥ１及びＥ２酵素を加えて反応させることを含み、
ポリユビキチン・スキャフォールド、異なる結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）に対する特異的な結合部分（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を有する少なくとも２個の生体分子、及び生体内における持続時間を延長するキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）がユビキチンのＮ末端またはＣ末端に直接またはリンカーで前記ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に結合されている、多機能性多重特異性マルチマー生体分子複合体を製造する方法であって、
前記ポリユビキチン・スキャフォールドは、少なくとも２つのユビキチンが共有結合によって連結されて形成され、
前記生体分子が、２～１０個の生体分子から構成され、他の生体分子と特異的に結合する活性部位（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ）を有し、前記ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方にリンカーで結合されており、
前記生体分子及び前記キャリアが、同じ末端に結合されておらず、
前記生体分子が、タンパク質であり、
前記キャリアが、アルブミン、抗体断片、Ｆｃドメイン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ（ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｅｘａｃｔ ｒｅｐｅａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＣＴＰ（ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＰＡＳ（ｐｒｏｌｉｎｅ－ａｌａｎｉｎｅ－ｓｅｒｉｎｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）、ＥＬＫ（ｅｌａｓｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＨＡＰ（ｈｏｍｏ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｏｌｙｍｅｒ）、及びＧＬＫ（ｇｅｌａｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つである、多機能性多重特異性マルチマー生体分子複合体を製造する方法。
【請求項9】
前記Ｅ２酵素が、ユビキチンのＮ末端から６番目、１１番目、２７番目、２９番目、３３番目、４８番目または６３番目のリジンと結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記Ｅ２酵素が、Ｅ２－２５Ｋユビキチン結合（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）酵素である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項11】
前記Ｅ２酵素が、ユビキチン結合酵素複合体であるＵｃｂ１３－ＭＭＳ２である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項12】
前記ユビキチンのＣ末端タグは、少なくとも２つのユビキチンがヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ）状または分岐状（ｂｒａｎｃｈｅｄ ｔｙｐｅ ｏｒ ｉｓｏ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｒａｎｃｈ ｔｙｐｅ）の形態で繰り返し連結されている、請求項８または９に記載の方法。
【請求項13】
前記ヘッドトゥーテール状または分岐状で連結されたユビキチンが、Ｎ末端から７５番目及び７６番目のグリシンがバリンを含む他のアミノ酸で置換されている、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質を含む生体分子をマルチマー形態の重合体として製造する方法に関する。具体的に、本発明は、宿主細胞から組換え発現させた生体分子を、ユビキチン化システムを用いて延長された生体内における持続時間を有する多機能性多重特異性生体分子重合体として製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）、ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）、ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）及び／または小分子化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）をマルチマー形態（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍ）に製作することは、様々なメリットを有する。例えば、２以上の同種または異種のタンパク質を融合（ｆｕｓｉｏｎ）したり、あるいは架橋剤（ｃｒｏｓｓ ｌｉｎｋｅｒ ｏｒ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を用いて結合したりすることにより、タンパク質の溶解性、ゲル化、熱安定性及びｐＨ安定性などの物理化学的な特性を改善することができる。例えば、架橋剤を介して多重結合されて形成されたラッカーゼ（ｌａｃｃａｓｅ）、クレア（ＣＬＥＡ；ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）は、澱粉の酸化の際により一層向上した安定性と性能を示し、他の酵素であるニトリルヒドラターゼ（ｎｉｔｒｉｌｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ）のクレア（ＣＬＥＡ）は、アクリロニトリル（ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）のアクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）への転換に卓越した活性の増加を示し、３６回にわたって再活用される間に活性を失わなかった。
【0003】
また、多くのタンパク質は、細胞内において複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成して複雑な機能を果たし、これは、タンパク質の近接効果（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｅｆｆｅｃｔ）によることが知られている。例えば、リグノセルロース（ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）の分解に必要な酵素であるセルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、β－グルコシダーゼ（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）、ヘミセルラーゼ（Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅ）などを、スキャフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を用いて複合混合物の形態で製造したセルラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｃｅｌｌｉｃ（登録商標） ＣＴｅｃ３）は、リグノセルロース（ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）の分解に際して３．５倍以上増加した効果を示すことが知られている。また、このようなマルチマー形態のタンパク質は、チャネリング効果（ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）を示す。すなわち、カップリング反応（ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）に関与する酵素が隣り合って存在すれば、中間体の伝達が効率よく行われて反応全体の効率が大きく向上する。また、ビード（ｂｅａｄ）もしくは基板（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に固定化されたタンパク質を用いて任意の物質を分析したり、検出の対象となる物質を分離及び／または精製したりするに当たっても、同種または異種のタンパク質をマルチマーの形態で用いることは、これの効率性の向上のために望ましいことが提案されている。
【0004】
このように、マルチマー形態のタンパク質が産業的及び医薬的な用途において様々なメリットを与えるにも拘わらず、このような構造のタンパク質を製作することは困難であることが知られている。例えば、マルチマータンパク質を遺伝子段階においてインフレーム（ｉｎ－ｆｒａｍｅ）で設計して新たなフュージョン酵素として開発・産生する方法が挙げられる。しかしながら、新たなタンパク質を設計して産生せねばならないため、開発時間が長引き、現実的に少なくとも２つの酵素を融合することは困難である。さらに、化学的な架橋剤（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ）を用いたタンパク質マルチマー構造体（ＣＬＥＡ）の製作方法の場合には、化学的な結合が特定の部位において起こらず、タンパク質の表面のどこでも起こり兼ねないため、活性を阻害することがある。マルチマー構造を形成するタンパク質を合成または微生物の発現で製造できること、かつ、これらのタンパク質の活性部位（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ）が妨げられないことが求められる。
【0005】
目的タンパク質を分離及び／または精製するための方法として、ユビキチンを用いる方法が提案されている。まず、ユビキチンと結合されたタンパク質をエンコード（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）する遺伝子を原核細胞（ｐｒｏｃａｒｙｏｔｉ ｃｃｅｌｌｓ）において発現させてユビキチンと結合された融合タンパク質を製造し、これをユビキチン切断酵素で処理して目的タンパク質のみをユビキチン融合タンパク質から有効に分離及び精製する方法である。特許文献１には、組換え遺伝子の発現及び発現済みのタンパク質の精製に関するものであり、ユビキチン様タンパク質（Ｕｂｌ）のＣ末端ドメインをエンコードするヌクレオチドが目的タンパク質をエンコードするヌクレオチドに動作可能なように（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）結合された融合タンパク質を製造し、これを宿主細胞において発現させることが開示されている。特許文献２には、組換えタンパク質を発現させるに当たって、ユビキチンを融合パートナーとして用いることが開示されている。また、特許文献３には、タンパク質の精製にユビキチンカラムを用いることに関するものであり、ポリユビキチン鎖をカラムに搬入し、Ｅ２を含むｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化を用いてタンパク質を精製することが開示されている。さらに、特許文献４には、組換えタンパク質を発現させて製造するに当たっての問題点である水溶性とフォルディング（折り畳み）の問題を解決するためのものであり、組換えタンパク質の発現及び分離、精製を容易にし、かつ、タンパク質の活性を高めるために、Ｕｌｐ１プロテアーゼ（Ｕｂｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ１）により認識される切断部位を有するＳＵＭＯを用いることが開示されている。しかしながら、これらの方法は、タンパク質の発現にユビキチンを用いることについて開示していることに留まり、マルチマー形態のタンパク質を製造することについて記述したり示唆したりしてはおらず、分離・精製しようとするタンパク質がユビキチンとランダムに結合するため、依然として分離または分析効率に限界を有する。
【0006】
その一方で、生体分子、例えば、タンパク質またはペプチド、または組換え産生されたタンパク質またはペプチドは、血清半減期の短い不安定な分子である。特に、これらのタンパク質またはペプチドは、診断または治療目的で水溶液中で製造された場合、非常に不安定である。さらに、そのようなタンパク質またはペプチド薬物は、生体内における短い血清半減期のために不利であり、高い頻度またはより高い用量で投与されなければならない。しかしながら、薬物の頻繁な投与は様々な種類の副作用を引き起こし、患者に不都合が生じる。例えば、薬物の頻繁な投与が必要な患者、例えば、糖尿病患者または多発性硬化症を患っている患者に発生する問題が広く知られている。このような生体分子のｉｎ ｖｉｖｏ安定性を高めるか、あるいは半減期を延長するための様々な方法が研究されてきた。その一例として、タンパク質またはペプチドなどの生体分子に半減期を増加させることができる成分を共有的に付着させることが挙げられる。例えば、ポリエチレングリコールまたはＰＥＧなどの重合体をポリペプチドに結合させることで、これらのペプチドの血清半減期を延ばせることは広く知られている。
【0007】
そこで、本発明者らは、タンパク質の活性が阻害されることなく、高い集積度を有し、延長された生体内における持続時間または半減期を有する多機能性多重特異性生体分子重合体を製造する方法を開発すべく鋭意努力した。その結果、ユビキチンと結合された生体分子を宿主細胞から組換え発現させ、それをユビキチン化に関わる酵素とｉｎ ｖｉｔｒｏで反応させ、ポリユビキチン・スキャフォールドに結合された多機能性マルチマー生体分子重合体を形成することにより本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】米国特許出願第１０／５０４，７８５号明細書
【文献】大韓民国特許出願第１０－２００５－００５０８２４号
【文献】大韓民国特許出願第１０－２０１５－０１２０８５２号
【文献】米国特許出願第１２／２４９，３３４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
このように、本発明は、目的の生体分子をポリユビキチン・スキャフォールドに結合させ、生体内における持続時間が延長された多機能性多重特異性生体分子（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を提供することを目的とする。
【0010】
本発明は、目的の生体分子をポリユビキチン・スキャフォールドに結合させ、生体内における持続時間が延長された多機能性多重特異性生体分子を製造する方法を提供することを他の目的とする。
【0011】
本発明は、前記多機能性多重特異性生体分子を含む薬学組成物を提供することを他の目的とする。
【0012】
本発明は、前記多機能性多重特異性生体分子を含む薬学組成物を製造する方法を提供することをさらに他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0013】
前記目的を達成するために、本発明は、少なくとも２つのユビキチンが共有結合して形成されたポリユビキチン・スキャフォールド、及び異なる結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）に対する特異的な結合部分（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を有する２～１０個の生体分子からなる多機能性多重特異性生体分子重合体であって、前記生体分子が、他の生体分子、低分子化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）またはナノ粒子と特異的に結合する活性部位（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ）を有し、前記ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方に直接結合されるか、あるいはリンカーによって結合され、前記生体分子の生体内における安定性及び／または持続時間を延長するキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）が、前記ユビキチンのＮ末端またはＣ末端に直接結合されるか、あるいはリンカーによって結合されている、多機能性多重特異性マルチマー生体分子重合体（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）を提供する。
【0014】
それに係る一実施例において、前記リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＥＡＡＡＫが１～３０個繰り返し組み合わせられてもよいが、それらに制限されるものではない。それに係る別の一実施例において、前記ユビキチンのＮ末端に結合された生体分子が、前記マルチマー生体分子重合体の遠位端（ｄｉｓｔａｌ ｅｎｄ）であってもよく、前記ユビキチンのＣ末端またはＮ末端、またはその両方に結合された生体分子が、マルチマー生体分子重合体の近位端（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｅｎｄ）であってもよい。
【0015】
本発明において、「重合体」は、一緒に連結された一連の生体分子のモノマー群を意味する。重合体は、線状または分岐状（分岐形態）であってもよい。重合体が分枝状であると、各重合体鎖は「重合体アーム（ａｒｍ）」と呼ばれることがある。開始剤部分（ｍｏｉｅｔｙ）に連結された重合体アームの末端は近位端（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｅｎｄ）であり、重合体アームの成長する鎖の末端は遠位端（ｄｉｓｔａｌ ｅｎｄ）である。
【0016】
本発明において「リンカー」とは、２つの基を一緒に連結する化学部分を意味する。リンカーは分解性または非分解性であってもよい。分解性リンカーは、その中でも加水分解性、酵素的分解性、ｐＨ感受性、光不安定性、またはジスルフィドリンカーであってもよい。他のリンカーには、同種二機能性及び異種二機能性リンカーが含まれる。
【0017】
本発明の一実施例において、前記キャリアは、生体分子の生体内における持続時間を延長する機能を果たすものであり、アルブミン、抗体断片、Ｆｃ ｄｏｍａｉｎ、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、ＸＴＥＮ（ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｅｘａｃｔ ｒｅｐｅａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ＣＴＰ（ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＰＡＳ（ｐｒｏｌｉｎｅ－ａｌａｎｉｎｅ－ｓｅｒｉｎｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）、ＥＬＫ（ｅｌａｓｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＨＡＰ（ｈｏｍｏ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｏｌｙｍｅｒ）、ＧＬＫ（ｇｅｌａｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＰＥＧ（ｐｏｌｙ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、及び脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）からなる群から選択される少なくとも１つであってもよいが、それらに制限されるものではない。
