特許 7525981 ニトロフェニルボロン酸組成物によって安定化したナノ粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-23

(45)【発行日】2024-07-31

(54)【発明の名称】ニトロフェニルボロン酸組成物によって安定化したナノ粒子

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/14 20060101AFI20240724BHJP

   A61K 31/4745 20060101ALI20240724BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240724BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20240724BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20240724BHJP

   A61K 47/69 20170101ALI20240724BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240724BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20240724BHJP

【ＦＩ】

A61K9/14

A61K31/4745

A61K31/7105

A61K47/34

A61K47/62

A61K47/69

A61P35/00

A61K39/395

【請求項の数】 21

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2019038673

(22)【出願日】2019-03-04

(62)【分割の表示】P 2017225589の分割

【原出願日】2013-03-01

(65)【公開番号】P2019108372

(43)【公開日】2019-07-04

【審査請求日】2019-04-03

【審判番号】

【審判請求日】2022-05-06

(73)【特許権者】

【識別番号】598128421

【氏名又は名称】カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィス マーク イー．

(72)【発明者】

【氏名】ハン ハン

【合議体】

【審判長】藤原 浩子

【審判官】井上 千弥子

【審判官】岩下 直人

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５１７３９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５００２０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１２／１５８６２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００５／１１９２５５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

A61K 9/00- 9/72

A61K31/00-31/80

A61K33/00-33/44

A61K47/00-47/69

A61P 1/00-43/00

ＣＡＰｌｕｓ・ＲＥＧＩＳＴＲＹ・ＭＥＤＬＩＮＥ・ＢＩＯＳＩＳ・ＥＭＢＡＳＥ・ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ａ）～（ｃ）を構成成分として含むナノ粒子であって、
（ａ）疎水性ポリマーブロックを含むよう修飾されたムチン酸ポリマー（ＭＡＰ）を含む修飾ミセル、
（ｂ）下記構造

【化1】

を有し、前記ムチン酸ポリマーが結合体化したニトロフェニルボロン酸含有ポリマーであって、
ここで、ｓは２０～３００であり、＊は標的リガンドであり、
（ｃ）化学的または生物学的活性を示す薬物であって、前記薬物は前記修飾ミセル内に含まれ、
ここで、前記ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーは、前記ナノ粒子が前記ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーを前記ナノ粒子の外部環境に存在するよう構成されるようにボロン酸とＭＡＰジオールとの間の可逆的共有結合によって前記ムチン酸ポリマーに結合される
前記ナノ粒子。

【請求項2】

前記修飾されたムチン酸ポリマーが、ペンタエリスリトール、エチレングリコールまたはグリセリンのポリマー単位をさらに含む、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項3】

前記修飾されたムチン酸ポリマーがポリエステル、ポリエーテルまたは多糖類の単位をさらに含む、請求項１または２に記載のナノ粒子。

【請求項4】

前記ポリエステルが少なくとも１つのヒドロキシル末端基で終結するポリカーボネート、ポリブチレートまたはポリエチレンテレフタレートである、請求項３に記載のナノ粒子。

【請求項5】

前記ポリエーテルがＨＯ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ－Ｈ（ｐ≧１）である、請求項３に記載のナノ粒子。

【請求項6】

前記ポリエーテルがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリ（テトラメチレンエーテル）グリコールである、請求項５に記載のナノ粒子。

【請求項7】

前記多糖類がシクロデキストリン、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチンまたはβ－グリカンである、請求項３に記載のナノ粒子。

【請求項8】

前記化学的または生物学的活性を示す薬物が治療剤である、請求項１～７のいずれか1項に記載のナノ粒子。

【請求項9】

前記治療剤が化学療法剤である、請求項８に記載のナノ粒子。

【請求項10】

前記治療剤が低分子化学療法剤またはポリヌクレオチドである、請求項８に記載のナノ粒子。

【請求項11】

前記治療剤がカンプトテシン、エポチロンまたはタキサンである、請求項８に記載のナノ粒子。

【請求項12】

前記治療剤がＤＮＡ、ＲＮＡまたは干渉ＲＮＡである、請求項８に記載のナノ粒子。

【請求項13】

前記標的リガンドが、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、アプタマーまたは抗体である、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項14】

前記標的リガンドが、抗体であり、前記ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーの末端部分に結合体化される、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項15】

前記標的リガンドが、トランスフェリンである、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか１項に記載のナノ粒子並びに好適な溶媒、キャリア、結合剤、賦形剤および／または希釈剤を含む、組成物。

【請求項17】

前記組成物が製薬組成物であり、好適な溶媒、キャリア、結合剤、賦形剤および／または希釈剤が製薬的に許容可能な溶媒、キャリア、結合剤、賦形剤および／または希釈剤である、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

化学的または生物学的活性を示す薬物での治療を必要とする状態を有する被験体を治療する方法における使用のための請求項１～１５のいずれか１項に記載のナノ粒子または請求項１６に記載の組成物であって、前記方法は、前記ナノ粒子または前記組成物を前記被験体に投与することを含む、前記ナノ粒子または前記組成物。

【請求項19】

前記状態が疾患であり、前記化学的または生物学的活性を示す薬物が前記疾患の治療に有効なものである、請求項１８に記載のナノ粒子または組成物。

【請求項20】

前記状態が癌であり、前記化学的または生物学的活性を示す薬物が化学療法化合物である、請求項１８に記載のナノ粒子または組成物。

【請求項21】

前記化学療法化合物が、カンプトテシン、エポチロンまたはタキサンである、請求項２０に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（政府の権利）
本発明は、国立がん研究所に与えられた助成金ＣＡ １１９３４７の下での政府の支持により行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。

【0002】

（発明の分野）
本開示は、キャリアナノ粒子、特に、目的の化合物を送達するために好適なナノ粒子、並びに関連する組成物、方法およびシステムに関する。

【背景技術】

【0003】

細胞、組織、器官および生物への目的の化合物の効果的な送達は、生体医学分野、画像化分野並びに種々の大きさおよび寸法の分子所定の標的への送達が所望される他の分野において、挑戦されている。

