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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-19
(45)【発行日】2024-07-29
(54)【発明の名称】Ｔｒｋ断片をコードする核酸構築物、及びその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240722BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240722BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240722BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240722BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240722BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240722BHJP
C07K 14/71 20060101ALI20240722BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20240722BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N5/10
A61K31/7088
A61P25/00
A61P43/00 107
C07K19/00
C07K14/71
C12Q1/68
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021503631
(86)(22)【出願日】2020-03-04
(86)【国際出願番号】 JP2020009259
(87)【国際公開番号】W WO2020179844
(87)【国際公開日】2020-09-10
【審査請求日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】P 2019038503
(32)【優先日】2019-03-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】591063394
【氏名又は名称】公益財団法人東京都医学総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】行方 和彦
(72)【発明者】
【氏名】原田 高幸
【審査官】大西 隆史
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００６／０９４０７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５３５６９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１９２５３８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１９－５００８８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】DEWITT, J. et al.，Oncogene，2013年03月04日，Vol. 33，pp. 977-985，DOI: 10.1038/onc.2013.39
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４
Ａ６１Ｋ ３５／００－５１／１２
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００１
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔｒｋの細胞内領域と膜局在化配列とを含み、Ｔｒｋの細胞外領域を含まない融合ポリペプチドをコードする核酸構築物であって、膜局在化配列は、アミノ酸の脂質修飾を誘導するものである、核酸構築物。
【請求項2】
Ｔｒｋの細胞内領域が以下の何れかから選択される、請求項１に記載の核酸構築物。１）配列番号２、６、９、１２、又は１４の何れかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド、
２）配列番号２、６、９、１２、又は１４の何れかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列で示されるポリペプチド。
【請求項3】
膜局在化配列はファルネシル化配列である、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項4】
ベクターである、請求項１～３の何れか一項に記載の核酸構築物。
【請求項5】
アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項6】
請求項１～５の何れか一項に記載の核酸構築物を含む医薬組成物。
【請求項7】
神経関連疾患薬である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
神経保護又は神経再生用である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
単離された細胞、又は、非ヒト動物の細胞であって、請求項１に記載の核酸構築物が発現可能に導入されている、神経系細胞。
【請求項10】
単離された細胞内で、又は、非ヒト動物の細胞内で、Ｔｒｋの細胞外領域を含まないＴｒｋの細胞内領域を、膜局在化配列を介して細胞膜に局在させる工程を含み、膜局在化配列は、アミノ酸の脂質修飾を誘導するものである、細胞活性化の方法。
【請求項11】
上記工程は、請求項１～５の何れか一項に記載の核酸構築物、請求項６～８の何れか一項に記載の医薬組成物から選択される何れかを神経系細胞内で発現させることによって行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
Ｔｒｋの細胞内領域と膜局在化配列とを含み、Ｔｒｋの細胞外領域を含まない融合ポリペプチドであって、膜局在化配列は、アミノ酸の脂質修飾を誘導するものである、融合ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｔｒｋファミリーの機能的断片をコードする核酸構築物とその利用とに関する。
【背景技術】
【0002】
神経細胞の生存、軸索伸長、並びに、中枢神経系の発生などに重要な役割を持つ神経栄養因子としてnerve growth factor（ＮＧＦ）、brain-derived neurotrophic factor（ＢＤＮＦ）、Neurotrophin-3（ＮＴ－３）、及び、ＮＴ－４／５等が知られている（非特許文献１）。
【0003】
上記のＢＤＮＦの高親和性受容体として知られているのがＴｒｋＢであり、通常は、その細胞外領域が二量体を形成することによって、ＢＤＮＦを受容可能とする。ただし、ＴｒｋＢには、細胞内のチロシンキナーゼドメインを欠いた短縮型も存在しており、その機能は十分には解明されていない（非特許文献２）。
【0004】
発明者等は、神経栄養因子の研究を長年にわたり行っており、グリアーグリア細胞及びグリアー神経細胞間のシグナル制御が、神経保護に重要であることを報告している（非特許文献３～５）。
【0005】
さらにＴｒｋＢシグナルによる神経保護と軸索再生とに関する研究を継続する中で、ＴｒｋＢシグナルによって活性化されるグアニンヌクレオチド交換因子（guanine nucleotide exchange factor: ＧＥＦ）であるＤｏｃｋ３の機能等にも注目してきた（非特許文献６～９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】国際公開ＷＯ２０１８／１８５４６８（国際公開日：２０１８年１０月１１日）
【非特許文献】
【0007】
【文献】Park H, Poo MM. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nat Rev Neurosci 14(1):7-23, 2013.
【文献】Fenner BM. Truncated TrkB: beyond a dominant negative receptor. Cytokine Growth Factor Rev 23(1-2): 15-24, 2012.
【文献】Harada T, Harada C, Nakayama N, Okuyama S, Yoshida K, Kohsaka S, Matsuda H, Wada K. Modification of glial-neuronal cell interactions prevents photoreceptor apoptosis during light-induced retinal degeneration.Neuron 26(2): 533-541, 2000.
【文献】Harada T, Harada C, Kohsaka S, Wada E, Yoshida K, Ohno S, Mamada H, Tanaka K, Parada LF, Wada K.Microglia-Muller glia cell interactions control neurotrophic factor production during light-induced retinal degeneration. J Neurosci 22(21): 9228-9236, 2002.
【文献】Harada C, Guo X, Namekata K, Kimura A, Nakamura K, Tanaka K, Parada LF, Harada T. Glia- and neuronspecific functions of TrkB signalling during retinal degeneration and regeneration. Nat Commun 2: 189, 2011.
【文献】Namekata K, Harada C, Taya C, Guo X, Kimura H, Parada LF, Harada T. Dock3 induces axonal outgrowth by stimulating membrane recruitment of the WAVE complex. Proc Natl Acad Sci U S A 107(16): 7586-7591, 2010.
【文献】Namekata K, Harada C, Guo X, Kimura A, Kittaka D, Watanabe H, Harada T. Dock3 stimulates axonal outgrowth via GSK-3β-mediated microtubule assembly. J Neurosci 32(1): 264-274, 2012.
【文献】Namekata K, Kimura A, Kawamura K, Harada C, Harada T. Dock GEFs and their therapeutic potential:neuroprotection and axon regeneration. Prog Retin Eye Res 43: 1-16, 2014.
