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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-22
(45)【発行日】2024-07-30
(54)【発明の名称】アミノ安息香酸類水酸化反応の評価方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/26 20060101AFI20240723BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/26 ZNA
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2019233554
(22)【出願日】2019-12-24
(65)【公開番号】P2021101628
(43)【公開日】2021-07-15
【審査請求日】2022-09-26
(73)【特許権者】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】野中 鏡士朗
(72)【発明者】
【氏名】高橋 史員
【審査官】小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】特開２００４－２８３１６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】J. Biotechnol.，1999年，Vol. 72，p. 141-149
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００ － １／７０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
酵素又は微生物を用いてアミノ安息香酸類を水酸化してアミノヒドロキシ安息香酸類を製造する反応において、アミノヒドロキシ安息香酸類の酸化誘導体を検出する工程を含む、アミノ安息香酸類の水酸化反応の評価方法であって、アミノ安息香酸類が４－アミノ安息香酸類、アミノヒドロキシ安息香酸類が４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類であり、酸化誘導体が反応液とラッカーゼを接触させることにより誘導される酸化誘導体である、方法。
【請求項2】
４－アミノ安息香酸類が、下記の一般式（１）：【化1】
で示されるアミノ安息香酸誘導体であり、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類が下記の一般式（２）：
【化2】
で示されるアミノヒドロキシ安息香酸誘導体である、請求項１記載の方法。
【請求項3】
水酸化反応が微生物を用いた発酵である、請求項１又は２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はアミノ安息香酸類を水酸化してアミノヒドロキシ安息香酸類を生産する反応の反応性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ポリベンズオキサゾール（ＰＢＯ）は耐熱性や力学強度に優れたエンジニアリングプラスチックとして知られており、繊維材料及び半導体素子の絶縁膜等に利用される（非特許文献１）。ベンズオキサゾール骨格はｏ－アミノフェノール骨格とカルボン酸との縮合により生成されることから、これらの官能基を分子内に有する４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（以下、４，３－ＡＨＢＡという。）や３－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸（以下、３，４－ＡＨＢＡという。）のようなアミノヒドロキシ安息香酸類はＰＢＯモノマーとして有用であると期待されている（特許文献１、非特許文献２）。
【0003】
また、近年、地球環境負荷軽減等に向けて再生可能資源を原料とした微生物発酵による化合物の製造方法が注目されている。
【0004】
斯かる状況の下、本出願人は、特定の４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素を産生する微生物がアミノ安息香酸類を効率よく水酸化できることを見出し、特許出願している（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特許４３８１１３２号公報
【文献】特願２０１８－１７１８４９
【非特許文献】
【0006】
【文献】村瀬浩貴,SENI GAKKAISHI（繊維と工業）, Vol.66, No.6 (2010)
【文献】Lon J. Mathias et al., Macromolecules, Vol.18, No.4, pp.616-622 (1985)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、アミノ安息香酸類を水酸化してアミノヒドロキシ安息香酸類を生産する反応の反応性を評価する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題に鑑み検討したところ、アミノ安息香酸類からアミノヒドロキシ安息香酸類を製造する水酸化反応において、アミノヒドロキシ安息香酸類を酸化誘導体へ変換した場合、その呈色度又は蛍光強度とアミノヒドロキシ安息香酸類の量がよく相関し、当該呈色度又は蛍光強度から水酸化反応の反応性を評価できることを見出した。
【0009】
すなわち、酵素又は微生物を用いてアミノ安息香酸類を水酸化してアミノヒドロキシ安息香酸類を製造する反応において、アミノヒドロキシ安息香酸類の酸化誘導体を検出する工程を含む、アミノ安息香酸類の水酸化反応の評価方法、を提供する。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、酵素又は微生物が有するアミノ安息香酸類水酸化活性を利用してアミノヒドロキシ安息香酸類を製造する際に、当該反応の反応性能、すなわち反応に作用する酵素の酵素活性や発酵生産性、具体的には酵素又は微生物が有するアミノ安息香酸類水酸化活性を簡便に評価することができる。本発明の方法を用いることにより、アミノ安息香酸類水酸化活性を有する酵素又はそれを生産する微生物を効率的にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の含有比とその酸化誘導体の呈色度との相関を示すグラフ。
【図2】４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の含有比とその酸化誘導体の蛍光強度との相関を示すグラフ。
【図3】培養液上清中の４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸濃度とその酸化誘導体の呈色度との相関を示すグラフ。
【図4】培養液上清中の４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸濃度とその酸化誘導体の蛍光強度との相関を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明のアミノ安息香酸類の水酸化反応の評価方法は、酵素又は微生物を用いてアミノ安息香酸類を水酸化してアミノヒドロキシ安息香酸類を製造する反応において、アミノヒドロキシ安息香酸類の酸化誘導体を検出する工程を含むものである。
本発明において、「酵素又は微生物を用いてアミノ安息香酸類を水酸化してアミノヒドロキシ安息香酸類を製造する反応」とは、酵素又は微生物が保有するアミノ安息香酸類を水酸化してアミノヒドロキシ安息香酸類に変換する触媒活性、すなわちアミノ安息香酸類水酸化活性を利用して、アミノ安息香酸類からアミノヒドロキシ安息香酸類を製造する反応を意味する。
本発明において、「酵素又は微生物を用いてアミノ安息香酸類を水酸化してアミノヒドロキシ安息香酸類を製造する反応」とは、酵素又は微生物が保有するアミノ安息香酸類を水酸化してアミノヒドロキシ安息香酸類に変換する触媒活性、すなわちアミノ安息香酸類水酸化活性を利用して、アミノ安息香酸類からアミノヒドロキシ安息香酸類を製造する反応を意味する。
【0013】
ここで、アミノ安息香酸類としては、好ましくは４－アミノ安息香酸類又は３－アミノ安息香酸類が挙げられ、より好ましくは、下記一般式（１）：
【0014】
【化1】
【0015】
