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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-22
(45)【発行日】2024-07-30
(54)【発明の名称】タンパク質翻訳の制御システム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20240723BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240723BHJP
C07K 14/08 20060101ALI20240723BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240723BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20240723BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240723BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20240723BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20240723BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/11 Z ZNA
C07K14/08
C12N15/12
C12N15/55
C12N15/63 Z
C12Q1/04
C12Q1/68
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2020015891
(22)【出願日】2020-01-31
(65)【公開番号】P2021122189
(43)【公開日】2021-08-30
【審査請求日】2023-01-30
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成３１年２月１日 第２０回武田科学振興財団生命科学シンポジウム ＲＮＡネオバイオロジー 武田薬品研修所にて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成３１年２月１日 第２０回武田科学振興財団生命科学シンポジウム ＲＮＡネオバイオロジー プログラム・アブストラクト集 第１３５頁にて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成３１年４月２７日 第１９回遺伝子・デリバリー研究会シンポジウム プログラム・アブストラクト集 第４２頁にて発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和１年５月８日 第１９回遺伝子・デリバリー研究会シンポジウム 千葉大学 西千葉キャンパス けやき会館にて発表
(73)【特許権者】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(74)【代理人】
【識別番号】100099623
【弁理士】
【氏名又は名称】奥山 尚一
(74)【代理人】
【氏名又は名称】松島 鉄男
(74)【代理人】
【識別番号】100125380
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 綾子
(74)【代理人】
【識別番号】100142996
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 聡二
(74)【代理人】
【識別番号】100166268
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 祐
(74)【代理人】
【識別番号】100180231
【弁理士】
【氏名又は名称】水島 亜希子
(74)【代理人】
【氏名又は名称】有原 幸一
(72)【発明者】
【氏名】齊藤 博英
(72)【発明者】
【氏名】中西 秀之
【審査官】大西 隆史
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１５－２２１０２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５２１６４２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２３５６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２１５５４（ＪＰ，Ａ）
【文献】WROBLEWSKA, Liliana et al.，Nature Biotechnology，2015年08月03日，Vol. 33，pp. 839-841，DOI: 10.1038/nbt3301
【文献】MATSUURA Satoshi et al.，Nature Communications，2018年11月19日，Vol. 9, Article No. 4847，pp. 1-8，DOI: 10.1038/s41467-018-07181-2
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）ＶＰｇタンパク質とＲＮＡ結合タンパク質とが結合した複合体、又は該複合体をコードするＲＮＡ、及び（２）7-メチルグアノシン5'-リン酸構造を有さず、かつ、5'UTRに存在する、該ＲＮＡ結合タンパクに対する１以上の結合モチーフと、タンパク質をコードする配列とを含むＲＮＡ
を含む、タンパク質翻訳の制御システム。
【請求項2】
前記（２）のＲＮＡが、ＲＮＡ結合タンパク質に対する２以上の結合モチーフを有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
（３）5’末端に7-メチルグアノシン5'-リン酸構造を有さず、かつ、5'UTRに存在する、前記ＲＮＡ結合タンパク質に対する結合モチーフと、タンパク質をコードする配列とを含むＲＮＡをさらに含む、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項4】
前記ＲＮＡ結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである、請求項１～３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項5】
前記（２）の各ＭＳ２ＣＰ結合モチーフが、下記の式（Ｉ）：
Ｎ１～Ｎ１５は、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵを表し；
ＲはＧ又はＡを表し；
ＹはＵ又はＣを表し；
Ｎ１とＮ１５とは、Ｎ２とＮ１４とは、Ｎ３とＮ１３とは、Ｎ４とＮ１２とは、Ｎ５とＮ１１とは、Ｎ６とＮ１０とは、及びＮ７とＮ９とは、それぞれ塩基対又はゆらぎ塩基対を形成する。）
で表される潜在的二次構造を有する、請求項４に記載のシステム。
【請求項6】
前記（３）のＲＮＡにコードされるタンパク質が、アポトーシス誘導タンパク質であり、前記（２）のＲＮＡにコードされるタンパク質が、抗アポトーシス性タンパク質である、請求項３～５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項7】
前記（３）のＲＮＡにコードされるタンパク質が、Ｃａｓヌクレアーゼであり、前記（２）のＲＮＡにコードされるタンパク質が、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、請求項３～５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項8】
前記（１）のＲＮＡがｍｉＲＮＡの標的配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項9】
（１）ＶＰｇタンパク質と、第１の二量体化ドメインとが結合した複合体又は該複合体をコードするＲＮＡ、（２）ＲＮＡ結合タンパク質と、第２の二量体化ドメインとが結合した複合体又はそれをコードするＲＮＡ、
（３）第１の二量体化ドメイン及び第２の二量体化ドメインに結合する架橋因子、及び
（４）5'UTRに存在する、該ＲＮＡ結合タンパクに対する１以上の結合モチーフと、タンパク質をコードする配列とを含むＲＮＡ
を含む、タンパク質翻訳の制御システム。
【請求項10】
（１）ＶＰｇタンパク質と、インテインと、標的分子に結合する分子とが結合した複合体又はそれをコードするＲＮＡ、（２）ＲＮＡ結合タンパク質と、インテインと、該標的分子に結合する分子とが結合した複合体又はそれをコードするＲＮＡ、及び
（３）5'UTRに存在する、該ＲＮＡ結合タンパクに対する１以上の結合モチーフと、タンパク質をコードする配列とを含むＲＮＡ、
を含む、タンパク質翻訳の制御システムであって、（１）のインテインと、（２）のインテインとが、標的分子を介して細胞内で会合してプロテインスプライシングを引き起こす、システム。
【請求項11】
前記（１）の複合体を構成する標的分子に結合する分子、及び前記（２）の複合体を構成する標的分子に結合する分子の少なくとも一方が抗体又はその一部である、請求項１０に記載のシステム。
【請求項12】
前記ＲＮＡ結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである、請求項９～１１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項13】
請求項３～５のいずれか１項に記載のシステムを細胞に導入する工程を含む、タンパク質の翻訳の制御方法であって、前記（３）のＲＮＡにコードされたタンパク質の翻訳の活性化と、前記（２）のＲＮＡにコードされたタンパク質の翻訳の抑制を同時に行う、方法。
【請求項14】
請求項６に記載のシステムを細胞に導入する工程を含む、細胞の選別方法。
【請求項15】
請求項７に記載のシステムを細胞に導入する工程を含む、該細胞の有する二本鎖ＤＮＡを改変する方法（ヒトの治療方法を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質翻訳の制御システムに関し、より詳細には、翻訳活性化因子とＲＮＡ結合タンパク質とが結合した複合体と、該複合体に対する結合モチーフを含むＲＮＡとを含むタンパク質翻訳の制御システムに関する。
【背景技術】
【0002】
内因性及び外因性の遺伝子発現の高度な調節を可能とする合成生物学的ツールの提供は、生物学的研究の分野及び医療分野の両方における重要な課題の１つである。遺伝子発現を調節する方法の大部分において、該方法は、遺伝子発現を調節する因子をコードするDNAの形態で細胞に送達されることで行われるが、DNAを用いる場合、ゲノムへの挿入変異誘発のリスクがあり、治療用途で深刻な問題を引き起こす可能性がある。そのため、より安全な方法として、ゲノムへの挿入率が低い、合成メッセンジャーRNA（mRNA）を用いた方法が有望な方法として着目されている。
【0003】
このように、合成mRNAは、生物学及び医学において有用であるが、mRNAをベースにした遺伝子発現の制御方法は、DNAを用いたものと比較してもはるかに少ないのが現状である。特に、DNAを用いた方法では、標的遺伝子の転写活性化方法の報告は多くなされているものの、RNAを用いる場合には、遺伝子発現の直接的な活性化は困難である。現在のRNAを用いた方法では、遺伝子発現の活性化は、複数のＲＮＡ結合タンパク質（RBP）を組み合わせることによる、翻訳抑制因子の抑制といった間接的な方法によって達成されているが、このような間接的な方法は、多くの因子が必要な複雑な方法となっている（例えば、非特許文献１～３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Wroblewska, L. et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nat. Biotechnol. 33, 839-41 (2015).
【文献】Matsuura, S. et al. Synthetic RNA-based logic computation in mammalian cells. Nat. Commun. 9, 4847 (2018).
【文献】Wagner, T. E. et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nat. Chem. Biol. 14, 1043-1050 (2018).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者らは以前、カリシウイルス由来の翻訳活性化タンパク質であるＶＰｇ（ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｏｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ）タンパク質を用いることで人工メッセンジャーＲＮＡの翻訳を人為的に活性化するシステムを開発した。このシステムは、ＲＮＡ結合タンパク質であるＭＳ２ＣＰ（ＭＳ２ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）と、翻訳活性化タンパク質を融合させたもの、及び正常な5’-Cap構造を有さず通常時の翻訳が低く抑えられている人工メッセンジャーＲＮＡにより構成される。かかるシステムは、人工メッセンジャーＲＮＡの5’非翻訳領域にはＭＳ２ＣＰの結合モチーフが含まれており、これを介した翻訳活性化タンパク質の人工メッセンジャーＲＮＡへの結合により翻訳が誘導される。しかしながら、上記のカリシウイルス由来の翻訳活性化タンパク質（ＶＰｇタンパク質）及びＭＳ２ＣＰ（ＭＳ２ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）の融合タンパク質と、人工メッセンジャーＲＮＡにより構成されるシステムでは、翻訳の活性化は可能であるが、そのままでは翻訳の抑制に適用はできない。そのため、翻訳の抑制のためには、別のタンパク質を用いる必要があり、翻訳制御システムが複雑になってしまう。また、翻訳の活性化のみでは、細胞種特異的な細胞の選別や、ゲノム編集を安全に行うことはできないため、翻訳の活性化と抑制を同時に行うことが重要である。従って、本発明は、従来のシステムより簡素化した翻訳制御システム、特に翻訳の活性化と抑制を同時に達成することが可能なシステムを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、上記翻訳活性化システムについてさらに研究を続けたところ、ＶＰｇタンパク質及びＭＳ２ＣＰの融合タンパク質と、ＭＳ２ＣＰにより認識されるＲＮＡモチーフとの結合力が弱いほど、翻訳活性化が高くなる（換言すれば、ＭＳ２ＣＰとＲＮＡモチーフとの結合力が高いほど、翻訳活性化が低くなる）ことを見出した。さらに翻訳活性化の低下の程度について検証するため、ＭＳ２ＣＰとの結合を高めた、二股構造のＲＮＡ結合モチーフを有する人工ｍＲＮＡを作製し、実際に検証を行った。その結果、翻訳の活性化が低下するのではなく、翻訳の抑制効果が認められたが、ＶＰｇタンパク質が翻訳活性を有することからも、前記翻訳の抑制効果は全く予測できず、驚くべきものであった。さらに、ＭＳＣＰ２以外のＲＮＡ結合タンパク質を用いた場合であっても、目的のタンパク質の翻訳の活性化及び／又は抑制が認められた。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。
【0007】
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
[１]
（１）翻訳活性化因子とＲＮＡ結合タンパク質とが結合した複合体、又は該複合体をコードするＲＮＡ、及び
（２）7-メチルグアノシン5'-リン酸構造を有さず、かつ該ＲＮＡ結合タンパクに対する１以上の結合モチーフと、タンパク質をコードする配列とを含むＲＮＡ
を含む、タンパク質翻訳の制御システム。
[２]
前記（２）のＲＮＡが、ＲＮＡ結合タンパク質に対する２以上の結合モチーフを有する、[１]に記載のシステム。
[３]
（３）5’末端に7-メチルグアノシン5'-リン酸構造を有さず、かつ前記ＲＮＡ結合タンパク質に対する結合モチーフと、タンパク質をコードする配列とを含むＲＮＡをさらに含む、[１]又は[２]に記載のシステム。
[４]
前記翻訳活性化因子がＶＰｇタンパク質である、[１]～[３]のいずれかに記載のシステム。
[５]
前記ＲＮＡ結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである、[１]～[４]のいずれかに記載のシステム。
[６]
前記（２）の各ＭＳ２ＣＰ結合モチーフが、下記の式（Ｉ）：
[１]
（１）翻訳活性化因子とＲＮＡ結合タンパク質とが結合した複合体、又は該複合体をコードするＲＮＡ、及び
（２）7-メチルグアノシン5'-リン酸構造を有さず、かつ該ＲＮＡ結合タンパクに対する１以上の結合モチーフと、タンパク質をコードする配列とを含むＲＮＡ
を含む、タンパク質翻訳の制御システム。
[２]
前記（２）のＲＮＡが、ＲＮＡ結合タンパク質に対する２以上の結合モチーフを有する、[１]に記載のシステム。
[３]
（３）5’末端に7-メチルグアノシン5'-リン酸構造を有さず、かつ前記ＲＮＡ結合タンパク質に対する結合モチーフと、タンパク質をコードする配列とを含むＲＮＡをさらに含む、[１]又は[２]に記載のシステム。
[４]
前記翻訳活性化因子がＶＰｇタンパク質である、[１]～[３]のいずれかに記載のシステム。
[５]
前記ＲＮＡ結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである、[１]～[４]のいずれかに記載のシステム。
[６]
前記（２）の各ＭＳ２ＣＰ結合モチーフが、下記の式（Ｉ）：
【0008】
【化1】
【0009】
（式中、
Ｎ１～Ｎ１５は、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵを表し；
ＲはＧ又はＡを表し；
ＹはＵ又はＣを表し；
Ｎ１とＮ１５とは、Ｎ２とＮ１４とは、Ｎ３とＮ１３とは、Ｎ４とＮ１２とは、Ｎ５とＮ１１とは、Ｎ６とＮ１０とは、及びＮ７とＮ９とは、それぞれ塩基対又はゆらぎ塩基対を形成する。）
で表される潜在的二次構造を有する、[５]に記載のシステム。
[７]
前記（３）のＲＮＡにコードされるタンパク質が、アポトーシス誘導タンパク質であり、前記（２）のＲＮＡにコードされるタンパク質が、抗アポトーシス性タンパク質である、[３]～[６]のいずれかに記載のシステム。
[８]
前記（３）のＲＮＡにコードされるタンパク質が、Ｃａｓヌクレアーゼであり、前記（２）のＲＮＡにコードされるタンパク質が、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、[３]～[６]のいずれかに記載のシステム。
[９]
前記（１）のＲＮＡがｍｉＲＮＡの標的配列を含む、[１]～[８]のいずれかに記載のシステム。
[１０]
タンパク質翻訳の制御がタンパク質翻訳の抑制である、[１]又は[２]に記載のシステム。
[１１]
（１）翻訳活性化因子と、第１の多量体化ドメインとが結合した複合体又は該複合体をコードするＲＮＡ、
（２）ＲＮＡ結合タンパク質と、第２の多量体化ドメインとが結合した複合体又はそれをコードするＲＮＡ、
（３）第１の多量体化ドメイン及び第２の多量体化ドメインに結合する架橋因子、及び
（４）該ＲＮＡ結合タンパクに対する１以上の結合モチーフと、タンパク質をコードする配列とを含むＲＮＡ、
を含む、タンパク質翻訳の制御システム。
[１２]
（１）翻訳活性化因子と、インテインと、標的分子に結合する分子とが結合した複合体又はそれをコードするＲＮＡ、
（２）ＲＮＡ結合タンパク質と、インテインと、該標的分子に結合する分子とが結合した複合体又はそれをコードするＲＮＡ、及び
（３）該ＲＮＡ結合タンパクに対する１以上の結合モチーフと、タンパク質をコードする配列とを含むＲＮＡ、
を含む、タンパク質翻訳の制御システムであって、（１）のインテインと、（２）のインテインとが、標的分子を介して細胞内で会合してプロテインスプライシングを引き起こす、システム。
[１３]
前記（１）の複合体を構成する標的分子に結合する分子、及び前記（２）の複合体を構成する標的分子に結合する分子の少なくとも一方が抗体又はその一部である、[１２]に記載のシステム。
[１４]
前記翻訳活性化因子がＶＰｇタンパク質である、[１１]～[１３]のいずれかに記載のシステム
[１５]
前記ＲＮＡ結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである、[１１]～[１４]のいずれかに記載のシステム。
[１６]
[３]～[６]のいずれかに記載のシステムを細胞に導入する工程を含む、タンパク質の翻訳の制御方法であって、前記（３）のＲＮＡにコードされたタンパク質の翻訳の活性化と、前記（２）のＲＮＡにコードされたタンパク質の翻訳の抑制を同時に行う、方法。
[１７]
[７]に記載のシステムを細胞に導入する工程を含む、細胞の選別方法。
[１８]
[８]に記載のシステムを細胞に導入する工程を含む、該細胞の有する二本鎖ＤＮＡを改変する方法。
[１９]
翻訳活性化因子とＲＮＡ結合タンパク質とが結合した複合体と、該タンパク質に対するＲＮＡ結合モチーフとの結合力を評価する工程を含む、ＲＮＡ結合モチーフを有するＲＮＡの該複合体によるタンパク質翻訳の制御の程度を予測する方法。
[２０]
前記翻訳活性化因子がＶＰｇタンパク質である、[１９]に記載のシステム。
[２１]
前記ＲＮＡ結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである、[１９]又は[２０]に記載の方法。
[２２]
タンパク質翻訳の制御がタンパク質翻訳の抑制である、[１９]～[２１]のいずれかに記載の方法。
[２３]
（１）[１９]～[２２]のいずれかに記載の方法により、ＲＮＡ結合モチーフを有する２以上のＲＮＡの翻訳の制御の程度を予測する工程、
（２）該翻訳の程度が予測されたＲＮＡの中から所望のＲＮＡを選択する工程、及び
（３）工程（２）で選択されたＲＮＡと、翻訳活性化因子とＲＮＡ結合タンパク質とが結合した複合体とを、細胞に導入する工程
を含む、タンパク質の翻訳を制御する方法。
Ｎ１～Ｎ１５は、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵを表し；
ＲはＧ又はＡを表し；
ＹはＵ又はＣを表し；
Ｎ１とＮ１５とは、Ｎ２とＮ１４とは、Ｎ３とＮ１３とは、Ｎ４とＮ１２とは、Ｎ５とＮ１１とは、Ｎ６とＮ１０とは、及びＮ７とＮ９とは、それぞれ塩基対又はゆらぎ塩基対を形成する。）
で表される潜在的二次構造を有する、[５]に記載のシステム。
[７]
前記（３）のＲＮＡにコードされるタンパク質が、アポトーシス誘導タンパク質であり、前記（２）のＲＮＡにコードされるタンパク質が、抗アポトーシス性タンパク質である、[３]～[６]のいずれかに記載のシステム。
[８]
前記（３）のＲＮＡにコードされるタンパク質が、Ｃａｓヌクレアーゼであり、前記（２）のＲＮＡにコードされるタンパク質が、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、[３]～[６]のいずれかに記載のシステム。
[９]
前記（１）のＲＮＡがｍｉＲＮＡの標的配列を含む、[１]～[８]のいずれかに記載のシステム。
[１０]
タンパク質翻訳の制御がタンパク質翻訳の抑制である、[１]又は[２]に記載のシステム。
[１１]
（１）翻訳活性化因子と、第１の多量体化ドメインとが結合した複合体又は該複合体をコードするＲＮＡ、
（２）ＲＮＡ結合タンパク質と、第２の多量体化ドメインとが結合した複合体又はそれをコードするＲＮＡ、
（３）第１の多量体化ドメイン及び第２の多量体化ドメインに結合する架橋因子、及び
（４）該ＲＮＡ結合タンパクに対する１以上の結合モチーフと、タンパク質をコードする配列とを含むＲＮＡ、
を含む、タンパク質翻訳の制御システム。
[１２]
（１）翻訳活性化因子と、インテインと、標的分子に結合する分子とが結合した複合体又はそれをコードするＲＮＡ、
（２）ＲＮＡ結合タンパク質と、インテインと、該標的分子に結合する分子とが結合した複合体又はそれをコードするＲＮＡ、及び
（３）該ＲＮＡ結合タンパクに対する１以上の結合モチーフと、タンパク質をコードする配列とを含むＲＮＡ、
を含む、タンパク質翻訳の制御システムであって、（１）のインテインと、（２）のインテインとが、標的分子を介して細胞内で会合してプロテインスプライシングを引き起こす、システム。
[１３]
前記（１）の複合体を構成する標的分子に結合する分子、及び前記（２）の複合体を構成する標的分子に結合する分子の少なくとも一方が抗体又はその一部である、[１２]に記載のシステム。
[１４]
前記翻訳活性化因子がＶＰｇタンパク質である、[１１]～[１３]のいずれかに記載のシステム
[１５]
前記ＲＮＡ結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである、[１１]～[１４]のいずれかに記載のシステム。
[１６]
[３]～[６]のいずれかに記載のシステムを細胞に導入する工程を含む、タンパク質の翻訳の制御方法であって、前記（３）のＲＮＡにコードされたタンパク質の翻訳の活性化と、前記（２）のＲＮＡにコードされたタンパク質の翻訳の抑制を同時に行う、方法。
