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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-19
(45)【発行日】2024-07-29
(54)【発明の名称】タンパク質のマクロ環化
(51)【国際特許分類】
C07K 1/107 20060101AFI20240722BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20240722BHJP
【ＦＩ】
C07K1/107
C12N9/10 ZNA
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2020557254
(86)(22)【出願日】2019-04-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-08-30
(86)【国際出願番号】 NL2019050229
(87)【国際公開番号】W WO2019203645
(87)【国際公開日】2019-10-24
【審査請求日】2022-03-17
(31)【優先権主張番号】18168298.0
(32)【優先日】2018-04-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】519191237
【氏名又は名称】スティヒティング ブイユー
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】グロスマン，トム ノーバート
(72)【発明者】
【氏名】ペレイ ヒメーノ，マルタ
(72)【発明者】
【氏名】ヘニッヒ，スヴェン
(72)【発明者】
【氏名】ノイバッハー，サスキア アントニエ
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】特表２００５－５００８３１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２７１８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】Bioconjugate Chemistry，2012年，Vol.23，pp.1856-1863
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
変性に対するポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせの安定性を増加させる方法であって、前記ポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせは、少なくとも２つの２次構造を有する天然の３次構造を示し、前記方法が、－ａ）天然の３次構造におけるポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせ内で、Ｃ３対称コアを有する３価チオール反応性架橋剤と反応するための空間近接性を有する少なくとも２つの異なる２次構造に位置する３システイン残基を同定することと
－ｂ）反応した架橋剤を含まないポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせの安定性と比較して、変性に対してポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせの天然の３次構造を安定化させる方法において、前記ポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせと３価チオール反応性架橋剤とを接触させることであって、前記架橋剤と前記３システイン残基の各々との共有結合を形成するように接触させることと、を含み、前記３システイン残基のαＣ原子は、辺の長さが６～２３オングストロームの三角形を形成する、方法。
【請求項2】
工程ａ）において、前記３システイン残基の１つ以上がポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせに導入され、修飾されたポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせが作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせが少なくとも第４のシステイン残基を含み、且つ前記方法が第４のシステインと前記架橋剤との間の共有結合の形成をもたらさない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせが酵素であり、且つ前記第４のシステインが前記酵素の活性部位の一部である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記架橋剤がＣ３対称性を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記架橋剤が、式（Ｉ）：【化1】
式中、
Ｑが、
【化2】
Ｑ中の各破線が、ＱがＬに結合される部位を表し、
各Ｌが、
【化3】
ここで、
各Ｕが、ＣＨ２及びＣＦ２から独立して選択され、
Ｖが、ＣＨ２であり、
Ｗが、ＣＦ２であり、
Ｘが、ＮＲ、ＮＨ、又はＯであり、
ここで、Ｒが、フルオロフォア又はアフィニティーハンドルであり、
ｎが、２～８の範囲の整数であり、
ｍが、１～４の範囲の整数であり、
ｏが、２又は３であり、且つ
ｖが、２又は３であり、
Ｌ中の各破線が、ＬがＱ又はＥに結合される部位を表し、
各Ｅが、
【化4】
ここで、
各Ｘが、ＮＨ及びＯから独立して選択され、
Ｙが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｔｏｓ（Ｏ－ＳＯ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ３）、及びＭｅｓ（Ｏ－ＳＯ２－ＣＨ３）から選択され、
Ｚが、ＣＨ２、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２、又はＯ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２であり、
Ｅ中の各破線が、ＥがＬに結合される部位を表す、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記架橋剤が、式（ＩＩＩ）：【化5】
【請求項8】
変性に対して安定化されたポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせであって、ポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせが、３システイン残基を含む少なくとも２つの２次構造を有する天然の３次構造を示し、前記３システイン残基が天然の３次構造におけるポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせ内で、Ｃ３対称コアを有する３価チオール反応性架橋剤と反応するための空間近接性を有する少なくとも２つの異なる２次構造に位置し、反応した架橋剤を含まないポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせの安定性と比較して、変性に対してポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせの天然の３次構造の安定化において、前記架橋剤と前記３システイン残基の各々との共有結合を形成しており、前記３システイン残基のαＣ原子は、辺の長さが６～２３オングストロームの三角形を形成する、ポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせ。
【請求項9】
前記ポリペプチドが、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＳｒｔＡのアミノ酸位置番号付けを基準にして、位置１１１、１４９、及び１７７にシステインによるアミノ酸置換を含むソルターゼＡポリペプチドであって、好ましくは前記ポリペプチドが配列番号１を有する、ソルターゼＡポリペプチドである、請求項８に記載の天然もしくは修飾されたポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせ。
【請求項10】
前記ポリペプチドが、下記の配列のアミノ酸位置番号付けを基準にして、位置５９４、５９９、及び６４６にシステインによるアミノ酸置換を含むＫＩＸドメインポリペプチドである、請求項８に記載の天然もしくは修飾されたポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせ。【化6】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、タンパク質のマクロ環化のための方法及び３価チオール反応性架橋剤に関する。本発明は、タンパク質の安定性を増加させるのに役立つ。
本発明は、タンパク質のマクロ環化のための方法及び３価チオール反応性架橋剤に関する。本発明は、タンパク質の安定性を増加させるのに役立つ。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
酵素は、ほとんどのバイオテクノロジープロセス及びバイオメディカルプロセスの必須成分であるが［１、２］、多くの場合、所望の苛酷な条件（たとえば昇温又は変性剤の存在）下では安定性が限られるため、その適用範囲は制限される。そのため、タンパク質構造の安定化は、好適な酵素の開発の中心的側面である。タンパク質３次構造の相互作用の複雑性及び配列改変に対する酵素活性の感受性は、酵素安定化の取組みを困難にしている。最小限の侵襲的ストラテジーは、治療適用のバイオ安定性を増加させるために主に適用される共有結合タンパク質修飾（たとえばペグ化又はグリコシル化）の使用を含む［３、４］。代替的に、酵素安定化は、ダイレクト評価を適用するタンパク質配列の改変、コンセンサスベース突然変異誘発、又は非タンパク質原性アミノ酸の導入により補完可能な計算アプローチ［５、６、７、８］を介して達成可能である［９］。これらのアプローチは、改善されたタンパク質コア相互作用、構造剛性化、及び／又は表面電荷分布を目指し、多くの場合、妥当な安定化効果を達成するために複数の最適化ラウンドを必要とする。
酵素は、ほとんどのバイオテクノロジープロセス及びバイオメディカルプロセスの必須成分であるが［１、２］、多くの場合、所望の苛酷な条件（たとえば昇温又は変性剤の存在）下では安定性が限られるため、その適用範囲は制限される。そのため、タンパク質構造の安定化は、好適な酵素の開発の中心的側面である。タンパク質３次構造の相互作用の複雑性及び配列改変に対する酵素活性の感受性は、酵素安定化の取組みを困難にしている。最小限の侵襲的ストラテジーは、治療適用のバイオ安定性を増加させるために主に適用される共有結合タンパク質修飾（たとえばペグ化又はグリコシル化）の使用を含む［３、４］。代替的に、酵素安定化は、ダイレクト評価を適用するタンパク質配列の改変、コンセンサスベース突然変異誘発、又は非タンパク質原性アミノ酸の導入により補完可能な計算アプローチ［５、６、７、８］を介して達成可能である［９］。これらのアプローチは、改善されたタンパク質コア相互作用、構造剛性化、及び／又は表面電荷分布を目指し、多くの場合、妥当な安定化効果を達成するために複数の最適化ラウンドを必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
タンパク質、とくに酵素の安定性を増加させる新しい方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【0004】
発明の概要
一態様では、本開示は、タンパク質の安定性を増加させる方法を提供する。タンパク質は少なくとも７０アミノ酸を含み、前記方法は、
－ａ）３システイン残基を含むタンパク質を提供することと、
－ｂ）前記タンパク質と３価チオール反応性架橋剤とを接触させることであって、前記架橋剤と３システイン残基の各々との共有結合を形成するように接触させることと、
を含む。好ましくは、工程ａ）は、３システイン残基の１つ以上を導入するようにタンパク質を改変することを含む。好ましくは、前記タンパク質は、少なくとも第４のシステイン残基を含み、且つ前記方法は、第４のシステインと架橋剤との間の共有結合の形成をもたらさない。好ましくは、タンパク質は酵素であり、且つ第４のシステインは酵素活性部位の一部である。好ましくは、架橋剤はＣ３対称性を有する。
一態様では、本開示は、タンパク質の安定性を増加させる方法を提供する。タンパク質は少なくとも７０アミノ酸を含み、前記方法は、
－ａ）３システイン残基を含むタンパク質を提供することと、
－ｂ）前記タンパク質と３価チオール反応性架橋剤とを接触させることであって、前記架橋剤と３システイン残基の各々との共有結合を形成するように接触させることと、
を含む。好ましくは、工程ａ）は、３システイン残基の１つ以上を導入するようにタンパク質を改変することを含む。好ましくは、前記タンパク質は、少なくとも第４のシステイン残基を含み、且つ前記方法は、第４のシステインと架橋剤との間の共有結合の形成をもたらさない。好ましくは、タンパク質は酵素であり、且つ第４のシステインは酵素活性部位の一部である。好ましくは、架橋剤はＣ３対称性を有する。
【0005】
好ましくは、前記架橋剤は、式（Ｉ）：
を有し、
式中、
Ｑが、
からなる群から選択されるコア構造であり、
Ｑ中の各破線が、ＱがＬに結合される部位を表し、
各Ｌが、
からなる群から独立して選択されるリンカーであり、
ここで、
各Ｕが、ＣＨ２及びＣＦ２から独立して選択され、
Ｖが、ＣＨ２であり、
Ｗが、ＣＦ２であり、
Ｘが、ＮＲ、ＮＨ、又はＯであり、
ここで、Ｒが、フルオロフォア又はアフィニティーハンドルであり、
ｎが、２～８の範囲の整数であり、
ｍが、１～４の範囲の整数であり、
ｏが、２又は３であり、且つ
ｖが、２又は３であり、
Ｌ中の各破線が、ＬがＱ又はＥに結合される部位を表し、
各Ｅが、
からなる群から独立して選択される求電子剤であり、
ここで、
各Ｘが、ＮＨ及びＯから独立して選択され、
Ｙが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｔｏｓ（Ｏ－ＳＯ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ３）、及びＭｅｓ（Ｏ－ＳＯ２－ＣＨ３）から選択され、
Ｚが、ＣＨ２、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２、又はＯ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２であり、
Ｅ中の各破線が、ＥがＬに結合される部位を表す。
【化1】
式中、
Ｑが、
【化2】
Ｑ中の各破線が、ＱがＬに結合される部位を表し、
各Ｌが、
【化3】
ここで、
各Ｕが、ＣＨ２及びＣＦ２から独立して選択され、
Ｖが、ＣＨ２であり、
Ｗが、ＣＦ２であり、
Ｘが、ＮＲ、ＮＨ、又はＯであり、
ここで、Ｒが、フルオロフォア又はアフィニティーハンドルであり、
ｎが、２～８の範囲の整数であり、
ｍが、１～４の範囲の整数であり、
ｏが、２又は３であり、且つ
ｖが、２又は３であり、
Ｌ中の各破線が、ＬがＱ又はＥに結合される部位を表し、
各Ｅが、
【化4】
ここで、
各Ｘが、ＮＨ及びＯから独立して選択され、
Ｙが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｔｏｓ（Ｏ－ＳＯ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ３）、及びＭｅｓ（Ｏ－ＳＯ２－ＣＨ３）から選択され、
