特許 7524210 ＣＤ２８ Ｔ細胞培養物、組成、およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-19

(45)【発行日】2024-07-29

(54)【発明の名称】ＣＤ２８ Ｔ細胞培養物、組成、およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20240722BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240722BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240722BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240722BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240722BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240722BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17

A61P35/00

A61P35/02

A61K35/76

C12N5/10 ZNA

C12N5/0783

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2021556499

(86)(22)【出願日】2020-03-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-05-24

(86)【国際出願番号】 US2020023585

(87)【国際公開番号】W WO2020191172

(87)【国際公開日】2020-09-24

【審査請求日】2023-03-17

(31)【優先権主張番号】102019108125.4

(32)【優先日】2019-03-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE

(31)【優先権主張番号】62/820,442

(32)【優先日】2019-03-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520184664

【氏名又は名称】イマティクス ユーエス，アイエヌシー．

(74)【代理人】

【識別番号】100088904

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100124453

【弁理士】

【氏名又は名称】資延 由利子

(74)【代理人】

【識別番号】100135208

【弁理士】

【氏名又は名称】大杉 卓也

(74)【代理人】

【識別番号】100163544

【弁理士】

【氏名又は名称】平田 緑

(74)【代理人】

【識別番号】100183656

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 晃

(74)【代理人】

【識別番号】100224786

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 卓之

(74)【代理人】

【識別番号】100225015

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 彩夏

(72)【発明者】

【氏名】アルパート，アミール

(72)【発明者】

【氏名】カルラ，マムタ

【審査官】佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５１４５１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／０９９７１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表平０８－５１１１６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５３１５８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５１３８９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許第０６９０５６８０（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】Neurol. Med. Chir.，1992年，Vol.32，pp.255-261

【文献】Weng NP. et al.，CD28(-) T cells: their role in the age-associated decline of immune function，Trends immunol.，2009年，Vol.30, No.7 ，pp.306-312，Author Manuscript: avalable in PMC 2010.01.05

【文献】Kasakovski D. et al.，T cell senescence and CAR-T cell exhaustion in hematological malignancies，Journal of hematology & oncology，2018年，Vol.11, No.1, Article No.91，pp.1-9

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８

Ｃ１２Ｎ ５／００－ ５／２８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

患者またはドナーから得られた開始末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を判定するステップ、および
前記判定された開始ＰＢＭＣが、少なくとも約５０％のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなるという条件で、前記判定された開始ＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で活性化するステップ、または
前記判定された開始ＰＢＭＣが、約５０％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなるという条件で、前記判定された開始ＰＢＭＣを抗ＣＤ２８抗体の非存在下において抗ＣＤ３抗体で活性化するステップ
を含んでなる、養子免疫療法のための有効性が改善されたＴ細胞を作製する方法。

【請求項2】

前記判定された開始ＰＢＭＣが、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなるという条件で、前記判定された開始ＰＢＭＣが、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で活性化される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記判定された開始ＰＢＭＣが、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなるという条件で、前記判定された開始ＰＢＭＣが、抗ＣＤ２８抗体の非存在下において抗ＣＤ３抗体で活性化される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記活性化開始ＰＢＭＣからのＴ細胞をウイルスベクターで形質導入するステップと、前記形質導入Ｔ細胞を増殖させるステップとをさらに含んでなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記形質導入するステップおよび前記増殖させるステップが、少なくとも１つのサイトカインの存在下で実行される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記少なくとも１つのサイトカインが、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１から選択される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を含んでなる、請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＩＬ－７の濃度が、約１ｎｇ／ｍｌ～９０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～７０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～６０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約４ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約６ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌである、請求項６または７に記載の方法。

【請求項9】

前記ＩＬ－１５の濃度が、約５ｎｇ／ｍｌ～５００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～４００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～３００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、または約４０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌである、請求項６～８のいずれか１つに記載の方法。

【請求項10】

前記形質導入が、約１時間～１２０時間、約１時間～１０８時間、約１時間～９６時間、約１時間～７２時間、約１時間～４８時間、約１時間～３６時間、約１時間～２４時間、約２時間～２４時間、約４時間～２４時間、約６時間～２４時間、約８時間～２４時間、約１０時間～２４時間、約１２時間～２４時間、約１４時間～２４時間、約１６時間～２４時間、約１８時間～２４時間、約２０時間～２４時間、または約２２時間～２４時間の期間内に実行される、請求項４～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記ウイルスベクターが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するレトロウイルスベクターである、請求項４～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ウイルスベクターが、ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターである、請求項４～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記増殖するステップが、約１日～約３０日、約１日～約２５日、約１日～約２０日、約１日～約１５日、約１日～約１０日、約２日～約１０日、約３日～約１０日、約４日～約１０日、約５日～約１０日、約６日～約１０日、約７日～約１０日、約８日～約１０日、または約９日～約１０日の期間内に実行される、請求項４～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記活性化するステップが、固相支持体上に前記抗ＣＤ３抗体および／または前記抗ＣＤ２８抗体で前記Ｔ細胞を固定化するステップを含んでなる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記抗ＣＤ３抗体および前記抗ＣＤ２８抗体がそれぞれ、約０．１μｇ／ｍｌ～約１０．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約８．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約６．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約４．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約２．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約１．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約０．８μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約０．６μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約０．５μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約０．２５μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ～約０．５μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ～約０．３μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ～約０．５μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ～約０．４μｇ／ｍｌ、または約０．４μｇ／ｍｌ～約０．５μｇ／ｍｌの濃度を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記活性化するステップが、約１時間～約１２０時間、約１時間～約１０８時間、約１時間～約９６時間、約１時間～約８４時間、約１時間～約７２時間、約１時間～約６０時間、約１時間～約４８時間、約１時間～約３６時間、約１時間～約２４時間、約２時間～約２４時間、約４時間～約２４時間、約６時間～約２４時間、約８時間～約２４時間、約１０時間～約２４時間、約１２時間～約２４時間、約１２時間～約７２時間、約２４時間～約７２時間、約６時間～約４８時間、約２４時間～約４８時間、約６時間～約７２時間、または約１時間～約１２時間の期間内に実行される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

１．分野
本開示は、Ｔ細胞の有効性を改善する方法を提供する。一態様では、本開示は、最終倍数増殖、ＣＤ８：ＣＤ４ Ｔ細胞比、相対的最終テロメア長、およびＴ細胞製品のクローン濃度を強化および予測する方法をさらに提供する。本開示は、それを必要とする対象においてがんを治療する方法、ならびに本明細書に記載される方法によって生産されるＴ細胞集団もまた提供する。

【背景技術】

【0002】

２．背景
免疫療法は、がんを治療するための非常に有望なアプローチとしてとして現れた。免疫療法は、細胞療法と低分子／抗体療法とに細分化され得る。細胞療法の分野では、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞療法が液体腫瘍において強力な臨床的有効性を示しており、Ｔ細胞受容体Ｔ（ＴＣＲ－Ｔ）細胞ベースの治療法は、様々な固形腫瘍の適応症において有望な初期結果を示している。臨床製品の有効性は、それらの生体内特性によって駆動されてもよく、これは生体外製造プロセス中に大きく刷り込まれてもよい。

【0003】

米国特許第８，３８３，０９９号明細書は、例えば、自己由来Ｔ細胞を培養することによって；ＯＫＴ３抗体、ＩＬ－２、およびフィーダーリンパ球を使用して培養Ｔ細胞を増殖させることによって、対象におけるがんの退行を促進する方法を記載する。

【0004】

米国特許第９，０７４，１８５号明細書は、自己由来Ｔ細胞を培養するステップと、培養Ｔ細胞をＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮するステップと、ＯＫＴ３抗体、ＩＬ－２、フィーダーリンパ球を用いて培養Ｔ細胞数の増殖を提供するステップとを含む、対象におけるがんの退行を促進するためのＴ細胞注入製品を生成する方法を記載する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

がん患者におけるＴ細胞の有効性およびＡＣＴの予後を改善する必要性がなおもある。この技術的問題の解決策は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態によって提供される。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、例えば、以下を含む、改善された効力を有するＴ細胞を産生するための方法を提供する：
●患者またはドナーからＴ細胞の集団を得るステップ、
●得られたＴ細胞集団におけるＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率をは判定するステップ、
●判定されたＴ細胞集団を抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体で活性化するステップ、
●ここで判定された集団は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなる。

【0007】

本開示は、例えば、以下を含む、改善された効力を有するＴ細胞を産生するための方法をさらに提供する：
●患者またはドナーからＴ細胞の集団を得るステップ、
●得られたＴ細胞集団におけるＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を判定するステップ、
●判定されたＴ細胞集団を抗ＣＤ２８抗体の非存在下において抗ＣＤ３抗体で活性化するステップ、
●ここで判定された集団は、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなる。

【0008】

本開示は、例えば、以下を含む、改善された効力を有するＴ細胞を産生するための生体外方法をさらに提供する：
●単離Ｔ細胞集団中で、ＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を判定するステップ、
●判定されたＴ細胞集団を抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体で活性化するステップ、
●ただし判定された集団は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなる。

【0009】

本開示は、例えば、以下を含む、改善された効力を有するＴ細胞を産生するための生体外方法をさらに提供する：
●単離Ｔ細胞集団中で、ＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を判定するステップ、
●判定されたＴ細胞集団を抗ＣＤ２８抗体の非存在下において抗ＣＤ３抗体で活性化するステップ、
●ただし判定された集団は、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなる。