[１７]
[７]に記載のシステムを細胞に導入する工程を含む、細胞の選別方法。
[１８]
[８]に記載のシステムを細胞に導入する工程を含む、該細胞の有する二本鎖ＤＮＡを改変する方法。
[１９]
翻訳活性化因子とＲＮＡ結合タンパク質とが結合した複合体と、該タンパク質に対するＲＮＡ結合モチーフとの結合力を評価する工程を含む、ＲＮＡ結合モチーフを有するＲＮＡの該複合体によるタンパク質翻訳の制御の程度を予測する方法。
[２０]
前記翻訳活性化因子がＶＰｇタンパク質である、[１９]に記載のシステム。
[２１]
前記ＲＮＡ結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである、[１９]又は[２０]に記載の方法。
[２２]
タンパク質翻訳の制御がタンパク質翻訳の抑制である、[１９]～[２１]のいずれかに記載の方法。
[２３]
（１）[１９]～[２２]のいずれかに記載の方法により、ＲＮＡ結合モチーフを有する２以上のＲＮＡの翻訳の制御の程度を予測する工程、
（２）該翻訳の程度が予測されたＲＮＡの中から所望のＲＮＡを選択する工程、及び
（３）工程（２）で選択されたＲＮＡと、翻訳活性化因子とＲＮＡ結合タンパク質とが結合した複合体とを、細胞に導入する工程
を含む、タンパク質の翻訳を制御する方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明のタンパク質翻訳システムにより、ゲノムへの挿入のリスクを低減しつつ、人工ｍＲＮＡの翻訳を制御することができる。さらに、別の人工合成ｍＲＮＡをシステムに用いることで、１種類の翻訳制御タンパク質の複合体のみを用いて、目的のタンパク質の翻訳の活性化と抑制を同時に達成することが可能となり、より簡便な、かつより副作用の少ない、細胞へのアポトーシスの誘導やゲノム編集が可能となる。さらに、薬物やタンパク質との接触をスイッチとして、目的のタンパク質の翻訳の活性化及び／又は抑制を誘導することができるため、タンパク質翻訳の制御を、特定のタイミングや期間に限定することもでき、より複雑なタンパク質翻訳の制御が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】CaVTによる翻訳制御のグラフィカルな要約。CaVTは、翻訳活性化因子と抑制因子の両方として機能する。弱い結合モチーフを含むmRNAは、CaVTにより翻訳が活性化されるが、強い結合モチーフを含むmRNAは、CaVTにより翻訳が抑制される。これらの翻訳制御を通じて、CaVTを、レポーター発現、アポトーシス誘導、及びゲノム編集の制御に使用できる。CaVTに対するマイクロRNA又は小分子による応答性の実現により、これらの生物学的現象における、細胞選択的又は条件的調節が可能となる。
【図2】合成mRNAにおける、翻訳活性化因子を構築するためのVPg（FCV）及びノロウイルスVPg（NV-GI）の比較。HeLa細胞に、MS2結合モチーフを有する、又は有さないhmAG1 mRNA（capアナログ：A-cap）、タグRFP mRNA、及び示されたタンパク質(indicated protei)のmRNAを同時トランスフェクトした。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。フローサイトメトリーにより蛍光を測定した。（a）翻訳開始のメカニズムの概略図。標準的な真核細胞のmRNAの場合、eIF4Fは5'キャップ構造（左上）を認識するが、カリシウイルスRNAの場合、VPgタンパク質は5'キャップ構造の代替物として機能する（右上）。カリシウイルスVPgベースの翻訳活性化因子（CaVT）の場合、MS2CPは合成mRNAの5'UTRに存在する、MS2CPの標的モチーフに結合する。eIF4FはVPgを認識し、翻訳を開始する（下）。翻訳的に不活性なcapアナログであるA-capが、標準的なcapの代わりに5’末端と融合しているため、これらの合成mRNAの基底翻訳レベルは低くなる。（b）示された各タンパク質により引き起こされるhmAG1/tagRFP比の倍数変化。hmAG1/tagRFP比の平均を、レポーターmRNAのみのサンプルのhmAG1/tagRFP比により正規化した。棒グラフは、3つの独立した実験の平均を示す（±SD）。（c）hmAG1及びtagRFPの代表的な二次元ドットプロット。（d）（c）に示したドットプロットの重ね合わせ。示されたタンパク質を発現するためにmRNAをトランスフェクトした細胞を灰色で示し、レポーターmRNAのみでトランスフェクトした細胞を濃い灰色で示す。（e）hmAG1とtagRFPの両方を発現する細胞におけるhmAG1/tagRFP比の代表的なヒストグラム。
【図3】合成mRNAの翻訳に対するMS2CP非融合Vpgの効果。HeLa細胞に、標的hmAG1 mRNA及び示された各タンパク質のmRNAを同時トランスフェクトした。蛍光をフローサイトメーターで測定した。（a）示された各タンパク質により生じたhmAG1/tagRFP比の倍数変化。hmAG1及びtagRFPの両方を発現する細胞を使用して、hmAG1/tagRFP比を計算し、3つの独立した実験の平均を示す。エラーバーはSDを表す。（b）hmAG1及びtagRFPの代表的な二次元ドットプロット。（c）（b）に示したドットプロットの重ね合わせ。示されたタンパク質を発現するためにmRNAをトランスフェクトした細胞を灰色で示し、レポーターmRNAのみでトランスフェクトした細胞を濃い灰色で示す。（d）hmAG1とtagRFPの両方を発現する細胞におけるhmAG1/tagRFP比の代表的なヒストグラム。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図4】ARCA-capを付加した合成mRNAの翻訳に対するCaVTの効果。HeLa細胞に1xMS2(C)site1-hmAG1 mRNA（capアナログ：ARCA）、tagRFP mRNA、及びCaVT mRNAを同時トランスフェクトした。蛍光をフローサイトメーターで測定した。（a）hmAG1及びtagRFPの代表的な二次元ドットプロット。（b）（a）に示したドットプロットの重ね合わせ。示されたタンパク質を発現するためにmRNAをトランスフェクトした細胞を灰色で示し、レポーターmRNAのみでトランスフェクトした細胞を濃い灰色で示す。（c）hmAG1とtagRFPの両方を発現する細胞におけるhmAG1/tagRFP比の代表的なヒストグラム。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図5】CaVTによる翻訳活性化に対する、MS2結合モチーフの修飾されたヌクレオシド、部位、及び変異と、MS2CPの変異体の影響。HeLa細胞に、MS2結合モチーフを有するhmAG1 mRNA（capアナログ：A-cap、修飾ヌクレオシド：N1mΨ又はΨ/5mC）、tagRFP mRNA、及びCaVT又はそのV29I変異体を発現するmRNAを同時トランスフェクトした。蛍光をフローサイトメーターで測定した。（a）MS2結合モチーフを有するhmAG1 mRNAの模式図。（b）CaVT（又はそのV29I変異体）を介した、示されたレポーターmRNAをトランスフェクトした細胞におけるhmAG1/tagRFP比の倍数変化。hmAG1とtagRFPの両方を発現する各細胞のhmAG1/tagRFP比の平均を計算し、レポーターmRNAのみのサンプルのhmAG1/tagRFP比で正規化した。棒グラフは、3つの独立した実験の平均を示す（±SD）。（c）hmAG1とtagRFPの両方を発現する細胞におけるhmAG1/tagRFP比の代表的なヒストグラム。レポーターmRNAのみでトランスフェクトした細胞を濃い灰色で示し、CaVT及びそのV29I変異体を発現するmRNAをトランスフェクトした細胞を、それぞれ灰色及び淡い灰色で示す。
【図6-1】標的mRNAバリアントの翻訳に対するCaVTの効果を示す代表的な二次元ドットプロット（標的mRNA：CaVT = 9：1）。HeLa細胞に、各標的hmAG1 mRNAバリアント及びCaVT（又はそのV29I変異体）mRNAを同時トランスフェクトした。蛍光をフローサイトメーターで測定した。（a）の重ね合わせを（b）に示す。hmAG1（+）/tagRFP（+）集団のヒストグラムを図2cに示す。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図6-2】標的mRNAバリアントの翻訳に対するCaVTの効果を示す代表的な二次元ドットプロット（標的mRNA：CaVT = 9：1）。HeLa細胞に、各標的hmAG1 mRNAバリアント及びCaVT（又はそのV29I変異体）mRNAを同時トランスフェクトした。蛍光をフローサイトメーターで測定した。（a）の重ね合わせを（b）に示す。hmAG1（+）/tagRFP（+）集団のヒストグラムを図2cに示す。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図7】標的mRNAバリアントの翻訳に対するCaVTの効果（標的mRNA：CaVT = 4：1）。HeLa細胞に、MS2結合モチーフを含むhmAG1 mRNA（capアナログ：A-cap、修飾ヌクレオシド：N1mΨ又はΨ/5mC、320 ng）、tagRFP mRNA（capアナログ：ARCA、修飾ヌクレオシド：N1mΨ、100 ng）、及びCaVT又はそのV29I変異体を発現するmRNA（capアナログ：ARCA、修飾ヌクレオシド：N1mΨ、80 ng）を同時トランスフェクトした。トランスフェクションの1日後、hmAG1及びtagRFPの蛍光をフローサイトメーターで測定した。（a）CaVT（又はそのV29I変異体）を介した、示されたレポーターmRNAをトランスフェクトした細胞におけるhmAG1/tagRFP比の倍数変化。hmAG1とtagRFPの両方を発現する細胞を使用して、hmAG1/tagRFP比を計算し、3つの独立した実験の平均を示す。エラーバーはSDを表す。（b）hmAG1とtagRFPの両方を発現する細胞におけるhmAG1/tagRFP比の代表的なヒストグラム。レポーターmRNAのみをトランスフェクトした細胞を濃い灰色で示し、CaVT及びそのV29I変異体を発現するmRNAをトランスフェクトした細胞を、それぞれ灰色及び淡い灰色で示す。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図8-1】標的mRNAバリアントの翻訳に対するCaVTの効果を示す代表的な二次元ドットプロット（標的mRNA：CaVT = 4：1）。HeLa細胞に、各標的hmAG1 mRNAバリアント及びCaVT（又はそのV29I変異体）mRNAを同時トランスフェクトした。蛍光をフローサイトメーターで測定した。（a）の重ね合わせを（b）に示す。hmAG1（+）/tagRFP（+）集団のヒストグラムを図7bに示す。
【図8-2】標的mRNAバリアントの翻訳に対するCaVTの効果を示す代表的な二次元ドットプロット（標的mRNA：CaVT = 4：1）。HeLa細胞に、各標的hmAG1 mRNAバリアント及びCaVT（又はそのV29I変異体）mRNAを同時トランスフェクトした。蛍光をフローサイトメーターで測定した。（a）の重ね合わせを（b）に示す。hmAG1（+）/tagRFP（+）集団のヒストグラムを図7bに示す。
【図9】強い結合モチーフを含むmRNAのCaVTを介した翻訳抑制。（a）2xScMS2(C)-hmAG1 mRNAの5'UTRにおけるMS2結合モチーフの予測RNA二次構造。ParasoR (Kawaguchi, R. & Kiryu, H. Parallel computation of genome-scale RNA secondary structure to detect structural constraints on human genome. BMC Bioinformatics 17, 203 (2016))を使用して構造を予測し、VARNA(Darty, K., Denise, A. & Ponty, Y. VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure. Bioinformatics 25, 1974-5 (2009))を使用して視覚化した。（b）CaVT（又はそのV29I変異体）を介した、示されたレポーターmRNAをトランスフェクトした細胞におけるhmAG1/tagRFP比の倍数変化。hmAG1とtagRFPの両方を発現する各細胞のhmAG1/tagRFP比の平均を計算し、レポーターmRNAのみのサンプルのhmAG1/tagRFP比で正規化した。棒グラフは、3つの独立した実験の平均を示す（±SD）。（c）hmAG1とtagRFPの両方を発現する細胞におけるhmAG1/tagRFP比の代表的なヒストグラム。レポーターmRNAのみをトランスフェクトした細胞を濃い灰色で示し、CaVT及びそのV29I変異体を発現するmRNAをトランスフェクトした細胞を、それぞれ灰色及び淡い灰色で示す。（d、e）2xScMS2(C)-hmAG1 mRNAをトランスフェクトした細胞の代表的な重ね合わせのドットプロット（A-capを付加、360 ng/well（d）又はARCA-capを付加、20 ng/well（e））。CaVT又はそのV29I変異体を発現するmRNAで同時トランスフェクトした細胞を灰色で示し、レポーターmRNAのみでトランスフェクトした細胞を濃い灰色で示す。
【図10】2xScMS2(C)-hmAG1 mRNAの翻訳に対するCaVTの効果を示す代表的な二次元ドットプロット（A-capを付加したターゲットmRNA：CaVT = 9：1、ARCA-capを付加したターゲットmRNA：CaVT = 1：2）。HeLa細胞に、A-cap（上）又はARCA-cap（下）を付加した2xScMS2(C)-hmAG1 mRNA、tagRFP mRNA、及びCaVT又はそのV29I変異体を発現するmRNAを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの1日後、hmAG1及びtagRFPの蛍光をフローサイトメーターで測定した。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図11】2xScMS2(C)-hmAG1 mRNAの翻訳に対するCaVTの効果（A-capを付加したターゲットmRNA：CaVT = 4：1）。HeLa細胞に、A-capを付加した2xScMS2(C)-hmAG1 mRNA、tagRFP mRNA、及びCaVT又はそのV29I変異体を発現するmRNAを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの1日後、hmAG1及びtagRFPの蛍光をフローサイトメーターで測定した。（a）示された各タンパク質により生じたhmAG1/tagRFP比の倍数変化。hmAG1/tagRFP比の平均を、レポーターmRNAのみのサンプルのhmAG1/tagRFP比により正規化した。棒グラフは、3つの独立した実験の平均を示す（±SD）。（b）hmAG1及びtagRFPの代表的な二次元ドットプロット。（c）hmAG1とtagRFPの両方を発現する細胞におけるhmAG1/tagRFP比の代表的なヒストグラム。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。（d）（b）に示したドットプロットの重ね合わせ。示されたタンパク質を発現するためにmRNAでトランスフェクトした細胞を灰色で示し、レポーターmRNAのみでトランスフェクトした細胞を濃い灰色で示す。
【図12】CaVTを介した翻訳の活性化と抑制によるアポトーシスの調節。（a）アポトーシス調節回路の模式図。アポトーシスは、Baxの翻訳活性化のみ（左）又はBaxの翻訳活性化とBcl-xLの翻訳抑制の両方（右）により誘導される。（b）アポトーシス調節回路をトランスフェクトした細胞の生存率。HeLa細胞に、1xMS2(U)site2-Bax（capアナログ：A-cap）、2xScMS2(C)-BclxL（capアナログ：ARCA）、及びCaVT又はMS2CP mRNAを同時トランスフェクトした。全てのmRNAにはN1mΨが含まれていた。細胞生存率を、WST-1アッセイにより分析した。棒グラフは平均値±標準偏差を示す（n = 4）。*** P<0.001；Dunnettの多重比較検定（両側）とANOVAによるBax mRNAなし/CaVT又はMS2CPなしのサンプルとの比較。（c、d）アネキシンV（アポトーシスマーカー）及びSYTOXレッド（死細胞マーカー）染色。HeLa細胞に、1xMS2(U)site2-Bax mRNA（capアナログ：A-cap）、2xScMS2(C)-BclxL mRNA（capアナログ：ARCA）、及びCaVT mRNAを同時トランスフェクトした。陽性対照として、1xMS2(U)site2-Bax mRNA（capアナログ：ARCA）をトランスフェクトした。全てのmRNAにはN1mΨが含まれていた。トランスフェクションの1日後、細胞を染色し、フローサイトメーターで分析した。棒グラフは、4つの独立した実験の平均を示す（±SD）（c）。代表的な二次元ドットプロット（d）。 ** P <0.01、*** P <0.001；Dunnettの多重比較検定（両側）とANOVAによる陰性対照との比較。
【図13】CaVTを介した翻訳の活性化と抑制によるゲノム編集の制御。（a）遺伝子ノックアウトを調節するRNA回路の概略図。EGFPノックアウトは、Cas9の翻訳活性化のみ（上）、又はCas9の翻訳活性化及びAcrIIA4の翻訳抑制の両方（下）により誘導される。（b、c）EGFPノックアウトを調節するためにRNA回路をトランスフェクトしたEGFP陰性細胞の割合。HeLa-EGFP細胞に、1xMS2(U)site2-SpCas9 mRNA（capアナログ：A-cap）、2xScMS2(C)-AcrIIA4 mRNA（capアナログ：ARCA）、CaVT mRNA、及びEGFPターゲティングsgRNAを同時トランスフェクトした。陽性対照及び陰性対照について、EGFPターゲティングsgRNAの有無にかかわらず、それぞれ1xMS2(U)site2-SpCas9 mRNA（capアナログ：ARCA）をトランスフェクトした。全てのmRNAにはN1mΨが含まれていた。トランスフェクションの5日後、EGFP蛍光をフローサイトメーターで分析した。棒グラフは、3つの独立した実験の平均を示す（±SD）（b）。代表的なヒストグラム（c）。*** P<0.001；Dunnettの多重比較検定（両側）とANOVAによる未処理サンプルとの比較。
【図14】miRNA応答性CaVT mRNAを使用した、miRNAを介した翻訳の活性化と抑制の同時制御。（a、b）miRNAにより調節されるアポトーシス誘導回路。HeLa細胞に、1xMS2(U)site2-Bax mRNA（capアナログ：A-cap）、2xScMS2(C)-BclxL mRNA（capアナログ：ARCA）、示されたCaVT mRNA、及び示されたmiRNAミミック(mimic)又は阻害剤を同時トランスフェクトした。陽性対照として、1xMS2(U)site2-Bax mRNA（capアナログ：ARCA）をトランスフェクトした。全てのmRNAにはN1mΨが含まれていた。トランスフェクションの1日後、細胞をアネキシンV及びSYTOX Redで染色し、その後フローサイトメトリーを行った。RNA回路の概略図（a）。棒グラフは、4つの独立した実験の平均を示す（±SD）（b）。* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001；Dunnettの多重比較検定（両側）とANOVAによる陰性対照との比較。（c、d）miRNA応答性ゲノム編集回路によるEGFPノックアウトの細胞選択的制御。示されたEGFP発現安定細胞株に、1xMS2(U)site2-SpCas9 mRNA（capアナログ：A-cap）、2xScMS2(C)-AcrIIA4 mRNA（capアナログ：ARCA）、示されたCaVT mRNA、及びEGFPターゲティングsgRNAを同時トランスフェクトした。陽性対照及び陰性対照については、EGFPターゲティングsgRNAの有無にかかわらず、それぞれ1xMS2(U)site2-SpCas9（capアナログ：ARCA）をトランスフェクトした。全てのmRNAにはN1mΨが含まれてた。トランスフェクションの5日後、EGFP蛍光をフローサイトメーターで分析した。RNA回路の概略図（c）。棒グラフは、3つの独立した実験の平均を示す（±SD）（d）。*** P<0.001；Dunnettの多重比較検定（両側）とANOVAによる未処理サンプルとの比較。
【図15】miRNA応答性のアポトーシス誘導遺伝子回路をトランスフェクトしたHeLa細胞の生存率。HeLa細胞に、1xMS2(U)site2-Bax mRNA（capアナログ：A-cap、修飾ヌクレオシド：N1mΨ）、2xScMS2(C)-BclxL mRNA（capアナログ：ARCA、修飾ヌクレオシド：N1mΨ）、示されたCaVT mRNA、及び示されたmiRNAミミック又は阻害剤を同時トランスフェクトした。トランスフェクションの1日後、細胞生存率をWST-1アッセイで測定した。エラーバーはSD（n = 4）を表す。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図16】miRNA応答性のアポトーシス誘導遺伝子回路をトランスフェクトしたHeLa細胞の代表的なドットプロット。HeLa細胞に、1xMS2(U)site2-Bax mRNA（capアナログ：A-cap、修飾ヌクレオシド：N1mΨ）、2xScMS2(C)-BclxL mRNA（capアナログ：ARCA、修飾ヌクレオシド：N1mΨ）、示されたCaVT mRNA、及び示されたmiRNAミミック又は阻害剤。トランスフェクションの1日後、細胞をアネキシンV及びSYTOX Redで染色し、その後フローサイトメーターで蛍光を測定した。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図17】miRNA応答性CaVTにより制御されるCRISPR/Cas9システムによるEGFPノックアウトの代表的なヒストグラム。HeLa細胞（a）及びiPS細胞（201B7株）（b）に1xMS2(U)site2-Cas9 mRNA（capアナログ：A-cap、修飾ヌクレオシド：N1mΨ）、2xScMS2(C)-AcrIIA4 mRNA（capアナログ：ARCA、修飾ヌクレオシド：N1mΨ）、EGFPターゲティングsgRNA、及び示されたCaVT mRNAを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの5日後、蛍光をフローサイトメーターで測定した。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図18】CaVTとヘテロ二量体化（hetero-dimerization）システムとを組み合わせた薬物媒介翻訳活性化。HeLa細胞に、MS2結合モチーフ（capアナログ：A-cap、修飾ヌクレオシド：N1mΨ又はΨ/5mC）を含むhmAG1 mRNA、並びにtagRFP、DmrC-VPg（FCV）、及びMS2CP-1xDmrA又はMS2CP(V29I)-1xDmrAを発現するmRNAを同時トランスフェクトした。次に、A/C heterodimerizerを添加した。（a）MS2CP-1xDmrA及びDmrC-VPg（FCV）で構成される薬物制御可能なCaVT(drug-regulatable CaVT)の概略図。MS2CP-1xDmrAは、標的mRNAのMS2結合モチーフに結合する。A/C heterodimerizerが存在しない場合、DmrC-VPgはDmrAに結合せず、VPgを介した翻訳活性化は生じない。A/C heterodimerizerの添加後、DmrA-DmrC相互作用により、VPgが標的mRNAに繋ぎ留められ、VPgは翻訳を活性化する。（b、c）翻訳に対する、MS2結合モチーフの修飾されたヌクレオシド、部位、及び変異と、MS2CPの変異体の影響。蛍光をフローサイトメトリーにより測定し、hmAG1/tagRFP比の平均を、レポーターmRNAのみの比率（b）又は0 nM A/Cheterodimerizerサンプルの比率（c）により正規化した。棒グラフは、3つの独立した実験の平均を示す（±SD）。（d、e）薬物制御可能なCaVTの用量依存性。1xMS2(U)site1-hmAG1（capアナログ：A-cap、修飾ヌクレオシド：N1mΨ）及びMS2CP-1xDmrA mRNAをトランスフェクションに使用した。hmAG1/tagRFP比の平均を、0 nM A/C heterodimerizerサンプルの比率により正規化した。棒グラフは、3つの独立した実験の平均を示す（±SD）（d）。代表的なヒストグラム（e）。（f）薬物誘導性の翻訳活性化のタイムラプス画像。1xMS2(U)site1-hmAG1（capアナログ：A-cap、修飾ヌクレオシド：N1mΨ）及びMS2CP-1xDmrA mRNAをトランスフェクションに使用した。各画像を、A/C heterodimerizerの添加後、示された時点でキャプチャした。スケールバーは200μmを表す。