Ｚが、ＣＨ２、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２、又はＯ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２であり、
Ｅ中の各破線が、ＥがＬに結合される部位を表す。
【0006】
本開示は、本明細書に開示される方法により得られる安定化タンパク質をさらに提供する。好ましくは、タンパク質は、ソルターゼＡポリペプチド又はＫＩＸドメインポリペプチドである。
【0007】
本開示は、更に、式ＩＩ：
を有する３価チオール反応性架橋剤を提供し、
式中、
Ｑが、
であり、
Ｑ中の各破線が、ＱがＬに結合される部位を表し、
各Ｌが、
からなる群から独立して選択されるリンカーであり、
ここで、
各Ｕが、ＣＨ２及びＣＦ２から独立して選択され、
Ｖが、ＣＨ２であり、
Ｗが、ＣＦ２であり、
Ｘが、ＮＲ、ＮＨ、又はＯであり、
ここで、Ｒが、フルオロフォア又はアフィニティーハンドルであり、ｎが、２～８の範囲の整数であり、ｍが、１～４の範囲の整数であり、
ｏが、２又は３であり、且つ
ｖが、２又は３であり、
Ｌ中の各破線が、ＬがＱ又はＥに結合される部位を表し、
各Ｅが、
からなる群から独立して選択される求電子剤であり、
ここで、
各Ｘが、ＮＨ及びＯから独立して選択され、
Ｙが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｔｏｓ（Ｏ－ＳＯ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ３）、及びＭｅｓ（Ｏ－ＳＯ２－ＣＨ３）から選択され、
Ｚが、ＣＨ２、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２、又はＯ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２であり、
Ｅ中の各破線が、ＥがＬに結合される部位を表す。
【化5】
式中、
Ｑが、
【化6】
Ｑ中の各破線が、ＱがＬに結合される部位を表し、
各Ｌが、
【化7】
ここで、
各Ｕが、ＣＨ２及びＣＦ２から独立して選択され、
Ｖが、ＣＨ２であり、
Ｗが、ＣＦ２であり、
Ｘが、ＮＲ、ＮＨ、又はＯであり、
ここで、Ｒが、フルオロフォア又はアフィニティーハンドルであり、ｎが、２～８の範囲の整数であり、ｍが、１～４の範囲の整数であり、
ｏが、２又は３であり、且つ
ｖが、２又は３であり、
Ｌ中の各破線が、ＬがＱ又はＥに結合される部位を表し、
各Ｅが、
【化8】
ここで、
各Ｘが、ＮＨ及びＯから独立して選択され、
Ｙが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｔｏｓ（Ｏ－ＳＯ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ３）、及びＭｅｓ（Ｏ－ＳＯ２－ＣＨ３）から選択され、
Ｚが、ＣＨ２、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２、又はＯ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２であり、
Ｅ中の各破線が、ＥがＬに結合される部位を表す。
【0008】
好ましくは、
Ｌが、
であり、
Ｕが、ＣＨ２であり、好ましくはｎが、２又は３であり、且つ
Ｅが、
であり、
ここで、ＸがＮＨであり、且つＹがＦ、Ｃｌ、又はＢｒ、好ましくはＣｌである。
Ｌが、
【化9】
Ｕが、ＣＨ２であり、好ましくはｎが、２又は３であり、且つ
Ｅが、
【化10】
ここで、ＸがＮＨであり、且つＹがＦ、Ｃｌ、又はＢｒ、好ましくはＣｌである。
【0009】
好ましくは、前記架橋剤が、式（ＩＩＩ）：
であり、式中、ｎが１であるか又はｎが２である。
【化11】
【0010】
本開示は、チオール基と反応させるための、好ましくはタンパク質中に存在する３システイン残基を架橋するための、本明細書に開示される架橋剤の使用をさらに提供する。
【0011】
本開示は、少なくとも７０アミノ酸を含み且つ少なくとも３システイン残基を含むタンパク質をさらに提供する。３システイン残基の各々は、３価チオール反応性架橋剤に共有結合される。好ましくは、３価チオール反応性架橋剤は、本明細書に開示される架橋剤である。
【0012】
本開示は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＳｒｔＡのアミノ酸位置番号付けを基準にして位置１１１、１４９、及び１７７にシステインによるアミノ酸置換を含むソルターゼＡポリペプチドをさらに提供する。好ましくは、ポリペプチドは配列番号１を有する。
【0013】
本開示は、図１３ｂのアミノ酸位置番号付けを基準にして位置５９４、５９９、及び６４６にシステインによるアミノ酸置換を含むＫＩＸドメインポリペプチドをさらに提供する。好ましくは、ポリペプチドは図１３ｃに表される配列を有する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
図面の簡単な説明
【図1a】モジュラービス又はトリス求電子架橋を用いた安定化タンパク質３次構造へのマクロ環化ストラテジー。
【図1b】アクセス可能なシステインの架橋のために考慮された求電子剤（マレイミド１、２－ブロモアセトアミド２、２－クロロアセトアミド３、アクリルアミド４）。
【図2a】環状酵素の生成に使用されるビス求電子剤（ｂ１～ｂ６）。
【図2b】ハイライトされたシステイン変異位置を有するＳｒｔＡのＮＭＲ構造（ＰＤＢ：１ｉｊａ）。システイン対（同一色）及びそれらの位置が示される。
【図2c】線状及び架橋ＳｒｔＡ変異体（７５μＭ）のＴｍ値のヒートマップ表示（２ｃ及び２ｅの緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ、３ｅでは０．０１％ Tweenを含む）。
【図2d】ＳｒｔＡ媒介ペプチド転移反応の機序（認識モチーフ：ＬＰＥＴＧ）。
【図2e】６５℃における線状及び架橋ＳｒｔＡ変異体の酵素活性（野生型ＳｒｔＡと比べたｖｒ）のヒートマップ表示（１０μＭ酵素、１０μＭ蛍光プローブ）（２ｃ及び２ｅの緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ、３ｅでは０．０１％ Tweenを含む）。
【図3a】ハイライトされたＳ７にシステイン変異位置を有するＳｒｔＡのＮＭＲ構造（ＰＤＢ：１ｉｊａ）。
【図3b】トリス求電子剤ｔ１の化学構造及びｔ１と共にインキュベートした後のタンパク質バンドを示すクーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（５０μＭ Ｓ７、１ｍＭ ｔ１、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ）。
【図3c】Ｔｍ値を含むＳｒｔＡ、Ｓ４－ｂ３、及びＳ７－ｔ１の融解曲線（３ｃ及び３ｄの緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ、ｄでは０．０１％ Tweenを含む）。
【図3d】６５℃における酵素活性によるプローブ切断の蛍光リードアウト（１０μＭ酵素、１０μＭ蛍光プローブ）（３ｃ及び３ｄの緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ、ｄでは０．０１％ Tweenを含む）。
【図4a】酵素不在下（ライトグレー）、ＳｒｔＡ使用時（ダークグレー）、又はＳ７－ｔ１使用時（レッド）における蛍光プローブ（●）を用いたペプチド転移反応（６５℃で１２ｈ）のＨＰＬＣクロマトグラム（４４０ｎｍ）。産物形成（▲、■）は、Ｓ７－ｔ１（５０μＭ酵素、１０μＭプローブ、２．５ｍＭ ＧＧＧ）の存在下でのみ観測された。
【図4b】酵素活性の温度依存性（３７℃のＳｒｔＡと比べたｖｒ）（１０μＭ酵素、１０μＭプローブ、２．５ｍＭ ＧＧＧ、緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ、０．０１％ Tween）。値はトリプリケートの平均値である（±１σ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意でない）。
【図4c】各種濃度のＧｄｎＨＣｌに対する３７℃における相対酵素活性（ＧｄｎＨＣｌ不在下のＳｒｔＡと比べたｖｒ）（条件及びデータ処理については３ｂを参照されたい）。
【図4d】フィブリル形成前（Ａ）並びにＧｄｎＨＣｌ（１Ｍ）不在下（Ｂ）及び存在下（Ｃ）での再可溶化後における可溶性α－Ｓｙｎ画分を示すクーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。
【図4e】フィブリル形成前Ａ（ＧｄｎＨＣｌ不使用）並びにＳｒｔＡ又はＳ７－ｔ１のどちらかの使用時の再可溶化後Ｂ（ＧｄｎＨＣｌ不使用）及びＣ（１Ｍ ＧｄｎＨＣｌ）における可溶性画分を用いたαｓｙｎ標識化の蛍光リードアウト（λｅｍ＝５２０ｎｍ）。
【図5】ビス求電子架橋剤の化学構造及び3D ChemDrawを用いて計算されたその長さ。
【図6a】本研究でクローニング、発現、及び評価されたＳｒｔＡのアミノ酸配列。
【図7a】ＳｒｔＡ酵素活性アッセイの模式図。蛍光プローブの化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム（１０ｍｉｎにわたるリニアグラジエント３０％～７０％ＡＣＮ、２１０ｎｍ）、及びＭＳスペクトル。
【図7b】３７℃（実線）及び６５℃（破線）におけるＳｒｔＡ加水分解活性アッセイのプロット。
【図8a】ＨＰＬＣ結合高分解能質量分析によるＳ７及びＳ７－ｔ１の４システインの修飾状態の解析。以下のトリプシン断片のスペクトルが示される。ａａ１００～１３４（Ｃ１１１を含む）。遊離システイン残基又はＣ４Ｈ４ＯＮ（グレー）修飾体は、ＭＳ処理前の酵素（Ｓ７又はＳ７－ｔ１）の遊離システインを表し、一方、Ｃ２Ｈ２Ｏ（レッド）修飾システインは、ｔ１との共有結合修飾を表す。
【図8b】ＨＰＬＣ結合高分解能質量分析によるＳ７及びＳ７－ｔ１の４システインの修飾状態の解析。以下のトリプシン断片のスペクトルが示される。１３８～１５１（Ｃ１４９を含む）。遊離システイン残基又はＣ４Ｈ４ＯＮ（グレー）修飾体は、ＭＳ処理前の酵素（Ｓ７又はＳ７－ｔ１）の遊離システインを表し、一方、Ｃ２Ｈ２Ｏ（レッド）修飾システインは、ｔ１との共有結合修飾を表す。
【図8c】ＨＰＬＣ結合高分解能質量分析によるＳ７及びＳ７－ｔ１の４システインの修飾状態の解析。以下のトリプシン断片のスペクトルが示される。１７６～１９０（Ｃ１７７及び活性部位Ｃ１８４を含む）。遊離システイン残基又はＣ４Ｈ４ＯＮ（グレー）修飾体は、ＭＳ処理前の酵素（Ｓ７又はＳ７－ｔ１）の遊離システインを表し、一方、Ｃ２Ｈ２Ｏ（レッド）修飾システインは、ｔ１との共有結合修飾を表す。
【図9a】配列番号２：Ｃ末端フレキシブルリンカー（ボールド）とＳｒｔＡ認識モチーフ（グレー）とアフィニティー精製用Ｈｉｓ６タグ（アンダーライン）とを含むα－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）配列。
【図9b】蛍光プローブＧＧＧＫ－ＦＩＴＣの化学構造及びＨＰＬＣ／ＭＳ解析。クロマトグラム（λ＝２１０ｎｍ）及びＭＳスペクトルが示される。
【図10a】フィブリル形成及びＧｄｎＨＣｌによる再可溶化のスキーム（Ａ：フィブリル形成前の精製α－Ｓｙｎ、Ｂ：ＧｄｎＨＣｌ不在下での再可溶化の試行－不溶性α－Ｓｙｎフィブリル、Ｃ：ＧｄｎＨＣｌ（１Ｍ）処理後の再可溶化α－シヌクレイン）。
【図11】熱変性の前及び後のＳｔｒＡ（グレー）及び二環式Ｓ７－ｔ１（レッド）のトランスペプチダーゼ活性。未処理タンパク質（ＳｔｒＡ及びＳ７－ｔ１）並びに加熱／冷却サイクルに付されたサンプル（ＳｔｒＡ＃及びＳ７－ｔ１＃、３０ｍｉｎにわたる室温から８５℃への加熱及び１５ｍｉｎにわたる室温への冷却）が比較される。酵素なしのサンプルを含めた（－）。統計的有意性は、対応のないｔ検定により評価した（ｎ＝３、ｎｓ：有意でないｐ＞０．０５）。
【図12a】ハイライトされたＫ１にシステイン変異位置を有するＫＩＸのＮＭＲ構造（ＰＤＢ：２ａｇｈ）。二次構造エレメントが命名されている。
【図12b】Ｔｍ値を含むＫＩＸ、Ｋ１－ｔ１、及びＫ１－ｔ２の融解曲線。
【図13a】本研究でサブクローニング、発現、及び評価されたＫＩＸｗｔのアミノ酸配列。
【図13b】本研究でサブクローニング、発現、及び評価されたＫＩＸ変異体Ｋ１のアミノ酸配列。突然変異は緑色でハイライトされる。
【図13c】ＫＩＸ ＮＭＲ構造（ＰＤＢコード：２ａｇｈ）の２０コンフォーマーにわたる下線付きアミノ酸位置のＣα原子間の平均距離。
【図13d】Ｓ７変異体のシステイン位置。ＳｒｔＡ ＮＭＲ構造（ＰＤＢコード：１ｉｊａ）の２５コンフォーマーにわたる下線付きアミノ酸位置のＣα原子間の平均距離。
【図14a】ＭＬＬペプチドの化学構造、ＨＰＬＣクロマトグラム（１０ｍｉｎ（３～１３ｍｉｎ）にわたるリニアグラジエント４０％～８０％ＡＣＮ、λ＝２１０ｎｍ）、及びＭＳスペクトル。
【図14b】ＫＩＸｗｔ並びに架橋形態Ｋ１－ｔ１及びＫ１－ｔ２のＦＰアッセイ。対応するＫｄ値が示される。
【図15a】ｔ２と共にインキュベートした後のタンパク質バンドを示すクーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（５０μＭ Ｓ７、１ｍＭ ｔ２、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ）。
【図15b】Ｓ７－ｔ２のｍ／ｚ値の計算値及び実測値の表。
【図15c】二環状Ｓ７－ｔ２のＭＳスペクトル。
【図15d】明白なＴｍ値を含むＳｒｔＡ及びＳ７－ｔ２の融解曲線。
【図15e】６５℃における酵素加水分解活性によるプローブ切断の蛍光リードアウト（１０μＭ酵素、１０μＭ蛍光プローブ）。実験ｄ及びｅに使用した緩衝液：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ、ｅ）では０．０１％ Tween２０を含む。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本開示の実施形態の詳細な説明
変性剤及び昇温に対して酵素の安定化を増加させることもまた、分子内架橋の導入により研究されてきた。追加のジスルフィドブリッジの組込み又は非酵素タンパク質ドメインで最近報告されている還元性環境に非感受性のジスルフィドミミックの導入［１０］に関する報告が存在する。そのほか、３次構造でＮ及びＣ末端の好適な空間アライメントを必要とするラクタム形成を介するタンパク質末端の架橋が適用されている［１１～１３］。
変性剤及び昇温に対して酵素の安定化を増加させることもまた、分子内架橋の導入により研究されてきた。追加のジスルフィドブリッジの組込み又は非酵素タンパク質ドメインで最近報告されている還元性環境に非感受性のジスルフィドミミックの導入［１０］に関する報告が存在する。そのほか、３次構造でＮ及びＣ末端の好適な空間アライメントを必要とするラクタム形成を介するタンパク質末端の架橋が適用されている［１１～１３］。
【0016】
これらの構造上の前提条件を低減するために、適切にアライメントされたシステイン側鎖との架橋を可能にするように非天然求電子アミノ酸の取込みが探究された［１４］。しかしながら、こうした非天然アミノ酸を導入するためのアンバー停止コドン抑制の使用は、タンパク質発現を複雑化する。そのほか、こうした修飾アミノ酸の取込みは、労力がかかるうえにすべての非天然アミノ酸で成功するとは限らない適合化ｔＲＮＡシンテターゼを必要とするので、リンカーライブラリーのスクリーニングは制限される［１５］。したがって、非天然アミノ酸の使用に依拠する架橋アプローチは、いくつかの欠点を抱える。