【0010】

一態様では、活性化Ｔ細胞集団はウイルスベクターで形質導入され、形質導入Ｔ細胞集団は増殖される。さらなる態様では、形質導入および増殖は、少なくとも１つのサイトカインの存在下で実行されてもよい。

【0011】

別の態様では、本開示は、以下を含む免疫療法の有効性が改善されたＴ細胞を産生するための方法に関する：
●患者またはドナーからＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を得るステップ、
●得られた集団中のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を判定するステップ、
●判定された集団を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で活性化するステップ、
●ここで判定された集団は、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなり、
●活性化Ｔ細胞集団をウイルスベクターで形質導入するステップ、
●形質導入Ｔ細胞集団を増殖させるステップ。

【0012】

別の態様では、本開示は、以下を含む免疫療法の有効性が改善されたＴ細胞を産生するための生体外方法に関する：
●単離ＣＤ８＋Ｔ細胞集団中で、ＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を判定するステップ、
●判定された集団を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で活性化するステップ、
●ただし判定された集団は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなり、
●活性化Ｔ細胞集団をウイルスベクターで形質導入するステップ、
●形質導入Ｔ細胞集団を増殖させるステップ。

【0013】

別の態様では、本開示は、以下を含む免疫療法の有効性が改善されたＴ細胞を産生するための方法に関する：
●患者またはドナーからＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を得るステップ、
●得られた集団中のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を判定するステップ、
●判定された集団が、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなるという条件で、判定された集団を抗ＣＤ２８抗体の非存在下において抗ＣＤ３抗体で活性化するステップ、
●活性化Ｔ細胞集団をウイルスベクターで形質導入するステップ、
●形質導入Ｔ細胞集団を増殖させるステップ。

【0014】

別の態様では、本開示は、以下を含む免疫療法の有効性が改善されたＴ細胞を産生するための生体外方法に関する：
●単離ＣＤ８＋Ｔ細胞集団中で、ＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を判定するステップ、
●判定された集団が、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなるという条件で、判定された集団を抗ＣＤ２８抗体の非存在下において抗ＣＤ３抗体で活性化するステップ、
●活性化Ｔ細胞集団をウイルスベクターで形質導入するステップ、
●形質導入Ｔ細胞集団を増殖させるステップ。

【0015】

別の態様では、形質導入および増殖は、少なくとも１つのサイトカインの存在下で実行されてもよい。

【0016】

別の態様では、活性化は、Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で固相支持体上に固定化することを含んでもよい。

【0017】

別の態様では、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体は、それぞれ約０．１μｇ／ｍｌ～約１０．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約８．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約６．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約４．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約２．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約１．０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ～約０．５μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ～約１０．０μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ～約７μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ～約２．０μｇ／ｍｌ、または約０．５μｇ／ｍｌ～約２．５μｇ／ｍｌの濃度を有する。

【0018】

別の態様では、活性化は、約１時間～約１２０時間、約１時間～約１０８時間、約１時間～約９６時間、約１時間～約８４時間、約１時間～約７２時間、約１時間～約６０時間、約１時間～約４８時間、約１時間～約３６時間、約１時間～約２４時間、約２時間～約２４時間、約４時間～約２４時間、約６時間～約２４時間、約８時間～約２４時間、約１０時間～約２４時間、約１２時間～約２４時間、約１２時間～約７２時間、約２４時間～約７２時間、約６時間～約４８時間、約２４時間～約４８時間、約６時間～約７２時間、または約１時間～約１２時間の期間内に実行されてもよい。

【0019】

別の態様では、少なくとも１つのサイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはそれらの組み合わせから選択されてもよい。

【0020】

別の態様では、少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－７とＩＬ－１５との組み合わせを含む。

【0021】

別の態様では、ＩＬ－７の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～９０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～８０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～７０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～６０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～１５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約４ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、約６ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌである。

【0022】

別の態様では、ＩＬ－１５の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ～５００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～４００ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ～３００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ、または約２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌであってもよい。

【0023】

別の態様では、形質導入は、約１時間～１２０時間、約１２時間～９６時間、約２４時間～９６時間、約２４時間～７２時間、約１０時間～４８時間、約１時間～３６時間、約１時間～２４時間、約２時間～２４時間、約４時間～２４時間、約６時間～２４時間、約８時間～２４時間、約１０時間～２４時間、約１時間～１２時間、約１４時間～２４時間、約１時間～１２時間、約６～約１８時間の期間内に実行されてもよい。

【0024】

別の態様では、ウイルスベクターは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するレトロウイルスベクターであってもよい。

【0025】

別の態様では、ウイルスベクターは、ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターであってもよい。

【0026】

別の態様では、増殖は、約１日～約３０日、約５～約３０日、約１日～約２５日、約２日～約２０日、約５日～約１５日、約２日～約１０日、約３日～約１５日、約３日～約２０日、約４日～約１０日、約５日～約１０日、約６日～約１０日、約７日～約２５日、約８日～約２５日、または約９日～約１２日の期間内に実行されてもよい。

【0027】

一態様では、本開示は、例えば、患者またはドナーからＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を得るステップと、得られた集団からＴ細胞ＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するステップと、単離細胞を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で活性化するステップと、活性化集団をウイルスベクターで形質導入するステップと、形質導入および増殖が少なくとも１つのサイトカインの存在下で実行されてもよい、形質導入された集団を増殖させるステップとを含み、単離細胞が、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する、養子免疫療法のための改善された効力を有するＴ細胞を産生するための方法に関する。

【0028】

別の態様では、本開示は、本開示の方法によって産生されたＴ細胞に関する。

【0029】

さらなる態様では、本開示は、本開示の方法から入手可能なＴ細胞、好ましくはＴ細胞集団、より好ましくは遺伝的形質導入Ｔ細胞に関する。本開示のさらなる態様では、Ｔ細胞、好ましくはＴ細胞集団、より好ましくは遺伝的形質導入Ｔ細胞は、本開示の方法から直接得られる。

【0030】

一態様では、本明細書に記載の方法によって提供される、少なくとも約５０％のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する遺伝的形質導入Ｔ細胞は、約５０％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなる判定された集団から生成されたものよりも少なくとも約１．２倍高く、少なくとも約１．５倍高く、少なくとも約２倍高く、少なくとも約２．５倍高く、少なくとも約３倍高く、少なくとも約３．５倍高く、少なくとも約４倍高く、少なくとも約４．５倍高く、または少なくとも約５倍高い倍数増殖を示してもよい。

【0031】

一態様では、本明細書に記載の方法によって提供される、少なくとも約５０％のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する遺伝的形質導入Ｔ細胞は、約５０％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなる判定された集団から生成されたものよりも少なくとも約１．２倍高く、少なくとも約１．５倍高く、少なくとも約２倍高く、少なくとも約２．５倍高く、少なくとも約３倍高く、少なくとも約３．５倍高く、少なくとも約４倍高く、少なくとも約４．５倍高く、または少なくとも約５倍高いＣＤ８：ＣＤ４ Ｔ細胞比を示してもよい。

【0032】

一態様では、本明細書に記載の方法によって提供される、少なくとも約５０％のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する遺伝的形質導入Ｔ細胞は、約５０％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなる判定された集団から生成されたものよりも少なくとも約１．２倍長く、少なくとも約１．５倍長く、少なくとも約２倍長く、少なくとも約２．５倍長く、少なくとも約３倍長く、少なくとも約３．５倍長く、少なくとも約４倍長く、少なくとも約４．５倍長く、または少なくとも約５倍長いテロメア長を示してもよい。

【0033】

一態様では、本明細書に記載の方法によって提供される、少なくとも約５０％のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する遺伝的形質導入Ｔ細胞は、約５０％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなる判定された集団から生成されたものよりも少なくとも約１．２倍高く、少なくとも約１．５倍高く、少なくとも約２倍高く、少なくとも約２．５倍高く、少なくとも約３倍高く、少なくとも約３．５倍高く、少なくとも約４倍高く、少なくとも約４．５倍高く、または少なくとも約５倍高いクローン濃度を示してもよい。

【0034】

別の態様では、本明細書に記載の方法によって生成された遺伝的形質導入Ｔ細胞は、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する判定された集団から産生されたＴ細胞と比較して、より高い倍数増殖、より高いＣＤ８：ＣＤ４ Ｔ細胞比、より長いテロメア長、および／またはより高いクローン濃度の１つまたは複数を示す。

【0035】

なおも別の態様では、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する判定された集団から選択された遺伝的形質導入Ｔ細胞は、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する判定された集団から生成されたＴ細胞と比較して、より高い倍数増殖、より高いＣＤ８：ＣＤ４ Ｔ細胞比、より長いテロメア長、および／またはより高いクローン濃度の１つまたは複数を示す。

【0036】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載された方法によって入手可能な遺伝的形質導入Ｔ細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる、例えば、医薬組成物などの組成物に関する。一態様では、本開示は、前述の態様のいずれか１つの方法によって生成された治療有効量のＴ細胞を患者に投与するステップを含む、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん腫（ＲＣＣ）、無害である前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、および子宮がん（ＵＥＣ）からなる群から選択されるがんを有する患者を治療する方法に関する。

【0037】

さらなる態様では、本開示は、薬剤として使用するための、前述の態様のいずれか１つの方法によって入手可能な遺伝的形質導入Ｔ細胞を含んでなる、例えば、医薬組成物などの組成物を指す。