【0004】

病理検査、治療処置、又は生物学基礎研究のいずれかのために、代表的には目的の生物活性および／又は化学活性を伴う種々のクラスの生体材料並びに生物分子を送達するために、幾つかの方法が公知であり、使用されている。

【0005】

化学薬剤又は生物薬剤（例えば、薬物、生物製剤、治療薬剤又は画像化薬剤）として使用されるために好適な分子の数が増えるに従い、種々の複雑性、寸法および化学的性質の化合物と共に使用されるために好適な送達システムの開発は、特に困難であることが証明されている。

【0006】

ナノ粒子は、送達の種々の方法による薬剤の送達のためのキャリアとして有用な構造である。薬剤を梱包し、輸送し、そして特定の標的に送達するための、数々の異なる戦略を用いる、幾つかのナノ粒子送達システムが、存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本明細書中で、ナノ粒子並びに関連の組成物、方法およびシステムが提供され、これは、目的の化合物の有効且つ特異的な送達のための、多機能型ツールを提供する。詳細には、幾つかの実施形態において、本明細書中で記載されるナノ粒子は、種々の大きさ、寸法および所定の標的に対する化学的性質の、広範な分子の運搬および送達のための柔軟なシステムとして使用され得る。

【0008】

１つの局面に従い、ポリオール含有ポリマーおよびニトロフェニルボロン酸含有ポリマーを含むナノ粒子が、記載される。このナノ粒子において、ボロン酸含有ポリマーは、ポリオール含有ポリマーとカップリングし、そしてこのナノ粒子は、ボロン酸含有ポリマーがこのナノ粒子の外部環境に存在するように構成される。１つ以上の目的の化合物は、ポリオール含有ポリマーおよび／又はボロン酸含有ポリマーの一部として又はこれに結合して、ナノ粒子によって運ばれることができる。

【0009】

別の局面に従い、組成物が記載される。この組成物は、本明細書中で記載されるナノ粒子および好適なビヒクル並びに／又は賦形剤を含む。

【0010】

別の局面に従い、標的に化合物を送達する方法が、記載される。この方法は、標的を本明細書中で記載されるナノ粒子と接触させることを含み、ここで、この化合物は、本明細書中で記載されるナノ粒子のポリオール含有ポリマー又はボロン酸含有ポリマーの中に含まれる。

【0011】

別の局面に従い、標的に化合物を送達するシステムが、記載される。このシステムは、可逆的共有結合を介して相互結合可能であり、化合物を含む本明細書中で記載されるナノ粒子中に集められる、少なくともポリオール含有ポリマーとボロン酸含有ポリマーとを含む。

【0012】

別の局面に従い、個体に化合物を投与する方法が、記載される。この方法は、有効量の本明細書中で記載されるナノ粒子をこの個体に投与することを含み、ここで、この化合物は、ポリオール含有ポリマーおよび／又はボロン酸含有ポリマーの中に含まれる。

【0013】

別の局面に従い、個体に化合物を投与するシステムが、記載される。このシステムは、可逆的共有結合を介して相互結合可能であり、本明細書中で記載される方法に従って個体に投与される化合物を結合した本明細書中で記載されるナノ粒子中に集められる、少なくともポリオール含有ポリマーとボロン酸含有ポリマーとを含む。

【0014】

別の局面に従い、ポリオール含有ポリマーおよびニトロフェニルボロン酸含有ポリマーを含むナノ粒子を調製する方法が、記載される。この方法は、ポリオール含有ポリマーとボロン酸含有ポリマーとのカップリングを可能にする時間および条件下で、ポリオール含有ポリマーをボロン酸含有ポリマーと接触させることを含む。

【0015】

別の局面に従い、幾つかのボロン酸含有ポリマーが記載され、これらは、本開示の以下の節において詳細に説明される。

【0016】

別の局面に従い、幾つかのポリオール含有ポリマーが記載され、これらは、本開示の以下の節において詳細に説明される。

【0017】

ニトロフェニルボロン酸基を有するポリマーに結合体化したポリオール含有ポリマーを有するナノ粒子が、本明細書中で記載され、これは、ナノ粒子のｐＫａを低下させて、その安定性を増大させる。

【0018】

本開示の別の局面は、標的にされたナノ粒子の記載を提供する。これは、幾つかの実施形態において、１つの単一標的リガンドのみを有し得る。これは、このナノ粒子の特定の標的、例えばこの粒子の標的リガンドについての結合パートナーを提示する細胞への、送達を促進することができる。この類の標的にされたナノ粒子は、複数の標的リガンドを有するナノ粒子を凌ぐ利点、例えば、より少ない表面リガンドを有することによって全体のサイズがより小さいことなどの利点を有し、並びに、アビディティベースの相互作用を介すると、親和性ベースの相互作用よりも、非特異的結合を媒介するリガンドが少ない。従って、治療薬剤を含有するか又は運搬するナノ粒子は、１つの標的リガンドのみを用いて、目的の配置（例えば、細胞又は組織）を首尾よく標的にすることができ、治療薬剤を、非常に高い標的リガンド対治療剤比で標的に送達することができる。記載のナノ粒子のこの局面は、このような治療剤を製造する効率を有意に高め、同時に、標的化を媒介する高価な抗体を多数使用する必要をも低下させる。

【0019】

本明細書中で記載されるナノ粒子および関連の組成物、方法およびシステムは、種々の大きさ、寸法および化学的性質の化合物を運搬するために好適な柔軟な分子構造として、幾つかの実施形態において使用され得る。

【0020】

本明細書中で記載されるナノ粒子および関連の組成物、方法およびシステムは、幾つかの実施形態において、分解、免疫系による認識、および血清タンパク質もしくは血球との結合による損失からの、運搬する化合物の保護を提供することができる送達システムとして使用され得る。

【0021】

本明細書中で記載されるナノ粒子および関連の組成物、方法およびシステムは、幾つかの実施形態において、立体安定性によって、並びに特定の標的、例えば組織、組織内の特定の細胞種、および特定の細胞種の中での特定の細胞間の配置にすら、化合物を送達する能力によって特徴づけられる、送達システムとして使用され得る。

【0022】

本明細書中で記載されるナノ粒子および関連の組成物、方法およびシステムは、幾つかの実施形態において、同じナノ粒子内での、複数の化合物の異なる速度および／又は時点での制御放出を含む、制御可能な様式での、運搬された化合物の放出のために、設計され得る。