〔式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基（－ＯＨ）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、アミノ基（－ＮＨ２）、ハロゲン原子、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、メチル基（－ＣＨ３）、エチル基（－ＣＨ２ＣＨ３）を示し、Ｒ２は水素原子、ヒドロキシ基（－ＯＨ）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、アミノ基（－ＮＨ２）、ハロゲン原子、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、メチル基（－ＣＨ３）、エチル基（－ＣＨ２ＣＨ３）を示し、Ｘ１及びＸ２は水素原子又はカルボキシ基であって少なくとも一方はカルボキシ基を示す。〕
で示されるアミノ安息香酸誘導体が挙げられる。
で示されるアミノ安息香酸誘導体が挙げられる。
【0016】
また、アミノヒドロキシ安息香酸類としては、好ましくは、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類又は３－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸類が挙げられ、より好ましくは下記の一般式（２）：
【0017】
【化2】
【0018】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１及びＸ２は前記と同じものを示す。〕
で示されるアミノヒドロキシ安息香酸誘導体が挙げられる。
で示されるアミノヒドロキシ安息香酸誘導体が挙げられる。
【0019】
式（１）又は（２）において、Ｒ１及びＲ２で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられ、好ましくはフッ素原子である。
【0020】
Ｒ１で示される官能基としては、水素原子、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、フッ素原子（－Ｆ）、塩素原子（－Ｃｌ）、又はメチル基（－ＣＨ３）が好ましい。
Ｒ２で示される官能基としては、水素原子、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、フッ素原子（－Ｆ）、塩素原子（－Ｃｌ）、又はメチル基（－ＣＨ３）が好ましい。
Ｒ１及びＲ２は、共に水素原子であるのがより好ましい。
Ｒ２で示される官能基としては、水素原子、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、フッ素原子（－Ｆ）、塩素原子（－Ｃｌ）、又はメチル基（－ＣＨ３）が好ましい。
Ｒ１及びＲ２は、共に水素原子であるのがより好ましい。
【0021】
本発明の水酸化反応に用いられる「酵素」は、アミノ安息香酸類を水酸化してアミノヒドロキシ安息香酸類に変換する触媒活性（アミノ安息香酸類水酸化活性）を有するポリペプチドを意味し、好ましくは、４－アミノ安息香酸類水酸化活性又は３－アミノ安息香酸類水酸化活性を有するポリペプチド、より好ましくは４－アミノ安息香酸類の３位を水酸化する活性又は３－アミノ安息香酸類の４位を水酸化する活性を有するポリペプチドが挙げられる。
斯かるアミノ安息香酸類水酸化活性を有するポリペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、前記特許文献２に記載された、下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドや、当該ペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有し、且つアミノ安息香酸類水酸化活性を有するペプチド変異体又は人為的な改変体が挙げられる（例えば、特願２０１９－２０３５２３、特願２０１９－２３３４８４、特願２０１９－２３３４８５、後記参考例３等）。
斯かるアミノ安息香酸類水酸化活性を有するポリペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、前記特許文献２に記載された、下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドや、当該ペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有し、且つアミノ安息香酸類水酸化活性を有するペプチド変異体又は人為的な改変体が挙げられる（例えば、特願２０１９－２０３５２３、特願２０１９－２３３４８４、特願２０１９－２３３４８５、後記参考例３等）。
【0022】
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド
（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド
（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド
【0023】
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（「ＨＦＭ１２２」とも称する）、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（「ＨＦＭ６８９」とも称する）は、４－ヒドロキシ安息香酸－３－モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１３．２）として知られている。「４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素活性」とは、４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素が示す触媒活性を意味し、４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素とは４－ヒドロキシ安息香酸の水酸化を触媒する酵素、好ましくは４－ヒドロキシ安息香酸の３位を水酸化して、プロトカテク酸を生成する反応とその逆反応のいずれか又は両方を促進する触媒活性を有する４－ヒドロキシ安息香酸－３－モノオキシゲナーゼを意味する。４－ヒドロキシ安息香酸－３－モノオキシゲナーゼは、本来の基質である４－ヒドロキシ安息香酸の他に、類似する分子構造を有する４－アミノ安息香酸の３位の水酸化を触媒する活性を有することが知られている（例えば、Domenico L. Gatti et al., Biochemistry, Vol.35, No.2, pp.567-578 (1996)）。斯かるＨＦＭ１２２及びＨＦＭ６８９は、本出願人により、４－アミノ安息香酸類の水酸化を触媒する活性、好ましくは４－アミノ安息香酸類の３位の水酸化を触媒する活性を有することが見出されている（前記特許文献２）。４－アミノ安息香酸水酸化活性は、当該特許文献２に記載の方法等により決定することができる。
【0024】
配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列の例としては、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列が挙げられる。
【0025】
ここで、アミノ酸配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【0026】
また、「１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列」とは、１個以上１０個以下、好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列をいう。また、アミノ酸の「付加」には、配列の一末端及び両末端へのアミノ酸の付加が含まれる。
【0027】
本発明の水酸化反応に用いられる「微生物」としては、上記の酵素、すなわちアミノ安息香酸類水酸化活性を有するポリペプチドを産生する微生物を意味する。ここで、微生物は、アミノ安息香酸類水酸化活性を有するポリペプチドを本来発現するものでよく、またポリペプチドを発現するように組換えられたものでもよい。すなわち、微生物は、アミノ安息香酸類水酸化活性を有するポリペプチドの発現に必要なポリヌクレオチドを発現可能な状態で含むものであればよく、好ましくは、当該ポリヌクレオチドが発現可能なように導入された微生物、当該ポリヌクレオチドの発現が強化された微生物、すなわち遺伝子組換え微生物である。
微生物は、真菌、酵母、放線菌、大腸菌、枯草菌等のいずれであってもよいが、大腸菌、放線菌が好ましい。放線菌としては、コリネバクテリウム属菌、マイコバクテリウム属菌、ロドコッカス属菌、ストレプトマイセス属菌、プロピオニバクテリウム属菌等が挙げられ、好ましくはコリネバクテリウム属菌であり、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムである。
