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特許7525762ＩＬ６Ｒに結合する抗体及びその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-23

(45)【発行日】2024-07-31

(54)【発明の名称】ＩＬ６Ｒに結合する抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

C07K 16/28 20060101AFI20240724BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20240724BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20240724BHJP

A61P 7/00 20060101ALI20240724BHJP

A61P 9/00 20060101ALI20240724BHJP

A61P 19/02 20060101ALI20240724BHJP

A61P 27/02 20060101ALI20240724BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20240724BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240724BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20240724BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20240724BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20240724BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20240724BHJP

C12N 15/13 20060101ALI20240724BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20240724BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

A61K39/395 U

A61K48/00

A61P7/00

A61P9/00

A61P19/02

A61P27/02

A61P29/00 101

A61P35/00

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2022569148

(86)(22)【出願日】2021-05-17

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-21

(86)【国際出願番号】 CN2021094107

(87)【国際公開番号】W WO2021233246

(87)【国際公開日】2021-11-25

【審査請求日】2022-11-16

(31)【優先権主張番号】63/026,274

(32)【優先日】2020-05-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】522040148

【氏名又は名称】ビオシオンインコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000877

【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チェン、ミンジウ

(72)【発明者】

【氏名】シア、シュカイ

【審査官】長谷川強

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５３０４９５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ１６／２８

Ａ６１Ｋ３９／３９５

Ａ６１Ｋ４８／００

Ａ６１Ｐ７／００

Ａ６１Ｐ９／００

Ａ６１Ｐ１９／０２

Ａ６１Ｐ２７／０２

Ａ６１Ｐ２９／００

Ａ６１Ｐ３５／００

Ｃ１２Ｎ１／１５

Ｃ１２Ｎ１／１９

Ｃ１２Ｎ１／２１

Ｃ１２Ｎ５／１０

Ｃ１２Ｎ１５／１３

Ｃ１２Ｎ１５／６３

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

インターロイキン６受容体サブユニットα（ＩＬ６Ｒ）に結合することができる、単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、
ｉ）ＶＨＣＤＲ１領域、ＶＨＣＤＲ２領域及びＶＨＣＤＲ３領域を含む、重鎖可変領域と、
ｉｉ）ＶＬＣＤＲ１領域、ＶＬＣＤＲ２領域及びＶＬＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含み、
前記ＶＨＣＤＲ１領域、前記ＶＨＣＤＲ２領域及び前記ＶＨＣＤＲ３領域、前記ＶＬＣＤＲ１領域、前記ＶＬＣＤＲ２領域及び前記ＶＬＣＤＲ３領域が、（１）配列番号１、４、１１、１５、１８及び２２のそれぞれ、（２）配列番号２、５、１２、１６、１９及び２２のそれぞれ、（３）配列番号２、６、１３、１５、２０及び２２のそれぞれ、（４）配列番号３、７、１１、１６、２０及び２２のそれぞれ、（５）配列番号２、８、１３、１６、２０及び２２のそれぞれ、（６）配列番号２、９、１３、１５、２０及び２２のそれぞれ、若しくは（７）配列番号２、１０、１４、１７、２１及び２３のそれぞれに記載のアミノ酸配列を含む、
単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。

【請求項2】

前記重鎖可変領域が、配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２又は３３に対する少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含み、
配列番号２５の４８番目、７４番目、及び７９番目のアミノ酸残基は、それぞれＩｌｅ（Ｉ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、及びＡｌａ（Ａ）、それぞれＭｅｔ（Ｍ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、及びＶａｌ（Ｖ）、又はそれぞれＩｌｅ（Ｉ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、及びＶａｌ（Ｖ）であり、
配列番号２７の６７番目、７０番目、及び７２番目のアミノ酸残基は、それぞれＬｙｓ（Ｋ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、及びＡｒｇ（Ｒ）、それぞれＬｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、及びＶａｌ（Ｖ）、又はそれぞれＡｒｇ（Ｒ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、及びＶａｌ（Ｖ）であり、
配列番号３２の７３番目及び８３番目のアミノ酸残基は、それぞれＡｓｎ（Ｎ）及びＬｅｕ（Ｌ）、又はそれぞれＧｌｕ（Ｅ）及びＰｈｅ（Ｆ）である、
請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。

【請求項3】

前記軽鎖可変領域が、配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０に対する少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含み、
配列番号３５の７２番目及び７９番目のアミノ酸残基は、それぞれＴｙｒ（Ｙ）及びＭｅｔ（Ｍ）、又はそれぞれＰｈｅ（Ｆ）及びＬｅｕ（Ｌ）であり、
配列番号３９の５０番目、６２番目及び８２番目のアミノ酸残基は、それぞれＴｙｒ（Ｙ）、Ｈｉｓ（Ｈ）及びＧｌｕ（Ｅ）、又はそれぞれＳｅｒ（Ｓ），Ａｒｇ（Ｒ），Ｇｌｙ（Ｇ）である、
請求項１または２に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。

【請求項4】

前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、
（１）配列番号２４及び３４のそれぞれ、
（２）配列番号２５の４８番目、７４番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＩｌｅ（Ｉ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、及びＡｌａ（Ａ）であり、配列番号３５の７２番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＴｙｒ（Ｙ）及びＭｅｔ（Ｍ）である、配列番号２５及び３５のそれぞれ、
（３）配列番号２６及び３６のそれぞれ、
（４）配列番号２７の６７番目、７０番目及び７２番目のアミノ酸残基がそれぞれＬｙｓ（Ｋ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＡｒｇ（Ｒ）であり、配列番号３５の７２番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＴｙｒ（Ｙ）及びＭｅｔ（Ｍ）である、配列番号２７及び３５のそれぞれ、
（５）配列番号２７の６７番目、７０番目及び７２番目のアミノ酸残基がそれぞれＬｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）及びＶａｌ（Ｖ）であり、配列番号３５の７２番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＴｙｒ（Ｙ）及びＭｅｔ（Ｍ）である、配列番号２７及び３５のそれぞれ、
（６）配列番号２５の４８番目、７４番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＭｅｔ（Ｍ）、Ｔｈｒ（Ｔ）及びＶａｌ（Ｖ）であり、配列番号３５の７２番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＴｙｒ（Ｙ）及びＭｅｔ（Ｍ）である、配列番号２５及び３５のそれぞれ、
（７）配列番号２７の６７番目、７０番目及び７２番目のアミノ酸残基がそれぞれＡｒｇ（Ｒ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＶａｌ（Ｖ）であり、配列番号３５の７２番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＴｙｒ（Ｙ）及びＭｅｔ（Ｍ）である、配列番号２７及び３５のそれぞれ、
（８）配列番号２５の４８番目、７４番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＩｌｅ（Ｉ）、Ｔｈｒ（Ｔ）及びＶａｌ（Ｖ）であり、配列番号３５の７２番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＴｙｒ（Ｙ）及びＭｅｔ（Ｍ）である、配列番号２５及び３５のそれぞれ、
（９）配列番号２５の４８番目、７４番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＩｌｅ（Ｉ）、Ｌｙｓ（Ｋ）及びＡｌａ（Ａ）であり、配列番号３５の７２番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＰｈｅ（Ｆ）及びＬｅｕ（Ｌ）である、配列番号２５及び３５のそれぞれ、
（１０）配列番号２７の６７番目、７０番目及び７２番目のアミノ酸残基がそれぞれＬｙｓ（Ｋ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＡｒｇ（Ｒ）であり、配列番号３５の７２番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＰｈｅ（Ｆ）及びＬｅｕ（Ｌ）である、配列番号２７及び３５のそれぞれ、
（１１）配列番号２７の６７番目、７０番目及び７２番目のアミノ酸残基がそれぞれＬｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）及びＶａｌ（Ｖ）であり、配列番号３５の７２番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＰｈｅ（Ｆ）及びＬｅｕ（Ｌ）である、配列番号２７及び３５のそれぞれ、
（１２）配列番号２５の４８番目、７４番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＭｅｔ（Ｍ）、Ｔｈｒ（Ｔ）及びＶａｌ（Ｖ）であり、配列番号３５の７２番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＰｈｅ（Ｆ）及びＬｅｕ（Ｌ）である、配列番号２５及び３５のそれぞれ、
（１３）配列番号２７の６７番目、７０番目及び７２番目のアミノ酸残基がそれぞれＡｒｇ（Ｒ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＶａｌ（Ｖ）であり、配列番号３５の７２番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＰｈｅ（Ｆ）及びＬｅｕ（Ｌ）である、配列番号２７及び３５のそれぞれ、
（１４）配列番号２５の４８番目、７４番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＩｌｅ（Ｉ）、Ｔｈｒ（Ｔ）及びＶａｌ（Ｖ）であり、配列番号３５の７２番目及び７９番目のアミノ酸残基がそれぞれＰｈｅ（Ｆ）及びＬｅｕ（Ｌ）である、配列番号２５及び３５のそれぞれ、
（１５）配列番号２８及び３７のそれぞれ、
（１６）配列番号２９及び３８のそれぞれ、
（１７）配列番号３９の５０番目、６２番目及び８２番目のアミノ酸残基がそれぞれＴｙｒ（Ｙ）、Ｈｉｓ（Ｈ）及びＧｌｕ（Ｅ）である、配列番号３０及び３９のそれぞれ、
（１８）配列番号３９の５０番目、６２番目及び８２番目のアミノ酸残基がそれぞれＳｅｒ（Ｓ）、Ａｒｇ（Ｒ）及びＧｌｙ（Ｇ）である、配列番号３１及び３９のそれぞれ、
（１９）配列番号３２の７３番目及び８３番目のアミノ酸残基がそれぞれＡｓｎ（Ｎ）及びＬｅｕ（Ｌ）である、配列番号３２及び３８のそれぞれ、
（２０）配列番号３２の７３番目及び８３番目のアミノ酸残基がそれぞれ、Ｇｌｕ（Ｅ）及びＰｈｅ（Ｆ）である、配列番号３２及び３８のそれぞれ、又は
（２１）配列番号３３及び４０のそれぞれ
に対する少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。

【請求項5】

ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。

【請求項6】

前記重鎖可変領域に連結された、配列番号４１の前記アミノ酸配列を有する重鎖定常領域、及び前記軽鎖可変領域に連結された、配列番号４２の前記アミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。

【請求項7】

マウス、キメラ又はヒト化抗体である、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分。

【請求項8】

請求項１から７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド。

【請求項9】

請求項８に記載のヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項10】

請求項９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項11】

請求項１から７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分、請求項８に記載のヌクレオチド、請求項９に記載の発現ベクター、又は請求項１０に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項12】

過剰なＩＬ６／ＩＬ６Ｒシグナル伝達に関連する炎症性疾患を治療するための、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記炎症性疾患が、関節リウマチ、全身型及び多関節型若年性特発性関節炎、巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、キャッスルマン病、サイトカイン放出症候群、シュニッツラー症候群、又は視神経脊髄炎である、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

過剰なＩＬ６／ＩＬ６Ｒシグナル伝達に関連する癌を治療するための請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記癌が、非小細胞肺癌、又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項１４に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願及び援用］
本出願は、２０２０年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／０２６，２７４号に対する優先権を主張するものである。

【0002】

本明細書に引用又は参照される全ての文献（本明細書に引用される全ての文献、特許、公開特許出願を含むがこれらに限定されない）（「本明細書に引用される文献」）、及び本明細書に引用される文献に引用又は参照される全ての文献は、本明細書又は参照により本明細書に援用されるあらゆる文献に記載される、あらゆる製品についてのあらゆる製造業者の説明書、記載、製品仕様書、及び製品シートと一緒に、参照により本明細書に援用され、本発明の実施に用いられ得る。より詳細には、全ての参照される文献は、各個々の文献が、具体的に及び個別に、参照により援用されることが示されるのと同程度に、参照により援用される。本開示に記載されるあらゆるＧｅｎｂａｎｋ配列は、本開示の最先の有効出願日のものであるＧｅｎｂａｎｋ配列とともに、参照により援用される。

【0003】

本開示は、一般に、高い親和性及び機能性でヒトＩＬ６Ｒに結合する、単離モノクローナル抗体、特に、マウス、キメラ又はヒト化モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分に関する。抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞及び抗体又はその抗原結合部分を発現するための方法も提供される。本開示はさらに、二重特異性分子、免疫抱合体、キメラ抗原受容体、腫瘍溶解性ウイルス、及び抗体又はその抗原結合部分を含み得る医薬組成物、並びに本開示の抗ＩＬ６Ｒ抗体又はその抗原結合部分を用いた診断又は治療方法を提供する。

【背景技術】

【0004】

インターロイキン－６（ＩＬ６）は、例えば、２つの膜貫通タンパク質のＩＬ６Ｒ（ＩＬ６Ｒα、ｇｐ８０又はＣＤ１２６としても知られる）及びｇｐ１３０との相互作用を通じて免疫及び代謝における役割を果たす、多機能性サイトカインである（Ｋａｎｇ，Ｓｅｔａｌ．，（２０１９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ５０（４）：１００７－１０２３）。

