特許 7524214 抗体コード配列をセーフハーバー遺伝子座に挿入するための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-19

(45)【発行日】2024-07-29

(54)【発明の名称】抗体コード配列をセーフハーバー遺伝子座に挿入するための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240722BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240722BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240722BHJP

   A01K 67/027 20240101ALI20240722BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240722BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240722BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240722BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240722BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240722BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240722BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20240722BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240722BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N15/09 110

C12N15/13 ZNA

C12N5/10

A01K67/027

C12N15/864 100Z

A61K48/00

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61P35/00

A61P31/00

A61P31/12

A61P31/16

A61P31/14

【請求項の数】 42

(21)【出願番号】P 2021558841

(86)(22)【出願日】2020-04-02

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-06

(86)【国際出願番号】 US2020026445

(87)【国際公開番号】W WO2020206162

(87)【国際公開日】2020-10-08

【審査請求日】2023-03-31

(31)【優先権主張番号】62/828,518

(32)【優先日】2019-04-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/887,885

(32)【優先日】2019-08-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ハートフォード， スザンヌ

(72)【発明者】

【氏名】ワン， チェン

(72)【発明者】

【氏名】ゴン， グオチュン

(72)【発明者】

【氏名】カラツオス， クリストス

(72)【発明者】

【氏名】ザンブロウィッツ， ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】ヤンコポーロス， ジョージ ディー．

【審査官】田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０９１５１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０３２６６４５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／１４８１９６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】NATURE BIOTECHNOLOGY，2005年，VOL.23, No.5，pp.584-590，doi:10.1038/nbt1087

【文献】mAbs，2015年，Vol.7, No.2，pp.403-412，http://dx.doi.org/10.1080/19420862.2015.1008351

【文献】BLOOD，2015年，VOL.126, No.15，pp.1777-1784，DOI 10.1182/blood-2014-12- 615492.

【文献】Molecular Therapy，2007年，Vol.15, No.6，pp.1153-1159，doi:10.1038/sj.mt.6300142

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ａ０１Ｋ ６７／０２７

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３１／００

Ａ６１Ｐ ３１／１４

Ａ６１Ｐ ３１／１２

Ａ６１Ｐ ３１／１６

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象における１つ以上の肝細胞においてアルブミン遺伝子座の第１イントロンへの抗体コード配列の挿入での使用のための組成物であって、ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および抗体コード配列を含む外因性ドナー核酸を含み、
前記ヌクレアーゼ剤が、前記アルブミン遺伝子座の第１イントロンにおける標的部位を標的として切断し、前記外因性ドナー核酸が前記アルブミン遺伝子座の第１イントロンに挿入され、
前記抗体は一本鎖抗体ではなく、
前記抗体は重鎖および別個の軽鎖を含み、
前記重鎖コード配列は、前記抗体コード配列の軽鎖コード配列の上流にあり、
前記重鎖コード配列は、Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈセグメントを含み、前記軽鎖コード配列は、Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含み、
前記重鎖と前記軽鎖は２Ａペプチドによって連結されており、
前記２ＡペプチドはＴ２Ａペプチドであり、
フューリン切断部位をコードする核酸は、前記重鎖コード配列と軽鎖コード配列との間に含まれ、前記フューリン切断部位は前記２Ａペプチドの上流に含まれ、
前記重鎖コード配列が、前記改変されたアルブミン遺伝子座における内因性アルブミン分泌シグナル配列に作動可能に連結されており、前記抗体コード配列が、前記軽鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含み、
前記挿入された抗体コード配列が、前記改変されたアルブミン遺伝子座における内因性アルブミンプロモーターに作動可能に連結されており、
前記抗体が前記疾患に関連する抗原を標的とする、
組成物。

【請求項2】

前記対象における抗体の発現が、前記対象における前記疾患に対して予防的または治療的効果を有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

対象における疾患の治療または予防での使用のための薬学的組成物であって、ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および抗体コード配列を含む外因性ドナー核酸を含み、
前記ヌクレアーゼ剤が、前記対象のアルブミン遺伝子座の第１イントロンにおける標的部位を標的として切断し、前記外因性ドナー核酸が前記対象における１つ以上の肝細胞中のアルブミン遺伝子座の第１イントロンに挿入され、
前記抗体は一本鎖抗体ではなく、
前記抗体は重鎖および別個の軽鎖を含み、
前記重鎖コード配列は、前記抗体コード配列の軽鎖コード配列の上流にあり、
前記重鎖コード配列は、Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈセグメントを含み、前記軽鎖コード配列は、Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含み、
前記重鎖と前記軽鎖は２Ａペプチドによって連結されており、
前記２ＡペプチドはＴ２Ａペプチドであり、
フューリン切断部位をコードする核酸は、前記重鎖コード配列と前記軽鎖コード配列との間に含まれ、前記フューリン切断部位は前記２Ａペプチドの上流に含まれ、
前記重鎖コード配列が、前記改変されたアルブミン遺伝子座における内因性アルブミン分泌シグナル配列に作動可能に連結されており、前記抗体コード配列が、前記軽鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含み、
前記挿入された抗体コード配列が、前記改変されたアルブミン遺伝子座における内因性アルブミンプロモーターに作動可能に連結されており、
前記抗体が前記対象において発現され、前記疾患に関連する抗原を標的とする、
薬学的組成物。

【請求項4】

前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記ヌクレアーゼ剤が前記クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質および前記ｇＲＮＡであり、前記クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質がＣａｓ９タンパク質であり、前記ｇＲＮＡが、
（ａ）前記標的部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、前記標的部位はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列とすぐ隣接する、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および
（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）
を含み、任意選択で、前記ｇＲＮＡが、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、
請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

（Ｉ）前記抗体コード配列が、非相同末端結合を介して挿入されるか、
（ＩＩ）前記抗体コード配列が、相同組換え修復を介して挿入されるか、
（ＩＩＩ）前記外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まないか、
（ＩＶ）前記外因性ドナー核酸は一本鎖であるか、
（Ｖ）前記外因性ドナー核酸は二本鎖であるか、
（ＶＩ）前記外因性ドナー核酸中の前記抗体コード配列が、各々の側で前記ヌクレアーゼ剤の前記標的部位に隣接し、前記ヌクレアーゼ剤が、前記抗体コード配列に隣接する前記標的部位を切断し、前記アルブミン遺伝子座の前記標的部位が、前記抗体コード配列が前記アルブミン遺伝子座に正しい方向で挿入された場合、もはや存在しないが、前記抗体コード配列が前記アルブミン遺伝子座に反対方向に挿入された場合、再形成され、前記外因性ドナー核酸がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達で送達され、前記抗体コード配列に隣接する前記標的部位の切断が前記ＡＡＶの末端逆位配列を除去するか、または
（ＶＩＩ）前記外因性分泌シグナル配列は、ＲＯＲ１分泌シグナル配列である、
請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

（Ｉ）前記疾患関連抗原ががん関連抗原、感染症関連抗原、ウイルス抗原または細菌抗原であり、任意選択で前記細菌抗原はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰｃｒＶ抗原である、および／または
（ＩＩ）前記抗体が、中和抗体であるか、または前記抗体は、広域中和抗体である、
請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

（１）前記ウイルス抗原がインフルエンザ血球凝集素抗原であり、前記抗体が、軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖と重鎖ＣＤＲ１～３を含む重鎖とを含み、
（Ｉ）前記軽鎖は、配列番号１８に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号２０に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号７６～７８に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号７９～８１に記載の配列に対して同一の配列を含むか、もしくは
（ＩＩ）前記軽鎖は、配列番号１２６に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号１２８に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１２９～１３１に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１３２～１３４に記載の配列に対して同一の配列を含むか、
（２）前記ウイルス抗原が、ジカエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原であり、前記抗体が、軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖と重鎖ＣＤＲ１～３を含む重鎖とを含み、
前記軽鎖は、配列番号３に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号６４～６６に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号６７～６９に記載の配列に対して同一の配列を含むか、または、
（３）前記ウイルス抗原が、ジカエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原であり、前記抗体が、軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖と重鎖ＣＤＲ１～３を含む重鎖とを含み、
前記軽鎖は、配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号１５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号７０～７２に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号７３～７５に記載の配列に対して同一の配列を含む、
請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

（Ｉ）前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が別個の送達ビヒクルに導入されるか、
（ＩＩ）前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が逐次的に導入されるか、
（ＩＩＩ）前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が同じ送達ビヒクルに一緒に導入されるか、または
（ＩＶ）前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が同時に導入される、
請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

（Ｉ）前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が単回投与もしくは複数回投与で導入されるか、
（ＩＩ）前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が静脈内注射を介して送達されるか、または
（ＩＩＩ）前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が、脂質ナノ粒子媒介送達を介して、もしくはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達を介して導入され、任意選択で、前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が両方とも、ＡＡＶ媒介送達によって導入され、任意選択で、前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が、２つの異なるＡＡＶベクターによって導入される、
請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

（Ｉ）前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸が、脂質ナノ粒子媒介送達を介して導入され、前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり、前記Ｃａｓ９が前記脂質ナノ粒子中にあり、ｍＲＮＡの形態にあり、前記脂質ナノ粒子中の前記ｇＲＮＡがＲＮＡの形態にある、ならびに／または
（ＩＩ）前記外因性ドナー核酸が、ＡＡＶ媒介送達を介して導入され、前記ＡＡＶが一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）もしくは自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり、任意選択で、前記ＡＡＶがＡＡＶ８もしくはＡＡＶ２／８である、
請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

（Ｉ）前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、前記ｇＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子媒介送達を介し導入され、前記外因性ドナー核酸がＡＡＶ８媒介送達またはＡＡＶ２／８媒介送達を介して導入されるか、または
（ＩＩ）前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、前記Ｃａｓ９をコードするＤＮＡが、第１のＡＡＶ８におけるＡＡＶ８媒介送達もしくは第１のＡＡＶ２／８におけるＡＡＶ２／８媒介送達を介して導入され、前記外因性ドナー核酸および前記ｇＲＮＡをコードするＤＮＡが、第２のＡＡＶ８におけるＡＡＶ８媒介送達または第２のＡＡＶ２／８におけるＡＡＶ２／８媒介送達を介して導入される、
請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

前記対象における前記抗体の発現が、前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸を導入した後、２週間、４週間、８週間、１２週間、または１６週間で、少なくとも２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、少なくとも２００μｇ／ｍＬ、少なくとも３００μｇ／ｍＬ、少なくとも４００μｇ／ｍＬ、少なくとも５００μｇ／ｍＬ、少なくとも６００μｇ／ｍＬ、少なくとも７００μｇ／ｍＬ、少なくとも８００μｇ／ｍＬ、少なくとも９００μｇ／ｍＬ、または少なくとも１０００μｇ／ｍＬの血漿レベルをもたらす、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

（Ｉ）前記対象が非ヒト哺乳類であり、任意選択で、前記非ヒト哺乳類がラットもしくはマウスであるか、または
（ＩＩ）前記対象がヒトである、
請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり、
前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が、脂質ナノ粒子媒介送達、アデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）媒介送達、またはＡＡＶ２／８媒介送達を介して送達され、
前記抗体コード配列が、前記対象の１つ以上の肝細胞において非相同末端結合を介して前記アルブミン遺伝子座の前記第１イントロンに挿入され、
前記抗体が、ウイルス抗原または細菌抗原を標的とし、
前記抗体が広域中和抗体である、
請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

対象の肝細胞におけるアルブミン遺伝子座の第１イントロンへの挿入のための、抗体コード配列を含む外因性ドナー核酸を含む組成物であって、
前記抗体は一本鎖抗体ではなく、
前記抗体は重鎖および別個の軽鎖を含み、
前記重鎖コード配列は、前記抗体コード配列の軽鎖コード配列の上流にあり、
前記重鎖コード配列は、Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈセグメントを含み、前記軽鎖コード配列は、Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含み、
前記重鎖と前記軽鎖は２Ａペプチドによって連結されており、
前記２ＡペプチドはＴ２Ａペプチドであり、
フューリン切断部位をコードする核酸は、前記重鎖コード配列と前記軽鎖コード配列との間に含まれ、前記フューリン切断部位は前記２Ａペプチドの上流に含まれ、
前記重鎖コード配列が、前記改変されたアルブミン遺伝子座における内因性アルブミン分泌シグナル配列に作動可能に連結されており、前記抗体コード配列が、前記軽鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含み、
前記挿入された抗体コード配列が、前記改変されたアルブミン遺伝子座における内因性アルブミンプロモーターに作動可能に連結されており、
前記抗体が前記疾患に関連する抗原を標的とする、
組成物。

【請求項17】

（Ｉ）前記外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まないか、
（ＩＩ）前記外因性ドナー核酸は一本鎖であるか、
（ＩＩＩ）前記外因性ドナー核酸は二本鎖であるか、
（ＩＶ）前記外因性ドナー核酸における前記抗体コード配列が、各々の側で前記ヌクレアーゼ剤の前記標的部位に隣接するか、または
（Ｖ）前記外因性分泌シグナル配列は、ＲＯＲ１分泌シグナル配列である、
請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

（Ｉ）前記疾患関連抗原ががん関連抗原、感染症関連抗原、ウイルス抗原もしくは細菌抗原であり、任意選択で前記細菌抗原はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰｃｒＶ抗原である、および／または
（ＩＩ）前記抗体が、中和抗体であるか、または前記抗体は、広域中和抗体である、
請求項１６または１７に記載の組成物。

【請求項19】

（１）前記ウイルス抗原がインフルエンザ血球凝集素抗原であり、前記抗体が、軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖と重鎖ＣＤＲ１～３を含む重鎖とを含み、
（Ｉ）前記軽鎖は、配列番号１８に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号２０に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号７６～７８に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号７９～８１に記載の配列に対して同一の配列を含むか、もしくは
（ＩＩ）前記軽鎖は、配列番号１２６に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号１２８に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１２９～１３１に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１３２～１３４に記載の配列に対して同一の配列を含むか、
（２）前記ウイルス抗原が、ジカエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原であり、前記抗体が、軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖と重鎖ＣＤＲ１～３を含む重鎖とを含み、
前記軽鎖は、配列番号３に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号６４～６６に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号６７～６９に記載の配列に対して同一の配列を含むか、または
（３）前記ウイルス抗原が、ジカエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原であり、前記抗体が、軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖と重鎖ＣＤＲ１～３を含む重鎖とを含み、
前記軽鎖は、配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号１５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号７０～７２に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号７３～７５に記載の配列に対して同一の配列を含む、
請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記外因性ドナー核酸が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、前記ＡＡＶが一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり、任意選択で、前記ＡＡＶがＡＡＶ８またはＡＡＶ２／８である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

前記外因性ドナー核酸がアデノ随伴ウイルス－８（ＡＡＶ８）またはＡＡＶ２／８中にあり、
前記抗体が、ウイルス抗原または細菌抗原を標的とし、
前記抗体が、広域中和抗体である、
請求項１６～２０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項22】

インビボで非ヒト動物の１つ以上の肝細胞、またはインビトロもしくはインビボで非ヒト動物の肝細胞において、アルブミン遺伝子座の第１イントロンへ抗体コード配列を挿入する方法であって、前記非ヒト動物の１つ以上の肝細胞または前記非ヒト動物の肝細胞に、（ａ）前記アルブミン遺伝子座の第１イントロンにおける標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸、および（ｂ）前記抗体コード配列を含む外因性ドナー核酸を導入することを含み、
前記ヌクレアーゼ剤が前記標的部位を切断し、前記抗体コード配列が前記アルブミン遺伝子座の第１イントロンへ挿入されて、改変されたアルブミン遺伝子座を生成し、
前記抗体は一本鎖抗体ではなく、
前記抗体は重鎖および別個の軽鎖を含み、
前記重鎖コード配列は、前記抗体コード配列の軽鎖コード配列の上流にあり、
前記重鎖コード配列は、Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈセグメントを含み、前記軽鎖コード配列は、Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含み、
前記重鎖と前記軽鎖は２Ａペプチドによって連結されており、
前記２ＡペプチドはＴ２Ａペプチドであり、
フューリン切断部位をコードする核酸は、前記重鎖コード配列と前記軽鎖コード配列との間に含まれ、前記フューリン切断部位は前記２Ａペプチドの上流に含まれ、
前記重鎖コード配列が、前記改変されたアルブミン遺伝子座における内因性アルブミン分泌シグナル配列に作動可能に連結されており、前記抗体コード配列が、前記軽鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含み、
前記挿入された抗体コード配列が、前記改変されたアルブミン遺伝子座における内因性アルブミンプロモーターに作動可能に連結されており、
前記抗体が前記疾患に関連する抗原を標的とする、
方法。

【請求項23】

前記動物における抗体の発現が、前記動物における前記疾患に対して予防的または治療的効果を有する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項25】

前記ヌクレアーゼ剤が前記クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質および前記ｇＲＮＡであり、前記クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質がＣａｓ９タンパク質であり、前記ｇＲＮＡが、
（ａ）前記標的部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であって、前記標的部位はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列とすぐ隣接する、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および
（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）
を含み、任意選択で、少なくとも１つの前記ｇＲＮＡが、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、
請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

（Ｉ）前記抗体コード配列が、非相同末端結合を介して挿入されるか、
（ＩＩ）前記抗体コード配列が、相同組換え修復を介して挿入されるか、
（ＩＩＩ）前記外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まないか、
（ＩＶ）前記外因性ドナー核酸は一本鎖であるか、
（Ｖ）前記外因性ドナー核酸は二本鎖であるか、
（ＶＩ）前記外因性ドナー核酸中の前記抗体コード配列が、各々の側で前記ヌクレアーゼ剤の前記標的部位に隣接し、前記ヌクレアーゼ剤が、前記抗体コード配列に隣接する前記標的部位を切断し、前記アルブミン遺伝子座の前記標的部位が、前記抗体コード配列が前記アルブミン遺伝子座に正しい方向で挿入された場合、もはや存在しないが、前記抗体コード配列が前記アルブミン遺伝子座に反対方向に挿入された場合、再形成され、前記外因性ドナー核酸がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達で送達され、前記抗体コード配列に隣接する前記標的部位の切断が前記ＡＡＶの末端逆位配列を除去するか、または
（ＶＩＩ）前記外因性分泌シグナル配列は、ＲＯＲ１分泌シグナル配列である、
請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

（Ｉ）前記疾患関連抗原ががん関連抗原、感染症関連抗原、ウイルス抗原もしくは細菌抗原であり、任意選択で前記細菌抗原はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰｃｒＶ抗原である、および／または
（ＩＩ）前記抗体が、中和抗体であるか、または前記抗体は、広域中和抗体である、
請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

（１）前記ウイルス抗原がインフルエンザ血球凝集素抗原であり、前記抗体が、軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖と重鎖ＣＤＲ１～３を含む重鎖とを含み、
（Ｉ）前記軽鎖は、配列番号１８に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号２０に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号７６～７８に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号７９～８１に記載の配列に対して同一の配列を含むか、もしくは、
（ＩＩ）前記軽鎖は、配列番号１２６に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号１２８に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１２９～１３１に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１３２～１３４に記載の配列に対して同一の配列を含むか、または
（２）前記ウイルス抗原が、ジカエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原であり、前記抗体が、軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖と重鎖ＣＤＲ１～３を含む重鎖とを含み、
前記軽鎖は、配列番号３に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号６４～６６に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号６７～６９に記載の配列に対して同一の配列を含むか、または
（３）前記ウイルス抗原が、ジカエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原であり、前記抗体が、軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖と重鎖ＣＤＲ１～３を含む重鎖とを含み、
前記軽鎖は、配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号１５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号７０～７２に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号７３～７５に記載の配列に対して同一の配列を含む、
請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

（Ｉ）前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が別個の送達ビヒクルに導入されるか、
（ＩＩ）前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が逐次的に導入されるか、
（ＩＩＩ）前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が同じ送達ビヒクルに一緒に導入されるか、または
（ＩＶ）前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が同時に導入される、
請求項２２～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

（Ｉ）前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が単回投与もしくは複数回投与で導入されるか、
（ＩＩ）前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が静脈内注射を介して送達されるか、または
（ＩＩＩ）前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が、脂質ナノ粒子媒介送達を介して、もしくはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達を介して導入され、任意選択で、前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が両方とも、ＡＡＶ媒介送達によって導入され、任意選択で、前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が、２つの異なるＡＡＶベクターによって導入される、
請求項２２～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

（Ｉ）前記ヌクレアーゼ剤もしくは前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸が、脂質ナノ粒子媒介送達を介して導入され、前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり、前記Ｃａｓ９が前記脂質ナノ粒子中にあり、ｍＲＮＡの形態にあり、前記脂質ナノ粒子中の前記ｇＲＮＡがＲＮＡの形態にある、ならびに／または
（ＩＩ）前記外因性ドナー核酸が、ＡＡＶ媒介送達を介して導入され、前記ＡＡＶが一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）もしくは自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり、任意選択で、前記ＡＡＶがＡＡＶ８もしくはＡＡＶ２／８である、
請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

（Ｉ）前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、前記方法が、脂質ナノ粒子媒介送達を介して前記ｇＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡを導入することを含み、前記外因性ドナー核酸がＡＡＶ８媒介送達もしくはＡＡＶ２／８媒介送達を介して導入されるか、または
（ＩＩ）前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、前記方法が、第１のＡＡＶ８におけるＡＡＶ８媒介送達もしくは第１のＡＡＶ２／８におけるＡＡＶ２／８媒介送達を介して前記Ｃａｓ９をコードするＤＮＡを導入すること、および前記外因性ドナー核酸および前記ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、第２のＡＡＶ８におけるＡＡＶ８媒介送達または第２のＡＡＶ２／８におけるＡＡＶ２／８媒介送達を介して導入することを含む、請求項２２～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記動物における前記抗体の発現が、前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸を導入した後、２週間、４週間、８週間、１２週間、または１６週間で、少なくとも２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、少なくとも２００μｇ／ｍＬ、少なくとも３００μｇ／ｍＬ、少なくとも４００μｇ／ｍＬ、少なくとも５００μｇ／ｍＬ、少なくとも６００μｇ／ｍＬ、少なくとも７００μｇ／ｍＬ、少なくとも８００μｇ／ｍＬ、少なくとも９００μｇ／ｍＬ、または少なくとも１０００μｇ／ｍＬの血漿レベルをもたらす、請求項２２～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記非ヒト動物が非ヒト哺乳類であり、任意選択で、前記非ヒト哺乳類がラットまたはマウスである、請求項２２～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり、
前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が、脂質ナノ粒子媒介送達、アデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）媒介送達、またはＡＡＶ２／８媒介送達を介して送達され、
前記抗体が、ウイルス抗原または細菌抗原を標的とし、
前記抗体が広域中和抗体である、
請求項２２～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

アルブミン遺伝子座の第１イントロンに組み込まれた外因性抗体コード配列を含む非ヒト動物の肝細胞であって、前記非ヒト動物の肝細胞は個々の動物に発生できず、
前記抗体は一本鎖抗体ではなく、
前記抗体は重鎖および別個の軽鎖を含み、
前記重鎖コード配列は、前記抗体コード配列の軽鎖コード配列の上流にあり、
前記重鎖コード配列は、Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈセグメントを含み、前記軽鎖コード配列は、Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含み、
前記重鎖と前記軽鎖は２Ａペプチドによって連結されており、
前記２ＡペプチドはＴ２Ａペプチドであり、
フューリン切断部位をコードする核酸は、前記重鎖コード配列と前記軽鎖コード配列との間に含まれ、前記フューリン切断部位は前記２Ａペプチドの上流に含まれ、
前記重鎖コード配列が、前記改変されたアルブミン遺伝子座における内因性アルブミン分泌シグナル配列に作動可能に連結されており、前記抗体コード配列が、前記軽鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含み、
前記挿入された抗体コード配列が、前記改変されたアルブミン遺伝子座における内因性アルブミンプロモーターに作動可能に連結されており、
前記抗体が前記疾患に関連する抗原を標的とする、
非ヒト動物の肝細胞。

【請求項37】

前記外因性分泌シグナル配列は、ＲＯＲ１分泌シグナル配列である、請求項３６に記載の非ヒト動物細胞。

【請求項38】

前記非ヒト動物における抗体の発現が、前記非ヒト動物における前記疾患に対して予防的または治療的効果を有する、請求項３６又は３７に記載の非ヒト動物の肝細胞。

【請求項39】

（Ｉ）前記疾患関連抗原ががん関連抗原、感染症関連抗原、ウイルス抗原もしくは細菌抗原であり、任意選択で前記細菌抗原はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰｃｒＶ抗原である、および／または
（ＩＩ）前記抗体が、中和抗体であるか、または前記抗体は、広域中和抗体である、
請求項３６～３８のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞。

【請求項40】

（１）前記ウイルス抗原がインフルエンザ血球凝集素抗原であり、前記抗体が、軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖と重鎖ＣＤＲ１～３を含む重鎖とを含み、
（Ｉ）前記軽鎖は、配列番号１８に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号２０に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号７６～７８に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号７９～８１に記載の配列に対して同一の配列を含むか、もしくは、
（ＩＩ）前記軽鎖は、配列番号１２６に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号１２８に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号１２９～１３１に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１３２～１３４に記載の配列に対して同一の配列を含む、または
（２）前記ウイルス抗原が、ジカエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原であり、前記抗体が、軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖と重鎖ＣＤＲ１～３を含む重鎖とを含み、
前記軽鎖は、配列番号３に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号６４～６６に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号６７～６９に記載の配列に対して同一の配列を含むか、または
（３）前記ウイルス抗原が、ジカエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原であり、前記抗体が、軽鎖ＣＤＲ１～３を含む軽鎖と重鎖ＣＤＲ１～３を含む重鎖とを含み、
前記軽鎖は、配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖は、配列番号１５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含み、
前記軽鎖ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号７０～７２に記載の配列に対して同一の配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号７３～７５に記載の配列に対して同一の配列を含む、
請求項３９に記載の非ヒト動物細胞。

【請求項41】

前記非ヒト動物が非ヒト哺乳類であり、任意選択で、前記非ヒト哺乳類がラットまたはマウスである、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞。

【請求項42】

前記抗体が、ウイルス抗原または細菌抗原を標的とし、
前記抗体が広域中和抗体である、
請求項３６～４１のいずれか一項に記載の非ヒト動物細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月３日に出願された米国出願第６２／８２８，５１８号および２０１９年８月１６日に出願された米国出願第６２／８８７，８８５号の権益を主張し、これらのそれぞれは、すべて目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
ファイル５４４９９８ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記述された配列表は１８６キロバイトであり、２０２０年４月２日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

中和抗体は、抗菌および抗ウイルス免疫において重要な役割を果たし、細菌性またはウイルス性疾患の予防または調節に役立つ。感染または能動ワクチン接種の際に免疫系によって作られた抗体は、細菌またはウイルスの表面上の容易にアクセス可能なループに焦点を合わせる傾向があり、それらはしばしば大きな配列および立体配座の変動性を有する。しかしながら、細菌またはウイルスの集団はこれらの抗体をすばやく回避することができ、抗体は機能に不可欠ではないタンパク質の部分を攻撃している。広域中和抗体はこれらの問題を克服することができるが、これらの抗体は通常遅すぎて疾患からの効果的な保護を提供できず、そのような抗体による治療は短期間の保護しか提供しない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

セーフハーバー遺伝子座に組み込まれた抗原結合タンパク質のコード配列を含む動物、およびインビボで動物においてセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質のコード配列を組み込むための方法が提供される。同様に、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれた抗原結合タンパク質のコード配列を含む細胞、ゲノム、または遺伝子、およびインビトロまたはインビボでの細胞、ゲノム、または遺伝子のセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質のコード配列を組み込むための方法が提供される。一態様では、インビボで動物においてセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を挿入するための方法が提供される。いくつかのそのような方法は、セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤、および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸を動物に導入することを含み、ヌクレアーゼ剤が標的部位を切断し、抗原結合タンパク質をコードする配列がセーフハーバー遺伝子座に挿入され、改変されたセーフハーバー遺伝子座が生成される。いくつかのそのような方法は、（ａ）セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸、および（ｂ）抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸を動物に導入することを含み、ヌクレアーゼ剤が標的部位を切断し、抗原結合タンパク質をコードする配列がセーフハーバー遺伝子座に挿入され、改変されたセーフハーバー遺伝子座が生成される。同様に、インビトロまたはインビボで細胞においてセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を挿入するための方法が提供される。いくつかのそのような方法は、セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤、および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸を細胞に導入することを含み、ヌクレアーゼ剤が標的部位を切断し、抗原結合タンパク質をコードする配列がセーフハーバー遺伝子座に挿入され、改変されたセーフハーバー遺伝子座が生成される。いくつかのそのような方法は、（ａ）セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸、および（ｂ）抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸を細胞に導入することを含み、ヌクレアーゼ剤が標的部位を切断し、抗原結合タンパク質をコードする配列がセーフハーバー遺伝子座に挿入され、改変されたセーフハーバー遺伝子座が生成される。別の態様では、対象（例えば、インビボの動物または細胞）内のセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を挿入することでの使用のための、ヌクレアーゼ剤および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸であって、ヌクレアーゼ剤は、セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的として切断し、外因性ドナー核酸は、セーフハーバー遺伝子座に挿入される、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー核酸が提供される。別の態様では、対象（例えば、インビボの動物または細胞）内のセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を挿入することでの使用のための、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸であって、ヌクレアーゼ剤は、セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的として切断し、外因性ドナー核酸は、セーフハーバー遺伝子座に挿入される、ヌクレアーゼ剤または１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸が提供される。いくつかのそのような方法は、セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤、および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸を動物または細胞に導入することを含み得、ヌクレアーゼ剤が標的部位を切断し、抗原結合タンパク質をコードする配列がセーフハーバー遺伝子座に挿入され、改変されたセーフハーバー遺伝子座が生成される。いくつかのそのような方法は、（ａ）セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸、および（ｂ）抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸を動物または細胞に導入することを含み得、ヌクレアーゼ剤が標的部位を切断し、抗原結合タンパク質をコードする配列がセーフハーバー遺伝子座に挿入され、改変されたセーフハーバー遺伝子座が生成される。別の態様では、対象（例えば、動物）における疾患の治療または予防の実施（予防）での使用のための、ヌクレアーゼ剤および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸であって、ヌクレアーゼ剤は、セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的として切断し、外因性ドナー核酸は、セーフハーバー遺伝子座に挿入され、抗原結合タンパク質は対象で発現し、疾患に関連する抗原を標的とする、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー核酸が提供される。別の態様では、対象（例えば、動物）における疾患の治療または予防の実施（予防）での使用のための、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸であって、ヌクレアーゼ剤は、対象のセーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的として切断し、外因性ドナー核酸は、セーフハーバー遺伝子座に挿入され、抗原結合タンパク質は対象で発現し、疾患に関連する抗原を標的とする、ヌクレアーゼ剤または１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸が提供される。いくつかのそのような方法は、セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤、および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸を動物に導入することを含み得、抗原結合タンパク質が疾患と関連する抗原を標的とし、ヌクレアーゼ剤が標的部位を切断し、抗原結合タンパク質をコードする配列がセーフハーバー遺伝子座に挿入され、改変されたセーフハーバー遺伝子座が生成され、それにより、抗原結合タンパク質は動物で発現し、疾患に関連する抗原に結合する。いくつかのそのような方法は、（ａ）セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸、および（ｂ）抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸を動物に導入することを含み得、抗原結合タンパク質は疾患と関連する抗原を標的とし、ヌクレアーゼ剤が標的部位を切断し、抗原結合タンパク質をコードする配列がセーフハーバー遺伝子座に挿入され、改変されたセーフハーバー遺伝子座が生成され、それにより、抗原結合タンパク質は動物で発現し、疾患に関連する抗原に結合する。

【0005】

いくつかのそのような方法では、抗原結合タンパク質は、疾患関連抗原を標的とする。いくつかのそのような方法では、動物における抗原結合タンパク質の、動物における疾患に対する予防的または治療的効果を有する。別の態様では、疾患を有するか、またはそのリスクのある動物における疾患を治療または予防を実施する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤、および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸を動物に導入することを含み得、抗原結合タンパク質が疾患と関連する抗原を標的とし、ヌクレアーゼ剤が標的部位を切断し、抗原結合タンパク質をコードする配列がセーフハーバー遺伝子座に挿入され、改変されたセーフハーバー遺伝子座が生成され、それにより、抗原結合タンパク質は動物で発現し、疾患に関連する抗原に結合する。いくつかのそのような方法は、（ａ）セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸、および（ｂ）抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸を動物に導入することを含み得、抗原結合タンパク質は疾患と関連する抗原を標的とし、ヌクレアーゼ剤が標的部位を切断し、抗原結合タンパク質をコードする配列がセーフハーバー遺伝子座に挿入され、改変されたセーフハーバー遺伝子座が生成され、それにより、抗原結合タンパク質は動物で発現し、疾患に関連する抗原に結合する。

【0006】

いくつかのそのような方法では、挿入された抗原結合タンパク質をコードする配列は、セーフハーバー遺伝子座の内因性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかのそのような方法では、改変されたセーフハーバー遺伝子座は、内因性分泌シグナルおよび抗原結合タンパク質を含むキメラタンパク質をコードする。

【0007】

いくつかのそのような方法では、セーフハーバー遺伝子座はアルブミン遺伝子座である。任意選択で、抗原結合タンパク質をコードする配列は、アルブミン遺伝子座の第１イントロンに挿入される。

【0008】

いくつかのそのような方法では、抗原結合タンパク質をコードする配列は、動物の１つ以上の肝細胞のセーフハーバー遺伝子座に挿入される。

【0009】

いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。任意選択で、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質およびｇＲＮＡであり、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質であり、ｇＲＮＡは、（ａ）標的部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）（標的部位はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列とすぐ隣接する）、および（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。任意選択で、少なくとも１つのｇＲＮＡは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

【0010】

いくつかのそのような方法では、抗原結合タンパク質をコードする配列は、非相同末端結合を介して挿入される。いくつかのそのような方法では、外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まない。いくつかのそのような方法では、抗原結合タンパク質をコードする配列は、相同組換え修復を介して挿入される。いくつかのそのような方法では、外因性ドナー核酸は一本鎖である。いくつかのそのような方法では、外因性ドナー核酸は二本鎖である。

【0011】

いくつかのそのような方法では、外因性ドナー核酸中の抗原結合タンパク質をコードする配列が、各々の側でヌクレアーゼ剤の標的部位に隣接し、ヌクレアーゼ剤が、抗原結合タンパク質をコードする配列に隣接する標的部位を切断する。任意選択で、セーフハーバー遺伝子座の標的部位が、抗原結合タンパク質をコードする配列がセーフハーバー遺伝子座に正しい方向で挿入された場合、もはや存在しないが、抗原結合タンパク質をコードする配列がセーフハーバー遺伝子座に反対方向に挿入された場合、再形成される。任意選択で、外因性ドナー核酸がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達で送達され、抗原結合タンパク質をコードする配列に隣接する標的部位の切断がＡＡＶの末端逆位配列を除去する。

【0012】

いくつかのそのような方法では、抗原結合タンパク質が、抗体、抗体の抗原結合断片、多重特異性抗体、ｓｃＦＶ、ｂｉｓ－ｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｖ－ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）_２、二重可変ドメイン抗原結合タンパク質、単一可変ドメイン抗原結合タンパク質、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）、またはデイビスボディ（Ｄａｖｉｓｂｏｄｙ）である。いくつかのそのような方法では、抗原結合タンパク質は一本鎖抗原結合タンパク質ではない。任意選択で、抗原結合タンパク質は、重鎖と別個の軽鎖とを含み、任意選択で、重鎖コード配列は、Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈセグメントを含み、軽鎖コード配列は、Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む。いくつかのそのような方法では、重鎖コード配列は、抗原結合タンパク質をコードする配列の軽鎖コード配列の上流にある。任意選択で、抗原結合タンパク質をコードする配列は、軽鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含む。いくつかのそのような方法では、軽鎖コード配列は、抗原結合タンパク質をコードする配列の重鎖コード配列の上流にある。任意選択で、抗原結合タンパク質をコードする配列は、重鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含む。いくつかのそのような方法では、外因性分泌シグナル配列は、ＲＯＲ１分泌シグナル配列である。

【0013】

いくつかのそのような方法では、抗原結合タンパク質をコードする配列は、２Ａペプチドまたは配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって連結された重鎖と軽鎖をコードする。任意選択で、重鎖と軽鎖は２Ａペプチドによって連結されている。任意選択で、２ＡペプチドはＴ２Ａペプチドである。

【0014】

いくつかのそのような方法では、疾患関連抗原はがん関連抗原である。いくつかのそのような方法でが、疾患関連抗原は、細菌抗原などの感染症関連抗原である。任意選択で、細菌抗原はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰｃｒＶ抗原である。いくつかのそのような方法では、疾患関連抗原はウイルス抗原である。任意選択で、ウイルス抗原はインフルエンザ抗原またはジカ抗原である。

【0015】

いくつかのそのような方法では、ウイルス抗原はインフルエンザ血球凝集素抗原である。任意選択で、抗原結合タンパク質は、３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖と３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖とを含み、（Ｉ）軽鎖は、配列番号１８に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、重鎖は、配列番号２０に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、任意選択で、３つの軽鎖ＣＤＲがそれぞれ配列番号７６～７８に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり、３本の重鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号７９～８１に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり；あるいは、（ＩＩ）改変されたセーフハーバー遺伝子座は、配列番号１２０に記載の配列に対して少なくとも９０％同一のコード配列を含み；あるいは、（ＩＩＩ）軽鎖は、配列番号１２６に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、重鎖は、配列番号１２８に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、任意選択で、３つの軽鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号１２９～１３１に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり、３つの重鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号１３２～１３４に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり；あるいは、（ＩＶ）改変されたセーフハーバー遺伝子座は、配列番号１４６に記載の配列に対して少なくとも９０％同一のコード配列を含む。

【0016】

いくつかのそのような方法では、ウイルス抗原は、ジカエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原である。任意選択で、抗原結合タンパク質は、３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖と３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖とを含み、（Ｉ）軽鎖は、配列番号３に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、重鎖は、配列番号５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、任意選択で、３つの軽鎖ＣＤＲがそれぞれ配列番号６４～６６に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり、３つの重鎖ＣＤＲがそれぞれ配列番号６７～６９に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり；あるいは、（ＩＩ）改変されたセーフハーバー遺伝子座は、配列番号１１５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一のコード配列を含む。任意選択で、抗原結合タンパク質は、３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖と３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖とを含み、（Ｉ）軽鎖は、配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、重鎖は、配列番号１５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、任意選択で、３つの軽鎖ＣＤＲがそれぞれ配列番号７０～７２に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり、３つの重鎖ＣＤＲがそれぞれ配列番号７３～７５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり；あるいは、（ＩＩ）改変されたセーフハーバー遺伝子座は、配列番号１１６～１１９のうちのいずれか１つに記載の配列に対して少なくとも９０％同一のコード配列を含む。

【0017】

いくつかのそのような方法では、疾患関連抗原は細菌抗原である。

【0018】

いくつかのそのような方法では、抗原結合タンパク質は、中和抗原結合タンパク質または中和抗体である。任意選択で、抗原結合タンパク質は、広域中和抗原結合タンパク質または広域中和抗体である。

【0019】

いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー核酸は、別々の送達ビヒクルに導入される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸は、別個の送達ビヒクルに導入される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー核酸は、同じ送達ビヒクルに一緒に導入される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸は、同じ送達ビヒクルに一緒に導入される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー核酸は同時に導入される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸は同時に導入される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー核酸は、逐次的に導入される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸は逐次的に導入される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー核酸は、単回投与で導入される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸は、単回投与で導入される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤および／または外因性ドナー核酸は、複数回投与で導入される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および／または外因性ドナー核酸は、複数回投与で導入される。いくつかのそのような方法にでは、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー核酸は、静脈内注射によって送達される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸は、静脈内注射によって送達される。

【0020】

いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー核酸は、脂質ナノ粒子媒介送達によって、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達によって導入される。任意選択で、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー核酸の両方が、ＡＡＶ媒介送達によって導入される。任意選択で、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー核酸は、複数の異なるＡＡＶベクターによって（例えば、２つの異なるＡＡＶベクターによって）導入される。任意選択で、ＡＡＶはＡＡＶ８またはＡＡＶ２／８である。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸は、脂質ナノ粒子媒介送達によって、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達によって導入される。任意選択で、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸と外因性ドナー核酸は両方とも、ＡＡＶ媒介送達によって導入される。任意選択で、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸は、複数の異なるＡＡＶベクターによって（例えば、２つの異なるＡＡＶベクターによって）導入される。任意選択で、ＡＡＶはＡＡＶ８またはＡＡＶ２／８である。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、脂質ナノ粒子を介した送達によって導入される。任意選択で、脂質ナノ粒子は、５０：３８．５：１０：１．５のモル比でＤｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ－ＤＭＧを含む。いくつかのそのような方法では、脂質ナノ粒子のヌクレアーゼ剤は、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。任意選択で、Ｃａｓ９はｍＲＮＡの形態であり、ｇＲＮＡはＲＮＡの形態である。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸は、脂質ナノ粒子媒介送達によって導入される。任意選択で、脂質ナノ粒子は、５０：３８．５：１０：１．５のモル比でＤｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ－ＤＭＧを含む。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。任意選択で、Ｃａｓ９は脂質ナノ粒子にあり、ｍＲＮＡの形態であり、脂質ナノ粒子にあるｇＲＮＡはＲＮＡの形態である。

【0021】

いくつかのそのような方法では、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶ媒介送達によって導入される。任意選択で、ＡＡＶは一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である。任意選択で、ＡＡＶは自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。任意選択で、ＡＡＶはＡＡＶ８またはＡＡＶ２／８である。