【0018】
本発明の他の一実施例において、前記ポリユビキチン・スキャフォールドは、ユビキチンの少なくとも１つのリジンが、アルギニンまたはアラニンを含む他のアミノ酸で置換されている供与体ユビキチンと、Ｎ末端から６番目、１１番目、２７番目、２９番目、３３番目、４８番目、または６３番目のリジンがアルギニンまたはアラニンを含む他のアミノ酸で置換されている受容体ユビキチンとが共有結合によって連結されて形成されていてもよい。さらに、本発明のまた他の一実施例において、前記ユビキチンのＮ末端から７３番目のロイシンが、プロリンを含む他のアミノ酸で置換されていてもよい。
【0019】
本発明における「生体分子」とは、生体内で生物学的活性を有する分子を意味する。本発明の一実施例において、前記生体分子は、インスリン、インスリン類似体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類、ＧＬＰ－１及びグルカゴン二重アゴニスト、ＧＬＰ－１及びＧＩＰ二重アゴニスト、ＧＬＰ－１及びグルカゴン及びＧＩＰ三重アゴニスト、エキセンディン－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）、エキセンディン－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）類似体、インスリン分泌ペプチド及びその類似体、ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、抗肥満ペプチド、Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｌｐｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、レプチン、ＧＩＰ（Ｇａｓｔｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、インターロイキン結合タンパク質類、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α－１アンチトリプシン、アルブミン、α－ラクトアルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、赤血球生成因子（ＥＰＯ）、高グリコシル化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、クロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子及び第ＸＩＩＩ因子、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン－結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ－反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドジスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、神経成長因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、副腎皮質ホルモン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体、受容体拮抗物質、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、アディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、インターロイキン受容体拮抗薬（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及び抗体断片類からなる群から選択されてもよい。
【0020】
本発明において、「結合部位」とは、他の物質または成分と結合する部位を意味し、「結合部分」とは、他の物質または成分と結合可能な部分を含む成分を意味する。また、本発明において、「活性部位」とは、リガンドまたは受容体と反応して活性を誘発する部位を意味する。
【0021】
また、ＵＣＴ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔａｇ）は、ユビキチンのＣ－ｔｅｒｍｉｎａｌ部位の特定の配列を意味し、ＵＣＴは、他のユビキチンの特定のリジンと共有結合することで結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）がなされる。
【0022】
また、本発明は、（ｉ）ユビキチンのＣ末端タグ（ｔａｇ）が融合またはリンカーによって結合された生体分子（ｂｉｏ－ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を原核細胞または真核細胞包含宿主細胞から組換え発現させること、及び（ｉｉ）前記宿主細胞の溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ）または精製産物に、ユビキチン化のためのＥ１、Ｅ２及びＥ３酵素、またはＥ１及びＥ２酵素を加えて反応させることを含み、ポリユビキチン・スキャフォールド、異なる結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）に対する特異的な結合部分（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を有する少なくとも２つの生体分子、及び生体内における持続時間を延長するキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）が前記ユビキチンのＮ末端またはＣ末端に直接またはリンカーで結合されている、多機能性多重特異性赤生体分子重合体を製造する方法であって、前記ポリユビキチン・スキャフォールドは、少なくとも２つのユビキチンが共有結合によって連結されて形成され、前記生体分子が、２～１０個の生体分子から構成され、他の生体分子、低分子化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）またはナノ粒子と特異的に結合する活性部位（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ）を有し、前記ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方にリンカーで結合されている、多機能性多重特異性マルチマー生体分子重合体（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）を製造する方法を提供する。
【0023】
それに係る一実施例において、前記Ｅ２酵素が、ユビキチンのＮ末端から６番目、１１番目、２７番目、２９番目、３３番目、４８番目または６３番目のリジンと結合するか、あるいはＥ２－２５Ｋユビキチン結合（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）酵素またはユビキチン結合酵素複合体であるＵｃｂ１３－ＭＭＳ２であってもよいが、それらに制限されるものではない。
【0024】
それに係る他の一実施例において、前記ユビキチンのＣ末端タグは、少なくとも２つのユビキチンがヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ）状または分岐状（ｂｒａｎｃｈｅｄ ｔｙｐｅ ｏｒ ｉｓｏ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｒａｎｃｈ ｔｙｐｅ）の形態で繰り返し連結されていてもよく、ここで、前記ヘッドトゥーテール状または分岐状で連結されたユビキチンが、Ｎ末端から７５番目及び７６番目のグリシンがバリンを含む他のアミノ酸で置換されていてもよい。
【発明の効果】
【0025】
本発明によれば、生体分子重合体または複合体同士の連結が、ポリユビキチン・スキャフォールドによってなされ、ポリユビキチンは、それに結合された生体分子同士の間隔と方向性を維持する堅固なスキャフォールド（ｒｉｇｉｄ ｓｃａｆｆｏｌｄ）またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）として作用する。よって、活性部位の妨害を受けることなく、多機能性多重特異性マルチマー生体分子重合体を製造することができる。
【0026】
さらに、本発明によれば、前記多機能性多重特異性マルチマー生体分子重合体は、生体内における持続時間を延長することのできる分子と結合して提供されることにより、生体内における安定性及び効能持続時間を延長する必要のある薬物の製造に用いることができる。
【0027】
本発明における生体分子は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つであってもよく、例えば、異種タンパク質を用いることにより、線状多機能性マルチマー重合体にモジュール化された機能性を付与してもよい。さらに、本発明によれば、前記多機能性多重特異性マルチマー生体分子重合体は、生体内における持続時間を延長することのできる分子と結合して提供されることにより、生体分子に対して生体内における延長された安定性及び効能持続時間を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】本発明の線状多機能性マルチマー融合タンパク質（ＵｎｉＳｔａｃ）を製造する過程を示す図である。
【図2】本発明のＵｎｉＳｔａｃ反応により形成されたマルチマー形態のＵＣＴ融合タンパク質を確認した結果図である。
【図3】本発明のＵｎｉＳｔａｃ反応により形成されたマルチマー形態のＵＣＴ融合タンパク質を確認した結果図である。
【図4】本発明の線状多機能性マルチマー融合タンパク質の様々な応用形態を示す図である。
【図5】Ｅ１－Ｅ２のみを用いたＵｎｉＳｔａｃ製造結果を示す図である。
【図6】本発明の線状多機能性マルチマー融合タンパク質の製造及びそれを固定化して利用する様子を示す概略図である。
【図7】ヘッドトゥーテール（Ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ）ＵＣＴ及びＵｎｉＳｔａｃ方法を示す概略図である。
【図8】本発明によって製造したキシロース還元酵素（Ｘｙｌｏｓｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ＸＲ）をＧＰＣで精製し、その後ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果図である。
【図9】本発明によって製造したオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ＯＡＣ）をＧＰＣで精製し、その後ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果図である。
【図10】本発明によって製造したキシリトール脱水素酵素（Ｘｙｌｉｔｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＸＤＨ）をＧＰＣで精製し、その後ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果図である。
【図11】本発明によって製造したトリオースリン酸イソメラーゼ（Ｔｒｉｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ＴＩＭ）をＧＰＣで精製し、その後ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果図である。
【図12】本発明によって製造したアルドラーゼ（Ａｌｄｏｌａｓｅ；ＡＬＤ）をＧＰＣで精製し、その後ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果図である。
【図13】本発明によって製造したフルクトース－１，６－ビスホスファターゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ １，６－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＦＢＰ）をＧＰＣで精製し、その後ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果図である。
【図14】本発明によって製造したピルビン酸オキシダーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ；ＰＯＰＧ）をＧＰＣで精製し、その後ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した結果図である。
【図15】キシロース還元酵素の活性を分析した結果図である。
【図16】キシロース還元酵素の安定性を分析した結果図である。
【図17】オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの活性を分析した結果図である。
【図18】オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの安定性を分析した結果図である。
【図19】キシリトール脱水素酵素の活性を分析した結果図である。
【図20】キシリトール脱水素酵素の安定性を分析した結果図である。
【図21】ピルビン酸オキシダーゼの活性を分析した結果図である。
【図22】３つの酵素、ＴＩＭ、ＡＬＤ及びＦＢＰが結合した構造のＵｎｉＳｔａｃ重合体（Ｐｏｌｙｍｅｒ）を示す図である。
【図23】ＴＩＭ、ＡＬＤ及びＦＢＰ酵素による相乗効果を示す図である。
【図24】タンパク質Ａ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）及びタンパク質Ｇ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）線状多機能性マルチマー複合体を製造し、その結果を確認した図である。
【図25】ユビキチンのＣ末端タグの７６グリシンのＣ末端にアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）が延長されたｈＧＨを製造して確認した結果図である。
【図26】Ｅ３から始まる重合体を製造し、それを確認した図である。
【図27】ＤＵＢの有無によるｈＧＨ重合体の製造結果を確認した図である。
【図28】タンパク質Ａ単位体が固定化されたビード及びタンパク質Ａ重合体が固定化されたビードに対するヒト由来ＩｇＧの結合活性を示す図である。
【図29】ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方にそれぞれ結合された線状の多機能性マルチマー生体分子重合体構造、及びその製造結果を示す図である。
【図30】二重ユビキチンにキャリアが結合された生体分子重合体とヒト血清アルブミンとの比較において、血中半減期は同等のレベルであり、生体吸収率（ＡＵＣ）はより優れたことを示すＰＫプロファイル結果図である。
【図31】Ｆｃベース（Ｆｃ ｂａｓｅｄ）受容体タンパク質を発現する遺伝子が連結されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを示す図である。
【図32】Ｆｃベース受容体タンパク質の発現を確認した結果図である。
【図33】ＩｇＧ Ｆｃ抗体に特異的に結合するＦｃベース受容体タンパク質の発現を確認した結果図である。
【図34】Ｆｃベース受容体タンパク質の精製結果を示す図である。
【図35】Ｆｃベース受容体タンパク質の精製結果を示す図である。
【図36】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析法によってユビキチン－ＩＬ－１ＲＡを確認した結果図である。
【図37】ユビキチン－ＩＬ－１ＲＡの精製過程を示す図である。
【図38】Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグ付きのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質の精製結果を示す図である。
【図39】Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグ付きのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質の精製結果を示す図である。
【図40】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析法によってＨｉｓ－ＳＵＭＯタグ付きのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡを確認した結果図である。
【図41】Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグが除去されたユビキチン－ＩＬ－１ＲＡを確認した結果図である。
【図42】Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグが除去されたユビキチン－ＩＬ－１ＲＡを確認した結果図である。
【図43】ユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質の精製結果を示す図である。
【図44】ユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質の精製結果を示す図である。
【図45】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析法により、受容体と供与体のコンジュゲーションの程度を確認した結果図である。
【図46】μＣＥ－ＳＤＳ分析法を用いたコンジュゲーション収率分析結果を示す図である。
【図47】コンジュゲーションの精製過程を示す図である。
【図48】Ｎｉ－セファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）で精製したコンジュゲーション確認結果を示す図である。
【図49】Ｎｉ－セファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）で精製したコンジュゲーション確認結果を示す図である。
【図50】精製されたコンジュゲーション確認結果を示す図である。
【図51】精製されたコンジュゲーション確認結果を示す図である。
【図52】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（還元（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ）及びネイティブ（Ｎａｔｉｖｅ）条件）で最終ＵｎｉＳｔａｃ重合体を確認した結果図である。
【図53】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（還元（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ）及びネイティブ（Ｎａｔｉｖｅ）条件）で最終ＵｎｉＳｔａｃ重合体を確認した結果図である。
【図54】μＣＥ－ＳＤＳ分析法を用いたモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）を確認した結果図である。
【図55】ＳＥＣ－ＨＰＬＣを用いたモノマーを確認した結果図である。
【図56】供与体タンパク質（Ｄ－１９２）、ＵｎｉＳｔａｃタンパク質（Ｃ－１９３）、及びヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ－ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）をキャリアとする受容体タンパク質を用いた融合タンパク質（Ｃ－１９２；比較群）の構造を示す図である。
【図57】融合タンパク質（Ｃ－１９２及びＤ－１９２）の皮下投与後の経時的な血中薬物濃度グラフである。