斯かる微生物としては、前述した（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを産生する微生物（前記特許文献２）や、当該ペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有し、且つアミノ安息香酸類水酸化活性を有するペプチド変異体又は人為的な改変体を産生する微生物（例えば、特願２０１９－２０３５２３、特願２０１９－２３３４８４、特願２０１９－２３３４８５、後記参考例３等）が例示できる。
微生物は、真菌、酵母、放線菌、大腸菌、枯草菌等のいずれであってもよいが、大腸菌、放線菌が好ましい。放線菌としては、コリネバクテリウム属菌、マイコバクテリウム属菌、ロドコッカス属菌、ストレプトマイセス属菌、プロピオニバクテリウム属菌等が挙げられ、好ましくはコリネバクテリウム属菌であり、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムである。
斯かる微生物としては、前述した（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを産生する微生物（前記特許文献２）や、当該ペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有し、且つアミノ安息香酸類水酸化活性を有するペプチド変異体又は人為的な改変体を産生する微生物（例えば、特願２０１９－２０３５２３、特願２０１９－２３３４８４、特願２０１９－２３３４８５、後記参考例３等）が例示できる。
【0028】
酵素又は微生物を用いたアミノヒドロキシ安息香酸類の製造反応は、アミノ安息香酸類を、酵素又は微生物と接触させることにより実施される。なお、微生物を用いる場合、アミノ安息香酸類は、菌体内で供給（生合成）されるものでもよく、外部から供給されるものでもよい。
【0029】
酵素又は微生物とアミノ安息香酸類との接触条件は、用いる酵素又は微生物に応じて適宜設計することができる。
微生物を用いる場合、微生物の培養物（培養液、培養上清、培養菌体、菌体の破砕物等が包含される）と菌体内又は菌体外のアミノ安息香酸類とを接触させるが、その方法は特に制限されず、微生物の培養中に接触させてもよく、培養後に別途接触させても良い。
微生物を用いる場合、微生物の培養物（培養液、培養上清、培養菌体、菌体の破砕物等が包含される）と菌体内又は菌体外のアミノ安息香酸類とを接触させるが、その方法は特に制限されず、微生物の培養中に接触させてもよく、培養後に別途接触させても良い。
【0030】
酵素を用いる場合、酵素は、当該酵素を産生する微生物を培養した培地成分等を含有した酵素含有水性液体を乾燥して得られたものでもよいが、これらを含有していない実質的に酵素自体から構成されるものでもよい。酵素としては、例えば、微生物を培養後、菌体を除去して製造された酵素含有水性液体から固定化したもの、もしくは酵素含有水性液体を粉末化したものを使用できる。
固定化酵素としては、酵素をシリカ、セライト、珪藻土、パーライト、ポリビニールアルコール、陰イオン交換樹脂、フェノール吸着樹脂、疎水性担体、陽イオン交換樹脂、キレート樹脂等の担体に固定化したものが挙げられる。粉末酵素は、酵素含有水性液体をスプレードライ、フリーズドライ、溶剤沈澱後の乾燥等の方法で乾燥、粉末化したものが挙げられる。
固定化酵素としては、酵素をシリカ、セライト、珪藻土、パーライト、ポリビニールアルコール、陰イオン交換樹脂、フェノール吸着樹脂、疎水性担体、陽イオン交換樹脂、キレート樹脂等の担体に固定化したものが挙げられる。粉末酵素は、酵素含有水性液体をスプレードライ、フリーズドライ、溶剤沈澱後の乾燥等の方法で乾燥、粉末化したものが挙げられる。
【0031】
接触条件は特に制限されないが、通常２０℃～５０℃で、５分～７２時間、好ましくは１時間～６０時間、より好ましくは１時間～２４時間、必要に応じ撹拌又は振とうしながら行うことができる。
【0032】
本発明において、アミノ安息香酸類の水酸化反応の評価は、アミノヒドロキシ安息香酸類の酸化誘導体を検出することにより行われる。
アミノヒドロキシ安息香酸類の酸化誘導体は、反応液と酸化剤又は酸化触媒を接触させ、反応液中に生成したアミノヒドロキシ安息香酸類と酸化剤又は酸化触媒を反応させることにより誘導できる。
水酸化反応が微生物を用いた反応である場合、培養液をそのまま、或いは遠心分離等により菌体を除去した後に、酸化誘導に供することができる。なお、アミノヒドロキシ安息香酸類が主に菌体内に生産される場合には、通常知られている方法、例えば、菌体を機械的方法、リゾチーム等を用いた酵素的方法又は界面活性剤等を用いた化学的処理によって破壊し、必要に応じて菌体を除去した後、酸化誘導に供するのが好ましい。
アミノヒドロキシ安息香酸類の酸化誘導体は、反応液と酸化剤又は酸化触媒を接触させ、反応液中に生成したアミノヒドロキシ安息香酸類と酸化剤又は酸化触媒を反応させることにより誘導できる。
水酸化反応が微生物を用いた反応である場合、培養液をそのまま、或いは遠心分離等により菌体を除去した後に、酸化誘導に供することができる。なお、アミノヒドロキシ安息香酸類が主に菌体内に生産される場合には、通常知られている方法、例えば、菌体を機械的方法、リゾチーム等を用いた酵素的方法又は界面活性剤等を用いた化学的処理によって破壊し、必要に応じて菌体を除去した後、酸化誘導に供するのが好ましい。
【0033】
アミノヒドロキシ安息香酸類の酸化誘導体としては、呈色可能な誘導体であれば限定されないが、例えば、下記式（３）：
【0034】
【化3】
【0035】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１及びＸ２は前記と同じものを示す。〕
で示されるアミノフェノキサジノン類が挙げられる。斯かるアミノフェノキサジノン類は、３５０～５５０ｎｍ付近に吸収を持ち、また当該吸収波長により励起され６００～８００ｎｍ付近に蛍光を発することから、例えば４４０ｎｍの吸光度を測定すること、また例えば励起波長を４４０ｎｍとして７５０ｎｍの蛍光強度を測定すること等により容易に検出することができる。
で示されるアミノフェノキサジノン類が挙げられる。斯かるアミノフェノキサジノン類は、３５０～５５０ｎｍ付近に吸収を持ち、また当該吸収波長により励起され６００～８００ｎｍ付近に蛍光を発することから、例えば４４０ｎｍの吸光度を測定すること、また例えば励起波長を４４０ｎｍとして７５０ｎｍの蛍光強度を測定すること等により容易に検出することができる。
【0036】
アミノヒドロキシ安息香酸類の酸化誘導に用いられる酸化剤又は酸化触媒としては、アミノヒドロキシ安息香酸類からアミノフェノキサジノン類等の呈色可能な酸化誘導体を形成できるものであれば限定されない。
酸化剤としては、酸素、過酸化水素、フェリシアン化カリウム、酸化銀、過マンガン酸塩、マンガン酸塩、過ヨウ素酸塩、二クロム酸塩等が挙げられ、酸化触媒としては、ラッカーゼ、カテコールオキシダーゼ、チロシナーゼ、ペルオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、モノフェノールオキシダーゼ、ジフェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、ｏ－ジフェノラーゼ、銅担持触媒、白金担持触媒等が挙げられる。
酸化剤としては、酸素、過酸化水素、フェリシアン化カリウム、酸化銀、過マンガン酸塩、マンガン酸塩、過ヨウ素酸塩、二クロム酸塩等が挙げられ、酸化触媒としては、ラッカーゼ、カテコールオキシダーゼ、チロシナーゼ、ペルオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、モノフェノールオキシダーゼ、ジフェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、ｏ－ジフェノラーゼ、銅担持触媒、白金担持触媒等が挙げられる。
【0037】
アミノヒドロキシ安息香酸類と酸化剤又は酸化触媒の接触は、反応系に酸化剤又は酸化触媒を添加し、室温で、一定時間、例えば１～５時間程度、放置又は振盪することにより実施できる。
【0038】
斯くして、生成されたアミノヒドロキシ安息香酸類の酸化誘導体は、特定波長（例えば４４０ｎｍ）における吸光度又は特定波長（例えば７５０ｎｍ）における蛍光強度を測定することにより、検出することができる。
【0039】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞酵素又は微生物を用いてアミノ安息香酸類を水酸化してアミノヒドロキシ安息香酸類を製造する反応において、アミノヒドロキシ安息香酸類の酸化誘導体を検出する工程を含む、アミノ安息香酸類の水酸化反応の評価方法。