【0005】

ＩＬ６Ｒの発現は、肝細胞、単球及びリンパ球に制限され、ＩＬ６Ｒの２つの形態、すなわち、膜結合ＩＬ６Ｒ（ｍＩＬ６Ｒ）及び可溶性ＩＬ６Ｒ（ｓＩＬ６Ｒ）が、ＩＬ６シグナル伝達に関与することが分かっている。ｓＩＬ６Ｒは、プロテアーゼによって、ｍＩＬ６Ｒから切断されるか、又は交互スプライスされたＩＬ６ＲｍＲＮＡから翻訳される（Ｒｉｅｔｈｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓｅｔａｌ．，（２０１７）ＰｌｏｓＢｉｏｌｏｇｙ１５（１）：ｅ２００００８０；Ｌｕｓｔ，Ｊ．Ａｅｔａｌ．，（１９９２）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ４（２）：９６－１００）。２つのＩＬ６Ｒ形態の存在＋ｇｐ３０の遍在的発現は、ＩＬ６が様々な系及び臓器においてその活性を発揮することを可能にする。具体的には、ＩＬ６は、ｍＩＬ６Ｒ及び膜結合ｇｐ１３０（ｍｇｐ１３０）に結合し、古典的なＩＬ６シグナル伝達を開始させる一方で、ＩＬ６のトランスシグナル伝達が、ｇｐ１３０を発現するがＩＬ６Ｒを発現しない細胞上でのＩＬ６－ｓＩＬ６－ｍｇｐ１３０複合体の形成によって活性化される。近年、樹状細胞上でＩＬ６及びｍＩＬ６Ｒによって形成される複合体が、ｍｇｐ１３０を発現するＴ細胞に提示される場合、ＩＬ６シグナル伝達の第３のタイプが、病原性Ｔヘルパー１７細胞のプライミングに必要であることが発見されている（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，Ｐ．Ｃｅｔａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７４：１－２０）。ｓＩＬ６媒介性シグナル伝達カスケードが、ＩＬ６－ｓＩＬ６Ｒとの相互作用時、循環血液中に存在する可溶性ｇｐ１３０によって下方制御され得る（Ｊｏｓｔｏｃｋ，Ｔｅｔａｌ．，（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ２６８（１）：１６０－１６７）。ＩＬ６シグナル伝達は、主に、２つの下流経路、ＪＡＫ及びＳＴＡＴ３経路とＪＡＫ－ＳＨＰ２－ＭＡＰキナーゼ経路とを活性化する（Ｋａｎｇ，Ｓｅｔａｌ．，（２０１９）上記）。

【0006】

ＩＬ６は、活性化Ｂ細胞を免疫グロブリン産生細胞に分化させ、天然ＣＤ４＋Ｔ細胞を、炎症性サイトカインＩＬ１７を産生するＴｈ１７系統に駆動することが報告されている（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔｅｔａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２４（６０９２）：７３－７６；Ｂｅｔｔｅｌｌｉ，Ｅｅｔａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４１（７０９０）：２３５－２３８）。過剰なＩＬ６発現は、免疫寛容を破壊し、炎症性疾患を引き起こし得る。例えば、高いＩＬ６レベルを伴う心臓粘液腫を有する患者において、自己免疫性症状が認められた（Ｈｉｒａｎｏ，Ｔｅｔａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４（１）：２２８－２３１）。ＩＬ６は、腫瘍細胞増殖を刺激することがさらに分かっており、腎細胞癌、リンパ腫、卵巣癌、メラノーマ及び前立腺癌などの癌における予後不良に関連する（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｏｅｔａｌ．，（２００７）Ｐｒｏｓｔａｔｅ６７：７６４－７７３）。さらに、ＩＬ６は、骨恒常性、組織再生、脂質代謝、血管新生などにおける役割を果たす。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ＩＬ６シグナル伝達は、自己免疫疾患を含む炎症性疾患の治療のため、標的にされている。例えば、ＩＬ６のｍＩＬ６Ｒ及びｓＩＬ６Ｒの双方への結合を阻害する、最初に開発されたＩＬ６Ｒ遮断薬のアクテムラ（登録商標）トシリズマブは、世界中の１００を超える国で、関節リウマチ、全身型及び多関節型若年性特発性関節炎、巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、キャッスルマン病及びキメラ抗原受容体Ｔ細胞が複合されたサイトカイン放出症候群（ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒＴｃｅｌｌｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄｃｙｔｏｋｉｎｅｒｅｌｅａｓｅｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療において認可されている。トシリズマブはまた、癌及び全身性硬化症などの他の炎症性疾患に対する潜在的な有効性について、臨床試験において試験されている。ＩＬ６及び／又はＩＬ６Ｒを標的にする他のいくつかの生物製剤が、有効性及び安全性特性について試験されることが報告されている。改善された有効性及び安全性を有する抗体は、常に所望されている。

【0008】

本出願におけるいずれの文献の引用又は特定も、このような文献が本開示に対する先行技術として利用可能であることを認めるものではない。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本開示は、ＩＬ６Ｒ（例えば、ヒトＩＬ６Ｒ）に結合し、トシリズマブなどの先行技術の抗ＩＬ６Ｒ抗体と比較して、より高くないとしても同等のヒト及び／又はサルＩＬ６Ｒに対する結合親和性／能力、並びにより高くないとしても同等のＩＬ６－ＩＬ６Ｒ相互作用に対するブロッキング活性を有する、単離モノクローナル抗体、例えば、マウス、キメラ又はヒト化モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。

【0010】

本開示の抗体又は抗原結合部分は、ＩＬ６及び／又はＩＬ６Ｒ関連疾患、例えば炎症性疾患、及び癌の治療を含む様々な用途に使用され得る。

【0011】

したがって、一態様において、本開示は、ＩＬ６Ｒに結合し、ｉ）ＶＨＣＤＲ１領域、ＶＨＣＤＲ２領域及びＶＨＣＤＲ３領域を含み得る重鎖可変領域であって、ＶＨＣＤＲ１領域、ＶＨＣＤＲ２領域及びＶＨＣＤＲ３領域が、（１）配列番号１、４及び１１のそれぞれ；（２）配列番号２、５及び１２のそれぞれ；（３）配列番号２、６及び１３のそれぞれ；（４）配列番号３、７及び１１のそれぞれ；（５）配列番号２、８及び１３のそれぞれ；（６）配列番号２、９及び１３のそれぞれ；若しくは（７）配列番号２、１０及び１４のそれぞれに対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得る、重鎖可変領域；並びに／又はｉｉ）ＶＬＣＤＲ１領域、ＶＬＣＤＲ２領域及びＶＬＣＤＲ３領域を含み得る軽鎖可変領域であって、ＶＬＣＤＲ１領域、ＶＬＣＤＲ２領域及びＶＬＣＤＲ３領域が、（１）配列番号１５、１８及び２２のそれぞれ；（２）配列番号１６、１９及び２２のそれぞれ；（３）配列番号１５、２０及び２２のそれぞれ；（４）配列番号１６、２０及び２２のそれぞれ；若しくは（５）配列番号１７、２１及び２３のそれぞれに対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得る、軽鎖可変領域を有する、単離モノクローナル抗体（例えば、マウス、キメラ又はヒト化抗体）、又はその抗原結合部分に関する。

【0012】

本開示の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３、並びにＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３は、（１）配列番号１、４、１１、１５、１８及び２２のそれぞれ；（２）配列番号２、５、１２、１６、１９及び２２のそれぞれ；（３）配列番号２、６、１３、１５、２０及び２２のそれぞれ；（４）配列番号３、７、１１、１６、２０及び２２のそれぞれ；（５）配列番号２、８、１３、１６、２０及び２２のそれぞれ；（６）配列番号２、９、１３、１５、２０及び２２のそれぞれ；又は（７）配列番号２、１０、１４、１７、２１及び２３のそれぞれに対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0013】

重鎖可変領域は、配列番号２４、２５（Ｘ１＝Ｉ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ａ；Ｘ１＝Ｍ、Ｘ２＝Ｔ、Ｘ３＝Ｖ；又はＸ１＝Ｉ、Ｘ２＝Ｔ、Ｘ３＝Ｖ）、２６、２７（Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｒ；Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｍ、Ｘ３＝Ｖ；又はＸ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｖ）、２８、２９、３０、３１、３２（Ｘ１＝Ｎ、Ｘ２＝Ｌ；又はＸ１＝Ｅ、Ｘ２＝Ｆ）又は３３に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。配列番号２４のアミノ酸配列は、配列番号４６又は４７のヌクレオチド配列によってコードされ得る。配列番号２７（Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｖ）のアミノ酸配列は、配列番号４８のヌクレオチド配列によってコードされ得る。

【0014】

軽鎖可変領域は、配列番号３４、３５（Ｘ１＝Ｙ、Ｘ２＝Ｍ；又はＸ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｌ）、３６、３７、３８、３９（Ｘ１＝Ｙ、Ｘ２＝Ｈ、Ｘ３＝Ｅ；又はＸ１＝Ｓ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｇ）又は４０に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。配列番号３４のアミノ酸配列は、配列番号４９又は５０のヌクレオチド配列によってコードされ得る。配列番号３５（Ｘ１＝Ｙ、Ｘ２＝Ｍ）のアミノ酸配列は、配列番号５１のヌクレオチド配列によってコードされ得る。

【0015】

本開示の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、（１）配列番号２４及び３４のそれぞれ；（２）配列番号２５（Ｘ１＝Ｉ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ａ）及び３５（Ｘ１＝Ｙ、Ｘ２＝Ｍ）のそれぞれ；（３）配列番号２６及び３６のそれぞれ；（４）配列番号２７（Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｒ）及び３５（Ｘ１＝Ｙ、Ｘ２＝Ｍ）のそれぞれ；（５）配列番号２７（Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｍ、Ｘ３＝Ｖ）及び３５（Ｘ１＝Ｙ、Ｘ２＝Ｍ）のそれぞれ；（６）配列番号２５（Ｘ１＝Ｍ、Ｘ２＝Ｔ、Ｘ３＝Ｖ）及び３５（Ｘ１＝Ｙ、Ｘ２＝Ｍ）のそれぞれ；（７）配列番号２７（Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｖ）及び３５（Ｘ１＝Ｙ、Ｘ２＝Ｍ）のそれぞれ；（８）配列番号２５（Ｘ１＝Ｉ、Ｘ２＝Ｔ、Ｘ３＝Ｖ）及び３５（Ｘ１＝Ｙ、Ｘ２＝Ｍ）のそれぞれ；（９）配列番号２５（Ｘ１＝Ｉ、Ｘ２＝Ｋ、Ｘ３＝Ａ）及び３５（Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｌ）のそれぞれ；（１０）２７（Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｒ）及び３５（Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｌ）のそれぞれ；（１１）２７（Ｘ１＝Ｋ、Ｘ２＝Ｍ、Ｘ３＝Ｖ）及び３５（Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｌ）のそれぞれ；（１２）配列番号２５（Ｘ１＝Ｍ、Ｘ２＝Ｔ、Ｘ３＝Ｖ）及び３５（Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｌ）のそれぞれ；（１３）２７（Ｘ１＝Ｒ、Ｘ２＝Ｌ、Ｘ３＝Ｖ）及び３５（Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｌ）のそれぞれ；（１４）配列番号２５（Ｘ１＝Ｉ、Ｘ２＝Ｔ、Ｘ３＝Ｖ）及び３５（Ｘ１＝Ｆ、Ｘ２＝Ｌ）のそれぞれ；（１５）配列番号２８及び３７のそれぞれ；（１６）配列番号２９及び３８のそれぞれ；（１７）配列番号３０及び３９（Ｘ１＝Ｙ、Ｘ２＝Ｈ、Ｘ３＝Ｅ）のそれぞれ；（１８）配列番号３１及び３９（Ｘ１＝Ｓ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｇ）のそれぞれ；（１９）配列番号３２（Ｘ１＝Ｎ、Ｘ２＝Ｌ）及び３８のそれぞれ；（２０）配列番号３２（Ｘ１＝Ｅ、Ｘ２＝Ｆ）及び３８のそれぞれ；又は（２１）配列番号３３及び４０のそれぞれに対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0016】

本開示の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、ジスルフィド結合によって連結される重鎖及び軽鎖を含み得、重鎖は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含み得、軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含み得、重鎖可変領域のＣ末端は、重鎖定常領域のＮ末端に連結され、軽鎖可変領域のＣ末端は、軽鎖定常領域のＮ末端に連結され、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、上記のアミノ酸配列を含み得、抗体又はその抗原結合部分は、ＩＬ６Ｒに結合する。重鎖定常領域は、例えば配列番号４１に記載されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１定常領域、又はその機能的フラグメントであり得、軽鎖定常領域は、例えば配列番号４２に記載されるアミノ酸配列を有するヒトκ定常領域、又はその機能的フラグメントであり得る。重鎖定常領域はまた、ヒトＩｇＧ４定常領域であり得る。軽鎖定常領域は、ヒトκ定常領域であり得る。配列番号４１及び４２のアミノ酸配列は、配列番号５２及び５３のそれぞれのヌクレオチド配列によってコードされ得る。

【0017】

いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むか又はそれからなり得、ここで、各重鎖は、上述される重鎖定常領域、重鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含み得、各軽鎖は、上述される軽鎖定常領域、軽鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含み得、ここで、抗体は、ＩＬ６Ｒに結合する。本開示の抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプの完全長抗体であり得る。他の実施形態における本開示の抗体又はその抗原結合部分は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体、又はＦａｂ若しくはＦａｂ'_２フラグメントなどの抗体フラグメントであり得る。

【0018】

本開示はまた、前記抗体又はその抗原結合部分と異なる結合特異性を有する第２の官能基（例えば、二次抗体）に連結された、本開示の抗体又はその抗原結合部分を含み得る二重特異性分子を提供する。本開示はまた、細胞毒などの治療剤に連結された、本開示の抗体又はその抗原結合部分を含み得る、抗体－薬物コンジュゲートなどの免疫抱合体を提供する。別の態様において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部に作られ得る。Ｔ細胞及びＮＫ細胞などの、抗原キメラ受容体を含み得る免疫細胞も提供される。本開示の抗体又はその抗原結合部分はまた、腫瘍溶解性ウイルスによってコードされるか又は腫瘍溶解性ウイルスとともに使用され得る。

