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特許7523898発酵工程中の機能性ペプチド含有量の減少が抑制された、はっ酵乳の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-19
(45)【発行日】2024-07-29
(54)【発明の名称】発酵工程中の機能性ペプチド含有量の減少が抑制された、はっ酵乳の製造方法
(51)【国際特許分類】
A23C 9/13 20060101AFI20240722BHJP
A23C 9/123 20060101ALI20240722BHJP
A23L 33/18 20160101ALN20240722BHJP
【ＦＩ】
A23C9/13 ZNA
A23C9/123
A23L33/18
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019180878
(22)【出願日】2019-09-30
(65)【公開番号】P2021052694
(43)【公開日】2021-04-08
【審査請求日】2022-09-01
(73)【特許権者】
【識別番号】000253503
【氏名又は名称】キリンホールディングス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100102255
【弁理士】
【氏名又は名称】小澤 誠次
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100188352
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 一弘
(74)【代理人】
【識別番号】100113860
【弁理士】
【氏名又は名称】松橋 泰典
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100198074
【弁理士】
【氏名又は名称】山村 昭裕
(74)【代理人】
【氏名又は名称】富田 博行
(72)【発明者】
【氏名】田浦 啓子
(72)【発明者】
【氏名】阿野 泰久
【審査官】厚田 一拓
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１３－２３３０９７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１３－０９０６０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１９－１３６００２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１１／１０５３３５（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｃ １／００ － ２３／００
Ａ２３Ｌ ２／００ － ３５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＦＳＴＡ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
はっ酵乳の製造において、原料乳と、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるテトラペプチド（ＧＴＷＹテトラペプチド）とを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスの菌体を用いることを特徴とする、０．１～１００ｍｇ／ｋｇのＧＴＷＹテトラペプチドを含有するはっ酵乳の製造方法。
【請求項2】
はっ酵乳の製造において、原料乳とＧＴＷＹテトラペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体を用いることを特徴とする、０．１～１００ｍｇ／ｋｇのＧＴＷＹテトラペプチドを含有するはっ酵乳の製造に際し、前記はっ酵乳原料配合液の発酵工程中のＧＴＷＹテトラペプチド含有量の減少を抑制する方法。
【請求項3】
０．１～１００ｍｇ／ｋｇのＧＴＷＹテトラペプチドを含有するはっ酵乳の製造において、原料乳とＧＴＷＹテトラペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための組成物であって、ラクトコッカス・ラクティスの菌体を有効成分とする、発酵工程における前記ＧＴＷＹペプチドの減少抑制用組成物。
【請求項4】
０．１～１００ｍｇ／ｋｇのＧＴＷＹテトラペプチドを含有するはっ酵乳の製造において、牛乳及び大豆ペプチドのいずれも含まず、ホエイペプチド及び／またはカゼインペプチドを含み、かつ、ＧＴＷＹペプチドの含有量が０．１～１００ｍｇ／ｋｇであるはっ酵乳原料配合液を、ラクトコッカス・ラクティスの菌体を用いて発酵させることを特徴とする、発酵によるＧＴＷＹテトラペプチドの減少を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、特定の機能性ペプチドを含むはっ酵乳原料配合液（すなわち、はっ酵乳の原料の配合液）を乳酸菌で発酵させる際に、発酵工程中の該特定の機能性ペプチド含有量の減少が抑制された、はっ酵乳の製造方法や、発酵工程中の特定の機能性ペプチド含有量の減少を抑制する方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
有用な生理活性を有する様々なペプチドが知られており、そのようなペプチドを有する飲食品への注目が近年高まっている。例えば特許文献１には、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｔｒｐ－ＴｙｒのＮ末端から３残基以上の連続したアミノ酸配列を含むペプチド又は該ペプチドを含有するβ－ラクトグロブリン加水分解物を、前記ペプチドの含量が添加後の全体量に対して０．０１重量％以上となる量で含む、発酵乳飲食品などが開示されている。特許文献１のこのペプチドは、β－ラクトグロブリンをトリプシンで加水分解することにより調製することができる。また、特許文献２には、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＮＣＭ Ｉ－３９９７、ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＮＣＭ Ｉ－３９９８およびラクトバチルス・ヘルベティカスＣＮＣＭ Ｉ－３９９９から選択されるラクトバチルス・ヘルベティカスの乳酸菌株と、トリペプチドＩＰＰ、ＶＰＰ、およびＬＰＰの混合物とを含む発酵乳製品が開示されている。特許文献２のこのペプチドは、前述の特定の乳酸菌株で乳を発酵させることにより調製することができる。
【0003】
また、これまでに本発明者らは、記憶学習機能及び／又は認知機能を増強する活性を有するペプチドを、ホエイ又はカゼインのタンパク分解物から見いだしている（特許文献３）。特許文献３には、かかるペプチドとして、ＧＴＷＹ（特許文献３の配列番号７；本願の配列番号１）のアミノ酸配列からなるテトラペプチド（以下、「ＧＴＷＹテトラペプチド」とも表す。）、ＷＹ（特許文献３の配列番号１３）のアミノ酸配列からなるジペプチド（以下、「ＷＹジペプチド」とも表す。）、ＷＬ（特許文献３の配列番号１５）のアミノ酸配列からなるジペプチド（以下、「ＷＬジペプチド」とも表す。）などが開示されている。また、特許文献３には、記憶学習機能等を増強する活性を有するペプチドを飲食品に配合することが記載されている。
【0004】
ところで、はっ酵乳の製造に使用することができる乳酸菌として、多くの種類の乳酸菌が知られており、かかる乳酸菌には例えば、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス、ラクトバシラス・ヘルベティカス、ラクトバシラス・デルブリッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクス等が含まれている（特許文献４）
【0005】
しかし、特許文献３に記載の特定の機能性ペプチドを含むはっ酵乳原料配合液を特定の乳酸菌で発酵させることにより、発酵工程中の該特定の機能性ペプチド含有量の減少が抑制されることはこれまで知られておらず、また、そのように減少が抑制される、特定のペプチドと特定の乳酸菌との組み合わせもこれまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開２０１１－１４４１６７号公報
【文献】特開２０１１－５２４７４４号公報
【文献】ＷＯ２０１５／１９４５６４号パンフレット
【文献】特開２０１７－１８４６８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、特許文献３に記載の生理活性ペプチドを含有するはっ酵乳の開発を行うこととした。はっ酵乳に生理活性ペプチドを含ませるタイミングは、発酵工程より前や後に添加するか、発酵に伴う酵素反応などで生成させることが考えられるところ、本発明者らは、発酵工程前にペプチドを添加する方法は、発酵が進行する過程で該ペプチドの含有量が大幅に減少してしまう場合が多いという課題を見出した。
【0008】
本発明の課題は、特定の機能性ペプチドを含むはっ酵乳原料配合液を乳酸菌で発酵させる際に、発酵工程中の該特定の機能性ペプチド含有量の減少が抑制された、はっ酵乳の製造方法や、発酵工程中の特定の機能性ペプチド含有量の減少を抑制する方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題を解決するべく、鋭意検討を行ったところ、ＧＴＷＹテトラペプチドを含むはっ酵乳原料配合液を発酵する場合には、ラクトコッカス・ラクティスを用いると、はっ酵乳原料配合液に配合する乳や発酵促進成分の種類にかかわらず、ＧＴＷＹテトラペプチドの含有量の減少を抑制することができ、
ＷＹジペプチドを含むはっ酵乳原料配合液を発酵する場合には、ラクトバシラス・ヘルベティカスを用いると、はっ酵乳原料配合液に配合する乳や発酵促進成分の種類にかかわらず、ＷＹジペプチドの含有量の減少を抑制することができ、ＷＬジペプチドを含むはっ酵乳原料配合液を発酵する場合には、ラクトコッカス・ラクティス及び／又はラクトバシラス・デルブリッキを用いると、はっ酵乳原料配合液に配合する乳や発酵促進成分の種類にかかわらず、ＷＬジペプチドの含有量の減少を抑制することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
ＷＹジペプチドを含むはっ酵乳原料配合液を発酵する場合には、ラクトバシラス・ヘルベティカスを用いると、はっ酵乳原料配合液に配合する乳や発酵促進成分の種類にかかわらず、ＷＹジペプチドの含有量の減少を抑制することができ、ＷＬジペプチドを含むはっ酵乳原料配合液を発酵する場合には、ラクトコッカス・ラクティス及び／又はラクトバシラス・デルブリッキを用いると、はっ酵乳原料配合液に配合する乳や発酵促進成分の種類にかかわらず、ＷＬジペプチドの含有量の減少を抑制することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【0010】
すなわち、本発明は、
（１）はっ酵乳の製造において、原料乳と、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるテトラペプチド（ＧＴＷＹテトラペプチド）とを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体を用いることを特徴とする、０．１～１００ｍｇ／ｋｇのＧＴＷＹテトラペプチドを含有するはっ酵乳の製造方法；
（２）ラクトコッカス・ラクティスの菌体が、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスの菌体、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体である、上記（１）に記載のはっ酵乳の製造方法；
（３）はっ酵乳の製造において、原料乳とＧＴＷＹテトラペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体を用いることを特徴とする、
０．１～１００ｍｇ／ｋｇのＧＴＷＹテトラペプチドを含有するはっ酵乳の製造に際し、前記はっ酵乳原料配合液の発酵工程中のＧＴＷＹテトラペプチド含有量の減少を抑制する方法。
（４）はっ酵乳の製造において、原料乳と、ＷＹのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＷＹジペプチド）とを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトバシラス・ヘルベティカスの菌体を用いることを特徴とする、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇのＷＹジペプチドを含有するはっ酵乳の製造方法；