【0023】

本明細書中で記載されるナノ粒子および関連の組成物、方法およびシステムは、幾つかの実施形態において、標的化の間に増大した特異性および／又は選択性をもって、並びに／又は当該分野の特定のシステムと比較して増大した化合物の標的による認識をもって、化合物を送達するために使用され得る。

【0024】

本明細書中で記載されるナノ粒子および関連の組成物、方法およびシステムは、幾つかの実施形態において、目的の化合物の制御された送達が望ましい用途（治療用途、診断用途および臨床用途などの医学的用途を含むが、これらに限らない）と組み合わせて使用され得る。さらなる用途は、生物学的分析、獣医学用途、および目的の化合物の動物以外の器官、特に植物器官への送達を含む。

【0025】

本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の詳細な説明および実施例において示される。他の特徴、目的および利点が、詳細な説明、実施例および図面から、並びに添付の請求の範囲から、明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

本明細書に組み込まれ、且つその一部を構成する添付の図面は、本開示の１つ以上の実施形態を説明し、詳細な説明および実施例と共に、本開示の原則および実施を説明するために寄与する。

【図1】ナノ粒子および化合物を含むボロン酸の非存在下での関連の形成のための関連方法の概略図を示す。パネルＡは、本明細書中で記載される実施形態に従うポリオール含有ポリマー（ＭＡＰ，４）および目的の化合物（核酸）の概略図を示す。パネルＢは、パネルＡにおいて示されるポリオールおよび化合物を含むポリマーの集合によって形成されるナノ粒子を示す。

【図2】本開示の実施形態に従うナノ粒子および関連の製造方法の概略図を示す。パネルＡは、本開示の実施形態に従うポリオール（ＭＡＰ，４）含有ポリマーおよびボロン酸（ＢＡ－ＰＥＧ，６）含有ポリマーを、目的の分子（核酸）と共に示す。パネルＢは、パネルＡにおいて示されるポリマーおよび化合物の集合によって形成されるＢＡ－ペグ化安定化ナノ粒子を示す。

【図3】本明細書中で記載される実施形態に従うポリオール含有ポリマーおよび目的の化合物を含む複合体の形成を示す。詳細には、図３は、本開示の実施形態に従うプラスミドＤＮＡを用いたＭＡＰゲルシフトアッセイの結果を示す。ＤＮＡラダーは、レーン１にローディングされる。レーン２～８は、電荷比を漸増的に増加させたＭＡＰと組み合わせたプラスミドＤＮＡを示す。電荷比は、核酸の負電荷の量で除算したＭＡＰ上の正電荷の量として定義される。

【図4】本明細書中で記載される実施形態に従うポリオール含有ポリマーおよび目的の化合物を含む複合体の形成を示す。詳細には、図４は、本開示の実施形態に従うｓｉＲＮＡを用いたＭＡＰゲルシフトアッセイの結果を示す。ＤＮＡラダーは、レーン１にローディングされる。レーン２～８は、電荷比を漸増的に増加させたＭＡＰと組み合わせたｓｉＲＮＡを示す。

【図5】本明細書中で記載される幾つかの実施形態に従うナノ粒子の特性を示す。詳細には、図５は、本開示の実施形態に従う、粒子サイズ（動的光散乱（ＤＬＳ）測定）対電荷比並びにゼータ電位（ナノ粒子の表面電荷に関する性質）対ＭＡＰ－プラスミドナノ粒子についての電荷比のプロットを説明する図を示す。

【図6】本明細書中で記載される幾つかの実施形態に従うナノ粒子の特性を示す。詳細には、図６は、本開示の実施形態に従う、粒子サイズ（ＤＬＳ）対電荷比並びにゼータ電位対ＢＡ－ペグ化ＭＡＰ－プラスミドナノ粒子についての電荷比のプロットを説明する図を示す。

【図7】本開示の実施形態に従う、ＢＡ－ペグ化ＭＡＰ－プラスミドナノ粒子の塩安定性を示す。プロットＡ：５：１ ＢＡ－ＰＥＧ＋ｎｐ＋１Ｘ ＰＢＳ ５分後；プロットＢ：５：１ ＢＡ－ＰＥＧ＋ｎｐ，透析３Ｘ ｗ／１００ｋＤａ＋１Ｘ ＰＢＳ ５分後；プロットＣ：５：１事前ペグ化ｗ／ＢＡ－ＰＥＧ＋１Ｘ ＰＢＳ ５分後；プロットＤ：５：１事前ペグ化ｗ／ＢＡ－ＰＥＧ，透析３Ｘ ｗ／１００ｋＤａ＋ＰＢＳ ５分後。

【図8】本明細書中で記載される実施形態に従うナノ粒子を用いたインビトロでのヒト細胞への薬剤の送達を示す。詳細には、図８は、本開示の実施形態に従う、ＨｅＬａ細胞内へのＭＡＰ／ｐＧＬ３トランスフェクションについての、ｐＧＬ３から発現されたルシフェラーゼタンパク質の量の測定値である相対的光ユニット（ＲＬＵ）対電荷比のプロットを、説明する図を示す。

【図9】本明細書中で記載される実施形態に従うナノ粒子を用いた、標的への薬剤の送達を示す。詳細には、図９は、本開示の実施形態に従う、ＭＡＰ／ｐＧＬ３トランスフェクション後の、細胞生存対電荷比のプロットを、説明する図を示す。生存データは、図８に示される実験のためのものである。

【図10】本明細書中で記載される実施形態に従うナノ粒子を用いた、標的への複数の化合物の送達を示す。詳細には、図１０は、本明細書中で記載される実施形態に従う、５＋／－の電荷比におけるＨｅＬａ細胞内へのｐＧＬ３およびｓｉＧＬ３を含有するＭＡＰ粒子の同時トランスフェクションについての、相対的光ユニット（ＲＬＵ）対粒子種のプロットを、説明する図を示す。ｓｉＣＯＮの語は、対照配列を有するｓｉＲＮＡを示す。

