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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-22
(45)【発行日】2024-07-30
(54)【発明の名称】アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンの生合成
(51)【国際特許分類】
C12N 1/19 20060101AFI20240723BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240723BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20240723BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20240723BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240723BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240723BHJP
C12N 15/61 20060101ALN20240723BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240723BHJP
C12P 23/00 20060101ALN20240723BHJP
【ＦＩ】
C12N1/19 ZNA
C12N1/21
C12N15/29
C12N15/53
C12N15/62 Z
C12N15/31
C12N15/61
C12N15/54
C12P23/00
【請求項の数】
24
(21)【出願番号】P 2022520244
(86)(22)【出願日】2020-10-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-09
(86)【国際出願番号】 US2020054323
(87)【国際公開番号】W WO2021067974
(87)【国際公開日】2021-04-08
【審査請求日】2022-05-23
(31)【優先権主張番号】62/911,116
(32)【優先日】2019-10-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】516131979
【氏名又は名称】コナゲン インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ウ，イシェン
(72)【発明者】
【氏名】ル，ワンリ
(72)【発明者】
【氏名】コートニー，ジェイコブ，ティー．
(72)【発明者】
【氏名】ナン，デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】ユ，オリバー
【審査官】藤山 純
(56)【参考文献】
【文献】CZAJKA, J. J. et al.，Engineering the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica to produce the aroma compound β-ionone，Microb Cell Fact，17(136)，2018年09月01日，pp.1-13
【文献】WERNER, N. et al.，Protein engineering of carotenoid cleavage dioxygenases to optimize β-ionone biosynthesis in yeast cell factories，Food Chemistry，vol.299，2019年07月08日，pp.1-8
【文献】YE, L. et al.，Optimizing the localization of astaxanthin enzymes for improved productivity，Biotechnol Biofuels，11(278)，2018年10月10日，pp.1-9
【文献】YANG, K. et al.， Subcellular engineering of lipase dependent pathways directed towards lipid related organelles for highly effectively compartmentalized biosynthesis of triacylglycerol derived products in Yarrowia lipolytica，Metabolic engineering，vol.55，2019年08月03日，pp.231-238
【文献】MATTHAUS, F et al.，Production of lycopene in the non-carotenoid-producing yeast Yarrowia lipolytica，Appl Environ Microbiol，80(5)，2014年03月，pp.1660-1669
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／１９
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｐ ２３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
イオノン化合物を産生するための組換え微生物産生宿主細胞であって、第１のコード配列を含む少なくとも１つの核酸構築物を含み、前記第１のコード配列が、カロチノイド開裂活性を有する第２のドメインに融合された脂質体区画化シグナルタグ（ＬＢＴ）として機能できる第１のドメインを含む融合酵素をコードし、前記宿主細胞が、ヤロウイア・リポリティカであり、前記第１のドメインが、オレオシンポリペプチドまたは含油性誘導性脂肪滴タンパク質であり、前記第２のドメインが、カロチノイド開裂ジオキシゲナーゼまたはカロチノイドオキシゲナーゼである、宿主細胞。
【請求項2】
前記第１のドメインが、配列番号９に対し少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項3】
前記第１のドメインが、配列番号１、配列番号３、または配列番号９に対し少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項4】
前記第１のドメインが、配列番号２９、または配列番号３０のアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むオレオシンポリペプチドである、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項5】
前記第２のドメインが、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４に対し少なくとも９０％の配列同一性を呈するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項6】
前記第２のドメインが、ツクバネアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｘ ｈｙｂｒｉｄａ）、モクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ｆｒａｇｒａｎｓ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、もしくはヨーロッパキイチゴ（Ｒｕｂｕｓ ｉｄａｅｕｓ）由来のＣＣＤ１酵素、またはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ベニノキ（Ｂｉｘａ Ｏｒｅｌｌａｎａ）、コギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）、サフラン（Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、マレーヤマバショウ（Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ）、セイヨウリンゴ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、ダマスクバラ（Ｒｏｓａ ｄａｍａｓｃｅｎｅ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、もしくはモクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ｆｒａｇｒａｎｓ）由来のＣＣＤ４酵素を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項7】
前記第１のドメインが、３～３０アミノ酸長を含みかつグリシン、セリン、スレオニン、およびそれらの組み合わせの群から選択されるアミノ酸を含むリンカーを介して前記第２のドメインに融合される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項8】
前記リンカーが、グリシン－セリンリンカーを含む、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項9】
前記第１のコード配列が、ＴＥＦプロモーターに作動可能に連結される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項10】
リコペンイプシロン－シクラーゼまたはカロチノイド開裂ジオキシゲナーゼもしくはカロチノイドオキシゲナーゼドメインに融合されたリコペンイプシロン－シクラーゼドメインを含む融合酵素をコードする第２のコード配列を同じ核酸構築物または異なる核酸構築物中にさらに含む、アルファ－イオノンを産生するための請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項11】
フィトエンシンターゼをコードする第２のコード配列を同じ核酸構築物または異なる核酸構築物中にさらに含む、ベータ－イオノンを産生するための請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項12】
フィトエンデヒドロゲナーゼをコードする第３のコード配列を同じ核酸構築物または異なる核酸構築物中にさらに含む、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項13】
１つ以上のコード配列を含む１つ以上の核酸構築物をさらに含み、前記１つ以上のコード配列が、宿主細胞に対し天然のメバロン酸経路酵素から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項14】
前記天然のメバロン酸経路酵素が、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）、およびイソペンテニル－二リン酸－イソメラーゼ（ＩＰＩ）からなる群から選択される、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項15】
１つ以上のコード配列を含む１つ以上の核酸構築物をさらに含み、前記１つ以上のコード配列が、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、ＧＧＰＰＳ：：ＦＰＰＳ融合酵素、フィトエンデヒドロゲナーゼ（ＣａｒＢ）、二官能性リコペンシクラーゼ／フィトエンシンターゼ（ＣａｒＲＰ）、およびリコペンシクラーゼ活性を有しない変異体ＣａｒＲＰ（ＣａｒＲＰ＊）からなる群から選択される１つ以上の酵素をコードする、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項16】
カロチノイド化合物を産生するための組換え微生物産生宿主細胞であって、ベータ－カロチンケトラーゼまたはベータ－カロチンヒドロキシラーゼに融合されたオレオシンポリペプチドを含む融合酵素をコードするコード配列を含む少なくとも１つの核酸構築物を含み、前記宿主細胞が、ヤロウイア・リポリティカである、宿主細胞。
【請求項17】
ベータ－カロチンケトラーゼに融合されたオレオシンポリペプチドを含む第１の融合酵素をコードする第１のコード配列とベータ－カロチンヒドロキシラーゼに融合されたオレオシンポリペプチドを含む第２の融合酵素をコードする第２のコード配列とを含む請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項18】
前記ベータ－カロチンケトラーゼが、藻類のまたは細菌のＢＫＴまたはＣｒｔＷである、請求項１６または１７に記載の宿主細胞。
【請求項19】
前記ベータ－カロチンケトラーゼが、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、クロレラ・ゾフィンギエンシス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、またはパントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）由来である、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項20】
前記ベータ－カロチンヒドロキシラーゼが、藻類ＣｒｔＲ－Ｂである、請求項１６または１７に記載の宿主細胞。
【請求項21】
前記藻類ＣｒｔＲ－Ｂが、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）またはＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項22】
前記オレオシンポリペプチドが、配列番号２９または配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項23】
前記カロチノイド化合物が、アスタキサンチンである、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項24】
前記カロチノイド化合物が、カンタキサンチンである、請求項１６に記載の宿主細胞。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１９年１０月４日に出願された米国仮出願第６２／９１１，１１６号の優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１０月４日に出願された米国仮出願第６２／９１１，１１６号の優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明の分野は、アルファイオノンおよびベータイオノンなどの、芳香化合物を含むカロチノイド化合物の生合成産生のための組成物およびプロセスに関する。より具体的には、本方法およびプロセスは、カロチノイド開裂ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）ドメインに連結された脂質体区画化シグナルタグ（ＬＢＴ）ドメインを有する融合酵素をコードする異種核酸を含むように形質転換された微生物宿主細胞を利用する。
【背景技術】
【0003】
消費者は、良い味およびにおいを有する食品、香料、および化粧品を求めている。多くの場合、これらの良い嗅覚および味覚の形質は、それらの臭気しきい値がｐｐｂ未満の範囲にある時に特別に優れた芳香特性を有する、アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンなどのカロチノイドの誘導体を介して提供される。アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンの現在の供給は、主に植物からの抽出プロセスまたは化学合成のいずれかによって行われている。より多くの消費者が天然成分を好むにつれて、天然源からのイオノンの市場需要が劇的に増加している。しかし、約１グラムのアルファ－イオノンを生産するには、約１００トンのラズベリー、すなわち農業面積２０ヘクタールを必要とする。さらに、植物抽出ベースの生産は、関心のある化合物の強度および存在量に対する気象影響、植物病害および／または収穫不良のリスク、化合物の安定性、生産増加の環境影響、および貿易制限などの著しい欠点を有する。構造的にアルファ－イオノンは、キラル中心を有する。植物（ラズベリーなど）由来の天然アルファ－イオノンは、（Ｒ）－（＋）－（Ｅ）－アルファ－イオノンである。対照的に、化学的に合成されたα－イオノンは、２つの異性体（ＲおよびＳ）を有する（図１）。Ｒ－エナンチオマーは、スミレのような、果実のような、またはラズベリーのような風味として記載される、独特で強力な花の風味および芳香を有し、一方、Ｓ－エナンチオマーは、ベータ－イオノンと同様の木質の香りを有する。したがって、化学的に合成されたアルファ－イオノンは、ラセミ混合物として存在し、２つの異なる香りを有するエナンチオマーを含有する。したがって、香料産業に対するその効用は限られている。（Ｓ）－アルファ－イオノンまたは（Ｒ）－アルファ－イオノンのエナンチオ選択的合成のための新規方法が報告されているが、合成された（Ｒ）－アルファ－イオノン報告の最も高いエナンチオマー純度は、現在まで約９７％であり、（Ｓ）－エナンチオマーのかなりの量が依然として存在することを意味する。さらに、化学合成産生は環境問題を引き起こす可能性があり、有毒な前駆体を使用する可能性があり、かつ産生プロセス自体は、主要な出発物質の費用のために費用の増加を受け得る。
【0004】
したがって、当該技術分野では、植物抽出および化学合成によってもたらされる限定なしに、経済的かつ確実に「天然」アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンを産生する新規方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本教示によれば、アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンは、微生物細胞培養を用いる酵素工学および発酵技術により高収率で確実に産生ができる。これらの微生物細胞培養物は、「天然」アルファ－イオノンまたはベータ－イオノンｄｅ ｎｏｖｏを商業的に有意な収率で合成できる。したがって、本明細書では、新規生合成方法が、アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンの産生の費用を低減し、かつこれらの芳香化合物が従来どおり抽出される天然源の大規模な栽培および加工の環境影響を低減するために提供される。
【0006】
より具体的には、本教示は、微生物発酵によりイオノン化合物（例えば、アルファ－イオノン、ベータ－イオノン）を作製するための方法および組成物を包含し、このような方法および組成物は、カロチノイド開裂ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）ドメインに連結された脂質体区画化シグナルタグ（ＬＢＴ）ドメインを有する融合酵素をコードする異種核酸分子による真核細胞の形質転換を含む。
【0007】
アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンの発酵産生は、それによりそれらのそれぞれの前駆体イプシロン－カロチンまたはベータ－カロチンが開裂される、反応ステップの効率により妨げられてきた。本開示は、ある区画化シグナルタグが、その中でイプシロン－カロチンおよびベータ－カロチンが蓄積する脂質体を標的にでき、それによってＣＣＤ酵素のそのような脂質体への結合親和性を増大し、したがってＣＣＤ酵素の触媒効率を劇的に増大するという知見に一部基づく。脂質体区画化シグナルタグ融合ＣＣＤをコードする核酸分子の過剰発現と、種々のカロチノイド前駆体生合成遺伝子の過剰発現を組み合わせることにより、イオノン化合物の産生は、可溶性タグの使用、部位指向性変異誘発、またはＥＣ－ＣＣＤ融合酵素のみを作製するなどの代替的戦略よりもはるかに高い力価を提供することにより、改善され得る。したがって、本開示は、化学合成または植物抽出に関連する欠点なしに、「天然の」アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンを産生するための経済的かつ信頼性の高い方法を提供する。
【0008】
一態様では、本教示は、イオノン化合物を産生するための組換え微生物産生宿主細胞に関し、宿主細胞は、融合酵素をコードするコード配列を含む少なくとも１つの核酸構築物を含み、融合酵素は、カロチノイド開裂活性を有する第２のドメインに融合された脂質体区画化シグナルタグとして機能できる第１のドメインを含む。様々な実施形態では、脂質体区画化シグナルタグ（ＬＢＴ）は、脂質体構造タンパク質（例えば、オレオシンおよびカレオシン）、含油性（ｏｌｅａｇｉｎｉｃｉｔｙ）誘導性脂質滴タンパク質（例えば、Ｏｉｌ１）、オレンジカロチノイド結合タンパク質、および膜輸送体タンパク質（例えば、ＳＴＬ１などの糖輸送体）であり得る。第２のドメインは、カロチノイド開裂ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）、またはイプシロン－カロチンおよびベータ－カロチンの適切な結合を開裂してアルファ－イオノンおよびベータ－イオノンを提供できる、他のモノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、およびペルオキシダーゼなどの機能的同等物であり得る。
【0009】