【0019】

本開示の抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、並びにこのような核酸を含み得る発現ベクター及びこのような発現ベクターを含み得る宿主細胞も、本開示によって包含される。宿主細胞を用いて、本開示の抗ＩＬ６Ｒ抗体又はその抗原結合部分を調製するための方法であって、（ｉ）宿主細胞において抗体を発現する工程及び（ｉｉ）宿主細胞又はその細胞培養物から抗体を単離する工程を含み得る、方法も提供される。

【0020】

本開示の抗体又はその抗原結合部分、免疫抱合体、二重特異性分子、腫瘍溶解性ウイルス、ＣＡＲ、ＣＡＲ－Ｔ細胞、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含み得る組成物も提供される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、特定の疾患を治療するための治療剤、例えば、抗炎症剤、又は抗癌剤をさらに含有し得る。

【0021】

さらに別の態様において、本開示は、過剰なＩＬ６／ＩＬ６Ｒシグナル伝達に関連する疾患を治療するための方法であって、治療有効量の、本開示の組成物を対象に投与することを含み得る、方法を提供する。

【0022】

疾患は、自己免疫疾患などの炎症性疾患であり得る。炎症性疾患としては、限定はされないが、関節リウマチ、全身型及び多関節型若年性特発性関節炎、巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、キャッスルマン病、サイトカイン放出症候群（例えば、キメラ抗原受容体Ｔ細胞が複合されたサイトカイン放出症候群）、シュニッツラー症候群、及び視神経脊髄炎が挙げられる。該方法は、限定はされないが、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＩＬ２Ｒ抗体、抗ＩＬ６抗体、及び抗ＩＬ１７抗体を含む抗炎症剤を投与することをさらに含み得る。

【0023】

疾患は、腫瘍又は癌であり得る。腫瘍は、限定はされないが、非小細胞肺癌、及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含む、固形腫瘍又は血液腫瘍であり得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる抗癌抗体、例えば、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＳＴＡＴ３抗体、及び／又は抗ＲＯＲ１抗体がさらに投与され得る。

【0024】

本開示の他の特徴及び利点は、限定であると解釈されるべきではない以下の詳細な説明及び実施例から明らかになるであろう。本出願を通して引用される全ての参照文献、Ｇｅｎｂａｎｋエントリ、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。

【0025】

したがって、本発明の目的は、任意の既に公知の製品、その製品の作製方法、又はその製品の使用方法を本発明に包含することではなく、したがって、本出願人は、その権利を留保し、任意の既に公知の製品、プロセス、又は方法の放棄を本明細書に開示する。本発明は、ＵＳＰＴＯの書面による記載及び実施可能要件（米国特許法第１１２条、第１段落）又はＥＰＯ（欧州特許条約（ＥＰＣ）８３条）を満たさない任意の製品、プロセス、又はその製品の作製方法又はその製品の使用方法を本発明の範囲内に包含することを意図しないことがさらに留意され、したがって、本出願人は、その権利を留保し、任意の既に記載された製品、その製品の作製方法、又はその製品の使用方法の放棄を本明細書に開示する。本発明の実施において、５３条（ｃ）ＥＰＣ及び規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣに準拠していることが有利であり得る。本出願の系統又は任意の他の系統又は任意の第三者の任意の先行出願における出願人の任意の登録特許の主題である任意の実施形態を明確に放棄する全ての権利が、明確に留保される。本明細書に記載されるいずれも、保証として解釈されるべきではない。

【0026】

本開示、特に、特許請求の範囲及び／又は段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語が、米国特許法による意味を有し得；例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得ること；及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」などの用語が、米国特許法による意味を有し、例えば、それらは、明示されていない要素を許容するが、先行技術において見出されるか又は本発明の基本的又は新規な特徴に影響を与える要素を除外することが留意される。

【0027】

例として示されるが、本発明を記載される特定の実施形態のみに限定することは意図されていない、以下の詳細な説明が、添付の図面と併せて最もよく理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1A】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ６Ｒに対するマウス抗体１Ｆ７及び１Ｄ４の結合能力を示す。

【図1B】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ６Ｒに対するマウス抗体１Ｆ７及び１Ａ３、１Ｂ５及び１Ｇ８の結合能力を示す。

【図1C】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ６Ｒに対するマウス抗体１Ｆ７及び３Ｃ２及び１Ｇ１の結合能力を示す。

【図1D】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ６Ｒに対するマウス抗体１Ｆ７及び１Ｈ９及び１Ｈ７の結合能力を示す。

【図2A】間接ＥＬＩＳＡにおける、マカクＩＬ６Ｒに対するマウス抗体１Ｈ７、１Ｆ７、１Ｂ５及び３Ｃ２の結合能力を示す。

【図2B】間接ＥＬＩＳＡにおける、マカクＩＬ６Ｒに対するマウス抗体１Ａ３、１Ｄ４及び１Ｇ８の結合能力を示す。

【図2C】間接ＥＬＩＳＡにおける、マカクＩＬ６Ｒに対するマウス抗体１Ｈ９及び１Ｇ１の結合能力を示す。

【図3A】細胞ベースの結合ＦＡＣＳアッセイにおける、ヒトＩＬ６Ｒを発現するＵ２６６細胞に対するマウス抗体１Ｆ７及び１Ｄ４の結合能力を示す。

【図3B】細胞ベースの結合ＦＡＣＳアッセイにおける、ヒトＩＬ６Ｒを発現するＵ２６６細胞に対するマウス抗体１Ａ３、１Ｇ８及び１Ｂ５の結合能力を示す。

【図3C】細胞ベースの結合ＦＡＣＳアッセイにおける、ヒトＩＬ６Ｒを発現するＵ２６６細胞に対するマウス抗体３Ｃ２及び１Ｇ１の結合能力を示す。

【図3D】細胞ベースの結合ＦＡＣＳアッセイにおける、ヒトＩＬ６Ｒを発現するＵ２６６細胞に対するマウス抗体１Ｈ９及び１Ｈ７の結合能力を示す。

【図4A】リガンドブロッキングＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ６Ｒ－ＩＬ６結合に対するマウス抗体１Ｆ７及び１Ｄ４のブロッキング能力を示す。

【図4B】リガンドブロッキングＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ６Ｒ－ＩＬ６結合に対するマウス抗体１Ａ３、１Ｇ８及び１Ｂ５のブロッキング能力を示す。

【図4C】リガンドブロッキングＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ６Ｒ－ＩＬ６結合に対するマウス抗体３Ｃ２及び１Ｇ１のブロッキング能力を示す。

【図4D】リガンドブロッキングＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ６Ｒ－ＩＬ６結合に対するマウス抗体１Ｈ９及び１Ｈ７のブロッキング能力を示す。

【図5A】ベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡにおける、ベンチマーク－ヒトＩＬ６Ｒ結合をブロックする、マウス抗体１Ｆ７及び１Ｄ４の能力を示す。

【図5B】ベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡにおける、ベンチマーク－ヒトＩＬ６Ｒ結合をブロックする、マウス抗体１Ａ３、１Ｇ８及び１Ｂ５の能力を示す。

【図5C】ベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡにおける、ベンチマーク－ヒトＩＬ６Ｒ結合をブロックする、マウス抗体３Ｃ２及び１Ｇ１の能力を示す。

【図5D】ベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡにおける、ベンチマーク－ヒトＩＬ６Ｒ結合をブロックする、マウス抗体１Ｈ９及び１Ｈ７の能力を示す。

【図6A】細胞ベースの機能アッセイにおける、ＴＦ－１細胞のＩＬ６媒介性増殖に対するマウス抗体１Ｆ７及び１Ｇ１の阻害効果を示す。

【図6B】細胞ベースの機能アッセイにおける、ＴＦ－１細胞のＩＬ６媒介性増殖に対するマウス抗体１Ｄ４及び１Ｈ９の阻害効果を示す。

【図6C】細胞ベースの機能アッセイにおける、ＴＦ－１細胞のＩＬ６媒介性増殖に対するマウス抗体１Ａ３及び１Ｂ５の阻害効果を示す。

【図6D】細胞ベースの機能アッセイにおける、ＴＦ－１細胞のＩＬ６媒介性増殖に対するマウス抗体１Ｇ８及び１Ｈ７の阻害効果を示す。

【図6E】細胞ベースの機能アッセイにおける、ＴＦ－１細胞のＩＬ６媒介性増殖に対するマウス抗体３Ｃ２の阻害効果を示す。

【図7A】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ６Ｒに対するキメラ抗体１Ｂ５及び１Ｈ７の結合能力を示す。

【図7B】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ６Ｒに対するキメラ抗体１Ｈ９（Ｂ）の結合能力を示す。

【図8A】リガンドブロッキングＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ６Ｒ－ＩＬ６結合に対するキメラ抗体１Ｂ５及び１Ｈ７のブロッキング能力を示す。

【図8B】リガンドブロッキングＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ６Ｒ－ＩＬ６結合に対するキメラ抗体１Ｈ９（Ｂ）のブロッキング能力を示す。

【図9A】ベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡにおける、ベンチマーク－ヒトＩＬ６Ｒ結合をブロックするキメラ抗体１Ｂ５及び１Ｈ７の能力を示す。

【図9B】ベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡにおける、ベンチマーク－ヒトＩＬ６Ｒ結合をブロックするキメラ抗体１Ｈ９の能力を示す。

【図10】ＨＥＫ２９３Ｔ－ＳＩＥ－Ｂ４レポーターアッセイにおける、ＩＬ６媒介性ルシフェラーゼ活性の阻害に対するキメラ抗体１Ｈ７、１Ｂ５、及び１Ｈ９の活性を示す。

【図11】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ６Ｒに対するヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５の結合能力を示す。

【図12】間接ＥＬＩＳＡにおける、マカクＩＬ６Ｒに対するヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５の結合能力を示す。

【図13】細胞ベースの結合ＦＡＣＳアッセイにおける、ヒトＩＬ６Ｒを発現するＵ２６６細胞に対するヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５の結合能力を示す。

【図14】リガンドブロッキングＥＬＩＳＡにおける、ヒトＩＬ６Ｒ－ＩＬ６結合に対するヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５のブロッキング能力を示す。

【図15】ベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡにおける、ベンチマーク－ヒトＩＬ６Ｒ結合をブロックするヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５の能力を示す。

【図16】ＨＥＫ２９３Ｔ－ＳＩＥ－Ｂ４レポーターアッセイにおける、ＩＬ６媒介性ルシフェラーゼ活性の阻害に対するヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５の活性を示す。

【図17】抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５のタンパク質サーマルシフトアッセイ結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本開示がより容易に理解され得ることを確実にするために、特定の用語がまず定義される。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載される。

【0030】

「ＩＬ６Ｒ」という用語は、表面抗原分類１２６（ＣＤ１２６）としても知られるインターロイキン６受容体を指す。「ＩＬ６Ｒ」という用語は、変異体、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ及びパラログを含み得る。例えば、ヒトＩＬ６Ｒタンパク質に特異的な抗体は、ある場合において、サルなどの、ヒト以外の種に由来するＩＬ６Ｒタンパク質と交差反応し得る。他の実施形態において、ヒトＩＬ６Ｒタンパク質に特異的な抗体は、ヒトＩＬ６Ｒタンパク質に完全に特異的であり得、他の種に対する又は他のタイプの交差反応性を示さないことがあり、又は全ての他の種ではなく特定の他の種に由来するＩＬ６Ｒと交差反応し得る。

【0031】

「ヒトＩＬ６Ｒ」という用語は、ＮＰ＿０００５５６．１のＧｅｎｂａｎｋ受託番号を有するヒトＩＬ６Ｒのアミノ酸配列などの、ヒトに由来するアミノ酸配列を有するＩＬ６Ｒタンパク質を指す。「マカクＩＬ６Ｒ」という用語は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０３６１９８．２を有するアミノ酸配列などの、アカゲザル（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ）に由来するアミノ酸配列を有するＩＬ６Ｒタンパク質を指す。

【0032】

本明細書において言及される「抗体」という用語は、全抗体及びその任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）又は一本鎖を含む。全抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結される２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含み得る糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｈと略記される）及び重鎖定常領域から構成され得る。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３から構成され得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｌと略記される）及び軽鎖定常領域から構成され得る。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃ_Ｌから構成され得る。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分類され得る。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

【0033】

本明細書において使用される際の、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ＩＬ６Ｒタンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能が、完全長抗体のフラグメントによって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ及びＣ_Ｈ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）_２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含み得る二価フラグメント；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ及びＣ_Ｈ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶ_Ｌ及びＶ_ＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄｅｔａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４－５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；並びに（ｖｉｉｉ）ナノボディ、単一可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、それらをＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄｅｔａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎｅｔａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）として作製可能にする合成リンカーによる、組換え方法を用いて結合され得る。このような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、これらのフラグメントは、インタクトな抗体と同じように有用性についてスクリーニングされる。

【0034】

本明細書において使用される際の「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＩＬ６Ｒタンパク質に特異的に結合する単離抗体は、ＩＬ６Ｒタンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＩＬ６Ｒタンパク質に特異的に結合する単離抗体は、他の種に由来するＩＬ６Ｒタンパク質などの他の抗原に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。

【0035】

本明細書において使用される際の「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。

【0036】

本明細書において使用される際の「マウス抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がマウス生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、マウス生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のマウス抗体は、マウス生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダム若しくは部位特異的変異誘発又はインビボで体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される際の「マウス抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がマウスフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことは意図されていない。