【図19】標的mRNAバリアントの翻訳に対する薬物制御可能なCaVTの効果を示す代表的なヒストグラム。HeLa細胞に、各標的hmAG1 mRNAバリアント、DmrC-VPg（FCV）mRNA、及びMS2CP-1xDmrA（又はMS2CP（V29I）-1xDmrA）mRNAを同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を0又は500 nM A/C heterodimerizerを含む培地で培養し、蛍光をフローサイトメーターで測定した。ヒストグラムは、hmAG1（+）/tagRFP（+）の集団を示す。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図20-1】標的mRNAバリアントの翻訳に対する薬物制御可能なCaVTの効果を示す代表的な二次元ドットプロット。HeLa細胞に、各標的hmAG1 mRNAバリアント、DmrC-VPg（FCV）mRNA、及びMS2CP-1xDmrA（又はMS2CP（V29I）-1xDmrA）mRNAを同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を0又は500 nM A/C heterodimerizerを含む培地で培養し、蛍光をフローサイトメーターで測定した。（a）DmrC-VPg（FCV）及びMS2CP-1xDmrA（又はMS2CP（V29I）-1xDmrA）を含まない細胞の蛍光。（b）500 nM A/C heterodimerizerを含む培地で培養した細胞の蛍光。（c）A/C heterodimerizerを含まない培地で培養した細胞の蛍光。（d）（b）（灰色として表示）と、（c）（濃い灰色として表示）の重ね合わせ。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図20-2】標的mRNAバリアントの翻訳に対する薬物制御可能なCaVTの効果を示す代表的な二次元ドットプロット。HeLa細胞に、各標的hmAG1 mRNAバリアント、DmrC-VPg（FCV）mRNA、及びMS2CP-1xDmrA（又はMS2CP（V29I）-1xDmrA）mRNAを同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を0又は500 nM A/C heterodimerizerを含む培地で培養し、蛍光をフローサイトメーターで測定した。（a）DmrC-VPg（FCV）及びMS2CP-1xDmrA（又はMS2CP（V29I）-1xDmrA）を含まない細胞の蛍光。（b）500 nM A/C heterodimerizerを含む培地で培養した細胞の蛍光。（c）A/C heterodimerizerを含まない培地で培養した細胞の蛍光。（d）（b）（灰色として表示）と、（c）（濃い灰色として表示）の重ね合わせ。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図20-3】標的mRNAバリアントの翻訳に対する薬物制御可能なCaVTの効果を示す代表的な二次元ドットプロット。HeLa細胞に、各標的hmAG1 mRNAバリアント、DmrC-VPg（FCV）mRNA、及びMS2CP-1xDmrA（又はMS2CP（V29I）-1xDmrA）mRNAを同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を0又は500 nM A/C heterodimerizerを含む培地で培養し、蛍光をフローサイトメーターで測定した。（a）DmrC-VPg（FCV）及びMS2CP-1xDmrA（又はMS2CP（V29I）-1xDmrA）を含まない細胞の蛍光。（b）500 nM A/C heterodimerizerを含む培地で培養した細胞の蛍光。（c）A/C heterodimerizerを含まない培地で培養した細胞の蛍光。（d）（b）（灰色として表示）と、（c）（濃い灰色として表示）の重ね合わせ。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図20-4】標的mRNAバリアントの翻訳に対する薬物制御可能なCaVTの効果を示す代表的な二次元ドットプロット。HeLa細胞に、各標的hmAG1 mRNAバリアント、DmrC-VPg（FCV）mRNA、及びMS2CP-1xDmrA（又はMS2CP（V29I）-1xDmrA）mRNAを同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を0又は500 nM A/C heterodimerizerを含む培地で培養し、蛍光をフローサイトメーターで測定した。（a）DmrC-VPg（FCV）及びMS2CP-1xDmrA（又はMS2CP（V29I）-1xDmrA）を含まない細胞の蛍光。（b）500 nM A/C heterodimerizerを含む培地で培養した細胞の蛍光。（c）A/C heterodimerizerを含まない培地で培養した細胞の蛍光。（d）（b）（灰色として表示）と、（c）（濃い灰色として表示）の重ね合わせ。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図21】A/C heterodimerizerに介される翻訳活性化の、MS2CP-1xDmrA及びDmrC-VPg（FCV）依存性を示す代表的な二次元ドットプロット。HeLa細胞に、tagRFP mRNA（100 ng）、1xMS2(U)site1-hmAG1 mRNA（320 ng）、及び示されたmRNA（MS2CP-1xDmrAについて20 ng、DmrC-VPg（FCV）について60 ng）を同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を0又は500 nM A/C heterodimerizerを含む培地で培養し、蛍光をフローサイトメーターで測定した。500又は0 nMのA/C heterodimerizerを含む培地で培養した細胞の蛍光を、それぞれ上部と中央の行に示す。それらの重ね合わせを、一番下の行に示す。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図22】薬物制御可能なCaVTの用量依存性を示す代表的な二次元ドットプロット。HeLa細胞に、1xMS2(C)-hmAG1、DmrC-VPg（FCV）、及びMS2CP-1xDmrA mRNAを同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、示された濃度のA/C heterodimerizerを含む培地で細胞を培養し、フローサイトメーターで蛍光を測定した。hmAG1（+）/tagRFP（+）集団のヒストグラムを図18eに示す。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【図24】図２４は、図23で概説された翻訳制御システムの実施例を示す。トリガーとなる標的タンパク質（eDHFR）の存在下において、制御対象mRNAからのhmAG1タンパク質発現が上昇したことが認められた。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、翻訳活性化因子と、ＲＮＡ結合タンパク質とが結合した翻訳制御タンパク質複合体（以下、「本発明の翻訳制御複合体」と称することがある。）又は該複合体をコードするＲＮＡと、5’末端に7-メチルグアノシン5'-リン酸構造を有さず、かつ該ＲＮＡ結合タンパクに対する（即ち、該タンパク質に認識されて結合する）１以上の結合モチーフを有する人工ｍＲＮＡを含む、タンパク質翻訳の制御システム（以下、「本発明の翻訳制御システム」と称することがある。）を提供する。
【0013】
本発明に用いる人工ｍＲＮＡは、それにコードされるタンパク質の翻訳を抑制する目的で用いてもよいし（該目的で用いるｍＲＮＡを、「本発明のオフスイッチ」と称することがある。）、翻訳を活性化する目的で用いてもよく（該目的で用いるｍＲＮＡを、「本発明のオンスイッチ」と称することがある。）、あるいはタンパク質の翻訳の活性化及び抑制を同時に達成する目的で、本発明のオフスイッチ及び本発明のオンスイッチの両方を用いてもよい。なお、本明細書において、本発明のオフスイッチと、本発明のオンスイッチとを包含するものとして、「本発明のＲＮＡスイッチ」との用語を用いることがある。
【0014】
本発明で用いる翻訳活性化因子としては、翻訳開始因子をリクルートして翻訳を活性化できるものであれば特に限定されない。本発明の一態様において、上記翻訳制御タンパク質複合体は、翻訳活性化因子として、ＶＰｇ（ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｏｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ）タンパク質を含む。以下では、翻訳活性化因子としてＶＰｇを例に挙げて説明するが、ＶＰｇ以外の翻訳化因子を用いる場合には、「ＶＰｇ」を他の翻訳化因子に読み替えるものとする。本発明の翻訳制御システムは、上記の構成により、タンパク質の翻訳を活性化又は抑制することができる。本明細書において「複合体」には、複数の分子で構成されるものだけでなく、融合タンパク質のように、構成タンパク質（例：ＶＰｇタンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、インテイン等）を単一の分子内に有するものも包含される。
【0015】
本明細書において、「人工メッセンジャーＲＮＡ」又は「人工ｍＲＮＡ」は、本発明の翻訳制御複合体により、該ＲＮＡにコードされたタンパク質の翻訳が制御されるＲＮＡを意味し、以下では、単に「ＲＮＡ」ということがある。
【0016】
本発明のオフスイッチ（又は本発明のオンスイッチ）を含む本発明の翻訳制御システムに、さらに、本発明のオンスイッチ（又は本発明のオフスイッチ）を含めることで、１種類の翻訳制御タンパク質の複合体により、一方のＲＮＡスイッチにコードされる目的のタンパク質の翻訳の活性化と、もう一方のＲＮＡスイッチにコードされる目的のタンパク質の翻訳の抑制を同時に達成することが可能となる。
【0017】
本明細書において、「タンパク質翻訳の制御」とは、本発明のオンスイッチ又はオフスイッチにコードされたタンパク質の翻訳量を、本発明の翻訳制御複合体を用いない対照と比較して、増加させること（即ち、タンパク質翻訳を活性化すること）、又は減少させること（即ち、タンパク質翻訳を抑制すること）を意味する。
【0018】
本発明で用いるＶＰｇタンパク質としては、タンパク質の翻訳活性化機能を有するものであれば特に制限されないが、例えば、ベシウイルス属、ラゴウイルス属、又はポティウイルス属に属するウイルス由来のＶＰｇタンパク質、該ＶＰｇタンパク質の改変体や翻訳活性化機能を有するその断片が挙げられる。かかるベシウイルス属に属するウイルスとしては、ネコカリシウイルス(NCBI Accession No:NP_783307.1)、イヌベシウイルス (NCBI Accession No:NP_786908.1)、豚水疱疹ウイルス(NCBI Accession No:NP_786894.1)、ラゴウイルス属に属するウイルスとしては、ウサギ出血病ウイルスのVPg (NCBI Accession No:NP_740330.1)、ポティウイルス属に属するウイルスとしては、Lupinus mosaic virus、Bean yellow mosaic virus、Papaya leaf distortion mosaic virusなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ベシウイルス属に属するウイルス、特にネコカリシウイルスである。本発明の一態様において、ＶＰｇタンパク質としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列（該配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号２で示す。）、配列番号３で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、2個、3個、4個、5個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号３で示されるアミノ酸配列と85％以上（例：90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を用いることができる。本明細書において、「ＶＰｇタンパク質」には、ＶＰｇタンパク質、ＶＰｇタンパク質改変体やそれらの断片も包含されるものとする。
【0019】
下述の実施例で示される通り、ＲＮＡ結合タンパク質として、複数種類（即ち、ＭＳＣＰ２、Ｌ７Ａｅ、ＬＩＮ２８Ａ）を用いて、目的のタンパク質の翻訳の活性化及び／又は抑制が実証されたため、特定のＲＮＡモチーフと結合できるタンパク質であれば、特に制限なく本発明に用いることができる。具体的には、本発明で用いるＲＮＡタンパク質としては、例えば、ＭＳ２ＣＰ、Ｌ７Ａｅ、ＬＩＮ２８Ａ、ＰＰ７ＣＰ、ｄＣａｓ１３、これらの改変体（例えば、ＭＳ２ＣＰの場合、V29I変異体、L77P変異体、W82R変異体、C101R変異体、dlFG変異体等）、RNA結合能を有するそれらの断片などが挙げられる。好ましくは、ＭＳ２ＣＰ又はその改変体である。本発明の一態様において、ＲＮＡタンパク質としては、配列番号５、７及び９のいずれかで示されるアミノ酸配列（各配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号４、６及び８で示す。）、配列番号５、７及び９のいずれかで示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号５、７及び９のいずれかで示されるアミノ酸配列と85％以上（例：90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を用いることができる。本明細書において、「ＲＮＡ結合タンパク質」には、野生型のＲＮＡ結合タンパク質、その改変体やそれらの断片も包含されるものとする。
【0020】
上記ＲＮＡ結合タンパク質は、上記ＶＰｇタンパク質との融合タンパク質として提供することもできるし、あるいは、ＳＨ３ドメイン、ＰＤＺドメイン、ＧＫドメイン、ＧＢドメイン等のタンパク質結合ドメインとそれらの結合パートナーとを、ＲＮＡ結合タンパク質と、ＶＰｇタンパク質とにそれぞれ融合させ、該ドメインとその結合パートナーとの相互作用を介してタンパク質複合体として提供してもよい。あるいは、以下で詳細に説明する通り、ＲＮＡ結合タンパク質と、ＶＰｇタンパク質とにそれぞれインテイン（intein）を融合させ、各タンパク質合成後のライゲーションにより、両者を連結することもできる。本明細書に記載のその他の複合体についても、同様である。
【0021】
本発明の好適な態様において、ＲＮＡ結合タンパク質とＶＰｇタンパク質との融合タンパク質としては、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（該配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号１０で示す。）、配列番号１１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、2個、3個、4個、5個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列と85％以上（例：90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を用いることができる。
【0022】
アミノ酸配列の同一性は、以下の条件下（expectancy =10; gap allowed; matrix=BLOSUM62; filtering=OFF）で、相同性計算アルゴリズムのNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて計算することができる。
【0023】
下述の実施例で示す通り、ＭＳ２ＣＰとＲＮＡモチーフとの結合力が高いほど、翻訳活性が低くなること、さらにはＭＳ２ＣＰ結合モチーフを２つ有し、かつ特定の足場構造を有することにより、強固にＭＳＣＰと結合するモチーフを用いた場合には、翻訳活性が抑制されることが観察された。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、かかる観察から、ＭＳ２ＣＰには、ＲＮＡモチーフと結合することで翻訳を抑制する機能も有しており、翻訳レベルは、ＶＰｇタンパク質を介した活性化と、ＭＳ２ＣＰを介した抑制のバランスによって決定され、ＲＮＡとＭＳ２ＣＰとの結合が強くなるに従い、ＭＳ２ＣＰを介した抑制作用が増強されるためであると推察される。そして、２つ以上のＭＳ２ＣＰが、例えば２つのＭＳＣＰ結合モチーフが足場構造を介して連結した構造などを有する本発明のオフスイッチに結合することで、本発明の翻訳制御複合体が常時ＲＮＡに結合している状態になり、このためにＶＰｇタンパク質によりリクルートされたリボソームがＲＮＡ上を進むのが阻害される結果、本発明のオフスイッチにコードされたタンパク質翻訳が抑制されると推察される。実際に、ＭＳＣＰとＶＰｇタンパク質とで構成される複合体ではなく、Ｌ７ＡｅとＶＰｇタンパク質とで構成される複合体を用いた場合にも、Ｌ７Ａｅと強固に結合するモチーフを有するＲＮＡを用いることで、翻訳の抑制効果が認められた。従って、本発明のオフスイッチは、結合モチーフを２つ以上含め、かつ少なくとも２つが足場構造を介して連結することや、結合モチーフの配列を変更すること、あるいはヌクレオチド残基に特定の修飾を施すことなどにより、ＲＮＡ結合タンパク質との結合性を一定以上にすることにより、特定の構造に限定されることなくタンパク質の翻訳抑制作用が生じると考えられる。
【0024】
本発明のオフスイッチは、典型的には、ＲＮＡ結合タンパク質に対する結合モチーフがＲＮＡの足場構造により安定化される。本発明の一態様において、本発明のオフスイッチは、２以上のＲＮＡ結合タンパク質に対する結合モチーフを有し、該結合モチーフの少なくとも２つが、ＲＮＡの足場構造を介して連結される。本明細書において、「ＲＮＡの足場（scaffold）構造」とは、１以上の結合モチーフに連結し、それにより該モチーフが安定する構造を意味し、かかる構造としては、特に限定されないが、例えば、塩基対形成により１以上のステム領域を有する構造が挙げられる。所望の安定性によりステム領域の塩基対を設計することができる（通常、ステム領域を形成する塩基対の数に応じて安定性が向上すると考えられる）。また、結合モチーフが２以上連結する場合には、少なくとも一方に足場構造を有していればよいが、安定性の観点からは、全ての結合モチーフに連結していることが好ましい。また、２以上のモチーフは、ステム領域を含み、あるいはステム領域を含まずに他の構造（例えば、ループ構造等）を介して連結されていてもよい。本明細書において、結合モチーフが安定するとは、足場構造がない場合と比較して、ＲＮＡの構造のゆらぎが減少して、ＲＮＡが下述の潜在的二次構造を有する確率が高くなること意味する。
【0025】
本発明のオフスイッチに含まれる、ＲＮＡ結合タンパク質に対する結合モチーフとしては、該タンパク質と結合するものであれば特に制限されない。上記結合モチーフを介したＲＮＡ結合タンパク質とＲＮＡとの結合により、該ＲＮＡにコードされたタンパク質の翻訳が抑制される。ＲＮＡ結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである場合を例に挙げれば、例えば、既知の文献（例：Grahn E et al., RNA. 7(11):1616-1627 (2001)）を参酌して適宜設計することができる。具体的には、結合モチーフの少なくとも１つが、下記の式（Ｉ）（ヌクレオチド配列を配列番号１として示す。）：
【0026】
【化2】
【0027】
（式中、
Ｎ１～Ｎ１５は、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵを表し；
ＲはＧ又はＡを表し；
ＹはＵ又はＣを表し；
Ｎ１とＮ１５とは、Ｎ２とＮ１４とは、Ｎ３とＮ１３とは、Ｎ４とＮ１２とは、Ｎ５とＮ１１とは、Ｎ６とＮ１０とは、及びＮ７とＮ９とは、それぞれ塩基対又はゆらぎ塩基対を形成する。）
で表される潜在的二次構造を有するＲＮＡが挙げられる。一態様において、Ｎ１がＡ、Ｎ２がＧ又はＣ（好ましくはＧ）、Ｎ３がＧ、Ｎ４がＵ、Ｎ５がＧ、Ｎ６がＧ、Ｎ７がＧ、Ｎ８がＵ、Ｎ９がＣ、Ｎ１０がＣ、Ｎ１１がＣ、Ｎ１２がＡ、Ｎ１３がＵ、Ｎ１４がＣ又はＧ（好ましくはＣ）、Ｎ１５がＵ、ＲがＡ、ＹがＣである構造が挙げられる。
Ｎ１～Ｎ１５は、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵを表し；
ＲはＧ又はＡを表し；
ＹはＵ又はＣを表し；
Ｎ１とＮ１５とは、Ｎ２とＮ１４とは、Ｎ３とＮ１３とは、Ｎ４とＮ１２とは、Ｎ５とＮ１１とは、Ｎ６とＮ１０とは、及びＮ７とＮ９とは、それぞれ塩基対又はゆらぎ塩基対を形成する。）
で表される潜在的二次構造を有するＲＮＡが挙げられる。一態様において、Ｎ１がＡ、Ｎ２がＧ又はＣ（好ましくはＧ）、Ｎ３がＧ、Ｎ４がＵ、Ｎ５がＧ、Ｎ６がＧ、Ｎ７がＧ、Ｎ８がＵ、Ｎ９がＣ、Ｎ１０がＣ、Ｎ１１がＣ、Ｎ１２がＡ、Ｎ１３がＵ、Ｎ１４がＣ又はＧ（好ましくはＣ）、Ｎ１５がＵ、ＲがＡ、ＹがＣである構造が挙げられる。
【0028】
【化3】
【0029】
（式中、
Ｎ１～Ｎ１５、Ｒ及びＹの定義は上記に記載の通りであり；；
Ｘa及びＸbは、それぞれ独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵであり；
ｎ及びｍは、それぞれ独立して、０以上の整数を表し；
Ｘaは、Ｘbと共に、バルジループを有していてもよいステム構造を構成する。）
で表される潜在的二次構造を有するＲＮＡが挙げられる。式（ＩＩ）におけるｎ及びｍは、それぞれ独立して、典型的には、１０００以下、好ましくは、１００以下（例：５０、２０、１０等）の整数である。
Ｎ１～Ｎ１５、Ｒ及びＹの定義は上記に記載の通りであり；；
Ｘa及びＸbは、それぞれ独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵであり；
ｎ及びｍは、それぞれ独立して、０以上の整数を表し；
Ｘaは、Ｘbと共に、バルジループを有していてもよいステム構造を構成する。）
で表される潜在的二次構造を有するＲＮＡが挙げられる。式（ＩＩ）におけるｎ及びｍは、それぞれ独立して、典型的には、１０００以下、好ましくは、１００以下（例：５０、２０、１０等）の整数である。
【0030】
本明細書において、上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される構造等の潜在的二次構造を「ＲＮＡ結合タンパク質の結合モチーフ」（単に「結合モチーフ」と略すこともある。）と称することがあり、ＲＮＡ結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである場合には、「ＭＳ２ＣＰ結合モチーフ」ともいう。潜在的二次構造とは、生理条件下で安定に存在する二次構造をいい、潜在的二次構造を有するか否かは、実施例に記載された構造予測プログラム（ParasoR）(Kawaguchi, R. & Kiryu, H. Parallel computation of genome-scale RNA secondary structure to detect structural constraints on human genome. BMC Bioinformatics 17, 203 (2016))によって決定できる。
【0031】
上記式（Ｉ）において、nとｍが異なる整数である場合（には、ＸaとＸｂは、バルジループを有することとなる。ｎとｍが同じ整数である場合にも、ＸaとＸｂから形成されるステム構造は、バルジループを有していてもよいが、ＭＳ２ＣＰ結合モチーフの安定性の観点からは、バルジループを有さないステム構造であることが好ましい。
【0032】
好ましい態様において、ＭＳ２ＣＰ結合モチーフを２つ含む本発明のオフスイッチは、上記式（ＩＩ）において、ｎ及びｍが、それぞれ独立して、０～５（例えば、１）である構造を含み、さらに具体的な構造として、上記式（ＩＩ）におけるｎ及びｍが１であり、その場合のＸａ及びＸｂがそれぞれＣ及びＧである構造を含む。あるいは、上記式（ＩＩ）において、ｎ及びｍが、それぞれ独立して、５～１０（例えば、７）である構造を含み、さらに具体的な構造として、上記式（ＩＩ）におけるｎ及びｍが７であり、その場合のＸa及びＸｂがそれぞれＡＣＧＡＧＣＧ及びＣＧＣＵＣＧＵである構造を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0033】
本発明のＲＮＡスイッチにＲＮＡ結合モチーフが２以上含まれる場合、上記構造（ＩＩ）で示される少なくとも２つの構造は、多分岐ループを介して連結されてもよい。前記多分岐ループのヌクレオチド数も特に限定されないが、例えば、４～１０個、又は５～９個（例：７個）である。また、前記多分岐ループには、他の構造、例えば、他の多分岐ループ（該多分岐ループは、さらにヘリックスループ構造等の他の構造を有していてもよい）を有していてもよい、例えば、０～１０個（例えば、２～５個）のステム構造などと連結していてもよい。これらの構造を有するさらに具体的な構造としては、図9aに記載の構造が挙げられるが、この構造に限定されない。本明細書において、ＭＳ２ＣＰ結合モチーフなどの結合モチーフを含み、式（ＩＩ）で示される構造を複数有する構造や図９aのように、複数の二次構造から構成される一体的な構造を、「ＲＮＡ結合タンパク質の結合ドメイン」（単に「結合ドメイン」と略すこともある。）と称することもある。かかる結合ドメインは、典型的には、ヘアピン構造、ヘリックス構造、バルジループ、内部ループ（internal-loop）、多分岐ループ（multi-branched loop）及びシュードノット構造から選択される少なくとも２種類の構造から形成される。