【0017】
本開示は、非天然アミノ酸の使用に依拠しない架橋タンパク質の生成方法を提供する。タンパク質は、たとえば、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、抗体、レセプター、抗原など、いずれかの機能を有しうる。いくつかの実施形態では、タンパク質は酵素である。当業者には自明のことながら、本明細書に記載の架橋タンパク質は、１ポリペプチド又はペプチド鎖超で構成されたタンパク質を含む。たとえば、抗体は、本開示の模範的タンパク質であり、ＩｇＧ抗体は、４ペプチド鎖で構成される。レセプターもまた、本開示の模範的タンパク質であり、多くのタンパク質は、たとえばヘテロ又はホモダイマーで構成される。いくつかの実施形態では、ポリペプチド／ペプチド鎖間で架橋が形成されるように、異なるポリペプチド又はペプチド鎖にシステイン残基が存在する。たとえば、本開示は、ヘテロダイマーレセプターの安定性を増加させる方法を企図する。本明細書で企図される多くの実施形態の一例として、レセプターが３価チオール反応性架橋剤に接触したときに架橋剤が３システイン残基の各々との共有結合をダイマー間で形成するように、一方のレセプターサブユニットに１システイン残基及び他方のレセプターサブユニットに２システイン残基を有するヘテロダイマーレセプターが提供される。
【0018】
特定的には、本方法は、架橋試薬を用いてタンパク質の安定性を改善する。当業者には明らかであるが、安定性の増加とは、架橋なしのタンパク質の安定性と比較した架橋タンパク質の安定性の増加を意味する。本明細書で用いられる「増加した安定性」という用語は、変性に対する耐性の増加又は感受性の減少を意味する。変性とは、２次又は３次構造の損失を意味し、ほとんどのタンパク質の生物学的機能とくに酵素活性は、変性時、低減又は消失される。変性は、機械的撹拌、照射、温度上昇の結果として又は化学変性剤により発生可能である。いくつかの実施形態では、改善された安定性とは、架橋なしのタンパク質と比べて架橋時のより高いフォールドタンパク質対アンフォールドタンパク質比の存在を意味する。改善された安定性は、温度、界面活性剤、変性剤、ｐＨなどのさまざまな条件下で存在するフォールドタンパク質の量を調べることにより決定可能である。好ましい実施形態では、本方法は、熱安定性及び／又は化学変性剤に対する安定性を改善する。
【0019】
いくつかの実施形態では、タンパク質の安定性は、Ｔｍを測定することにより決定可能である。「Ｔｍ」という用語は、タンパク質の５０％がアンフォールドした温度を意味する。典型的には、Ｔｍが高いほどタンパク質は安定である。いくつかの実施形態では、本方法は、タンパク質のＴｍを増加させるためのものである。いくつかの実施形態では、タンパク質の安定性は、タンパク質に及ぼす化学剤の影響を測定することにより決定可能である。化学変性剤とは、タンパク質内の非共有結合相互作用及び共有結合を破壊可能な作用剤のことである。模範的化学変性剤としては、グアニジニウムヒドロクロライド、グアナジニウムチオシアネート、ウレア、アセトン、有機溶媒、塩、還元剤（たとえば、ジチオトレイトール、β－メルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン）、界面活性剤、及び酸が挙げられる。プロテアーゼなどの生物学的作用剤もまた、変性剤として作用しうる。
【0020】
いくつかの実施形態では、本方法は、
－ａ）本明細書に開示される３システイン残基を含むタンパク質（Ｉ）を提供することと、
－ｂ）前記タンパク質と本明細書に開示される３価チオール反応性架橋剤とを接触させることであって、架橋剤と３システイン残基の各々との共有結合を形成し架橋タンパク質（ＩＩ）をもたらすように接触させることと、
を含み、架橋タンパク質（ＩＩ）は、架橋欠如タンパク質（Ｉ）と比較して増加したＴｍ及び／又は変性に対する増加した耐性を有する。
－ａ）本明細書に開示される３システイン残基を含むタンパク質（Ｉ）を提供することと、
－ｂ）前記タンパク質と本明細書に開示される３価チオール反応性架橋剤とを接触させることであって、架橋剤と３システイン残基の各々との共有結合を形成し架橋タンパク質（ＩＩ）をもたらすように接触させることと、
を含み、架橋タンパク質（ＩＩ）は、架橋欠如タンパク質（Ｉ）と比較して増加したＴｍ及び／又は変性に対する増加した耐性を有する。
【0021】
本明細書に開示される方法は、３システイン残基を含むタンパク質を提供することを含む。タンパク質は、３価チオール反応性架橋剤と接触して架橋剤と３システイン残基の各々との共有結合を形成する。実施例に記載されるように、ビ環化は、モノ環化と比較してタンパク質３次構造のより強い安定化をもたらすとともに、依然としてタンパク質の機能を保持する。いくつかの実施形態では、架橋される３システイン残基はタンパク質に内在する。しかしながら、ほとんどのタンパク質では、３システイン残基の１つ以上はタンパク質に導入されるであろう。システイン残基の導入は、当業者に公知のいずれかの方法により、たとえば、修飾タンパク質を化学合成することにより又は組換えＤＮＡ技術を用いて１つ以上のシステインを導入することにより達成しうる。いくつかの実施形態では、修飾タンパク質は、当技術分野で周知の技術により発現ベクターにクローニングして細胞培養で発現させることが可能である。また、本開示が本明細書に記載の結合の１つ超を有するタンパク質を包含することは明らかである。たとえば、システイン残基の３つが架橋可能であるとともに他の３システイン残基が架橋可能である６システイン残基を有するタンパク質を提供しうる。かかる実施形態では、架橋剤は、３システイン残基の各セットに対して同一でありうるか又は異なりうる。
【0022】
ショートペプチドは、一般に、その天然コンフォメーションを保持しない。事実上、多くのペプチドはきわめてフレキシブルである。そのため、ショートペプチドを特定コンフォメーションに拘束して骨格フレキシビリティーを低減する手段として、ペプチドステープリング技術が開発されてきた（たとえば、Lau et al. 2015 Chem Soc Rev 44:91-102にレビューされている）。ショート線状ペプチドを拘束して新規な活性を有する新たな構造を採用することは、薬剤発見にも有用である。たとえば、Bashiruddin et al. (2015 Bioorganic Chemistry 61: 45-50)には、融合三環状ペプチドをリボソーム合成する方法が記載されている。この技術は、新たな構造を有するペプチドのライブラリーを作成するために使用され、次いで、たとえば、とくに新たな機能を同定するためにバイオ活性のスクリーニングに使用可能である。この方法では、Ｎ末端のＣｌＡｃ基と、第２の位置の１Ｃｙｓ残基と、任意に離間した下流のさらなる３Ｃｙｓ残基と、を有するペプチドが翻訳され、続いてＴＢＭＢが添加される。Bashiruddinらは、４０アミノ酸未満の長さを有するショートペプチドを試験しているにすぎない。
【0023】
また、Chen et al. (2012 ChemBioChem 13: 1032-1038)は、高親和性リガンドのスクリーニングのためのペプチドライブラリーに関する。１７アミノ酸ペプチドをＴＣＥＰで完全に還元し、アセトニトリル（有機溶媒）に溶解されたさまざまなリンカー化合物と共にインキュベートした。著者らは、さまざまなリンカーとランダムペプチドライブラリーとの組合せが構造的にきわめて多様なマクロ環状タンパク質のライブラリーを作成するストラテジーでありうると結論付けている。
【0024】
特定２次構造又はループコンフォメーションのショートアミノ酸鎖を構造的に強化するペプチドステープリングとは異なり、本開示の方法は、タンパク質３次構造の安定性を改善する。本開示は、少なくとも７０アミノ酸を有するタンパク質に関する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、少なくとも８０アミノ酸さらには少なくとも１００アミノ酸を有する。ペプチドの単純構造とは異なり、タンパク質の複数の２次構造は、フォールドしてより複雑な３次元構造を形成する。好ましくは、本方法は、少なくとも２つの識別可能な２次構造を有するタンパク質に関する。好ましくは、本方法で提供されるタンパク質は、フォールドタンパク質、より正確には架橋前に変性されていないタンパク質である。本明細書に説明されるように、本開示の目的の１つは、タンパク質の「天然」フォールディング又は構造を安定化させる方法を提供することである。好ましい実施形態では、本方法は、非架橋タンパク質と比較してタンパク質の（天然）３次構造の安定性を増加させる。
【0025】
本明細書で用いられる場合、タンパク質の「２次構造」は、骨格アミノ基とカルボキシル基との間の水素結合のパターンにより定義される。αヘリックス、βシート、βターン、及びωループは、タンパク質の模範的２次構造である。本明細書で用いられる場合、「３次構造」とは、タンパク質の３次元形状を意味する。
【0026】
タンパク質構造予測技術は当技術分野で周知であり、相同性モデリング及びスレッディングのほか、ニューラルネットワーク、隠れマルコフモデル、及びサポートベクトルマシンを利用するより先進的な方法を含む。そのほか、タンパク質の３次構造は、Ｘ線結晶解析や核磁気共鳴（ＮＭＲ）研究などの公知の方法により決定可能である。Rosettaソフトウェアなどのパブリックに利用可能なソフトウェアもまた、タンパク質構造予測及び新たな構造の設計に使用可能である。Voet, Pratt, Voet: Principles of Biochemistry, 2017 Chapter 6 Proteins: Three-Dimensional Structure for a review on protein folding and secondary structure; structure prediction and determining protein structureを参照されたい。
【0027】
好ましくは、架橋用の３システインは、少なくとも２つの識別可能な２次構造に位置する。たとえば、第１のシステインは、第１のαヘリックスに位置しうるとともに、第２のシステインは、第２のαヘリックスに位置しうる。第３のシステインは、第１若しくは第２のαヘリックスのどちらか又はさらなる２次構造に位置しうる。かかる方法は、架橋が少なくとも２つの２次構造間の安定性を増加させるという利点を有する。より好ましくは、架橋用の３システインは、少なくとも３つの識別可能な２次構造に位置する。
【0028】
３システイン残基は、好適には、本明細書に開示される架橋剤と３システイン残基の各々との共有結合を形成可能なようにタンパク質内に位置する。好ましくは、システイン残基は、１次アミノ酸配列で少なくとも３アミノ酸分離されるとともに依然として空間近接する。好ましくは、３システイン残基のαＣ原子は、辺の長さが６～２３オングストロームの三角形を形成する。好ましくは、システインは、タンパク質の同一側を向いている。
【0029】
架橋用のタンパク質に１システイン残基以上を導入するとき、ペプチドステープリングの当技術分野で公知の設計原理を考慮しうる。たとえば、αヘリックスの同一面上に位置するペプチドのアミノ酸残基を共有結合で連結又は「ステープル」可能であることは公知である。かかる残基の間隔は、一般に、ｉ，ｉ＋４、ｉ＋７、ｉ＋１１、ｉ＋１２、ｉ＋１４、及びｉ＋１５である。βシートの安定性を促進するために、ステープルされる残基の間隔は、一般に、ｉ、ｉ，ｉ＋２、ｉ＋４、ｉ＋６、ｉ＋８、ｉ＋１０などである。ステープルは、剛性を付与してペプチドの所望の２次構造を強化する。
【0030】
３システイン残基の好ましい位置は、埋込み位置でもコア位置でもないことが好ましい。本明細書で用いられる「埋込み位置」とは、タンパク質の内側の位置及び／又は溶媒にアクセス不能若しくはほぼアクセス不能な位置を意味する。タンパク質のアクセス可能表面積は、いくつかの異なる予測方法により決定可能である（たとえば、Zheng, et al., Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2004;57:558-564、及びFaraggi et al., Proteins. 2014 Nov; 82(11): 3170-3176を参照されたい）。好ましくは、３システイン残基は、３次構造の表面上に位置し、且つ結合（たとえば、リガンド結合、基質認識）に関与しない。
【0031】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、本方法の結果として架橋されない少なくとも第４のシステイン残基を含む。かかる方法は、タンパク質がたとえば結合ドメイン又は酵素活性部位に生物的役割を有するシステイン残基を含むときにとくに有用である。実施例に記載されるように、修飾ＳｒｔＡポリペプチドへの本方法の適用は、驚くべきことに、組換え導入された３システイン残基の架橋をもたらしたが、酵素活性にきわめて重要な内因性システイン残基を架橋しなかった。
【0032】
本明細書に開示される方法の利点の１つは、架橋が天然に存在しないアミノ酸に依拠しないことである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、天然に存在しないアミノ酸を含まない。「天然に存在しないアミノ酸」という用語は、その側鎖機能性が天然に存在するアミノ酸とは異なるアミノ酸を含む。天然に存在するアミノ酸は、２０共通アミノ酸、すなわち、アラニン、アルギニン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、ヒスチジン、リシン、メチオニン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、さらにはピロリシン及びセレノシスチンを含む。
【0033】
非内因性システイン残基がタンパク質に導入される実施形態では、修飾の効果は、たとえば生物学的活性アッセイで決定可能である。たとえば、タンパク質が酵素である場合、１システイン以上が導入されたタンパク質の酵素活性を測定可能である。酵素活性のいくらの損失は許容可能であるが、酵素活性を顕著に低減する修飾は回避されるべきである。たとえば、結合性（たとえば親和性及び特異性）やタンパク質活性（たとえば下流のシグナリング）などの効果を決定するために、類似のアッセイを実施可能である。タンパク質の生物学的活性を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング法は周知である。
【0034】
本開示は、本明細書に開示されるように、タンパク質安定性を増加させるための３価チオール反応性架橋剤に関する。本明細書で用いられる場合、「架橋剤」という用語は、１つ以上の共有結合により分子たとえばタンパク質を化学結合可能な試薬を意味する。架橋試薬は「３価チオール反応性」である。すなわち、スルフヒドリル基たとえばシステインのチオール側鎖に装着可能な３つの反応性末端を含有する。好ましくは、架橋剤のチオール反応性末端は求電子剤を含む。好ましくは、架橋剤はホモ３官能性であり、より正確には各チオール反応性末端は同一官能基を有する。好ましくは、架橋剤はＣ３対称コアを有する。これには、（トリ）架橋タンパク質の一形態のみが形成されるという利点がある。３価チオール反応性架橋剤は当技術分野で公知である（たとえば２６～２９を参照されたい）。しかしながら、かかる架橋剤が、タンパク質の機能（とくに結合活性又は酵素機能）を維持しつつ、少なくとも７０アミノ酸を有するタンパク質の安定性を増加可能であることは報告されていなかった。
【0035】