【0037】

「キメラ抗体」という用語は、非ヒト源に由来する遺伝物質を、ヒトに由来する遺伝物質と組み合わせることによって作製される抗体を指す。又はより一般に、キメラ抗体は、特定の種に由来する遺伝物質を、別の種に由来する遺伝物質とともに有する抗体である。

【0038】

本明細書において使用される際の「ヒト化抗体」という用語は、タンパク質配列が、ヒトにおいて天然に産生される抗体形態との類似性を増大するように修飾された、非ヒト種に由来する抗体を指す。

【0039】

「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。

【0040】

「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義的に使用される。

【0041】

本明細書において使用される際、「ヒトＩＬ６Ｒに特異的に結合する」抗体は、ヒトＩＬ６Ｒタンパク質（場合により、１つ以上の非ヒトに由来するＩＬ６Ｒタンパク質）に結合するが、非ＩＬ６Ｒタンパク質に実質的に結合しない抗体を指すことが意図される。好ましくは、抗体は、「高い親和性」、すなわち、５．０×１０^－８Ｍ以下、より好ましくは、１．０×１０^－８Ｍ以下、より好ましくは、７．０×１０^－９Ｍ以下のＫ_ＤでヒトＩＬ６Ｒタンパク質に結合する。

【0042】

本明細書において使用される際の、タンパク質又は細胞に「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質又は細胞に結合しないか又は高い親和性で結合しない、すなわち、１．０×１０^－６Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０^－５Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０^－４Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０^－３Ｍ以上、さらにより好ましくは、１．０×１０^－２Ｍ以上のＫ_Ｄでタンパク質又は細胞に結合することを意味する。

【0043】

ＩｇＧ抗体に対する「高い親和性」という用語は、標的抗原に対して１．０×１０^－６Ｍ以下、より好ましくは、５．０×１０^－８Ｍ以下、さらにより好ましくは、１．０×１０^－８Ｍ以下、さらにより好ましくは、３．０×１０^－９Ｍ以下、さらにより好ましくは、１．０×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄを有する抗体を指す。しかしながら、「高い親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高い親和性」結合は、１０^－６Ｍ以下、より好ましくは、１０^－７Ｍ以下、さらにより好ましくは、１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄを有する抗体を指す。

【0044】

本明細書において使用される際の「Ｋ_{ａｓｓｏｃ}」又は「Ｋ_ａ」という用語が、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度を指すことが意図される一方、本明細書において使用される際の「Ｋ_ｄｉｓ」又は「Ｋ_ｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことが意図される。本明細書において使用される際の「Ｋ_Ｄ」という用語は、解離定数を指すことが意図され、これは、Ｋ_ｄ対Ｋ_ａの比率（すなわち、Ｋ_ｄ／Ｋ_ａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体についてのＫ_Ｄ値は、当該技術分野において十分に確立された方法を用いて決定され得る。抗体のＫ_Ｄを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いる、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることによる。

【0045】

最大半量の有効濃度としても知られている「ＥＣ_５０」という用語は、特定の曝露時間の後の、ベースラインと最大値との間の中間の応答を誘導する抗体の濃度を指す。

【0046】

半数阻害濃度としても知られている「ＩＣ_５０」という用語は、抗体の非存在と比べて５０％だけ特定の生物学的又は生化学的機能を阻害する抗体の濃度を指す。

【0047】

「対象」という用語は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、及びは虫類などの、哺乳動物及び非哺乳動物を含むが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ及びウマなどの哺乳動物が好ましい。

【0048】

「治療有効量」という用語は、疾患若しくは病態（癌など）に関連する症状を予防若しくは改善し、及び／又は疾患若しくは病態の重症度を低下させるのに十分な、本開示の抗体の量を意味する。治療有効量は、治療される病態に関して理解され、実際の有効量は、当業者によって容易に理解される。

【0049】

本開示の様々な態様が、以下のサブセクションにさらに詳細に記載される。

【0050】

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、トシリズマブなどの既に記載された抗ＩＬ６Ｒ抗体と比較して、より良好でないとしても同等の、結合親和性／能力でヒトＩＬ６Ｒに特異的に結合する。

【0051】

本開示の抗体又はその抗原結合部分は、トシリズマブなどの既に記載された抗ＩＬ６Ｒ抗体と比較して、同等の又はより高い活性で、ＩＬ６Ｒに対するＩＬ６の結合、ひいてはＩＬ６－ＩＬ６Ｒ－ｇｐ１３０複合体の生成をブロックする。

【0052】

本開示の抗体は、マウス、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体である。

【0053】

本開示の抗体は、後述されるように、また以下の実施例において、構造的に及び化学的に特徴付けられるモノクローナル抗体である。抗体の重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列番号は、以下の表１に要約され、いくつかの抗体は、同じＶ_Ｈ又はＶ_Ｌを共有する。抗体の重鎖定常領域は、例えば、配列番号４１に記載されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であり得、抗体の軽鎖定常領域は、例えば、配列番号４２に記載されるアミノ酸配列を有するヒトκ定常領域であり得る。本開示の抗体はまた、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域及びヒトκ軽鎖定常領域を含有し得る。

【0054】

【表1】

【0055】

【表2】

【0056】

表１中の重鎖可変領域ＣＤＲ及び軽鎖可変領域ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって定義されている。しかしながら、当該技術分野において周知であるように、ＣＤＲ領域はまた、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づいて、Ｃｈｏｔｈｉａ、及びＩＭＧＴ、ＡｂＭ、又はＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステム／方法などの他のシステムによって決定され得る。

【0057】

本開示の詳細な重鎖又は軽鎖ＣＤＲ配列は、ＣＤＲ配列が他とかなり異なる１Ｈ９を除き、表２に記載される。７つの抗体が、正確に同じ軽鎖ＣＤＲ３、並びにかなり類似する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２を含有することが分かる。

【0058】

ヒトＩＬ６Ｒに結合する他の抗ＩＬ６Ｒ抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列（又はＣＤＲ配列）は、本開示の抗ＩＬ６Ｒ抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列（又はＣＤＲ配列）と「混合及び適合させる」ことができる。好ましくは、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ鎖（又はこのような鎖内のＣＤＲ）が、混合及び適合される場合、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ対合からのＶ_Ｈ配列が、構造的に類似のＶ_Ｈ配列で置き換えられる。同様に、好ましくは、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ対合からのＶ_Ｌ配列が、構造的に類似のＶ_Ｌ配列で置き換えられる。

【0059】

したがって、一実施形態において、本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、
（ａ）表１中で上に列挙されるアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域；及び
（ｂ）表１中で上に列挙されるアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域、又は別の抗ＩＬ６Ｒ抗体のＶ_Ｌを含み得、ここで、抗体は、ヒトＩＬ６Ｒに特異的に結合する。

【0060】

別の実施形態において、本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、
（ａ）表１中で上に列挙される重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域；及び
（ｂ）表１中で上に列挙される軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域又は別の抗ＩＬ６Ｒ抗体のＣＤＲを含み得、ここで、抗体は、ヒトＩＬ６Ｒに特異的に結合する。

【0061】

さらに別の実施形態において、抗体、又はその抗原結合部分は、ヒトＩＬ６Ｒに結合する他の抗体のＣＤＲ、例えば、重鎖可変領域からのＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ３と組み合わされた抗ＩＬ６Ｒ抗体の重鎖可変ＣＤＲ２領域、並びに／或いは異なる抗ＩＬ６Ｒ抗体の軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含む。

【0062】

さらに、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２ドメインから独立して、ＣＤＲ３ドメインは、単独で、同種抗原に対する抗体の結合特異性を決定することができること、及び複数の抗体が、予想通りに、共通のＣＤＲ３配列に基づいて、同じ結合特異性を有して生成され得ることが当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｌｉｍｋａｅｔａｌ．，ＢｒｉｔｉｓｈＪ．ｏｆＣａｎｃｅｒ８３（２）：２５２－２６０（２０００）；Ｂｅｉｂｏｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３－８４９（２０００）；Ｒａｄｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０－８９１５（１９９８）；Ｂａｒｂａｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１－２１６２（１９９４）；Ｂａｒｂａｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９－２５３３（１９９５）；Ｄｉｔｚｅｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９－７４９（１９９６）；Ｂｅｒｅｚｏｖｅｔａｌ．，ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ８：ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｖｉｅｗ８（２００１）；Ｉｇａｒａｓｈｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２－７（１９９５）；Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７２：８０７－１０（１９９８）；Ｌｅｖｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４－８（１９９３）；ＰｏｌｙｍｅｎｉｓａｎｄＳｔｏｌｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８－５３２９（１９９４）及びＸｕａｎｄＤａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：３７－４５（２０００）を参照されたい。また、米国特許第６，９５１，６４６号明細書；同第６，９１４，１２８号明細書；同第６，０９０，３８２号明細書；同第６，８１８，２１６号明細書；同第６，１５６，３１３号明細書；同第６，８２７，９２５号明細書；同第５，８３３，９４３号明細書；同第５，７６２，９０５号明細書及び同第５，７６０，１８５号明細書を参照されたい。これらの参照文献はそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される。

【0063】

したがって、別の実施形態において、本開示の抗体は、抗ＩＬ６Ｒ抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２、並びに抗ＩＬ６Ｒ抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３、又は別の抗ＩＬ６Ｒ抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含み得、ここで、抗体は、ヒトＩＬ６Ｒに特異的に結合することが可能である。これらの抗体は、好ましくは、（ａ）ＩＬ６Ｒとの結合について競合し；（ｂ）機能的特性を保持し；（ｃ）同じエピトープに結合し；及び／又は（ｄ）本開示の抗ＩＬ６Ｒ抗体と同様の結合親和性を有する。さらに別の実施形態において、抗体は、抗ＩＬ６Ｒ抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、又は別の抗ＩＬ６Ｒ抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２をさらに含み得、ここで、抗体は、ヒトＩＬ６Ｒに特異的に結合することが可能である。別の実施形態において、本開示の抗体は、抗ＩＬ６Ｒ抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１、又は別の抗ＩＬ６Ｒ抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１をさらに含み得、ここで、抗体は、ヒトＩＬ６Ｒに特異的に結合することが可能である。

【0064】

［保存的修飾］
別の実施形態において、本開示の抗体は、１つ以上の保存的修飾だけ、本開示の抗ＩＬ６Ｒ抗体のものと異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列を含み得る。特定の保存的配列修飾が、抗原結合を除去せずに作製され得ることが、当該技術分野において理解される。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌｅｔａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ３２：１１８０－８；ｄｅＷｉｌｄｔｅｔａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５－４１；Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖｅｔａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４－２６８７０；Ｈａｌｌｅｔａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５－１２；ＫｅｌｌｅｙａｎｄＯ'Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５；Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙｅｔａｌ．，（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１－６及びＢｅｅｒｓｅｔａｌ．，（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５－４３を参照されたい。

【0065】

したがって、一実施形態において、抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含み得る重鎖可変領域及び／又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み得、ここで：
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み得；及び／又は
（ｂ）重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み得；及び／又は
（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み得；及び／又は
（ｄ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び／又はＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列；及び／又はその保存的修飾を含み得；
（ｅ）抗体は、ヒトＩＬ６Ｒに特異的に結合する。

【0066】

本開示の抗体は、ヒトＩＬ６Ｒに対する高親和性結合、及びＩＬ６Ｒ－ＩＬ６結合に対するブロッキング活性などの、上述される以下の機能的特性の１つ以上を有する。

【0067】

様々な実施形態において、抗体は、例えば、マウス、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体であり得る。

【0068】

本明細書において使用される際、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に実質的に影響を与えないか又は変化させないアミノ酸修飾を指すことが意図される。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加及び欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などの、当該技術分野において公知の標準的な技術によって、本開示の抗体に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β－分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換され得、改変された抗体が、本明細書に記載される機能アッセイを用いて、保持された機能（すなわち、上記の機能）について試験され得る。

【0069】

本開示の抗体は、修飾された抗体を操作するように、出発材料として本開示の抗ＩＬ６Ｒ抗体のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ配列の１つ以上を有する抗体を用いて調製され得る。抗体は、１つ又は両方の可変領域（すなわち、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ）内、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域内及び／又は１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することによって操作され得る。それに加えて又はその代わりに、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を改変するために、定常領域内の残基を修飾することによって操作され得る。

【0070】

特定の実施形態において、ＣＤＲグラフト法は、抗体の可変領域を操作するのに使用され得る。抗体は、主に、６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外部の配列より個々の抗体間でより異なっている。ＣＤＲ配列が、ほとんどの抗体－抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列にグラフトされた特定の天然抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２７；Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２－５２５；Ｑｕｅｅｎｅｔａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．を参照されたい。Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９－１００３３；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書も参照されたい）。

【0071】

したがって、本開示の別の実施形態は、上述される、本開示の配列を含み得るＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含み得る重鎖可変領域、及び／又は上述される、本開示の配列を含み得るＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含み得る軽鎖可変領域を含み得る、単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分に関する。これらの抗体が、本開示のモノクローナル抗体のＶ_Ｈ及びＶ_ＬＣＤＲ配列を含む一方、それらは、異なるフレームワーク配列を含み得る。

【0072】

このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベース又は刊行されている参照文献から得られる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列の配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで、インターネットで利用可能）、並びにＫａｂａｔｅｔａｌ．，（１９９１）（上記に引用される）；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８；及びＣｏｘｅｔａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６（これらのそれぞれの内容が、参照により本明細書に明示的に援用される）において見出され得る。別の例として、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおいて見出され得る。例えば、ＨＣｏ７ＨｕＭＡｂマウスにおいて見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋ受託番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７及びＢＣ０７０３３３）、３－３３（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）並びに３－７（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）において利用可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ＨｕＭＡｂマウスにおいて見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋ受託番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７及びＢＣ０７０３３３）、５－５１（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）、４－３４（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）、３－３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）並びに３－２３（ＡＪ４０６６７８）において利用可能である。

