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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-22
(45)【発行日】2024-07-30
(54)【発明の名称】マウス大腸蟯虫の検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20240723BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20240723BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
C12Q1/6888 Z
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2020118717
(22)【出願日】2020-07-09
(65)【公開番号】P2022015698
(43)【公開日】2022-01-21
【審査請求日】2023-06-06
(73)【特許権者】
【識別番号】304020177
【氏名又は名称】国立大学法人山口大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100102255
【弁理士】
【氏名又は名称】小澤 誠次
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100198074
【弁理士】
【氏名又は名称】山村 昭裕
(74)【代理人】
【氏名又は名称】富田 博行
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(72)【発明者】
【氏名】水上 洋一
(72)【発明者】
【氏名】諌山 慧士朗
【審査官】藤井 美穂
(56)【参考文献】
【文献】Veterinary Parasitology，2008年，Vol.153，p.379-383
【文献】日本分子生物学会年会講演要旨集，2019年，Vol. 第42回，#2P-0671
【文献】腸内細菌学雑誌，2006年，Vol.20，p.259-262
【文献】動衛研ニュース，2010年，No.38，p.10
【文献】BioTechniques，2005年，Vol.38, No.4, ，p.605-610
【文献】Molecular and Cellular Probes，2003年，Vol.17，p.253-259
【文献】Database DDBJ/EMBL/GenBank [online], Accession No. EU263107.2, 03-JUN-2008 uploaded, [2024年04月24日検索], Definition: Aspiculuris tetraptera internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence，<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU263107>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程（ａ）～（ｃ）を含むことを特徴とする、マウス大腸蟯虫の検出方法。（ａ）被験マウスの糞を含む液を、ビーズ存在下でホモジナイズ処理した後、アルコール沈殿処理を行うことにより糞試料を調製する工程；
（ｂ）調製した糞試料と、以下のプライマーセット（i）及びプローブ（ii）とを用いてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行う工程；
（i）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２（Internal Transcribed Spacer 2）領域のＤＮＡを増幅可能なプライマーセットであって、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含み、かつ、配列番号２の７番目のヌクレオチド残基及び１６番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡ（locked nucleic acid）であるフォワードプライマーと、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含み、かつ、配列番号３の１０番目のヌクレオチド残基及び１８番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡであるリバースプライマーとからなる、前記プライマーセット
（ii）前記プライマーセットにより増幅される、マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２領域のＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、５’末端が蛍光物質で標識され、３’末端がクエンチャー物質で標識され、かつ、配列番号４に示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含み、配列番号４の７番目のヌクレオチド残基及び１５番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡである、前記プローブ
（ｃ）蛍光物質由来の蛍光シグナルを検出する工程；
【請求項2】
アルコール沈殿処理がエタノール沈殿処理であることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項3】
以下のプライマーセット（i）及びプローブ（ii）を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の検出方法に用いるためのキット。（i）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２（Internal Transcribed Spacer 2）領域のＤＮＡを増幅可能なプライマーセットであって、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含み、かつ、配列番号２の７番目のヌクレオチド残基及び１６番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡ（locked nucleic acid）であるフォワードプライマーと、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含み、かつ、配列番号３の１０番目のヌクレオチド残基及び１８番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡであるリバースプライマーとからなる、前記プライマーセット
（ii）前記プライマーセットにより増幅される、マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２領域のＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、５’末端が蛍光物質で標識され、３’末端がクエンチャー物質で標識され、かつ、配列番号４に示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含み、配列番号４の７番目のヌクレオチド残基及び１５番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡである、前記プローブ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マウスがマウス大腸蟯虫（Aspiculuris tetraptera）に寄生しているか否かを検出する方法や、かかる方法に用いるためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
マウス大腸蟯虫は、実験マウスにおいて最も頻繁に検出される寄生性蟯虫である。蟯虫に感染した実験マウスは、自己免疫疾患の発症率が増加する；リンパ腫の発生率が増加する；飼料中の抗原に対するアレルギー反応が亢進する；等の影響が認められることが知られている。このため、実験結果に与える影響を排除するためにも、蟯虫に感染していない実験マウスを用いることが望ましい。
【0003】
マウスがマウス大腸蟯虫に感染していることは、結腸内容物中に存在する成虫や卵を顕微鏡下で直接観察することにより確認することができる。この方法の信頼性は高いものの、結腸内容物を採取するためにマウスを安楽死させる必要がある。一方、マウスを安楽死させずに、マウスがマウス大腸蟯虫に感染していることを確認する方法として、マウスの糞を採取し、マウス大腸蟯虫卵のゲノムＤＮＡをＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）により検出する方法が報告されている（非特許文献１～４）。また、蟯虫卵が有する自家蛍光を指標として、蟯虫卵を検出する方法も報告されている（特許文献１）。
【0004】
ＰＣＲは、これまでは、ＤＮＡのみからなるプライマーセットを用いて実施されるケースが多かったが、最近では、相補鎖に対する熱安定性に優れたＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）を含有するプライマーセットを使用するケースが増えている。例えば、ＬＮＡを含有するプライマーセットは、等温核酸増幅法において、バックグラウンドシグナルを抑制できることが報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２０１２－８０４２号公報
【文献】特表２００４－５２６４３２号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】Leblanc, M., et al. J Am Assoc Lab Anim Sci.2014.
【文献】Gerwin, P.M., et al. J Am Assoc LabAnim Sci. 2017;56: 32-41.
【文献】Dole, V.S., et al. J Am Assoc LabAnim Sci. 2011;50: 904-909.
【文献】Parel, J.D.C., et al. Vet Parasitol.2008;153: 379-383.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の課題は、比較的簡便にマウス由来の糞試料を調製でき、かつ、当該糞試料中に含まれるマウス大腸蟯虫由来のゲノムＤＮＡを感度よく定量的に検出できる方法やキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２（Internal Transcribed Spacer 2）領域のＤＮＡを特異的に増幅するＬＮＡ含有プライマーセットと、当該領域のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするＬＮＡ含有TaqMan（蛍光）プローブとを用いたTaqManプローブアッセイ（すなわち、ハイブリダイゼーション法によるＰＣＲ）を行うと、ＬＮＡ非含有のプライマーセット及びTaqManプローブを用いたTaqManプローブアッセイを行った場合や、ＬＮＡ非含有のプライマーセットを用いたSYBR Greenアッセイ（すなわち、インターカレーション法によるＰＣＲ）を行った場合と比べ、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを、感度よく定量的に検出できることを見いだした。さらに、TaqManプローブアッセイに用いる糞試料の処理条件について検討した結果、マウスの糞からエタノール沈殿処理により糞試料を調製すると、他の処理（加熱処理、ＢＳＡ処理、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００処理、又はＴｗｅｅｎ－２０処理）により糞試料を調製した場合と比べ、糞試料に含まれるマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを、感度よく定量的に検出できることを確認した。本発明は、これら知見に基づき、完成するに至ったものである。