いくつかの実施形態では、３価チオール反応性架橋剤は、フルオロフォア又はアフィニティーハンドルを含む。好適なフルオロフォアは当技術分野で周知であり、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、AMCA、Marina Blue色素、及びCascade Blue色素（Invitrogenから入手可能）を含む。アフィニティーハンドルとは、検出及び／又は精製に使用可能な分子を意味する。好適なアフィニティーハンドルは当技術分野で公知であり、抗体、２本鎖ＤＮＡ配列、修飾核酸、及び核酸ミミック、たとえば、ペプチド核酸、ロックド核酸、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、リガンド、レセプター、ペプチド、又はコグネイト結合剤を容易に入手可能な低分子を含みうる。好適なアフィニティータグは、ペプチド「タグ」、たとえば、ポリヒスチジン、カルモジュリン、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＨＡ、及びＭｙｃタグである。他の好適なアフィニティータグは当技術分野で周知である。
【0036】
架橋反応は、当技術分野で公知の条件下で行われる。たとえば、Mattson et al. Molecular Biology Reports 1993, Volume 17:pp 167-183、Paramelle et al. Proteomics 2013 13:438-456を参照されたい。一般的には、反応は、ｐＨ６～８及び４～４０℃の温度で行われる。任意選択的に、架橋反応の効率及び／又は特異性は、ＭＳを用いて決定可能である。本明細書にさらに記載されるように、本開示の目的の１つは、タンパク質の「天然」フォールディング又は構造を安定化させる方法を提供することである。好ましくは、反応は、タンパク質の３次構造を破壊しない条件下で行われる。いくつかの架橋剤は、溶解のために有機溶媒を必要とする。有機溶媒の存在は、タンパク質の変性をもたらしうる。好ましい実施形態では、反応は有機溶媒を用いることなく行われる。好ましい架橋剤は、溶解用有機溶媒を必要としないものである。
【0037】
いくつかの実施形態では、本方法は、架橋タンパク質の安定性を決定することをさらに含む。たとえば、本明細書に記載されるように熱安定性及び／又は化学的安定性を決定し、架橋されていないタンパク質と比較可能である。架橋の生物学的活性もまた決定可能である。
【0038】
本開示は、式（Ｉ）：
を有する架橋剤をさらに提供する。
式中、
Ｑは、
からなる群から選択されるコア構造であり、
Ｑ中の各破線は、ＱがＬに結合される部位を表し、各Ｌは、
からなる群から独立して選択されるリンカーであり、
各Ｕは、ＣＨ２及びＣＦ２から独立して選択され、
Ｖは、ＣＨ２であり、
Ｗは、ＣＦ２であり、
Ｘは、ＮＲ、ＮＨ、又はＯであり、
ここで、Ｒは、フルオロフォア又はアフィニティーハンドルであり、
ｎは、２～８の範囲の整数であり、
ｍは、１～４の範囲の整数であり、
ｏは、２又は３であり、且つ
ｖは、２又は３であり、
Ｌ中の各破線は、ＬがＱ又はＥに結合される部位を表し、各Ｅは、
からなる群から独立して選択される求電子剤であり、
各Ｘは、ＮＨ及びＯから独立して選択され、
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｔｏｓ（Ｏ－ＳＯ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ３）、及びＭｅｓ（Ｏ－ＳＯ２－ＣＨ３）から選択され、
Ｚは、ＣＨ２、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２、又はＯ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２であり、
Ｅ中の各破線は、ＥがＬに結合される部位を表す。
【化12】
式中、
Ｑは、
【化13】
Ｑ中の各破線は、ＱがＬに結合される部位を表し、各Ｌは、
【化14】
各Ｕは、ＣＨ２及びＣＦ２から独立して選択され、
Ｖは、ＣＨ２であり、
Ｗは、ＣＦ２であり、
Ｘは、ＮＲ、ＮＨ、又はＯであり、
ここで、Ｒは、フルオロフォア又はアフィニティーハンドルであり、
ｎは、２～８の範囲の整数であり、
ｍは、１～４の範囲の整数であり、
ｏは、２又は３であり、且つ
ｖは、２又は３であり、
Ｌ中の各破線は、ＬがＱ又はＥに結合される部位を表し、各Ｅは、
【化15】
各Ｘは、ＮＨ及びＯから独立して選択され、
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｔｏｓ（Ｏ－ＳＯ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ３）、及びＭｅｓ（Ｏ－ＳＯ２－ＣＨ３）から選択され、
Ｚは、ＣＨ２、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２、又はＯ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２であり、
Ｅ中の各破線は、ＥがＬに結合される部位を表す。
【0039】
好ましくは、Ｌは、
であり、Ｕは、ＣＨ２であり、好ましくはｎは、２又は３であり、及び／又は
Ｅは、
であり、好ましくはＸは、ＮＨであり、且つＹは、Ｆ、Ｃｌ、又はＢｒ、好ましくはＣｌである。
【化16】
Ｅは、
【化17】
【0040】
理論により拘束されることを望むものではないが、非親水性コア（すなわちＱ）を有する３価架橋剤は、タンパク質の架橋に、より適すると考えられる。トリス求電子剤を利用する公知のペプチドステープリング技術では、芳香族コアを有する架橋剤が一般に使用される。こうした場合には、コア構造は、疎水性コアとして機能し、それに近接して非極性アミノ酸側鎖をアライメントする。しかしながら、好ましい本方法では、非芳香族架橋剤がタンパク質の表面上に位置するであろう。好ましくは、Ｑは、
である。
【化18】
【0041】
本開示は、式ＩＩ：
を有する架橋剤をさらに提供する。
式中、
Ｑは、
であり、
Ｑ中の各破線は、ＱがＬに結合される部位を表し、各Ｌは、
からなる群から独立して選択されるリンカーであり、
各Ｕは、ＣＨ２及びＣＦ２から独立して選択され、
Ｖは、ＣＨ２であり、
Ｗは、ＣＦ２であり、
Ｘは、ＮＲ、ＮＨ、又はＯであり、
ここで、Ｒは、フルオロフォア又はアフィニティーハンドルであり、ｎは、２～８の範囲の整数であり、ｍは、１～４の範囲の整数であり、
ｏは、２又は３であり、且つ
ｖは、２又は３であり、
Ｌ中の各破線は、ＬがＱ又はＥに結合される部位を表し、各Ｅは、
からなる群から独立して選択される求電子剤であり、
各Ｘは、ＮＨ及びＯから独立して選択され、
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｔｏｓ（Ｏ－ＳＯ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ３）、及びＭｅｓ（Ｏ－ＳＯ２－ＣＨ３）から選択され、
Ｚは、ＣＨ２、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２、又はＯ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２であり、
Ｅ中の各破線は、ＥがＬに結合される部位を表す。
【化19】
式中、
Ｑは、
【化20】
Ｑ中の各破線は、ＱがＬに結合される部位を表し、各Ｌは、
【化21】
各Ｕは、ＣＨ２及びＣＦ２から独立して選択され、
Ｖは、ＣＨ２であり、
Ｗは、ＣＦ２であり、
Ｘは、ＮＲ、ＮＨ、又はＯであり、
ここで、Ｒは、フルオロフォア又はアフィニティーハンドルであり、ｎは、２～８の範囲の整数であり、ｍは、１～４の範囲の整数であり、
ｏは、２又は３であり、且つ
ｖは、２又は３であり、
Ｌ中の各破線は、ＬがＱ又はＥに結合される部位を表し、各Ｅは、
【化22】
各Ｘは、ＮＨ及びＯから独立して選択され、
Ｙは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｔｏｓ（Ｏ－ＳＯ２－Ｃ６Ｈ４－ＣＨ３）、及びＭｅｓ（Ｏ－ＳＯ２－ＣＨ３）から選択され、
Ｚは、ＣＨ２、ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２、又はＯ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２であり、
Ｅ中の各破線は、ＥがＬに結合される部位を表す。
【0042】
好ましくは、Ｌは、
であり、Ｕは、ＣＨ２であり、好ましくはｎは、２又は３であり、及び／又は
Ｅは、
であり、好ましくはＸは、ＮＨであり、且つＹは、Ｆ、Ｃｌ、又はＢｒ、好ましくはＣｌである。
【化23】
Ｅは、
【化24】
【0043】
好ましい実施形態では、架橋剤は、式ＩＩＩ：
である。式中、ｎは１であるか又はｎは２である。実施例で実証されるように、かかる架橋剤は、溶解用有機溶媒を必要としない。
【化25】
【0044】
上記の架橋剤は、チオール基との反応にとくに有用である。したがって、それらはシステイン残基を架橋するために使用可能であるとともに、たとえば本明細書に記載の方法で３価チオール反応性架橋剤として使用可能である。
【0045】
本開示は、本明細書に開示される方法により得られる安定化タンパク質をさらに提供する。一実施形態では、本開示は、（たとえば少なくとも７０アミノ酸を含み且つ少なくとも３システイン残基を含む本明細書に開示される）タンパク質を提供する。３システイン残基の各々は、３価チオール反応性架橋剤に共有結合される。好ましくは、タンパク質は、（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）の式を有する架橋剤により架橋される。模範的実施形態では、タンパク質は、ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）ポリペプチドである。好ましくは、ＳｒｔＡは、式（ＩＩＩ）で架橋される。
【0046】
ＳｒｔＡは、原核生物酵素のソルターゼファミリーに属するトランスペプチダーゼである。それは、タンパク質の特異的標識化を可能にする重要なバイオ分子ツールである［１６～１８］。しかしながら、より高い温度又は変性剤が必要とされるとき、標識化効率は劇的に低下し、この酵素の適用性を制限する。実施例に記載されるように、本開示は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＳｒｔＡのアミノ酸位置番号付けを基準にして位置１１１、１４９、及び１７７にシステインを有するＳｒｔＡポリペプチドの生成を記述する。この修飾タンパク質を３価チオール反応性架橋剤で架橋すると、融解温度が１１．２℃上昇するとともにグアニジニウムヒドロクロライドに対する耐性が増加することから、安定性の増加が示唆される。好ましい実施形態では、ＳｒｔＡポリペプチドは、アミノ酸配列：
GSHMQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDVKPTDVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEV（配列番号１）
を有する。
GSHMQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDVKPTDVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEV（配列番号１）
を有する。
【0047】
実施例に記載されるように、本明細書に開示される架橋ＳｒｔＡは、野生型（非架橋）ＳｒｔＡが十分な活性を提供しない条件下でタンパク質標識実験に使用可能である。本開示は、好ましくはグアニジニウムヒドロクロライドなどの化学変性剤の存在下でタンパク質／細胞を標識するための本明細書に開示される架橋ＳｒｔＡの使用をさらに提供する。
【0048】
模範的実施形態では、タンパク質はＫＩＸドメインポリペプチドである。好ましくは、ＫＩＸドメインは、式（ＩＩＩ）又は式（ＩＶ）で架橋される。本開示は、３価チオール反応性架橋剤に共有結合される３システイン残基を含むＫＩＸドメインポリペプチドを提供する。
【0049】
本明細書で用いられる場合、「to comprise（～を含む）」とは、その非限定的な意味で用いられ、その単語に続くアイテムを含むが特定的に挙げられていないアイテムを除外するものではないことを意味する。そのほか、動詞の「to consist（～からなる）」は、「to consist essentially of（～から本質的になる）」で置き換えうる。つまり、本明細書に定義される化合物又は補助化合物は、本発明のユニークな特徴を変化させない追加の成分であれば特定的に明記された以外の追加の成分を含みうる。
【0050】
冠詞の「a（１つの）」及び「an（１つの）」は、本明細書では、冠詞の文法上の目的語の１つ以上（すなわち少なくとも１つ）を意味するものとして用いられる。例として、「an element（エレメント）」は、１つのエレメント又は１超のエレメントを意味する。
【0051】
数値との関連で用いられるときの「approximately（約）」又は「about（約）」という語（approximately 10（約１０）、about 10（約１０））は、好ましくは、１０という所与の値がそれよりも１％大きい又は小さい値でありうることを意味する。
【0052】
以下の実施例で本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、単に本発明を明確化する役割を果たすにすぎない。
【実施例】
【0053】
実施例
実施例１
ここで、我々は、完全にタンパク質原性アミノ酸で構成されたタンパク質の翻訳後修飾を介する酵素の安定化のための構造ベースストラテジーを報告する。アクセス可能システイン残基対を提示する酵素変異体セットをステープルするためにビス求電子剤のライブラリーを使用した（図１ａ）。得られる単環状タンパク質の安定化挙動に基づいて、熱変性及び化学変性に対する大幅に増加した耐性を示す二環状酵素を設計した。
実施例１
ここで、我々は、完全にタンパク質原性アミノ酸で構成されたタンパク質の翻訳後修飾を介する酵素の安定化のための構造ベースストラテジーを報告する。アクセス可能システイン残基対を提示する酵素変異体セットをステープルするためにビス求電子剤のライブラリーを使用した（図１ａ）。得られる単環状タンパク質の安定化挙動に基づいて、熱変性及び化学変性に対する大幅に増加した耐性を示す二環状酵素を設計した。
【0054】
我々は、我々の安定化努力目標として黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ、ａａ６０～２０６）を選択した。ＳｒｔＡを安定化させるために、我々は、ペプチドを拘束するために以前に適用された［１９～２３］且つシステイン残基対を標的とするビス求電子剤の使用を含む架橋ストラテジーを考慮した。ＳｒｔＡは、その活性にきわめて重要な活性部位に位置する単一システインを含有する。最初に、我々は、活性部位システインと反応しない官能基を探求するために溶媒露出システインの共有結合修飾に以前に使用した４つの求電子剤（１～４、図１ｂ）を試験した。２－クロロアセトアミド（３）及びアクリルアミド（４）ではなく２つの最も反応性の求電子剤マレイミド（１）及び２－ブロモアセトアミド（２）と共にインキュベートしたとき、調製スケールのタンパク質修飾に好適な条件は、このきわめて重要なシステインの実質的な修飾をもたらした。チオールはアクリルアミドへの可逆的付加を示す傾向があるので、我々は、求電子剤として２－クロロアセトアミドを選択し、広範にわたる距離（２１Åまで、図５）を生じる８～１７ブリッジング原子を有するビス求電子リンカーセット（ｂ１～ｂ６、図２ａ）を設計した。