【0073】

抗体タンパク質配列は、当業者に周知の、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，（１９９７）、上記を参照）と呼ばれる配列類似性検索法の１つを用いて、コンパイルされたタンパク質配列データベースに対して比較される。

【0074】

本開示の抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、本開示の抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似のものである。Ｖ_ＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子において見出されるものと同一の配列を有するフレームワーク領域にグラフトされ得、又はＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域にグラフトされ得る。例えば、ある場合において、抗体の抗原結合能力を維持又は強化するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが分かっている（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。

【0075】

別のタイプの可変領域修飾は、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_ＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させることであり、それによって、対象とする抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善する。部位特異的変異誘発又はＰＣＲ媒介変異誘発は、変異を導入するために行われ得、抗体結合に対する効果、又は対象とする他の機能的特性が、当該技術分野において公知のインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価され得る。好ましくは、保存的修飾（当該技術分野において公知であるように）が導入される。変異は、アミノ酸置換、付加又は欠失であり得るが、好ましくは、置換である。さらに、典型的に、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４又は５つ以下の残基が改変される。

【0076】

したがって、別の実施形態において、本開示は、（ａ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含み得るＶ_ＨＣＤＲ１領域；（ｂ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含み得るＶ_ＨＣＤＲ２領域；（ｃ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含み得るＶ_ＨＣＤＲ３領域；（ｄ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含み得るＶ_ＬＣＤＲ１領域；（ｅ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含み得るＶ_ＬＣＤＲ２領域；及び（ｆ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含み得るＶ_ＬＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含み得る、単離された抗ＩＬ６Ｒモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。

【0077】

本開示の操作された抗体は、修飾が、例えば、抗体の特性を改善するために、Ｖ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌ内のフレームワーク残基に行われたものを含む。典型的に、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、一手法は、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列へと「復帰変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」させることである。より詳細には、体細胞変異を起こした抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することによって同定され得る。

【0078】

別のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の潜在的な免疫原性を低下させるために、フレームワーク領域内、或いは１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を変異させることを含む。この手法は、「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書にさらに詳細に記載されている。

【0079】

フレームワーク若しくはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えて、又はその代わりに、本開示の抗体は、典型的に、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存的細胞毒性などの、抗体の１つ以上の機能的特性を改変するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作され得る。さらに、本開示の抗体は、同様に抗体の１つ以上の機能的特性を改変するために化学修飾され得るか（例えば、１つ以上の化学部分が、抗体に結合され得る）又はそのグリコシル化を改変するために修飾され得る。

【0080】

一実施形態において、Ｃ_Ｈ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変化される、例えば、増加又は減少されるように修飾される。この手法は、米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。Ｃ_Ｈ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖の組み立てを容易にするために、又は抗体の安定性を増大若しくは低下させるために変化される。

【0081】

別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生体半減期を減少させるように変異される。より詳細には、１つ以上のアミノ酸変異は、抗体が、天然Ｆｃ－ヒンジ領域ＳｐＡ結合と比べて損なわれたブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有するように、Ｆｃ－ヒンジフラグメントのＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメイン境界領域に導入される。この手法は、米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳細に記載されている。

【0082】

さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化は、修飾される。例えば、非グリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増大するために改変され得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を改変することによって達成され得る。例えば、１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位をなくし、それによって、その部位におけるグリコシル化をなくすように行われ得る。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大し得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び同第６，３５０，８６１号明細書を参照されたい。

【0083】

それに加えて又はその代わりに、改変されたタイプのグリコシル化を有する抗体、例えば、減少した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体又は増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体が作製され得る。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大又は減少することが実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現することによって達成され得る。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当該技術分野において記載されており、本開示の組換え抗体を発現する宿主細胞として使用され、それによって、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生することができる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（α（１，６）－フコシルトランスフェラーゼ）を欠いており、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９細胞株において発現される抗体が、それらの炭水化物においてフコースを欠くようになっている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９ＦＵＴ８－／－細胞株を、２つの置換ベクターを用いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的化破壊によって生成した（米国特許出願公開第２００４０１１０７０４号明細書及びＹａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉｅｔａｌ．，（２００４）ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ８７：６１４－２２を参照されたい）。別の例として、欧州特許第１，１７６，１９５号明細書には、このような細胞株において発現される抗体が、α－１，６結合関連酵素を減少させるか又は除去することによって低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株が記載されている。また、欧州特許第１，１７６，１９５号明細書には、抗体のＦｃ領域に結合するか又は酵素活性を有さない、フコースのＮ－アセチルグルコサミンへの付加に対して低い酵素活性を有する細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣＣＲＬ１６６２）が記載されている。ＰＣＴ公報国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットには、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に結合する能力を低下させ、その宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化ももたらす変異ＣＨＯ細胞株であるＬｅｃ１３細胞が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓｅｔａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照）。修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体はまた、ＰＣＴ公報国際公開第０６／０８９２３１号パンフレットに記載されるように、ニワトリ卵において産生され得る。或いは、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、アオウキクサ属（Ｌｅｍｎａ）などの植物細胞において産生され得る。植物系における抗体の産生のための方法は、２００６年８月１１日に出願されたＡｌｓｔｏｎ＆ＢｉｒｄＬＬＰ代理人整理番号０４０９８９／３１４９１１号に対応する米国特許出願に開示されている。抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切断され得；例えば、フコシダーゼα－Ｌ－フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏｅｔａｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６－２３）。

【0084】

本開示によって想定される本明細書の抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生体（例えば、血清）半減期を増加させるために、ペグ化され得る。抗体をペグ化するために、抗体、又はそのフラグメントは、典型的に、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体フラグメントに結合される条件下で、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応される。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応によって行われる。本明細書において使用される際、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ_１～Ｃ_１０）アルコキシ－又はアリールオキシ－ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール－マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの形態のいずれかを包含することが意図される。特定の実施形態において、ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当該技術分野において公知であり、本開示の抗体に適用され得る。例えば、欧州特許第１５４３１６号明細書及び欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照されたい。

【0085】

本開示の抗体は、その異なるクラスを検出及び／又は区別するために、それらの様々な物理的特性によって特徴付けられ得る。

【0086】

例えば、抗体は、軽鎖又は重鎖可変領域のいずれかにおける１つ以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗体の増加した免疫原性又は改変された抗原結合による抗体のｐＫの改変をもたらし得る（Ｍａｒｓｈａｌｌｅｔａｌ（１９７２）ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ４１：６７３－７０２；ＧａｌａａｎｄＭｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７２：５４８９－９４；Ｗａｌｌｉｃｋｅｔａｌ（１９８８）ＪＥｘｐＭｅｄ１６８：１０９９－１０９；Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１２：４３Ｒ－５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈｅｔａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１６：４５２－７；Ｍｉｍｕｒａｅｔａｌ．，（２０００）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ３７：６９７－７０６）。グリコシル化は、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフにおいて起こることが知られている。ある場合には、可変領域グリコシル化を含まない抗ＩＬ６Ｒ抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択することによって、又はグリコシル化領域内の残基を変異させることによって、達成され得る。

【0087】

好ましい実施形態において、抗体は、アスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ－Ｇ又はＤ－Ｇ配列において起こり得、結合をポリペプチド鎖に導入し、その安定性を低下させる（イソアスパラギン酸効果）イソアスパラギン酸残基の生成をもたらし得る。

【0088】

各抗体は、一般に６～９．５のｐＨ範囲内の特有の等電点（ｐＩ）を有する。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、典型的に、７～９．５のｐＨ範囲内であり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、典型的に、６～８のｐＨ範囲内である。正常範囲外のｐＩを有する抗体が、インビボ条件下でいくらかのアンフォールディング及び不安定性を有し得ると推測されている。したがって、正常範囲内のｐＩ値を有する抗ＩＬ６Ｒ抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲内のｐＩを有する抗体を選択することによって、又は荷電表面残基を変異させることによって達成され得る。

【0089】

別の態様において、本開示は、本開示の抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域、又はＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。核酸は、全細胞で、細胞溶解物で、又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、標準的な技術によって、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から精製されたとき、「単離された」又は「実質的に純粋にされた」。本開示の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでいても又は含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。

【0090】

本開示の核酸は、標準的な分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体について、ハイブリドーマによって作られる抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって得られる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）得られる抗体について、このような抗体をコードする核酸が、遺伝子ライブラリーから回収され得る。

【0091】

本開示の好ましい核酸分子は、ＩＬ６Ｒモノクローナル抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列又はＣＤＲをコードするものを含む。Ｖ_Ｈ及びＶ_ＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作され得る。これらの操作において、Ｖ_Ｌ－又はＶ_ＨをコードするＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域又はフレキシブルリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメントに作動可能に連結される。この文脈において使用される際の「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に留まるように、２つのＤＮＡフラグメントが結合されることを意味することが意図される。

【0092】

Ｖ_Ｈ領域をコードする単離されたＤＮＡは、Ｖ_ＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知であり、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得られる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子について、Ｖ_ＨをコードするＤＮＡは、重鎖Ｃ_Ｈ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。

【0093】

Ｖ_Ｌ領域をコードする単離されたＤＮＡは、Ｖ_ＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、Ｃ_Ｌをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知であり、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得られる。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域であり得る。

【0094】

ｓｃＦｖ遺伝子を生成するために、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列が、フレキシブルリンカーによって結合されたＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域を有する連続一本鎖タンパク質として発現され得るように、Ｖ_Ｈ－及びＶ_ＬをコードするＤＮＡフラグメントは、フレキシブルリンカーをコードする別のフラグメントに作動可能に連結される（例えば、Ｂｉｒｄｅｔａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６；Ｈｕｓｔｏｎｅｔａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙｅｔａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２－５５４を参照されたい）。

【0095】

本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技術を用いて産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための他の実施形態は、Ｂリンパ球のウイルス又は発癌性形質転換及びファージディスプレイ技術を含む。キメラ又はヒト化抗体も、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書（これらの内容は、全体が参照により本明細書に具体的に援用される）を参照されたい。

【0096】

本開示の抗体はまた、例えば、当該技術分野において周知であるような、組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション方法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマ中で産生され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２）。一実施形態において、標準的な分子生物学技術によって得られる部分的又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結されるように、１つ以上の発現ベクターに挿入される。これに関して、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように、抗体遺伝子が、ベクターにライゲートされることを意味することが意図される。

【0097】

「調節配列」という用語は、抗体遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指向するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルスに由来するプロモーター及び／又はエンハンサー、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）及びポリオーマウイルスエンハンサーを含む。或いは、ユビキチンプロモーター又はβ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列が使用され得る。さらにまた、調節要素は、ＳＶ４０初期プロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列からの配列を含む、ＳＲαプロモーター系などの異なる源に由来する配列から構成される（Ｔａｋｅｂｅｅｔａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６－４７２）。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。

【0098】

抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、同じ又は別個の発現ベクターに挿入され得る。好ましい実施形態において、可変領域は、Ｖ_Ｈセグメントが、ベクター内のＣ_Ｈセグメントに作動可能に連結され、Ｖ_Ｌセグメントが、ベクター内のＣ_Ｌセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに可変領域を挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を生成するために使用される。それに加えて又はその代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）であり得る。

【0099】

抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子を有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書；同第４，６３４，６６５号明細書及び同第５，１７９，０１７号明細書を参照されたい）。例えば、典型的に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞において、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ－宿主細胞における使用のため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。

【0100】

軽鎖及び重鎖の発現のため、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態が、外来性ＤＮＡを原核生物又は真核生物宿主細胞に導入するために一般的に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。原核生物又は真核生物宿主細胞のいずれにおいても本開示の抗体を発現させることが理論上可能であるが、真核細胞、特に哺乳動物細胞が、原核細胞より、適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が高いため、このような真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。

【0101】

本開示の組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎａｎｄＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１に記載されているような、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される、ＵｒｌａｕｂａｎｄＣｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６－４２２０に記載されている、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞との使用について、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号パンフレット、国際公開第８９／０１０３６号パンフレット及び欧州特許第３３８，８４１号明細書に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞に導入されるとき、抗体は、宿主細胞における抗体の発現又は、より好ましくは、宿主細胞が増殖される培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたって、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、培養培地から回収され得る。

【0102】

別の態様において、本開示は、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、少なくとも１つの他の機能分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体又はリガンド）に連結された本開示の１つ以上の抗体を含み得る二重特異性分子を特徴とする。したがって、本明細書において使用される際、「二重特異性分子」は、３つ以上の特異性を有する分子を含む。

【0103】

一実施形態において、二重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性及び抗ＩＬ６Ｒ結合特異性に加えて、第３の特異性を有する。第３の特異性は、抗促進因子（ａｎｔｉ－ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｆａｃｔｏｒ）（ＥＦ）、例えば、細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、それによって標的細胞に対する免疫応答を増加させる分子に関するものであり得る。例えば、抗促進因子は、細胞毒性Ｔ細胞（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、若しくはＩＣＡＭ－１を介して）又は他の免疫細胞に結合して、標的細胞に対する増加した免疫応答をもたらし得る。