【文献】行方和彦, 原田高幸. 神経軸索の再生におけるDock3 の機能. 生化学 84(5), 368-373, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
以上のように、ＴｒｋＢが、神経保護等において果たす重要な役割が、様々な観点から解明され始めている。
【0009】
しかし、ＴｒｋＢ全長遺伝子を組み込んだ遺伝子ベクターにおいては、ＴｒｋＢの高発現を誘導することは困難である。これは、ＴｒｋＢ全長遺伝子は比較的サイズが大きいため、使用可能なプロモータサイズ等に制限がかかるからである。
【0010】
また、神経関連疾患の治療に際しては、ＴｒｋＢを過剰発現させるだけでなく、同時にＢＤＮＦを定期的に投与することが必要と考えられることから、これまでＴｒｋＢを活用した遺伝子治療研究は実用化されていない。
【0011】
最近、ＢＤＮＦとＴｒｋＢとの融合タンパクをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターが報告されている（特許文献１）。しかし、当該融合タンパク質の分子サイズから、発現レベルはそれほど高くないと推測される。
【0012】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ｔｒｋファミリーの機能的断片をコードする新規な核酸構築物とその利用とを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0013】
上記の課題を解決するために、本発明は、以下に示す態様を含む。
【0014】
（ｉ）Ｔｒｋの細胞内領域と膜局在化配列とを含む融合ポリペプチドをコードする核酸構築物。
【0015】
（ｉｉ）細胞内で、Ｔｒｋの細胞内領域を、膜局在化配列を介して細胞膜に局在させる工程を含む、細胞活性化の方法。
【0016】
（ｉｉｉ）Ｔｒｋの細胞内領域と膜局在化配列とを含む融合ポリペプチド。
【発明の効果】
【0017】
本発明の一態様によれば、Ｔｒｋファミリーの機能的断片をコードする新規な核酸構築物とその利用等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】常時活性型ＴｒｋＢ（ＣＡ－ＴｒｋＢ）の構造を示す図である。
【図2】実施例１で作製したアデノ随伴ウイルスベクターを示す図である。
【図3】実施例１の結果（ＣＡ－ＴｒｋＢの発現量）を示す図である。
【図4】実施例１の他の結果（ＣＡ－ＴｒｋＢによる細胞内シグナル伝達）を示す図である。
【図5】実施例２の結果（ＣＡ－ＴｒｋＢによる網膜神経節細胞の保護）を示す図である。
【図6】実施例２の結果（ＣＡ－ＴｒｋＢによる視神経軸索再生）を示す図である。
【図7】実施例３の結果（緑内障モデルマウスを用いた、ＣＡ－ＴｒｋＢによる網膜神経節細胞の保護）を示す図である。
【図8】実施例４の結果（ＣＡ-ＴｒｋＢの変異体を用いたシグナル伝達の検証）を示す図である。
【図9】実施例５に関し、常時活性型のＴｒｋＡ及びＴｒｋＣの構造と、実施例５の結果（ＣＡ－ＴｒｋＡ及びＣによる細胞内シグナル伝達）を示す図である。
【図10】実施例におけるｉＳＨ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片の塩基配列を示す図である。
【図11】実施例におけるＣＡ－ＴｒｋＡをコードする遺伝子断片の塩基配列を示す図である。
【図12】実施例におけるＣＡ－ＴｒｋＣをコードする遺伝子断片の塩基配列を示す図である。
【図13】実施例６の結果（視覚誘発電位の計測）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
〔用語などの定義〕
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言できる。「ポリヌクレオチド」は、特に明記しない場合は、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することができる天然に存在するヌクレオチドの既知の類似体を含有するポリヌクレオチドを包含する。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言できる。特に言及のない限り、「塩基配列」はデオキシリボヌクレオチドの配列またはリボヌクレオチドの配列を意図している。また、ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖構造であってもよく、一本鎖の場合はセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言できる。「ポリヌクレオチド」は、特に明記しない場合は、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することができる天然に存在するヌクレオチドの既知の類似体を含有するポリヌクレオチドを包含する。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言できる。特に言及のない限り、「塩基配列」はデオキシリボヌクレオチドの配列またはリボヌクレオチドの配列を意図している。また、ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖構造であってもよく、一本鎖の場合はセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。
【0020】
本明細書において、「遺伝子」は、タンパク質をコードしている「ポリヌクレオチド」を指す。
【0021】
本明細書において、遺伝子の「発現制御領域」は、遺伝子の発現を制御している「ポリヌクレオチド」を指す。「発現制御領域」の一例としては、プロモータ領域、エンハンサ領域などが挙げられる。
【0022】
本明細書において、「発現カセット」は、発現宿主内で機能的な発現制御領域と、当該発現制御領域と作動可能に連結されたポリヌクレオチドとを含む発現単位を指す。発現カセットにおいて、当該ポリヌクレオチドは好ましくは遺伝子または遺伝子の断片である。発現カセットの一例は、上記発現制御領域と上記ポリヌクレオチドとを遺伝子工学的に連結したものである。「作動可能に連結」とは、ポリヌクレオチドの発現が発現制御配列によって制御されている状態を指す。発現カセットは発現ベクターの形態であってもよい。
【0023】
本明細書において、「ポリペプチド」は、「タンパク質」とも換言できる。「ポリペプチド」は、アミノ酸がペプチド結合してなる構造を含むが、さらに、例えば、糖鎖、またはイソプレノイド基などの構造を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、特に明記しない場合は、天然に存在するアミノ酸と同様に機能することができる、天然に存在するアミノ酸の既知の類似体を含有するポリペプチドを包含する。
【0024】
〔１．核酸構築物〕
本発明の一実施形態に係る核酸構築物は、Ｔｒｋの細胞内領域と膜局在化配列とを含む融合ポリペプチドをコードする核酸構築物である。本発明は、この核酸構築物を細胞内で発現させることによって、神経栄養因子（ニューロトロフィン）の投与を行わずとも、Ｔｒｋの下流の細胞内シグナル経路を活性化可能にするという驚くべき知見に基づきなされたものである。すなわち、本願発明は、この核酸構築物がコードしている融合ポリペプチドが持つ膜局在化配列を介して、Ｔｒｋの細胞内領域を細胞膜に局在させるという、細胞活性化の新たな手法に関する。
本発明の一実施形態に係る核酸構築物は、Ｔｒｋの細胞内領域と膜局在化配列とを含む融合ポリペプチドをコードする核酸構築物である。本発明は、この核酸構築物を細胞内で発現させることによって、神経栄養因子（ニューロトロフィン）の投与を行わずとも、Ｔｒｋの下流の細胞内シグナル経路を活性化可能にするという驚くべき知見に基づきなされたものである。すなわち、本願発明は、この核酸構築物がコードしている融合ポリペプチドが持つ膜局在化配列を介して、Ｔｒｋの細胞内領域を細胞膜に局在させるという、細胞活性化の新たな手法に関する。
【0025】
本実施形態に係る核酸構築物は、例えば、以下に代表される効果を奏する。
１）対応する神経栄養因子を過剰発現又は投与することを要さない。
２）Ｔｒｋ全長と比較して、活性化に必要な分子サイズを大幅に小さくすることができる。これによって、分子の高発現化を可能とする。さらに、核酸構築物の設計の自由度が大幅に拡大するため、例えば、高発現化や遺伝子導入効率の向上等をより容易に実現することができる。
１）対応する神経栄養因子を過剰発現又は投与することを要さない。
２）Ｔｒｋ全長と比較して、活性化に必要な分子サイズを大幅に小さくすることができる。これによって、分子の高発現化を可能とする。さらに、核酸構築物の設計の自由度が大幅に拡大するため、例えば、高発現化や遺伝子導入効率の向上等をより容易に実現することができる。
【0026】
（融合ポリペプチド）