【0038】

さらなる態様では、本開示は、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん腫（ＲＣＣ）、無害である前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、および子宮がん（ＵＥＣ）からなる群から選択されるがんの治療において使用するための、前述の態様のいずれか１つの方法によって入手可能な遺伝的形質導入Ｔ細胞を含んでなる、例えば、医薬組成物などの組成物に言及する。

【0039】

さらなる態様では、本開示は、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん腫（ＲＣＣ）、無害である前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、および子宮がん（ＵＥＣ）からなる群から選択されるがんの治療のための、前述の態様のいずれか１つの方法によって入手可能な遺伝的形質導入Ｔ細胞を含んでなる、例えば、医薬組成物などの組成物の使用に言及する。

【0040】

さらなる態様では、本開示は、患者からＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を得るステップと、得られた集団中のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を判定するステップと、判定された集団が、少なくとも約５０％のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなるという条件で、判定された集団を抗ＣＤ３抗体抗ＣＤ２８抗体で活性化するステップと、または判定された集団が、約５０％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなるという条件で、判定された集団を抗ＣＤ２８抗体の非存在下において抗ＣＤ３抗体で活性化するステップと、活性化Ｔ細胞集団をウイルスベクターで形質導入するステップと、形質導入Ｔ細胞集団を増殖させるステップと、および増殖Ｔ細胞集団を患者に投与するステップとを含み、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん腫（ＲＣＣ）、無害である前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、および子宮がん（ＵＥＣ）からなる群から選択されるがんを有する患者を治療する方法に言及する。

【0041】

さらなる態様では、本開示は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子とのペプチド複合体へのＴＣＲ結合に言及し、その中ではペプチドは、配列番号１～１５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。

【0042】

別の態様では、ウイルスベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するレトロウイルスベクターであってもよい。

【0043】

別の態様では、ウイルスベクターは、ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターであってもよい。

【0044】

別の態様では、ＣＡＲはＣＤ１９ ＣＡＲであってもよい。

【0045】

さらなる態様では、本開示は、患者からＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を得るステップと、得られた集団中のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を判定するステップと、判定された集団が、少なくとも約５０％のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなるという条件で、判定された集団を抗ＣＤ３抗体抗ＣＤ２８抗体で活性化するステップと、または判定された集団が、約５０％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含んでなるという条件で、判定された集団を抗ＣＤ２８抗体の非存在下において抗ＣＤ３抗体で活性化するステップと、活性化Ｔ細胞集団をウイルスベクターで形質導入するステップと、形質導入Ｔ細胞集団を増殖させるステップと、増殖Ｔ細胞集団の倍数増殖を判定するステップと、倍数増殖が１０倍を超えるという条件で、増殖Ｔ細胞集団を患者に投与するステップとを含んでなる、肝細胞がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、神経膠芽腫（ＧＢ）、胃がん（ＧＣ）、食道がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、膵臓がん（ＰＣ）、腎細胞がん腫（ＲＣＣ）、無害である前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺がん（ＰＣＡ）、卵巣がん（ＯＣ）、黒色腫、乳がん、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、メルケル細胞がん（ＭＣＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、胆嚢がんおよび胆管がん（ＧＢＣ、ＣＣＣ）、膀胱がん（ＵＢＣ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、および子宮がん（ＵＥＣ）からなる群から選択されるがんを有する患者を治療する方法に言及する。

【0046】

さらなる態様では、倍数増殖は、約２～約５０倍、約５～約５０倍、約１０～約５０、約２～約３０倍、約１０～約２０倍、約２～約２５倍、約５～約２５倍、約７～約２０倍、約２～約１０倍、約２～約５倍であってもよい。別の態様では、倍数増殖は、２倍を超え、３倍を超え、４倍を超え、５倍を超え、８倍を超え、１０倍を超え、または２０倍を超えてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0047】

本開示の性質、目的、および利点のさらなる理解のために、同様の参照番号が同様の要素を示す以下の図面と併せて読まれる、以下の詳細な説明を参照すべきである。

【0048】

【図1】図１Ａ：本開示の一実施形態に従った、大きな年齢差にわたる健常人ＰＢＭＣのＣＤ８コンパートメント内のＣＤ２８発現の百分率を示す。ドナーは、ＣＤ２８発現についてフローサイトメトリーによって分析された。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７の線形回帰によって判定されたように、線形相関（Ｒ^２＝０．７１２４）が、ＣＤ８ Ｔ細胞中の開始ＣＤ２８の間に観察された。図１Ｂ：本開示の一実施形態に従った、７日間の製造の終了時における、ＣＤ３コンパートメント、すなわち、ＣＤ８陽性およびＣＤ４陽性コンパートメント内のＣＤ８陽性細胞の最終百分率を示す。開始ＣＤ２８百分率および最終ＣＤ８百分率は、フローサイトメトリーによって計算された。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７の線形回帰によって判定されたように、ＣＤ２８の開始百分率と最終ＣＤ８％の間には、０．８１２１のＲ^２の相関がある。図１Ｃ：本開示の一実施形態に従って、７日目までに達成された倍数増殖を示す。開始ＣＤ２８百分率は、フローサイトメトリーによって計算された。形質導入の日から培養期間の７日目までの総倍数増殖が計算された。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７の線形回帰によって判定されたように、ＣＤ２８の開始百分率と最終倍数増殖の間には、０．８５７９のＲ^２の相関がある。図１Ｄ：本開示の一実施形態に従ったフローサイトメトリーによって測定された、最終テロメア長を示す。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７の線形回帰によって判定されたように、ＣＤ２８の開始百分率と最終テロメア長の間には、０．９５８１のＲ^２の相関がある。

【図2】本開示の一実施形態に従った、Ｔ細胞増殖動態の特性評価を示す。３人の健常ドナーのうち、例えば、９３．４％などのより高い（Ｈｉ）ＰＢＭＣのＣＤ８コンパートメント中のＣＤ２８発現を有するドナーは、例えば、５４．３％などの中程度の（Ｍｉｄ）、および例えば、３１．１％などの低い（Ｌｏｗ）ＰＢＭＣのＣＤ８コンパートメント中のＣＤ２８発現ドナーと比較して、４日目の細胞数対２日目の細胞数（ＣＤ３／ＣＤ２８による活性化の２日後）によって定義されるように、初期増殖を受け得るより多くのＴ細胞クローンを含有する。

【図3】本開示の一実施形態に従った、クローンの縮小および増殖が、開始ＣＤ２８百分率と相関することを示す。３人の健常ドナーから、単一分子ＤＮＡ配列決定が実行され、個々のＴ細胞クローンが経時的に追跡された。差次的に豊富な百分率は、活性化後と比較して、評価可能なＴ細胞クローンの総数の増殖または縮小のいずれかである、増殖の１０日目までの全てのＴ細胞クローンの割合を表す。ＣＤ２８発現細胞の百分率は、開始ＰＢＭＣからのフローサイトメトリーによって計算された。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７の線形回帰によって判定されたように、ＣＤ２８の開始百分率と差次的に豊富な百分率の間には、０．９７２６のＲ^２の相関がある。

【図4】本開示の一実施形態に従った、負のクローン分裂を伴うＴ細胞増殖の遅延を示す低ＣＤ２８発現ドナーを示す。集団増殖は、総生細胞に基づいて計算されてもよく、増殖倍数を表してもよい。クローン分裂はｌｏｇ２（クローン倍数増殖）として計算され、得られた中央値に相当し、負の値、すなわち破線より下の値は、培養中でクローン頻度が縮小したときに得られる一方で、正の値、すなわち破線より上は、培養中でクローン頻度が拡大したときに得られる。全ての点は、活性化後ベースラインとの比較であり、Ｔ細胞増殖プロセスの４日目まで計算された。

【図5】本開示の別の実施形態に従った、Ｔ細胞増殖動態の特性評価を示す。Ｔ細胞クローンは、各Ｔ細胞クローンのｌｏｇ_２（増殖倍数）によって推定された、それらが受けた分裂回数に基づいてビニングされた。初期、中期、および後期の増殖は、製造プロセスの４、７、および１０日目に対応する。インサートには、その時点での細胞の総数（Ｔｏｔ）と共に、中央値（Ｍｅｄ）および平均値（Ａｖｇ）のクローン分裂が含まれる。

【図6】本開示の別の実施形態に従った、Ｔ細胞増殖動態の特性評価を示す。１億個の細胞に到達するために必要な分裂回数は、後期増殖時点までの平均分裂回数に基づいて計算された。

【図7】本開示の別の実施形態に従った、Ｔ細胞増殖動態の特性評価を示す。正または負の初期増殖（２日目～４日目）を経たＴ細胞クローン間の平均最終クローン分裂が計算された。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜．０００１。

【図8】本開示の別の実施形態に従った、Ｔ細胞増殖動態の特性評価を示す。刺激後の固有のバーストに続いて、ＣＤ２８が低いドナー（例えば、中程度のＣＤ２８＋および低いＣＤ２８＋）では固有のクローンが継続的に減少する。固有のＴ細胞クローンは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ＣＤＲ３領域の固有のＤＮＡ分子読み取り数に由来してもよい。値１の点線は、活性化後に存在したよりもＴ細胞クローンが少ない点をマークする。クローンの多様性（固有のクローン数）は、初期（４日目）、中期（７日目）、および後期（１０日目）のＴ細胞製造手順全体で測定された。全ての値は、活性化後（２日目）の時点での固有のＴ細胞クローン数について正規化される。