（５）はっ酵乳の製造において、原料乳とＷＹジペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトバシラス・ヘルベティカスの菌体を用いることを特徴とする、
０．０１～５０ｍｇ／ｋｇのＷＹジペプチドを含有するはっ酵乳の製造に際し、前記はっ酵乳原料配合液の発酵工程中のＷＹジペプチド含有量の減少を抑制する方法；
（６）はっ酵乳の製造において、原料乳と、ＷＬのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＷＬジペプチド）とを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体を用いることを特徴とする、０．０２～５０ｍｇ／ｋｇのＷＬジペプチドを含有するはっ酵乳の製造方法；
（７）ラクトコッカス・ラクティスの菌体が、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスの菌体であり、及び、ラクトバシラス・デルブリッキの菌体が、ラクトバシラス・デルブリッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスの菌体である、上記（６）に記載のはっ酵乳の製造方法；や
（８）はっ酵乳の製造において、原料乳とＷＬジペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体を用いることを特徴とする、
０．０２～５０ｍｇ／ｋｇのＷＬジペプチドを含有するはっ酵乳の製造に際し、前記はっ酵乳原料配合液の発酵工程中のＷＬジペプチド含有量の減少を抑制する方法；
などに関する。
（１）はっ酵乳の製造において、原料乳と、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるテトラペプチド（ＧＴＷＹテトラペプチド）とを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体を用いることを特徴とする、０．１～１００ｍｇ／ｋｇのＧＴＷＹテトラペプチドを含有するはっ酵乳の製造方法；
（２）ラクトコッカス・ラクティスの菌体が、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスの菌体、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体である、上記（１）に記載のはっ酵乳の製造方法；
（３）はっ酵乳の製造において、原料乳とＧＴＷＹテトラペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体を用いることを特徴とする、
０．１～１００ｍｇ／ｋｇのＧＴＷＹテトラペプチドを含有するはっ酵乳の製造に際し、前記はっ酵乳原料配合液の発酵工程中のＧＴＷＹテトラペプチド含有量の減少を抑制する方法。
（４）はっ酵乳の製造において、原料乳と、ＷＹのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＷＹジペプチド）とを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトバシラス・ヘルベティカスの菌体を用いることを特徴とする、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇのＷＹジペプチドを含有するはっ酵乳の製造方法；
（５）はっ酵乳の製造において、原料乳とＷＹジペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトバシラス・ヘルベティカスの菌体を用いることを特徴とする、
０．０１～５０ｍｇ／ｋｇのＷＹジペプチドを含有するはっ酵乳の製造に際し、前記はっ酵乳原料配合液の発酵工程中のＷＹジペプチド含有量の減少を抑制する方法；
（６）はっ酵乳の製造において、原料乳と、ＷＬのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＷＬジペプチド）とを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体を用いることを特徴とする、０．０２～５０ｍｇ／ｋｇのＷＬジペプチドを含有するはっ酵乳の製造方法；
（７）ラクトコッカス・ラクティスの菌体が、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスの菌体であり、及び、ラクトバシラス・デルブリッキの菌体が、ラクトバシラス・デルブリッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスの菌体である、上記（６）に記載のはっ酵乳の製造方法；や
（８）はっ酵乳の製造において、原料乳とＷＬジペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体を用いることを特徴とする、
０．０２～５０ｍｇ／ｋｇのＷＬジペプチドを含有するはっ酵乳の製造に際し、前記はっ酵乳原料配合液の発酵工程中のＷＬジペプチド含有量の減少を抑制する方法；
などに関する。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、特定の機能性ペプチドを含むはっ酵乳原料配合液を乳酸菌で発酵させる際に、発酵工程中の該特定の機能性ペプチド含有量の減少が抑制された、はっ酵乳の製造方法や、発酵工程中の特定の機能性ペプチド含有量の減少を抑制する方法等を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、
［１］はっ酵乳の製造方法において、原料乳と、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるテトラペプチド（ＧＴＷＹテトラペプチド）とを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体を用いることを特徴とする、０．１～１００ｍｇ／ｋｇのＧＴＷＹテトラペプチドを含有するはっ酵乳の製造方法（以下、「本発明の製造方法１」とも表示する。）；や、
［２］はっ酵乳の製造において、原料乳とＧＴＷＹテトラペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体を用いることを特徴とする、
０．１～１００ｍｇ／ｋｇのＧＴＷＹテトラペプチドを含有するはっ酵乳の製造に際し、前記はっ酵乳原料配合液の発酵工程中のＧＴＷＹテトラペプチド含有量の減少を抑制する方法（以下、「本発明の抑制方法１」とも表示する。）；や、
［３］はっ酵乳の製造方法において、原料乳と、ＷＹのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＷＹジペプチド）とを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトバシラス・ヘルベティカスの菌体を用いることを特徴とする、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇのＷＹジペプチドを含有するはっ酵乳の製造方法（以下、「本発明の製造方法２」とも表示する。）；や、
［４］はっ酵乳の製造において、原料乳とＷＹジペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトバシラス・ヘルベティカスの菌体を用いることを特徴とする、
０．０１～５０ｍｇ／ｋｇのＷＹジペプチドを含有するはっ酵乳の製造に際し、前記はっ酵乳原料配合液の発酵工程中のＷＹジペプチド含有量の減少を抑制する方法（以下、「本発明の抑制方法２」とも表示する。）；や、
［５］はっ酵乳の製造方法において、原料乳と、ＷＬのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＷＬジペプチド）とを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体を用いることを特徴とする、０．０２～５０ｍｇ／ｋｇのＷＬジペプチドを含有するはっ酵乳の製造方法（以下、「本発明の製造方法３」とも表示する。）；や、
［６］はっ酵乳の製造において、原料乳とＷＬジペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体を用いることを特徴とする、
０．０２～５０ｍｇ／ｋｇのＷＬジペプチドを含有するはっ酵乳の製造に際し、前記はっ酵乳原料配合液の発酵工程中のＷＬジペプチド含有量の減少を抑制する方法（以下、「本発明の抑制方法３」とも表示する。）；や、
［７］ラクトコッカス・ラクティスの菌体と、０．１～１００ｍｇ／ｋｇのＧＴＷＹテトラペプチドとを含有するはっ酵乳（以下、「本発明のはっ酵乳１とも表示する。）や、
［８］ラクトバシラス・ヘルベティカスの菌体と、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇのＷＹジペプチドとを含有するはっ酵乳（以下、「本発明のはっ酵乳２」とも表示する。）や、
［９］ラクトコッカス・ラクティスの菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体と、０．０２～５０ｍｇ／ｋｇのＷＬジペプチドを含有するはっ酵乳（以下、「本発明のはっ酵乳３」とも表示する。）、
などの実施態様を含んでいる。
［１］はっ酵乳の製造方法において、原料乳と、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるテトラペプチド（ＧＴＷＹテトラペプチド）とを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体を用いることを特徴とする、０．１～１００ｍｇ／ｋｇのＧＴＷＹテトラペプチドを含有するはっ酵乳の製造方法（以下、「本発明の製造方法１」とも表示する。）；や、
［２］はっ酵乳の製造において、原料乳とＧＴＷＹテトラペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体を用いることを特徴とする、
０．１～１００ｍｇ／ｋｇのＧＴＷＹテトラペプチドを含有するはっ酵乳の製造に際し、前記はっ酵乳原料配合液の発酵工程中のＧＴＷＹテトラペプチド含有量の減少を抑制する方法（以下、「本発明の抑制方法１」とも表示する。）；や、
［３］はっ酵乳の製造方法において、原料乳と、ＷＹのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＷＹジペプチド）とを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトバシラス・ヘルベティカスの菌体を用いることを特徴とする、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇのＷＹジペプチドを含有するはっ酵乳の製造方法（以下、「本発明の製造方法２」とも表示する。）；や、
［４］はっ酵乳の製造において、原料乳とＷＹジペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトバシラス・ヘルベティカスの菌体を用いることを特徴とする、
０．０１～５０ｍｇ／ｋｇのＷＹジペプチドを含有するはっ酵乳の製造に際し、前記はっ酵乳原料配合液の発酵工程中のＷＹジペプチド含有量の減少を抑制する方法（以下、「本発明の抑制方法２」とも表示する。）；や、
［５］はっ酵乳の製造方法において、原料乳と、ＷＬのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＷＬジペプチド）とを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体を用いることを特徴とする、０．０２～５０ｍｇ／ｋｇのＷＬジペプチドを含有するはっ酵乳の製造方法（以下、「本発明の製造方法３」とも表示する。）；や、
［６］はっ酵乳の製造において、原料乳とＷＬジペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクティスの菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体を用いることを特徴とする、
０．０２～５０ｍｇ／ｋｇのＷＬジペプチドを含有するはっ酵乳の製造に際し、前記はっ酵乳原料配合液の発酵工程中のＷＬジペプチド含有量の減少を抑制する方法（以下、「本発明の抑制方法３」とも表示する。）；や、
［７］ラクトコッカス・ラクティスの菌体と、０．１～１００ｍｇ／ｋｇのＧＴＷＹテトラペプチドとを含有するはっ酵乳（以下、「本発明のはっ酵乳１とも表示する。）や、
［８］ラクトバシラス・ヘルベティカスの菌体と、０．０１～５０ｍｇ／ｋｇのＷＹジペプチドとを含有するはっ酵乳（以下、「本発明のはっ酵乳２」とも表示する。）や、
