特許 7525615 ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-22

(45)【発行日】2024-07-30

(54)【発明の名称】ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20240723BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20240723BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALN20240723BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240723BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6876 Z

C12N15/09 Z

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2022543550

(86)(22)【出願日】2020-01-17

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-13

(86)【国際出願番号】 CN2020072727

(87)【国際公開番号】W WO2021142769

(87)【国際公開日】2021-07-22

【審査請求日】2022-08-19

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】521425353

【氏名又は名称】深▲せん▼華大智造科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＭＧＩ ＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｍａｉｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄ ｆｌｏｏｒ ｏｆ Ｎｏ．１１ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｂｅｉｓｈａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｚｏｎｅ，Ｙａｎｔｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０８３，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100112656

【弁理士】

【氏名又は名称】宮田 英毅

(74)【代理人】

【識別番号】100089118

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 宏明

(72)【発明者】

【氏名】▲ゴン▼梅花

(72)【発明者】

【氏名】劉生茂

(72)【発明者】

【氏名】徐崇鈞

(72)【発明者】

【氏名】周爽

(72)【発明者】

【氏名】王静静

(72)【発明者】

【氏名】李計广

(72)【発明者】

【氏名】韋小芳

(72)【発明者】

【氏名】蒋慧

(72)【発明者】

【氏名】劉健

【審査官】小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／２０９９４６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／０８６５３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００７／１２０２０８（ＷＯ，Ａ２）

【文献】米国特許第０５３０８７５１（ＵＳ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ （ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法であって、前記方法は、
シーケンシング対象である環状ＤＮＡ分子を増幅テンプレートとして第１のラウンドのローリングサークル増幅を行い、第１の部分のテンプレート鎖を生成するステップと、
前記第１の部分のテンプレート鎖にブロッキングされた増幅プライマーまたはブロッキングされていない増幅プライマーをハイブリダイズし、次に、前記環状ＤＮＡ分子を増幅テンプレートとして第２のラウンドのローリングサークル増幅を行い続け、第２の部分のテンプレート鎖を生成するステップと、
前記第１の部分のテンプレート鎖と前記第２の部分のテンプレート鎖のうちのいずれか一方のテンプレート鎖を第１鎖シーケンシングテンプレートとして、他方のテンプレート鎖を増幅テンプレートとして多重置換増幅を行い、第２鎖シーケンシングテンプレートを生成するステップと、
それぞれ前記第１鎖シーケンシングテンプレートと前記第２鎖シーケンシングテンプレートに第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズし、第１鎖シーケンシングと第２鎖シーケンシングを同時に行い、前記ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンスを取得するステップと、を含み、
前記ローリングサークル増幅と前記多重置換増幅の時間を制御することによって前記第１鎖シーケンシングテンプレートと第２鎖シーケンシングテンプレートのコピー数を制御し、
前記第１鎖シーケンシングテンプレートと第２鎖シーケンシングテンプレートのコピー数の間に倍数の違いがあり、シーケンシングプロセス中に前記倍数の違いによる信号の違いによってシーケンシングされた塩基を位置決めする、
ことを特徴とするＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法。

