特許 7525505 象牙芽細胞増殖・分化促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-22

(45)【発行日】2024-07-30

(54)【発明の名称】象牙芽細胞増殖・分化促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/235 20060101AFI20240723BHJP

   A61K 6/20 20200101ALI20240723BHJP

   A61K 6/50 20200101ALI20240723BHJP

   A61K 6/60 20200101ALI20240723BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240723BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20240723BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240723BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240723BHJP

【ＦＩ】

A61K31/235

A61K6/20

A61K6/50

A61K6/60

A61K45/00

A61K47/42

A61K47/46

A61P1/02

A61P29/00

A61P43/00 105

A61P43/00 107

A61P43/00 121

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2021553564

(86)(22)【出願日】2020-10-23

(86)【国際出願番号】 JP2020039911

(87)【国際公開番号】W WO2021079988

(87)【国際公開日】2021-04-29

【審査請求日】2023-07-13

(31)【優先権主張番号】P 2019193019

(32)【優先日】2019-10-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】592093578

【氏名又は名称】サンメディカル株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100103517

【弁理士】

【氏名又は名称】岡本 寛之

(74)【代理人】

【識別番号】100149607

【弁理士】

【氏名又は名称】宇田 新一

(72)【発明者】

【氏名】斎藤 隆史

(72)【発明者】

【氏名】邱 友靖

(72)【発明者】

【氏名】大槻 環

(72)【発明者】

【氏名】多田 明世

(72)【発明者】

【氏名】山本 隆司

(72)【発明者】

【氏名】小里 達也

(72)【発明者】

【氏名】中村 久美子

(72)【発明者】

【氏名】石田 忠

【審査官】愛清 哲

(56)【参考文献】

【文献】特開２００６－３４７９４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００４－３０７４７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／０８４７８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１９／０２９０５５０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１９－９９４８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】QIU Youjing, TANG Jia and SAITO Takashi，The in vitro effects of CCN2 on odontoblast-like cells，Archives of Oral Biology，2018年，vol.94，p.54-61

【文献】田上順次, 北迫勇一, 園田秀一, 大槻昌幸, 猪越重久，接着性レジンによる歯髄保護と修復，接着歯学，1999年，vol.17, No.1，p.56-60

【文献】Effects of calcium salts of acidic monomers on mineral induction of phosphoprotein immobilized to agarose beads，J Biomed Mater Res Part A，2012年，vol.100A, ISSUE.10，pp.2760-2765，DOI: 10.1002/jbm.a.34212

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０

Ａ６１Ｋ ６／００－ ６／９０

Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９

Ａ６１Ｐ １／００－ １／１８

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩を含有することを特徴とする、象牙芽細胞増殖・分化促進剤。

【請求項2】

前記４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩を、溶解、分散または吸着する生体吸収材料をさらに含有する、請求項１に記載の象牙芽細胞増殖・分化促進剤。

【請求項3】

抗炎症剤をさらに含有する、請求項１に記載の象牙芽細胞増殖・分化促進剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、象牙芽細胞増殖・分化促進剤に関する。

【背景技術】

【0002】

う蝕（虫歯）の歯科治療において、う蝕部分を除去した後、クラウンやインレー、コンポジットレジンなどの修復材料を、歯科用接着剤により歯牙に接着することが知られている。そのような歯科用接着剤は、例えば、歯質（象牙質）を脱灰した後に塗布され、脱灰された部分に浸透することによって、ハイブリッド層を形成する。これによって、歯科用接着剤は、修復材料と歯質との接着性の向上を図っている。

【0003】

しかるに、う蝕感染部位が歯質深くまで至っている場合、う蝕除去する際に歯髄に至り、感染部周囲に突発的な露髄をおこす場合があり、そのような歯科用接着剤では、歯質の強度低下や歯髄の神経に悪影響を及ぼすおそれがある。そこで、歯科用接着剤に、歯質の再石灰化能を有する歯科材料を添加することが種々検討されている。

【0004】

例えば、重合性基と酸性基とを有する単量体の酸性基がカルシウムにより中和されている単量体カルシウム塩、および／または、重合性基と酸性基とを有する単量体の重合体であり、酸性基がカルシウムにより中和されている重合体カルシウム塩を含有する歯科材料が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

【0005】

そのような歯科材料の再石灰化能は、Ｈｅｐｅｓ水溶液に塩化カルシウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウムおよびアジ化ナトリウムを添加して石灰化溶媒を調製し、石灰化溶媒に上記した歯科材料を添加した後、石灰化溶媒中で生成したカルシウムの析出量を測定することにより、確認されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】特開２００６－３４７９４３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかるに、う蝕が歯髄近くまであるいは歯髄に到達している場合、う蝕病原菌に感染した歯髄周辺の象牙質ないしは歯髄の一部を除去する必要がある。近年、歯髄の全てを除去（抜髄）すると歯質、特に象牙質が脆弱化することから、歯髄において、感染部分を除去する一方、未感染部分を保存することが望まれている。