【図11】本明細書中で記載される実施形態に従うナノ粒子を用いた、標的への化合物の送達を示す。詳細には、図１１は、本明細書中で記載される実施形態に従う、５＋／－の電荷比におけるＨｅＬａ－Ｌｕｃ細胞内へのＭＡＰ／ｓｉＧＬ３の送達についての、相対的光ユニット（ＲＬＵ）対ｓｉＧＬ３濃度のプロットを、説明する図を示す。

【図12】本開示の幾つかの実施形態に従う標的リガンドを提示するボロン酸含有ポリマーの合成の概略図を示す。詳細には、図１２は、本開示の実施形態に従うボロン酸－ペグジスルフィド－トランスフェリンの合成のための模式図を示す。

【図13】本明細書中で記載される幾つかの実施形態に従うナノ粒子の合成の概略図を示す。詳細には、図１３は、本開示の実施形態に従う、水中でのカンポテシン（Campothecin）ムチン酸ポリマー（ＣＰＴ－ムチン酸ポリマー）を用いるナノ粒子の形成のための模式図を示す。

【図14】本開示の実施形態に従って調製された、水中で結合体化されたＣＰＴ－ムチン酸ポリマーから形成されたナノ粒子の粒子サイズおよびゼータ電位をまとめた表を示す。

【図15】本明細書中で記載される幾つかの実施形態に従うナノ粒子の合成の概略図を示す。詳細には、図１５は、本開示の実施形態に従う、水中でのＣＰＴ－ムチン酸ポリマーおよびボロン酸－ジスルフィド－ＰＥＧ_５０００を用いるボロン酸－ペグ化ナノ粒子の形成を示す。

【図16】ペグなし、ニトロペグ－ＰＥＧおよび０．２５ｍｏｌ％ハーセプチン－ＰＥＧ－ニトロＰＢＡによって安定化されたＭＡＰ－４／ｓｉＲＮＡの塩安定性を示す。電荷比３（＋／－）において調製され、得られた溶液が１ｘ ＰＢＳにおけるものであるように、１０ｘ ＰＢＳを５分の時点で添加した。

【図17】ＡおよびＢは、（Ａ）ＢＴ－４７４においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）－ＰＥＧ－ニトロＰＢＡ対ナノ粒子の増大した比における標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の、中型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子又は標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の、細胞内取り込みを示す。（Ｂ）ＢＴ－４７４細胞株（塗りつぶしバー）およびＭＣＦ－７細胞株（白いバー）における遊離のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（１０ｍｇ／ｍｌ）を含有又は非含有の、中型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子又は標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の、細胞内取り込みを示す。

【図18】ＡおよびＢは、１０ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ注射でのＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、短型、中型および長型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の血漿薬物動態学を示す。１０ｍｇ／ｋｇでＣＤ２Ｆ１マウス内に注射された遊離のＣＰＴを、比較として示す。（Ａ）時間の関数としてのポリマー結合ＣＰＴの血漿濃度。（Ｂ）時間の関数としての非結合体化ＣＰＴの血漿濃度。

【図19A】処置の４時間後および２４時間後の、ＭＡＰ－ＣＰＴ（５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ）および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴ（５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ，２９ｍｇ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｋｇ）ナノ粒子の生体分布を示す。腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、腎臓又は肺の１グラムあたりの全ＣＰＴの注射した用量（ＩＤ）百分率。

【図19B】処置の４時間後および２４時間後の、ＭＡＰ－ＣＰＴ（５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ）および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴ（５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ，２９ｍｇ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｋｇ）ナノ粒子の生体分布を示す。腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、腎臓および肺における、各器官において結合体化されていない全ＣＰＴ百分率。

【図19C】処置の４時間後および２４時間後の、ＭＡＰ－ＣＰＴ（５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ）および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴ（５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ，２９ｍｇ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｋｇ）ナノ粒子の生体分布を示す。血漿中のＣＰＴの全濃度。

【図19D】処置の４時間後および２４時間後の、ＭＡＰ－ＣＰＴ（５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ）および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴ（５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ，２９ｍｇ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｋｇ）ナノ粒子の生体分布を示す。血漿中で結合体化されていない全ＣＰＴの百分率。

【図20】（Ａ）４時間でのＭＡＰ－ＣＰＴ（５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ）（Ｂ）２４時間でのＭＡＰ－ＣＰＴ（５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ）（Ｃ）４時間での標的化ＭＡＰ－ＣＰＴ（５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ，２９ｍｇ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｋｇ）（Ｄ）２４時間での標的化ＭＡＰ－ＣＰＴ（５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ，２９ｍｇ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｋｇ）によって処理されたＮＣｒヌードマウスから採取したＢＴ－４７４腫瘍切片の共焦点免疫蛍光顕微鏡写真を図示する。左パネルは発光４４０ｎｍ（ＣＰＴ，ピンク）、中央左パネルは発光５１９ｎｍ（ＭＡＰ，緑）、中央右パネルは発光６４７ｎｍ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標），青）、右パネルは画像のオーバーレイ。

【図21】ＢＴ－４７４異種移植片腫瘍を有するＮＣｒヌードマウスにおける抗腫瘍効力を示す。時間の関数としての平均腫瘍体積、２週間に１度受けたハーセプチンの投薬を含む群、全ての他の群は３週間に１度投薬を受けた。

【図22】（Ａ）５．９ｍｇ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｋｇおよび（Ｂ）標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子（５．９ｍｇ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｋｇおよび１ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ）によって処置したＮＣｒヌードマウスについての、抗腫瘍効力を示す。

【発明を実施するための形態】

【0027】

ナノ粒子に含まれる化合物を送達するための、ナノ粒子、並びに関連して使用され得る組成物、方法およびシステム、記載のナノ粒子を製造する方法、記載のナノ粒子を用いる処置方法、並びに記載のナノ粒子を集めるためのキットが、本明細書中で提供される。