【0009】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下の工程（ａ）～（ｃ）を含むことを特徴とする、マウス大腸蟯虫の検出方法。
（ａ）被験マウスの糞を含む液を、ビーズ存在下でホモジナイズ処理した後、アルコール沈殿処理を行うことにより糞試料を調製する工程；
（ｂ）調製した糞試料と、以下のプライマーセット（i）及びプローブ（ii）とを用いてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行う工程；
（i）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２（Internal Transcribed Spacer 2）領域のＤＮＡを増幅可能なプライマーセットであって、１又は２以上のＬＮＡ（locked nucleic acid）を含むフォワードプライマーと、１又は２以上のＬＮＡを含むリバースプライマーとからなる、前記プライマーセット
（ii）前記プライマーセットにより増幅される、マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２領域のＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、５’末端が蛍光物質で標識され、３’末端がクエンチャー物質で標識され、かつ、１又は２以上のＬＮＡを含む、前記プローブ
（ｃ）蛍光物質由来の蛍光シグナルを検出する工程；
〔２〕フォワードプライマーが、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーであって、配列番号２の７番目のヌクレオチド残基及び１６番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡである、前記フォワードプライマーであり、
リバースプライマーが、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含むリバースプライマーであって、配列番号３の１０番目のヌクレオチド残基及び１８番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡである、前記リバースプライマーであり、
プローブが、配列番号４に示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブであって、配列番号４の７番目のヌクレオチド残基及び１５番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡである、前記プローブ
であることを特徴とする上記〔１〕に記載の検出方法。
〔３〕アルコール沈殿処理がエタノール沈殿処理であることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の検出方法。
〔４〕以下のプライマーセット（i）及びプローブ（ii）を含むことを特徴とする、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の検出方法に用いるためのキット。
（i）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２（Internal Transcribed Spacer 2）領域のＤＮＡを増幅可能なプライマーセットであって、１又は２以上のＬＮＡ（locked nucleic acid）を含むフォワードプライマーと、１又は２以上のＬＮＡを含むリバースプライマーとからなる、前記プライマーセット
（ii）前記プライマーセットにより増幅される、マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２領域のＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、５’末端が蛍光物質で標識され、３’末端がクエンチャー物質で標識され、かつ、１又は２以上のＬＮＡを含む、前記プローブ
〔５〕フォワードプライマーが、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーであって、配列番号２の７番目のヌクレオチド残基及び１６番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡである、前記フォワードプライマーであり、
リバースプライマーが、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含むリバースプライマーであって、配列番号３の１０番目のヌクレオチド残基及び１８番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡである、前記リバースプライマーであり、
プローブが、配列番号４に示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブであって、配列番号４の７番目のヌクレオチド残基及び１５番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡである、前記プローブ
であることを特徴とする上記〔４〕に記載のキット。
〔１〕以下の工程（ａ）～（ｃ）を含むことを特徴とする、マウス大腸蟯虫の検出方法。
（ａ）被験マウスの糞を含む液を、ビーズ存在下でホモジナイズ処理した後、アルコール沈殿処理を行うことにより糞試料を調製する工程；
（ｂ）調製した糞試料と、以下のプライマーセット（i）及びプローブ（ii）とを用いてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行う工程；
（i）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２（Internal Transcribed Spacer 2）領域のＤＮＡを増幅可能なプライマーセットであって、１又は２以上のＬＮＡ（locked nucleic acid）を含むフォワードプライマーと、１又は２以上のＬＮＡを含むリバースプライマーとからなる、前記プライマーセット
（ii）前記プライマーセットにより増幅される、マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２領域のＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、５’末端が蛍光物質で標識され、３’末端がクエンチャー物質で標識され、かつ、１又は２以上のＬＮＡを含む、前記プローブ
（ｃ）蛍光物質由来の蛍光シグナルを検出する工程；
〔２〕フォワードプライマーが、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーであって、配列番号２の７番目のヌクレオチド残基及び１６番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡである、前記フォワードプライマーであり、
リバースプライマーが、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含むリバースプライマーであって、配列番号３の１０番目のヌクレオチド残基及び１８番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡである、前記リバースプライマーであり、
プローブが、配列番号４に示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブであって、配列番号４の７番目のヌクレオチド残基及び１５番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡである、前記プローブ
であることを特徴とする上記〔１〕に記載の検出方法。
〔３〕アルコール沈殿処理がエタノール沈殿処理であることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の検出方法。
〔４〕以下のプライマーセット（i）及びプローブ（ii）を含むことを特徴とする、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の検出方法に用いるためのキット。
（i）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２（Internal Transcribed Spacer 2）領域のＤＮＡを増幅可能なプライマーセットであって、１又は２以上のＬＮＡ（locked nucleic acid）を含むフォワードプライマーと、１又は２以上のＬＮＡを含むリバースプライマーとからなる、前記プライマーセット
（ii）前記プライマーセットにより増幅される、マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２領域のＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、５’末端が蛍光物質で標識され、３’末端がクエンチャー物質で標識され、かつ、１又は２以上のＬＮＡを含む、前記プローブ
〔５〕フォワードプライマーが、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーであって、配列番号２の７番目のヌクレオチド残基及び１６番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡである、前記フォワードプライマーであり、
リバースプライマーが、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含むリバースプライマーであって、配列番号３の１０番目のヌクレオチド残基及び１８番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡである、前記リバースプライマーであり、
プローブが、配列番号４に示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブであって、配列番号４の７番目のヌクレオチド残基及び１５番目のヌクレオチド残基が、それぞれＬＮＡである、前記プローブ
であることを特徴とする上記〔４〕に記載のキット。
【0010】
また本発明の実施の他の形態として、
上記工程（ａ）～（ｃ）を含み、かつ、工程（ｃ）の後、蛍光物質由来の蛍光シグナルが検出された場合、前記被験マウスは、マウス大腸蟯虫に感染している又は感染している可能性が高いと判定する工程（ｐ）を含む、マウス大腸蟯虫感染の判定方法；や、
上記プライマーセット（i）及びプローブ（ii）を含む、かかる判定方法に用いるためのマウス大腸蟯虫感染判定用キット；
を挙げることができる。
上記工程（ａ）～（ｃ）を含み、かつ、工程（ｃ）の後、蛍光物質由来の蛍光シグナルが検出された場合、前記被験マウスは、マウス大腸蟯虫に感染している又は感染している可能性が高いと判定する工程（ｐ）を含む、マウス大腸蟯虫感染の判定方法；や、
上記プライマーセット（i）及びプローブ（ii）を含む、かかる判定方法に用いるためのマウス大腸蟯虫感染判定用キット；
を挙げることができる。
【発明の効果】
【0011】
本発明によると、比較的簡便にマウス由来の糞試料を調製でき、かつ、当該糞試料中に含まれるマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを感度よく定量的に検出できる。このため、実験マウスにおける、マウス大腸蟯虫の感染の有無や程度を、実験マウスを安楽死させることなく、比較的簡便かつ感度よく検出・判定することができ、マウス大腸蟯虫感染実験マウスの早期発見と、マウス大腸蟯虫の早期駆除に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図１Ａは、対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーのアニール温度を５１．０～６９．０℃の範囲内に設定し、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、当該ＤＮＡを検出した結果を示す図である。図中の「Ｍ」はサイズマーカーを示す（以下、同じ）。図２Ｂは、対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーの濃度を９．１～３００ｎＭの範囲内に設定し、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、当該ＤＮＡを検出した結果を示す図である。図１Ｃは、ＰＣＲサイクル数を２０～３５の範囲内に設定し、１０～１０００コピーの陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、当該ＤＮＡを検出した結果を示す図である。図１Ｄは、図１Ｃの結果で得られたバンドのシグナル強度を測定した結果（平均値±標準誤差［ＳＥ］、ｎ＝３）を示す図である。図中の「Ｒ２」は決定係数を示す。