［９］ラクトコッカス・ラクティスの菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体と、０．０２～５０ｍｇ／ｋｇのＷＬジペプチドを含有するはっ酵乳（以下、「本発明のはっ酵乳３」とも表示する。）、
などの実施態様を含んでいる。
【0013】
（はっ酵乳）
本明細書において「はっ酵乳」とは、乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（乳等省令 ）で定義される「発酵乳」、「乳製品乳酸菌飲料」、および「乳酸菌飲料」を包含する意味である。「発酵乳」の成分規格は、無脂乳固形分８．０％以上、乳酸菌（又は酵母数）１０００万個／ｍＬ以上であり、「乳製品乳酸菌飲料」の成分規格は、無脂乳固形分３．０％以上、乳酸菌・酵母数１０００万個／ｍＬ以上であり、「乳酸菌飲料」の成分規格は、無脂乳固形分３．０％未満、乳酸菌・酵母数１００万個／ｍＬ以上である。
本明細書において「はっ酵乳」とは、乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（乳等省令 ）で定義される「発酵乳」、「乳製品乳酸菌飲料」、および「乳酸菌飲料」を包含する意味である。「発酵乳」の成分規格は、無脂乳固形分８．０％以上、乳酸菌（又は酵母数）１０００万個／ｍＬ以上であり、「乳製品乳酸菌飲料」の成分規格は、無脂乳固形分３．０％以上、乳酸菌・酵母数１０００万個／ｍＬ以上であり、「乳酸菌飲料」の成分規格は、無脂乳固形分３．０％未満、乳酸菌・酵母数１００万個／ｍＬ以上である。
【0014】
本明細書における「はっ酵乳」には、例えば、生乳、牛乳、特別牛乳、生山羊乳、殺菌山羊乳、生めん羊乳、成分調整牛乳、低脂肪牛乳、無脂肪牛乳および加工乳などの乳またはこれと同等以上の無脂乳固形分を含む乳等を、乳酸菌で発酵させ、糊状または液状にしたものまたはこれらを凍結したものが含まれる。
【0015】
本発明における「はっ酵乳」としては発酵乳（ヨーグルト）が好ましく挙げられ、ヨーグルトとしては、ハードヨーグルト、ソフトヨーグルト（糊状はっ酵乳）、ドリンクヨーグルト（液状はっ酵乳）、フローズンヨーグルト（凍結状はっ酵乳）が挙げられる。なお、発酵乳の種類としては、大別すると、容器にはっ酵乳原料配合液を充填して発酵させた凝固状のヨーグルト（静置型ヨーグルト、後発酵タイプのヨーグルト）と、タンクにはっ酵乳原料配合液を入れて発酵し、生じたカードを砕き、これを容器に充填したヨーグルト（撹拌型ヨーグルト、前発酵タイプのヨーグルト）と、があるが、本発明における発酵乳は前発酵タイプであってもよいし、後発酵タイプであってもよい。ハードヨーグルトは通常は静置型ヨーグルトであり、ソフトヨーグルト、ドリンクヨーグルト、フローズンヨーグルトは通常は攪拌型ヨーグルトである。
【0016】
（ペプチド）
本発明の製造方法１や本発明の抑制方法１や本発明のはっ酵乳１では、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるテトラペプチド（ＧＴＷＹテトラペプチド）を少なくとも用い、本発明の製造方法２や本発明の抑制方法２や本発明のはっ酵乳２では、ＷＹのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＷＹジペプチド）を少なくとも用い、本発明の製造方法３や本発明の抑制方法３や本発明のはっ酵乳３では、ＷＬのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＷＬジペプチド）を少なくとも用いる。以下、本明細書において、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド及びＷＬジペプチドからなる群から選択される１種又は２種又は３種のペプチドを、「本発明におけるペプチド」とも表示する。本発明におけるペプチドは、前述したように、記憶学習機能及び／又は認知機能を増強する活性を有するペプチドである（特許文献３）。
本発明の製造方法１や本発明の抑制方法１や本発明のはっ酵乳１では、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるテトラペプチド（ＧＴＷＹテトラペプチド）を少なくとも用い、本発明の製造方法２や本発明の抑制方法２や本発明のはっ酵乳２では、ＷＹのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＷＹジペプチド）を少なくとも用い、本発明の製造方法３や本発明の抑制方法３や本発明のはっ酵乳３では、ＷＬのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＷＬジペプチド）を少なくとも用いる。以下、本明細書において、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド及びＷＬジペプチドからなる群から選択される１種又は２種又は３種のペプチドを、「本発明におけるペプチド」とも表示する。本発明におけるペプチドは、前述したように、記憶学習機能及び／又は認知機能を増強する活性を有するペプチドである（特許文献３）。
【0017】
本発明におけるペプチドは、化学合成によって得られたものを用いてもよく、乳、大豆、小麦、卵、畜肉、魚肉、魚介などに由来するタンパク質やポリペプチド原料等から化学的もしくは酵素的に分解して得られたものを用いてもよい。具体的には、例えば、本発明に用いるペプチドの配列は、少なくとも、乳のホエイやカゼイン、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、大豆のグリシニン、小麦のグルテニン、卵黄のリボビテリン、卵白のオボアルブミン、オボトランスフェリン、リゾチウム、チキン蛋白のコラーゲンなどに含まれているから、それらや、それらを含有する食品もしくは食品素材を酸加水分解やプロテアーゼによる酵素処理、又は微生物発酵等に供して、上記ペプチドを生成させることができる。本発明の組成物としてはその調製物をそのまま用いてもよいし、濃縮したり、スプレードライや凍結乾燥等により乾燥粉末として用いてもよい。また、必要に応じて不純物、塩、酵素等の除去など、任意の程度の精製を施して用いてもよい。
【0018】
本発明におけるペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ型のアミノ酸のみから構成されていてもよいし、Ｄ型のアミノ酸のみから構成されていてもよいし、あるいは両者が混在したペプチドのいずれであってもよい。また、天然に存在するアミノ酸のみから構成されていてもよいし、アミノ酸にリン酸化やグリコシル化等、任意の官能基が結合した修飾アミノ酸のみから構成されていてもよいし、あるいは両者が混在したペプチドのいずれであってもよい。また、ペプチドが２以上の不斉炭素を含む場合には、エナンチオマー、ジアステレオマー、あるいは両者が混在したペプチドのいずれであってもよい。
【0019】
さらに、本発明におけるペプチドは、その薬学上許容される塩もしくは溶媒和物であってもよい。例えば、薬学上許容される酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩などが挙げられる。また、薬学上許容される金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩などが挙げられる。また、薬学上許容されるアンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられる。また、薬学上許容される有機アミン付加塩としては、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられる。
【0020】
本発明に用いる「本発明におけるペプチド」（すなわち、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド及びＷＬジペプチドからなる群から選択される１種又は２種又は３種のペプチド）としては、「本発明におけるペプチド」；「本発明におけるペプチドを含む組成物」；「本発明におけるペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつ、はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合に本発明におけるペプチドを生じることができるペプチド及び／又はタンパク質」などが挙げられ、「本発明におけるペプチド」をより高濃度で含むはっ酵乳を製造する観点から、「本発明におけるペプチド」や、「本発明におけるペプチドを含む組成物」が好ましく挙げられ、より低いコストで利用できる観点から、「本発明におけるペプチドを含む組成物」がより好ましく挙げられる。
なお、「本発明におけるペプチド」；「本発明におけるペプチドを含む組成物」；「本発明におけるペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつ、はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合に本発明におけるペプチドを生じることができるペプチド及び／又はタンパク質」は、いずれかを用いてもよいし、これらの２種又は３種を併用してもよい。
なお、「本発明におけるペプチド」；「本発明におけるペプチドを含む組成物」；「本発明におけるペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつ、はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合に本発明におけるペプチドを生じることができるペプチド及び／又はタンパク質」は、いずれかを用いてもよいし、これらの２種又は３種を併用してもよい。
【0021】
上記の「本発明におけるペプチドを含む組成物」としては、本発明におけるペプチド（すなわち、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド及びＷＬジペプチドからなる群から選択される１種又は２種又は３種のペプチド）を含む組成物である限り特に制限されないが、本発明におけるペプチドを含む乳ペプチド（すなわち、乳タンパク質の加水分解物であるペプチド）が好ましく挙げられ、本発明におけるペプチドを含むホエイペプチド（ホエイタンパク質の加水分解物）や、本発明におけるペプチドを含むカゼインペプチド（カゼインタンパク質の加水分解物）がより好ましく挙げられる。より詳細には、ＧＴＷＹテトラペプチドやＷＹジペプチドを用いる場合は、ホエイペプチドを好適に用いることができ、ＷＹジペプチドを用いる場合は、カゼインペプチドを好適に用いることができ、ＷＬジペプチドを用いる場合は、ホエイペプチドを好適に用いることができる。
【0022】
上記の「本発明におけるペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつ、はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合に本発明におけるペプチドを生じることができるペプチド及び／又はタンパク質」としては、本発明におけるペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつ、はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合に本発明におけるペプチドを生じることができるペプチド及び／又はタンパク質である限り特に制限されないが、乳タンパク質、ホエイタンパク質、カゼインタンパク質などが挙げられ、乳タンパク質、ホエイタンパク質が好ましく挙げられる。例えば、乳タンパク質やホエイタンパク質を含むはっ酵乳原料配合液を、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスNBRC100676や、ラクトバシラス・デルブリッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスNBRC13953で発酵させると、ＷＬジペプチド濃度が発酵前より高くなる場合がある。
【0023】
上記の乳ペプチドや乳タンパク質等は市販されているものを使用することができる。例えばホエイペプチドとしては、ＨＷ－３（雪印メグミルク社製）、ＬＥ８０ＧＦ－ＵＳ（日本新薬社製）が好ましく挙げられ、ＨＷ－３がより好ましく挙げられ、カゼインペプチドとしては、ＣＥ９０ＧＭＭ（日本新薬社製）が好ましく挙げられ、乳タンパク質としては、乳たん白Ｚ（日本新薬社製）が挙げられ、ホエイタンパク質としては、ＰＲＯＧＥＬ８００（日本新薬社製）、エンラクトＹＹＹ（日本新薬社製）が挙げられる。
【0024】
本発明におけるペプチドの使用量としては特に制限されないが、本発明の効果をより多く享受する観点から、本発明におけるペプチドを一定量以上使用することが好ましい。