＜２＞酵素が下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド、又は当該ペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有し、且つアミノ安息香酸類水酸化活性を有するペプチド変異体又は人為的な改変体である、＜１＞の方法。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド
（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド
＜３＞微生物が下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを産生する微生物、又は当該ペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有し、且つアミノ安息香酸類水酸化活性を有するペプチド変異体又は人為的な改変体を産生する微生物である、＜１＞の方法。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド
（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド
＜３＞微生物が、コリネバクテリウム属菌である、＜２＞の方法。
＜４＞コリネバクテリウム属菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、＜３＞の方法。
＜５＞アミノ安息香酸類が４－アミノ安息香酸類又は３－アミノ安息香酸類であり、アミノヒドロキシ安息香酸類が４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類又は３－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸類である、＜１＞～＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞４－アミノ安息香酸類又は３－アミノ安息香酸類が、下記の一般式（１）：
＜１＞酵素又は微生物を用いてアミノ安息香酸類を水酸化してアミノヒドロキシ安息香酸類を製造する反応において、アミノヒドロキシ安息香酸類の酸化誘導体を検出する工程を含む、アミノ安息香酸類の水酸化反応の評価方法。
＜２＞酵素が下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド、又は当該ペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有し、且つアミノ安息香酸類水酸化活性を有するペプチド変異体又は人為的な改変体である、＜１＞の方法。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド
（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド
＜３＞微生物が下記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを産生する微生物、又は当該ペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有し、且つアミノ安息香酸類水酸化活性を有するペプチド変異体又は人為的な改変体を産生する微生物である、＜１＞の方法。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド
（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素活性を有するポリペプチド
＜３＞微生物が、コリネバクテリウム属菌である、＜２＞の方法。
＜４＞コリネバクテリウム属菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、＜３＞の方法。
＜５＞アミノ安息香酸類が４－アミノ安息香酸類又は３－アミノ安息香酸類であり、アミノヒドロキシ安息香酸類が４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類又は３－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸類である、＜１＞～＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞４－アミノ安息香酸類又は３－アミノ安息香酸類が、下記の一般式（１）：
【0040】
【化4】
【0041】
〔式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、メチル基、エチル基を示し、Ｒ２は水素原子、ヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、メチル基、エチル基を示し、Ｘ１及びＸ２は水素原子又はカルボキシ基であって少なくとも一方はカルボキシ基を示す。〕
で示されるアミノ安息香酸誘導体であり、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類又は３－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸類が下記の一般式（２）：
で示されるアミノ安息香酸誘導体であり、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類又は３－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸類が下記の一般式（２）：
【0042】
【化5】
【0043】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ１及びＸ２は前記と同じものを示す。〕
で示されるアミノヒドロキシ安息香酸誘導体である、＜５＞の方法。
＜７＞式（１）及び（２）において、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である、＜６＞の方法。
＜８＞水酸化反応が微生物を用いた発酵である、＜１＞～＜７＞のいずれかの方法。
＜９＞酸化誘導体が、反応液と酸化剤又は酸化触媒を接触させることにより誘導される、＜１＞～＜８＞のいずれかの方法。
＜１０＞酸化剤が、酸素、過酸化水素、フェリシアン化カリウム、酸化銀、過マンガン酸塩、マンガン酸塩、過ヨウ素酸塩、二クロム酸塩から選ばれる酸化剤である、＜９＞の方法。
＜１１＞酸化触媒が、ラッカーゼ、カテコールオキシダーゼ、チロシナーゼ、ペルオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、モノフェノールオキシダーゼ、ジフェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、ｏ－ジフェノラーゼから選ばれる酸化酵素である、＜９＞又は＜１０＞の方法。
＜１２＞糖類からアミノヒドロキシ安息香酸類を製造する方法であって、前記＜１＞～＜１１＞のいずれかに記載の評価方法を工程として含むアミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
＜１３＞前記糖類が、グルコース、マルトース、スクロース、フルクトース、キシロース、モラセス、グリセリン、でんぷん加水分解物及びこれらの含有物である、＜１２＞の方法。
で示されるアミノヒドロキシ安息香酸誘導体である、＜５＞の方法。
＜７＞式（１）及び（２）において、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である、＜６＞の方法。
＜８＞水酸化反応が微生物を用いた発酵である、＜１＞～＜７＞のいずれかの方法。
＜９＞酸化誘導体が、反応液と酸化剤又は酸化触媒を接触させることにより誘導される、＜１＞～＜８＞のいずれかの方法。
＜１０＞酸化剤が、酸素、過酸化水素、フェリシアン化カリウム、酸化銀、過マンガン酸塩、マンガン酸塩、過ヨウ素酸塩、二クロム酸塩から選ばれる酸化剤である、＜９＞の方法。
＜１１＞酸化触媒が、ラッカーゼ、カテコールオキシダーゼ、チロシナーゼ、ペルオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、モノフェノールオキシダーゼ、ジフェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、ｏ－ジフェノラーゼから選ばれる酸化酵素である、＜９＞又は＜１０＞の方法。