【請求項2】

前記ブロッキングされた増幅プライマーは３’末端がリン酸化された第１鎖シーケンシングプライマーであり、前記ブロッキングされていない増幅プライマーは多重置換増幅プライマーであることを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記方法は、
一本鎖環状ＤＮＡ分子をテンプレートとして、第１のラウンドのローリングサークル増幅を行ってＤＮＡナノスフェアを形成するステップと、
前記第１のラウンドのローリングサークル増幅によって生成された第１の部分のテンプレート鎖に３’末端がリン酸化された第１鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、
前記ＤＮＡナノスフェアに対して第２のラウンドのローリングサークル増幅を行い続け、テンプレート鎖の３’末端を延長して第２の部分のテンプレート鎖を生成し、前記第２の部分のテンプレート鎖を第１鎖シーケンシングテンプレートとして使用するステップと、
前記３’末端がリン酸化された第１鎖シーケンシングプライマーを脱リン酸化し、多重置換増幅を行い、第２鎖シーケンシングテンプレートを生成し、第２鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、
前記第１鎖シーケンシングテンプレートに第１鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズし、マシン上でシーケンシングできる、第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーがハイブリダイズされているＤＮＡナノスフェアテンプレートを取得するステップと、
前記第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーの作用下で、第１鎖シーケンシングと第２鎖シーケンシングを同時に行い、前記ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンスを取得するステップと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記方法は、
一本鎖環状ＤＮＡ分子をテンプレートとして、第１のラウンドのローリングサークル増幅を行ってＤＮＡナノスフェアを形成するステップと、
前記第１のラウンドのローリングサークル増幅によって生成された第１の部分のテンプレート鎖に多重置換増幅プライマーをハイブリダイズするステップと、
前記ＤＮＡナノスフェアに対して第２のラウンドのローリングサークル増幅を行い続け、テンプレート鎖の３’末端を延長して第２の部分のテンプレート鎖を生成し、前記第２の部分のテンプレート鎖を第１鎖シーケンシングテンプレートとして使用するステップと、
前記多重置換増幅プライマーの作用下で、多重置換増幅を行い、第２鎖シーケンシングテンプレートを生成し、第２鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、
前記第１鎖シーケンシングテンプレートに第１鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズし、マシン上でシーケンシングできる、第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーがハイブリダイズされているＤＮＡナノスフェアテンプレートを取得するステップと、
前記第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーの作用下で、第１鎖シーケンシングと第２鎖シーケンシングを同時に行い、前記ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンスを取得するステップと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記方法は、
一本鎖環状ＤＮＡ分子をテンプレートとして、第１のラウンドのローリングサークル増幅を行ってＤＮＡナノスフェアを形成するステップと、
前記第１のラウンドのローリングサークル増幅によって生成された第１の部分のテンプレート鎖に３’末端がリン酸化された第１鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、
前記ＤＮＡナノスフェアに対して第２のラウンドのローリングサークル増幅を行い続け、テンプレート鎖の３’末端を延長するステップであって、第２のラウンドのローリングサークル増幅中に、まず、ｄＵＴＰを含む混合液で延長し、一部にＵ塩基を持つテンプレート鎖を形成させ、次に、ｄＮＴＰｓ混合液で延長し続け、第２の部分のテンプレート鎖を生成するステップと、
前記第２の部分のテンプレート鎖に多重置換増幅プライマーをハイブリダイズし、多重置換増幅を行って第２鎖シーケンシングテンプレートを生成するステップと、
前記第２鎖シーケンシングテンプレートに第２鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズし、前記３’末端がリン酸化された第１鎖シーケンシングプライマーを脱リン酸化し、マシン上でシーケンシングできる、第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーがハイブリダイズされているＤＮＡナノスフェアテンプレートを取得するステップと、
前記第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーの作用下で、第１鎖シーケンシングと第２鎖シーケンシングを同時に行い、前記ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンスを取得するステップと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記方法では、シーケンシングプロセス中に異なる蛍光を有する異なる特異的抗体を加えることでブロッキング基付きの異なる塩基を特異的に認識し、塩基信号の収集を実現することを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記シーケンシングプロセスは、まず、ブロッキング基付きの塩基を加え、次に、ブロッキング基付きの塩基を特異的に認識することができる異なる蛍光を有する特異的抗体を加えて信号の収集を行い、続いて抗体を溶出して信号を除去し、ブロッキング基を除去することによって、次のラウンドのサイクルに進むことを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。

【請求項8】

第２鎖ｒｅａｄ２の信号強度は、第１鎖ｒｅａｄ１の信号強度の２倍または他の倍数である請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は核酸のシーケンシング技術分野に関し、特にＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

現在、ハイスループットシーケンシングの方法には、主に、シングルエンドシーケンシング、ペアエンドシーケンシング（ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ／ｍａｔｅ－ｐａｉｒｅｄ、ＰＥ／ＭＰ）があり、そのうち、ＰＥ／ＭＰシーケンシングは双方向シーケンシングとも呼ばれ、長いシーケンスに対してその両端のシーケンスを測定しており、両端のシーケンスは「１ペア」となり、中央の距離は挿入されたフラグメントの長さであり、シーケンスの組み立て、比較等を行うことができ、遺伝子フラグメントの複製、削除及び挿入の場合、このような方法はより正確であり、ゲノム上での範囲がより広く、Ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄとＭａｔｅ－ｐａｉｒｅｄの違いはライブラリの構築方法である。現在、Ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄシーケンシングが主流になり、シーケンシングの長さを増加すると同時に、構造変異分析に新しい方法を提供することができる。