【0008】

この場合、歯髄の感染部分を除去すると、歯髄腔内にスペースが生じて、歯髄の未感染部分が露出する。そこで、覆髄剤を歯髄腔内のスペースに充填して、歯髄を覆うことによって歯髄を生活させたまま保存することが検討される。

【0009】

例えば、覆髄剤として水酸化カルシウム系薬剤を使用し、水酸化カルシウムにより象牙芽細胞を刺激して、接触させた歯髄の一部に象牙質橋（デンチンブリッジ）の生成を促す間接覆髄法が提案されている。このような間接覆髄法は、生活歯髄の一部を象牙質に分化させるため、歯髄自体の容積が減少して、歯髄が委縮するおそれがある。

【0010】

また、特許文献１に記載の歯科材料は、上記したように、通常、歯科用接着剤に添加されるものであって、覆髄剤に添加されるものではない。

【0011】

本発明は、象牙芽細胞の増殖および/または幹細胞から象牙芽細胞への分化の促進を図ることができる象牙芽細胞増殖・分化促進剤を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明［１］は、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩を含有する象牙芽細胞増殖・分化促進剤を含む。

【0013】

本発明［２］は、前記４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩を、溶解、分散または吸着する生体吸収材料をさらに含有する、上記［１］に記載の象牙芽細胞増殖・分化促進剤を含む。

【0014】

本発明［３］は、抗炎症剤をさらに含有する、上記［１］または［２］に記載の象牙芽細胞増殖・分化促進剤を含む。

【発明の効果】

【0015】

本発明の象牙芽細胞増殖・分化促進剤は、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩を含有するので、象牙芽細胞の増殖および/または、幹細胞から象牙芽細胞への分化を促進することができる。そのため、歯科治療において、歯髄の感染部分を除去したときに露出する歯髄に、象牙芽細胞増殖・分化促進剤を接触させることにより、歯髄腔内のスペースに象牙芽細胞を増殖させることが期待できる。この場合、増殖した象牙芽細胞が象牙質を生成するので、歯髄腔の容積減少を抑制でき、ひいては、歯髄の委縮を抑制できる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１Ａは、う蝕が歯髄に到達していない歯牙の概略構成図を示す。図１Ｂは、う蝕が歯髄に到達した歯牙の概略構成図を示す。図１Ｃは、図１Ｂに続いて、歯髄の感染部分が除去され、歯髄が露出した歯牙の概略構成図を示す。図１Ｄは、図１Ｃに続いて、露出した歯髄を従来の覆髄剤で覆った状態の歯牙の概略構成図を示す。

【図2】図２Ａは、図１Ｃに続いて、露出した歯髄を象牙芽細胞増殖・分化促進剤で覆った状態の歯牙の概略構成図を示す。図２Ｂは、図２Ａに続いて、象牙芽細胞が増殖・分化して、歯髄腔が埋まった状態の歯牙の概略構成図を示す。

【図3】図３は、実施例１～５の象牙芽細胞増殖・分化促進剤により増殖させたラット象牙芽細胞様細胞株のＣＣＫ－８アッセイの結果を示すグラフである。

【図4】図４は、実施例４、６～１０の象牙芽細胞増殖・分化促進剤により増殖させたラット象牙芽細胞様細胞株のＣＣＫ－８アッセイの結果を示すグラフである。

【図5】図５Ａは、実施例４、６および７の象牙芽細胞増殖・分化促進剤を用いた象牙芽細胞増殖試験のリアルタイムＰＣＲ解析結果であって、ｒＤＳＰＰのｍＲＮＡの発現量を示す。図５Ｂは、図５Ａと同様の象牙芽細胞増殖試験のリアルタイムＰＣＲ解析結果であって、ｒＤＭＰ－１のｍＲＮＡの発現量を示す。図５Ｃは、図５Ａと同様の象牙芽細胞増殖試験のリアルタイムＰＣＲ解析結果であって、ｒＯＣＮのｍＲＮＡの発現量を示す。図５Ｄは、図５Ａと同様の象牙芽細胞増殖試験のリアルタイムＰＣＲ解析結果であって、ｒＯＰＮの発現量を示す。