【図2】図２Ａは、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡ（図中の「ゲノムＤＮＡ」）を鋳型としてＰＣＲを行い、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを検出した結果を示す図である。図中の「ＰＣ」は、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、当該ＤＮＡを検出した結果を示す図である。図２Ｂは、図２Ａの結果で得られたバンドのシグナル強度を測定した結果（平均値±標準誤差［ＳＥ］、ｎ＝３）を示す図である。
【図3】図３Ａ及びＢは、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを鋳型とし、４種類のアッセイ（本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイ［図中の「TaqMan－ＬＮＡ」］；対照プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイ［図中の「TaqMan－Ｎｏｒｍａｌ」］；本件プライマーセットを用いたSYBR Greenアッセイ［図中の「ＳＹＢＲ－ＬＮＡ」］；及び対照プライマーセットを用いたSYBR Greenアッセイ［図中の「ＳＹＢＲ－Ｎｏｒｍａｌ」］）によるＰＣＲを行い、当該ＤＮＡを検出（図３Ａ）及び定量（図３Ｂ）した結果を示す図である。図３Ｃは、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡ（図中の「ゲノムＤＮＡ」）を鋳型とし、本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイによるＰＣＲを行い、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを定量した結果を示す図である。
【図4】図４Ａは、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを含む糞含有液（図中の「８、４０、２００μｇの糞量」）から得られた上清を鋳型としてＰＣＲを行い、当該ＤＮＡを検出した結果を示す図である。図４Ｂは、かかる上清を加熱処理したものを鋳型としてＰＣＲを行い、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを検出した結果を示す図である。図４Ｃは、上記上清を加熱処理し、さらに、ＢＳＡ処理したもの（図４Ｃの「ＢＳＡ」）、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００処理したもの（図４Ｃの「ＴｒｉｔｏｎＸ」）、又はＴｗｅｅｎ－２０処理したもの（図４Ｃの「Ｔｗｅｅｎ２０」）を鋳型としてＰＣＲを行い、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを検出した結果を示す図である。図４Ｄは、上記上清をエタノール沈殿処理したものを鋳型としてＰＣＲを行い、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域ＤＮＡを検出した結果を示す図である。図中の「ＰＣ」は、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、当該ＤＮＡを検出した結果を示す図である。
【図5】エタノール沈殿処理によりマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡ（図中の「ゲノムＤＮＡ」）を含む糞試料を調製し、本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイを行い、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを定量した結果（平均値±標準誤差［ＳＥ］、ｎ＝３）を示す図である。
【図6】図６Ａ及びＢは、マウス大腸蟯虫感染が不明なマウスを８種類のケージ（＃１～８）で飼育し、これらケージ内の糞からエタノール沈殿処理により糞試料を調製し、本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイを行い、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを検出（図６Ａ）及び定量（図６Ｂ）した結果を示す図である。図６Ｃａは、ケージ＃８で飼育したマウス由来の結腸内容物に含まれるマウス大腸蟯虫の成虫の顕微鏡画像である。図６Ｃｂは、ケージ＃８で飼育したマウス由来の糞に含まれるマウス大腸蟯虫の卵の顕微鏡画像である。図６Ｃａ及びＣｂにおいて、サイズバーは、それぞれ５００μｍ及び５０μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明のマウス大腸蟯虫の検出方法としては、被験マウスの糞を含む液を、ビーズ存在下でホモジナイズ処理した後、アルコール沈殿処理を行うことにより糞試料を調製する工程（ａ）；調製した糞試料と、以下のプライマーセット（i）及びプローブ（ii）とを用いてＰＣＲを行う工程（ｂ）；及び、蛍光物質由来の蛍光シグナルを検出する工程（ｃ）；を順次含む、マウス大腸蟯虫を検出する方法（以下、「本件検出方法」ということがある）であれば特に制限されない。
（i）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２領域のＤＮＡ（以下、「本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡ」ということがある）を増幅可能なプライマーセットであって、１又は２以上のＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）を含むフォワードプライマー（以下、「本件フォワードプライマー」ということがある）と、１又は２以上のＬＮＡを含むリバースプライマー（以下、「本件リバースプライマー」ということがある）とからなる、前記プライマーセット（以下、「本件プライマーセット」ということがある）
（ii）本件プライマーセットにより増幅される本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、５’末端が蛍光物質で標識され、３’末端がクエンチャー物質で標識され、かつ、１又は２以上のＬＮＡを含む、前記プローブ（以下、「本件プローブ」ということがある）
（i）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２領域のＤＮＡ（以下、「本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡ」ということがある）を増幅可能なプライマーセットであって、１又は２以上のＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）を含むフォワードプライマー（以下、「本件フォワードプライマー」ということがある）と、１又は２以上のＬＮＡを含むリバースプライマー（以下、「本件リバースプライマー」ということがある）とからなる、前記プライマーセット（以下、「本件プライマーセット」ということがある）
（ii）本件プライマーセットにより増幅される本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡにハイブリダイズするプローブであって、５’末端が蛍光物質で標識され、３’末端がクエンチャー物質で標識され、かつ、１又は２以上のＬＮＡを含む、前記プローブ（以下、「本件プローブ」ということがある）
【0014】
また、本発明のマウス大腸蟯虫検出用キットとしては、「本件検出方法に用いるため」という用途に特定された、本件プライマーセットと本件プローブとを含むキット（以下、「本件キット」ということがある）であれば特に制限されない。本件キットは、マウス大腸蟯虫を検出するためのキットに関する用途発明であり、これらキットには、一般にこの種の検出キットに用いられる成分、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤、本件検出方法の工程（ａ）において使用するビーズの他、取扱説明書、マウス大腸蟯虫を検出するための説明書等の添付文書が含まれ得る。
【0015】
本明細書において、「マウス大腸蟯虫」とは、マウス大腸蟯虫の個体（幼虫、成虫）及び／又はマウス大腸蟯虫の卵を意味する。
【0016】
本明細書において、「ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）」とは、下記の化学式に示すとおり、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）において、リボヌクレオチドの２’位の酸素原子と４’位の炭素原子をメチレンで架橋（リボースをC3′- endo型で固定）した架橋型人工核酸を意味し、２’，４’－ＢＮＡ（Bridged Nucleic Acid）とも呼ばれている。
【0017】
【化1】
【0018】
上記被験マウスとしては、マウス大腸蟯虫の感染のおそれがあるハツカネズミ属（Mus）のネズミであればよく、例えば、ハツカネズミ（Mus musculus）、アルジェリアハツカネズミ（Mus spretus）、オキナワハツカネズミ（Mus caroli）、スリランカハツカネズミ（Mus mayori）、インドハツカネズミ（Mus booduga）、ケニアハツカネズミ（Mus sorella）等を挙げることができ、ハツカネズミ（Mus musculus）を好適に例示することができる。上記被験マウスとしては、野生マウスであっても、実験に使用されるマウス（例えば、ヌードマウス、トランスジェニックマウス、ノックアウトマウス）であってもよい。
【0019】
上記工程（ａ）において、ビーズ存在下でホモジナイズ処理する方法としては、被験マウスの糞中に含まれるマウス大腸蟯虫を、ビーズを用いて破砕、粉砕、及び／又は溶解できる方法であればよく、例えば、ビーズクラッシャー（μＴ－１２、TAITEC社製）、Precellys（Bertin Instruments社製）、Shake master NEO（バイオメディカルサイエンス社製）等のビーズ式ホモジナイザーを用いた方法を挙げることができる。
【0020】
上記工程（ａ）において、使用するビーズの材質、形状、大きさ等は、被験マウスの糞を含む液を、ビーズ存在下でホモジナイズ処理したときに、糞に含まれるマウス大腸蟯虫を破砕し得るものであればよく、ビーズの材質としては、例えば、ジルコニア（二酸化ジルコニウム）、ジルコニウム、石英、シリカ、ステンレス、酸化マグネシウム、酸化チタン、酸化マンガン、マグネシウム、チタン、マンガン等を挙げることができる。また、ビーズの形状としては、略球状を挙げることができ、球状が好ましい。また、ビーズの大きさとしては、例えば、最長部分の長さが０．０２～３．０ｍｍの範囲内、好ましくは０．０５～１．０ｍｍ、より好ましくは０．１～０．６ｍｍである。
【0021】
上記工程（ａ）において、ホモジナイズ処理するときの糞の量としては、例えば、液（溶媒）１ｍＬ当たり１００μｇ～１ｇの範囲内、好ましくは１～６００ｍｇ、より好ましくは３～３００ｍｇ、さらに好ましくは６～１００ｍｇ、さらにより好ましくは１０～８０ｍｇである。
【0022】
上記工程（ａ）において、ホモジナイズ処理するときのビーズの量としては、例えば、液（溶媒）１ｍＬ当たり１ｍｇ～１０ｇの範囲内、好ましくは１０ｍｇ～２ｇ、より好ましくは４０ｍｇ～１ｇ、さらに好ましくは８０～８００ｍｇ、さらにより好ましくは１００～５００ｍｇである。
【0023】