【0003】

現在、ペアエンドシーケンシング方法について、異なるシーケンシングプラットフォームはシーケンシング手段が異なるが、基本的に、最初にＤＮＡの１本の鎖であるｒｅａｄ１をシーケンシングし、シーケンシングが完了した後、相補鎖であるｒｅａｄ２をシーケンシングする必要があり、例えば、現在市場占有率が最も高いＩｌｌｕｍｉｎａ社によるペアエンドシーケンシングは、主にブリッジ増幅法を採用しており、まず、ＤＮＡ断片化を行い、次に、両端にアダプターを加え、アダプターにはシーケンシングプライマー結合部位が含まれ、第１のラウンドのｒｅａｄ１のシーケンシングが完了した後、第１のラウンドのシーケンシングのテンプレート鎖を除去し、ペアエンドシーケンスモジュール（Ｐａｉｒｅｄ－Ｅｎｄ Ｍｏｄｕｌｅ）を使用して、相補鎖の再生と増幅をその場でガイドし、第２のラウンドのシーケンシングで使用されるテンプレート量を達成し、第２のラウンドの相補鎖ｒｅａｄ２の合成シーケンシングを行う。

【0004】

従来のペアエンドシーケンシング方法に存在する問題は、ＤＮＡの２本の鎖を別々に順次にシーケンシングする必要があり、シーケンシングスループットを低下させ、シーケンシングコストを増加する。

【発明の概要】

【0005】

本発明はＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法を提供し、ＤＮＡの両端から同時にシーケンシングすることができ、ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の同期シーケンシング、即ちｒｅａｄ１とｒｅａｄ２の同時シーケンシングを実現し、これにより、シーケンシング時間とシーケンシングコストを大幅に節約し、シーケンシングスループットを向上させる。

【0006】

本発明は以下の技術的手段によって実現される。

【0007】

ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法であって、
シーケンシング対象である環状ＤＮＡ分子を増幅テンプレートとして第１のラウンドのローリングサークル増幅を行い、第１の部分のテンプレート鎖を生成するステップと、
上記第１の部分のテンプレート鎖にブロッキングされた増幅プライマーまたはブロッキングされていない増幅プライマーをハイブリダイズし、次に、上記環状ＤＮＡ分子を増幅テンプレートとして第２のラウンドのローリングサークル増幅を行い続け、第２の部分のテンプレート鎖を生成するステップと、
上記第１の部分のテンプレート鎖と上記第２の部分のテンプレート鎖のうちのいずれかの部分のテンプレート鎖を第１鎖シーケンシングテンプレートとして、他方のテンプレート鎖を増幅テンプレートとして多重置換増幅を行い、第２鎖シーケンシングテンプレートを生成するステップと、
それぞれ上記第１鎖シーケンシングテンプレートと第２鎖シーケンシングテンプレートに第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズし、第１鎖シーケンシングと第２鎖シーケンシングを同時に行い、上記ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンスを取得するステップと、を含む。

【0008】

好ましい実施例において、上記ブロッキングされた増幅プライマーは３’末端がリン酸化された第１鎖シーケンシングプライマーであり、上記ブロッキングされていない増幅プライマーは多重置換増幅プライマーである。

【0009】

好ましい実施例において、上記方法は、
一本鎖環状ＤＮＡ分子をテンプレートとして、第１のラウンドのローリングサークル増幅を行ってＤＮＡナノスフェアを形成するステップと、
上記第１のラウンドのローリングサークル増幅によって生成された第１の部分のテンプレート鎖に３’末端がリン酸化された第１鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、
上記ＤＮＡナノスフェアに対して第２のラウンドのローリングサークル増幅を行い続け、テンプレート鎖の３’末端を延長して第２の部分のテンプレート鎖を生成し、上記第２の部分のテンプレート鎖を第１鎖シーケンシングテンプレートとして使用するステップと、
上記３’末端がリン酸化された第１鎖シーケンシングプライマーを脱リン酸化し、多重置換増幅を行って第２鎖シーケンシングテンプレートを生成し、第２鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、
上記第１鎖シーケンシングテンプレートに第１鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズし、マシン上でシーケンシングできる、第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーがハイブリダイズされているＤＮＡナノスフェアテンプレートを取得するステップと、
上記第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーの作用の下で、第１鎖シーケンシングと第２鎖シーケンシングを同時に行い、上記ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンスを取得するステップと、を含む。

【0010】

好ましい実施例において、上記方法は、
一本鎖環状ＤＮＡ分子をテンプレートとして、第１のラウンドのローリングサークル増幅を行ってＤＮＡナノスフェアを形成するステップと、
上記第１のラウンドのローリングサークル増幅によって生成された第１の部分のテンプレート鎖に多重置換増幅プライマーをハイブリダイズするステップと、
上記ＤＮＡナノスフェアに対して第２のラウンドのローリングサークル増幅を行い続け、テンプレート鎖の３’末端を延長して第２の部分のテンプレート鎖を生成し、上記第２の部分のテンプレート鎖を第１鎖シーケンシングテンプレートとして使用するステップと、
上記多重置換増幅プライマーの作用の下で、多重置換増幅を行って第２鎖シーケンシングテンプレートを生成し、第２鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、
上記第１鎖シーケンシングテンプレートに第１鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズし、マシン上でシーケンシングできる、第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーがハイブリダイズされているＤＮＡナノスフェアテンプレートを取得するステップと、
上記第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーの作用の下で、第１鎖シーケンシングと第２鎖シーケンシングを同時に行い、上記ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンスを取得するステップと、を含む。