【0022】

いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、脂質ナノ粒子媒介送達を介して導入されるクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶ８媒介またはＡＡＶ２／８媒介送達によって導入される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）をコードするＤＮＡおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするＤＮＡを含み、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡは、第１のＡＡＶ８におけるＡＡＶ８媒介送達または第１のＡＡＶ２／８におけるＡＡＶ２／８媒介送達によって導入され、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡおよび外因性ドナー核酸は、第２のＡＡＶ８におけるＡＡＶ８媒介送達または第２のＡＡＶ２／８におけるＡＡＶ２／８媒介送達によって導入される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、方法は、脂質ナノ粒子媒介送達によってｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを導入することを含み、外因性ドナー核酸がＡＡＶ８媒介送達またはＡＡＶ２／８媒介送達によって導入される。いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、方法は、第１のＡＡＶ８におけるＡＡＶ８媒介送達または第１のＡＡＶ２／８におけるＡＡＶ２／８媒介送達によってＣａｓ９をコードするＤＮＡを導入することと、第２のＡＡＶ８におけるＡＡＶ８媒介送達または第２のＡＡＶ２／８におけるＡＡＶ２／８媒介送達によって外因性ドナー核酸およびｇＲＮＡをコードするＤＮＡを導入することと、を含む。

【0023】

いくつかのそのような方法では、動物における抗原結合タンパク質の発現は、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー核酸を導入した後、約２週間、約４週間、または約８週間で、少なくとも約２．５、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、または少なくとも約５００μｇ／ｍＬの血漿レベルをもたらす。いくつかのそのような方法では、動物における抗原結合タンパク質の発現は、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸を導入した後、約２週間、約４週間、約８週間、約１２週間、または約１６週間で、少なくとも約２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約６００μｇ／ｍＬ、少なくとも約７００μｇ／ｍＬ、少なくとも約８００μｇ／ｍＬ、少なくとも約９００μｇ／ｍＬ、または少なくとも約１０００μｇ／ｍＬの血漿レベルをもたらす。

【0024】

いくつかのそのような方法では、動物は非ヒト動物である。任意選択で、動物は非ヒト哺乳動物である。任意選択で、非ヒト哺乳動物はラットまたはマウスである。いくつかのそのような方法では、動物はヒトである。

【0025】

いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー配列は、脂質ナノ粒子媒介送達、アデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）媒介送達、またはＡＡＶ２／８媒介送達によって送達され、抗原結合タンパク質をコードする配列は、非相同末端結合によって、動物の１つ以上の肝細胞内で内因性アルブミン遺伝子座の第１イントロンに挿入され、挿入された抗原結合タンパク質をコードする配列は内因性アルブミンプロモーターに作動可能に連結され、改変されたアルブミン遺伝子座が内因性アルブミン分泌シグナルと抗原結合シグナルとを含むキメラタンパク質をコードし、抗原結合タンパク質がウイルス抗原または細菌抗原を標的とし、抗原結合タンパク質が広域中和抗体であり、抗原結合タンパク質をコードする配列は、２Ａペプチドによって連結された重鎖と別個の軽鎖とをコードする。任意選択で、重鎖コード配列は、抗原結合タンパク質をコードする配列の軽鎖コード配列の上流にあり、抗原結合タンパク質をコードする配列が、軽鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含み、外因性分泌シグナル配列がＲＯＲ１分泌シグナル配列である。

【0026】

いくつかのそのような方法では、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および外因性ドナー配列は、脂質ナノ粒子媒介送達、アデノ関連ウイルス８（ＡＡＶ８）媒介送達、またはＡＡＶ２／８媒介送達によって送達され、抗原結合タンパク質をコードする配列は、動物の１つ以上の肝細胞内で非相同末端結合によって内因性アルブミン遺伝子座に挿入され、挿入された抗原結合タンパク質をコードする配列は、内因性アルブミンプロモーターに作動可能に連結され、改変されたアルブミン遺伝子座は、内因性アルブミン分泌シグナルと抗原結合タンパク質を含むキメラタンパク質をコードし、抗原結合タンパク質はウイルス抗原または細菌抗原を標的とし、抗原結合タンパク質は広域中和抗体であり、抗原結合タンパク質をコードする配列は、２Ａペプチドによって連結された重鎖と別個の軽鎖とをコードする。任意選択で、重鎖コード配列は、抗原結合タンパク質をコードする配列の軽鎖コード配列の上流にあり、抗原結合タンパク質をコードする配列が、軽鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含み、外因性分泌シグナル配列がＲＯＲ１分泌シグナル配列である。

【0027】

別の態様では、上記の方法のいずれかによって生産された動物が提供される。別の態様では、上記の方法のいずれかによって生成された細胞、改変されたゲノム、または改変されたセーフハーバー遺伝子が提供される。別の態様では、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれた外因性抗原結合タンパク質をコードする配列を含む動物、細胞、またはゲノムが提供される。

【0028】

いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、挿入された抗原結合タンパク質をコードする配列は、セーフハーバー遺伝子座の内因性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムにおいて、改変されたセーフハーバー遺伝子座は、内因性分泌シグナルと抗原結合タンパク質を含むキメラタンパク質をコードする。

【0029】

一部のそのような動物、細胞、またはゲノムでは、セーフハーバー遺伝子座はアルブミン遺伝子座である。必要に応じて、抗原結合タンパク質をコードする配列は、アルブミン遺伝子座の第１イントロンに挿入される。

【0030】

いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、抗原結合タンパク質をコードする配列は、動物の１つ以上の肝細胞のセーフハーバー遺伝子座に挿入される。

【0031】

いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、抗原結合タンパク質が、抗体、抗体の抗原結合断片、多重特異性抗体、ｓｃＦＶ、ｂｉｓ－ｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｖ－ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）_２、二重可変ドメイン抗原結合タンパク質、単一可変ドメイン抗原結合タンパク質、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、またはデイビスボディである。任意選択で、抗原結合タンパク質は一本鎖抗原結合タンパク質ではない。任意選択で、抗原結合タンパク質は、重鎖と別個の軽鎖とを含み、任意選択で、重鎖コード配列は、Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈセグメントを含み、軽鎖コード配列は、Ｖ_ＬおよびＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む。いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、重鎖コード配列は、抗原結合タンパク質をコードする配列の軽鎖コード配列の上流にある。任意選択で、抗原結合タンパク質をコードする配列は、軽鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含む。いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、軽鎖コード配列は、抗原結合タンパク質をコードする配列の重鎖コード配列の上流にある。任意選択で、抗原結合タンパク質をコードする配列は、重鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含む。いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、外因性分泌シグナル配列は、ＲＯＲ１分泌シグナル配列である。

【0032】

いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、抗原結合タンパク質をコードする配列は、２Ａペプチドまたは配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって連結された重鎖と軽鎖をコードする。任意選択で、重鎖と軽鎖は２Ａペプチドによって連結されている。任意選択で、２ＡペプチドはＴ２Ａペプチドである。

【0033】

いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、抗原結合タンパク質は、疾患関連抗原を標的とする。いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、動物における抗原結合タンパク質の、動物における疾患に対する予防的または治療的効果を有する。いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、疾患関連抗原はがん関連抗原である。いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、疾患関連抗原は感染症関連抗原である。任意選択で、疾患関連抗原はウイルス抗原である。任意選択で、ウイルス抗原はインフルエンザ抗原またはジカ抗原である。

【0034】

いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、ウイルス抗原はインフルエンザ血球凝集素抗原である。任意選択で、抗原結合タンパク質は、３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖と３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖とを含み、（Ｉ）軽鎖は、配列番号１８に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、重鎖は、配列番号２０に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、任意選択で、３つの軽鎖ＣＤＲがそれぞれ配列番号７６～７８に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり、３本の重鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号７９～８１に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり；あるいは、（ＩＩ）改変されたセーフハーバー遺伝子座は、配列番号１２０に記載の配列に対して少なくとも９０％同一のコード配列を含み；あるいは、（ＩＩＩ）軽鎖は、配列番号１２６に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、重鎖は、配列番号１２８に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、任意選択で、３つの軽鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号１２９～１３１に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり、３つの重鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号１３２～１３４に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり；あるいは、（ＩＶ）改変されたセーフハーバー遺伝子座は、配列番号１４６に記載の配列に対して少なくとも９０％同一のコード配列を含む。

【0035】

いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、ウイルス抗原は、ジカエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原である。任意選択で、抗原結合タンパク質は、３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖と３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖とを含み、（Ｉ）軽鎖は、配列番号３に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、重鎖は、配列番号５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、任意選択で、３つの軽鎖ＣＤＲがそれぞれ配列番号６４～６６に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり、３つの重鎖ＣＤＲがそれぞれ配列番号６７～６９に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり；あるいは、（ＩＩ）改変されたセーフハーバー遺伝子座は、配列番号１１５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一のコード配列を含む。いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、抗原結合タンパク質は、３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖と３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖とを含み、（Ｉ）軽鎖は、配列番号１３に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、重鎖は、配列番号１５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、任意選択で、３つの軽鎖ＣＤＲがそれぞれ配列番号７０～７２に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり、３つの重鎖ＣＤＲがそれぞれ配列番号７３～７５に記載の配列に対して少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり；あるいは、（ＩＩ）改変されたセーフハーバー遺伝子座は、配列番号１１６～１１９のうちのいずれか１つに記載の配列に対して少なくとも９０％同一のコード配列を含む。

【0036】

いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、疾患関連抗原は細菌抗原である。任意選択で、細菌抗原はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰｃｒＶ抗原である。

【0037】

いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、抗原結合タンパク質は中和抗原結合タンパク質または中和抗体である。任意選択で、抗原結合タンパク質は、広域中和抗原結合タンパク質または広域中和抗体である。

【0038】

いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、動物における抗原結合タンパク質の発現は、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー核酸を導入した後、約２週間、約４週間、または約８週間で、少なくとも約２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、または少なくとも約５００μｇ／ｍＬの血漿レベルをもたらす。いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、動物における抗原結合タンパク質の発現は、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー核酸を導入した後、約２週間、約４週間、約８週間、約１２週間、または約１６週間で、少なくとも約２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約６００μｇ／ｍＬ、少なくとも約７００μｇ／ｍＬ、少なくとも約８００μｇ／ｍＬ、少なくとも約９００μｇ／ｍＬ、または少なくとも約１０００μｇ／ｍＬの血漿レベルをもたらす。いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、動物における抗原結合タンパク質の発現が、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸を導入した後、約２週間、約４週間、または約８週間で、少なくとも約２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、または少なくとも約５００μｇ／ｍＬの血漿レベルをもたらす。いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、動物における抗原結合タンパク質の発現は、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸を導入した後、約２週間、約４週間、約８週間、約１２週間、または約１６週間で、少なくとも約２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約６００μｇ／ｍＬ、少なくとも約７００μｇ／ｍＬ、少なくとも約８００μｇ／ｍＬ、少なくとも約９００μｇ／ｍＬ、または少なくとも約１０００μｇ／ｍＬの血漿レベルをもたらす。

【0039】

いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、動物は非ヒト動物である。任意選択で、動物は非ヒト哺乳動物である。任意選択で、非ヒト哺乳動物はラットまたはマウスである。いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、動物はヒトである。

【0040】

いくつかのそのような動物、細胞、またはゲノムでは、抗原結合タンパク質をコードする配列は、動物の１つ以上の肝細胞内で内因性アルブミン遺伝子座の第１イントロンに挿入され、挿入された抗原結合タンパク質をコードする配列は内因性アルブミンプロモーターに作動可能に連結され、改変されたアルブミン遺伝子座が内因性アルブミン分泌シグナルと抗原結合シグナルとを含むキメラタンパク質をコードし、抗原結合タンパク質がウイルス抗原または細菌抗原を標的とし、抗原結合タンパク質が広域中和抗体であり、抗原結合タンパク質をコードする配列は、２Ａペプチドによって連結された重鎖と別個の軽鎖とをコードする。任意選択で、重鎖コード配列は、抗原結合タンパク質をコードする配列の軽鎖コード配列の上流にあり、抗原結合タンパク質をコードする配列が、軽鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含み、外因性分泌シグナル配列がＲＯＲ１分泌シグナル配列である。

【0041】

別の態様では、セーフハーバー遺伝子座に挿入するための抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸が提供される。別の態様では、セーフハーバー遺伝子に組み込まれた抗原結合タンパク質のコード配列を含むセーフハーバー遺伝子が提供される。別の態様では、改変されたセーフハーバー遺伝子を生成するための方法であって、セーフハーバー遺伝子を、セーフハーバー遺伝子内の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤および抗原結合タンパク質コード配列を含む外因性ドナー核酸と接触させることを含み、ヌクレアーゼ剤が標的部位を切断し、抗原結合タンパク質をコードする配列がセーフハーバー遺伝子に挿入されて、改変されたセーフハーバー遺伝子を生成する、方法が提供される。別の態様では、低改変されたセーフハーバー遺伝子を生成するための方法であって、セーフハーバー遺伝子を、抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸と接触させることを含み、抗原結合タンパク質をコードする配列はセーフハーバー遺伝子に挿入されて、改変されたセーフハーバー遺伝子を生成する、方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】内因性アルブミン遺伝子座の第１イントロンに抗体遺伝子を挿入するための一般的な概略図を示す（原寸に比例していない）。ＳＤはスプライスドナー部位を指し、ＳＡはマウスアルブミン遺伝子の第１イントロン由来のスプライスアクセプター部位を指し、ＬＣは抗体軽鎖（例えば、抗ジカ、ＲＥＧＮ４５０４）を指し、ＨＣは抗体重鎖（例えば、抗ジカ、ＲＥＧＮ４５０４）を指し、ｍＡｌｂｓｓは内因性アルブミン遺伝子のエキソン１によってコードされるアルブミン分泌シグナルペプチドを指し、ｓｓはマウスＲｏｒ１シグナルペプチドを指し、ｓＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメントを指し、ＰｏｌｙＡはＳＶ４０ポリＡ配列を指し、２Ａはブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）由来の２Ａ自己切断ペプチドを指す。

【図2】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によるＣａｓ９ ｍＲＮＡとアルブミン標的化ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ１バージョン１（Ｎ－Ｃａｐ）またはバージョン２）のマウス肝臓への送達、およびＡＡＶ２／８ ＡｌｂＳＡ ４５０４抗ジカ抗体ドナー配列（Ｐ２Ａ自己切断ペプチドによって連結された軽鎖および重鎖）の送達に続く、抗ジカ抗体のマウスアルブミン遺伝子座への挿入を試験する実験設計を示す。

【図3】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびアルブミン標的化ｇＲＮＡで構成されるＬＮＰ（ガイドＲＮＡ１バージョン１（Ｎ－Ｃａｐ）またはバージョン２のいずれか）とＡＡＶ２／８ ＡｌｂＳＡ ４５０４抗ジカ抗体ドナー配列との共注射後、７日目（１週目）、１４日目（２週目）、および２８日目（４週目）のマウスの血漿サンプルでＥＬＩＳＡにより測定したＲＥＧＮ４５０４抗ジカ抗体（組み込まれたＡＡＶ）の発現を示す。ｙ軸はｈＩｇＧ濃度を示す。

【図4】Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ ＬＮＰおよびＡＡＶ２／８ ＡｌｂＳＡ４５０４抗ジカ抗体ドナー配列の注射後４週間目に採取された血漿サンプルにおけるジカ中和アッセイの結果を示す。陽性対照抗体（ＲＥＧＮ４５０４抗ジカ抗体）の結果も示される。

【図5】組み込まれたＡＡＶによって産生された抗体のウエスタンブロット分析を示す。１５番は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとガイドＲＮＡ１ｖ１を含むＬＮＰを注射したマウスの１つである。１７番は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとガイドＲＮＡ１ｖ２を含むＬＮＰを注射したマウスの１つである。

【図6】マウスアルブミン遺伝子座のイントロン１への相同性非依存性標的挿入媒介の一方向ＡＡＶ－ＲＥＧＮ４４４６標的挿入の概略図を示す。ｈＵ６ ｇＲＮＡ１は、ヒトＵ６プロモーターによって駆動されるガイドＲＮＡ １ｖ１の発現カセットである。ＳＡはマウスアルブミン遺伝子の第１イントロン由来のスプライシングアクセプターを指し、ＨＣは抗ジカＲＥＧＮ４４４６の重鎖を指し、フューリンはフューリン切断部位を指し、２Ａは２Ａ自己切断ペプチドを指し（口蹄疫ウイルス１８（Ｆ２Ａ）、ブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）、およびｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）由来の２Ａが試験された）、Ｓｓはシグナル配列を指し（この例ではマウスアルブミンシグナル配列とマウスＲｏｒ１シグナル配列が試験された）、ＬＣは抗ジカＲＥＧＮ４４４６の軽鎖を指し、ＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメントを指し、ＰｏｌｙＡはウシ成長ホルモンポリＡ配列を指す。ＡＡＶはＣａｓ９レディーマウスに注射された。

【図7】図６に示すような、アルブミン標的化ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ １ ｖ１）抗ジカ（ＲＥＧＮ４４４６）抗体ドナー配列のＣａｓ９レディーマウスへのＡＡＶ２／８による送達後のマウスアルブミン遺伝子座の第１イントロンへの抗ジカ抗体（ＲＥＧＮ４４４６）の挿入を試験するための実験設計を示す。ウイルスはＣａｓ９レディーマウスに静脈内注射された。抗体価、結合、および機能アッセイのために、１０日目、２８日目、および５６日目に血清を収集した。挿入率およびｍＲＮＡレベル測定のために７０日目にマウスを解体した。

【図8】アルブミン標的化ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１ｖ１）および様々な抗ジカ（ＲＥＧＮ４４４６）抗体ドナー配列をコードするＡＡＶの注射後、１０日目、２８日目、および５６日目のＣａｓ９レディーマウス由来の血漿サンプルでの４４４６抗ジカ抗体（組み込まれたＡＡＶ）の発現を示す。エピソームＡＡＶ（ＣＭＶおよびＣＡＳＩ）ならびに組み込まれたＡＡＶ（Ｆ２Ａ／Ａｌｂｓｓ、Ｐ２Ａ／Ａｌｂｓｓ、Ｔ２Ａ／Ａｌｂｓｓ、およびＴ２Ａ／ＲＯＲｓｓ）の結果が示される。

【図9】エピソームＡＡＶ（ＣＭＶ ＬＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓ ＨＣ；ＣＡＳＩ ＨＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓ ＬＣ）または組み込まれたＡＡＶ（ｇＲＮＡ１ｖ１ ＨＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓ ＬＣ）から発現した抗体のウエスタンブロット分析を示す。

【図10】エピソームＡＡＶ（ＣＭＶ ＬＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓ ＨＣ；ＣＡＳＩ ＨＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓ ＬＣ）または組み込まれたＡＡＶ（ｇＲＮＡ１ｖ１ ＨＣ Ｆ２Ａ Ａｌｂｓｓ ＬＣ；ｇＲＮＡ１ ＨＣ Ｐ２Ａ Ａｌｂｓｓ ＬＣ；ｇＲＮＡ１ ＨＣ Ｔ２Ａ Ａｌｂｓｓ ＬＣ；ｇＲＮＡ１ ＨＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓＬＣ；およびｇＲＮＡ１ＨＣ Ｔ２Ａ ＬＣ）から発現した抗体の結合能（ジカエンベロープタンパク質に対する結合）を示す。陽性対照抗体（ＲＥＧＮ４４４６抗ジカ抗体）の結果も示される。

【図11】エピソームＡＡＶ（ＣＭＶ ＬＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓ ＨＣ；ＣＡＳＩ ＨＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓ ＬＣ）または組み込まれたＡＡＶ（ｇＲＮＡ１ｖ１ ＨＣ Ｆ２Ａ Ａｌｂｓｓ ＬＣ；ｇＲＮＡ１ ＨＣ Ｐ２Ａ Ａｌｂｓｓ ＬＣ；ｇＲＮＡ１ ＨＣ Ｔ２Ａ Ａｌｂｓｓ ＬＣ；ｇＲＮＡ１ ＨＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓＬＣ；およびｇＲＮＡ１ＨＣ Ｔ２Ａ ＬＣ）から発現した抗体の中和アッセイの結果（ジカ感染）を示す。陽性対照抗体（ＲＥＧＮ４４４６抗ジカ抗体）の結果も示される。

【図12A】エピソームＡＡＶ（ＣＭＶ ＬＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓ ＨＣ；ＣＡＳＩ ＨＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓ ＬＣ）または組み込まれたＡＡＶ（Ｆ２Ａ／Ａｌｂｓｓ；Ｐ２Ａ／Ａｌｂｓｓ；Ｔ２Ａ／Ａｌｂｓｓ；およびＴ２Ａ／ＲＯＲｓｓ）も注射後のＣａｓ９レディーマウスの肝臓におけるインデル率を示す。

【図12B】ＴＡＱＭＡＮ ｑＰＣＲによって測定されたときの、Ｃａｓ９レディーマウスの肝臓における、エピソームＡＡＶ（ＣＭＶ ＬＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓ ＨＣ；ＣＡＳＩ ＨＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓ ＬＣ）または組み込まれたＡＡＶ（Ｆ２Ａ／Ａｌｂｓｓ；Ｐ２Ａ／Ａｌｂｓｓ；Ｔ２Ａ／Ａｌｂｓｓ；およびＴ２Ａ／ＲＯＲｓｓ）から発現した抗体（ｍＡｌｂ－ＲＥＧＮ４４４６）のｍＲＮＡレベルを示す。

【図13】Ｃａｓ９とｇＲＮＡの両方の発現カセットを担持するＡＡＶのゲノム構造を示している。

【図14】４つの異なるプロモーターによって駆動されるｔＲＮＡＧｌｎ ｇＲＮＡ（標的遺伝子１を標的とする）およびＣａｓ９を担持するＡＡＶ２／８ウイルスの注射前と後（注射後３５日目）の血清標的タンパク質１レベルを示す。

【図15】１つはＣａｓ９を担持し、もう１つはｇＲＮＡと挿入テンプレートを担持する２つのＡＡＶを注射したマウスの抗体レベルを示す。この図は、１つはアルブミン標的化ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１ｖ１）と抗ジカ（ＲＥＧＮ４４４６）抗体ドナー配列（Ｔ２Ａ／ＲＯＲｓｓ）をコードし、もう１つはＳｅｒｐｉｎＡＰプロモーターによって駆動されるＣａｓ９配列を担持する、２つのＡＡＶの注射後、１１日目と２８日目のＣ５７ＢＬ／６マウスの血清サンプルにおける４４４６抗ジカ抗体（組み込まれたＡＡＶ）の発現を示す。マウスあたり２つの異なるレベルのウイルスゲノム（Ｄｕａｌ－ＬｏｗおよびＤｕａｌ－Ｈｉｇｈ）でのエピソームＡＡＶ（ＣＡＳＩ ＨＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓ ＬＣ）と組み込まれたＡＡＶの結果が示される。ガイドのみの群では、Ｃａｓ９配列を担持するＡＡＶが送達されなかったため、組み込みは起きなかった。

【図16】エピソームＡＡＶまたは組み込まれたＡＡＶ（デュアルＡＡＶ実験）から発現した中和アッセイの結果（ジカ感染）を示す。

【図17】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によるＣａｓ９ ｍＲＮＡとアルブミン標的化ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ１ｖ１）のマウス肝臓への送達、およびＡＡＶ２／８ ＡｌｂＳＡ ３２６３抗ＨＡ抗体ドナー配列（Ｐ２Ａ自己切断ペプチドによって連結された軽鎖と重鎖）の送達に続く、マウスアルブミン遺伝子座の第１イントロンへの抗ＨＡ（インフルエンザ血球凝集素）抗体の挿入を試験する実験設計を示す。

【図18】注射後１１、２８、４２、５６、１１８日目に、１つがＣａｓ９を担持し、もう１つがｇＲＮＡと挿入テンプレートを担持する２つのＡＡＶを注射したマウスのマウス血清中の循環抗体レベルを示す。エピソーム発現とＣａｓ９媒介組み込みの比較が示される。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでの実験結果を左のパネルに示し、ＢＡＬＢ／ｃマウスでの実験結果を右のパネルに示す。

【図19】エピソームＡＡＶまたは組み込まれたＡＡＶ（デュアルＡＡＶ実験）から発現した抗体の結合能（ジカエンベロープタンパク質への結合）を示す。黒丸とひし形はＣ５７ＢＬ／６マウスでの実験を表し、白丸とひし形はＢＡＬＢ／ｃマウスでの実験を表す。ナイーブマウス血清にスパイクした陽性対照抗体（ＲＥＧＮ４４４６抗ジカ抗体）の結果も示される。

【図20】力価、結合、抗体の質、中和のアッセイを含む、マウスアルブミン遺伝子座の第１イントロンへの抗ジカ抗体の挿入を試験するための実験計画を示す。また、この実験で共送達された２つのＡＡＶのゲノム構造も示す。

【図21】Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、エピソームＡＡＶまたは組み込まれたＡＡＶ（デュアルＡＡＶ実験）から発現した抗体の中和アッセイの結果（ジカ感染）を示す。ナイーブマウス血清にスパイクした陽性対照抗体（ＲＥＧＮ４４４６抗ジカ抗体）の結果も示される。

【図22】エピソームＡＡＶまたは組み込まれたＡＡＶ（デュアルＡＡＶ実験）から発現した抗体のインビボジカ接種実験計画を示す。

【図23】以下で処理されたマウスにおけるジカウイルスによる接種の１日前のｈＩｇＧ血清レベルを示す。（１）ＰＢＳ（生理食塩水）；（２）オフターゲット対照抗体（ＣＡＧ ＨＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓ ＬＣ）（非ジカｍＡＢ）をエピソーム発現するＡＡＶ２／８；（３）低用量（１．０Ｅ＋１１ ＶＧ／マウス）または（４）高用量（５．０Ｅ＋１１ ＶＧ／マウス）の、ＲＥＧＮ４４４６抗ジカ抗体（ＣＡＳＩ ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）をエピソーム発現するＡＡＶ２／８（それぞれ、エピソーム－低用量およびエピソーム－高用量）；（５）低用量（５Ｅ＋１１ ＶＧ／マウス／ベクター）または（６）高用量（１Ｅ＋１２ ＶＧ／マウス／ベクター）の２つのＡＡＶ、１つはｇＲＮＡ１とＲＥＧＮ４４４６ ｍＡｂ発現カセット（ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）を担持し、第２のものはｓｅｒｐｉｎＡＰプロモーターによって駆動されるＣａｓ９カセットを担持する（それぞれ挿入－低および挿入－高）；あるいは（７）２００μｇのＣＨＯ精製ＲＥＧＮ４４４６抗ジカｍＡＢ（ＣＨＯ精製）。

【図24A】図２３と同じ群であるが、感染していない対照も含むジカ接種実験の結果（生存パーセント）を示す。

【図24B】図２４Ａと同じデータを示すが、力価で並べ替えている。図の上の表の値は、ジカウイルスの接種の１日前に測定されたモノクローナル抗体のレベル（μｇ／ｍＬ）であり、コードは、ｍＡＢテンプレートを送達したＡＡＶのタイプ（エピソーム発現のための単一ＡＡＶ、またはＣａｓ９媒介組み込みおよび低用量もしくは高用量のいずれかのためのデュアルＡＡＶのいずれか）である。

【図25】以下で処理されたマウスのｈＩｇＧ血清レベルを示す。（１）ＰＢＳ（生理食塩水）；（２）ＲＥＧＮ４４４６抗ジカ（ＣＡＳＩ ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）（エピソーム－５日目－抗ジカ）；（３）Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ（ＣＡＧ ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）（エピソーム－５日目－抗ＰｃｒＶ）；（４）Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗ＨＡ（ＣＡＧ ＬＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＨＣ）（エピソーム－５日目－抗ＨＡ）；（５）Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ（ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）（挿入－１２日目－抗ＰｃｒＶ）；または（６）Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗ＨＡ（ＬＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＨＣ）（挿入－１２日目－抗ＨＡ）。エピソームＡＡＶ実験はＣ５７ＢＬ／６マウスで実施され、挿入実験はＣａｓ９レディーマウスで実施された。

【図26】エピソームＡＡＶ（ＣＡＧ ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）または組み込まれたＡＡＶ（ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）から発現した抗ＰｃｒＶ抗体の結合能（ＰｃｒＶタンパク質への結合）を示す。精製された陽性対照抗体（Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ抗体）の結果も示される。エピソーム抗ジカ抗体を陰性対照として使用した。

【図27】細胞毒性アッセイの結果を示す。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株６０７７ＰｃｒＶ媒介性細胞毒性効果は、エピソームＡＡＶ（ＣＡＧ ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）または組み込まれたＡＡＶ（ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）から発現した抗ＰｃｒＶ抗体によって中和される。比較のために、ＰＢＳまたはナイーブマウス血清のいずれかで希釈したＣＨＯ精製抗ＰｃｒＶ抗体の結果を示す。エピソームＡＡＶ（ＣＡＳＩ ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）から発現した抗ジカ抗体を陰性対照として使用した。

【図28】エピソームＡＡＶ（ＣＡＧ ＬＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＨＣ）または組み込まれたＡＡＶ（ＬＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＨＣ）から発現した抗体の結合能（ＨＡタンパク質への結合）を示す。精製された陽性対照抗体（Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗ＨＡ抗体）の結果も示される。エピソーム抗ジカ抗体を陰性対照として使用した。

【図29】中和アッセイの結果を示す。インフルエンザ株Ｈ１Ｎ１Ａ／ＰＲ／８／１９３４は、エピソームＡＡＶ（ＣＡＧ ＬＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＨＣ）または組み込まれたＡＡＶ（ＬＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＨＣ）から発現した抗ＨＡ抗体によって中和される。精製された陽性対照抗体（Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗ＨＡ抗体）の結果も示される。精製した抗Ｆｅｌｄ１抗体および血清のみを陰性対照として使用した。

【図30】エピソームＡＡＶまたは組み込まれたＡＡＶ（デュアルＡＡＶ実験）から発現した抗体のインビボシュードモナス接種実験計画法を示している。

【図31】以下で処理したマウスにおける、９日前（シュードモナスの接種の７日前）にＡＡＶを注射したＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスのｈＩｇＧ力価を示す。（１）ＰＢＳ；（２）アイソタイプ対照抗体Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗ＨＡ（ＣＡＧ ＬＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＨＣ）（抗ＨＡ）をエピソーム発現するＡＡＶ２／８；（３）低用量（１．０Ｅ＋１０ ＶＧ／マウス）または（４）高用量（１．０Ｅ＋１１ ＶＧ／マウス）のＨ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ抗体（ＣＡＧ ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）をエピソーム発現するＡＡＶ２／８（エピソーム－低用量およびエピソーム－高）、（５）低用量（１Ｅ＋１１ ＶＧ／マウス／ベクター）または（６）高用量（１Ｅ＋１２ ＶＧ／マウス／ベクター）の２つのＡＡＶ、１つはｇＲＮＡ１とＨ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ ｍＡｂ発現カセット（ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）を担持し、第２のものはｓｅｒｐｉｎＡＰプロモーターによって駆動されるＣａｓ９カセットを担持する（それぞれ挿入－低および挿入－高）；あるいは（７）低用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）または（８）高用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）のＣＨＯ精製Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ ｍＡＢ（それぞれ、０．２ｍｐｋ ＣＨＯおよび１．０ｍｐｋ ＣＨＯ）。

【図32A】感染していない対照、保護されていない細菌のみの対照、保護されていないアイソタイプ対照も含む、図３１のエピソーム－低（ＣＡＧ低）、エピソーム－高（ＣＡＧ高）、挿入－低（ＫＩ低）、挿入－図３１の高（ＫＩ高）群での、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでのシュードモナス接種実験（生存パーセント）の結果を示す。

【図32B】感染していない対照、保護されていない細菌のみの対照、保護されていないアイソタイプ対照も含む、図３１のエピソーム－低（ＣＡＧ低）、エピソーム－高（ＣＡＧ高）、挿入－低（ＫＩ低）、挿入－図３１の高（ＫＩ高）群での、ＢＡＬＢ／ｃマウスでのシュードモナス接種実験（生存パーセント）の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0043】

定義
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コードされたおよびコード化されていないアミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾されるかまたは誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーが含まれる。「ドメイン」という用語は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。

【0044】

本明細書で互換的に使用される、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの類似体もしくは修飾バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらには、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、およびプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学修飾、生化学修飾、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。

【0045】

「ゲノムに組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれるように、細胞に導入されている核酸を指す。細胞のゲノムへの核酸の安定した組み込みのために、任意のプロトコールを使用してよい。

【0046】

「発現ベクター」または「発現コンストラクト」または「発現カセット」という用語は、特定の宿主細胞または生命体における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切な核酸配列に作動可能に連結された所望のコード配列を含む組換え核酸を指す。原核生物での発現に必要な核酸配列には、通常、プロモーター、オペレーター（任意選択）、リボソーム結合部位、およびその他の配列が含まれる。真核細胞は一般に、プロモーター、エンハンサー、終結およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られており、必要な発現を犠牲にすることなく、一部の要素を削除したり、他の要素を追加したりできる。

【0047】

「ターゲティングベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介ライゲーション、または細胞のゲノム中の標的位置への組換えの他の手段によって導入され得る組換え核酸を指す。

【0048】

「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含み、ウイルスベクター粒子へのパッケージングに十分な、またはそれを許容する要素を含む組換え核酸を指す。ベクターおよび／または粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を、インビトロ、エクスビボ、またはインビボのいずれかで細胞に導入する目的で利用することができる。ウイルスベクターの多くの形態が知られている。

【0049】

細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、タンパク質、および核酸に関して「分離された」という用語は、通常インサイチュで存在し得る他の細菌、ウイルス、細胞、または他の成分に関して比較的精製されている細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、タンパク質、および核酸、細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、タンパク質、および核酸の実質的に純粋な調製物までを含み、ならびにそれらの実質的に純粋な調製物を含む。「単離された」という用語はまた、天然に存在する対応物を有さず、化学的に合成され、それにより他の細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、タンパク質、および核酸が実質的に混入していないか、またはそれらに天然に付随する（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、もしくは他の成分）ほとんどの他の成分（例えば、細胞成分）から分離もしくは精製されているタンパク質および核酸も含む。

【0050】

「野生型」という用語は、（変異型、病変した、改変したなどとは対照的に）正常な状態または文脈に見られるような構造および／または活性を有する実体を指す。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。

【0051】

「内因性配列」という用語は、細胞または動物内で天然に存在する核酸配列を指す。例えば、動物の内因性アルブミン配列は、動物のアルブミン遺伝子座で天然に存在する天然のアルブミン配列を指す。

【0052】

「外因性」分子または配列には、その形態で細胞に通常は存在しない分子または配列が含まれる。通常の存在には、細胞の特定の発生段階および環境条件に関する存在が含まれる。外因性分子または配列には、例えば、細胞内の対応する内因性配列の変異バージョン、例えば、内因性配列のヒト化バージョンが含まれ得るか、または細胞内であるが、異なる形態の（すなわち、染色体内ではない）内因性配列に対応する配列が含まれ得る。対照的に、内因性分子または配列は、その形態で、特定の細胞において、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在する分子または配列を含む。

【0053】

核酸またはタンパク質の文脈で使用される場合の「異種」という用語は、核酸またはタンパク質が、同じ分子内で一緒に天然に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントに関して使用される場合、核酸またはタンパク質が、自然界で互いに同じ関係（例えば、一緒に結合されている）で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、自然界で他の分子と関連して見出されない、別の核酸分子内の、または別の核酸分子に結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、自然界でコード配列に関連して見出されない配列に隣接するコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、自然界で他のペプチドと関連して見出されない別のペプチド分子内にあるか、または別のペプチド分子に結合したアミノ酸のセグメントである（例えば、融合タンパク質、またはタグ付きタンパク質）。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種の分泌または局在化配列を含むことができる。

【0054】

「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対のコドンの組み合わせの多様性によって示されるように、コドンの縮重を利用し、一般に、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、特定の宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を改変するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸は、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または他の任意の宿主細胞を含む、所与の原核細胞または真核細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと改変することができる。コドン使用表は、例えば「コドン使用データベース」で容易に入手できる。これらの表は、様々な方法で適合させることができる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＮａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現のための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズム（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照のこと）もまた利用可能である。

【0055】

「遺伝子座」という用語は、遺伝子（または重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドをコードする配列、または生物のゲノムの染色体上の位置の特定の位置を指す。例えば、「アルブミン遺伝子座」は、アルブミン遺伝子、アルブミンＤＮＡ配列、アルブミンをコードする配列、またはそのような配列が常駐すると同定されている生物のゲノムの染色体上のアルブミンの位置の特定の位置を指し得る。「アルブミン遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはそれらの組み合わせを含む、アルブミン遺伝子の調節エレメントを含み得る。

【0056】

「遺伝子」という用語は、自然に存在する場合、少なくとも１つのコーディング領域と少なくとも１つの非コーディング領域を含む可能性のある染色体内のＤＮＡ配列を指す。産物（例えば、非限定的に、ＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列は、非コードイントロンで中断されたコード領域および５’端と３’端の両方のコード領域に隣接して位置する配列を含み得、遺伝子が全長のｍＲＮＡ（５’および３’の非翻訳配列を含む）に対応するようなる。さらに、調節配列を含む他の非コード配列（例えば、非限定的に、プロモーター、エンハンサー、および転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位、サイレンサー、絶縁配列、およびマトリックス結合領域も遺伝子に存在してもよい。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近接（例えば、非限定的に、１０ｋｂ以内）してもよく、または離れていてもよく、それらは遺伝子の転写と翻訳のレベルまたは速度に影響を及ぼす。

【0057】

「対立遺伝子」という用語は、遺伝子のバリアントを指す。いくつかの遺伝子は、染色体上の同じ位置、または遺伝子座に位置する様々な異なる形態を有する。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各ペアは、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合であり、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合であると記載される。

【0058】

「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始することを指示することができるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節する。プロモーターは、本明細書に開示される１つ以上の細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、多能性細胞、一細胞期胚、分化した細胞、またはそれらの組み合わせ）において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２において見出すことができる。

【0059】

構成的プロモーターは、すべての組織またはすべての発生段階の特定の組織で活性があるものである。構成的プロモーターの例としては、ヒトサイトメガロウイルス最初期（ｈＣＭＶ）、マウスサイトメガロウイルス最初期（ｍＣＭＶ）、ヒト伸長因子１アルファ（ｈＥＦ１α）、マウス伸長因子１アルファ（ｍＥＦ１α）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ニワトリベータアクチンハイブリッド（ＣＡＧまたはＣＢｈ）、ＳＶ４０初期、およびベータ２チューブリンプロモーターが挙げられる。

【0060】

誘導性プロモーターの例としては、例えば、化学的に調節されたプロモーターおよび物理的に調節されたプロモーターが挙げられる。化学的に調節されるプロモーターとしては、例えば、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、ｔｅｔ－Ｏｎプロモーター、もしくはｔｅｔ－Ｏｆｆプロモーター）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体のプロモーター、もしくはエクジソン受容体のプロモーター）、または金属調節プロモーター（例えば、金属タンパク質プロモーター）が挙げられる。物理的に調節されるプロモーターとしては、例えば、温度調節プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）、および光調節プロモーター（例えば、光誘導性プロモーターまたは光抑制性プロモーター）が挙げられる。

【0061】

組織特異的プロモーターは、例えば、ニューロン特異的プロモーター、グリア特異的プロモーター、筋細胞特異的プロモーター、心臓細胞特異的プロモーター、腎臓細胞特異的プロモーター、骨細胞特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、または免疫細胞特異的プロモーター（例えば、Ｂ細胞プロモーターまたはＴ細胞プロモーター）であり得る。

【0062】

発生的に調節されるプロモーターとしては、例えば、発生の胚段階の間のみ、または成体細胞においてのみ活性なプロモーターが挙げられる。

【0063】

「作動可能に連結」または「作動可能に連結されている」は、近位の２つ以上の構成要素（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）を含み、その両方の成分が正常に機能し、かつ構成要素の少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに及ぶ機能を媒介し得る可能性をもたらす。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、そのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、そのような配列が相互に近接していること、またはトランスに作用する（例えば、調節配列が、コード配列の転写を制御するために離れて作用し得る）ことを含み得る。

【0064】

核酸の「相補性」とは、核酸の一方の鎖のヌクレオチド配列が、その核酸塩基群の配向のために、反対側の核酸鎖の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡの相補的塩基は通常ＡとＴ、ＣとＧである。ＲＮＡでは通常ＣとＧ、ＵとＡである。相補性は完全または実質的／十分であり得る。２つの核酸間の完全な相補性は、２つの核酸が二重鎖を形成できることを意味し、二重鎖のすべての塩基がワトソン－クリック対形成によって相補的な塩基に結合する。「実質的」または「十分」に相補的とは、一方の鎖の配列が反対側の鎖の配列と完全におよび／または完全に相補的ではないが、２つの鎖の塩基間で十分な結合が起こり、ハイブリダイゼーション条件のセット（例えば、塩濃度と温度）で安定したハイブリッド複合体を形成することを意味する。このような条件は、配列と標準的な数学的計算を使用してハイブリダイズした鎖のＴｍ（融解温度）を予測するか、日常的な方法を使用してＴｍを経験的に決定することによって予測できる。Ｔｍは、２つの核酸鎖の間に形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性する（すなわち、二本鎖核酸分子の集団が一本鎖に半分解離する）温度を含む。Ｔｍより低い温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成が有利であるが、Ｔｍより高い温度では、ハイブリダイゼーション複合体中の鎖の融解または分離が有利である。他の既知のＴｍ計算は核酸の構造的特徴を考慮するが、Ｔｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％）を使用することにより、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中の既知のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸について推定され得る。