本実施形態に係る核酸構築物がコードしている融合ポリペプチドは、後述する、１）Ｔｒｋの細胞内領域と、２）膜局在化配列と、を含むものである。膜局在化配列は、その特性に応じて、融合ポリペプチドのＮ末端側、又は、融合ポリペプチドのＣ末端側に配置されることが好ましい場合がある。Ｔｒｋの細胞内領域との関係では、膜局在化配列は、当該細胞内領域のＮ末端側（膜貫通領域に近い側）に対して配置しても、Ｃ末端側に対して配置してもよい。なお、実施例に示す常時活性型Ｔｒｋでは、膜局在化配列は、融合ポリペプチドのＣ末端側に配置され、かつ、Ｔｒｋの細胞内領域のＣ末端側に対して配置されている。これにより、実施例に示す常時活性型Ｔｒｋは、細胞膜に対して、Ｔｒｋの細胞内領域を通常とは逆に位置させる（図１・９も参照）。
本実施形態に係る核酸構築物がコードしている融合ポリペプチドは、後述する、１）Ｔｒｋの細胞内領域と、２）膜局在化配列と、を含むものである。膜局在化配列は、その特性に応じて、融合ポリペプチドのＮ末端側、又は、融合ポリペプチドのＣ末端側に配置されることが好ましい場合がある。Ｔｒｋの細胞内領域との関係では、膜局在化配列は、当該細胞内領域のＮ末端側（膜貫通領域に近い側）に対して配置しても、Ｃ末端側に対して配置してもよい。なお、実施例に示す常時活性型Ｔｒｋでは、膜局在化配列は、融合ポリペプチドのＣ末端側に配置され、かつ、Ｔｒｋの細胞内領域のＣ末端側に対して配置されている。これにより、実施例に示す常時活性型Ｔｒｋは、細胞膜に対して、Ｔｒｋの細胞内領域を通常とは逆に位置させる（図１・９も参照）。
【0027】
融合ポリペプチドは、一例において、「Ｔｒｋの細胞内領域及び膜局在化配列」以外の「他の配列」を含んでいてもよい。「他の配列」としては、例えば、スペーサ配列、ｐ８５のＳＨ２配列等が挙げられる。「他の配列」を挿入する位置は、その目的に応じて設定すればよく、例えば、Ｔｒｋの細胞内領域と膜局在化配列との間であり、融合ポリペプチドのＮ末端側であり（この場合、膜局在化配列はＣ末端側に配置されることが好ましい場合がある）、又は、融合ポリペプチドのＣ末端側である（この場合、膜局在化配列はＮ末端側に配置されることが好ましい場合がある）。
【0028】
融合ポリペプチドは、好ましい一例において、アミノ酸数が３００個以上で６５０個以下の範囲内であり、３３０個以上で６３０個以下の範囲内であることがより好ましい場合がある。なお、融合ポリペプチドのうち「Ｔｒｋの細胞内領域及び膜局在化配列」は、好ましい一例において、アミノ酸数が３００個以上で４５０個以下であり、３３０個以上で４４０個以下、或いは、３５０個以上で４４０個以下、或いは、３６０個以上（又は３７０個以上）で４４０個以下、或いは、３６０個以上（又は３７０個以上）で４１０個以下の範囲内であることがより好ましい場合がある。融合ポリペプチドのサイズが小さければ、例えば、１）核酸構築物における他の構成（すなわち、融合ポリペプチドをコードする領域以外の構成）の設計の自由度が拡大する、２）融合ポリペプチドの発現効率が向上する、等の利点がある。特に、核酸構築物におけるプロモータ等の選択肢が広がることは、融合ポリペプチドの発現効率の向上に大きく寄与する。
【0029】
融合ポリペプチドは、一例において、Ｔｒｋの細胞外領域の一部、及び／又は、膜貫通領域の一部を含んでいてもよい。融合ポリペプチドは、好ましい一例において、Ｔｒｋの細胞外領域、及び／又は、膜貫通領域を含んでいない。融合ポリペプチドは、より好ましい一例において、Ｔｒｋの細胞外領域、及び、膜貫通領域の双方を含んでいない。
【0030】
（Ｔｒｋの細胞内領域）
本実施形態において、Ｔｒｋの細胞内領域とは、一回膜貫通型のタンパク質である、神経栄養因子の高親和性受容体（Ｔｒｋ）の細胞内領域に相当するポリペプチド、並びに、当該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを指す。細胞内領域は、細胞質ドメインとも称される。
本実施形態において、Ｔｒｋの細胞内領域とは、一回膜貫通型のタンパク質である、神経栄養因子の高親和性受容体（Ｔｒｋ）の細胞内領域に相当するポリペプチド、並びに、当該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを指す。細胞内領域は、細胞質ドメインとも称される。
【0031】
Ｔｒｋのファミリーとして、現在までに、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、及びＴｒｋＣの三種が報告されている。ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、及びＴｒｋＣは何れも、その細胞外領域が神経栄養因子を受容するドメインであり、その細胞内領域がチロシンキナーゼ活性を有する。神経系細胞において、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ及びＴｒｋＣは何れも、対応する神経栄養因子を受容することを契機に、その下流の細胞内シグナル経路が活性化される。なお、ＴｒｋＡはＮＧＦの受容体であり、ＴｒｋＢはＢＤＮＦ及びＮＴ－４／５の受容体であり、ＴｒｋＣはＮＴ－３の受容体である。
【0032】
Ｔｒｋの細胞内領域は、１）チロシンキナーゼ活性を有している、及び／又は、２）細胞膜に局在させた場合にＴｒｋの下流の細胞内シグナル経路を活性化する、ことが出来るものであればよい。Ｔｒｋの下流の細胞内シグナル経路の活性化は、既知の手法、例えば、Ｒａｓ、ＥＲＫ１／２、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、及び、ホスホリパーゼＣ－γ等から選択される少なくとも一つの発現の増大として把握可能である。
【0033】
Ｔｒｋの細胞内領域は、特に限定されないが、例えば、以下のものが好ましい。
１）配列番号２、６、９、１２、又は１４の何れかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド。なお、配列番号２はヒト由来のＴｒｋＢの細胞内領域のアミノ酸配列の一例であり、配列番号６はマウス由来のＴｒｋＡの細胞内領域のアミノ酸配列の一例であり、配列番号９はマウス由来のＴｒｋＣの細胞内領域のアミノ酸配列の一例であり、配列番号１２はヒト由来のＴｒｋＡの細胞内領域のアミノ酸配列の一例であり、配列番号１４はヒト由来のＴｒｋＣの細胞内領域のアミノ酸配列の一例である。
２）配列番号２、６、９、１２、又は１４の何れかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチド。機能的に同等なポリペプチドとしては、例えば、配列番号２、６、又は９の何れかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列で示されるポリペプチドが挙げられる。なお、配列同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上がより好ましい。
なお、配列番号６に示すアミノ酸配列における１０４番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）は、チロシンキナーゼ活性又はＴｒｋＡの下流の細胞内シグナル経路の活性化に不可欠なアミノ酸であるため変異が無いことが好ましい。
同様に、配列番号２に示すアミノ酸配列における１３４番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）は、チロシンキナーゼ活性又はＴｒｋＢの下流の細胞内シグナル経路の活性化に不可欠なアミノ酸であるため、変異が無いことが好ましい。
同様に、配列番号９に示すアミノ酸配列における１１８番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）は、チロシンキナーゼ活性又はＴｒｋＣの下流の細胞内シグナル経路の活性化に不可欠なアミノ酸であるため、変異が無いことが好ましい。
同様に、配列番号１２に示すアミノ酸配列における１０４番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）は、チロシンキナーゼ活性又はＴｒｋＡの下流の細胞内シグナル経路の活性化に不可欠なアミノ酸であるため、変異が無いことが好ましい。
同様に、配列番号１４に示すアミノ酸配列における１１８番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）は、チロシンキナーゼ活性又はＴｒｋＣの下流の細胞内シグナル経路の活性化に不可欠なアミノ酸であるため、変異が無いことが好ましい。
１）配列番号２、６、９、１２、又は１４の何れかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド。なお、配列番号２はヒト由来のＴｒｋＢの細胞内領域のアミノ酸配列の一例であり、配列番号６はマウス由来のＴｒｋＡの細胞内領域のアミノ酸配列の一例であり、配列番号９はマウス由来のＴｒｋＣの細胞内領域のアミノ酸配列の一例であり、配列番号１２はヒト由来のＴｒｋＡの細胞内領域のアミノ酸配列の一例であり、配列番号１４はヒト由来のＴｒｋＣの細胞内領域のアミノ酸配列の一例である。