【0028】

用語「ナノ粒子」は、本明細書中で使用される場合、ナノスケールの寸法の複合構造物を示す。詳細には、ナノ粒子は、代表的には、約１～約１０００ｎｍの範囲のサイズの粒子であり、通常は球形であるが、ナノ粒子組成物によって異なる形態学が可能である。ナノ粒子の外部環境に接触するナノ粒子の部分は、一般に、ナノ粒子の表面と定義される。本明中で記載されるナノ粒子において、サイズの制限は、２次元で限定され、したがって、本明細書中で記載されるナノ粒子は、約１～約１０００ｎｍの径を有する複合構造物を含み、ここで、この特定の径は、ナノ粒子組成物および実験設計に従うナノ粒子の用途に依存する。例えば、幾つかの治療用途に使用されるナノ粒子は、代表的に、約２００ｎｍ以下のサイズを有し、そして詳細には、癌処置に関連する送達のために使用されるものは、代表的に、約１～約１００ｎｍの径を有する。用語「標的化ナノ粒子」は、標的薬剤又は標的リガンドに結合体化されたナノ粒子をいう。

【0029】

ナノ粒子のさらなる望ましい特性、例えば表面電荷および立体安定化は、目的の特定の用途の観点で変動してもよい。癌処置などの臨床用途において望ましい場合がある特性の例の幾つかは、科学文献において記載されている。さらなる特性は、本開示を読むことにより、当業者によって理解される。ナノ粒子の寸法および特性は、当該分野で公知の技術によって検出され得る。粒子の寸法を検出する技術の例としては、動的光拡散（ＤＬＳ）並びに透過電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）および原子力顕微鏡検査（ＡＦＭ）などの種々の顕微鏡検査が挙げられるが、これらに限定されない。粒子形態を検出するための技術の例としては、ＴＥＭおよびＡＦＭが挙げられるが、これらに限定されない。表面電荷を検出するための技術の例としては、ゼータ電位ゼータ電位法が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる技術は、^１Ｈ、^１１Ｂ、^１３Ｃ並びに^１９Ｆ ＮＭＲ、ＵＶ／可視光および赤外線／ラマン顕微鏡検査並びに蛍光顕微鏡検査（ナノ粒子が蛍光標識と組み合わせて使用される場合）並びに当業者によって理解されるさらなる技術によって含められる他の化学特性を検出するために好適である。

【0030】

本明細書中で記載されるナノ粒子および関連の組成物、方法およびシステムは、目的の化合物および詳細には薬剤を、所定の標的に対し送達するために使用され得る。

【0031】

用語「送達する」および「送達」は、本明細書中で記載される場合、化合物の空間的配置に影響を及ぼす、詳細にはこのような配置を制御する活性を示す。従って、本開示の意味における化合物の送達は、特定の時間、特定の一連の条件下で、化合物の位置決めおよび動きに影響を及ぼし、その結果、これらの条件下でのこの化合物の位置決めおよび動きが、さもなければこの化合物が有する位置決めおよび動きに対し変えられる能力を示す。

【0032】

詳細には、参照エンドポイントに関して、化合物の送達は、化合物の位置決めおよび動きを制御することにより、この化合物が最終的に選択された参照エンドポイントに配置される能力を、示す。インビトロシステムにおいて、化合物の送達は、通常、この化合物の化学的および／又は生物学的検出可能特性および活性の対応する改変を伴う。インビトロシステムにおいて、化合物の送達はまた、代表的に、この化合物の薬物動態学の改変を伴い、薬力学の改変を伴う場合もある。

【0033】

化合物の薬物動態学は、この化合物の吸収、分布、代謝およびシステムからの代表的には個体の身体によってもたらされる排出を、示す。詳細には、用語「吸収」は、物質が身体に入る過程を示し、用語「分布」は、身体の体液および組織を通した物質の分散又は播種を示し、用語「代謝」は、親化合物から娘代謝物への不可逆的変換を示し、並びに用語「排出」は、身体からの物質の排除を示す。この化合物が処方物中である場合、薬物動態学は、この処方物からのこの化合物の遊離をも含み、これは、この化合物、代表的には薬物の、この処方物からの放出の過程を示す。用語「薬力学」は、身体上又は微生物上又は身体内又は体上の寄生生物における化合物の物理学的効果、薬物作用のメカニズムおよび薬物濃度と効果との間の関係性を示す。当業者は、目的の化合物および詳細には目的の薬剤、例えば薬物の、薬物動態学および薬力学的特徴並びに特性に好適である技術および手順を同定することができる。

【0034】

用語「薬剤」は、本明細書中で使用される場合、標的に関連する化学的又は生物学的活性を示すことが可能な化合物を示す。用語「化学活性」は、本明細書中で使用される場合、化学反応を行う分子の能力を示す。用語「生物学活性」は、本明細書中で使用される場合、生物に影響を及ぼす分子の能力を示す。薬剤の化学活性の例は、共有結合の形成又は静電相互作用を含む。薬剤の生物学的活性の例は、内因性分子の産生および分泌、内因性分子又は外因性分子の吸収および代謝、並びに目的の遺伝子の転写および翻訳を含む遺伝子発現の活性化又は不活化を含む。

【0035】

用語「標的」は、本明細書中で使用される場合、単細胞生物又は多細胞生物又はそれらの任意の部分を含み、並びにインビトロ又はインビボの生物学的システム又はその任意の部分を含む、目的の生物学的システムを含む。

【0036】

本明細書中で記載されるナノ粒子、ポリオール含有ポリマーに結合したボロン酸含有ポリマーは、ナノ粒子の環境的外部に提示されるようにナノ粒子において配置される。

【0037】

用語「ポリマー」は、本明細書中で使用される場合、代表的には共有化学結合によって結合した反復する構造単位から構成される大型分子を示す。好適なポリマーは、直鎖および／又は分枝鎖状であってもよく、且つホモポリマーの形態をとっても、又はコポリマーの形態をとってもよい。コポリマーが使用される場合、このコポリマーは、ランダムコポリマーであっても、分枝鎖状コポリマーであってもよい。ポリマーの例は、水分散性ポリマー、および詳細には、水溶性ポリマーを含む。例えば、好適なポリマーとしては、多糖類、ポリエステル、ポリアミド、ポリエーテル、ポリカーボネート、ポリアクリレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。治療的および／又は製薬的使用並びに用途のために、このポリマーは、低毒性プロフィール、詳細には、低い毒性又は細胞毒性を有さなければならない。好適なポリマーとしては、約５００，０００以下の分子量を有するポリマーが挙げられる。詳細には、好適なポリマーは、約１００，０００以下の分子量を有し得る。