様々な実施形態では、本教示は、第１の核酸配列および第２の核酸配列を含む合成のまたは組換えの核酸分子（すなわち、ＬＢＴ－ＣＣＤ融合酵素コード配列）に関し、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、融合酵素を一緒にコードし、こうした融合酵素は、脂質体区画化シグナルタグとして機能できる第１のドメインおよびカロチノイド開裂活性を有する第２のドメインを含む。いくつかの実施形態では、脂質体区画化シグナルタグは、脂質体構造タンパク質、含油性誘導性脂肪滴タンパク質、オレンジカロチノイド結合タンパク質、および膜輸送体タンパク質からなる群から選択できる。ある特定の実施形態では、脂質体区画化シグナルタグは、１５ｋＤａ～２６ｋＤａの分子量を有する脂質体構造タンパク質などの、小さい脂質体構造タンパク質であり得る。例えば、その分子量は、２５ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満、または約１７または１８ｋＤａであり得る。好ましい実施形態では、融合酵素の第１のドメインは、オレオシンまたはカレオシンであり得る。特定の実施形態では、融合酵素の第１のドメインは、配列番号２９または配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質体区画化シグナルタグは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、トウダイグサ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）、Ｃｏｉｘ ｌａｃｒｙｍａ、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、またはアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）由来のカレオシンであり得る。
【0010】
様々な実施形態では、ＣＣＤ酵素に融合される脂質体区画化シグナルタグは、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）１６ｋＤａオレオシンタンパク質または脂質体に結合し得るその機能的バリアントであり得る。例えば、トウモロコシ１６ｋＤａオレオシンタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、トウモロコシ１６ｋＤａオレオシンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、トウモロコシ１６ｋＤａオレオシンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第１の核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0011】
様々な実施形態では、ＣＣＤ酵素に融合される脂質体区画化シグナルタグは、ゴマ１７ｋＤａオレオシンタンパク質または脂質体に結合し得るその機能的バリアントであり得る。例えば、ゴマ１７ｋＤａオレオシンタンパク質は、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ゴマ１７ｋＤａオレオシンタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ゴマ１７ｋＤａオレオシンタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第１の核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0012】
様々な実施形態では、ＣＣＤ酵素に融合される脂質体区画化シグナルタグは、リムノスピラ（Ｌｉｍｎｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）オレンジカロチノイド結合タンパク質または脂質体に結合し得るその機能的バリアントであり得る。例えば、オレンジカロチノイド結合タンパク質は、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、オレンジカロチノイド結合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、オレンジカロチノイド結合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第１の核酸配列は、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0013】
様々な実施形態では、ＣＣＤ酵素に融合される脂質体区画化シグナルタグは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）膜輸送体Ｓｔｌ１ｐタンパク質または脂質体に結合し得るその機能的バリアントであり得る。例えば、膜輸送体Ｓｔｌ１ｐタンパク質は、配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、膜輸送体Ｓｔｌ１ｐタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、膜輸送体Ｓｔｌ１ｐタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第１の核酸配列は、配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0014】
様々な実施形態では、ＣＣＤ酵素に融合される脂質体区画化シグナルタグは、ヤロウイア・リポリティカ脂質滴タンパク質Ｏｉｌ１ｐまたは脂質体に結合し得るその機能的バリアントであり得る。例えば、脂質滴タンパク質Ｏｉｌ１ｐは、配列番号９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、脂質滴タンパク質Ｏｉｌ１ｐは、配列番号９のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、脂質滴タンパク質Ｏｉｌ１ｐは、配列番号９のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第１の核酸配列は、配列番号１０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0015】
様々な実施形態では、ＣＣＤ酵素に融合される脂質体区画化シグナルタグは、シロイヌナズナカレオシンまたは脂質体に結合し得るその機能的バリアントであり得る。例えば、シロイヌナズナカレオシンは、配列番号３１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態ではシロイヌナズナカレオシンは、配列番号３１のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態ではシロイヌナズナカレオシンは、配列番号３１のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第１の核酸配列は、配列番号３２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0016】
様々な実施形態では、ＣＣＤ酵素に融合される脂質体区画化シグナルタグは、ゴマカレオシンまたは脂質体に結合し得るその機能的バリアントであり得る。例えば、ゴマは、配列番号３３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ゴマは、配列番号３３のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ゴマは、配列番号３３のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第１の核酸配列は、配列番号３４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0017】
様々な実施形態では、本教示による融合酵素は、溶解度増強タグを含まない。このような溶解度増強タグの例としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、小さいユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）タンパク質、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはチオレドキシン（ＴｒｘＡ）が挙げられる。
【0018】
様々な実施形態では、カロチノイド開裂活性を有する第２のドメインは、カロチノイド－開裂ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）であり得る。例えば、ＣＣＤ酵素は、広範囲のカロチノイドの結合５，６（５’、６’）、７，８（７’、８’）、および９，１０（９’、１０’）の二重結合を開裂できるＣＣＤ１またはＣＣＤ４酵素であり得る。例えば、第２のドメインは、ツクバネアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｘ ｈｙｂｒｉｄａ）ＣＣＤ１（ＰｈＣＣＤ１）またはその機能的バリアントであり得る。例えば、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第２の核酸配列は、配列番号１２または配列番号１３に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0019】
別の実施形態では、第２のドメインは、モクセイ（Ｏｓｍａｎｔｈｕｓ ｆｒａｇｒａｎｓ）ＣＣＤ１酵素またはその機能的バリアントであり得る。例えば、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第２の核酸配列は、配列番号１５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0020】
さらに別の実施形態では、第２のドメインは、トウモロコシＣＣＤ１またはその機能的バリアントであり得る。例えば、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第２の核酸配列は、配列番号１７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0021】
他の実施形態では、第２のドメインは、これらに限定されないが、シアノバクテリアネンジュモ（Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カロトリクス属（Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ ｓｐ．）Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ ｂｒｅｖｉｓｓｉｍａ、およびＳｃｙｔｏｎｅｍａ ｍｉｌｌｅｉなどの様々なシアノバクテリア由来の、カロチノイドオキシゲナーゼ、９－シスエポキシカロチノイドジオキシゲナーゼ、またはその機能的バリアントであり得る。例えば、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第２の核酸配列は、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３または配列番号２５に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0022】
いくつかの実施形態では、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、ツクバネアサガオ、モクセイ、トウモロコシ、シロイヌナズナ、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、およびヨーロッパキイチゴ（Ｒｕｂｕｓ ｉｄａｅｕｓ）由来のＣＣＤ１酵素を含み得る。他の実施形態では、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、シロイヌナズナ、ベニノキ（Ｂｉｘａ Ｏｒｅｌｌａｎａ）、コギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）、サフラン（Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、マレーヤマバショウ（Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ）、セイヨウリンゴ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、ダマスクバラ（Ｒｏｓａ ｄａｍａｓｃｅｎｅ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、およびモクセイ由来のＣＣＤ４酵素を含み得る。所望のイオノン化合物がアルファ－イオノンである実施形態において、第２のドメインまたはＣＣＤドメインは、ツクバネアサガオまたはモクセイのＣＣＤ１酵素、コギクのＣＣＤ４酵素、またはそれらの機能的相同体を含み得る。所望のイオノン化合物がベータ－イオノンである実施形態において、第２ドメインのまたはＣＣＤドメインは、ツクバネアサガオまたはモクセイのＣＣＤ１酵素、モモのＣＣＤ４酵素、またはそれらの機能的相同体を含み得る。
【0023】
様々な実施形態では、核酸分子は、一方の末端で第１の核酸配列に、他方の末端で第２の核酸配列に作動可能に連結された第３の核酸配列を含み得、第３の核酸配列は、第１のドメインを第２のドメインに連結するリンカーをコードする。例えば、リンカーは、３～３０アミノ酸長を含み得る。リンカーは、グリシン、セリン、スレオニン、およびそれらの組み合わせの群から選択されるアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンリンカーであり得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳの１つ以上のユニットを含み得る。特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳであり得る。代替的実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであり得る。
【0024】
本教示の別の態様は、核酸構築物に関する。核酸構築物は、異種核酸配列に作動可能に連結された上記核酸分子の様々な実施形態を含んでよい。例えば、異種核酸配列は、プロモーター配列などの発現制御配列をコードできる。いくつかの実施形態では、核酸構築物はまた、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）リコペンイプシロン－シクラーゼ（ＥＣ）などのリコペンイプシロン－シクラーゼまたはその機能的相同体をコードする異種核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸構築物はまた、フィトエンシンターゼ（ＣａｒＲＰ）をコードする異種核酸配列を含み得る。
【0025】
本教示のさらに別の態様は、本明細書に記載のカロチノイド開裂ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）ドメインに連結された脂質体区画化シグナルタグ（ＬＢＴ）ドメインを含む融合酵素に関する。ＬＢＴドメインは、リンカーを介してＣＣＤドメインに連結され得る。例えば、リンカーは、３～３０アミノ酸長を含み得る。リンカーは、グリシン、セリン、スレオニン、およびそれらの組み合わせの群から選択されるアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンリンカーであり得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳの１つ以上のユニットを含んでよい。特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳであり得る。代替的実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであり得る。様々な実施形態では、融合酵素は、リンカーを介してＣＣＤドメインに融合されるＬＢＴドメインからなり得る。
【0026】
本教示のさらに別の態様は、宿主細胞を形質転換する方法に関し得る。この方法は、宿主細胞に上記の本核酸分子または核酸構築物のいずれかを導入すること、およびカロチノイド（例えば、イオノン）化合物の産生のために使用できる形質転換宿主細胞を選択またはスクリーニングすること、を含み得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、藻類細胞、または真菌細胞などの微生物細胞であり得る。他の実施形態では、宿主細胞は、目的のカロチノイドおよびイオノンを天然に産生しない植物細胞であり得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ヤロウイア；エシェリヒア；サルモネラ；バチルス；アシネトバクター；ストレプトマイセス；コリネバクテリウム；メチロシヌス；メチロモナス；ロドコッカス；シュードモナス；ロドバクター；シネコシスティス；サッカロミセス；チゴサッカロミセス；クルイウェロマイセス；カンジダ；ハンセヌラ；デバリオミセス；ムコール；ピキア；トルロプシス；アスペルギルス；アルスロボトリス；ブレビバクテリア；マイコバクテリウム；アルスロバクター；シトロバクター；クレブシエラ；パントエア；およびクロストリジウムから選択され得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、ヤロウイア・リポリティカ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であり得る。
【0027】
本教示のさらに別の態様は、上記の本核酸分子のいずれかを含む組換え細胞に関し得る。組換え細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、細菌細胞、酵母細胞、藻類細胞、または真菌細胞などの微生物細胞であり得る。他の実施形態では、組換え細胞は、目的のイオノンを天然に産生しない植物細胞であり得る。ある特定の実施形態では、組換え細胞は、ヤロウイア；エシェリヒア；サルモネラ；バチルス；アシネトバクター；ストレプトマイセス；コリネバクテリウム；メチロシヌス；メチロモナス；ロドコッカス；シュードモナス；ロドバクター；シネコシスティス；サッカロミセス；チゴサッカロミセス；クルイウェロマイセス；カンジダ；ハンセヌラ；デバリオミセス；ムコール；ピキア；トルロプシス；アスペルギルス；アルスロボトリス；ブレビバクテリア；マイコバクテリウム；アルスロバクター；シトロバクター；クレブシエラ；パントエア；およびクロストリジウムから選択され得る。特定の実施形態では、組換え細胞は、ヤロウイア・リポリティカ、サッカロミセス・セレビシエ、またはコリネバクテリウム・グルタミカムであり得る。
【0028】
本教示のさらに別の態様は、アルファ－イオノンまたはベータ－イオノンなどのイオノン化合物を産生するための方法に関し得る。本方法は、本教示による組換え宿主細胞を好適な培地（例えば、グルコースまたはグリセロールを含む培地）中で、それによりイオノン化合物が産生される条件下で培養することを含み得る。組換え宿主細胞は、本発明の核酸分子または上記の構築物のいずれかを含んでよく、培養ステップは、本教示による融合酵素の発現をもたらし、結果として、組換え宿主細胞によるアルファ－イオノンまたはベータ－イオノンの産生を増加させる。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、メバロン酸経路に関与する１つ以上の遺伝子を過剰発現するようにさらに形質転換され得る。例えば、アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンの両方の産生の前駆体であるリコペンの産生を増加させるために、形質転換宿主細胞は、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）、およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）の１つ以上を過剰発現するように形質転換され得る。いくつかの実施形態では、形質転換宿主細胞は、ＧＧＰＰＳにイン－フレームで融合されたＦＰＰＳ（ＦＰＰＳ：：ＧＧＰＰＳ）を含む融合酵素をコードする合成核酸分子を過剰発現するように形質転換され得る。いくつかの実施形態では、形質転換宿主細胞はさらに、フィトエンデヒドロゲナーゼ（ＣａｒＢ）、二官能性リコペンシクラーゼ／フィトエンシンターゼ（ＣａｒＲＰ）、またはその変異体（例えば、変異体ＣａｒＲＰ－Ｅ７８Ｋ（ＣａｒＲＰ＊）、ここで、変異は、ＣａｒＲＰ酵素のリコペンシクラーゼ活性をノックアウトする）を過剰発現するように形質転換され得る。例えば、ベータ－カロチンの産生を増加させるために、ベータ－イオノンの直前の前駆体である形質転換宿主細胞を、ＣａｒＲＰおよびＣａｒＢを過剰発現するように形質転換し、これが今度はベータ－イオノンの産生を増加させる。あるいは、イプシロン－カロチンの産生を増加させるために、形質転換宿主細胞を、ＣａｒＲＰ＊、ＣａｒＢ、およびイプシロン－シクラーゼ（ＥＣ）遺伝子を過剰発現するように形質転換できる。例えば、イプシロン－シクラーゼ遺伝子は、レタスＥＣ遺伝子であり得る。こうした実施形態では、形質転換宿主細胞は、配列番号２６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を有する核酸分子を過剰発現するように形質転換され得る。ある特定の実施形態では、形質転換宿主細胞は、第１のＥＣドメインおよび第２のＣＣＤドメインを有する融合酵素をコードする核酸分子を過剰発現するように形質転換され得、ＥＣドメインは、本教示によるリンカーを介してＣＣＤドメインに連結されて、イプシロン－カロチン、および次いでアルファ－イオノンの産生をさらに改善する。
【0029】