【0011】

好ましい実施例において、上記方法は、
一本鎖環状ＤＮＡ分子をテンプレートとして、第１のラウンドのローリングサークル増幅を行ってＤＮＡナノスフェアを形成するステップと、
上記第１のラウンドのローリングサークル増幅によって生成された第１の部分のテンプレート鎖に３’末端がリン酸化された第１鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、
上記ＤＮＡナノスフェアに対して第２のラウンドのローリングサークル増幅を行い続けて、テンプレート鎖の３’末端を延長するステップであって、第２のラウンドのローリングサークル増幅には、まず、ｄＵＴＰを含む混合液で延長し、一部にＵ塩基を持つテンプレート鎖を形成させ、次に、ｄＮＴＰｓ混合液で延長し続け、第２の部分のテンプレート鎖を生成するステップと、
上記第２の部分のテンプレート鎖に多重置換増幅プライマーをハイブリダイズし、多重置換増幅を行って、第２鎖シーケンシングテンプレートを生成するステップと、
上記第２鎖シーケンシングテンプレートに第２鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズし、上記３’末端がリン酸化された第１鎖シーケンシングプライマーを脱リン酸化し、マシン上でシーケンシングできる、第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーがハイブリダイズされているＤＮＡナノスフェアテンプレートを取得するステップと、
上記第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーの作用の下で、第１鎖シーケンシングと第２鎖シーケンシングを同時に行い、上記ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンスを取得するステップと、を含む。

【0012】

好ましい実施例において、上記方法において上記ローリングサークル増幅と上記多重置換増幅の時間を制御することによって上記第１鎖シーケンシングテンプレートと第２鎖シーケンシングテンプレートのコピー数を制御する。

【0013】

好ましい実施例において、上記第１鎖シーケンシングテンプレートと第２鎖シーケンシングテンプレートのコピー数には倍数の違いがあるため、シーケンシングプロセス中に上記倍数の違いによる信号の違いによってシーケンシングされた塩基を位置決めするようにする。

【0014】

好ましい実施例において、上記方法では、シーケンシングプロセス中に異なる蛍光を有する異なる特異的抗体を加えることでブロッキング基付きの異なる塩基を特異的に認識し、塩基信号の収集を実現する。

【0015】

好ましい実施例において、上記シーケンシングプロセスは、まず、ブロッキング基付きの塩基を加え、次に、ブロッキング基付きの塩基を特異的に認識することができる異なる蛍光を有する特異的抗体を加えて信号の収集を行い、次に、抗体を溶出して信号を除去し、続いて、ブロッキング基を除去することにより、次のサイクルに進む。好ましい実施例において、上記シーケンシングはＭＧＩＳＥＱ（登録商標）－２０００シーケンサーで行われる。

【0016】

本発明によるシーケンシング方法は、２ラウンドのローリングサークル増幅と多重置換増幅によってマシン上でシーケンシングできるＤＮＡナノスフェアテンプレートを生成し、該ＤＮＡナノスフェアテンプレートに第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーがハイブリダイズされ、第１鎖シーケンシングと第２鎖シーケンシングを同時に行い、ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンスを取得することができ、これにより、シーケンシング時間とシーケンシングコストを大幅に削減し、シーケンシングスループットを向上させる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本発明の実施例におけるＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法の第１の手段の原理模式図である。

【図2】本発明の実施例におけるＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法の第２の手段の原理模式図である。

【図3】本発明の実施例におけるＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法の第３の手段の原理模式図である。

【図4】本発明の実施例におけるＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法の第１の手段のシーケンシング信号結果図である。

【図5】本発明の実施例におけるＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法の第２の手段のシーケンシング信号結果図である。

【図6】本発明の実施例におけるＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法の第３の手段のシーケンシング信号結果図である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下、具体的な実施形態を通じて、図面を参照しながら本発明を更に詳細に説明する。以下の実施形態において、本発明がより良く理解されるために数多くの細部を説明する。しかしながら、当業者は、一部の特徴が異なる状況で省略されることができるか、または他の材料、方法によって置き換えられることができることを容易に認識することができる。