＜１２＞糖類からアミノヒドロキシ安息香酸類を製造する方法であって、前記＜１＞～＜１１＞のいずれかに記載の評価方法を工程として含むアミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
＜１３＞前記糖類が、グルコース、マルトース、スクロース、フルクトース、キシロース、モラセス、グリセリン、でんぷん加水分解物及びこれらの含有物である、＜１２＞の方法。
【実施例】
【0044】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
参考例１ ４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の酸化誘導体の検出
２５ｍＬ容の遠心管（ＩＷＡＫＩ）内でラッカーゼＭ１２０（天野エンザイム）粉末０．０４ｇを１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）２０ｍＬと混合し、遠心分離（１５００×ｇ，５分）を行った後の上清を酵素液とした。遠心分離機にはｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２ （ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いた。また、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（「４，３－ＡＨＢＡ」：東京化成工業）及び４－アミノ安息香酸（「４－ＡＢＡ」：東京化成工業）それぞれ２ｍｇを１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）１０ｍＬに溶解し、表１に示す比率で混合したものを基質溶液とした。
９６穴アッセイプレート（ＩＷＡＫＩ）を用いて酵素液１８０μＬに対し基質溶液２０μＬを添加し、室温で１時間静置した後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて４４０ｎｍの吸光度を測定した。続いて反応液１８０μＬをＡｓｓａｙ Ｐｌａｔｅ ９６ ｗｅｌｌ Ｂｌａｃｋ， Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ （ＣＯＲＮＩＮＧ）に移し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯを用いて７５０ｎｍ（励起波長４４０ｎｍ）の蛍光強度を測定した。図１及び図２に示す通り、４４０ｎｍの吸光度及び７５０ｎｍの蛍光強度は４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の含有比と相関した。
参考例１ ４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の酸化誘導体の検出
２５ｍＬ容の遠心管（ＩＷＡＫＩ）内でラッカーゼＭ１２０（天野エンザイム）粉末０．０４ｇを１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）２０ｍＬと混合し、遠心分離（１５００×ｇ，５分）を行った後の上清を酵素液とした。遠心分離機にはｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２ （ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いた。また、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（「４，３－ＡＨＢＡ」：東京化成工業）及び４－アミノ安息香酸（「４－ＡＢＡ」：東京化成工業）それぞれ２ｍｇを１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）１０ｍＬに溶解し、表１に示す比率で混合したものを基質溶液とした。
９６穴アッセイプレート（ＩＷＡＫＩ）を用いて酵素液１８０μＬに対し基質溶液２０μＬを添加し、室温で１時間静置した後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて４４０ｎｍの吸光度を測定した。続いて反応液１８０μＬをＡｓｓａｙ Ｐｌａｔｅ ９６ ｗｅｌｌ Ｂｌａｃｋ， Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ （ＣＯＲＮＩＮＧ）に移し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯを用いて７５０ｎｍ（励起波長４４０ｎｍ）の蛍光強度を測定した。図１及び図２に示す通り、４４０ｎｍの吸光度及び７５０ｎｍの蛍光強度は４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の含有比と相関した。
【0045】
【表1】
【0046】
また、同様に調製された酸化誘導後の溶液１００μＬをメタノール２００μＬと混合し、アクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行なった後ＬＣ－ＭＳ（ＬＣＭＳ－２０２０、島津製作所）に供した。分析カラムにはＳｕｎｒｉｓｅ Ｃ２８（３μｍ， ２．９ｍｍｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構）を用い、溶離液Ａを１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、溶離液Ｂを１０ｍＭ酢酸アンモニウム＋９９％メタノール溶液とし、流速０．２ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件にてグラジエント溶出を行なった。溶出時間７．７分にて４４０ｎｍ付近に吸収を持つ物質（ｍ／ｚ＝２５７）が検出され、下記式（４）で示される２－アミノフェノキサジン－３－オン－７－カルボン酸（２－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｘａｚｉｎ－３－ｏｎｅ－７－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）の分子量（Ｍｗ：２５６，［Ｍ＋Ｈ］＋＝２５７）と一致した。
【0047】
【化6】
【0048】
実施例１ 培養液上清における４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の酸化誘導体の検出
後述する参考例３に従って作成したアミノ安息香酸水酸化活性を持つ酵素を産生するコリネバクテリウム・グルタミカム菌株を、９６ Ｓｑｕａｒｅ Ｗｅｌｌ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｐｌａｔｅ（ＡＢ－０６６１， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてそれぞれ表２に示すＣＧＸＩＩ培地（カナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含む）０．６ｍＬに接種し、Ｂｉｏｓｈａｋｅｒ Ｍ・ＢＲ－０２４（ＴＡＩＴＥＣ）を用いて３０℃・１２００ｒｐｍにて２日間振盪した。
後述する参考例３に従って作成したアミノ安息香酸水酸化活性を持つ酵素を産生するコリネバクテリウム・グルタミカム菌株を、９６ Ｓｑｕａｒｅ Ｗｅｌｌ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｐｌａｔｅ（ＡＢ－０６６１， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてそれぞれ表２に示すＣＧＸＩＩ培地（カナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含む）０．６ｍＬに接種し、Ｂｉｏｓｈａｋｅｒ Ｍ・ＢＲ－０２４（ＴＡＩＴＥＣ）を用いて３０℃・１２００ｒｐｍにて２日間振盪した。
【0049】
得られた培養液を遠心分離（１５００×ｇ，５分）し、上清を培養液上清とした。また、２５ｍＬ容の遠心管（ＩＷＡＫＩ）内でラッカーゼＭ１２０（天野エンザイム）粉末０．０４ｇを１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）２０ｍＬと混合し、遠心分離（１５００×ｇ，５分）を行った後の上清を酵素液とした。培養液上清１０μＬを酵素液１９０μＬと混合し、室温で１時間静置した後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯを用いて４４０ｎｍの吸光度及び７５０ｎｍの蛍光強度（励起波長：４４０ｎｍ）を測定した。培養液上清中の４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸濃度を参考例２の方法に従って算出し、吸光度及び蛍光強度と比較した。図３及び図４に示すように、培養液上清を使用した場合においても、４４０ｎｍの吸光度及び７５０ｎｍの蛍光強度は４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸濃度と相関した。