本教示は、カロチノイド化合物を産生するための組換え宿主細胞も包含する。宿主細胞は、ベータ－カロチンケトラーゼ（ＢＫＴもしくはＣｒｔＷ）またはベータ－カロチンヒドロキシラーゼ（ＣｒｔＲ－Ｂ）に融合されたＬＢＴドメイン（例えば、オレオシンまたはカレオシンポリペプチド）を有する融合酵素をコードするコード配列を含む少なくとも１つの核酸構築物を含み得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＬＢＴ－ＢＫＴ融合酵素をコードするコード配列およびＬＢＴ－ＣｒｔＲ－Ｂ融合酵素をコードするコード配列の両方を含み得る。ベータ－カロチンケトラーゼおよびベータ－カロチンヒドロキシラーゼは、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、クロレラ・ゾフィンギエンシス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．，）、およびパントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）由来であり得る。一実施形態では、本発明は、アスタキサンチンを産生する方法に関し、本方法は、アスタキサンチンが産生される条件下で、ＬＢＴ－ＢＫＴ融合酵素をコードするコード配列およびＬＢＴ－ＣｒｔＲ－Ｂ融合酵素をコードするコード配列の両方で形質転換された組換え宿主細胞を培養することを包含する。別の実施形態では、本発明は、カンタキサンチンを産生する方法に関し、本方法は、ＬＢＴ－ＣｒｔＷ融合酵素をコードするコード配列で形質転換された組換え宿主細胞を、カンタキサンチンが産生される条件下で培養することを含む。
【0030】
本開示は、様々な改変および代替形態の影響を受けやすいが、その特定の実施形態が、例として図面に示され、本明細書で詳細に説明される。しかしながら、本明細書に提示される図面および詳細な説明は、開示される特定の実施形態に本開示を限定することを意図するものではなく、反対に、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨および範囲内にあるすべての変形、均等物、および代替物を網羅することを意図するものであることが理解されるべきである。
【0031】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を参照して、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明において明らかになるであろう。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれ、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによってより良く理解され得る。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれ、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによってより良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】（Ｒ）－アルファ－イオノン（上）、（Ｓ）－アルファ－イオノン（中心）、およびベータ－イオノン（下）の化学構造を示す。
【図2】本教示によるアルファ－イオノンおよびベータ－イオノンへの生合成経路を示す。上の部分は、選択された宿主細胞において内因的に起こり得るメバロン酸経路を示す。下の部分は、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）からフィトエンへ、リコペンへの異種生合成経路を示し、これは、イプシロン－シクラーゼ（ＥＣ）遺伝子または二官能性リコペンシクラーゼ／フィトエンシンターゼ（ＣａｒＲＰ）が過剰発現されるかに応じて、それぞれ、イプシロン－カロチンまたはベータ－カロチンを導く。本教示によるＬＢＴ－ＣＣＤ融合酵素の存在下で、イプシロン－カロチンは、アルファ－イオノンに変換され、ベータ－カロチンは、ベータ－イオノンに変換される。灰色で網掛けされている遺伝子は、形質転換宿主細胞で過剰発現される遺伝子である。
【図3】ヤロウイア・リポリティカ（ＡおよびＢ）およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ）における脂質体または脂質滴中のカロチノイド蓄積の顕微鏡画像を示す。
【図4】本発明者らが、図２に強調して示される種々の遺伝子を過剰発現させるために生成したプラスミドを示す。これらの遺伝子カセットを、実施例１、３、５、７および８にさらに詳細に記載されるとおり、ヤロウイア・リポリティカＡＴＣＣ ９０８１１株の染色体に組み込んだ。
【図5】形質転換ヤロウイア・リポリティカ株の細胞培養におけるイプシロン－カロチン産生を確認するＨＰＬＣプロフィルおよびＵＶスペクトルを示す。
【図6】形質転換ヤロウイア・リポリティカ株の細胞培養におけるベータ－カロチン産生を確認するＨＰＬＣプロフィルおよびＵＶスペクトルを示す。
【図7】形質転換ヤロウイア・リポリティカ株の細胞培養におけるアルファ－イオノン産生を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示す。
【図8】実施例７に記載された異なる戦略を用いて異種ＣＣＤ遺伝子（ＰｈＣＣＤ１）を過剰発現するように形質転換されたヤロウイア・リポリティカ株によるアルファ－イオノンの産生力価を比較する。
【図9】形質転換ヤロウイア・リポリティカ株の細胞培養におけるベータ－イオノン産生を確認するＧＣ／ＭＳスペクトルを示す。
【図10】ヘマトコッカス（左）およびクロレラ・ゾフィンギエンシス（右）におけるアスタキサンチン生合成経路を示す。酵素は、それらの遺伝子の命名に従って命名される。ＢＫＴ、ベータ－カロチノイドケトラーゼ；ＣｒｔＲ－Ｂ、ベータ－カロチノイドヒドロキシラーゼ。カンタキサンチンは、ベータ－カロチンからベータ－カロチノイドケトラーゼＣｒｔＷを介してエキネノンに、エキネノンからＣｒｔＷを介してカンタキサンチンへと合成できる。
【図11】ＣｒｔＲＢ酵素をコードするコード配列およびＢＫＴ酵素をコードするコード配列を含む核酸構築物（ｃｒｔＲＢ－ＢＫＴ）を用いて形質転換された株と比較して、ＬＢＴ－ＣｒｔＲＢ融合酵素をコードするコード配列およびＬＢＴ－ＢＫＴ融合酵素をコードするコード配列を含む核酸構築物（オレオシン：：ｃｒｔＲＢ－オレオシンン：：ＢＫＴ）を用いて形質転換された組換え微生物産生株を用いた場合の、アスタキサンチン（ＡＳ）およびゼアキサンチン（ＺＸ）の増加された産生を示す。ＣＸは、カンタキサンチンを表し、ＢＣは、ベータ－カロチンを表す。
【図12】ＣｒｔＷ酵素をコードするコード配列を含む核酸構築物（ｃｒｔＷ）で形質転換された株と比較して、ＬＢＴ－ＣｒｔＷ融合酵素をコードするコード配列を含む核酸構築物（オレオシン：：ｃｒｔＷ）で形質転換された組換え微生物産生株を用いた場合の、カンタキサンチン（ＣＸ）の増加された産生を示す。ＢＣは、ベータ－カロチンを示す。
【発明を実施するための形態】
【0033】
含油性酵母ヤロウイア・リポリティカは、アセチル－ＣｏＡ（カロチノイド主鎖の出発物質、図２参照）のその大きな細胞間プールサイズ、および十分に確立された遺伝的ツールボックスのため、カロチノイド産生のための最も多産の異種宿主の１つである。発明者らは、異なるカロチノイド前駆体生合成遺伝子の多数の組み合わせをスクリーニングした。本発明者らは、ＨＭＧＳ、ＨＭＧＲ、ＩＰＩ、ＦＰＰＳおよびＧＧＰＰＳ遺伝子の共過剰発現を介して、カロチノイド産生のための種々の効率の高い宿主株を作製した。ヤロウイア・リポリティカカロチノイド宿主株でのＣａｒＲＰ＊／ＣａｒＢ、ＣａｒＲＰ／ＣａｒＢ、またはｃａｒＲＰ＊／ＣａｒＢ／ＥＣ遺伝子の過剰発現は、リコペン（２ｇ／Ｌ）、ベータ－カロチン（４ｇ／Ｌ）またはイプシロン－カロチン（１．５ｇ／Ｌ）の高力価産生をもたらす。
【0034】
宿主としてリコペン産生ヤロウイア・リポリティカ株を用いて、本発明者らは、イオノン産生のために２８のＣＣＤ酵素をスクリーニングした。スクリーニングされた種々のＣＣＤ酵素のうち、植物ツクバネアサガオ由来のＰｈＣＣＤ１（配列番号１１）が、最も高い活性を呈した。しかし、野生型ＰｈＣＣＤ１で形質転換した株は、試験管ベースの細胞培養から３ｍｇ／Ｌ未満のアルファ－イオノンしか産生できなかった。ＣＣＤ酵素の触媒効率はイオノン化合物の発酵産生の重要なボトルネックであることが、報告された。ヤロウイア・リポリティカ宿主細胞の油性の性質は、カロチノイドの蓄積に非常に有用である。図３Ａおよび図３Ｂに示すとおり、赤色リコペンおよびオレンジ色イプシロン－カロチンが、ヤロウイア・リポリティカ細胞の脂質体中に蓄積する。同様に、カロチノイドを含む脂質滴が、コリネバクテリウム・グルタミカムカロチン産生株において観察される（図３Ｃ）。したがって、本発明者らは、脂質体（小滴）中のカロチンの蓄積が、カロチン基質分子のＣＣＤ酵素への結合を妨げ得ると仮定した。したがって、本発明者らは、ＰｈＣＣＤ１酵素自体に対するタンパク質工学的努力の他に、異なる推定区画化シグナルタグに連結されたＰｈＣＣＤ１を含む複数の融合酵素をスクリーニングすることにより、脂質体に基づく細胞内区画工学に基づく新規アプローチを調査することを決定した。実施例が示すように、このアプローチは、カロチノイド開裂酵素の効率の顕著な改善をもたらした。したがって、本発明は、商業的スケールアップ産生に好適である「天然の」アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンを産生するための経済的かつ信頼性のあるアプローチを提供する。
【0035】
アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンを作製する方法
本明細書に記載の方法は、いくつかの実施形態において、融合酵素およびそのような融合酵素を発現するように形質転換された組換え宿主細胞を用いる「天然の」アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンの産生を提供する。様々な実施形態では、本方法は、核酸分子で形質転換された成長する細胞を含む細胞系を含み、このような核酸分子は、第１の核酸配列および第２の核酸配列を含み、このような第１および第２の核酸配列は、一緒に、脂質体区画化シグナルタグとして機能できる第１のドメイン（本明細書では、ＬＢＴドメインと呼ばれることもある）およびカロチノイド開裂活性を有する第２のドメイン（本明細書では、カロチノイド開裂ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）ドメインと呼ばれることもある）を含む異種融合酵素をコードする。いくつかの実施形態では、細胞系は、細菌細胞、酵母細胞、目的のイオノンを天然で産生しない植物細胞、藻類細胞、細菌細胞および／または本明細書に記載される脂質体区画化シグナルタグおよび／またはＣＣＤを天然にコードしない真菌細胞を含み得る。特定の実施形態では、細胞系は、ヤロウイア；エシェリヒア；サルモネラ；バチルス；アシネトバクター；ストレプトマイセス；コリネバクテリウム；メチロシヌス；メチロモナス；ロドコッカス；シュードモナス；ロドバクター；シネコシスティス；サッカロミセス；チゴサッカロミセス；クルイウェロマイセス；カンジダ；ハンセヌラ；デバリオミセス；ムコール；ピキア；トルロプシス；アスペルギルス；アルスロボトリス；ブレビバクテリア；マイコバクテリウム；アルスロバクター；シトロバクター；クレブシエラ；パントエア；およびクロストリジウムから選択される成長中の細菌細胞および／または酵母細胞を含み得る。
本明細書に記載の方法は、いくつかの実施形態において、融合酵素およびそのような融合酵素を発現するように形質転換された組換え宿主細胞を用いる「天然の」アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンの産生を提供する。様々な実施形態では、本方法は、核酸分子で形質転換された成長する細胞を含む細胞系を含み、このような核酸分子は、第１の核酸配列および第２の核酸配列を含み、このような第１および第２の核酸配列は、一緒に、脂質体区画化シグナルタグとして機能できる第１のドメイン（本明細書では、ＬＢＴドメインと呼ばれることもある）およびカロチノイド開裂活性を有する第２のドメイン（本明細書では、カロチノイド開裂ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）ドメインと呼ばれることもある）を含む異種融合酵素をコードする。いくつかの実施形態では、細胞系は、細菌細胞、酵母細胞、目的のイオノンを天然で産生しない植物細胞、藻類細胞、細菌細胞および／または本明細書に記載される脂質体区画化シグナルタグおよび／またはＣＣＤを天然にコードしない真菌細胞を含み得る。特定の実施形態では、細胞系は、ヤロウイア；エシェリヒア；サルモネラ；バチルス；アシネトバクター；ストレプトマイセス；コリネバクテリウム；メチロシヌス；メチロモナス；ロドコッカス；シュードモナス；ロドバクター；シネコシスティス；サッカロミセス；チゴサッカロミセス；クルイウェロマイセス；カンジダ；ハンセヌラ；デバリオミセス；ムコール；ピキア；トルロプシス；アスペルギルス；アルスロボトリス；ブレビバクテリア；マイコバクテリウム；アルスロバクター；シトロバクター；クレブシエラ；パントエア；およびクロストリジウムから選択される成長中の細菌細胞および／または酵母細胞を含み得る。
【0036】
アルファ－イオノンまたはベータ－イオノン生合成のための経路および酵素
図２を参照して、グルコースまたはグリセロールのような炭素源からのアルファ－イオノンおよびベータ－イオノンの生合成産生を、微生物宿主細胞における一連の天然のおよび異種の遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ過剰発現を介して行うことができる。イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびその異性体ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）は、カロチノイドの直接前駆体であるゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を作製するためのＣ５構成要素である。植物または真菌宿主細胞では、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰは、メバロン酸（ＭＶＡ）経路から産生され得る。アセチル－ＣｏＡの２分子は、アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによってアセトアセチル－ＣｏＡの１分子に縮合される（ＡｔｏＢ）。アセトアセチル－ＣｏＡは、それぞれ、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）およびＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）により中間ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）を介してメバロン酸に変換される。次いで、ＩＰＰが、メバロン酸キナーゼ（ＭｅｖＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）およびホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）の３つの酵素によりメバロン酸から産生される。ＭＶＡ経路は、ＩＰＰからＤＭＡＰＰを生成するためにイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）を必要とする。複数のＩＰＰおよびＤＭＡＰＰ分子の連結により、ＧＧＰＰが形成される。二官能性リコペンシクラーゼ／フィトエンシンターゼＣａｒＲＰにより触媒される２つのＧＧＰＰユニットの縮合により、フィトエンが産生され、これは次いでフィトエンデヒドロゲナーゼＣａｒＢによりリコペンに変換される。リコペンは、イプシロン－シクラーゼ（ＥＣ）によりイプシロン－カロチンに環化されるか、ＣａｒＲＰによりベータ－カロチンに環化される。ＣＣＤ酵素によるイプシロン－カロチンまたはベータ－カロチンの開裂は、それぞれ、アルファ－イオノンまたはベータ－イオノンの産生をもたらす。
図２を参照して、グルコースまたはグリセロールのような炭素源からのアルファ－イオノンおよびベータ－イオノンの生合成産生を、微生物宿主細胞における一連の天然のおよび異種の遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ過剰発現を介して行うことができる。イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびその異性体ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）は、カロチノイドの直接前駆体であるゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を作製するためのＣ５構成要素である。植物または真菌宿主細胞では、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰは、メバロン酸（ＭＶＡ）経路から産生され得る。アセチル－ＣｏＡの２分子は、アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによってアセトアセチル－ＣｏＡの１分子に縮合される（ＡｔｏＢ）。アセトアセチル－ＣｏＡは、それぞれ、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）およびＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）により中間ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）を介してメバロン酸に変換される。次いで、ＩＰＰが、メバロン酸キナーゼ（ＭｅｖＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）およびホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤ）の３つの酵素によりメバロン酸から産生される。ＭＶＡ経路は、ＩＰＰからＤＭＡＰＰを生成するためにイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＰＩ）を必要とする。複数のＩＰＰおよびＤＭＡＰＰ分子の連結により、ＧＧＰＰが形成される。二官能性リコペンシクラーゼ／フィトエンシンターゼＣａｒＲＰにより触媒される２つのＧＧＰＰユニットの縮合により、フィトエンが産生され、これは次いでフィトエンデヒドロゲナーゼＣａｒＢによりリコペンに変換される。リコペンは、イプシロン－シクラーゼ（ＥＣ）によりイプシロン－カロチンに環化されるか、ＣａｒＲＰによりベータ－カロチンに環化される。ＣＣＤ酵素によるイプシロン－カロチンまたはベータ－カロチンの開裂は、それぞれ、アルファ－イオノンまたはベータ－イオノンの産生をもたらす。
【0037】
図２を続いて参照して、本教示に従って形質転換された微生物宿主細胞において過剰発現される遺伝子が、灰色で強調／陰影付けされる。具体的には、これらは以下を含む：ＨＭＧＳ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＸＰ＿５０６０５２．１）；ＨＭＧＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＲＤＷ２５０９１．１）；ＩＰＩ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＸＰ＿５０４９７４．１）；ＦＰＰＳ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＸＰ＿５０３５９９．１）；ＧＧＰＰＳ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＸＰ＿５０２９２３．１）；ＣａｒＲＰ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ９ＵＵＱ６．１）；ＣａｒＲＰ＊（７８位でリジンに変異したグルタミン酸を有する変異体ＣａｒＲＰ－Ｅ７８Ｋ）；ＣａｒＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＯＡＤ０７７２５．１）；ＥＣ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＫ０７４３４．１）；およびＰｈＣＣＤ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＴ６８１８９．１）。
【0038】
脂質体区画化シグナルタグ
図３を参照して、ヤロウイア・リポリティカ（ＡおよびＢ）およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ）における脂質体（小滴）中のカロチン基質の蓄積を観察した。脂質体（小滴）は、トリアシルグリセロールおよびステリルエステルなどの中性脂質の形態で代謝エネルギーを貯蔵するユビキタスオルガネラである。推定脂質体区画化シグナルタグは、脂質体の形成を促進する脂質合成酵素、および脂質体集合体のための構造または膜タンパク質を含み得る。加えて、オレンジカロチノイド結合タンパク質は、カロチノイドに対するその高い親和性のため有用であり得る。多数の候補タンパク質の厳密なスクリーニングを実施後に、本発明者らは、脂質体区画化シグナルタグとＣＣＤ酵素が融合酵素として一緒に発現されるときに、ヤロウイア・リポリティカ細胞におけるＣＣＤ酵素のｉｎ ｖｉｖｏカロチノイド開裂効率の改善をもたらした、特定の推定脂質体区画化シグナルタグを同定した。これらの脂質体区画化シグナルタグは、脂質体構造タンパク質（例えば、様々なオレオシンおよびカレオシン）、含油性誘導性脂質滴タンパク質（例えば、Ｏｉｌ１）、オレンジカロチノイド結合タンパク質、および膜輸送体タンパク質（例えば、ＳＴＬ１などの糖輸送体）を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質体区画化シグナルタグは、配列番号２９または配列番号３０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むオレオシンであり得る。いくつかの実施形態では、脂質体区画化シグナルタグは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、トウダイグサ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）、Ｃｏｉｘ ｌａｃｒｙｍａ、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、またはアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）由来のカレオシンであり得る。いくつかの実施形態では、脂質体区画化シグナルタグは、リムノスピラ（Ｌｉｍｎｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）オレンジカロチノイド結合タンパク質、ヤロウイア・リポリティカ膜輸送体Ｓｔｌ１ｐタンパク質、ヤロウイア・リポリティカ脂質滴タンパク質Ｏｉｌ１ｐ、トウモロコシ１６ｋＤａオレオシン、ゴマ１７ｋＤａオレオシン、シロイヌナズナカレオシン、およびゴマカレオシンからなる群から選択され得る。任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、トウモロコシオレオシンおよびゴマオレオシンの保存ドメインにそれぞれ対応する、配列番号２９または配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本教示による脂質体区画化シグナルタグとして有用であり得ると考えている。