【0019】

また、本明細書に記載されている特徴、操作、または特性は、任意の適切な方法で組み合わせて、様々な実施形態を形成することができる。また、同時に、方法の説明におけるステップまたは動作は、当業者に明らかな方法で順番に交換または調整することができる。したがって、本明細書と図面における様々な順序は、ある実施例を明確に説明することのみを目的としており、特に明記しない限り、ある順序に従う必要がある場合を除き、必要な順序を意味するものではない。

【0020】

本発明による方法は、２ラウンドのローリングサークル増幅と多重置換増幅を利用してマシン上でシーケンシングできるＤＮＡナノスフェアテンプレートを生成、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の時間と多重置換増幅（ＭＤＡ）の時間を制御することによって第２鎖ｒｅａｄ２または第１鎖ｒｅａｄ１のテンプレートを生成することができ、このように、第２鎖ｒｅａｄ２のコピー数及び第１鎖ｒｅａｄ１のコピー数は両方とも制御可能であり、ある手段によって第２鎖と第１鎖の両方を兼ね備えるテンプレートを形成し、次に、第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーをそれぞれハイブリダイズし、第２鎖ｒｅａｄ２と第１鎖ｒｅａｄ１のコピー数の違いによる信号の違いによって、例えば第２鎖ｒｅａｄ２の信号は第１鎖ｒｅａｄ１の２倍または他の倍数にすることによって、シーケンシングされた塩基に対して第１鎖ｒｅａｄ１と第２鎖ｒｅａｄ２の位置決めを行い、第１鎖と第２鎖の同期シーケンシング反応を行うことができ、これによりＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖を同期にシーケンシングさせる技術的手段を実現する。

【0021】

具体的に、本発明の実施例において、ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法であって、
シーケンシング対象である環状ＤＮＡ分子を増幅テンプレートとして第１のラウンドのローリングサークル増幅を行い、第１の部分のテンプレート鎖を生成するステップと、
上記第１の部分のテンプレート鎖にブロッキングされた増幅プライマーまたはブロッキングされていない増幅プライマーをハイブリダイズし、上記環状ＤＮＡ分子を増幅テンプレートとして第２のラウンドのローリングサークル増幅を行い続け、第２の部分のテンプレート鎖を生成するステップと、
上記第１の部分のテンプレート鎖と上記第２の部分のテンプレート鎖のうちのいずれか一方のテンプレート鎖を第１鎖シーケンシングテンプレートとして、他方のテンプレート鎖を増幅テンプレートとして多重置換増幅を行って第２鎖シーケンシングテンプレートを生成するステップと、
それぞれ上記第１鎖シーケンシングテンプレートと第２鎖シーケンシングテンプレートに第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズし、第１鎖シーケンシングと第２鎖シーケンシングを同時に行い、上記ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンスを取得するステップと、を含む。

【0022】

本発明において、ローリングサークル増幅は、第１のラウンドのローリングサークル増幅と第２のラウンドのローリングサークル増幅の２つの段階を含み、これにより第１の部分のテンプレート鎖と第２の部分のテンプレート鎖をそれぞれ生成する。ローリングサークル増幅の時間を制御することによって、第１の部分のテンプレート鎖と第２の部分のテンプレート鎖の長さを制御することができ、これに対応し、第１鎖と第２鎖のコピー数を制御する。ローリングサークル増幅は、一般的にＤＮＡポリメラーゼの作用下で行われ、最も一般的に使用されるのはｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。

【0023】

本発明において、第１の部分のテンプレート鎖と第２の部分のテンプレート鎖のうちのいずれか一方を第１鎖シーケンシングテンプレートとして使用することができ、これに対応して、他方を多重置換増幅のテンプレート鎖として第２鎖シーケンシングテンプレートを生成する。

【0024】

本発明において、第１のラウンドのローリングサークル増幅と第２のラウンドのローリングサークル増幅の間で、第１の部分のテンプレート鎖にブロッキングされた増幅プライマーまたはブロッキングされていない増幅プライマーをハイブリダイズし、第１の部分のテンプレート鎖を一時的に閉鎖する一方で、これらの増幅プライマーは、後続の多重置換増幅のプライマーシーケンスとして、または後続の第１鎖シーケンシングのプライマーとして使用されることができる。