【図58】融合タンパク質（Ｃ－１９３及びＤ－１９２）の皮下投与後の経時的な血中薬物濃度グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明は、一実施例において、（ｉ）ユビキチンのＣ末端タグ（ｔａｇ）が融合またはリンカーによって結合された生体分子（ｂｉｏ－ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を原核細胞または真核細胞包含宿主細胞から組換え発現させること、及び（ｉｉ）前記宿主細胞の溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ）または精製産物に、ユビキチン化のためのＥ１、Ｅ２及びＥ３酵素、またはＥ１及びＥ２酵素を加えて反応させることを含み、ポリユビキチン・スキャフォールド、異なる結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）に対する特異的な結合部分（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を有する少なくとも２つの生体分子、及び生体内における持続時間を延長するキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）が前記ユビキチンのＮ末端またはＣ末端に直接またはリンカーで結合されている、多機能性多重特異性赤生体分子重合体を製造する方法であって、前記ポリユビキチン・スキャフォールドは、少なくとも２つのユビキチンが共有結合によって連結されて形成され、前記生体分子が、他の生体分子、低分子化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）またはナノ粒子と特異的に結合する活性部位（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ）を有し、前記ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方にリンカーで結合されている、多機能性多重特異性マルチマー生体分子重合体を製造する方法を提供する。
【0030】
本発明において、多機能性多重特異性マルチマー生体分子重合体または複合体の形成を開始するイニシエータ（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）は、Ｅ３、Ｅ２、Ｅ１、フリーユビキチン（ｆｒｅｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、またはＥ３の目的基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であってもよい。ここで、Ｅ２酵素は、ユビキチンのリジンのうち４８番または６３番に結合してもよく、Ｅ２酵素は、Ｅ２－２５Ｋユビキチン結合（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）酵素であるか、あるいはユビキチン結合酵素複合体Ｕｃｂ１３－ＭＭＳ２であってもよい。
【0031】
本発明において、生体分子は、好ましくは、ユビキチンのＮ末端にそれぞれ結合する。また、マルチマー生体分子重合体は、２～３０個の生体分子からなってもよい。
図１に、本発明のＵｎｉＳｔａｃ反応を概略的に示す。
図１に、本発明のＵｎｉＳｔａｃ反応を概略的に示す。
【0032】
【0033】
さらに、本発明の多機能性多重特異性マルチマー生体分子重合体は、様々な形態で製造されてもよい。図４、図６及び図７に、具体的な例を示す。すなわち、第１図は、図１に示すように、ユビキチンのＣ末端タグ付き酵素（ｅｎｚｙｍｅ）とＵｎｉＳｔａｃ混合物とを反応させ、その後、濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）してＵｎｉＳｔａｃ線状酵素重合体を製造する過程を概略的に示す。第２図は、ユビキチンのＣ末端タグ付き酵素とＵｎｉＳｔａｃ混合物とを反応させ、その後、架橋剤（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）と共に沈殿（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）させてＵｎｉＳｔａｃ酵素凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を製造する過程を示す。第３図は、ユビキチンのＣ末端タグ付きタンパク質を基板またはビード上に固定化する過程を概略的に示す。
【0034】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に従い本発明の範囲がこれらの実施例により何ら制限されないということは当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。
【0035】
［製造例］
製造例１：Ｃ末端融合タンパク質のクローニング、発現及び精製
本発明の実施例に用いられたＵＣＴ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔａｇ）（配列番号：１）タンパク質融合体をエンコードする遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．社に依頼して製造した。
製造例１：Ｃ末端融合タンパク質のクローニング、発現及び精製
本発明の実施例に用いられたＵＣＴ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔａｇ）（配列番号：１）タンパク質融合体をエンコードする遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．社に依頼して製造した。
【0036】
Ｃ末端にユビキチンタグを含まないＵｂ ｏｕｔ遺伝子構造物を製造するために、ファーストクローニングシステム（ｆａｓｔ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｌｉ Ｃ、Ｗｅｎ Ａ、Ｓｈｅｎ Ｂ、Ｌｕ Ｊ、Ｈｕａｎｇ Ｙ、Ｃｈａｎｇ Ｙ（２０１１）．Ｆａｓｔ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ、ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ｆｒｅｅ、ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ａｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１、９２．）を用いた。この方法は、制限酵素及びリガーゼのない条件下でＰＣＲ産物に直接Ｄｐｎ１を処理するのみで、Ｄｐｎ１がポリメラーゼと共にまだ明らかにされていないメカニズムによって制限酵素及びリガーゼの役割を果たすことにより、遺伝子連結（挿入、除去または置換）が可能な技術である。この方法において、フュージョンポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と両末端がオーバーラップするように設計されたプライマーを使用して、削除されるべき領域を除くすべてのベクター上でＰＣＲ（９５℃３分、９５℃１５秒～５５℃１分～７２℃１分／ｋｂ１８回繰り返し、７２℃５分、１２℃２０分）を行った。次に、ＰＣＲ結果物に対するＤｐｎ１処理を３７℃で１時間行い、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、所望のプラスミドを得た。すべての遺伝子構成物を商業的なＤＮＡシーケンシングによって確認した。
【0037】
ＵＣＴ融合タンパク質の過剰発現のために、各遺伝子構成物をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）（ＸＲ、ＴＩＭ、ＡＬＤ）、Ｒｏｓｅｔｔａ ｐＬｙｓＳ ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）（ＸＤＨ、ＯＡＣ、ＰＯＰＧ）、Ｏｒｉｇａｍｉ２ ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）（ＦＢＰ）菌株に形質転換した。タンパク質発現プラスミド（ｐＥＴ２１ａ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を含む細胞を３７℃、ＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ）で培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。ＯＤ600値が約０．６に達すると、２５０μＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；ＩＰＴＧ）を使用し、１６℃で２０時間にかけてタンパク質発現を誘導した。次に、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、４℃で１５分）し、その後、細胞ペレットを溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ２、２０ｍＭのイミダゾール）中に再懸濁し、ソニケーション（５０％ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）、ｐｌｕｓｅ ｏｎ３秒－ｏｆｆ５秒、最終１５分）で溶解した。次いで、溶解物を１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間さらに遠心分離した。Ｎ末端Ｈｉｓ－ｔａｇを含むタンパク質の水溶性画分を、ニッケル親和及びＦＰＬＣ緩衝液（Ｎｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ、ＱＩＡＧＥＮ、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ2）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇゲルフィルトレーションカラム１６／６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。酵素活性分析のために、全てのＵＣＴタンパク質を１００μＭに濃縮した。全ての標的タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した。図８ないし図１４は、ターゲット（標的）タンパク質を確認した結果図である。本発明に用いられるＵＣＴ融合タンパク質は、表１のとおりである。
【0038】
【表1】
【0039】
製造例２：ＵｎｉＳｔａｃ線状構造体の製造
本発明において、線状多機能性マルチマー形態の融合タンパク質を製造するための反応を、ＵｎｉＳｔａｃ反応と命名した。ＵｎｉＳｔａｃ反応（全体の体積５０μＬ）をＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）中で行い、ＵｎｉＳｔａｃ反応のためのＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、０．５μＭのＥ２、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）を本発明のＵＣＴタンパク質融合体に添加し、反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうし、ＵｎｉＳｔａｃ反応を行った。
本発明において、線状多機能性マルチマー形態の融合タンパク質を製造するための反応を、ＵｎｉＳｔａｃ反応と命名した。ＵｎｉＳｔａｃ反応（全体の体積５０μＬ）をＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）中で行い、ＵｎｉＳｔａｃ反応のためのＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、０．５μＭのＥ２、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）を本発明のＵＣＴタンパク質融合体に添加し、反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうし、ＵｎｉＳｔａｃ反応を行った。
【0040】
反応に用いられたタンパク質の割合は、１μＭのＥ３酵素当たり１０～２０μＭのＵＣＴタンパク質融合体（１：１０～１：２０比）の濃度で行った。これは、ＵｎｉＳｔａｃ反応により、１時間内に最低でも１０個以上の融合体モノマーが線形多機能性マルチマーを形成するための目的に設定された条件である。本発明で使用したＥ１、Ｅ２及びＥ３は、それぞれ以下のとおりである。
【0041】
【表2】
【0042】
製造例３：Ｅ１－Ｅ２のみを用いたＵｎｉＳｔａｃの製造（Ｅ２プラットフォーム）
Ｅ２－２５Ｋ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ－Ｕ５８５２２．１）（ｈｕｍａｎ Ｅ２）、Ｕｃｂ１３（ｙｅａｓｔ Ｅ２）－ＭＭＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ－Ｕ６６７２４．１）（ｙｅａｓｔ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｖａｒｉａｎｔ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ－Ｕ６６７２４．１）を利用してＥ２－ＵｎｉＳｔａｃを製造した。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社で合成した組換えＤＮＡプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）を使用した。Ｅ２－ＵｎｉＳｔａｃ反応を緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、５ｍＭのＭｇＣｌ2）条件下で、Ｅ２－ＵｎｉＳｔａｃ混合物（１μＭのＥ１、１０μＭのＥ２、４ｍＭのＡＴＰ）を自由ユビキチン（ｆｒｅｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）溶液（２０μＭ）に添加して反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうし、Ｅ２－ＵｎｉＳｔａｃ反応を行った。図５にその結果を示す。
Ｅ２－２５Ｋ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ－Ｕ５８５２２．１）（ｈｕｍａｎ Ｅ２）、Ｕｃｂ１３（ｙｅａｓｔ Ｅ２）－ＭＭＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ－Ｕ６６７２４．１）（ｙｅａｓｔ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｖａｒｉａｎｔ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ－Ｕ６６７２４．１）を利用してＥ２－ＵｎｉＳｔａｃを製造した。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社で合成した組換えＤＮＡプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）を使用した。Ｅ２－ＵｎｉＳｔａｃ反応を緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、５ｍＭのＭｇＣｌ2）条件下で、Ｅ２－ＵｎｉＳｔａｃ混合物（１μＭのＥ１、１０μＭのＥ２、４ｍＭのＡＴＰ）を自由ユビキチン（ｆｒｅｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）溶液（２０μＭ）に添加して反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうし、Ｅ２－ＵｎｉＳｔａｃ反応を行った。図５にその結果を示す。
【実施例】
【0043】
実施例１：キシロース還元酵素（Ｘｙｌｏｓｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ＸＲ）の活性及び安定性の分析
キシロース還元酵素の活性の分析
ＵｎｉＳｔａｃ反応をＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）中で行い、ＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、５μＭのＥ２、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）をＸＲタンパク質溶液に添加し、反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、次いで、触媒活性を分析した。ＮＡＤＨ酸化によって誘導される３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定することで、ＸＲの触媒活性を分析した。
キシロース還元酵素の活性の分析
ＵｎｉＳｔａｃ反応をＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）中で行い、ＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、５μＭのＥ２、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）をＸＲタンパク質溶液に添加し、反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、次いで、触媒活性を分析した。ＮＡＤＨ酸化によって誘導される３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定することで、ＸＲの触媒活性を分析した。
【0044】
触媒活性分析のための反応は、１ｍＭのＭｇＣｌ2及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する１００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＸＲ（１０μＭ）及びキシロース（２００ｍＭ）混合物にＮＡＤＨ（２ｍＭ）を添加して開始した。ＸＲは、ＸＲのＣ末端にユビキチンタグ（ｔａｇ）を含まないモノマー形態のサンプルであり、同様のＵｎｉＳｔａｃ混合条件下、重合体を形成しなかった。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を用いて行った。その結果を図１５に示す。
【0045】
図１５に示すように、本発明によるＸＲが補助基質（ｃｏ－ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてＮＡＤＨを用い、Ｄ－キシロースをキシリトール（ｘｙｌｉｔｏｌ）に還元することを促した。吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）は、溶液中のＮＡＤＨの量を示す。ＸＲのＵｎｉＳｔａｃ重合体（下側曲線）は、モノマー形態（上側曲線）と比較してＮＡＤＨ消耗がより速かった。両方の反応は、いずれも同じ量のモノマーを含有している。よって、増加した反応速度は、単にモノマー間の共有結合のみに依存する。結局、ユビキチンタグのないＸＲモノマーと比較して、ＸＲ ＵｎｉＳｔａｃ重合体の活性が１０倍増加したことを確認した。
【0046】
キシロース還元酵素のｐＨ安定性の分析
ＮＡＤＨ及びキシロースを添加して反応を開始する前に、ＸＲモノマー及びＵｎｉＳｔａｃ重合体の両方を３０分間、指示されたｐＨで処理した。図１６に示すように、ｐＨ５．５及び６．５において、ＸＲ ＵｎｉＳｔａｃ重合体は、ユビキチンタグのないモノマーＸＲと比較して著しく改善された安定性を示した。結果は、３回の実験の平均値である。
ＮＡＤＨ及びキシロースを添加して反応を開始する前に、ＸＲモノマー及びＵｎｉＳｔａｃ重合体の両方を３０分間、指示されたｐＨで処理した。図１６に示すように、ｐＨ５．５及び６．５において、ＸＲ ＵｎｉＳｔａｃ重合体は、ユビキチンタグのないモノマーＸＲと比較して著しく改善された安定性を示した。結果は、３回の実験の平均値である。