図３を参照して、ヤロウイア・リポリティカ（ＡおよびＢ）およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ）における脂質体（小滴）中のカロチン基質の蓄積を観察した。脂質体（小滴）は、トリアシルグリセロールおよびステリルエステルなどの中性脂質の形態で代謝エネルギーを貯蔵するユビキタスオルガネラである。推定脂質体区画化シグナルタグは、脂質体の形成を促進する脂質合成酵素、および脂質体集合体のための構造または膜タンパク質を含み得る。加えて、オレンジカロチノイド結合タンパク質は、カロチノイドに対するその高い親和性のため有用であり得る。多数の候補タンパク質の厳密なスクリーニングを実施後に、本発明者らは、脂質体区画化シグナルタグとＣＣＤ酵素が融合酵素として一緒に発現されるときに、ヤロウイア・リポリティカ細胞におけるＣＣＤ酵素のｉｎ ｖｉｖｏカロチノイド開裂効率の改善をもたらした、特定の推定脂質体区画化シグナルタグを同定した。これらの脂質体区画化シグナルタグは、脂質体構造タンパク質（例えば、様々なオレオシンおよびカレオシン）、含油性誘導性脂質滴タンパク質（例えば、Ｏｉｌ１）、オレンジカロチノイド結合タンパク質、および膜輸送体タンパク質（例えば、ＳＴＬ１などの糖輸送体）を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質体区画化シグナルタグは、配列番号２９または配列番号３０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むオレオシンであり得る。いくつかの実施形態では、脂質体区画化シグナルタグは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、トウダイグサ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）、Ｃｏｉｘ ｌａｃｒｙｍａ、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、またはアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）由来のカレオシンであり得る。いくつかの実施形態では、脂質体区画化シグナルタグは、リムノスピラ（Ｌｉｍｎｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）オレンジカロチノイド結合タンパク質、ヤロウイア・リポリティカ膜輸送体Ｓｔｌ１ｐタンパク質、ヤロウイア・リポリティカ脂質滴タンパク質Ｏｉｌ１ｐ、トウモロコシ１６ｋＤａオレオシン、ゴマ１７ｋＤａオレオシン、シロイヌナズナカレオシン、およびゴマカレオシンからなる群から選択され得る。任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、トウモロコシオレオシンおよびゴマオレオシンの保存ドメインにそれぞれ対応する、配列番号２９または配列番号３０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本教示による脂質体区画化シグナルタグとして有用であり得ると考えている。
【0039】
様々な実施形態では、ＣＣＤ酵素に融合される脂質体区画化シグナルタグは、トウモロコシ１６ｋＤａオレオシンタンパク質または脂質体に結合し得るその機能的バリアントであり得る。例えば、トウモロコシ１６ｋＤａオレオシンタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、トウモロコシ１６ｋＤａオレオシンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、トウモロコシ１６ｋＤａオレオシンタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第１の核酸配列は、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0040】
様々な実施形態では、ＣＣＤ酵素に融合される脂質体区画化シグナルタグは、ゴマ１７ｋＤａオレオシンタンパク質または脂質体に結合し得るその機能的バリアントであり得る。例えば、ゴマ１７ｋＤａオレオシンタンパク質は、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ゴマ１７ｋＤａオレオシンタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ゴマ１７ｋＤａオレオシンタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第１の核酸配列は、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0041】
様々な実施形態では、ＣＣＤ酵素に融合される脂質体区画化シグナルタグは、リムノスピラ（Ｌｉｍｎｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）オレンジカロチノイド結合タンパク質または脂質体に結合し得るその機能的バリアントであり得る。例えば、オレンジカロチノイド結合タンパク質は、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、オレンジカロチノイド結合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、オレンジカロチノイド結合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第１の核酸配列は、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0042】
様々な実施形態では、ＣＣＤ酵素に融合される脂質体区画化シグナルタグは、ヤロウイア・リポリティカ膜輸送体Ｓｔｌ１ｐタンパク質または脂質体に結合し得るその機能的バリアントであり得る。例えば、膜輸送体Ｓｔｌ１ｐタンパク質は、配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、膜輸送体Ｓｔｌ１ｐタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、膜輸送体Ｓｔｌ１ｐタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第１の核酸配列は、配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0043】
様々な実施形態では、ＣＣＤ酵素に融合される脂質体区画化シグナルタグは、ヤロウイア・リポリティカ脂質滴タンパク質Ｏｉｌ１ｐまたは脂質体に結合し得るその機能的バリアントであり得る。例えば、脂質滴タンパク質Ｏｉｌ１ｐは、配列番号９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、脂質滴タンパク質Ｏｉｌ１ｐは、配列番号９のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、脂質滴タンパク質Ｏｉｌ１ｐは、配列番号９のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第１の核酸配列は、配列番号１０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0044】
様々な実施形態では、ＣＣＤ酵素に融合された脂質体区画化シグナルタグは、シロイヌナズナカレオシンまたは脂質体に結合できるその機能的バリアントであり得る。例えば、シロイヌナズナカレオシンは、配列番号３１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態ではシロイヌナズナカレオシンは、配列番号３１のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、シロイヌナズナカレオシンは、配列番号３１のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第１の核酸配列は、配列番号３２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0045】
様々な実施形態では、ＣＣＤ酵素に融合される脂質体区画化シグナルタグは、ゴマカレオシンまたは脂質体に結合し得るその機能的バリアントであり得る。例えば、ゴマは、配列番号３３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ゴマは、配列番号３３のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ゴマは、配列番号３３のアミノ酸配列からなり得る。したがって、第１の核酸配列は、配列番号３４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【0046】
カロチノイド開裂ドメイン
カロチノイド開裂活性を呈する酵素は、種々のカロチノイド開裂ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）を含み得る。例えば、本発明の融合酵素のカロチノイド開裂ドメインは、広範囲のカロチノイドの二重結合５，６（５’、６’）、７，８（７’、８’）、および９，１０（９’、１０’）を開裂できるＣＣＤ１またはＣＣＤ４酵素であり得る。例えば、ＣＣＤは、ツクバネアサガオＣＣＤ（ＰｈＣＣＤ１）またはその機能的バリアントであり得る。例えば、ＣＣＤは、配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ＣＣＤは、配列番号１１のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ＣＣＤは、配列番号１１のアミノ酸配列からなり得る。他の実施形態では、ＣＣＤは、モクセイＣＣＤまたはその機能的バリアントであり得る。例えば、ＣＣＤは、配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ＣＣＤは、配列番号１４のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ＣＣＤは、配列番号１４のアミノ酸配列からなり得る。さらに他の実施形態では、ＣＣＤは、トウモロコシＣＣＤまたはその機能的バリアントであり得る。例えば、ＣＣＤは、配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ＣＣＤは、配列番号１６のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ＣＣＤは、配列番号１６のアミノ酸配列からなり得る。
カロチノイド開裂活性を呈する酵素は、種々のカロチノイド開裂ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）を含み得る。例えば、本発明の融合酵素のカロチノイド開裂ドメインは、広範囲のカロチノイドの二重結合５，６（５’、６’）、７，８（７’、８’）、および９，１０（９’、１０’）を開裂できるＣＣＤ１またはＣＣＤ４酵素であり得る。例えば、ＣＣＤは、ツクバネアサガオＣＣＤ（ＰｈＣＣＤ１）またはその機能的バリアントであり得る。例えば、ＣＣＤは、配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ＣＣＤは、配列番号１１のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ＣＣＤは、配列番号１１のアミノ酸配列からなり得る。他の実施形態では、ＣＣＤは、モクセイＣＣＤまたはその機能的バリアントであり得る。例えば、ＣＣＤは、配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ＣＣＤは、配列番号１４のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ＣＣＤは、配列番号１４のアミノ酸配列からなり得る。さらに他の実施形態では、ＣＣＤは、トウモロコシＣＣＤまたはその機能的バリアントであり得る。例えば、ＣＣＤは、配列番号１６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ＣＣＤは、配列番号１６のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ＣＣＤは、配列番号１６のアミノ酸配列からなり得る。
【0047】
いくつかの実施形態では、ＣＣＤは、ＰｈＣＣＤ１の相同体であり得る。例えば、ＣＣＤは、カロチノイドオキシゲナーゼ、９－シスエポキシカロチノイドジオキシゲナーゼ、またはその機能的バリアントであり得る。このような相同体は、これらに限定されないが、シアノバクテリアネンジュモ（Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カロトリクス属（Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ ｓｐ．）Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ ｂｒｅｖｉｓｓｉｍａ、およびＳｃｙｔｏｎｅｍａ ｍｉｌｌｅｉなどの、種々のシアノバクテリアに由来し得る。例えば、ＣＣＤは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ＣＣＤは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ＣＣＤは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４のアミノ酸配列からなり得る。
【0048】
いくつかの実施形態では、ＣＣＤドメインは、シロイヌナズナ、ブドウ、ニンジン、トマト、およびヨーロッパキイチゴ由来のＣＣＤ１酵素を含み得る。他の実施形態では、ＣＣＤドメインは、シロイヌナズナ、ベニノキ（Ｂｉｘａ Ｏｒｅｌｌａｎａ）、コギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）、サフラン（Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、マレーヤマバショウ（Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａ）、セイヨウリンゴ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、ダマスクバラ（Ｒｏｓａ ｄａｍａｓｃｅｎｅ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、およびモクセイ由来のＣＣＤ４酵素を含み得る。所望のイオノン化合物がアルファ－イオノンである実施形態において、ＣＣＤドメインは、ツクバネアサガオまたはモクセイのＣＣＤ１酵素、コギクのＣＣＤ４酵素、またはそれらの機能的相同体を含み得る。所望のイオノン化合物がベータ－イオノンである実施形態において、ＣＣＤドメインは、ツクバネアサガオまたはモクセイのＣＣＤ１酵素、モモのＣＣＤ４酵素、またはそれらの機能的相同体を含み得る。
【0049】
融合酵素
融合酵素を含む融合タンパク質は、多機能特性を有する新規生体分子のクラスとして開発されている。２つ以上のタンパク質ドメインを一緒に遺伝的に融合させることにより、融合タンパク質産物は、それらの構成部分の各々に由来する多くの別個の機能を得ることができる。組換え融合タンパク質を成功裏に構築するには、２つの必須要素：構成タンパク質およびリンカーを必要とする。構成タンパク質の選択は、融合タンパク質産物の所望の機能に基づき、本教示によれば、上述のＬＢＴドメインおよびＣＣＤドメインを含む。タンパク質ドメインを一緒に接合させるための好適なリンカーの選択は、好適でないリンカーが融合タンパク質のミスフォールディング、タンパク質産生における低収率、または生物活性の障害をもたらし得るので、複雑であり得る。
融合酵素を含む融合タンパク質は、多機能特性を有する新規生体分子のクラスとして開発されている。２つ以上のタンパク質ドメインを一緒に遺伝的に融合させることにより、融合タンパク質産物は、それらの構成部分の各々に由来する多くの別個の機能を得ることができる。組換え融合タンパク質を成功裏に構築するには、２つの必須要素：構成タンパク質およびリンカーを必要とする。構成タンパク質の選択は、融合タンパク質産物の所望の機能に基づき、本教示によれば、上述のＬＢＴドメインおよびＣＣＤドメインを含む。タンパク質ドメインを一緒に接合させるための好適なリンカーの選択は、好適でないリンカーが融合タンパク質のミスフォールディング、タンパク質産生における低収率、または生物活性の障害をもたらし得るので、複雑であり得る。
【0050】
いくつかの実施形態では、第１のＬＢＴドメインを第２のＣＣＤドメインに連結するために使用されるリンカーは、３～３０アミノ酸長を含み得る。リンカーは、グリシン、セリン、スレオニン、およびそれらの組み合わせの群から選択されるアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンリンカーであり得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳの１つ以上のユニットを含むことができる。特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳであり得る。代替的実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであり得る。
【0051】
本発明の融合酵素は、リンカーを介してＣＣＤドメインに融合されたＬＢＴドメインからなり得る。融合酵素は、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、小さいユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）タンパク質、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはチオレドキシン（ＴｒｘＡ）、またはそれらの任意の機能的相同体を含む任意の構成成分を含まなくてよい。
【0052】
核酸および核酸構築物
本教示による核酸分子は、ＬＢＴドメインおよびＣＣＤドメインを含む融合酵素を一緒にコードする第１の核酸配列および第２の酸配列を有する合成および組換え核酸分子を含む。様々な実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。様々な実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、または配列番号２５に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。様々な実施形態では、本核酸分子はまた、本明細書に記載のリンカーをコードする第３の核酸配列を含む。
本教示による核酸分子は、ＬＢＴドメインおよびＣＣＤドメインを含む融合酵素を一緒にコードする第１の核酸配列および第２の酸配列を有する合成および組換え核酸分子を含む。様々な実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。様々な実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、または配列番号２５に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。様々な実施形態では、本核酸分子はまた、本明細書に記載のリンカーをコードする第３の核酸配列を含む。
【0053】
本教示による核酸構築物は、他の異種核酸配列に作動可能に連結され得る、本明細書に提供される合成または組換え核酸分子を含み得る。例えば、本明細書に提供される構築物は、本明細書に記載の１つ以上の融合酵素をコードする核酸配列を含んでよく、その核酸配列は、他の異種核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、異種核酸配列は、調節エレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の融合酵素をコードする核酸配列は、ターミネーター配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、ヤロウイア細胞中で機能的である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される核酸構築物は、発現カセットまたはベクターとしてさらに定義される。