【0065】

ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的な配列を含むことを要求するが、塩基間のミスマッチも可能である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の度合いに依存する。２つの核酸配列間の相補性の度合いがより大きいと、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値がより大きくなる。短い区間の相補性（例えば、３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下、または１８以下のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置は、重要になる（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．の１１．７～－１１．８を参照）。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小の長さは、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、および少なくとも約３０ヌクレオチドを含む。さらに、温度および洗浄溶液の塩濃度は、相補性の領域の長さおよび相補性の度合いなどの要素に従って、必要に応じて調整され得る。

【0066】

ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズするべきその標的核酸の配列と１００％相補性である必要はない。さらに、ポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズし、介在するセグメント、または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しない（例えば、ループ構造、またはヘアピン構造）ようになってもよい。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、それらが標的とされている標的核酸配列内の標的領域に対する少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相補性を含み得る。例えば、２０ヌクレオチドのうち１８ヌクレオチドが標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするであろうｇＲＮＡは、９０％の相補性を表すであろう。この例において、残りの非相補性ヌクレオチドは、相補性ヌクレオチドとクラスターを形成するか、散在していてもよく、互いに、または相補性ヌクレオチドと連続的である必要はない。

【0067】

核酸内の特定の区間の核酸配列間の相補性パーセントは、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアラインメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６）またはＧａｐ ｐｒｏｇｒａｍ （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用して（デフォルト設定を使用し、これは（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）のアルゴリズムを使用する）、日常的に決定できる。

【0068】

本明細書で提供される方法および組成物は、様々な異なる成分を使用する。記載全体の一部の成分には、活性バリアントと断片を含めることができる。このような成分には、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびガイドＲＮＡが含まれる。これらの成分のそれぞれの生物学的活性は、本明細書のいずこかに記載されている。「機能性」という用語は、生物学的活性または機能を示すタンパク質または核酸（またはその断片、もしくはバリアント）の生来の能力を指す。そのような生物学的活性または機能には、例えば、Ｃａｓタンパク質がガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡ配列に結合する能力が含まれ得る。機能的断片またはバリアントの生物学的機能は、元の分子と比較して同じであるか、または実際に変更され得る（例えば、それらの特異性または選択性または有効性に関して）が、分子の基本的な生物学的機能を保持する。

【0069】

「バリアント」という用語は、集団で最も一般的な配列とは異なるヌクレオチド配列（例えば、１ヌクレオチド）、または集団で最も一般的な配列とは異なるタンパク質配列（例えば、１アミノ酸）を指す。

【0070】

「断片」という用語は、タンパク質に言及する場合、全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。「断片」という用語は、核酸に言及する場合、全長の核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、または内部断片（すなわち、タンパク質のＮ末端とＣ末端のそれぞれの一部の除去）であり得る。断片は、例えば、核酸断片を指す場合、５’断片（すなわち、核酸の３’末端の一部の除去）、３’断片（すなわち、核酸の５’末端の一部の除去）、または内部断片（すなわち、核酸の５’末端と３’末端のそれぞれの一部の除去）であり得る。

【0071】

２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大の一致のためにアラインさせる場合、同じである２つの配列の残基を指す。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なり、その保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有し、したがって、分子の機能特性を変化させない他のアミノ酸残基で置換されている。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを、置換の保存的性質について補正するために、上方に調整してもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を行う手段は、周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、それによって、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換がゼロのスコアを与えられる場合に、保存的置換は、ゼロから１のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行されるように計算される。

【0072】

「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較することによって決定される値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加また欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。特に明記しない限り（例えば、短い方の配列が、連結された非相同配列を含む）、比較ウィンドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の全長である。

【0073】

特に明記しない限り、配列同一性／類似性の値は、パラメーター：５０のＧＡＰ重量および３の長さ重量、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列の同一性％および類似性％；８のＧＡＰ重量および２の長さ重量、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列の同一性％および類似性％を使用し、ＧＡＰバージョン１０またはその任意の同等のプログラムを使用して得られた値を指す。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。

【0074】

「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、または極性の、異なるアミノ酸との置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、またはグリシンとセリンの間などの、１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換が含まれる。加えて、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、またはメチオニンから極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、またはリシンへの、および／または極性残基から非極性残基への置換が含まれる。典型的なアミノ酸の分類は、以下の表１に要約されている。

【0075】

【表1】

【0076】

「相同」配列（例えば、核酸配列）は、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、既知の参照配列と同一か、または実質的に同様である配列のいずれかを含む。相同配列は、例えば、オルソロガス配列およびパラロガス配列を含み得る。例えば、相同遺伝子は典型的には、種分化イベント（オルソロガス遺伝子）または遺伝子重複イベント（パラロガス遺伝子）のいずれかを介して、共通の祖先ＤＮＡ配列から派生する。「オルソロガス」遺伝子には、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した様々な種の遺伝子が含まれる。オーソログは典型的には、進化の過程で同じ機能を保持している。「パラロガス」遺伝子には、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子が含まれる。パラログは、進化の過程で新しい機能を進化させることができる。

【0077】

「インビトロ」という用語は、人工環境、および人工環境（例えば、試験管または単離された細胞もしくは細胞株）内で生じるプロセスまたは反応を含む。「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、細胞または生物または身体）、および天然環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。「エクスビボ」という用語は、個体の体から取り出された細胞、およびそのような細胞内で起こるプロセスまたは反応を含む。

【0078】

「レポーター遺伝子」という用語は、内因性または異種プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列を含むコンストラクトがプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化に必要な因子を含む（または含むようにすることができる）細胞に導入される場合、容易かつ定量的にアッセイされる遺伝子産物（典型的には酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。レポーター遺伝子の例としては、ベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌のクロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。「レポータータンパク質」は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。

【0079】

本明細書で使用される場合、「蛍光レポータータンパク質」という用語は、蛍光に基づいて検出可能なレポータータンパク質を意味し、ここで、蛍光は、レポータータンパク質から直接、蛍光発生基質に対するレポータータンパク質の活性、または蛍光タグ付き化合物への結合について親和性を有するタンパク質のいずれかからのものであり得る。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、モノメリックアザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、シトリン、ヴィーナス、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、アズライト、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、サファイア、およびＴサファイア）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、およびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、およびＪｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ）、ならびにフローサイトメトリー法で細胞内の存在を検出できるその他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。

【0080】

二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答する修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路（相同組換え（ＨＲ）と非相同末端結合（ＮＨＥＪ））を介して行われる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｓｐａｒｅｋ＆Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２（８）：８８６－８９７を参照されたい。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介される標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含み得る。

【0081】

「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間で遺伝情報を交換する任意のプロセスを含み、任意のメカニズムによって起こり得る。組換えは、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）を介して発生する可能性がある。ＨＤＲまたはＨＲには、ヌクレオチド配列の相同性を必要とする可能性のある核酸修復の形式が含まれ、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復のテンプレートとして「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の導入をもたらす。特定の理論に拘束されることを望まないが、そのような導入は、壊れた標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーが標的の一部となる遺伝情報を再合成するために使用される合成依存的鎖アニーリング、および／または関連するプロセスを含み得る。場合によっては、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５３：９１０－９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４５７６８：１－９、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたい。

【0082】

非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、相同テンプレートを必要とせずに、切断末端を互いにまたは外因性配列への直接ライゲーションによる、核酸における二本鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる非隣接配列のライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断部位の近くで欠失、挿入、または転座を引き起こす可能性がある。例えば、ＮＨＥＪはまた、切断末端を外因性ドナー核酸の末端と直接ライゲーションすること（すなわち、ＮＨＥＪベースの捕捉）により、外因性ドナー核酸の標的化された組み込みをもたらすことができる。このようなＮＨＥＪを介した標的組み込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用できない場合（例えば、非分裂細胞、一次細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復を不十分に行う細胞）、外因性ドナー核酸の挿入に適している。さらに、相同組換え修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域に関する知識は必要なく、これは、ゲノム配列の知識が限られているゲノムを有する生物への標的化挿入を試みるときに有益である。組み込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列との間の平滑末端のライゲーションを介して、または切断されたゲノム配列のヌクレアーゼ剤によって生成されたものと互換性がある突出に隣接する外因性ドナー核酸を使用する突出末端（すなわち、５’または３’突出を有する）のライゲーションを介して進行することができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびＭａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（３）：５３９－５４６を参照されたい。平滑末端がライゲーションされる場合、断片結合に必要なマイクロホモロジーの領域を生成するために標的および／またはドナー切除が必要になる場合があり、これにより標的配列に望ましくない変化が生じる可能性がある。

【0083】

１つ以上の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分との組み合わせで含有し得る。「本質的に～からなる」という移行句は、請求項の範囲が、請求項に記載された特定の要素、および特許請求された発明の基本的かつ新規の特性に実質的に影響を及ぼさない要素を包含すると解釈されることを意味する。したがって、本発明の請求項で使用される場合の「本質的に～からなる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されることを意図するものではない。

【0084】

「任意選択的の」または「任意選択で」は、引き続いて記載された事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、および説明が、当該事象または状況が起こる場合の例およびそれが起こらない場合の例を含むことを意味する。

【0085】

値の範囲の指定は、その範囲内の、またはその範囲を定義するすべての整数、およびその範囲内の整数によって定義されるすべての部分範囲を含む。

【0086】

文脈から特に明らかでない限り、「約」という用語は記載された値の±５である値を包含する。

【0087】

「および／または」という用語は、関連する列挙された項目の１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替物（「または」）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、包含する。

【0088】

「または」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを指し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。

【0089】

冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が別段に明確に規定していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「タンパク質」または「少なくとも１つのタンパク質」という用語は、それらの混合物を含む複数のタンパク質を含むことができる。

【0090】

統計的に有意なとは、ｐ≦０．０５を意味する。
（発明を実施するための形態）

【0091】

Ｉ．概要
中和抗体は、抗菌および抗ウイルス免疫において重要な役割を果たし、細菌性またはウイルス性疾患の予防または調節に役立つ。このような抗体は、細胞が生物学的に持つ効果を中和することにより、抗原または感染体から細胞を防御する。

【0092】

能動ワクチン接種は、一般的にウイルス性疾患と闘うための最良のアプローチと考えられており、細菌性疾患と闘うためにも同様に使用できる。能動免疫とは、身体を抗原にさらして適応免疫応答を生成するプロセスを指す。応答が発生するまでに数日／数週間かかるが、数年続く場合がある。受動免疫とは、感染から保護するために、外因性の供給源から事前に形成された特異的抗体を提供するプロセスを指す。しかし、個人の免疫システムは刺激されていないため、免疫記憶は生成されない。その結果、受動免疫は即時であるが、短命の保護を提供する。保護は数年ではなく数日から数か月続く。受動免疫は、ワクチン接種に比べていくつかの利点がある。特に、受動免疫は、新しい薬剤耐性微生物の出現、薬物療法に反応しない疾患、および従来のワクチンに応答できない免疫系障害のある固体にとって魅力的なアプローチになっている。

【0093】

感染または能動ワクチン接種の際に免疫系によって作られた抗体は、細菌またはウイルスの表面上の容易にアクセス可能なループに焦点を合わせる傾向があり、それらはしばしば大きな配列および立体配座の変動性を有する。これは、細菌またはウイルスの集団はこれらの抗体をすばやく回避することができ、抗体は機能に不可欠ではないタンパク質の部分を攻撃するという２つの理由で問題である。例えば、ＨＩＶのようないくつかのウイルスに対する効果的なワクチンの開発への障害は、そのようなウイルスが変異して多数の準種に進化するという並外れた能力である。細菌またはウイルスの多くの株または準種を攻撃するため「広域」と呼ばれ、細菌またはウイルスの主要な機能部位を攻撃して感染を阻止するため「中和」と呼ばれる、広域中和抗体は、これらの問題を克服できる。しかしながら、これらの抗体は通常遅すぎて疾患からの効果的な保護を提供できず、そのような抗体による治療は短期間の保護しか提供しない。

【0094】

広域中和抗体などの抗原結合タンパク質のコード配列をインビボで動物のアルブミン遺伝子座などのセーフハーバー遺伝子座に組み込むための、方法および組成物が本明細書で提供される。抗原結合タンパク質をコードする配列は、一本鎖抗原結合タンパク質ではない抗原結合タンパク質を生成するために、同じセーフハーバー遺伝子座に組み込まれた重鎖コード配列および別個の軽鎖コード配列を含み得る。同様に、インビボで動物の任意のゲノム遺伝子座に広域中和抗体などの抗原結合タンパク質のコード配列を組み込むための方法および組成物が本明細書で提供される。抗原結合タンパク質をコードする配列は、一本鎖抗原結合タンパク質ではない抗原結合タンパク質を生成するために、同じゲノム遺伝子座に組み込まれた重鎖コード配列および別個の軽鎖コード配列を含み得る。そのような方法は、感染症を含む多くの疾患の治療ウィンドウに到達する高レベルの抗体発現をもたらし、典型的に、細胞あたり複数のコピーで持続するエピソームベクターによって達成される発現レベルに匹敵する。本明細書に開示される方法におけるコード配列の組み込みは、非複製エピソームが細胞分裂を通じて漸進的かつ迅速に希釈されるため、導入遺伝子の保持が非複製エピソームベクターで問題となる可能性があるため、非組み込みエピソームベクターよりも有利である。細胞分裂では、ＡＡＶ ＤＮＡは細胞分裂によって希釈されるため、治療応答を継続するには、より多くのウイルスを投与する必要がある。これらのその後の曝露は、ウイルスの急速な中和をもたらし、したがって、宿主応答の低下をもたらす可能性がある。しかしながら、これらの問題は、本明細書に開示される組み込み方法が使用される場合には発生しない。本明細書に開示される方法によって達成される抗体発現のレベルは、ウイルスおよび細菌などの感染性病原体による感染から動物を保護するか、またはそのような感染性病原体による感染を治療することができる。しかしながら、方法および組成物は、ウイルスまたは細菌の抗原を標的とする治療用抗体に限定されず、他の治療用抗体も包含する。

【0095】

ＩＩ．セーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を挿入する方法
インビボで細胞または動物のセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を挿入するための方法が本明細書で提供される。同様に、インビトロまたはエクスビボで細胞においてセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を挿入するための方法が本明細書で提供される。同様に、インビボで細胞または動物においてゲノム遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を挿入するための方法が本明細書で提供される。同様に、インビトロまたはエクスビボで細胞においてゲノム遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を挿入するための方法が提供される。同様に、対象（例えば、インビボの動物または細胞）内のゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を挿入することでの使用のための、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸であって、ヌクレアーゼ剤は、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的として切断し、外因性ドナー核酸は、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に挿入される、ヌクレアーゼ剤または（１つ以上の核酸）および外因性ドナー核酸が提供される。同様に、対象（例えば、インビボでの動物または細胞）のゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を挿入する際に使用するための、抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸であって、外因性ドナー核酸は、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に挿入される、外因性ドナー核酸が提供される。同様に、対象（例えば、動物）における疾患の治療または予防の実施（予防）での使用のための、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸であって、ヌクレアーゼ剤は、対象のゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的として切断し、外因性ドナー核酸は、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に挿入され、抗原結合タンパク質は対象で発現し、疾患に関連する抗原を標的とする、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）および外因性ドナー核酸が提供される。同様に、対象（例えば、動物）における疾患の治療または予防の実施（予防）での使用のための、抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸であって、外因性ドナー核酸は、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に挿入され、抗原結合タンパク質は対象で発現し、疾患に関連する抗原を標的とする、外因性ドナー核酸が提供される。そのような方法は、例えば、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸を動物または細胞に導入することを含み得る。ヌクレアーゼ剤は、標的部位を切断することができ、抗原結合タンパク質をコードする配列がゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に挿入されて、改変されたゲノム遺伝子またはセーフハーバー遺伝子座をもたらす。代替的に、そのような方法は、抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸を動物または細胞に導入することを含み得る。抗原結合タンパク質をコードする配列は、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に挿入され（例えば、相同組換えまたは組換えまたは挿入のための他の任意のメカニズムを介して）、改変されたゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座をもたらす。同様に、抗原結合タンパク質をコードする配列をゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子に挿入するための方法、または抗原結合タンパク質をコードする配列をゲノム遺伝子座またはゲノム内のセーフハーバー遺伝子座に挿入するための方法が提供される。そのような方法は、例えば、ゲノム遺伝子またはセーフハーバー遺伝子またはゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座を、ゲノム遺伝子／遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子／遺伝子座の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤（あるいはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸と接触させることを含み得、ヌクレアーゼ剤が標的部位を切断し、抗原結合タンパク質をコードする配列がゲノム遺伝子／遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子／遺伝子座に挿入され、改変されたゲノム遺伝子／遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子／遺伝子座をもたらす。代替的に、そのような方法は、ゲノム遺伝子／遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子／遺伝子座を、抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸と接触させることを含み得、抗原結合タンパク質をコードする配列は、ゲノム遺伝子／遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子／遺伝子座に挿入され、改変されたゲノム遺伝子／遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子／遺伝子座をもたらす。任意選択で、ゲノム遺伝子／遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子／遺伝子座の異なる標的部位を標的とする２つ以上のヌクレアーゼ剤を使用することができる。改変されたゲノム遺伝子／遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子／遺伝子座は、抗原結合タンパク質をコードする配列についてヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。

【0096】

任意選択で、そのような方法は、動物における抗原結合タンパク質の発現および／または活性を評価することをさらに含むことができる。そのような方法の例は、抗原結合タンパク質（およびコード配列）の例、ヌクレアーゼ剤の種類、外因性ドナー核酸の種類、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の種類、およびそのような方法で使用できる動物の種類と同様に、本明細書のいずこかに開示されている。いくつかの方法では、動物からの血清または血漿サンプルにおける抗原結合タンパク質の発現は、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）および外因性ドナー配列の注射後、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、または約６ヶ月の時点で、少なくとも約５００、少なくとも約１０００、少なくとも約１５００、少なくとも約２０００、少なくとも約２５００、少なくとも約３０００、少なくとも約３５００、少なくとも約４０００、少なくとも約４５００、少なくとも約５０００、少なくとも約５５００、少なくとも約６０００、少なくとも約６５００、少なくとも約７０００、少なくとも約７５００、少なくとも約８０００、少なくとも約８５００、少なくとも約９０００、少なくとも約９５００、少なくとも約１００００、少なくとも約２００００、少なくとも約３００００、少なくとも約４００００、少なくとも約５００００、少なくとも約６００００、少なくとも約７００００、少なくとも約８００００、少なくとも約９００００、少なくとも約１０００００、少なくとも約１１００００、少なくとも約１２００００、少なくとも約１３００００、少なくとも約１４００００、少なくとも約１５００００、少なくとも約２０００００、少なくとも約２５００００、少なくとも約３０００００、少なくとも約３５００００、少なくとも約４０００００、少なくとも約５０００００、少なくとも約６０００００、少なくとも約７０００００、少なくとも約８０００００、少なくとも約９０００００、または少なくとも約１００００００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、少なくとも約０．５、少なくとも約１、少なくとも約１．５、少なくとも約２、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、少なくとも約５．５、少なくとも約６、少なくとも約６．５、少なくとも約７、少なくとも約７．５、少なくとも約８、少なくとも約８．５、少なくとも約９、少なくとも約９．５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１０００μｇ／ｍＬ）である。例えば、発現は、注射後、約２週間、約４週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、または約６ヶ月で、少なくとも約２５００、少なくとも約５０００、少なくとも約１００００、少なくとも約１０００００、少なくとも約４０００００、少なくとも約５０００００、少なくとも約６０００００、少なくとも約７０００００、少なくとも約８０００００、少なくとも約９０００００、または少なくとも約１００００００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、少なくとも約２．５、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約１１００、少なくとも約１２００、少なくとも約１３００、少なくとも約１４００、または少なくとも約１５００μｇ／ｍＬ）であり得る。抗原結合タンパク質または抗体が細菌またはウイルス抗原を標的とするいくつかの方法では、感染率は、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）および外因性ドナー配列の注射後、（例えば、中和アッセイで決定される場合、）約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、または約６ヶ月の時点で、陰性対照サンプルの感染性と比較して、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０未満％、約２５％未満に低下する。例えば、感染性は、注射後約２週間で、約６５％未満、約６０％未満、または約５５％未満に低下し得る。

【0097】

ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）および外因性ドナー配列は、本明細書のいずこかに開示されているように、任意の送達方法（例えば、ＡＡＶ、ＬＮＰ、またはＨＤＤ）および任意の投与経路を介して、任意の形態（例えば、ＤＮＡまたはガイドＲＮＡのＲＮＡ；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質のタンパク質）で導入することができる。１つの具体的な例において、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達によって送達され、外因性ドナー核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達（例えば、ＡＡＶ８を媒介送達またはＡＡＶ２／８媒介送達）を介して送達される。例えば、ヌクレアーゼ剤はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり得、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座（例えば、アルブミンのイントロン１）を標的とするｇＲＮＡは、ＬＮＰ媒介送達を介して送達され得、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶ８媒介送達またはＡＡＶ２／８媒介送達を介して送達され得る。別の具体的な例では、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）と外因性ドナー核酸の両方は、ＡＡＶ媒介送達を介して（例えば、２つの別々のＡＡＶ８またはＡＡＶ２／８などの２つの別個のＡＡＶを介して）送達される。例えば、第１のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ２／８）は、Ｃａｓ９発現カセットを担持することができ、第２のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ２／８）は、ｇＲＮＡ発現カセットおよび外因性ドナー核酸を担持することができる。代替的に、第１のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ２／８）は、Ｃａｓ９発現カセットおよびｇＲＮＡ発現カセットを担持することができ、第２のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ２／８）は、外因性ドナー核酸を担持することができる。Ｕ６プロモーターまたはｓｍａｌｌ ｔＲＮＡ Ｇｌｎなど、様々なプロモーターを使用してｇＲＮＡの発現を駆動することができる。同様に、Ｃａｓ９の発現を駆動するために様々なプロモーターを使用できる。いくつかの方法では、Ｃａｓ９コード配列がＡＡＶコンストラクトに適合することができるように小さなプロモーターが使用される。そのようなプロモーターの例としては、Ｅｆｓ、ＳＶ４０、または肝臓特異的エンハンサー（例えば、ＨＢＶウイルス由来のＥ２またはセルピンＡ遺伝子由来のセルピンＡ）およびコアプロモーター（例えば、本明細書に開示されたＥ２Ｐ合成プロモーターまたはセルピンＡＰ合成プロモーター）を含む合成プロモーターが挙げられる。

【0098】

抗原結合タンパク質をコードする配列は、動物の特定の種類の細胞に挿入することができる。ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）および外因性ドナー配列を動物に導入するための方法およびビヒクルは、動物のどのタイプの細胞が標的とされるかに影響を及ぼし得る。いくつかの方法では、例えば、抗原結合タンパク質をコードする配列は、肝細胞のゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に挿入される。ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）および外因性ドナー配列を動物に導入するための方法およびビヒクル（脂質ナノ粒子媒介送達およびＡＡＶ８媒介送達またはＡＡＶ２／８媒介送達などの肝臓を標的とする方法およびビヒクルを含む）は、本明細書のいずこかでより詳細に開示されている。

【0099】

ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座、特にアルブミンセーフハーバー遺伝子座への抗原結合タンパク質をコードする配列の標的化挿入は、複数の利点を提供する。そのような方法は、抗原結合タンパク質をコードする配列の安定した長期発現を可能にするための安定した改変をもたらす。アルブミンのセーフハーバー遺伝子座に関して、そのような方法は、天然のアルブミンエンハンサー／プロモーターの高い転写活性を利用することができる。インビボ遺伝子ターゲティングでは、修正された細胞を積極的に選択することが不可能な場合があり、限られた数の細胞をターゲティングしても、疾患の表現型を修正するのに十分な分泌タンパク質が得られない場合がある。肝臓を指向する遺伝子導入は、たとえごく一部の肝細胞しか標的にされていなくても、肝臓が大量のタンパク質を血中に分泌する能力があるため、魅力的である。

【0100】

抗原結合タンパク質をコードする配列は、外因性ドナー核酸の外因性プロモーターに作動可能に連結することができる。使用できるプロモーターのタイプの例は、本明細書のいずこかに開示されている。代替的に、抗原結合タンパク質配列は、プロモーターのない遺伝子を含むことができ、挿入された抗原結合タンパク質をコードする配列は、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の内因性プロモーターに作動可能に連結され得る。内因性プロモーターの使用は、外因性ドナー配列にプロモーターを含める必要がなく、例えば、ＡＡＶでは通常効率的にパッケージングされない可能性があるより大きな導入遺伝子のパッケージングを可能にするため、有利である。例えば、挿入された抗原結合タンパク質をコードする配列は、内因性アルブミン遺伝子座に挿入され、内因性アルブミンプロモーターに作動可能に連結されて、主に肝組織において高い発現レベルをもたらすことができる。

【0101】

任意選択で、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の内因性遺伝子の一部またはすべてを、抗原結合タンパク質をコードする配列の挿入時に発現させることができる。代替的に、いくつかの実施形態では、内因性ゲノム遺伝子またはセーフハーバー遺伝子のいずれも発現させることができない。一例として、改変されたゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座は、内因性分泌シグナルと抗原結合タンパク質とを含むキメラタンパク質をコードすることができる。例えば、アルブミン遺伝子の第１エキソンは、最終的なタンパク質産物から切断される分泌ペプチドをコードするため、アルブミン遺伝子座の第１イントロンを標的にすることができる。このようなシナリオでは、スプライスアクセプターと抗原結合タンパク質をコードする配列を担持するプロモーターのない抗原結合タンパク質カセットが、抗原結合タンパク質の発現と分泌をサポートする。アルブミンエキソン１と組み込まれた抗原結合タンパク質をコードする配列との間のスプライシングは、抗原結合タンパク質配列に作動可能に連結された内因性分泌ペプチドを含むキメラｍＲＮＡおよびタンパク質を作成する。

【0102】

外因性ドナー配列の抗原結合タンパク質をコードする配列は、任意の手段でゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に挿入することができる。二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答する修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路（相同組換え（ＨＲ）と非相同末端結合（ＮＨＥＪ））を介して行われる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｓｐａｒｅｋ＆Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ＆Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６－８９７を参照されたい。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介される標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含み得る。

【0103】

「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間で遺伝情報を交換する任意のプロセスを含み、任意のメカニズムによって起こり得る。組換えは、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）を介して発生する可能性がある。ＨＤＲまたはＨＲには、ヌクレオチド配列の相同性を必要とする可能性のある核酸修復の形式が含まれ、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復のテンプレートとして「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の導入をもたらす。特定の理論に拘束されることを望まないが、そのような導入は、壊れた標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーが標的の一部となる遺伝情報を再合成するために使用される合成依存的鎖アニーリング、および／または関連するプロセスを含み得る。場合によっては、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５３：９１０－９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４５７６８：１－９、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたい。

【0104】

ＮＨＥＪは、相同テンプレートを必要とせずに、切断末端を互いにまたは外因性配列への直接ライゲーションによる、核酸における二本鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる非隣接配列のライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断部位の近くで欠失、挿入、または転座を引き起こす可能性がある。例えば、ＮＨＥＪはまた、切断末端を外因性ドナー核酸の末端と直接ライゲーションすること（すなわち、ＮＨＥＪベースの捕捉）により、外因性ドナー核酸の標的化された組み込みをもたらすことができる。このようなＮＨＥＪを介した標的組み込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用できない場合（例えば、非分裂細胞、一次細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復を不十分に行う細胞）、外因性ドナー核酸の挿入に適している。さらに、相同組換え修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域に関する知識は必要なく、これは、ゲノム配列の知識が限られているゲノムを有する生物への標的化挿入を試みるときに有益である。組み込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列との間の平滑末端のライゲーションを介して、または切断されたゲノム配列のヌクレアーゼ剤によって生成されたものと互換性がある突出に隣接する外因性ドナー核酸を使用する突出末端（すなわち、５’または３’突出を有する）のライゲーションを介して進行することができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびＭａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（３）：５３９－５４６を参照されたい。平滑末端がライゲーションされる場合、断片結合に必要なマイクロホモロジーの領域を生成するために標的および／またはドナー切除が必要になる場合があり、これにより標的配列に望ましくない変化が生じる可能性がある。

【0105】

具体的な例では、外因性ドナー核酸は、相同性に依存しない標的化された組み込み（例えば、方向性のある相同性に依存しない標的化された組み込み）を介して挿入され得る。例えば、外因性ドナー核酸の抗原結合タンパク質をコードする配列は、ヌクレアーゼ剤の標的部位が両側に隣接している（例えば、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座と同じ標的部位、および同じヌクレアーゼ剤がゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の標的部位を切断するために使用される）。次いで、ヌクレアーゼ剤は、抗原結合タンパク質をコードする配列に隣接する標的部位を切断することができる。具体的な例では、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶ媒介送達で送達され、抗原結合タンパク質をコードする配列に隣接する標的部位の切断は、ＡＡＶの末端逆位配列（ＩＴＲ）を除去することができる。ＩＴＲを除去すると、繰り返された配列のために配列決定作業が妨げられる可能性があるため、成功したターゲティングの評価が容易になる。いくつかの方法では、抗原結合タンパク質をコードする配列が正しい方向でゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に挿入された場合、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の標的部位（例えば、隣接するプロトスペーサー隣接モチーフを含むｇＲＮＡ標的配列）はもはや存在しないが、抗原結合タンパク質のコード配列がゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に反対方向に挿入されると再形成される。これは、抗原結合タンパク質をコードする配列が発現のために正しい方向に挿入されることを確実にするのに役立ち得る。

【0106】

Ａ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼおよびその他のヌクレアーゼ剤
１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
本明細書に開示される方法および組成物は、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムまたはそのようなシステムの構成要素を利用して、細胞内のゲノム（例えば、ゲノム遺伝子座またはゲノム内のセーフハーバー遺伝子座、例えばアルブミン遺伝子座）を改変することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与する、またはその活性を指示する転写産物およびその他の要素が含まれている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例えば、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩシステム、またはタイプＶシステム（例えば、サブタイプＶ－ＡまたはサブタイプＶ－Ｂ）であり得る。本明細書に開示される方法および組成物は、核酸の部位特異的結合または切断のためにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用することができる。

【0107】

本明細書に開示される組成物および方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、天然に存在しなくてもよい。「天然に存在しない」システムには、システムの１つ以上の構成要素が天然に存在する状態から改変または変異されているか、自然に関連付けられている少なくとも１つの他の構成要素がないか、またはそれらが自然に関連付けられていない少なくとも１つの他の構成要素に関連付けられているなど、人間の手の関与を示すものが含まれる。例えば、一部のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、天然に存在しないｇＲＮＡとＣａｓタンパク質を含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ複合体を使用するか、天然に存在しないＣａｓタンパク質を使用するか、天然に存在しないｇＲＮＡを使用する。

【0108】

ａ．Ｃａｓタンパク質
Ｃａｓタンパク質は一般に、ガイドＲＮＡと相互作用できる少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮアーゼドメインまたはＲＮアーゼドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、および他のドメインを含み得る。いくつかのそのようなドメイン（例えば、ＤＮアーゼドメイン）は、天然のＣａｓタンパク質に由来してもよい。他のそのようなドメインを付加して、改変されたＣａｓタンパク質を作ってもよい。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む、核酸切断のための触媒活性を有する。切断は、平滑末端または千鳥状の末端を生成してもよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。例えば、野生型のＣａｓ９タンパク質は、通常、平滑の切断産物を生成する。代替的に、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は、５ヌクレオチドの５’突出を有する切断産物をもたらすことができ、切断は、非標的鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後に発生し、標的鎖の２３番目の塩基の後に発生する。Ｃａｓタンパク質は、完全な切断活性を有し、標的ゲノム遺伝子座で二本鎖切断を作成することができ（例えば、平滑末端を持つ二本鎖切断）、またはそれは、標的ゲノム遺伝子座で一本鎖切断を作成するニッカーゼであってもよい。

【0109】

Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｓｍ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそれらの相同体または改変バージョンが挙げられる。

【0110】

例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質はタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来のものであり、典型的には、保存された構造を持つ４つの重要なモチーフを共有している。モチーフ１、２、４はＲｕｖＣ様のモチーフで、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ種、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ種、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ種、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ種、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ種、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ種、Ｌｙｎｇｂｙａ種、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ種、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの追加の例は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられている）は、例示的なＣａｓ９タンパク質である。例示的なＳｐＣａｓ９タンパク質配列は、配列番号６２（配列番号６１に示されているＤＮＡ配列によってコードされている）に示されている。例示的なＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ配列は、配列番号６３に示されている。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．８：１４５００を参照されたい。ＳａＣａｓ９はＳｐＣａｓ９よりも小さく、ＣｊＣａｓ９はＳａＣａｓ９とＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＥｄｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７３（４）：７１４－７２６を参照されたい。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座によってコードされるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９ Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）またはＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座由来のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓｔ３Ｃａｓ９））は他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）または代替ＰＡＭ（Ｅ１３６９Ｒ／Ｅ１４４９Ｈ／Ｒ１５５６Ａ置換）を認識するＲＨＡ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９バリアントは、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。これらおよび他の例示的なＣａｓ９タンパク質は、例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１に概説される。

【0111】

Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １由来のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の対応するドメインに相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインと、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンリッチクラスターに対応するものを含む大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかしながら、Ｃｐｆ１はＣａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いており、ＨＮＨドメインを含む長いインサートを含むＣａｓ９とは対照的に、ＲｕｖＣ様ドメインはＣｐｆ１配列に隣接している。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７７１を参照されたい。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ亜種、ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ種ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；割り当てられたＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ｑ７Ｑ２）は、例示的なＣｐｆ１タンパク質である。

【0112】

Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、天然に存在するもの）、改変されたＣａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型または改変されたＣａｓタンパク質の断片であり得る。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または改変されたＣａｓタンパク質の触媒活性に関して、活性なバリアントまたは断片であり得る。触媒活性に関する活性なバリアントまたは断片は、野生型または修飾されたＣａｓタンパク質またはその一部に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含み得、活性なバリアントは、所望の切断部位で切断する能力を保持し、したがってニック誘導または二本鎖切断誘導活性を保持する。ニック誘導または二本鎖切断誘導活性のアッセイは知られており、一般に、切断部位を含むＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性および特異性を測定する。

【0113】

改変されたＣａｓタンパク質の一例は、改変されたＳｐＣａｓ９－ＨＦ１タンパク質であり、非特異的ＤＮＡ接触を減らすように設計された改変（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）を含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９の忠実度の高いバリアントである。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９（７５８７）：４９０－４９５を参照されたい。改変されたＣａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された改変されたｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたい。他のＳｐＣａｓ９バリアントには、Ｋ８５５ＡおよびＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが含まれる。これらおよび他の改変されたＣａｓ９タンパク質は、例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１に概説される。改変されたＣａｓ９タンパク質の別の例はｘＣａｓ９であり、これは拡張された範囲のＰＡＭ配列を認識できるＳｐＣａｓ９バリアントである。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ ５５６：５７－６３を参照されたい。

【0114】

Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、および酵素活性のうちの１つ以上を増加または減少させるように改変することができる。Ｃａｓタンパク質は、安定性など、タンパク質の他の活性または特性を変更するように改変することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインを改変、欠失、または不活性化することができ、またはＣａｓタンパク質を短縮して、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するか、またはＣａｓタンパク質の活性または特性を最適化（例えば、増強または低減）することができる。

【0115】

Ｃａｓタンパク質は、ＤＮアーゼドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含むことができる。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体構成で、標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質は、ＤＮアーゼドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含むこともできる。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は一般にＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインとＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインはそれぞれ、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断して、ＤＮＡに二本鎖切断を行うことができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１を参照されたい。

【0116】

ヌクレアーゼドメインの１つ以上またはすべてを欠失または変異させることで、それらがもはや機能しなくさせたり、ヌクレアーゼ活性が低下させたりすることができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質でヌクレアーゼドメインの１つが欠失または変異している場合、結果として得られるＣａｓ９タンパク質はニッカーゼと呼ばれ、二本鎖標的ＤＮＡ内で一本鎖切断を生成できるが、二本鎖切断は生成できない（すなわち、相補鎖または非相補鎖を切断できるが、両方を切断することはできない）。両方のヌクレアーゼドメインが欠失または変異した場合、結果として得られるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低下する（例えば、ヌクレアーゼヌルもしくはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、または触媒作用が破壊されているＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ））。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の位置１０でアスパラギン酸からアラニン）変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにあるＨ９３９Ａ（アミノ酸位置８３９でのヒスチジンからアラニン）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸位置８４０でのヒスチジンからアラニン）、またはＮ８６３Ａ（アミノ酸位置Ｎ８６３でのヒスチジンからアラニン）はＣａｓ９をニッカーゼに変換できる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の他の例には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９への対応する変異が含まれる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（２１）：９２７５－９２８２およびＷＯ２０１３／１４１６８０を参照されたい。このような変異は、部位特異的変異導入、ＰＣＲ媒介変異導入、または全遺伝子合成などの方法を使用して生成することができる。ニッカーゼを作成する他の変異の例は、例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１３／１４２５７８に見出すことができる。Ｃａｓタンパク質においてすべてのヌクレアーゼドメインが欠失または変異している（例えば、Ｃａｓ９タンパク質において両方のヌクレアーゼドメインが欠失または変異している）場合、結果として生じるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低下する（例えば、ヌクレアーゼヌル、またはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）。１つの具体的な例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０ＡのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９の二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９と最適に整列した場合の別の種由来のＣａｓ９の対応する二重変異体である。別の具体的な例は、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３ＡのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９の二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９と最適に整列した場合の別の種由来のＣａｓ９の対応する二重変異体である。

【0117】

ｘＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例は、ＳｐＣａｓ９について前述したものと同じである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、位置Ｎ５８０での置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）および位置Ｄ１０での置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含み得、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質をもたらす。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１０６２３６を参照されたい。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている（例えば、Ｄ１６ＡとＨ５８８Ａの組み合わせ）。Ｓｔ１Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている（例えば、Ｄ９Ａ、Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９Ａ、およびＮ６２２Ａの組み合わせ）。Ｓｔ３Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている（例えば、Ｄ１０ＡとＮ８７０Ａの組み合わせ）。ＣｊＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている（例えば、Ｄ８ＡとＨ５５９Ａの組み合わせ）。ＦｎＣａｓ９およびＲＨＡ ＦｎＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている（例えば、Ｎ９９５Ａ）。

【0118】

Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１ Ｃｐｆ１）由来のＣｐｆ１タンパク質を参照すると、このような変異には、ＡｓＣｐｆ１の９０８、９９３、もしくは１２６３の位置、またはＣｐｆ１オーソログの対応する位置、またはＬｂＣｐｆ１の８３２、９２５、９４７、もしくは１１８０の位置、またはＣｐｆ１オーソログの対応する位置が含まれ得る。そのような変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、およびＤ１２６３ＡまたはＣｐｆ１オーソログの対応する変異、またはＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、およびＤ１１８０ＡまたはＣｐｆ１オーソログの対応する変異のうちの１つ以上を含み得る。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／０２０８２４３を参照されたい。

【0119】

Ｃａｓタンパク質はまた、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は切断ドメインまたはエピジェネティック修飾ドメインに融合させることができる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい。Ｃａｓタンパク質は、安定性の増加または減少を提供する異種ポリペプチドに融合することもできる。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置してもよい。

【0120】

一例として、Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在化を提供する１つ以上の異種ポリペプチドに融合してもよい。そのような異種ポリペプチドは、例えば、核を標的とするための単一部分ＳＶ４０ ＮＬＳおよび／または二部分アルファインポーチンＮＬＳなどの１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを含んでもよい。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（８）：５１０１－５１０５を参照されたい。このような細胞内局在化シグナルは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または任意の場所に位置してもよい。ＮＬＳは、塩基性アミノ酸の区間を含むことができ、一部分配列または二部分配列であってよい。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端にＮＬＳ（例えば、アルファ－インポーチンＮＬＳまたは単一部分ＮＬＳ）およびＣ末端にＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳまたは二部分ＮＬＳ）を含む２つ以上のＮＬＳを含んでもよい。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端に２つ以上のＮＬＳおよび／またはＣ末端に２つ以上のＮＬＳを含み得る。

【0121】

Ｃａｓタンパク質は、細胞透過性ドメインまたはタンパク質導入ドメインに作動可能に連結してもよい。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来してもよい。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたい。細胞透過性ドメインは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または任意の場所に配置し得る。

【0122】

Ｃａｓタンパク質はまた、追跡または精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結してもよい。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、モノメリックアザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、シトリン、ヴィーナス、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、アズライト、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、サファイア、Ｔサファイア）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど）、およびその他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、血球凝集素（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。

【0123】

Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸またはドナー配列に係留してもよい。そのような係留（すなわち、物理的結合）は、共有相互作用または非共有相互作用を介して達成することができ、係留は、直接（例えば、タンパク質またはインテイン修飾上のシステインまたはリジン残基の修飾によって達成することができる直接融合または化学的結合を介して）、またはストレプトアビジンまたはアプタマーなどの１つ以上の介在するリンカーまたはアダプター分子を介して達成することができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５（１）：４１－５５、Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６（４６）：８８１９－８８２２、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ（２００９）Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２（１０）：１３２８－１３３２、Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．１０（９）：１５５１－１５５７、およびＫｈａｔｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０（１４）：４５３２－４５３９を参照されたい。タンパク質－核酸コンジュゲートを合成するための非共有戦略には、ビオチン－ストレプトアビジンおよびニッケル－ヒスチジン法が含まれる。共有結合タンパク質－核酸コンジュゲートは、様々な化学物質を使用して適切に機能化された核酸とタンパク質を接続することによって合成できる。これらの化学物質のいくつかは、タンパク質表面のアミノ酸残基（例えば、リジンアミンまたはシステインチオール）へのオリゴヌクレオチドの直接結合を含むが、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾または触媒もしくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質の核酸への共有結合の方法には、例えば、オリゴヌクレオチドのタンパク質リジンまたはシステイン残基への化学的架橋、発現されたタンパク質ライゲーション、化学酵素的方法、および光アプタマーの使用が含まれ得る。標識された核酸またはドナー配列は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端、Ｎ末端、または内部領域に係留されていてもよい。一例では、標識された核酸またはドナー配列は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端またはＮ末端に係留される。同様に、Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸またはドナー配列の５’末端、３’末端、または内部領域に係留されていてもよい。すなわち、標識された核酸またはドナー配列は、任意の方向および極性で係留してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸またはドナー配列の５’末端または３’末端に係留されていてもよい。