【0055】
次いで、３次構造全体の安定化を目指して、システイン対をＳｒｔＡに導入するのに好適な位置を選択した。我々は、（ｉ）基質認識に関与しない表面残基を考慮し、（ｉｉ）２つの異なる二次構造エレメントに位置するとともに（ｉｉｉ）依然として空間近接（ＮＭＲ構造ＰＤＢ：１ｉｊａに基づいて距離＜２０Å）する対を選択した。これらの基準に基づいて、６つのＳｒｔＡ変異体（Ｓ１～Ｓ６、図２ｂ、図６）を設計し、Ｅ．コリ（E. coli）で異種発現させ、そして精製した。続いて、すべてのビス求電子剤とのステープリング反応を実施し、各種変換度を示した。ＭＳ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥにより環化物の形成を確認した。我々は、Ｓ１、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ６では、すべての架橋で高変換率を観測したが、Ｓ５では、最短架橋（ｂ１）で低効率を示した。Ｓ２では、すべての架橋剤で低収率が観測された。反応後、タンパク質サンプルを透析し、未反応ビス求電子剤を除去した。
【0056】
最初に、トリプトファン蛍光の変化を介して、（透析後に得られた）すべての非修飾変異体及び架橋変異体の融解温度（Ｔｍ）を決定した（図２ｃ）。ＳｒｔＡ（Ｔｍ＝５９．４℃）と比較して、Ｓ３以外のすべての非架橋変異体は、より低い熱安定性を示す（ΔＴｍ＝＋２．９℃）。酵素架橋は、環状Ｓ３形態の強い安定化をもたらしたが（ΔＴｍ≧＋１０．１℃）、残りの変異体ではより中程度の効果が観測された。変異体での最安定形態は、Ｓ１ｂ１（ΔＴｍ＝＋２．８℃）、Ｓ２ｂ２（ΔＴｍ＝＋０．４℃）、Ｓ４ｂ３（ΔＴｍ＝＋４．４℃）、Ｓ５ｂ５（ΔＴｍ＝＋３．４℃）、及びＳ６ｂ１（ΔＴｍ＝＋３．９℃）である。
【0057】
ＳｒｔＡは、ショートペプチド配列（ＬＰＥＴＧ、図２ｄ）を認識し、それを切断し、そのＮ末端断片とアシル中間体を形成するトランスペプチダーゼである。次いで、中間体は、好ましくは、オリゴグリシンのＮ末端により攻撃され、新たなペプチド結合を形成する（図２ｄ）。好適な求核剤の不在下で、水はアシル中間体を攻撃し、加水分解するであろう（図２ｄ）。トランスペプチダーゼ活性を調べるために、フルオロフォア／クエンチャー対がＳｒｔＡ処理により分離される以前に報告されたプローブ系を適用した（図７）。活性スクリーニングでは、我々は、野生型ＳｒｔＡが強い能力低下（４％の残存活性、図７）を示す６５℃での加水分解反応を選択した［２４、２５］。ＳｒｔＡ（ｖｒ＝１、図２ｅ）と比べて、いくつかの架橋酵素は増加した活性を示す。驚くべきことに、Ｓ３の熱安定性環状形態は、低減された酵素活性を提供する（図２ｅ）。これとは対照的に、Ｓ４及びＳ５の架橋形態は、ロバストな活性増強を示す（＞２倍、薄赤色及び暗赤色、図２ｅ）。全体的に最も高い活性増大は、ＳｒｔＡの３．４倍の活性のＳ４－ｂ３で観測される。まとめると、６５℃で観測される活性の改善は中程度であることから、３次構造の十分な安定化を付与するにはモノ環化では十分でない可能性があることが示唆される。
【0058】
タンパク質３次構造のより強い安定化を達成するために、我々は酵素のビ環化を目指した。注目すべきこととして、２つの最良性能ＳｒｔＡ変異体Ｓ４及びＳ５（薄青色及び暗青色、図２ｂ）は、１つの変異部位（ａａ１４９）を共有する。それらのシステイン置換の同時導入（ａａ１１１、１４９、及び１７７）は、トリス求電子剤との反応により二環状タンパク質を形成可能な変異体Ｓ７（図３ａ）を生成する。二環状ペプチド［２６～２８］及びミニタンパク質［２９］の以前に報告された合成からの類推により、我々は我々の架橋剤でＣ３対称コアを選択し、我々はそれを３つの２－クロロアセトアミド基で修飾した（ｔ１、図３ｂ）。１３ブリッジング原子を提供するようにトリス求電子剤ｔ１を設計し、それによりＳ４（ｂ３／ｂ４：１０／１１原子）及びＳ５（ｂ５／ｂ６：１４／１７原子）に好ましい架橋範囲内にした。Ｓ７とｔ１との架橋反応は効率的に進行し、ステープル酵素Ｓ７－ｔ１を提供する（図３ｂ）。分析ＨＰＬＣ／ＭＳ解析は、Ｓ７の定量的変換率を示し、予想分子量を有する生成物の形成を明確に示す。高分解能ＭＳ解析は、適正修飾部位（システイン１１１、１４９、及び１７７）を確認するとともに、ステープリング後の活性部位システインの非修飾状態も検証する（図８）。Ｓ７－ｔ１の熱安定性を調べて、我々は大幅に増加した融解温度（Ｔｍ＝７０．６℃、図３ｃ）を観測した。これはＳｒｔＡの値（Ｔｍ＝５９．４℃）よりも１１．２℃高く、最活性単環状タンパク質Ｓ４－ｂ３の値（Ｔｍ＝６３．８℃）よりも６．８℃高い。次いで、我々は、単環状形態に対して記載したように６５℃でＳ７－ｔ１の酵素活性を決定した（図３ｄ）。その優れた熱安定性に呼応して、我々は、ＳｒｔＡ（８．７倍）及び最活性単環状酵素Ｓ４－ｂ３（２．６倍、図３ｄ）と比較したときに６５℃で強く増加した酵素活性を観測する。
【0059】
これまで、我々は、求核剤として水を用いて加水分解条件下で酵素活性を調べた（加水分解、図２ｄ）。タンパク質標識化へのＳ７－ｔ１の適用を想定して、次いで、我々は、上記の蛍光プローブを用いて、ただし、今度は求核剤トリグリシンの存在下で、６５℃でそのペプチド転移性能を調べた（転移、図２ｄ）。リードアウトとしてＨＰＬＣ／ＭＳを用いて（図４ａ）、我々は、再度、いずれの酵素も用いない処理（ライトグレー）に類似したＳｒｔＡによるごく弱い基質変換のみ（ダークグレー）を観測した。Ｓ７－ｔ１の存在下では（レッド、図４ａ）、出発材料のシグナル（●）は大幅に減少し、２つの新たなピークが現れた。ＭＳに基づいて、一方のピークはＣ末端断片（▲）、他方のピークはトリグリシンにライゲートされたと思われるＮ末端断片（■）に帰属された。重要なこととして、加水分解物（Ｄａｂｃｙｌ－ＱＡＬＰＥＴ）のシグナルは検出されなかったことから、Ｓ７－ｔ１の適正機能が検証される。昇温下でのタンパク質アンフォールディングが可逆的であるかを評価するために、我々は、加熱の前及び後で３７℃でＳｒｔＡ及びＳ７－ｔ１の酵素活性を比較した（８５℃図１１）。注目すべきこととして、両方の酵素のトランスペプチダーゼ活性は、加熱／冷却サイクルの影響を受けないことから、可逆的アンフォールディングが示唆される。
【0060】
次の実験セットでは、我々は、再度蛍光リードアウトを用いてペプチド転移反応の熱活性プロファイルを決定した（図４ｂ）。３７℃～５５℃では、ＳｒｔＡ（グレー）及びＳ７－ｔ１（レッド）の酵素活性は、類似したごく弱い温度依存性を呈するにすぎない。５５℃超では、両方の酵素が活性の損失を生じ、ＳｒｔＡでは非常に激しく、６５℃ではほぼ完全な不活性化をもたらす（図４ｂ）。Ｓ７－ｔ１では、活性低減はかなり小さく、３７℃と比べて６３％（６５℃で）及び２７％（７０℃で）の残存活性を有する。ＳｒｔＡと比較して、Ｓ７－ｔ１は、熱ストレスに対して約１０℃増加した耐性を示し、これはその＋１１．２℃高い融解温度と良く相関する。増強された熱安定性は、多くの場合、グアニジニウムヒドロクロライド（ＧｄｎＨＣｌ）などの変性剤に対する耐性と相俟って生じる。そうした理由から、トランスペプチダーゼ活性に及ぼすＧｄｎＨＣｌの影響を調べたところ、０．５Ｍまでの変性剤濃度に対してＳｒｔＡ及びＳ７ｔ１の依存性は低いことが明らかになった（図４ｃ）。０．７５～１．５Ｍでは、Ｓ７－ｔ１はＳｒｔＡよりも有意に活性である。１Ｍ ＧｄｎＨＣｌでは最も顕著となり、ＳｒｔＡは、いずれの検出可能酵素活性も示さないが（ｖｒ＜１％、図４ｃ）、Ｓ７－ｔ１は、依然として４０％の残存活性（ＧｄｎＨＣｌ不在と比較して）を提供する。より高いＧｄｎＨＣｌ濃度（≧２Ｍ）では、両方の酵素がその酵素活性を失う。
【0061】
これまで、我々は、ショート試験ペプチドの標識化にＳ７－ｔ１を適用した。次いで、我々は、とくに野生型ＳｒｔＡが十分な活性を提供しない条件下でもＳ７－ｔ１がタンパク質標識化に有用であるかに関心を払った。その目的のために、我々は、対象タンパク質としてα－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）を選択した。α－Ｓｙｎは１４０アミノ酸を含み、パーキンソン病をはじめとする各種神経変性疾患の発症に関連する病原性フィブリルを形成可能である［３０］。αＳｙｎフィブリルは、ＧｄｎＨＣｌを用いて可溶化可能である［３１］。我々は、標識化を可能にするためにＣ末端ＳｒｔＡ認識モチーフを有するαＳｙｎ形態を設計した。発現及び精製の後、可溶性α－Ｓｙｎ（Ａ）をフィブリル形成及び超遠心分離に付した［３１］。不溶性フィブリルを洗浄し、ＧｄｎＨＣｌ（１Ｍ）欠如（Ｂ）又は含有（Ｃ）のどちらかの緩衝液で処理した［３１］。得られた可溶性画分（Ｂ及びＣ）とα－Ｓｙｎの精製可溶性形態（Ａ、図４ｄ）とを比較したとき、我々は、ＧｄｎＨＣｌの不在下（Ｂ）ではなく存在下（Ｃ）でのみ再可溶化を明確に観測した。タンパク質標識化を調べるために、これらの可溶性サンプル（Ａ、Ｂ、Ｃ）をＳｒｔＡ又はＳ７－ｔ１のどちらか及び蛍光基質と共にインキュベートした（図９）。次いで、我々は、リードアウト用の蛍光イメージャーを利用してＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して解析を実施した。フィブリル形成前したがってＧｄｎＨＣｌ不在下の可溶性α－Ｓｙｎ（Ａ）では、ＳｒｔＡ及びＳ７－ｔ１は強力なバンドをもたらすことから、効率的タンパク質標識化が示唆される（図４ｅ）。予想通り、ＧｄｎＨＣｌ欠如したがって同様に可溶性α－Ｓｙｎ欠如の再可溶化条件下（Ｂ）では、我々はいずれの蛍光シグナルも観測しなかった（Ｂ、図４ｅ）。それとは対照的に、ＧｄｎＨＣｌ（１Ｍ）を用いた再可溶化では、α－Ｓｙｎ標識化は、野生型ＳｒｔＡ（Ｃ）ではなくＳ７－ｔ１でのみ発生する。注目すべきこととして、Ｓ７－ｔ１の蛍光バンド強度の差（Ａ対Ｃ、図４ｅ）は、可溶性画分のα－Ｓｙｎの量（Ａ対Ｃ、図４ｄ）と良く相関することから、ＧｄｎＨＣｌの存在下でのＳ７ｔ１の良好な標識化効率が示唆される。
【0062】
ビ環化を介するタンパク質安定化のより広範な適用性を評価するために、我々は、第２の標的としてヒトＣＲＥＢ結合タンパク質由来のＫＩＸドメインを選択した（図５ａ）。ＫＩＸは、中心の３つのαヘリックスバンドル（α１、α２、α３）で構成される複数のタンパク質結合パートナーを有するアダプタードメインである。このバンドルとＣ末端３１０ヘリックス（Ｇ１）との間の接合は、構造完全性にきわめて重要である（図１２ａ）［３４］。そのため、我々は、システイン取込みに好適な３つの位置の３次構造安定化検索のためにこの領域に焦点を当てた。ＳｒｔＡ安定化時の我々の経験に基づいて、次のガイドラインを適用した。すなわち、（ｉ）溶媒アクセス可能残基を考慮した。それは（ｉｉ）３つの識別可能な２次構造に位置するとともに、（ｉｉｉ）タンパク質の同一側を向き、且つ（ｉｖ）辺の長さが６～１７Å（Ｃα－Ｃα距離）の三角形にまたがる。これらの基準に基づいて、我々は、システイン置換用としてＨ５９４、Ｌ５９９、及びＲ６４６を選択し、ＫＩＸ変異体Ｋ１を得た（図１２ａ、図１２）。
【0063】
架橋のために、我々はトリス求電子剤ｔ１（ｎ＝２、図３ｂ）及びより短い形態ｔ２（ｎ＝１）を選択した。なぜなら、Ｋ１中の３つの変異部位間の距離（７．８、１０．０、及び１１．５Å、図１２）がＳ７中（８．５、１２．４、及び１５．７Å、図１３ｄ）よりも短いことに、我々は気付いたからである。両方のトリス求電子剤の架橋は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＭＳ解析により確認されるように効率的に進行する（データは示されていない）。架橋が３次構造に影響を及ぼすかを評価するために、我々は、ＫＩＸ並びに両方の二環状変異体（Ｋ１－ｔ１及びＫ１－ｔ２）のその結合パートナーＭＬＬへの親和性を比較した。蛍光偏光アッセイを用いて、我々は、ＫＩＸ、Ｋ１－ｔ１、及びＫ１－ｔ２への類似した結合親和性を観測した（それぞれ、Ｋｄ＝０．６、０．９、及び０．９μＭ、図１４）。次いで、我々は、３つのタンパク質の見掛けの融解温度を測定し（図１２ｂ）、ＫＩＸと比較したときにＫ１－ｔ１及びＫ１－ｔ２で強く増加した熱安定性（それぞれΔＴｍ＝＋２０．６℃及び＋２４．６℃）を見いだした。注目すべきこととして、両方のトリス求電子剤は、類似した安定化効果を有し、より短い架橋ｔ２が最良の性能を発揮した。また、これらの結果に基づいて、我々は、ＳｔｒＡ変異体Ｓ７に対するトリス求電子剤ｔ２の効果を評価することに関心を払った。架橋反応は効率的に進行し、二環状酵素Ｓ７－ｔ２をもたらす（図１５）。注目すべきこととして、我々は、Ｓ７－ｔ２（ΔＴｍ＝＋１１．５℃、図１５）でＳ７－ｔ１（ΔＴｍ＝＋１１．２℃）と類似した熱安定化を観測することから、架橋の長さのマイナーな変動に対する耐性が示唆される。
【0064】
まとめると、我々は、全体がタンパク質原性アミノ酸で構成された天然タンパク質へのモジュラー架橋の組込みを可能にする、酵素の安定化のための構造ベースアプローチを報告する。我々は、一連のモノ環化ＳｒｔＡ変異体を探究し、熱変性及び化学変性に対する大幅に増加した耐性を呈する二環状酵素Ｓ７ｔ１の設計をもたらした。重要なこととして、Ｓ７ｔ１は、１Ｍ ＧｄｎＨＣｌの存在下でのα－Ｓｙｎの標識化が効率的であることを実証した。この条件下では、野生型ＳｒｔＡは酵素活性を示さなかった。我々は、我々のＳｒｔＡ変異体でこの問題に遭遇しなかったとはいえ、追加の表面露出システイン残基が環化反応時に望ましくない副生物もたらす可能性があることに留意することが重要である。かかる場合には、これらのシステインを変更するか（たとえばセリンに）又は触媒活性が必要であれば架橋時に活性部位をブロックすることが必要であろう。ＳｒｔＡでの我々の知見から、我々は、タンパク質のビ環化及び安定化のガイドラインを導出し、それをＫＩＸドメインに適用した。３つのシステインＫＩＸ変異体を設計し、２つの異なるＣ３対称トリス求電子剤と反応させ、両方とも大幅に増加した熱安定性を有する２つの二環状ＫＩＸ形態を得た。全体的に見て、我々のアプローチは、全体がタンパク質原性アミノ酸で構成された組換えタンパク質の構造ベース安定化を促進する。タンパク質環化のための合成求電子剤の使用は、さまざまなチューナブル架橋構成の容易な利用手段を与える。追加の特徴として、我々は、アフィニティーハンドル（たとえば酵素精製／リサイクル用）［３２］や近接ベースソルターゼ媒介ライゲーション用リガンドなどの追加の官能基の導入を可能にする架橋剤の使用を想定する［３３］。まとめると、提示されたタンパク質安定化技術は、追加の官能基の同時取込みの機会を提供する新規な安定化酵素の迅速な利用手段を与える可能性を有する。
【0065】
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[29] B. Dang, H. Wu, V. K. Mulligan, M. Mravic, Y. Wu, T. Lemmin, A. Ford, D.-A. Silva, D. Baker, W. F. DeGrado, Proc. Natl. Acad. Sci. 2017, 201710695.
[30] M. R. Cookson, Mol. Neurodegener. 2009, 4, 9.
[31] R. Porcari, C. Proukakis, C. A. Waudby, B. Bolognesi, P. P. Mangione, J. F. S. Paton, S. Mullin, L. D. Cabrita, A. Penco, A. Relini, et al., J. Biol. Chem. 2015, 290, 2395-2404.