【0047】
実施例２：オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ＯＡＣ）の活性及び安定性の分析
ＯＡＣの活性の分析
ブドウ糖新生作用（ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与するＯＡＣは、ＡＳＴ－ＡＬＴと共に肝損傷を調査するために用いられる。ＵｎｉＳｔａｃ反応をＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）で行い、ＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、５μＭのＥ２、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）をＯＡＣタンパク質溶液に添加し、反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、次いで、触媒活性を分析した。ＯＡＣの活性の分析は、以下の条件下、ＮＡＤＨ消耗の進行に伴う吸光度（３４０ｎｍ）の減少に基づいて行った：４５ｍＭのＴＥＡ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ８．０、０．４５ｍＭのＭｎＣｌ2、２ｍＭのＮＡＤＨ、１１ Ｕ ｏｆ ＬＤＨ、５μＭのＯＡＣ、２．５ｍＭ。
ＯＡＣの活性の分析
ブドウ糖新生作用（ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関与するＯＡＣは、ＡＳＴ－ＡＬＴと共に肝損傷を調査するために用いられる。ＵｎｉＳｔａｃ反応をＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）で行い、ＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、５μＭのＥ２、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）をＯＡＣタンパク質溶液に添加し、反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、次いで、触媒活性を分析した。ＯＡＣの活性の分析は、以下の条件下、ＮＡＤＨ消耗の進行に伴う吸光度（３４０ｎｍ）の減少に基づいて行った：４５ｍＭのＴＥＡ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ８．０、０．４５ｍＭのＭｎＣｌ2、２ｍＭのＮＡＤＨ、１１ Ｕ ｏｆ ＬＤＨ、５μＭのＯＡＣ、２．５ｍＭ。
【0048】
ＯＡＣは、ＯＡＣのＣ末端にユビキチンタグを含まないモノマー形態のサンプルであり、同様のＵｎｉＳｔａｃ混合条件下、重合体を形成しなかった。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を用いて行った。その結果を図１７に示す。
【0049】
図１７に示すように、Ｃ末端にＵｂのないモノマー（ＯＡＣ）の活性と、重合体（ＵｎｉＳｔａｃｅｄ ＯＡＣ）の活性とを比較したところ、重合体の活性が９倍増加した。吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）は、溶液中のＮＡＤＨの量を示す。ＯＡＣのＵｎｉＳｔａｃ重合体（下側曲線）は、モノマー形態（上側曲線）と比較してＮＡＤＨ消耗がより速かった。両方の反応は、いずれも同じ量のモノマーを含有している。よって、増加した反応速度は、単にモノマー間の共有結合のみに依存する。結局、ユビキチンタグのないＯＡＣモノマー（ＯＡＣ）と比較して、ＯＡＣ ＵｎｉＳｔａｃ重合体の活性が９倍増加したことを確認した。
【0050】
ＯＡＣの安定性の分析
ＮＡＤＨ及びオキサロ酢酸（ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ）を添加して反応を開始する前に、ＯＡＣモノマー及びＵｎｉＳｔａｃ重合体の両方を３０分間、指示されたｐＨで処理した。図１８に示すように、ｐＨ４．５～６．５の低いｐＨにおいて、ＯＡＣ ＵｎｉＳｔａｃ重合体は、ユビキチンタグのないモノマーＯＡＣ（ＯＡＣ）と比較して著しく向上したｐＨ安定性を示した。結果は、３回の実験の平均値である。
ＮＡＤＨ及びオキサロ酢酸（ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ）を添加して反応を開始する前に、ＯＡＣモノマー及びＵｎｉＳｔａｃ重合体の両方を３０分間、指示されたｐＨで処理した。図１８に示すように、ｐＨ４．５～６．５の低いｐＨにおいて、ＯＡＣ ＵｎｉＳｔａｃ重合体は、ユビキチンタグのないモノマーＯＡＣ（ＯＡＣ）と比較して著しく向上したｐＨ安定性を示した。結果は、３回の実験の平均値である。
【0051】
実施例３：キシリトール脱水素酵素（Ｘｙｌｉｔｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＸＤＨ）の活性及び安定性の分析
ＸＤＨの活性の分析
ＸＤＨはＤ－Ｘｙｌｏｓｅ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ経路に属する酵素であり、ＸＲの結果物であるキシリトールをＮＡＤ+を用いてキシルロース（ｘｙｌｕｌｏｓｅ）に変換することが知られている。ＸＤＨの活性の分析のために、まずは、ＵｎｉＳｔａｃ反応をＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）で行い、ＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、５μＭのＥ２、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）をＸＤＨタンパク質溶液に添加し、反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、次いで、触媒活性を分析した。３４０ｎｍでＮＡＤ+還元をモニターして、ＸＤＨ活性を測定した。反応は、１ｍＭのＭｇＣｌ2及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する１００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＸＤＨ（２０μＭ）及びキシロース（２００ｍＭ）混合物にＮＡＤＨ（２ｍＭ）を添加することによって開始した。ＸＤＨは、ＸＤＨのＣ末端にユビキチンタグを含まないモノマー形態のサンプルであり、同様のＵｎｉＳｔａｃ混合条件下、重合体を形成しなかった。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を用いた。その結果を図１９に示す。
ＸＤＨの活性の分析
ＸＤＨはＤ－Ｘｙｌｏｓｅ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ経路に属する酵素であり、ＸＲの結果物であるキシリトールをＮＡＤ+を用いてキシルロース（ｘｙｌｕｌｏｓｅ）に変換することが知られている。ＸＤＨの活性の分析のために、まずは、ＵｎｉＳｔａｃ反応をＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）で行い、ＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、５μＭのＥ２、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）をＸＤＨタンパク質溶液に添加し、反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、次いで、触媒活性を分析した。３４０ｎｍでＮＡＤ+還元をモニターして、ＸＤＨ活性を測定した。反応は、１ｍＭのＭｇＣｌ2及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する１００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＸＤＨ（２０μＭ）及びキシロース（２００ｍＭ）混合物にＮＡＤＨ（２ｍＭ）を添加することによって開始した。ＸＤＨは、ＸＤＨのＣ末端にユビキチンタグを含まないモノマー形態のサンプルであり、同様のＵｎｉＳｔａｃ混合条件下、重合体を形成しなかった。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を用いた。その結果を図１９に示す。
【0052】
図１９に示すように、ｐＨ５．５において、ＸＤＨ ＵｎｉＳｔａｃ重合体（上側曲線）は、そのモノマー形態（下側曲線）と比較して、ＮＡＤＨ＋消耗率がより高かった。両方の反応は、いずれも同じ量のモノマーを含有している。よって、活性の違いは、単にモノマー間の共有結合のみに依存する。結局、ユビキチンタグのないＸＤＨモノマー（ＸＤＨ）と比較して、ＸＤＨ ＵｎｉＳｔａｃ重合体の活性が１０倍増加したことを確認した。
【0053】
ＸＤＨの安定性の分析
ＮＡＤ+及びキシリトールを加えて反応を開始する前に、ＸＤＨモノマー及びＵｎｉＳｔａｃ重合体の両方を３０分間、指示されたｐＨで処理した。図２０に示すように、測定された全てのｐＨにおいて、ＸＲ ＵｎｉＳｔａｃ重合体は、ＸＤＨと比較して著しく増加したｐＨ安定性を示した。結果は、３回の実験の平均値である。
ＮＡＤ+及びキシリトールを加えて反応を開始する前に、ＸＤＨモノマー及びＵｎｉＳｔａｃ重合体の両方を３０分間、指示されたｐＨで処理した。図２０に示すように、測定された全てのｐＨにおいて、ＸＲ ＵｎｉＳｔａｃ重合体は、ＸＤＨと比較して著しく増加したｐＨ安定性を示した。結果は、３回の実験の平均値である。
【0054】
実施例４：ピルビン酸オキシダーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ；ＰＯＰＧ）の活性の分析
ＰＯＰＧは、ブドウ糖新生作用に関与する酵素であるＡＳＴ－ＡＬＴのような酵素を検出し、肝損傷を調査するために用いられることが知られている。ＰＯＰＧの活性の分析のために、まずは、ＵｎｉＳｔａｃ反応をＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）で行い、ＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、５μＭのＥ２、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）をＰＯＰＧタンパク質溶液に添加し、反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、次いで、触媒活性を分析した。触媒活性を分析するために、ＡＢＴＳによるピルビン酸のＰＯＰＧ酸化プロセスによって生成されるＨ2Ｏ2量を測定した。反応は、リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）緩衝液中のピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）（１００ｍＭ）、ピロリン酸塩（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（６ｍＭ）、ＡＢＴＳ（２，２’－ａｚｉｎｏ－ｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ）（１０ｍＭ）及びＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（０．２Ｕ／ｍＬ）混合物にＰＯＰＧ（５μＭ）を添加して開始した。
ＰＯＰＧは、ブドウ糖新生作用に関与する酵素であるＡＳＴ－ＡＬＴのような酵素を検出し、肝損傷を調査するために用いられることが知られている。ＰＯＰＧの活性の分析のために、まずは、ＵｎｉＳｔａｃ反応をＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）で行い、ＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、５μＭのＥ２、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）をＰＯＰＧタンパク質溶液に添加し、反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、次いで、触媒活性を分析した。触媒活性を分析するために、ＡＢＴＳによるピルビン酸のＰＯＰＧ酸化プロセスによって生成されるＨ2Ｏ2量を測定した。反応は、リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）緩衝液中のピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）（１００ｍＭ）、ピロリン酸塩（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（６ｍＭ）、ＡＢＴＳ（２，２’－ａｚｉｎｏ－ｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ）（１０ｍＭ）及びＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（０．２Ｕ／ｍＬ）混合物にＰＯＰＧ（５μＭ）を添加して開始した。
【0055】
ＰＯＰＧモノマー（ＰＯＰＧ）は、ＰＯＰＧのＣ末端にユビキチンタグを有さないモノマー形態のサンプルであり、同様のユビスタック混合条件下、重合体を形成しない。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を用いて行った。図２１に示すように、ｐＨ５．５では、ＰＯＰＧ（上側曲線）は、そのモノマー形態（下側曲線）と比較してより高い活性を示した。両方の反応は、いずれも同じ量のモノマーを含有している。よって、以上の活性の違いは、単にモノマー間の共有結合のみにに依存する。結局、ＰＯＰＧ ＵｎｉＳｔａｃ重合体の活性は、ユビキチンタグのないＰＯＰＧモノマー（ＰＯＰＧ）と比較して２倍増加したことを確認した。
【0056】
実施例５：ユビキチン酵素の相乗効果の分析
トリオースリン酸イソメラーゼ（Ｔｒｉｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ＴＩＭ）、アルドラーゼ（Ａｌｄｏｌａｓｅ；ＡＬＤ）、及びフルクトース－１，６－ビスホスファターゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ １，６－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＦＢＰ）は、ＤＨＡＰ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）から最終生成物としてＦ６Ｐを生成するためのカスケード反応を形成することが知られている。ＵｎｉＳｔａｃ酵素の相乗効果の分析は、フルクトース－６－リン酸（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｆ６Ｐ）、ＴＩＭ生成物、ＡＬＤ及びＦＢＰ酵素複合体を測定することによって行った。Ｆ６Ｐは、ホスホグルコースイソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ＰＧＩ）によりグルコース－６－リン酸（Ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｇ６Ｐ）に異性化され、基質として同量のＮＡＤ+がグルコース－６－リン酸脱水素酵素（Ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；Ｇ６ＰＤＨ）によって変形される。酵素活性を、ＨＥＰＥＳ緩衝液条件（２００ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのＭｎＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ2）中の４μＭのＴＩＭ、ＡＬＤ及びＦＢＰ酵素複合体混合物中に、２．５ｍＭの酵素複合体（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＤＨＡＰ）、２０Ｕ／ｍＬの分析酵素（ＰＧＩ及びＧ６ＰＤＨ）及び２．５ｍＭのＮＡＤ+酵素複合体を添加して新たに生成されたＮＡＤＨの量を、３４０ｎｍで測定して決定した。
トリオースリン酸イソメラーゼ（Ｔｒｉｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ＴＩＭ）、アルドラーゼ（Ａｌｄｏｌａｓｅ；ＡＬＤ）、及びフルクトース－１，６－ビスホスファターゼ（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ １，６－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＦＢＰ）は、ＤＨＡＰ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）から最終生成物としてＦ６Ｐを生成するためのカスケード反応を形成することが知られている。ＵｎｉＳｔａｃ酵素の相乗効果の分析は、フルクトース－６－リン酸（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｆ６Ｐ）、ＴＩＭ生成物、ＡＬＤ及びＦＢＰ酵素複合体を測定することによって行った。Ｆ６Ｐは、ホスホグルコースイソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ＰＧＩ）によりグルコース－６－リン酸（Ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；Ｇ６Ｐ）に異性化され、基質として同量のＮＡＤ+がグルコース－６－リン酸脱水素酵素（Ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；Ｇ６ＰＤＨ）によって変形される。酵素活性を、ＨＥＰＥＳ緩衝液条件（２００ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのＭｎＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ2）中の４μＭのＴＩＭ、ＡＬＤ及びＦＢＰ酵素複合体混合物中に、２．５ｍＭの酵素複合体（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＤＨＡＰ）、２０Ｕ／ｍＬの分析酵素（ＰＧＩ及びＧ６ＰＤＨ）及び２．５ｍＭのＮＡＤ+酵素複合体を添加して新たに生成されたＮＡＤＨの量を、３４０ｎｍで測定して決定した。
【0057】
酵素複合体混合物は、酵素のＣ末端にユビキチンタグを有さず、同様のＵｎｉＳｔａｃ混合物条件下、重合体を形成しないモノマー形態のサンプルである。統計分析は、Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）を用いて行った。指示時点で反応を終了し、Ｆ６Ｐがグルコース－６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換されるためにＮＡＤ＋を用いるホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）を用い、Ｆ６Ｐの量を測定した。吸光度は、Ｆ６Ｐの量を示す。
【0058】
その実験結果を図２３に示す。図２３に示すように、３つの異なる酵素のＵｎｉＳｔａｃ重合体（上側曲線）がモノマー酵素混合物（下側曲線）よりも５倍高い活性を示し、ＵｎｉＳｔａｃ前記酵素による相乗効果を確認した。図２２は、３つの酵素、ＴＩＭ、ＡＬＤ及びＦＢＰが結合された構造（ＵｎｉＳｔａｃ Ｐｏｌｙｍｅｒ）の結果物を示す。
【0059】
実施例６：ユビキチンの多段階標識（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃｓ）方法