【0054】
細胞系
本明細書において言及されるとおり、本発明の方法による細胞系は、ＣＣＤドメインに連結されたＬＢＴドメインを含む本発明の融合酵素を発現するために使用できる任意の細胞（複数可）を含み得る。このような細胞系としては、これらに限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞を挙げることができる。いくつかの実施形態では、細胞系は、細菌細胞、酵母細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞系は、原核細胞、真核細胞、およびそれらの組み合わせを含む。
本明細書において言及されるとおり、本発明の方法による細胞系は、ＣＣＤドメインに連結されたＬＢＴドメインを含む本発明の融合酵素を発現するために使用できる任意の細胞（複数可）を含み得る。このような細胞系としては、これらに限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞および動物細胞を挙げることができる。いくつかの実施形態では、細胞系は、細菌細胞、酵母細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞系は、原核細胞、真核細胞、およびそれらの組み合わせを含む。
【0055】
本開示の細菌細胞は、限定するものではないが、エシェリキア属、ストレプトマイセス属、ザイモモナス属、アセトバクター属、シトロバクター属、シネコシスティス属、リゾビウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、連鎖球菌属、キサントモナス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、バチルス属、アルカリゲネス属、緑膿菌属、エロモナス属、アゾトバクター属、コマモナス属、マイコバクテリウム属、ロドコッカス属、グルコノバクター属、ラルストニア属、アシドチオバチルス属、ミクロルナタス属、ゲオバクター属、ゲオバチルス属、アルスロバクター属、フラボバクテリウム属、セラチア属、サッカロポリスポラ属（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｐ）、サーマス属、ステノトロホモナス属、クロモバクテリウム属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐｐ）、サッカロポリスポラ属（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｐ）、アグロバクテリウム属、パントエア属、およびビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）を含む。
【0056】
本開示の酵母細胞としては、限定されるものではないが、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）を含む。本発明の開示によれば、本明細書で特許請求される酵母は、真菌界のメンバーとして分類される真核生物の単細胞微生物である。酵母は、多細胞祖先から進化した単細胞生物であるが、本開示に有用ないくつかの種は、仮性菌糸または偽菌糸として知られる連結した出芽細胞の糸を形成することによって多細胞特性を発現できる。
【0057】
細胞培養
細胞培養物は、培養物中にある任意の細胞（複数可）を指す。培養またはインキュベートは、細胞を、制御された条件下、典型的にはそれらの自然環境外で成長させるプロセスである。例えば、酵母細胞などの細胞は、液体栄養ブロス中で細胞懸濁液として成長させ得る。細胞培養物は、これらに限定されないが、細菌細胞培養物、酵母細胞培養物、植物細胞培養物、および動物細胞培養物を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、細菌細胞、酵母細胞、またはそれらの組み合わせを含む。
細胞培養物は、培養物中にある任意の細胞（複数可）を指す。培養またはインキュベートは、細胞を、制御された条件下、典型的にはそれらの自然環境外で成長させるプロセスである。例えば、酵母細胞などの細胞は、液体栄養ブロス中で細胞懸濁液として成長させ得る。細胞培養物は、これらに限定されないが、細菌細胞培養物、酵母細胞培養物、植物細胞培養物、および動物細胞培養物を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、細菌細胞、酵母細胞、またはそれらの組み合わせを含む。
【0058】
本開示の細菌細胞培養物は、限定するものではないが、エシェリキア属、ストレプトマイセス属、ザイモモナス属、アセトバクター属、シトロバクター属、シネコシスティス属、リゾビウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、連鎖球菌属、キサントモナス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、バチルス属、アルカリゲネス属、緑膿菌属、エロモナス属、アゾトバクター属、コマモナス属、マイコバクテリウム属、ロドコッカス属、グルコノバクター属、ラルストニア属、アシドチオバチルス属、ミクロルナタス属、ゲオバクター属、ゲオバチルス属、アルスロバクター属、フラボバクテリウム属、セラチア属、サッカロポリスポラ属（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｐ）、サーマス属、ステノトロホモナス属、クロモバクテリウム属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐｐ）、サッカロポリスポラ属（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｐ）、アグロバクテリウム属、パントエア属、およびビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）を含む細菌細胞を含む。
【0059】
本開示の酵母細胞培養は、限定されるものではないが、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）を含む酵母細胞を含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞培養物は、当技術分野において公知である１つ以上の栄養物質を含む水性培地であり得る。そのような液体培地は、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、および／または成長因子を含んでよい。
好適な炭素源としては、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、およびコーンシロップが挙げられる。好適な窒素源の例としては、ペプトン、コーンスティープリカー、ミーンエクス（ｍｅａｎ ｅｘｔｒａｃｔ）、酵母エキス、カゼイン、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩、硝酸塩およびそれらの混合物などの有機および無機窒素含有物質を挙げることができる。無機塩の例としては、リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、およびカリウム塩を挙げることができる。液体培地はまた、１つ以上のビタミンおよび／またはミネラルを含んでよい。
好適な炭素源としては、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、およびコーンシロップが挙げられる。好適な窒素源の例としては、ペプトン、コーンスティープリカー、ミーンエクス（ｍｅａｎ ｅｘｔｒａｃｔ）、酵母エキス、カゼイン、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩、硝酸塩およびそれらの混合物などの有機および無機窒素含有物質を挙げることができる。無機塩の例としては、リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、およびカリウム塩を挙げることができる。液体培地はまた、１つ以上のビタミンおよび／またはミネラルを含んでよい。
【0061】
いくつかの実施形態では、細胞は、１６℃～４０℃の温度で培養される。例えば、細胞は、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃または４０℃の温度で培養され得る。
【0062】
いくつかの実施形態では、細胞は、約３～約９のｐＨ範囲で、好ましくは約４～約８の範囲で培養される。ｐＨは、塩酸、酢酸、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニアなどの無機酸もしくは有機酸もしくは塩基の添加、またはリン酸塩、フタル酸塩もしくはＴｒｉｓ（登録商標）などの緩衝液の添加によって調節できる。
【0063】
いくつかの実施形態では、細胞は、０．５時間～９６時間、またはそれより長い期間培養される。例えば、細胞は、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、または７２時間培養されてよい。典型的には、細菌細胞などの細胞は、１２～２４時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、１２時間～２４時間、３７℃の温度で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、１２時間～２４時間、１６℃の温度で培養される。
【0064】
いくつかの実施形態では、細胞は、細胞培養培地の密度１ｘ１０８（ＯＤ６００＜１）～２ｘ１０１１（ＯＤ～２００）生存細胞／ｍｌに培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、密度１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、４ｘ１０８、５ｘ１０８、６ｘ１０８、７ｘ１０８、８ｘ１０８、９ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９、９ｘ１０９、１ｘ１０１０、２ｘ１０１０、３ｘ１０１０、４ｘ１０１０、５ｘ１０１０、６ｘ１０１０、７ｘ１０１０、８ｘ１０１０、９ｘ１０１０、１ｘ１０１１、または２ｘ１０１１生細胞／ｍｌに培養される。（換算係数：ＯＤ１＝８ｘ１０８細胞／ｍｌ）。
【0065】
合成生物学
本明細書で用いられる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９年（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＳ ｗｉｔｈ ＧＥＮＥ ＦＵＳＩＯＮＳ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８４年；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、ＩＮ ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７年に記載され、これらは、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で用いられる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９年（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＳ ｗｉｔｈ ＧＥＮＥ ＦＵＳＩＯＮＳ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８４年；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、ＩＮ ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７年に記載され、これらは、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
【0066】
微生物産生系
形質転換宿主細胞におけるタンパク質の発現は、最も多くの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて、細菌または酵母宿主細胞において行われる。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に複数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは典型的には、次の３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増加させる；２）組換えタンパク質の溶解度を増大させる；および３）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を補助する。多くの場合、タンパク質分解開裂部位が、融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入されて、融合タンパク質の精製に続いて、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。そのようなベクターは、本開示の範囲内である。
形質転換宿主細胞におけるタンパク質の発現は、最も多くの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて、細菌または酵母宿主細胞において行われる。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に複数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは典型的には、次の３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増加させる；２）組換えタンパク質の溶解度を増大させる；および３）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を補助する。多くの場合、タンパク質分解開裂部位が、融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入されて、融合タンパク質の精製に続いて、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。そのようなベクターは、本開示の範囲内である。
【0067】
一実施形態では、発現ベクターは、微生物細胞における組換えポリペプチドの発現のための遺伝的エレメントを含む。微生物細胞における転写および翻訳のためのエレメントは、プロモーター、タンパク質複合体のコード領域、および転写ターミネーターを含み得る。
【0068】
当業者であれば、発現ベクターの調製に利用可能な分子生物学技術を知っているであろう。本技術の発現ベクターに組み込むために使用されるポリヌクレオチドは、本明細書に記載のとおり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのルーチン技術によって調製され得る。
【0069】
複数の分子生物学技術が、相補的な凝集末端を介してＤＮＡをベクターに作動可能に連結するために開発されている。一実施形態では、相補的なホモポリマートラクトを、ベクターＤＮＡに挿入される核酸分子に加えることができる。ベクターおよび核酸分子を次に、、相補的なホモポリマーテール間の水素結合により接合して、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【0070】
代替的実施形態では、提供される１つ以上の制限部位を含む合成リンカーを使用して、本技術のポリヌクレオチドを発現ベクターに作動可能に連結する。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成される。一実施形態では、核酸分子は、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩで処理され、これらの酵素は、突出した３’－一本鎖末端を３’－５’－エキソヌクレアーゼ活性により除去し、陥没３’末端をそれらの重合活性により埋め、それにより平滑末端ＤＮＡセグメントを生成する。この平滑末端セグメントを次いで、バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼなどの、平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒できる酵素の存在下で、大量のモル過剰のリンカー分子と共にインキュベートする。したがって、反応生成物は、その末端に高分子リンカー配列を保持するポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは次に、適切な制限酵素により開裂され、ポリヌクレオチドの末端と適合する末端を産生する酵素により開裂された発現ベクターにライゲートされる。
【0071】
あるいは、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）部位を有するベクターが使用され得る。必要とされるＰＣＲ増幅ポリヌクレオチドを次いで、制限消化またはライゲーションなしに、ＬＩＣベクターにクローニングできる（Ａｓｌａｎｉｄｉｓ ａｎｄ ｄｅ Ｊｏｎｇ，ＮＵＣＬ．ＡＣＩＤ．ＲＥＳ．１８ ６０６９－７４，（１９９０年），Ｈａｕｎ，ｅｔ ａｌ，ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ １３，５１５－１８（１９９２年）、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【0072】
一実施形態では、選択されたプラスミドへの挿入のための目的のポリヌクレオチドを単離および／または改変するために、ＰＣＲを使用することが好適である。配列のＰＣＲ調製での使用のために適切なプライマーは、核酸分子の必要とされるコード領域を単離し、制限エンドヌクレアーゼまたはＬＩＣ部位を追加し、コード領域を所望のリーディングフレームに配置するように設計され得る。
【0073】
一実施形態では、本技術の発現ベクターに組み込むためのポリヌクレオチドは、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲの使用により調製される。コード領域が増幅され、一方でプライマー自体は、増幅される配列産物に組み込まれる。一実施形態では、増幅プライマーは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、これは、増幅された配列産物が適切なベクター中にクローン化されることを可能にする。
【0074】
発現ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって、植物または微生物の宿主細胞に導入できる。本技術の発現ベクターによる適切な細胞の形質転換は、当技術分野において公知である方法によって達成され、典型的には、ベクターおよび細胞の種類の両方に依存する。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、ケモポレーションまたはエレクトロポレーションが挙げられる。
【0075】
うまく形質転換された細胞、すなわち、発現ベクターを含む細胞は、当技術分野で周知の技術によって同定され得る。例えば、本技術の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を培養して、本明細書に記載のポリペプチドを産生できる。細胞を、当技術分野で周知の技術により、発現ベクターＤＮＡの存在について検査できる。
【0076】
宿主細胞は、前述の発現ベクターの単一のコピー、または代替的に発現ベクターの複数のコピーを含み得る。
【0077】
いくつかの実施形態では、形質転換細胞は、細菌細胞、酵母細胞、藻類細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞であってよい。いくつかの実施形態では、細胞は、カノーラ植物細胞、ナタネ植物細胞、ヤシ植物細胞、ヒマワリ植物細胞、ワタ植物細胞、トウモロコシ植物細胞、ピーナッツ植物細胞、アマ植物細胞、ゴマ植物細胞、ダイズ植物細胞、およびペチュニア植物細胞からなる群から選択される植物細胞である。
【0078】
微生物宿主細胞発現系、および外来タンパク質の高レベルの発現を指示する調節配列を含有する発現ベクターは、当業者によく知られている。これらのいずれもが、微生物宿主細胞における本技術の組換えポリペプチドの発現のためのベクターを構築するために使用可能であろう。これらのベクターを次に、形質転換を介して適切な微生物に導入して、本技術の組換えポリペプチドの高レベルの発現を可能にするであろう。
【0079】
好適な微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当技術分野でよく知られている。典型的には、ベクターまたはカセットは、関連するポリヌクレオチドの転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体組込みを可能にする配列を含む。好適なベクターは、転写開始制御を保有するポリヌクレオチドの領域５’および転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’を含む。両方の制御領域が、形質転換宿主細胞に相同な遺伝子に由来することが好ましいが、このような制御領域は、宿主として選択された特定の種に固有の遺伝子に由来する必要はないことは理解されるべきである。
【0080】