[32] C. B. Rosen, R. L. Kwant, J. I. MacDonald, M. Rao, M. B. Francis, Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 8585-8589.
[33] H. H. Wang, B. Altun, K. Nwe, A. Tsourkas, Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 5349-5352.
[34] R. N. De Guzman, N. K. Goto, H. J. Dyson, P. E. Wright, J. Mol. Biol. 2006, 355, 1005-1013.
【0066】
方法
１．１ ペプチド合成及び特徴付け
標準的Ｆｍｏｃベース固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）プロトコルに従ってＦｍｏｃ－Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄ ＭＢＨＡ樹脂（Iris Biotech GmbH）上でペプチド合成をマニュアルで実施した。樹脂の初期アミンローディングに対して計算された４ｅｑ．を用いて、すべてのＦｍｏｃ保護アミノ酸をカップリングした。カップリング条件は、第１のカップリング反応（２０分）では、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の、４ｅｑ．の（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ－モルホリノ－カルベニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）、４ｅｑ．のオキシマ、及び８ｅｑ．のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）であった。第２のカップリング（４５分）では、ＤＭＦ中の、４ｅｑ．のベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）及び８ｅｑ．のＤＩＰＥＡを使用した。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン溶液を用いて樹脂を１５分間処理して達成した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、ＤＭＦ中の３ｅｑ．のその異性体及び６ｅｑ．のＤＩＰＥＡを用いて２ｈにわたり２回カップリングした。処理後、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）溶液（２×２ｈ）でペプチドを樹脂から切断し、Ｅｔ２Ｏを用いて－２０℃で沈殿させた。Freezone4.5－１０５℃フリーズドライシステム（Labconco）で凍結乾燥後、ペプチドをＨ２Ｏ：アセトニトリル（１：１）に溶解し、Nucleodur C18逆相カラム（１０×１２５ｍｍ、１１０Å、粒子サイズ５μｍ、Macherey-Nagel、溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ、６ｍＬ ｍｉｎ－１の流量）を用いて逆相半分取ＨＰＬＣで精製した。得られた生成物を凍結乾燥した。
１．１ ペプチド合成及び特徴付け
標準的Ｆｍｏｃベース固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）プロトコルに従ってＦｍｏｃ－Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄ ＭＢＨＡ樹脂（Iris Biotech GmbH）上でペプチド合成をマニュアルで実施した。樹脂の初期アミンローディングに対して計算された４ｅｑ．を用いて、すべてのＦｍｏｃ保護アミノ酸をカップリングした。カップリング条件は、第１のカップリング反応（２０分）では、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の、４ｅｑ．の（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ－モルホリノ－カルベニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）、４ｅｑ．のオキシマ、及び８ｅｑ．のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）であった。第２のカップリング（４５分）では、ＤＭＦ中の、４ｅｑ．のベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）及び８ｅｑ．のＤＩＰＥＡを使用した。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン溶液を用いて樹脂を１５分間処理して達成した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、ＤＭＦ中の３ｅｑ．のその異性体及び６ｅｑ．のＤＩＰＥＡを用いて２ｈにわたり２回カップリングした。処理後、ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ：ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）溶液（２×２ｈ）でペプチドを樹脂から切断し、Ｅｔ２Ｏを用いて－２０℃で沈殿させた。Freezone4.5－１０５℃フリーズドライシステム（Labconco）で凍結乾燥後、ペプチドをＨ２Ｏ：アセトニトリル（１：１）に溶解し、Nucleodur C18逆相カラム（１０×１２５ｍｍ、１１０Å、粒子サイズ５μｍ、Macherey-Nagel、溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ、６ｍＬ ｍｉｎ－１の流量）を用いて逆相半分取ＨＰＬＣで精製した。得られた生成物を凍結乾燥した。
【0067】
ペプチドの同一性及び純度は、Zorbax Eclipse,XDB-C18逆相カラム（４．６×１５０ｍｍ、粒子サイズ５μｍ、Agilent、溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ、１ｍＬ ｍｉｎ－１の流量）を備えたＨＰＬＣ－ＭＳシステム（Agilent Technologies）で実施されたＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ解析により確認した。ＦＩＴＣ標識化ペプチドは、Ｖ－５５０ＵＶ／ＶＩＳ分光測光器（Jasco）を用いて測光定量した。ＧＧＧＫ－ＦＩＴＣペプチドに対して、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中で４９４ｎｍの吸光度を測定し、吸光係数ε（ＦＩＴＣ）４９４＝７７０００Ｍ－１ ｃｍ－１を用いて濃度を計算した。Ｄａｂｃｙｌ－ＱＡＬＰＥＴＧＥＫ－ＦＩＴＣペプチドに対して、４９４ｎｍのＤａｂｃｙｌ吸収を追加的に考慮した（ε（Ｄａｂｃｙｌ）４９４＝１４０００Ｍ－１ ｃｍ－１）。
【0068】
１．２ タンパク質の発現及び精製
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＳｒｔＡのａａ６０～２０６をコードする修飾pET28a(+)ベクターは、AG Musacchio (Max Planck Institute, Dortmund, Germany)により提供された。変異体Ｓ１～Ｓ７は、各々対応するＮ末端Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質をもたらす部位指向突然変異誘発（Quikchange（商標）、Stratagene）、制限及びライゲーション、又はｉｎ ｖｉｖｏクローニングを用いた配列修飾のいずれかにより得た（図６）。これらのコンストラクトをE. coli BL21 Gold (DE3) (Agilent Technologies)にトランスフォームした。トランスフォーマントを用いてLuria Broth (LB)（５０μｇ ｍＬ－１カナマイシン）一晩前培養物に接種した（３７℃でインキュベート）。この培養物を用いてTerrific Broth(TB)培養物（２Ｌ）に接種し、０．７のＯＤ６００に達するまで３７℃でインキュベートした。０．５ｍＭ ＩＰＴＧの添加によりタンパク質発現を誘発し、培養物を２５℃で一晩インキュベートした。遠心分離により細胞を採取し、ライシス緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール（ｖ／ｖ））に再懸濁し、マイクロフリュイダイザーで破壊した。遠心分離（７００００ｒｃｆ、４℃、４５ｍｉｎ）により細胞ライセートから細胞デブリを除去した。続く精製工程はすべて４℃で実施した。ＦＰＬＣアフィニティークロマトグラフィー（HisTrap（商標） Fast Flow Crude 5 mL,GE Healthcare）を介して上清からＳｒｔＡ及び変異体Ｓ１～Ｓ７を単離した。５ＣＶ洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール（ｖ／ｖ）、２０ｍＭイミダゾール）でカラムを洗浄した。トロンビン緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ）中４℃でトロンビン切断（５Ｕ ｍｇ－１）をカラム上で一晩実施し、標的タンパク質溶出液を得た。トロンビン酵素からＳｒｔＡ及び変異体を分離するために、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ中のAekta Pure, Column HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, GE Healthcare）。限外濾過（Amicon, Merck、１０ｋＤａカットオフ）を介して精製タンパク質を２５ｍｇ ｍＬ－１まで濃縮し、スナップ凍結し、－８０℃で貯蔵した。
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＳｒｔＡのａａ６０～２０６をコードする修飾pET28a(+)ベクターは、AG Musacchio (Max Planck Institute, Dortmund, Germany)により提供された。変異体Ｓ１～Ｓ７は、各々対応するＮ末端Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質をもたらす部位指向突然変異誘発（Quikchange（商標）、Stratagene）、制限及びライゲーション、又はｉｎ ｖｉｖｏクローニングを用いた配列修飾のいずれかにより得た（図６）。これらのコンストラクトをE. coli BL21 Gold (DE3) (Agilent Technologies)にトランスフォームした。トランスフォーマントを用いてLuria Broth (LB)（５０μｇ ｍＬ－１カナマイシン）一晩前培養物に接種した（３７℃でインキュベート）。この培養物を用いてTerrific Broth(TB)培養物（２Ｌ）に接種し、０．７のＯＤ６００に達するまで３７℃でインキュベートした。０．５ｍＭ ＩＰＴＧの添加によりタンパク質発現を誘発し、培養物を２５℃で一晩インキュベートした。遠心分離により細胞を採取し、ライシス緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール（ｖ／ｖ））に再懸濁し、マイクロフリュイダイザーで破壊した。遠心分離（７００００ｒｃｆ、４℃、４５ｍｉｎ）により細胞ライセートから細胞デブリを除去した。続く精製工程はすべて４℃で実施した。ＦＰＬＣアフィニティークロマトグラフィー（HisTrap（商標） Fast Flow Crude 5 mL,GE Healthcare）を介して上清からＳｒｔＡ及び変異体Ｓ１～Ｓ７を単離した。５ＣＶ洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール（ｖ／ｖ）、２０ｍＭイミダゾール）でカラムを洗浄した。トロンビン緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ）中４℃でトロンビン切断（５Ｕ ｍｇ－１）をカラム上で一晩実施し、標的タンパク質溶出液を得た。トロンビン酵素からＳｒｔＡ及び変異体を分離するために、サイズ排除クロマトグラフィーを実施した（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ中のAekta Pure, Column HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, GE Healthcare）。限外濾過（Amicon, Merck、１０ｋＤａカットオフ）を介して精製タンパク質を２５ｍｇ ｍＬ－１まで濃縮し、スナップ凍結し、－８０℃で貯蔵した。
【0069】
Ｃ末端フレキシブルリンカー、ＳｒｔＡ認識部位、さらにはアフィニティー精製用Ｈｉｓ６タグを含有するα－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）コンストラクトのコード配列（図９）を遺伝子合成品（Integrated DNA Technologies）として購入し、制限（ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ）並びにライゲーションを介してpET28a(+)ベクターにサブクローニングした。タンパク質発現のために、ベクターをE. coli BL21 Gold (DE3)にトランスフォームした。トランスフォーマントを用いて一晩ＬＢ前培養物に接種した（５０μｇ ｍＬ－１カナマイシン、３７℃）。この培養物を用いてカナマイシン（５０μｇ ｍＬ－１）含有ＬＢ培養物（２Ｌ）に接種し、０．７のＯＤ６００に達するまで３７℃でインキュベートした。タンパク質発現は、０．５ｍＭ ＩＰＴＧの添加により誘発して３７℃で４ｈ実施した。遠心分離により細胞を採取し、ライシス緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、超音波処理（１ｓオン２ｓオフ、４０％出力、０℃で４×３０ｓサイクル）により破壊した。遠心分離（７００００ｒｃｆ、１ｈ）により細胞ライセートから細胞デブリを除去した。フォローアップ精製工程はすべて４℃で実施した。アフィニティークロマトグラフィー（Aekta Pure, HisTrap（商標） Fast Flow Crude 5 mL, GE Healthcare）を介してα－Ｓｙｎを上清から単離した。５ｍＭイミダゾールを含有するライシス緩衝液を用いて洗浄を実施した。イミダゾールグラジエント（５ｍＭ～５００ｍＭ）でカラムからαＳｙｎを溶出させた。タンパク質含有画分をプールし、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析した（Slide A Lyzer Dialysis Cassette, Thermo、３．５ｋＤａカットオフ）。得られた純粋α－Ｓｙｎを限外濾過（Amicon, Merck、３ｋＤａカットオフ）を介して５ｍｇ ｍＬ－１まで濃縮し、フィブリル形成に付した。
【0070】
Gateway attB1及びattB2（Thermo）アタッチメントとPreScissionプロテアーゼ認識部位とを含有するＫＩＸ及びＫ１コンストラクトのコード配列（図１３）は、合成品であり、Integrated DNA Technologiesから購入した。その後、コード領域をpDONR201ベクター（BP Clonase酵素ミックス、Thermo）に導入した。続いて、LR Clonase酵素ミックス（Thermo）を利用してコード領域をpGEX-4t-3 Gateway適合目標ベクターに導入した。得られた発現ベクターをE. coli BL21 Gold (DE3)にトランスフォームした。トランスフォーマントを用いて一晩ＬＢ前培養物（１００μｇ ｍＬ－１アンピシリン、３７℃）に接種し、続いてこの培養物を用いてアンピシリン（１００μｇ ｍＬ－１）含有ＴＢ培養物（２Ｌ）に接種し、１のＯＤ６００に達するまで３７℃でインキュベートした。タンパク質発現は、０．５ｍＭ ＩＰＴＧの添加により誘発して２０℃で一晩実施した。遠心分離により細胞を採取し、ライシス緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＰＭＳＦ、及び２ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁と、マイクロフリュイダイザーを用いて破壊した。遠心分離（７００００ｒｃｆ、４℃、６０ｍｉｎ）により細胞ライセートから細胞デブリを除去した。続く精製工程はすべて４℃で実施した。アフィニティークロマトグラフィー（Aekta Pure, GSTPrep（商標） FF 16/10, GE Healthcare）を介してＫＩＸ及びＫ１を上清から単離した。ベースライン（ＯＤ２８０）に達するまで、洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄を実施した。洗浄緩衝液中４℃でPreScission切断をカラム上で一晩実施した。得られた標的タンパク質を、限外濾過を介して約６ｍｇ ｍＬ－１まで濃縮した（Amicon, Merck、３ｋＤａカットオフ、ｒ．ｔ．）。続いてサイズ排除クロマトグラフィーを実施した（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＴＣＥＰ中のAekta Pure, Column HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, GE Healthcare）。精製タンパク質を６ｍｇ ｍＬ－１まで濃縮し（Amicon、Merck、３ｋＤａカットオフ、ｒ．ｔ．）、スナップ凍結し、－８０℃で貯蔵した。
【0071】
生成されたベクターコンストラクトはすべて、サンガーシーケンシングにより配列確認された。タンパク質はすべて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを介してその品質を確認した。
【0072】
１．３ α－Ｓｙｎフィブリルの形成及び再可溶化
フィブリル形成のために、４ｍＬの精製可溶性α－Ｓｙｎ（５ｍｇ ｍＬ－１）を３７℃、１２５０ｒｐｍで４日間撹拌した。得られた懸濁液を６００μＬアリコートで超遠心分離した（１３５０００ｒｃｆ、４℃、４５ｍｉｎ）。Nanodrop（ＯＤ２８０）を介して上清のタンパク質含有率を定量し、フィブリル形成の効率をモニターした。上清の除去後、ＳｒｔＡ緩衝液（４×５００μＬ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ）でペレットを十分に洗浄した。再可溶化のために、穏やかに振盪しながらＧｄｎＨＣｌあり（１Ｍ）又はなしのどちらかでＳｒｔＡ緩衝液中室温でフィブリルサンプルを３ｈ処理した。上清を続く標識化に使用した。
フィブリル形成のために、４ｍＬの精製可溶性α－Ｓｙｎ（５ｍｇ ｍＬ－１）を３７℃、１２５０ｒｐｍで４日間撹拌した。得られた懸濁液を６００μＬアリコートで超遠心分離した（１３５０００ｒｃｆ、４℃、４５ｍｉｎ）。Nanodrop（ＯＤ２８０）を介して上清のタンパク質含有率を定量し、フィブリル形成の効率をモニターした。上清の除去後、ＳｒｔＡ緩衝液（４×５００μＬ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ）でペレットを十分に洗浄した。再可溶化のために、穏やかに振盪しながらＧｄｎＨＣｌあり（１Ｍ）又はなしのどちらかでＳｒｔＡ緩衝液中室温でフィブリルサンプルを３ｈ処理した。上清を続く標識化に使用した。
【0073】
１．４ α－Ｓｙｎ標識化反応
再可溶化α－Ｓｙｎ画分をＳｒｔＡ緩衝液（＋／－１Ｍ ＧｄｎＨＣｌ）で１：６希釈して初期ＧｎｄＨＣｌ濃度を維持し、２ｍＭ ＧＧＧＫ－ＦＩＴＣと１００μＭ ＳｒｔＡ又はＳ７－ｔ１のどちらかとで補足した。標識用サンプルを３５０ｒｐｍ及び３７℃で１６ｈインキュベートした。Gel Doc XRシステム（BioRad）で蛍光に関してＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上でサンプルを解析した。次いで、ゲルをクーマシーに染色した（図１０）。
再可溶化α－Ｓｙｎ画分をＳｒｔＡ緩衝液（＋／－１Ｍ ＧｄｎＨＣｌ）で１：６希釈して初期ＧｎｄＨＣｌ濃度を維持し、２ｍＭ ＧＧＧＫ－ＦＩＴＣと１００μＭ ＳｒｔＡ又はＳ７－ｔ１のどちらかとで補足した。標識用サンプルを３５０ｒｐｍ及び３７℃で１６ｈインキュベートした。Gel Doc XRシステム（BioRad）で蛍光に関してＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上でサンプルを解析した。次いで、ゲルをクーマシーに染色した（図１０）。
【0074】
１．５ ビス及びトリス求電子架橋剤の合成及び特徴付け
０℃のＨ２Ｏ／ＤＣＭ（２：３、１８ｍＬ）中のＫ２ＣＯ３（３３ｍｍｏｌ、３．３ｅｑ．）の溶液に、対応するジアミン（１０ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を添加した。得られた混合物を冷却し、その後、クロロアセチルクロライド（２２ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ．）を０℃で１ｈにわたり滴下した。添加終了後、氷浴を除去し、混合物を室温で一晩撹拌した。所望の生成物をＤＣＭで３回抽出した。続いて、有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。生成物の同一性は、ＮＭＲにより確認した。トリス求電子架橋剤ｔ１に対して、当量を調整して同一プロトコルを使用した。いずれの架橋反応でも、新たに調製された架橋剤を使用しなければならない。
０℃のＨ２Ｏ／ＤＣＭ（２：３、１８ｍＬ）中のＫ２ＣＯ３（３３ｍｍｏｌ、３．３ｅｑ．）の溶液に、対応するジアミン（１０ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を添加した。得られた混合物を冷却し、その後、クロロアセチルクロライド（２２ｍｍｏｌ、２．２ｅｑ．）を０℃で１ｈにわたり滴下した。添加終了後、氷浴を除去し、混合物を室温で一晩撹拌した。所望の生成物をＤＣＭで３回抽出した。続いて、有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。生成物の同一性は、ＮＭＲにより確認した。トリス求電子架橋剤ｔ１に対して、当量を調整して同一プロトコルを使用した。いずれの架橋反応でも、新たに調製された架橋剤を使用しなければならない。
【0075】
Ｎ，Ｎ’－ビス（クロロアセチル）－１，２－エチレンジアミン（ｂ１）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.27 (bs, CONH, 2H), 4.04 (s, CH2, 4H), 3.17 (m, CH2, 4H).