【0038】

用語「ポリオール含有ポリマー」又は「ポリオールポリマー」は、本明細書中で使用される場合、多数のヒドロキシル官能基を提示するポリマーを示す。詳細には、本明細書中で記載されるナノ粒子を形成するために好適なポリオール含有ポリマーは、ボロン酸含有ポリマーの少なくとも１つのボロン酸とカップリング相互作用のために、ヒドロキシル官能基の少なくとも一部を提示するポリマーを含む。

【0039】

用語「提示する」は、化合物又は官能基に対して本明細書中で使用される場合、結合した化合物又は官能基の化学反応性を維持するために行われる結合を示す。従って、表面上に提示される官能基は、適切な条件下で、官能基を化学的に特徴づける１つ以上の化学反応を行うことができる。

【0040】

ポリマーを形成する構造単位は、ポリオールモノマー、例えばペンタエリスリトール、エチレングリコールおよびグリセリンを含む。ポリオールを含むポリマーの例は、ポリエステル、ポリエーテルおよび多糖類を含む。好適なポリエステルの例としては、ジオール、および詳細には、ｐ≧１を有する一般式ＨＯ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐ－Ｈのジオール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリ（テトラメチレンエーテル）グリコールが挙げられるが、これらに限定されない。好適な多糖類の例としては、シクロデキストリン、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチンおよびβ－グルカンが挙げられ、これらに限定されない。好適なポリエステルの例としては、ポリカーボネート、ポリブチレートおよびポリエチレンテレフタレート、ヒドロキシル末端基で終結する全てが挙げられるが、これらに限定されない。ポリオール含有ポリマーの例は、約５００，０００以下の分子量、詳細には約３００～約１００，０００の分子量のポリマーを含む。

【0041】

幾つかのポリオール含有ポリマーは、市販されており、および／又は当業者によって同定され得る技術および手順を用いて産生され得る。ポリオールポリマーの例の合成のための手順の例は、科学文献において以前に記載されており、他は実施例１～４において説明される。ポリオール含有ポリマーを製造するためのさらなる手順は、本開示を考慮し、当業者によって同定され得る。

【0042】

用語「ボロン酸含有ポリマー」又は「ＢＡポリマー」は、本明細書中で使用される場合、ポリオール含有ポリマーのヒドロキシル基に結合するために提示された少なくとも１つのボロン酸基を含むポリマーを示す。詳細には、本明細書中で記載されるナノ粒子のボロン酸含有ポリマーとしては、炭素とボロンとの化学結合を含むアルキル又はアリール置換ボロン酸の少なくとも１つの構造単位を含むポリマーが挙げられる。好適なＢＡポリマーは、ボロン酸が末端構造単位又は任意の他の好適な部分に存在し、生じたポリマーに親水性の特性を与えるポリマーを含む。ポリオール含有ポリマーの例は、約４０，０００以下の分子量、詳細には約２０，０００～約１０，０００の分子量のポリマーを含む。

【0043】

幾つかのボロン酸含有ポリマーは、市販されており、および／又は当業者によって同定され得る技術および手順を用いて産生され得る。ポリオールポリマーの例の合成のための手順の例は、科学文献において以前に記載されており、他は実施例５～８において説明される。ＢＡポリマーを製造するためのさらなる手順は、本開示を考慮し、当業者によって同定され得る。

【0044】

本明細書中で記載されるナノ粒子において、ポリオールポリマーは、ＢＡポリマーとカップリングされる。用語「カップリングされた」又は「カップリング」は、２つの分子間の結合に関して本明細書中で使用される場合、可逆的共有結合を形成する相互作用を示す。詳細には、好適な培地の存在下で、ＢＡポリマー上に提示されるボロン酸は、迅速かつ可逆的な対合の共有結合相互作用を介してポリオールのヒドロキシル基と相互作用し、好適な培地中でボロン酸エステルを形成する。好適な培地としては、水および幾つかの水溶液並びに当業者によって同定され得るさらなる有機培地が挙げられる。詳細には、水性培地中で接触した場合、ＢＡポリマーおよびポリオールは反応し、水を副産物として生じる。このボロン酸ポリオール相互作用は、一般に、水溶液中がより好ましいが、有機培地中でも進行することが公知である。さらに、１，２ジオールおよび１，３ジオールによって形成された環状エステルは、一般に、その非環状エステル対応物よりもより安定性である。

【0045】

従って、本明細書中で記載されるナノ粒子において、少なくともボロン酸含有ポリマーのボロン酸は、ポリオール含有ポリマーのヒドロキシル基に、可逆的共有結合によって結合される。ＢＡポリマーとポリオールポリマーとの間のボロン酸エステルは、例えば、ナノ粒子を構成するボロン酸およびポリオールの特定の化学的性質および特性に依存して、ボロン－１１核磁気共鳴（^１１Ｂ ＮＭＲ）、電位滴定、選択したＵＶ／可視光および蛍光検出技術などの当業者によって同定される方法および美術によって、検出され得る。

【0046】

本明細書中で記載されるＢＡポリマーの本明細書中で記載されるポリオールポリマーとのカップリング相互作用から生じたナノ粒子は、粒子の表面上にＢＡポリマーを提示する。幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、約１～約１０００ｎｍの径および球形の形態を有し得るが、粒子の寸法および形態は、ナノ粒子を形成するために用いられたＢＡポリマーおよびポリオールポリマーによって、並びに本開示に従ってナノ粒子において運ばれた化合物によって、主に決定される。

【0047】

幾つかの実施形態において、ナノ粒子によって運ばれる目的の化合物は、ＢＡポリマーおよび／又はポリオールポリマーの一部を形成する。このような実施形態の例は、ポリマーの１つ以上の原子が特定の同位体、例えば詳細には、^１９Ｆおよび^１０Ｂによって置き換えられており、従って標的の画像化のためか、および／又は標的に放射線処置を提供するための薬剤として好適である、ナノ粒子によって提供される。

【0048】

幾つかの実施形態において、ナノ粒子に運ばれる目的の化合物は、ポリマー、代表的にはポリオールポリマーに、共有結合又は非共有結合を介して結合される。このような実施形態の例は、化合物ポリオールポリマーおよびＢＡポリマーのうち少なくとも１つにおける１つ以上の部分が１つ以上の目的に結合するナノ粒子によって、提供される。