所望の微生物宿主細胞中で組換えポリペプチドの発現を駆動するために有用である、開始制御領域またはプロモーターは、多数あり、当業者にはよく知られている。これらの遺伝子を駆動できる実質的に任意のプロモーターは、これらに限定されないが、ＣＹＣＩ、ＨＩＳ３、ＧＡＬＩ、ＧＡＬＩＯ、ＡＤＨＩ、ＰＧＫ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣＩ、ＴＲＰＩ、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセスにおける発現に有用）；ＴＥＦ（ヤロウイアにおける発現に有用）；ＡＯＸＩ（ピキアにおける発現に有用）；およびｌａｃ、ｔｒｐ、ＪＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌における発現に有用）を含み、本技術にとって好適である。
【0081】
終結制御領域はまた、微生物宿主に固有の様々な遺伝子に由来し得る。終結部位は任意により、本明細書に記載の微生物宿主に含まれ得る。
【0082】
植物細胞では、本技術の発現ベクターは、所望の組織内の所望の発生段階で、本発明の技術の組換えポリペプチドの発現を指示できるプロモーターに作動可能に連結されたコード領域を含み得る。便宜上、発現されるポリヌクレオチドは、プロモーター配列および同じポリヌクレオチドに由来する翻訳リーダー配列を含み得る。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列も存在するものとする。発現ベクターはまた、ポリヌクレオチド発現を容易にするために、１つ以上のイントロンを含んでもよい。
【0083】
植物宿主細胞については、コード領域の発現を誘導できる任意のプロモーターおよび任意のターミネーターの任意の組み合わせを、本技術のベクター配列において使用してよい。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの好適な例は、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子由来のものを含む。使用され得る効率的な植物プロモーターの１つの型は、高レベルの植物プロモーターである。このようなプロモーターは、本技術の発現ベクターと作動可能な連結において、ベクターの発現を促進できるはずである。本技術において使用され得る高レベル植物プロモーターとしては、例えばダイズ由来のリブロース－１，５－ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（複数可）のプロモーター（Ｂｅｒｒｙ－Ｌｏｗｅら、Ｊ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＡＰＰ．ＧＥＮ．，１：４８３－９８（１９８２年）、それが本明細書に一致する程度に、その全体が本明細書に援用される）、およびクロロフィル結合タンパク質のプロモーターが挙げられる。これら２つのプロモーターは、植物細胞中で光誘発性であることが知られている（例えば、ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＰＬＡＮＴＳ，ＡＮ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＰＥＲＳＰＥＣＴＩＶＥ，Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎ．Ｙ．（１９８３年）、２９－３８頁；Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，２５８：１３９９（１９８３年）、およびＤｕｎｓｍｕｉｒら、ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＥＤ ＧＥＮＥＴＩＣＳ，２：２８５（１９８３年）を参照されたい、これらは、それぞれ、本明細書に一致する程度まで、参照により本明細書に組み込まれる）。
【0084】
同一性スコアリングを用いる配列類似性の解析
本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、２つの最適に整列されたポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、構成成分、例えばヌクレオチドまたはアミノ酸の整列のウィンドウ全体にわたって不変である程度を指す。試験配列および参照配列の整列セグメントについての「同一性画分」は、２つの整列された配列によって共有され参照配列セグメント中の成分（すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さい画定された部分）の総数で除算される、同一成分の数である。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、２つの最適に整列されたポリヌクレオチドまたはペプチド配列が、構成成分、例えばヌクレオチドまたはアミノ酸の整列のウィンドウ全体にわたって不変である程度を指す。試験配列および参照配列の整列セグメントについての「同一性画分」は、２つの整列された配列によって共有され参照配列セグメント中の成分（すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さい画定された部分）の総数で除算される、同一成分の数である。
【0085】
本明細書で使用される場合、「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」という用語は、２つの配列が最適に整列される（比較ウィンドウにわたり総計で参照配列の２０パーセント未満である適切なヌクレオチドの挿入、欠失、またはギャップを有する）場合に、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較される、参照（「クエリ」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の直鎖ポリヌクレオチド配列中の同一ヌクレオチドのパーセンテージを指す。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適アライメントは、当業者に周知であり、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法、および好ましくはＧＣＧ（商標登録）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（商標登録）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムのコンピュータによる実施によって行われてよい。試験配列および参照配列の整列セグメントについての「同一性画分」は、２つの整列された配列によって共有され参照配列セグメント中の成分（すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さい画定された部分）の総数で除算される、同一成分の数である。パーセント配列同一性は、同一性画分に１００を乗じたものとして表される。１つ以上のポリヌクレオチド配列の比較は、完全長ポリヌクレオチド配列もしくはその一部に対し、またはより長いポリヌクレオチド配列に対してでよい。本開示の目的のために、「パーセント同一性」は、翻訳されたヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を、ポリヌクレオチド配列についてＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定されてもよい。
【0086】
配列同一性のパーセントは好ましくは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（商標）（Ｖｅｒｓｉｏｎ１０；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」または「Ｇａｐ」プログラムを用いて決定される。「ギャップ」は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ４８：４４３－５３，１９７０年）のアルゴリズムを利用して、一致の数を最大化しかつギャップの数を最小化する２つの配列のアラインメントを見つける。「ＢｅｓｔＦｉｔ」は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列と挿入ギャップの間の最良の類似性のセグメントの最適アラインメントを行って、一致の数を最大化する（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，ＡＤＶＡＮＣＥＳ ＩＮ ＡＰＰＬＩＥＤ ＭＡＴＨＥＭＡＴＩＣＳ，２：４８２－４８９，１９８１年，Ｓｍｉｔｈら、ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ １１：２２０５－２２２０，１９８３年）。パーセント同一性は、最も好ましくは、「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」プログラムを用いて決定される。
【0087】
配列同一性を決定するための有用な方法はまた、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ２０８９４；ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢＩ，ＮＬＭ，ＮＩＨ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２１５：４０３－１０（１９９０年）を参照）から公的に入手可能なＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムに開示されており、ＢＬＡＳＴプログラムのバージョン２．０以降は、配列へのギャップ（欠失および挿入）の導入を可能にし；ペプチド配列については、配列同一性を決定するためにＢＬＡＳＴＸを使用でき；ポリヌクレオチド配列については、ＢＬＡＳＴＮを使用して、配列同一性を決定できる。
【0088】
本明細書中で使用される場合、「実質的なパーセント配列同一性」という用語は、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、またはさらに高い配列同一性、例えば約９８％または約９９％の配列同一性のパーセント配列同一性を指す。したがって、本開示の一実施形態は、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、またはさらに高い配列同一性、例えば約９８％または約９９％の配列同一性のパーセント配列同一性を有する、ポリヌクレオチド分子である。
【0089】
同一性および類似性
同一性は、配列のアラインメント（配列情報、構造情報、または他の一部の情報のみを用いて行うことができるが、通常は配列情報のみに基づく）後の配列対間で同じであるアミノ酸の画分であり、類似性は、いくつかの類似性マトリックスを用いたアラインメントに基づいて割り当てられるスコアである。類似性インデックスは、以下のＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、またはＧＯＮＮＥＴのいずれか１つ、またはタンパク質の配列アラインメントのために当業者によって使用される任意のマトリックスであってよい。
同一性は、配列のアラインメント（配列情報、構造情報、または他の一部の情報のみを用いて行うことができるが、通常は配列情報のみに基づく）後の配列対間で同じであるアミノ酸の画分であり、類似性は、いくつかの類似性マトリックスを用いたアラインメントに基づいて割り当てられるスコアである。類似性インデックスは、以下のＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、またはＧＯＮＮＥＴのいずれか１つ、またはタンパク質の配列アラインメントのために当業者によって使用される任意のマトリックスであってよい。
【0090】
同一性は、２つの部分配列間の対応の度合いである（配列間にギャップはない）。２５％以上の同一性は、機能の類似を意味し、一方で１８～２５％は、構造または機能の類似を意味する。２つの完全に無関係な配列またはランダムな配列（１００残基を超える配列）が、２０％より高い同一性を有し得ることに留意されたい。類似性は、２つの配列を比較したときの、その配列間の類似の度合いである。これは、それらの同一性に依存する。
【0091】
本明細書で使用する用語の説明：
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の意味を指示しない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の意味を指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【0092】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」などの用語が説明または特許請求の範囲で使用される限り、そのような用語は、特許請求において移行句として使用される場合に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」が解釈されるとおり、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」と同様に包括的であることが意図される。
【0093】
「例示的」という言葉は、本明細書では、「例、実例、または例示として機能する」ことを意味するために使用される。本明細書で「例示的」として記載される任意の実施形態は、必ずしも他の実施形態よりも好ましいまたは有利であるものと解釈されるべきではない。
【0094】
「相補的」という用語は、当業者にその通常の慣習的な意味を与えるものであり、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を説明するために限定なく使用される。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンは、チミンに相補的であり、シトシンは、グアニンに相補的である。したがって、本技術は、添付の配列表に報告されるような完全配列に相補的である単離された核酸断片、ならびにそれらの実質的に類似した核酸配列も含む。
【0095】
「核酸」および「ヌクレオチド」という用語は、当業者にそれぞれの通常および慣習的な意味を与えるものであり、これらに限定されないが、それらの一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびポリマーを指すために使用される。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。特に明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾されたバリアントまたは縮重バリアント（例えば、縮重コドン置換）、および相補的配列、ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。
【0096】
「コード配列」は、当業者に通常かつ慣用的な意味を与えるものであり、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指すために限定されることなく使用される。
【0097】
「単離された」という用語は、当業者に通常かつ慣用的な意味を与えるものであり、単離された核酸または単離されたポリペプチドの文脈で使用される場合、限定するものではないが、ヒトの手によって、その天然環境とは別に存在し、したがって、天然の産物ではない核酸またはポリペプチドを指すために使用される。単離された核酸またはポリペプチドは、精製形態で存在し得るか、または、例えば、トランスジェニック宿主細胞中などの非天然環境に存在し得る。
【0098】
本明細書で使用されるとき、用語「インキュベートすること（ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ）」および「インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）」は、２つ以上の化学的または生物学的実体（例えば、化学的化合物および酵素）を混合する、およびそれらが所望の産物を産生するのに好ましい条件下で相互作用することを可能にする、過程を意味する。
【0099】
「縮重バリアント」という用語は、１つ以上の縮重コドン置換によって参照核酸配列とは異なる残基配列を有する核酸配列を指す。縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る。核酸配列およびそのすべての縮重バリアントは、同じアミノ酸またはポリペプチドを発現する。
【0100】
この「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」という用語は、当業者にそれぞれの通常のおよび慣習的な意味を与えるものである。３つの用語は、同義的に使用されることがあり、そのサイズまたは機能に関係なく、これらに限定されないが、アミノ酸またはアミノ酸類似体のポリマーを指すために使用される。「タンパク質」は多くの場合、比較的大きいポリペプチドに関して使用され、「ペプチド」は多くの場合、小さいポリペプチドに関して使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は重複し、変動する。本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、特に記載のない限り、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を指す。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、ポリヌクレオチド産物を指す場合、本明細書では同義的に使用される。したがって、例示的ポリペプチドとしては、ポリヌクレオチド産物、天然存在タンパク質、相同体、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前述の他の同等物、バリアント、および類似体が挙げられる。
【0101】
「ポリペプチド断片」および「断片」という用語は、参照ポリペプチドに関して使用される場合、当技術分野の当業者にそれらの通常および慣習的な意味を与えるものであり、これらに限定されないが、参照ポリペプチド自体と比較してアミノ酸残基が欠失しているが、残りのアミノ酸配列が、通常、参照ポリペプチド内の対応する位置と同一であるポリペプチドを指すために使用される。そのような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端、あるいはその両方で起こり得る。
【0102】
ポリペプチドまたはタンパク質の「機能的断片」という用語は、全長ポリペプチドもしくはタンパク質の一部であり、かつ実質的に同じ生物学的活性を有するか、または全長ポリペプチドもしくはタンパク質と実質的に同じ機能を実行する（例えば、同じ酵素反応を実行する）、ペプチド断片を指す。
【0103】
用語「バリアントポリペプチド」「修飾アミノ酸配列」または「修飾ポリペプチド」は、同義的に使用され、１つ以上のアミノ酸により、例えば、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加により、参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を指す。一態様では、バリアントは、「機能的バリアント」であり、これは参照ポリペプチドの能力の一部または全部を保持する。
【0104】
「機能的バリアント」という用語は、保存的に置換されたバリアントをさらに含む。「保存的に置換されたバリアント」という用語は、１つ以上の保存的アミノ酸置換により参照ペプチドと異なり、かつ参照ペプチドの活性の一部またはすべてを維持するアミノ酸配列を有するペプチドを指す。「保存的アミノ酸置換」は、機能的に類似した残基による、あるアミノ酸残基の置換である。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの非極性（疎水性）残基の別のものへの置換；アルギニンとリジン、グルタミンとアスパラギン、スレオニンとセリンなど、別のものへの１つの荷電もしくは極性（親水性）残基の置換；リジンもしくはアルギニンなどの１つの塩基性残基の別のものへの置換；アスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基の別のものへの置換；またはフェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンなどの１つの芳香族残基の別のものへの置換が挙げられる。そのような置換は、タンパク質またはポリペプチドの見かけの分子量または等電点にほとんどまたはまったく影響を有しないと予想される。「保存的置換バリアント」という句はまた、得られるペプチドが本明細書に記載の参照ペプチドの活性の一部またはすべてを維持するという条件で、ある残基が化学的に誘導体化された残基で置換される、ペプチドを含む。
【0105】
用語「バリアント」は、本技術のポリペプチドに関連して、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、およびさらには１００％同一のアミノ酸配列を有する機能的に活性なポリペプチドをさらに含む。
【0106】
本技術のバリアントポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後、かつ配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない場合に、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指す。
【0107】
パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当該技術分野の範囲内である様々な方法で達成できる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定できる。例えば、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２を用いて決定され得る。ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ncbi.nlm.nih.gov.からダウンロードできる。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ２は、いくつかの検索パラメータを使用し、それらの検索パラメータの全てが、例えば、アンマスク（ｕｎｍａｓｋ）イエス（ｙｅｓ）、鎖＝全て、予測される発生１０、最小低複合長（ｍｉｎｉｍｕｍ ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｌｅｎｇｔｈ）＝１５／５、マルチパスｅ値＝０．０１、マルチパス＝２５のための定数、最終ギャップアラインメントについてのドロップオフ＝２５およびスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含むデフォルト値に設定される。ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２がアミノ酸配列比較のために用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、もしくは所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（これは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、もしくは所与のアミノ酸配列Ｂに対する特定の％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａとして代替的に述べることができる）は、以下のように計算される：１００×分数Ｘ／Ｙ、式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ２により、ＡおよびＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコアされるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解される。
【0108】
この意味で、アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は、当技術分野において周知である。一般に、「類似性」は、アミノ酸が同一であるか、または電荷もしくは疎水性などの類似の化学的特性および／または物理的特性を有する、適切な場所での２つ以上のポリペプチドのアミノ酸対アミノ酸の正確な比較を指す。いわゆる「％類似性」が次いで、比較されるポリペプチド配列間で決定され得る。核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術も当技術分野において周知であり、その遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること（通常はｃＤＮＡ中間体を介して）およびその中にコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれを第２のアミノ酸配列と比較すること、を含む。一般に、「同一性」は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。２つ以上のポリヌクレオチド配列は、２つ以上のアミノ酸配列でできるように、それらの「パーセント同一性」を決定することにより比較できる。ウィスコンシン配列解析パッケージ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）で利用可能なプログラム、例えば、ＧＡＰプログラムは、２つのポリヌクレオチド間の同一性と、２つのポリペプチド配列間の同一性および類似性の両方をそれぞれ計算できる。配列間の同一性または類似性を計算するための他のプログラムは、当業者に知られている。
【0109】
参照位置に「対応する」アミノ酸位置は、アミノ酸配列を整列させることによって同定されるように、参照配列と整列する位置を指す。このようなアライメントは、手動で、またはＣｌｕｓｔａｌＷ２、Ｂｌａｓｔ２などの周知の配列アライメントプログラムを使用することにより行われる。
【0110】
特に明記しない限り、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の％同一性は、２つの配列の短い方の全長にわたる同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージを指す。
【0111】
すべての文法的形態および綴りの変形における「相同」という用語は、スーパーファミリーからのポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよび異なる種からの相同ポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む、「共通の進化的起源」を保有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の関係を指す（Ｒｅｅｃｋら、ＣＥＬＬ ５０：６６７，１９８７年）。そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それらの配列類似性によって反映されるように、パーセント同一性または保存された位置での特定のアミノ酸またはモチーフの存在に関して、配列相同性を有する。例えば、２つの相同ポリペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、さらには１００％同一である、アミノ酸配列を有し得る。
【0112】
「好適な調節配列」は、当業者にその通常の慣習的な意味を与えるものとし、限定されないが、コード配列の上流（５’非コード配列）に、内部に、または下流（３’非コード配列）に位置し、かつ関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指すために使用される。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含み得る。
【0113】
「プロモーター」は、当業者にその通常の慣習的な意味を与えるものとし、限定されないが、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指すために使用される。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’に位置している。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されてよく、さらには合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、または異なる発達段階において、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることが当業者によって理解される。ほとんどの場合ほとんどの細胞型で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることが、さらに認識される。
【0114】
「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響を受けるような、単一の核酸断片上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を与えることができる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結できる。
【0115】
本明細書で使用される「発現」という用語は、当業者にその通常の慣習的な意味を与えるものとし、これらに限定されないが、本技術の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指すために使用される。「過剰発現」は、通常のまたは形質転換されない生物における産生のレベルを超える、トランスジェニックまたは組換え生物における遺伝子産物の産生を指す。
【0116】
「形質転換」は、当業者にその通常の慣習的な意味を与えるものとし、これらに限定されないが、標的細胞によるさらなる発現のための、ポリヌクレオチドの標的細胞への移入を指すために使用される。移入されたポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムまたは染色体ＤＮＡに組み込まれ得、その結果、遺伝的に安定な遺伝をもたらすか、またはそれは、宿主の染色体は関係なく複製できる。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。
【0117】
本明細書で宿主細胞に関連して使用される場合、「形質転換された」、「トランスジェニック」、および「組換え」という用語は、当業者にそれぞれの通常および慣習的な意味を与えるものとし、これらに限定されないが、その中に異種核酸分子が導入された、植物または微生物細胞などの、宿主生物の細胞を指すために使用される。核酸分子は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ得るか、または核酸分子は、染色体外分子として存在し得る。このような染色体外分子は、自己複製され得る。形質転換された細胞、組織、または対象は、形質転換プロセスの最終産物のみでなく、そのトランスジェニック子孫も包含すると理解される。
【0118】
ポリヌクレオチドに関連して本明細書で使用される場合、「組換え」、「異種」、および「外因性」という用語は、当業者にそれらの通常の慣習的な意味を与えるものであり、これに限定されないが、特定の宿主細胞に対し外来の供給源に由来する、または同じ供給源に由来する場合、その元の形態から改変された、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列または遺伝子）を指すために使用される。したがって、宿主細胞における異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対し内因性であるが、例えば、部位指向性変異誘発または他の組換え技術の使用によって改変された、遺伝子を含む。これらの用語はまた、天然に存在するＤＮＡ配列の非天然に存在する複数のコピーを含む。したがって、これらの用語は、細胞に対し外来であるか異種である、または細胞に対し相同であるが、そのエレメントが通常見出されない宿主細胞内の位置にあるかもしくは形態である、ＤＮＡセグメントを指す。
【0119】
同様に、「組換え」、「異種」、および「外因性」という用語は、ポリペプチドまたはアミノ酸配列に関連して本明細書で使用される場合、特定の宿主細胞に対し外来性の供給源に由来するか、または、同じ供給源に由来する場合、その元の形態から修飾される、ポリペプチドまたはアミノ酸配列を意味する。したがって、組換えＤＮＡセグメントを宿主細胞内で発現させて、組換えポリペプチドを産生できる。
【0120】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」という用語は、当業者にそれぞれの通常および慣習的な意味を与えるものであり、これらに限定されないが、多くの場合、細胞の中枢代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である遺伝子を運搬する、追加の染色体エレメントを指すために使用される。このようなエレメントは、任意の供給源に由来する、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、直鎖または環状の、自律的に複製する配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってよく、その中で複数のヌクレオチド配列が独自の構造へと接合されまたは再度組み合わされ、それは細胞中に適切な３’非翻訳配列と共に選択された遺伝子産物のプロモーター断片およびＤＮＡ配列を導入できる。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、かつ特定の宿主細胞の形質転換を促進する外来遺伝子に加えてエレメントを有する、特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、かつ外来遺伝子に加えて外来宿主におけるその遺伝子の発現の増強を可能にするエレメントを有する、特定のベクターを指す。
【0121】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を本開示の実施または試験に使用できるが、好ましい材料および方法が、以下に記載される。
【0122】
以下の非限定的例を検討することにより、本開示はより完全に理解されるであろう。これらの例は、本技術の好ましい実施形態を示しているが、例示としてのみ与えられていることを理解されたい。以上の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本技術の本質的特徴を確認でき、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本技術を様々な用途および条件に適合させるために様々な変更および修正を加えることができる。
【0123】
実施例
実施例１：イプシロン－カロチンを産生するヤロウイア・リポリティカ株の生成
一般に、構成的ＴＥＦプロモーターおよびＸＰＲ２ターミネーターを、ヤロウイア・リポリティカＡＴＣＣ ９０８１１宿主細胞における個々の遺伝子の過剰発現のために使用した。ＴＥＦプロモーターおよびＸＰＲ２ターミネーターの両方を保有するｐＵＣ５７－Ｋａｎベースのベクターを、クローニングした。個々の遺伝子を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いて、ＴＥＦプロモーターとＸＰＲ２ターミネーターの間にクローニングした。ＴＥＦプロモーター、過剰発現のための１つ以上の遺伝子、およびＸＰＲ２ターミネーターを含むカセットを、ＰＣＲを用いて増幅し、次いで、それぞれ栄養要求性リジン、ロイシンおよびウラシルマーカーを有する、ｐＹｌｅｘ－ＳＤＨ、ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｌｅｕ、およびｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｌｅｕなどの高コピー数ヤロウイア組込みベクターにクローニングした。
実施例１：イプシロン－カロチンを産生するヤロウイア・リポリティカ株の生成
一般に、構成的ＴＥＦプロモーターおよびＸＰＲ２ターミネーターを、ヤロウイア・リポリティカＡＴＣＣ ９０８１１宿主細胞における個々の遺伝子の過剰発現のために使用した。ＴＥＦプロモーターおよびＸＰＲ２ターミネーターの両方を保有するｐＵＣ５７－Ｋａｎベースのベクターを、クローニングした。個々の遺伝子を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いて、ＴＥＦプロモーターとＸＰＲ２ターミネーターの間にクローニングした。ＴＥＦプロモーター、過剰発現のための１つ以上の遺伝子、およびＸＰＲ２ターミネーターを含むカセットを、ＰＣＲを用いて増幅し、次いで、それぞれ栄養要求性リジン、ロイシンおよびウラシルマーカーを有する、ｐＹｌｅｘ－ＳＤＨ、ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｌｅｕ、およびｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｌｅｕなどの高コピー数ヤロウイア組込みベクターにクローニングした。
【0124】
カロチノイド前駆体供給を増幅させるために、ＨＭＧＳ、ＨＭＧＲおよびＩＰＩをコードする遺伝子を含む３つの遺伝子を、それらの自身のＴＥＦプロモーターおよびＸＰＲ２ターミネーターと共に、ｐＹｌｅｘ－ＳＤＨベクターにクローニングして、ｐＹｌｅｘ－ＳＤＨ－ＴＥＦ－ＩＰＩ－ＴＥＦ－ＨＭＧＲ－ＴＥＦ－ＨＭＧＳ構築物を生成した（図４Ａ）。ｐＹｌｅｘ－ＳＤＨ－ＴＥＦ－ＩＰＩ－ＴＥＦ－ＨＭＧＲ－ＴＥＦ－ＨＭＧＳ構築物を次いで用いて、ヤロウイア・リポリティカＡＴＣＣ ９０８１１宿主を形質転換し、リジンを含まない最小培地プレート上で選択した。
【0125】
リコペン産生のための２つの遺伝子、特にＣａｒＲＰ＊（そのリコペンシクラーゼ活性を完全に喪失した変異体ＣａｒＲＰ）およびＣａｒＢをコードする遺伝子、ならびにＧＧＰＰＳにイン－フレームで融合されたＦＰＰＳを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を、それら自身のＴＥＦプロモーターおよびＸＰＲ２ターミネーターと共にｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｌｅｕベクターにクローニングして、ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｌｅｕ－ＴＥＦ－ｃａｒＢ－ＴＥＦ－ｃａｒＲＰ＊－ＴＥＦ－ＧＧＰＰＳ：：ＦＰＰＳ構築物を生成した（図４Ｂ）。ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｌｅｕ－ＴＥＦ－ｃａｒＢ－ＴＥＦ－ｃａｒＲＰ＊－ＴＥＦ－ＧＧＰＰＳ：：ＦＰＰＳ構築物を次いで用いて、ｐＹｌｅｘ－ＳＤＨ－ＴＥＦ－ＩＰＩ－ＴＥＦ－ＨＭＧＲ－ＴＥＦ－ＨＭＧＳを有するヤロウイア・リポリティカＡＴＣＣ ９０８１１株を形質転換し、ロイシンを含まない最小培地プレート上で選択した。赤色クローンは、ヤロウイア・リポリティカ産生菌であった。最も高いリコペン含量を有するコロニーを、ＬＹＣ－４０と命名し、イプシロン－カロチンおよびアルファ－イオノン産生のための宿主として選択した。
【0126】
イプシロン－シクラーゼ（ＥＣ）遺伝子を、ＴＥＦプロモーターおよびＸＰＲ２ターミネーターと共にｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｕｒａベクターにクローニングして、ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｕｒａ－ＴＥＦ－ＥＣ構築物を作製した。ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｕｒａ－ＴＥＦ－ＥＣを次いで用いて、リコペン産生ヤロウイア・リポリティカＡＴＣＣ ９０８１１宿主ＬＹＣ－４０を形質転換し、ウラシルを含まない最小培地プレート上で選択した。したがって、オレンジ色のイプシロン－カロチン産生ヤロウイア・リポリティカ株を生成した。
【0127】
実施例２：ＨＰＬＣ分析のためのイプシロン－カロチンの抽出
イプシロン－カロチン産生ヤロウイア・リポリティカ株を、ＹＰＤ寒天プレート上にストリークし、３０℃で成長させた。インキュベーションの２日後に、オレンジ色コロニーを、ＹＰＤ液体培地５ｍｌ中で２５０ｒｐｍおよび３０℃で４日間成長させた。０．２ｍｌの細胞培養物を、遠心分離により回収し、細胞ペレットを、０．８ｍｌのメタノールおよび０．２ｍｌのジクロロメタン中に再懸濁した。直径０．５ｍｍのガラスビーズを次いで、添加した。ヤロウイア・リポリティカ細胞を、ビーズビーターホモジナイザー中で１分間破壊した。次いで、混合物を、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を、ＨＰＬＣ分析のために回収した。
イプシロン－カロチン産生ヤロウイア・リポリティカ株を、ＹＰＤ寒天プレート上にストリークし、３０℃で成長させた。インキュベーションの２日後に、オレンジ色コロニーを、ＹＰＤ液体培地５ｍｌ中で２５０ｒｐｍおよび３０℃で４日間成長させた。０．２ｍｌの細胞培養物を、遠心分離により回収し、細胞ペレットを、０．８ｍｌのメタノールおよび０．２ｍｌのジクロロメタン中に再懸濁した。直径０．５ｍｍのガラスビーズを次いで、添加した。ヤロウイア・リポリティカ細胞を、ビーズビーターホモジナイザー中で１分間破壊した。次いで、混合物を、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を、ＨＰＬＣ分析のために回収した。
【0128】
イプシロン－カロチンのＨＰＬＣ分析を、クォータナリポンプ、温度制御カラムコンパートメント、オートサンプラーおよびＵＶ吸光度検出器を備えるＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて行った。ガードカラムを有するＧｅｍｉｎｉ Ｃ１８（１５０ｍｍｘ４．６ｍｍ ３μｍ）を、リコペン、デルタ－カロチンおよびイプシロン－カロチンの特徴を明らかにするために使用した。流速１．０ｍｌ／分を適用し、移動相は、イソプロパノール（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）で構成された。プログラムは、０～５分８５％ Ｂ；５～１３分８５％～６０％ Ｂ；１３～１４分６０％～８５％Ｂ；１４～１６分８５％Ｂであり、検出波長は、リコペン、デルタ－カロチンおよびイプシロン－カロチンに対し４７４ｎｍであった。
【0129】
図５に示すとおり、ＨＭＧＳ、ＨＭＧＲ、ＩＰＩ、ＣａｒＲＰ＊、ＣａｒＢ、ＦＰＰＳ：：ＧＧＰＰＳ、およびＥＣの遺伝子を保有するヤロウイア・リポリティカ株は、既知の標準に対し抽出した産物の保持時間（上）およびＵＶスペクトル（下）を比較することにより、リコペン（１０分ピーク）、デルタ－カロチン（１１．５分ピーク）およびイプシロン－カロチン（１３分ピーク）を蓄積した。
【0130】
実施例３：ベータ－カロチンを産生するヤロウイア・リポリティカ株の生成