上記工程（ａ）におけるアルコール沈殿処理としては、ＤＮＡが主成分であるＰＣＲ産物を、負に帯電したＤＮＡを中和できる塩と、アルコールとの存在下で凝集させ、沈殿を得る（コロイドの塩析）方法であればよく、ここで「負に帯電したＤＮＡを中和できる塩」としては、例えば、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム等を挙げることができ、酢酸ナトリウムを好適に例示することができる。また、アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール等を挙げることができ、エタノールを好適に例示することができる。ＤＮＡをより効率よく沈殿させるために、キャリア（例えば、グリコーゲンやｔＲＮＡ）を添加してもよい。ＰＣＲ産物由来の沈殿物は、目視でできれば、当該沈殿物をそのまま回収してもよいが、目視できなければ、市販の遠心分離装置を用いた遠心処理により沈殿させる。ＤＮＡをより効率よく沈殿させるために、遠心処理前に、冷却処理（例えば、０～－３５℃の範囲内で、１０分～２時間冷却処理）してもよい。遠心処理後は、塩を完全に除去するために、アルコール（好ましくは、アルコール沈殿処理で使用したアルコールと同じ種類のアルコール）で洗浄することが好ましい。沈殿物は、液中に懸濁・溶解し、工程（ｂ）のＰＣＲに用いる。
【0024】
本明細書において、「被験マウスの糞を含む液」の溶媒や、上記沈殿物を懸濁・溶解する溶媒（液）としては、等張液、低張液、及び高張液のいずれでもよい。かかる液としては、例えば、純水、緩衝効果のある水（例えば、ＴＥ緩衝液［Ｔｒｉｓ-ＥＤＴＡ緩衝液］、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液）、生理食塩水、緩衝効果のある生理食塩水（例えば、ＴＥ緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］）等を挙げることができる。液のｐＨは、例えば、５．０～１０．０の範囲内であり、好ましくは、６．０～９．０である。
【0025】
上記工程（ａ）において、ホモジナイズ処理及びアルコール沈殿処理に加えて、これら以外の処理、例えば、フェノール、クロロホルム等の疎水性有機溶媒を用いた処理；ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０等の界面活性剤を用いた処理；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、バクテリオファージ由来Ｔ４遺伝子３２タンパク質等のＰＣＲ阻害物質吸着性タンパク質を添加する処理；プロテイナーゼＫ（Proteinase K）、アミラーゼ等の分解酵素を用いた処理；などにより、糞試料を調製してもよいが、ホモジナイズ処理及びアルコール沈殿処理以外の処理がなくても、糞試料中に含まれるマウス大腸蟯虫由来のゲノムＤＮＡを感度よく定量的に検出できるため、簡便性も考慮すると、ホモジナイズ処理及びアルコール沈殿処理以外の上記処理を行わないで、糞試料を調製することが好ましい。
【0026】
上記工程（ｂ）におけるＰＣＲは、具体的には、ハイブリダイゼーション法によるＰＣＲである。ハイブリダイゼーション法によるＰＣＲは、本件プライマーセットにより本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡが増幅される工程において、ＤＮＡポリメラーゼが有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、本件プライマーセットにより増幅される本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡにハイブリダイズした本件プローブが分解され、蛍光物質が本件プローブから遊離し、クエンチャー物質によるクエンチング（消光）が解除され、その結果生じた蛍光物質由来の蛍光シグナルを指標として、ＰＣＲ産物（すなわち、本件プライマーセットにより増幅される本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡ）を検出・定量する方法である。したがって、工程（ｂ）におけるＰＣＲは、インターカレーション法によるＰＣＲ、すなわち、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等の二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光物質が、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡに取り込まれ、取り込まれた蛍光物質の蛍光シグナルを指標として、ＰＣＲ産物を検出・定量する方法とは異なる。
【0027】
本件プローブにおける蛍光物質及びクエンチャー物質の組合せとしては、プローブがインタクトで存在するときは、クエンチャー物質により蛍光物質由来の蛍光シグナルが消光され、プローブの分解により蛍光物質がプローブから遊離したときは、クエンチャー物質による消光が抑制され、蛍光物質由来の蛍光シグナルが検出されるという効果を発揮し得るものであればよく、例えば、ＦＡＭ（蛍光物質）及びＩＢＦＱ（クエンチャー物質）、ＦＡＭ（蛍光物質）及びＴＡＭＲＡ（クエンチャー物質）、ＴＥＴ（蛍光物質）及びＩＢＦＱ（クエンチャー物質）、ＨＥＸ（蛍光物質）及びＩＢＦＱ（クエンチャー物質）、Ｃｙ５（蛍光物質）及びＩＢＦＱ（クエンチャー物質）、ＦＡＭ（蛍光物質）及びＢＨＱ１又は２（クエンチャー物質）、ＴＥＴ（蛍光物質）及びＢＨＱ１又は２（クエンチャー物質）、ＨＥＸ（蛍光物質）及びＢＨＱ１又は２（クエンチャー物質）、ＭＡＸ ＮＨＳエステル（蛍光物質）及びＩＢＦＱ（クエンチャー物質）、ＭＡＸ ＮＨＳエステル（蛍光物質）及びＢＨＱ１又は２（クエンチャー物質）、Ｃｙ３（蛍光物質）及びＩＢＲＱ（クエンチャー物質）、Ｃｙ３（蛍光物質）及びＢＨＱ２（クエンチャー物質）、ＴＹＥ５６３（蛍光物質）及びＩＢＲＱ（クエンチャー物質）、ＴＹＥ５６３（蛍光物質）及びＢＨＱ２（クエンチャー物質）、ＴＥＸ６１５（蛍光物質）及びＩＢＲＱ（クエンチャー物質）、ＴＥＸ６１５（蛍光物質）及びＢＨＱ２（クエンチャー物質）、Ｃｙ５（蛍光物質）及びＩＢＲＱ（クエンチャー物質）、Ｃｙ５（蛍光物質）及びＢＨＱ２（クエンチャー物質）、ＴＹＥ６６５（蛍光物質）及びＩＢＲＱ（クエンチャー物質）、ＴＹＥ６６５（蛍光物質）及びＢＨＱ２（クエンチャー物質）、ＦＡＭ（蛍光物質）及びＴＡＭＲＡ ＮＨＳエステル（クエンチャー物質）、ＪＯＥ ＮＨＳエステル（蛍光物質）及びＩＢＦＱ（クエンチャー物質）、ＪＯＥ ＮＨＳエステル（蛍光物質）及びＢＨＱ１又は２（クエンチャー物質）、ＴＡＭＲＡ ＮＨＳエステル（蛍光物質）及びＩＢＲＱ（クエンチャー物質）、ＴＡＭＲＡ ＮＨＳエステル（蛍光物質）及びＢＨＱ２（クエンチャー物質）、ＲＯＸ ＮＨＳエステル（蛍光物質）及びＩＢＲＱ（クエンチャー物質）、ＲＯＸ ＮＨＳエステル（蛍光物質）及びＢＨＱ２（クエンチャー物質）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－Ｘ ＮＨＳエステル（蛍光物質）及びＩＢＲＱ（クエンチャー物質）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ－Ｘ ＮＨＳエステル（蛍光物質）及びＢＨＱ２（クエンチャー物質）等の組合せを挙げることができる。
【0028】
上記工程（ｂ）及び（ｃ）は、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とが一体化したリアルタイムＰＣＲ装置、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴシステム（Applied Biosystems社製)、ＣＦＸ３８４ Ｔｏｕｃｈリアルタイム解析システム（Bio-Rad社製）等を用いて行うことができる。
【0029】
上記工程（ｃ）において、蛍光物質由来の蛍光シグナルは、濃度既知の本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡを鋳型として、本件検出方法におけるＰＣＲを行い、ＤＮＡ濃度と、ＰＣＲ産物が一定量に到達するときのサイクル数（threshold cycle；Ｃｔ値）との関係を示す検量線を作成する。検査対象の糞試料についても、同じ条件下でＰＣＲを行い、Ｃｔ値を求め、この値と検量線から、糞試料中の本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡを検出・定量することができる。
【0030】
上記工程（ｃ）において、蛍光物質由来の蛍光シグナルが検出された場合、被験マウスは、マウス大腸蟯虫に感染している又は感染している可能性が高いと判定することができ、蛍光物質由来の蛍光シグナルが検出されなかった場合、被験マウスは、マウス大腸蟯虫に感染していない又は感染していない可能性が高いと判定することができる。
【0031】
本件フォワードプライマーは、２本鎖のポリヌクレオチド（センス鎖及びアンチセンス鎖）からなる本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡのうち、アンチセンス鎖にアニールし、本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡの上流から下流にＤＮＡ合成するためのプライマーである。また、本件リバースプライマーは、２本鎖のポリヌクレオチド（センス鎖及びアンチセンス鎖）からなる本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡのうち、センス鎖にアニールし、本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡの下流から上流にＤＮＡ合成するためのプライマーである。また、本件プローブは、本件プライマーセットにより増幅される、２本鎖のポリヌクレオチド（センス鎖及びアンチセンス鎖）からなる本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡのうち、アンチセンス鎖又はセンス鎖にハイブリダイズするプローブである。例えば、本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡが、配列番号１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡである場合、配列番号１のヌクレオチド配列の１番目のヌクレオチド残基が上流側であり、５９８番目のヌクレオチド残基が下流側であり、配列番号１のヌクレオチド配列がセンス鎖であり、配列番号１のヌクレオチド配列の相補配列が、アンチセンス鎖である。
【0032】
本件プライマーセット及び本件プローブは、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列情報を基に、Primer Express（登録商標）ソフトウェア（Applied Biosystems社製）やＬＮＡ設計ガイドライン（Qiagen社製）等の公知の手法により、適宜設計することができる。
【0033】
本件フォワードプライマー、本件リバースプライマー、及び本件プローブの組合せとしては、具体的には、配列番号２のヌクレオチド配列を含み、配列番号２の７番目のヌクレオチド残基がＬＮＡであり、かつ、配列番号２の１６番目のヌクレオチド残基がＬＮＡであるフォワードプライマーと、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、配列番号３の１０番目のヌクレオチド残基がＬＮＡであり、かつ、配列番号３の１８番目のヌクレオチド残基がＬＮＡであるリバースプライマーと、配列番号４のヌクレオチド配列又はその相補配列を含み、配列番号４の７番目のヌクレオチド残基がＬＮＡであり、かつ、配列番号４の１５番目のヌクレオチド残基がＬＮＡであるプローブの組合せを挙げることができる。本件フォワードプライマーとしては、配列番号２のヌクレオチド配列を３’末端に含むものが好ましく、配列番号２のヌクレオチド配列からなるものが最も好ましい。また、本件リバースプライマーとしては、配列番号３のヌクレオチド配列を３’末端に含むものが好ましく、配列番号３のヌクレオチド配列からなるものが最も好ましい。また、本件プローブとしては、配列番号４のヌクレオチド配列又はその相補配列からなるものが最も好ましい。