【0124】

Ｃａｓタンパク質は任意の形態で提供してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供してもよい。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供してもよい。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が細胞に導入されると、Ｃａｓタンパク質は、一過性に、条件付きで、または構成的に細胞内で発現され得る。

【0125】

ｍＲＮＡとして提供されるＣａｓタンパク質は、安定性および／または免疫原性の特性を改善するために修飾することができる。修飾は、ｍＲＮＡ内の１つ以上のヌクレオシドに対して行うことができる。ｍＲＮＡ核酸塩基への化学修飾の例には、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、および５－メチル－シチジンが含まれる。例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含むキャップされポリアデニル化されたＣａｓ ｍＲＮＡを使用することができる。同様に、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義のコドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾することができる。

【0126】

Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結することができる。代替的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現コンストラクト中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現コンストラクトは、遺伝子または他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸コンストラクトを含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に存在してもよい。代替的に、それは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別のベクターまたはプラスミドであってもよい。発現コンストラクトにおいて使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。任意選択で、プロモーターは、一方向のＣａｓタンパク質と他の方向のガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向プロモーターであってもよい。このような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ならびに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターで構成してもよい。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥとＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。双方向プロモーターを使用してＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。

【0127】

様々なプロモーターを使用して、Ｃａｓ発現またはＣａｓ９発現を駆動できる。いくつかの方法では、ＣａｓまたはＣａｓ９コード配列がＡＡＶコンストラクトに適合することができるように小さなプロモーターが使用される。そのようなプロモーターの例としては、Ｅｆｓ、ＳＶ４０、または肝臓特異的エンハンサー（例えば、ＨＢＶウイルス由来のＥ２またはセルピンＡ遺伝子由来のセルピンＡ）およびコアプロモーター（例えば、Ｅ２Ｐ合成プロモーターまたはセルピンＡＰ合成プロモーター）を含む合成プロモーターが挙げられる。

【0128】

ｂ．ガイドＲＮＡ
「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、「ＤＮＡ標的化セグメント」と「タンパク質結合セグメント」の２つのセグメントで構成できる。「セグメント」は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの連続したストレッチなどの、分子のセクションまたは領域を含む。Ｃａｓ９用などの一部のｇＲＮＡは、「アクチベーター－ＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）と「ターゲッター－ＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）の２つの別個のＲＮＡ分子を含むことができる。他のｇＲＮＡは単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり、これは「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれることもある。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、およびＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい。例えば、Ｃａｓ９の場合、シングルガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに（例えば、リンカーを介して）融合したｃｒＲＮＡを含むことができる。例えば、Ｃｐｆ１の場合、標的配列への結合を実現するために必要なのはｃｒＲＮＡだけである。「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、二重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡおよび単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。

【0129】

例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「アクチベーター－ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）と、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドの区間の両方を含む。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’）に位置するｃｒＲＮＡテールの例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号５１）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれも、配列番号５１の５’末端に結合して、ｃｒＲＮＡを形成することができる。

【0130】

対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーター－ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドの区間を含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドの区間は、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドの区間と相補的であり、ハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。そのようなとき、各ｃｒＲＮＡは対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言える。例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号５２）、ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１２１）、またはＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号１２２）を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。

【0131】

ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要なシステムでは、ｃｒＲＮＡと対応するｔｒａｃｒＲＮＡがハイブリダイズして、ｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要なシステムでは、ｃｒＲＮＡはｇＲＮＡであってもよい。ｃｒＲＮＡはさらに、標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを提供する。細胞内での修飾に使用する場合、特定のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に特異的になるように設計できる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３－８２６、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２２７－２２９、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２３３－２３９、およびＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－８２３を参照されたい。

【0132】

所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、以下により詳細に記載されるように、標的ＤＮＡの相補鎖上の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的に標的ＤＮＡと相互作用する。そのようなとき、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は変動してもよく、ｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。対象のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように改変することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと生物によって異なるが、２１から４６ヌクレオチドの長さの２つのダイレクトリピート（ＤＲ）が隣接する、２１から７２ヌクレオチドの長さの標的化セグメントをしばしば含む（例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、ハイブリダイズし、転じて、ｔｒａｃｒＲＮＡはＣａｓタンパク質に結合する。

【0133】

ＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、少なくとも約１２、１５、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０ヌクレオチドの長さを有してもよい。そのようなＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、約１２～約１００、約１２～約８０、約１２～約５０、約１２～約４０、約１２～約３０、約１２～約２５、または約１２～約２０ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは約１５～約２５ヌクレオチド（例えば、約１７～約２０ヌクレオチド、または約１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド）であってよい。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００２４５２３を参照されたい。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、１６～２０ヌクレオチド長、または１７～２０ヌクレオチド長である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは２１～２３ヌクレオチド長である。Ｃｐｆ１の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチド長または少なくとも１８ヌクレオチド長である。

【0134】

ｔｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）であってよく、様々な長さであってよい。それらは、一次転写物または処理された形態を含んでもよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部として、または２分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれ以上のヌクレオチド）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例には、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、および６５ヌクレオチドのバージョンが含まれる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１（７３４０）：６０２－６０７、ＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたい。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例には、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、および＋８５バージョン内にあるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが含まれ、「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれていることを示す。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，６９７，３５９を参照されたい。

【0135】

ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であってよい。ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、約２０個の連続するヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であってよい。一例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端にある１４個の連続するヌクレオチドに対して１００％であってよく、そして残りの部分に対して０％まで低くてもよい。このような場合、ＤＮＡ標的化セグメントは１４ヌクレオチドの長さであるとみなすことができる。別の例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端にある７個の連続するヌクレオチドに対して１００％であってよく、そして残りの部分に対して０％まで低くてもよい。このような場合、ＤＮＡ標的化セグメントは７ヌクレオチドの長さであるとみなすことができる。一部のガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的化セグメント内の少なくとも１７個のヌクレオチドが標的ＤＮＡの相補鎖に相補的である。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは２０ヌクレオチド長であり、標的ＤＮＡの相補鎖との１、２、または３個のミスマッチを含んでもよい。一例では、ミスマッチは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対応する相補鎖（すなわち、ＰＡＭ配列の逆相補体）の領域に隣接していない（例えば、ミスマッチは、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの５’末端にあるか、またはミスマッチは、ＰＡＭ配列に対応する相補鎖の領域から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９塩基対離れている）。

【0136】

ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的な２つのヌクレオチドの区間を含むことができる。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドはハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。対象のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは結合したＣａｓタンパク質をＤＮＡ標的化セグメントを介して標的化ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に誘導する。

【0137】

シングルガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントと足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合またはＣａｓ結合配列）を含んでもよい。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、３’足場配列に結合した５’ＤＮＡ標的化セグメントを有してもよい。例示的な足場配列は、以下を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる：ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１；配列番号５３）；ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２；配列番号５４）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３；配列番号５５）；ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４；配列番号５６）；およびＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（バージョン５；配列番号５７）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（バージョン６；配列番号１２３）；またはＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵ（バージョン７；配列番号１２４）。本明細書に開示されるガイドＲＮＡ標的配列のいずれかを標的とするガイドＲＮＡは、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のいずれかに融合したガイドＲＮＡの５’末端のＤＮＡ標的化セグメントを含んでもよい。すなわち、本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれも、上述の足場配列のうちのいずれかの５’末端に結合して、単一ガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。

【0138】

ガイドＲＮＡは、追加の望ましい特徴（例えば、改変または調節された安定性；細胞内標的化；蛍光標識による追跡；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）を提供する改変または配列を含み得る。そのような改変の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））；３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）；リボスイッチ配列（例えば、タンパク質および／またはタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節されたアクセス可能性を可能にするため）；安定性制御シーケンス；ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する改変または配列；追跡を提供する改変または配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を促進する部分への結合、蛍光検出を可能にする配列など）；タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する改変または配列、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。改変の他の例には、操作されたステムループ二重構造、操作されたバルジ領域、ステムループ二重構造の３’の操作されたヘアピン、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１５／０３７６５８６を参照されたい。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域と最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される二重鎖内のヌクレオチドの対になっていない領域であり得る。バルジは、二重鎖の片側に、対になっていない５’－ＸＸＸＹ－３’を含むことができる。ここで、Ｘは任意のプリンであり、Ｙは反対側の鎖のヌクレオチドおよび二重鎖の反対側の対になっていないヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成できるヌクレオチドであり得る。

【0139】

修飾されていない核酸は分解されやすい可能性がある。外因性の核酸はまた、自然免疫応答を誘発する可能性がある。修飾は、安定性を導入し、免疫原性を低下させるのに役立つ。ガイドＲＮＡは、例えば、以下のうちの１つ以上を含む修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを含むことができる：（１）ホスホジエステル骨格結合における、非結合リン酸酸素の１つもしくは両方および／または結合リン酸酸素の１つ以上の改変もしくは置換；（２）リボース糖の２’ヒドロキシルの改変または置換などのリボース糖の構成要素の改変または置換；（３）リン酸部分の脱リン酸化リンカーによる置換；（４）天然に存在する核酸塩基の修飾または置換；（５）リボース－リン酸骨格の置換または修飾；（６）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾（例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、または部分の結合）；ならびに（７）糖の修飾。他の可能なガイドＲＮＡ修飾には、ウラシルまたはポリウラシルトラクトの修飾または置換が含まれる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１５／０４８５７７およびＵＳ２０１６／０２３７４５５を参照されたい。同様の改変を、Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓをコードする核酸に加えることができる。例えば、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義のコドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾することができる。

【0140】

一例として、ガイドＲＮＡの５’または３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含んでもよい（例えば、塩基は、ホスホロチオエート基である修飾リン酸基を有してもよい）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’または３’末端の２、３、または４個の末端ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含んでもよい。別の例として、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有してもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端（例えば、５’末端）の２、３、または４個の末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾を含んでもよい。例えば、すべての目的のためにぞれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１およびＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５を参照されたい。１つの具体的な例において、ガイドＲＮＡは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の具体的な例では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用しないすべての２’ＯＨ基が２’－Ｏ－メチル類似体に置き換えられ、Ｃａｓ９と最小限の相互作用をゆするガイドＲＮＡのテール領域は、５’および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合で修飾されている。さらに、ＤＮＡ標的化セグメントは、一部の塩基に２’－フルオロ修飾を有する。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３５（１２）：１１７９－１１８７を参照されたい。改変されたガイドＲＮＡの他の例は、例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１０７０２８Ａ１に提供されている。そのような化学修飾は、例えば、エキソヌクレアーゼからのより優れた安定性および保護をガイドＲＮＡに提供して、それらが未修飾のガイドＲＮＡよりも長く細胞内に存続することを可能にする。このような化学修飾は、例えば、ＲＮＡを積極的に分解したり、細胞死をもたらす免疫カスケードを引き起こしたりする可能性のある自然免疫応答から保護することもできる。

【0141】

ガイドＲＮＡはどのような形態で提供してもよい。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別個のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ）または１つの分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかとして、または任意選択でＣａｓタンパク質との複合体の形態で、ＲＮＡの形態で提供してもよい。ｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供してもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）または別個のＲＮＡ分子（例えば、別個のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードしてもよい。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として、またはそれぞれｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別個のＤＮＡ分子として提供してもよい。

【0142】

ｇＲＮＡがＤＮＡの形態で提供される場合、ｇＲＮＡは一過性、条件付き、または構成的に細胞内で発現してもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結してもよい。代替的に、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現コンストラクトのプロモーターに作動可能に連結してもよい。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸などの異種核酸を含むベクター内にあってもよい。代替的に、それは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別のベクターまたはプラスミドにあってもよい。そのような発現コンストラクトにおいて使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向プロモーターであってよい。適切なプロモーターの具体例としては、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。別の例では、ｓｍａｌｌ ｔＲＮＡ Ｇｌｎを使用して、ガイドＲＮＡの発現を駆動してもよい。

【0143】

代替的に、ｇＲＮＡは他の様々な方法で調製してもよい。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって調製してもよい（例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい）。ガイドＲＮＡは、化学合成によって調製された合成分子にしてもよい。例えば、ガイドＲＮＡを化学的に合成して、２’－Ｏ－メチル類似体および最初の３個の５’および３’末端ＲＮＡ残基に３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含めてもよい。

【0144】

ガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）は、１個以上のガイドＲＮＡ（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上のガイドＲＮＡ）と、ガイドＲＮＡの安定性を増加させる（例えば、所定の保存条件下（例えば、－２０℃、４℃、または周囲温度）で、分解産物が閾値未満、例えば出発核酸またはタンパク質の０．５重量％未満のままである期間を延長する、あるいはインビボでの安定性を増加させる）担体と、を含む組成物であり得る。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ、Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻状物、および脂質微小管が挙げられる。そのような組成物は、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含んでもよい。

【0145】

ｃ．ガイドＲＮＡ標的配列
ガイドＲＮＡの標的ＤＮＡには、結合に十分な条件が存在する場合に、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合するＤＮＡに存在する核酸配列が含まれる。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分野で知られている（例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照されたい）。ｇＲＮＡに相補的でハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は「相補的鎖」と呼ぶことができ、「相補的鎖」に相補的である（したがってＣａｓタンパク質またはｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」または「テンプレート鎖」と呼ぶことができる。

【0146】

標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列と非相補鎖上の対応する配列（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）の両方を含む。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、ガイドＲＮＡが相補鎖上でハイブリダイズする配列に対応する（すなわち、その逆相補体）非相補鎖上の配列を具体的に指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭに隣接する非相補的鎖上の配列（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭの上流または５’）を指す。ガイドＲＮＡ標的配列はガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと同等であるが、ウラシルの代わりにチミンを使用している。一例として、ＳｐＣａｓ９酵素のガイドＲＮＡ標的配列は、非相補鎖上の５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭの上流の配列を参照することができる。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補鎖に対して相補性を持つように設計されており、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖とのハイブリダイゼーションにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在するならば、完全な相補性は必要とは限らない。ガイドＲＮＡが本明細書でガイドＲＮＡ標的配列を標的とするものとして言及される場合、それは、ガイドＲＮＡが、非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の逆相補体である標的ＤＮＡの相補鎖配列にハイブリダイズすることを意味する。

【0147】

標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含むことができ、例えば、細胞の核または細胞質内、あるいはミトコンドリアまたは葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置することができる。標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性または外因性の任意の核酸配列であってよい。ガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節配列）であってよく、または両方を含んでもよい。

【0148】

Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合および切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの相補鎖との間の塩基対形成相補性と、（ｉｉ）標的ＤＮＡの非相補鎖にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフとの両方によって決定される位置で起こり得る。ＰＡＭはガイドＲＮＡ標的配列に隣接することができる。任意選択で、ガイドＲＮＡ標的配列の３’末端にＰＡＭを隣接させることができる（例えば、Ｃａｓ９の場合）。代替的に、ガイドＲＮＡ標的配列の５’末端にＰＡＭを隣接させることができる（例えば、Ｃｐｆ１の場合）。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の上流または下流（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列内）の約１～約１０または約２～約５塩基対（例えば、３塩基対）であり得る。ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列（すなわち、非相補鎖上）は５’－Ｎ_１ＧＧ－３’であってよく、Ｎ_１は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ＰＡＭは標的ＤＮＡの非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列のすぐ３’にある。したがって、相補鎖（すなわち、逆相補鎖）上のＰＡＭに対応する配列は５’－ＣＣＮ_２－３’であり、Ｎ_２は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする配列のすぐ５’にある。いくつかのこのような場合には、Ｎ_１およびＮ_２は相補的であってよく、Ｎ_１－Ｎ_２塩基対は、任意の塩基対であってよい（例えば、Ｎ_１＝ＣかつＮ_２＝Ｇ、Ｎ_１＝ＧかつＮ_２＝Ｃ、Ｎ_１＝ＡかつＮ_２＝Ｔ、またはＮ_１＝ＴかつＮ_２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭはＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲであり得、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり、ＲはＧまたはＡであり得る。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣまたはＮＮＮＮＲＹＡＣであり得、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり、ＲはＧまたはＡであり得る。場合によっては（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）、ＰＡＭ配列は５’末端の上流にあり、配列５’－ＴＴＮ－３’を有し得る。

【0149】

ガイドＲＮＡ標的配列の例は、ＳｐＣａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭの２つの例は、ＧＮ_１９ＮＧＧ（配列番号５８）またはＮ_２０ＮＧＧ（配列番号５９）である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１６５８２５を参照されたい。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ガイドＲＮＡ標的配列およびＰＡＭの他の例は、インビトロでのＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を促進するために、５’末端に２つのグアニンヌクレオチドを含み得る（例えば、ＧＧＮ_２０ＮＧＧ；配列番号６０）。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたい。他のガイドＲＮＡ標的配列およびＰＡＭは、５’ＧまたはＧＧおよび３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、配列番号５８～６０の４～２２ヌクレオチド長を有してもよい。さらに他のガイドＲＮＡ標的配列およびＰＡＭは、配列番号５８～６０の１４～２０ヌクレオチド長を有してもよい。

【0150】

アルブミン遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、例えば、アルブミン遺伝子の第１のイントロン、またはアルブミン遺伝子の第１のイントロンに隣接する配列（例えば、アルブミン遺伝子の第１のエキソンまたは第２のエキソン）を標的とすることができる。

【0151】

標的ＤＮＡにハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ複合体の形成は、ガイドＲＮＡ標的配列（すなわち、標的ＤＮＡの非相補鎖上、およびガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖の逆相補体上のガイドＲＮＡ標的配列）に対応する領域内またはその近くの標的ＤＮＡの一方または両方の鎖の切断をもたらし得る。例えば、切断部位は、ガイドＲＮＡ標的配列内にあり得る（例えば、ＰＡＭ配列に対して定義された位置に）。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断または二本鎖切断を生成する標的ＤＮＡの位置を含む。切断部位は、一本鎖のみ（例えば、ニッカーゼが使用される場合）または二本鎖ＤＮＡの両方の鎖上にあり得る。切断部位は、両方の鎖の同じ位置にあってもよく（平滑末端を生成する；例えばＣａｓ９））、または各鎖の異なる部位にあってもよい（千鳥状の末端（すなわち、突出）を生成する；例えば、Ｃｐｆ１）。千鳥状の末端は、例えば、それぞれが異なる鎖の異なる切断部位で一本鎖切断を生成し、それによって二本鎖切断を生成する２つのＣａｓタンパク質を使用することによって生成することができる。例えば、第１のニッカーゼは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖に一本鎖切断を作成でき、第２のニッカーゼはｄｓＤＮＡの第２の鎖に一本鎖切断を作成して突出配列を作成できる。場合によっては、第１の鎖のガイドＲＮＡ標的配列またはニッカーゼ切断部位は、第２の鎖のガイドＲＮＡ標的配列またはニッカーゼ切断部位から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、または１，０００塩基対離れている。

【0152】

２．その他のヌクレアーゼ剤およびヌクレアーゼ剤の標的配列
所望の標的配列においてニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤を、本明細書に開示される方法および組成物で使用することができる。ヌクレアーゼ剤が所望の標的配列でニックまたは二本鎖切断を誘導する限り、天然に存在するか、または天然のヌクレアーゼ剤を使用することができる。代替的に、改変または操作されたヌクレアーゼ剤を使用することができる。「操作されたヌクレアーゼ剤」は、その天然の形態から操作された（改変または誘導された）ヌクレアーゼを含み、所望の標的配列においてニックまたは二本鎖切断を特異的に認識および誘導する。したがって、操作されたヌクレアーゼ剤は、天然の天然に存在するヌクレアーゼ剤から誘導することができ、または人工的に作成または合成することができる。操作されたヌクレアーゼは、例えば、標的配列においてニックまたは二本鎖切断を誘導することができ、標的配列は、天然の（非操作または非修飾）ヌクレアーゼ剤によって認識されたであろう配列ではない。ヌクレアーゼ剤の修飾は、タンパク質切断剤中のわずか１アミノ酸または核酸切断剤中の１ヌクレオチドであってよい。標的配列または他のＤＮＡにおいてニックまたは二本鎖切断を生成することは、本明細書では、標的配列または他のＤＮＡを「切断する（ｃｕｔｔｉｎｇ）」または「切断する（ｃｌｅａｖｉｎｇ）」と呼ぶことができる。

【0153】

例示された標的配列の活性バリアントおよび断片も提供される。そのような活性バリアントは、所与の標的配列に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有していてもよく、活性バリアントは生物活性を保持し、したがって、配列特異的な方法でヌクレアーゼ剤によって認識および切断されることができる。ヌクレアーゼ剤によって標的配列の二本鎖切断を測定するアッセイは、当該技術分野で知られている（例えば^{、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）}のｑＰＣＲアッセイ、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７６：２９５－３０７）。

【0154】

ヌクレアーゼ剤の標的配列は、標的遺伝子座の中または近くのどこであってもよい。標的配列は、遺伝子のコード領域内、または遺伝子の発現に影響を及ぼす調節領域内に位置してもよい。ヌクレアーゼ剤の標的配列は、イントロン、エキソン、プロモーター、エンハンサー、調節領域、または任意の非タンパク質コード領域に位置してもよい。代替的に、標的配列は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内に位置してもよい。そのような位置は、選択マーカーのコード領域内または調節領域内に位置することができ、これらは選択マーカーの発現に影響を及ぼす。したがって、ヌクレアーゼ剤の標的配列は、選択マーカーのイントロン、プロモーター、エンハンサー、調節領域、または選択マーカーをコードするポリヌクレオチドの任意の非タンパク質コード領域に位置してもよい。標的配列でのニックまたは二本鎖切断は、選択マーカーの活性を破壊してもよく、機能的選択マーカーの存在または非存在をアッセイする方法が知られている。

【0155】

ヌクレアーゼ剤の１つの種類は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物のゲノム内の特定の標的配列で二本鎖切断を行うために使用できる配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然または操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、またはその機能的部分を、例えば、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合することによって作成される。独自のモジュラーＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインにより、特定のＤＮＡ認識特異性を備えたタンパク質の設計が可能になる。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ標的部位を認識するように操作することができ、したがって、所望の標的配列で二本鎖切断を行うために使用することができる。すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／０７９４３０；Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７（５０）：２１６１７－２１６２２、Ｓｃｈｏｌｚｅ＆Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ １：４２８－４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７－７６１、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４、およびＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：１４３－１４８を参照されたい。

【0156】

適切なＴＡＬヌクレアーゼの例、および適切なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２３９３１５Ａ１、ＵＳ２０１１／０２６９２３４Ａ１、ＵＳ２０１１／０１４５９４０Ａ１、ＵＳ２００３／０２３２４１０Ａ１、ＵＳ２００５／０２０８４８９Ａ１、ＵＳ２００５／００２６１５７Ａ１、ＵＳ２００５／００６４４７４Ａ１、ＵＳ２００６／０１８８９８７Ａ１、およびＵＳ２００６／００６３２３１Ａ１に開示されている。様々な実施形態では、例えば、目的の遺伝子座または目的のゲノム遺伝子座において標的核酸配列内またはその近くを切断するＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが操作され、ここで、標的核酸配列は、ターゲティングベクターによって改変される配列またはその近くにある。本明細書で提供される様々な方法および組成物での使用に適したＴＡＬヌクレアーゼには、本明細書に記載の標的ベクターによって改変される標的核酸配列またはその近くに結合するように特別に設計されたものが含まれる。

【0157】

一部のＴＡＬＥＮでは、ＴＡＬＥＮの各モノマーは、２つの超可変残基を介して単一の塩基対を認識する３３～３５のＴＡＬリピートを含む。一部のＴＡＬＥＮでは、ヌクレアーゼ剤は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むことができ、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結され、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、様々な長さ（１２～２０ｂｐ）のスペーサー配列によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖における２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、標的配列で二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを作成する。

【0158】

本明細書に開示される様々な方法および組成物で使用されるヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をさらに含むことができる。一部のＺＦＮでは、ＺＦＮの各モノマーは３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは３ｂｐのサブサイトに結合する。他のＺＦＮでは、ＺＦＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮを含むことができ、第１および第２のＺＦＮのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに作動可能に連結され、第１および第２のＺＦＮは、約５～７ｂｐのスペーサーで分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖における２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを生成する。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００６／０２４６５６７、ＵＳ２００８／０１８２３３２、ＵＳ２００２／００８１６１４、ＵＳ２００３／００２１７７６、ＷＯ／２００２／０５７３０８Ａ２、ＵＳ２０１３／０１２３４８４、ＵＳ２０１０／０２９１０４８、ＷＯ／２０１１／０１７２９３Ａ２、およびＧａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３１（７）：３９７－４０５を参照されたい。

【0159】

ヌクレアーゼ剤（すなわち、操作されたヌクレアーゼ剤）の活性バリアントおよび断片も提供される。そのような活性バリアントは、天然のヌクレアーゼ剤に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有していてもよく、活性バリアントは、所望の標的配列で切断する能力を保持し、したがって、ニックまたは二本鎖切断誘導活性を保持する。例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ剤のいずれも、天然エンドヌクレアーゼ配列から改変し、天然ヌクレアーゼ剤によって認識されなかった標的配列でニックまたは二本鎖切断を認識および誘導するように設計してもよい。したがって、いくつかの操作されたヌクレアーゼは、対応する天然のヌクレアーゼ剤標的配列とは異なる標的配列でニックまたは二本鎖切断を誘導する特異性を有する。ニックまたは二本鎖切断誘導活性のためのアッセイは知られており、一般に、標的配列を含むＤＮＡ基質上のエンドヌクレアーゼの全体的な活性および特異性を測定する。

【0160】

ヌクレアーゼ剤は、当該技術分野で知られている任意の手段によって細胞に導入してもよい。ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドは、細胞に直接導入してもよい。代替的に、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入してもよい。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入されると、ヌクレアーゼ剤は、細胞内で一過性に、条件付きで、または構成的に発現され得る。したがって、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれ得、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結され得る。目的のそのようなプロモーターは、本明細書のいずこかでさらに詳細に論じられている。代替的に、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入される。

【0161】

ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、ターゲッテングベクター（例えば、挿入ポリヌクレオチドを含むターゲッテングベクター、または挿入ポリヌクレオチドを含むターゲッテングベクターとは別のベクターもしくはプラスミド）にあってよい。

【0162】

ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入によりヌクレアーゼ剤が細胞に提供される場合、ヌクレアーゼ剤をコードするそのようなポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチド配列と比較して、目的の細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置換するように改変され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞を含む所与の原核細胞または真核細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと改変することができる。

【0163】

「ヌクレアーゼ剤の標的配列」という用語は、ヌクレアーゼ剤によってニックまたは二本鎖切断が誘導されるＤＮＡ配列を含む。ヌクレアーゼ剤の標的配列は、細胞に対して内因性（または天然）であり得るか、または標的配列は、細胞に対して外因性であり得る。細胞にとって外因性である標的配列は、細胞のゲノム内で天然に存在しない。標的配列はまた、標的遺伝子座に配置されることを望む目的のポリヌクレオチドに対して外因性であり得る。場合によっては、標的配列は宿主細胞のゲノムに一度だけ存在する。

【0164】

標的配列の長さは変動してもよく、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対の場合は約３０～３６ｂｐ（すなわち、各ＺＦＮについて約１５～１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の場合は約３６ｂｐ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの場合は約２０ｂｐの標的配列を含む。

【0165】

Ｂ．外因性ドナー核酸および抗原結合タンパク質をコードする配列
１．外因性ドナー核酸
本明細書に開示される方法および組成物は、外因性ドナー核酸を利用して、Ｃａｓタンパク質などのヌクレアーゼ剤による標的ゲノム遺伝子座の切断に続いて、標的ゲノム遺伝子座（例えば、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座）を改変する。

【0166】

このような方法では、Ｃａｓタンパク質が標的ゲノム遺伝子座を切断して一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断を作成し、切断またはニックの入った遺伝子座が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介ライゲーションまたは相同組換え修復を介して外因性ドナー核酸によって修復される。任意選択で、外因性ドナー核酸による修復は、ヌクレアーゼ標的配列を除去または破壊し、その結果、標的化された対立遺伝子は、ヌクレアーゼ剤によって再標的化され得ない。

【0167】

外因性ドナー核酸は、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座、例えばアルブミン遺伝子座の任意の配列を標的にすることができる。いくつかの外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含む。他の外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まない。外因性ドナー核酸は、相同組換え修復によってゲノム遺伝子座もしくはセーフハーバー遺伝子座に挿入することができ、および／またはそれらは、非相同末端結合によってゲノム遺伝子座もしくはセーフハーバー遺伝子座に挿入することができる。一例では、外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）は、アルブミン遺伝子座のイントロン１、イントロン１２、またはイントロン１３を標的化することができる。例えば、外因性ドナー核酸は、アルブミン遺伝子のイントロン１を標的にすることができる。

【0168】

外因性ドナー核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができ、それらは一本鎖または二本鎖であり得、そしてそれらは直線状または環状の形態であり得る。例えば、外因性ドナー核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｏｓｈｉｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１０４３１を参照されたい。外因性ドナー核酸は、ネイキッド核酸であってもよく、ＡＡＶなどのウイルスによって送達されてもよい。具体的な例では、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶを介して送達することができ、非相同末端結合によってゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に挿入することができる（例えば、外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まないものであってよい）。

【0169】

例示的な外因性ドナー核酸は、約５０ヌクレオチド～約５ｋｂの長さ、または約５０ヌクレオチド～約３ｋｂの長さである。代替的に、外因性ドナー核酸は、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、約２ｋｂ～約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ～約３ｋｂ、約３ｋｂ～約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ～約４ｋｂ、約４ｋｂ～約４．５ｋｂ、または約４．５ｋｂ～約５ｋｂの長さであってよい。代替的に、外因性ドナー核酸は、例えば、５ｋｂ、４．５ｋｂ、４ｋｂ、３．５ｋｂ、３ｋｂ、または２．５ｋｂ以下の長さであってよい。

【0170】

一例では、外因性ドナー核酸は、約８０ヌクレオチド～約３ｋｂの長さのｓｓＯＤＮである。そのようなｓｓＯＤＮは、５’末端および／または３’末端にホモロジーアームまたは短い一本鎖領域を有することができ、これらは、例えばそれぞれ約４０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチドの長さである、標的ゲノム遺伝子座でのヌクレアーゼ剤媒介切断によって作成される１つ以上の突出に相補的である。そのようなｓｓＯＤＮはまた、例えば、それぞれ約３０ヌクレオチドから～１００ヌクレオチドの長さであるホモロジーアームまたは相補的領域を有してもよい。ホモロジーアームまたは相補的領域は、対称的（例えば、各４０ヌクレオチドまたは各６０ヌクレオチド長）であってもよく、またはそれらは非対称的（例えば、３６ヌクレオチド長である１つのホモロジーアームまたは相補的領域、および９１ヌクレオチド長である１つのホモロジーアームまたは相補的領域）であってもよい。

【0171】

外因性ドナー核酸は、追加の望ましい特徴（例えば、修飾または調節された安定性；蛍光標識による追跡または検出；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）を提供する修飾または配列を含み得る。外因性ドナー核酸は、１つ以上の蛍光標識、精製タグ、エピトープタグ、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。例えば、外因性ドナー核酸は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの蛍光標識などの１つ以上の蛍光標識（例えば、蛍光タンパク質または他のフルオロフォアまたは色素）を含んでもよい。例示的な蛍光標識としては、フルオレセイン（例えば、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ））、テキサスレッド、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、パシフィックブルー、５－（および－６）－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）およびＣｙ７などのフルオロフォアが挙げられる。オリゴヌクレオチドを標識するための幅広い蛍光色素が市販されている（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）。そのような蛍光標識（例えば、内部蛍光標識）は、例えば、外因性ドナー核酸の末端と適合性のある突出端を有する切断された標的核酸に直接組み込まれた外因性ドナー核酸を検出するために使用することができる。標識またはタグは、外因性ドナー核酸の５’末端、３’末端、または内部にあってよい。例えば、外因性ドナー核酸は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＩＲ７００フルオロフォア（５’ＩＲＤＹＥ（登録商標）７００）を有する５’末端にコンジュゲートさせることができる。

【0172】

本明細書に開示される外因性ドナー核酸はまた、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれるＤＮＡのセグメント（すなわち、抗原結合タンパク質のコード配列）を含む核酸インサートを含む。標的ゲノム遺伝子座での核酸インサートの組み込みは、標的ゲノム遺伝子座への目的の核酸配列の付加、または標的ゲノム遺伝子座での目的の核酸配列の置換（すなわち、欠失および挿入）をもたらし得る。いくつかの外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座での対応する欠失なしに、標的ゲノム遺伝子座での核酸インサートの挿入のために設計されている。他の外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座で目的の核酸配列を欠失し、それを核酸インサートで置き換えるように設計されている。

【0173】

欠失および／または置換される標的ゲノム遺伝子座における核酸インサートまたは対応する核酸は、様々な長さであってよい。欠失および／または置換される標的ゲノム遺伝子座における例示的な核酸インサートまたは対応する核酸は、約１ヌクレオチドから約５ｋｂの長さであるか、または約１ヌクレオチドから約３ｋｂヌクレオチドの長さである。例えば、欠失および／または置換される標的ゲノム遺伝子座における核酸インサートまたは対応する核酸は、約１～約１００、約１００～約２００、約２００～約３００、約３００～約４００、約４００～約５００、約５００～約６００、約６００～約７００、約７００～約８００、約８００～約９００、または約９００～約１，０００ヌクレオチドの長さであってよい。同様に、欠失および／または置換される標的ゲノム遺伝子座における核酸インサートまたは対応する核酸は、約１ｋｂ～１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、約２ｋｂ～約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ～約３ｋｂ、約３ｋｂ～約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ～約４ｋｂ、約４ｋｂ～約４．５ｋｂ、約４．５ｋｂ～約５ｋｂ、またはそれ以上の長さであってよい。

【0174】

欠失および／または置換される標的ゲノム遺伝子座の核酸インサートまたは対応する核酸は、エキソンなどのコード領域、イントロン、非翻訳領域、または調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、もしくは転写リプレッサー結合要素）などの非コード領域、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。

【0175】

核酸インサートはまた、条件付き対立遺伝子を含み得る。条件付き対立遺伝子は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されているように、多機能対立遺伝子であってよい。例えば、条件付き対立遺伝子は、以下を含むことができる：（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス方向の作動配列、（ｂ）センスまたはアンチセンス方向の薬物選択カセット（ＤＳＣ）、（ｃ）アンチセンス配向の目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）、（ｄ）逆方向の条件付き反転モジュール（ＣＯＩＮ、エキソン分割イントロンと反転可能な遺伝子トラップのようなモジュールを利用）。例えばＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。条件付き対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼへの曝露時に再結合して、（ｉ）作動配列およびＤＳＣを欠き、（ｉｉ）センス方向のＮＳＩとアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む、条件付き対立遺伝子を形成する再結合可能なユニットをさらに含むことができる。例えばＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。

【0176】

核酸インサートはまた、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含み得る。代替的に、核酸インサートは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを欠くことができる。選択マーカーは、選択カセットに入れることができる。任意選択で、選択カセットは自己削除カセットにすることができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，６９７，８５１およびＵＳ２０１３／０３１２１２９を参照されたい。一例として、自己削除カセットは、マウスＰｒｍ１プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子（イントロンによって分離されたＣｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンを含む）およびヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。Ｐｒｍ１プロモーターを使用することにより、Ｆ０動物のオスの生殖細胞で特異的に自己欠失カセットを削除することができる。例示的な選択マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、標的とされる細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。プロモーターの例は、本明細書のいずこかに記載されている。

【0177】

核酸インサートはまた、レポーター遺伝子を含み得る。例示的なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＭｍＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－Ｒｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－サファイア、およびアルカリホスファターゼをコードするものが挙げられる。このようなレポーター遺伝子は、標的とされる細胞で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターの例は、本明細書のいずこかに記載されている。

【0178】

核酸インサートはまた、１つ以上の発現カセットまたは削除カセットを含み得る。所与のカセットは、発現に影響を及ぼす様々な調節成分とともに、目的のヌクレオチド配列、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、およびレポーター遺伝子のうちの１つ以上を含むことができる。含めることができる選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子の例は、本明細書のいずこかで詳細に論じられている。

【0179】

核酸インサートは、部位特異的組換え標的配列に隣接する核酸を含むことができる。代替的に、核酸インサートは、１つ以上の部位特異的組換え標的配列を含むことができる。核酸インサート全体がそのような部位特異的組換え標的配列に隣接することができるが、核酸インサート内の任意の領域または目的の個々のポリヌクレオチドもまた、そのような部位に隣接することができる。核酸インサートまたは核酸インサート内の目的の任意のポリヌクレオチドに隣接することができる部位特異的組換え標的配列は、例えば、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。一例では、部位特異的組換え部位は、核酸インサート内に含まれる選択マーカーおよび／またはレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドに隣接している。標的遺伝子座での核酸インサートの組み込みに続いて、部位特異的組換え部位間の配列を除去することができる。任意選択で、２つの外因性ドナー核酸を使用することができ、それぞれが部位特異的組換え部位を含む核酸インサートを有する。外因性ドナー核酸は、目的の核酸に隣接する５’および３’領域を標的にすることができる。２つの核酸インサートを標的ゲノム遺伝子座に組み込んだ後、２つの挿入された部位特異的組換え部位の間の目的の核酸を除去することができる。

【0180】

核酸インサートはまた、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、およびタイプＩＶエンドヌクレアーゼを含む、制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、制限酵素）のための１つ以上の制限部位を含むことができる。タイプＩおよびタイプＩＩＩの制限エンドヌクレアーゼは特定の認識部位を認識するが、典型的には、ヌクレアーゼ結合部位から可変位置で切断する。これは、切断部位（認識部位）から数百塩基対離れている場合がある。タイプＩＩシステムでは、制限活性はメチラーゼ活性とは無関係であり、切断は典型的には、結合部位内または結合部位の近くの特定の部位で起こる。ほとんどのタイプＩＩ酵素はパリンドローム配列を切断するが、タイプＩＩａ酵素は非パリンドローム認識部位を認識して認識部位の外側で切断し、タイプＩＩｂ酵素は認識部位の外側の両方の部位で配列を２回切断し、タイプＩＩｓ酵素は非対称認識部位を認識し、片側で、認識部位から約１～２０ヌクレオチドの定義された距離で切断する。ＩＶ型制限酵素はメチル化されたＤＮＡを標的とする。制限酵素は、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのウェブページ；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８－４２０、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：１８０５－１８１２、およびＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）ｉｎ Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩ，ｐｐ．７６１－７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ））でさらに説明および分類されている。

【0181】

ａ．非相同末端結合媒介挿入のためのドナー核酸
一部の外因性ドナー核酸は、非相同末端結合によってゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に挿入することができる。場合によっては、そのような外因性ドナー核酸はホモロジーアームを含まない。例えば、そのような外因性ドナー核酸は、ヌクレアーゼ剤による切断後の平滑末端二本鎖切断に挿入することができる。具体的な例では、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶを介して送達することができ、非相同末端結合によってゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に挿入することができる（例えば、外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まないものであってよい）。

【0182】

具体的な例では、外因性ドナー核酸は、相同性に依存しない標的化された組み込みを介して挿入することができる。例えば、外因性ドナー核酸の抗原結合タンパク質をコードする配列は、ヌクレアーゼ剤の標的部位が両側に隣接している（例えば、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座と同じ標的部位、および同じヌクレアーゼ剤がゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の標的部位を切断するために使用される）。次いで、ヌクレアーゼ剤は、抗原結合タンパク質をコードする配列に隣接する標的部位を切断することができる。具体的な例では、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶ媒介送達で送達され、抗原結合タンパク質をコードする配列に隣接する標的部位の切断は、ＡＡＶの末端逆位配列（ＩＴＲ）を除去することができる。いくつかの方法では、抗原結合タンパク質をコードする配列が正しい方向でゲノム遺伝子座またはセーフハーバーに挿入された場合、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の標的部位（例えば、隣接するプロトスペーサー隣接モチーフを含むｇＲＮＡ標的配列）はもはや存在しないが、抗原結合タンパク質のコード配列がゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に反対方向に挿入されると再形成される。これは、抗原結合タンパク質をコードする配列が発現のために正しい方向に挿入されることを確実にするのに役立ち得る。

【0183】

他の外因性ドナー核酸は、５’末端および／または３’末端に短い一本鎖領域を有し、これは、標的ゲノム遺伝子座でのヌクレアーゼ剤媒介切断によって作成される１つ以上の突出に相補的である。例えば、いくつかの外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座における５’および／または３’標的配列でのヌクレアーゼ媒介切断によって作成された１つ以上の突出に相補的な５’末端および／または３’末端に短い一本鎖領域を有する。いくつかのそのような外因性ドナー核酸は、５’末端のみまたは３’末端のみに相補的領域を有する。例えば、いくつかのそのような外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列で作成された突出に相補的な５’末端にのみ、または標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列で作成された突出に相補的な３’末端にのみ相補領域を有する。他のそのような外因性ドナー核酸は、５’末端と３’末端の両方に相補的領域を有する。例えば、他のそのような外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座でのヌクレアーゼ媒介切断によって生成される５’と３’末端の両方に相補的領域（例えば、それぞれ第１および第２の突出に相補的）を有する。例えば、外因性ドナー核酸が二本鎖である場合、一本鎖相補的領域は、ドナー核酸の上部鎖の５’末端およびドナー核酸の下部鎖の５’末端から伸長し、両端に５’突出を作成することができる。代替的に、一本鎖相補領域は、ドナー核酸の上部鎖の３’末端から、およびテンプレートの下部鎖の３’末端から伸長し、３’突出を作成することができる。