【0034】
本発明のオンスイッチに含まれる結合モチーフとしては、ＲＮＡ結合タンパク質と結合するものであれば特に制限されない。上記結合モチーフを介したＲＮＡ結合タンパク質とＲＮＡとの結合により、該ＲＮＡにコードされたタンパク質の翻訳が活性化される。ＲＮＡ結合タンパク質がＭＳ２ＣＰである場合を例にとれば、結合モチーフとしては、上記式（ＩＩ）で表される構造を有するものが挙げられる。
【0035】
結合モチーフがＭＳ２ＣＰ結合モチーフ以外の場合にも、当業者であれば、対応するＲＮＡ結合タンパク質に合わせて、それに対応するＲＮＡモチーフやＲＮＡドメインを設計することができる。結合モチーフがＬ７Ａｅ結合モチーフとしては、例えば、既知の文献（例：Shi X et al., Nat Chem Biol. 12(3):146-152 (2016)）を参酌して適宜設計することができ、具体的には、下記式（ＩＩＩ）で示される構造を有するものが挙げられる。結合モチーフがＬＩＮ２８Ａ結合モチーフとしては、例えば、既知の文献（例：Kawasaki S et al., Nucleic Acids Res. 45(12):e117 (2017)）を参酌して適宜設計することができ、具体的には、ＧＧＧＡＵ配列を含むステムループ構造を有するものが挙げられる。また、ＲＮＡモチーフのＲＮＡ内における位置や配列、構造、ヌクレオチド残基の修飾等を適宜設計することで、翻訳の活性化又は抑制の程度を調節することも可能である。
【0036】
【化4】
【0037】
（式中、
Ｎ１～Ｎ１１は、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵを表し；
Ｎ２とＮ１０とは、及びＮ３とＮ９とは、それぞれ塩基対又はゆらぎ塩基対を形成する。）
Ｎ１～Ｎ１１は、それぞれ独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＵを表し；
Ｎ２とＮ１０とは、及びＮ３とＮ９とは、それぞれ塩基対又はゆらぎ塩基対を形成する。）
【0038】
本発明のオフスイッチは、翻訳開始因子（例：elF4E等）が結合できるように、典型的には5’末端capアナログ（例：Anti Reverse Cap アナログ（ARCA）等）を付加することが好ましい。一方で、本発明のオンスイッチは、翻訳漏れを防ぐなどの目的で、翻訳を不活化する修飾（例えば、A-cap等）を施すことが好ましい。以下では、上記cap又はcapアナログが付加された5’末端の構造を、cap構造と称することがある。
【0039】
結合モチーフ又は結合ドメインは、本発明のＲＮＡスイッチの翻訳開始コドンよりも上流（即ち、5’UTR）であれば、どの位置に存在してもよい。下述の実施例で示す通り、5’UTRの位置により、本発明のオンスイッチの翻訳活性が変化することが示されたため、目的に応じて適宜位置を調節することができる。5’UTRの具体例として、例えば配列番号１２又は１３で示される配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【0040】
以上より、本発明の一態様において、本発明のＲＮＡスイッチは、５’末端から３’末端にかけて、
（i）任意により、第一のスペーサー、
（ii）前記スペーサーの３’側に、結合モチーフ又は結合ドメイン、及び
（iii）任意により、前記結合モチーフ又は結合ドメインの３’側に、第二のスペーサー、
を含んでなる５’ＵＴＲ調節構造部、
並びに３’側に目的タンパク質の遺伝子をコードする塩基配列
を有する。
（i）任意により、第一のスペーサー、
（ii）前記スペーサーの３’側に、結合モチーフ又は結合ドメイン、及び
（iii）任意により、前記結合モチーフ又は結合ドメインの３’側に、第二のスペーサー、
を含んでなる５’ＵＴＲ調節構造部、
並びに３’側に目的タンパク質の遺伝子をコードする塩基配列
を有する。
【0041】
各スペーサーの長さは、任意の塩基数であってよく、０～８００塩基、０～７００塩基、０～６００塩基、０～５００塩基、０～４５０塩基、０～４００塩基、０～３５０塩基、０～３００塩基、０～２５０塩基、０～２００塩基、０～１５０塩基、０～１００塩基、０～５０塩基、０～４０塩基、０～３０塩基、０～２０塩基または０～１０塩基が例示される。制限酵素サイトなどの塩基配列についてもスペーサーの塩基配列に含まれるものとする。スペーサーの塩基数を調節することで、翻訳活性を調節することができる。
【0042】
結合モチーフの長さも、任意の塩基数であってもよく、通常、約200ヌクレオチド以下であり得るが、例えば約100ヌクレオチド以下であり、好ましくは約50ヌクレオチド以下であり、より好ましくは約40ヌクレオチド以下である。結合ドメインの長さも、任意の塩基数であってもよく、通常、約300ヌクレオチド以下であり得るが、例えば約200ヌクレオチド以下であり、好ましくは約150ヌクレオチド以下である。総ヌクレオチド数が少なければ、大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。結合モチーフ及び結合ドメインの長さの下限は、結合モチーフ配列（例：配列番号１で表わされる配列）を含む限り特に制限はないが、例えば15ヌクレオチド以上、好ましくは20ヌクレオチド以上、より好ましくは25ヌクレオチド以上である。
【0043】
本発明のＲＮＡスイッチは、本発明の翻訳制御複合体に対する結合性又は化学的安定性を高めるため、あるいは細胞への毒性（例：炎症の誘発等）を低減するため、各ヌクレオチドの糖残基（リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の2’位、3’位及び／又は4’位のヒドロキシ基または水素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、アルコキシ化（例、メトキシ化、エトキシ化）、O-アリル化、S-アルキル化（例、S-メチル化、S-エチル化）、S-アリル化、アミノ化（例、-NH2）が挙げられる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145参照)。
また糖残基については、2’位及び4’位で架橋構造を形成したBNA:Bridged nucleic acid(LNA:Linked nucleic acid)とすることもできる。このような糖残基の改変も、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Tetrahedron Lett., 38, 8735-8738 (1997); Tetrahedron, 59, 5123-5128 (2003)、Rahman S.M.A., Seki S., Obika S., Yoshikawa H., Miyashita K., Imanishi T., J. Am. Chem. Soc., 130, 4886-4896 (2008)など参照）。
また糖残基については、2’位及び4’位で架橋構造を形成したBNA:Bridged nucleic acid(LNA:Linked nucleic acid)とすることもできる。このような糖残基の改変も、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Tetrahedron Lett., 38, 8735-8738 (1997); Tetrahedron, 59, 5123-5128 (2003)、Rahman S.M.A., Seki S., Obika S., Yoshikawa H., Miyashita K., Imanishi T., J. Am. Chem. Soc., 130, 4886-4896 (2008)など参照）。
【0044】
本発明のＲＮＡスイッチはまた、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、5位ピリミジン改変、6及び／又は8位プリン改変、環外アミンでの改変、4-チオウリジンでの置換、5-ブロモ又は5-ヨード－ウラシルでの置換が挙げられる。また、細胞毒性を低減させること等を目的として、通常のウリジン、シチジンに替えて、シュードウリジン（Ψ）、N1-メチルシュードウリジン（N1mΨ）、5-メチルシチジン（5mC）等の修飾塩基を含んでいてもよい。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。
【0045】
ヌクレアーゼ及び加水分解に対する耐性等を高めるため、本発明のＲＮＡスイッチに含まれるリン酸基（例えば、末端のリン酸残基）が改変されていてもよい。例えば、リン酸基たるP(O)O基が、P(O)S（チオエート）、P(S)S（ジチオエート）、P(O)NR2（アミデート）、P(O)R、R(O)OR’、CO又はCH2（ホルムアセタール）又は3’-アミン（-NH-CH2-CH2-）で置換されていてもよい〔ここで各々のR又はR’は独立して、Hであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。
連結基としては、-O-、-N-又は－Ｓ－が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
連結基としては、-O-、-N-又は－Ｓ－が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
【0046】
下述の実施例で示す通り、RNAの修飾の種類により、RNA結合タンパク質と該タンパク質に対する結合モチーフとの結合力に差異が生じることが示された。従って、修飾の種類を適宜変更することで、RNA結合タンパク質と該タンパク質に対する結合モチーフとの結合力を調節することも可能である。上記核酸塩基、糖残基及びリン酸残基に対する具体的な修飾を以下に示すが、これらに限定されるものではない。
【0047】
【化5】
【0048】
本発明の翻訳制御複合体をコードするＲＮＡや、本発明のＲＮＡスイッチは、本明細書中の開示及び当該技術分野における自体公知の方法により合成することができる。合成方法の一つはRNAポリメラーゼを用いる方法である。目的の配列とRNAポリメラーゼのプロモーター配列を持つDNAを化学合成し、これをテンプレートにして既に公知の方法により転写することで目的のRNAを得ることができる。このようにして得られたRNAは、公知の方法により容易に精製することができる。精製はクロマトグラフィー等の自体公知の方法により行われる。作製したRNAは、自体公知の方法により、各種修飾を導入することができる。
【0049】
また、該ＲＮＡから、細胞を用いて、あるいは無細胞系でタンパク質を合成させることで、本発明の翻訳制御複合体などの目的のタンパク質を製造することができる。
【0050】
また、本発明の翻訳制御複合体が、該複合体をコードするＲＮＡの形態である場合には、該ＲＮＡに、特定のｍｉＲＮＡ標的配列に制御されるように機能的に連結させることで、該ｍｉＲＮＡが存在する細胞のみで、翻訳制御複合体の翻訳量を抑制することができる。従って、本発明の一態様において、本発明の翻訳制御複合体をコードするＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの標的配列を含む。本明細書において、miRNA標的配列に制御されるとは、細胞で発現しているmiRNAの活性化量（即ち、成熟し、かつ標的配列の認識能を有するmiRNAの存在量）に相関して、本発明の翻訳制御複合体をコードするＲＮＡが翻訳の阻害又は分解等を受けて、該複合体の発現量が抑制されることを意味する。
【0051】
本明細書において、「miRNA」とは、mRNAからタンパク質への翻訳の阻害やmRNAの分解を通して、遺伝子の発現調節に関与する、細胞内に存在する短鎖（通常20-25塩基）のノンコーディングRNAを意味する。このmiRNAは、DNAからmiRNAとその相補鎖を含むヘアピンループ構造を取ることが可能な一本鎖のpri-miRNAとして転写され、核内にあるDroshaと呼ばれる酵素により一部が切断されpre-miRNAとなって核外に輸送された後、さらにDicerによって切断されて作用・機能する。上記miRNAは、データベースの情報（例えば、http://www.mirbase.org/又はhttp://www.microrna.org/）に登録されたmiRNA、当該データベースに記載されている文献情報に記載されたmiRNAより適宜選択してもよく、マイクロアレイ解析などを用いて新たに同定してもよい。
【0052】
本明細書において、miRNAの標的配列とは、該miRNAが認識し、所定の複数のタンパク質と相互作用してRNA-induced silencing complex（RISC）を形成し、当該RISCが結合する配列を意味する。本明細書において、miRNA標的配列は、当該miRNAに完全に相補的な配列であることが好ましいが、当該miRNA標的配列は、miRNAによって認識され得る限り、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していてもよい。当該miRNAに完全に相補的な配列からの不一致は、所望の細胞において、通常にmiRNAが認識し得る不一致であればよく、生体内における細胞内の本来の機能では、40～50％程度の不一致も許容される。このような不一致は、特に限定されないが、1塩基、2塩基、3塩基、4塩基、5塩基、6塩基、7塩基、8塩基、9塩基、若しくは10塩基の不一致、又は全認識配列の1％以上、5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、若しくは40％の不一致が例示される。また、特には、細胞が備えているmRNA上のmiRNA標的配列のように、特に、シード領域以外の部分に、すなわちmiRNAの3’側16塩基程度に対応する、標的配列内の5’側の領域に、多数の不一致を含んでもよく、シード領域の部分は、不一致を含まないか、1塩基、2塩基、若しくは3塩基の不一致を含んでもよい。このような配列は、当該RISCが特異的に結合する塩基数を含む塩基長であればよく、長さは別段限定されず、miRNAの塩基数と同数でもよく、あるいは該miRNAの塩基数よりも多い若しくは少ない塩基数でもよい。好ましくは、18塩基以上、24塩基未満の配列、より好ましくは、20塩基以上、22塩基未満の配列である。
【0053】
miRNA標的配列の数は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、あるいはそれ以上であってもよい。miRNA標的配列の上限数も、特に制限されず、cap構造から開始コドンまでの塩基数や、終止コドンからポリAテールの開始点までの塩基数などを考慮し、適宜決定することができる。また、複数（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又はそれ以上）のmiRNA標的配列が連なっていても良く、miRNAが結合しうる限り、miRNA標的配列間にその他の配列を含んでいてもよい。
【0054】
あるいは、miRNA以外の分子を用いて、翻訳を制御してもよい。このような分子としては、ＶＰｇタンパク質に融合させたタンパク質と、ＲＮＡ結合タンパク質に融合させたタンパク質の両方に結合する分子が挙げられる。従って、本発明の別の態様において、（Ａ）ＶＰｇタンパク質と、第１の多量体化ドメインとが結合した複合体又は該複合体をコードするＲＮＡ、（Ｂ）ＲＮＡ結合タンパク質と、第２の多量体化ドメインとが結合した複合体又はそれをコードするＲＮＡ、（Ｃ）第１の多量体化ドメイン及び第２の多量体化ドメインとに結合する架橋因子、及び（Ｄ）本発明のオンスイッチ、を含む、タンパク質翻訳の制御システムが提供される。前記第１の多量体化ドメインと、第２の多量体化ドメインとが、前記（Ｃ）の架橋因子を介して細胞内で会合することで、細胞内でＶＰｇタンパク質とＲＮＡ結合タンパク質との複合体が形成される。かかるシステムには、さらに本発明のオフスイッチが含まれていてもよいし、上記（Ｄ）のオンスイッチの代わりに本発明のオフスイッチが含まれていてもよい。
【0055】
上記の第１の多量体化ドメインと第２の多量体化ドメインとは、同じ分子であってもよく、異なる分子であってもよい。異なる分子である場合には、第１の多量体化ドメインと第２の多量体化ドメインとの組み合わせは、ＦＫＢＰ（ＤｍｒＡ）及びＦＲＢ、ＦＫＢＰ及びカルシニューリン、ＦＫＢＰ及びシクロフィリン、ＦＫＢＰ及び細菌性ＤＨＦＲ、カルシニューリン及びシクロフィリン、ＰＹＬ１及びＡＢＩ１、並びにＧＩＢ１及びＧＡＩから選択される。これらのタンパク質は、変異体（例：ＦＫＢＰ１２のＦ３６Ｖ変異体（ＤｍｒＢ）、ＦＲＢのＴ８２変異体（ＤｍｒＣ）等）であってもよい。
【0056】
上記架橋因子としては、上記多量体化ドメインの組み合わせにより適宜選択できるが、例えば、ラパマイシンもしくはそのラパログ（例：ＡＰ２１９６７（A/C Heterodimerizer））、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、アブシシン酸（ＡＢＡ）もしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、トリメトプリム（Ｔｍｐ）（ＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ））もしくはその誘導体、並びにこれらの任意の組合せが挙げられる。
【0057】
さらに別の態様において、（ａ）ＶＰｇタンパク質と、インテインと、標的分子に結合する分子とが結合した複合体又はそれをコードするＲＮＡ、（ｂ）ＲＮＡ結合タンパク質と、インテインと、該標的分子に結合する分子とが結合した複合体又はそれをコードするＲＮＡ、及び（ｃ）本発明のオフスイッチ、及び／又は本発明のオンスイッチ、を含む、タンパク質翻訳の制御システムが挙げられる。前記（ａ）のインテインと、（ｂ）のインテインとが、標的分子を介して細胞内で会合してプロテインスプライシングを引き起こし、細胞内でＶＰｇタンパク質とＲＮＡ結合タンパク質との複合体が形成される。かかるシステムの概要を、図２３に示す。
【0058】
本発明に用いるインテインとしては、プロテインスプライシング活性を有する限り特に限定されず、フルインテインであっても、ミニインテインであってもよい。既存のインテインデータベース等から必要な配列情報や分割位置等を入手して本発明に使用することができる。インテインが、一分子でプロテインスプライシング活性を有する場合には、適宜該インテインを分割（例えば、Ｎ末端領域とＣ末端領域とに分割）し、各断片をそれぞれＶＰｇタンパク質及びＲＮＡ結合タンパク質等に結合させて用いることができる。インテインが分離インテインである場合には、適切なペアとなるように、各インテインをそれぞれＶＰｇタンパク質及びＲＮＡ結合タンパク質等に結合させて用いることができる。分離インテインは、多様なシアノバクテリアおよび古細菌において確認されており(Caspi et al., Mol Microbiol. 50:1569-1577 (2003); Choi J. et al., J Mol Biol. 356:1093-1106 (2006.); Dassa B. et al., Biochemistry. 46:322-330 (2007.); Liu X. and Yang J., J Biol Chem. 278:26315-26318 (2003); Wu H. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 95:9226-9231 (1998.); Zettler J. et al., FEBS Letters. 583:909-914 (2009))、これら既存のインテインを適宜用いるか、適宜改変を施して用いることができる。具体的には、インテインの組み合わせの一例としては、配列番号１５で示されるＮインテイン（該タンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号１４で示す。）と配列番号１７で示されるＣインテイン（該タンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号１６で示す。）が挙げられるが、この組み合わせに限定されない。また、インテインは、上記標的分子に結合する分子に結合させてもよい。
【0059】
（ａ）の複合体を構成する、標的分子に結合する分子、及び（ｂ）の複合体を構成する、標的分子に結合する分子は、標的分子は同一であるが、結合する部位は異なる分子であれば特に限定されない。標的分子に結合する分子としては、具体的には、抗体やペプチドアプタマー、フィブロネクチン由来の人工ペプチド（例：monobody）、DARPinなどが挙げられる。
【0060】
本発明で使用される抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来である。本発明の抗体は、例えば、既知の配列情報に基づき、該抗体と、ＶＰｇ又はＲＮＡ結合タンパク質との融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター等を作製し、該ベクターからＲＮＡ又はタンパク質を作製することができる。本発明で用いる抗体は、フルボディ抗体であっても、フラグメント抗体（例：ナノボディ抗体、Fab、F(ab')2等であっても、それらの改変体（例： scFv等）であってもよく、本明細書では、これらを包含するものとして、「抗体」との用語を用いる。
【0061】
本発明で用いるペプチドアプタマーは、アミノ酸残基又は両末端部分に修飾が加えられたペプチドであってもよい。ペプチドアプタマーは、当業者において周知の方法を用いて選別することができる。限定はしないが、例えば、酵母のTwo-hybrid法により選別することができる。本発明で用いるアプタマーは、上記本発明のＲＮＡスイッチの作製方法と同様の方法で作製することできる。その他の分子についても、自体公知の方法に基づき、適宜作製することができる。
【0062】
上記標的分子としては、抗体やペプチドアプタマーなどと結合する限り特に限定されないが、細胞に対する毒性がないものが好ましい。標的分子の具体例としては、例えば、タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、及び天然化合物などが例示される。目的に応じて、適宜標的分子を選択することができ、例えば細胞内状態に応じて発現を制御したい場合であれば、検知したい細胞内状態に特異的な分子であれば、タンパク質でもペプチドでも特に制限なく用いることができ、また、外部から導入して制御したい場合であれば、細胞膜を透過しやすい低分子化合物を選択するなど、当業者であれば適宜選択することができる。
【0063】
下述の実施例で示す通り、上記架橋因子を用いた場合に、該因子の濃度依存的に翻訳活性が生じることが示された。従って、細胞に導入する架橋因子や、標的分子の濃度を調節することにより、翻訳量を調節することも可能である。
【0064】
本発明のオフスイッチ（又はオンスイッチ）にコードされるタンパク質は、本発明のオンスイッチ（又はオフスイッチ）にコードされるタンパク質に対する阻害効果を有するものにすることで、オンスイッチ（又はオフスイッチ）のタンパク質の活性と、その抑制を同時に達成することができる。従って、本発明の一態様において、本発明の翻訳制御システムを細胞に導入する工程を含む、タンパク質の翻訳の制御方法であって、本発明のオンスイッチにコードされたタンパク質の翻訳の活性化と、本発明のオフスイッチにコードされたタンパク質の翻訳の抑制を同時に行う、方法が提供される。
【0065】
下述の実施例で示される通り、ｍｉＲＮＡや薬物（例：上記標的分子や多量体化ドメインに結合する架橋因子等）の刺激により翻訳の活性化が生じる、アポトーシス誘導タンパク質をコードするオンスイッチを用いる場合には、オフスイッチとして、抗アポトーシス性タンパク質をコードするＲＮＡを用いることで、ｍｉＲＮＡや薬物等による刺激の非存在下における翻訳のリーク（漏れ）による望ましくないアポトーシス誘導タンパク質による毒性を、オフスイッチにコードされる抗アポトーシス性タンパク質により打ち消すことが可能となり、また上記刺激の存在下では、アポトーシス誘導タンパク質の翻訳を活性化すると同時に、抗アポトーシス性タンパク質については翻訳を抑制することができ、効率よく細胞のアポトーシスを誘導することができる。アポトーシス誘導タンパク質の代わりに任意のタンパク質を用いることができ、例えばＣａｓヌクレアーゼを用いると、刺激の非存在下での予期せぬオフターゲット作用の発生を抑制しつつ、刺激の存在下でのみＣａｓヌクレアーゼによるゲノム編集を効率よく行うことができる。
【0066】