２）配列番号２、６、９、１２、又は１４の何れかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチド。機能的に同等なポリペプチドとしては、例えば、配列番号２、６、又は９の何れかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列で示されるポリペプチドが挙げられる。なお、配列同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上がより好ましい。
なお、配列番号６に示すアミノ酸配列における１０４番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）は、チロシンキナーゼ活性又はＴｒｋＡの下流の細胞内シグナル経路の活性化に不可欠なアミノ酸であるため変異が無いことが好ましい。
同様に、配列番号２に示すアミノ酸配列における１３４番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）は、チロシンキナーゼ活性又はＴｒｋＢの下流の細胞内シグナル経路の活性化に不可欠なアミノ酸であるため、変異が無いことが好ましい。
同様に、配列番号９に示すアミノ酸配列における１１８番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）は、チロシンキナーゼ活性又はＴｒｋＣの下流の細胞内シグナル経路の活性化に不可欠なアミノ酸であるため、変異が無いことが好ましい。
同様に、配列番号１２に示すアミノ酸配列における１０４番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）は、チロシンキナーゼ活性又はＴｒｋＡの下流の細胞内シグナル経路の活性化に不可欠なアミノ酸であるため、変異が無いことが好ましい。
同様に、配列番号１４に示すアミノ酸配列における１１８番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）は、チロシンキナーゼ活性又はＴｒｋＣの下流の細胞内シグナル経路の活性化に不可欠なアミノ酸であるため、変異が無いことが好ましい。
【0034】
（膜局在化配列）
膜局在化配列は、上記の融合ポリペプチドを、細胞膜に局在化させるためのペプチド配列である。膜局在化配列は、好ましくは、アミノ酸の脂質修飾を誘導するものである。アミノ酸の脂質修飾の種類は特に限定されないが、例えば、１）脂肪酸アシル化、２）プレニル化、３）グリコシルホスファチジルイノシトール化、又は、４）コレステロール化、等が挙げられ、より具体的には、ミリストイル化、パルミトイル化、ファルネシル化、又は、ゲラニルゲラニル化等が挙げられ、中でも好ましくはファルネシル化、又は、ゲラニルゲラニル化が挙げられる。
膜局在化配列は、上記の融合ポリペプチドを、細胞膜に局在化させるためのペプチド配列である。膜局在化配列は、好ましくは、アミノ酸の脂質修飾を誘導するものである。アミノ酸の脂質修飾の種類は特に限定されないが、例えば、１）脂肪酸アシル化、２）プレニル化、３）グリコシルホスファチジルイノシトール化、又は、４）コレステロール化、等が挙げられ、より具体的には、ミリストイル化、パルミトイル化、ファルネシル化、又は、ゲラニルゲラニル化等が挙げられ、中でも好ましくはファルネシル化、又は、ゲラニルゲラニル化が挙げられる。
【0035】
膜局在化配列を構成するアミノ酸配列モチーフとしては、具体的には例えば、以下のものが挙げられる。なおＸは任意のアミノ酸を指し、Ａはａｌｉｐｈａｔｉｃアミノ酸（例えば、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、メチオニン）を指し、Ｃはシステインを指す。
１）Met-Gly-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ser-Ｘ-Ｘ-Ｘ（N末端側脂質修飾モチーフ（Nミリストイル化））２）ＣＡＡＸモチーフ、ＣＣモチーフ、ＣＸＣモチーフ、ＣＣＸＸモチーフ（Ｃ末端側脂質修飾モチーフ）。
１）Met-Gly-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ser-Ｘ-Ｘ-Ｘ（N末端側脂質修飾モチーフ（Nミリストイル化））２）ＣＡＡＸモチーフ、ＣＣモチーフ、ＣＸＣモチーフ、ＣＣＸＸモチーフ（Ｃ末端側脂質修飾モチーフ）。
【0036】
（核酸構築物の形態）
本実施形態に係る核酸構築物の一形態は、Ｔｒｋの細胞内領域と膜局在化配列とを含む上記の融合ポリペプチドをコードする遺伝子である。その一例は、配列番号４、５、８、又は１１に示す何れかの塩基配列を持つ遺伝子であり、或いは、配列番号４、５、８、又は１１に示す塩基配列の何れかと８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を示す塩基配列を持つ遺伝子である。なお、上記融合ポリペプチドを構成するＴｒｋの細胞内領域をコードする遺伝子の一例は、配列番号３、７、１０、１３、又は１５に示す何れかの塩基配列を持つ遺伝子であり、或いは、配列番号３、７、１０、１３、又は１５に示す塩基配列の何れかと８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を示す塩基配列を持つ遺伝子である。
本実施形態に係る核酸構築物の一形態は、Ｔｒｋの細胞内領域と膜局在化配列とを含む上記の融合ポリペプチドをコードする遺伝子である。その一例は、配列番号４、５、８、又は１１に示す何れかの塩基配列を持つ遺伝子であり、或いは、配列番号４、５、８、又は１１に示す塩基配列の何れかと８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を示す塩基配列を持つ遺伝子である。なお、上記融合ポリペプチドを構成するＴｒｋの細胞内領域をコードする遺伝子の一例は、配列番号３、７、１０、１３、又は１５に示す何れかの塩基配列を持つ遺伝子であり、或いは、配列番号３、７、１０、１３、又は１５に示す塩基配列の何れかと８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を示す塩基配列を持つ遺伝子である。
【0037】
本実施形態に係る核酸構築物の他の形態は、上記の遺伝子を発現させる発現カセットである。発現カセットは好ましくは発現ベクターであり、より好ましくはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等のウイルスベクターである。中でも、神経関連疾患に対する遺伝子治療への利用の観点では、アデノ随伴ウイルスベクターが好ましく、中でも、中枢神経系等に対する組織指向性を示す血清型１（ＡＡＶ１）、組織指向性が広い血清型２（ＡＡＶ２）、中枢神経系や網膜等に対する組織指向性を示す血清型５（ＡＡＶ５）等のアデノ随伴ウイルスベクターが、神経関連疾患に対する遺伝子治療への利用の観点で好ましい場合がある。
【0038】
上記の発現カセットは、発現宿主内で機能的な任意の発現制御領域を備える。発現制御領域であるプロモータの種類は特に限定されないが、具体的には例えば、ＣＡＧプロモータ、ＣＭＶプロモータ、ＳＹＮ（シナプシン）Ｉ等の、哺乳類（特にヒト）において高発現をもたらすか、特定の組織において選択的に機能するプロモータが好ましい場合がある。プロモータとしては、これらの中でもＣＡＧプロモータがより好ましい場合がある。発現カセットにおいて、プロモータは遺伝子の上流側に配置される。
【0039】
上記の発現カセットは、必要に応じて、転写で生じたｍＲＮＡの安定性を高める等の作用を持ち、遺伝子の発現向上等に機能する機能的配列をさらに備えていてもよい。機能的配列の一例として、ＷＰＲＥ（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element）配列が挙げられる。発現カセットにおいて、ＷＰＲＥ配列は、遺伝子の下流側に配置される。
【0040】
上記の発現カセットが備えてもよい機能的配列の他の例は、ポリＡテイルの付加シグナル配列である。ポリＡテイルの付加シグナル配列の一例は、シミアンウイルス４０の該当配列、ヒト成長ホルモンの該当配列等が挙げられ、ヒト成長ホルモンの該当配列がより好ましい場合がある。発現カセットにおいて、ＷＰＲＥ配列は、遺伝子の下流側に配置される。
【0041】
上記の発現カセットは、ＩＴＲｓ（inverted terminal repeat sequences）等をさらに備えていてもよい。ＩＴＲｓは転写単位の全体（プロモータからポリＡテイルの付加シグナル配列まで）を挟み込むように、発現カセット内に配置される。
【0042】
〔２．医薬組成物〕
本発明の一実施形態に係る医薬組成物は、上記した核酸構築物を含んでなる遺伝子治療薬である。この医薬組成物は、一例において、神経関連疾患薬であり、より具体的な一例では、神経保護又は神経再生用である。この医薬組成物は、強力な神経保護効果と軸索再生効果とを発揮し、神経関連疾患の治療及び／又は予防に用いることができる。本発明の範疇には、この医薬組成物を投与対象に有効量投与する、神経関連疾患の治療及び／又は予防の方法が含まれる。