Ｎ，Ｎ’－ビス（クロロアセチル）－１，３－プロピレンジアミン（ｂ２）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.20 (m, CONH, 2H), 4.04 (s, CH2, 4H), 3.10 (td, J = 6.9, 5.7 Hz, CH2, 4H), 1.57 (p, J = 6.9 Hz, CH2, 2H).
Ｎ，Ｎ’－ビス（クロロアセチル）－１，４－ブタンジアミン（ｂ３）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.19 (m, CONH, 2H), 4.02 (s, CH2, 4H), 3.08 (m, CH2, 4H), 1.41 (m, CH2, 4H).
Ｎ，Ｎ’－（オキシビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（２－クロロアセタミド）（ｂ４）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.92 (bs, CONH, 2H), 4.07 (s, CH2, 4H), 3.59 (m, CH2, 4H), 3.53 (m, CH2, 4H).
Ｎ，Ｎ’－（（エタン－１，２－ジイルビス（オキシ））ビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（２－クロロアセタミド）（ｂ５）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.23 (m, CONH, 2H), 4.06 (s, CH2, 4H), 3.52 (m, CH2, 4H), 3.44 (t, J = 5.8 Hz, CH2, 4H), 3.25 (q, J = 5.8 Hz, CH2, 4H).
Ｎ，Ｎ’－（（（オキシビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（オキシ））ビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（２－クロロアセタミド）（ｂ６）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.23 (m, CONH, 2H), 4.06 (s, CH2, 4H), 3.52 (m, CH2, 8H), 3.44 (t, J = 5.8 Hz, CH2, 4H), 3.25 (q, J = 5.8 Hz, CH2, 4H).
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’－（ニトリロトリス（プロパン－３，１－ジイル））トリス（２－クロロアセタミド）（ｔ１）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.23 (t, J = 5.6 Hz, CONH, 3H), 4.03 (s, CH2, 6H), 3.10 (q, J = 6.6 Hz, CH2, 6H), 2.34 (t, J = 6.9 Hz, CH2, 6H), 1.52 (p, J = 7.1 Hz, CH2, 6H).
Ｎ，Ｎ’－ビス（クロロアセチル）－１，３－プロピレンジアミン（ｂ２）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.20 (m, CONH, 2H), 4.04 (s, CH2, 4H), 3.10 (td, J = 6.9, 5.7 Hz, CH2, 4H), 1.57 (p, J = 6.9 Hz, CH2, 2H).
Ｎ，Ｎ’－ビス（クロロアセチル）－１，４－ブタンジアミン（ｂ３）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.19 (m, CONH, 2H), 4.02 (s, CH2, 4H), 3.08 (m, CH2, 4H), 1.41 (m, CH2, 4H).
Ｎ，Ｎ’－（オキシビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（２－クロロアセタミド）（ｂ４）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.92 (bs, CONH, 2H), 4.07 (s, CH2, 4H), 3.59 (m, CH2, 4H), 3.53 (m, CH2, 4H).
Ｎ，Ｎ’－（（エタン－１，２－ジイルビス（オキシ））ビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（２－クロロアセタミド）（ｂ５）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.23 (m, CONH, 2H), 4.06 (s, CH2, 4H), 3.52 (m, CH2, 4H), 3.44 (t, J = 5.8 Hz, CH2, 4H), 3.25 (q, J = 5.8 Hz, CH2, 4H).
Ｎ，Ｎ’－（（（オキシビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（オキシ））ビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（２－クロロアセタミド）（ｂ６）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.23 (m, CONH, 2H), 4.06 (s, CH2, 4H), 3.52 (m, CH2, 8H), 3.44 (t, J = 5.8 Hz, CH2, 4H), 3.25 (q, J = 5.8 Hz, CH2, 4H).
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’－（ニトリロトリス（プロパン－３，１－ジイル））トリス（２－クロロアセタミド）（ｔ１）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.23 (t, J = 5.6 Hz, CONH, 3H), 4.03 (s, CH2, 6H), 3.10 (q, J = 6.6 Hz, CH2, 6H), 2.34 (t, J = 6.9 Hz, CH2, 6H), 1.52 (p, J = 7.1 Hz, CH2, 6H).
【0076】
１．６ 求電子剤によるタンパク質修飾
野生型ＳｒｔＡと共に４つの異なる求電子剤の反応性を評価した。そのため、３５℃及び３５０ｒｐｍで架橋緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｍＭ ＴＣＥＰ）中で２ｍＭ求電子剤（アクリルアミド１、２－ブロモアセトアミド２、２－クロロアセトアミド３、又は４マレイミド酪酸４）と共に５０μＭ ＳｒｔＡを２４ｈインキュベートした。ＭＳにより反応を解析した。
野生型ＳｒｔＡと共に４つの異なる求電子剤の反応性を評価した。そのため、３５℃及び３５０ｒｐｍで架橋緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｍＭ ＴＣＥＰ）中で２ｍＭ求電子剤（アクリルアミド１、２－ブロモアセトアミド２、２－クロロアセトアミド３、又は４マレイミド酪酸４）と共に５０μＭ ＳｒｔＡを２４ｈインキュベートした。ＭＳにより反応を解析した。
【0077】
タンパク質変異体Ｓ１～Ｓ６を反応緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｍＭ ＴＣＥＰ）で５０μＭに希釈し、３５℃及び３５０ｒｐｍで０．５ｍＭビス求電子架橋剤（ｂ１～ｂ６、ＤＭＳＯ中５０ｍＭ）と共に２４ｈインキュベートした。反応を停止するために、限外濾過（Amicon Ultra遠心濾過機、０．５ｍＬ、Merck、１０ｋＤａカットオフ）により溶液を濃縮し、低分子量ビス求電子架橋剤を除去するためにＳｒｔＡ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ）で５回洗浄し、緩衝液を交換して最終架橋タンパク質変異体を濃縮した。得られたタンパク質をスナップ凍結し、－８０℃で貯蔵した。変異体Ｓ７とトリス求電子架橋剤ｔ１との架橋のために、ｔ１の濃度のみを０．５ｍＭではなく１ｍＭに変化させて、上記のプロトコルを適用した（図３ｂ）。
【0078】
１．７ 融解温度（Ｔｍ）の測定
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰで各タンパク質を７５μＭに希釈した。３５％の励磁パワーを用いて１℃ ｍｉｎ－１の加熱速度でPrometheus NT.48 (NanoTemper Technologies)により温度をスキャンした（２０～９５℃）。３５０ｎｍ及び３３０ｎｍの蛍光強度比（Ｆ３５０／Ｆ３３０）を温度に対してプロットし、Nanotemper technologiesプロトコルを用いてＴｍ値を決定した。
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰで各タンパク質を７５μＭに希釈した。３５％の励磁パワーを用いて１℃ ｍｉｎ－１の加熱速度でPrometheus NT.48 (NanoTemper Technologies)により温度をスキャンした（２０～９５℃）。３５０ｎｍ及び３３０ｎｍの蛍光強度比（Ｆ３５０／Ｆ３３０）を温度に対してプロットし、Nanotemper technologiesプロトコルを用いてＴｍ値を決定した。
【0079】
１．８ 酵素的加水分解アッセイ
ＳｔｒＡ（図７）及び変異体によるプローブＤａｂｃｙｌ－ＱＡＬＰＥＴＧＥＫ－ＦＩＴＣの加水分解は、増加した蛍光を呈する切断産物ＧＥＫ－ＦＩＴＣを提供する。リアルタイムＰＣＲシステム（StepOnePlus（商標） Real-Time PCR System, Applied Biosystems）を用いて所与の温度で（１６ｈにわたり１０分ステップで）蛍光（ＦＡＭチャネル、５２０ｎｍ）を測定することにより蛍光の変化をモニターした。Tween（最終濃度０．０１％）が補足されたＳｒｔＡ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ）で酵素を２０μＭに希釈した。得られた酵素溶液を同一緩衝液中でペプチドプローブ（Ｄａｂｃｙｌ－ＱＡＬＰＥＴＧＥＫ－ＦＩＴＣ）の２０μＭ溶液と１：１混合した（最終体積２０μＬ、１０μＭプローブ、１０μＭ酵素）。酵素なしのサンプルをブランクとして使用した。蛍光リードアウトをバックグラウンド減算し、時間に対してプロットした。曲線の直線部分の傾きを酵素活性の尺度として決定した（ｖ）。続いて、ｖ値をｖ（ＳｒｔＡ）で除算し、相対活性を得た。
ＳｔｒＡ（図７）及び変異体によるプローブＤａｂｃｙｌ－ＱＡＬＰＥＴＧＥＫ－ＦＩＴＣの加水分解は、増加した蛍光を呈する切断産物ＧＥＫ－ＦＩＴＣを提供する。リアルタイムＰＣＲシステム（StepOnePlus（商標） Real-Time PCR System, Applied Biosystems）を用いて所与の温度で（１６ｈにわたり１０分ステップで）蛍光（ＦＡＭチャネル、５２０ｎｍ）を測定することにより蛍光の変化をモニターした。Tween（最終濃度０．０１％）が補足されたＳｒｔＡ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ）で酵素を２０μＭに希釈した。得られた酵素溶液を同一緩衝液中でペプチドプローブ（Ｄａｂｃｙｌ－ＱＡＬＰＥＴＧＥＫ－ＦＩＴＣ）の２０μＭ溶液と１：１混合した（最終体積２０μＬ、１０μＭプローブ、１０μＭ酵素）。酵素なしのサンプルをブランクとして使用した。蛍光リードアウトをバックグラウンド減算し、時間に対してプロットした。曲線の直線部分の傾きを酵素活性の尺度として決定した（ｖ）。続いて、ｖ値をｖ（ＳｒｔＡ）で除算し、相対活性を得た。
【0080】
１．９ 酵素的ペプチド転移アッセイ
蛍光リードアウト
このアッセイは、上記の加水分解アッセイと同様に実施したが、２．５ｍＭトリグリシン（Ｇ３、Sigma-Aldrich）の存在下で行った。ＳｒｔＡ及びＳ７－ｔ１の熱活性プロファイルを作成するために、各種温度（３７℃、４５℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃）でペプチド転移活性を決定した。トリプリケートを測定し、平均し、エラーバー（１σ）と共にプロットした。統計的有意性は、対応のないｔ検定（GraphPad）により評価した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした（ｎｓ：有意でない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、図４ｂ）。
蛍光リードアウト
このアッセイは、上記の加水分解アッセイと同様に実施したが、２．５ｍＭトリグリシン（Ｇ３、Sigma-Aldrich）の存在下で行った。ＳｒｔＡ及びＳ７－ｔ１の熱活性プロファイルを作成するために、各種温度（３７℃、４５℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃）でペプチド転移活性を決定した。トリプリケートを測定し、平均し、エラーバー（１σ）と共にプロットした。統計的有意性は、対応のないｔ検定（GraphPad）により評価した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした（ｎｓ：有意でない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、図４ｂ）。
【0081】
ペプチド転移活性のＨＰＬＣ－ＭＳモニタリング
ＳｒｔＡ及びＳ７－ｔ１に対して６５℃で反応を実施した。反応条件：５０μＭ ＰＯＩ（ＳｒｔＡ又はＳ７－ｔ１）、１０μＭペプチドプローブ（Ｄａｂｃｙｌ－ＱＡＬＰＥＴＧＥＫ－ＦＩＴＣ）、ＳｒｔＡ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ）中の２．５ｍＭ Ｇ３、６５℃、１２ｈ、３５０ｒｐｍ。１％ＴＦＡの添加により反応混合物をクエンチした。これらの反応の生成物をＨＰＬＣ－ＭＳにより解析した（図４ａ）。