【0025】

本発明において、これらの増幅プライマーはブロッキングされたもの、またはブロッキングされていないもののいずれかであってもよく、ブロッキングされた増幅プライマーは一般的に３’末端がブロッキング基によってブロッキングされることでポリメラーゼの作用下で延長できないプライマーを指す。本発明の一実施例において、ブロッキングされた増幅プライマーは３’末端がリン酸化された第１鎖シーケンシングプライマーであり、該第１鎖シーケンシングプライマーの３’末端にリン酸化修飾を有し、延長できないため、第２のラウンドのローリングサークル増幅の過程において変わらない。第２のラウンドのローリングサークル増幅の後、３’末端がリン酸化された第１鎖シーケンシングプライマーを脱リン酸化することができ、第１鎖シーケンシングプライマーの３’末端基はヒドロキシル基になり、ポリメラーゼ作用下で延長することができる。したがって、この脱リン酸化された第１鎖シーケンシングプライマーは後続の多重置換増幅のプライマーまたは後続の第１鎖シーケンシングのプライマーとして使用されることができ、具体的な用途は技術的手段の設計形態によって決定できる。

【0026】

ブロッキングされていない増幅プライマーは第１の部分のテンプレート鎖に結合され、第２のラウンドのローリングサークル増幅の過程において、該増幅プライマーは延長反応を起こすが、ローリングサークル増幅の延長反応に影響しない。第２のラウンドのローリングサークル増幅の後、適切な反応条件下で、ＭＤＡプライマー延長反応を行い、第２鎖シーケンシングテンプレートを生成する。したがって、本発明の一実施例において、ブロッキングされていない増幅プライマーは多重置換増幅プライマーである。

【0027】

本発明によるＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法は複数の具体的な技術的手段によって実現されることができ、本発明は制限ではなく、典型的な詳しい手段を提供し、この３種の技術的手段に基づいて、当業者は他の適切な変形された手段を作成することができるのを理解すべきである。

【0028】

図１に示すように、ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法の第１の詳しい技術的手段は、一本鎖環状ＤＮＡ分子をテンプレートとして使用し、停止溶液を加えずに、第１のラウンドのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を行ってＤＮＡナノスフェア（ＤＮＢ）を形成するステップと、次に、第１のラウンドのローリングサークル増幅によって生成された第１の部分のテンプレート鎖に３’末端リン酸化修飾を有する第１鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、続いて、該ＤＮＢに対して第２のラウンドのローリングサークル増幅を行い続け、テンプレート鎖の３’末端を延長し、延長されたテンプレート鎖を後続で第１鎖ｒｅａｄ１のシーケンシングテンプレートとするステップと、次に、事前にハイブリダイズされた３’末端リン酸化修飾の第１鎖シーケンシングプライマーを脱リン酸化し、多重置換増幅（ＭＤＡ）を行って第２鎖ｒｅａｄ２シーケンシングテンプレートを生成し、第２鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、最後に、第１鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズし、このとき、ＤＮＢテンプレートにハイブリダイズされた第１鎖シーケンシングプライマーと生成された第２鎖シーケンシングテンプレートの両方があり、且つ第２鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーの作用下で、第１鎖シーケンシングと第２鎖シーケンシングを同時に行ってＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンスを取得するステップと、を含む。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の時間と多重置換増幅（ＭＤＡ）による第２鎖ｒｅａｄ２の時間の両方は制御可能であるため、このように、第２鎖ｒｅａｄ２のコピー数及び第１鎖ｒｅａｄ１のコピー数の両方は制御可能であり、第２鎖ｒｅａｄ２と第１鎖ｒｅａｄ１のコピー数による信号違いによって、例えば第２鎖ｒｅａｄ２の信号は第１鎖ｒｅａｄ１の２倍または他の倍数にすることによって、シーケンシングされた塩基に対してｒｅａｄ１とｒｅａｄ２の位置決めを行うことができる。

【0029】

図２に示すように、ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法の第２の詳しい技術的手段は、一本鎖環状ＤＮＡ分子をテンプレートとして使用し、停止溶液を加えずに、第１のラウンドのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を行ってＤＮＡナノスフェア（ＤＮＢ）を形成するステップと、次に、多重置換増幅（ＭＤＡ）プライマーをハイブリダイズするステップと、次に、該ＤＮＢに対して第２のラウンドのローリングサークル増幅を行い続け、テンプレート鎖の３’末端を延長し、延長されたテンプレートを後続で第１鎖ｒｅａｄ１のシーケンシングテンプレートとして、ＭＤＡプライマーを事前にハイブリダイズした部分に対して多重置換増幅（ＭＤＡ）を行い、第２鎖ｒｅａｄ２のシーケンシングテンプレートを生成し、第２鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、続いて、第１鎖ｒｅａｄ１のシーケンシングテンプレートに第１鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、このとき、ＤＮＢテンプレートにハイブリダイズされた第１鎖シーケンシングプライマーと生成された第２鎖シーケンシングテンプレートの両方があり、且つ第２鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、最後に、第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーの作用下で、第１鎖シーケンシングと第２鎖シーケンシングを同時に行い、ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンスを取得するステップと、を含む。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の時間と多重置換増幅（ＭＤＡ）による第２鎖ｒｅａｄ２の時間の両方は制御可能であるため、このように、第２鎖ｒｅａｄ２のコピー数及び第１鎖ｒｅａｄ１のコピー数の両方は制御可能であり、第２鎖ｒｅａｄ２と第１鎖ｒｅａｄ１のコピー数による信号違いによって、例えば第２鎖ｒｅａｄ２の信号は第１鎖ｒｅａｄ１の２倍または他の倍数にすることによって、シーケンシングされた塩基に対してｒｅａｄ１とｒｅａｄ２の位置決めを行うことができる。