【発明を実施するための形態】

【0049】

遺伝子改変Ｔ細胞を使用した養子Ｔ細胞療法は、いくつかの悪性腫瘍の潜在的な治療の選択肢として出現した。細胞療法の製造の中核を成すのは、刺激、遺伝子工学、および増殖方法の組み合わせを用いた製造である。この枠組み内で、治療的に妥当な投与量に対する細胞の増殖と、「生きている薬」の増殖可能性を維持する必要性との間に、微妙なバランスがあってもよい。

【0050】

本明細書に記載されるように、本開示は、Ｔ細胞の有効性を改善する方法、および最終倍数増殖、ＣＤ８：ＣＤ４ Ｔ細胞比、相対的最終テロメア長、およびＴ細胞製品のクローン濃度を強化し予測する方法を提供する。本開示は、それを必要とする対象においてがんを治療する方法、ならびに本明細書に記載される方法によって生産されるＴ細胞集団もまた提供する。

【0051】

ＣＤ２８はＴ細胞上で発現される分子の１つであり、それはＴ細胞活性化に必要な共刺激シグナルを提供する。ＣＤ２８は、Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）の受容体である。Ｔｏｌｌ様受容体リガンドによって活性化されると、Ｂ７．１発現が抗原提示細胞（ＡＰＣ）において上方制御される。抗原提示細胞上のＢ７．２発現は構成的である。ＣＤ２８は、ナイーブＴ細胞上で構成的に発現される唯一のＢ７受容体である。ＴＣＲに加えてＣＤ２８を介した刺激は、様々なインターロイキン（特にＩＬ－２およびＩＬ－６）の産生のために、Ｔ細胞に強力な共刺激シグナルを提供し得る。

【0052】

Ｔ細胞が長期間にわたって増殖した場合、複数の増殖性サイトカインが存在するにもかかわらず、Ｔ細胞はそれらの増殖能を失い、機能的に老化することもある。さらに、ＣＤ２８の発現は、最終Ｔ細胞倍数増殖をはじめとする、複数の製造指標と相関していてもよい。したがって、ＣＤ２８発現の喪失は、Ｔ細胞増殖のボトルネックを生み出してもよく、製造中に特定のＴ細胞クローンがその他のクローンと比較して非常に有利になってもよい。複数の相関関係を組み合わせた、利用可能な臨床試験データのメタ分析は、より若年の患者がＣＤ２８共刺激を伴うＴ細胞製造により良く反応するようであり、より高齢の患者はＣＤ２８共刺激を欠くＴ細胞製造により良く反応するようであることを示す。

【0053】

本開示の一態様では、ＣＤ２８陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の開始百分率は、１）倍数Ｔ細胞増殖、２）ＣＤ８：ＣＤ４ Ｔ細胞比（またはＣＤ３陽性細胞の％ＣＤ８陽性細胞）、および３）最終Ｔ細胞製品対テロメア長の正確な予測を可能にするバイオマーカーとして使用されてもよい。さらに、ＣＤＲ３ ＤＮＡ配列決定を使用して、様々な開始ＣＤ２８発現レベルを有するドナーからのクローン集団が追跡されてもよい。この分析から、異なるＣＤ２８開始発現レベルは、Ｔ細胞製造プロセス全体を通じてクローン増殖動態に有意差をもたらしてもよい。

【0054】

Ｔ細胞製造のプロセスは、ＰＢＭＣ由来のＴ細胞の単離、活性化、および増殖に依存する。活性化は、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する固定化作動性抗体と、それに続くサイトカイン環境での増殖を介して達成されてもよい。製造中に、治療効果に影響を与えてもよい、倍数Ｔ細胞増殖およびＣＤ８＋：ＣＤ４＋細胞比などの製品特性が追跡されて、最低限の基準が満たされてもよい。したがって、これらの指標に影響を及ぼし、臨床製造の結果に影響を与え得る要因について、より深い知識を有することが望ましい場合がある。

【0055】

例えば、Ｔ細胞製品を製造するプロセスは、一般的に５つのステップに分けられてもよい：（１）患者末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するための白血球アフェレーシス、（２）活性化、（３）非ウイルス性またはウイルスコード化ＴＣＲ／ＣＡＲベクターによるＰＢＭＣからのＴ細胞の遺伝子修飾、（４）臨床的に適切な用量を作製するためのＴ細胞の増殖、および（５）Ｔ細胞注入前の患者の任意選択的なリンパ球枯渇、および患者への改変Ｔ細胞の注入。Ｔ細胞コンパートメントの活性化は、αＣＤ２８抗体を介した共刺激刺激の存在下または非存在下で、主に作動性αＣＤ３抗体の使用を介して達成されもよく、通常はＩＬ－２の増殖がそれに続くが、ＩＬ－７ＩＬ－１５がナイーブＴ細胞最終製品を産生してもよい。

【0056】

増殖プロセス中、Ｔ細胞はＴＣＲ刺激の除去のために、増殖と縮小の間でバランスが取れていてもよい。製造中に、Ｔ細胞は終末分化したエフェクター細胞へと分化し、このプロセスはＰＢＭＣの最初の分化状態に依存していてもよい。より高齢のドナーからのＰＢＭＣは、ＣＤ２８陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞が濃縮されていてもよい。さらに、非アポトーシス性の外因性ＦａｓベースのＴ細胞－Ｔ細胞相互作用が、ナイーブＴ細胞の分化をを駆動してもよい。これらの観察結果は、特定のＴ細胞が、Ｔ細胞の生体外増殖中に、その他のＴ細胞を凌駕してもよいことを示す。したがって、この縮小と増殖の力学は、クローンレベルで解明されなくてはならない。

【0057】

特定の態様では、本明細書所のＴ細胞は、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ＣＧ－ＣＳＦでの刺激後に採取されたＰＢＭ、骨髄、または臍帯血由来のＴ細胞などの初代ヒトＴ細胞を含んでもよい。条件は、ｍＲＮＡおよびＤＮＡおよび電気穿孔の使用を含んでもよい。形質移入に続いて、細胞は、即座に輸液されてもよく、または保存されてもよい。特定の態様では、形質移入に続いて、細胞への遺伝子移入から約１日、約２日、約３日、約４日、または約５日以上以内に、細胞をバルク集団として数日間、数週間、または数ヶ月間、生体外で増殖させてもよい。

【0058】

さらなる態様では、形質移入に続いて形質移入体がクローン化されてもよく、単一の組み込まれたまたはエピソーム的に維持された発現カセットまたはプラスミドの存在、およびＴＣＲの発現を実証するクローンが、生体外で増殖されてもよい。増殖のために選択されたクローンは、ペプチド発現標的細胞を特異的に認識して溶解する能力を実証してもよい。組換えＴ細胞は、ＩＬ－２での刺激、または共通γ鎖に結合するその他のサイトカイン（例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１など）での刺激によって増殖させてもよい。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞での刺激によって増殖させてもよい。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞上で増殖させてもよく、またはＴ細胞表面上のＣＤ３を架橋するＯＫＴ３などの抗体を用いて増殖させてもよい。組換えＴ細胞のサブセットは、人工抗原提示細胞上で欠失させてもよく、またはＴ細胞表面上でＣＤ５２に結合するＣａｍｐａｔｈなどの抗体を用いて欠失させてもよい。さらなる態様では、遺伝子改変細胞は凍結保存されてもよい。

【0059】

「活性化」という用語は、十分に刺激されて、検出可能な細胞増殖を誘導するＴ細胞の状態を指す。特定の実施形態では、活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能に付随し得る。「活性化Ｔ細胞」という用語は、とりわけ、増殖中のＴ細胞を指す。Ｔ細胞の完全な活性化には、ＴＣＲを介して生成されたシグナルだけでは不十分であり、１つまたは複数の二次的シグナルまたは共刺激シグナルもまた必要である。したがって、Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した一次刺激シグナルと、１つまたは複数の二次的共刺激シグナルとを含んでなる。共刺激は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を介したまたはＣＤ２を介した刺激などの一次活性化シグナルを受信したＴ細胞による、増殖および／またはサイトカイン産生によって証明され得る。

【0060】

特定の態様では、本開示は、ＴＣＲをコード化するＤＮＡコンストラクトを含有する発現ベクターでＴ細胞を形質移入するステップと、次に、任意選択的に、抗原陽性細胞、組換え抗原、または受容体に対する抗体で細胞を刺激して、細胞を増殖させるステップとを含んでなる、抗原特異的再誘導されたＴ細胞を作製しおよび／または増殖させる方法を含んでもよい。

【0061】

別の態様では、裸のＤＮＡまたはＲＮＡを使用して、電気穿孔、またはその他の非ウイルス性遺伝子移入（ソノポレーションなどであるが、これに限定されるものではない）によって、Ｔ細胞を安定に形質移入し、再誘導する方法が提供される。ほとんどの研究者らは、異種遺伝子をＴ細胞に輸送するために、ウイルスベクターを使用している。裸のＤＮＡまたはＲＮＡを使用することで、再誘導Ｔ細胞の製造に必要な時間が短縮され得る。「裸のＤＮＡまたはＲＮＡ」は、発現のために適切な方向で発現カセットまたはベクターに含有されるＴＣＲをコード化するＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。本開示の電気穿孔法は、ＴＣＲを発現してその表面に保有する、安定な形質移入体を生成する。