【0184】

相補的領域は、外因性ドナー核酸と標的核酸との間のライゲーションを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例示的な相補的領域は、約１～約５ヌクレオチドの長さ、約１～約２５ヌクレオチドの長さ、または約５～約１５０ヌクレオチドの長さである。例えば、相補的領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さであってよい。代替的に、相補的領域は、約５～約１０、約１０～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０ヌクレオチド、またはそれ以上の長さであってよい。

【0185】

このような相補的領域は、２対のニッカーゼによって作成された突出を相補的にすることができる。ＤＮＡの反対側の鎖を切断して第１の二本鎖切断を作成する第１および第２のニッカーゼ、およびＤＮＡの反対側の鎖を切断して第２の二本鎖切断を作成する第３および第４のニッカーゼを使用することにより、両端が千鳥状の２つの二本鎖切断を作成できる。例えば、Ｃａｓタンパク質を使用して、第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡに対応する第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡ標的配列にニックを入れることができる。第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列は、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第１および第２のニッカーゼによって作成されたニックが二本鎖切断を作成するように、第１の切断部位を作成するように配置することができる（すなわち、第１の切断部位は、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内のニックを含む）。同様に、第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列は、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第３および第４のニッカーゼによって作成されたニックが二本鎖切断を作成するように、第２の切断部位を作成するように配置することができる（すなわち第２の切断部位は、第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックを含む）。第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列および／または第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックは、突出を作成するオフセットニックであり得る。オフセットウィンドウは、例えば、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、またはそれ以上であり得る。すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５４：１３８０－１３８９、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３３－８３８、およびＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：３９９－４０４を参照されたい。そのような場合、二本鎖外因性ドナー核酸は、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内のニックおよび第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックによって作成された突出に相補的な一本鎖相補領域で設計することができる。次いで、そのような外因性ドナー核酸は、非相同末端結合媒介ライゲーションによって挿入することができる。

【0186】

ｂ．相同組換え修復による挿入のためのドナー核酸
いくつかの外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含む。外因性ドナー核酸が核酸インサートも含む場合、ホモロジーアームは核酸インサートに隣接することができる。参照を容易にするために、ホモロジーアームは、本明細書では５’および３’（すなわち、上流および下流）ホモロジーアームと呼ばれる。この用語は、外因性ドナー核酸内の核酸インサートに対するホモロジーアームの相対位置に関連している。５’および３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の領域に対応し、これらは、本明細書では、それぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と呼ばれる。

【0187】

ホモロジーアームおよび標的配列は、２つの領域が相同組換え反応の基質として作用するのに十分なレベルの配列同一性を互いに共有する場合、互いに「対応する」または「対応している」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるか、または配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と外因性ドナー核酸に見られる対応するホモロジーアームとの間の配列同一性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、外因性ドナー核酸（またはその断片）のホモロジーアームおよび標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性であり得、これにより、配列は相同組換えを起こす。さらに、ホモロジーアームと対応する標的配列との間の対応する相同性領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例示的なホモロジーアームは、約２５ヌクレオチド～約２．５ｋｂの長さであるか、約２５ヌクレオチド～約１．５ｋｂの長さであるか、または約２５～約５００ヌクレオチドの長さである。例えば、所与のホモロジーアーム（またはホモロジーアームのそれぞれ）および／または対応する標的配列は、約２５～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１５０、約１５０～約２００、約２００～約２５０、約２５０～約３００、約３００～約３５０、約３５０～約４００、約４００～約４５０、または約４５０～約５００ヌクレオチド長の対応する相同性領域を含み得、その結果、ホモロジーアームは、標的核酸内の対応する標的配列との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有する。代替的に、所与のホモロジーアーム（または各ホモロジーアーム）および／または対応する標的配列は、約０．５ｋｂ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、または約２ｋｂ～約２．５ｋｂの長さである対応する相同性領域を含み得る。例えば、ホモロジーアームは、それぞれ約７５０ヌクレオチドの長さであり得る。ホモロジーアームは対称的（それぞれの長さがほぼ同じサイズ）であってもよく、非対称的（一方が他方よりも長い）であってもよい。

【0188】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは他のヌクレアーゼ剤を外因性ドナー核酸と組み合わせて使用する場合、ヌクレアーゼ切断部位またはヌクレアーゼ切断部位での一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断の際に、標的配列とホモロジーアームとの間の相同組換え事象の発生を促進するように、５’および３’標的配列をヌクレアーゼ切断部位に十分に近接して（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列に十分に近接して）配置することができる。「ヌクレアーゼ切断部位」という用語は、ヌクレアーゼ剤（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９タンパク質）によってニックまたは二本鎖切断が作成されるＤＮＡ配列を含む。外因性ドナー核酸の５’および３’ホモロジーアームに対応する標的化遺伝子座内の標的配列は、距離がヌクレアーゼ切断部位での一本鎖切断または二本鎖切断の際の５’および３’標的配列とホモロジーアームとの間の相同組換え事象の発生を促進するような距離である場合、ヌクレアーゼ切断部位に「十分に近接して位置する」。したがって、外因性ドナー核酸の５’および／または３’ホモロジーアームに対応する標的配列は、例えば、所与のヌクレアーゼ切断部位の少なくとも１ヌクレオチド内、または所与のヌクレアーゼ切断部位の少なくとも１０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド内であり得る。一例として、ヌクレアーゼ切断部位は、標的配列の少なくとも一方または両方に直接隣接し得る。

【0189】

外因性ドナー核酸のホモロジーアームおよびヌクレアーゼ切断部位に対応する標的配列の空間的関係は変化し得る。例えば、標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位の５’に位置してもよく、標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位の３’に位置してもよく、または標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位に隣接していてもよい。

【0190】

２．抗原結合タンパク質
本明細書に開示される外因性ドナー核酸は、抗原結合タンパク質のコード配列を含む。本明細書に開示される場合、「抗原結合タンパク質」には、抗原に結合する任意のタンパク質が含まれる。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体の抗原結合断片、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦＶ、ビスｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｖ－ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）_２、ＤＶＤ（デュアル可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、またはデイビスボディが含まれる（すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５８６，７１３号）。

【0191】

「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重鎖（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変ドメインおよび重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）を含む。重鎖の定数領域は、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）を含む。重鎖および軽鎖可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分割され得る。各重鎖および軽鎖可変ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端に次の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と略され得；軽鎖ＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と省略され得る）。「高親和性」抗体という用語は、約１０^－９Ｍ以下（例えば、１×１０^－９Ｍ、１×１０^－１０Ｍ、約１×１０^－１１Ｍ、または約１×１０^－１２Ｍ）のその標的エピトープに対するＫ_Ｄを有する抗体を指す。一実施形態では、Ｋ_Ｄは、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって測定される。別の実施形態では、Ｋ_ＤはＥＬＩＳＡによって測定される。

【0192】

抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、中和抗原結合タンパク質または抗体、あるいは広域中和抗原結合タンパク質または抗体であり得る。中和抗体は、細胞が生物学的に持つあらゆる効果を中和することにより、抗原または感染体から細胞を防御する抗体である。広域中和抗体（ｂＮＡｂ）は、特定の細菌またはウイルスの複数の株に影響を及ぼす。例えば、広域中和抗体は、保存された機能的標的に焦点を合わせ、保存された細菌またはウイルスタンパク質の脆弱な部位（例えば、インフルエンザウイルスタンパク質血球凝集素の脆弱な部位）を攻撃することができる。感染またはワクチン接種の際に免疫系によって作られた抗体は、細菌またはウイルスの表面上の容易にアクセス可能なループに焦点を合わせる傾向があり、それらはしばしば大きな配列および立体配座の変動性を有する。これは、細菌またはウイルスの集団はこれらの抗体をすばやく回避することができ、抗体は機能に不可欠ではないタンパク質の部分を攻撃するという２つの理由で問題である。細菌またはウイルスの多くの株を攻撃するため「広域」と呼ばれ、細菌またはウイルスの主要な機能部位を攻撃して感染を阻止するため「中和」と呼ばれる、広域中和抗体は、これらの問題を克服できる。しかし残念ながら、これらの抗体は通常遅すぎて、疾患からの効果的な保護を提供しない。

【0193】

本明細書に開示される抗原結合タンパク質は、任意の抗原を標的とすることができる。「抗原」という用語は、分子全体であろうと分子内のドメインであろうと、その物質に結合特異性を有する抗体の産生を誘発することができる物質を指す。抗原という用語には、野生型宿主生物では自己認識によって抗体産生を誘発しないが、免疫学的寛容を破壊する適切な遺伝子工学を用いて宿主動物でそのような応答を誘発することができる物質も含まれる。

【0194】

一例として、標的抗原は、疾患関連抗原であり得る。「疾患関連抗原」という用語は、その存在が特定の疾患の発生または進行と相関している抗原を指す。例えば、抗原は、疾患関連タンパク質（すなわち、その発現が疾患の発生または進行と相関しているタンパク質）に存在し得る。任意選択で、疾患関連タンパク質は、特定のタイプの疾患で発現されるが、通常は健康な成人組織では発現されないタンパク質（すなわち、疾患特異的発現または疾患限定発現を有するタンパク質）であり得る。しかしながら、疾患関連タンパク質は、疾患特異的または疾患限定的な発現を示す必要はない。

【0195】

一例として、疾患関連抗原は、がん関連抗原であってよい。「がん関連抗原」という用語は、その存在が１つ以上のタイプのがんの発生または進行と相関している抗原を指す。例えば、抗原は、がん関連タンパク質（すなわち、その発現が１つ以上のタイプのがんの発生または進行と相関しているタンパク質）に存在してもよい。例えば、がん関連タンパク質は、発癌性タンパク質（すなわち、細胞成長を調節するタンパク質などの、がんの進行に寄与し得る活性を有するタンパク質）であり得るか、または腫瘍抑制タンパク質（すなわち、通常、細胞周期の負の調節によってまたはアポトーシスの促進などによって、がん形成の可能性を軽減するように作用するタンパク質）であり得る。任意選択で、がん関連タンパク質は、特定のタイプのがんで発現するが、通常は健康な成人組織では発現されないタンパク質（すなわち、がん特異的発現、がん限定発現、腫瘍特異的発現、または腫瘍限定発現を有するタンパク質）であり得る。しかしながら、がん関連タンパク質は、がん特異的、がん限定、腫瘍特異的、または腫瘍限定の発現を有する必要はない。がん特異的またはがん限定とみなされるタンパク質の例は、がん精巣抗原またはがん胎児性抗原である。がん精巣抗原（ＣＴＡ）は、異なる組織学的起源のヒト腫瘍で発現する腫瘍関連抗原の大きなファミリーであるが、男性の生殖細胞を除いて、正常組織では発現しない。がんでは、これらの発生抗原は再発現することができ、免疫活性化の場所として機能することができる。がん胎児性抗原（ＯＦＡ）は、通常、胎児の発育中にのみ存在するタンパク質あるが、特定の種類のがんの成人に見られる。

【0196】

別の例として、疾患関連抗原は、感染症関連抗原であり得る。「感染症関連抗原」という用語は、その存在が特定の感染症の発生または進行と相関している抗原を指す。例えば、抗原は、感染症関連タンパク質（すなわち、その発現が感染症の発生または進行と相関しているタンパク質）に存在し得る。任意選択で、感染症関連タンパク質は、特定のタイプの感染症で発現されるが、通常は健康な成人組織では発現されないタンパク質（すなわち、感染症特異的発現または感染症限定発現を有するタンパク質）であり得る。しかしながら、感染症関連タンパク質は、感染症特異的または感染症限定的な発現を示す必要はない。例えば、抗原は、ウイルス抗原または細菌抗原であり得る。そのような抗原には、例えば、免疫系によって認識され、免疫応答を誘発することができるウイルスまたは細菌の表面上の分子構造（例えば、ウイルスタンパク質または細菌タンパク質）が含まれる。

【0197】

ウイルス抗原の例には、ジカウイルスまたはインフルエンザ（インフルエンザ）ウイルスによって発現されるタンパク質内の抗原が含まれる。ジカ熱は、主に感染したネッタイシマカ（Ａｅ．ａｅｇｙｐｔｉおよびＡｅ．Ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）に刺されることで人々に広がるウイルスである。妊娠中のジカウイルス感染は、小頭症およびその他の重度の脳障害を引き起こす可能性がある。例えば、ジカ抗原は、ジカウイルスエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質内の抗原であり得るが、これに限定されない。インフルエンザウイルスは、インフルエンザ（一般に「インフルエンザ」として知られている）と呼ばれる感染症を引き起こすウイルスである。タイプＡ、タイプＢ、およびタイプＣと呼ばれる３種類のインフルエンザウイルスがヒトに感染する。インフルエンザ抗原は、血球凝集素タンパク質内の抗原であり得るが、これらに限定されない。ウイルス抗原および細菌抗原には、他のウイルスおよび他の細菌の抗原も含まれる。インフルエンザ血球凝集素を標的とする抗体の例は、例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１００８０７に提供されている。

【0198】

細菌抗原の例としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって発現するタンパク質内の抗原（例えば、ＩＩＩ型病原性システム移動タンパク質であるＰｃｒＶ内の抗原）が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、重症患者に致命的な急性肺感染症を引き起こす日和見細菌性病原体である。その病因は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが肺上皮の壊死を引き起こし、循環系に播種し、細菌血症、敗血症、および死亡をもたらす、ＩＩＩ型分泌システム（ＴＴＳＳ）によって付与される細菌の病原性に関連している。ＴＴＳＳは、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが細胞毒素を真核細胞に直接移動させ、細胞死を誘発することを可能にする。エルシニア属のＶ抗原ＬｃｒＶのホモログであるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＶ抗原ＰｃｒＶは、ＴＴＳ毒素移動に不可欠な貢献者である。

【0199】

「エピトープ」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、１つ以上のタンパク質の三次フォールディングによって並置された隣接アミノ酸または非隣接アミノ酸から形成することができる。隣接アミノ酸から形成されるエピトープ（線形エピトープとしても既知）は典型的には、変性溶媒に対する曝露で保持されるが、三次フォールディングによって形成されたエピトープ（配座異性エピトープとしても既知）は典型的には、変性溶媒での処置で失われる。エピトープは典型的には、少なくとも３、さらに通常は、少なくとも５または８～１０のアミノ酸を特有の空間配座で含む。エピトープの空間配座を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい。

【0200】

「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という用語は、任意の生物からの免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む免疫グロブリン重鎖配列を含む。重鎖可変ドメインは、特に明記しない限り、３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域を含む。重鎖の断片には、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。典型的な重鎖は、可変ドメインに続いて、（Ｎ末端からＣ末端まで）Ｃ_Ｈ１ドメイン、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２ドメイン、およびＣ_Ｈ３ドメインを有する。重鎖の機能的断片は、エピトープを特異的に認識することができ（例えば、マイクロモル、ナノモル、またはピコモル範囲の_ＫＤでエピトープを認識する）、細胞から発現および分泌することができ、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片を含む。重鎖可変ドメインは、生殖細胞系列に存在するＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈセグメントのレパートリーに由来するＶ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈセグメントを一般に含む可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる。様々な生物のＶ、Ｄ、およびＪ重鎖セグメントの配列、位置、および命名法は、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）のインターネット経由でＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ」からアクセスできるＩＭＧＴデータベースに見出すことができる。

【0201】

「軽鎖」という用語は、任意の生物からの免疫グロブリン軽鎖配列を含み、特に明記しない限り、ヒトカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖およびＶｐｒｅＢ、ならびに代理軽鎖を含む。軽鎖可変ドメインには、特に指定がない限り、通常、３つの軽鎖ＣＤＲと４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が含まれる。一般に、全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含む可変ドメイン、および軽鎖定常領域アミノ酸配列を含む。軽鎖可変ドメインは、生殖細胞系に存在する軽鎖ＶおよびＪ遺伝子セグメントのレパートリーに由来する軽鎖Ｖ_Ｌおよび軽鎖Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントを一般に含む軽鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる。様々な生物の軽鎖ＶおよびＪ遺伝子セグメントの配列、位置、および命名法は、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）のＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ」からインターネット経由でアクセスできるＩＭＧＴデータベースにある。軽鎖には、例えば、それらが現れるエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される第１または第２のエピトープのいずれにも選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖はまた、それらが現れるエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される１つ以上のエピトープに結合して認識するか、または結合および認識することで重鎖を補助するものを含む。

【0202】

本明細書で使用される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、通常（すなわち、野生型動物において）、免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域内の２つのフレームワーク領域の間に現れる、生物の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。ＣＤＲは、例えば、生殖細胞系列配列、または例えば、ナイーブまたは成熟Ｂ細胞もしくはＴ細胞によって再構成された配列によって、コードされ得る。ＣＤＲは、体細胞変異（例えば、動物の生殖細胞系列にコードされている配列とは異なる）、ヒト化、および／またはアミノ酸の置換、追加、または欠失で修飾することができる。いくつかの状況（例えば、ＣＤＲ３の場合）では、ＣＤＲは、隣接していない（例えば、再構成されていない核酸配列において）が、Ｂ細胞核酸配列において、例えば、配列のスプライシングまたは接続の結果として（例えば、ＶＤＪ組換えによる重鎖ＣＤＲ３の形成）隣接している２つ以上の配列（例えば、生殖系列配列）によってコードされ得る。

【0203】

「再構成されていない」という用語は、Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメント（重鎖の場合、Ｄ遺伝子セグメントも同様）が別々に維持されるが、結合して、Ｖ（Ｄ）Ｊレパートリーの単一のＶ、（Ｄ）、Ｊで構成される再構成されたＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子を形成することができる免疫グロブリン遺伝子座の状態を含む。「再構成された」という用語は、Ｖセグメントが本質的に完全なＶ_ＨまたはＶ_Ｌドメインをそれぞれコードする配置でＤＪまたはＪセグメントに直接隣接して配置される重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の構成を含む。

【0204】

外因性ドナー核酸中の抗原結合タンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであってよく、一本鎖または二本鎖であってよく、直線状または環状であってよい。それらは、発現ベクターまたはターゲティングベクターなどのベクターの一部であってよい。ベクターはまた、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、およびレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターであってよい。例えば、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ２／８などのＡＡＶの一部であってよい。

【0205】

必要に応じて、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のために、核酸をコドン最適化してもよい。例えば、核酸は、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと改変することができる。

【0206】

外因性ドナー核酸における抗原結合タンパク質をコードする配列は、任意選択で、動物内でのインビボまたは細胞内でのエクスビボでの発現のための任意の適切なプロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、外因性ドナー核酸は、抗原結合タンパク質をコードする配列が、ゲノムに組み込まれると、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座で内因性プロモーターに作動可能に連結されるように設計することができる。動物は、本明細書のいずこかに記載されているような任意の適切な動物であり得る。プロモーターは、構成的に活性なプロモーター（例えば、ＣＡＧプロモーターもしくはＵ６プロモーター）、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。そのようなプロモーターはよく知られており、本明細書のいずこかで議論されている。発現コンストラクトにおいて使用することができるプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、または接合体のうちの１つ以上において活性なプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。

【0207】

任意選択で、プロモーターは、一方の遺伝子（例えば、軽鎖をコードする遺伝子）および第２の遺伝子（例えば、重鎖をコードする遺伝子）の発現を他の方向に駆動する双方向プロモーターであり得る。このような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ならびに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターで構成してもよい。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥとＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。双方向プロモーターを使用して２つの遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。

【0208】

抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖなどの一本鎖抗原結合タンパク質であってよい。代替的に、抗原結合タンパク質は一本鎖抗原結合タンパク質ではない。例えば、抗原結合タンパク質は、別々の軽鎖および重鎖を含むことができる。重鎖コード配列は、軽鎖コード配列の上流にあり得るか、または軽鎖コード配列は、重鎖コード配列の上流にあり得る。１つの具体的な例において、重鎖コード配列は、軽鎖コード配列の上流にある。例えば、重鎖コード配列は、Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈセグメントを含むことができ、軽鎖コード配列は、軽鎖Ｖ_Ｌおよび軽鎖Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントを含むことができる。抗原結合タンパク質をコードする配列は、外因性ドナー核酸の外因性プロモーターに作動可能に連結することができ、または外因性ドナー核酸は、抗原結合タンパク質をコードする配列が、ゲノムに組み込まれると、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座で内因性プロモーターに作動可能に連結されるように設計することができる。１つの具体的な例において、外因性ドナー核酸は、抗原結合タンパク質をコードする配列が、ゲノムに組み込まれると、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座で内因性プロモーターに作動可能に連結されるように設計することができる。同様に、外因性ドナー核酸の抗原結合タンパク質をコードする配列は、分泌のための外因性シグナル配列を含み得、および／または外因性ドナー核酸は、抗原結合タンパク質をコードする配列が、ゲノムに組み込まれた後のゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座での内因性シグナル配列に作動可能に連結されるように設計され得る。一例では、外因性ドナー核酸は、抗原結合タンパク質をコードする配列が、ゲノムに組み込まれると、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座で内因性シグナル配列に作動可能に連結されるように設計することができる。具体的な例において、抗原結合タンパク質は、別個の軽鎖および重鎖を含み、外因性ドナー核酸は、１つの鎖のコード配列がゲノムに組み込まれると、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座で内因性シグナル配列に作動可能に連結されるように設計され、他の鎖のコード配列は別の外因性シグナル配列に作動可能に連結される。具体的な例において、抗原結合タンパク質は、別個の軽鎖および重鎖を含み、外因性ドナー核酸は、外因性ドナー核酸の上流にある鎖コード配列のいずれかがゲノムに組み込まれると、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座で内因性シグナル配列に作動可能に連結されるように設計され、外因性シグナル配列は、外因性ドナー核酸の下流にある鎖コード配列のいずれかに作動可能に連結される。代替的に、外因性ドナー核酸は、両方の鎖のコード配列が、ゲノムに組み込まれると、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の内因性シグナル配列に作動可能に連結されるように設計することができ、または両方の鎖のコード配列が同じ外因性シグナル配列に作動可能に連結され得るか、または各鎖のコード配列が、別個の外因性シグナル配列に作動可能に連結され得る。

【0209】

シグナル配列（すなわち、Ｎ末端シグナル配列）は、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）に依存する方法で、新生分泌タンパク質および膜タンパク質の小胞体（ＥＲ）へのターゲティングを媒介する。通常、シグナル配列は共翻訳的に切断され、シグナルペプチドと成熟タンパク質が生成される。使用できる外因性シグナル配列またはシグナルペプチドの例には、例えば、マウスアルブミン、ヒトアルブミン、マウスＲＯＲ１、ヒトＲＯＲ１、ヒトアズロシジン、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ Ｉｇカッパ鎖Ｖ ＩＩＩ領域ＭＯＰＣ６３様、およびヒトＩｇカッパ鎖Ｖ ＩＩＩ領域ＶＧのようなシグナル配列／ペプチドが含まれる。他の既知のシグナル配列／ペプチドも使用することができる。具体的な例では、ＲＯＲ１シグナル配列が使用される。そのようなシグナル配列の例は、配列番号３３（配列番号３１または３２によってコードされる）に記載されている。

【0210】

抗原結合タンパク質をコードする配列（例えば、重鎖コード配列および軽鎖コード配列）中の１つ以上の核酸は、マルチシストロン性発現コンストラクトで一緒になり得る。例えば、重鎖および軽鎖をコードする核酸は、バイシストロン性発現コンストラクトにおいて一緒になり得る。例えば、図１を参照されたい。マルチシストロン性発現ベクターは、同じｍＲＮＡ（すなわち、同じプロモーターから生成された転写物）から２つ以上の別々のタンパク質を同時に発現する。タンパク質のマルチシストロン発現のための適切な戦略には、例えば、２Ａペプチドの使用および配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の使用が含まれる。一例として、そのようなマルチシストロン性ベクターは、１つ以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用して、ｍＲＮＡの内部領域からの翻訳の開始を可能にすることができる。別の例として、そのようなマルチシストロン性ベクターは、１つ以上の２Ａペプチドを使用することができる。これらのペプチドは小さな「自己切断」ペプチドであり、一般に１８～２２アミノ酸の長さを有し、同じｍＲＮＡから等モルレベルの複数の遺伝子を生成する。リボソームは、２ＡペプチドのＣ末端でのグリシル－プロリルペプチド結合の合成をスキップし、２Ａペプチドとそのすぐ下流のペプチドの間の「切断」を引き起こす。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（４）：ｅ１８５５６を参照されたい。「切断」は、Ｃ末端にあるグリシンとプロリン残基の間で発生し、上流のシストロンが、その最後にいくつかの残基を付加し、下流のシストロンはプロリンで始まる。その結果、「切断された」下流ペプチドは、そのＮ末端にプロリンを有する。２Ａ媒介切断は、すべての真核細胞で普遍的な現象である。２Ａペプチドは、ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、およびＣ型ロタウイルスから同定されている。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５：６２７－６３８を参照されたい。使用できる２Ａペプチドの例には、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、ブタテッショウウイルス－１２Ａ（Ｐ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、およびＦＭＤＶ２Ａ（Ｆ２Ａ）が含まれる。例示的なＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＦ２Ａ配列には、以下が含まれる：Ｔ２Ａ（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号２９）；Ｐ２Ａ（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号２５）；Ｅ２Ａ（ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号３０）；およびＦ２Ａ（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号２７）。ＧＳＧ残基は、これらのペプチドのいずれかの５’末端に付加して、切断効率を向上させることができる。

【0211】

いくつかの外因性ドナー核酸において、フューリン切断部位をコードする核酸は、軽鎖コード配列と重鎖コード配列との間に含まれる。いくつかの外因性ドナー核酸において、リンカー例えば、（ＧＳＧ）をコードする核酸は、軽鎖コード配列と重鎖コード配列との間（例えば、２Ａペプチドコード配列のすぐ上流）に含まれる。例えば、フューリン切断部位を２Ａペプチドの上流に含めることができ、フューリン切断部位と２Ａペプチドの両方が軽鎖と重鎖の間に位置する（すなわち、上流鎖－フューリン切断部位－２Ａペプチド－下流鎖）。翻訳中、２Ａペプチド配列で第１の切断事象が発生する。しかしながら、２Ａペプチドのほとんどは、上流鎖のＣ末端に残存物として付着したままになり（例えば、軽鎖が重鎖の上流にある場合は軽鎖、重鎖が軽鎖の上流にある場合は重鎖）、下流鎖のＮ末端（またはシグナル配列が下流鎖の上流に含まれる場合はシグナル配列のＮ末端）に１つのアミノ酸が付加されている。フューリン切断部位で開始される第２の切断事象は、翻訳後プロセシングによってより天然の重鎖または軽鎖を得るために、２Ａ残存物のない上流鎖を生成する。

【0212】

外因性ドナー核酸はまた、抗原結合タンパク質をコードする配列の下流にポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターを含み得る。外因性ドナー核酸はまた、抗原結合タンパク質をコードする配列の上流にポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターを含み得る。抗原結合タンパク質をコードする配列の上流のポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、部位特異的リコンビナーゼによって認識されるリコンビナーゼ認識部位に隣接することができる。任意選択で、リコンビナーゼ認識部位はまた、例えば、薬剤耐性タンパク質のコード配列を含む選択カセットに隣接する。任意選択で、リコンビナーゼ認識部位は選択カセットに隣接しない。ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、コード配列によってコードされるタンパク質またはＲＮＡ（例えば、キメラＣａｓタンパク質、キメラアダプタータンパク質、ガイドＲＮＡ、またはリコンビナーゼ）の転写および発現を妨げる。しかしながら、部位特異的リコンビナーゼに曝露すると、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターが切除されると、タンパク質またはＲＮＡを発現させることができる。

【0213】

そのような構成は、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターが組織特異的または発生段階特異的な方法で切除される場合、抗原結合タンパク質をコードする配列を含む動物における組織特異的発現または発生段階特異的発現を可能にし得る。組織特異的または発生段階特異的な方法でのポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターの切除は、抗原結合タンパク質発現カセットを含む動物が、組織特異的または発生段階特異的プロモーターに作動可能に連結された部位特異的リコンビナーゼのコード配列をさらに含む場合に達成され得る。次いで、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターは、それらの組織またはそれらの発生段階でのみ切除され、組織特異的発現または発生段階特異的発現を可能にする。一例では、抗原結合タンパク質は、肝臓特異的な方法で発現させることができる。そのようなプロモーターの例はよく知られている。

【0214】

任意の転写ターミネーターまたはポリアデニル化シグナルを使用できる。本明細書で使用される「転写ターミネーター」は、転写の終結を引き起こすＤＮＡ配列を指す。真核生物では、転写ターミネーターはタンパク質因子によって認識され、終結の後に、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの存在下でｍＲＮＡ転写物にポリ（Ａ）テールを追加するプロセスであるポリアデニル化が続く。哺乳動物のポリ（Ａ）シグナルは、典型的には、約４５ヌクレオチド長のコア配列で構成されており、切断とポリアデニル化の効率を高めるのに役立つ多様な補助配列が隣接している場合がある。コア配列は、ポリＡ認識モチーフまたはポリＡ認識配列と呼ばれ、切断およびポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）によって認識される、ｍＲＮＡ内の高度に保存された上流要素（ＡＡＴＡＡＡまたはＡＡＵＡＡＡ）、ならびに定義が不十分であり、切断刺激因子（ＣｓｔＦ）によって結合される下流領域（ＵまたはＧとＵが豊富）で構成される。使用できる転写ターミネーターの例としては、例えば、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリアデニル化シグナル、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）後期ポリアデニル化シグナル、ウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）ポリアデニル化シグナル、ＡＯＸ１転写終結配列、ＣＹＣ１転写終結配列、または真核細胞における遺伝子発現の調節に適していることが知られている任意の転写終結配列が挙げられる。

【0215】

部位特異的リコンビナーゼには、２つの組換え部位が単一の核酸内または別々の核酸上で物理的に分離されているリコンビナーゼ認識部位間の組換えを促進することができる酵素が含まれる。リコンビナーゼの例には、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼが含まれる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の一例はＣｒｅｉであり、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンがイントロンによって分離され、原核細胞での発現を防ぐ。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を促進するための核局在化シグナルをさらに含むことができる（例えば、ＮＬＳ－Ｃｒｅｉ）。リコンビナーゼ認識部位には、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象の基質として機能することができるヌクレオチド配列が含まれる。リコンビナーゼ認識部位の例には、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、ならびにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、およびｌｏｘ５１７１などのｌｏｘ部位が含まれる。

【0216】

本明細書に開示される外因性ドナー核酸は、他の構成要素も含むことができる。そのような外因性ドナー核酸は、抗原結合タンパク質をコードする配列の５’末端に３’スプライシング配列（スプライスアクセプター部位）をさらに含み得る。３’スプライシング配列という用語は、スプライシング機構によって認識および結合され得る３’イントロン／エキソン境界における核酸配列を指す。外因性ドナー核酸はまた、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメントなどの転写後調節エレメントを含み得る。

【0217】

ジカウイルスエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質を標的とする抗原結合タンパク質をコードするドナー核酸の具体例は、ＳＡ－ＬＣ－Ｐ２Ａ－ＨＣ－ｐＡを含み、ここで、ＳＡはスプライスアクセプター部位を指し、ＬＣは抗体の軽鎖を指し、Ｐ２ＡはＰ２Ａペプチドを指し、ＨＣは抗体の重鎖を指し、ｐＡはポリアデニル化シグナルを指す。そのようなドナーの例は、配列番号１に記載されている。軽鎖ヌクレオチド配列は、配列番号２に記載され、配列番号３に記載されるタンパク質配列をコードする。重鎖ヌクレオチド配列は、配列番号４に記載され、配列番号５に記載されるタンパク質配列をコードする。軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号１０３に記載され、配列番号１０４に記載されるタンパク質をコードする。重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号１０５に記載され、配列番号１０６に記載されるタンパク質をコードする。３つの軽鎖ＣＤＲは、それぞれ、配列番号６４～６６に記載されて、それぞれ、配列番号８５～８７によってコードされる。３つの重鎖ＣＤＲは、それぞれ、配列番号６７～６９に記載されて、それぞれ、配列番号８８～９０によってコードされる。抗ジカ抗体の例は、配列番号３に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である軽鎖（任意選択で、配列番号６４～６６に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、配列番号５に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である重鎖（任意選択で、配列番号６７～６９に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、を含む。抗ジカ抗体の例は、配列番号１０４に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域（任意選択で、配列番号６４～６６に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、配列番号１０６に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域（任意選択で、配列番号６７～６９に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、を含む。具体的な例において、改変されたアルブミン遺伝子座（内因性マウスアルブミンエキソン１および組み込まれた抗体コード配列を含む）は、配列番号１１５に記載の配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコード配列を含み得る。

【0218】

ジカウイルスエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質を標的とする抗原結合タンパク質をコードするドナー核酸の他の具体例は、ＳＡ－ＨＣ－Ｆ２Ａ－Ａｌｂｓｓ－ＬＣ－ｐＡ、ＳＡ－ＨＣ－Ｐ２Ａ－Ａｌｂｓｓ－ＬＣ－ｐＡ、Ｓａ－ＨＣ－Ｔ２Ａ－Ａｌｂｓｓ－ＬＣ－ｐＡ、またはＨＣ－Ｔ２Ａ－ＲＯＲｓｓ－ＬＣ－ｐＡを含み、ここでＳＡはスプライスアクセプター部位を指し、ＬＣは抗体の軽鎖を指し、Ｐ２ＡはＰ２Ａペプチドを指し、ＨＣは抗体重鎖を指し、Ａｌｂｓｓはアルブミンシグナル配列（例えば、マウスアルブミン由来）を指し、ｐＡはポリアデニル化シグナルを指す。そのようなドナーの例は、配列番号６～９に記載されている。軽鎖ヌクレオチド配列は、配列番号１２に記載され、配列番号１３に記載されるタンパク質配列をコードする。重鎖ヌクレオチド配列は、配列番号１４に記載され、配列番号１５に記載されるタンパク質配列をコードする。軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号１０７に記載され、配列番号１０８に記載されるタンパク質配列をコードする。重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号１０９に記載され、配列番号１１０に記載されるタンパク質配列をコードする。３つの軽鎖ＣＤＲは、それぞれ、配列番号７０～７２に記載されて、それぞれ、配列番号９１～９３によってコードされる。３つの重鎖ＣＤＲは、それぞれ、配列番号７３～７５に記載されて、それぞれ、配列番号９４～９６によってコードされる。抗ジカ抗体の例は、配列番号１３に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である軽鎖（任意選択で、配列番号７０～７２に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、配列番号１５に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である重鎖（任意選択で、配列番号７３～７５に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、を含む。抗ジカ抗体の例は、配列番号１０８に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域（任意選択で、配列番号７０～７２に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、配列番号１１０に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域（任意選択で、配列番号７３～７５に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、を含む。具体的な例において、改変されたアルブミン遺伝子座（内因性マウスアルブミンエキソン１および組み込まれた抗体コード配列を含む）は、配列番号１１６～１１９のうちのいずれか１つに記載の配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコード配列を含み得る。

【0219】

インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を標的とする抗原結合タンパク質をコードするドナー核酸の具体例は、ＳＡ－ＬＣ－Ｐ２Ａ－ＨＣ－ｐＡを含み、ここで、ＳＡはスプライスアクセプター部位を指し、ＬＣは抗体の軽鎖を指し、Ｐ２ＡはＰ２Ａペプチドを指し、ＨＣは抗体の重鎖を指し、ｐＡはポリアデニル化シグナルを指す。インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を標的とする抗原結合タンパク質をコードするドナー核酸の別の具体的な例は、ＳＡ－ＬＣ－Ｔ２Ａ－ＨＣ－ｐＡを含み、ここで、ＳＡはスプライスアクセプター部位を指し、ＬＣは抗体の軽鎖を指し、Ｔ２ＡはＴ２Ａペプチドを指し、ＨＣは抗体の重鎖を指し、ｐＡはポリアデニル化シグナルを指す。そのようなドナーの例は、配列番号１６に記載されている。軽鎖ヌクレオチド配列は、配列番号１７に記載され、配列番号１８に記載されるタンパク質配列をコードする。重鎖ヌクレオチド配列は、配列番号１９に記載され、配列番号２０に記載されるタンパク質配列をコードする。軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号１１１に記載され、配列番号１１２に記載されるタンパク質配列をコードする。重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号１１３に記載され、配列番号１１４に記載されるタンパク質配列をコードする。３つの軽鎖ＣＤＲは、それぞれ、配列番号７６～７８に記載されて、それぞれ、配列番号９７～９９によってコードされる。３つの重鎖ＣＤＲは、それぞれ、配列番号７９～８１に記載されて、それぞれ、配列番号１００～１０２によってコードされる。抗ＨＡ抗体の例は、配列番号１８に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である軽鎖（任意選択で、配列番号７６～７８に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、配列番号２０に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である重鎖（任意選択で、配列番号７９～８１に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、を含む。抗ＨＡ抗体の例は、配列番号１１２に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域（任意選択で配列番号７６～７８に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、配列番号１１４に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域（任意選択で、配列番号７９～８１に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、を含む。具体的な例において、改変されたアルブミン遺伝子座（内因性マウスアルブミンエキソン１および組み込まれた抗体コード配列を含む）は、配列番号１２０に記載の配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコード配列を含み得る。

【0220】

インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を標的とする抗原結合タンパク質をコードするドナー核酸の別の具体例は、ＳＡ－ＬＣ－Ｔ２Ａ－ＲｏＲｓｓ－ＨＣ－ｐＡを含み、ここで、ＳＡはスプライスアクセプター部位を指し、ＬＣは抗体の軽鎖を指し、Ｔ２ＡはＴ２Ａペプチドを指し、ＲＯＲｓｓはＲＯＲシグナル配列を指し、ＨＣは抗体の重鎖を指し、ｐＡはポリアデニル化シグナルを指す。そのようなドナーの例は、配列番号１４５に記載されている。軽鎖ヌクレオチド配列は、配列番号１２５に記載され、配列番号１２６に記載されるタンパク質配列をコードする。重鎖ヌクレオチド配列は、配列番号１２７に記載され、配列番号１２８に記載されるタンパク質配列をコードする。軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号１４１に記載され、配列番号１４２に記載されるタンパク質配列をコードする。重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号１４３に記載され、配列番号１４４に記載されるタンパク質配列をコードする。３つの軽鎖ＣＤＲは、それぞれ、配列番号１２９～１３１に記載されて、それぞれ、配列番号１３５～１３７によってコードされる。３つの重鎖ＣＤＲは、それぞれ、配列番号１３２～１３４に記載されて、それぞれ、配列番号１３８～１４０によってコードされる。抗ＨＡ抗体の例は、配列番号１２６に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である軽鎖（任意選択で、配列番号１２９～１３１に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、配列番号１２８に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である重鎖（任意選択で、配列番号１３２～１３４に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、を含む。抗ＨＡ抗体の例は、配列番号１４２に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域（任意選択で配列番号１２９～１３１に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、配列番号１４４に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域（任意選択で、配列番号１３２～１３４に記載されているものに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＤＲを含む）と、を含む。具体的な例において、改変されたアルブミン遺伝子座（組み込まれた抗体コード配列を含む）は、配列番号１４６に記載の配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコード配列を含み得る。

【0221】

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰｃｒＶタンパク質を標的とする抗原結合タンパク質をコードするドナー核酸の具体例は、ＳＡ－ＨＣ－Ｔ２Ａ－ＬＣ－ｐＡを含み、ここで、ＳＡはスプライスアクセプター部位を指し、ＬＣは抗体の軽鎖を指し、Ｔ２ＡはＴ２Ａペプチドを指し、ＨＣは抗体の重鎖を指し、ｐＡはポリアデニル化シグナルを指す。

【0222】

Ｃ．セーフハーバー遺伝子座とアルブミン遺伝子座
本明細書のいずこかに記載されている抗原結合タンパク質をコードする配列は、細胞または動物の標的ゲノム遺伝子座にゲノム組み込みされ得る。セーフハーバー遺伝子座（セーフハーバー遺伝子）など、遺伝子を発現できる任意の標的ゲノム遺伝子座を使用することができる。組み込まれた外因性ＤＮＡと宿主ゲノムの間の相互作用は、組み込みの信頼性と安全性を制限する可能性があり、標的遺伝子改変によるものではなく、周囲の内因性遺伝子に対する組み込みの意図しない影響による明白な表現型効果をもたらす可能性がある。例えば、ランダムに挿入された導入遺伝子は、位置効果とサイレンシングの影響を受けやすく、その発現が信頼できず、予測できないものになる可能性がある。同様に、外因性ＤＮＡの染色体遺伝子座への組み込みは、周囲の内因性遺伝子とクロマチンに影響を及ぼし、それによって細胞の挙動と表現型を変化させる可能性がある。セーフハーバー遺伝子座には、導入遺伝子または他の外因性核酸インサートが、細胞の挙動または表現型を明白に変えることなく（すなわち、宿主細胞に有害な影響を与えることなく）、目的のすべての組織で安定かつ確実に発現できる染色体遺伝子座が含まれる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １２：５１－５８を参照されたい。例えば、セーフハーバー遺伝子座は、挿入された遺伝子配列の発現が、隣接する遺伝子からのリードスルー発現によって乱されない遺伝子座であり得る。例えば、セーフハーバー遺伝子座には、内因性遺伝子の構造または発現に悪影響を及ぼすことなく、外因性ＤＮＡが予測可能な方法で組み込まれて機能できる染色体遺伝子座を含めることができる。セーフハーバー遺伝子座には、遺伝子外領域または遺伝子内領域、例えば、必須ではない、不要な、または明白な表現型の結果なしに破壊できる遺伝子内の遺伝子座を含めることができる。