【図6】図６は、実施例９、１１～１７の象牙芽細胞増殖・分化促進剤を接触させたヒト歯髄幹細胞のＣＣＫ－８アッセイの結果を示すグラフである。

【図7】図７Ａは、実施例１２および比較例１～３の象牙芽細胞増殖・分化促進剤を用いたヒト歯髄幹細胞から象牙芽細胞への分化試験のリアルタイムＰＣＲ解析結果であって、ＢＳＰのｍＲＮＡの発現量を示す。図７Ｂは、図７Ａと同様のヒト歯髄幹細胞から象牙芽細胞への分化試験のリアルタイムＰＣＲ解析結果であって、ｒＯＰＮのｍＲＮＡの発現量を示す。図７Ｃは、図７Ａと同様のヒト歯髄幹細胞から象牙芽細胞への分化試験のリアルタイムＰＣＲ解析結果であって、ｒＯＣＮのｍＲＮＡの発現量を示す。図７Ｄは、図７Ａと同様のヒト歯髄幹細胞から象牙芽細胞への分化試験のリアルタイムＰＣＲ解析結果であって、ｒＤＳＰＰのｍＲＮＡの発現量を示す。図７Ｅは、図７Ａと同様のヒト歯髄幹細胞から象牙芽細胞への分化試験のリアルタイムＰＣＲ解析結果であって、ｒＤＭＰ－１のｍＲＮＡの発現量を示す。

【図8】図８は、実施例１２の象牙芽細胞増殖・分化促進剤を用いたアルカリホスターゼ測定（静置時間１４日間、２１日間および２８日間）の結果を示すグラフである。

【図9】図９Ａは、実施例１２および比較例１～４の象牙芽細胞増殖・分化促進剤を用いたアリザリンレッドＳ染色測定（静置時間３０日間）の結果を示すグラフである。図９Ｂは、図９Ａと同様のアリザリンレッドＳ染色測定（静置時間３２日間）の結果を示すグラフである。

【図10】図１０Ａは、実施例１２の象牙芽細胞増殖・分化促進剤を用いた間葉系幹細胞から象牙芽細胞への分化試験のリアルタイムＰＣＲ解析結果であって、ＢＳＰのｍＲＮＡの発現量を示す。図１０Ｂは、図１０Ａと同様の間葉系幹細胞から象牙芽細胞への分化試験のリアルタイムＰＣＲ解析結果であって、ｒＤＭＰ－１のｍＲＮＡの発現量を示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明の象牙芽細胞増殖・分化促進剤は、必須成分として、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩を含有する。

【0018】

（１）４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩
４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩は、下記一般式（１）により示される。

【0019】

【化1】

【0020】

（一般式（１）中、Ｒは、ＨまたはＣＨ_３を示す。）
一般式（１）において、Ｒは、水素原子またはメチル基を示し、好ましくは、メチル基を示す。

【0021】

つまり、象牙芽細胞増殖・分化促進剤は、４－アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩および／または４－メタクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩（以下、Ｃ－ＭＥＴとする。）を含み、好ましくは、Ｃ－ＭＥＴを含む。

【0022】

４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩の含有割合は、象牙芽細胞増殖・分化促進剤の固形分を１００質量％としたときに、例えば、０．０１質量％以上、好ましくは、０．０３質量％以上、例えば、１００質量％以下、好ましくは、９５質量％以下である。

【0023】

４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩の含有割合が上記下限以上であれば、象牙芽細胞の増殖および/または幹細胞から象牙芽細胞への分化を確実に促進できる。４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩の含有割合が上記上限以下であれば、象牙芽細胞の増殖および/または幹細胞から象牙芽細胞への分化の促進効果を確保できながら、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩の使用量を低減できる。

【0024】

（２）生体吸収材料
象牙芽細胞増殖・分化促進剤は、任意成分として、好ましくは、生体吸収材料をさらに含有する。

【0025】

象牙芽細胞増殖・分化促進剤が生体吸収材料を含有すれば、象牙芽細胞増殖・分化促進剤を歯髄に接触させたときに、象牙芽細胞が増殖および/または幹細胞から象牙芽細胞への分化するためのスペースを十分に確保することができる（図２Ａ参照）。

【0026】

生体吸収材料は、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩を、溶解、分散または吸着する。

【0027】

生体吸収材料は、生体が吸収可能な材料であって、例えば、コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、アテロコラーゲンなど）、タンパク質（例えば、ゼラチン、フィブリンなど）、多糖類（例えば、酸化セルロース、キチン・キトサン、ヒアルロン酸など）、合成高分子（例えば、ポリグリコール酸・共重合体、ポリ乳酸・共重合体など）、リン酸系・炭酸系無機材料（例えば、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、炭酸カルシウムなど）などが挙げられる。生体吸収材料は、単独使用または２種以上併用することができる。

【0028】

生体吸収材料のなかでは、好ましくは、コラーゲンが挙げられる。

【0029】

常温（２５℃）における生体吸収材料の状態は、特に制限されず、液体であってもよく、固体であってもよい。生体吸収材料が常温において液体である場合、生体吸収材料は、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩を溶解または分散する。生体吸収材料が常温において固体である場合、生体吸収材料は、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩を吸着する。