【0030】

図３に示すように、ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法の第３の詳しい技術的手段は、一本鎖環状ＤＮＡ分子をテンプレートとして使用し、停止溶液を加えずに第１のラウンドのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を行ってＤＮＡナノスフェア（ＤＮＢ）を形成するステップと、第１のラウンドのローリングサークル増幅によって生成された第１の部分のテンプレート鎖に３’末端リン酸化修飾を有する第１鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズし、第１鎖ｒｅａｄ１のシーケンシングに使用できるように、このプライマーを後続で脱リン酸化するステップと、次に、このＤＮＢを２つの段階で第２のラウンドのローリングサークル増幅を行い、テンプレート鎖の３’末端を延長するステップであって、まず、ｄＵＴＰを含む混合液で延長し、一部にＵ塩基を持つテンプレート鎖を形成させ、Ｕ塩基を含むテンプレート鎖はｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼによって認識されることができないため、この部分がＭＤＡ増幅を行うことができなく、さらに、ｄＮＴＰｓ混合液で正常な延長を行い、この部分は後続でＭＤＡ増幅に使用できるように第２の部分のテンプレート鎖を生成するステップと、次に、第２の部分のテンプレート鎖に第１鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズし、多重置換増幅（ＭＤＡ）を行い、第２鎖ｒｅａｄ２シーケンシングテンプレートを生成し、第２鎖ｒｅａｄ２シーケンシングプライマーをハイブリダイズし、次に３’末端リン酸化修飾の第１鎖シーケンシングプライマーを脱リン酸化し、このとき、ＤＮＢテンプレートにハイブリダイズされた第１鎖シーケンシングプライマーと生成された第２鎖シーケンシングテンプレートの両方があり、且つ第２鎖シーケンシングプライマーをハイブリダイズするステップと、最後に、第１鎖シーケンシングプライマーと第２鎖シーケンシングプライマーの作用下で、第１鎖シーケンシングと第２鎖シーケンシングを同時に行い、ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンスを取得するステップと、を含む。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の時間と多重置換増幅（ＭＤＡ）による第２鎖ｒｅａｄ２の時間の両方は制御可能であるため、このように、第２鎖ｒｅａｄ２のコピー数及び第１鎖ｒｅａｄ１のコピー数の両方は制御可能であり、第２鎖ｒｅａｄ２と第１鎖ｒｅａｄ１のコピー数による信号違いによって、例えば第２鎖ｒｅａｄ２の信号は第１鎖ｒｅａｄ１の２倍または他の倍数にすることによって、シーケンシングされた塩基に対してｒｅａｄ１とｒｅａｄ２の位置決めを行うことができる。

【0031】

本発明の方法は、適切な修飾及び変形の後、他の二本鎖ＤＮＡまたは他の構造のＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の同期シーケンシングにも適用できる。変形された技術的手段では、異なる手段によって第１鎖ｒｅａｄ１シーケンシングテンプレートと第２鎖ｒｅａｄ２シーケンシングテンプレートの両方を形成する必要があり、第２鎖ｒｅａｄ２と第１鎖ｒｅａｄ１のコピー数にある程度の違いがあるため、ｒｅａｄ２とｒｅａｄ１の信号強度の違いを形成し、２つのテンプレートを区別して位置決めし、これにより、ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のシーケンシングを同期させる方法を実現する。