【0104】

二重特異性分子は、多くの異なるフォーマット及びサイズであり得る。サイズスペクトルの一方の側では、二重特異性分子は、同一の特異性の２つの結合アームを有する代わりに、それぞれ異なる特異性を有する２つの結合アームを有することを除いて、従来の抗体フォーマットを保持している。他方の側では、ペプチド鎖によって連結される２つの一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ'ｓ）、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）_２構築物からなる二重特異性分子である。中間サイズの二重特異性分子は、ペプチジルリンカーによって連結される２つの異なるＦ（ａｂ）フラグメントを含む。これらの及び他のフォーマットの二重特異性分子は、遺伝子組換え、体細胞ハイブリダイゼーション、又は化学的方法によって調製され得る。例えば、Ｋｕｆｅｒｅｔａｌ（上記に引用される）；ＣａｏａｎｄＳｕｒｅｓｈ，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（６），６３５－６４４（１９９８）；及びｖａｎＳｐｒｉｅｌｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ，２１（８），３９１－３９７（２０００）、並びにそれらの中に引用される参照文献を参照されたい。

【0105】

さらに別の態様において、本発明は、診断方法、組成物及びキットを提供する。ある実施形態において、本発明の抗体は、細胞又は組織におけるＩＬ６Ｒαの存在及び発現を判定するため、使用される。ある実施形態において、診断は予後を示し、且つ／又は治療及び／若しくはフォローアップ治療を方向づける。例えば、ＩＬ６シグナル伝達は、自己免疫疾患及び／又はＩＬ６／ＩＬ６Ｒ関連腫瘍又は癌を含む、炎症性疾患の治療に対して標的化されている。ある実施形態において、本発明の抗体は、自己免疫疾患及び／又はＩＬ６／ＩＬ６Ｒ関連腫瘍又は癌の予後及び適切な治療及びフォローアップを決定するための診断キット又は方法において利用される。

【0106】

本開示の抗体は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などの免疫抱合体を形成するために、治療剤にコンジュゲートされ得る。好適な治療剤としては、抗炎症剤及び抗癌剤が挙げられる。ＡＤＣにおいて、抗体及び治療剤は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィド、又はヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｃｉｔ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、又はＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００号明細書；同第６，９８９，４５２号明細書；及び同第７，１２９，２６１号明細書；ＰＣＴ公報国際公開第０２／０９６９１０号パンフレット；国際公開第０７／０３８，６５８号パンフレット；国際公開第０７／０５１，０８１号パンフレット；国際公開第０７／０５９，４０４号パンフレット；国際公開第０８／０８３，３１２号パンフレット；及び国際公開第０８／１０３，６９３号パンフレット；米国特許出願公開第２００６００２４３１７号明細書；同第２００６０００４０８１号明細書；及び同第２００６０２４７２９５号明細書（これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される）に記載されているように調製され得る。

【0107】

腫瘍溶解性ウイルスは、優先的に、癌細胞を感染させ、死滅させる。本開示の抗体は、腫瘍溶解性ウイルスとともに使用され得る。或いは、本開示の抗体をコードする腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトの身体に導入され得る。

【0108】

抗ＩＬ６ＲｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も、本明細書において提供され、この抗ＩＬ６ＲｓｃＦｖは、本明細書に記載されるＣＤＲ及び重鎖／軽鎖可変領域を含み得る。

【0109】

抗ＩＬ６ＲＣＡＲは、（ａ）抗ＩＬ６ＲｓｃＦｖを含み得る細胞外抗原結合ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン；及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。

【0110】

ＣＡＲは、新生受容体を小胞体に指向する、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端におけるシグナルペプチド、及び受容体を結合のためにより多く利用できるようにする、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端におけるヒンジペプチドを含有し得る。ＣＡＲは、好ましくは、細胞内シグナル伝達ドメインにおいて、主要な細胞内シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。主に使用される、最も有効な主要な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭを含むＣＤ３－ζ細胞質ドメインであり、そのリン酸化が、Ｔ細胞活性化をもたらす。共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＯＸ４０などの共刺激タンパク質に由来し得る。

【0111】

ＣＡＲは、Ｔ細胞増殖、持続性、及び抗腫瘍活性を促進する因子、例えば、サイトカイン、及び共刺激リガンドをさらに追加し得る。

【0112】

本明細書において提供されるＣＡＲを含み得る操作された免疫エフェクター細胞も提供される。ある実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、又は胚性幹細胞である。ある実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。

【0113】

別の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体とともに製剤化される、本開示の１つ以上の抗体（（又はその抗原結合部分、又は二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体）を含み得る医薬組成物を提供する。抗体（又はその抗原結合部分、又は二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体）は、組成物が、２つ以上の抗体（又はその抗原結合部分、又は二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体）を含むとき、別々に投与され得る。組成物は、１つ以上のさらなる薬学的に有効な成分、例えば、別の抗体又は薬剤、例えば、抗腫瘍薬又は抗炎症剤を任意に含有し得る。

【0114】

医薬組成物は、あらゆる賦形剤を含み得る。使用され得る賦形剤は、担体、表面活性剤、増粘剤又は乳化剤、固体結合剤、分散若しくは懸濁補助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、防腐剤、等張剤、及びそれらの組合せを含む。好適な賦形剤の選択及び使用が、Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈＥｄ．（ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ２００３）（その開示内容は、参照により本明細書に援用される）に教示されている。

【0115】

好ましくは、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に好適である。投与経路に応じて、有効成分は、酸の作用及びそれを不活性にし得る他の天然条件からそれを保護するための材料でコーティングされ得る。本明細書において使用される際の「非経口投与」という語句は、経腸及び局所投与以外の、通常注射による投与方法を意味し、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外並びに胸骨内注射及び注入を含む。或いは、本開示の抗体は、経口（ｎｏｎ－ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路によって、例えば、局所、表皮又は粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下又は局所的に投与され得る。

【0116】

医薬組成物は、滅菌水溶液又は分散体の形態であり得る。それらはまた、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は他の高い薬物濃度に好適な規則的な構造で製剤化され得る。

【0117】

単一剤形を製造するために担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療される対象及び特定の投与方法に応じて変化し、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００％のうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、約０．０１％～約９９％の有効成分、好ましくは、約０．１％～約７０％、最も好ましくは、約１％～約３０％の有効成分の範囲である。

【0118】

投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するために調整される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、経時的に数回の分割投与で投与されてもよく、又は用量は、治療状況の緊急性により示されるとき比例的に減少若しくは増加され得る。投与の容易性及び投与量の均一性のため、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される際の投与単位形態は、治療される対象に対する単位投与量として適した物理的に分離した単位を指し；各単位は、必要な医薬担体とともに、所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の有効成分を含有する。或いは、抗体は、あまり頻繁でない投与が必要とされる場合、徐放性製剤として投与され得る。

【0119】

組成物の投与のため、投与量は、約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。

【0120】

本開示の抗ＩＬ６Ｒ抗体又はその抗原結合部分、又は二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体の「治療有効投与量」は、好ましくは、疾患の症状の重症度の低下、疾患の無症状期間の頻度及び持続時間の増加、又は疾患の苦痛に起因する障害若しくは身体障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍を有する対象の治療について、「治療有効投与量」は、好ましくは、非治療対象と比べて、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、さらにより好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％だけ腫瘍増殖を阻害する。治療有効量の治療用抗体は、腫瘍サイズを減少させるか、又は典型的にヒトであるか又は別の哺乳動物であり得る対象において症状を改善することができる。

【0121】

医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤であり得る。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が使用され得る。例えば、ＳｕｓｔａｉｎｅｄａｎｄＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９７８を参照されたい。

【0122】

特定の実施形態において、本開示のモノクローナル抗体は、インビボで適切な分布を確実にするため製剤化され得る。例えば、本開示の治療用抗体が、血液脳関門を通過することを確実にするために、それらは、リポソーム中で製剤化され得、これらは、特定の細胞又は器官への選択的輸送を促進するための標的分子をさらに含み得る。例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書；同第５，３７４，５４８号明細書；同第５，４１６，０１６号明細書；及び同第５，３９９，３３１号明細書；Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５；Ｕｍｅｚａｗａｅｔａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８；Ｂｌｏｅｍａｎｅｔａｌ．，（１９９５）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓｅｔａｌ．，（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０；Ｂｒｉｓｃｏｅｅｔａｌ．，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４；Ｓｃｈｒｅｉｅｒｅｔａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０；ＫｅｉｎａｎｅｎａｎｄＬａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３４６：１２３；及びＫｉｌｌｉｏｎａｎｄＦｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２７３を参照されたい。

【0123】

本開示の抗体又はその抗原結合部分、又は二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体を含み得る医薬組成物は、例えば、過剰なＩＬ６シグナル伝達を伴う炎症性疾患の治療を含む、多くのインビトロ及びインビボでの有用性を有する。

【0124】

ＩＬ６のＩＬ６Ｒとの結合をブロックする本開示の抗ＩＬ６Ｒ抗体の能力を所与として、本開示は、自己免疫疾患などのＩＬ６／ＩＬ６Ｒ関連炎症性疾患、及びキャッスルマン病を治療するための方法であって、本開示の医薬組成物を対象に投与することを含み得る、方法を提供する。炎症性疾患として、限定はされないが、関節リウマチ、全身型及び多関節型若年性特発性関節炎、巨細胞性動脈炎、高安動脈炎、キャッスルマン病、キメラ抗原受容体Ｔ細胞が複合されたサイトカイン放出症候群、サイトカイン放出症候群、シュニッツラー症候群、及び視神経脊髄炎が挙げられる。

【0125】

一態様において、本開示は、本開示の医薬組成物が、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ関連炎症性疾患を寛解する際に有効な１つ以上のさらなる薬剤と共投与される組合せ治療を提供する。このような薬剤は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＩＬ２Ｒ抗体、抗ＩＬ６抗体、及び抗ＩＬ１７抗体であり得る。特定の実施形態では、対象はヒトである。

【0126】

本明細書において説明される治療剤の組合せは、薬学的に許容される担体中の単一の組成物と同時に、又は薬学的に許容される担体中の各薬剤を含む別個の組成物として同時に投与され得る。別の実施形態において、治療剤の組合せは、連続して投与され得る。

【0127】

さらに、組合せ治療の２つ以上の用量が、連続して投与される場合、連続投与の順序は、投与の各時点で逆になり得るか又は同じ順序に保持され得、連続投与は、同時投与と組み合わされ得、又はそれらの任意の組合せである。

【0128】

本発明及びその利点が詳述されているが、様々な変化、置換及び変更が、添付の特許請求の範囲で定義されるような本発明の精神及び範囲から逸脱することなく本明細書でなされ得ることは理解されるべきである。

【0129】

本開示は、以下の実施例によってさらに例示され、これは、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用される全ての図及び全ての参照文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。
［実施例］

【実施例1】

【0130】

＜ハイブリドーマ技術を用いたマウス抗ＩＬ６Ｒモノクローナル抗体の生成＞
［免疫化］
マウスを、ＥＨａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８に記載されている方法にしたがって免疫化した。組換えヒトＩＬ６Ｒα－ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＩＬＲ－Ｈ４２２３）を、免疫原として使用し、社内調製ヒトＩＬ６Ｒ－Ｆｃタンパク質（配列番号４３に記載されるアミノ酸配列）を、抗血清力価を決定するため、及び抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマをスクリーニングするために使用した。免疫化投与量は、一次免疫のために５０μｇのヒトＩＬ６Ｒα－ｈｉｓ／マウス／注射、及び追加免疫のために２５μｇのヒトＩＬ６Ｒα－ｈｉｓ／マウス／注射を含んでいた。免疫応答を増加させるために、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）を、一次及び追加免疫のためにそれぞれ使用した。簡潔には、所望の量のアジュバントを、加圧滅菌された１．５ｍＬの微小遠心分離管に移した。抗原を、０．２５～１．０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するＰＢＳ又は生理食塩水中で調製した。次に、計算された量の抗原を、アジュバントとともに微小遠心分離管に加え、溶液を、２分間にわたって穏やかにボルテックスすることによって混合して、油中水型エマルジョンを生成した。次に、アジュバント－抗原混合物を、動物に注射するための適切なシリンジに吸い込ませた。合計で５０又は２５μｇの抗原を、１００～２００μｌの体積で注射した。各動物を免疫化し、次に、抗血清力価に応じて２～３回追加接種した。良好な力価を有する動物に、融合前に腹腔内注射によって最終追加接種を与えた。

【0131】

［ハイブリドーマ融合及びスクリーニング］
マウス骨髄腫細胞株（ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５８１）の細胞を培養して、融合直前に対数期段階に到達させた。免疫化マウスに由来する脾臓細胞を、ＥＨａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８に記載される方法にしたがって、滅菌的に調製し、骨髄腫細胞と融合させた。続いて、融合された「ハイブリッド細胞」を、ＤＭＥＭ／２０％ｖ／ｖのＦＣＳ／ＨＡＴ培地中の９６ウェル細胞プレート中に分配した。生存しているハイブリドーマコロニーが、融合の７～１０日後に顕微鏡で観察された。２週間後、各ウェルからの上清を、（配列番号４３として社内で調製された）ヒトＩＬ６Ｒ－Ｆｃタンパク質を用いて間接ＥＬＩＳＡ及び捕捉ＥＬＩＳＡに供した。次に、ヒトＩＬ６Ｒ－Ｆｃに結合された抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを選択し、２４ウェルプレートに移した。これらのハイブリドーマを、ＩＬ６Ｒ－ＩＬ６結合をブロックするための活性についてさらに試験した。ヒトＩＬ６Ｒに対する高特異性及び高いＩＬ６－ＩＬ６Ｒブロッキング活性を示した抗体を産生するハイブリドーマクローンを、細胞株のクローン性を確実にするため、限界希釈によってサブクローニングし、次に、モノクローナル抗体を精製した。簡潔に述べると、プロテインＡセファロースカラム（ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、Ｃａｔ＃ＡＡ０２７３）を、５～１０カラム体積中でＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。細胞上清を、カラムに通過させ、次に、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまで、カラムを、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。カラムを、溶出緩衝液（０．１Ｍのグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．７）で溶離し、直ちに中和緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を含む１．５ｍｌ管に収集した。免疫グロブリンを含有する画分を、プールし、４℃で一晩、ＰＢＳ中で透析した。続いて、精製されたモノクローナル抗体のインビトロ機能活性を、以下のように特性決定した。