【0030】

生体吸収材料の含有割合は、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸１質量部に対して、例えば、２質量部以上、好ましくは、５質量部以上、例えば、１００質量部以下、好ましくは、８０質量部以下である。

【0031】

（３）抗炎症剤
また、象牙芽細胞増殖・分化促進剤は、任意成分として、好ましくは、抗炎症剤をさらに含有する。

【0032】

抗炎症剤が生体吸収材料を含有すれば、象牙芽細胞増殖・分化促進剤が歯髄と接触したときに、歯髄の炎症を抑制できるとともに、象牙芽細胞の増殖および/または幹細胞から象牙芽細胞への分化の促進を確実に図ることができる（図２Ａ参照）。

【0033】

抗炎症剤は、歯科材料に適用可能な公知の抗炎症剤であれば特に制限されず、例えば、ステロイド系抗炎症剤（例えば、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベクロメタゾンなど）、ベタメタゾン、フルチカゾン、ヒドロコルチゾンなどが挙げられる。抗炎症剤は、単独使用または２種以上併用することができる。

【0034】

抗炎症剤のなかでは、好ましくは、ステロイド系抗炎症剤が挙げられ、より好ましくは、デキサメタゾンが挙げられる。

【0035】

抗炎症剤の含有割合は、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸１質量部に対して、例えば、１×１０^-７質量部以上、好ましくは、１×１０^-６質量部以上、例えば、１×１０^-２質量部以下、好ましくは、１×１０^-３質量部以下である。

【0036】

（４）その他の添加剤
さらに、象牙芽細胞増殖・分化促進剤は、任意成分として、その他の添加剤を適宜の割合で含有することができる。その他の添加剤として、例えば、賦形剤、保存剤、緩衝材、着色剤、着香剤、粘稠剤などが挙げられる。

【0037】

（５）象牙芽細胞増殖・分化促進剤の剤形
上記した象牙芽細胞増殖・分化促進剤は、例えば、覆髄剤として好適に利用できる。象牙芽細胞増殖・分化促進剤は、う蝕が歯髄に到達している場合に、歯科治療により露出した歯髄に接触するように使用される（図２Ａ参照）。象牙芽細胞増殖・分化促進剤の剤形は、特に制限されず、例えば、粉剤、液剤、シート剤などが挙げられる。

【0038】

（５－１）粉剤
象牙芽細胞増殖・分化促進剤が粉剤である場合、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩は、好ましくは、粒子形状を有する。

【0039】

４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩の平均一次粒子径は、例えば、１μｍ以上、好ましくは、５μｍ以上、例えば、１００μｍ以下、好ましくは、５０μｍ以下である。

【0040】

粉剤である象牙芽細胞増殖・分化促進剤を使用するには、例えば、象牙芽細胞増殖・分化促進剤を綿球に一旦保持した後、その綿球を歯髄に接触、または歯髄近くで振るなどさせて、象牙芽細胞増殖・分化促進剤を歯髄に付着させる（図２Ａ参照）。

【0041】

（５－２）液剤
象牙芽細胞増殖・分化促進剤が液剤である場合、象牙芽細胞増殖・分化促進剤は、好ましくは、溶媒を含有する。

【0042】

溶媒は、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩を、溶解または分散できる。

【0043】

溶媒として、例えば、高極性溶媒（例えば、水、エタノールなど）、中極性溶媒（例えば、アセトンなど）、低極性溶媒（例えば、油など）などが挙げられる。溶媒は、単独使用または２種以上併用することができる。

【0044】

溶媒のなかでは、好ましくは、水、エタノール、アセトンが挙げられる。

【0045】

液剤である象牙芽細胞増殖・分化促進剤における４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩の濃度は、例えば、１μｇ／ｍＬ以上、好ましくは、１０μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは、１５０μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは、３００μｇ／ｍＬ以上、例えば、５０００μｇ／ｍＬ以下、好ましくは、３０００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは、２０００μｇ／ｍＬ以下、とりわけ好ましくは、１２００μｇ／ｍＬ以下である。

【0046】

４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩の濃度が上記下限以上であれば、象牙芽細胞の増殖および/または幹細胞から象牙芽細胞への分化をより一層確実に促進することができる。４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩の濃度が上記上限以下であれば、象牙芽細胞の増殖および/または幹細胞から象牙芽細胞への分化の促進効果を十分に確保できながら、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩の使用量の低減できる。

【0047】

液剤である象牙芽細胞増殖・分化促進剤を使用するには、例えば、歯髄に塗布、噴霧または滴下する（図２Ａ参照）。

【0048】

（５－３）シート剤
象牙芽細胞増殖・分化促進剤がシート剤である場合、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩は、好ましくは、生体吸収材料からなるシート（例えば、コラーゲンシートなど）に吸着される。