【0050】
【表2】
【0051】
参考例２ ４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の定量
４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の定量はＨＰＬＣにより行った。ＨＰＬＣ分析に供する反応液を０．１％リン酸にて適宜希釈した後、アクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行なった。
ＨＰＬＣの装置は、Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）を用いた。分析カラムには、Ｌ－カラム ＯＤＳ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×1５０mｍ、化学物質評価研究機構）を用い、溶離液Ａを０．１Ｍ リン酸二水素カリウムの０．１％リン酸溶液、溶離液Ｂを７０％メタノールとし、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件にてグラジエント溶出を行なった。４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の検出にはＵＶ検出器（検出波長２８０ｎｍ）を用いた。標準試料〔４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（販売元コードＡ１１９４、東京化成工業）〕を用いて濃度検量線を作成し、濃度検量線に基づいて４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の定量を行なった。
４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の定量はＨＰＬＣにより行った。ＨＰＬＣ分析に供する反応液を０．１％リン酸にて適宜希釈した後、アクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行なった。
ＨＰＬＣの装置は、Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）を用いた。分析カラムには、Ｌ－カラム ＯＤＳ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×1５０mｍ、化学物質評価研究機構）を用い、溶離液Ａを０．１Ｍ リン酸二水素カリウムの０．１％リン酸溶液、溶離液Ｂを７０％メタノールとし、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件にてグラジエント溶出を行なった。４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の検出にはＵＶ検出器（検出波長２８０ｎｍ）を用いた。標準試料〔４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（販売元コードＡ１１９４、東京化成工業）〕を用いて濃度検量線を作成し、濃度検量線に基づいて４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の定量を行なった。
【0052】
参考例３ 形質転換株の作製
以下の例において、特に記載のない限りＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用して行った。
（１）野生型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製
（ａ）プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣの作製
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２株から常法によって抽出されたゲノムを鋳型に、プライマーＧＮ１４＿１２７（配列番号５，TATTAATTAAATGCGCGTTTTAATTATTGATAATTATGATTC）とＧＮ１４＿１３３（配列番号６，TTGCGGCCGCTTGTTTAAACCTCCTTACAGAAAAATGGTTGGGCG）を用いたＰＣＲにて４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ及び４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子が含まれたＤＮＡ断片を増幅し、これをプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ（特願２０１５－２５４９１参照）のＰａｃＩ部位とＮｏｔＩ部位の間に挿入することで、プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣを得た。
以下の例において、特に記載のない限りＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用して行った。
（１）野生型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製
（ａ）プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣの作製
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２株から常法によって抽出されたゲノムを鋳型に、プライマーＧＮ１４＿１２７（配列番号５，TATTAATTAAATGCGCGTTTTAATTATTGATAATTATGATTC）とＧＮ１４＿１３３（配列番号６，TTGCGGCCGCTTGTTTAAACCTCCTTACAGAAAAATGGTTGGGCG）を用いたＰＣＲにて４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ及び４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子が含まれたＤＮＡ断片を増幅し、これをプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ（特願２０１５－２５４９１参照）のＰａｃＩ部位とＮｏｔＩ部位の間に挿入することで、プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣを得た。
【0053】
（ｂ）プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＨＦＭ１２２の作製
上記で得られたプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣを鋳型に、プライマーｐａｂＡＢＣｃｏｒｙ ｖｅｃ Ｒ（配列番号７，AAATTTAAACCTCCTTTACAGAAAAATGGTTGG）とｐａｂＡＢＣｃｏｒｙ ｖｅｃ Ｆ（配列番号８，GGAGGTTTAAACAAGCGGCCGCGATATC）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を合成した。続いてアミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドＨＦＭ１２２をコードする遺伝子（配列番号１）を含むプラスミドを人工遺伝子合成により作製し、これを鋳型としてプライマーｐＥＣｓｆＤ ＨＦＭ１２２ Ｆ（配列番号９，AGGAGGTTTAAATTTATGCGCACTCAGGTGGCTAT）とｐＥＣｓｆＤ ＨＦＭ１２２ Ｒ（配列番号１０，CTTGTTTAAACCTCCTTATACGAGTGGCAGTCCTA）を用いたＰＣＲにてインサート用ＤＮＡ断片を合成した。これらのＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＨＦＭ１２２を構築した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地（Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ １％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ １％，カナマイシン硫酸塩５０μｇ／ｍＬ、寒天 １．