本発明の一実施形態に係る医薬組成物は、上記した核酸構築物を含んでなる遺伝子治療薬である。この医薬組成物は、一例において、神経関連疾患薬であり、より具体的な一例では、神経保護又は神経再生用である。この医薬組成物は、強力な神経保護効果と軸索再生効果とを発揮し、神経関連疾患の治療及び／又は予防に用いることができる。本発明の範疇には、この医薬組成物を投与対象に有効量投与する、神経関連疾患の治療及び／又は予防の方法が含まれる。
【0043】
（投与対象）
投与対象となるヒト又は非ヒト動物は、好ましくは、ヒトを含む哺乳類からなる群より選択される何れかである。投与対象となる哺乳類の種類は特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物；ウシ、ウマ等の家畜；ヒト；が挙げられ、特に好ましくはヒトである。投与対象となるヒト又は非ヒト動物は、例えば、後述する神経関連疾患を有している。
投与対象となるヒト又は非ヒト動物は、好ましくは、ヒトを含む哺乳類からなる群より選択される何れかである。投与対象となる哺乳類の種類は特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物；ウシ、ウマ等の家畜；ヒト；が挙げられ、特に好ましくはヒトである。投与対象となるヒト又は非ヒト動物は、例えば、後述する神経関連疾患を有している。
【0044】
（神経関連疾患）
治療及び／又は予防の対象となる神経関連疾患の種類は特に限定されないが、神経系細胞の変性、及び／又は、神経系細胞の細胞死に起因して、その機能が損なわれる病態を指す。神経系細胞の変性や細胞死の原因は特に限定されず、事故等を原因とする神経系の損傷等も含まれる。
治療及び／又は予防の対象となる神経関連疾患の種類は特に限定されないが、神経系細胞の変性、及び／又は、神経系細胞の細胞死に起因して、その機能が損なわれる病態を指す。神経系細胞の変性や細胞死の原因は特に限定されず、事故等を原因とする神経系の損傷等も含まれる。
【0045】
視覚神経系の神経関連疾患としては、緑内障、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症等の神経変性疾患の他、事故等を原因とする視覚神経系の損傷等が挙げられ、中でも、緑内障に代表される網膜神経節細胞の変性を伴う疾患、視覚神経系の損傷（視神経外傷）とが本発明が適用される対象疾患としてより好ましい場合があり得る。聴覚神経系の神経関連疾患としては、神経性難聴などの感覚神経変性疾患の他、事故等を原因とする聴覚神経系の損傷等が挙げられる。
【0046】
（投与法、投与量、投与回数等）
医薬組成物の投与方法は特に限定されず、注入（注射器又は注入ポンプ等を利用）、点眼投与、経皮投与、舌下投与といった手法により局所投与されてもよいし、経口投与、静脈内又は動脈内への血管内投与、腸内投与といった手法により全身投与されてもよい。好ましい一つの投与態様では、治療等の対象となる神経系の近傍に対して局所投与される。
医薬組成物の投与方法は特に限定されず、注入（注射器又は注入ポンプ等を利用）、点眼投与、経皮投与、舌下投与といった手法により局所投与されてもよいし、経口投与、静脈内又は動脈内への血管内投与、腸内投与といった手法により全身投与されてもよい。好ましい一つの投与態様では、治療等の対象となる神経系の近傍に対して局所投与される。
【0047】
医薬組成物の投与量（有効な量）は、投与対象となる上記ヒト又は動物の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数等に応じて適宜設定すればよい。また、必要であれば、当該医薬組成物を用いたインビボアッセイを事前に行い、過度の実験を要することなく上記投与量を決定することができる。
【0048】
医薬組成物の投与回数も、効果が得られる限り特に限定されず、例えば、上記投与量、投与経路、症状、ヒト又は動物の年齢や性別に応じて適宜設定すればよい。
【0049】
（核酸構築物以外の成分）
本発明の一実施形態に係る医薬組成物は、上記の核酸構築物と、薬学的に許容される担体とを少なくとも含んで構成されていてもよい。薬学的に許容される担体は、特に限定されないが、上記の核酸構築物の機能を実質的に阻害せず、かつ、投与対象となるヒト又は非ヒト動物に対して実質的な悪影響を及ぼさないという性質を備えることが好ましい。なお、この医薬組成物は水等の液体担体を含むものであることが好ましい場合があり、一例ではリポソーム製剤であってもよい。
本発明の一実施形態に係る医薬組成物は、上記の核酸構築物と、薬学的に許容される担体とを少なくとも含んで構成されていてもよい。薬学的に許容される担体は、特に限定されないが、上記の核酸構築物の機能を実質的に阻害せず、かつ、投与対象となるヒト又は非ヒト動物に対して実質的な悪影響を及ぼさないという性質を備えることが好ましい。なお、この医薬組成物は水等の液体担体を含むものであることが好ましい場合があり、一例ではリポソーム製剤であってもよい。
【0050】
上記の医薬組成物を構成する成分として、さらに例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用の塩類、緩衝剤、着色剤、抗酸化剤、粘度調整剤、等を挙げることが出来るが特にこれらに限定されない。
【0051】
〔３．細胞活性化の方法等〕
本発明の一実施形態に係る細胞活性化の方法は、細胞内で、Ｔｒｋの細胞内領域を、膜局在化配列を介して細胞膜に局在させる工程（局在化工程）を含む方法である。この局在化工程は、典型的には、〔１．核酸構築物〕欄に記載の核酸構築物、及び、〔２．医薬組成物〕欄に記載の医薬組成物から選択される何れかを神経系細胞内で発現させることによって行うことが出来る。ここで神経系細胞の種類は特に限定されず、中枢神経系の細胞、末梢神経系の細胞、これらの細胞の前駆細胞等を包含する。神経系細胞は単離されたものであってもよく、ヒト又は非ヒト動物の体内に存在するものであってもよい。
本発明の一実施形態に係る細胞活性化の方法は、細胞内で、Ｔｒｋの細胞内領域を、膜局在化配列を介して細胞膜に局在させる工程（局在化工程）を含む方法である。この局在化工程は、典型的には、〔１．核酸構築物〕欄に記載の核酸構築物、及び、〔２．医薬組成物〕欄に記載の医薬組成物から選択される何れかを神経系細胞内で発現させることによって行うことが出来る。ここで神経系細胞の種類は特に限定されず、中枢神経系の細胞、末梢神経系の細胞、これらの細胞の前駆細胞等を包含する。神経系細胞は単離されたものであってもよく、ヒト又は非ヒト動物の体内に存在するものであってもよい。
【0052】
上記の細胞活性化の方法によれば、神経栄養因子の投与を行わずとも、Ｔｒｋの下流の細胞内シグナル経路を活性化可能となる。また、細胞活性化の結果として、強力な神経保護効果と軸索再生効果とが発揮され、神経関連疾患の治療及び／又は予防に利用することができる。
【0053】
本発明の一実施形態はさらに、〔１．核酸構築物〕欄に記載の核酸構築物が発現可能に導入されている神経系細胞や、当該神経系細胞を有する非ヒト動物等を提供する。
【0054】
〔４．まとめ〕
上述の通り、本発明は、以下に示す態様を含む。
上述の通り、本発明は、以下に示す態様を含む。
【0055】
（１）Ｔｒｋの細胞内領域と膜局在化配列とを含む融合ポリペプチドをコードする核酸構築物。
【0056】
（２）Ｔｒｋの細胞内領域が以下の何れかから選択される、（１）に記載の核酸構築物。１）配列番号２、６、９、１２、又は１４の何れかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド、
２）配列番号２、６、９、１２、又は１４の何れかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列で示されるポリペプチド。
２）配列番号２、６、９、１２、又は１４の何れかに記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列で示されるポリペプチド。
【0057】
（３）膜局在化配列は、アミノ酸の脂質修飾を誘導するものである、（１）又は（２）に記載の核酸構築物。
【0058】
（４）膜局在化配列はファルネシル化配列である、（３）に記載の核酸構築物。
【0059】
（５）ベクターである、（１）～（４）の何れかに記載の核酸構築物。
【0060】
（６）アデノ随伴ウイルスベクターである、（５）に記載の核酸構築物。
【0061】
（７）上記（１）～（６）の何れかに記載の核酸構築物を含む医薬組成物。
【0062】
（８）神経関連疾患薬である、（７）に記載の医薬組成物。
【0063】
（９）神経保護又は神経再生用である、（８）に記載の医薬組成物。
【0064】
（１０）上記（１）に記載の核酸構築物が発現可能に導入されている、神経系細胞。
【0065】
（１１）細胞内で、Ｔｒｋの細胞内領域を、膜局在化配列を介して細胞膜に局在させる工程を含む、細胞活性化の方法。
【0066】
（１２）上記工程は、（１）～（６）の何れかに記載の核酸構築物、（７）～（９）の何れかに記載の医薬組成物から選択される何れかを神経系細胞内で発現させることによって行う、（１１）に記載の方法。
【0067】
（１３）Ｔｒｋの細胞内領域と膜局在化配列とを含む融合ポリペプチド。この融合ポリペプチドは、上記（１）～（４）の何れかに記載された核酸構築物がコードしているものであってもよい。