【0223】

このようなセーフハーバー遺伝子座は、すべての組織でオープンクロマチン構成を提供でき、胚発生中および成体で遍在的に発現することができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：３７８９－３７９４を参照されたい。さらに、セーフハーバー遺伝子座を高効率で標的化することができ、セーフハーバー遺伝子座を明白な表現型を伴わずに破壊することができる。セーフハーバー遺伝子座の例には、アルブミン、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、およびＲｏｓａ２６が含まれる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号、同第７，９７２，８５４号、同第７，９１４，７９６号、同第７，９５１，９２５号、同第８，１１０，３７９号、同第８，４０９，８６１号、同第８，５８６，５２６号、ならびに米国特許公開第２００３／０２３２４１０号、同第２００５／０２０８４８９号、同第２００５／００２６１５７号、同第２００６／００６３２３１号、同第２００８／０１５９９９６号、同第２０１０／００２１８２６４号、同第２０１２／００１７２９０号、同第２０１１／０２６５１９８号、同第２０１３／０１３７１０４号、同第２０１３／０１２２５９１号、同第２０１３／０１７７９８３号、同第２０１３／０１７７９６０号、および同第２０１３／０１２２５９１号を参照されたい。適切なセーフハーバー遺伝子座の別の例はＴＴＲである。

【0224】

抗原結合タンパク質のコード配列は、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の任意の部分に組み込むことができる。例えば、それらは、セーフハーバー遺伝子座のイントロンもしくはエキソンに挿入することができ、あるいはゲノム遺伝子座もしくはセーフハーバー遺伝子座の１つ以上のイントロンおよび／またはエキソンを置き換えることができる。標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた発現カセットは、標的ゲノム遺伝子座で内因性プロモーター（例えば、内因性アルブミンプロモーター）に作動可能に連結することができ、または標的ゲノム遺伝子座に対して異種である外因性プロモーターに作動可能に連結することができる。一例では、抗原結合タンパク質をコードする配列は、標的ゲノム遺伝子座（例えば、アルブミン遺伝子座）に組み込まれ、標的ゲノム遺伝子座（例えば、アルブミンプロモーター）で内因性プロモーターに作動可能に連結されている。別の例では、抗原結合タンパク質をコードする配列は、標的ゲノム遺伝子座（例えば、アルブミン遺伝子座）に組み込まれ、異種プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）に作動可能に連結されている。

【0225】

一例では、セーフハーバー遺伝子座はアルブミン遺伝子座である。アルブミンは肝臓で産生され、血中に分泌されるタンパク質である。血清アルブミンは、ヒトの血液中に見られるタンパク質の大部分である。アルブミン遺伝子座は高度に発現しており、ヒトでは毎日約１５ｇのアルブミンタンパク質が産生される。アルブミンにはオートクリン機能がなく、単対立遺伝子ノックアウトに関連する表現型は見られず、二対立遺伝子ノックアウトでは軽度の表現型の観察のみが見られる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：９４１７－９４２１を参照されたい。アルブミン遺伝子座は、治療用遺伝子の挿入と発現のための安全で効果的な部位である。長期発現のための肝臓のアルブミン遺伝子座への挿入は、魅力的な治療モダリティである。一例では、抗原結合タンパク質配列は、アルブミン遺伝子座の第１イントロンなどの、アルブミン遺伝子座のイントロンに組み込まれる。例えば、図１を参照されたい。アルブミン遺伝子構造は、その第１エキソンが最終タンパク質産物から切断される分泌ペプチド（シグナルペプチドまたはシグナル配列）をコードするため、イントロン配列への導入遺伝子のターゲティングに適している。例えば、スプライスアクセプターと治療用導入遺伝子を有するプロモーターのないカセットの組み込みは、多くの異なるタンパク質の発現と分泌をサポートする。

【0226】

ヒトＡＬＢは第４染色体上のヒト４ｑ１３．３に位置する（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ ２１３；Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＧＲＣｈ３８．ｐ１２（ＧＣＦ＿０００００１４０５．３８）；ｌｏｃａｔｉｏｎ ＮＣ＿０００００４．１２（７３４０４２３９．．７３４２１４８４（＋）））。この遺伝子は１５個のエキソンを有すると報告されている。野生型ヒトアルブミンタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２７６８が割り当てられている。少なくとも３つのアイソフォームが知られている（Ｐ０２７６８－１～Ｐ０２７６８－３）。マウスＡｌｂは、第５染色体上のマウス５ Ｅ１；５ ４４．７ ｃＭに位置する（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ １１６５７；Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＧＲＣｍ３８．ｐ４（ＧＣＦ＿０００００１６３５．２４）；位置ＮＣ＿００００７１．６（９０，４６０，８７０．．９０，４７６，６０２（＋）））。この遺伝子は１５個のエキソンを有すると報告されている。野生型マウスアルブミンタンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０７７２４が割り当てられている。他の多くの非ヒト動物のアルブミン配列も知られている。これらには、例えば、ウシ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２７６９；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ２８０７１７）、ラット（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２７７０；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ２４１８６）、ニワトリ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１９１２１）、スマトラオランウータン（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ５ＮＶＨ５；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ１００１７４１４５）、ウマ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３５７４７；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ１０００３４２０６）、ネコ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４９０６４；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ４４８８４３）、ウサギ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４９０６５；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ１００００９１９５）、イヌ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４９８２２；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ４０３５５０）、ブタ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８８３５；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ３９６９６０）、スナネズミ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ３５０９０）、ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ２８５２２）；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ７０４８９２）、ロバ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ５ＸＬＥ４；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ１０６８３５１０８）、ヒツジ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１４６３９；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ４４３３９３）、ウシガエル（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２１８４７）、ゴールデンハムスター（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ６ＹＦ５６）；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ１０１８３７２２９）、およびヤギ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ８５２９５）が含まれる。

【0227】

Ｄ．細胞および動物へのヌクレアーゼ剤およびドナー核酸の導入
本明細書に開示される方法は、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸）および外因性ドナー核酸を細胞または動物に導入することを含む。「導入すること」は、核酸またはタンパク質が動物内の細胞の内部または細胞の内部にアクセスできるように、細胞または動物に核酸またはタンパク質を提示することを含む。導入することは、任意の手段によって達成することができ、２つ以上の構成要素（例えば、２つの構成要素、またはすべての構成要素）を、任意の組み合わせで同時にまたは逐次的に細胞または動物に導入することができる。例えば、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）は、外因性ドナー核酸を導入する前に、細胞または動物に導入することができる。さらに、２つ以上の構成要素は、同じ送達方法または異なる送達方法によって細胞または動物に導入することができる。同様に、２つ以上の構成要素は、同じ投与経路または異なる投与経路によって動物に導入することができる。

【0228】

ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ（例えば、インビトロ転写されたＲＮＡ）の形態で、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。同様に、Ｃａｓ９タンパク質、ＺＦＮ、またはＴＡＬＥＮなどのタンパク質構成要素は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の形で細胞に導入することができる。例えば、ガイドＲＮＡとＣａｓ９タンパク質はどちらもＲＮＡの形態で導入できる。ＤＮＡの形態で導入されると、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、ＡＡＶを介して送達され、Ｕ６プロモーターの下でインビボで発現できる。そのようなＤＮＡは、１つ以上の発現コンストラクト中にあり得る。例えば、そのような発現コンストラクトは、単一の核酸分子の構成要素であり得る。代替的に、それらは、２つ以上の核酸分子の間で任意の組み合わせで分離することができる（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡおよび１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、別個の核酸分子の構成要素であり得る）。

【0229】

ガイドＲＮＡまたはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結することができる。発現コンストラクトは、遺伝子または他の目的の核酸配列の発現を指示することができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸コンストラクトを含む。発現コンストラクトにおいて使用することができる適切プロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。任意選択で、プロモーターは、一方向のガイドＲＮＡと他の方向の別の構成要素の両方の発現を駆動する双方向プロモーターであってもよい。このような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ならびに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターで構成してもよい。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥとＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。双方向プロモーターを使用してガイドＲＮＡと別の構成要素をコードする遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。

【0230】

ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ（または他の構成要素）をコードする核酸は、ガイドＲＮＡの安定性を増加させる（例えば、所定の保存条件下（例えば、－２０℃、４℃、または周囲温度）で、分解産物が閾値未満、例えば出発核酸またはタンパク質の０．５重量％未満のままである期間を延長する、あるいはインビボでの安定性を増加させる）担体を含む組成物中で提供され得る。そのような担体の非限定的な例としては、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ、Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻状物、および脂質微小管が挙げられる。

【0231】

細胞または動物への核酸またはタンパク質の導入を可能にするために、様々な方法および組成物が本明細書で提供される。核酸またはタンパク質を細胞または動物に導入するためのそのような方法には、例えば、ベクター送達、粒子媒介送達、エキソソーム媒介送達、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達、細胞透過性ペプチド媒介送達、または埋め込み型デバイスを介した送達が含まれ得る。具体的な例として、核酸またはタンパク質は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ、Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻状物、または脂質微小管などの担体中で、細胞または動物に導入することができる。動物への送達のいくつかの具体例には、流体力学的送達、ウイルス媒介送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達、またはアデノウイルス、レンチウイルス、もしくはレトロウイルスによる）、および脂質ナノ粒子媒介送達が含まれる。１つの具体的な例では、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）と外因性ドナー配列の両方を、ＬＮＰ媒介送達を介して送達してもよい。別の具体的な例では、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）と外因性ドナー配列の両方を、ＡＡＶ媒介送達を介して送達してもよい。例えば、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）と外因性ドナー配列とは、複数の異なるＡＡＶベクター（例えば、２つの異なるＡＡＶベクター）を介して送達してもよい。ヌクレアーゼ剤がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）である具体例では、第１のＡＡＶベクターはＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）またはＣａｓをコードする核酸を送達してもよく、第２のＡＡＶベクターはｇＲＮＡ（またはｇＲＮＡをコードする核酸）と外因性ドナー配列を送達してもよい。例えば、Ｃａｓ９コード配列がＡＡＶコンストラクトに適合することができるように、小さなプロモーターを使用することができる。そのようなプロモーターの例としては、Ｅｆｓ、ＳＶ４０、または肝臓特異的エンハンサー（例えば、ＨＢＶウイルス由来のＥ２またはセルピンＡ遺伝子由来のセルピンＡ）およびコアプロモーター（例えば、本明細書に開示されたＥ２Ｐ合成プロモーターまたはセルピンＡＰ合成プロモーター）を含む合成プロモーターが挙げられる。例示的なプロモーターには、以下が含まれる：（１）伸長因子１アルファショート（ＥＦ）（配列番号４０）、（２）シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（配列番号４１）、および２つの合成プロモーター（（３）初期領域２プロモーター（Ｅ２Ｐ）（配列番号４２）、および（４）セルピンＡＰ（配列番号４３））。しかしながら、他のプロモーターを使用してもよい。

【0232】

Ｃａｓ９（Ｃａｓ９をコードする核酸）が第１のＡＡＶで送達され、ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡをコードする核酸）と外因性ドナー配列が第２のＡＡＶで送達される場合、第１および第２のＡＡＶは任意の適切な比（例えば、送達されたウイルスゲノムの比）で送達され得る。例えば、第１のＡＡＶと第２のＡＡＶの比は、約２５：１～約１：２５、約１０：１～約１：１０、約５：１～約１：５、約約４：１～約１：４、約４：１～約１：１、約１：１～約１：４、約３：１～約１：３、約３：１～約１：１、約１：１～約１：３、約２：１～約１：２、約２：１～約１：１、約１：１～約１：２、または約１：１であり得る。具体例では、第１のＡＡＶと第２のＡＡＶの比は約１：２である。別の具体例では、第１のＡＡＶと第２のＡＡＶの比は約２：１である。別の具体例では、第１のＡＡＶと第２のＡＡＶの比は約１：１である。別の具体例では、第１のＡＡＶと第２のＡＡＶの比は約５：１である。別の具体例では、第１のＡＡＶと第２のＡＡＶの比は約１０：１である。別の具体例では、第１のＡＡＶと第２のＡＡＶの比は約１：５である。別の具体例では、第１のＡＡＶと第２のＡＡＶの比は約１：１０である。

【0233】

別の具体的な例では、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）をＬＮＰ媒介送達を介して送達してもよく、外因性ドナー配列をＡＡＶ媒介送達を介して送達してもよい。別の具体的な例では、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）をＡＡＶ媒介送達を介して送達してもよく、外因性ドナー配列をＬＮＰ媒介送達を介して送達してもよい。

【0234】

細胞または動物への核酸およびタンパク質の導入は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によって達成することができる。流体力学的送達は、インビボでの細胞内ＤＮＡ送達の方法として出現した。実質細胞への遺伝子送達では、必須のＤＮＡ配列のみを選択した血管から注射する必要があり、現在のウイルスおよび合成ベクターに関連する安全性の懸念が排除される。ＤＮＡは血流に注入されると、血液にアクセスできる様々な組織の細胞に到達することができる。流体力学的送達は、循環中の非圧縮性血液への大量の溶液の迅速な注射によって生成される力を利用して、大きくて膜不透過性の化合物が実質細胞に入るのを妨げる内皮および細胞膜の物理的障壁を克服する。ＤＮＡの送達に加えて、この方法は、ＲＮＡ、タンパク質、およびその他の小さな化合物をインビボで効率的に細胞内に送達するのに役立つ。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｎａｍａｓｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２８（４）：６９４－７０１を参照されたい。

【0235】

核酸の導入は、ＡＡＶ媒介送達またはレンチウイルス媒介送達などのウイルス媒介送達によっても達成することができる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが含まれる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染できる。ウイルスは宿主ゲノムに組み込まれてもよく、または代替的に宿主ゲノムに組み込まれなくてもよい。このようなウイルスは、免疫力が低下するように操作することもできる。ウイルスは、複製可能であってもよく、複製欠損（例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングの追加ラウンドに必要な１つ以上の遺伝子に欠陥がある）であってもよい。ウイルスは、一過性の発現、長期的な発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月）、または永続的な発現（例えば、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡの）を引き起こし得る。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）は、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５、および１０^１６ベクターゲノム／ｍＬを含む。

【0236】

ｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム、ＲｅｐとＣａｐで構成され、相補ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの末端逆位配列が隣接している。ＡＡＶトランスファープラスミドを構築する場合、導入遺伝子は２つのＩＴＲの間に配置され、ＲｅｐとＣａｐはトランスで供給される。ＲｅｐとＣａｐに加えて、ＡＡＶはアデノウイルス由来の遺伝子を含むヘルパープラスミドを必要とする場合がある。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、およびＶＡ）はＡＡＶ複製を仲介する。例えば、トランスファープラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、およびヘルパープラスミドをアデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含むＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を生成することができる。代替的に、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を組み合わせて単一のプラスミドとすることもできる。同様のパッケージングセルおよび方法は、レトロウイルスなどの他のウイルスにも使用できる。

【0237】

ＡＡＶの複数の血清型が確認されている。これらの血清型は、感染する細胞の種類（すなわち、それらの指向性）が異なり、特定の細胞型の優先的な形質導入を可能にする。ＣＮＳ組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。心臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。腎臓組織に対する血清型にはＡＡＶ２が含まれる。肺組織に対する血清型には、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、およびＡＡＶ９が含まれる。膵臓組織に対する血清型にはＡＡＶ８が含まれる。光受容細胞に対する血清型には、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。網膜色素上皮組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。骨格筋組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９が含まれる。肝臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９、特にＡＡＶ８が含まれる。

【0238】

指向性は、キャプシドと異なるウイルス血清型からのゲノムの混合である偽型付けによってさらに洗練することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５のキャプシドにパッケージされた血清型２のゲノムを含むウイルスを示す。偽型ウイルスの使用は、形質導入効率を改善するだけでなく、指向性を変えることができる。異なる血清型に由来するハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルスの指向性を改変することもできる。例えば、ＡＡＶ－ＤＪには、８つの血清型由来のハイブリッドキャプシドが含まれており、インビボで幅広い細胞型にわたって高い感染力を示す。ＡＡＶ－ＤＪ８は、ＡＡＶ－ＤＪの特性を示すが、脳への取り込みが強化された別の例である。ＡＡＶ血清型は、変異によっても改変できる。ＡＡＶ２の変異改変の例には、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、およびＳ６６２Ｖが含まれる。ＡＡＶ３の変異改変の例には、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、およびＴ４９２Ｖが含まれる。ＡＡＶ６の変異改変の例には、Ｓ６６３ＶおよびＴ４９２Ｖが含まれる。他の偽型／改変ＡＡＶ変異体には、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが含まれる。具体的な例では、ＡＡＶはＡＡＶ２／８（ＡＡＶ２ゲノムおよびＡＡＶ８キャプシドタンパク質を含むｒｅｐタンパク質）である。

【0239】

導入遺伝子の発現を加速するために、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは細胞のＤＮＡ複製機構に依存して、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補鎖を合成するため、導入遺伝子の発現が遅れる可能性がある。この遅延に対処するために、感染時に自発的にアニーリングすることができる相補的配列を含むｓｃＡＡＶを使用することができ、宿主細胞のＤＮＡ合成の必要性を排除する。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターも使用できる。

【0240】

パッケージング容量を増やすために、より長い導入遺伝子を、１つ目は３’スプライスドナー、２つ目は５’スプライスアクセプターである２つのＡＡＶトランスファープラスミドに分割することができる。細胞の共感染時に、これらのウイルスはコンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、完全長の導入遺伝子を発現させることができる。これにより、より長い導入遺伝子の発現が可能になるが、発現の効率は低下する。容量を増やすための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、導入遺伝子は２つのトランスファープラスミドに分割できるが、共発現が相同組換えと全長導入遺伝子の発現を誘導するように、実質的な配列の重複がある。

【0241】

特定のＡＡＶでは、カーゴはヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）を含むことができる。特定のＡＡＶでは、カーゴはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。特定のＡＡＶにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含み得る。特定のＡＡＶでは、カーゴに外因性ドナー配列を含めることができる。特定のＡＡＶでは、カーゴはヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）と外因性ドナー配列とを含むことができる。特定のＡＡＶにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸、および外因性ドナー配列を含み得る。

【0242】

核酸とタンパク質の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達によっても達成できる。例えば、ＬＮＰ媒介送達は、ＲＮＡの形態でガイドＲＮＡを送達するために使用することができる。具体的な例では、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質はそれぞれ、同じＬＮＰでのＬＮＰ媒介送達を介してＲＮＡの形態で導入される。本明細書のいずこかでより詳細に論じられるように、１つ以上のＲＮＡは、５’末端および／または３’末端に１つ以上の安定化末端修飾を含むように修飾され得る。そのような修飾には、例えば、５’末端および／または３’末端の１つ以上のホスホロチオエート結合、または５’末端および／または３’末端の１つ以上の２’－Ｏ－メチル修飾が含まれ得る。このような方法による送達は、ガイドＲＮＡの一過性の存在をもたらし、生分解性脂質はクリアランスを改善し、忍容性を改善し、免疫原性を低下させる。脂質製剤は、生体分子を分解から保護すると同時に、細胞への取り込みを改善することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に結合した複数の脂質分子を含む粒子である。これらには、ミクロスフェア（単層および多層ベシクル、例えばリポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相が含まれる。そのような脂質ナノ粒子は、送達のために１つ以上の核酸またはタンパク質をカプセル化するために使用することができる。カチオン性脂質を含む製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含めることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電または両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、およびナノ粒子がインビボで存在できる時間を増加させるステルス脂質である。適切なカチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の例は、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／０１０８４０Ａ１およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および１つ以上の他の成分を含むことができる。一例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含むことができる。別の例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質およびＤＳＰＣなどの中性脂質を含むことができる。別の例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの任意の中性脂質、およびＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３などのステルス脂質を含むことができる。

【0243】

ＬＮＰは、以下の１つ以上またはすべてを含み得る：（ｉ）カプセル化およびエンドソーム脱出のための脂質、（ｉｉ）安定化のための中性脂質、（ｉｉｉ）安定化のためのヘルパー脂質、および（ｉｖ）ステルス脂質を含む。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。特定のＬＮＰでは、カーゴはヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）を含むことができる。特定のＬＮＰでは、カーゴはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。特定のＬＮＰにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含み得る。特定のＬＮＰでは、カーゴに外因性ドナー配列を含めることができる。特定のＬＮＰでは、カーゴはヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）と外因性ドナー配列とを含むことができる。特定のＬＮＰにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸、および外因性ドナー配列を含み得る。

【0244】

カプセル化およびエンドソーム脱出のための脂質は、カチオン性脂質であり得る。脂質はまた、生分解性イオン化可能脂質などの生分解性脂質であり得る。適切な脂質の一例は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートである脂質ＡまたはＬＰ０１である。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。適切な脂質の別の例は、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）とも呼ばれる、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）である脂質Ｂである。適切な脂質の別の例は、２－（（４－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン－１，３－ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－９，１２－ジエノアート）である脂質Ｃである。適切な脂質の別の例は、３－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）－１３－（オクタノイルオキシ）トリデシル３－オクチルウンデカノアートである脂質Ｄである。他の適切な脂質としては、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（［（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル］４－（ジメチルアミノ）ブタノエートまたはＤｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３））としても知られる）が挙げられる。

【0245】

本明細書に記載のＬＮＰでの使用に適したいくつかのそのような脂質は、インビボで生分解性である。例えば、そのような脂質を含むＬＮＰには、脂質の少なくとも７５％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去されるものが含まれる。別の例として、ＬＮＰの少なくとも５０％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去される。

【0246】

このような脂質は、それらが含まれる培地のｐＨに応じてイオン化可能であってよい。例えば、わずかに酸性の培地では、脂質はプロトン化され、したがって正電荷を帯びることができる。逆に、例えば、ｐＨが約７．３５である血液などのわずかに塩基性の媒体では、脂質はプロトン化されない可能性があり、したがって電荷を帯びない可能性がある。いくつかの実施形態では、脂質は、少なくとも約９、９．５、または１０のｐＨでプロトン化され得る。そのような脂質が電荷を帯びる能力は、その固有のｐＫａに関連している。例えば、脂質は、独立して、約５．８～約６．２の範囲のｐＫａを有し得る。

【0247】

中性脂質は、ＬＮＰを安定化し、その加工を改善するよう機能する。適切な中性脂質の例には、様々な中性、非荷電、または双性イオン性脂質が含まれる。本開示における使用に好適な中性リン脂質の例は、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステロイルホスファチジルコリン、または１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルロレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、イソホスファチジルエタノールアミン、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＯＰＣ）、およびこれらの組み合わせを含むが、これらには限定されない。例えば、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択され得る。

【0248】

ヘルパー脂質には、トランスフェクションを促進する脂質が含まれる。ヘルパー脂質がトランスフェクションを強化する機序は、粒子安定性を増強することを含んでもよい。場合によっては、ヘルパー脂質が膜の融合性を高めることができる。ヘルパー脂質は、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールを含む。適切なヘルパー脂質の例には、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、およびヘミコハク酸コレステロールが含まれる。一例では、ヘルパー脂質はコレステロールまたはヘミコハク酸コレステロールであり得る。

【0249】

ステルス脂質には、ナノ粒子がインビボで存在できる時間の長さを変える脂質が含まれる。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減し、粒子サイズを制御することによって製剤化プロセスにおいて有用である。ステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性を調節し得る。適切なステルス脂質には、脂質部分に連結された親水性頭部基を有する脂質が含まれる。

【0250】

ステルス脂質の親水性頭部基は、例えば、ＰＥＧ（しばしばポリ（エチレンオキシド）と呼ばれる）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、およびポリＮ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドに基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含んでもよい。ＰＥＧという用語は、ポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。特定のＬＮＰ製剤では、ＰＥＧはＰＥＧ２０００とも呼ばれるＰＥＧ－２Ｋであり、平均分子量は約２，０００ダルトンである。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。

【0251】

ステルス脂質の脂質部分は、例えば、独立して約Ｃ４～約Ｃ４０の飽和または不飽和の炭素原子を含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含むジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから由来し得、ここで鎖は１つ以上の、例えばアミドまたはエステルなどの官能基を含み得る。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つ以上の置換アルキル基をさらに含み得る。

【0252】

一例として、ステルス脂質は、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ－ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（ｌ－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧ）、ポリ（エチレングリコール）－２０００－ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡ））、および１，２－ジステアリルオキシプロピル－３－アミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡ）から選択してもよい。１つの具体的な例において、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧであってよい。

【0253】

ＬＮＰは、製剤中の成分脂質の異なるそれぞれのモル比を含むことができる。ＣＣＤ脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４２モル％～約４７モル％、または約４５％であってよい。ヘルパー脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４１モル％～約４６モル％、または約４４モル％であってよい。中性脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約２０モル％、約５モル％～約１５モル％、約７モル％～約１２モル％、または約９モル％であってよい。ステルス脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約１０モル％、約１モル％～約５モル％、約１モル％～約３モル％、約２モル％、または約１モル％であってよい。

【0254】

ＬＮＰは、生分解性脂質（Ｎ）の正に帯電したアミン基と、カプセル化される核酸の負に帯電したリン酸基（Ｐ）との間で異なる比を有することができる。これは、方程式Ｎ／Ｐで数学的に表すことができる。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約０．５～約１００、約１～約５０、約１～約２５、約１～約１０、約１～約７、約３～約５、約４～約５、約４、約４．５、または約５であってよい。

【0255】

一部のＬＮＰでは、カーゴは、Ｃａｓ ｍＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）およびｇＲＮＡを含むことができる。Ｃａｓ ｍＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）およびｇＲＮＡは、異なる比であってよい。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５、または約１：１のＣａｓ ｍＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）とｇＲＮＡの比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、または約１０：１のＣａｓ ｍＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）とｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５のＣａｓ ｍＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）とｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：２の、ｃａｓ ｍＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）とｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。具体的な例において、Ｃａｓ ｍＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）とｇＲＮＡとの比は、約１：１または約１：２であってよい。

【0256】

一部のＬＮＰでは、カーゴは外因性ドナー核酸とｇＲＮＡを含むことができる。外因性ドナー核酸とｇＲＮＡは異なる比にすることができる。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５、または約１：１の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡの比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、約５：１～約１：１、約１０：１、または約１：１０の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡの比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：１：３、１：５、１：１０、または１：２５の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡ核酸の比を含んでもよい。

【0257】

適切なＬＮＰの具体的な例は、４．５の窒素対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比を持ち、４５：４４：９：２のモル比で生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む。生分解性カチオン性脂質は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであり得る。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５を参照されたい。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量比で１：１にすることができる。適切なＬＮＰの別の具体的な例には、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ－ＤＭＧが５０：３８．５：１０：１．５のモル比で含まれている。

【0258】

適切なＬＮＰの別の具体的な例は、６の窒素対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比を持ち、５０：３８：９：３のモル比で生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む。生分解性カチオン性脂質は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであり得る。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量比で１：２にすることができる。

【0259】

免疫原性を低下させるために、送達様式を選択することができる。例えば、異なる構成要素は、異なる様式（例えば、二峰性送達）によって配信され得る。これらの異なる様式は、対象の送達された分子に異なる薬力学または薬物動態特性を与える可能性がある。例えば、異なる様式は、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらす可能性がある。いくつかの送達様式（例えば、自律複製またはゲノム組み込みによって細胞内で持続する核酸ベクターの送達）は、分子のより持続的な発現および存在をもたらすが、他の送達様式は、一過性で持続性が低い（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の送達）。より一時的な方法で、例えばＲＮＡとして成分を送達することにより、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体が存在し、短期間のみ活性化することを保証し、免疫原性を低下させることができる。このような一時的な送達は、オフターゲットの改変の可能性を減らすこともできる。

【0260】

インビボでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内を含む任意の適切な経路によることができる。全身投与様式には、例えば、経口および非経口経路が含まれる。非経口経路の例には、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、および腹腔内経路が含まれる。具体的な例は静脈内注入である。局所投与様式には、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体（例えば、尾状核または被殻へ）、大脳皮質、前中心回旋、海馬（例えば、歯状回またはＣＡ３領域）、側頭皮質、扁桃体、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床、視蓋、被殻、またはニグラ実質への局所的な実質内送達）、眼内、眼窩内、結膜下、硝子体内、網膜下、および強膜を介した経路が含まれる。（全身的アプローチと比較して）有意に少量の成分は、全身的に投与された場合（例えば、静脈内）と比較して、局所的に投与された場合（例えば、実質内または硝子体内）に効果を発揮し得る。局所投与様式はまた、治療有効量の成分が全身投与されるときに起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生率を低減または排除し得る。

【0261】

具体的な例は、静脈内注射または注入である。ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸）および／または外因性ドナー核酸を含む組成物は、１つ以上の生理学的および薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または助剤を含んでもよい。製剤は、選択した投与経路に依存する可能性がある。「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤が製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに実質的に有害ではないことを意味する。

【0262】

投与の頻度および投与回数は、他の要因の中でもとりわけ、外因性ドナー核酸またはガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）の半減期および投与経路に依存し得る。細胞または動物への核酸またはタンパク質の導入は、ある期間にわたって１回または複数回実施することができる。例えば、導入は、ある期間にわたって一度だけ、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、ある期間にわたって少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回、実施することができる。

【0263】

Ｅ．インビボでの組み込まれた抗原結合タンパク質をコードする配列の発現および活性の測定
本明細書に開示される方法は、挿入された抗原結合タンパク質をコードする配列の発現および／または活性を評価することをさらに含むことができる。標的化遺伝子改変を有する細胞を同定するために様々な方法を使用することができる。スクリーニングは、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲを介して実施することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。好適な定量的なアッセイの他の例としては、蛍光媒介インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブすべてに対する定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、の目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０１４４６５５号を参照されたい）。

【0264】

次世代シーケンシング（ＮＧＳ）もスクリーニングに使用できる。次世代シーケンシングは、「ＮＧＳ」または「超並列シーケンシング」または「ハイスループットシーケンシング」と呼ばれることもある。ＮＧＳは、ＭＯＡアッセイに加えてスクリーニングツールとして使用して、標的となる遺伝子改変の正確な性質と、それが細胞タイプ、組織タイプ、または臓器タイプ間で一貫しているかどうかを定義できる。

【0265】

非ヒト動物におけるゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の改変を評価することは、任意の組織または臓器からの任意の細胞型にあり得る。例えば、評価は、同じ組織または臓器からの複数の細胞型、または組織または臓器内の複数の場所からの細胞で行うことができる。これは、標的組織または臓器内のどの細胞型が標的化されているか、または組織または臓器のどのセクションがヒトアルブミン標的化試薬によって到達されているかについての情報を提供することができる。別の例として、評価は複数の種類の組織または複数の臓器で行うことができる。特定の組織、臓器、または細胞型が標的にされる方法では、これは、その組織または臓器がどれほど効果的に標的にされるか、および他の組織または臓器にオフターゲット効果があるかどうかについての情報を提供することができる。

【0266】

抗原結合タンパク質の発現を測定するための方法は、例えば、動物からの血漿または血清中の抗体レベルを測定することを含み得る。そのような方法はよく知られている。そのような方法はまた、外因性ドナー核酸によってコードされる抗体ｍＲＮＡの発現を評価すること、または抗体の発現を評価することを含み得る。この測定は、肝臓内または肝臓内の特定の細胞型または領域内で行うことができ、または分泌された抗体の血清レベルを測定することを含むことができる。実施できるアッセイには、例えば、力価（ｈＩｇＧ）のＥＬＩＳＡ、標的抗原への結合のＥＬＩＳＡ、および以下の実施例１に記載されるような抗体の品質のためのウエスタンブロットが含まれる。

【0267】

使用できるアッセイの一例は、無傷の固定組織との関連で、単一ヌクレオチドの変化を含む、細胞特異的に編集された転写物を定量化することができる方法である、ＲＮＡＳＣＯＰＥ（商標）およびＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイである。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡ ＩＳＨアッセイは、遺伝子編集の特性評価においてＮＧＳおよびｑＰＣＲを補完することができる。ＮＧＳ／ｑＰＣＲは野生型および編集された配列の定量的平均値を提供できるが、組織内の編集された細胞の不均一性またはパーセンテージに関する情報は提供しない。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＩＳＨアッセイは、組織全体のランドスケープビューと、編集されたｍＲＮＡ転写物を含む標的組織内の実際の細胞数を定量化できる単一細胞分解能での野生型対編集された転写物の定量化とを提供できる。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）アッセイは、ペアオリゴ（「ＺＺ」）プローブを使用して非特異的なバックグラウンドなしでシグナルを増幅し、単一分子ＲＮＡ検出を実現する。しかしながら、ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）プローブの設計とシグナル増幅システムにより、ＺＺプローブを使用した単一分子ＲＮＡの検出が可能になり、無傷の固定組織における単一ヌクレオチドの編集と変異を差次的に検出できる。

【0268】

抗原結合タンパク質がウイルスまたは細菌の抗原を標的とする中和抗原結合タンパク質である場合、抗原結合タンパク質の活性を測定するためのアッセイは、ウイルスまたは細菌の中和アッセイを含み得る。例としては、感染した宿主細胞および感染性ウイルス粒子を検出するためにウイルスまたは細菌抗原に特異的な蛍光標識抗体を使用する免疫染色技術を使用するプラーク減少中和試験（ウイルスプラークアッセイ）または焦点形成アッセイが挙げられる。同様のアッセイはよく知られている。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ １７：１５７－１６２、およびＷｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５（１０）：３１０４－３１１２を参照されたい。

【0269】

抗原結合タンパク質の活性は、抗原結合タンパク質の標的となるウイルスまたは細菌に動物を曝露し、抗原結合タンパク質が感染から保護するかどうかを評価することによっても試験できる。同様の腫瘍アッセイモデルは、がん関連抗原を標的とする抗原結合タンパク質に使用できる。他の疾患関連抗原を標的とする抗原結合タンパク質についても、同様のアッセイが存在するか、開発できる。

【0270】

ＩＩＩ．予防的または治療的用途
本明細書に開示される方法は、疾患を有するかまたはそのリスクがある動物（ヒトまたは非ヒト）における疾患を治療またはその予防を実施するために使用することができる。対象が、危険因子のない個体よりも統計的に有意に高い疾患発症の危険性の危険因子に個体を置く少なくとも１つの既知の危険因子（例えば、遺伝的、生化学的、家族歴、状況的曝露）を有する場合、その個人は疾患のリスクが高くなる。

【0271】

例えば、そのような方法は、ゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座内の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸またはヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸）と抗原結合タンパク質が疾患に関連する抗原を標的とする、抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性のドナー核酸とを動物に導入することを含み得る。ヌクレアーゼ剤は、標的部位を切断することができ、抗原結合タンパク質をコードする配列がゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に挿入されて、改変されたゲノム遺伝子またはセーフハーバー遺伝子座をもたらし得る。次いで、抗原結合タンパク質を動物で発現させ、疾患に関連する抗原に結合させることができる。インビボで動物のゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を挿入するための方法は、本明細書のいずこかでより詳細に論じられている。

【0272】

抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、治療用抗原結合タンパク質または抗体であり得る。そのような抗原結合タンパク質または抗体は、疾患を引き起こす標的タンパク質の中和もしくはクリアランスのために、または疾患関連細胞（例えば、がん細胞）を選択的に殺傷するかもしくは除去するために使用することができる。このような抗体は、例えば、中和、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を含む、いくつかの異なる作用機序を介して作用することができる。

【0273】

抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、中和抗原結合タンパク質または抗体、あるいは広域中和抗原結合タンパク質または抗体であり得る。中和抗体は、細胞が生物学的に持つあらゆる効果を中和することにより、抗原または感染体から細胞を防御する抗体である。広域中和抗体（ｂＮＡｂ）は、特定の細菌またはウイルスの複数の株に影響を及ぼす。

【0274】

疾患関連抗原は、本明細書のいずこかでより詳細に説明されている。いくつかの例として、そのような抗原は、がん関連抗原、感染症関連抗原、細菌抗原、またはウイルス抗原であり得る。それぞれの例は、本明細書のいずこかに開示されている。

【0275】

ＩＶ．セーフハーバー遺伝子座に挿入された抗原結合タンパク質をコードする配列を含む細胞または動物またはゲノム
本明細書に開示される方法によって産生されるか、または本明細書に記載されるようなゲノム遺伝子座もしくはセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を含むゲノム、細胞、および動物も提供される。挿入することができる抗原結合タンパク質およびコード配列は、本明細書のいずこかでより詳細に記載されている。同様に、アルブミン遺伝子座などのゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座の例は、本明細書のいずこかでより詳細に説明されている。抗原結合タンパク質をコードする配列が安定して組み込まれるゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座は、抗原結合タンパク質をコードする配列についてはヘテロ接合であってよく、または抗原結合タンパク質をコードする配列についてはホモ接合であってもよい。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各ペアは、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合であり、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合であると記載される。本明細書に記載のゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を含む動物は、その生殖系列にゲノム遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を含むことができる。

【0276】

本明細書で提供されるゲノム、細胞、または動物は、例えば、動物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、およびヒトを含む、例えば、真核生物であり得る。「動物」という用語には、哺乳類、魚類、鳥類が含まれる。哺乳動物は、例えば、非ヒト哺乳動物、ヒト、げっ歯動物、ラット、マウス、またはハムスターであり得る。他の非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、家畜（例えば、ウシ、去勢牛などのウシ種、ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種、ならびにブタ、およびイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥類には、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒルなどが含まれる。飼育動物および農業用動物も含まれる。「非ヒト」という用語はヒトを除外する。

【0277】

細胞はまた、任意のタイプの未分化または分化状態であり得る。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞、またはマウス胚性幹（ＥＳ）細胞またはラットＥＳ細胞などの非ヒト多能性細胞）、または非多能性細胞であってよい。全能性細胞には、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞が含まれ、多能性細胞には、１種以上の分化細胞型へと発生する能力を有する未分化細胞が含まれる。

【0278】

本明細書で提供される細胞はまた、生殖細胞（例えば、精子または卵母細胞）であってよい。細胞は、有糸分裂能力のある細胞または有糸分裂的に不活性な細胞、減数分裂能力のある細胞または減数分裂的に不活性な細胞であり得る。同様に、細胞はまた、初代体細胞または初代体細胞ではない細胞であり得る。体細胞には、配偶子、生殖細胞、配偶子細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞が含まれる。例えば、細胞は、肝細胞、腎臓細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉系細胞、ケラチノサイト、血液細胞、メラノサイト、単球、単核細胞、単球前駆細胞、Ｂ細胞、赤芽球－巨核球細胞、好酸球、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島ベータ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、神経幹細胞、ニューロン、肝芽細胞、肝細胞、心筋細胞、骨格筋芽細胞、平滑筋細胞、管細胞、腺房細胞、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、白色または褐色脂肪細胞、または眼細胞（例えば、小柱網目細胞、網膜色素上皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、網膜周囲細胞、結膜上皮細胞、結膜線維芽細胞、虹彩色素上皮細胞、角膜細胞、水晶体上皮細胞、非色素繊毛上皮細胞、眼脈絡膜線維芽細胞、光受容細胞、神経節細胞、双極細胞、水平細胞、またはアマクリン細胞）であり得る。例えば、細胞は、肝芽細胞または肝細胞などの肝細胞であり得る。

【0279】

本明細書で提供される細胞は、正常で健康な細胞であってよいか、または罹患した細胞または変異を有する細胞であってよい。

【0280】

本明細書で提供される動物は、ヒトであってよいか、またはそれらは、ヒト以外の動物であってよい。本明細書に記載の核酸または発現カセットを含む非ヒト動物は、本明細書のいずこかに記載されている方法によって作製することができる。「動物」という用語には、哺乳類、魚類、鳥類が含まれる。哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、ヒツジ、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）、および家畜（例えば、ウシおよび去勢牛などのウシ種、ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種、ならびにブタおよびイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥類には、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、およびアヒルが含まれる。飼育動物および農業用動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語はヒトを除外する。ヒト以外の動物の具体的な例には、マウスおよびラットなどのげっ歯類が含まれる。

【0281】

非ヒト動物は、あらゆる遺伝的背景からのものであってよい。例えば、適切なマウスは、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９とＣ５７ＢＬ／６の雑種、ＢＡＬＢ／ｃ系統、またはスイスウェブスター系統からのものであり得る。１２９系統の例には、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、および１２９Ｔ２が含まれる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ １０（８）：８３６を参照されたい。Ｃ５７ＢＬ系統の例には、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが含まれる。適切なマウスはまた、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統の雑種（例えば、５０％１２９と５０％Ｃ５７ＢＬ／６）からのものであり得る。同様に、適切なマウスは、前述の１２９系統の雑種または前述のＢＬ／６系統の雑種（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）からのものであり得る。

【0282】

同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはフィッシャーＦ３４４またはフィッシャーＦ６などのフィッシャーラット系統からのものであり得る。ラットはまた、上述の２つ以上の系統の雑種に由来する系統から得ることができる。例えば、適切なラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統からのものであり得る。ＡＣＩラット系統は、白い腹と足、およびＲＴ１^ａｖ１ハプロタイプを有する黒いアグーチを持っていることを特徴としている。このような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートとＲＴ１^ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴としている。このようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。場合によっては、適切なラットは近交系ラット系統に由来する可能性がある。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。