例えば、本発明の製造方法１や本発明の抑制方法１や本発明のはっ酵乳１の製造においては、はっ酵乳原料配合液中のＧＴＷＹテトラペプチドの含有量が０．１ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは２ｍｇ／ｋｇ以上、であって、１００ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５０ｍｇ／ｋｇ以下、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｋｇ以下となるように、ＧＴＷＹテトラペプチド及び／又はＧＴＷＹテトラペプチドを含む組成物をはっ酵乳原料配合液中に含有させることが好ましく挙げられる。
また、本発明の製造方法２や本発明の抑制方法２や本発明のはっ酵乳２の製造においては、はっ酵乳原料配合液中のＷＹジペプチドの含有量が０．０１ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇ以上であって、５０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは２０ｍｇ／ｋｇ以下、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下となるように、ＷＹジペプチド及び／又はＷＹジペプチドを含む組成物をはっ酵乳原料配合液中に含有させることが好ましく挙げられる。
また、本発明の製造方法３や本発明の抑制方法３や本発明のはっ酵乳３の製造においては、はっ酵乳原料配合液中のＷＬジペプチドの含有量が０．０２ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ以上であって、５０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下、さらに好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下なるように、ＷＬジペプチド及び／又はＷＬジペプチドを含む組成物をはっ酵乳原料配合液中に含有させることが好ましく挙げられる。
例えば、本発明の製造方法１や本発明の抑制方法１や本発明のはっ酵乳１の製造においては、はっ酵乳原料配合液中のＧＴＷＹテトラペプチドの含有量が０．１ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは２ｍｇ／ｋｇ以上、であって、１００ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５０ｍｇ／ｋｇ以下、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｋｇ以下となるように、ＧＴＷＹテトラペプチド及び／又はＧＴＷＹテトラペプチドを含む組成物をはっ酵乳原料配合液中に含有させることが好ましく挙げられる。
また、本発明の製造方法２や本発明の抑制方法２や本発明のはっ酵乳２の製造においては、はっ酵乳原料配合液中のＷＹジペプチドの含有量が０．０１ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇ以上であって、５０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは２０ｍｇ／ｋｇ以下、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下となるように、ＷＹジペプチド及び／又はＷＹジペプチドを含む組成物をはっ酵乳原料配合液中に含有させることが好ましく挙げられる。
また、本発明の製造方法３や本発明の抑制方法３や本発明のはっ酵乳３の製造においては、はっ酵乳原料配合液中のＷＬジペプチドの含有量が０．０２ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ以上であって、５０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下、さらに好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下なるように、ＷＬジペプチド及び／又はＷＬジペプチドを含む組成物をはっ酵乳原料配合液中に含有させることが好ましく挙げられる。
【0025】
また、本発明におけるペプチドの好ましい使用量を、はっ酵乳中の本発明におけるペプチドの濃度で以下に記載する。
本発明の製造方法１や本発明の抑制方法１や本発明のはっ酵乳１の製造においては、はっ酵乳中のＧＴＷＹテトラペプチドの含有量が０．１ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは２ｍｇ／ｋｇ以上、であって、１００ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５０ｍｇ／ｋｇ以下、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｋｇ以下となるように、「ＧＴＷＹテトラペプチド」、「ＧＴＷＹテトラペプチドを含む組成物」及び「ＧＴＷＹのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつ、はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合にＧＴＷＹテトラペプチドを生じることができるペプチド及び／又はタンパク質」からなる群から選択される１種又は２種又は３種（好ましくは、「ＧＴＷＹテトラペプチド」及び／又は「ＧＴＷＹテトラペプチドを含む組成物」）をはっ酵乳原料配合液中に含有させることが好ましく挙げられる。
本発明の製造方法２や本発明の抑制方法２や本発明のはっ酵乳２の製造においては、はっ酵乳中のＷＹジペプチドの含有量が０．０１ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇ以上であって、５０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは２０ｍｇ／ｋｇ以下、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下となるように、「ＷＹジペプチド」、「ＷＹジペプチドを含む組成物」及び「ＷＹのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつ、はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合にＷＹジペプチドを生じることができるペプチド及び／又はタンパク質」からなる群から選択される１種又は２種又は３種（好ましくは、「ＷＹジペプチド」及び／又は「ＷＹジペプチドを含む組成物」）をはっ酵乳原料配合液中に含有させることが好ましく挙げられる。
本発明の製造方法３や本発明の抑制方法３や本発明のはっ酵乳３の製造においては、はっ酵乳中のＷＬジペプチドの含有量が０．０２ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ以上であって、５０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下、さらに好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下となるように、「ＷＬジペプチド」、「ＷＬジペプチドを含む組成物」及び「ＷＬのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつ、はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合にＷＬジペプチドを生じることができるペプチド及び／又はタンパク質」からなる群から選択される１種又は２種又は３種（好ましくは、「ＷＬジペプチド」及び／又は「ＷＬジペプチドを含む組成物」）をはっ酵乳原料配合液中に含有させることが好ましく挙げられる。
本発明の製造方法１や本発明の抑制方法１や本発明のはっ酵乳１の製造においては、はっ酵乳中のＧＴＷＹテトラペプチドの含有量が０．１ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは２ｍｇ／ｋｇ以上、であって、１００ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５０ｍｇ／ｋｇ以下、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｋｇ以下となるように、「ＧＴＷＹテトラペプチド」、「ＧＴＷＹテトラペプチドを含む組成物」及び「ＧＴＷＹのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつ、はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合にＧＴＷＹテトラペプチドを生じることができるペプチド及び／又はタンパク質」からなる群から選択される１種又は２種又は３種（好ましくは、「ＧＴＷＹテトラペプチド」及び／又は「ＧＴＷＹテトラペプチドを含む組成物」）をはっ酵乳原料配合液中に含有させることが好ましく挙げられる。
本発明の製造方法２や本発明の抑制方法２や本発明のはっ酵乳２の製造においては、はっ酵乳中のＷＹジペプチドの含有量が０．０１ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは０．５ｍｇ／ｋｇ以上であって、５０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは２０ｍｇ／ｋｇ以下、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下となるように、「ＷＹジペプチド」、「ＷＹジペプチドを含む組成物」及び「ＷＹのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつ、はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合にＷＹジペプチドを生じることができるペプチド及び／又はタンパク質」からなる群から選択される１種又は２種又は３種（好ましくは、「ＷＹジペプチド」及び／又は「ＷＹジペプチドを含む組成物」）をはっ酵乳原料配合液中に含有させることが好ましく挙げられる。
本発明の製造方法３や本発明の抑制方法３や本発明のはっ酵乳３の製造においては、はっ酵乳中のＷＬジペプチドの含有量が０．０２ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは０．２ｍｇ／ｋｇ以上であって、５０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下、さらに好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下となるように、「ＷＬジペプチド」、「ＷＬジペプチドを含む組成物」及び「ＷＬのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、かつ、はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合にＷＬジペプチドを生じることができるペプチド及び／又はタンパク質」からなる群から選択される１種又は２種又は３種（好ましくは、「ＷＬジペプチド」及び／又は「ＷＬジペプチドを含む組成物」）をはっ酵乳原料配合液中に含有させることが好ましく挙げられる。
【0026】
（原料乳）
「原料乳」は、ヨーグルトなどのはっ酵乳の原料となるものである。本発明では、公知の原料乳を適宜用いることができる。原料乳には、殺菌前のものも、殺菌後のものも含まれる。原料乳の具体的な原料としては、生乳、殺菌処理した乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、クリーム、バターミルク、バター及び水からなる群から選択される１種又は２種以上が挙げられ、生乳、殺菌処理した乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、クリーム及び水からなる群から選択される１種又は２種以上が好ましく挙げられ、「生乳」、「殺菌処理した乳」、「脱脂乳」、「全脂粉乳及び水」、「脱脂粉乳及び水」、「生乳及びクリーム」、「殺菌処理した乳及びクリーム」、「脱脂乳及びクリーム」、「全脂粉乳、水及びクリーム」、「脱脂粉乳、水及びクリーム」などがより好ましく挙げられる。