従って、本発明の一実施態様において、本発明のオンスイッチにコードされるタンパク質が、アポトーシス誘導タンパク質であり、本発明のオフスイッチにコードされるタンパク質が、抗アポトーシス性タンパク質である、アポトーシス誘導システム（以下、「本発明のアポトーシス誘導システム」と称することがある）が提供される。また、別の一実施態様において、本発明のオンスイッチにコードされるタンパク質が、Ｃａｓヌクレアーゼであり、本発明のオフスイッチにコードされるタンパク質が、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質である、ゲノム編集システム（以下、「本発明のゲノム編集システム」と称することがある）が提供される。また、これらのシステムも、本発明の翻訳制御システムに包含されるものとする。
【0067】
本発明のアポトーシス誘導システムに用いるアポトーシス誘導タンパク質としては、例えば、ＩκＢ、Ｓｍａｃ/ＤＩＡＢＬＯ、ＩＣＥ、ＨｔｒＡ２/ＯＭＩ、ＡＩＦ、ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｇ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｎｏｘａ、Ｈｒｋ （ｈａｒａｋｉｒｉ）、Ｍｔｄ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、ＰＵＭＡ、ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｆａｓ、Ｔｋなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、Ｂａｘである。また、抗アポトーシス性誘導タンパク質は、アポトーシス誘導タンパク質の効果を直接（例えば、該タンパク質に結合して阻害することなどにより）抑制するものであっても、あるいは間接的に（例えば、細胞のアポトーシスの発生確率自体を低下させることなどにより）抑制するものであってもよい。かかる抗アポトーシス性タンパク質としては、例えば、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘ、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｃｌ－ＸＳ、Ｂｃｌ－ｗ、ＢＡＧなどがあげられるが、これらに限定されない。好ましくは、Ｂｃｌ－ｘＬである。また、通常のアポトーシス経路とは異なるメカニズムで細胞死を引き起こすBarnaseと、その阻害タンパク質であるBarstarとの組み合わせなども、本発明のアポトーシス誘導システムとして用いることができる。
【0068】
本発明のアポトーシス誘導システムを細胞に導入することで、アポトーシス誘導タンパク質が発現する細胞のみを特異的に殺傷することができるため、該システムは、細胞の選別に用いることができる。従って、本発明の別の態様において、本発明のアポトーシス誘導システムを細胞に導入する工程を含む、細胞の選別方法（以下、「本発明の細胞選別方法」と称することがある。）が提供される。例えば、本発明の翻訳制御複合体をコードするＲＮＡが、miRNA標的配列を有する場合には、該配列に結合することができるmiRNAを発現する細胞においては、翻訳制御複合体の翻訳が抑制され、アポトーシス誘導タンパク質の翻訳も抑制されるため、アポトーシスが生じない。このようにして、特定のmiRNAを発現する細胞のみを選別することができる。
【0069】
本発明のゲノム編集システムに用いるＣａｓヌクレアーゼとしては、ガイドＲＮＡと複合体を形成して、目的遺伝子中の標的ヌクレオチド配列とそれに隣接するprotospacer adjacent motif（PAM）を認識し結合し得る限り特に制限はないが、好ましくはCas9若しくはCpf1又はそれらの改変体である。Cas9としては、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のCas9（SpCas9；PAM配列NGG（NはA、G、T又はC。以下同じ））、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）由来のCas9（StCas9；PAM配列NNAGAAW）、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）由来のCas9（NmCas9；PAM配列NNNNGATT）、Staphylococcus aureus由来のCas9(SaCas9；PAM配列：NNGRRT）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）由来のCas9（CjCas9；PAM配列NNNVRYM(VはA、G又はC；RはA又はG；YはT又はC；MはA又はCを示す））が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、SpCas9又はそれらの改変体である。また、Cpf1としては、例えば、フランシセラ・ノヴィシダ（Francisella novicida）由来のCpf1（FnCpf1；PAM配列NTT）、アシダミノコッカス sp．（Acidaminococcus sp．）由来のCpf1（AsCpf1；PAM配列NTTT）、ラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）由来のCpf1（LbCpf1；PAM配列NTTT）等が挙げられるが、それらに限定されない。
【0070】
Ｃａｓヌクレアーゼが標的ヌクレオチド配列にリクルートできるように、本発明のゲノム編集システムには、通常ガイドＲＮＡが含まれる。ガイドＲＮＡのターゲティング配列の設計は、例えば公開のガイドRNA設計ウェブサイト（CRISPR Design Tool、CRISPRdirect等）を用いることなどにより、適宜設計できる。これらの候補の中から、目的の宿主ゲノム中のオフターゲットサイト数が少ない候補配列をターゲッティング配列として用いることができる。使用するガイドRNA設計ソフトウェアに宿主ゲノムのオフターゲットサイトを検索する機能がない場合、例えば、候補配列の3’側の8～12ヌクレオチド（標的ヌクレオチド配列の識別能の高いseed配列）について、宿主ゲノムに対してBlast検索をかけることにより、オフターゲットサイトを検索することができる。tracrRNAなども、Casヌクレアーゼの種類に応じて適宜設計することができる。
【0071】
また、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼの効果を直接抑制するものであっても、あるいは間接的に抑制するものであってもよい。かかる抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質としては、例えば、ＡｃｒＩＩＡ１、ＡｃｒＩＩＡ２、ＡｃｒＩＩＡ３、ＡｃｒＩＩＡ４、ＡｃｒＩＩＣ１、ＡｃｒＩＩＣ２、ＡｃｒＩＩＣ３や、これらのタンパク質と同一性の高いタンパク質などが挙げられる。抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質については、Pawluk A, Davidson AR, Maxwell KL (January 2018). "Anti-CRISPR: discovery, mechanism and function". Nature Reviews. Microbiology. 16 (1): 12-17.や、WO 2018/093990などを適宜参酌して設計等することができる。あるいは、Ｃａｓヌクレアーゼの少なくとも一方のＤＮＡ切断能が失活した変異体を用いることで、ＤＮＡ切断能を有するＣａｓヌクレアーゼとガイドＲＮＡを取り合うことで該ヌクレアーゼを阻害することができるため、Ｃａｓヌクレアーゼの変異体を用いてもよい。かかる変異体としては、例えば、SpCas9の場合、10番目のAsp残基をAla残基に変換し、及び／又は、840番目のHis残基をAla残基に変換した変異体を用いることができる。あるいは、SaCas9の場合は、10番目のAsp残基をAla残基に変換し、及び／又は556番目のAsp残基、557番目のHis残基及び／又は580番目のAsn残基をAla残基に変換した変異体を調製することができる。
【0072】
また、本発明の本発明のゲノム編集システムを細胞に導入することで、特定細胞のみで、あるいはタイミングでゲノム編集を行うこともできる。従って、本発明の別の態様において、本発明のゲノム編集システムを細胞に導入する工程を含む、該細胞の有する二本鎖ＤＮＡを改変する方法が提供される。本明細書において、二本鎖DNAの「改変」とは、DNA鎖上のあるヌクレオチド（例えば、dA、dC、dG又はdT）又はヌクレオチド配列が、他のヌクレオチド又はヌクレオチド配列に置換されること、あるいはDNA鎖上のあるヌクレオチド間に他のヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列が挿入されることを意味する。ここで、改変される二本鎖DNAは特に制限されないが、好ましくはゲノムDNAである。
【0073】
さらに、本発明の翻訳制御複合体と、該タンパク質に対するＲＮＡ結合モチーフとの結合力を評価することで、ＲＮＡ結合モチーフを有するＲＮＡの該複合体によるタンパク質翻訳の制御の程度を予測する方法（以下、「本発明の予測方法」と称することがある）が提供される。該予測結果に基づき、目的に応じたタンパク質の制御をすることも可能である。従って、本発明のさらに別の態様において、（１）本発明の予測方法により、ＲＮＡ結合モチーフを有する２以上のＲＮＡの翻訳の制御の程度を予測する工程、（２）該翻訳の程度が予測されたＲＮＡの中から所望のＲＮＡを選択する工程、及び（３）工程（２）で選択されたＲＮＡと、ＶＰｇタンパク質とＲＮＡ結合タンパク質とが結合した複合体とを、細胞に導入する工程を含む、タンパク質の翻訳を制御する方法が提供される。
【0074】
本発明の翻訳制御複合体と、該タンパク質に対するＲＮＡ結合モチーフとの結合力との程度の評価は、自体公知の方法により行うことができる。例えば、ＲＮＡ結合モチーフを有し、かつレポータータンパク質をコードする配列を有するＲＮＡをあらかじめ導入した細胞を用いて、該細胞に本発明の翻訳制御複合体を導入し、該レポータータンパク質の翻訳量が、コントロール群（例：該複合体を導入していない細胞群、該複合体を導入する前の細胞群、あるいは翻訳制御機能を有さないタンパク質を導入した細胞群等）と比較することで、本発明の翻訳制御複合体と、該タンパク質に対するＲＮＡ結合モチーフとの結合力との程度の評価することができる。あるいは、本発明のＲＮＡ結合モチーフの、5’UTRにおける位置や配列、修飾などの情報に基づき、実際に実験することなく評価することも可能である。また、評価結果に基づき、評価したＲＮＡの中から所望のＲＮＡを選択したり、ＲＮＡ結合モチーフの位置や配列を適宜変更することで、タンパク質の翻訳を制御することができる。
【0075】
ＲＮＡの細胞への導入は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、リバーストランスフェクション法等を用いて、細胞に導入することができる。異なる２種以上のＲＮＡを導入する場合、複数のＲＮＡを細胞に同時導入することが好ましい。この時の導入量は、導入される細胞集団、導入するmRNA、導入方法及び導入試薬の種類により異なり、所望の発現量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。
【0076】
翻訳制御複合体や上記標的分子などをタンパク質の形態で導入する場合には、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）若しくは細胞透過性ペプチド（CPP）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systems）、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE）及びProVectin（IMGENEX）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Q biogene）及びChariot Kit（Active Motif）、HVJエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。タンパク質を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で5～15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で1ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
【0077】
PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT（Frankel, A. et al, Cell55, 1189-93 (1988)；Green, M. & Loewenstein, P.M. Cell 55, 1179-88 (1988) ）、Penetratin（Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994)）、Buforin II（Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000)）、Transportan（Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998)）、MAP（model amphipathic peptide）（Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998)）、K-FGF（Lin, Y. Z. etal. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995)）、Ku70（Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003)）、Prion（Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002)）、pVEC（Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001)）、Pep-1（Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001)）、Pep-7（Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002)）、SynBl（Rousselle, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86 (2000)）、HN-I（Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000)）、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。PTD由来のCPPとしては、11R（Cell Stem Cell, 4:381-384 (2009)）や9R（Cell Stem Cell, 4:472-476 (2009)）等のポリアルギニンが挙げられる。
【0078】
本発明の翻訳制御システムを導入する細胞は、mRNAの翻訳がCap依存である真核細胞であれば特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられるが、中でも動物細胞が好ましい。動物細胞としては、例えば、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、サル、オランウータン、チンパンジー、ヒト等）の細胞が挙げられる。動物細胞としては、例えば、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、dhfr遺伝子欠損CHO細胞、マウスL細胞，マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞，ラットGH3細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞（例：HEK293細胞）、ヒト肝癌由来細胞（例：HepG2）、ヒトFL細胞などの細胞株、ヒト及び他の哺乳動物のiPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞、種々の組織から調製した初代培養細胞が用いられる。さらには、ゼブラフィッシュ胚、アフリカツメガエル卵母細胞なども用いることができる。
【0079】
本発明の翻訳システムを導入した細胞は、細胞の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。動物細胞を培養する場合の培地としては、例えば、約5～約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）〔Science，122，501 (1952)〕，ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔Virology，8，396 (1959)〕，RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association，199，519 (1967)〕，199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1 (1950)〕などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6～約8である。培養は、通常約30℃～約40℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
【0080】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【0081】
後述の実施例では、以下のようにして実験を行った。
＜pDNAの構築＞
ＰＣＲのため、KOD plus Neo（東洋紡、大阪、日本）又はQ5 Hot Start High-Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs Japan、東京、日本）を使用して、インサートを調製した。オリゴDNAを、Greiner Japan（東京、日本）又はEurofins Genomics K.K. （東京、日本）から購入した。PCR及び制限酵素処理産物を、Monarch PCR及びDNA Cleanup Kit（New England Biolabs Japan）で精製した。全てのpDNAを大腸菌株DH5α又はHST08で増幅し、PureYield Plasmid Miniprep Kit（Promega K.K.、東京、日本）を使用して精製した。pDNAの構築方法の詳細を、表１としてまとめた。
＜pDNAの構築＞
ＰＣＲのため、KOD plus Neo（東洋紡、大阪、日本）又はQ5 Hot Start High-Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs Japan、東京、日本）を使用して、インサートを調製した。オリゴDNAを、Greiner Japan（東京、日本）又はEurofins Genomics K.K. （東京、日本）から購入した。PCR及び制限酵素処理産物を、Monarch PCR及びDNA Cleanup Kit（New England Biolabs Japan）で精製した。全てのpDNAを大腸菌株DH5α又はHST08で増幅し、PureYield Plasmid Miniprep Kit（Promega K.K.、東京、日本）を使用して精製した。pDNAの構築方法の詳細を、表１としてまとめた。
【0082】
【表1-1】
【0083】
【表1-2】
【0084】
＜mRNAのin vitro転写＞
テンプレートDNAは、Q5 Hot Start High-Fidelity DNAポリメラーゼ又はPrimeSTAR MAX DNAポリメラーゼ（Takara Bio、滋賀、日本）を用いたPCRで調製した。PCRに用いたオリゴDNAは、Greiner Japan又はEurofins Genomics K.K.から購入した。PCR産物を、Monarch PCR & DNA Cleanup Kitにより精製した。各テンプレートDNAの詳細を表２としてまとめ、またプライマーリストを表３としてまとめた。得られたテンプレートDNA及びMEGAscript T7 Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific K.K.、神奈川、日本）を使用して、in vitro転写を実施した。6 mM Capアナログ（Anti Reverse Cap アナログ（ARCA）（TriLink Biotechnologies、サンディエゴ、USA）又はG（5 '）ppp（5'）A RNA Cap Structure Analog（A-cap）（New England Biolabs Japan））、1.5 mM GTP、7.5 mM ATP、CTP又は5-メチル-CTP、及び疑似UTP（pseudo-UTP）又はN1-メチル-疑似UTP（TriLink Biotechnologies）をin vitro転写に使用した。転写後、TURBO DNase（Thermo Fisher Scientific K.K.）を添加して、テンプレートDNAを分解した。得られたRNAをSPRIビーズミックスで精製し、rApidアルカリホスファターゼ（Roche Diagnostics K.K.、東京、日本）で脱リン酸化した。脱リン酸化RNAは、RNeasy Minelute Cleanup Kit（Qiagen K.K.、東京、日本）を使用して精製した。得られたRNAの長さを、MultiNA（島津製作所、京都、日本）又はAgilent Bioanalyzer 2100及びRNA 6000 Pico Kit（Agilent Technologies Japan Ltd.、東京、日本）により分析した。
テンプレートDNAは、Q5 Hot Start High-Fidelity DNAポリメラーゼ又はPrimeSTAR MAX DNAポリメラーゼ（Takara Bio、滋賀、日本）を用いたPCRで調製した。PCRに用いたオリゴDNAは、Greiner Japan又はEurofins Genomics K.K.から購入した。PCR産物を、Monarch PCR & DNA Cleanup Kitにより精製した。各テンプレートDNAの詳細を表２としてまとめ、またプライマーリストを表３としてまとめた。得られたテンプレートDNA及びMEGAscript T7 Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific K.K.、神奈川、日本）を使用して、in vitro転写を実施した。6 mM Capアナログ（Anti Reverse Cap アナログ（ARCA）（TriLink Biotechnologies、サンディエゴ、USA）又はG（5 '）ppp（5'）A RNA Cap Structure Analog（A-cap）（New England Biolabs Japan））、1.5 mM GTP、7.5 mM ATP、CTP又は5-メチル-CTP、及び疑似UTP（pseudo-UTP）又はN1-メチル-疑似UTP（TriLink Biotechnologies）をin vitro転写に使用した。転写後、TURBO DNase（Thermo Fisher Scientific K.K.）を添加して、テンプレートDNAを分解した。得られたRNAをSPRIビーズミックスで精製し、rApidアルカリホスファターゼ（Roche Diagnostics K.K.、東京、日本）で脱リン酸化した。脱リン酸化RNAは、RNeasy Minelute Cleanup Kit（Qiagen K.K.、東京、日本）を使用して精製した。得られたRNAの長さを、MultiNA（島津製作所、京都、日本）又はAgilent Bioanalyzer 2100及びRNA 6000 Pico Kit（Agilent Technologies Japan Ltd.、東京、日本）により分析した。
【0085】
【表2-1】
【0086】
【表2-2】
【0087】
【表3-1】
【0088】
【表3-2】
【0089】
＜mRNAのin vitro転写＞
テンプレートDNAは、Q5 Hot Start High-Fidelity DNAポリメラーゼを用いたPCRにより調製した。PCRに用いたオリゴDNAは、Greiner Japan又はEurofins Genomics K.K.から購入した。PCR産物を、Monarch PCR & DNA Cleanup Kitにより精製した。各テンプレートDNAの詳細は、表２に記載の通りである。得られたテンプレートDNAとMEGAshortscript T7 Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific K.K.）を用いて、in vitro転写を実施した。他の全てのステップは、上記の＜mRNAのin vitro転写＞に記載の通り行った。