本発明の製造例によって、ユビキチンのＣ末端タグ付き生体分子を合成した。次に、ヒドロキシルアミン（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ）を含む重合体（ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））を前記生体分子と反応させた。その結果、重合体がオキシム連結部位（ｏｘｉｍｅ ｌｉｎｋａｇｅ）により、ユビキチンで標識されたことが確認された。オキシム連結は、高分子薬物送達システム（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）が可能なツールとして使用できる。
本発明の製造例によって、ユビキチンのＣ末端タグ付き生体分子を合成した。次に、ヒドロキシルアミン（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ）を含む重合体（ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））を前記生体分子と反応させた。その結果、重合体がオキシム連結部位（ｏｘｉｍｅ ｌｉｎｋａｇｅ）により、ユビキチンで標識されたことが確認された。オキシム連結は、高分子薬物送達システム（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）が可能なツールとして使用できる。
【0060】
実施例７：タンパク質Ａ及びタンパク質Ｇの線状マルチマー重合体の製造
ＵｎｉＳｔａｃ反応（全体の体積５０μＬ）をＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）中で行い、ＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、５μＭのＥ２、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）をタンパク質Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）またはタンパク質Ｇ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）溶液に添加し、反応を開始した。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社で合成したタンパク質Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ－ＡＡＢ０５７４３．１）、タンパク質Ｇ（ＣＡＡ２７６３８．１）に対応する配列を含む組換えＤＮＡプラスミドを使用した。室温で１時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。
ＵｎｉＳｔａｃ反応（全体の体積５０μＬ）をＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）中で行い、ＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、５μＭのＥ２、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）をタンパク質Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）またはタンパク質Ｇ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）溶液に添加し、反応を開始した。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社で合成したタンパク質Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ－ＡＡＢ０５７４３．１）、タンパク質Ｇ（ＣＡＡ２７６３８．１）に対応する配列を含む組換えＤＮＡプラスミドを使用した。室温で１時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。
【0061】
図２４に示すように、ＵｎｉＳｔａｃ混合物を入れなかった試料と比較して、ＵｎｉＳｔａｃ混合物を入れた試料において、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇのモノマーバンド（ｍｏｎｏｍｅｒ ｂａｎｄ）は減少し、高分子質量のバンド（線状マルチマー重合体）が新たに現れたことを確認した。さらに、線状マルチマー重合体の一部は、分子量が数百ｋＤａまで増加し、濃縮ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌ）を通過できなかったことが確認された。
【0062】
実施例８：ユビキチンのＣ末端タグの７６グリシンのＣ末端にアスパラギン酸が延長されたｈＧＨ
ＵＣＴ融合タンパク質を過剰発現するために、各遺伝子構成物をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）菌株に形質転換した。本実施例では、タンパク質としてｈＧＨ（配列番号：１８）を用いた。タンパク質発現プラスミド（ｐＥＴ２１ａ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を含む細胞を３７℃、ＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ）で培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。ＯＤ600値が約０．６に達すると、２５０μＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；ＩＰＴＧ）を使用し、１６℃で２０時間にかけてタンパク質発現を誘導した。次に、遠心分離（３５００ｒｐｍ、４℃で１５分）し、その後、細胞ペレットを溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ2、２０ｍＭのイミダゾール）中に再懸濁し、ソニケーション（５０％ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）、ｐｌｕｓｅ ｏｎ３秒－ｏｆｆ５秒、最終１５分）で溶解した。次いで、溶解物を１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間さらに遠心分離した。Ｎ末端Ｈｉｓ－ｔａｇを含むタンパク質の水溶性画分を、ニッケル親和及びＦＰＬＣ緩衝液（Ｎｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ－ＱＩＡＧＥＮ、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ2）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇゲルフィルトレーションカラム１６／６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。精製されたｈＧＨを１００μＭに濃縮し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した。その結果を図２５に示す。
ＵＣＴ融合タンパク質を過剰発現するために、各遺伝子構成物をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）菌株に形質転換した。本実施例では、タンパク質としてｈＧＨ（配列番号：１８）を用いた。タンパク質発現プラスミド（ｐＥＴ２１ａ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を含む細胞を３７℃、ＬＢ培地（Ｍｉｌｌｅｒ）で培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。ＯＤ600値が約０．６に達すると、２５０μＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－ｂｅｔａ－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；ＩＰＴＧ）を使用し、１６℃で２０時間にかけてタンパク質発現を誘導した。次に、遠心分離（３５００ｒｐｍ、４℃で１５分）し、その後、細胞ペレットを溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ2、２０ｍＭのイミダゾール）中に再懸濁し、ソニケーション（５０％ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）、ｐｌｕｓｅ ｏｎ３秒－ｏｆｆ５秒、最終１５分）で溶解した。次いで、溶解物を１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間さらに遠心分離した。Ｎ末端Ｈｉｓ－ｔａｇを含むタンパク質の水溶性画分を、ニッケル親和及びＦＰＬＣ緩衝液（Ｎｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ－ＱＩＡＧＥＮ、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ2）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇゲルフィルトレーションカラム１６／６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。精製されたｈＧＨを１００μＭに濃縮し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した。その結果を図２５に示す。
【0063】
実施例９：Ｅ３（Ｒｓｐ５）から開始されたポリユビキチン・スキャフォールドの製造
ＵｎｉＳｔａｃ反応（全体の体積５０μＬ）をＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）中で行い、ＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、５μＭのＥ２（Ｕｂｃｈ５ａまたはＵｂｃｈ７）、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）をタンパク質溶液に添加し、反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。
ＵｎｉＳｔａｃ反応（全体の体積５０μＬ）をＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）中で行い、ＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、５μＭのＥ２（Ｕｂｃｈ５ａまたはＵｂｃｈ７）、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）をタンパク質溶液に添加し、反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。
【0064】
図２６に示すように、ＵｎｉＳｔａｃ混合物を含まないサンプルと比較して、ＵｎｉＳｔａｃ混合物を入れたサンプルでは、Ｅ３の量が減少したことを確認した。これは、Ｅ３から開始されたポリユビキチン・スキャフォールドの形成により分子質量が増加したＥ３のバンドが上方に移動したためである。また、Ｕｂｃｈ５ａ Ｅ２を含むＵｎｉＳｔａｃ混合物（図２６Ａ）と比較して、反応性の弱いＵｂｃｈ７ Ｅ２を含むＵｎｉＳｔａｃ混合物（図２６Ｂ）を添加した結果では、経時的にＥ３（Ｒｓｐ５）にユビキチンが１つずつ追加連結され、分子量が徐々に増加する過程を確認した。
【0065】
実施例１０：ＤＵＢの有無によるｈＧＨの重合体製造
ＤＵＢが一緒に存在する条件とＤＵＢが除外された条件下、ｈＧＨ（配列番号：１８）のＵｎｉＳｔａｃ反応を比較した。このとき使用されたｈＧＨは、Ｃ末端に２つのユビキチンタグがヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ）状で繰り返し連結されており、そのユビキチンタグのＣ末端は、アスパラギン酸で延長された形態である。よって、ＤＵＢを用いてユビキチンタグＣ末端のアスパラギン酸を切り出さなければ、ＵｎｉＳｔａｃ反応は起こらない。
ＤＵＢが一緒に存在する条件とＤＵＢが除外された条件下、ｈＧＨ（配列番号：１８）のＵｎｉＳｔａｃ反応を比較した。このとき使用されたｈＧＨは、Ｃ末端に２つのユビキチンタグがヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ）状で繰り返し連結されており、そのユビキチンタグのＣ末端は、アスパラギン酸で延長された形態である。よって、ＤＵＢを用いてユビキチンタグＣ末端のアスパラギン酸を切り出さなければ、ＵｎｉＳｔａｃ反応は起こらない。
【0066】
生体分子であるｈＧＨの重合体形成を確認するためのＵｎｉＳｔａｃ反応は、ＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）中で行い、ＵｎｉＳｔａｃ混合物（１μＭのＥ１、５μＭのＥ２（ｕｂｃｈ５ａ）、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）を２０μＭのｈＧＨタンパク質溶液に添加し、反応を開始した。
【0067】
また、Ｅ３を除いたＥ２－ＵｎｉＳｔａｃ反応は、Ｅ２－ＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．０、５ｍＭのＭｇＣｌ2）中で行い、Ｅ２－ＵｎｉＳｔａｃ混合物（１μＭのＥ１、１０μＭのＥ２（Ｕｃｂ１３－ＭＭＳ２複合体）、４ｍＭのＡＴＰ）を２０μＭのｈＧＨタンパク質溶液に添加し、反応を開始した。
ＤＵＢの活性を合わせて確認するために、反応は、ＤＵＢ（ＹＵＨ１）を含まない条件と、ＤＵＢ（ＹＵＨ１）が２μＭ入った条件下、それぞれ同時に行った。室温で１～４時間にかけて振とうして全ての反応を行い、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
ＤＵＢの活性を合わせて確認するために、反応は、ＤＵＢ（ＹＵＨ１）を含まない条件と、ＤＵＢ（ＹＵＨ１）が２μＭ入った条件下、それぞれ同時に行った。室温で１～４時間にかけて振とうして全ての反応を行い、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
【0068】
図２７に示すように、ＤＵＢを含む条件下のみでｈＧＨの重合体が形成されることを確認し、ＤＵＢを含まない条件では、ｈＧＨ ＵＣＴのＣ末端のアスパラギン酸が切り取られず、重合体が形成されなかったことを確認した。
【0069】
実施例１１：ビードに固定されたタンパク質Ａ重合体の結合活性
タンパク質Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）重合体を作製するためのＵｎｉＳｔａｃ反応を、ＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）中で行った。ＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、５μＭのＥ２（Ｕｂｃｈ５ａまたはＵｂｃｈ７）、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）をタンパク質Ａのタンパク質溶液に添加し、反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、次いで５０％濃度のラテックスビード（Ｌａｔｅｘ ｂｅａｄ）と共に１：１の割合で混合し、室温で４時間にかけて振とうすることで、タンパク質Ａ重合体をビードに固定化する反応を行った。固定化反応後、固定化されていないタンパク質を除去するために、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4 ｐＨ７．４、１．８ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ）で３回洗浄した。洗浄後、ヒト血清から得られた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を２ｍｇ／ｍＬの濃度でビードに添加し、ビードに固定化されたタンパク質Ａ重合体の結合活性を分析した。結合反応は、室温で１時間振とうしてから、前記洗浄方法と同様にＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
タンパク質Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）重合体を作製するためのＵｎｉＳｔａｃ反応を、ＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）中で行った。ＵｎｉＳｔａｃ混合物（０．５μＭのＥ１、５μＭのＥ２（Ｕｂｃｈ５ａまたはＵｂｃｈ７）、１μＭのＥ３、４ｍＭのＡＴＰ）をタンパク質Ａのタンパク質溶液に添加し、反応を開始した。室温で１時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、次いで５０％濃度のラテックスビード（Ｌａｔｅｘ ｂｅａｄ）と共に１：１の割合で混合し、室温で４時間にかけて振とうすることで、タンパク質Ａ重合体をビードに固定化する反応を行った。固定化反応後、固定化されていないタンパク質を除去するために、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4 ｐＨ７．４、１．８ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ）で３回洗浄した。洗浄後、ヒト血清から得られた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を２ｍｇ／ｍＬの濃度でビードに添加し、ビードに固定化されたタンパク質Ａ重合体の結合活性を分析した。結合反応は、室温で１時間振とうしてから、前記洗浄方法と同様にＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
【0070】
図２８に示すように、ＵｎｉＳｔａｃ混合物を添加せずに残りを同様に行い、タンパク質Ａ単位体が固定化されたビードと比較して、タンパク質Ａ重合体が固定化されたビードに対するヒト由来ＩｇＧの結合活性が１５％以上増加されたことを確認した。
【0071】
実施例１２：ユビキチンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方にそれぞれ結合された線状の多価生体分子重合体の製造
Ｎ末端にｈＧＨが結合された供与体ユビキチン（配列番号：１８）及びＮ末端にｈＧＨが結合された受容体ユビキチン（配列番号：１９）ダイマー（図２９（Ａ））と、Ｎ末端にｈＧＨが結合された供与体ユビキチン（配列番号：１８）及びＣ末端にｈＧＨが結合された受容体ユビキチン（配列番号：２０）ダイマー（図２９（Ｂ））と、Ｎ末端にｈＧＨが結合された供与体ユビキチン（配列番号：１８）及びＮ末端にＳＵＭＯとＣ末端にｈＧＨがそれぞれ結合された受容体ユビキチン（配列番号：２１）ダイマー（図２９（Ｃ））と、をそれぞれ製造し、ＵｎｉＳｔａｃダイマー（ｄｉｍｅｒ）形成を確認した。
Ｎ末端にｈＧＨが結合された供与体ユビキチン（配列番号：１８）及びＮ末端にｈＧＨが結合された受容体ユビキチン（配列番号：１９）ダイマー（図２９（Ａ））と、Ｎ末端にｈＧＨが結合された供与体ユビキチン（配列番号：１８）及びＣ末端にｈＧＨが結合された受容体ユビキチン（配列番号：２０）ダイマー（図２９（Ｂ））と、Ｎ末端にｈＧＨが結合された供与体ユビキチン（配列番号：１８）及びＮ末端にＳＵＭＯとＣ末端にｈＧＨがそれぞれ結合された受容体ユビキチン（配列番号：２１）ダイマー（図２９（Ｃ））と、をそれぞれ製造し、ＵｎｉＳｔａｃダイマー（ｄｉｍｅｒ）形成を確認した。
【0072】
受容体ユビキチンは、７３番目のロイシンがプロリンで置換された形態であり、図２９（Ｃ）において、受容体ユビキチンの４８番目または図２９（Ａ）及び（Ｂ）において、６３番目のリシンを除いた残りのリシンはアルギニンで置換された形態であり、Ｃ末端は、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）または生体分子（ｈＧＨ）で延長されている形態である。