【0034】
本件フォワードプライマー、本件リバースプライマー、及び本件プローブの長さとしては、例えば、１０ヌクレオチド以上（好ましくは１４、１６、１８、２０、２２、又は２５ヌクレオチド以上）であり、１００ヌクレオチド以下（好ましくは６０、５０、４０、３５、３０、又は２８ヌクレオチド以下）である。
【0035】
また、本件プライマーセットにより増幅されるＰＣＲ産物の長さとしては、例えば、３０ヌクレオチド以上（好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０ヌクレオチド以上）であり、５９０ヌクレオチド以下（好ましくは５６０、５３０、５００、４６０、４３０、４００、３６０、３３０、３００、２６０、２３０、２００、１６０、１３０、又は１００ヌクレオチド以下）である。
【0036】
本件フォワードプライマーは、本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡのアンチセンス鎖にアニールするポリヌクレオチド又はその類縁体を含む。また、本件リバースプライマーは、本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡのセンス鎖にアニールするポリヌクレオチド又はその類縁体を含む。また、本件プローブは、本件プライマーセットにより増幅される本件ＩＴＳ－２領域ＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド又はその類縁体を含む。かかるポリヌクレオチド又はその類縁体としては、例えば、ＤＮＡ；ＲＮＡ；ＰＮＡ（polyamide nucleic acid、ペプチド核酸）、ＥＮＡ（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids）、ＧＮＡ（Glycerol nucleic acid、グリセロール核酸）、ＴＮＡ（Threose nucleicacid、トレオース核酸）等のＬＮＡ以外の人工核酸；を挙げることができ、簡便性や安定性を考慮すると、ＤＮＡが好ましい。また、本件フォワードプライマー、本件リバースプライマー、及び本件プローブは、２本鎖であってもよいが、通常は１本鎖である。
【0037】
本発明において、「配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性」とは、配列番号１のヌクレオチド配列における１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、付加又は逆位され、配列番号１のヌクレオチド配列全体の９０％以上の配列が同一であることを意味する。ここで、「１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたヌクレオチド配列」とは、例えば１～５９個の範囲内、好ましくは１～５５個の範囲内、より好ましくは１～５０個の範囲内、さらに好ましくは１～４０個の範囲内、より好ましくは１～３０個の範囲内、さらに好ましくは１～２０個の範囲内、より好ましくは１～１５個の範囲内の数のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたヌクレオチド配列を意味する。
【0038】
本発明において、「少なくとも９０％の同一性」としては、好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらにより好ましくは９４％以上、特に好ましくは９５％以上、特により好ましくは９６％以上、特にさらに好ましくは９７％以上、特にさらにより好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上（約１００％）の同一性である。ヌクレオチド配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）に基づくＢＬＡＳＴＸ又はＢＬＡＳＴＰと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403,1990）に基づくＢＬＡＳＴＮと呼ばれるプログラム（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）を利用して決定することができる。ＢＬＡＳＴＮを用いてヌクレオチド配列を解析する場合は、パラメーターは、例えば、score＝100、wordlength＝12とする。
【0039】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、本実施例で使用したマウスは、ハツカネズミ（Mus musculus）である。
【実施例】
【0040】
１．材料及び方法
［ＰＣＲ用プライマー及びプローブ］
マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２領域のＤＮＡ（表１参照）（以下、「マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ」ということがある）をＰＣＲにより検出するために、ＬＮＡを含むプライマーである本件フォワードプライマー及び本件リバースプライマーからなる本件プライマーセット（表２参照）（味の素バイオファーマ社製）と、ＬＮＡを含み、かつ、５’末端及び３’末端がそれぞれ蛍光物質（ＦＡＭ）及びクエンチャー物質（ＩＢＦＱ）で標識されたプローブである本件プローブ（表２参照）（IDT社製）とを用いた。なお、比較対照として、本件プライマーセットとヌクレオチド配列が同一であり、かつ、ＬＮＡを含まないプライマーセットである対照プライマーセット（すなわち、対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーからなるもの）を用いた（表２参照）。
［ＰＣＲ用プライマー及びプローブ］
マウス大腸蟯虫のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ－２領域のＤＮＡ（表１参照）（以下、「マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ」ということがある）をＰＣＲにより検出するために、ＬＮＡを含むプライマーである本件フォワードプライマー及び本件リバースプライマーからなる本件プライマーセット（表２参照）（味の素バイオファーマ社製）と、ＬＮＡを含み、かつ、５’末端及び３’末端がそれぞれ蛍光物質（ＦＡＭ）及びクエンチャー物質（ＩＢＦＱ）で標識されたプローブである本件プローブ（表２参照）（IDT社製）とを用いた。なお、比較対照として、本件プライマーセットとヌクレオチド配列が同一であり、かつ、ＬＮＡを含まないプライマーセットである対照プライマーセット（すなわち、対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーからなるもの）を用いた（表２参照）。
【0041】
【表1】
【0042】
【表2】
【0043】
［陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ］
ＰＣＲの陽性コントロール用鋳型ＤＮＡとして、配列番号１のヌクレオチド配列（すなわち、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ）の１～９５番目のヌクレオチド残基を含む２本鎖ポリヌクレオチド（表３参照）（本明細書において、「陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ」ということがある）を合成した。
ＰＣＲの陽性コントロール用鋳型ＤＮＡとして、配列番号１のヌクレオチド配列（すなわち、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ）の１～９５番目のヌクレオチド残基を含む２本鎖ポリヌクレオチド（表３参照）（本明細書において、「陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ」ということがある）を合成した。
【0044】
【表3】
【0045】
［マウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡ］
マウス大腸蟯虫に感染したマウスの糞から定法にしたがって精製されたゲノムＤＮＡ（本明細書において、「マウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡ」ということがある）を、実験動物中央研究所により分与された。
マウス大腸蟯虫に感染したマウスの糞から定法にしたがって精製されたゲノムＤＮＡ（本明細書において、「マウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡ」ということがある）を、実験動物中央研究所により分与された。
【0046】
［ＰＣＲ］
図１及び２において、鋳型ＤＮＡ（陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ、又はマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡ）を、２７０μＭのｄＮＴＰｓ（タカラバイオ社製）、１５０ｎＭの対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマー、並びに５ユニットのTaqＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs社製）を含有するＰＣＲ混合物に添加した。なお、図１Ｂにおいて、プライマーの濃度は９．１～３００ｎＭに変更した。以下の表４に示す条件で、ＰＣＲサーマルサイクラー（Dicer TP600；タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で２０分間染色することによりＤＮＡを可視化した。画像解析装置（FluorChemFC2；Alpha Innotech Corporation社製）を用いて可視化したＤＮＡの画像を取得し、Metamorphイメージングソフトウェア（Molecular Devices社製）を用いてＤＮＡ（バンド）のシグナル強度を測定した。
図１及び２において、鋳型ＤＮＡ（陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ、又はマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡ）を、２７０μＭのｄＮＴＰｓ（タカラバイオ社製）、１５０ｎＭの対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマー、並びに５ユニットのTaqＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs社製）を含有するＰＣＲ混合物に添加した。なお、図１Ｂにおいて、プライマーの濃度は９．１～３００ｎＭに変更した。以下の表４に示す条件で、ＰＣＲサーマルサイクラー（Dicer TP600；タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で２０分間染色することによりＤＮＡを可視化した。画像解析装置（FluorChemFC2；Alpha Innotech Corporation社製）を用いて可視化したＤＮＡの画像を取得し、Metamorphイメージングソフトウェア（Molecular Devices社製）を用いてＤＮＡ（バンド）のシグナル強度を測定した。
【0047】
【0048】
［ＤＮＡシークエンシング］
ＰＣＲ産物のＤＮＡシークエンシングは、文献「Watanabe, K.,et al. Sci Rep. 2018. doi:10.1038/s41598-018-34290-1」記載の方法に従って、3130xlジェネティックアナライザー（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて行った。
ＰＣＲ産物のＤＮＡシークエンシングは、文献「Watanabe, K.,et al. Sci Rep. 2018. doi:10.1038/s41598-018-34290-1」記載の方法に従って、3130xlジェネティックアナライザー（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて行った。