テンプレートDNAは、Q5 Hot Start High-Fidelity DNAポリメラーゼを用いたPCRにより調製した。PCRに用いたオリゴDNAは、Greiner Japan又はEurofins Genomics K.K.から購入した。PCR産物を、Monarch PCR & DNA Cleanup Kitにより精製した。各テンプレートDNAの詳細は、表２に記載の通りである。得られたテンプレートDNAとMEGAshortscript T7 Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific K.K.）を用いて、in vitro転写を実施した。他の全てのステップは、上記の＜mRNAのin vitro転写＞に記載の通り行った。
【0090】
＜細胞の培養＞
HeLa細胞（ATCC CCL-2）を、9％ウシ胎児血清、抗生物質－抗真菌剤混合溶液（Sigma-Aldrich Japan、東京、日本）、0.09 mM MEM非必須アミノ酸（Thermo Fisher Scientific）、及び0.9 mM ピルビン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich Japan）を含むダルベッコ変法イーグル培地（4.5 g / Lグルコース及びL-Gln、を含むが、ピルビン酸ナトリウムを含まない液体）（ナカライテスク、京都、日本）で維持した。ヒト人工多能性幹細胞（hiPS細胞、201B7-EGFP株）は、Knut Woltjen博士（京都大学）から提供を受けた。hiPS細胞をStemFit AK02N（味の素、東京、日本）中で維持した。培地を2日ごとに1回交換し、0.5×TrypLE Select（Thermo Fisher Scientific）及びセルスクレーパーを使用して8日ごとに1回継代を行った。細胞播種の時点で、プレートをiMatrix-511シルク（日本、東京、ニッピ）でコーティングした。詳細については、以前の報告した通りである（Nakagawa, M. et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594 (2014)）。
HeLa細胞（ATCC CCL-2）を、9％ウシ胎児血清、抗生物質－抗真菌剤混合溶液（Sigma-Aldrich Japan、東京、日本）、0.09 mM MEM非必須アミノ酸（Thermo Fisher Scientific）、及び0.9 mM ピルビン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich Japan）を含むダルベッコ変法イーグル培地（4.5 g / Lグルコース及びL-Gln、を含むが、ピルビン酸ナトリウムを含まない液体）（ナカライテスク、京都、日本）で維持した。ヒト人工多能性幹細胞（hiPS細胞、201B7-EGFP株）は、Knut Woltjen博士（京都大学）から提供を受けた。hiPS細胞をStemFit AK02N（味の素、東京、日本）中で維持した。培地を2日ごとに1回交換し、0.5×TrypLE Select（Thermo Fisher Scientific）及びセルスクレーパーを使用して8日ごとに1回継代を行った。細胞播種の時点で、プレートをiMatrix-511シルク（日本、東京、ニッピ）でコーティングした。詳細については、以前の報告した通りである（Nakagawa, M. et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594 (2014)）。
【0091】
＜レポーターmRNAトランスフェクション及びフローサイトメトリー＞
5 x 104 HeLa細胞を24ウェルプレートに播種し、1日後に1μL/wellのLipofectamine MessengerMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いて、指定量のmRNAをトランスフェクトした。その1日後、200μL/wellのトリプシン/EDTAを用いて細胞を回収し、500μL/wellのDMEMに懸濁した。次に、蛍光をBD Accuri C6（BD Biosciences、サンノゼ、USA）により測定した。tagRFPとhmAG1の両方の励起波長は488 nmであった。バンドパスフィルターは、tagRFPについては585/40 nm、hmAG1については530/30 nm（90％減衰）であった。データの視覚化と、hmAG1とtagRFPの両方を発現する各細胞のhmAG1/tagRFP比の平均の計算とは、FlowJo 7.6.5（BD Biosciences）により行った。蛍光補正の値（530/30-585/40 nmについては0.7～0.9％、585/40-530/30 nmについては36～38％）を、hmAG1又はtagRFPのいずれかをトランスフェクトした細胞の蛍光をベースに決定した。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
5 x 104 HeLa細胞を24ウェルプレートに播種し、1日後に1μL/wellのLipofectamine MessengerMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いて、指定量のmRNAをトランスフェクトした。その1日後、200μL/wellのトリプシン/EDTAを用いて細胞を回収し、500μL/wellのDMEMに懸濁した。次に、蛍光をBD Accuri C6（BD Biosciences、サンノゼ、USA）により測定した。tagRFPとhmAG1の両方の励起波長は488 nmであった。バンドパスフィルターは、tagRFPについては585/40 nm、hmAG1については530/30 nm（90％減衰）であった。データの視覚化と、hmAG1とtagRFPの両方を発現する各細胞のhmAG1/tagRFP比の平均の計算とは、FlowJo 7.6.5（BD Biosciences）により行った。蛍光補正の値（530/30-585/40 nmについては0.7～0.9％、585/40-530/30 nmについては36～38％）を、hmAG1又はtagRFPのいずれかをトランスフェクトした細胞の蛍光をベースに決定した。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【0092】
【表4-1】
【0093】
【表4-2】
【0094】
【表4-3】
【0095】
【表4-4】
【0096】
【表4-5】
【0097】
【表4-6】
【0098】
【表4-7】
【0099】
【表4-8】
【0100】
【表4-9】
【0101】
【表4-10】
【0102】
【表4-11】
【0103】
【表4-12】
【0104】
【表4-13】
【0105】
【表4-14】
【0106】
【表4-15】
【0107】
【表4-16】
【0108】
【表4-17】
【0109】
【表4-18】
【0110】
＜WST-1アッセイ＞
1x104個のHeLa細胞を96ウェルプレートに播種し、1日後に、0.25 μL/wellのLipofectamine MessengerMAXを使用して、指定量のmRNAをトランスフェクトした。1日後、細胞増殖試薬であるWST-1（Roche Diagnostics KK）を含む培地を調製し（1：10（最終希釈））、トランスフェクトした細胞の培地を置き換えるために使用した。37℃で1時間インキュベートした後、440 nm及び620 nmの吸収波長をマイクロプレートリーダー（Infinite M1000、Tecan Japan Co.、Ltd.、神奈川、日本）で測定した。R 3.6.1を使用して統計分析を行った。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
1x104個のHeLa細胞を96ウェルプレートに播種し、1日後に、0.25 μL/wellのLipofectamine MessengerMAXを使用して、指定量のmRNAをトランスフェクトした。1日後、細胞増殖試薬であるWST-1（Roche Diagnostics KK）を含む培地を調製し（1：10（最終希釈））、トランスフェクトした細胞の培地を置き換えるために使用した。37℃で1時間インキュベートした後、440 nm及び620 nmの吸収波長をマイクロプレートリーダー（Infinite M1000、Tecan Japan Co.、Ltd.、神奈川、日本）で測定した。R 3.6.1を使用して統計分析を行った。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【0111】
＜アネキシンV及びSYTOX赤色染色によるアポトーシスアッセイ＞
5x104個のHeLa細胞を24ウェルプレートに播種し、1日後に1μL/wellのLipofectamine MessengerMAXを使用して、指定量のmRNAをトランスフェクトした。1日後、各ウェルの上清を回収し、200 μL/wellのアキュターゼ（Nacalai Tesque）を使用して細胞を回収した。収集した細胞を各ウェルの収集した上清に懸濁し、200 gで5分間遠心分離した。沈殿した細胞をアネキシンV、Alexa Fluor 488コンジュゲート（Thermo Fisher Scientific）、及びSYTOX Red（Thermo Fisher Scientific）を用いて、室温で30分間染色した。次に、各サンプルに200μLのPBSを加え、BD Accuri C6で蛍光を測定した。励起波長は、Alexa Fluor 488コンジュゲートについては488 nm、SYTOX Redについては640 nmであった。バンドパスフィルターは、Alexa Fluor 488コンジュゲートについては533/30 nm、SYTOX Redについては675/25 nmであった。得られたデータを、FlowJo 7.6.5により分析した。R 3.6.1を使用して統計分析を行った。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
5x104個のHeLa細胞を24ウェルプレートに播種し、1日後に1μL/wellのLipofectamine MessengerMAXを使用して、指定量のmRNAをトランスフェクトした。1日後、各ウェルの上清を回収し、200 μL/wellのアキュターゼ（Nacalai Tesque）を使用して細胞を回収した。収集した細胞を各ウェルの収集した上清に懸濁し、200 gで5分間遠心分離した。沈殿した細胞をアネキシンV、Alexa Fluor 488コンジュゲート（Thermo Fisher Scientific）、及びSYTOX Red（Thermo Fisher Scientific）を用いて、室温で30分間染色した。次に、各サンプルに200μLのPBSを加え、BD Accuri C6で蛍光を測定した。励起波長は、Alexa Fluor 488コンジュゲートについては488 nm、SYTOX Redについては640 nmであった。バンドパスフィルターは、Alexa Fluor 488コンジュゲートについては533/30 nm、SYTOX Redについては675/25 nmであった。得られたデータを、FlowJo 7.6.5により分析した。R 3.6.1を使用して統計分析を行った。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【0112】
＜HeLa細胞のEGFPノックアウトアッセイ＞
5x104個のHeLa-EGFP細胞（Hirosawa, M. et al. Cell-type-specific genome editing with a microRNA-responsive CRISPR-Cas9 switch. Nucleic Acids Res. 45, (2017).）を24ウェルプレートに播種し、1日後に1μL/wellのLipofectamine MessengerMAXを使用して、指定量のmRNA及びEGFPターゲティングsgRNAをトランスフェクトした。1日後、細胞を継代した。トランスフェクションの5日後、BD Accuri C6により蛍光を測定した。励起波長とバンドパスフィルターは、それぞれ488及び533/30 nmであった。得られたデータを、FlowJo 7.6.5により分析した。R 3.6.1を使用して統計分析を行った。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
5x104個のHeLa-EGFP細胞（Hirosawa, M. et al. Cell-type-specific genome editing with a microRNA-responsive CRISPR-Cas9 switch. Nucleic Acids Res. 45, (2017).）を24ウェルプレートに播種し、1日後に1μL/wellのLipofectamine MessengerMAXを使用して、指定量のmRNA及びEGFPターゲティングsgRNAをトランスフェクトした。1日後、細胞を継代した。トランスフェクションの5日後、BD Accuri C6により蛍光を測定した。励起波長とバンドパスフィルターは、それぞれ488及び533/30 nmであった。得られたデータを、FlowJo 7.6.5により分析した。R 3.6.1を使用して統計分析を行った。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【0113】
＜iPS細胞のEGFPノックアウトアッセイ＞
5x103個の201B7-EGFP細胞（Hirosawa, M. et al. Cell-type-specific genome editing with a microRNA-responsive CRISPR-Cas9 switch. Nucleic Acids Res. 45, (2017).）を24ウェルプレートに播種し、1日後に1μL/wellのLipofectamine MessengerMAXを使用して、指定量のmRNA及びEGFPターゲティングsgRNAをトランスフェクトした。培地を2日ごとに交換した。全ての他のステップは、上記＜HeLa細胞のEGFPノックアウトアッセイ＞に記載した通りに行った。
5x103個の201B7-EGFP細胞（Hirosawa, M. et al. Cell-type-specific genome editing with a microRNA-responsive CRISPR-Cas9 switch. Nucleic Acids Res. 45, (2017).）を24ウェルプレートに播種し、1日後に1μL/wellのLipofectamine MessengerMAXを使用して、指定量のmRNA及びEGFPターゲティングsgRNAをトランスフェクトした。培地を2日ごとに交換した。全ての他のステップは、上記＜HeLa細胞のEGFPノックアウトアッセイ＞に記載した通りに行った。
【0114】
＜タイムラプスイメージング＞
5×104個のHeLa細胞を24ウェルプレートに播種し、1日後に1μL/wellのLipofectamine MessengerMAXを使用して、指定量のmRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの5時間後、培地を除去し、400又は500μLの新鮮な培地を加えた。次に、プレートをBiostation CT（Nikon、東京、日本）に移した。2時間後、2500 nMのA/C Heterodimer（Takara Bio）を含む100μLの培地を、400μLの培地を含むウェルに加えた（最終濃度= 500 nM）。A/C Heterodimerの添加後、30分ごとにBiostation CT（対物レンズ：10x）を使用してタイムラプス画像をキャプチャした。蛍光イメージング用のフィルターセットは472/520 nmであった。露光時間は、明視野及び蛍光イメージングで、それぞれ4ミリ秒及び400ミリ秒であった。全ての蛍光画像のコントラストは、ImageJ（Schneider, C. A., Rasband, W. S. & Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods 9, 671-675 (2012).）により、同様に調整した。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
5×104個のHeLa細胞を24ウェルプレートに播種し、1日後に1μL/wellのLipofectamine MessengerMAXを使用して、指定量のmRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの5時間後、培地を除去し、400又は500μLの新鮮な培地を加えた。次に、プレートをBiostation CT（Nikon、東京、日本）に移した。2時間後、2500 nMのA/C Heterodimer（Takara Bio）を含む100μLの培地を、400μLの培地を含むウェルに加えた（最終濃度= 500 nM）。A/C Heterodimerの添加後、30分ごとにBiostation CT（対物レンズ：10x）を使用してタイムラプス画像をキャプチャした。蛍光イメージング用のフィルターセットは472/520 nmであった。露光時間は、明視野及び蛍光イメージングで、それぞれ4ミリ秒及び400ミリ秒であった。全ての蛍光画像のコントラストは、ImageJ（Schneider, C. A., Rasband, W. S. & Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods 9, 671-675 (2012).）により、同様に調整した。トランスフェクション条件の詳細は、表４に記載の通りである。
【0115】
＜タンパク質応答性スイッチの作製＞
eDHFRタンパク質のαエピトープに結合するnanobody (Nb113)、ならびにβエピトープに結合するnanobody (CA1698) のアミノ酸配列は以下の論文より取得した。
David Oyen, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics, Vol. 1834, Issue 10, Page 2147-2157, October 2013,
“Mechanistic analysis of allosteric and non-allosteric effects arising from nanobody binding to two epitopes of the dihydrofolate reductase of Escherichia coli”
近接時にタンパク質スプライシングを起こして2種類のタンパク質を融合させるインテインのアミノ酸配列は以下の論文より取得した。
Josef A. Gramespacher et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 141, Page 13708-13712, August 2019, “Proximity Induced Splicing Utilizing Caged Split Inteins”
これらのタンパク質の遺伝子はThermoFisher Scientific社による人工遺伝子合成により得た。
また、eDHFR遺伝子は名古屋工業大学 築地真也教授より受領したプラスミドベクターpEGFP-eDHFRより得た。
eDHFRタンパク質のαエピトープに結合するnanobody (Nb113)、ならびにβエピトープに結合するnanobody (CA1698) のアミノ酸配列は以下の論文より取得した。
David Oyen, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics, Vol. 1834, Issue 10, Page 2147-2157, October 2013,
“Mechanistic analysis of allosteric and non-allosteric effects arising from nanobody binding to two epitopes of the dihydrofolate reductase of Escherichia coli”
近接時にタンパク質スプライシングを起こして2種類のタンパク質を融合させるインテインのアミノ酸配列は以下の論文より取得した。
Josef A. Gramespacher et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 141, Page 13708-13712, August 2019, “Proximity Induced Splicing Utilizing Caged Split Inteins”
これらのタンパク質の遺伝子はThermoFisher Scientific社による人工遺伝子合成により得た。
また、eDHFR遺伝子は名古屋工業大学 築地真也教授より受領したプラスミドベクターpEGFP-eDHFRより得た。
【0116】
これらのDNAならびにプラスミドベクターpcDNA3.1-MS2CP-VPg(FCV), pBCMV-iLID-VPg(FCV)からタカラバイオ社In-Fusion HD cloning kitを用いてpcDNA3.1-MS2CP-eNpuNcage-Nb113ならびにpBCMV-CA1698-NpuCcage-VPg(FCV)を作製した。これらのプラスミドベクターを鋳型として、PCRにより以下の試験管内転写反応用鋳型DNAを得た。
・MS2CP-eNpuNcage-Nb113（配列番号89）
MS2CP gene, eNpu caged N-intein gene, Nanobody (Nb113) gene
・CA1698-NpuCcage-VPg(FCV)（配列番号90）
Nanobody (CA1698) gene, Npu caged C-intein gene, VPg(FCV) gene
・eDHFR（配列番号91）
eDHFR gene
・MS2CP-eNpuNcage-Nb113（配列番号89）
MS2CP gene, eNpu caged N-intein gene, Nanobody (Nb113) gene
・CA1698-NpuCcage-VPg(FCV)（配列番号90）
Nanobody (CA1698) gene, Npu caged C-intein gene, VPg(FCV) gene
・eDHFR（配列番号91）
eDHFR gene
【0117】
上記方法により作製した鋳型DNAから、ThermoFisher Scientific社MEGAscript T7 Transcription Kit、TriLink社CleanCap AG (3’OMe)ならびにN1-Methylpseudouridine-5'-triphosphateを用いて、以下の手順でmRNAを作製した。
10ｘMegascript buffer: 1 μl
75 mM ATP: 0.8 μl
75 mM CTP: 0.8 μl
75 mM GTP: 0.8 μl
100 mM N1-Methylpseudouridine-5'-triphosphate: 0.6 μl
鋳型DNA: 400 ng
T7 enzyme mix: 1 μl
100 mM CleanCap AG(3’OMe): 0.48 μl
の混合液を調製し、MilliQを加えて計10 μlとした。
次に、試験管内転写反応を行い（37℃ 6時間）、TURBO DNase 1 μlを加え、鋳型DNAの分解反応を行った（37℃ 30分）。次いで、Beckman coulter社RNA Clean XPを用いて分解産物を精製し、Roche社Rapid alkaline phosphataseにて脱リン酸化反応を行った（37℃ 30分）。その後、New England Biolabs社Monarch RNA Cleanup Kitにて産物を精製し、ThermoFisher Scientific社Nanodrop2000によりRNA濃度を確認した。また、島津製作所MultiNAによりmRNAのサイズを確認した。
10ｘMegascript buffer: 1 μl
75 mM ATP: 0.8 μl
75 mM CTP: 0.8 μl
75 mM GTP: 0.8 μl
100 mM N1-Methylpseudouridine-5'-triphosphate: 0.6 μl
鋳型DNA: 400 ng
T7 enzyme mix: 1 μl
100 mM CleanCap AG(3’OMe): 0.48 μl
の混合液を調製し、MilliQを加えて計10 μlとした。
次に、試験管内転写反応を行い（37℃ 6時間）、TURBO DNase 1 μlを加え、鋳型DNAの分解反応を行った（37℃ 30分）。次いで、Beckman coulter社RNA Clean XPを用いて分解産物を精製し、Roche社Rapid alkaline phosphataseにて脱リン酸化反応を行った（37℃ 30分）。その後、New England Biolabs社Monarch RNA Cleanup Kitにて産物を精製し、ThermoFisher Scientific社Nanodrop2000によりRNA濃度を確認した。また、島津製作所MultiNAによりmRNAのサイズを確認した。
【0118】
＜ＭＳＣＰ２以外のＲＮＡ結合タンパク質をコードするRNAの調製＞