【0073】
ＵｎｉＳｔａｃ反応（図２９（Ａ）及び（Ｂ））は、ＵｎｉＳｔａｃ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ2）中で行い、ＵｎｉＳｔａｃ混合物（１μＭのＥ１、５μＭのＥ２（Ｕｂｃ１３－ＭＭＳ２複合体）、４ｍＭのＡＴＰ）を、１０μＭの受容体ユビキチンタンパク質と供与体ユビキチンタンパク質が混合された溶液（総ユビキチン濃度２０μＭ）に添加し、反応を開始した。
【0074】
また、ＵｎｉＳｔａｃ反応（図２９（Ｃ））は、前記反応と同様の条件下、Ｅ２をＵｂｃ１３－ＭＭＳ２複合体ではなくＥ２－２５Ｋに、受容体ユビキチンは６３番目ではなく４８番目のＬｙｓのみを有する形態のタンパク質に置き換えて反応を開始した。２７℃で４時間にかけて振とうしてＵｎｉＳｔａｃ反応を行い、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。ＵｎｉＳｔａｃ反応（図２９（Ｂ））では、Ｈｉｓ－ｓｕｍｏ－Ｕｂ－ｈＧＨ形態のタンパク質にＳＥＮＰ１酵素を用いてＨｉｓ－ｓｕｍｏを切り出したＵｂ－ｈＧＨ形態の受容体ユビキチンを使用し、そのとき、残存するＳＥＮＰ１がＵｎｉＳｔａｃ反応に含まれて供与体ｈＧＨ、Ｕｂｃ１３とＭＭＳ２のＨｉｓ－ｓｕｍｏも一緒に切り出し、反応後、ダイマー及びＥ２（Ｕｂｃ１３、ＭＭＳ２）のバンドシフト（ｂａｎｄ ｓｈｉｆｔ）がなされたことを確認した。
【0075】
図２９に示すように、生体分子がＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方にそれぞれ結合された形態のいずれでも、ＵｎｉＳｔａｃダイマーが形成されたことを確認した。本実施例で用いたタンパク質などの配列番号は以下のとおりである：Ｎ末端にｈＧＨが結合された供与体ユビキチン（配列番号：１８）；Ｎ末端にｈＧＨが結合された受容体ユビキチン（配列番号：１９）；Ｃ末端にｈＧＨが結合された受容体ユビキチン（配列番号：２０）；Ｎ末端にＳＵＭＯとＣ末端にｈＧＨがそれぞれ結合された受容体ユビキチン（配列番号：２１）
【0076】
実施例１３：薬物動態の確認
ジユビキチン－アルブミン（ＯＧＢ１）とアルブミン（ＯＧＢ３）をＳｐｒａｑｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ系オス９週齢ラットに単回皮下投与し、その後、時間帯ごとに血液を採取して血清中の薬物濃度を分析した。ジユビキチン－アルブミンは、０．８３３ｍｇ／ｋｇ、アルブミンは１ｍｇ／ｋｇ投与し、一群当たり雄１２匹で構成した。血中薬物濃度の分析のための採血は、投与前（Ｂｌａｎｋ）、投与後０．５、１、２、４、６、８、１２、２４、３６、４８、及び７２時間（合計１２ポイント）に一群当たり３匹ずつ行った。
ジユビキチン－アルブミン（ＯＧＢ１）とアルブミン（ＯＧＢ３）をＳｐｒａｑｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ系オス９週齢ラットに単回皮下投与し、その後、時間帯ごとに血液を採取して血清中の薬物濃度を分析した。ジユビキチン－アルブミンは、０．８３３ｍｇ／ｋｇ、アルブミンは１ｍｇ／ｋｇ投与し、一群当たり雄１２匹で構成した。血中薬物濃度の分析のための採血は、投与前（Ｂｌａｎｋ）、投与後０．５、１、２、４、６、８、１２、２４、３６、４８、及び７２時間（合計１２ポイント）に一群当たり３匹ずつ行った。
【0077】
対照群は雄５匹で構成し、投与後１及び２４時間に採血を行った。採取した血液は血清を分離し、－７０±１０℃で超低温冷凍保存した。時間ごとに採血した検体からの薬物濃度の分析は、ヒト血清アルブミンＥＬＩＳＡ ｋｉｔで測定した。ＥＬＩＳＡ分析は、希釈用バッファー（１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ）とラット共血清を１：１で混合した希釈用血清を用意して用いた。希釈用血清に、ジユビキチン－アルブミンを８００ｎｇ／ｍＬから１５．６２５ｎｇ／ｍＬまで希釈して各ウェルに分注した。各検体は、ラット共血清と希釈用バッファーを用いて最終１：１希釈用血清となるように希釈し、各ウェルに分注した。ヒト血清アルブミンｋｉｔの捕獲（Ｃａｐｔｕｒｅ）とＤｅｔｅｃｔｏｒ抗体を抗体希釈ＣＰ溶液に希釈し、抗体混合溶液を調製した。抗体混合溶液を各ウェルに１００μＬ分注し、室温で１時間、４００ｒｐｍで培養した。培養が完了したら、洗浄溶液を３００μＬずつウェルに分注し、振り落とす過程を３回繰り返した。ＴＭＢ基質溶液を各ウェルに１００μＬずつ分注し、室温で１０分、４００ｒｐｍで培養してから、Ｓｔｏｐ溶液を各ウェルに１００μＬずつ分注して器具に入れ、吸光度（ＯＤ４５０）を測定する。アルブミンは、１００ｎｇ／ｍＬから２．５ｎｇ／ｍＬまで希釈して各ウェルに分注し、残りの検体希釈と実験過程は同様に行い、吸光度を測定した。濃度ごとに測定された吸光度数値に基づいて４パラメータで検量線を算出し、検量線に対して検体から測定された吸光度数値に基づき、血清中の薬物濃度を最終算出した。血清中の試験物質の濃度測定結果について薬物動態学的パラメータをＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｖｅｒ．８．１、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ－Ａ Ｃｅｒｔａｒａ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）で算出し、薬物動態を評価した。
【0078】
図３０に示すように、ジユビキチン－アルブミン（ＯＧＢ１）がより高い血漿濃度を示すことが確認された。また、ジユビキチン－アルブミン（ＯＧＢ１）を投与した群は、アルブミン（ＯＧＢ３）を投与した群と比較して、ＡＵＣが１．８倍、Ｃｍａｘが２倍以上増加したことを確認した。よって、本発明のジユビキチン－アルブミン重合体は、より少ない濃度でより優れた薬物動態学的効果を奏することが分かる。
【0079】
結果的に、本発明の生体分子重合体は、生体内における持続時間を延長することのできる分子と結合して提供されることにより、生体内における効能持続時間を延長する必要のある薬学組成物の製造に用いることができる。
【0080】
実施例１４：Ｆｃベース（Ｆｃ－ｂａｓｅｄ）受容体タンパク質（受容体タンパク質）発現可能な組換え発現プラスミドＤＮＡの製造
受容体ユビキチンのＣ末端にキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）が直接結合された融合タンパク質を以下の方法で製造した。融合タンパク質のキャリアタンパク質として抗体断片（ＩｇＧ Ｆｃ ｄｏｍａｉｎ）を使用し、融合タンパク質を「Ｆｃベース受容体タンパク質」という。
受容体ユビキチンのＣ末端にキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）が直接結合された融合タンパク質を以下の方法で製造した。融合タンパク質のキャリアタンパク質として抗体断片（ＩｇＧ Ｆｃ ｄｏｍａｉｎ）を使用し、融合タンパク質を「Ｆｃベース受容体タンパク質」という。
【0081】
細胞に溶解性を発現させるために、タンパク質を細胞外に分泌させるシグナルペプチド（Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、受容体ユビキチン、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）、及びＦｃ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターに挿入するように設計した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターは、ＣＭＶプロモータ、アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）耐性遺伝子などを有する動物細胞用発現ベクターである。
【0082】
図３１は、Ｆｃベース受容体タンパク質を発現する遺伝子が連結されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを示す図である。Ｆｃベース受容体タンパク質を発現する塩基配列及びアミノ酸配列を、表３及び表４に示す。
【0083】
【表3】
【0084】
【表4】
【0085】
以上のＦｃベース受容体タンパク質組換え発現ベクターを確保した。
【0086】
Ｆｃベース受容体タンパク質プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡをＤＨ５αコンピテント細胞（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）に入れ、４２℃で１分間熱ショック（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）処理して形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。塗抹されたＬＢ固体培地プレートは、３７℃で１６時間以上静置培養してコロニー（Ｃｏｌｏｎｙ）を確保した。単一コロニー（Ｃｏｌｏｎｙ）を突いて、５ｍＬのＬＢ培地に接種し、その後、３７℃、２２０ｒｐｍで１６時間培養した。培養液の一部をアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を含むＬＢ培地に接種し、その後、３７℃、２２０ｒｐｍで１６時間培養した。培養液は、３，５００ｒｐｍに３０分間遠心分離して大腸菌ペレット（Ｐｅｌｌｅｔ）を確保し、続いてＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）のＰ１、Ｐ２、Ｐ３溶液を添加して細胞壁を壊し、タンパク質が分離されたＤＮＡ混濁液を確保した。ＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）の精製カラムを用いて確保したＤＮＡ混濁液からプラスミドＤＮＡペレットを確保し、自然乾燥した。乾燥したＤＮＡペレットに細胞培養用水（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて溶かし、その後、０．２２μｍのフィルターで濾過した。最終抽出したプラスミドＤＮＡは、ナノドロップ機器（ＩＭＰＬＥＮ）を用いてＤＮＡ濃度と純度を測定し、その後、タンパク質発現に使用した。
【0087】
実施例１５：Ｆｃベース受容体タンパク質（受容体タンパク質）の発現及び確認
Ｆｃベース受容体タンパク質の発現
Ｅｘｐｉ２９３Ｆヒト細胞（Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ）は、ヒト胎児性腎臓（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ）２９３細胞株（Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）に由来し、高い形質感染及び高いタンパク質発現効率を有する。
Ｆｃベース受容体タンパク質の発現
Ｅｘｐｉ２９３Ｆヒト細胞（Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ）は、ヒト胎児性腎臓（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ）２９３細胞株（Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）に由来し、高い形質感染及び高いタンパク質発現効率を有する。
【0088】
形質移入過程の２４時間前に、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（Ｇｉｂｃｏ）細胞を３×１０6 ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで接種し、８％ＣＯ2インキュベーター内のオービタルシェーカー（Ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）に装着し、３７℃、８０％湿度以上、９５ｒｐｍ（５０ｍｍのｓｈａｋｉｎｇ ｄｉａｍｅｔｅｒ）条件下で２４時間培養した。細胞を計数して細胞生存度（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）及び細胞数を確認し、最終３×１０6 ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度及び合計２００ｍＬの体積となるように、Ｅｘｐｉ２９３発現培地（Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉａ Ｇｉｂｃｏ）で希釈し、１Ｌ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに接種した。
【0089】
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ）培地１２ｍＬにＦｃベース受容体タンパク質組換え発現ベクターＤＮＡ ２００μｇと、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ）１１．２ｍＬにＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）６４０μＬとをそれぞれ希釈し、その後、室温で５分間反応させた。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２９３ Ｒｅａｇｅｎｔを含む溶液をＦｃベース受容体タンパク質組換え発現ベクターＤＮＡを含む溶液に入れて混合し、室温で１２分間反応させた。３×１０6 ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように接種した１Ｌフラスコにゆっくり分注し、形質移入（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。８％ＣＯ2インキュベーター内のオービタルシェーカー（Ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）に装着し、３７℃、８０％湿度以上、９５ｒｐｍ（５０ｍｍのｓｈａｋｉｎｇ ｄｉａｍｅｔｅｒ）条件下で１８時間培養した。１８時間後、Ｅｎｈａｎｃｅｒ １（Ｇｉｂｃｏ）１．２ ｍＬとＥｎｈａｎｃｅｒ ２（Ｇｉｂｃｏ）１２ｍＬをそれぞれ添加し、８％ＣＯ2インキュベーター内のオービタルシェーカー（Ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）に装着し、３７℃、８０％湿度以上、９５ｒｐｍ（５０ｍｍのｓｈａｋｉｎｇ ｄｉａｍｅｔｅｒ）条件下で７日培養した。
【0090】
Ｆｃベース受容体タンパク質の発現の確認
以上で確保した培養液を３，５００ｒｐｍ条件下で３０分以上遠心分離し、細胞ペレットを除いたＦｃベース受容体タンパク質の発現培養液のみを確保した。確保した培養液をフィルターに濾過して不純物を除去した。培養液からＦｃベース受容体タンパク質発程度を確認するために、８０μＬを取り、５Ｘ非還元性サンプルローディング染料（Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ）を２０μＬを加えて混合し、９５度で１０分間放置した。
以上で確保した培養液を３，５００ｒｐｍ条件下で３０分以上遠心分離し、細胞ペレットを除いたＦｃベース受容体タンパク質の発現培養液のみを確保した。確保した培養液をフィルターに濾過して不純物を除去した。培養液からＦｃベース受容体タンパク質発程度を確認するために、８０μＬを取り、５Ｘ非還元性サンプルローディング染料（Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ）を２０μＬを加えて混合し、９５度で１０分間放置した。
【0091】
発現量を定性的に分析するために、３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００、７５０、１，０００ｍｇ／ｍＬに希釈したウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）８０μＬを取り、５Ｘ非還元性サンプルローディング色素（Ｎｏｎ－ｒｅローディングダイ）２０μＬを加えて混合し、９５度で１０分間放置した。各試料及びサイズ確認用マーカータンパク質を１０％Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅゲルにロードし、８０ボルト（Ｖ）で約２０分間、１２０ボルト（Ｖ）で９０分間タンパク質を分離した。ゲルランニングが完了したら、クーマシーブリリアントブルーＲ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ）で軽く振とうしながら染色し、１０％酢酸（Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を含むバッファーを用いて軽く振とうしながら、染色したゲルの染色試薬を除去した。脱色済みのジェルは、画像ファイルで確保し、イメージジェイ（Ｉｍａｇｅ Ｊ）プログラムによってウシ血清アルブミンタンパク質のバンド量に対するＦｃベース受容体タンパク質の濃度を定性及び定量した。その結果を図３２に示す。
【0092】
図３２に示すように、１００ｋＤａサイズのＦｃベース受容体タンパク質が形成されたことを確認し、２６４．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質形成を確認した。
【0093】
Ｆｃベース受容体タンパク質の標的特異性の確認
Ｆｃベース受容体タンパク質標的特異的な発現を確認するために、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った。発現培養液８０μＬを取り、５Ｘ非還元性サンプルローディング染料（Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ）２０μＬを加えて混合し、９５度で１０分間放置した。用意された試料及びサイズ確認用マーカータンパク質を１０％Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅゲルにロードし、８０ボルト（Ｖ）で約２０分間、１２０ボルト（Ｖ）で９０分間タンパク質を分離した。ゲルは、フッ素化ポリビニリデンメンブレイン（ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に電気移動（Ｔｒａｎｓｆｅｒ）するために、０．３アンペア（Ａ）で約２時間タンパク質を移動させた。メンブレインに５％脱脂粉乳（Ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を含む１× ＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ ２０）に１時間軽く振とうしながら非特異的反応を除去するブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行った。ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体に特異的に結合するヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＨＲＰを用いてＦｃベース受容体タンパク質に特異的な発現有無を確認した。その結果を図３に示す。Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌは、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡを含まないサンプルである。