【実施例2】

【0132】

＜ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴を用いたマウス抗ＩＬ６Ｒモノクローナル抗体の親和性決定＞
実施例１で生成された、精製抗ＩＬ６Ｒマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００システム（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって、結合親和性及び結合速度について特性決定した。

【0133】

簡潔に述べると、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃ＢＲ１００８３８、ＭｏｕｓｅＡｎｔｉｂｏｄｙＣａｐｔｕｒｅＫｉｔ）を、Ｂｉａｃｏｒｅによって提供される標準的なアミンカップリングキット（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて、第一級アミンを介して、ＣＭ５チップ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ＃ＢＲ１００５３０からのカルボキシメチルデキストラン被覆チップ）に共有結合し、プロテインＧチップ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃２９－１７９３－１５）を、ベンチマークの親和性決定のために使用した。バイオセンサー表面上の未反応部分を、エタノールアミンでブロックした。次に、本開示の精製抗ＩＬ６Ｒ抗体及び抗ＩＬ６Ｒベンチマーク（配列番号５５及び５６にそれぞれ記載される重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を用いて社内で調製される、本明細書中でベンチマーク又はアクテムラ（登録商標）とも呼ばれる、トシリズマブ）を、２μｇ／ｍｌの濃度で、それぞれ１０μＬ／分の流量でチップ上に流した。次に、連続希釈された組換えヒトＩＬ６Ｒ－ｈｉｓ（社内調製、配列番号４４に記載されるアミノ酸配列）又はマカクＩＬ６Ｒ－ｈｉｓタンパク質（社内調製、配列番号４５に記載されるアミノ酸配列）、１００ｎＭから出発してＨＢＳ－ＥＰ^＋緩衝液中の２倍連続希釈（Ｂｉａｃｏｒｅによって提供された）を、３０μＬ／分の流量でチップ上に流した。抗原－抗体結合速度を、２分間にわたって追跡し、解離速度を、１０分間にわたって追跡した。結合及び解離曲線を、ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。Ｋ_Ｄ、Ｋ_ａ及びＫ_ｄ値を決定し、以下の表３に要約した。

【0134】

本開示の全ての試験される抗ＩＬ６Ｒ抗体は、ヒトＩＬ６Ｒ及びマカクＩＬ６Ｒにトシリズマブより高い結合親和性で特異的に結合した。

【0135】

【表3】

【実施例3】

【0136】

＜マウス抗ＩＬ６Ｒモノクローナル抗体の結合活性＞
マウス抗ＩＬ６Ｒ抗体を、それらの結合活性について、捕捉ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって試験した。

【0137】

［３．１捕捉ＥＬＩＳＡ］
捕捉ＥＬＩＳＡの場合、９６ウェルマイクロプレートを、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧのＦ（ａｂ'）_２フラグメント特異的（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃１１５－００５－０７２）で被覆し、３７℃で２時間インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、次に、４℃で一晩にわたって、２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ中５％ｗ／ｖの無脂肪乳）でブロックした。プレートを４回洗浄し、１００μｌ／ウェルの本開示の連続希釈されたマウス抗ＩＬ６Ｒ抗体、ベンチマーク及び陰性対照ｈＩｇＧ（静脈注射用のヒト免疫グロブリン（ｐＨ４）、ＨｕａｌａｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＩｎｃ．）、１００００ｎｇ／ｍｌから出発してＰＢＳＴ中２．５％ｗ／ｖの無脂肪乳中の５倍希釈のそれぞれとともに、３７℃で４０分間にわたってインキュベートし、次に、再度４回洗浄した。捕捉抗ＩＬ６Ｒ抗体を含有するプレートを、ビオチン標識ヒトＩＬ６Ｒ－Ｆｃタンパク質（社内で調製、配列番号４３、ＰＢＳＴ中２．５％ｗ／ｖの無脂肪乳中３９．５ｎｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）とともに、３７℃で４０分間にわたってインキュベートし、４回洗浄し、ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ（ＰＢＳＴ中１：１００００希釈、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃０１６－０３０－０８４、１００μｌ／ウェル）とともに、３７℃で４０分間にわたってインキュベートした。最後の洗浄の後、プレートを、１００μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡ基質ＴＭＢ（ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ、Ｃａｔ＃ＴＭＢ－Ｓ－００２）とともにインキュベートした。反応を、５０μｌ／ウェルの１ＭのＨ_２ＳＯ_４で、室温で３～１０分間で停止させ、各ウェルの吸光度を、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで読み取った。次に、ＯＤ（４５０～６３０）値を、抗体濃度に対してプロットした。データを、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＥＣ_５０値を報告した。

【0138】

［３．２間接ＥＬＩＳＡ］
抗ＩＬ６Ｒ抗体を、マカクＩＬ６Ｒとのそれらの交差反応性について試験した。簡潔に述べると、９６ウェルマイクロプレートを、３７℃で２時間にわたって、炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９．６）中の１００μｌ／ウェルの２μｇ／ｍｌのマカクＩＬ６Ｒ－ｈｉｓタンパク質（社内で調製、配列番号４５に記載されるアミノ酸配列）で被覆した。ＥＬＩＳＡプレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、次に、３７℃で２時間にわたって、２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ中５％ｗ／ｖの無脂肪乳）でブロックした。プレートを４回洗浄し、１００μｌ／ウェルの、本開示の連続希釈された抗ＩＬ６Ｒ抗体又は対照（６６．６７ｎＭから出発して、２．５％ｗ／ｖの無脂肪乳でＰＢＳＴ中５倍連続希釈）とともにインキュベートし、３７℃で４０分間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを、再度４回洗浄し、３７℃で４０分間にわたって、１００μｌ／ウェルのペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧのＦｃγフラグメント特異的（ＰＢＳＴ緩衝液中１：５０００希釈、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃１１５－０３５－０７１）とともにインキュベートした。最後の洗浄の後、プレートを、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ（ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ）とともにインキュベートした。反応を、５０μｌ／ウェルの１ＭのＨ_２ＳＯ_４で、室温で３～１０分後に停止させ、各ウェルの吸光度を、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで読み取った。次に、ＯＤ（４５０～６３０）値を、抗体濃度に対してプロットした。データを、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＥＣ_５０値を報告した。

【0139】

［３．３細胞ベースの結合ＦＡＣＳ］
細胞表面上に発現されたＩＬ６Ｒに対するマウス抗ＩＬ６Ｒ抗体の結合活性を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって試験した。簡潔に述べると、ヒト骨髄腫細胞Ｕ２６６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１９６（商標））を、細胞培養フラスコから収集し、２回洗浄し、２％ｖ／ｖのウシ胎仔血清（ＦＡＣＳ緩衝液）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁させた。９６ウェルプレート中のウェル当たり２×１０^５個のＵ２６６細胞を、氷上で４０分間にわたって、様々な濃度で（ＦＡＣＳ緩衝液中、３倍連続希釈で４０ｎＭから出発する）、１００μｌの抗ＩＬ６Ｒ抗体又は対照とともにインキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＲ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ'）_２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＦＡＣＳ緩衝液中１：１０００希釈、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃１１５－１１６－１４６）を加えた。暗所で、４℃で４０分間にわたるインキュベーションの後、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させた。蛍光を、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ－ＨＴＳ機器を用いて測定した。データを、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＥＣ_５０値を報告した。

【0140】

結果を、図１Ａ～図１Ｄ、図２Ａ～図２Ｃ及び図３Ａ～図３Ｄに要約し、示した。

【0141】

図１Ａ～図１Ｄから、本開示の抗ＩＬ６Ｒ抗体が、トシリズマブと比較してより高いＢｍａｘ（最大結合）及びより低いＥＣ_５０で、ヒトＩＬ６Ｒに特異的に結合したことがわかり、より多くのＩＬ６Ｒにより効率的に結合したことが示唆される。

【0142】

図２Ａ～図２Ｃに示すように、抗体のマカクＩＬ６Ｒに対する結合活性の場合、トシリズマブと比較して、全てにおいて、Ｂｍａｘはより低く、ＥＣ_５０はより高かった。

【0143】

図３Ａ～図３Ｄによると、本開示の全ての抗体は、細胞表面のヒトＩＬ６Ｒにより効率的に結合したが、Ｂｍａｘは、トシリズマブと比較してより低かった。

【実施例4】

【0144】

＜ＩＬ６Ｒ－トシリズマブ又はＩＬ６Ｒ－ＩＬ６結合に対するマウス抗ＩＬ６Ｒ抗体のブロッキング活性＞
［４．１リガンドブロッキングＥＬＩＳＡ］
ＩＬ６－ＩＬ６Ｒ結合をブロックする本開示の抗ＩＬ６Ｒ抗体の能力を、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した。簡潔に述べると、ヒトＩＬ６タンパク質（ＳｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｃ．、Ｃａｔ＃１０３９５－ＨＮＡＥ）を、３７℃で２時間にわたって、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍＬ、９６ウェルマイクロプレート上、１００μｌ／ウェルで被覆した。ＥＬＩＳＡプレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、次に、４℃で一晩にわたって、２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ中５％ｗ／ｖの無脂肪乳）でブロックした。

【0145】

翌日、抗ＩＬ６Ｒ抗体又は対照を、ビオチン標識ヒトＩＬ６Ｒ－Ｆｃタンパク質（社内で調製、配列番号４３、ＰＢＳＴ中２．５％ｗ／ｖの無脂肪乳中３９．５ｎｇ／ｍｌ）、１００ｎＭから出発して４倍連続希釈で希釈し、室温で４０分間にわたってインキュベートした。プレートを４回洗浄後、抗体／ＩＬ６Ｒ－Ｆｃ混合物を、ヒトＩＬ６被覆プレートに、１００μｌ／ウェルで加え、３７℃で４０分間にわたってインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄し、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ（ＰＢＳＴ緩衝液中１：１００００希釈、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃０１６－０３０－０８４）を加え、３７℃で４０分間にわたってインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液を用いて再度洗浄した。最後に、ＴＭＢを加え、反応を、１ＭのＨ_２ＳＯ_４を用いて停止させた。吸光度を、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで読み取り、次に、ＯＤ（４５０～６３０）値を、抗体濃度に対してプロットした。データを、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＩＣ_５０値を報告した。

【0146】

［４．２ベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡ］
ヒトＩＬ６Ｒタンパク質へのベンチマーク（トシリズマブ）結合をブロックする本開示の抗ＩＬ６Ｒ抗体の能力を、競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。簡潔に述べると、ベンチマークを、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬで、９６ウェルマイクロプレート上で、１００μｌ／ウェルで被覆し、３７℃で２時間にわたってインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、次に、４℃で一晩にわたって、２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ中５％ｗ／ｖの無脂肪乳）でブロックした。

【0147】

翌日、本開示の抗ＩＬ６Ｒ抗体又は対照を、ビオチン標識ヒトＩＬ６Ｒ－Ｆｃタンパク質（配列番号４３、ＰＢＳＴ中２．５％ｗ／ｖの無脂肪乳中１３．６ｎｇ／ｍｌ）、１００ｎＭから出発して５倍連続希釈で希釈し、室温で４０分間にわたってインキュベートした。プレートを４回洗浄後、抗体／ＩＬ６Ｒ－Ｆｃ混合物を、ベンチマーク被覆プレートに、１００μｌ／ウェルで加えた。３７℃で４０分間にわたってインキュベーション後、プレートを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄した。次に、ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰを加え、プレートを、３７℃で４０分間にわたってインキュベートした。最後に、プレートを、洗浄緩衝液を用いて洗浄し、ＴＭＢを加えた。反応を、１ＭのＨ_２ＳＯ_４を用いて停止させ、吸光度を、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで読み取った。ＯＤ（４５０～６３０）値を、抗体濃度に対してプロットした。データを、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＩＣ_５０値を報告した。

【0148】

２つのアッセイの結果を、図４Ａ～図４Ｄ及び図５Ａ～図５Ｄに示した。

【0149】

本開示の全ての抗ＩＬ６Ｒ抗体が、トシリズマブと比較して、より低いＩＣ５０で、より効率的にヒトＩＬ６－ヒトＩＬ６Ｒ結合をブロックすることができたことが、図４Ａ～図４Ｄから分かる。

【0150】

図５Ａ～図５Ｄは、本開示の全ての抗ＩＬ６Ｒ抗体が、トシリズマブへのＩＬ６Ｒ結合をブロックすることができたことを示し、これは、これらの抗体が、トシリズマブが結合したのと同じ又は同様のエピトープに結合し得たことを示唆している。

【実施例5】

【0151】

＜マウス抗ＩＬ６Ｒ抗体の細胞ベースの機能アッセイ＞
本開示の全ての抗ＩＬ６Ｒ抗体を、ＩＬ６誘導性のＴＦ－１細胞増殖に対する阻害効果について、さらに試験した。

【0152】

簡潔に述べると、１０％ｖ／ｖのＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１００９９－１４１）を加えた１００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃Ａ１０４９１－０１）中の対数期段階の８×ｌ０^３個のＴＦ－１細胞（ヒト前骨髄性細胞株、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２００３）を、９６ウェルプレートに蒔いた。次に、プレートに、５０μｌの本開示の連続希釈された抗ＩＬ６Ｒ抗体又は対照（陰性対照としての社内調製抗ＣＤ２２抗体を含む）を加え（培地の５倍連続希釈で８００ｎＭから出発する）、３７℃で３０分間にわたってインキュベートした。次に、プレートに、５０μｌのヒトＩＬ６タンパク質（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ＃１０３９５－ＨＮＡＥ、培地中６．４ｎｇ／ｍＬ）を加え、次に、３７℃で４日間にわたって、５％ＣＯ_２のインキュベーターに入れた。プレートを遠心分離し、上清を廃棄した。次に、プレートに、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ７５７２、５０μｌ／ウェル）の試薬を加え、２５℃で１０分間にわたってインキュベートした。化学発光を、ＴｅｃａｎＩｎｆｉｎｉｔ（登録商標）２００Ｐｒｏ機器を用いて測定した。データを、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＩＣ_５０値を報告した。