【0062】

特定の態様では、ＴＣＲコンストラクトは、裸のＤＮＡとしてまたは適切なベクター内で対象自身のＴ細胞に導入されてもよい。当該技術分野の裸のＤＮＡを使用した電気穿孔によるＴ細胞の安定的な形質移入の方法。例えば、その内容全体が参照により援用される、米国特許第６，４１０，３１９号明細書を参照されたい。裸のＤＮＡは、一般に、発現のために適切な方向でプラスミド発現ベクターに含有される、本開示のＴＣＲをコード化するＤＮＡを指す。有利なことに、裸のＤＮＡの使用は、本開示のＴＣＲを発現するＴ細胞を製造するための所用時間を短縮する。

【0063】

代案としては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）を使用して、ＴＣＲコンストラクトがＴ細胞に導入され得る。本開示の方法に従って使用するのに適したベクターは、対象のＴ細胞において自己複製しない。ウイルスに基づく多数のベクターが知られており、その中では、細胞内に維持されるウイルスのコピー数は十分に低く、細胞の生存能が維持される。例示的なベクターとしては、ｐＦＢ－ｎｅｏベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標））、ならびにＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ、またはＢＰＶに基づくベクターが挙げられる。

【0064】

形質移入または形質導入されたＴ細胞が、所望の調節を有する表面膜タンパク質として、ＴＣＲコンストラクトを所望レベルで発現できることが確立されたら、ＴＣＲが宿主細胞において所望のシグナル誘導を提供するために機能的であるかどうかが、判定され得る。引き続いて、形質導入Ｔ細胞が対象に再導入または投与され、対象における抗腫瘍応答が活性化される。

【0065】

投与を容易にするために、本開示に従った形質導入Ｔ細胞は、さらに薬学的に許容可能であり得る適切な担体または希釈剤を用いて、医薬組成物にされまたは生体内投与に適したインプラントにされ得る。このような組成物またはインプラントを製造するための手段は、当該技術分野で記載されている（例えば、参照によりその内容全体が本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ，ｅｄ．（１９８０、を参照されたい）。適切な場合には、形質導入Ｔ細胞は、それぞれの投与経路のための通常の方法で、カプセル、溶液、注射、吸入剤、または煙霧剤のなどの半固体または液体の形態の調製物に製剤化され得る。当該技術分野で公知の手段を利用して、組成物が標的組織または器官に到達するまで、組成物の放出および吸収が防止または最小化され、または組成物の時限放出が確実にされ得る。しかし、望ましくは、細胞がＴＣＲを発現することを妨げない、薬学的に許容可能な形態が用いられる。したがって、望ましくは、形質導入Ｔ細胞は、平衡塩類溶液、好ましくはハンク平衡塩類溶液、または生理食塩水を含有する、医薬組成物にされ得る。

【0066】

本開示の方法を使用して、感染性疾患またはがんの治療で使用するための選択されたＴ細胞集団が増殖され得る。得られたＴ細胞集団は遺伝的に形質導入されて、免疫療法に使用され得るか、または感染性因子の生体外分析のために使用され得る。Ｔ細胞集団の十分な数への増殖に続いて、増殖Ｔ細胞は個人に戻されてもよい。本開示の方法はまた、Ｔ細胞の再生可能な供給源を提供してもよい。したがって、個人からのＴ細胞を生体外で増殖させ得て、増殖した集団の一部が個人に再投与され得て、別の部分は長期保存および引き続く増殖と個人への投与のためにアリコートで冷凍され得る。同様に、がんに罹患した個人から腫瘍浸潤性リンパ球の集団が得られ、Ｔ細胞を刺激して十分な数に増殖されて個人に戻され得る。

【0067】

一態様では、Ｔ細胞の増殖および／または活性化は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１の１つまたは複数の存在下で行われる。別の態様では、Ｔ細胞の増殖および／または活性化は、ＩＬ－２単独、ＩＬ－７単独、ＩＬ－１５単独、ＩＬ－２とＩＬ－１５の組み合わせ、またはＩＬ－７とＩＬ－１５の組み合わせで行われる。

【0068】

本開示はまた、固相表面に共役された、Ｔ細胞増殖のためにＴ細胞に共刺激シグナルを提供する薬剤（例えば、抗ＣＤ２８抗体、Ｂ７－１またはＢ７－２リガンド）を含有する組成物に関係してもよく、それは、同じ固相表面に共役された、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを提供する薬剤（例えば、抗ＣＤ３抗体）をさらに含んでもよい。これらの薬剤は、好ましくは、ビーズまたはフラスコまたはバッグに付着されてもよい。異なる固相表面に共役された各薬剤（すなわち、第１の固相表面に共役された、一次Ｔ細胞活性化シグナルを提供する薬剤、および第２の固相表面に共役された、共刺激シグナルを提供する薬剤）を含んでなる組成物もまた、本開示の範囲内であってもよい。

【0069】

本発明の組成物は単位用量剤形で提供され得て、その中では、例えば、注射などの各投与単位が、所定量の組成物を単独で、またはその他の活性剤との適切な組み合わせで含有してもよい。本明細書の用法では、単位用量剤形という用語は、ヒトおよび動物対象のための単位投薬量として適切な物理的離散単位を指し、各単位は、適切な場合には薬学的に許容可能な希釈剤、担体、またはビヒクルと関連して、単独で、またはその他の活性剤との組み合わせで、所望の効果を生じるのに十分な量で計算された本発明の組成物の所定量を含む。本開示の新規の単位用量剤形の仕様は、特定の対象における医薬組成物に関連する特定の薬力学に依存する。

【0070】

長期的な特異的抗腫瘍応答が確立されて、このような治療の非存在下で帰結するよりも、腫瘍のサイズを縮小させまたは腫瘍の増殖または再増殖を排除するように、望ましくは単離された形質導入Ｔ細胞の有効量または十分な数が組成物中に存在して、対象に導入される。望ましくは、対象に再導入された形質導入Ｔ細胞の量は、形質導入Ｔ細胞が存在しないこと以外は同じである条件と比較して、腫瘍サイズの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、または約９９％の減少を引き起こしてもよい。

【0071】

したがって、投与される形質導入Ｔ細胞の量は、投与経路を考慮すべきであり、所望の治療応答を達成するのに十分な数の形質導入Ｔ細胞が導入されるような量でなくてはならない。さらに、本明細書に記載の組成物に含まれる各活性剤の量（例えば、接触させる各細胞あたりの量、または特定の体重あたりの量）は、異なる用途において変動し得る。一般に、形質導入Ｔ細胞の濃度は、好ましくは、治療される対象に少なくとも約１×１０^６～約１×１０^９個の形質導入Ｔ細胞／ｍ^２（またはｋｇ）患者、なおもより望ましくは、約１×１０^７～約５×１０^８個の形質導入Ｔ細胞／ｍ^２（またはｋｇ）患者を提供するのに十分であるべきであるが、それを上回る例えば、５×１０^８細胞／ｍ^２（またはｋｇ）患者を超える、またはそれを下回る例えば、１×１０^７細胞／ｍ^２（またはｋｇ）患者未満などの任意の適切量が利用され得る。投与スケジュールは、十分確立された細胞ベースの治療法に基づき得て（例えば、参照によりその内容全体が本明細書に援用される、米国特許第４，６９０，９１５号明細書を参照されたい）、または交互の持続輸液ストラテジーが用いられ得る。

【0072】

これらの値は、本開示の方法を本発明の実施のために最適化する際に、実務家によって利用される、一連の形質導入Ｔ細胞の一般的ガイダンスを提供してもよい。本明細書におけるこのような範囲の列挙は、特定の用途で正当化されるかもしれないように、より多いまたはより少ない量の成分の使用を決して排除するものではない。例えば、実際の用量およびスケジュールは、組成物がその他の医薬組成物と組み合わせて投与されるかどうかによって、または薬物動態、薬物消長、および代謝における個人間の差異によって変動し得る。当業者は、特定の状況の要件に従って、容易に任意の必要な調節をし得る。

【0073】

一態様では、腫瘍関連抗原、本明細書に記載される方法および実施形態で使用できる、ＴＡＡペプチドとしては、例えば、米国特許第２０１６０１８７３５１号明細書、米国特許第２０１７０１６５３３５号明細書、米国特許第２０１７００３５８０７号明細書、米国特許第２０１６０２８０７５９号明細書、米国特許第２０１６０２８７６８７号明細書、米国特許第２０１６０３４６３７１号明細書、米国特許第２０１６０３６８９６５号明細書、米国特許第２０１７００２２２５１号明細書、米国特許第２０１７０００２０５５号明細書、米国特許第２０１７００２９４８６号明細書、米国特許第２０１７００３７０８９号明細書、Ｕ．米国特許第２０１７０１３６１０８号明細書、米国特許第２０１７０１０１４７３号明細書、米国特許第２０１７００９６４６１号明細書、米国特許第２０１７０１６５３３７号明細書、米国特許第２０１７０１８９５０５号明細書、米国特許第２０１７０１７３１３２号明細書、米国特許第２０１７０２９６６４０号明細書、米国特許第２０１７０２５３６３３号明細書、米国特許第２０１７０２６０２４９号明細書、米国特許第２０１８００５１０８０号明細書、および米国特許第２０１８０１６４３１５号明細書に記載される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドが挙げられ、これらの各出版物の内容およびその中に記載されている配列リストは、それらの全体が参照により本明細書に援用される。