Ｆｃベース受容体タンパク質標的特異的な発現を確認するために、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った。発現培養液８０μＬを取り、５Ｘ非還元性サンプルローディング染料（Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ）２０μＬを加えて混合し、９５度で１０分間放置した。用意された試料及びサイズ確認用マーカータンパク質を１０％Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅゲルにロードし、８０ボルト（Ｖ）で約２０分間、１２０ボルト（Ｖ）で９０分間タンパク質を分離した。ゲルは、フッ素化ポリビニリデンメンブレイン（ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に電気移動（Ｔｒａｎｓｆｅｒ）するために、０．３アンペア（Ａ）で約２時間タンパク質を移動させた。メンブレインに５％脱脂粉乳（Ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を含む１× ＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ ２０）に１時間軽く振とうしながら非特異的反応を除去するブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行った。ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体に特異的に結合するヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＨＲＰを用いてＦｃベース受容体タンパク質に特異的な発現有無を確認した。その結果を図３に示す。Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌは、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡを含まないサンプルである。
【0094】
図３３に示すように、ＩｇＧ Ｆｃ抗体に特異的に結合する１００ｋＤａサイズのＦｃベース受容体タンパク質の発現が確認された。
【0095】
Ｆｃベース受容体タンパク質の精製
以上で発現したＦｃベース受容体タンパク質培養液を、Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｐｒｉｓｍ Ａ（Ｃｙｔｉｖａ）カラムにロード（ｌｏａｄｉｎｇ）した。Ｅｑｕｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを用いてカラムに結合しない不純物（ｉｍｐｕｒｉｔｙ）を除去し、Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １（５０ｍＭのＳｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ａｔ ｐＨ４．５）及びＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２（５０ｍＭのＳｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ａｔ ｐＨ４．０）を用い、ｓｔｅｐ ｅｌｕｔｉｏｎによりタンパク質を回収した。回収された受容体タンパク質に１ＭのＴｒｉｓを添加し、回収されたタンパク質をｐＨ７．５の状態にする。ｐＨ滴定後に回収された受容体タンパク質は、２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５のバッファーでｄｉａｌｙｓｉｓを行い、その後、ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎを行った。１０％のインハウス・ゲル（ｉｎ－ｈｏｕｓｅ ｇｅｌ）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥによる受容体タンパク質の精製結果を確認した。その結果を図３４及び図３５に示す。
以上で発現したＦｃベース受容体タンパク質培養液を、Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｐｒｉｓｍ Ａ（Ｃｙｔｉｖａ）カラムにロード（ｌｏａｄｉｎｇ）した。Ｅｑｕｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを用いてカラムに結合しない不純物（ｉｍｐｕｒｉｔｙ）を除去し、Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １（５０ｍＭのＳｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ａｔ ｐＨ４．５）及びＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２（５０ｍＭのＳｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ａｔ ｐＨ４．０）を用い、ｓｔｅｐ ｅｌｕｔｉｏｎによりタンパク質を回収した。回収された受容体タンパク質に１ＭのＴｒｉｓを添加し、回収されたタンパク質をｐＨ７．５の状態にする。ｐＨ滴定後に回収された受容体タンパク質は、２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５のバッファーでｄｉａｌｙｓｉｓを行い、その後、ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎを行った。１０％のインハウス・ゲル（ｉｎ－ｈｏｕｓｅ ｇｅｌ）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥによる受容体タンパク質の精製結果を確認した。その結果を図３４及び図３５に示す。
【0096】
実施例１６：ユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質（供与体タンパク質）の発現及び精製
ユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質の発現
供与体ユビキチンのＣ末端に生体分子が直接結合されているユビキチン生体分子タンパク質を以下のように製造した。
ユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質の発現
供与体ユビキチンのＣ末端に生体分子が直接結合されているユビキチン生体分子タンパク質を以下のように製造した。
【0097】
ユビキチン生体分子タンパク質を暗号化する遺伝子配列をＨｉｓ－ＳＵＭＯタグ付きｐＥＴ２１ａ ｖｅｃｔｏｒに形質転換し、その後、遺伝子が挿入されたプラスミド０．５μＬをコンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）５０μＬを含むＥチューブに入れた。その後、タッピング（ｔａｐｐｉｎｇ）して混合してから、氷中で２０分間放置した。熱衝撃を加えるために、４２℃の水槽にＥチューブを５０秒間放置した後、氷中で５分間放置した。次いで、新鮮なＬＢ培地３００μＬをＥチューブに添加し、３７振とう培養器（ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で１時間培養して形質転換を完了した。形質転換済みの細胞を、ＢＳＣ中で１００ｍｇ／ｍＬ濃度のアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を１／１０００含むＬＢプレートに拡散（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）させ、３７℃の静置培養器（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で一晩培養した。それから、得られた単一コロニー（Ｃｏｌｏｎｙ）を突いて、１００ｍｇ／ｍＬ濃度のアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を１／１０００含む１００ｍＬにＴＢ培地に接種し、その後、３７℃、２２０ｒｐｍで６時間シード（ｓｅｅｄ）培養した。
【0098】
生体分子としてＩＬ－１ＲＡを含むユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質（供与体、Ｄ－１９２）の場合、１００ｍｇ／ｍＬの濃度のアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を１／１０００含む３Ｌインハウス（Ｉｎ－ｈｏｕｓｅ）ＴＢ培地に、シード培養液を１：１００の割合で接種し、主培養（ｍａｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）を行った。Ｂｉｏｃａｎｖａｓ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ（Ｃｅｎｔｒｉｏｎ）を用い、３７℃、溶存酸素量（Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ）４０％で４時間培養し、１Ｍ ＩＰＴＧ ｓｔｏｃｋを最終濃度２００μＭにｉｎｄｕｃｔｉｏｎを行った。培養液の溶存酸素量を４０％に合わせるために、培養時間中にｉｍｐｅｌｌｅｒのＲＰＭを３００～７００ｒｐｍに自動調節した。ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ後、さらに１４時間培養し、培養を終了した。培養済みの培養液を７０００ｇに３０分間遠心分離し、大腸菌ｗｅｔ ｃｅｌｌを確保した。
【0099】
Ｃｅｄｅｘ ＢＩＯ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて培養完了後の残りの栄養素とＯｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙを測定した。結果を表５に示す。
【0100】
【表5】
【0101】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析法によってユビキチン－ＩＬ－１ＲＡを確認した結果を図３６に示す。また、ユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質の濃度を測定したところ、９６３．３２ｍｇ／Ｌであると分析された。
【0102】
ユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質の精製
ユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質を以下の過程で精製した（図３７）。
ユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質を以下の過程で精製した（図３７）。
【0103】
（Ａ）溶解／超音波処理
培養により確保したｗｅｔ ｃｅｌｌを溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いてｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎを行った。１ｇのｗｅｔ ｃｅｌｌ当たり９ｍＬの溶解バッファーを入れて行った。溶解試料を氷中に入れ、ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎをＰｕｌｅｓ ｏｎ／ｏｆｆ＝３秒／５秒、４５％のａｍｐｌｉｔｕｄｅ条件下で２０分間行った。Ｌｙｓａｔｅは、１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔのみを確保した。
培養により確保したｗｅｔ ｃｅｌｌを溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いてｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎを行った。１ｇのｗｅｔ ｃｅｌｌ当たり９ｍＬの溶解バッファーを入れて行った。溶解試料を氷中に入れ、ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎをＰｕｌｅｓ ｏｎ／ｏｆｆ＝３秒／５秒、４５％のａｍｐｌｉｔｕｄｅ条件下で２０分間行った。Ｌｙｓａｔｅは、１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔのみを確保した。
【0104】
（Ｂ）捕獲精製
Ｎｉ－セファロース樹脂（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｒｅｓｉｎ）（Ｃｙｔｉｖａ）にｌｙｓａｔｅをロード（ｌｏａｄｉｎｇ）した。サンプルのロードが完了した後、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．０２Ｍのイミダゾール）を用いてｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃタンパク質を十分に洗浄して除去した。その後、ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．２Ｍのイミダゾール）を用い、Ｈｉｇ－ＳＵＭＯタグ付きのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質を回収した。回収されたＨｉｓ－ＳＵＭＯタグ付きのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０のバッファーでｄｉａｌｙｓｉｓを行い、イミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を除去した。Ｎｉカラムによる供与体タンパク質の精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認し、その結果を図３８及び図３９に示す。
Ｎｉ－セファロース樹脂（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｒｅｓｉｎ）（Ｃｙｔｉｖａ）にｌｙｓａｔｅをロード（ｌｏａｄｉｎｇ）した。サンプルのロードが完了した後、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．０２Ｍのイミダゾール）を用いてｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃタンパク質を十分に洗浄して除去した。その後、ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．２Ｍのイミダゾール）を用い、Ｈｉｇ－ＳＵＭＯタグ付きのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質を回収した。回収されたＨｉｓ－ＳＵＭＯタグ付きのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０のバッファーでｄｉａｌｙｓｉｓを行い、イミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を除去した。Ｎｉカラムによる供与体タンパク質の精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認し、その結果を図３８及び図３９に示す。
【0105】
（Ｃ）ＳＥＮＰ１酵素消化
Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグ付きのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質及びＳＥＮＰ１を、１００ｍｇのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質：１ｍｇのＳＥＮＰ１の割合でＳＥＮＰ１酵素消化（ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を行った。Ｎｉ－精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）で回収されたタンパク質の濃度定量を行い、Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグ付きのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質量に基づいて、対応するｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＳＮＥＰ１を混合した。反応混合物を室温（１５～２５℃）で１時間放置した。ＳＥＮＰ１酵素消化をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認し、その結果を図４０に示す。
Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグ付きのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質及びＳＥＮＰ１を、１００ｍｇのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質：１ｍｇのＳＥＮＰ１の割合でＳＥＮＰ１酵素消化（ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を行った。Ｎｉ－精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）で回収されたタンパク質の濃度定量を行い、Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグ付きのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質量に基づいて、対応するｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＳＮＥＰ１を混合した。反応混合物を室温（１５～２５℃）で１時間放置した。ＳＥＮＰ１酵素消化をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認し、その結果を図４０に示す。
【0106】
（Ｄ）Ｈｉｓ－ＳＵＭＯの除去
Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．０２Ｍのイミダゾール）で平衡化したＮｉ－セファロース樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）に反応混合物をロードした。サンプルロード（Ｓａｍｐｌｅ ｌｏａｄｉｎｇ）を行い、Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグが切り取られたユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質は、フロースルーで抜けるようにした。サンプルのロードが完了した後、Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．０２Ｍのイミダゾール）を使用して残りのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質を回収し、回収したユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質を２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０のバッファーでｄｉａｌｙｓｉｓを行い、イミダゾールを除去した。Ｈｉｓ－ＳＵＭＯが除去される工程をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認し、その結果を図４１及び図４２に示す。
Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．０２Ｍのイミダゾール）で平衡化したＮｉ－セファロース樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）に反応混合物をロードした。サンプルロード（Ｓａｍｐｌｅ ｌｏａｄｉｎｇ）を行い、Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグが切り取られたユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質は、フロースルーで抜けるようにした。サンプルのロードが完了した後、Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．０２Ｍのイミダゾール）を使用して残りのユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質を回収し、回収したユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質を２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０のバッファーでｄｉａｌｙｓｉｓを行い、イミダゾールを除去した。Ｈｉｓ－ＳＵＭＯが除去される工程をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認し、その結果を図４１及び図４２に示す。
【0107】
（Ｅ）精製
Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０のバッファー）で平衡化したアニオン交換樹脂（Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｏｌｕｍｎ）カラムに、前段階で回収したユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質をロードした。ユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質は、フロースルーで抜けるようにした。回収したユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質は、最終１０ｍｇ／ｍＬとなるようにｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎを行った。研磨（Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）のためのアニオン交換樹脂工程を行い、その結果を図４３及び図４４に示す。
Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０のバッファー）で平衡化したアニオン交換樹脂（Ａｎｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｏｌｕｍｎ）カラムに、前段階で回収したユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質をロードした。ユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質は、フロースルーで抜けるようにした。回収したユビキチン－ＩＬ－１ＲＡタンパク質は、最終１０ｍｇ／ｍＬとなるようにｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎを行った。研磨（Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）のためのアニオン交換樹脂工程を行い、その結果を図４３及び図４４に示す。
【0108】
実施例１７：コンジュゲーション
コンジュゲーションの実施及び収率
実施例１８で生産された受容体タンパク質と実施例１９で生産された供与体タンパク質とを用いてコンジュゲーションを行った。受容体と供与体タンパク質のモル比を１：３にして行った。そのとき、受容体のタンパク質は、１０～５０μＭに設定可能である。その他、ＵｎｉＳｔａｃ混合物にはＥ１、Ｅ２、Ｅ３、ＡＴＰを添加し、反応を開始した。反応は２５℃で１６時間静置状態で行った。
コンジュゲーションの実施及び収率
実施例１８で生産された受容体タンパク質と実施例１９で生産された供与体タンパク質とを用いてコンジュゲーションを行った。受容体と供与体タンパク質のモル比を１：３にして行った。そのとき、受容体のタンパク質は、１０～５０μＭに設定可能である。その他、ＵｎｉＳｔａｃ混合物にはＥ１、Ｅ２、Ｅ３、ＡＴＰを添加し、反応を開始した。反応は２５℃で１６時間静置状態で行った。
【0109】
コンジュゲーション反応結果物（Ｃ－１９３）を４～１２％勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥに１．１２μｇの受容体をロードしてコンジュゲーション程度を定性分析した。その結果を図４５に示す。
【0110】
さらに、μＣＥ－ＳＤＳ分析法を用いて、反応結果物のコンジュゲーション程度を定量分析した。ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを用いて試料前処理を行い、その後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ Ｌａｂｃｈｉｐを用いて分析を行い、収率分析した。その結果を表６及び図４６に示す。
【0111】
【表6】
【0112】
【数1】
【0113】
表６のコンジュゲーション収率は、数式１を用いて計算し、ＵｎｉＳｔａｃコンジュケーション収率は、９７．２１％であり、非常に高い受容体特異的数値を示した。
【0114】
ＵｎｉＳｔａｃコンジュゲーションの精製
コンジュゲーション（Ｃ－１９３）試料のみを回収するために、以下の工程により精製を行った（図４７）。
コンジュゲーション（Ｃ－１９３）試料のみを回収するために、以下の工程により精製を行った（図４７）。
【0115】
反応結果物を、Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ）で平衡化したＮｉ－セファロース樹脂を用意する。ローディング試料は、５ＭのＮａＣｌを少量添加して、ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙを５０ｍＳ／ｃｍに合わせる。該当ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙで用意したサンプルを、準備されたカラムへのローディングを完了し、その後、ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ）を用いて不純物を除去した。その後、ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）を用いてコンジュゲーション（Ｃ－１９３）を回収した。回収されたコンジュゲーション（Ｃ－１９３）は、塩を添加していないｐＨ７．０のリン酸ナトリウムバッファーでｄｉａｌｙｓｉｓを行い、塩及びイミダゾールを除去した。Ｎｉ精製結果をクロマトグラフィーにより確認し、それを図４８及び図４９に示す。
【0116】
Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０のバッファー）で平衡化したアニオン交換樹脂（Ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）カラムに、コンジュゲーションをロードした。Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２５０ｍＭのＮａＣｌ）を用いてコンジュゲーションを回収した。その結果を図５０及び図５１に示す。
【0117】
最終ＵｎｉＳｔａｃ
コンジュゲーション（Ｃ－１９３）を剤型化バッファー（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（４．６ｍＭのＨｉｓｔｉｄｉｎｅ、５．７ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＡｒｇｉｎｉｎｅ、０．１ｇ／ｍＬのｔｒｅｈａｌｏｓｅ）でｄｉａｌｙｓｉｓを用いてフォーミュレーションを行った。最終ＵｎｉＳｔａｃ産物は、１．１及び０．５ｍｇ／ｍＬとなるように希釈して用意した。得られた資料を、－７０℃のｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒに保管した。
コンジュゲーション（Ｃ－１９３）を剤型化バッファー（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（４．６ｍＭのＨｉｓｔｉｄｉｎｅ、５．７ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＡｒｇｉｎｉｎｅ、０．１ｇ／ｍＬのｔｒｅｈａｌｏｓｅ）でｄｉａｌｙｓｉｓを用いてフォーミュレーションを行った。最終ＵｎｉＳｔａｃ産物は、１．１及び０．５ｍｇ／ｍＬとなるように希釈して用意した。得られた資料を、－７０℃のｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒに保管した。
【0118】
実施例１８：最終ＵｎｉＳｔａｃ重合体の異化学分析
最終ＵｎｉＳｔａｃ重合体（Ｄｒｕｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｃ－１９３）の純度を測定するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（還元（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ）及びネイティブ（Ｎａｔｉｖｅ）条件）、μＣＥ－ＳＤＳ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を行った。
最終ＵｎｉＳｔａｃ重合体（Ｄｒｕｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｃ－１９３）の純度を測定するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（還元（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ）及びネイティブ（Ｎａｔｉｖｅ）条件）、μＣＥ－ＳＤＳ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を行った。
【0119】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
最終結合体産物（ＤＳ、Ｃ－１９３）を還元（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件で分析するために、４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ ＧｅｌとＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを用いて還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。用意されたＰＡＧＥに３μｇずつ試料ローディングを行い、その結果を図５２に示す。
最終結合体産物（ＤＳ、Ｃ－１９３）を還元（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件で分析するために、４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ ＧｅｌとＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを用いて還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。用意されたＰＡＧＥに３μｇずつ試料ローディングを行い、その結果を図５２に示す。
【0120】
最終結合体産物（Ｃ－１９３ ＤＳ）をネイティブ（Ｎａｔｉｖｅ）条件で分析するために、４－１５％のＴ／Ｇ－ＰＡＧ－ＢＣ ｎｏｎ－ＳＤＳとＴｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎａｔｉｖｅ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを用い、ネイティブ－ＰＡＧＥ分析を行った。用意されたＰＡＧＥに４．５μｇずつ試料ローディングを行い、その結果を図５３に示す。
【0121】
μＣＥ－ＳＤＳ分析
μＣＥ－ＳＤＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌａｂｃｈｉｐ ＧＸ ＩＩ Ｔｏｕｃｈ．） 分析法を用いて、Ｃ－１９３ ＤＳ資料に含まれているｆｒａｇｍｅｎｔ含有程度を分析した。ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて試料前処理を行い、その後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ Ｌａｂｃｈｉｐ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて分析を行った。その結果を表７及び図５４に示す。
μＣＥ－ＳＤＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌａｂｃｈｉｐ ＧＸ ＩＩ Ｔｏｕｃｈ．） 分析法を用いて、Ｃ－１９３ ＤＳ資料に含まれているｆｒａｇｍｅｎｔ含有程度を分析した。ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて試料前処理を行い、その後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙ Ｌａｂｃｈｉｐ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて分析を行った。その結果を表７及び図５４に示す。
【0122】
【表7】
【0123】
【数2】
【0124】
数式２を用いてモノマー純度を計算した結果を表７に示し、９８％以上と高いモノマー純度を確認した。
【0125】
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析
ＳＥＣ－ＨＰＬＣカラム及びＡｌｌｉａｎｃｅ ｅ２６９５ ＸＣ ＨＰＬＣ機器を用いて、Ｃ－１９３ ＤＳ資料に含まれているＨｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔの含有程度を分析した。Ｃ－１９３ＤＳ試料約３０μｇをそれぞれ準備したカラムにｉｎｊｅｃｔｉｏｎして分析を行った。その結果を表８及び図５５に示す。
ＳＥＣ－ＨＰＬＣカラム及びＡｌｌｉａｎｃｅ ｅ２６９５ ＸＣ ＨＰＬＣ機器を用いて、Ｃ－１９３ ＤＳ資料に含まれているＨｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔの含有程度を分析した。Ｃ－１９３ＤＳ試料約３０μｇをそれぞれ準備したカラムにｉｎｊｅｃｔｉｏｎして分析を行った。その結果を表８及び図５５に示す。
【0126】
【表8】
【0127】
数式２を用いてモノマー純度を計算した結果を表８に示し、１００％と非常に高いモノマー純度を確認した。
【0128】
実施例１９：融合タンパク質（Ｃ－１９２、Ｃ－１９３及びＤ－１９２）の薬物動態の比較
供与体タンパク質（Ｄ－１９２）、ＵｎｉＳｔａｃタンパク質（Ｃ－１９３）、及びヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ－ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）をキャリアとする受容体タンパク質を用いた融合タンパク質（Ｃ－１９２）を用意した。当該３つの試料に対する構造を図５６に示す。
供与体タンパク質（Ｄ－１９２）、ＵｎｉＳｔａｃタンパク質（Ｃ－１９３）、及びヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ－ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）をキャリアとする受容体タンパク質を用いた融合タンパク質（Ｃ－１９２）を用意した。当該３つの試料に対する構造を図５６に示す。
【0129】
その３つの試料を用いて９週齢雄ＩＣＲマウスに単回皮下投与し、その後、時間帯ごとに血液を採取して血中薬物濃度を分析し、薬物動態パラメータを算出するために、薬物動態測定試験を行った。
【0130】
（株）オリエントバイオ（Ｏｒｉｅｎｔ ＢＩＯ、Ｋｏｒｅａ）から購入した８週齢の雄ＩＣＲマウスを７日間検疫し、純化させた。検疫及び純化後、全ての動物に対して体重を順位付け、各群の平均体重が均一に分布するように群分離（採血時間当たりｎ＝２）を行った。その後、Ｃ－１９２試験物質を１０ｍｇ／ｋｇ、Ｃ－１９３試験物質を１ｍｇ／ｋｇ、及びＤ－１９２試験物質を１ｍｇ／ｋｇの用量で各マウスに単回皮下投与した。採血時点は、投与前、Ｃ－１９２投与後の２、６、８、１０、１６、３２、２４、４８、７２及び９６時間、Ｃ－１９３投与後の０．５、１、２、４、６、８、１０、１６、２４、３２、４０、４８、５６及び７２時間、及びＤ－１９２投与後の１、２、３、４、５及び６時間にそれぞれ実施した。採取した血液は、遠心分離により血清を分離し、血中薬物濃度分析のために－７０±１０℃で保存した。
【0131】
試験物質の血中薬物濃度を測定するために、ＩＬ－１ＲＡに特異的な反応性を有するＨｕｍａｎ ＩＬ－１ＲＡ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）を用いた。まず、９６ウェルプレートに標準物質及び時間帯ごとの血清を５０μＬずつ分注し、次にＨｕｍａｎ ＩＬ－１ＲＡ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔで提供する抗体ｃｏｃｋｔａｉｌを各ウェルに５０μＬずつ分注して、２５℃の混合装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒ）で４００ｒｐｍで１時間反応させた。ウェルプレートの溶液を捨て、残渣が残らないように振り払った。洗浄液３００μＬを各ウェルに分注し、それから捨てて振り払う過程を３回繰り返した。発色剤を各ウェルに１００μＬずつ分注し、それから２５℃の混合装置に４００ｒｐｍで１０分間反応させた。
【0132】
最後に、停止液を各ウェルに１００μＬずつ分注し、それから吸光度測定器（Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。標準物質に対して算出された時間帯ごとの血清中の薬物の濃度は、薬物動態パラメータの算出に用いられた。マウスにおける融合タンパク質（Ｃ－１９２、Ｃ－１９３及びＤ－１９２）の皮下投与後の経時的な血中薬物濃度グラフを図５７及び図５８に示す。
【0133】
さらに、以上の実験結果に基づく薬物動態パラメータの算出結果を、表９に示す。
【0134】
【表9】
【0135】
表９に示すように、薬物の体内安定性を示す半減期に基づいて３つの融合タンパク質を比較評価すると、ヒト血清アルブミンをキャリアとする融合タンパク質（Ｃ－１９２）は、受容体タンパク質（Ｄ－１９２）と比較して、半減期が０．４時間から９．３時間に約２３倍増加することを確認した。
【0136】
また、Ｆｃをキャリアとする融合タンパク質（Ｃ－１９３）は、受容体タンパク質（Ｄ－１９２）と比較して、半減期が０．４時間から１３．７時間に約３３倍増加することを確認した。
【0137】
結局、アルブミン及びＦｃキャリアが融合された融合タンパク質は、半減期、ＡＵＣ、Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘを増加させて優れた薬物動態特性を有することから、少ない用量で所望の部位に薬物を適用可能な優れた医薬品として活用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【図25】
【図26A】
【図26B】
【図27A】
【図27B】
【図28A】
【図28B】
【図29A】
【図29B】
【図29C】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【図57】
【図58】
【配列表】