【0049】

この場合、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩は、好ましくは、粒子形状を有する。４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩の平均一次粒子径の範囲は、例えば、上記の範囲と同様である。

【0050】

シート剤である象牙芽細胞増殖・分化促進剤を使用するには、例えば、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩が歯髄に接触するように、歯牙に貼付する（図２Ａ参照）。

【0051】

（５）作用効果
う蝕が歯髄１に到達していない場合、歯科治療では、図１Ａに示すように、エナメル質３および原生象牙質２のう蝕部分が除去されて、例えば、窩洞９が形成される。そして、窩洞９の内面を脱灰した後、公知の歯科用接着剤７を窩洞９の内面に塗布して、修復材料８（例えば、インレー、コンポジットレジンなど）を、歯科用接着剤７により歯牙に接着する。つまり、歯科用接着剤７は、う蝕が歯髄１に到達していない場合に、エナメル質３および原生象牙質２の表面と接触する一方、歯髄１とは接触しないように使用される。

【0052】

一方、図１Ｂに示すように、う蝕１０が歯髄１に到達している場合、歯科治療において、エナメル質３および原生象牙質２のう蝕部分とともに、う蝕病原菌に感染した歯髄１の感染部分１Ａが除去され、歯髄の未感染部分１Ｂが保存される。この場合、図１Ｃに示すように、感染部分１Ａの除去により、原生象牙質２が有する歯髄腔２Ａ内にはスペースＳが生じており、未感染部分１Ｂの一部は、エナメル質３に形成された窩洞３Ａ、原生象牙質２に形成された窩洞２ＢおよびスペースＳを介して、露出している。

【0053】

図１Ｄに示すように、露出する未感染部分１Ｂに、従来の覆髄剤４（例えば、水酸化カルシウム系の薬剤）を接触させると、未感染部分１Ｂに含まれる象牙芽細胞が刺激されて、歯髄腔２Ａ内のスペースＳに臨む未感染部分１Ｂの表面にのみ、第三象牙質６が生成する。そのため、歯髄腔２Ａの容積が減少して、歯髄１が委縮するおそれがある。

【0054】

一方、図２Ａに示すように、露出する未感染部分１Ｂに、４－（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩を含有する象牙芽細胞増殖・分化促進剤５を接触させると、図２Ｂに示すように、未感染部分１Ｂに含まれる象牙芽細胞の増殖および/または幹細胞から象牙芽細胞への分化を促進でき、歯髄腔２Ａ内のスペースＳに臨む未感染部分１Ｂの表面のみならず、スペースＳを埋めるように象牙芽細胞７が増殖することを期待できる。そして、増殖した象牙芽細胞が第三象牙質６を、歯髄腔２Ａの外側（例えば、原生象牙質２の窩洞２Ｂ内）に生成するので、歯髄腔２Ａの容積減少を抑制でき、ひいては、歯髄１の委縮を抑制できる。

【実施例】

【0055】

以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、それらに限定されない。以下の記載において用いられる配合割合（含有割合）、物性値、パラメータなどの具体的数値は、上記の「発明を実施するための形態」において記載されている、それらに対応する配合割合（含有割合）、物性値、パラメータなど該当記載の上限値（「以下」、「未満」として定義されている数値）または下限値（「以上」、「超過」として定義されている数値）に代替することができる。

【0056】

＜実施例１～実施例１０＞
＜＜４－メタクリロイルオキシエチルトリメリット酸のカルシウム塩の調製＞＞
撹拌装置、冷却管、温度計および滴下ロートを備えるガラス製反応装置に、エタノール６４ｇと、４－メタクリロキシエチルトリメリット酸（以下、４－ＭＥＴとする。）３．１９ｇ（０．０１ｍｏｌ）とを加えて、氷水で反応装置の内温を約１０℃に冷却しながら撹拌して、４－ＭＥＴをエタノールに溶解した。

【0057】

別途、蒸留水４００ｇに水酸化カルシウム０．７４ｇ（０．０１ｍｏｌ）を溶解させて、水酸化カルシウム水溶液を調製した。そして、水酸化カルシウム水溶液を滴下ロートにより、４－ＭＥＴのエタノール溶液に約３０分かけて滴下した。このとき、反応装置の内温が変化しないように維持した。

【0058】

４－ＭＥＴのエタノール溶液の滴下終了から３０分間、反応装置の内温を室温（２５℃）に上昇させて、反応液の攪拌を続けて、４－ＭＥＴと水酸化カルシウムとの反応生成物を熟成した。得られた反応液を減圧蒸留器にて濃縮して、析出した反応生成物を濾過した。残渣をエタノールで洗浄および乾燥し、白色の固体粉末約３．３ｇを得た。

【0059】

得られた固体粉末は、ＮＭＲ分析および元素分析により、４－ＭＥＴのカルシウム塩（Ｃ－ＭＥＴ）であることを確認した。Ｃ－ＭＥＴにおける酸塩基グラム当量比（カルシウム塩基グラム当量／酸グラム当量）は、１．０［グラム当量／グラム当量］であった。