【0074】

一態様では、本明細書に記載されるＴ細胞は、上記の特許および刊行物の１つまたは複数に記載されるＴＡＡペプチドを提示する細胞を選択的に認識する。

【0075】

別の態様では、本明細書に記載される方法および実施形態で使用できるＴＡＡは、配列番号１～配列番号１５８から選択される少なくとも１つを含む。一態様では、Ｔ細胞は、配列番号１～１５８に記載される、または本明細書に記載の特許または出願のいずれかに記載される、ＴＡＡペプチドを提示する細胞を選択的に認識する。

【0076】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0077】

一態様では、本明細書に記載される方法と共に使用できるＴ細胞受容体としては、例えば、米国特許第２０１７０２６７７３８号明細書、米国特許第２０１７０３１２３５０号明細書、米国特許第２０１８００５１０８０号明細書、米国特許第２０１８０１６４３１５号明細書、米国特許第２０１０１６１３９６号明細書、米国特許第２０１０１６２９２２号明細書、米国特許第２０１８０２７３６０２号明細書、米国特許第２０１９０００２５５６号明細書、米国特許第２０１８０１３５０３９号明細書に記載されるものが挙げられ、これらの各出版物の内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。

【0078】

当該技術分野の熟練当業者によって理解されるであろうように、本明細書に記載の方法によって生成された遺伝的形質導入Ｔ細胞は、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満のＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する判定された集団から生成されたＴ細胞Ｔ細胞と比較して、より高い倍数増殖、より高いＣＤ８：ＣＤ４ Ｔ細胞比、より長いテロメア長、および／またはより高いクローン濃度の１つまたは複数を示すので、本明細書に記載の方法によって生成された遺伝的形質導入Ｔ細胞は、改善された効力、より具体的には、養子免疫療法などの免疫療法に対する改善された効力を有する。

【実施例】

【0079】

Ｔ細胞製造プロトコルの設計においては、所望の細胞数を満たすためにＴ細胞を増殖させる必要性と、最終的Ｔ細胞製品の増殖能を維持することの間でバランスが存在してもよい。このパラダイム内では、開始ＰＢＭＣ集団の属性に基づいて製造の結果を予測することに、利点があってもよい。

【0080】

観察されたＴ細胞発現プロファイルの不均一性は、選択圧のための必要基準が存在してもよいことを示唆する。この圧力は、理論上は、特定のＴ細胞集団の複製能力を制限してもよい。共刺激分子の分析から、開始ＣＤ８細胞およびＴ細胞増殖プロトコル全体を通じて、ＣＤ２８発現が失われてもよい。当然のことながら、これにより２種類のＣＤ８ Ｔ細胞、すなわち与えられたＣＤ２８共刺激の恩恵を受けるものと、恩恵を受けないものとが生成する。以下の実施例は、ＣＤ２８の固有の重要性、および開始ＣＤ２８表現型と複数の製造指標との相関関係を示す。

【0081】

実施例１
Ｔ細胞製造
健常ドナー全血をＨｅｍａｃａｒｅから購入し、Ｆｉｃｏｌｌ勾配によってＰＢＭＣを単離した。４℃のＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ１７－５１６Ｆ）中の１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １６－００３７－８５）および１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １６－０２８９－８５）抗体で一晩被覆された組織培養フラスコ上に、１×１０^６個の生ＰＢＭＣ／ｍｌを蒔種することによって、５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ １００－３１８）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ １３０－０９７－１９６）培地中で、ＰＢＭＣを１６～２４時間活性化した。翌日、全細胞を単離して、１×１０^６個の生細胞／ｍｌに再懸濁し、５ｍｌをＧｒｅｘ２４ウェルプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ ８０１９２Ｍ）のウェル内に播種した。細胞は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ２００－０７）、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ２００－１５）、および１０μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンの存在下で、模擬形質転換するか、またはＴＣＲレンティウイルスコンストラクト（Ｌｅｎｔｉｇｅｎによって製造される）で形質転換した。翌日、細胞に、上記濃度でＩＬ－７およびＩＬ－１５を補充した３５ｍｌの完全ＴｅｘＭＡＣＳを供給した。細胞は、所望の製造時間（すなわち、合計４、７、または１０日間）に応じて、２、５、または８日間さらに培養した。製造後、細胞をカウントし、Ｃｙｒｏｓｔｏｒｅ１０内で５×１０^６／ｍｌで凍結し、－８０℃に１６～２４時間置き、必要になるまでＬＮ２気相で長期保存した。

【0082】

ＰｋＨ６７染色
ＰｋＨ６７（Ｓｉｇｍａ ＰＫＨ６７ＧＬ）染色は、７日目または１０日目の製造された細胞に比べてより大きな細胞サイズを考慮して、４日目の製造された細胞を２倍の濃度で染色したことを除いて、製造業者のプロトコルに従って実施した。ＰｋＨ染色は、フローサイトメトリー生存色素染色前に実施した。

【0083】

ＣＤＲ３配列決定（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびＴ細胞受容体可変β鎖配列決定解析
ヒトＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３領域の免疫配列決定は、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ（登録商標）アッセイ（ワシントン州シアトルのＡｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。抽出されたゲノムＤＮＡは、バイアス制御されたマルチプレックスＰＣＲ中で増幅させ、高スループット配列決定がそれに続いた。さらなる解析のために、各固有のＴＣＲβ ＣＤＲ３領域の絶対量を同定して定量化するために、配列を畳み込んでフィルタリングした。

【0084】

フローサイトメトリーの染色および取得
生細胞を定量化し、ＰＢＳ中で１～２×１０^６個の生細胞／ｍｌに再懸濁し、次に製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｖｅ－Ｄｅａｄ ａｑｕａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｌ３４９５７）染色で染色した。次に細胞を流動緩衝液で洗浄し、所望の抗体混合物（ＣＤ３ ＰｅｒＣｐ－Ｃｙ５．５ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３００３２８、Ｖｂ８ ＰＥ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３４８１０４、ＣＤ４５Ｒｏ ＰＥ－Ｃｙ７ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０４２３０、ＣＤ９５ ＡＰＣ－ｆｉｒｅ７５０ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０５６３８、ＣＤ８ ＢＶ６０５ ＢＤ ５６４１１６、ＣＤ２７ ＢＶ６５０ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０２８２７、ＣＤ６２Ｌ ＢＶ７８５ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０４８３０）で再懸濁し、残りの表面染色の前に、ＣＣＲ７（ＣＣＲ７ ＢＶ４１ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３５３２０８）染色を血清なしでＲＰＭＩで３７℃で実行したことを除いては、暗所で４℃で１５～３０分間染色した。次に、細胞を流動緩衝液で洗浄し、固定緩衝液中に再懸濁して、ＢＤ ＦｏｒｔｅｓｓａまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析装置上で取得するまで４℃で保存した。

【0085】

テロメア長判定
相対テロメア長は、製造業者の指示（Ｄａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｋ５３２７）に従って判定した。簡潔に述べると、Ｔ細胞と対照腫瘍細胞１３０１（４Ｎゲノム）とを１：１の比率で混合した。次に、細胞を透過処理し、テロメアＰＮＡ ＦＩＴＣプローブを一晩ハイブリダイズした。翌日、対比ヨウ化プロピジウム染色を実施して無傷の細胞を識別し、フローサイトメトリーによって細胞を取得した。試験細胞のテロメア長は、対照腫瘍細胞株１３０１のテロメア長に対する比率として計算した。

【0086】

実施例２
ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２８発現はＩＬ－７およびＩＬ－１５による生体外Ｔ細胞増殖のバイオマーカーとして機能する
ＣＤ８ Ｔ細胞中のＣＤ２８の年齢相関損失
ドナー間の選択圧については、ドナー間に固有の不均一性が存在してもよい。ＰＢＭＣからのＴ細胞製品の製造は、抗原特異的細胞溶解性ＣＤ８ Ｔ細胞を効率的に活性化し増殖させる能力に依存する。このプロセス中に、最小投与量として細胞の増殖を追跡する必要性があってもよい。この必要性は、多くの場合、臨床試験の設計に基づいて満たされてもよい。高齢のＰＢＭＣからのＴ細胞製品の製造は、血液中のＣＤ２８陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞の蓄積によって複雑になり得る。

【0087】

図１Ａは、ＣＤ２８プロファイリングから、ドナーが高齢であるほど、ＣＤ２８を発現するＣＤ８細胞の開始百分率が低く、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７の線形回帰によって判定されたように、Ｒ^２相関が０．７１２４であることを示す。これらの細胞は、同族ペプチドとＣＤ３／ＣＤ２８を介した刺激との双方に対して、増殖能が低下していてもよい。

【0088】

ＩＬ－７およびＩＬ－１５は、Ｔ細胞増殖中のＩＬ－２の使用と比較して、Ｔ細胞のナイーブ性を維持してもよい。したがって、ＩＬ－７およびＩＬ－１５は臨床製造のための好ましい方法であってもよい。さらに、ＣＤ２８－陰性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ１５に応答して、それらのＣＤ２８陽性相当物と同等に増殖してもよい。ＣＤ２８発現がＩＬ－７およびＩＬ－１５の存在下でＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の製造にどのように影響するかを比較するために、６人の健常ドナーから得られたＴ細胞を臨床様プロセスを使用して製造した。