５％）に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーに対しＳａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ）及びプライマーｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｆ （配列番号１１，GCTATCAAAACATTCGGCACATTGGTTTTCC）、ｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｒ（配列番号１２，GGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTC）を用いたＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡ断片の導入が確認された形質転換株を選抜した。得られた形質転換株をＬＢＫｍ液体培地（Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ １％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ １％，カナマイシン硫酸塩５０μｇ／ｍＬ）２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行った。
上記で得られたプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣを鋳型に、プライマーｐａｂＡＢＣｃｏｒｙ ｖｅｃ Ｒ（配列番号７，AAATTTAAACCTCCTTTACAGAAAAATGGTTGG）とｐａｂＡＢＣｃｏｒｙ ｖｅｃ Ｆ（配列番号８，GGAGGTTTAAACAAGCGGCCGCGATATC）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を合成した。続いてアミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドＨＦＭ１２２をコードする遺伝子（配列番号１）を含むプラスミドを人工遺伝子合成により作製し、これを鋳型としてプライマーｐＥＣｓｆＤ ＨＦＭ１２２ Ｆ（配列番号９，AGGAGGTTTAAATTTATGCGCACTCAGGTGGCTAT）とｐＥＣｓｆＤ ＨＦＭ１２２ Ｒ（配列番号１０，CTTGTTTAAACCTCCTTATACGAGTGGCAGTCCTA）を用いたＰＣＲにてインサート用ＤＮＡ断片を合成した。これらのＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＨＦＭ１２２を構築した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地（Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ １％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ １％，カナマイシン硫酸塩５０μｇ／ｍＬ、寒天 １．５％）に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーに対しＳａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ）及びプライマーｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｆ （配列番号１１，GCTATCAAAACATTCGGCACATTGGTTTTCC）、ｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｒ（配列番号１２，GGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTC）を用いたＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡ断片の導入が確認された形質転換株を選抜した。得られた形質転換株をＬＢＫｍ液体培地（Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ １％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ １％，カナマイシン硫酸塩５０μｇ／ｍＬ）２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行った。
【0054】
（ｃ）プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２の作製
上記で得られたプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＨＦＭ１２２を鋳型に、プライマーｐａｂＣ ｌａｓｔ Ｒ（配列番号１３，TTACAGAAAAATGGTTGGGCGCAA）とＨＦＭ１２２ Ｆ（配列番号１４，ATGCGCACTCAGGTGGCTATCG）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を合成した。続いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株が有するｔｕｆ遺伝子（ｃｇ０５８７）のプロモーター（以下、ｔｕプロモーターと称する）を含むＤＮＡ断片（配列番号１５，TACGTACCTGCAGGTAGCGTGTCAGTAGGCGCGTAGGGTAAGTGGGGTAGCGGCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTCAACAGCATTGATTTCGATGTATTTAGCTGGCCGTTACCCTGCGAATGTCCACAGGGTAGCTGGTAGTTTGAAAATCAACGCCGTTGCCCTTAGGATTCAGTAACTGGCACATTTTGTAATGCGCTAGATCTGTGTGCTCAGTCTTCCAGGCTGCTTATCACAGTGAAAGCAAAACCAATTCGTGGCTGCGAAAGTCGTAGCCACCACGAAGTCCAAAGGAGGATCTAAATTATGAATAATATAAAAGGAGGAATTAATTAA）を人工遺伝子合成により作製し、これを鋳型としてプライマーｐａｂＣ－Ｐｔｕ Ｆ（配列番号１６，ACCATTTTTCTGTAATACGTACCTGCAGGTAGCGTG）とＰｔｕ－ＨＦＭ１２２ Ｒ（配列番号１７，CACCTGAGTGCGCATTTAATTAATTCCTCCTTTTA）を用いたＰＣＲにてインサート用ＤＮＡ断片を合成した。これらのＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２を構築した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーに対しＳａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ）及びプライマーＰｔｕ ｓｅｑ １（配列番号１８，GCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTC）、ｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｒ（配列番号１２，GGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTC）を用いたＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡ断片の導入が確認された形質転換株を選抜した。得られた形質転換株をＬＢＫｍ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行った。
構築したプラスミドにおいては、ｇａｐプロモーターの制御下に４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ及び４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子が連結され、さらにｔｕプロモーターの制御下に野生型ＨＦＭ１２２をコードする遺伝子が連結されている。