【0049】
［定量ＰＣＲ］
SYBRGreenアッセイ（文献「Aihara,M., et al.Gene. 2012;501: 118-126.」参照）においては、１×QuantiTect SYBR green buffer（Qiagen社製）及び１８．８ｎＭの２種類のプライマーセット（対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーからなる対照プライマーセット、又は、本件フォワードプライマー及び本件リバースプライマーからなる本件プライマーセット）を含有するｑＰＣＲ混合物に、鋳型ＤＮＡ（１００コピーの陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ［図３Ａ及びＢ］、又はマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡ［図３Ｃ］）を添加した。TaqManプローブアッセイにおいては、１×Sso-Advanced universalprobe supermix（Bio-Rad Laboratories社製）、１００ｎＭの本件プローブ、及び９．４ｎＭの２種類のプライマーセット（対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーからなる対照プライマーセット、又は、本件フォワードプライマー及び本件リバースプライマーからなる本件プライマーセット）を含有する標準ｑＰＣＲ混合物に、鋳型ＤＮＡ（１００コピーの陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ［図３Ａ及びＢ］、又はマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡ［図３Ｃ］）を添加した。次に、以下の表５に示す条件で、ＣＦＸ３８４ Ｔｏｕｃｈリアルタイム解析システム（Bio-Rad社製）を用いた定量ＰＣＲを行った。蛍光レベル（ＲＦＵ：relativefluorescence unit）の閾値を１００未満に設定することにより（図３Ａ参照）、すべての試料のサイクル閾値（Ｃｔ値）を決定した。１．３７～３０００コピーの陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを３段階で希釈した液を用いて検量線を作成し、かかる検量線を基に、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡに含まれるマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡのコピー数（図３Ｃの縦軸）を測定した。
SYBRGreenアッセイ（文献「Aihara,M., et al.Gene. 2012;501: 118-126.」参照）においては、１×QuantiTect SYBR green buffer（Qiagen社製）及び１８．８ｎＭの２種類のプライマーセット（対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーからなる対照プライマーセット、又は、本件フォワードプライマー及び本件リバースプライマーからなる本件プライマーセット）を含有するｑＰＣＲ混合物に、鋳型ＤＮＡ（１００コピーの陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ［図３Ａ及びＢ］、又はマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡ［図３Ｃ］）を添加した。TaqManプローブアッセイにおいては、１×Sso-Advanced universalprobe supermix（Bio-Rad Laboratories社製）、１００ｎＭの本件プローブ、及び９．４ｎＭの２種類のプライマーセット（対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーからなる対照プライマーセット、又は、本件フォワードプライマー及び本件リバースプライマーからなる本件プライマーセット）を含有する標準ｑＰＣＲ混合物に、鋳型ＤＮＡ（１００コピーの陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ［図３Ａ及びＢ］、又はマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡ［図３Ｃ］）を添加した。次に、以下の表５に示す条件で、ＣＦＸ３８４ Ｔｏｕｃｈリアルタイム解析システム（Bio-Rad社製）を用いた定量ＰＣＲを行った。蛍光レベル（ＲＦＵ：relativefluorescence unit）の閾値を１００未満に設定することにより（図３Ａ参照）、すべての試料のサイクル閾値（Ｃｔ値）を決定した。１．３７～３０００コピーの陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを３段階で希釈した液を用いて検量線を作成し、かかる検量線を基に、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡに含まれるマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡのコピー数（図３Ｃの縦軸）を測定した。
【0050】
【表5】
【0051】
［陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを含む糞試料を用いたＰＣＲ］
マウス大腸蟯虫に感染していないことが確認されたマウスのケージから糞の塊を採取し、コニカルチューブに回収した。糞の塊を串（skewer）で細かくした後、ＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ-ＥＤＴＡ緩衝液［ｐＨ８．０］）を添加し、糞懸濁液を調製した。溶媒１ｍＬ当たり２５ｍｇの糞を含む糞懸濁液１ｍＬを、直径が０．３ｍｍの球状のガラスビーズ２５０ｍｇを含むセーフロックチューブ（Safe-Lock Tube）に加え、ビーズクラッシャー（μＴ－１２、TAITEC社製）を用いて３２００ｒｐｍ、３０秒間ホモジナイズ処理をした。その後、８～２００μｇの糞を含む液に、最終濃度１ｎｇ／μＬの陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを加え、９５℃で５分加熱処理した後、１１，０００×ｇで５分間遠心処理により得られた上清（図４Ａ）を鋳型とし、上記［ＰＣＲ］の項目に記載の方法に従ってＰＣＲを行った。また、かかる上清を９５℃で５分間加熱処理したもの（図４Ｂ）や、上清を９５℃で５分間加熱処理し、さらに、１％のＢＳＡ処理したもの（図４Ｃの「ＢＳＡ」）、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００処理したもの（図４Ｃの「ＴｒｉｔｏｎＸ」）、又は０．１％のＴｗｅｅｎ－２０処理したもの（図４Ｃの「Ｔｗｅｅｎ２０」）を鋳型とし、上記［ＰＣＲ］の項目に記載の方法に従ってＰＣＲを行った。さらに、上記上清を、エタノール沈殿処理したもの（図４Ｄ）を鋳型とし、上記［ＰＣＲ］の項目に記載の方法に従ってＰＣＲを行った。エタノール沈殿処理は、上記上清に、１／１０倍の３Ｍの酢酸ナトリウムと、２倍の氷冷１００％エタノールを添加し、－３０℃で１時間冷却処理した後、１１，０００×ｇで１５分、４℃で遠心処理することにより行った。また、得られた沈殿物（ＤＮＡ）を７０％エタノールで洗浄し、１５分乾燥処理した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。なお、コントロールとして、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡそれ自体を鋳型とし、上記［ＰＣＲ］の項目に記載の方法に従ってＰＣＲを行った。
マウス大腸蟯虫に感染していないことが確認されたマウスのケージから糞の塊を採取し、コニカルチューブに回収した。糞の塊を串（skewer）で細かくした後、ＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ-ＥＤＴＡ緩衝液［ｐＨ８．０］）を添加し、糞懸濁液を調製した。溶媒１ｍＬ当たり２５ｍｇの糞を含む糞懸濁液１ｍＬを、直径が０．３ｍｍの球状のガラスビーズ２５０ｍｇを含むセーフロックチューブ（Safe-Lock Tube）に加え、ビーズクラッシャー（μＴ－１２、TAITEC社製）を用いて３２００ｒｐｍ、３０秒間ホモジナイズ処理をした。その後、８～２００μｇの糞を含む液に、最終濃度１ｎｇ／μＬの陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを加え、９５℃で５分加熱処理した後、１１，０００×ｇで５分間遠心処理により得られた上清（図４Ａ）を鋳型とし、上記［ＰＣＲ］の項目に記載の方法に従ってＰＣＲを行った。また、かかる上清を９５℃で５分間加熱処理したもの（図４Ｂ）や、上清を９５℃で５分間加熱処理し、さらに、１％のＢＳＡ処理したもの（図４Ｃの「ＢＳＡ」）、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００処理したもの（図４Ｃの「ＴｒｉｔｏｎＸ」）、又は０．１％のＴｗｅｅｎ－２０処理したもの（図４Ｃの「Ｔｗｅｅｎ２０」）を鋳型とし、上記［ＰＣＲ］の項目に記載の方法に従ってＰＣＲを行った。さらに、上記上清を、エタノール沈殿処理したもの（図４Ｄ）を鋳型とし、上記［ＰＣＲ］の項目に記載の方法に従ってＰＣＲを行った。エタノール沈殿処理は、上記上清に、１／１０倍の３Ｍの酢酸ナトリウムと、２倍の氷冷１００％エタノールを添加し、－３０℃で１時間冷却処理した後、１１，０００×ｇで１５分、４℃で遠心処理することにより行った。また、得られた沈殿物（ＤＮＡ）を７０％エタノールで洗浄し、１５分乾燥処理した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。なお、コントロールとして、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡそれ自体を鋳型とし、上記［ＰＣＲ］の項目に記載の方法に従ってＰＣＲを行った。
【0052】
［エタノール沈殿処理により得られた、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡを含む糞試料を用いた定量ＰＣＲ］
マウス大腸蟯虫に感染していないことが確認されたマウスのケージから糞の塊を採取し、コニカルチューブに回収した。糞の塊を串（skewer）で細かくした後、ＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ-ＥＤＴＡ緩衝液［ｐＨ８．０］）を添加し、糞懸濁液を調製した。溶媒１ｍＬ当たり２５ｍｇの糞を含む糞懸濁液を、直径が０．３ｍｍの球状のガラスビーズ２５０ｍｇを含むセーフロックチューブ（Safe-Lock Tube）に加え、ビーズクラッシャー（μＴ－１２、TAITEC社製）を用いて３２００ｒｐｍ、３０秒間ホモジナイズ処理をした。その後、４μｇの糞を含む液に、０．５～１３．３ｎｇのマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡを加え、９５℃で５分加熱処理した後、１１，０００×ｇで５分間遠心処理により上清を回収した。回収した上清を、上記［陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを含む糞試料を用いたＰＣＲ］の項目に記載の方法に従ってエタノール沈殿処理を行い、糞試料を調製した。調製した糞試料を鋳型とし、上記［定量ＰＣＲ］の項目に記載の方法に従って定量ＰＣＲを行った。