hLIN28A-VPg(FCV)の試験管内転写反応用鋳型DNAは、pUC19-hLIN28A-VPg(FCV)を鋳型とし、YF-771ならびにHNC-396をPrimerとしてPCRにて作製した。
L7Ae-VPg(FCV)試験管内転写反応用鋳型DNAは、pcDNA3.1-L7Ae-VPg(FCV)を鋳型とし、まずKEC-415 (CACCGGTCGCCACCATGTACGTGAGATTTGAGGTTCCTG（配列番号92）)ならびにHNC-266をPrimerとしてPCRを行った後、このPCR産物を鋳型として更にHNC-242、HNC-396、KEC-62ならびに3’UTR oligo DNAをPrimerとして用いてPCRを行うことで作製した。その他の手順については、上記＜mRNAのin vitro転写＞欄に記載の手順と同様である。このようにした調整したRNAを、図25に記載の手順により、HeLa細胞に導入した。hLIN28A-VPg(FCV) IVTテンプレート、KtV5-hmAG1 IVTテンプレート、L7Ae-VPg(FCV) IVTテンプレート、preElet7d-hmAG1 IVTテンプレート、及びStbC(let7d)-hmAG1 IVTテンプレートの配列を、それぞれ配列番号93～97で示す。
hLIN28A-VPg(FCV)の試験管内転写反応用鋳型DNAは、pUC19-hLIN28A-VPg(FCV)を鋳型とし、YF-771ならびにHNC-396をPrimerとしてPCRにて作製した。
L7Ae-VPg(FCV)試験管内転写反応用鋳型DNAは、pcDNA3.1-L7Ae-VPg(FCV)を鋳型とし、まずKEC-415 (CACCGGTCGCCACCATGTACGTGAGATTTGAGGTTCCTG（配列番号92）)ならびにHNC-266をPrimerとしてPCRを行った後、このPCR産物を鋳型として更にHNC-242、HNC-396、KEC-62ならびに3’UTR oligo DNAをPrimerとして用いてPCRを行うことで作製した。その他の手順については、上記＜mRNAのin vitro転写＞欄に記載の手順と同様である。このようにした調整したRNAを、図25に記載の手順により、HeLa細胞に導入した。hLIN28A-VPg(FCV) IVTテンプレート、KtV5-hmAG1 IVTテンプレート、L7Ae-VPg(FCV) IVTテンプレート、preElet7d-hmAG1 IVTテンプレート、及びStbC(let7d)-hmAG1 IVTテンプレートの配列を、それぞれ配列番号93～97で示す。
【0119】
実施例１：翻訳活性化因子（翻訳アクチベーター）を開発するためのMS2CP及びVPgタンパク質融合タンパク質の作製
カリシウイルスの自然な生活環では、VPgタンパク質はゲノム及びサブゲノムRNAの5 '末端と共有結合する（Royall, E. & Locker, N. Translational control during calicivirus infection. Viruses 8, 1-13 (2016)）。共有結合の形成は、カリシウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼによる転写と関連しているため（Rohayem, J., Robel, I., Jager, K., Scheffler, U. & Rudolph, W. Protein-Primed and De Novo Initiation of RNA Synthesis by Norovirus 3Dpol. J. Virol. 80, 7060-7069 (2006)）、同じ方法でVPgタンパク質と合成mRNAとを結合することは困難である。従って、VPgタンパク質と標準構造を有さない合成mRNAとの相互作用のため、モチーフ特異的なRNA結合タンパク質（RBP）である、MS2CPのdlFGバリアント（Peabody, D. S. & Ely, K. R. Control of translational repression by protein - protein interactions. Nucleic Acids Res. 20, 1649-1655 (1992)、Lim, F. & David, S. P. Mutations that increase the affinity of a translational repressor for RNA. Nucleic Acids Res. 22, 3748-3752 (1994)）を用いた（図2a）。MS2CPを介したVPgタンパク質の結合がmRNAの翻訳を活性化できるか否かを調べるために、ノロウイルスGI（NV-GI）由来のVPgタンパク質、又はネコカリシウイルス（FCV）由来のVPgタンパク質に結合したMS2CPを発現するmRNAを調製した（それぞれ、MS2CP-VPgタンパク質（NV-GI）及びMS2CP-VPgタンパク質（FCV））。これらのタンパク質の標的として、5'末端にMS2CPの結合モチーフを含むヒトコドンに最適化した単量体のアザミグリーン（hmAG1）をコードするmRNA（1xMS2（C）site1-hmAG1 mRNA）も調製した。これらのmRNA及びトランスフェクションコントロールとしてのtagRFP mRNAをHeLa細胞に同時トランスフェクトし、hmAG1/tagRFP比を分析して翻訳活性化をモニターした。MS2CP-VPg（NV-GI）及びMS2CP-VPg（FCV）の両方をMS2CPと融合させると、hmAG1翻訳を活性化したが、MS2CP-VPg（NV-GI）では、MS2結合モチーフを有さないmRNAの高い非特異的翻訳の活性化が示され、MS2CPに媒介された標的mRNAは、その活性化レベルを減少させた（図2b-e）。対照的に、MS2CP-VPg（FCV）は、非特異的な翻訳活性化が低く、hmAG1 mRNAにMS2結合モチーフを追加することで、MS2CP-VPgタンパク質（FCV）を介した翻訳活性化が2.3倍増加した（図2b-e）。一方で、MS2CP又は未融合のVPgタンパク質（FCV）タンパク質のみでは、MS2結合モチーフ依存的な翻訳活性化の増加は認められなかった（図2b-e及び図3）。これらの結果から、MS2CP-VPgタンパク質（FCV）は特定の標的mRNAの翻訳活性化により適していると結論付けた。この融合タンパク質をカリシウイルスVPgタンパク質ベースの翻訳活性化因子（CaVT）と名付け、以下の実験で用いた。
カリシウイルスの自然な生活環では、VPgタンパク質はゲノム及びサブゲノムRNAの5 '末端と共有結合する（Royall, E. & Locker, N. Translational control during calicivirus infection. Viruses 8, 1-13 (2016)）。共有結合の形成は、カリシウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼによる転写と関連しているため（Rohayem, J., Robel, I., Jager, K., Scheffler, U. & Rudolph, W. Protein-Primed and De Novo Initiation of RNA Synthesis by Norovirus 3Dpol. J. Virol. 80, 7060-7069 (2006)）、同じ方法でVPgタンパク質と合成mRNAとを結合することは困難である。従って、VPgタンパク質と標準構造を有さない合成mRNAとの相互作用のため、モチーフ特異的なRNA結合タンパク質（RBP）である、MS2CPのdlFGバリアント（Peabody, D. S. & Ely, K. R. Control of translational repression by protein - protein interactions. Nucleic Acids Res. 20, 1649-1655 (1992)、Lim, F. & David, S. P. Mutations that increase the affinity of a translational repressor for RNA. Nucleic Acids Res. 22, 3748-3752 (1994)）を用いた（図2a）。MS2CPを介したVPgタンパク質の結合がmRNAの翻訳を活性化できるか否かを調べるために、ノロウイルスGI（NV-GI）由来のVPgタンパク質、又はネコカリシウイルス（FCV）由来のVPgタンパク質に結合したMS2CPを発現するmRNAを調製した（それぞれ、MS2CP-VPgタンパク質（NV-GI）及びMS2CP-VPgタンパク質（FCV））。これらのタンパク質の標的として、5'末端にMS2CPの結合モチーフを含むヒトコドンに最適化した単量体のアザミグリーン（hmAG1）をコードするmRNA（1xMS2（C）site1-hmAG1 mRNA）も調製した。これらのmRNA及びトランスフェクションコントロールとしてのtagRFP mRNAをHeLa細胞に同時トランスフェクトし、hmAG1/tagRFP比を分析して翻訳活性化をモニターした。MS2CP-VPg（NV-GI）及びMS2CP-VPg（FCV）の両方をMS2CPと融合させると、hmAG1翻訳を活性化したが、MS2CP-VPg（NV-GI）では、MS2結合モチーフを有さないmRNAの高い非特異的翻訳の活性化が示され、MS2CPに媒介された標的mRNAは、その活性化レベルを減少させた（図2b-e）。対照的に、MS2CP-VPg（FCV）は、非特異的な翻訳活性化が低く、hmAG1 mRNAにMS2結合モチーフを追加することで、MS2CP-VPgタンパク質（FCV）を介した翻訳活性化が2.3倍増加した（図2b-e）。一方で、MS2CP又は未融合のVPgタンパク質（FCV）タンパク質のみでは、MS2結合モチーフ依存的な翻訳活性化の増加は認められなかった（図2b-e及び図3）。これらの結果から、MS2CP-VPgタンパク質（FCV）は特定の標的mRNAの翻訳活性化により適していると結論付けた。この融合タンパク質をカリシウイルスVPgタンパク質ベースの翻訳活性化因子（CaVT）と名付け、以下の実験で用いた。
【0120】
CaVTを介した翻訳の増加がVPgタンパク質のcapを模倣する効果により引き起こされたことをさらに確認するため、翻訳活性化capアナログ（Anti Reverse Cap Analog ; ARCA）でキャップ済みの1xMS2（C）site1-hmAG1 mRNAに対するCaVTの効果を検証した。1xMS2（C）site1-hmAG1 mRNAを用いた場合、CaVTの結合は翻訳活性化ではなく翻訳抑制を誘発したが（図4）、この効果はVPgタンパク質非融合MS2CPを用いた場合(Endo, K., Stapleton, J. A., Hayashi, K., Saito, H. & Inoue, T. Quantitative and simultaneous translational control of distinct mammalian mRNAs. Nucleic Acids Res. 41, e135 (2013))と同様の効果であった。
【0121】
実施例２：CaVT用の標的mRNAの最適化
親和性と翻訳活性化の相関関係を調べるために、次に2つのMS2CPバリアント（従来のMS2CP及びMS2結合モチーフに親和性の高いV29I変異体（Lim, F. & David, S. P. Mutations that increase the affinity of a translational repressor for RNA. Nucleic Acids Res. 22, 3748-3752 (1994)））を用いた。また、6種類の異なるhmAG1 mRNAバリアントを設計した（図5a）。これらのhmAG1 mRNAは、2つのMS2結合モチーフのバリアント（C又はU）の1つを含んでおり、ネイティブなヌクレオシドコンテキストにおいては、CバリアントはUバリアントよりもMS2CPに対して高い親和性を有している（Lowary, P. T. & Uhlenbeck, O. C. An RNA mutation that increases the affinity of an RNA-protein interaction. Nucleic Acids Res. 15, 10483-93 (1987)）。これらのモチーフの位置は、5'端（site1）、5' UTRの中心（site2）、又はコザック配列のすぐ上流（site3）である。さらに、2つの異なるヌクレオシド組成（ウリジンの代わりにN1-メチルシュードウリジン（N1mΨ）、ウリジン及びシチジンの代わりにそれぞれシュードウリジン（Ψ）及び5-メチルシチジン（5mC））を有するように、これらのhmAG1 mRNAバリアントを調製した。本発明者らの研究により、MS2CPがΨ/ 5mCを含むRNAよりもN1mΨを含むRNAに強く結合できることが示唆された。これらのCaVT及びhmAG1 mRNAバリアントをHeLa細胞に同時トランスフェクトし、フローサイトメーターを使用してhmAG1蛍光を測定した（図5b、c及び図6）。より高い翻訳活性化は、N1mΨを含むUバリアントモチーフと、Ψ/5mCを含むCバリアントモチーフにより達成され、モチーフの最も適切な位置はsite2（CaVTによる翻訳活性化の7.1から8.2倍の増加）であった（図5b、c、及び図6）。特に、CaVT/hmAG1 mRNA比が1/9から1/4に増加しても、翻訳活性化レベルは改善しなかった（図7及び8）。
親和性と翻訳活性化の相関関係を調べるために、次に2つのMS2CPバリアント（従来のMS2CP及びMS2結合モチーフに親和性の高いV29I変異体（Lim, F. & David, S. P. Mutations that increase the affinity of a translational repressor for RNA. Nucleic Acids Res. 22, 3748-3752 (1994)））を用いた。また、6種類の異なるhmAG1 mRNAバリアントを設計した（図5a）。これらのhmAG1 mRNAは、2つのMS2結合モチーフのバリアント（C又はU）の1つを含んでおり、ネイティブなヌクレオシドコンテキストにおいては、CバリアントはUバリアントよりもMS2CPに対して高い親和性を有している（Lowary, P. T. & Uhlenbeck, O. C. An RNA mutation that increases the affinity of an RNA-protein interaction. Nucleic Acids Res. 15, 10483-93 (1987)）。これらのモチーフの位置は、5'端（site1）、5' UTRの中心（site2）、又はコザック配列のすぐ上流（site3）である。さらに、2つの異なるヌクレオシド組成（ウリジンの代わりにN1-メチルシュードウリジン（N1mΨ）、ウリジン及びシチジンの代わりにそれぞれシュードウリジン（Ψ）及び5-メチルシチジン（5mC））を有するように、これらのhmAG1 mRNAバリアントを調製した。本発明者らの研究により、MS2CPがΨ/ 5mCを含むRNAよりもN1mΨを含むRNAに強く結合できることが示唆された。これらのCaVT及びhmAG1 mRNAバリアントをHeLa細胞に同時トランスフェクトし、フローサイトメーターを使用してhmAG1蛍光を測定した（図5b、c及び図6）。より高い翻訳活性化は、N1mΨを含むUバリアントモチーフと、Ψ/5mCを含むCバリアントモチーフにより達成され、モチーフの最も適切な位置はsite2（CaVTによる翻訳活性化の7.1から8.2倍の増加）であった（図5b、c、及び図6）。特に、CaVT/hmAG1 mRNA比が1/9から1/4に増加しても、翻訳活性化レベルは改善しなかった（図7及び8）。
【0122】
最も高い親和性の組み合わせ（MS2CP（V29I）と、Cバリアントモチーフを有し、かつN1mΨを含むmRNAとの組み合わせ）は、最も低い翻訳活性化を示した（図5b及び図7a）。これらの結果に基づいて、最適な親和性を超えると翻訳活性化レベルが低下する可能性があるという仮説を立てた。この仮説を検証するために、従来のCバリアントモチーフよりも親和性が高い、足場（scaffold）により安定化されたCバリアントモチーフの2つのコピーを含むhmAG1 mRNA（2xScMS2（C）-hmAG1）を設計した（図9a）（Matsuura, S. et al. Synthetic RNA-based logic computation in mammalian cells. Nat. Commun. 9, 4847 (2018)）。興味深いことに、2xScMS2（C）-hmAG1 mRNA（N1Ψを含む）の翻訳は、CaVTにより活性化されず、抑制された（図9b-d、図10a及び11）。CaVTによる翻訳抑制は、ARCAでキャップされた2xScMS2（C）-hmAG1 mRNAを同時トランスフェクトした場合に、より明白となった（図9e及び図10b）。これらの結果は、モチーフの位置とCaVTとmRNAとの親和性を操作することにより、反対方向（活性化と抑制）に翻訳レベルを調節できることを示している。N1mΨを含むmRNAでは効率的な翻訳活性化と抑制が観察されたため（図5-11）、N1mΨを含むmRNAを以下の実験で使用した。
【0123】
実施例３：CaVTによる細胞運命の調節の検証
アポトーシスタンパク質の発現を調節することによる望ましくない細胞の殺傷は、合成生物学の分野において重要な用途がある（Nakanishi, H. & Saito, H. Mammalian gene circuits with biomolecule-responsive RNA devices. Curr. Opin. Chem. Biol. 52, 16-22 (2019)）。細胞を殺傷する遺伝子回路（gene circuit）は、がん遺伝子治療や細胞治療に使用できる（Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R. & Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science 333, 1307-11 (2011)、Miki, K. et al. Efficient Detection and Purification of Cell Populations Using Synthetic MicroRNA Switches. Cell Stem Cell 16, 699-711 (2015)）。しかし、タンパク質発現の漏れと回路の複雑さのために、洗練されたアポトーシス調節の提供は依然として課題のままである。従って、CaVTを介した翻訳活性化とアポトーシスタンパク質の抑制を使用して、効率的なアポトーシス調節システムを設計した。まず、ヒトBax（アポトーシス促進タンパク質）遺伝子と、その5'UTR（1xMS2（U）site2-Bax）の中央にUバリアントモチーフとを含むmRNA（標準的な5'cap構造は有さない）を調製した（図12a、左）。CaVT mRNAの同時トランスフェクションにより、アポトーシス細胞の数が1xMS2（U）site2-Baxにより増加したが、CaVTが存在しない場合でも、アポトーシス誘導の一部が観察された（図12b-d）。
アポトーシスタンパク質の発現を調節することによる望ましくない細胞の殺傷は、合成生物学の分野において重要な用途がある（Nakanishi, H. & Saito, H. Mammalian gene circuits with biomolecule-responsive RNA devices. Curr. Opin. Chem. Biol. 52, 16-22 (2019)）。細胞を殺傷する遺伝子回路（gene circuit）は、がん遺伝子治療や細胞治療に使用できる（Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R. & Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science 333, 1307-11 (2011)、Miki, K. et al. Efficient Detection and Purification of Cell Populations Using Synthetic MicroRNA Switches. Cell Stem Cell 16, 699-711 (2015)）。しかし、タンパク質発現の漏れと回路の複雑さのために、洗練されたアポトーシス調節の提供は依然として課題のままである。従って、CaVTを介した翻訳活性化とアポトーシスタンパク質の抑制を使用して、効率的なアポトーシス調節システムを設計した。まず、ヒトBax（アポトーシス促進タンパク質）遺伝子と、その5'UTR（1xMS2（U）site2-Bax）の中央にUバリアントモチーフとを含むmRNA（標準的な5'cap構造は有さない）を調製した（図12a、左）。CaVT mRNAの同時トランスフェクションにより、アポトーシス細胞の数が1xMS2（U）site2-Baxにより増加したが、CaVTが存在しない場合でも、アポトーシス誘導の一部が観察された（図12b-d）。
【0124】
1xMS2（U）site2-hmAG1をトランスフェクトした場合、CaVTの非存在下で、発現が漏れたものが観察された（図6及び8）。hmAG1実験の結果に基づいて、Baxの発現の漏れが、CaVTの非存在下でのアポトーシスの原因であり得ると考えられた。この発現の漏れにより引き起こされるアポトーシス効果を減らすために、次に、Baxと直接結合してアポトーシスを阻害する抗アポトーシスタンパク質であるBcl-xL21(Saito, H., Fujita, Y., Kashida, S., Hayashi, K. & Inoue, T. Synthetic human cell fate regulation by protein-driven RNA switches. Nat. Commun. 2, 160 (2011))をコードするmRNAを設計した。2xScMS2（C）-BclxLと名付けたBcl-xL mRNAには、足場によって安定化されたCバリアントモチーフのコピーが2つ含まれており、CaVTを介した隣接するコーディング領域の翻訳抑制を引き起こすと考えられる。従って、CaVTは、それぞれ1xMS2（U）site2-Bax及び2xScMS2（C）-BclxLの翻訳を同時に活性化及び抑制すると考えられる（図12a、右）。CaVTの非存在下では、1xMS2（U）site2-Baxと2xScMS2（C）-BclxLとの同時トランスフェクションは、mRNA非処理細胞と比較してアポトーシス細胞の増加は認められなかった。対照的に、CaVT mRNAを追加して同時トランスフェクションすると、アポトーシス細胞の数を有意に増加させた（図12b-d）。これらの結果から、CaVTを介した翻訳調節システムが、単一のタンパク質による異なるmRNAの同時の活性化及び抑制により、洗練された細胞運命調節を可能にすることが示された。
【0125】
実施例４：CaVTを介したゲノム編集の調節の検証
次に、CaVTによるゲノム編集の制御を検証した（図13a）。まず、化膿連鎖球菌由来のCas9（1xMS2（U）site2-SpCas9）の翻訳活性化のためのmRNAを調製した。Cas9は、標的DNAに相補的な配列を含むガイドRNAと複合体を形成する、ターゲットのプログラム可能なヌクレアーゼである(Jinek, M. et al. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science 337, 816-822 (2012))。Cas9は、ガイドRNA配列を設計することで標的DNAの切断部位をプログラムできるため、遺伝子ノックアウトやノックインなどのゲノム編集に広く使用されている（Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)、Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)、Hirosawa, M. et al. Cell-type-specific genome editing with a microRNA-responsive CRISPR-Cas9 switch. Nucleic Acids Res. 45, (2017)）。Cas9のCaVTを介した翻訳活性化を検証するために、1xMS2（U）site2-SpCas9 mRNAと、EGFPを発現するHeLa細胞（HeLa-EGFP）のEGFP遺伝子を標的とする単一ガイドRNA（sgRNA）とを同時トランスフェクした（図13a、上）。Baxの場合と同様に、MS2CP-VPg（FCV）の同時トランスフェクションによりEGFPのノックアウトが増加した（細胞の約60％がEGFP陰性であった）が、MS2CP-VPgの非存在下でもEGFPのノックアウトが一部観察され（細胞の約40％がEGFP陰性であった）、未処理細胞よりも有意に高かった（図13b及びc）。そのため、Cas9と結合してCas9のDNA認識及びエンドヌクレアーゼ活性を阻害する抗CRISPRタンパク質である、AcrIIA4（Rauch, B. J. et al. Inhibition of CRISPR-Cas9 with Bacteriophage Proteins. Cell 168, 150-158.e10 (2017)、Hirosawa, M., Fujita, Y. & Saito, H. Cell-Type-Specific CRISPR Activation with MicroRNA-Responsive AcrllA4 Switch. ACS Synth. Biol. 8, 1575-1582 (2019)、Dong, D. et al. Structural basis of CRISPR-SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein. Nature 546, 436-439 (2017)）をコードするmRNAを調製した。2xScMS2（C）-AcrIIA4と名付けたAcrIIA4をコードするmRNAは、2xScMS2（C）-BclxLと同一のモチーフを有し、MS2CP-VPg（FCV）を介したAcrIIA4の翻訳抑制を可能とする（図13a、下）。CaVT mRNAを同時トランスフェクトした場合、1xMS2（U）site2-SpCas9及び2xScMS2（C）-AcrIIA4 mRNAをトランスフェクトした細胞は、翻訳活性を発揮するcapアナログ (ARCA)を有するCas9 mRNAをトランスフェクトしたポジティブコントロールに匹敵する、高いEGFPノックアウト効率を示した。一方、CaVTの非存在下では、1xMS2（U）site2-SpCas9及び2xScMS2（C）-AcrIIA4を同時トランスフェクトした細胞のEGFP陰性率は、未処理細胞のEGFP陰性率に匹敵した（図13b及びc）。これらの結果は、Cas9とAcrIIA4の同時アップレギュレーションとダウンレギュレーションにより、CaVTがゲノム編集の効率的な調節を可能にすることを示す。