【0283】

一部の動物では、血清または血漿中の抗原結合タンパク質の発現は、少なくとも約５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、１１００００、１２００００、１３００００、または１４００００、１５００００、２０００００、２５００００、３０００００、３５００００、または４０００００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、少なくとも約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、または１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００μｇ／ｍＬ）である。例えば、発現は、少なくとも約２５００、５０００、１００００、１０００００、または４０００００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、少なくとも約２．５、５、１０、１００、または４００μｇ／ｍＬ）であってよい。

【0284】

上記または下記で引用されているすべての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、各項目が、参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、すべての目的に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが違う時間にアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日においてアクセッション番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、アクセッション番号に関する実際の出願日以前または優先出願の出願日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。別段に他の指示がない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さおよび理解の目的に対し図表および例を介していくつかの詳細が記載されているが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変化および改変を実施することができることが明らかになろう。

【0285】

配列の簡単な説明
添付の配列表に列記されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、およびアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進み、３’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントもまた提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。

【0286】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【実施例】

【0287】

実施例１．マウスアルブミン遺伝子座への抗ジカ抗体遺伝子の挿入
マウスアルブミン遺伝子座への脂質ナノ粒子およびＡＡＶ媒介抗体の挿入
アルブミン遺伝子座は、治療用遺伝子の挿入と発現のための安全で効果的な部位である。ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９テクノロジーと安全なＡＡＶベクターを組み合わせて、予防的または治療的抗体遺伝子を肝臓のアルブミン遺伝子座にノックインして長期発現させることは、魅力的な治療モダリティである。

【0288】

予防的または治療的抗体遺伝子を肝臓のアルブミン遺伝子座にノックインするために、図１に示され、以下でより詳細に説明されるように、抗体発現のために抗体遺伝子をマウスアルブミン遺伝子座に挿入するための、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと、マウスアルブミン遺伝子の第１イントロンを標的とするｇＲＮＡと、自己切断ペプチドによって結合した抗体軽鎖および重鎖をコードするＡＡＶ２／８を担持する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を使用した。ＡＡＶ２／８は、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質と組み合わされたＡＡＶ２ゲノムおよびｒｅｐタンパク質を有する。重鎖コード配列は、Ｖ_Ｈ、Ｄ_Ｈ、およびＪ_Ｈセグメントを含み、軽鎖コード配列は、軽鎖Ｖ_Ｌおよび軽鎖Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントを含む。

【0289】

挿入戦略には、脂質ナノ粒子を使用してＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡをマウス肝臓に送達し、マウスアルブミン遺伝子の第１イントロンに二本鎖切断を誘導することが含まれていた。アルブミン遺伝子構造は、その第１エキソンが最終タンパク質産物から切断される分泌ペプチド（シグナルペプチドまたはシグナル配列）をコードするため、イントロン配列への導入遺伝子のターゲティングに適している。したがって、スプライスアクセプターと治療用抗体導入遺伝子を有するプロモーターのないカセットの組み込みは、治療用抗体導入遺伝子の発現と分泌をサポートした。次いで、抗体の軽鎖と重鎖をコードするＡＡＶ２／８は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介して二本鎖切断部位に組み込まれ、図１に示すように、抗体遺伝子は内因性アルブミンプロモーターによって転写された。

【0290】

実験で使用したＡＡＶゲノム（ｐＡＡＶ－ＡｌｂＳＡ－ＲＥＧＮ４５０４；配列番号１）には、２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）が隣接していた。ＡＡＶには、マウスアルブミン遺伝子の第１イントロンのスプライシングアクセプター（ＡｌｂＳＡ；配列番号２１）、ＲＥＧＮ４５０４抗体軽鎖ｃＤＮＡ（４５０４ＬＣ；配列番号２（核酸）および配列番号３（タンパク質））が含まれ、配列を正しいオープンリーディングフレームに保持するための２つの追加のＣ塩基、フューリン切断部位（配列番号２２（核酸）および配列番号２３（タンパク質））、ＧＳＧアミノ酸で構成されるリンカー、マウスＲｏｒ１シグナル配列（ｍＲＯＲｓｓ；配列番号３１または３２（核酸）および配列番号３３（タンパク質））、ＲＥＧＮ４５０４抗体重鎖コード配列（４５０４ＨＣ；配列番号４（核酸））および配列番号５（タンパク質））、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメントの短縮形（ｓＷＰＲＥ；配列番号３６）、ならびにＳＶ４０ポリＡ（ＳＶ４０ポリＡ；配列番号３７）を伴っていた。マウスアルブミン遺伝子座に組み込まれたドナーコンストラクト（内因性マウスアルブミンエキソン１：ｍＡｌｂｓｓ－ＬＣ－Ｐ２Ａ－ｍＲＯＲｓｓ－ＨＣ ＲＥＧＮ４５０４を含む）のコード配列は、配列番号１１５に示されている。

【0291】

第１の実験では、ＡＡＶドナー配列は、配列番号１に記載のＡＡＶ２／８ ＡｌｂＳＡ ４５０４抗Ｅｎｖ（ジカ）抗体ドナー配列であった。ドナーは、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドによって連結された抗体重鎖の上流の抗体軽鎖を含んでいた。配列の配列識別子を以下の表３に示す。

【0292】

【表3】

【0293】

脂質ナノ粒子は、マウスアルブミン遺伝子座のイントロン１を標的とする２つの異なるバージョンのガイドＲＮＡを送達するように設計された。第１のバージョン（ｇＲＮＡ１ｖ１）はＮキャップ修飾されており、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでいた。第２のバージョン（ｇＲＮＡ１ｖ２）は、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用しないすべての２’ＯＨ基が２’－Ｏ－メチル類似体に置き換えられ、Ｃａｓ９と最小限の相互作用をゆするガイドＲＮＡのテール領域は、５’および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合で修飾されていた。さらに、ＤＮＡ標的化セグメントは、一部の塩基に２’－フルオロ修飾を有する。

【0294】

脂質ナノ粒子の製剤を表４に示す。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（キャップされ、修飾ウリジンを含む）およびｇＲＮＡ（重量比１：１で含まれる）。ＬＮＰはＮＡＮＯＡＳＳＥＭＢＬＥＲ（商標）ベンチトップで製剤化された。ナノ粒子は、微少流体チップで自己組織化した。

【0295】

【表4】

【0296】

実験計画を図２に示す。群ごとに３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を１ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈内注射し、ＡＡＶ ＡｌｂＳＡ ４５０４（３Ｅ１１ ｖｇ／マウス）を０日目に共注射した。実験には３つの群が含まれていた。（１）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを送達するＬＮＰと第１のバージョンのガイドＲＮＡ１ｖ１＋ＡＡＶ２／８ ＡｌｂＳＡ ４５０４とを送達するＬＮＰ；（２）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと第２のバージョンのガイドＲＮＡ１＋ＡＡＶ２／８ ＡｌｂＳＡ ４５０４を送達するＬＮＰ；（３）生理食塩水陰性対照。図２に示すように、ＬＮＰおよびＡＡＶ２／８の注射は０日目に行われた。血漿採血は、７、１４、および２８日目（すなわち、１、２、および４週目）に得られた。

【0297】

アデノ随伴ウイルスの産生は、ＨＥＫ２９３細胞を用いたトリプルトランスフェクション法を使用して実施された。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｍｅｔｚｇｅｒ（２０１６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３（２）：ｅ３８を参照されたい。適切なベクター、１つのヘルパープラスミド、ｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号２４００７４）、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含む１つのプラスミド（ｐＡＡＶ ＲＣ２（Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号ＶＰＫ－４２２）、ｐＡＡＶ ＲＣ２／８（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号ＶＰＫ－４２６）、およびＡＡＶ ＩＴＲと導入遺伝子を提供する１つのプラスミド（ｐＡＡＶ－ＡｌｂＳＡ－ＲＥＧＮ４５０４；配列番号１）による、ＰＥＦｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）媒介トランスフェクションの１日前に、細胞を播種した。トランスフェクションの７２時間後、培地を回収し、細胞を緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５％デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ６７５０－１００Ｇ）］で溶解した。次に、ベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を培地と細胞溶解物の両方に最終濃度０．５Ｕ／μＬになるように加えた後、３７℃で６０分間インキュベートした。細胞溶解物を４０００ｒｐｍで３０分間スピンダウンした。細胞溶解物と培地を合わせ、最終濃度８％のＰＥＧ８０００（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ番号Ｐ４３４０）で沈殿させた。ペレットを４００ｍＭのＮａＣｌに再懸濁し、１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清中のウイルスを１４９，０００ｇで３時間の超遠心分離によりペレット化し、ｑＰＣＲにより力価測定した。

【0298】

ｑＰＣＲでＡＡＶゲノムを滴定するために、ＡＡＶサンプルをＤＮａｓｅＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＥＮ０５２５）で３７℃で１時間処理し、ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔ Ａｌｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号４４０３３１９）を使用して溶解した。カプセル化されたウイルスゲノムは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＡＡＶ２ ＩＴＲに対するプライマーを使用して定量化された。ＡＡＶ２ ＩＴＲプライマーの配列は、５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ－３’（ｆｗｄ ＩＴＲ；配列番号８２）および５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ－３’（ｒｅｖ ＩＴＲ；配列番号８３）であり、それぞれ、ＡＡＶからの左側の内部逆位反復配列（ＩＴＲ）の配列、および右側の内部逆位反復配列（ＩＴＲ）の配列に由来する。ＡＡＶ２ ＩＴＲプローブの配列は、５’－６－ＦＡＭ－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ－ＴＡＭＲＡ－３’（配列番号８４）であった。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３（１）：１８－２８を参照されたい。９５℃で１０分間の活性化ステップの後、９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、４０サイクルの２ステップＰＣＲサイクルを実施した。ＴＡＱＭＡＮユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３０４４３７）をｑＰＣＲで使用した。ＤＮＡプラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号２４００７４）を標準として使用して絶対力価を決定した。

【0299】

血清中の抗体価を定量化するためにＥＬＩＳＡアッセイを実施した。黒色の９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号４３７１１１）を、１μｇ／ｍＬのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃガンマ断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ番号１０９－００５－０９８）で４℃で一晩コーティングした。プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液（ＶＷＲ番号５１５１－００１１）で洗浄した後、３％－ＢＳＡブロッキング緩衝液（ＳｅｒａＣａｒｅ番号５１４０－０００８）で室温で１時間ブロックした。プレートを４回洗浄した後、標準として精製されたＲＥＧＮ４５０４（抗ジカＡｂ）抗体、または０．５％－ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０ＡＤＢ溶液（ＳｅｒａＣａｒｅ番号５１４０－００００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号８５１１４）で１：１００に初期希釈した後、１：３段階希釈のマウス血清のいずれかと１時間室温でインキュベートした。標準抗体および血清とのインキュベーション後、プレートを４回洗浄し、ＡＤＢ溶液中１：１０，０００のヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号３１４１２）で室温で１時間インキュベートした。最後に、プレートを８回洗浄し、次いでＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号３７０７０）を使用して発色し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ２０３０ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ３マルチラベルリーダーで読み取った。

【0300】

ＬＮＰとＡＡＶの共注射により、ｇＲＮＡ１ｖ１を注射したマウスでは約１μｇ／ｍＬの抗体発現が得られ、ｇＲＮＡ１ｖ２を注射したマウスでは０．５μｇ／ｍＬの抗体発現が得られた（図３）。抗体発現は４週目まで増加し続けた。ＬＮＰとｇＲＮＡ１ｖ１およびＡＡＶ２／８－ＡｌｂＳＡ－ＲＥＧＮ４５０４の共注射により、４週目に約１０μｇ／ｍＬの抗体が発現し、ｇＲＮＡ１ｖ２を注射したマウスでは５μｇ／ｍＬの抗体が発現した（図３）。第１のガイドＲＮＡバージョン（Ｎ－ｃａｐ ｇＲＮＡ）を含むＬＮＰは、第２のガイドＲＮＡバージョンよりもよりよく機能した。血清中の１０μｇ／ｍＬの抗体は、感染症などの多くの疾患の治療域に到達する。組み込まれたＡＡＶから発現した抗体は、ジカ熱、インフルエンザ、またはその他の感染症の病原体による致死的な感染からマウスを保護する可能性がある。

【0301】

組み込まれたＡＡＶから産生された抗体が機能的であり、ジカウイルスに対して中和活性を有するかどうかを判定するために、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ ＬＮＰおよびＡＡＶ２／８ ＡｌｂＳＡ４５０４抗ジカ抗体ドナー配列の注射後４週間目に採取した血漿サンプルを使用してジカ中和アッセイを実施した。感染の１日前に、１万個のＶｅｒｏ細胞（カタログ番号ＣＣＬ－８１、ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、黒色で透明な底部の９６ウェル細胞培養処理プレート（Ｃａｔ＃３９０４、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｔｅｒｂｏｒｏ、ＮＪ）中のＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳ、ＰＳＧ）（カタログ番号１０３１３－０２１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にウェルごとに播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。次いで、１２μＬの血清を出発点として使用した。次いで、血漿を１：３希釈係数のＤＭＥＭで希釈し、総量を１２μＬに保った。１２μＬの２．０Ｅ＋０４ ｆｆｕ／ｍＬ ＭＲ７６６ウイルス（ＵＴＭＢ Ａｒｂｏｖｉｒｕｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）を血漿とインキュベートし、３０分のインキュベーション後に細胞に添加した。感染の１日後、細胞を氷冷したメタノールとアセトンの１：１混合液で４℃で３０分間固定し、５％ＦＢＳと０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含むＰＢＳで室温で１５分間透過処理し、ＰＢＳ＋５％ＦＢＳを用いて室温で３０分間ブロッキングし、一次抗体（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｒａｎｃｈから入手したジカマウス免疫化腹水液をＰＢＳ＋５％ＦＢＳで１：１０，０００に希釈）で室温で１時間染色し、二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス１μｇ／ｍＬを含むＰＢＳ＋５％ＦＢＳ、カタログ番号Ａ１１００１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）と室温で１時間インキュベートした。次いで、ＭｉｎｉＭａｘモジュールを備えたＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３（カタログ番号３５３７０１３４６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）プレートリーダーでプレートを読み取った。マウス血清中の抗体は中和活性を有しなかった（図４）。

【0302】

ウエスタンブロットを使用して、終末採血からの血清中の抗体の品質を評価した。簡潔に述べると、１５μｇの血清をＮｕＰＡＧＥサンプル還元剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号ＮＰ０００９）を含むか、または含まないＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプル緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号ＮＰ０００７）で希釈し、７０℃で１０分間インキュベートした。次いで、サンプルをＮｕＰＡＧＥ ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号ＮＰ０３２１ＢＯＸ）にロードし、ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ ＳＤＳ泳動緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号ＮＰ０００１）で２００Ｖで約３５分間泳動した。ラダーとしてＭａｇｉｃＭａｒｋ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号ＬＣ５６０２）を使用し、ゲルの陽性対照としてＲＥＧＮ４５０４（抗ジカＡｂ）を使用した。ゲルは、ｉＢｌｏｔ２ドライブロッティングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号ＩＢ２１００１）によってｉＢｌｏｔ２ ＰＶＤＦ ＭｉｎｉＳｔａｃｋｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号ＩＢ２４００２）に転写された。メンブレンをＴＢＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号２８３６０）中の５％ミルク（ＶＷＲ番号Ｍ２０３－１０Ｇ－１０ＰＫ）で室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳ中のヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号３１４１２）で１：５，０００で室温で１時間プローブした。次いで、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号３４０９５）を使用してブロットを発色し、ＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰイメージングシステムでイメージングした。ウエスタンブロッティングは、軽鎖の発現が異常であることを示し、軽鎖が不適切に切断されたことを示唆した（図５）。

【0303】

Ｃａｓ９レディーマウスのマウスアルブミン遺伝子座への抗体挿入
第１の概念実証実験の後、導入遺伝子は、Ｃａｓ９レディーマウスのマウスアルブミン遺伝子の第１イントロンへのＡＡＶ－ＲＥＧＮ４４４６の相同性非依存性標的挿入媒介一方向標的挿入用に設計された（図６）。マウスゲノムのＲｏｓａ２６遺伝子座の第１イントロンに組み込まれたＣａｓ９コード配列を有するＣａｓ９レディーマウスは、ＵＳ２０１９／００３２１５５およびＷＯ２０１９／０２８０３２に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0304】

この戦略では、重鎖をコードするセグメントは軽鎖をコードするセグメントの上流にあったため（図６）、重鎖の分泌は内因性のアルブミン分泌シグナルによって駆動された。異なる２Ａペプチド、Ｆ２Ａ（配列番号２６（核酸）および２７（タンパク質））、Ｐ２Ａ（配列番号２４（核酸）および２５（タンパク質））、ならびにＴ２Ａ（配列番号２８（核酸）および２９（タンパク質））、ならびに、アルブミン（配列番号３４（核酸）および３５（タンパク質））とマウスＲｏｒ１シグナル配列（配列番号３１または３２（核酸）および３３（タンパク質））の両方は、軽鎖発現の駆動について試験された（図６）。さらに、ＲＥＧＮ４５０４による上述の実験とは対照的に、ＩＴＲは削除された。４つの異なる挿入コンストラクト（（１）ＡＡＶ２／８．ｈＵ６ｇＲＮＡ１．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｆ２Ａ Ａｌｂｓｓ ＬＣ（配列番号６）、（２）ＡＡＶ２／８．ｈＵ６ｇＲＮＡ１．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｐ２Ａ Ａｌｂｓｓ ＬＣ（配列番号７）、（３）ＡＡＶ２／８．ｈＵ６ｇＲＮＡ１．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ Ａｌｂｓｓ ＬＣ（配列番号８）、および（４）ＡＡＶ２／８．ｈＵ６ｇＲＮＡ１．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ ＲＯＲｓｓ ＬＣ（配列番号９））および２つのエピソーム抗体発現コンストラクト（（５）ＡＡＶ２／８．ＣＭＶ．ＲＥＧＮ４４４６ ＬＣ Ｔ２Ａ ＨＣ（配列番号１１）、および（６）ＡＡＶ２／８．ＣＡＳＩ．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ ＬＣ（配列番号１０））を、Ｃａｓ９レディーマウスに注射した（表５）。配列の配列識別子を以下の表６に示す。マウスアルブミン遺伝子座に組み込まれたドナーコンストラクトのコード配列（内因性マウスアルブミンエキソン１を含む：（１）ｍＡｌｂｓｓ－ＨＣ－Ｆ２Ａ－Ａｌｂｓｓ－ＬＣ ＲＥＧＮ４４４６；（２）ｍＡｌｂｓｓ－ＨＣ－Ｐ２Ａ－Ａｌｂｓｓ－ＬＣ ＲＥＧＮ４４４６；（３）ｍＡｌｂｓｓ－ＨＣ－Ｔ２Ａ－Ａｌｂｓｓ－ＬＣ ＲＥＧＮ４４４６；および（４）ｍＡｌｂｓｓ－ＨＣ－Ｔ２Ａ－ＲＯＲｓｓ－ＬＣ ＲＥＧＮ４４４６）は、それぞれ配列番号１１６－１１９に記載されている。

【0305】

【表5】

【表6】

【0306】

実験設計を図７に示す。群ごとに、７～１１週齢の３匹のオスｐＲｏｓａ２６＠ＸｂａＩ－ｌｏｘＰ－Ｃａｓ９－２Ａ－ｅＧＦＰ（２６００ＫＯ／３０４０ＷＴ）マウスを使用した。ＡＡＶ２／８は０日目に注射された（２００μＬ ＩＶ注射）。図７に示すように、ＡＡＶ２／８注射は０日目に行われ、血清採血は１０日目、２８日目、または５６日目に得られた。さらなる分析のために、注射後７０日目にマウスを解体した。血清採血後に行われた試験には、力価のＥＬＩＳＡ（ｈＩｇＧ；図８）、結合のＥＬＩＳＡ（ジカ；図１０）、抗体品質のウエスタンブロット（図９）、および機能性の中和アッセイ（図１１）が含まれていた。マウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）アッセイも実施された（データ示さず）。

【0307】

エピソーム抗体発現コンストラクトは、２８日後のマウス血清において約１００μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬの抗体力価をもたらした。軽鎖の前にアルブミンシグナル配列を含む挿入されたＡＡＶは、約５μｇ／ｍＬの抗体発現をもたらした。驚いたことに、軽鎖の前にｍＲｏｒ１シグナル配列と組み込まれたＡＡＶは、マウス血清中で約１０００μｇ／ｍＬの抗体を発現した（図８）。軽鎖の上流のＲＯＲシグナル配列を使用した力価は、軽鎖の上流のアルブミンシグナル配列を使用した力価よりも有意に高かった。ウエスタンブロッティングは、組み込まれたＡＡＶから発現した抗体の重鎖と軽鎖の分子量が精製された抗体と類似していることを示した（図９）。

【0308】

ＥＬＩＳＡを使用して、エピソームＡＡＶおよび組み込まれたＡＡＶから発現した抗体の結合親和性を測定した。ジカ（ｐｒＭ８０Ｅ）－ｍｍｈ（ロット番号ＲＥＧＮ４２３３－Ｌ４ ５／１２／１６ ＰＢＳＧ ０．２７９ｍｇ／ｍＬ）を、黒色の９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号４３７１１１）で４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートをＫＰＬ洗浄緩衝液（ＶＷＲ番号５１５１－００１１）で洗浄した後、３％－ＢＳＡブロッキング緩衝液（ＳｅｒａＣａｒｅ番号５１４０－０００８）で室温で１時間ブロックした。プレートを４回洗浄した後、標準として精製されたＲＥＧＮ４４４６（抗ジカＡｂ）抗体、または０．５％－ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０ＡＤＢ溶液（ＳｅｒａＣａｒｅ番号５１４０－００００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号８５１１４）で１：１００に初期希釈した後、１：３段階希釈のマウス血清（終末採血から）のいずれかと１時間室温でインキュベートした。標準抗体および血清とのインキュベーション後、プレートを４回洗浄し、ＡＤＢ溶液中１：１０，０００のヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号３１４１２）で室温で１時間インキュベートした。最後に、プレートを８回洗浄し、次いでＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号３７０７０）を使用して発色し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ２０３０ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ３マルチラベルリーダーで読み取った。ＥＬＩＳＡは、エピソームＡＡＶと組み込まれたＡＡＶの両方から発現した抗体の結合能力が精製されたＲＥＧＮ４４４６に匹敵することを示した（図１０）。

【0309】

マウスによって産生された抗体が機能的であるかどうかを判定するために、終末採血からの血清を用いてジカ中和アッセイを実施した。ジカ中和アッセイ（図４で説明したように実施）は、エピソームＡＡＶと組み込まれたＡＡＶの両方から発現した抗体の中和活性が精製ＲＥＧＮ４４４６と同様であることを示した（図１１）。組織収集のために犠牲にされたマウスのインデルのＮＧＳ分析は、インデル率（アルブミン遺伝子の第１イントロンでのＣａｓ９／ｇＲＮＡ１切断によって引き起こされる）が挿入コンストラクトを注射されたマウス間で類似しているのに対し、生理食塩水とエピソームＡＡＶを注射されたマウスはバックグラウンドレベルのインデル率を有した（図１２Ａ）。アルブミンエキソン１に結合する１つのプライマーと、抗体重鎖に結合するもう１つのプライマーによるＴＡＱＭＡＮ ｑＰＣＲは、抗体のｍＲＮＡレベルが類似していることを示した。これは、軽鎖の前のｍＲｏｒ１シグナル配列がマウス肝臓で２ｌｏｇを超える抗体産生を促進することを示している（図１２Ｂ）。２つのコンストラクトの唯一の違いが軽鎖コード配列の上流のシグナル配列であるＴ２Ａ／ＡｌｂｓｓとＴ２Ａ／ＲＯＲｓｓを比較すると、ＲＯＲｓｓはアルブミンシグナル配列と比較して抗体分泌を劇的に促進するようである。図８と図１２Ｂを比較されたい。

【0310】

アルブミン遺伝子への２つのＡＡＶ媒介抗体挿入
上に示したように、Ｃａｓ９レディーマウスのマウスアルブミン遺伝子座のイントロン１に抗体遺伝子を挿入すると、高レベルの抗体発現をもたらした。Ｃａｓ９レディーではない生物に挿入を行うために、Ｃａｓ９発現カセットを担持する別のＡＡＶを使用することができる。Ｃａｓ９のｃＤＮＡ（４．１ｋｂ）はＡＡＶのパッケージング容量に近いため）、最初にＡＡＶ／Ｃａｓ９コンストラクトに適合し、肝臓でのＣａｓ９発現を駆動できるいくつかの小さなプロモーターをスクリーニングした。

【0311】

小さなｔＲＮＡＧｌｎプロモーター（配列番号３８）を使用して、標的遺伝子１を標的とするガイドＲＮＡの発現を駆動した。Ｃａｓ９発現を駆動するために４つのプロモーターを試験した：（１）伸長因子１アルファショート（ＥＦ）（配列番号４０）、（２）シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（配列番号４１）、および２つの合成プロモーター（（３）初期領域２プロモーター（Ｅ２Ｐ）（配列番号４２）、および（４）セルピンＡＰ（配列番号４３））。合成プロモーターは、ＨＢＶウイルス由来の肝臓特異的エンハンサーＥ２（配列番号４４）、またはセルピンＡ遺伝子由来のセルピンＡエンハンサー（配列番号４５））およびコアプロモーター（配列番号４６）から構成されていた（図１３）。

【0312】

ｔＲＮＡＧｌｎ ｇＲＮＡおよびＣａｓ９を担持し、４つの異なるプロモーターによって駆動される、１Ｅ１２ ＶＧのＡＡＶ２／８ウイルス（ｔＧｌｎ ｇＲＮＡ ＥＦｓ Ｃａｓ９（配列番号４７）、ｔＧｌｎ ｇＲＮＡ ＳＶ４０ Ｃａｓ９（配列番号４８）、ｔＧｌｎ ｇＲＮＡ Ｅ２Ｐ Ｃａｓ９（配列番号４９）、およびｔＧｌｎ ｇＲＮＡセルピンＡＰ Ｃａｓ９（配列番号５０））をマウスに注射した。５つの群が試験された：（１）生理食塩水対照、（２）ＡＡＶ２／８．ｔＧｌｎ ｇＲＮＡ ｅ２Ｐ Ｃａｓ９、（３）ＡＡＶ２／８．ｔＧｌｎ ｇＲＮＡ セルピンＡＰ Ｃａｓ９、（４）ＡＡＶ２／８．ｔＧｌｎ ｇＲＮＡ Ｅｆｓ Ｃａｓ９、および（５）ＡＡＶ２／８．ｔＧｌｎ ｇＲＮＡ ＳＶ４０ｐＣａｓ９。

【0313】

５週間後、血清を採取し、製造元のプロトコールに従ってＥＬＩＳＡによって標的タンパク質１レベルを分析した（図１４）。合成プロモーターを注射したマウスでは、標的タンパク質１レベルがノックダウンされ、セルピンＡプロモーターが最もよく機能しているように見えた（図１４）。

【0314】

次に、２つのＡＡＶ、５Ｅ１１ ＶＧまたは１Ｅ１２ ＶＧ／マウスのいずれかのＡＡＶ２／８．セルピンＡＰ．Ｃａｓ９（配列番号３９）および１Ｅ１２ ＶＧ／マウスのＡＡＶ２／８．ｈＵ６ｇＲＮＡ１．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ ｍＲＯＲｓｓ ＬＣ（配列番号９）を、５週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスまたは８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。群ごとに３匹のマウスを使用した。実験設計を図２０と表７に示す。

【0315】

【表7】

【0316】

ｇＲＮＡ１コード配列はＣａｓ９ ＡＡＶの代わりにＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ ｍＲＯＲｓｓ ＬＣ ＡＡＶに含まれているため、両方のＡＡＶに感染した細胞のみがインデルと抗体遺伝子の挿入を有する。エピソームＡＡＶ２／８．ＣＡＳＩ．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ ＬＣ（配列番号１０）を陽性対照として使用した。注射の４週間後、ＡＡＶ２／８．セルピンＡＰ．Ｃａｓ９の力価が高い群の抗体発現レベルは約１００μｇ／ｍＬであったが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは力価の低いグループは約５０μｇ／ｍＬであった（図１５）。一方、ＡＡＶ２／８．ｈＵ６ｇＲＮＡ１ｖ１．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ ｍＲＯＲｓｓ ＬＣ注射マウス（Ｃａｓ９ ＡＡＶ注射なし）には抗体発現がなかった。次いで、ＡＡＶ２／８．セルピンＡＰ．Ｃａｓ９（配列番号３９；１Ｅ１２ ＶＧ／マウス）およびＡＡＶ２／８．ｈＵ６ｇＲＮＡ１．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ ｍＲＯＲｓｓ ＬＣ（配列番号９；１Ｅ１２ ＶＧ／マウス）を注射したマウス、ならびにエピソームＡＡＶ２／８．ＣＡＳＩ．ＲＥＧＮ４４４６（５Ｅ１１ ＶＧ／マウス）を注射したマウスについて、高力価群の時間経過を１１８日に延長した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＢＡＬＢ／ｃマウスの両方を使用した。注射後１１８日で、組み込みのためのＡＡＶ２／８．セルピンＡＰ．Ｃａｓ９（配列番号３９）およびＡＡＶ２／８．ｈＵ６ｇＲＮＡ１．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ ｍＲＯＲｓｓ ＬＣ（配列番号９）を注射したマウスの抗体発現レベルは１０００μｇ／ｍＬに近づき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのエピソームＡＡＶ２／８．ＣＡＳＩ．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ ＬＣ（配列番号１０）対照群の抗体発現レベルと同等であった（図１８、左パネル）。同じ傾向がＢＡＬＢ／ｃマウスでも観察された－抗体（ヒトＩｇＧ）レベルの持続的な増加が経時的に観察され、エピソーム対照群の発現レベルに近づいた（図１８、右パネル）－これらの結果は系統特異的でないことを示した。

【0317】

マウスによって産生された抗体が機能的であるかどうかを判定するために、図１５の高力価群の２８日目の血清を使用してジカ中和アッセイを実施した。ジカ中和アッセイ（図４で説明したように実施）は、この方法で生成された抗体が、精製されたＲＥＧＮ４４４６と同等にジカウイルスを中和することを示した（図１６）。さらに、結合能力（ジカエンベロープタンパク質への結合）を上述のように評価して、精製されたＲＥＧＮ４４４６の結合を、エピソームＡＡＶから発現した抗体またはＣａｓ９媒介ＡＡＶ組み込みに続いて発現した抗体と比較した。ＥＬＩＳＡは、エピソームＡＡＶと組み込まれたＡＡＶの両方から発現した抗体の結合能力が精製されたＲＥＧＮ４４４６に匹敵することを示した。図１９を参照されたい。したがって、エピソームおよび挿入戦略を介して発現したモノクローナル抗体は、結合アッセイと中和アッセイの両方によって評価されるとき、ＣＨＯ産生精製抗体と機能的に同等であった。結合および中和の結果の定量化を以下の表８に示す。

【0318】

【表8】

【0319】

中和のために、ベロ細胞を感染の１日前に１０，０００細胞／ウェルで黒色の透明底部の９６ウェル細胞培養処理プレート中のＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳ、ＰＳＧ）に播種し、感染の時まで、３７℃で５％ＣＯ_２でインキュベートした。感染の日に、マウス血清サンプルをＤＭＥＭ感染培地（２％ＦＢＳ、ＰＳＧ）で最終中和反応濃度の２倍に希釈した。血清を培地に添加して、中和ウェルあたり１２μＬの血清の開始濃度とした（希釈あたり２４μＬの血清。ウイルスと１：１で組み合わせると、最終中和ウェルで１２μＬ／血清が得られる）。次いで、サンプルを９６ウェルＶ底マイクロタイタープレートで３倍に段階希釈し、中和ウェルあたり０．０００２μＬの血清で終了し、合計１１の血清濃度とした。対照抗体ＲＥＧＮ４４４６（ロットＨ４ｙＨ２５７０３Ｎ）も、ＤＭＥＭ感染培地で、ビヒクルを注射したマウスからの血清とともに、最終中和反応濃度の２倍に希釈し、中和反応での開始濃度を５μｇ／ｍＬ（３．３３Ｅ－０８Ｍ、または３３．３３ｎＭ）とし、９６ウェルマイクロタイタープレート全体で３倍段階希釈し、０．００００８μｇ／ｍＬ（５．６５Ｅ－１３Ｍまたは５６５ｆＭ）で終了する、合計１１の希釈とした。血清／培地の非感染および感染対照を可能にするために、ＤＭＥＭ感染培地、またはアッセイで使用される血清の最大量と混合されたＤＭＥＭ感染培地を含む対照ウェルも調製された。ウイルスは、ＭＲ７６６ウイルス（ＵＴＭＢ Ａｒｂｏｖｉｒｕｓ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから取得し、Ｖｅｒｏ細胞で継代３まで増殖）をＤＭＥＭ感染培地で２．０Ｅ＋０６ｆｆｕ／ｍＬのストック濃度から希釈して、２ｆｆｕ／細胞、または２０，０００ｆｆｕ／中和ウェルの感染多重度を与えることによって調製した。抗体と血清希釈は、Ｖ底９６ウェルマイクロタイタープレート中で希釈したウイルスと１：１で組み合わせ、３０分間３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。次いで、ウイルス／抗体／血清希釈液を細胞に加えた。１時間のインキュベーション後、接種物を除去し、細胞を１００μＬのＤＭＥＭ＋１％ＦＢＳ、ＰＳＧ、１％メチルセルロースで覆い、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩（１６～２０時間）インキュベートした。メチルセルロースオーバーレイを細胞から吸引し、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、図４で概説したプロトコールに従って、細胞を固定、染色、および定量した。結果を図２１に示す。これは、ＡＡＶを注射したマウスの血清中のエピソームおよび肝臓に挿入された抗ジカ抗体による同等の中和を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＢＡＬＢ／ｃマウスの両方の血清中のエピソームおよび肝臓に挿入された抗ジカモノクローナル抗体は、ナイーブマウス血清にスパイクされたＣＨＯ精製抗体と機能的に同等であった。

【0320】

エピソームまたはデュアルＡＡＶ挿入戦略のいずれかから生成されたモノクローナル抗体の機能を試験するために、インビボのジカ接種モデルが採用された。図２２を参照されたい。１０～１１週齢のメスのインターフェロンアルファおよびベータ受容体１ノックアウトマウス（ＩＦＮＡＲ）を、Ｎ＝４マウスの７つの群に分けた。群は、以下のいずれかの注射を受けた。（１）ＰＢＳ、（２）ＣＡＧプロモーターによって駆動されるオフターゲット対照抗体をエピソームで発現するＡＡＶ２／８、（３）低用量（１．０Ｅ＋１１ ＶＧ／マウス）、または（４）高用量（５．０Ｅ＋１１ＶＧ／マウス）のＡＡＶ２／８．ＣＡＳＩ．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ ＬＣ（配列番号１０）でＲＥＧＮ４４４６抗ジカ抗体をエピソームで発現する、（５）低用量（５．０Ｅ＋１１ＶＧ／マウス／ベクター）または（６）高用量（１．０Ｅ＋１２ＶＧ／マウス／ベクター）の、ＲＥＧＮ４４４６抗ジカ抗体の肝臓挿入発現のためのＡＡＶ２／８．ＳｅｒｐｉｎＡＰ．Ｃａｓ９（配列番号３９）およびＡＡＶ２／８．ｈＵ６ｇＲＮＡ１．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ ｍＲＯＲｓｓ ＬＣ（配列番号９；１Ｅ１２ ＶＧ／マウス）の両方、または（７）２００μｇのＣＨＯ精製ＲＥＧＮ４４４６抗ジカ抗体。群（１）～（６）は尾静脈注射により静脈内注射された。群（５）および（６）は、接種開始の２１日前に注射された。群（１）～（４）は接種の１４日前に注射された。群（７）は接種の２日前に皮下注射された。接種の１日前に、すべてのマウスを眼窩後方から採血し、血清を収集して、ヒトＦＣ ＥＬＩＳＡを実施し、各マウスのヒトモノクローナル抗体（オフターゲット対照またはＲＥＧＮ４４４６のいずれか）の循環力価を測定した。接種前にマウスの体重を測定し、腹腔内で１０^５ｆｆｕのＦＳＳ１３０２５ウイルスに感染させた。次いで、ジカウイルスの送達後最大１４日間、２４時間ごとにマウスの体重を測定した。体重減少が接種日の体重の＞２０％に達したら、マウスを犠牲にした。残りのすべてのマウスは１４日目に犠牲にされた。

【0321】

図２３は、接種の１日前に各動物でＦＣ ＥＬＩＳＡによって検出されたｈＩｇＧの力価を示す。各バーの高さは群ごとの平均力価であり、各ポイントはその群内の個々の動物の力価を表す。図３で概説したのと同じＦＣ ＥＬＩＳＡプロトコールを、各マウスから収集した血清で使用した。推定生存率は、ＣＨＯ精製のＲＥＧＮ４５０４またはＲＥＧＮ４４４６抗ジカ抗体を使用した以前の接種実験に基づいて点線でプロットされている。エピソームおよびＰＢＳ注射は接種の１４日前に実施され、挿入（デュアルＡＡＶ）は接種の２１日前に実施された。ＣＨＯ精製群には、接種の２日前に２００μｇのＲＥＧＮ４４４６を注射した。

【0322】

図２４Ａは、送達されたＶＧ／マウスによって群分けされた動物の生存データの結果を示す。図２３に示すように、各用量群では、特にエピソーム群において、接種の１日前に測定された循環ｍＡＢの量に大きなばらつきがある。さらに、群ごとに４匹のマウスがいた。したがって、データを見る別の方法は、図２４Ｂに示すように、ＡＡＶ送達のタイプと用量ではなく、接種時の循環ｍＡＢの量によってマウスを群分けすることである。図２４Ｂは、高用量または低用量でエピソームまたはデュアルＡＡＶ戦略によって送達されたかどうかに関係なく、循環ＡＡＶ送達ＲＥＧＮ４４４６の力価によって動物が群分けされるように再配置された図２４Ａのデータを示す。図２４Ｂの上部の表の値は、接種の１日前に測定されたｍＡＢのレベル（μｇ／ｍＬ）であり、コードは、ｍＡＢテンプレートを送達したＡＡＶのタイプエピソーム発現のための単一ＡＡＶ、またはＣａｓ９媒介組み込みおよび低用量もしくは高用量のいずれかのためのデュアルＡＡＶのいずれか）である。図２４Ａのようにデータをプロットして送達されたＡＡＶのタイプごとに群分けすると、用量反応は不明瞭になるが、図２４Ｂは、接種に対する用量反応を示す機能的ｍＡＢを生成したことを示している。

【0323】

実施例２．マウスアルブミン遺伝子座への抗血球凝集素抗体または抗ＰｃｒＶ抗体遺伝子の挿入
同じ戦略を使用して、抗血球凝集素（抗ＨＡ；インフルエンザ）抗体または抗ＰｃｒＶ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）抗体を組み込んで発現させる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１００８０７を参照されたい。次いで、アルブミン遺伝子座から発現した抗体がマウスの感染を予防するかどうかを判定するために試験が行われる。

【0324】

第１の実験では、ＡＡＶドナー配列は、配列番号１６に記載のＡＡＶ２／８ ＡｌｂＳＡ ３２６３抗ＨＡ（インフルエンザ）抗体ドナー配列であった。ドナーは、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドによって連結された抗体軽鎖と抗体重鎖とを含んでいた。配列の配列識別子を以下の表９に示す。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１００８０７（Ｈ１Ｈ１１７２９Ｐ）も参照されたい。マウスアルブミン遺伝子座に組み込まれたドナーコンストラクト（内因性マウスアルブミンエキソン１：ｍＡｌｂｓｓ－ＬＣ－Ｐ２Ａ－ＨＣ ＲＥＧＮ３２６３を含む）のコード配列は、配列番号１２０に示されている。

【0325】

【表9】

【0326】

第１の実験（抗ＨＡ）の実験設計を図１７に示す。群ごとに５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用する。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は２ｍｇ／ｋｇの濃度で注射され、ＡＡＶ ＡｌｂＳＡ ３２６３（３Ｅ１１）またはＡＡＶ ＣＭＶ ３２６３（１Ｅ１１）は０日目にＬＮＰなしで、または０日目にＬＮＰの共注射で注射される。実験には６つの群が含まれる：（１）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ１ｖ１＋ＡＡＶ２／８ ＡｌｂＳＡ ３２６３を送達するＬＮＰ、（２）ＡＡＶ２／８ ＡｌｂＳＡ３２６３単独、（３）ＡＡＶ２／８ ＣＭＶ３２６３単独、（４）ＲＥＧＮ ３２６３抗体注射（高用量）、（５）ＲＥＧＮ３２６３抗体注射（低用量）、ならびに（６）生理食塩水陰性対照。図１７に示すように、ＬＮＰおよびＡＡＶ２／８の注射は０日目に行われ、抗体の注射（高用量および低用量の陽性対照）は９日目に行われる。血漿採血は７日目（すなわち、１週目）に得られる。その後、インフルエンザウイルスを注射して、アルブミン遺伝子座から発現した抗体がマウスの感染を予防するかどうかを試験する。