【0068】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【0069】
〔実施例１〕 常時活性型ＴｒｋＢ（constitutive active ＴｒｋＢ（以下、ＣＡ－ＴｒｋＢ））ベクターの作成
（方法）
ＴｒｋＢ分子の細胞内領域を発現するＡＡＶベクター（ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢと称する）を、次の通り作製した。ＣＡ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片を組み込むＡＡＶベクターは、Applied Viromics社製のpAAV-CAG-shuttle-WPREを用いた。ＴｒｋＢの細胞内領域のＮ末端にｍｙｃ－タグを付加し、当該領域のＣ末端にファルネシル（Farnecyl）化シグナル配列を付加したタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ＣＡ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片として準備した（図１も参照）。すなわち、ＣＡ－ＴｒｋＢは、ＴｒｋＢの細胞外領域および膜貫通領域を含まず、ＴｒｋＢの細胞内領域のみを用い、当該細胞内領域にｍｙｃ－タグおよびファルネシル化シグナル配列を付加して構成している。
（方法）
ＴｒｋＢ分子の細胞内領域を発現するＡＡＶベクター（ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢと称する）を、次の通り作製した。ＣＡ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片を組み込むＡＡＶベクターは、Applied Viromics社製のpAAV-CAG-shuttle-WPREを用いた。ＴｒｋＢの細胞内領域のＮ末端にｍｙｃ－タグを付加し、当該領域のＣ末端にファルネシル（Farnecyl）化シグナル配列を付加したタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ＣＡ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片として準備した（図１も参照）。すなわち、ＣＡ－ＴｒｋＢは、ＴｒｋＢの細胞外領域および膜貫通領域を含まず、ＴｒｋＢの細胞内領域のみを用い、当該細胞内領域にｍｙｃ－タグおよびファルネシル化シグナル配列を付加して構成している。
【0070】
なお、ファルネシル化シグナル配列（配列番号１にその塩基配列を示す）は、タンパク質を膜に局在させるためのシグナル配列である。なお、ＴｒｋＢの細胞内領域のアミノ酸配列を配列番号２、ＴｒｋＢの細胞内領域をコードする遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を配列番号３として示す。また、ＣＡ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片（ＡＡＶベクターへ挿入した遺伝子断片の全長）の塩基配列を配列番号４として示す。
【0071】
ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢは、ＣＡ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片用の発現制御システムとしてＣＡＧプロモータを使用し、さらにＷＰＲＥ配列とヒト成長ホルモン（Human Growth hormon）由来のポリＡ配列とを融合させることで高発現を目指したものである（図２参照）。ＷＰＲＥ配列とヒト成長ホルモン由来のポリＡ配列とは、このＡＡＶベクターにおいて、ファルネシル化シグナル配列の下流側に設けられている。なお、ＣＡＧプロモータ、ＷＰＲＥ配列、及び、ヒト成長ホルモン由来のポリＡ配列は、元のＡＡＶベクターに始めから組み込まれているものである。
【0072】
次いで、得られたＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢをＣｏｓ７細胞へトランスフェクションして、その発現量や活性を評価した。
【0073】
（結果）
ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢをＣｏｓ７細胞へトランスフェクションした結果を、図３及び図４に示す。図３は、ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢをＣｏｓ７細胞へトランスフェクションして、２４時間の培養の後に細胞を溶解し、抗ｍｙｃ抗体（Santa Cruz社製のc-Myc抗体（9E10））を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す。ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢは、同様の実験を行った、全長ＴｒｋＢベクターと比較して、発現量が明らかに増大することが確認された。なお、全長ＴｒｋＢベクターとは、ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢの構造と比較して、ＣＡ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片に代えて全長のＴｒｋＢをコードする遺伝子断片が挿入されたアデノ随伴ウイルスベクターである。
ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢをＣｏｓ７細胞へトランスフェクションした結果を、図３及び図４に示す。図３は、ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢをＣｏｓ７細胞へトランスフェクションして、２４時間の培養の後に細胞を溶解し、抗ｍｙｃ抗体（Santa Cruz社製のc-Myc抗体（9E10））を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す。ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢは、同様の実験を行った、全長ＴｒｋＢベクターと比較して、発現量が明らかに増大することが確認された。なお、全長ＴｒｋＢベクターとは、ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢの構造と比較して、ＣＡ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片に代えて全長のＴｒｋＢをコードする遺伝子断片が挿入されたアデノ随伴ウイルスベクターである。
【0074】
図４は、ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢをＣｏｓ７細胞へトランスフェクションして、２４時間の培養の後に細胞を溶解し、抗ｐＥＲＫ抗体（Cell Signaling社製のPhospho-p44/42(Erk1/2)(Thr202/Thr204)）、抗ｐＡＫＴ抗体（Cell Signaling社製のPhospho-Akt(Ser473) (587F11)）、抗ＥＲＫ抗体（Cell Signaling社製のp44/42 MAPK(Erk1/2)(137F5)）、抗ＡＫＴ抗体（Cell Signaling社製のAkt antibody）を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す。ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢを発現したＣｏｓ７細胞ではｐＥＲＫおよびｐＡＫＴの産生が増大しており、両シグナルが活性化していることが認められた。ただし、ＥＲＫおよびＡＫＴともに総量には変化がなかった。なお、ｐＥＲＫおよびｐＡＫＴは、ＴｒｋＢの下流に位置する細胞内シグナルである。なお、図４中のコントロールは、空ベクター（ＡＡＶ-ＣＡ-ＴｒｋＢベクターから、ＣＡ-ＴｒｋＢ配列を除いたもの）を用いて同様の実験を行った結果であり、ｐＥＲＫおよびｐＡＫＴの産生はほぼ見られなかった。
【0075】
〔実施例２〕 視神経挫滅モデルの病理学的解析
（方法）
＝神経保護効果の評価法＝
マウス（系統名 C57BL/6：チャールズリバー社より入手）に対して、視神経挫滅の１４日前に、ＡＡＶ－ＤｓＲｅｄ（対照群）またはＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢを、眼球内に２μＬ投与した。なお、ＡＡＶ－ＤｓＲｅｄとは、ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢの構造と比較して、ＣＡ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片に代えて蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子断片が挿入されたアデノ随伴ウイルスベクターである。