ＳｒｔＡ及びＳ７－ｔ１に対して６５℃で反応を実施した。反応条件：５０μＭ ＰＯＩ（ＳｒｔＡ又はＳ７－ｔ１）、１０μＭペプチドプローブ（Ｄａｂｃｙｌ－ＱＡＬＰＥＴＧＥＫ－ＦＩＴＣ）、ＳｒｔＡ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ）中の２．５ｍＭ Ｇ３、６５℃、１２ｈ、３５０ｒｐｍ。１％ＴＦＡの添加により反応混合物をクエンチした。これらの反応の生成物をＨＰＬＣ－ＭＳにより解析した（図４ａ）。
【0082】
ＧｄｎＨＣｌの存在下のペプチド転移活性
変性剤ＧｄｎＨＣｌの存在下でＳｒｔＡ及びＳ７－ｔ１のペプチド転移活性効率を評価した。固定のＰＯＩ（１０μＭ）、ペプチドプローブ（１０μＭ）、及びＧ３（２．５ｍＭ）の濃度並びに固定の温度（３７℃）でのペプチド転移活性を、いくつかのＧｄｎＨＣｌ濃度（０Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍ、１．５Ｍ、及び２．０Ｍ）で測定した。トリプリケートを測定し、平均し、エラーバー（１σ）と共にプロットした。統計的有意性は、対応のないｔ検定（GraphPad）により評価した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした（ｎｓ：有意でない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、図４ｃ）。
変性剤ＧｄｎＨＣｌの存在下でＳｒｔＡ及びＳ７－ｔ１のペプチド転移活性効率を評価した。固定のＰＯＩ（１０μＭ）、ペプチドプローブ（１０μＭ）、及びＧ３（２．５ｍＭ）の濃度並びに固定の温度（３７℃）でのペプチド転移活性を、いくつかのＧｄｎＨＣｌ濃度（０Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍ、１．５Ｍ、及び２．０Ｍ）で測定した。トリプリケートを測定し、平均し、エラーバー（１σ）と共にプロットした。統計的有意性は、対応のないｔ検定（GraphPad）により評価した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした（ｎｓ：有意でない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、図４ｃ）。
【0083】
１．１０ ＳｒｔＡ及びＳ７－ｔ１のフォールディング可逆性
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ、及び０．０１％ Tween 20でＳｒｔＡ及びＳ７－ｔ１を２０μＭに希釈した。これらの溶液をThermoMixer (HTA-BioTec)で３０ｍｉｎにわたり室温から８５℃に加熱し、次いで、６０分にわたり室温に冷却した。その後、予加熱されていないタンパク質の新たに調製された溶液と一緒に３７℃でタンパク質のペプチド転移活性を評価した。
２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＴＣＥＰ、及び０．０１％ Tween 20でＳｒｔＡ及びＳ７－ｔ１を２０μＭに希釈した。これらの溶液をThermoMixer (HTA-BioTec)で３０ｍｉｎにわたり室温から８５℃に加熱し、次いで、６０分にわたり室温に冷却した。その後、予加熱されていないタンパク質の新たに調製された溶液と一緒に３７℃でタンパク質のペプチド転移活性を評価した。
【0084】
１．１１ ＨＰＬＣ結合高分解能質量分析
非修飾Ｓ７及び二環状Ｓ７－ｔ１を、まず１ｍＭ ＤＴＴと共に、次いで５．５ｍＭヨードアセトアミドと共に、インキュベートし、８Ｍウレアで変性させ、最後に消化させた。最初に、ＬｙｓＣ（和光（商標）、日本、大阪）を３時間使用し（タンパク質対酵素比５０：１）、４体積の５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＡＭＢＩＣ、ｐＨ８．３）で２．０Ｍウレアの最終濃度に希釈した後、シーケンシンググレード修飾トリプシン（Promega（商標）, Madison, WI、タンパク質対酵素比５０：１）でペプチドを３７℃で一晩消化させた。ペプチドをＣ１８ステージチップ上で脱塩し、０．１％ギ酸を含む６５ｍｉｎグラジエント５～６０％アセトニトリルを用いて、UltiMate（商標）3000 RSLCnanoシステム（ThermoFisher Scientific, Germany）上でPepMap100 RSLC C18ナノＨＰＬＣカラム（２μｍ、１００Å、７５ＩＤ×２５ｃｍ、nanoViper, Dionex, Germany）で１００～３００ｎｇのペプチドを分離し、次いで、Q Exactive（商標） Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer HF (ThermoFisher Scientific)でナノエレクトロスプレー源（Nanospray Flex Ion Scource, Thermo Scientific）を介して直接スプレーした。ナノＨＰＬＣを四重極オービトラップ質量分析計に結合するために、標準的被覆SilicaTip（ＩＤ２０μｍ、Ｔｉｐ－ＩＤ１０μｍ、New Objective, Woburn, MA, USA）を使用した。１回のサーベイスキャン、続いて１０回のＭＳ／ＭＳスキャンを行うデータ依存モードでQ Exactive（商標）HFを操作した。分解能７００００で質量範囲３００～１６５０ｍ／ｚでＭＳスペクトルを取得し、続いて、分解能１７５００で高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）ＭＳ／ＭＳスキャンまで行った。得られた生のファイルは、可変修飾として脱アミド化（ｄｅ、Ａｓｎ及びＧｌｎ用）、酸化（ｏｘ、Ｍｅｔ用）、カルバミドメチル化（ｃａ、Ｃｙｓ用）、及びｔ１レムナント（ｃｌ、Ｃ２Ｈ２Ｏ［－Ｈ］、Ｃｙｓ用）を用いてＳ７に対してAndromedaサーチアルゴリズム検索を含むMaxQuantソフトウェア（バージョン１．５．２．１８）で処理した。フル質量スペクトルの質量確度は、第１のサーチでは２０ｐｐｍ、第２のサーチでは４．５ｐｐｍ、及びＭＳ／ＭＳスペクトルでは２０ｐｐｍに設定した。２回の誤切断は許容した。ペプチド及び部位デコイ画分で１％の偽発見率カットオフを適用した。
非修飾Ｓ７及び二環状Ｓ７－ｔ１を、まず１ｍＭ ＤＴＴと共に、次いで５．５ｍＭヨードアセトアミドと共に、インキュベートし、８Ｍウレアで変性させ、最後に消化させた。最初に、ＬｙｓＣ（和光（商標）、日本、大阪）を３時間使用し（タンパク質対酵素比５０：１）、４体積の５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＡＭＢＩＣ、ｐＨ８．３）で２．０Ｍウレアの最終濃度に希釈した後、シーケンシンググレード修飾トリプシン（Promega（商標）, Madison, WI、タンパク質対酵素比５０：１）でペプチドを３７℃で一晩消化させた。ペプチドをＣ１８ステージチップ上で脱塩し、０．１％ギ酸を含む６５ｍｉｎグラジエント５～６０％アセトニトリルを用いて、UltiMate（商標）3000 RSLCnanoシステム（ThermoFisher Scientific, Germany）上でPepMap100 RSLC C18ナノＨＰＬＣカラム（２μｍ、１００Å、７５ＩＤ×２５ｃｍ、nanoViper, Dionex, Germany）で１００～３００ｎｇのペプチドを分離し、次いで、Q Exactive（商標） Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer HF (ThermoFisher Scientific)でナノエレクトロスプレー源（Nanospray Flex Ion Scource, Thermo Scientific）を介して直接スプレーした。ナノＨＰＬＣを四重極オービトラップ質量分析計に結合するために、標準的被覆SilicaTip（ＩＤ２０μｍ、Ｔｉｐ－ＩＤ１０μｍ、New Objective, Woburn, MA, USA）を使用した。１回のサーベイスキャン、続いて１０回のＭＳ／ＭＳスキャンを行うデータ依存モードでQ Exactive（商標）HFを操作した。分解能７００００で質量範囲３００～１６５０ｍ／ｚでＭＳスペクトルを取得し、続いて、分解能１７５００で高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）ＭＳ／ＭＳスキャンまで行った。得られた生のファイルは、可変修飾として脱アミド化（ｄｅ、Ａｓｎ及びＧｌｎ用）、酸化（ｏｘ、Ｍｅｔ用）、カルバミドメチル化（ｃａ、Ｃｙｓ用）、及びｔ１レムナント（ｃｌ、Ｃ２Ｈ２Ｏ［－Ｈ］、Ｃｙｓ用）を用いてＳ７に対してAndromedaサーチアルゴリズム検索を含むMaxQuantソフトウェア（バージョン１．５．２．１８）で処理した。フル質量スペクトルの質量確度は、第１のサーチでは２０ｐｐｍ、第２のサーチでは４．５ｐｐｍ、及びＭＳ／ＭＳスペクトルでは２０ｐｐｍに設定した。２回の誤切断は許容した。ペプチド及び部位デコイ画分で１％の偽発見率カットオフを適用した。
【0085】
１．１２ 蛍光偏光アッセイ（ＦＰ）
ＦＩＴＣ標識化ペプチドＦＩＴＣ－Ｏ２Ｏｃ－ＧＮＩＬＰＳＤＩ（Ｎｌｅ）ＤＦＶＬＫＮＴＰ－ＮＨ２を用いて、混合系統白血病（ＭＬＬ）転写因子へのＫ１－ｔ１及びＫ１－ｔ２の結合を評価した。この配列はＭＬＬに由来し、全体を通してＭＬＬペプチドとして参照する。２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び２ｍＭ ＴＣＥＰ中の４０ｎＭ ＭＬＬペプチドの溶液を調製した。同一緩衝液を用いて３８４ウェルプレート（ブラック、丸底、Corning）上でＫＩＸ、Ｋ１－ｔ１、及びＫ１－ｔ２の３倍稀釈を１４工程で実施した。次いで、５μＬの４０ｎＭ ＭＬＬペプチド溶液を添加し、最終２０μＬの溶液をｒ．ｔ．でインキュベートした。７０μＭ～０μＭの最終タンパク質範囲を使用した。１ｈインキュベートした後、λ（ｅｘ）＝４８５ｎｍ及びλ（ｅｍ）＝５２５ｎｍでSpark 20Mプレートリーダー（Tecan）を用いて蛍光偏光を測定した。GraphPad Prismソフトウェアで用量－反応曲線の非線形回帰分析を適用することによりＫｄを決定した。
ＦＩＴＣ標識化ペプチドＦＩＴＣ－Ｏ２Ｏｃ－ＧＮＩＬＰＳＤＩ（Ｎｌｅ）ＤＦＶＬＫＮＴＰ－ＮＨ２を用いて、混合系統白血病（ＭＬＬ）転写因子へのＫ１－ｔ１及びＫ１－ｔ２の結合を評価した。この配列はＭＬＬに由来し、全体を通してＭＬＬペプチドとして参照する。２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び２ｍＭ ＴＣＥＰ中の４０ｎＭ ＭＬＬペプチドの溶液を調製した。同一緩衝液を用いて３８４ウェルプレート（ブラック、丸底、Corning）上でＫＩＸ、Ｋ１－ｔ１、及びＫ１－ｔ２の３倍稀釈を１４工程で実施した。次いで、５μＬの４０ｎＭ ＭＬＬペプチド溶液を添加し、最終２０μＬの溶液をｒ．ｔ．でインキュベートした。７０μＭ～０μＭの最終タンパク質範囲を使用した。１ｈインキュベートした後、λ（ｅｘ）＝４８５ｎｍ及びλ（ｅｍ）＝５２５ｎｍでSpark 20Mプレートリーダー（Tecan）を用いて蛍光偏光を測定した。GraphPad Prismソフトウェアで用量－反応曲線の非線形回帰分析を適用することによりＫｄを決定した。
【0086】
実施例２
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）は、多くの異なる基質分子に対してアルデヒド部分からカルボン酸への高化学選択的酸化に適用されてきた［T. Knaus, V. Tseliou, L. D. Humphreys, N. S. Scrutton, F. G. Mutti, Green Chemistry 2018 1］。融解温度は４７℃よりもわずかに高い。つまり、わずか２～４時間後にＡＬＤＨの触媒活性は顕著に低減される。架橋ＡＬＤＨは、酵素の熱安定性を改善したりバイオ触媒的酸化時にその「寿命」を増加させたりするのに役立ちうる。ウシ水晶体由来のＡＬＤＨ（ＡＬＤＨ－Ｂｏｖ）は、４次構造が入手可能であるホモダイマー及び／又はテトラマーを形成する。マルチマーの３つのモノマーを架橋するために、以下のアミノ酸配列を有するＡＬＤＨ－Ｂｏｖポリペプチドのアミノ酸位置番号付けを基準にして位置７３、４１４、４９９にシステインを有するＡＬＤＨ－Ｂｏｖポリペプチドを設計し、マルチマーの２つのモノマーを架橋するために、位置７２、２３８、４４８にシステインを有するＡＬＤＨ－Ｂｏｖポリペプチドを設計する。
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アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）は、多くの異なる基質分子に対してアルデヒド部分からカルボン酸への高化学選択的酸化に適用されてきた［T. Knaus, V. Tseliou, L. D. Humphreys, N. S. Scrutton, F. G. Mutti, Green Chemistry 2018 1］。融解温度は４７℃よりもわずかに高い。つまり、わずか２～４時間後にＡＬＤＨの触媒活性は顕著に低減される。架橋ＡＬＤＨは、酵素の熱安定性を改善したりバイオ触媒的酸化時にその「寿命」を増加させたりするのに役立ちうる。ウシ水晶体由来のＡＬＤＨ（ＡＬＤＨ－Ｂｏｖ）は、４次構造が入手可能であるホモダイマー及び／又はテトラマーを形成する。マルチマーの３つのモノマーを架橋するために、以下のアミノ酸配列を有するＡＬＤＨ－Ｂｏｖポリペプチドのアミノ酸位置番号付けを基準にして位置７３、４１４、４９９にシステインを有するＡＬＤＨ－Ｂｏｖポリペプチドを設計し、マルチマーの２つのモノマーを架橋するために、位置７２、２３８、４４８にシステインを有するＡＬＤＨ－Ｂｏｖポリペプチドを設計する。
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【0087】
かかる架橋ＡＬＤＨ－Ｂｏｖポリペプチドは、増加した熱安定性を有すると予想される。
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図4e】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図7a】
【図7b】
【図8a-1】
【図8a-2】
【図8b-1】
【図8b-2】
【図8c-1】
【図8c-2】
【図9a】
【図9b】
【図10a】
【図10b】
【図11】
【図12a】
【図12b】
【図13a】
【図13b】
【図13c】
【図13d】
【図14a】
【図14b】
【図15a】
【図15b】
【図15c】
【図15d】
【図15e】
【配列表】