【0327】

エピソームとデュアルＡＡＶ戦略の両方を使用して発現する追加のモノクローナル抗体を実証するために、Ｃ５７ＢＬ／６メスマウス（９週齢）にＡＡＶ２／８エピソームフォーマットの３つのｍＡＢのうちの１つを注射した：（１）ＡＡＶ２／８．ＣＡＳＩ．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ ＬＣ（配列番号１０）、（２）Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ（ＣＡＧプロモーターＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）、または（３）Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗ＨＡ（ＣＡＧプロモーターＬＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＨＣ）。ＲＥＧＮ４４４６はＩｇＧ４ユーバーステルスフォーマットである。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ１０，５５６，９５２を参照されたい。Ｈ１Ｈ２９３３９ＰおよびＨ１Ｈ１１８２９Ｎ２はＩｇＧ１フォーマットである。Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗体配列の配列識別子を以下の表１０に示す。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／１００８０７も参照されたい。ウイルスは、尾静脈注射を介して１Ｅ１２ ＶＧ／マウスの用量で送達された。５、２０、および３０日目にマウスを眼窩後方から採血し、分析のために血清を収集した。循環するヒトＩｇＧの力価は、ＦＣ ＥＬＩＳＡを使用して測定した。図３で概説したのと同じＦＣ ＥＬＩＳＡプロトコールを、各マウスから収集した血清で使用した。各ｍＡＢに対応する一致するＣＨＯ精製タンパク質を使用して、血清サンプルの各セットの標準曲線を個別に作成した。図２５には、最初の時点の値のみが示されている。

【0328】

【表10】

【0329】

さらに、ｐＲｏｓａ２６＠ＸｂａＩ－ｌｏｘＰ－Ｃａｓ９－２Ａ－ｅＧＦＰメスマウス（２２週齢）に、ｇＲＮＡ１と、２つの抗体発現カセットのうちの１とを担持するＡＡＶ２／８と１つを注射した：（１）Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ（ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）、または（２）Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗ＨＡ（ＬＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＨＣ）（配列番号１４５）。ウイルスは、尾静脈注射を介して１Ｅ１２ ＶＧ／マウスの用量で送達された。１２、２７、および３７日目にマウスを眼窩後方から採血し、分析のために血清を収集した。循環するヒトＩｇＧの力価は、ＦＣ ＥＬＩＳＡを使用して測定した。図３で概説したのと同じＦＣ ＥＬＩＳＡプロトコールを、各マウスから収集した血清で使用した。各ｍＡＢに対応する一致するＣＨＯ精製タンパク質を使用して、血清サンプルの各セットの標準曲線を個別に作成した。図２５には、最初の時点の値のみが示されている。ｇＲＮＡ１とＨ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ（ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）発現カセットとを担持するＡＡＶ２／８を注射した個々のｐＲｏｓａ２６＠ＸｂａＩ－ｌｏｘＰ－Ｃａｓ９－２Ａ－ｅＧＦＰメスマウス（２２週齢）の、ヒトＦＣ ＥＬＩＳＡによって検出されたｈＩｇＧ値が表１１に示される。図２５のデータは、抗ジカ抗体と同様に、抗ＰｃｒＶおよび抗ＨＡモノクローナル抗体がＡＡＶ媒介挿入戦略を使用してインビボで発現できることを示している。

【0330】

【表11】

【0331】

図２６および２７は、それぞれ、上述の実験におけるマウスからの血清Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶｍＡＢの結合および中和／細胞毒性データを示している。サンプルには、ＰＢＳにスパイクされたＣＨＯ精製Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ、ビヒクル注射マウス血清にスパイクされたＣＨＯ精製Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ、エピソームフォーマットのＲＥＧＮ４４４６抗ジカｍＡＢ ＡＡＶ２／８．ＣＡＳＩ．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ ＬＣ（配列番号ＮＯ：１０）を注射したマウスの血清、エピソームフォーマットのＨ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ ｍＡＢ（ＣＡＧ ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）を注射したマウスの血清、および挿入フォーマットのＨ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ ｍＡＢ（ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）を注射したマウスの血清が含まれる。エピソームサンプルは、注射の５日後に収集された血清からのものであった。挿入サンプルは、注射の１２日後に収集された血清からのものであった。エピソームおよび肝臓に挿入された抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体は、インビトロでＣＨＯ産生精製抗体と比較して、結合および中和においてわずかに効果が低いようであった。図２６および表１２は、マウス血清からのエピソームおよび肝臓に挿入された抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体の結合が、ＣＨＯ産生モノクローナル抗体よりもわずかに弱いことを示している。図２７および表１２は、マウス血清からのエピソームおよび肝臓に挿入された抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体の中和が、ＣＨＯ産生モノクローナル抗体の２～５倍以内であることを示している。

【0332】

ＡＡＶ送達からの抗ＰｃｒＶ含有血清のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰｃｒＶ組換えタンパク質へのＥＬＩＳＡ結合（図２６）は、以下のように実施された：ＭｉｃｒｏＳｏｒｐ ９６ウェルプレートは、０．２μｇ／ウェルの組換え全長Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰｃｒＶ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）でコーティングされ、４℃で一晩インキュベートした。翌朝、プレートを洗浄緩衝液（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むイミダゾール緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、２００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中３％ＢＳＡ）で２５℃で２時間ブロッキングした。プレートを１回洗浄し、複数の力価の抗ＰｃｒＶ抗体（３３３ｎＭ～０．１ｐＭの範囲で０．５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０／ＰＢＳで１：３段階希釈）または血清希釈（１：３００希釈で開始して０．５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０／ＰＢＳで１：３段階希釈）をタンパク質を含むウェルに加え、２５℃で１時間インキュベートした。ウェルを３回洗浄した後、ウェルあたり１００ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＨＲＰ二次抗体とともに２５℃で１時間インキュベートした。１００μＬのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ化学発光基質を各ウェルに添加し、シグナルを検出した（Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ３プレートリーダー、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。発光は、１２ポイントの応答曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）で４パラメーターのロジスティック方程式によって分析された。

【0333】

次のように図２７のための中和／細胞毒性アッセイを実施した：Ａ５４９細胞を９６ウェルの透明底黒色組織培養処理プレート中に、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（１０％熱不活化ＦＢＳおよびＬ－グルタミンを補充）中にｍＬ当たり約５×１０^５細胞の密度で播種し、５％ＣＯ_２で３７℃で一晩インキュベートした。翌日、培地を細胞から除去し、１００μＬのアッセイ培地（フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ、１０％熱不活化ＦＢＳを補充）と交換した。一方、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ６０７７株（Ｇｅｒａｌｄ Ｐｉｅｒ，Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の対数期培養は、以下のように調製した：一晩のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ培養物をＬＢ中で増殖させ、新鮮なＬＢで１：５０に希釈し、ＯＤ_６００が約１になるまで３７℃で振とうしながら増殖させた。培養物をアッセイ培地で１回洗浄し、ＰＢＳでＯＤ_６００＝０．０３に希釈した。５０μＬ中の等量の細菌を、５０μＬの複数の力価の抗ＰｃｒＶ抗体（３３３ｎＭ～１７ｐＭの範囲で１：３段階希釈）または血清希釈（１：１００希釈から開始した１：３段階希釈）と混合し、２５°で３０～４５分間インキュベートした。培地をＡ５４９細胞から除去し、１００μＬの細菌：抗体ミックスで置き換え、５％ＣＯ_２で３７℃で２時間インキュベートした。ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ（商標）アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞死を決定した。発光は、１０ポイントの応答曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）で４パラメーターのロジスティック方程式によって分析された。

【0334】

【表12】

【0335】

図２８および２９は、それぞれ、上述の実験におけるマウスからの血清Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗ＨＡ ｍＡＢの結合および中和データを示している。サンプルには、ＰＢＳにスパイクされたＣＨＯ精製Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２、ビヒクル注射マウス血清にスパイクされたＣＨＯ精製Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２、エピソームフォーマットのＲＥＧＮ４４４６抗ジカｍＡＢ ＡＡＶ２／８．ＣＡＳＩ．ＲＥＧＮ４４４６ ＨＣ Ｔ２Ａ ＬＣ（配列番号ＮＯ：１０）を注射したマウスの血清、エピソームフォーマットのＨ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗ＨＡ ｍＡＢ（ＣＡＧ ＬＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＨＣ）を注射したマウスの血清、および挿入フォーマットのＨ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗ＨＡ ｍＡＢ（ＬＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＨＣ）（配列番号１４５）を注射したマウスの血清が含まれる。エピソームサンプルは、注射の５日後に収集された血清からのものであった。挿入サンプルは、注射の１２日後に収集された血清からのものであった。アイソタイプ対照は、ＣＨＯ精製された抗ＦＥＬＤ１である。エピソームおよび肝臓に挿入された抗ＨＡモノクローナル抗体は、インビトロでＣＨＯ産生精製抗体と機能的に同等であった。図２８は、マウス血清中のエピソームおよび肝臓に挿入された抗ＨＡモノクローナル抗体の同等の結合を示し、図２９は、マウス血清中のエピソームおよび肝臓に挿入された抗ＨＡモノクローナル抗体の同等の中和を示している。

【0336】

ＭＤＣＫ Ｌｏｎｄｏｎ細胞を、９６ウェルプレートの５０μＬの感染培地（１％ピルビン酸ナトリウム、０．２１％Ｌｏｗ ＩｇＧ ＢＳＡ溶液、および０．５％ゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ）に４０，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を４時間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。次いで、プレートを、１０＾－４の希釈で５０μＬのＨ１Ｎ１ Ａ／プエルトリコ／０８／１９３４で感染させ優しくタップして、２０時間、３７℃、５％ＣＯ_２、元の場所に戻した。続いて、プレートをＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡ５０μＬで固定し、室温で１５分間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、３００μＬのＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液で室温で１時間ブロッキングした。ＰＢＳまたはナイーブマウス血清にスパイクしたＣＨＯ精製Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗ＨＡ抗体（１００μｇ／ｍＬ抗体濃度から開始）、あるいはエピソームもしくは挿入されたＨ１Ｈ１１８９２Ｎ２抗ＨＡまたはエピソームＲＥＧＮ４４４６抗ジカフォーマットを有するＡＡＶを注射したマウスの血清をＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液で１：４から１．２Ｅ－４ｕｇ／ｍＬの最終濃度まで滴定した。インキュベーション後、ブロッキング緩衝液をプレートから取り出し、希釈した抗体を７５μＬ／ウェルで細胞に添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液（イミダゾール緩衝生理食塩水およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２０をＭｉｌｌｉ－Ｑ水で１倍に希釈）で３回洗浄し、７５μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液で１：２０００希釈した二次抗体（ロバ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲート）でオーバーレイした。二次溶液をプレート上で室温で１時間インキュベートした。続いて、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、１：１で調製した７５μＬ／ウェルの発色基質ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ基質を加えた。プレートは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘプレートリーダーで発光について直ちに読み取られた。

【0337】

継代１０未満のＭＤＣＫ Ｌｏｎｄｏｎ細胞をＭＤＣＫ培地（１０％熱不活化ＦＢＳ ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌ－グルタミン、およびゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭ）中にウェルあたり約８×１０^３細胞の密度で、９６ウェルの透明な底部黒色組織培養処理プレートに播種し、５％ＣＯ_２で３７℃で一晩インキュベートした。Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗ＨＡ抗体のエピソームフォーマットまたは挿入フォーマットのいずれかを注射したマウスの血清を１：１０に希釈し、次いでサンプルを９６ウェルＶ底マイクロタイタープレートで６倍に段階希釈して合計１１の血清濃度にした。ＣＨＯ精製Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗ＨＡ抗体を陽性対照としてナイーブマウス血清に希釈した。ＣＨＯ精製抗ＦＥＬＤ１を、同じく２００μｇ／ｍＬの陰性アイソタイプ対照としてナイーブマウス血清にスパイクした。Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１Ａ／ＰＲ／０８／３４（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＶＲ－１４６９、ロット番号５８１０１２０２）を氷上で解凍し、使用直前に希釈し、事前に希釈した血清抗体と１：１で組み合わせた。ＭＤＣＫ細胞から培地を除去し、６０μＬの２重の抗体：ウイルス混合物で置き換えた。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で２０時間インキュベートして、病巣を形成させた。翌日、抗体：ウイルス混合物を吸引除去し、細胞を洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。次いでプレートを洗浄し、２００μＬのブロッキング緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３７５３８および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を除去し、７５μＬの希釈一次抗体（マウス抗インフルエンザＡ ＮＰ抗体Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＡＢ８２５１）を添加して、４℃で一晩インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳで２回洗浄し、二次抗体（ヤギα－マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗体）を室温で１時間適用した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＣＴＬ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して直ちに読み取った。プレートは自動焦点で画像化され、感染していないウイルスのみの対照ウェルを使用して、最小および最大の蛍光設定で設定した。カウントのための設定として蛍光病巣を選択し、プレートを読み取った。次いで、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍに、カウントされた蛍光（感染）細胞の数と抗体濃度のＬＯＧ Ｍとしてプロットした。

【0338】

エピソームまたはデュアルＡＡＶ挿入戦略のいずれかから生成された抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体の機能を試験するために、インビボのシュードモナス接種モデルが採用された。図３０を参照されたい。メスのＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ－ＥｌｉｔｅおよびメスのＢＡＬＢ／ｃ Ｅｌｉｔｅマウス（５週齢）をＮ＝５マウス／群／種の１０の群に分けた。群は以下のいずれかを注射された。（１）ＰＢＳ、（２）アイソタイプ対照抗体Ｈ１Ｈ１１８２９Ｎ２抗ＨＡ（ＣＡＧ ＬＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＨＣ）をエピソーム発現するＡＡＶ２／８、（３）低用量（１．０Ｅ＋１０ＶＧ／マウス）もしくは（４）高用量（１．０Ｅ＋１１ ＶＧ／マウス）の、ＣＡＧプロモーター（ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣフォーマット）によって駆動されるＨ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ抗体をエピソーム発現するＡＡＶ２／８、（５）低用量（１Ｅ＋１１ＶＧ／マウス／ベクター）もしくは（６）高用量（１Ｅ＋１２ ＶＧ／マウス／ベクター）の、ｇＲＮＡ１とＨ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ ｍＡｂ発現カセット（ＨＣ＿Ｔ２Ａ＿ＲＯＲｓｓ＿ＬＣ）を担持する１つと、ＡＡＶ２／８．ＳｅｒｐｉｎＡＰ．Ｃａｓ９（配列番号３９）との２つのＡＡＶ、（７）低用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）もしくは（８）高用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）のＣＨＯ精製Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ ｍＡＢ、または（９）１．０ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ６８４ ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照。群１０は、感染していない対照として機能するマウスの群であった。別の群（群１１）は、保護されていない感染した対照（細菌のみ）として機能した。群（１）～（６）は、接種開始の１６日前に尾静脈注射により静脈内注射された。群（７）～（９）は、接種の２日前に皮下注射された。追加のＮ＝５マウスにも、追加のビヒクルのみの対照マウスのためにＰＢＳを皮下注射し、群（１）のマウスの総数を１０匹／種にした。接種の７日前に、群（１）～（６）のマウスを眼窩後方から採血し、血清を収集して、ヒトＦＣ ＥＬＩＳＡを実施し、各マウスのヒトｍＡＢ（アイソタイプ対照またはＨ１Ｈ２３９３３Ｐ）の循環力価を決定した。接種の日にマウスの体重を測定し、次いで鼻腔内注射によりＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株６０７７を接種した。次いで、細菌投与後最大７日間、２４時間ごとにマウスの体重を測定した。体重減少が＞２０％に達するか、マウスが次のような臨床的苦痛の他の兆候を示したら、マウスを犠牲にした。無気力；刺激に反応しない；けば立った毛皮、腰を下ろした姿勢、震え；または「神経学的」徴候（頭の傾き、回転、片側への落下）。瀕死であることが判明した、仰向けにしたときに自分自身を正すことができないマウスも犠牲にした。残りのすべてのマウスは、細菌感染後７日目に犠牲にされた。

【0339】

図３１は、９日前（これは接種の７日前）にＡＡＶを注射したマウスのｈＩｇＧ力価を示す。上述の実験で記載したように、ＡＡＶを使用してモノクローナル抗体カセットを送達した後９日目にマウス血清中を循環するｈＩｇＧのレベルを決定するために、ヒトＦＣ ＥＬＩＳＡを実施した（図３の方法で記載したように）。いくつかの値は、この時点でのアッセイの検出限界（１００ｎｇ／ｍＬ）を下回っていた。別の実験では、年齢を一致させたＢＡＬＢ／ｃ－ｅｌｉｔｅマウスに、低用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）または高用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）のＣＨＯ精製Ｈ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶモノクローナル抗体を注射し、２日後に血清を２回採取し、これらの用量に対応する接種時に予想される循環ヒトＩｇＧレベルを決定した。これらの値は、グラフの右側にあるバーである。過去の観察と一致して、ＡＡＶ８はＢＡＬＢ／ｃよりも効率的にＣ５７ＢＬ／６マウスを形質導入する。その結果、シングルＡＡＶ（エピソーム）またはデュアルＡＡＶ（挿入）戦略のいずれかの形質導入の成功から生じる分泌タンパク質の値は、予想通りＢＡＬＢ／ｃマウスで低かった。挿入戦略では２つの異なるＡＡＶの形質導入を成功させる必要があるため、感染力が低下すると、タンパク質の分泌をもたらすＡＡＶが１つだけ必要な場合よりも、系統間で観察される力価がさらに低下する。

【0340】

図３２Ａおよび３２Ｂは、上記で概説したシュードモナス接種実験における群（２）～（６）および（１０）～（１１）の結果を示す（図３０）。これらは、モノクローナル抗体のＡＡＶ送達と、感染していない細菌のみの対照を含む群である。Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ－Ｅｌｉｔｅマウスでは、すべてのＡＡＶエピソーム送達アイソタイプ群（２）および保護されていない感染マウス（１１）は接種を生き延びなかった。すべての非感染マウス（１０）およびデュアルＡＡＶ戦略を使用してエピソームＡＡＶ発現またはアルブミン遺伝子座の第１イントロンへの挿入のいずれかを介して肝臓からＨ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ ｍＡＢを生成するマウスは、低用量または高用量のどちらが投与されたかに関係なく（３）～（６）生存した。図３２Ａを参照されたい。ＢＡＬＢ／ｃ－ｅｌｉｔｅマウスでは、５匹中４匹のＡＡＶエピソーム送達アイソタイプ対照（２）、すべての保護されていない感染マウス（１１）、およびすべてのデュアルＡＡＶ挿入戦略低用量マウス（５）は接種を生き延びなかった。すべての非感染マウス（１０）およびエピソームＡＡＶ発現を介して肝臓からＨ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ ｍＡＢを生成するマウスは、低用量でも高用量でも（３）～（４）生存した。高用量を受けたデュアルＡＡＶ戦略からＨ１Ｈ２９３３９Ｐ抗ＰｃｒＶ ｍＡＢを生成するすべてのマウス（６）は生き残った。図３２Ｂを参照されたい。

【0341】

要約すると、アルブミン遺伝子座への複数の異なる抗体遺伝子の挿入の成功を示し、生成された抗体がインビトロでＣＨＯ生成精製抗体と機能的に同等であり、インビボ接種モデルで保護を提供することを示した。これらの実験は、複数のＩｇＧタイプの抗体を使用して行われた。すべてのジカデータは、ＩｇＧ１であるＲＥＧＮ４５０４またはＩｇＧ４ユーバーステルスフォーマットであるＲＥＧＮ４４４６を使用しており、抗ＰｃｒＶおよび抗ＨＡ抗体はＩｇＧ１フォーマットである。ウイルスを標的とする抗体（抗ジカ熱または抗ＨＡ）および細菌を標的とする抗体（抗ＰｃｒＶ）を用いた発現、機能性、および保護効果を示した。同様に、重鎖が最初である挿入された抗体遺伝子（抗ＰｃｒＶおよび抗ジカ）を試験し、軽鎖が最初である抗体遺伝子（抗ＨＡおよび抗ジカ）を試験した。同様に、２つの抗体鎖間で複数の異なる２Ａタンパク質を試験した（抗ＰｃｒＶは最初に重鎖のＴ２Ａであり、抗ＨＡは最初に軽鎖のＴ２Ａであり、抗ジカで重鎖が最初であるＦ２Ａ、Ｐ２Ａ、およびＴ２Ａを試験した）。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
インビボで動物またはインビトロもしくはインビボで細胞においてセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を挿入するための方法であって、（ａ）前記セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤、または前記ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸、および（ｂ）前記抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸を前記動物または前記細胞に導入することを含み、
前記ヌクレアーゼ剤が前記標的部位を切断し、前記抗原結合タンパク質をコードする配列が前記セーフハーバー遺伝子座に挿入されて、改変されたセーフハーバー遺伝子座を生成する、方法。
(項目２)
前記抗原結合タンパク質が疾患関連抗原を標的とする、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記動物における抗原結合タンパク質の発現が、前記動物における前記疾患に対して予防的または治療的効果を有する、項目２に記載の方法。
(項目４)
疾患を有するか、またはそのリスクのある動物において前記疾患を治療するか、またはその予防を実施する方法であって、（ａ）セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的とするヌクレアーゼ剤、または前記ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸、および（ｂ）抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸を前記動物に導入することを含み、
前記抗原結合タンパク質が、前記疾患に関連する抗原を標的とし、
前記ヌクレアーゼ剤が前記標的部位を切断し、前記抗原結合タンパク質をコードする配列が前記セーフハーバー遺伝子座に挿入されて、改変されたセーフハーバー遺伝子座を生成し、
それにより、前記抗原結合タンパク質が、前記動物で発現し、前記疾患に関連する前記抗原に結合する、方法。
(項目５)
前記挿入された抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記セーフハーバー遺伝子座の内因性プロモーターに作動可能に連結されている、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目６)
前記改変されたセーフハーバー遺伝子座が、内因性分泌シグナルおよび前記抗原結合タンパク質を含むキメラタンパク質をコードする、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目７)
前記セーフハーバー遺伝子座がアルブミン遺伝子座である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目８)
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記アルブミン遺伝子座の第１イントロンに挿入される、項目７に記載の方法。
(項目９)
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記動物の１つ以上の肝細胞のセーフハーバー遺伝子座に挿入される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０)
前記ヌクレアーゼ剤がジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１)
前記ヌクレアーゼ剤が前記Ｃａｓタンパク質および前記ｇＲＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質であり、前記ｇＲＮＡが、
（ａ）前記標的部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）（前記標的部位はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列とすぐ隣接する）と、
（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、を含む、項目１０に記載の方法。
(項目１２)
前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、項目１１に記載の方法。
(項目１３)
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、非相同末端結合を介して挿入される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４)
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が相同組換え修復を介して挿入される、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５)
前記外因性ドナー核酸がホモロジーアームを含まない、項目１～１３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６)
前記外因性ドナー核酸が一本鎖である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７)
前記外因性ドナー核酸が二本鎖である、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８)
前記外因性ドナー核酸中の前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、各々の側で前記ヌクレアーゼ剤の前記標的部位に隣接し、前記ヌクレアーゼ剤が、前記抗原結合タンパク質をコードする配列に隣接する前記標的部位を切断する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９)
前記セーフハーバー遺伝子座の前記標的部位が、前記抗原結合タンパク質をコードする配列が前記セーフハーバー遺伝子座に正しい方向で挿入された場合、もはや存在しないが、前記抗原結合タンパク質をコードする配列が前記セーフハーバー遺伝子座に反対方向に挿入された場合、再形成される、項目１８に記載の方法。
(項目２０)
前記外因性ドナー核酸がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達で送達され、前記抗原結合タンパク質をコードする配列に隣接する前記標的部位の切断が前記ＡＡＶの末端逆位配列を除去する、項目１８または１９に記載の方法。
(項目２１)
前記抗原結合タンパク質が、抗体、抗体の抗原結合断片、多重特異性抗体、ｓｃＦＶ、ｂｉｓ－ｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｖ－ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ） _２ 、二重可変ドメイン抗原結合タンパク質、単一可変ドメイン抗原結合タンパク質、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）、またはデイビスボディ（Ｄａｖｉｓｂｏｄｙ）である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２)
前記抗原結合タンパク質が一本鎖抗原結合タンパク質ではない、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３)
前記抗原結合タンパク質が重鎖と別個の軽鎖とを含み、任意選択で、前記重鎖コード配列がＶ _Ｈ 、Ｄ _Ｈ 、およびＪ _Ｈ セグメントを含み、前記軽鎖コード配列がＶ _Ｌ およびＪ _Ｌ 遺伝子セグメントを含む、項目２２に記載の方法。
(項目２４)
前記重鎖コード配列が、前記抗原結合タンパク質をコードする配列の前記軽鎖コード配列の上流にある、項目２３に記載の方法。
(項目２５)
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記軽鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含む、項目２４に記載の方法。
(項目２６)
前記軽鎖コード配列が、前記抗原結合タンパク質をコードする配列の前記重鎖コード配列の上流にある、項目２３に記載の方法。
(項目２７)
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記重鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含む、項目２６に記載の方法。
(項目２８)
前記外因性分泌シグナル配列がＲＯＲ１分泌シグナル配列である、項目２５または２７に記載の方法。
(項目２９)
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、２Ａペプチドまたは配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって連結された重鎖および軽鎖をコードする、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目３０)
前記重鎖および前記軽鎖が前記２Ａペプチドによって連結されている、項目２９に記載の方法。
(項目３１)
前記２ＡペプチドがＴ２Ａペプチドである、項目３０に記載の方法。
(項目３２)
前記疾患関連抗原ががん関連抗原である、項目２～３１のいずれか一項に記載の方法。
(項目３３)
前記疾患関連抗原が感染症関連抗原である、項目２～３１のいずれか一項に記載の方法。
(項目３４)
前記疾患関連抗原がウイルス抗原である、項目３３に記載の方法。
(項目３５)
前記ウイルス抗原がインフルエンザ抗原またはジカ抗原である、項目３４に記載の方法。
(項目３６)
前記ウイルス抗原がインフルエンザ血球凝集素抗原である、項目３５に記載の方法。
(項目３７)
前記抗原結合タンパク質が、３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖および３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖を含み、
（Ｉ）前記軽鎖が、配列番号１８に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記重鎖が、配列番号２０に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
任意選択で、前記３つの軽鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号７６～７８に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記３つの重鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号７９～８１に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるか、あるいは、
（ＩＩ）前記改変されたセーフハーバー遺伝子座が、配列番号１２０に記載の配列と少なくとも９０％同一のコード配列を含むか、あるいは、
（ＩＩＩ）前記軽鎖が、配列番号１２６に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記重鎖が、配列番号１２８に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
任意選択で、前記３つの軽鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号１２９～１３１に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記３つの重鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号１３２～１３４に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるか、あるいは、
（ＩＶ）前記改変されたセーフハーバー遺伝子座が、配列番号１４６に記載の配列と少なくとも９０％同一のコード配列を含む、項目３６に記載の動物。
(項目３８)
前記ウイルス抗原がジカエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原である、項目３５に記載の方法。
(項目３９)
前記抗原結合タンパク質が、３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖および３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖を含み、
（Ｉ）前記軽鎖が、配列番号３に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記重鎖が、配列番号５に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
任意選択で、前記３つの軽鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号６４～６６に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記３つの重鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号６７～６９に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるか、あるいは、
（ＩＩ）前記改変されたセーフハーバー遺伝子座が、配列番号１１５に記載の配列と少なくとも９０％同一のコード配列を含む、項目３８に記載の動物。
(項目４０)
前記抗原結合タンパク質が、３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖および３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖を含み、
（Ｉ）前記軽鎖が、配列番号１３に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記重鎖が、配列番号１５に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
任意選択で、前記３つの軽鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号７０～７２に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記３つの重鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号７３～７５に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるか、あるいは、
（ＩＩ）前記改変されたセーフハーバー遺伝子座が、配列番号１１６～１１９のうちのいずれか１つに記載の配列と少なくとも９０％同一のコード配列を含む、項目３８に記載の動物。
(項目４１)
前記疾患関連抗原が細菌抗原であり、任意選択で、前記細菌抗原がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰｃｒＶ抗原である、項目３３に記載の方法。
(項目４２)
前記抗原結合タンパク質が中和抗原結合タンパク質または中和抗体である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目４３)
前記抗原結合タンパク質が、広域中和抗原結合タンパク質または広域中和抗体である、項目４２に記載の方法。
(項目４４)
前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が別個の送達ビヒクルに導入される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目４５)
前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が同じ送達ビヒクルに一緒に導入される、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
(項目４６)
前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が同時に導入される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目４７)
前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が逐次的に導入される、項目１～４４のいずれか一項に記載の方法。
(項目４８)
前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が単回投与で導入される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目４９)
前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および／または前記外因性ドナー核酸が複数回投与で導入される、項目１～４７のいずれか一項に記載の方法。
(項目５０)
前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が静脈内注射を介して送達される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目５１)
前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が、脂質ナノ粒子媒介送達を介して、またはアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達を介して導入され、任意選択で、前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が両方とも、ＡＡＶ媒介送達によって導入され、任意選択で、前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸が、２つの異なるＡＡＶベクターによって導入される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目５２)
前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸が、脂質ナノ粒子媒介送達を介して導入される、項目５１に記載の方法。
(項目５３)
前記脂質ナノ粒子が、５０：３８．５：１０：１．５のモル比でＤｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ－ＤＭＧを含む、項目５２に記載の方法。
(項目５４)
前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、項目５２または５３に記載の方法。
(項目５５)
前記Ｃａｓ９が前記脂質ナノ粒子中にあり、ｍＲＮＡの形態にあり、前記脂質ナノ粒子中の前記ｇＲＮＡがＲＮＡの形態にある、項目５４に記載の方法。
(項目５６)
前記外因性ドナー核酸が、ＡＡＶ媒介送達を介して導入される、項目５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
(項目５７)
前記ＡＡＶが一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）である、項目５６に記載の方法。
(項目５８)
前記ＡＡＶが自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、項目５６に記載の方法。
(項目５９)
前記ＡＡＶがＡＡＶ８またはＡＡＶ２／８である、項目５６～５８のいずれか一項に記載の方法。
(項目６０)
前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、前記方法が、脂質ナノ粒子媒介送達を介して前記ｇＲＮＡおよび前記Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡを導入することを含み、前記外因性ドナー核酸がＡＡＶ８媒介送達またはＡＡＶ２／８媒介送達を介して導入される、項目１～５１のいずれか一項に記載の方法。
(項目６１)
前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、前記方法が、第１のＡＡＶ８におけるＡＡＶ８媒介送達または第１のＡＡＶ２／８におけるＡＡＶ２／８媒介送達を介して前記Ｃａｓ９をコードするＤＮＡを導入することと、第２のＡＡＶ８におけるＡＡＶ８媒介送達または第２のＡＡＶ２／８におけるＡＡＶ２／８媒介送達を介して前記外因性ドナー核酸および前記ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを導入することと、を含む、項目１～５１のいずれか一項に記載の方法。
(項目６２)
前記動物における前記抗原結合タンパク質の発現が、前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸を導入した後、約２週間、約４週間、約８週間、約１２週間、または約１６週間で、少なくとも約２．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約６００μｇ／ｍＬ、少なくとも約７００μｇ／ｍＬ、少なくとも約８００μｇ／ｍＬ、少なくとも約９００μｇ／ｍＬ、または少なくとも約１０００μｇ／ｍの血漿レベルをもたらす、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目６３)
前記動物が非ヒト動物である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目６４)
前記動物が非ヒト哺乳動物である、項目６３に記載の方法。
(項目６５)
前記非ヒト哺乳動物がラットまたはマウスである、項目６４に記載の方法。
(項目６６)
前記動物がヒトである、項目１～６２のいずれか一項に記載の方法。
(項目６７)
前記ヌクレアーゼ剤が、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連９（Ｃａｓ９）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり、
前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー配列が、脂質ナノ粒子媒介送達、アデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）媒介送達、またはＡＡＶ２／８媒介送達を介して送達され、
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記動物の１つ以上の肝細胞において非相同末端結合を介して内因性アルブミン遺伝子座の前記第１イントロンに挿入され、
前記挿入された抗原結合タンパク質をコードする配列が、内因性アルブミンプロモーターに作動可能に連結され、
改変されたアルブミン遺伝子座が、内因性アルブミン分泌シグナルおよび前記抗原結合タンパク質を含むキメラタンパク質をコードし、
前記抗原結合タンパク質が、ウイルス抗原または細菌抗原を標的とし、
前記抗原結合タンパク質が広域中和抗体であり、
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、２Ａペプチドによって連結された重鎖と別個の軽鎖とをコードする、項目１～６６のいずれか一項に記載の動物。
(項目６８)
前記重鎖コード配列が、前記抗原結合タンパク質をコードする配列の前記軽鎖コード配列の上流にあり、前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記軽鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含み、前記外因性分泌シグナル配列がＲＯＲ１分泌シグナル配列である、項目６７に記載の方法。
(項目６９)
先行項目のいずれか一項に記載の方法によって生産された動物、または先行項目のいずれか一項に記載の方法によって生産された細胞。
(項目７０)
セーフハーバー遺伝子座に組み込まれた外因性抗原結合タンパク質をコードする配列を含む、動物。
(項目７１)
前記挿入された抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記セーフハーバー遺伝子座の内因性プロモーターに作動可能に連結されている、項目６９または７０に記載の動物。
(項目７２)
前記改変されたセーフハーバー遺伝子座が、内因性分泌シグナルおよび前記抗原結合タンパク質を含むキメラタンパク質をコードする、項目６９～７１のいずれか一項に記載の動物。
(項目７３)
前記セーフハーバー遺伝子座がアルブミン遺伝子座である、項目６９～７２のいずれか一項に記載の動物。
(項目７４)
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記アルブミン遺伝子座の前記第１イントロンに挿入される、項目７３に記載の動物。
(項目７５)
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記動物の１つ以上の肝細胞の前記セーフハーバー遺伝子座に挿入される、項目６９～７４のいずれか一項に記載の動物。
(項目７６)
前記抗原結合タンパク質が、抗体、抗体の抗原結合断片、多重特異性抗体、ｓｃＦＶ、ｂｉｓ－ｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｖ－ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ） _２ 、二重可変ドメイン抗原結合タンパク質、単一可変ドメイン抗原結合タンパク質、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、またはデイビスボディである、項目６９～７５のいずれか一項に記載の動物。
(項目７７)
前記抗原結合タンパク質が一本鎖抗原結合タンパク質ではない、項目６９～７６のいずれか一項に記載の動物。
(項目７８)
前記抗原結合タンパク質が重鎖と別個の軽鎖とを含み、任意選択で、前記重鎖コード配列がＶ _Ｈ 、Ｄ _Ｈ 、およびＪ _Ｈ セグメントを含み、前記軽鎖コード配列がＶ _Ｌ およびＪ _Ｌ 遺伝子セグメントを含む、項目７７に記載の動物。
(項目７９)
前記重鎖コード配列が、前記抗原結合タンパク質をコードする配列の前記軽鎖コード配列の上流にある、項目７８に記載の動物。
(項目８０)
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記軽鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含む、項目７９に記載の動物。
(項目８１)
前記軽鎖コード配列が、前記抗原結合タンパク質をコードする配列の前記重鎖コード配列の上流にある、項目７８に記載の動物。
(項目８２)
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記重鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含む、項目８１に記載の動物。
(項目８３)
前記外因性分泌シグナル配列がＲＯＲ１分泌シグナル配列である、項目８０または８２に記載の動物。
(項目８４)
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、２Ａペプチドまたは配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって連結された重鎖および軽鎖をコードする、項目６９～８３のいずれか一項に記載の動物。
(項目８５)
前記重鎖および前記軽鎖が前記２Ａペプチドによって連結されている、項目８４に記載の動物。
(項目８６)
前記２ＡペプチドがＴ２Ａペプチドである、項目８５に記載の動物。
(項目８７)
前記抗原結合タンパク質が疾患関連抗原を標的とする、項目６９～８６のいずれか１項に記載の動物。
(項目８８)
前記動物における抗原結合タンパク質の発現が、前記動物における前記疾患に対して予防的または治療的効果を有する、項目８７に記載の動物。
(項目８９)
前記疾患関連抗原ががん関連抗原である、項目８７または８８に記載の動物。
(項目９０)
前記疾患関連抗原が感染症関連抗原である、項目８７または８８に記載の動物。
(項目９１)
前記疾患関連抗原がウイルス抗原である、項目９０に記載の動物。
(項目９２)
前記ウイルス抗原がインフルエンザ抗原またはジカ抗原である、項目９１に記載の動物。
(項目９３)
前記ウイルス抗原がインフルエンザ血球凝集素抗原である、項目９２に記載の動物。
(項目９４)
前記抗原結合タンパク質が、３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖および３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖を含み、
（Ｉ）前記軽鎖が、配列番号１８に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記重鎖が、配列番号２０に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
任意選択で、前記３つの軽鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号７６～７８に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記３つの重鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号７９～８１に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるか、あるいは、
（ＩＩ）前記改変されたセーフハーバー遺伝子座が、配列番号１２０に記載の配列と少なくとも９０％同一のコード配列を含むか、あるいは、
（ＩＩＩ）前記軽鎖が、配列番号１２６に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記重鎖が、配列番号１２８に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
任意選択で、前記３つの軽鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号１２９～１３１に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記３つの重鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号１３２～１３４に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるか、あるいは、
（ＩＶ）前記改変されたセーフハーバー遺伝子座が、配列番号１４６に記載の配列と少なくとも９０％同一のコード配列を含む、項目９３に記載の動物。
(項目９５)
前記ウイルス抗原がジカエンベロープ（Ｅｎｖ）抗原である、項目９２に記載の動物。
(項目９６)
前記抗原結合タンパク質が、３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖および３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖を含み、
（Ｉ）前記軽鎖が、配列番号３に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記重鎖が、配列番号５に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
任意選択で、前記３つの軽鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号６４～６６に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記３つの重鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号６７～６９に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるか、あるいは、
（ＩＩ）前記改変されたセーフハーバー遺伝子座が、配列番号１１５に記載の配列と少なくとも９０％同一のコード配列を含む、項目９５に記載の動物。
(項目９７)
前記抗原結合タンパク質が、３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖および３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖を含み、
（Ｉ）前記軽鎖が、配列番号１３に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記重鎖が、配列番号１５に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
任意選択で、前記３つの軽鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号７０～７２に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記３つの重鎖ＣＤＲが、それぞれ配列番号７３～７５に記載の配列と少なくとも９０％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるか、あるいは、
（ＩＩ）前記改変されたセーフハーバー遺伝子座が、配列番号１１６～１１９のうちのいずれか１つに記載の配列と少なくとも９０％同一のコード配列を含む、項目９５に記載の動物。
(項目９８)
前記疾患関連抗原が細菌抗原であり、任意選択で、前記細菌抗原がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰｃｒＶ抗原である、項目９０に記載の動物。
(項目９９)
前記抗原結合タンパク質が中和抗原結合タンパク質または中和抗体である、項目６９～９８のいずれか一項に記載の動物。
(項目１００)
前記抗原結合タンパク質が、広域中和抗原結合タンパク質または広域中和抗体である、項目９９に記載の動物。
(項目１０１)
前記動物における前記抗原結合タンパク質の発現が、前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記１つ以上の核酸および前記外因性ドナー核酸を導入した後、約２週間、約４週間、または約８週間で、少なくとも約２．５、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、または少なくとも約５００μｇ／ｍＬの血漿レベルをもたらす、項目６９～１００のいずれか一項に記載の動物。
(項目１０２)
前記動物が非ヒト動物である、項目６９～１０１のいずれか一項に記載の動物。
(項目１０３)
前記動物が非ヒト哺乳動物である、項目１０２に記載の動物。
(項目１０４)
前記非ヒト哺乳動物がラットまたはマウスである、項目１０３に記載の動物。
(項目１０５)
前記動物がヒトである、項目６９～１０１のいずれか一項に記載の動物。
(項目１０６)
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記動物の１つ以上の肝細胞の内因性アルブミン遺伝子座の前記第１イントロンに挿入され、
前記挿入された抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記内因性アルブミンプロモーターに作動可能に連結され、
前記改変されたアルブミン遺伝子座が、内因性アルブミン分泌シグナルおよび前記抗原結合タンパク質を含むキメラタンパク質をコードし、
前記抗原結合タンパク質が、ウイルス抗原または細菌抗原を標的とし、
前記抗原結合タンパク質が広域中和抗体であり、
前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、２Ａペプチドによって連結された重鎖と別個の軽鎖とをコードする、項目６９～１０５のいずれか一項に記載の動物。
(項目１０７)
前記重鎖コード配列が、前記抗原結合タンパク質をコードする配列の前記軽鎖コード配列の上流にあり、前記抗原結合タンパク質をコードする配列が、前記軽鎖コード配列の上流に外因性分泌シグナル配列を含み、前記外因性分泌シグナル配列がＲＯＲ１分泌シグナル配列である、項目１０６に記載の動物。
(項目１０８)
セーフハーバー遺伝子座に組み込まれた外因性抗原結合タンパク質をコードする配列を含む、細胞。
(項目１０９)
セーフハーバー遺伝子座に組み込まれた外因性抗原結合タンパク質をコードする配列を含む、ゲノム。
(項目１１０)
セーフハーバー遺伝子座に挿入するための抗原結合タンパク質をコードする配列を含む、外因性ドナー核酸。
(項目１１１)
セーフハーバー遺伝子に組み込まれた外因性抗原結合タンパク質をコードする配列を含む、セーフハーバー遺伝子。
(項目１１２)
対象内のセーフハーバー遺伝子座に抗原結合タンパク質をコードする配列を挿入することでの使用のための、ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸であって、前記ヌクレアーゼ剤が前記セーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的として切断し、前記外因性ドナー核酸が前記セーフハーバー遺伝子座に挿入される、ヌクレアーゼ剤または１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸。
(項目１１３)
対象における疾患の治療または予防での使用のための、ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸および抗原結合タンパク質をコードする配列を含む外因性ドナー核酸であって、前記ヌクレアーゼ剤が前記対象のセーフハーバー遺伝子座の標的部位を標的として切断し、前記外因性ドナー核酸が前記セーフハーバー遺伝子座に挿入され、前記抗原結合タンパク質が前記対象で発現し、前記疾患に関連する抗原を標的とする、ヌクレアーゼ剤または１つ以上の核酸および外因性ドナー核酸。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32A】

【図32B】

【配列表】

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