【0089】

ＣＤ２８開始百分率は、Ｔ細胞増殖中の最終ＣＤ８百分率と相関する
ＣＤ８コンパートメント中のＣＤ２８発現は年齢と相関していてもよいため、ＣＤ２８発現に依存するその他の製造指標もまた偏っていてもよい。細胞溶解性ＣＤ４細胞が同定されているとはいえ、腫瘍細胞溶解性機能を遂行するのは主にＣＤ８コンパートメントであることから、Ｔ細胞増殖の終了時に、ＣＤ８：ＣＤ４細胞比（またはＣＤ３陽性細胞の％ＣＤ８陽性細胞）を測定してもよい。したがって、ＣＤ８細胞中の開始ＣＤ２８発現と、細胞の最終百分率との間には相関関係があってもよい。

【0090】

図１Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞コンパートメント中のＣＤ２８発現の開始百分率と、培養７日目（中期増殖）のＣＤ３陽性細胞の最終％ＣＤ８陽性細胞との間に、０．８１２１のＲ^２相関関係があることを示す。これらの結果は、ＣＤ２８発現がＣＤ８＋Ｔ細胞の選択圧の推進力として機能してもよいことを示唆する。

【0091】

ＣＤ２８開始百分率は倍数増殖と相関する
臨床Ｔ細胞増殖プロトコルは、多くの場合、発生した個体数倍加を理解するための測定基準として、最終製品の倍数増殖を測定する。

【0092】

図１Ｃは、増殖プロトコルにおいて、７日目（中期増殖）までに、Ｒ^２の相関が０．８５７９となり、倍数増殖と開始ＣＤ２８発現レベルとの間に明確な相関関係があったことを示す。ＣＤ４＋細胞と比較したＣＤ８＋細胞の増殖は、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ２８発現の開始百分率と密接に相関している。これらの結果は、ＰＢＭＣの開始表現型に基づいて臨床的拡大が成功するかどうかを予測し得るので、製造プロセスの開発に影響を与える。

【0093】

テロメア長の減少はＣＤ２８発現の開始と相関する
細胞は高度に分化して最終的には老化するので、テロメア長の損失は機能不全細胞の証明である。テロメラーゼの発現は、ＣＤ３＋ＣＤ２８刺激に続くＣＤ４またはＣＤ８コンパートメントのＣＤ２８発現細胞に限定されてもよい。したがって、最終相対テロメア長も、このＣＤ２８発現細胞画分に対応していてもよい。

【0094】

図１Ｄは、Ｔ細胞製品の最終相対テロメア長が、細胞の開始ＣＤ２８百分率と最終相対テロメア長との間の０．９５８１のＲ^２相関関係で、開始培養中のＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２８発現のレベルと密接に相関してもよいことを示す。この分析は、複数の健常ドナーと複数の非小細胞肺がん患者に由来するＰＢＭＣから実行された。このデータは、ＩＬ－７／ＩＬ－１５ベースのＴ細胞製造の結果が培養開始前に予測され得て、養子Ｔ細胞製造プロトコルの設計に重要な影響を与えてもよいことを示唆する。例えば、注入された細胞治療製品の持続性は、がん患者の臨床転帰と相関していてもよいので、注入された腫瘍細胞浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）臨床製品の最終テロメア長は、Ｔ細胞クローンの持続性と関連していてもよい。

【0095】

総合すると、開始ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２８発現を測定することによって、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を用いて製造されたＴ細胞製品の最終的なＣＤ８％、倍数増殖、および相対テロメア長を合理的に予測し得る。同じＣＤ２８発現との相関は、ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して老化中により高いレベルでのＣＤ２８発現を維持してもよいＣＤ４＋Ｔ細胞の文脈では、見られないこともあることに留意されたい。

【0096】

実施例３
ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２８発現はＴ細胞クローンの偏った増殖に関連している
開始ＰＢＭＣ中のＣＤ２８発現の増加はＴ細胞製造中に有利な増殖動態をもたらす
Ｔ細胞の増殖中にクローン集団の増殖を特徴付けるために、個々のＴ細胞クローンの増殖動態を、製造プロセス中にクローンＤＮＡの配列と各クローン集団内の絶対数によって追跡した。個々のクローンを追跡する場合、増殖プロセスの初期（４日目）、中期（７日目）、および後期（１０日目）に、Ｔ細胞クローン集団内のクローン分裂とＴ細胞の絶対数を測定した。

【0097】

例えば、ＣＤ２８^ｌｏｗ（３１．１％）、ＣＤ２８^ｍｉｄ（５４．３％）、またはＣＤ２８^ｈｉｇｈ（９３．４％）発現レベルに基づいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤＲ３ ＤＮＡ配列決定を介した、クローンＴ細胞の増殖と縮小の力学を特徴付けるために、ＰＢＭＣを作動性ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で一晩刺激して模擬形質導入し、製造プロセスの４日目、７日目、および１０日目の増殖プロセス中に試料採取した。細胞計数は各試料採取点で実行され、Ｔ細胞数は各クローン集団内で計算されたので、クローン分裂回数は次の式を使用して計算されてもよい：
クローン倍数増殖＝（最終クローン数／開始クローン数）
クローンあたり推定分裂回数＝Ｌｏｇ２（クローン倍数増殖）。

【0098】

特定のＣＤ８＋Ｔ細胞集団の増殖を定量化すると共に、クローン集団の縮小もまた定量化してもよいが、これは増殖染色ベースの技術では可能でないこともある。

【0099】

図２は、開始ＰＢＭＣが、ＣＤ２８^ｈｉｇｈ（９３．４％）の初期の増殖上の利点をもたらし、製造中にＴ細胞クローンのほぼ３分の２（６３．４１％）が活性化ステップ（２日目）と４日目の間で増殖することを示す。対照的に、ＣＤ２８の発現量が少ない開始集団は、製造の初期段階でほとんどのＴ細胞クローンが縮小するという動態を示し、その中ではＣＤ２８^ｍｉｄ（５４．３％）とＣＤ２８^ｌｏｗ（３１．１％）の集団は、それぞれ初期増殖クローンの２３．７４％と１．１９％を含有した。すなわち、ＣＤ２８^ｍｉｄおよびＣＤ２８^ｌｏｗを発現するサンプルの７６．２６％および９８．８１％は、初期増殖段階でそれぞれ縮小した。これは、これらの２つの対象集団のこの段階の負の倍数増殖と一致した一方で、ＣＤ２８^ｈｉｇｈサンプルは正の倍数増殖を示した。したがって、クローンレベルでＴ細胞製造を特徴付けることによって、増殖プロセスの初期にＴ細胞クローンの有意な縮小が生じてもよく、これはＣＤ２８発現ＣＤ８＋細胞の開始百分率と反比例してもよい。

【0100】

クローンの縮小および増殖は開始ＣＤ２８百分率と相関する
単一培養から、個々のＴ細胞クローン頻度を追跡し、活性化後（２日目）の時点と比較した。この比較から、有意に頻度が上がったクローンと下がったクローンを評価し、その合計を差示的に豊富な百分率とした。

【0101】

図３は、差示的に豊富な百分率と開始ＣＤ２８百分率の間に強い相関関係があることを示す（Ｒ^２＝０．９７２６）。開始サンプル中のＣＤ２８の量が少ないほど、差示的に豊富になったクローンの百分率が高くなる。これは、特定の集団におけるＣＤ２８の欠如が、その他のクローンがその中に向けて増殖するための生態学的ニッチを生み出し、ＣＤ２８の欠如が、Ｔ細胞増殖延長プロトコル中に死滅してもよい集団を生み出すことを示唆する。

【0102】

ＣＤ２８の発現量が少ないドナーは負の中央値のクローン分裂を伴うＴ細胞増殖の遅延を示す
ＣＤ２８ボトルネックがＴ細胞培養中に存在する場合、ＣＤ２８を発現した細胞の開始百分率に基づいて、Ｔ細胞集団の増殖における予想された遅延がある。同様に、全てのＴ細胞クローンがすぐに増殖できた場合、増殖プロトコルの早期にクローンあたりの正の分裂回数が予測される。

【0103】

図４は、例えば、ＣＤ２８^ｍｉｄとＣＤ２８^ｌｏｗなどのＣＤ２８の発現量が低いものと中程度のものでは、活性化後（２日目）と増殖後４日目の間に集団増殖が負であることを示し、これは、これらの２つの時点の間に細胞数が縮小したことを示唆して、ボトルネック事象の定義を満たす。さらに、高ＣＤ２８発現培養（例えば、ＣＤ２８^ｈｉｇｈ）についてのみ、全体として正のクローン分裂が観察され、この培養では高い百分率のＴ細胞クローンが即座に分裂できたことを示す。

【0104】

図５は、クローン集団の分裂を追跡した場合、ＣＤ２８^ｌｏｗサンプルが増殖の最後に非正規分布の分裂パターンを示す一方で、ＣＤ２８^ｍｉｄとＣＤ２８^ｈｉｇｈ集団は、同様の平均および中央値のクローン分裂によって示されるように、より正規分布した特性評価、すなわち製造全体にわたるクローン分裂の正規分布を示す。

【0105】

縮小の増加と初期増殖の減少に一致して、ＣＤ２８^ｌｏｗ集団は、培養中で所定のレベルの増殖に達するために、クローン分裂回数の増加を必要としてもよい。すなわち、開始ＣＤ２８発現が低いほど、同じ数のＴ細胞に到達するためにより多くの分裂が必要になってもよい。

【0106】

図６は、ＣＤ２８^ｌｏｗ集団が１×１０^８細胞の増殖に至るまでに１．９６回のクローン分裂を必要とした一方で、ＣＤ２８^ｍｉｄ集団は１．６４回、ＣＤ２８^ｈｉｇｈ集団は同じ細胞数でも０．９６回しか分裂しなかったことを示す。