【0060】

Ｃ－ＭＥＴをボールミルで粗粉砕し、さらにメノウ乳鉢にて十分に均一な微粉末にした。Ｃ－ＭＥＴ粉末の一部を走査型電子顕微鏡にて観察したところ、Ｃ－ＭＥＴ粉末の最大一次粒子径は、約３０μｍであり、Ｃ－ＭＥＴ粉末の最小一次平均粒子径は、約０．１μｍであった。Ｃ－ＭＥＴ粉末をエチレンオキシドにてガス滅菌して分包して保管した。

【0061】

＜＜象牙芽細胞増殖・分化促進剤の調製＞＞
次いで、各実施例においてＣ－ＭＥＴの濃度が下記になるように、Ｃ－ＭＥＴ粉末を超純水（ｄＨ_２Ｏ）に溶解または分散して、液剤である象牙芽細胞増殖・分化促進剤を調製した。なお、実施例１７では、Ｃ－ＭＥＴを超純水に溶解または分散せずに、粉末状体のＣ－ＭＥＴを、粉剤である象牙芽細胞増殖・分化促進剤とした。
実施例１：１０μｇ／ｍＬ（１．０質量％）
実施例２：２０μｇ／ｍＬ（２．０質量％）
実施例３：５０μｇ／ｍＬ（４．８質量％）
実施例４：１００μｇ／ｍＬ（９．１質量％）
実施例５：２００μｇ／ｍＬ（１６．７質量％）
実施例６：３００μｇ／ｍＬ（２３．１質量％）
実施例７：５００μｇ／ｍＬ（３３．３質量％）
実施例８：１０００μｇ／ｍＬ（５０．０質量％）
実施例９：１５００μｇ／ｍＬ（６０．０質量％）
実施例１０：２０００μｇ／ｍＬ（６６．７質量％）
実施例１１：３０．９μｇ／ｍＬ（３．０質量％）
実施例１２：５２．６μｇ／ｍＬ（５．０質量％）
実施例１３：１１１．１μｇ／ｍＬ（１０．０質量％）
実施例１４：２５０ｇ／ｍＬ（２０．０質量％）
実施例１５：６６６．７μｇ／ｍＬ（４０．０質量％）
実施例１６：４０００μｇ／ｍＬ（８０．０質量％）
実施例１７：１００．０質量％。

【0062】

＜評価＞
＜＜象牙芽細胞増殖試験＞＞
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が５質量％添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を準備した。そして、ラット象牙芽細胞様細胞株の一種であるＭＤＰＣ－２３細胞（ラット歯乳頭由来細胞）を、ＤＭＥＭにおいて培養した。次いで、マイクロプレート（９６ウェル）の各ウェルに１０００個のＭＤＰＣ－２３細胞が分配されるように、ＭＤＰＣ－２３細胞が培養されているＤＭＥＭ０．１ｍＬを各ウェルに注入した。

【0063】

次いで、実施例１～１０の象牙芽細胞増殖・分化促進剤および超純水（コントロール）のそれぞれを、対応するウェルに加えた。その後、常温（２５℃）で５日間静置した後、生細胞数測定キット（ＣＣＫ－８：Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８）によって、ＭＤＰＣ－２３細胞の増殖を評価した。

【0064】

ＣＣＫ－８アッセイでは、マイクロプレートリーダー（測定波長：４５０ｎｍ）を使用した。また、ＣＣＫ－８アッセイを６回繰り返した。

【0065】

実施例１～５およびコントロールのＣＣＫ－８アッセイ結果を図３に示し、実施例４、６～１０およびコントロールのＣＣＫ－８アッセイ結果を図４に示す。

【0066】

図３および図４に示されるように、各実施例の象牙芽細胞増殖・分化促進剤により、コントロールと比較して、ＭＤＰＣ－２３細胞の増殖が顕著に促進されていることが確認された。

【0067】

また、図４に示すように、象牙芽細胞増殖・分化促進剤におけるＣ－ＭＥＴの濃度が５００μｇ／ｍＬ（実施例７）までは、Ｃ－ＭＥＴの濃度の増加に伴って、ＭＤＰＣ－２３細胞の増殖・分化促進効果が徐々に向上することが確認され、Ｃ－ＭＥＴの濃度が５００μｇ／ｍＬを超過すると、それ以上のＭＤＰＣ－２３細胞の増殖・分化促進効果の向上は、確認されなかった。