【0049】

用語「結合する」「結合した」又は「結合」は。本明細書中で使用される場合、２つ以上の構成要素を互いに保つための、結合、連結、力又は結びつきによる、接続もしくは統合をいい、これは、直接的又は間接的な結合を含むので、例えば、第１化合物が第２化合物に直接的に結合する場合、並びに、１つ以上の中間体化合物、詳細には中間分子が、第１化合物と第２化合物との間に置かれる実施形態を含む。

【0050】

詳細には、幾つかの実施形態において、化合物は、ポリオールポリマー又はＢＡポリマーに、このポリマーの好適な部分へのこの化合物の共有結合を介して結合し得る。共有結合の例は、薬物カンプトテシンのムチン酸ポリマーへの結合が、生分解性エステル結合連結を介して行われる実施例１９、並びに、トランスフェリンのＢＡ－ＰＥＧ_５０００への結合がトランスフェリンのペグ化を介して行われる実施例９において、説明される。

【0051】

幾つかの実施形態において、このポリマーは、目的の特定の化合物の結合を可能にするように、（例えば、目的の化合物上の対応する官能基に特異的に結合できる１つ以上の官能基の付加によって）設計され得るか、又は改変され得る。例えば、幾つかの実施形態において、ナノ粒子をＢＡ－ＰＥＧ－Ｘによってペグ化することが可能であり、ここで、Ｘは、チオールと特異的に反応するか又はアミンと非特異的に反応する、マレイミド基又はヨードアセチル基又は遊離の遊離基であってもよい。結合される化合物は、次いでチオール官能基を発現する改変の後に、マレイミド基又はヨードアセチル基と反応し得る。結合される化合物はまた、アルデヒド又はケトン基によって改変されてもよく、そしてこれらは、ポリオール上のジオールによる縮合反応を介して反応し得、アセタール又はケタールを生じ得る。

【0052】

幾つかの実施形態において、目的の化合物は、結合される化合物とポリマーの好適な部分との間の非共有結合、例えばイオン結合および分子間相互作用を介して、ポリオールポリマー又はＢＡポリマーに結合され得る。非共有結合の例は、実施例１０において説明される。

【0053】

目的の化合物は、ナノ粒子の形成の前、形成の際、又は形成の後に、例えば、ポリマーの改変および／又は粒子混成物における任意の結合した化合物の改変を介して、ナノ粒子に結合され得る。ナノ粒子における化合物の結合を行う手順の例は、実施例の節において説明される。ＢＡポリマー、ポリオールポリマー又は本明細書中で記載されるナノ粒子の他の構成要素（例えば、予め導入された目的の化合物）に化合物が結合するさらなる手順は、本開示を読むことにより、当業者によって同定され得る。

【0054】

幾つかの実施形態において、本明細書中で記載されるナノ粒子上に提示されたＢＡポリマーに結合した少なくとも１つの目的の化合物は、標的リガンドとして使用され得る薬剤である。詳細には、幾つかの実施形態において、このナノ粒子は、標的リガンドとして使用される１つ以上の薬剤とＢＡポリマー上で結合し、そして選択された標的に送達される１つ以上の薬剤とポリオールポリマーおよび／又はＢＡポリマー上で結合する。

【0055】

用語「標的リガンド」又は「標的薬剤」は、本開示において使用される場合、特定の標的に契合する目的のため、並びに詳細には、例えばナノ粒子の細胞レセプター結合を可能にすることによる特定の細胞認識の目的のために、ナノ粒子の表面上に提示され得る任意の分子を示す。好適なリガンドの例としては、ビタミン（例えば、葉酸）、タンパク質（例えば、トランスフェリンおよびモノクローナル抗体）、ペプチドおよび多糖類が挙げられるが、これらに限定されない。詳細には、標的リガンドは、特定の表面細胞レセプター、例えば抗ＶＥＧＦ、葉酸などの低分子、並びに他のタンパク質、例えばホロ－トランスフェリンなどに対する、抗体であってもよい。

【0056】

選択したリガンドは、当業者の理解するものであり、所望の送達の種類に依存して変動し得る。別の例として、このリガンドは、膜透過処理薬剤又は膜透過性薬剤、例えばＨＩＶ－１由来のＴＡＴタンパク質であってもよい。ＴＡＴタンパク質は、ウイルス転写活性化であり、活発に細胞核内に入り込む。Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ．９８，８７８６ ８７９１，（２００１）。ＢＡポリマーに結合した好適な標的リガンドは、代表的に、その末端にボロン酸が結合したポリ（エチレンオキシド）などの柔軟なスペーサーを含む（実施例９を参照されたい）。

【0057】

幾つかの実施形態において、ポリオールポリマーおよび／又はＢＡポリマー（標的リガンドを含む）の少なくとも１つの化合物は、化学的又は生物学的活性、例えば治療活性が発揮される標的、例えば個体に送達される薬剤、詳細には薬物であってもよい。

【0058】

本明細書中で記載されるナノ粒子を形成するためのポリオールポリマーおよびＢＡポリマーの節は、目的の化合物および標的の観点で実施され得る。詳細には、本明細書中で記載されるナノ粒子を形成するために好適なポリオール含有ポリマーおよび好適なＢＡポリマーの節は、候補ポリオールポリマーおよびＢＡポリマーを提供し、本開示を考慮したカップリング相互作用を形成することができるポリオールポリマーおよびＢＡポリマーを選択することによって実施され得、ここで、選択されたＢＡポリマーおよびポリオールポリマーは、ポリオールポリマーおよび／又はＢＡポリマーに含まれるか又は結合する目的の化合物および標的リガンドの観点で、ポリオールポリマーがＢＡポリマーよりも親水性であるような化学的組成を有する。表面ナノ粒子上でのＢＡポリマーおよびナノ粒子に対し外部の環境における関連の提示の検出は、実施例１２に説明されるように、ナノ粒子の表面の改変を実施し得るゼータ電位の検出によって実施され得る。（図６を参照されたい。）粒子の表面電荷および塩溶液中での粒子の安定性を検出するためのさらなる手順としては、実施例１２において例示されたもの（詳細には図７を参照されたい）などの粒子サイズの電荷の検出、並びに、当業者によって同定され得るさらなる手順が挙げられる。