（方法）
＝神経保護効果の評価法＝
マウス（系統名 C57BL/6：チャールズリバー社より入手）に対して、視神経挫滅の１４日前に、ＡＡＶ－ＤｓＲｅｄ（対照群）またはＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢを、眼球内に２μＬ投与した。なお、ＡＡＶ－ＤｓＲｅｄとは、ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢの構造と比較して、ＣＡ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片に代えて蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄをコードする遺伝子断片が挿入されたアデノ随伴ウイルスベクターである。
【0076】
次いで、上記マウスの視神経を露出し、眼球後方の約１ｍｍの箇所で視神経を物理的に挫滅した（方法の詳細は、非特許文献６及び７も参照）。そして、視神経挫滅の１４日後に網膜の展開標本を作成し、残存する網膜神経節細胞の数を定量的にカウントした。なお、視神経採取の１０日前（網膜の展開標本を作成する１０日前と同義）に、脳の上丘から色素Fluoro‐Gold（Fluorochrome社製の商品名）を注入し、網膜神経節細胞を逆行性標識している。
【0077】
＝視神経再生の評価法＝
マウス（系統名C57BL/6：チャールズリバー社より入手）に対して、視神経挫滅の１４日前に、ＡＡＶ－ＤｓＲｅｄ（対照群）またはＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢを、眼球内に２μＬ投与した。
マウス（系統名C57BL/6：チャールズリバー社より入手）に対して、視神経挫滅の１４日前に、ＡＡＶ－ＤｓＲｅｄ（対照群）またはＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢを、眼球内に２μＬ投与した。
【0078】
視神経挫滅は、上記の「神経保護効果の評価法」と同様に行った。そして、視神経挫滅の１４日後にマウスを灌流固定し、視神経の病理標本を作成して、挫滅部位からの軸索再生量を定量化した。なお、視神経採取の３日前（視神経の病理標本を作成する３日前と同義）に、眼球から蛍光色素ＣＴＢを注入し、再生軸索線維を発色させた。
【0079】
（結果）
＝神経保護効果＝
視神経挫滅１４日後に、残存する網膜神経節細胞の数を定量化した。ＡＡＶ-ＣＡ-ＴｒｋＢ投与群（1720 ± 72cells/mm2）では、ＡＡＶ-ＤｓＲｅｄ投与群（664 ± 14 cells/mm2）と比較して、残存する網膜神経節細胞数が有意に増加していた（図５）。ｐ＜０．０１(one-tailed Student’s t test)である。
＝神経保護効果＝
視神経挫滅１４日後に、残存する網膜神経節細胞の数を定量化した。ＡＡＶ-ＣＡ-ＴｒｋＢ投与群（1720 ± 72cells/mm2）では、ＡＡＶ-ＤｓＲｅｄ投与群（664 ± 14 cells/mm2）と比較して、残存する網膜神経節細胞数が有意に増加していた（図５）。ｐ＜０．０１(one-tailed Student’s t test)である。
【0080】
＝視神経再生＝
視神経挫滅１４日後にＣＴＢでラベルされた再生軸索を計測した結果、ＡＡＶ-ＣＡ-ＴｒｋＢ投与群ではＡＡＶ-ＤｓＲｅｄ投与群と比較して、再生軸索数及び伸長距離の両面において、顕著な改善が認められた（図６）。なお、図６に示すグラフのＸ軸は視神経挫滅部位からの距離（μｍ）、Ｙ軸は軸索数を指す。ｐ＜０．０５(one-tailed Student’s t test)である。
視神経挫滅１４日後にＣＴＢでラベルされた再生軸索を計測した結果、ＡＡＶ-ＣＡ-ＴｒｋＢ投与群ではＡＡＶ-ＤｓＲｅｄ投与群と比較して、再生軸索数及び伸長距離の両面において、顕著な改善が認められた（図６）。なお、図６に示すグラフのＸ軸は視神経挫滅部位からの距離（μｍ）、Ｙ軸は軸索数を指す。ｐ＜０．０５(one-tailed Student’s t test)である。
【0081】
〔実施例３〕 ＣＡ-ＴｒｋＢによる網膜神経節細胞の保護作用（緑内障モデルマウス）
（方法）
緑内障モデルマウスであるＧＬＡＳＴノックアウトマウス（参考論文：Harada T, et al. The potential role of glutamate transporters in the pathogenesis of normal tension glaucoma. The Journal of Clinical Investigation 117: 1763-1770, 2007.）は、３-５週齢にかけて網膜神経節細胞が消失して視機能低下を引き起こす。１０日齢のＧＬＡＳＴノックアウトマウスに、ＡＡＶ－ＤｓＲｅｄ（対照群）またはＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢを、眼球内に１μＬ投与した（実施例２も参照）。次いで、１２週齢に達したこれらノックアウトマウスの網膜の展開標本を作成し、残存する網膜神経節細胞の数をカウントした。網膜神経節細胞の検出にはＲＢＰＭＳ抗体（Merck Millipore社製のanti-RBPMS antibody）による免疫染色を用いた。ＲＢＰＭＳは、網膜神経節細胞のマーカーである。
（方法）
緑内障モデルマウスであるＧＬＡＳＴノックアウトマウス（参考論文：Harada T, et al. The potential role of glutamate transporters in the pathogenesis of normal tension glaucoma. The Journal of Clinical Investigation 117: 1763-1770, 2007.）は、３-５週齢にかけて網膜神経節細胞が消失して視機能低下を引き起こす。１０日齢のＧＬＡＳＴノックアウトマウスに、ＡＡＶ－ＤｓＲｅｄ（対照群）またはＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢを、眼球内に１μＬ投与した（実施例２も参照）。次いで、１２週齢に達したこれらノックアウトマウスの網膜の展開標本を作成し、残存する網膜神経節細胞の数をカウントした。網膜神経節細胞の検出にはＲＢＰＭＳ抗体（Merck Millipore社製のanti-RBPMS antibody）による免疫染色を用いた。ＲＢＰＭＳは、網膜神経節細胞のマーカーである。
【0082】
（結果）
図７に示すように、ＡＡＶ-ＣＡ-ＴｒｋＢ投与群では、対照群と比較して、残存する網膜神経節細胞数が有意に増加していた。P＜０．０５(one-tailed Student’s t test)である。
図７に示すように、ＡＡＶ-ＣＡ-ＴｒｋＢ投与群では、対照群と比較して、残存する網膜神経節細胞数が有意に増加していた。P＜０．０５(one-tailed Student’s t test)である。
【0083】
〔実施例４〕
（方法）
次に、ＣＡ-ＴｒｋＢの以下の変異体（図８も参照）を発現するベクターを用いて、シグナル伝達の活性を検討した。
・「Ｃｙｔｏ－ＴｒｋＢ」ベクター：ＴｒｋＢの細胞内領域のＮ末端にｍｙｃ－タグを付加したタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、実施例１のＡＡＶベクターに組み込んだもの。実施例１のＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢと比較して、ＴｒｋＢの細胞内領域のＣ末端にファルネシル化シグナル配列を付加していない点のみが異なる。
・「ＫＤ－ＴｒｋＢ」ベクター：実施例１のＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢと比較して、コードするタンパク質が、ＴｒｋＢの細胞内領域に、そのキナーゼ活性を消失させる１アミノ酸変異（１３４番目のアミノ酸がリジンからアスパラギンに変異）が生じている点のみが異なる。
・「ｉＳＨ－ＴｒｋＢ」ベクター：実施例１のＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢと比較して、コードするタンパク質が、ＴｒｋＢの細胞内領域のＮ末端とｍｙｃ－タグとの間に、さらにｐ８５のＳＨ２配列を挿入したものである点のみで異なる。なお、ＳＨ２配列は、ＰＩ３Ｋの構成因子ｐ１１０と複合体を形成するために必要な配列である。ｉＳＨ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片（ＡＡＶベクターへ挿入した遺伝子断片の全長）の塩基配列を配列番号５、及び図１０として示す。
（方法）
次に、ＣＡ-ＴｒｋＢの以下の変異体（図８も参照）を発現するベクターを用いて、シグナル伝達の活性を検討した。