【0032】

本発明の方法は、シーケンシングプロセス中に、異なる蛍光を有する異なる特異的抗体を加えることでブロッキング基付きの異なる塩基を特異的に認識することができ、塩基信号の収集を実現する。例えば、一実施例において、まず、ブロッキング基付きの塩基を加え、次に、ブロッキング基付きのＡ塩基とＴ塩基を特異的に認識することができる異なる蛍光を有する特異的抗体を加え、信号の収集を行い、次に、抗体を溶出し、信号を除去し、次に、ブロッキング基付きのＣ塩基とＧ塩基を特異的に認識することができる異なる蛍光を有する特異的抗体を加え、信号の収集を行う。このように、反応ごとに、２種の蛍光信号のみが発光し、次に、ｒｅａｄ２とｒｅａｄ１はまた信号の違いがあり、信号の認識効果を向上させ、これにより、同期シーケンシングのシーケンシング品質を向上させる。

【0033】

以下、実施例を通じて本発明の技術的手段及び効果を説明したが、実施例は単なる例示であり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解すべきである。

【0034】

実施例１

【0035】

１．機器
ＭＧＩＳＥＱ（登録商標）－２０００シーケンサー、ＭＧＩＳＥＱ（登録商標）－２０００シーケンシング試薬スライド（７１５ｎｍ）、ミニローダー、ＰＣＲ機、ＰＣＲ８連管、ピペット一式、高速遠心分離機。

【0036】

２．試薬
本実施例に使用される試薬を下記表１に示す。

【0037】

【表1】

【0038】

３．試薬準備
１）３’リン酸化第１鎖シーケンシングプライマーの溶解
３’リン酸化第１鎖シーケンシングプライマー粉末を入れた１．５ミリリットルの遠心分離管をｅｐｐｅｎｄｏｒｆ高速遠心分離機（５４１５Ｄ）で、最大回転数で５分間遠心分離し、プライマーラベルの説明に従って、１ＸＴＥ緩衝試薬でプライマーを１００μＭのサイト占有プライマーストック溶液に溶解する。
２）１μＭの３’リン酸化第１鎖シーケンシングプライマーワーキング溶液の調製を下記表２に示す。

【0039】

【表2】

３）ＰＮＫ酵素試薬の調製（脱リン酸化用）を下記表３に示す。

【0040】

【表3】

【0041】

４．操作ステップ
１）「ＭＧＩＳＥＱ（登録商標）－２０００ＲＳハイスループットシーケンシング試薬キット取扱説明書」を参照して大腸菌ライブラリに対してＤＮＡナノスフェアの調製を行い、３枚のシーケンシングスライドを準備し、ＤＮＡナノスフェアをＭＧＩＳＥＱ（登録商標）－２０００シーケンシング試薬スライド（７１５ｎｍ）にローディングし、次に、それぞれ本発明に紹介された３つの技術的手段に従って第２鎖ｒｅａｄ２と第１鎖ｒｅａｄ１テンプレートを形成する。
２）「ＭＧＩＳＥＱ（登録商標）－２０００ＲＳハイスループットシーケンシング試薬キット取扱説明書」を参照して３セットのシーケンシング試薬キットを準備する。
３）「ＭＧＩＳＥＱ（登録商標）－２０００ＲＳハイスループットシーケンシング試薬キット取扱説明書」に従って、シーケンシング試薬キット、チップをＭＧＩＳＥＱ（登録商標）２０００シーケンサーに置き、対応するスクリプトを選択し、ＳＥ１を設定し、シーケンシングを行い、この手段の実現可能性を証明するために、このシーケンシングで第２鎖ｒｅａｄ２シーケンシングプライマーのハイブリダイズを行い、ｒｅａｄ２の第１のサイクル（ｃｙｃｌｅ１）のシーケンシングを行い、シーケンシングが完了した後、ｒｅａｄ２のシーケンシング鎖をブロッキングし、次に、第１鎖ｒｅａｄ１シーケンシングプライマーをハイブリダイズし、ｒｅａｄ１の第１のサイクル（ｃｙｃｌｅ１）のシーケンシングを行う。

【0042】

５．結果
結果は、図４～図６に示すように、図４は本発明の第１の手段のシーケンシング信号結果であり、図５は本発明の第２の手段のシーケンシング信号結果であり、図６は本発明の第３の手段のシーケンシング信号結果である。結果から分かるように、以上の３種の手段は実現可能であるが、第１の手段と第２の手段は第３の手段よりも優れた。具体的に、第１の手段のｒｅａｄ２の信号はｒｅａｄ１の略２倍であり、第２の手段のｒｅａｄ２の信号はｒｅａｄ１の略２．５倍であり、第３の手段のｒｅａｄ２の信号はｒｅａｄ１の略１．２倍である。

【0043】

以上で具体的な例を使用して本発明を説明したが、本発明を理解するのを助けるためにのみ使用され、本発明を限定することを意図するものではない。当業者にとって、本発明の構想によれば、いくつかの単純な推論、変形または置換を行うこともできる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】