「原料乳」は、ヨーグルトなどのはっ酵乳の原料となるものである。本発明では、公知の原料乳を適宜用いることができる。原料乳には、殺菌前のものも、殺菌後のものも含まれる。原料乳の具体的な原料としては、生乳、殺菌処理した乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、クリーム、バターミルク、バター及び水からなる群から選択される１種又は２種以上が挙げられ、生乳、殺菌処理した乳、脱脂乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、クリーム及び水からなる群から選択される１種又は２種以上が好ましく挙げられ、「生乳」、「殺菌処理した乳」、「脱脂乳」、「全脂粉乳及び水」、「脱脂粉乳及び水」、「生乳及びクリーム」、「殺菌処理した乳及びクリーム」、「脱脂乳及びクリーム」、「全脂粉乳、水及びクリーム」、「脱脂粉乳、水及びクリーム」などがより好ましく挙げられる。
【0027】
原料乳は、公知であり、公知の方法に従って調製することができる。例えば、全脂粉乳や脱脂粉乳は、全脂粉乳や脱脂粉乳を水で希釈したものを好ましく用いることができ、全脂粉乳や脱脂粉乳が７～１３重量％となるように水で希釈したものをより好ましく用いることができる。
【0028】
本発明において使用される原料乳は、無脂乳固形分として６．０％以上１０．０％以下が好ましく、より好ましくは７．０％以上９．０％以下である。また、乳脂肪分として０．５％以上４．０％以下が好ましく、より好ましくは１．０％以上３．０％以下である。
【0029】
（本発明におけるはっ酵乳原料配合液）
本発明におけるはっ酵乳原料配合液は、原料乳と本発明における所定のペプチドとを含んでいる限り特に制限されない。本発明における所定のペプチドとして、本発明の製造方法１や本発明の抑制方法１や本発明のはっ酵乳１の製造においては、ＧＴＷＹテトラペプチドを少なくとも用い、本発明の製造方法２や本発明の抑制方法２や本発明のはっ酵乳２の製造においては、ＷＹジペプチドを少なくとも用い、本発明の製造方法３や本発明の抑制方法３や本発明のはっ酵乳３の製造においては、ＷＬジペプチドを少なくとも用いる。本発明は、はっ酵乳原料配合液を調製する工程をさらに含んでいなくてもよいが、さらに含んでいてもよい。はっ酵乳原料配合液を調製する工程としては、原料乳と、本発明における所定のペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を調製する工程である限り特に制限されないが、例えば原料乳と、本発明における所定のペプチドを混合する工程が挙げられる。
本発明におけるはっ酵乳原料配合液は、原料乳と本発明における所定のペプチドとを含んでいる限り特に制限されない。本発明における所定のペプチドとして、本発明の製造方法１や本発明の抑制方法１や本発明のはっ酵乳１の製造においては、ＧＴＷＹテトラペプチドを少なくとも用い、本発明の製造方法２や本発明の抑制方法２や本発明のはっ酵乳２の製造においては、ＷＹジペプチドを少なくとも用い、本発明の製造方法３や本発明の抑制方法３や本発明のはっ酵乳３の製造においては、ＷＬジペプチドを少なくとも用いる。本発明は、はっ酵乳原料配合液を調製する工程をさらに含んでいなくてもよいが、さらに含んでいてもよい。はっ酵乳原料配合液を調製する工程としては、原料乳と、本発明における所定のペプチドとを含むはっ酵乳原料配合液を調製する工程である限り特に制限されないが、例えば原料乳と、本発明における所定のペプチドを混合する工程が挙げられる。
【0030】
（はっ酵乳原料配合液における任意成分）
本発明におけるはっ酵乳原料配合液には、本発明の効果を損なわない範囲で、安定剤、香料、甘味料、発酵促進成分等を含有させてもよい。
本発明におけるはっ酵乳原料配合液には、本発明の効果を損なわない範囲で、安定剤、香料、甘味料、発酵促進成分等を含有させてもよい。
【0031】
上記の安定剤としては特に限定されず、例えば、寒天、ゼラチン等が挙げられる。上記の香料としては特に限定されず、例えば、天然香料、各種フレーバー類等が挙げられる。また、上記の甘味料としては特に限定されず、例えば、砂糖、水あめ、粉飴、異性化糖、乳糖、麦芽糖、果糖、転化糖、還元麦芽水あめ、蜂蜜、トレハロース、パラチノース、Ｄ－キシロース等の糖類；キシリトール、ソルビトール、マルチロール、エリスリトール等の糖アルコール類；サッカリンナトリウム、サイクラメート及びその塩、アセスルファムカリウム、ソーマチン、アスパルテーム、スクラロース、アリテーム、ネオテーム、ステビア抽出物に含まれるステビオサイド等の高甘味度甘味料等が挙げられ、これらの甘味料を１種又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【0032】
上記の発酵促進成分としては、「本発明におけるペプチドのいずれでもないペプチド」や「はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合に本発明におけるペプチドを生じないペプチド及び／又はタンパク質」などが挙げられ、より具体的には、「乳ペプチド（ホエイペプチド及び／又はカゼインペプチドなど）に含まれるペプチドであって、本発明におけるペプチドのいずれでもないペプチド」、「大豆ペプチドに含まれるペプチドであって、本発明におけるペプチドのいずれでもないペプチド」、「はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合に本発明におけるペプチドを生じない乳タンパク質（ホエイタンパク質及び／又はカゼインタンパク質など）」が挙げられる。かかる発酵促進成分として具体的には、「前述のＨＷ－３（雪印メグミルク社製）に含まれるペプチドのうち、本発明におけるペプチドではないペプチド」、「ＬＥ８０ＧＦ－ＵＳ（日本新薬社製）に含まれるペプチドのうち、本発明におけるペプチドではないペプチド」、「ＣＥ９０ＧＭＭ（日本新薬社製）に含まれるペプチドのうち、本発明におけるペプチドではないペプチド」、「乳たん白Ｚ（日本新薬社製）に含まれるタンパク質のうち、はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合に本発明におけるペプチドを生じないタンパク質」、「ＰＲＯＧＥＬ８００（日本新薬社製）に含まれるタンパク質のうち、はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合に本発明におけるペプチドを生じないタンパク質」、「エンラクトＹＹＹ（日本新薬社製）に含まれるタンパク質のうち、はっ酵乳原料配合液に含有させて発酵させた場合に本発明におけるペプチドを生じないタンパク質」などが好ましく挙げられる。
【0033】
（均質化処理工程）
本発明は、はっ酵乳原料配合液を均質化処理する工程をさらに含んでいなくてもよいが、均質化処理する工程をさらに含んでいることが好ましい。はっ酵乳原料配合液を均質化処理する方法としては、ホモジナイザー等ではっ酵乳原料配合液に圧力を加えるなど、通常用いられている方法を用いることができる。均質化処理を行う場合、均質化処理を行う時点は特に制限されず、後述する加熱殺菌処理の前に行ってもよいし、加熱殺菌処理の後であって発酵工程の前に行ってもよいが、より衛生的であることから加熱殺菌処理の前に行うことが好ましい。
本発明は、はっ酵乳原料配合液を均質化処理する工程をさらに含んでいなくてもよいが、均質化処理する工程をさらに含んでいることが好ましい。はっ酵乳原料配合液を均質化処理する方法としては、ホモジナイザー等ではっ酵乳原料配合液に圧力を加えるなど、通常用いられている方法を用いることができる。均質化処理を行う場合、均質化処理を行う時点は特に制限されず、後述する加熱殺菌処理の前に行ってもよいし、加熱殺菌処理の後であって発酵工程の前に行ってもよいが、より衛生的であることから加熱殺菌処理の前に行うことが好ましい。
【0034】
（加熱殺菌処理工程）
本発明は、はっ酵乳原料配合液を加熱殺菌処理する工程をさらに含んでいることが好ましい。加熱殺菌処理を行う場合、加熱殺菌処理を行う時点は特に制限されないが、はっ酵乳原料配合液を調製する工程より後であって、発酵工程よりも前に行うことが好ましい。はっ酵乳原料配合液を加熱殺菌処理する方法としては、通常用いられている方法を用いることができる。例えば、はっ酵乳原料配合液を、プレート式殺菌機、チューブラー式殺菌機、直接加熱式殺菌機、ジャケット付きタンク等の加熱処理装置等を用いて加熱することにより行なうことができる。なお、加熱殺菌処理する工程の後に、はっ酵乳原料配合液を冷却することが好ましい。
本発明は、はっ酵乳原料配合液を加熱殺菌処理する工程をさらに含んでいることが好ましい。加熱殺菌処理を行う場合、加熱殺菌処理を行う時点は特に制限されないが、はっ酵乳原料配合液を調製する工程より後であって、発酵工程よりも前に行うことが好ましい。はっ酵乳原料配合液を加熱殺菌処理する方法としては、通常用いられている方法を用いることができる。例えば、はっ酵乳原料配合液を、プレート式殺菌機、チューブラー式殺菌機、直接加熱式殺菌機、ジャケット付きタンク等の加熱処理装置等を用いて加熱することにより行なうことができる。なお、加熱殺菌処理する工程の後に、はっ酵乳原料配合液を冷却することが好ましい。
【0035】
（発酵工程）
本発明において、本発明におけるはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、所定の乳酸菌の菌体を用いる、とは、本発明におけるはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、所定の乳酸菌の菌体を用いる限り特に制限されないが、より具体的には、本発明におけるはっ酵乳原料配合液に所定の乳酸菌の菌体を添加して発酵させる工程を実施することが好適に含まれる。本発明におけるかかる発酵工程としては、はっ酵乳原料配合液に所定の乳酸菌の菌体を添加して発酵させる工程である限り特に制限されない。
本発明において、本発明におけるはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、所定の乳酸菌の菌体を用いる、とは、本発明におけるはっ酵乳原料配合液を発酵させるための乳酸菌として、所定の乳酸菌の菌体を用いる限り特に制限されないが、より具体的には、本発明におけるはっ酵乳原料配合液に所定の乳酸菌の菌体を添加して発酵させる工程を実施することが好適に含まれる。本発明におけるかかる発酵工程としては、はっ酵乳原料配合液に所定の乳酸菌の菌体を添加して発酵させる工程である限り特に制限されない。
【0036】
かかる発酵工程で用いる所定の乳酸菌の種類と、発酵工程中の含有量の減少を抑制する対象のペプチドの種類は以下のように対応している。以下、そのペプチドの減少を抑制するための発酵工程で用いる所定の乳酸菌を、その「ペプチドに対応する乳酸菌」とも表示する。
ＧＴＷＹテトラペプチドに対応する所定の乳酸菌の菌体（すなわち、本発明の製造方法１や本発明の抑制方法１や本発明のはっ酵乳１の製造において用いる乳酸菌の菌体）は、ラクトコッカス・ラクティスの菌体であり、好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスの菌体、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体であり、より好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス分離株の菌体、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスNBRC100676の菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体であり、ＷＹジペプチドに対応する所定の乳酸菌の菌体（すなわち、本発明の製造方法２や本発明の抑制方法２や本発明のはっ酵乳２の製造において用いる乳酸菌の菌体）は、ラクトバシラス・ヘルベティカスの菌体であり、好ましくはラクトバシラス・ヘルベティカスNBRC15019の菌体であり、ＷＬジペプチドに対応する所定の乳酸菌の菌体（すなわち、本発明の製造方法３や本発明の抑制方法３や本発明のはっ酵乳３の製造において用いる乳酸菌の菌体）は、ラクトコッカス・ラクティスの菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体であり、好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クレモリスの菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体であり、より好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クレモリスNBRC100676の菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスNBRC13953の菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体である。