・「Ｃｙｔｏ－ＴｒｋＢ」ベクター：ＴｒｋＢの細胞内領域のＮ末端にｍｙｃ－タグを付加したタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、実施例１のＡＡＶベクターに組み込んだもの。実施例１のＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢと比較して、ＴｒｋＢの細胞内領域のＣ末端にファルネシル化シグナル配列を付加していない点のみが異なる。
・「ＫＤ－ＴｒｋＢ」ベクター：実施例１のＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢと比較して、コードするタンパク質が、ＴｒｋＢの細胞内領域に、そのキナーゼ活性を消失させる１アミノ酸変異（１３４番目のアミノ酸がリジンからアスパラギンに変異）が生じている点のみが異なる。
・「ｉＳＨ－ＴｒｋＢ」ベクター：実施例１のＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢと比較して、コードするタンパク質が、ＴｒｋＢの細胞内領域のＮ末端とｍｙｃ－タグとの間に、さらにｐ８５のＳＨ２配列を挿入したものである点のみで異なる。なお、ＳＨ２配列は、ＰＩ３Ｋの構成因子ｐ１１０と複合体を形成するために必要な配列である。ｉＳＨ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片（ＡＡＶベクターへ挿入した遺伝子断片の全長）の塩基配列を配列番号５、及び図１０として示す。
【0084】
次いで、実施例１と同様にして、これらのベクターをＣｏｓ７細胞へトランスフェクションして、２４時間の培養の後に細胞を溶解し、ＥＲＫおよびＡＫＴの活性化への影響をウエスタンブロット法にて検討した。
【0085】
（結果）
図８に示すように、「Ｃｙｔｏ－ＴｒｋＢ」ベクターおよび「ＫＤ－ＴｒｋＢ」ベクターをトランスフェクションした場合は、ｐＥＲＫおよびｐＡＫＴの増大が見られず、両シグナルの活性化は認められないことが判明した。一方、「ｉＳＨ－ＴｒｋＢ」ベクターをトランスフェクションした場合は、ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢをトランスフェクションした場合（図中ではＣＡ－ＴｒｋＢと表示）と比較してＡＫＴ活性が顕著に増加する傾向を認めた。なお、図８中のコントロールは、実施例１のコントロールと同じものである。
図８に示すように、「Ｃｙｔｏ－ＴｒｋＢ」ベクターおよび「ＫＤ－ＴｒｋＢ」ベクターをトランスフェクションした場合は、ｐＥＲＫおよびｐＡＫＴの増大が見られず、両シグナルの活性化は認められないことが判明した。一方、「ｉＳＨ－ＴｒｋＢ」ベクターをトランスフェクションした場合は、ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＢをトランスフェクションした場合（図中ではＣＡ－ＴｒｋＢと表示）と比較してＡＫＴ活性が顕著に増加する傾向を認めた。なお、図８中のコントロールは、実施例１のコントロールと同じものである。
【0086】
〔実施例５〕常時活性型ＴｒｋＡベクター及び常時活性型ＴｒｋＣベクターの作成
（方法）
ＴｒｋＡ分子の細胞内領域を発現するＡＡＶベクター（ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＡと称する）を、実施例１の方法に従って作製した。すなわち、ＴｒｋＢの細胞内領域に代えてＴｒｋＡの細胞内領域をコードする点以外はＣＡ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片（実施例１参照）と同じ構造を持つ断片を用いて、実施例１に記載の方法に従いＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＡを作製した（図９も参照）。
ＴｒｋＡの細胞内領域のアミノ酸配列を配列番号６、ＴｒｋＡの細胞内領域をコードする遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を配列番号７として示す。また、ＣＡ－ＴｒｋＡをコードする遺伝子断片（ＡＡＶベクターへ挿入した遺伝子断片の全長）の塩基配列を配列番号８、及び図１１として示す。
（方法）
ＴｒｋＡ分子の細胞内領域を発現するＡＡＶベクター（ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＡと称する）を、実施例１の方法に従って作製した。すなわち、ＴｒｋＢの細胞内領域に代えてＴｒｋＡの細胞内領域をコードする点以外はＣＡ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片（実施例１参照）と同じ構造を持つ断片を用いて、実施例１に記載の方法に従いＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＡを作製した（図９も参照）。
ＴｒｋＡの細胞内領域のアミノ酸配列を配列番号６、ＴｒｋＡの細胞内領域をコードする遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を配列番号７として示す。また、ＣＡ－ＴｒｋＡをコードする遺伝子断片（ＡＡＶベクターへ挿入した遺伝子断片の全長）の塩基配列を配列番号８、及び図１１として示す。
【0087】
同様に、ＴｒｋＣ分子の細胞内領域を発現するＡＡＶベクター（ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＣと称する）を、実施例１の方法に従って作製した。すなわち、ＴｒｋＢの細胞内領域に代えてＴｒｋＣの細胞内領域をコードする点以外はＣＡ－ＴｒｋＢをコードする遺伝子断片（実施例１参照）と同じ構造を持つ断片を用いて、実施例１に記載の方法に従いＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＣを作製した（図９も参照）。
ＴｒｋＣの細胞内領域のアミノ酸配列を配列番号９、ＴｒｋＣの細胞内領域をコードする遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を配列番号１０として示す。また、ＣＡ－ＴｒｋＣをコードする遺伝子断片（ＡＡＶベクターへ挿入した遺伝子断片の全長）の塩基配列を配列番号１１、及び図１２として示す。
ＴｒｋＣの細胞内領域のアミノ酸配列を配列番号９、ＴｒｋＣの細胞内領域をコードする遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を配列番号１０として示す。また、ＣＡ－ＴｒｋＣをコードする遺伝子断片（ＡＡＶベクターへ挿入した遺伝子断片の全長）の塩基配列を配列番号１１、及び図１２として示す。
【0088】
次いで、実施例１と同様にして、これらのベクターをＣｏｓ７細胞へトランスフェクションして、２４時間の培養の後に細胞を溶解し、ＴｒｋＢのホモログであるＴｒｋＡおよびＴｒｋＣに関して、ＥＲＫおよびＡＫＴの活性化への影響をウエスタンブロット法にて検討した。
【0089】
（結果）
図９に示すように、ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＡおよびＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＣをトランスフェクションした場合は、ｐＥＲＫおよびｐＡＫＴが増大しており、両シグナルが活性化していることが認められた。なお、図９中のコントロールは、実施例１のコントロールと同じものである。
図９に示すように、ＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＡおよびＡＡＶ－ＣＡ－ＴｒｋＣをトランスフェクションした場合は、ｐＥＲＫおよびｐＡＫＴが増大しており、両シグナルが活性化していることが認められた。なお、図９中のコントロールは、実施例１のコントロールと同じものである。
【0090】
〔実施例６〕 ＣＡ-ＴｒｋＢによる視機能の回復作用（視神経挫滅モデルマウス）
（方法）
成熟マウスに対して、実施例２の方法に従ってＡＡＶ-ＣＡ-ＴｒｋＢ投与群を得た。その１４日後に視神経を挫滅し、挫滅の１４日後および２８日後に、脳の上丘に電極ポートを手術的に取り付け、フラッシュ刺激による視覚誘発電位（F-VEP：Flash-Visual Evoked Potential）を測定した。
（方法）
成熟マウスに対して、実施例２の方法に従ってＡＡＶ-ＣＡ-ＴｒｋＢ投与群を得た。その１４日後に視神経を挫滅し、挫滅の１４日後および２８日後に、脳の上丘に電極ポートを手術的に取り付け、フラッシュ刺激による視覚誘発電位（F-VEP：Flash-Visual Evoked Potential）を測定した。
【0091】
（結果）
図１３に示すように、挫滅２週間後では、視覚誘発電位の反応が消失したが、挫滅４週間後では視覚誘発電位の発生が見られ、視機能の部分的な回復が確認された。
図１３に示すように、挫滅２週間後では、視覚誘発電位の反応が消失したが、挫滅４週間後では視覚誘発電位の発生が見られ、視機能の部分的な回復が確認された。
【産業上の利用可能性】
【0092】
本発明は、例えば、神経関連疾患等を対象とする医療用途に利用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】