【0068】

＜＜象牙質形成に関する関連遺伝子の発現試験＞＞
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が５質量％添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を準備した。そして、ＭＤＰＣ－２３細胞（ラット歯乳頭由来細胞）をＤＭＥＭにおいて培養した。次いで、マイクロプレート（１２ウェル）の各ウェルに１０４個のＭＤＰＣ－２３細胞が分配されるように、ＭＤＰＣ－２３細胞が培養されているＤＭＥＭ２ｍＬを各ウェルに注入した。

【0069】

次いで、実施例４、６および７の象牙芽細胞増殖・分化促進剤と超純水（コントロール）とのそれぞれを、対応するウェルに加えた。その後、常温（２５℃）で５日間静置した後、各ウェルに、１０ｍｍｏｌ／Ｌのβ－グリセロリン酸（β－ＧＰ）水溶液０．０２ｍＬと、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸０．０２ｍＬと、１００ｎｍｏｌ／Ｌのデキサメタゾン水溶液（ステロイド系抗炎症剤）０．００２ｍＬとを添加した。

【0070】

その後、さらに２日間静置した後、リアルタイムＰＣＲを実施した。なお、内部標準として、β－アクチンを使用した。また、リアルタイムＰＣＲを３回繰り返した。

【0071】

ＲＮＡ－象牙質シアロリンタンパク質（ｒＤＳＰＰ）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現量を図５Ａに示す。ＲＮＡ－象牙質マトリックスタンパク質（ｒＤＭＰ－１）のｍＲＮＡの発現量を図５Ｂに示す。ＲＮＡ－オステオカルシン（ｒＯＣＮ）のｍＲＮＡの発現量を図５Ｃに示す。ＲＮＡ－オステオポンチン（ｒＯＰＮ）のｍＲＮＡの発現量を図５Ｄに示す。

【0072】

図５Ａおよび図５Ｂに示すように、象牙質特有のタンパク質（ｒＤＳＰＰおよびｒＤＭＰ－１）を生成する遺伝子の増加が確認され、かつ、図５Ｃおよび図５Ｄに示すように、硬組織（石灰化）に必要な骨基質タンパク質（オステオカルシンおよびオステオポンチン）を生成する遺伝子の増加が確認された。そのため、増殖したＭＤＰＣ－２３細胞による象牙質の形成が期待できる。

【0073】

＜＜細胞生存率測定＞＞
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）５質量％、５０ユニット／ｍＬペニシリン、および、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を準備した。そして、ヒト歯髄幹細胞（ｈＤＰＳＣ）を、ＤＭＥＭにおいて培養した。次いで、１０ｍｍｏｌ／Ｌのβ－グリセロリン酸（β－ＧＰ）０．０２ｍＬと、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸０．０２ｍＬとを、ｈＤＰＳＣを培養するＤＭＥＭに添加した。

【0074】

次いで、マイクロプレート（９６ウェル）の各ウェルに１，０００～３，０００個のｈＤＰＳＣが分配されるように、ｈＤＰＳＣが培養されているＤＭＥＭ０．１ｍＬを各ウェルに注入した。

【0075】

次いで、実施例９、１１～１７の象牙芽細胞増殖・分化促進剤および超純水（コントロール）のそれぞれを、対応するウェルに加えた。その後、常温（２５℃）で４日間静置した後、生細胞数測定キット（ＣＣＫ－８：Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８）によって、細胞生存率を評価した。

【0076】

ＣＣＫ－８アッセイでは、マイクロプレートリーダー（測定波長：４５０ｎｍ）を使用した。また、ＣＣＫ－８アッセイを６回繰り返した。その結果を図６に示す。

【0077】

図６に示されるように、各実施例の象牙芽細胞増殖・分化促進剤を添加しても、コントロールと同様に、細胞が十分に生存することが確認された。

【0078】

＜＜ヒト歯髄幹細胞から象牙芽細胞への分化試験＞＞
上記した細胞生存率測定と同様にして、ｈＤＰＳＣを培養するＤＭＥＭを準備した。

【0079】

また、粉末状の下記試料のそれぞれを超純水（ｄＨ_２Ｏ）に溶解または分散した後、ＤＭＥＭで希釈して、実施例１２および比較例１～４の象牙芽細胞増殖・分化促進剤を調製した。各象牙芽細胞増殖・分化促進剤における試料の濃度は、５質量％であった。

【0080】

試料：
４－ＭＥＴのカルシウム塩：Ｃ－ＭＥＴ（実施例１２）、
４－メタクリロキシエチルトリメリット酸：４－ＭＥＴ（比較例１）、
水酸化カルシウム：ＣＨ（比較例２）、
ミネラルトリオキサイドアグリゲート：ＭＴＡ（比較例３）、
塩化カルシウム：ＣａＣｌ_２（比較例４）。