ＧＴＷＹテトラペプチドに対応する所定の乳酸菌の菌体（すなわち、本発明の製造方法１や本発明の抑制方法１や本発明のはっ酵乳１の製造において用いる乳酸菌の菌体）は、ラクトコッカス・ラクティスの菌体であり、好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスの菌体、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体であり、より好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス分離株の菌体、及びラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスNBRC100676の菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体であり、ＷＹジペプチドに対応する所定の乳酸菌の菌体（すなわち、本発明の製造方法２や本発明の抑制方法２や本発明のはっ酵乳２の製造において用いる乳酸菌の菌体）は、ラクトバシラス・ヘルベティカスの菌体であり、好ましくはラクトバシラス・ヘルベティカスNBRC15019の菌体であり、ＷＬジペプチドに対応する所定の乳酸菌の菌体（すなわち、本発明の製造方法３や本発明の抑制方法３や本発明のはっ酵乳３の製造において用いる乳酸菌の菌体）は、ラクトコッカス・ラクティスの菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体であり、好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クレモリスの菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスの菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体であり、より好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クレモリスNBRC100676の菌体、及びラクトバシラス・デルブリッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスNBRC13953の菌体からなる群から選択される１種又は２種の菌体である。
【0037】
本発明において、ペプチドに対応する乳酸菌のみを用いてもよいが、ペプチドに対応する乳酸菌以外の乳酸菌を併用してもよい。ペプチドに対応する乳酸菌以外の乳酸菌としては特に制限されないが、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダムなどが挙げられる。本発明において、ペプチドに対応する乳酸菌以外の乳酸菌を併用する場合の併用割合は特に制限されないが、はっ酵乳原料配合液中のすべての乳酸菌の濃度（ＣＦＵ／ｇ）に対する、ペプチドに対応する乳酸菌の濃度（ＣＦＵ／ｇ）の割合（％）で、例えば３０％以上、好ましくは４５％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上であることが挙げられる。
【0038】
本発明に用いる乳酸菌は、さまざまな寄託機関などから入手することができる。例えば、ＮＢＲＣ番号で特定される微生物は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８にある独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（NITE Biological Resource Center：ＮＢＲＣ）より入手可能である。なお、ＮＢＲＣでは菌株名による検索で様々な菌株のＮＢＲＣ番号を特定することができるため、ＮＢＲＣ番号を事前に知らなくても、様々な菌株を入手することができる。また、本発明に用いる乳酸菌は、自然界から分離することもできる。
【0039】
所定の乳酸菌の菌体は、はっ酵乳の公知の製造方法において採用されている方法ではっ酵乳原料配合液に添加することができる。例えば、乳酸菌が増殖し得る培養培地で乳酸菌を培養した後、乳酸菌の菌体を含むその培養培地をはっ酵乳原料配合液に添加することができる。はっ酵乳原料配合液に添加する乳酸菌の添加量としては、その乳酸菌の添加後、はっ酵乳原料配合液の発酵が進む限り特に制限されないが、例えば、はっ酵乳原料配合液中のその乳酸菌の濃度が１×１０５ＣＦＵ／ｇ以上、好ましくは１×１０７ＣＦＵ／ｇ以上となるように添加することが好ましい。
【0040】
発酵温度などの発酵条件は、原料乳に添加された乳酸菌の種類や、求める発酵乳の風味などを考慮して適宜調整することができる。発酵室内の温度（発酵温度）の好適な例として、ラクトコッカス・ラクティスの場合は２５～３５℃が挙げられ、ラクトバシラス・デルブリッキや、ラクトバシラス・ヘルベティカスの場合は３５～４５℃が挙げられる。
【0041】
発酵時間は、用いる乳酸菌の種類、発酵温度、製造するはっ酵乳の種類や性質などに応じて適宜調整することができ、例えば１～９６時間、好ましくは２～７２時間、より好ましくは３～４８時間が挙げられる。発酵ははっ酵乳のｐＨが例えば５．０５以下、好ましくは４．８３以下、より好ましくは４．２～４．８３程度になるまで行うことが好ましい。はっ酵乳のｐＨは常法により測定することができる。
【0042】
（容器への充填工程）
本発明は、容器への充填工程をさらに含んでいなくてもよいが、さらに含んでいることが好ましい。
後発酵の製法の場合は、はっ酵乳原料配合液（好ましくは、加熱殺菌処理工程を経たはっ酵乳原料配合液、より好ましくは、加熱殺菌処理工程を経た後であって、所定の乳酸菌の菌体を添加する前のはっ酵乳原料配合液）を容器に充填することが好ましい。一方、前発酵の製法の場合は、発酵工程後の発酵乳（好ましくは、発酵工程後、攪拌した後の発酵乳）を容器に充填することが好ましい。
本発明は、容器への充填工程をさらに含んでいなくてもよいが、さらに含んでいることが好ましい。
後発酵の製法の場合は、はっ酵乳原料配合液（好ましくは、加熱殺菌処理工程を経たはっ酵乳原料配合液、より好ましくは、加熱殺菌処理工程を経た後であって、所定の乳酸菌の菌体を添加する前のはっ酵乳原料配合液）を容器に充填することが好ましい。一方、前発酵の製法の場合は、発酵工程後の発酵乳（好ましくは、発酵工程後、攪拌した後の発酵乳）を容器に充填することが好ましい。
【0043】
（発酵工程中の本発明におけるペプチド含有量の減少の抑制）
本発明において、「発酵工程中の本発明におけるペプチド（すなわち、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド又はＷＬジペプチド）含有量の減少が抑制された」はっ酵乳とは、本発明におけるそのペプチド（すなわち、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド又はＷＬジペプチド）に対応する乳酸菌を用いないこと以外は、同種のはっ酵乳原料配合液を用いて同じ製法で製造したはっ酵乳（以下、「コントロールはっ酵乳」とも表示する。）と比較して、はっ酵乳中の本発明におけるそのペプチド（すなわち、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド又はＷＬジペプチド）の含有濃度が高いはっ酵乳を意味する。
なお、本発明における「発酵工程中の本発明におけるペプチド（すなわち、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド又はＷＬジペプチド）含有量の減少が抑制された」はっ酵乳には、便宜上、発酵工程中の本発明におけるペプチド（すなわち、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド又はＷＬジペプチド）含有量が増加する場合も含まれることとする。
本発明において、「発酵工程中の本発明におけるペプチド（すなわち、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド又はＷＬジペプチド）含有量の減少が抑制された」はっ酵乳とは、本発明におけるそのペプチド（すなわち、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド又はＷＬジペプチド）に対応する乳酸菌を用いないこと以外は、同種のはっ酵乳原料配合液を用いて同じ製法で製造したはっ酵乳（以下、「コントロールはっ酵乳」とも表示する。）と比較して、はっ酵乳中の本発明におけるそのペプチド（すなわち、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド又はＷＬジペプチド）の含有濃度が高いはっ酵乳を意味する。
なお、本発明における「発酵工程中の本発明におけるペプチド（すなわち、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド又はＷＬジペプチド）含有量の減少が抑制された」はっ酵乳には、便宜上、発酵工程中の本発明におけるペプチド（すなわち、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド又はＷＬジペプチド）含有量が増加する場合も含まれることとする。
【0044】
本発明におけるペプチド含有量の減少の抑制の程度としては、特に制限されないが、好ましい程度としては、発酵前のはっ酵乳原料配合液中の本発明におけるペプチド（すなわち、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド又はＷＬジペプチド）濃度を基準（すなわち１００％）としたときの、本発明におけるペプチド（すなわち、ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド又はＷＬジペプチド）濃度の割合（％）（以下、ペプチド残存率）で、例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上が挙げられる。また、好ましい態様としては、後述の実施例のはっ酵乳原料配合液１～１５のうち、２種類以上、好ましくは３種類以上、より好ましくは３種以上で、ペプチド残存率が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上であることが挙げられる。
【0045】
（ペプチド濃度の測定方法）
はっ酵乳原料配合液中やはっ酵乳中の本発明におけるペプチドの濃度は液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳＭＳ法）にて測定する。ＬＣ／ＭＳＭＳ法としては、後述の実施例に記載された方法を使用する。
はっ酵乳原料配合液中やはっ酵乳中の本発明におけるペプチドの濃度は液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳＭＳ法）にて測定する。ＬＣ／ＭＳＭＳ法としては、後述の実施例に記載された方法を使用する。
【0046】
以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【0047】
［試験１］はっ酵乳原料に含まれる測定対象ペプチド濃度の測定
はっ酵乳の原料として、牛乳及び／又は脱脂粉乳のほか、発酵促進剤として乳タンパク質や乳ペプチド（乳タンパク質の加水分解物であるペプチド）が用いられる場合がある。後述の試験２以降の試験で、市販の脱脂粉乳と、乳タンパク質や乳ペプチドとをはっ酵乳原料配合液に含有させるため、これら脱脂粉乳、乳タンパク質、乳ペプチド中の本発明におけるペプチド等の濃度を測定することとした。なお、測定対象ペプチド（合計６種）には、本発明におけるペプチド（ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド、ＷＬジペプチド）の他、以下の３種のペプチドが含まれる。これら３種類のペプチドも、以前、本発明者らが記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するペプチドとして見いだしたペプチドである（特許文献３）。
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるテトラペプチド（ＴＷＹＳテトラペプチド）
ＴＷＹのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＴＷＹトリペプチド）
ＷＶのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＷＶジペプチド）
はっ酵乳の原料として、牛乳及び／又は脱脂粉乳のほか、発酵促進剤として乳タンパク質や乳ペプチド（乳タンパク質の加水分解物であるペプチド）が用いられる場合がある。後述の試験２以降の試験で、市販の脱脂粉乳と、乳タンパク質や乳ペプチドとをはっ酵乳原料配合液に含有させるため、これら脱脂粉乳、乳タンパク質、乳ペプチド中の本発明におけるペプチド等の濃度を測定することとした。なお、測定対象ペプチド（合計６種）には、本発明におけるペプチド（ＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド、ＷＬジペプチド）の他、以下の３種のペプチドが含まれる。これら３種類のペプチドも、以前、本発明者らが記憶学習機能及び／又は認知機能を増強するペプチドとして見いだしたペプチドである（特許文献３）。