上記で得られたプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＨＦＭ１２２を鋳型に、プライマーｐａｂＣ ｌａｓｔ Ｒ（配列番号１３，TTACAGAAAAATGGTTGGGCGCAA）とＨＦＭ１２２ Ｆ（配列番号１４，ATGCGCACTCAGGTGGCTATCG）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を合成した。続いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株が有するｔｕｆ遺伝子（ｃｇ０５８７）のプロモーター（以下、ｔｕプロモーターと称する）を含むＤＮＡ断片（配列番号１５，TACGTACCTGCAGGTAGCGTGTCAGTAGGCGCGTAGGGTAAGTGGGGTAGCGGCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTCAACAGCATTGATTTCGATGTATTTAGCTGGCCGTTACCCTGCGAATGTCCACAGGGTAGCTGGTAGTTTGAAAATCAACGCCGTTGCCCTTAGGATTCAGTAACTGGCACATTTTGTAATGCGCTAGATCTGTGTGCTCAGTCTTCCAGGCTGCTTATCACAGTGAAAGCAAAACCAATTCGTGGCTGCGAAAGTCGTAGCCACCACGAAGTCCAAAGGAGGATCTAAATTATGAATAATATAAAAGGAGGAATTAATTAA）を人工遺伝子合成により作製し、これを鋳型としてプライマーｐａｂＣ－Ｐｔｕ Ｆ（配列番号１６，ACCATTTTTCTGTAATACGTACCTGCAGGTAGCGTG）とＰｔｕ－ＨＦＭ１２２ Ｒ（配列番号１７，CACCTGAGTGCGCATTTAATTAATTCCTCCTTTTA）を用いたＰＣＲにてインサート用ＤＮＡ断片を合成した。これらのＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２を構築した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーに対しＳａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ）及びプライマーＰｔｕ ｓｅｑ １（配列番号１８，GCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTC）、ｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｒ（配列番号１２，GGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTC）を用いたＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡ断片の導入が確認された形質転換株を選抜した。得られた形質転換株をＬＢＫｍ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行った。
構築したプラスミドにおいては、ｇａｐプロモーターの制御下に４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ及び４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子が連結され、さらにｔｕプロモーターの制御下に野生型ＨＦＭ１２２をコードする遺伝子が連結されている。
【0055】
（２）変異型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製
変異型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製について、ＨＦＭ１２２の４７位のバリンがロイシンに置換された変異型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製を例として以下に示す。
プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２を鋳型として、相補的プライマーＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ Ｆ（配列番号１９，GCTGGTCTCCTGGAACGTATCACGGTG）、ＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ Ｒ（配列番号２０，TTCCAGGAGACCAGCCCGAACTCGGCC）を用いたＰＣＲにてプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを構築した。ＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行い、処理後の液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーを形質転換株として選抜した。形質転換株をＬＢＫｍ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行った。
同様に、プライマーＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ Ｆ及びＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ Ｒに代えて表３の「プライマー」に示すプライマーを用いたＰＣＲにて各酵素変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドを得た。
変異型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製について、ＨＦＭ１２２の４７位のバリンがロイシンに置換された変異型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製を例として以下に示す。
プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２を鋳型として、相補的プライマーＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ Ｆ（配列番号１９，GCTGGTCTCCTGGAACGTATCACGGTG）、ＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ Ｒ（配列番号２０，TTCCAGGAGACCAGCCCGAACTCGGCC）を用いたＰＣＲにてプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを構築した。ＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行い、処理後の液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーを形質転換株として選抜した。形質転換株をＬＢＫｍ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行った。
同様に、プライマーＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ Ｆ及びＨＦＭ１２２ Ｖ４７Ｌ Ｒに代えて表３の「プライマー」に示すプライマーを用いたＰＣＲにて各酵素変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドを得た。
【0056】
【表3】
【0057】
（３）プラスミドの宿主細胞への導入
上記で得られた各プラスミドを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＲＨＧ１４５株（特願２０１４－５２３７５７参照）をエレクトロポレーション法（Ｂｉｏ－ｒａｄ）により形質転換した。得られた形質転換細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３０℃で２日間静置し、得られたコロニーを形質転換株とした。
上記で得られた各プラスミドを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＲＨＧ１４５株（特願２０１４－５２３７５７参照）をエレクトロポレーション法（Ｂｉｏ－ｒａｄ）により形質転換した。得られた形質転換細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３０℃で２日間静置し、得られたコロニーを形質転換株とした。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】