ベータ－カロチン産生のための２つの遺伝子、特にＣａｒＲＰおよびＣａｒＢをコードする遺伝子、ならびにＧＧＰＰＳにイン－フレームで融合されたＦＰＰＳを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を、それら自身のＴＥＦプロモーターおよびＸＰＲ２ターミネーターと共にｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｌｅｕベクターにクローニングして、ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｌｅｕ－ＴＥＦ－ｃａｒＢ－ＴＥＦ－ｃａｒＲＰ－ＴＥＦ－ＧＧＰＰＳ：：ＦＰＰＳ構築物を作製した。ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｌｅｕ－ＴＥＦ－ｃａｒＢ－ＴＥＦ－ｃａｒＲＰ－ＴＥＦ－ＧＧＰＰＳ：：ＦＰＰＳ構築物を次いで用いて、ｐＹｌｅｘ－ＳＤＨ－ＴＥＦ－ＩＰＩ－ＴＥＦ－ＨＭＧＲ－ＴＥＦ－ＨＭＧＳを有するヤロウイア・リポリティカＡＴＣＣ ９０８１１株を形質転換し、ロイシンを含まない最小培地プレート上で選択した。オレンジ色のクローンは、ヤロウイア・リポリティカベータ－カロチン産生菌であった。最も高いベータ－カロチン含量を有するコロニーを、ＢＣ－３と命名し、ベータ－イオノン産生のための宿主として選択した。
ベータ－カロチン産生のための２つの遺伝子、特にＣａｒＲＰおよびＣａｒＢをコードする遺伝子、ならびにＧＧＰＰＳにイン－フレームで融合されたＦＰＰＳを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を、それら自身のＴＥＦプロモーターおよびＸＰＲ２ターミネーターと共にｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｌｅｕベクターにクローニングして、ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｌｅｕ－ＴＥＦ－ｃａｒＢ－ＴＥＦ－ｃａｒＲＰ－ＴＥＦ－ＧＧＰＰＳ：：ＦＰＰＳ構築物を作製した。ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｌｅｕ－ＴＥＦ－ｃａｒＢ－ＴＥＦ－ｃａｒＲＰ－ＴＥＦ－ＧＧＰＰＳ：：ＦＰＰＳ構築物を次いで用いて、ｐＹｌｅｘ－ＳＤＨ－ＴＥＦ－ＩＰＩ－ＴＥＦ－ＨＭＧＲ－ＴＥＦ－ＨＭＧＳを有するヤロウイア・リポリティカＡＴＣＣ ９０８１１株を形質転換し、ロイシンを含まない最小培地プレート上で選択した。オレンジ色のクローンは、ヤロウイア・リポリティカベータ－カロチン産生菌であった。最も高いベータ－カロチン含量を有するコロニーを、ＢＣ－３と命名し、ベータ－イオノン産生のための宿主として選択した。
【0131】
実施例４：ＨＰＬＣ分析のためのベータ－カロチンの抽出
ベータ－カロチン産生ヤロウイア・リポリティカ株を、ＹＰＤ寒天プレート上にストリークし、３０℃で成長させた。インキュベーションの２日後に、オレンジ色コロニーを、ＹＰＤ液体培地５ｍｌ中で２５０ｒｐｍおよび３０℃で４日間成長させた。０．２ｍｌの細胞培養物を、遠心分離により回収し、細胞ペレットを、０．８ｍｌのメタノールおよび０．２ｍｌのジクロロメタン中に再懸濁した。直径０．５ｍｍのガラスビーズを次いで、添加した。ヤロウイア・リポリティカ細胞を、ビーズビーターホモジナイザー中で１分間破壊した。次いで、混合物を、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を、ＨＰＬＣ分析のために回収した。
ベータ－カロチン産生ヤロウイア・リポリティカ株を、ＹＰＤ寒天プレート上にストリークし、３０℃で成長させた。インキュベーションの２日後に、オレンジ色コロニーを、ＹＰＤ液体培地５ｍｌ中で２５０ｒｐｍおよび３０℃で４日間成長させた。０．２ｍｌの細胞培養物を、遠心分離により回収し、細胞ペレットを、０．８ｍｌのメタノールおよび０．２ｍｌのジクロロメタン中に再懸濁した。直径０．５ｍｍのガラスビーズを次いで、添加した。ヤロウイア・リポリティカ細胞を、ビーズビーターホモジナイザー中で１分間破壊した。次いで、混合物を、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を、ＨＰＬＣ分析のために回収した。
【0132】
ベータ－カロチンのＨＰＬＣ分析を、クォータナリポンプ、温度制御カラムコンパートメント、オートサンプラーおよびＵＶ吸光度検出器を備えたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて行った。ガードカラムを有するＧｅｍｉｎｉ Ｃ１８（１５０ｍｍｘ４．６ｍｍ ３μｍ）を、ベータ－カロチンの特徴づけのために用いた。流速１．０ｍｌ／分を適用し、移動相は、イソプロパノール（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）で構成された。プログラムは、０～５分８５％ Ｂ、５～１３分８５％～６０％Ｂ、１３～１４分６０％～８５％Ｂ、１４～１６分８５％ Ｂである。検出波長は、ベータ－カロチンに対し４７４ｎｍであった。
【0133】
図６に示すとおり、ＨＭＧＳ、ＨＭＧＲ、ＩＰＩ、ｃａｒＲＰ、ｃａｒＢおよびＦＰＰＳ：：ＧＧＰＰＳの遺伝子を保有するヤロウイア・リポリティカは、ベータ－カロチン標準のものに対し抽出したベータ－カロチンの保持時間（上）およびＵＶスペクトル（下）を比較することにより、ベータ－カロチン（１３．５分ピーク）を蓄積する。
【0134】
実施例５：９，１０（９’，１０’）カロチノイド開裂活性を有する候補ＣＣＤ酵素の同定
【0135】
カロチノイド開裂ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）酵素は、種々のカロチン基質（図５に示すイプシロン－カロチンおよび図６に示すベータ－カロチンなど）の開裂を触媒して、種々のイオノン化合物（アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンなど）を生成できる。図２を参照して、効率的なＣＣＤは、アルファ－イオノンまたはベータ－イオノンへの生合成経路における決定因子および重要なボトルネックである。
【0136】
いくつかの植物またはシアノバクテリアは、イオノン化合物を作製できることが報告されている。既知のＣＣＤ遺伝子配列の公開文献および配列類似性ネットワーク（ＳＳＮ）解析に基づいて、２８の候補ＣＣＤ遺伝子を、ヤロウイア・リポリティカにおける最も効率的なＣＣＤ酵素のｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングのために選択した。候補ＣＣＤ遺伝子は個々に、ｐＵＣ５７－Ｋａｎ－ＴＥＦ－ＸＰＲ２ベクターにクローニングされている。各候補ＣＣＤ遺伝子を、それ自体のＴＥＦプロモーターおよびＸＰＲ２ターミネーターと共に、ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｕｒａ－ＴＥＦ－ＥＣベクターにクローン化して、ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｕｒａ－ＴＥＦ－ＥＣ－ＴＥＦ－ＣＣＤ構築物を生成した。各ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｕｒａ－ＴＥＦ－ＥＣ－ＴＥＦ－ＣＣＤ構築物を次いで用いて、リコペン産生ヤロウイア・リポリティカＡＴＣＣ ９０８１１宿主ＬＹＣ－４０を形質転換し、ウラシルを含まない最小培地プレート上で選択した。このようにして、オレンジ色または黄色のアルファ－イオノン産生ヤロウイア・リポリティカ株を生成した。スクリーニングされたＣＣＤ酵素のすべての中で、本発明者らは、ＰｈＣＣＤ１（植物ツクバネアサガオ由来）を最も高い活性を有するＣＣＤ酵素として同定したが、試験管ベースの細胞培養からのそのアルファ－イオノン力価は、依然として非常に低かった（＜３ｍｇ／Ｌ）。コドン最適化ＰｈＣＣＤ１遺伝子の３つの異なるバージョン（配列番号１２および配列番号１３など）を次いで、同じ戦略を用いてスクリーニングして、ヤロウイア・リポリティカＡＴＣＣ ９０８１１（配列番号１３）中の最も効率的なＰｈＣＣＤ１遺伝子を同定した。
【0137】
実施例6： ＧＣ－ＭＳ分析のためのアルファ－イオノンの抽出
推定上のオレンジ色または黄色のアルファ－イオノン産生ヤロウイア・リポリティカクローンを、ウラシルを含まない最小培地プレート上にストリークし、３０℃で成長させた。３日間のインキュベーション後に、コロニーを、５ｍｌのＹＰＤ液体培地中で２５０ｒｐｍおよび３０℃で５日間成長させた。アルファ－イオノンの産生を分析するために、１．０ｍｌのヤロウイア・リポリティカ細胞培養物を、採取し、酵母スラリーを、完全な混合のために少なくとも１分間ボルテックスして１．０ｍｌのｎ－ヘキサンで抽出した。２０００ｒｐｍで１０分間の遠心後に、ｎ－ヘキサン相を、ＧＣ／ＭＳ分析に用いた。
推定上のオレンジ色または黄色のアルファ－イオノン産生ヤロウイア・リポリティカクローンを、ウラシルを含まない最小培地プレート上にストリークし、３０℃で成長させた。３日間のインキュベーション後に、コロニーを、５ｍｌのＹＰＤ液体培地中で２５０ｒｐｍおよび３０℃で５日間成長させた。アルファ－イオノンの産生を分析するために、１．０ｍｌのヤロウイア・リポリティカ細胞培養物を、採取し、酵母スラリーを、完全な混合のために少なくとも１分間ボルテックスして１．０ｍｌのｎ－ヘキサンで抽出した。２０００ｒｐｍで１０分間の遠心後に、ｎ－ヘキサン相を、ＧＣ／ＭＳ分析に用いた。
【0138】
ＧＣ／ＭＳ分析を、ＧＣＭＳ－ＱＰ２０１０Ｓ検出器と組み合わせたＳｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ－２０１０システムで行った。分析カラムは、ＳＨＲＸＩ－５ＭＳ（厚さ０．２５μｍ、長さ３０ｍ、直径０．２５ｍｍ）であり、噴射温度は、スプリットモードで２６５℃である。温度勾配は、０～１分１１０℃、１～８．７５分１１０℃～２６５℃、勾配２０；８．７５～９．７５分、２６５℃である。
【0139】
図７に示すとおり、ＨＭＧＳ、ＨＭＧＲ、ＩＰＩ、ＣａｒＲＰ＊、ＣａｒＢ、ＦＰＰＳ：：ＧＧＰＰＳ、ＥＣおよびＣＣＤの遺伝子を保有するヤロウイア・リポリティカ株は、真のアルファ－イオノン標準（下）に対し抽出した産物の保持時間および質量分析データ（上、中心）を比較したときに、アルファ－イオノン（４．３分ピーク）を蓄積することが示された。
【0140】
実施例７：候補脂質体区画化シグナルタグを同定して、ＰｈＣＣＤ１ ９，１０（９’，１０’）カロチノイド開裂活性を改善する
図２を参照して、アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンへの生合成経路での最後の酵素、すなわちＣＣＤは、その不十分な活性によりイオノン産生の重要なボトルネックである。カロチノイドプラットフォームとして大腸菌を用いて、ＣＣＤカロチノイド開裂活性を改善する努力がなされている。ＣＣＤへ可溶性タグを添加すること、部位指向性変異誘発を用いること、およびカロチンシクラーゼ－ＣＣＤ融合酵素を作製することを含む、複数の戦略が、大腸菌におけるＯｆＣＣＤ１の触媒特性を改善し得ることが報告された。また、部位指向性変異誘発およびペプチド－ＣＣＤ発現の組み合わせは、サッカロミセス・セレビジアエプラットフォームを用いて、ＰｈＣＣＤ１活性をわずかに改善し得ることが報告されている。しかし、本発明者らの知る限り、ヤロウイア・リポリティカプラットフォームを用いてＣＣＤ活性を改善することは成功していない。ＣＣＤ酵素に対するタンパク質工学的努力に加えて、発明者らは、ＰｈＣＣＤ１などのＣＣＤの開裂活性を改善するために、脂質体をベースにした細胞内区画内工学的アプローチを調査することを選択した。
図２を参照して、アルファ－イオノンおよびベータ－イオノンへの生合成経路での最後の酵素、すなわちＣＣＤは、その不十分な活性によりイオノン産生の重要なボトルネックである。カロチノイドプラットフォームとして大腸菌を用いて、ＣＣＤカロチノイド開裂活性を改善する努力がなされている。ＣＣＤへ可溶性タグを添加すること、部位指向性変異誘発を用いること、およびカロチンシクラーゼ－ＣＣＤ融合酵素を作製することを含む、複数の戦略が、大腸菌におけるＯｆＣＣＤ１の触媒特性を改善し得ることが報告された。また、部位指向性変異誘発およびペプチド－ＣＣＤ発現の組み合わせは、サッカロミセス・セレビジアエプラットフォームを用いて、ＰｈＣＣＤ１活性をわずかに改善し得ることが報告されている。しかし、本発明者らの知る限り、ヤロウイア・リポリティカプラットフォームを用いてＣＣＤ活性を改善することは成功していない。ＣＣＤ酵素に対するタンパク質工学的努力に加えて、発明者らは、ＰｈＣＣＤ１などのＣＣＤの開裂活性を改善するために、脂質体をベースにした細胞内区画内工学的アプローチを調査することを選択した。
【0141】
生合成経路または酵素の区画化は、化学的産生を増大させるための効率的な戦略である。経路または酵素の区画化は、酵素を基質または必須の補助因子に接近させること、基質の有効濃度を増加させること、または酵素反応のためのより好適な化学的環境を提供することにより、化学的産生を助ける。図３を参照して、本発明者らは顕微鏡下で、赤色のリコペンおよびオレンジ色のカロチンが、ヤロウイア・リポリティカ細胞中の脂質体およびコリネバクテリウム・グルタミカム細胞中の脂質滴中に蓄積することを観察した。そのため、本発明者らは、宿主としてヤロウイア・リポリティカリコペン産生株ＬＹＣ－４０を用いて、複数の推定脂質体区画化シグナルタグ（種々の脂質合成酵素、脂質体集合体のための膜タンパク質、および脂質体構造タンパク質、ならびにオレンジカロチノイド結合タンパク質など）のｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングを実施することを決定した。
【0142】
ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｕｒａ－ＴＥＦ－ＥＣ－ＴＥＦ－ＰｈＣＣＤ１ベクターを、コドン最適化されたＴＥＦプロモーターとＰｈＣＣＤ１遺伝子の間のＢｓａＩ部位を用いて作製した。推定脂質体区画化シグナルタグ（ＬＢＴ）をコードする候補遺伝子を、ＢｓａＩ部位に個々にクローニングして、ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｕｒａ－ＴＥＦ－ＥＣ－ＴＥＦ－ＬＢＴ＿ＣＣＤ構築物を生成した（図４Ｃ）。各構築物を次いで用いて、リコペン産生ヤロウイア・リポリティカＡＴＣＣ ９０８１１宿主ＬＹＣ－４０を形質転換し、ウラシルを含まない最小培地プレート上で選択した。このように、黄色の推定アルファ－イオノン産生ヤロウイア・リポリティカ株を、最も効率的な脂質体区画化シグナルタグのＧＣ／ＭＳスクリーニングのために生成した。
【0143】
図８に示すとおり、可溶性タグ（例えば、ＴｒｘＡタグ化ＰｈＣＣＤ１、ＴｒｘＡのためのアミノ酸配列およびコドン最適化核酸配列は、配列番号２７および配列番号２８として提供される）を添加する戦略、部位指向性変異誘発（ＰｈＣＣＤ１－Ｋ１６４Ｌ、ＰｈＣＣＤ１－Ｔ１７０Ａ、ＰｈＣＣＤ１－Ａ３２７Ｓ、ＰｈＣＣＤ１－Ｓ４２８Ｎ、ＰｈＣＣＤ１－Ｋ１６４Ｌ＿Ｔ１７０Ａ＿Ａ３２７Ｓ、ＰｈＣＣＤ１－Ｋ１６４Ｌ＿Ｔ１７０Ａ＿Ａ３２７Ｓ＿Ｓ４２８Ｎ、配列番号１１の変異体に対応）の戦略、およびイプシロンシクラーゼ（ＥＣ）－ＣＣＤ融合酵素（ＥＣ－ＬＧＳ－ＰｈＣＣＤ１）を作製する戦略と比較して、多数の脂質体区画化シグナルタグは、ヤロウイア・リポリティカ細胞におけるＰｈＣＣＤ１のｉｎ ｖｉｖｏカロチノイド開裂効率を劇的に改善できた。これらの脂質体区画化シグナルタグは、リムノスピラ（Ｌｉｍｎｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）オレンジカロチノイド結合タンパク質、ヤロウイア・リポリティカ膜輸送体Ｓｔｌ１ｐタンパク質、ヤロウイア・リポリティカ脂質滴タンパク質Ｏｉｌ１ｐ、トウモロコシ１６ｋＤａオレオシンおよびゴマ１７ｋＤａオレオシンを含む。図８を続いて参照して、記載された代替的戦略を介する力価の約５倍の増加に限定されず、ＣＣＤ酵素に連結された脂質体区画化シグナルタグを含む融合酵素を使用する本発明の方法は、力価の増加が１１倍～３３倍を超える範囲であることが示された。
【0144】
実施例８：ベータ－イオノンを産生するヤロウイア・リポリティカ株の生成
脂質体区画化タグ付けＰｈＣＣＤ１をコードする遺伝子を、ＴＥＦプロモーターおよびＸＰＲ２ターミネーターと共に、ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｕｒａベクターにクローニングして、ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｕｒａ－ＴＥＦ－ＬＢＴ＿ＰｈＣＣＤ１構築物を生成した。ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｕｒａ－ＴＥＦ－ＬＢＴ＿ＰｈＣＣＤ１構築物を次いで用いて、ベータ－カロチン産生ヤロウイア・リポリティカＡＴＣＣ ９０８１１宿主ＢＣ－３を形質転換し、ウラシルを含まない最小培地プレート上で選択した。このように、黄色のベータ－イオノン産生ヤロウイア・リポリティカ株を、生成した。黄色のクローンを、ウラシルを含まない最小培地プレート上にストリークし、３０℃で成長させた。３日間のインキュベーション後に、コロニーを、５ｍｌのＹＰＤ液体培地中で２５０ｒｐｍおよび３０℃で５日間成長させた。ベータ－イオノンの産生を分析するために、１．０ｍｌのヤロウイア・リポリティカ細胞培養物を、採取し、酵母スラリーを、完全な混合のために少なくとも１分間ボルテックスして１．０ｍｌのｎ－ヘキサンで抽出した。２０００ｒｐｍで１０分間の遠心後に、ｎ－ヘキサン相を、ＧＣ／ＭＳ分析に用いた。
脂質体区画化タグ付けＰｈＣＣＤ１をコードする遺伝子を、ＴＥＦプロモーターおよびＸＰＲ２ターミネーターと共に、ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｕｒａベクターにクローニングして、ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｕｒａ－ＴＥＦ－ＬＢＴ＿ＰｈＣＣＤ１構築物を生成した。ｐＹｃｏｎＶｅｃ－Ｕｒａ－ＴＥＦ－ＬＢＴ＿ＰｈＣＣＤ１構築物を次いで用いて、ベータ－カロチン産生ヤロウイア・リポリティカＡＴＣＣ ９０８１１宿主ＢＣ－３を形質転換し、ウラシルを含まない最小培地プレート上で選択した。このように、黄色のベータ－イオノン産生ヤロウイア・リポリティカ株を、生成した。黄色のクローンを、ウラシルを含まない最小培地プレート上にストリークし、３０℃で成長させた。３日間のインキュベーション後に、コロニーを、５ｍｌのＹＰＤ液体培地中で２５０ｒｐｍおよび３０℃で５日間成長させた。ベータ－イオノンの産生を分析するために、１．０ｍｌのヤロウイア・リポリティカ細胞培養物を、採取し、酵母スラリーを、完全な混合のために少なくとも１分間ボルテックスして１．０ｍｌのｎ－ヘキサンで抽出した。２０００ｒｐｍで１０分間の遠心後に、ｎ－ヘキサン相を、ＧＣ／ＭＳ分析に用いた。
【0145】
ＧＣ／ＭＳ分析を、ＧＣＭＳ－ＱＰ２０１０Ｓ検出器と組み合わせたＳｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ－２０１０システムで行った。分析カラムは、ＳＨＲＸＩ－５ＭＳ（厚さ０．２５μｍ、長さ３０ｍ、直径０．２５ｍｍ）であり、噴射温度は、スプリットモードで２６５℃である。温度勾配は、０～１分１１０℃、１～８．７５分１１０℃～２６５℃、勾配２０；８．７５～９．７５分、２６５℃である。
【0146】
図９に示すとおり、遺伝子ＨＭＧＳ、ＨＭＧＲ、ＩＰＩ、ＣａｒＲＰ、ＣａｒＢ、ＦＰＰＳ：：ＧＧＰＰＳおよび脂質体区画化タグ付きＰｈＣＣＤ１を保有するヤロウイア・リポリティカ株は、真のベータ－イオノン標準のもの（下）に対し抽出した産物の保持時間および質量分析データ（上、中心）を比較することにより、ベータ－イオノン（４．７分ピーク）を蓄積した。
【0147】
実施例９：融合タンパク質オレオシン：：ｃｒｔＲＢおよびオレオシン：：ＢＫＴを発現することによるアスタキサンチンの産生増加
本明細書に記載のＬＢＴペプチドを、他のカロチノイド生成酵素に融合して、他のカロチノイド化合物の生成を増加させることができる。図１１は、タグのないＣｒｔＲＢ酵素をコードするコード配列およびタグのないＢＫＴ酵素をコードするコード配列を含む核酸構築物（ｃｒｔＲＢ－ＢＫＴ）で形質転換された株と比較して、ＬＢＴ－ＣｒｔＲＢ融合酵素をコードするコード配列およびＬＢＴ－ＢＫＴ融合酵素をコードするコード配列を含む核酸構築物（オレオシン：：ｃｒｔＲＢ－オレオシン：：ＢＫＴ）で形質転換された組換え微生物産生株を用いる場合の、アスタキサンチン（ＡＳ）およびゼアキサンチン（ＺＸ）の産生の増加を示す。
本明細書に記載のＬＢＴペプチドを、他のカロチノイド生成酵素に融合して、他のカロチノイド化合物の生成を増加させることができる。図１１は、タグのないＣｒｔＲＢ酵素をコードするコード配列およびタグのないＢＫＴ酵素をコードするコード配列を含む核酸構築物（ｃｒｔＲＢ－ＢＫＴ）で形質転換された株と比較して、ＬＢＴ－ＣｒｔＲＢ融合酵素をコードするコード配列およびＬＢＴ－ＢＫＴ融合酵素をコードするコード配列を含む核酸構築物（オレオシン：：ｃｒｔＲＢ－オレオシン：：ＢＫＴ）で形質転換された組換え微生物産生株を用いる場合の、アスタキサンチン（ＡＳ）およびゼアキサンチン（ＺＸ）の産生の増加を示す。
【0148】
実施例１０：融合タンパク質オレオシン：：ｃｒｔを発現することによるカンタンキサンチンの産生増加
図１２は、タグなしＣｒｔＷ酵素をコードするコード配列を含む核酸構築物（ｃｒｔＷ）で形質転換された株と比較して、ＬＢＴ－ＣｒｔＷ融合酵素をコードするコード配列（オレオシン：：ｃｒｔＷ）を含む核酸構築物で形質転換された組換え微生物産生株を用いた場合のカンタキサンチン（ＣＸ）の産生の増加を示す。
図１２は、タグなしＣｒｔＷ酵素をコードするコード配列を含む核酸構築物（ｃｒｔＷ）で形質転換された株と比較して、ＬＢＴ－ＣｒｔＷ融合酵素をコードするコード配列（オレオシン：：ｃｒｔＷ）を含む核酸構築物で形質転換された組換え微生物産生株を用いた場合のカンタキサンチン（ＣＸ）の産生の増加を示す。
【0149】
目的の配列
【化1】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】