次に、CaVTによるゲノム編集の制御を検証した（図13a）。まず、化膿連鎖球菌由来のCas9（1xMS2（U）site2-SpCas9）の翻訳活性化のためのmRNAを調製した。Cas9は、標的DNAに相補的な配列を含むガイドRNAと複合体を形成する、ターゲットのプログラム可能なヌクレアーゼである(Jinek, M. et al. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science 337, 816-822 (2012))。Cas9は、ガイドRNA配列を設計することで標的DNAの切断部位をプログラムできるため、遺伝子ノックアウトやノックインなどのゲノム編集に広く使用されている（Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)、Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)、Hirosawa, M. et al. Cell-type-specific genome editing with a microRNA-responsive CRISPR-Cas9 switch. Nucleic Acids Res. 45, (2017)）。Cas9のCaVTを介した翻訳活性化を検証するために、1xMS2（U）site2-SpCas9 mRNAと、EGFPを発現するHeLa細胞（HeLa-EGFP）のEGFP遺伝子を標的とする単一ガイドRNA（sgRNA）とを同時トランスフェクした（図13a、上）。Baxの場合と同様に、MS2CP-VPg（FCV）の同時トランスフェクションによりEGFPのノックアウトが増加した（細胞の約60％がEGFP陰性であった）が、MS2CP-VPgの非存在下でもEGFPのノックアウトが一部観察され（細胞の約40％がEGFP陰性であった）、未処理細胞よりも有意に高かった（図13b及びc）。そのため、Cas9と結合してCas9のDNA認識及びエンドヌクレアーゼ活性を阻害する抗CRISPRタンパク質である、AcrIIA4（Rauch, B. J. et al. Inhibition of CRISPR-Cas9 with Bacteriophage Proteins. Cell 168, 150-158.e10 (2017)、Hirosawa, M., Fujita, Y. & Saito, H. Cell-Type-Specific CRISPR Activation with MicroRNA-Responsive AcrllA4 Switch. ACS Synth. Biol. 8, 1575-1582 (2019)、Dong, D. et al. Structural basis of CRISPR-SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein. Nature 546, 436-439 (2017)）をコードするmRNAを調製した。2xScMS2（C）-AcrIIA4と名付けたAcrIIA4をコードするmRNAは、2xScMS2（C）-BclxLと同一のモチーフを有し、MS2CP-VPg（FCV）を介したAcrIIA4の翻訳抑制を可能とする（図13a、下）。CaVT mRNAを同時トランスフェクトした場合、1xMS2（U）site2-SpCas9及び2xScMS2（C）-AcrIIA4 mRNAをトランスフェクトした細胞は、翻訳活性を発揮するcapアナログ (ARCA)を有するCas9 mRNAをトランスフェクトしたポジティブコントロールに匹敵する、高いEGFPノックアウト効率を示した。一方、CaVTの非存在下では、1xMS2（U）site2-SpCas9及び2xScMS2（C）-AcrIIA4を同時トランスフェクトした細胞のEGFP陰性率は、未処理細胞のEGFP陰性率に匹敵した（図13b及びc）。これらの結果は、Cas9とAcrIIA4の同時アップレギュレーションとダウンレギュレーションにより、CaVTがゲノム編集の効率的な調節を可能にすることを示す。
【0126】
実施例５：miRNA応答性CaVTによる細胞選択的な調節の検証
次に、CaVTベースのRNA回路(RNA circuits)が内因性シグナルを検出し、細胞の種類に特異的な様式で目的の出力を生成できるか否かを調べた。miRNAには様々な種類があり、またその活性は細胞の種類に依存するため（Ludwig, N. et al. Distribution of miRNA expression across human tissues. Nucleic Acids Res. 44, 3865-3877 (2016)）、代表的なマーカーとしてmicroRNA（miRNA）を選択した。miRNAは、mRNAの分解又は翻訳抑制を介してmRNAの翻訳を制御する小さな（約22 nt）非コードRNAである(Zeng, Y., Yi, R. & Cullen, B. R. MicroRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression by similar mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 9779-84 (2003))。miRNAは、Argonauteタンパク質（Ago2など）と複合体を形成し、miRNAに部分的又は完全に相補的な配列を含むmRNAを切断又は翻訳抑制する。
次に、CaVTベースのRNA回路(RNA circuits)が内因性シグナルを検出し、細胞の種類に特異的な様式で目的の出力を生成できるか否かを調べた。miRNAには様々な種類があり、またその活性は細胞の種類に依存するため（Ludwig, N. et al. Distribution of miRNA expression across human tissues. Nucleic Acids Res. 44, 3865-3877 (2016)）、代表的なマーカーとしてmicroRNA（miRNA）を選択した。miRNAは、mRNAの分解又は翻訳抑制を介してmRNAの翻訳を制御する小さな（約22 nt）非コードRNAである(Zeng, Y., Yi, R. & Cullen, B. R. MicroRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression by similar mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 9779-84 (2003))。miRNAは、Argonauteタンパク質（Ago2など）と複合体を形成し、miRNAに部分的又は完全に相補的な配列を含むmRNAを切断又は翻訳抑制する。
【0127】
RNA回路で細胞の状態に依存した翻訳活性化と抑制を達成するために、特定の細胞の種類をソート又は視覚化するために以前用いたmiRNA応答性mRNAに注目した（Hirosawa, M. et al. Cell-type-specific genome editing with a microRNA-responsive CRISPR-Cas9 switch. Nucleic Acids Res. 45, (2017)、Miki, K. et al. Efficient Detection and Purification of Cell Populations Using Synthetic MicroRNA Switches. Cell Stem Cell 16, 699-711 (2015)、Endo, K., Hayashi, K. & Saito, H. High-resolution Identification and Separation of Living Cell Types by Multiple microRNA-responsive Synthetic mRNAs. Sci. Rep. 6, 21991 (2016)、Parr, C. J. C. et al. MicroRNA-302 switch to identify and eliminate undifferentiated human pluripotent stem cells. Sci. Rep. 6, 32532 (2016)、Nakanishi, H. et al. Monitoring and visualizing microRNA dynamics during live cell differentiation using microRNA-responsive non-viral reporter vectors. Biomaterials 128, 121-135 (2017)）。従って、HeLa及びヒトiPS細胞（hiPSC、201B7株）でそれぞれ高度に発現する2つのmiRNA（即ち、miR-21-5p及びmiR-302a-5p）の相補配列を含むCaVT mRNAを設計した。HeLa細胞では内因性miR-302a-5p活性が非常に低いため（Hirosawa, M. et al. Cell-type-specific genome editing with a microRNA-responsive CRISPR-Cas9 switch. Nucleic Acids Res. 45, (2017)）、1xMS2（U）site2-Bax及び2xScMS2（C）-BclxL（図14a）で構成されるアポトーシス誘導回路をHeLa細胞に同時トランスフェクトした場合に、miR-302a-5p応答性CaVT mRNAは、従来のCaVT mRNAに匹敵するアポトーシス誘導を示した。miR-302a-5pミミックの添加により細胞死が減少したことから、システムのmiRNA応答性が実証された（図14b及び図15、16）。miRNA応答性のアポトーシス誘導回路が内因性miRNAに応答できるか否かを調べるために、miR-21-5p応答性CaVT mRNAを、1xMS2（U）site2-Bax及び2xScMS2（C）-BclxLと共に、内因性miR-21-5p活性が高いHeLa細胞(Hirosawa, M. et al. Cell-type-specific genome editing with a microRNA-responsive CRISPR-Cas9 switch. Nucleic Acids Res. 45, (2017))に同時トランスフェクトした。コントロール及びmiR-302a-5p応答性CaVTとは異なり、miR-21-5p応答性CaVTはアポトーシスを誘発しなかった。miR-21-5p阻害剤の添加によりアポトーシス誘導が回復したことから、アポトーシス誘導の消失は、内因性のmiR-21-5pを介したCaVTの抑制によって引き起こされたことが示された（図14b及び図15、16）。
【0128】
次に、miRNA応答性CaVTが細胞選択的なゲノム編集に使用できるか否かを調べた。この目的のために、HeLa細胞及びhiPSCのEGFP発現安定細胞株に、1xMS2（U）site2-SpCas9、2xScMS2（C）-AcrIIA4、EGFPターゲティングsgRNA、及びmiRNA応答性CaVT mRNA又は従来のCaVT mRNAで構成されるゲノム編集回路を同時トランスフェクトした（図14c）。アポトーシス誘導回路の場合と同様に、HeLa細胞では、miR-302a-5p応答性CaVTにより誘導されるEGFPノックアウトは、従来のCaVTによるものと同程度の効率的であった。対照的に、miR-21-5p応答性CaVTのEGFPノックアウトを誘導する効率は非常に低く、非処理細胞と同様のレベルであった（図14d上部及び図17a）。これらの結果は、HeLa細胞における低いmiR-302a-5p活性と高いmiR-21-5p活性と一致している。高いmiR-302a-5p及び中程度のmiR-21-5pの発現を示すhiPS細胞では、miR-302a-5p及びmiR-21-5p応答性CaVTによって誘導されるEGFPノックアウト効率は、それぞれ従来のCaVTの約1/4及び1/2倍であった（図14d下部及び図17b）。これらの結果から、CaVTが、細胞選択的調節を達成するためのRNA回路において有用なコンポーネントになり得ることが示された。
【0129】
実施例６：スプリットCaVTによる薬物誘導性翻訳活性化の検証
薬物制御可能な遺伝子発現システムは、適切なレベル及び時間で遺伝子発現を調節できる。薬物で制御可能な人工転写活性化因子（例えば、テトラサイクリン誘導性トランス活性化因子）は、DNA回路に広く使用されているが、RNA回路には適用できない。RNA回路の条件付き遺伝子調節に適用可能な薬物制御可能なCaVTを構築するために、薬物応答性DmrA-DmrCヘテロ二量体化システム（ラパマイシン応答性FKBP-FRBヘテロ二量体化システムのバリアント）を利用した。DmrCとDmrAとは、A/C Heterodimerizerの存在下で互いに結合する（Liberles, S. D., Diver, S. T., Austin, D. J. & Schreiber, S. L. Inducible gene expression and protein translocation using nontoxic ligands identified by a mammalian three-hybrid screen. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 7825-7830 (1997)、Bayle, J. H. et al. Rapamycin analogs with differential binding specificity permit orthogonal control of protein activity. Chem. Biol. 13, 99-107 (2006)）。MS2CP（又はそのV29I変異体）とVPgタンパク質（FCV）をそれぞれDmrA及びDmrCと融合させ、dimerizerの存在下のみでVPgタンパク質（FCV）が標的mRNAと相互作用するようにした（図18a）。次に、標的mRNAの12のバリアント（2つの修飾ヌクレオシド組成（N1mΨ又はΨ/5mC）を有する、図5aに示す6つの構造体）、MS2CP-1xDmrA mRNA、及びDmrC-VPg（FCV）mRNAを、HeLa細胞に同時トランスフェクトし、dimerizerの存在下又は非存在下で細胞をインキュベートした。標的mRNAの翻訳活性化は全ての組み合わせで観察されたが、ヌクレオシド修飾とモチーフバリアントの最適な組み合わせは、Uバリアントを有するN1mΨ含有mRNAであった（図18b、c、及び図19、20）が、このことは従来のCaVTの結果と一致している（図5及び図11）。ただし、従来のCaVTの場合とは異なり、MS2結合モチーフの最も適切な位置は、薬物制御可能なCaVTのsite1であった。dimerizerを介した翻訳活性化がMS2CP-1xDmrA-DmrC-VPg（FCV）の相互作用依存的なメカニズムにより誘導されたことを確認するために、MS2CP-1xDmrA又はDmrC-VPg（FCV）を有さない細胞にdimerizerを導入した。dimerizerによる翻訳活性化は、MS2CP-1xDmrAとDmrC-VPg（FCV）の両方が存在する場合にのみ観察された（図21）。薬物制御可能なCaVTの用量依存性を確認するために、1xMS2（U）site1-hmAG1 mRNA、MS2CP-1xDmrA mRNA、及びDmrC-VPg（FCV） mRNAの同時トランスフェクションを行った後、様々な濃度でdimerizerを含む培地で細胞をインキュベートした。図18d、e、及び図22に示すように、翻訳の用量依存的な増加が観察された。最後に、タイムラプス画像をキャプチャして薬物制御可能なCaVTの応答時間を調べた。dimerizer添加の3時間後には、hmAG1蛍光の増加が観察された（図18f）。これらの結果から、薬物制御可能なCaVTシステムによる合成mRNAからの条件付き翻訳活性化を達成できることが示された。
薬物制御可能な遺伝子発現システムは、適切なレベル及び時間で遺伝子発現を調節できる。薬物で制御可能な人工転写活性化因子（例えば、テトラサイクリン誘導性トランス活性化因子）は、DNA回路に広く使用されているが、RNA回路には適用できない。RNA回路の条件付き遺伝子調節に適用可能な薬物制御可能なCaVTを構築するために、薬物応答性DmrA-DmrCヘテロ二量体化システム（ラパマイシン応答性FKBP-FRBヘテロ二量体化システムのバリアント）を利用した。DmrCとDmrAとは、A/C Heterodimerizerの存在下で互いに結合する（Liberles, S. D., Diver, S. T., Austin, D. J. & Schreiber, S. L. Inducible gene expression and protein translocation using nontoxic ligands identified by a mammalian three-hybrid screen. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 7825-7830 (1997)、Bayle, J. H. et al. Rapamycin analogs with differential binding specificity permit orthogonal control of protein activity. Chem. Biol. 13, 99-107 (2006)）。MS2CP（又はそのV29I変異体）とVPgタンパク質（FCV）をそれぞれDmrA及びDmrCと融合させ、dimerizerの存在下のみでVPgタンパク質（FCV）が標的mRNAと相互作用するようにした（図18a）。次に、標的mRNAの12のバリアント（2つの修飾ヌクレオシド組成（N1mΨ又はΨ/5mC）を有する、図5aに示す6つの構造体）、MS2CP-1xDmrA mRNA、及びDmrC-VPg（FCV）mRNAを、HeLa細胞に同時トランスフェクトし、dimerizerの存在下又は非存在下で細胞をインキュベートした。標的mRNAの翻訳活性化は全ての組み合わせで観察されたが、ヌクレオシド修飾とモチーフバリアントの最適な組み合わせは、Uバリアントを有するN1mΨ含有mRNAであった（図18b、c、及び図19、20）が、このことは従来のCaVTの結果と一致している（図5及び図11）。ただし、従来のCaVTの場合とは異なり、MS2結合モチーフの最も適切な位置は、薬物制御可能なCaVTのsite1であった。dimerizerを介した翻訳活性化がMS2CP-1xDmrA-DmrC-VPg（FCV）の相互作用依存的なメカニズムにより誘導されたことを確認するために、MS2CP-1xDmrA又はDmrC-VPg（FCV）を有さない細胞にdimerizerを導入した。dimerizerによる翻訳活性化は、MS2CP-1xDmrAとDmrC-VPg（FCV）の両方が存在する場合にのみ観察された（図21）。薬物制御可能なCaVTの用量依存性を確認するために、1xMS2（U）site1-hmAG1 mRNA、MS2CP-1xDmrA mRNA、及びDmrC-VPg（FCV） mRNAの同時トランスフェクションを行った後、様々な濃度でdimerizerを含む培地で細胞をインキュベートした。図18d、e、及び図22に示すように、翻訳の用量依存的な増加が観察された。最後に、タイムラプス画像をキャプチャして薬物制御可能なCaVTの応答時間を調べた。dimerizer添加の3時間後には、hmAG1蛍光の増加が観察された（図18f）。これらの結果から、薬物制御可能なCaVTシステムによる合成mRNAからの条件付き翻訳活性化を達成できることが示された。
【0130】
実施例７：タンパク質応答型スイッチによる翻訳活性化の検証
本実施例で用いる検証システムの概要を図23として示す。上記＜タンパク質応答性スイッチの作製＞に記載の方法により作製したmRNAを、ThermoFisher Scientific社Lipofectamine messengerMAXを用いて1xMS2(U)site1-hmAG1 mRNAとともにHeLa細胞にトランスフェクションし、その翌日にBD Biosciences社AccuriC6にて蛍光を測定した。結果を図24に示す。標的タンパク質の添加により、翻訳活性化が認められた。
本実施例で用いる検証システムの概要を図23として示す。上記＜タンパク質応答性スイッチの作製＞に記載の方法により作製したmRNAを、ThermoFisher Scientific社Lipofectamine messengerMAXを用いて1xMS2(U)site1-hmAG1 mRNAとともにHeLa細胞にトランスフェクションし、その翌日にBD Biosciences社AccuriC6にて蛍光を測定した。結果を図24に示す。標的タンパク質の添加により、翻訳活性化が認められた。
【0131】
実施例８：ＭＳＣＰ２以外のＲＮＡ結合タンパク質を用いた翻訳制御の検証
hLIN28A-VPg(FCV) mRNAを、hLIN28Aに対する弱い結合モチーフを5’UTRに持つmRNAであるpreElet7d-hmAG1とともにLipofectamine messengerMAXにてHeLa細胞にトランスフェクションし、その翌日にAccuriC6にてhmAG1の蛍光を測定したところ、hLIN28A-VPg(FCV)によるhmAG1の翻訳活性化が認められた。一方、preElet7d-hmAG1よりも強い結合モチーフを持つmRNAであるStbC-hmAG1では、hLIN28A-VPg(FCV)による翻訳活性化効果は低く抑えられた（図25）。
また、L7Ae-VPg(FCV) mRNAを、L7Aeに対する強い結合モチーフであるK-turn variant 5 (KtV5) を5’UTR内に持つKtV5-hmAG1 mRNA（CapアナログとしてはARCAを有する）とともに同様の手順にてHeLa細胞にトランスフェクションして蛍光を測定したところ、L7Ae-VPg(FCV)によるKtV5-hmAG1の翻訳抑制が観察された（図26）。
hLIN28A-VPg(FCV) mRNAを、hLIN28Aに対する弱い結合モチーフを5’UTRに持つmRNAであるpreElet7d-hmAG1とともにLipofectamine messengerMAXにてHeLa細胞にトランスフェクションし、その翌日にAccuriC6にてhmAG1の蛍光を測定したところ、hLIN28A-VPg(FCV)によるhmAG1の翻訳活性化が認められた。一方、preElet7d-hmAG1よりも強い結合モチーフを持つmRNAであるStbC-hmAG1では、hLIN28A-VPg(FCV)による翻訳活性化効果は低く抑えられた（図25）。
また、L7Ae-VPg(FCV) mRNAを、L7Aeに対する強い結合モチーフであるK-turn variant 5 (KtV5) を5’UTR内に持つKtV5-hmAG1 mRNA（CapアナログとしてはARCAを有する）とともに同様の手順にてHeLa細胞にトランスフェクションして蛍光を測定したところ、L7Ae-VPg(FCV)によるKtV5-hmAG1の翻訳抑制が観察された（図26）。
【産業上の利用可能性】
【0132】
本発明によれば、ゲノムへの挿入のリスクを低減しつつ、１種類の翻訳制御タンパク質の複合体のみを用いて、目的のタンパク質の翻訳の活性化と抑制を同時に達成することが可能となり、より簡便な、かつより副作用の少ない、細胞へのアポトーシスの誘導やゲノム編集が可能となる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20-1】
【図20-2】
【図20-3】
【図20-4】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】