【0153】

アッセイの結果を、図６Ａ～図６Ｅに示した。

【0154】

全ての抗ＩＬ６Ｒ抗体が、トシリズマブと比較して、同等の又はややより低い活性で、ＩＬ－６誘導性のＴＦ－１細胞増殖を阻害することができたことが分かる。

【実施例6】

【0155】

＜キメラ抗体の生成及び特性決定＞
抗ＩＬ６ＲマウスｍＡｂの重鎖及び軽鎖可変領域をシーケンシングし、配列番号を表１に要約した。

【0156】

抗ＩＬ６ＲマウスｍＡｂの１Ｂ５、１Ｈ９及び１Ｈ７の重鎖及び軽鎖可変領域をそれぞれ、ヒトＩｇＧ１重鎖（配列番号４１）及びヒトκ軽鎖定常領域（配列番号４２）にインフレームでクローニングし、ここで、可変領域のＣ末端が、それぞれの定常領域のＮ末端に連結された。

【0157】

ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に連結された重鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含むベクター、及びヒトκ軽鎖定常領域に連結された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含むベクターを、１ｍｇ／ｍＬのＰＥＩで、１．１：１の軽鎖対重鎖構築物の比率で、５０ｍｌの２９３Ｆ懸濁細胞培養物中で一過性にトランスフェクトした。

【0158】

細胞上清を、振とうフラスコ中で６日後に収集し、沈降させて、細胞をペレット化し、次に、キメラ抗体を、上記のように、細胞上清から精製した。精製抗体を、前述の実施例中のプロトコルにしたがって、捕捉ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ親和性試験及び細胞ベースのレポーターアッセイにおいて、下記の修飾及びプロトコルの存在下又は不在下で試験した。

【0159】

レポーターアッセイでは、ＳＩＥ（ｓｉｓ誘導性エレメント）駆動ルシフェラーゼレポーター遺伝子ｌｕｃ２Ｐ（フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓ））を有する社内調製細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ－ＳＩＥ－Ｂ４を使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ－ＳＩＥ－Ｂ４細胞は、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）３０００トランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の説明書にしたがって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐＧＬ４．４７［ｌｕｃ２Ｐ／ＳＩＥ／Ｈｙｇｒｏ］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｅ４０４Ａ）でトランスフェクトすることによって調製した。簡潔に述べると、１０％ｖ／ｖのＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１００９９－１４１）及び１０％ｗ／ｖのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１３６０－０７０）を加えた１００μｌのＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１０５６６－０１６）中の２×ｌ０^４個のＨＥＫ２９３Ｔ－ＳＩＥ－Ｂ４細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３９０３）の各ウェルに蒔いた。次に、プレートに、５０μｌの本開示の連続希釈されたキメラ抗ＩＬ６Ｒ抗体又は対照（陰性対照としての社内調製抗ＣＤ２２抗体を含む）を加え（培地中、５倍連続希釈で８００ｎＭから出発）、３７℃で３０分間にわたってインキュベートした。次に、プレートに、５０μｌのヒトＩＬ６タンパク質（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ＃１０３９５－ＨＮＡＥ、培地中４ｎｇ／ｍＬ）を加え、次に、３７℃で２４時間にわたって、５％ＣＯ_２インキュベーターに入れた。プレートを遠心分離し、１ウェル当たり１００μｌの上清を廃棄した。ルシフェラーゼ検出試薬（５０μＬ／ウェル、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｅ６１２０）を加えた。５分以内に、プレートを、Ｔｅｃａｎｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｐｒｏプレートリーダーによる分析にかけた。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＩＣ_５０値を報告した。

【0160】

捕捉ＥＬＩＳＡでは、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）_２フラグメント特異的（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９－００５－０９７）を、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）_２フラグメント特異的の代わりに、１００μｌ／ウェルで使用した。

【0161】

ＢＩＡｃｏｒｅでは、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃ＢＲ１００８３９、ＨｕｍａｎＡｎｔｉｂｏｄｙＣａｐｔｕｒｅＫｉｔ）を、ヤギ抗マウスＩｇＧの代わりにＣＭ５チップに共有結合し、ＣＭ５チップを、プロテインＧチップの代わりに、トシリズマブに使用した。１００ｎＭの濃度で組換えヒトＩＬ６Ｒ－ｈｉｓ（配列番号４４に記載されるアミノ酸配列）を、連続希釈された組換えヒトＩＬ６Ｒ－ｈｉｓの代わりに、３０μＬ／分の流量でチップ上に流した。

【0162】

結果を、表４並びに図７Ａ～７Ｂ、図８Ａ～８Ｂ、図９Ａ～９Ｂ及び図１０に示した。

【0163】

【表4】

【0164】

データは、キメラ抗ＩＬ６Ｒ抗体が、それらの親マウスｍＡｂに対して、同様のヒトＩＬ６Ｒに対する結合親和性／能力、及び同様のＩＬ６－ＩＬ６Ｒ相互作用に対するブロッキング活性を有することを示し、それらは、細胞ベースのレポーターアッセイにおいて、トシリズマブと同等であり（図１０参照）、他のアッセイにおいて、トシリズマブよりも良好であった（図７Ａ～７Ｂ、図８Ａ～８Ｂ及び図９Ａ～９Ｂを参照）。

【実施例7】

【0165】

＜抗ＩＬ６Ｒ抗体１Ｈ７のヒト化＞
マウス抗ＩＬ６Ｒ抗体１Ｈ７を、ヒト化し、さらに特性決定した。抗体のヒト化を、以下に詳細に記載される十分に確立されたＣＤＲグラフト方法を用いて行った。

【0166】

マウス抗体１Ｈ７のヒト化のための受容体フレームワークを選択するために、１Ｈ７の軽鎖及び重鎖可変領域配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子データベースに対してブラストした。最も高い相同性を有するヒト生殖細胞系列を、ヒト化のための受容体フレームワークとして選択した。抗体重鎖／軽鎖可変領域ＣＤＲを、選択されたフレームワークに挿入し、フレームワーク中の残基を、より多い候補重鎖／軽鎖可変領域を得るようにさらに変異させた。合計で１３の例示的なヒト化１Ｈ７抗体（すなわち、ｈｕ１Ｈ７－Ｖ１からｈｕ１Ｈ７－Ｖ１２及びｈｕ１Ｈ７－Ｖ１－２）が得られ、その重鎖／軽鎖可変領域配列番号を表１に示した。

【0167】

ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号４１）に連結されたヒト化重鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含むベクター、及びヒトκ軽鎖定常領域（配列番号４２）に連結されたヒト化軽鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含むベクターを、１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩで、１．１：１の軽鎖対重鎖構築物の比率で、５０ｍｌの２９３Ｆ懸濁細胞培養物中で一過性にトランスフェクトした。

【実施例8】

【0168】

＜例示的なヒト化抗体の特性決定＞
ヒト化抗体を含有する細胞上清を、振とうフラスコ中で６日後に収集し、修正を伴う上述されたプロトコルにしたがって、直接的にＢＩＡｃｏｒｅ試験に供した。具体的には、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃ＢＲ１００８３９、ＨｕｍａｎＡｎｔｉｂｏｄｙＣａｐｔｕｒｅＫｉｔ）を、ヤギ抗マウスＩｇＧの代わりに、ＣＭ５チップに共有結合し、ＣＭ５チップを、プロテインＧチップの代わりに、トシリズマブに使用した。キメラ抗体及びトシリズマブを、１０μｇ／ｍｌの濃度で、ＨＢＳ－ＥＰ^＋中で調製し、ヒト化抗体を含む細胞上清を１０倍に希釈した。Ｋ_ａ、Ｋ_ｄ及びＫ_Ｄ値を決定し、以下の表５に要約した。

【0169】

データは、例示的なヒト化抗体が、キメラ抗体に対して同様のヒトＩＬ６Ｒ結合親和性を有し、それらが、トシリズマブの場合より高いことを示した。

【0170】

【表5】

【0171】

ヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５を、上記のように精製し、下記の若干の修正を伴う、前述の実施例中のプロトコルにしたがって、ＢＩＡｃｏｒｅ、捕捉ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、細胞ベースの結合ＦＡＣＳ、競合ＥＬＩＳＡ及び細胞ベースのレポーターアッセイにおいて試験した。

【0172】

捕捉ＥＬＩＳＡでは、９６ウェルマイクロプレートを、２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）_２フラグメント特異的、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｔ＃１０９－００５－０９７）で、ヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ'）_２フラグメントの代わりに、１００μｌ／ウェルで被覆した。

【0173】

間接ＥＬＩＳＡでは、ペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ'）_２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｔ＃１０９－０３６－０９８）を、ペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的の代わりに、１００μｌ／ウェルで使用した。

【0174】

Ｂｉａｃｏｒｅでは、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃ＢＲ１００８３９、ＨｕｍａｎＡｎｔｉｂｏｄｙＣａｐｔｕｒｅＫｉｔ）を、ヤギ抗マウスＩｇＧの代わりにＣＭ５チップに共有結合し、ＣＭ５チップを、プロテインＧチップの代わりに、トシリズマブに使用した。

【0175】

細胞ベースの結合ＦＡＣＳでは、Ｒ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃１０９－１１５－０９８）を、Ｒ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ'）_２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）の代わりに、ＦＡＣＳ緩衝液中１：１０００希釈、１００μｌ／ウェルで使用した。

【0176】

さらに、ヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５を、熱安定性アッセイにおいて試験し、ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）ＴｈｅｒｍａｌＳｈｉｆｔＰｒｏｔｅｉｎＳｔａｂｉｌｉｔｙＫｉｔ（Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｃａｔ＃３３０２２－Ｔ）を用いて、Ｔｍ（溶解温度）を決定した。簡潔に述べると、ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）色素を解凍し、室温に到達させた。色素を含むバイアルをボルテックスし、遠心分離した。次に、１０倍色素を、５μＬの２００倍色素を９５μＬのＰＢＳに加えることによって調製した。２μＬの１０倍色素及び１０μｇのヒト化抗体を加え、ＰＢＳを、２０μＬの総反応体積になるまで加えた。色素及び抗体を含む管を、短時間にわたって回転させ、表６中のパラメータを有する融解曲線プログラムを用いて設定されたリアルタイムＰＣＲサーモサイクラー（Ｒｏｃｈｅ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ）に入れた。

【0177】

【表6】

【0178】

結果を、表７及び図１１～１７に示した。

【0179】

データによると、ヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５は、トシリズマブと比較すると、ヒトＩＬ６Ｒに対するより高い結合親和性／活性及びより高いＩＬ６Ｒ－ＩＬ６ブロッキング能力を示した。特に、抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５は、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＳＩＥ－Ｂ４細胞レポーターアッセイにおいて、ＩＬ６媒介性ルシフェラーゼ活性の阻害に対して、トシリズマブより良好な生物活性を示した。

【0180】

【表7】

【0181】

ヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５が、キメラ抗体１Ｈ７と比較して、ヒト及びマカクＩＬ６Ｒに対する同等の結合親和性を示したことが表７から分かる。換言すれば、ヒト及びマカクＩＬ６Ｒに対するｈｕ１Ｈ７－Ｖ５の結合親和性は、トシリズマブの場合より高かった。

【0182】

ヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５が、トシリズマブと比較して、より高いＢｍａｘ（最大結合）及びより低いＥＣ_５０で、ヒトＩＬ６Ｒに特異的に結合したことが図１１から分かり、それが、より多くのＩＬ６Ｒにより効率的に結合したことを示唆している。

【0183】

マカクＩＬ６Ｒに対する抗体の結合活性では、図１２に示すように、トシリズマブと比較して、Ｂｍａｘは、より高く、ＥＣ_５０は、より低かった。

【0184】

図１３によると、ヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５は、細胞表面ヒトＩＬ６Ｒに、トシリズマブより高いＢｍａｘ（最大結合）及びより低いＥＣ_５０で、より効率的に結合し、それが、より多くのＩＬ６Ｒに、より効率的に結合したことを示唆している。

【0185】

図１４は、ヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５が、ＩＬ６Ｒ－ＩＬ６結合をブロックすることができ、ブロッキング活性が、トシリズマブの場合より高いことを示した。

【0186】

図１５によると、ヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５は、ヒトＩＬ６Ｒ－トシリズマブ結合をブロックすることができ、ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５が、トシリズマブが結合したのと同様のエピトープに結合し得たことを示唆している。

【0187】

図１６に示すように、ヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５は、細胞ベースのレポーターアッセイにおいて、トシリズマブより高い機能活性を有した。

【0188】

さらに、図１７に示すように、ヒト化抗体ｈｕ１Ｈ７－Ｖ５は、融解温度で、ヒト身体内でおそらく安定であった。

【0189】

本開示は、１つ以上の実施形態とともに上述されているが、本開示が、それらの実施形態に限定されないことが理解されるべきであり、説明は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれ得る際、全ての代替例、修飾、及び均等物を包含することが意図される。本明細書に引用される全ての参照文献は、全体が参照によりさらに援用される。

【0190】

本出願中の配列が、以下に要約される。

【0191】

【表8】