【0081】

次いで、実施例１２および比較例１～４の象牙芽細胞増殖・分化促進剤と超純水（コントロール）とのそれぞれを、ｈＤＰＳＣを培養するＤＭＥＭに直接溶解した。

【0082】

その後、２４日間静置した後、実施例１２および比較例１～４の象牙芽細胞増殖・分化促進剤と超純水（コントロール）とを溶解したＤＭＥＭについて、リアルタイムＰＣＲを実施した。なお、内部標準として、β－アクチンを使用した。

【0083】

ＲＮＡ－骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）のｍＲＮＡの発現量を図７Ａに示す。ＲＮＡ－オステオポンチン（ｒＯＰＮ）のｍＲＮＡの発現量を図７Ｂに示す。ＲＮＡ－オステオカルシン（ｒＯＣＮ）のｍＲＮＡの発現量を図７Ｃに示す。ＲＮＡ－象牙質シアロリンタンパク質（ｒＤＳＰＰ）のｍＲＮＡの発現量を図７Ｄに示す。ＲＮＡ－象牙質マトリックスタンパク質（ｒＤＭＰ－１）のｍＲＮＡの発現量を図７Ｅに示す。

【0084】

図７Ａ～図７Ｅに示すように、Ｃ－ＭＥＴをｈＤＰＳＣと接触させると、象牙芽細胞に特有な遺伝子（ＢＳＰ、ｒＯＰＮ、ｒＯＣＢ、ｒＤＳＰＰおよびｒＤＭＰ－１）の増加が確認された。一方、４－ＭＥＴ、ＣＨおよびＭＴＡのそれぞれをｈＤＰＳＣに接触させても、象牙芽細胞に特有な遺伝子の増加は確認されなかった、これによって、Ｃ－ＭＥＴが、ｈＤＰＳＣから象牙芽細胞への分化を促進することが確認された。

【0085】

また、実施例１２の象牙芽細胞増殖・分化促進剤と超純水（コントロール）とを溶解したＤＭＥＭに関して、１４日間、２１日間および２８日間静置したときの石灰化状態を、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰａｓｅ）測定により評価した。その結果を図８に示す。

【0086】

さらに、実施例１２および比較例１～４の象牙芽細胞増殖・分化促進剤と超純水（コントロール）とを溶解したＤＭＥＭに関して、３０日間および３２日間静置したときの石灰化状態を、アリザリンレッドＳ染色測定により評価した。その結果を図９Ａおよび図９Ｂに示す。なお、石灰化状態の評価は、有意水準を１％として、ワンウェイＡＮＯＶＡと、ポストホックＴｕｋｅｙ’ｓ ＨＳＤテストとを用いて実施した。

【0087】

図８、図９Ａおよび図９Ｂに示すように、Ｃ－ＭＥＴをｈＤＰＳＣと接触させると、石灰化が促進されることが確認された。また、ＣＨ、ＭＴＡおよびＣａＣｌ_２をｈＤＰＳＣに接触させた場合においても、石灰化が確認された。しかし、ＣＨおよびＭＴＡをｈＤＰＳＣに接触させた場合、図７Ａ～図７Ｅに示すように、ｈＤＰＳＣから象牙芽細胞への分化を促進が観測されないことから、細胞上でカルシウムイオンがリン酸と結合してリン酸カルシウムが沈着していると思われる。

【0088】

＜＜間葉系幹細胞から象牙芽細胞への分化試験＞＞
ｈＤＰＳＣを間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に変更したこと以外は、上記した細胞生存率測定と同様にして、ＭＳＣを培養するＤＭＥＭを準備した。

【0089】

次いで、実施例１２の象牙芽細胞増殖・分化促進剤と超純水（コントロール）とのそれぞれを、ＭＳＣを培養するＤＭＥＭに直接溶解した。その後、１０日間、１７日間および２４日間静置したときのリアルタイムＰＣＲを実施した。なお、内部標準として、β－アクチンを使用した。

【0090】

ＲＮＡ－骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）のｍＲＮＡの発現量を図８Ａに示す。ＲＮＡ－象牙質マトリックスタンパク質（ｒＤＭＰ－１）のｍＲＮＡの発現量を図８Ｂに示す。

【0091】

図８Ａおよび図８Ｂに示すように、Ｃ－ＭＥＴをＭＳＣと接触させると、象牙芽細胞に特有な遺伝子の増加が確認された。これによって、Ｃ－ＭＥＴが、ＭＳＣから象牙芽細胞への分化を促進することが確認された。

【0092】

なお、上記発明は、本発明の例示の実施形態として提供したが、これは単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。当該技術分野の当業者によって明らかな本発明の変形例は、後記請求の範囲に含まれる。

【産業上の利用可能性】

【0093】

本発明の象牙芽細胞増殖・分化促進剤は、例えば、覆髄剤として好適に用いることができる。

【符号の説明】

【0094】

１ 歯髄
２ 原生象牙質
３ エナメル質
５ 象牙芽細胞増殖・分化促進剤
６ 第三象牙質

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】