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるテトラペプチド（ＴＷＹＳテトラペプチド）
ＴＷＹのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＴＷＹトリペプチド）
ＷＶのアミノ酸配列からなるジペプチド（ＷＶジペプチド）
【0048】
（１）方法
脱脂粉乳として、Ｄｉｆｃｏ社製の脱脂粉乳を用意した。また、乳ペプチドとして、ＬＥ８０ＧＦ－ＵＳ（日本新薬社製）、ＣＥ９０ＧＭＭ（日本新薬社製）、ＨＷ－３（雪印メグミルク社製）を、乳タンパク質として、乳たん白Ｚ（日本新薬社製）、ＰＲＯＧＥＬ８００（日本新薬社製）、エンラクトＹＹＹ（日本新薬社製）を用意した。なお、ＬＥ８０ＧＦ－ＵＳはホエイペプチド（ホエイタンパク質の加水分解物）であり、ＣＥ９０ＧＭＭはカゼインペプチド（カゼインタンパク質の加水分解物）であり、ＨＷ－３はホエイペプチドであり、乳たん白Ｚは乳タンパク質であり、ＰＲＯＧＥＬ８００はホエイタンパク濃縮物であり、エンラクトＹＹＹはホエイタンパク濃縮物である。
脱脂粉乳として、Ｄｉｆｃｏ社製の脱脂粉乳を用意した。また、乳ペプチドとして、ＬＥ８０ＧＦ－ＵＳ（日本新薬社製）、ＣＥ９０ＧＭＭ（日本新薬社製）、ＨＷ－３（雪印メグミルク社製）を、乳タンパク質として、乳たん白Ｚ（日本新薬社製）、ＰＲＯＧＥＬ８００（日本新薬社製）、エンラクトＹＹＹ（日本新薬社製）を用意した。なお、ＬＥ８０ＧＦ－ＵＳはホエイペプチド（ホエイタンパク質の加水分解物）であり、ＣＥ９０ＧＭＭはカゼインペプチド（カゼインタンパク質の加水分解物）であり、ＨＷ－３はホエイペプチドであり、乳たん白Ｚは乳タンパク質であり、ＰＲＯＧＥＬ８００はホエイタンパク濃縮物であり、エンラクトＹＹＹはホエイタンパク濃縮物である。
【0049】
（ア）分析サンプルの調製
はっ酵乳原料（先に挙げた脱脂粉乳、乳タンパク質、乳ペプチドのうちのいずれか１種）を２０ｍｇ分取して水に溶解、希釈して、いずれか１種のはっ酵乳原料を０．０１％（Ｗ／Ｖ）含む溶液を得た。この溶液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ×３分間、５℃。以下同じ）してその上清を限外濾過（１０ｋＤａ。以下同じ）して濾液を得た。濾液を適宜希釈し分析サンプルとした。測定はＬＣ／ＭＳＭＳを用い、以下の条件とした。濃度換算は検量線法によった。
はっ酵乳原料（先に挙げた脱脂粉乳、乳タンパク質、乳ペプチドのうちのいずれか１種）を２０ｍｇ分取して水に溶解、希釈して、いずれか１種のはっ酵乳原料を０．０１％（Ｗ／Ｖ）含む溶液を得た。この溶液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ×３分間、５℃。以下同じ）してその上清を限外濾過（１０ｋＤａ。以下同じ）して濾液を得た。濾液を適宜希釈し分析サンプルとした。測定はＬＣ／ＭＳＭＳを用い、以下の条件とした。濃度換算は検量線法によった。
【0050】
（イ）分析条件
（i）装置
質量分析計：4000Q TRAP（エービー・サイエックス社製）
ＬＣ計：Agilent 1200 Series（アジレント・テクノロジー社製）
（ii）ＬＣ条件
カラム：TSK gel ODS-100V 3μM 2.0mm I．D．Ｘ150mm（東ソー社製）
カラム温度：70℃
移動相Ａ：0.1 vol％ギ酸-蒸留水
移動相Ｂ：0.1 vol％ギ酸-アセトニトリル
流量：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：２μＬ
ＬＣ／ＭＳＭＳ グラジエント条件（表１）
（i）装置
質量分析計：4000Q TRAP（エービー・サイエックス社製）
ＬＣ計：Agilent 1200 Series（アジレント・テクノロジー社製）
（ii）ＬＣ条件
カラム：TSK gel ODS-100V 3μM 2.0mm I．D．Ｘ150mm（東ソー社製）
カラム温度：70℃
移動相Ａ：0.1 vol％ギ酸-蒸留水
移動相Ｂ：0.1 vol％ギ酸-アセトニトリル
流量：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：２μＬ
ＬＣ／ＭＳＭＳ グラジエント条件（表１）
【0051】
【表1】
【0052】
（iii）MSMS条件
イオン化法：ＥＳＩ（正イオン検出モード）
カーテンガス：40 psi
ネブライザーガス：50 psi
乾燥ガス：80 psi
乾燥ガス温度：600 ℃
コリジョンガス：窒素
イオン化電圧：5000 V
各測定対象ペプチドにおける設定質量数(m/z)，コリジョンエネルギー(CE；eV)，DP電圧(V)をそれぞれ表２に記載した。
イオン化法：ＥＳＩ（正イオン検出モード）
カーテンガス：40 psi
ネブライザーガス：50 psi
乾燥ガス：80 psi
乾燥ガス温度：600 ℃
コリジョンガス：窒素
イオン化電圧：5000 V
各測定対象ペプチドにおける設定質量数(m/z)，コリジョンエネルギー(CE；eV)，DP電圧(V)をそれぞれ表２に記載した。
【0053】
【表2】
【0054】
（２）結果
はっ酵乳の各原料（合計７種）中の各測定対象ペプチド（合計６種）の濃度を測定した結果を以下の表３に示す。なお、かかる測定の定量下限値は０．０５ｍｇ／ｇであり、表３における「－」はそのペプチド濃度が定量下限値未満であったことを表す。
はっ酵乳の各原料（合計７種）中の各測定対象ペプチド（合計６種）の濃度を測定した結果を以下の表３に示す。なお、かかる測定の定量下限値は０．０５ｍｇ／ｇであり、表３における「－」はそのペプチド濃度が定量下限値未満であったことを表す。
【0055】
【表3】
【0056】
表３の結果から分かるように、脱脂粉乳、乳たん白Ｚ、ＰＲＯＧＥＬ８００、及び、エンラクトＹＹＹでは、いずれの測定対象ペプチドも、定量下限値（０．０５ｍｇ／ｇ）未満であった。一方、ＬＥ８０ＧＦ－ＵＳはＧＴＷＹテトラペプチド及びＷＹジペプチドを、ＣＥ９０ＧＭＭはＷＹジペプチドを、ＨＷ－３はＧＴＷＹテトラペプチド、ＷＹジペプチド、ＷＶジペプチド及びＷＬジペプチドを、表３に記載の濃度で含んでいることが示された。
【0057】
［試験２］はっ酵乳原料配合液からはっ酵乳への発酵の過程における、測定対象ペプチドの濃度の変化（１）
はっ酵乳原料配合液からはっ酵乳への発酵の過程で測定対象ペプチドの濃度がどのように変化するかを以下の方法で調べた。試験２では、測定対象ペプチドとして、ＧＴＷＹテトラペプチドとＷＹジペプチドの濃度の変化を調べた。
はっ酵乳原料配合液からはっ酵乳への発酵の過程で測定対象ペプチドの濃度がどのように変化するかを以下の方法で調べた。試験２では、測定対象ペプチドとして、ＧＴＷＹテトラペプチドとＷＹジペプチドの濃度の変化を調べた。
【0058】
２－１ はっ酵乳の製造
（１）はっ酵乳原料配合液の調製
後述の表４又は５に記載の組成で原料を混合した後、１０５℃で１０分間オートクレーブ殺菌し、常温まで冷却してはっ酵乳原料配合液１～１０をそれぞれ得た。はっ酵乳原料配合液１～１０においては、発酵促進剤として、乳ペプチド（ホエイペプチド：ＬＥ８０ＧＦ－ＵＳ、ＨＷ－３； カゼインペプチド：ＣＥ９０ＧＭＭ）又は大豆ペプチド（ＨＫＢ：不二製油社製）を使用した。
（１）はっ酵乳原料配合液の調製
後述の表４又は５に記載の組成で原料を混合した後、１０５℃で１０分間オートクレーブ殺菌し、常温まで冷却してはっ酵乳原料配合液１～１０をそれぞれ得た。はっ酵乳原料配合液１～１０においては、発酵促進剤として、乳ペプチド（ホエイペプチド：ＬＥ８０ＧＦ－ＵＳ、ＨＷ－３； カゼインペプチド：ＣＥ９０ＧＭＭ）又は大豆ペプチド（ＨＫＢ：不二製油社製）を使用した。
【0059】
【表4】
【0060】
【表5】
【0061】
（２）供試菌株の前培養液の調製
１０％（Ｗ／Ｖ）のスキムミルク（Difco社製）及び０．２％（Ｗ／Ｖ）のYeast extract （Difco社製）を含む水溶液を１０５℃で１０分間オートクレーブ殺菌し、前培養培地とした。表６記載の各供試菌の凍結液約３０μＬを前培養培地３ｍＬにそれぞれ植菌して、表６記載の各温度で７２時間培養し、各供試菌の前培養液（以下、それぞれ「供試菌前培養液１～１５」）を得た。なお、各供試菌は、ＮＢＲＣなどから入手した。
１０％（Ｗ／Ｖ）のスキムミルク（Difco社製）及び０．２％（Ｗ／Ｖ）のYeast extract （Difco社製）を含む水溶液を１０５℃で１０分間オートクレーブ殺菌し、前培養培地とした。表６記載の各供試菌の凍結液約３０μＬを前培養培地３ｍＬにそれぞれ植菌して、表６記載の各温度で７２時間培養し、各供試菌の前培養液（以下、それぞれ「供試菌前培養液１～１５」）を得た。なお、各供試菌は、ＮＢＲＣなどから入手した。
【0062】
【表6】
【0063】
（３）はっ酵工程
上記表４及び表５に記載のはっ酵乳原料配合液１～１０に、それぞれ供試菌前培養液１～１５を３％（Ｗ／Ｖ）添加した後、前培養のときと同じ培養温度（表６）で発酵を行った。発酵はヨーグルトの製造を想定して、各はっ酵乳原料配合液について、はっ酵乳原料配合液が半流動ゲル状のヨーグルトとなるまで発酵を行って各はっ酵乳サンプルを得た。ただし、はっ酵乳配合液の種類と供試菌の種類によっては、培養を比較的長時間行ってもはっ酵乳配合液のｐＨの低下の程度が少なく、半流動ゲル状ではなく液状に近いままのはっ酵乳サンプルもあった。各はっ酵乳サンプルを５℃に冷却した後、撹拌して、分析に供した。また、発酵工程を行わない各はっ酵乳原料配合液はコントロールとして分析に供した。
上記表４及び表５に記載のはっ酵乳原料配合液１～１０に、それぞれ供試菌前培養液１～１５を３％（Ｗ／Ｖ）添加した後、前培養のときと同じ培養温度（表６）で発酵を行った。発酵はヨーグルトの製造を想定して、各はっ酵乳原料配合液について、はっ酵乳原料配合液が半流動ゲル状のヨーグルトとなるまで発酵を行って各はっ酵乳サンプルを得た。ただし、はっ酵乳配合液の種類と供試菌の種類によっては、培養を比較的長時間行ってもはっ酵乳配合液のｐＨの低下の程度が少なく、半流動ゲル状ではなく液状に近いままのはっ酵乳サンプルもあった。各はっ酵乳サンプルを５℃に冷却した後、撹拌して、分析に供した。また、発酵工程を行わない各はっ酵乳原料配合液はコントロールとして分析に供した。
【0064】
２－２ ペプチドの分析
（１）方法
はっ酵乳サンプル及びはっ酵前のはっ酵乳原料配合液（コントロール）に含まれるＧＴＷＹテトラペプチド濃度及びＷＹジペプチド濃度を測定した。
（１）方法
はっ酵乳サンプル及びはっ酵前のはっ酵乳原料配合液（コントロール）に含まれるＧＴＷＹテトラペプチド濃度及びＷＹジペプチド濃度を測定した。
【0065】
はっ酵乳サンプル０．５ｇに水０．５ｍＬを加えて懸濁し、遠心分離したものの上清を限外濾過した濾液を適宜希釈したものを分析サンプルとした。はっ酵前のはっ酵乳原料配合液（コントロール）については、はっ酵乳原料配合液（すなわち、所定の原料を混合した後、１０５℃で１０分間オートクレーブ殺菌し、常温まで冷却した配合液）０．５ｇに水０．５ｍＬを加えて懸濁し、前記分析サンプルと同様に遠心分離、限外濾過、適宜希釈したものを分析サンプルとした。これらの分析サンプルの分析はＬＣ／ＭＳＭＳを用い、試験１の際と同じ分析条件で行った。濃度換算は検量線法によった。また、はっ酵乳原料配合液やはっ酵乳サンプルのｐＨは常法により測定した。
【0066】
（２）結果
供試菌番号１～７の乳酸菌でそれぞれ発酵させた各はっ酵乳におけるＧＴＷＹテトラペプチド濃度及びＷＹジペプチド濃度、並びに、各コントロールにおけるＧＴＷＹテトラペプチド濃度及びＷＹジペプチド濃度を以下の表７～表１０に示す。また、供試菌番号８～１５の乳酸菌でそれぞれ発酵させた各はっ酵乳におけるＧＴＷＹテトラペプチド濃度及びＷＹジペプチド濃度、並びに、各コントロールにおけるＧＴＷＹテトラペプチド濃度及びＷＹジペプチド濃度を以下の表１１～表１４に示す。
例えば、はっ酵乳原料配合液１の項目において、供試菌番号１の項目のＧＴＷＹテトラペプチド濃度は、はっ酵乳原料配合液１を表５の供試菌番号１の乳酸菌株で発酵させたはっ酵乳サンプル中のＧＴＷＹテトラペプチド濃度を表す。
また、各はっ酵乳サンプル及びはっ酵前の各はっ酵乳原料配合液（コントロール）のｐＨを測定した結果を以下の表７～表１４に示し、また、各はっ酵乳サンプルの発酵時間も以下の表７～表１４に示す。