【0107】

総合して、このデータは、高ＣＤ２８開始集団が、Ｔ細胞縮小の減少と必要なＴ細胞分裂回数の減少によって特徴付けられるより有利なＴ細胞増殖を経てよいことを示す。

【0108】

これらの結果は、Ｔ細胞集団のＣＤ２８発現が高いほど、初期Ｔ細胞クローン増殖の可能性が高いことを示唆する。さらに、定義された細胞数あたりのＴ細胞分裂回数の減少は、ＣＤ２８の発現の増加がＴ細胞増殖性を維持してもよいことを示唆する。

【0109】

特定のクローン集団の初期増殖が、増殖プロセスを通じて維持され得るかどうかを判定するために、正または負の初期増殖（２日目から４日目）を経た、例えば、ＣＤ２８^ｈｉｇｈ、ＣＤ２８^ｍｉｄ、およびＣＤ２８^ｌｏｗなどのＴ細胞クローンの間の最終クローン分裂の平均値を算出した。

【0110】

図７は、ＣＤ２８の発現にかかわりなく、全てのＴ細胞集団において、初期増殖クローンは、増殖プロセスの終わり（２日目から４日目）までに分裂する可能性が統計的に高いことを示す。

【0111】

ＤＮＡクローン配列決定によるＣＤ２８の発現が低いドナーにおける増殖中の固有のＴ細胞クローンの減少
製造の活性化段階では、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）が発生してもよく、より若年の、よりナイーブ様のＴ細胞は、より高齢のエフェクター様細胞と比較してより高い増殖性を有してもよい。したがって、これらの要因は、Ｔ細胞の製造におけるボトルネックをもたらしてもよく、例えば、Ｔ細胞クローン集団が全集団から除去される一方で、その他は最終製品中に保持される。Ｔ細胞製品に対するＡＩＣＤの影響を調査するために、製造プロセス全体を通じてクローン多様性（または濃度）を固有のＴ細胞クローン集団の相対数の尺度として判定した。

【0112】

培養全体を通じて固有のＴ細胞クローンの数を追跡すると、ボトルネックが存在する場合、ボトルネック事象後の固有のＴ細胞クローンの数に大きな変動があると予想される。クローン濃度は、配列決定からのＤＮＡ分子の読み取り回数について正規化された固有のＴ細胞クローンの数を計算するための測定値であってもよい。

【0113】

図８は、ＣＤ２８発現に関係なく、全てのＴ細胞集団について、活性化後（２日目）から初期増殖（４日目）までクローン濃度（またはクローン多様性）が増加したことを示し、これは、以前は検出不能であった低頻度のクローンの増殖を表している可能性が高い。最大のクローン多様性は、増殖プロセスのこの初期段階で達成されてもよく、測定基準は、チェックポイント療法および化学療法に対する臨床的奏功の改善に関連してもよいことに留意されたい。この初期バーストに続いて、ＣＤ２８^ｌｏｗおよびＣＤ２８^ｍｉｄを発現する集団のクローン多様性が有意に減少し、製造プロセスを生き延びることができない固有のＴ細胞クローンの縮小を表す。増殖の初期と後期の時点の間（４日目から１０日目）のクローン多様性のこの減少は、増殖が続くにつれてかなりのクローンの除去があったことを示唆する。対照的に、ＣＤ２８^ｈｉｇｈは、製造プロセス全体を通じて同様のクローンレベルを維持した。これらの結果は、開始ＰＢＭＣ培養に中のＣＤ２８発現レベルが、ＣＤ８＋Ｔ細胞コンパートメントの多岐にわたる増殖動態と強く関連していてもよいことを示唆する。クローン多様性の欠如は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の４年生存率の低下と関連していたので、これらの結果はＴ細胞製品の有効性に影響を与えてもよい。Ｔ細胞の持続性は、Ｔ細胞製品の有効性に寄与してもよい。弱い非同族のＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用は、Ｔ細胞の恒常性増殖と持続に寄与してもよい。したがって、ＣＤ２８発現量が低い開始Ｔ細胞から調製されたものなどの最終Ｔ細胞製品中のクローン多様性の欠如の不利な点としては、自己持続性非同族のＴＣＲ－ｐＭＨＣ生存シグナルに遭遇する確率が低いことに起因する、Ｔ細胞の恒常性増殖の低下が挙げられてもよい。

【0114】

実施例４
より若年の患者はＣＤ２８共刺激によって製造された場合にＣＤ１９ ＣＡＲ療法に対する応答が改善される
提案された生体外Ｔ細胞増殖ボトルネックの有意性をさらに探索するために、臨床試験メタ分析を実施して、高齢患者におけるＣＤ２８発現の喪失が臨床傾向を生み出すかどうかを調査した。以前のデータに基づくと、Ｔ細胞製造（ＣＤ３単独またはＣＤ２８との併用）に基づいて、より高齢の患者はより若年の患者とは異なって動作する。

【0115】

４０件のＴ細胞療法の臨床試験が公開されている。その多くは、未確認の部分（たとえば、試験されていない新規ＴＣＲまたはＣＡＲ分子）を使用した初期段階の試験である。メタ分析は、一様で比較可能なデータセットを生成するための選別ステップを必要とした。選別および編纂の後、合計１０７人の患者データ点のＣＤ１９悪性腫瘍を標的化する７件の臨床試験を解析した。この解析から、４５歳未満の患者は、ＣＤ３単独（４４．４４％）と比較して、ＣＤ３＋ＣＤ２８で細胞を製造した場合の臨床的予後がより良好であった（６６．６７％）。対照的に、患者が４５歳を超える場合、ＣＤ３＋ＣＤ２８法（３０．００％）でなくＣＤ３単独（７１．４３％）で製造することの利点があった（表１）。

【0116】

【表2】

表１：ＣＤ２８共刺激の差示的効果。データは、合計４７個のデータ点を用いた、４件のＣＤ１９ ＣＡＲ試験のメタ分析からのものである。４５歳未満の患者は、４５歳を超える患者と比較して、製造時にＣＤ２８共刺激を与えられた場合により良く機能したが、４５歳を超える患者は、ＣＤ２８共刺激を与えられなかった場合により良く機能した。換言すれば、４５歳未満の患者はＴ細胞製造のＣＤ３＋ＣＤ２８法の恩恵を受けてもよく、４５歳を超える患者はＴ細胞製造のＣＤ３単独法の恩恵を受けてもよい。ＣＲ＝完全奏効、ＰＲ＝部分奏効、ＳＤ＝安定した疾患、ＮＲ／ＰＤ＝無応答／進行性疾患、ＮＥ＝評価不能。各臨床的奏効は、出典の臨床試験解析に基づいて定義された。

【0117】

利用可能な臨床試験データのこのメタ分析は、例えば、４５歳未満などのより若年の患者が、ＣＤ２８共刺激を伴うＴ細胞製造により良く応答するように見えることを示す一方で、例えば、４５歳を超えるなどのより高齢の患者は、ＣＤ２８共刺激を欠くＴ細胞製造に対してより良く応答するように見える。

【0118】

臨床的奏効率は多発性骨髄腫に対する臨床試験における生体外増殖倍数と相関する
複数の臨床および前臨床調査は、表現型的により若年の低分化型Ｔ細胞が、より高齢の高分化型Ｔ細胞製品と比較してより性能が優れていることを示唆する。製造データ（図１および２）に基づくと、ＣＤ２８を高発現する（より若年の）開始ＰＢＭＣは、生体外でより高い倍数増殖を達成してもよく、表現型的に低分化型の最終生成物をもたらしてもよい。したがって、より若く、低分化型の開始ＰＢＭＣを同じ期間使用してＴ細胞を製造し、それらを培養してより高い倍数増殖を達成することによって、低分化型で、より強力な臨床製品を得てもよい。

【0119】

表２は、αＢＣＭＡ多発性骨髄腫ＣＡＲの臨床試験から、細胞培養が生体外で１０倍を超える倍数増殖を達成した場合、５７％の応答率があったことを示す。比較すると、培養物が１０倍の倍数増殖を達成できなかった場合、０％の応答率があった。これらの観察結果は、Ｔ細胞の効力を予測する際の翻訳関連性と製造中心のモデルをさらに支持する。

【0120】

【表3】

表２：生体外製造指標は多発性骨髄腫における臨床的奏効と相関する。臨床製造からのデータを臨床的奏効率と組み合わせて、製造中に達成されたＣＤ３＋細胞の倍数増殖によって選別した。奏効率は、グループ内の患者の総数に対するＰＲまたはＣＲを達成した患者の数として計算された。ＰＲ＝部分奏効、ＳＤ＝安定した疾患、ＣＲ＝完全奏効。

【0121】

本開示の利点としては、開始ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２８発現を測定することによる、最終ＣＤ８％、倍数増殖、およびＴ細胞製品の相対テロメア長の予測と、ＣＤ２８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の開始％中のＣＤ２８発現に基づく個別化治療とが挙げられてもよい。さらに、本開示の製造は、様々な製造期間、開始細胞数、刺激条件、および異なる増殖培地で個別化されてもよい。これによって、例えば、倍数増殖などの生体外製造指標が改善されてもよく、より良い臨床転帰と相関してもよい。本開示の細胞療法製造は、患者に非常に特異的であってもよく、特定のグループは、それらの開始細胞表現型に基づいて製造に対してより良くまたはより悪く応答する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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