マウス大腸蟯虫に感染していないことが確認されたマウスのケージから糞の塊を採取し、コニカルチューブに回収した。糞の塊を串（skewer）で細かくした後、ＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ-ＥＤＴＡ緩衝液［ｐＨ８．０］）を添加し、糞懸濁液を調製した。溶媒１ｍＬ当たり２５ｍｇの糞を含む糞懸濁液を、直径が０．３ｍｍの球状のガラスビーズ２５０ｍｇを含むセーフロックチューブ（Safe-Lock Tube）に加え、ビーズクラッシャー（μＴ－１２、TAITEC社製）を用いて３２００ｒｐｍ、３０秒間ホモジナイズ処理をした。その後、４μｇの糞を含む液に、０．５～１３．３ｎｇのマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡを加え、９５℃で５分加熱処理した後、１１，０００×ｇで５分間遠心処理により上清を回収した。回収した上清を、上記［陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを含む糞試料を用いたＰＣＲ］の項目に記載の方法に従ってエタノール沈殿処理を行い、糞試料を調製した。調製した糞試料を鋳型とし、上記［定量ＰＣＲ］の項目に記載の方法に従って定量ＰＣＲを行った。
【0053】
［エタノール沈殿処理により得られた糞試料を用いた定量ＰＣＲ］
マウス大腸蟯虫感染が不明なマウスを、１ケージ当たり３～５匹で飼育した８種類のケージ（＃１～８）から糞の塊を採取し、コニカルチューブに回収した。糞の塊を串（skewer）で細かくした後、ＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ-ＥＤＴＡ緩衝液［ｐＨ８．０］）を添加し、糞懸濁液を調製した。溶媒１ｍＬ当たり２５ｍｇの糞を含む糞懸濁液を、直径が０．３ｍｍの球状のガラスビーズ２５０ｍｇを含むセーフロックチューブ（Safe-Lock Tube）に加え、ビーズクラッシャー（μＴ－１２、TAITEC社製）を用いて３２００ｒｐｍ、３０秒間ホモジナイズ処理をした。その後、２５ｍｇの糞を含む液を９５℃で５分加熱処理した後、１１，０００×ｇで５分間遠心処理により上清を回収した。回収した上清を、上記［陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを含む糞試料を用いたＰＣＲ］の項目に記載の方法に従ってエタノール沈殿処理を行い、糞試料を調製した。調製した糞試料を鋳型とし、上記［定量ＰＣＲ］の項目に記載の方法に従って定量ＰＣＲを行った。
マウス大腸蟯虫感染が不明なマウスを、１ケージ当たり３～５匹で飼育した８種類のケージ（＃１～８）から糞の塊を採取し、コニカルチューブに回収した。糞の塊を串（skewer）で細かくした後、ＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ-ＥＤＴＡ緩衝液［ｐＨ８．０］）を添加し、糞懸濁液を調製した。溶媒１ｍＬ当たり２５ｍｇの糞を含む糞懸濁液を、直径が０．３ｍｍの球状のガラスビーズ２５０ｍｇを含むセーフロックチューブ（Safe-Lock Tube）に加え、ビーズクラッシャー（μＴ－１２、TAITEC社製）を用いて３２００ｒｐｍ、３０秒間ホモジナイズ処理をした。その後、２５ｍｇの糞を含む液を９５℃で５分加熱処理した後、１１，０００×ｇで５分間遠心処理により上清を回収した。回収した上清を、上記［陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを含む糞試料を用いたＰＣＲ］の項目に記載の方法に従ってエタノール沈殿処理を行い、糞試料を調製した。調製した糞試料を鋳型とし、上記［定量ＰＣＲ］の項目に記載の方法に従って定量ＰＣＲを行った。
【0054】
２．結果及び考察
［ＰＣＲ条件の検討］
マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを検出するためのＰＣＲの条件を最適化するために、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを鋳型とし、（ＬＮＡを含まない）対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーを用いたＰＣＲにより検討を行った。まず、１００コピーの鋳型ＤＮＡ（すなわち、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ）を使用し、対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーのアニール温度を５１．０～６９．０℃の範囲内で検討した結果、アニーリング温度が５８．９℃のとき、鋳型ＤＮＡ由来のシングルバンドが検出された（図１Ａ参照）。また、対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーの濃度を９．１～３００ｎＭの範囲内で検討した結果、対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーの濃度が１５０ｎＭ及び３００ｎＭのとき、鋳型ＤＮＡ由来のバンドが検出されたのに対して、これらプライマーの濃度が７５ｎＭ以下のときは、鋳型ＤＮＡ由来のバンドは検出されなかった（図１Ｂ参照）。また、鋳型ＤＮＡのコピー数が１０～１０００の範囲内のとき、コピー数を定量できるＰＣＲのサイクル数を２０～３５の範囲内で検討した結果、ＰＣＲのサイクル数が３０サイクルのとき、決定係数（Ｒ２）が最も高く、定量性が高いことが示された（図１Ｃ及び１Ｄ参照）。
［ＰＣＲ条件の検討］
マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを検出するためのＰＣＲの条件を最適化するために、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを鋳型とし、（ＬＮＡを含まない）対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーを用いたＰＣＲにより検討を行った。まず、１００コピーの鋳型ＤＮＡ（すなわち、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ）を使用し、対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーのアニール温度を５１．０～６９．０℃の範囲内で検討した結果、アニーリング温度が５８．９℃のとき、鋳型ＤＮＡ由来のシングルバンドが検出された（図１Ａ参照）。また、対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーの濃度を９．１～３００ｎＭの範囲内で検討した結果、対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーの濃度が１５０ｎＭ及び３００ｎＭのとき、鋳型ＤＮＡ由来のバンドが検出されたのに対して、これらプライマーの濃度が７５ｎＭ以下のときは、鋳型ＤＮＡ由来のバンドは検出されなかった（図１Ｂ参照）。また、鋳型ＤＮＡのコピー数が１０～１０００の範囲内のとき、コピー数を定量できるＰＣＲのサイクル数を２０～３５の範囲内で検討した結果、ＰＣＲのサイクル数が３０サイクルのとき、決定係数（Ｒ２）が最も高く、定量性が高いことが示された（図１Ｃ及び１Ｄ参照）。
【0055】
以上の結果から、以降の実験において、対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーを用いたＰＣＲは、プライマーのアニール温度を５８．９℃に設定し、プライマーの濃度を１５０ｎＭに設定し、ＰＣＲのサイクル数を３０に設定して行った。
【0056】
０．５～５０ｎｇのマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡを鋳型とし、対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーを用いたＰＣＲを行った。その結果、いずれの濃度のマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡを鋳型とした場合でも、単一のバンドが検出され、かかるバンドのサイズは、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを鋳型した場合に検出されたバンドのサイズと同じであった（図２参照）。また、得られたＰＣＲ産物について、ＤＮＡシークエンシングを行ったところ、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡであることが確認された。これらの結果は、ＰＣＲ実験条件下において、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、対照フォワードプライマー及び対照リバースプライマーがアニールするプライマーセットを用いたＰＣＲを行うことにより、マウス大腸蟯虫感染の有無を感度よく検出できることを示している。
【0057】
［定量ＰＣＲ］
ＬＮＡに基づくTaqManアッセイにより、黄色ブドウ球菌（S. aureus）による白チーズの汚染の検出レベルが向上したことが報告されている（文献「Kadiroglu,P., et al. J Microbiol Methods. 2014. doi:10.1016/j.mimet.2014.06.022」参照）。そこで、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞中のマウス大腸蟯虫由来ゲノムＤＮＡを感度よく定量するために、本件プライマーセット、すなわち、ＬＮＡ含有プライマーセットと、本件プローブ、すなわち、ＬＮＡ含有TaqManプローブとを用いたTaqManプローブアッセイを行った。なお、比較対照として、対照プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイや、本件プライマーセット又は対照プライマーセットを用いたSYBR Greenアッセイも行った。
ＬＮＡに基づくTaqManアッセイにより、黄色ブドウ球菌（S. aureus）による白チーズの汚染の検出レベルが向上したことが報告されている（文献「Kadiroglu,P., et al. J Microbiol Methods. 2014. doi:10.1016/j.mimet.2014.06.022」参照）。そこで、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞中のマウス大腸蟯虫由来ゲノムＤＮＡを感度よく定量するために、本件プライマーセット、すなわち、ＬＮＡ含有プライマーセットと、本件プローブ、すなわち、ＬＮＡ含有TaqManプローブとを用いたTaqManプローブアッセイを行った。なお、比較対照として、対照プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイや、本件プライマーセット又は対照プライマーセットを用いたSYBR Greenアッセイも行った。
【0058】
その結果、本件プライマーセットを用いた場合、対照プライマーセットを用いた場合と比べ、TaqManプローブアッセイ及びSYBR Greenアッセイのいずれにおいても、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡの検出感度は上昇したものの、本件プライマーセット及び本件プローブを用いてTaqManプローブアッセイを行った場合が最も検出感度が高かった（図３Ａ参照）。
【0059】
また、各々のアッセイについて、検出されたマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡのコピー数と、ＰＣＲサイクル数との間の関係を調べた。その結果、本件プライマーセット及び本件プローブを用いてTaqManプローブアッセイを行った場合、コピー数１～３０００の範囲では単純線形回帰の相関係数が０．９９４であり、対照プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイを行った場合の相関係数（０．９１７）よりも高いことが示された（図３Ｂ参照）。また、本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイの検出感度は、本件プライマーセットを用いたSYBRアッセイと比べ、１００倍以上向上した。
【0060】