供試菌番号１～７の乳酸菌でそれぞれ発酵させた各はっ酵乳におけるＧＴＷＹテトラペプチド濃度及びＷＹジペプチド濃度、並びに、各コントロールにおけるＧＴＷＹテトラペプチド濃度及びＷＹジペプチド濃度を以下の表７～表１０に示す。また、供試菌番号８～１５の乳酸菌でそれぞれ発酵させた各はっ酵乳におけるＧＴＷＹテトラペプチド濃度及びＷＹジペプチド濃度、並びに、各コントロールにおけるＧＴＷＹテトラペプチド濃度及びＷＹジペプチド濃度を以下の表１１～表１４に示す。
例えば、はっ酵乳原料配合液１の項目において、供試菌番号１の項目のＧＴＷＹテトラペプチド濃度は、はっ酵乳原料配合液１を表５の供試菌番号１の乳酸菌株で発酵させたはっ酵乳サンプル中のＧＴＷＹテトラペプチド濃度を表す。
また、各はっ酵乳サンプル及びはっ酵前の各はっ酵乳原料配合液（コントロール）のｐＨを測定した結果を以下の表７～表１４に示し、また、各はっ酵乳サンプルの発酵時間も以下の表７～表１４に示す。
【0067】
【表7】
【0068】
【表8】
【0069】
【表9】
【0070】
【表10】
【0071】
【表11】
【0072】
【表12】
【0073】
【表13】
【0074】
【表14】
【0075】
上記表７～表１４の結果から分かるように、はっ酵乳原料配合液の種類や供試菌の種類によって、ＧＴＷＹテトラペプチド濃度やＷＹジペプチド濃度が大きく異なることが分かった。そこで、発酵前のはっ酵乳原料配合液中のＧＴＷＹテトラペプチド濃度又はＷＹジペプチド濃度（いずれのペプチド濃度も表７～表１４参照）を基準（すなわち１００％）としたときの、はっ酵乳サンプル中のＧＴＷＹテトラペプチド濃度又はＷＹジペプチド濃度（いずれのペプチド濃度も表７～表１４参照）の割合（％）（以下、「ペプチドの残存率（％）」とも表示する。）をそれぞれ算出した結果を、それぞれ以下の表１５～表２２に示す。なお、表１５～表２２において、好ましいペプチドの残存率（％）として、かかる残存率が６０％以上の場合は残存率（％）の数値に一重の下線を記し、７０％以上の場合は残存率（％）の数値に二重の下線を記した。また、ｐＨはある程度低い方が好ましいため、はっ酵乳サンプルのｐＨが５．０５以下の場合にはｐＨの数値に一重の下線を記し、ｐＨが４．８３以下の場合にはｐＨの数値に二重の下線を記した。
【0076】
【表15】
【0077】
【表16】
【0078】
【表17】
【0079】
【表18】
【0080】
【表19】
【0081】
【表20】
【0082】
【表21】
【0083】
【表22】
【0084】
表１５～表２２の結果から、発酵工程の乳酸菌として供試菌３（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス分離株）又は供試菌４（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスNBRC100676）を使用すると、はっ酵乳の原料の種類にかかわらず（すなわち、はっ酵乳原料配合液１～１０のいずれかにかかわらず）、ＧＴＷＹテトラペプチドの残存率（％）が高いはっ酵乳が得られること（すなわち、発酵工程中のＧＴＷＹテトラペプチド含有量の減少を抑制できること）が示された。このことから、ラクトコッカス・ラクティス種に属する菌であれば、はっ酵乳の原料の種類にかかわらず、発酵工程中のＧＴＷＹテトラペプチド含有量の減少を抑制できると考えられた。
【0085】
また、表１５～表２２の結果から、供試菌１０（ラクトバシラス・ヘルベティカスNBRC15019）を使用すると、はっ酵乳の原料の種類にかかわらず（すなわち、はっ酵乳原料配合液１～１０のいずれかにかかわらず）、ＷＹジペプチドの残存率（％）が高いはっ酵乳が得られること（すなわち、発酵工程中のＷＹジペプチド含有量の減少を抑制できること）が示された。
【0086】
［試験３］はっ酵乳原料配合液からはっ酵乳への発酵の過程における、測定対象ペプチドの濃度の変化（２）
はっ酵乳原料配合液からはっ酵乳への発酵の過程で測定対象ペプチドの濃度がどのように変化するかを以下の方法で調べた。試験３では、測定対象ペプチドとして、ＴＷＹＳテトラペプチド、ＴＷＹトリペプチド、ＷＶジペプチド及びＷＬジペプチドの濃度の変化を調べた。
はっ酵乳原料配合液からはっ酵乳への発酵の過程で測定対象ペプチドの濃度がどのように変化するかを以下の方法で調べた。試験３では、測定対象ペプチドとして、ＴＷＹＳテトラペプチド、ＴＷＹトリペプチド、ＷＶジペプチド及びＷＬジペプチドの濃度の変化を調べた。
【0087】
３－１ はっ酵乳の製造
（１）はっ酵乳原料配合液の調製
後述の表２３に記載の組成で原料を混合した後、１０５℃で１０分間オートクレーブ殺菌し、常温まで冷却してはっ酵乳原料配合液１１～１５をそれぞれ得た。はっ酵乳原料配合液１１～１５においては、発酵促進剤として、ＬＥ８０ＧＦ－ＵＳ（ホエイペプチド）、ＣＥ９０ＧＭＭ（カゼインペプチド）、乳たん白Ｚ（乳タンパク質）、ＰＲＯＧＥＬ８００（ホエイタンパク濃縮物）又はエンラクトＹＹＹ（ホエイタンパク濃縮物）を使用した。
（１）はっ酵乳原料配合液の調製
後述の表２３に記載の組成で原料を混合した後、１０５℃で１０分間オートクレーブ殺菌し、常温まで冷却してはっ酵乳原料配合液１１～１５をそれぞれ得た。はっ酵乳原料配合液１１～１５においては、発酵促進剤として、ＬＥ８０ＧＦ－ＵＳ（ホエイペプチド）、ＣＥ９０ＧＭＭ（カゼインペプチド）、乳たん白Ｚ（乳タンパク質）、ＰＲＯＧＥＬ８００（ホエイタンパク濃縮物）又はエンラクトＹＹＹ（ホエイタンパク濃縮物）を使用した。
【0088】
【表23】
【0089】
（２）供試菌株の前培養液の調製
前述の試験２の２－１の（２）に記載の方法で、供試菌前培養液１～１５を得た。
前述の試験２の２－１の（２）に記載の方法で、供試菌前培養液１～１５を得た。
【0090】
（３）はっ酵工程
上記表２３に記載のはっ酵乳原料配合液１１～２０に、それぞれ供試菌前培養液１～１５を３％（Ｗ／Ｖ）添加した後、前培養のときと同じ発酵温度（表６）で発酵を行った。発酵はヨーグルトの製造を想定して、各はっ酵乳原料配合液について、はっ酵乳原料配合液が半流動ゲル状のヨーグルトとなるまで発酵を行って各はっ酵乳サンプルを得た。ただし、はっ酵乳配合液の種類と供試菌の種類によっては、発酵を比較的長時間行ってもはっ酵乳配合液のｐＨの低下の程度が少なく、半流動ゲル状ではなく液状に近いはっ酵乳サンプルであった。各はっ酵乳サンプルを５℃に冷却した後、撹拌して、分析に供した。また、発酵工程を行わない各はっ酵乳原料配合液はコントロールとして分析に供した。
上記表２３に記載のはっ酵乳原料配合液１１～２０に、それぞれ供試菌前培養液１～１５を３％（Ｗ／Ｖ）添加した後、前培養のときと同じ発酵温度（表６）で発酵を行った。発酵はヨーグルトの製造を想定して、各はっ酵乳原料配合液について、はっ酵乳原料配合液が半流動ゲル状のヨーグルトとなるまで発酵を行って各はっ酵乳サンプルを得た。ただし、はっ酵乳配合液の種類と供試菌の種類によっては、発酵を比較的長時間行ってもはっ酵乳配合液のｐＨの低下の程度が少なく、半流動ゲル状ではなく液状に近いはっ酵乳サンプルであった。各はっ酵乳サンプルを５℃に冷却した後、撹拌して、分析に供した。また、発酵工程を行わない各はっ酵乳原料配合液はコントロールとして分析に供した。
【0091】
３－２ ペプチドの分析
（１）方法
はっ酵乳サンプル及びはっ酵前のはっ酵乳原料配合液（コントロール）に含まれるＴＷＹＳテトラペプチド濃度、ＴＷＹトリペプチド濃度、ＷＶジペプチド濃度及びＷＬジペプチド濃度を測定した。
（１）方法
はっ酵乳サンプル及びはっ酵前のはっ酵乳原料配合液（コントロール）に含まれるＴＷＹＳテトラペプチド濃度、ＴＷＹトリペプチド濃度、ＷＶジペプチド濃度及びＷＬジペプチド濃度を測定した。
【0092】
はっ酵乳サンプル０．５ｇに水０．５ｍＬを加えて懸濁し、遠心分離したものの上清を限外濾過した濾液を適宜希釈したものを分析サンプルとした。はっ酵前のはっ酵乳原料配合液（コントロール）については、はっ酵乳原料配合液（すなわち、所定の原料を混合した後、１０５℃で１０分間オートクレーブ殺菌し、常温まで冷却した配合液）０．５ｇに水０．５ｍＬを加えて懸濁し、前記分析サンプルと同様に遠心分離、限外濾過、適宜希釈したものを分析サンプルとした。これらの分析サンプルの分析はＬＣ／ＭＳＭＳを用い、試験１の際と同じ分析条件で行った。濃度換算は検量線法によった。
【0093】
（２）結果
供試菌番号１、３、４、６、８、９、１５の乳酸菌でそれぞれ発酵させた各はっ酵乳における各測定対象ペプチド濃度（ＴＷＹＳテトラペプチド濃度、ＴＷＹトリペプチド濃度、ＷＶジペプチド濃度、ＷＬジペプチド濃度）、並びに、各コントロールにおける各測定対象ペプチド濃度（ＴＷＹＳテトラペプチド濃度、ＴＷＹトリペプチド濃度、ＷＶジペプチド濃度、ＷＬジペプチド濃度）を以下の表２４～表２６に示す。また、各はっ酵乳サンプルの発酵時間も以下の表２４～表２６に示す。
供試菌番号１、３、４、６、８、９、１５の乳酸菌でそれぞれ発酵させた各はっ酵乳における各測定対象ペプチド濃度（ＴＷＹＳテトラペプチド濃度、ＴＷＹトリペプチド濃度、ＷＶジペプチド濃度、ＷＬジペプチド濃度）、並びに、各コントロールにおける各測定対象ペプチド濃度（ＴＷＹＳテトラペプチド濃度、ＴＷＹトリペプチド濃度、ＷＶジペプチド濃度、ＷＬジペプチド濃度）を以下の表２４～表２６に示す。また、各はっ酵乳サンプルの発酵時間も以下の表２４～表２６に示す。
【0094】
【表24】
【0095】
【表25】
【0096】
【表26】
【0097】
上記表２４～表２６の結果から分かるように、はっ酵乳原料配合液の種類や供試菌の種類によって、ＴＷＹＳテトラペプチド濃度、ＴＷＹトリペプチド濃度、ＷＶジペプチド濃度やＷＬジペプチド濃度が大きく異なることが分かった。そこで、発酵前のはっ酵乳原料配合液中の測定対象ペプチド濃度（ＴＷＹＳテトラペプチド濃度、ＴＷＹトリペプチド濃度、ＷＶジペプチド濃度又はＷＬジペプチド濃度（いずれのペプチド濃度も表２４～表２６参照）を基準（すなわち１００％）としたときの、はっ酵乳サンプル中のその測定対象ペプチド（ＴＷＹＳテトラペプチド濃度、ＴＷＹトリペプチド濃度、ＷＶジペプチド濃度又はＷＬジペプチド濃度）（いずれのペプチド濃度も表２４～表２６参照）の割合（％）（「ペプチドの残存率（％）」）をそれぞれ算出した結果を、それぞれ以下の表２７～表２９に示す。なお、表２７～表２９において、好ましいペプチドの残存率（％）として、かかる残存率が６０％以上の場合は残存率（％）の数値に一重の下線を記し、７０％以上の場合は残存率（％）の数値に二重の下線を記した。
【0098】
【表27】
【0099】
【表28】
【0100】
【表29】
【0101】
表２７～表２９の結果から、発酵工程の乳酸菌として供試菌４（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリスNBRC100676）や、供試菌９（ラクトバシラス・デルブリッキ・サブスピーシーズ・ブルガリクスNBRC13953）を使用すると、はっ酵乳の原料の種類にかかわらず（すなわち、はっ酵乳原料配合液１１～１５のいずれかにかかわらず）、ＷＬジペプチドの残存率（％）が高いはっ酵乳が得られること（すなわち、発酵工程中のおけるＷＬジペプチド含有量の減少を抑制できること）が示された。このことから、ラクトコッカス・ラクティス又はラクトバシラス・デルブリッキを用いると、はっ酵乳の原料の種類にかかわらず、発酵工程中のＷＬジペプチド含有量の減少を抑制できると考えられた。
なお、表２８～２９の結果から、はっ酵乳原料配合液１３～１５で供試菌４又は供試菌９を用いた場合は、発酵前より発酵後の方がＷＬペプチド濃度が高かったため、ＷＬジペプチドに残存割合が１００％を超えている。しかし、供試菌４又は供試菌９を用いた場合のはっ酵乳中のＷＬジペプチドの濃度は、乳タンパク質を含むはっ酵乳原料配合液１３～１５を用いた場合よりも、乳ペプチド（ホエイペプチド又はカゼインペプチド）を含むはっ酵乳原料配合液１１及び１２を用いた場合の方が高かった。したがって、本発明の製造方法３や本発明の抑制方法３において、ＷＬペプチドとして、ホエイペプチドやカゼインペプチドを用いることが好ましいことが示された。
なお、表２８～２９の結果から、はっ酵乳原料配合液１３～１５で供試菌４又は供試菌９を用いた場合は、発酵前より発酵後の方がＷＬペプチド濃度が高かったため、ＷＬジペプチドに残存割合が１００％を超えている。しかし、供試菌４又は供試菌９を用いた場合のはっ酵乳中のＷＬジペプチドの濃度は、乳タンパク質を含むはっ酵乳原料配合液１３～１５を用いた場合よりも、乳ペプチド（ホエイペプチド又はカゼインペプチド）を含むはっ酵乳原料配合液１１及び１２を用いた場合の方が高かった。したがって、本発明の製造方法３や本発明の抑制方法３において、ＷＬペプチドとして、ホエイペプチドやカゼインペプチドを用いることが好ましいことが示された。
【産業上の利用可能性】
【0102】
本発明によれば、特定の機能性ペプチドを含むはっ酵乳原料配合液を乳酸菌で発酵させる際に、発酵工程中の該特定の機能性ペプチド含有量の減少が抑制された、はっ酵乳の製造方法や、発酵工程中の特定の機能性ペプチド含有量の減少が抑制されたはっ酵乳等を提供することができる。