さらに、本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイを用いて、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡにおけるマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡのコピー数を測定した。その結果、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡの量に依存して、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のコピー数が上昇することが示された（図３Ｃ参照）。また、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡが２０ｐｇと少量であっても、約１コピーのマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを検出できることが示された（図３Ｃ参照）。この結果は、本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイを行うと、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞から抽出されたゲノムＤＮＡが少量であっても、当該糞中に含まれるマウス大腸蟯虫由来ゲノムＤＮＡを、感度よく定量できることを示している。
【0061】
［陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを含む糞試料を用いたＰＣＲ］
実験マウスのマウス大腸蟯虫感染を、糞からゲノムＤＮＡを精製することなく簡便に検出できるかどうかを検証するために、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを含む糞含有液から遠心処理により得られた上清を用いてＰＣＲを行った。その結果、糞量が８μｇのときは、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ由来のバンドが検出されたものの、糞量が４０～２００μｇのときは、かかるバンドが検出されなかった（図４Ａ参照）。この結果は、糞存在下で陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡの回収率が遠心処理により低下（例えば、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡが沈殿物に付着することによるロス）したり、糞に含まれる少なくとも１つの可溶性成分（例えば、多糖類やカルシウムイオン等）がＰＣＲ反応を阻害する可能性を示唆している。
実験マウスのマウス大腸蟯虫感染を、糞からゲノムＤＮＡを精製することなく簡便に検出できるかどうかを検証するために、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡを含む糞含有液から遠心処理により得られた上清を用いてＰＣＲを行った。その結果、糞量が８μｇのときは、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ由来のバンドが検出されたものの、糞量が４０～２００μｇのときは、かかるバンドが検出されなかった（図４Ａ参照）。この結果は、糞存在下で陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡの回収率が遠心処理により低下（例えば、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡが沈殿物に付着することによるロス）したり、糞に含まれる少なくとも１つの可溶性成分（例えば、多糖類やカルシウムイオン等）がＰＣＲ反応を阻害する可能性を示唆している。
【0062】
また、上記上清を、加熱処理や、加熱処理に加えて、さらに、ＢＳＡ処理、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００処理、又はＴｗｅｅｎ－２０処理した場合も、糞量が４０～２００μｇのときは、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ由来のバンドは検出されなかった（図４Ｂ及びＣ参照）。一方、上記上清を、エタノール沈殿処理すると、糞量が４０のμｇのとき、陽性コントロール用ＩＴＳ－２領域のＤＮＡ由来のバンドが検出された（図４Ｄ参照）。この結果は、エタノール沈殿処理により糞試料を調製し、ＰＣＲを行うと、他の処理（加熱処理、ＢＳＡ処理、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００処理、又はＴｗｅｅｎ－２０処理）により糞試料を調製してＰＣＲを行った場合と比べ、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡの検出感度が、少なくとも５倍上昇することを示している。
【0063】
［エタノール沈殿処理により得られた、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡを含む糞試料を用いた定量ＰＣＲ］
次に、エタノール沈殿処理によりマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡを含む糞試料を調製し、かかる糞試料を鋳型として、本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイを行った。その結果、４μｇの糞存在下において、検出されたマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡのコピー数は、糞非存在下において、検出されたマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡのコピー数の約５０％であった（図５Ａ参照）。また、糞量の増加に伴い、検出されたマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡのコピー数は低下したものの、比率の変動率はほぼ一定であった（図５Ａ参照）。また、０．５～１３．３ｎｇの範囲のマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡと、検出されたマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡのコピー数との決定係数（Ｒ２）は０．９８４であり、相関関係が認められた（図５Ｂ参照）。この結果は、エタノール沈殿処理によりマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡを含む糞試料を調製し、本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイを行うと、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞中のマウス大腸蟯虫ゲノムＤＮＡを定量的に検出できることを示している。
次に、エタノール沈殿処理によりマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡを含む糞試料を調製し、かかる糞試料を鋳型として、本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイを行った。その結果、４μｇの糞存在下において、検出されたマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡのコピー数は、糞非存在下において、検出されたマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡのコピー数の約５０％であった（図５Ａ参照）。また、糞量の増加に伴い、検出されたマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡのコピー数は低下したものの、比率の変動率はほぼ一定であった（図５Ａ参照）。また、０．５～１３．３ｎｇの範囲のマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡと、検出されたマウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡのコピー数との決定係数（Ｒ２）は０．９８４であり、相関関係が認められた（図５Ｂ参照）。この結果は、エタノール沈殿処理によりマウス大腸蟯虫感染マウスの糞由来ゲノムＤＮＡを含む糞試料を調製し、本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイを行うと、マウス大腸蟯虫感染マウスの糞中のマウス大腸蟯虫ゲノムＤＮＡを定量的に検出できることを示している。
【0064】
［エタノール沈殿処理により得られた糞試料を用いた定量ＰＣＲ］
次に、マウス大腸蟯虫感染が不明なマウスを８種類のケージ（＃１～８）で飼育し、これらケージ内の糞からエタノール沈殿処理により糞試料を調製し、本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイを行った。その結果、２種類のケージ（＃７及び＃８）で飼育したマウス由来の糞試料から、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡが検出された（図６Ａ及びＢ参照）。一方、残りの６種類のケージ（＃１～６）で飼育したマウスの糞試料からは、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡは検出されなかった（図６Ａ及びＢ参照）。さらに、位相差顕微鏡を用いて、結腸内容物及び糞を直接観察した結果、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡが検出されたマウス（ケージ＃８で飼育したマウス）の結腸には、マウス大腸蟯虫の個体（成虫）が認められ（図６Ｃａ参照）、糞にはマウス大腸蟯虫の卵も観察された（図６Ｃｂ参照）。一方、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡが検出されなかったマウス（ケージ＃１～６で飼育したマウス）の結腸及び糞からは、マウス大腸蟯虫の個体や卵は認められなかった。以上の結果から、マウスの糞からアルコール（例えば、エタノール）沈殿処理により糞試料を調製し、本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイを行うと、比較的簡便にマウス由来の糞試料を調製できるとともに、当該糞試料中に含まれるマウス大腸蟯虫由来のゲノムＤＮＡを感度よく検出できることを示している。
次に、マウス大腸蟯虫感染が不明なマウスを８種類のケージ（＃１～８）で飼育し、これらケージ内の糞からエタノール沈殿処理により糞試料を調製し、本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイを行った。その結果、２種類のケージ（＃７及び＃８）で飼育したマウス由来の糞試料から、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡが検出された（図６Ａ及びＢ参照）。一方、残りの６種類のケージ（＃１～６）で飼育したマウスの糞試料からは、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡは検出されなかった（図６Ａ及びＢ参照）。さらに、位相差顕微鏡を用いて、結腸内容物及び糞を直接観察した結果、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡが検出されたマウス（ケージ＃８で飼育したマウス）の結腸には、マウス大腸蟯虫の個体（成虫）が認められ（図６Ｃａ参照）、糞にはマウス大腸蟯虫の卵も観察された（図６Ｃｂ参照）。一方、マウス大腸蟯虫リボソームＤＮＡ由来ＩＴＳ－２領域のＤＮＡが検出されなかったマウス（ケージ＃１～６で飼育したマウス）の結腸及び糞からは、マウス大腸蟯虫の個体や卵は認められなかった。以上の結果から、マウスの糞からアルコール（例えば、エタノール）沈殿処理により糞試料を調製し、本件プライマーセット及び本件プローブを用いたTaqManプローブアッセイを行うと、比較的簡便にマウス由来の糞試料を調製できるとともに、当該糞試料中に含まれるマウス大腸蟯虫由来のゲノムＤＮＡを感度よく検出できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【0065】
本発明は、マウス大腸蟯虫感染実験マウスの早期発見と、マウス大腸蟯虫の早期駆除に資するものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】