【0059】

幾つかの実施形態において、ポリオール含有ポリマーは、以下の構造単位の少なくとも１つ以上を含み：

【0060】

【化1】

式中、
Ａは、以下の式：

【0061】

【化2】

ここで、
Ｒ_１およびＲ_２は、約１０ｋＤａ以下の分子量を有する任意の炭素ベースの基又は有機基から独立して選択され；
Ｘは、－Ｈ、－Ｆ、－Ｃ、－Ｎ又は－Ｏの１つ以上を含む脂肪族基から選択され；且つ
Ｙは、－ＯＨであるか、又はヒドロキシル（－ＯＨ）基を有する有機部分（－ＣＨ_２ＯＨ、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、－ＣＦ_２ＯＨ、－ＣＦ_２ＣＦ_２ＯＨおよびＣ（Ｒ_１Ｇ_１）（ＲＧ_２）（Ｒ_１Ｇ_３）ＯＨが挙げられるがこれらに限定されず、ここでＲ_１Ｇ_１、Ｒ_１Ｇ_２およびＲ_１Ｇ_３は、独立して有機ベースの官能基である）から独立して選択され、
且つ
Ｂは、第１のＡ部分のＲ_１およびＲ_２の１つを第２のＡ部分のＲ_１およびＲ_２の１つに連結する有機部分である。

【0062】

用語「部分」は、本明細書中で使用される場合、より大きな分子又は分子種の部分を構成する一連の原子を示す。詳細には、部分は、反復するポリマー構造単位の構成成分をいう。例示的な部分としては、酸又は塩基の種、糖、炭水化物、アルキル基、アリール基およびポリマー構造単位を形成するために有用な任意の他の分子構成成分が挙げられる。

【0063】

用語「有機部分」は、本明細書中で使用される場合、炭素原子を含む部分を示す。詳細には、有機部分としては、天然および合成の化合物、並びにヘテロ原子を含む化合物が挙げられる。例示的な天然有機部分としては、殆どの糖、幾つかのアルカロイドおよびテルペノイド、炭水化物、脂質および脂肪酸、核酸、タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸、ビタミン並びに脂肪および油が挙げられるが、これらに限定されない。合成有機基は、他の化合物との反応によって調製される化合物をいう。

【0064】

幾つかの実施形態において、１つ以上の目的の化合物は、（Ａ）、（Ｂ）又は（Ａ）および（Ｂ）に結合され得る。

【0065】

幾つかの実施形態において、Ｒ_１およびＲ_２は、独立して以下の式を有し：

【0066】

【化3】

式中、
ｄは、０～１００であり；
ｅは、０～１００であり；
ｆは、０～１００であり；
Ｚは、１つの有機部分を別の有機部分、詳細には、本明細書中で規定される部分Ａ又は部分Ｂに連結する共有結合であり、そして
Ｚ_１は、－ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＳＨおよび－ＣＯＯＨから独立して選択される。

【0067】

幾つかの実施形態において、Ｚは、－ＮＨ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）、－ＳＳ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＨ（＝ＮＨ_２ ^＋）－又は－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－から独立して選択される。

【0068】

ポリオール含有ポリマーの構造単位Ａが式（ＩＶ）を有する幾つかの実施形態において、Ｘは、Ｃ_ｖＨ_２ｖ＋１であってもよく、ここで、ｖ＝０～５であり、且つＹは、－ＯＨである。

【0069】

幾つかの実施形態において、Ｒ１および／又はＲ２は、式（Ｖ）を有し、ここで、Ｚは、－ＮＨ（＝ＮＨ_２ ^＋）－であり、且つ／又はＺ_１は、ＮＨ_２である。

【0070】

幾つかの実施形態において、本明細書中記載される粒子のポリオール含有ポリマー（Ａ）は、以下の式：

【0071】

【化4】

から独立して選択され、
式中、
スペーサーは、任意の有機部分（詳細には、必要に応じてヘテロ原子、例えば硫黄、窒素、酸素又はフッ素を含むアルキル基、フェニル基又はアルコキシ基が挙げられ得る）から独立して選択され、
アミノ酸は、遊離のアミン基および遊離のカルボン酸基を有する任意の有機基から選択され；
ｎは、１～２０であり；且つ
Ｚ_１は、－ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＳＨおよび－ＣＯＯＨから独立して選択される。

【0072】

幾つかの実施形態において、Ｚ１およびＮＨ２および／又は糖は、グルコース、フルクトース、マンニトール、スクロース、ガラクトース、ソルビトール、キシロース又はガラクトースなどの任意の単糖類であり得る。

【0073】

幾つかの実施形態において、本明細書中記載される粒子のポリオール含有ポリマーの１つ以上の構造単位（Ａ）は、以下の式：

【0074】

【化5】

から独立して選択され得る。

【0075】

幾つかの実施形態において、（Ｂ）は、官能基を介して２つの（Ａ）部分を連結する、任意の直鎖状、分枝鎖状、対称又は非対称の化合物によって、形成され得る。

【0076】

幾つかの実施形態において、（Ｂ）は、少なくとも２つの架橋可能な基が２つの（Ａ）部分を連結する化合物によって形成され得る。

【0077】

幾つかの実施形態において、（Ｂ）は、中性、カチオン性又はアニオン性の有機基を含み、その性質および組成は、共有結合的に又は非共有結合的に繋がれる化合物の化学的性質に依存する。

【0078】

アニオン性カーゴと一緒の使用のための（Ｂ）のカチオン性部分の例としては、アミジン基、第４級アンモニウム、第１級アミン基、第３級アミン基（そのｐＫａ未満にプロトン化した）第３級アミン基、およびイミダゾリウムを有する有機基が挙げられるが、これらに限定されない。

【0079】

カチオン性カーゴと一緒の使用のための（Ｂ）に含まれるアニオン性部分の例としては、式のスルホネート、式のニトレート、式のカルボキシレート、およびホスホネートを有する有機基が挙げられるが、これらに限定されない。

【0080】

詳細には、それぞれアニオン性カーゴおよびカチオン性カーゴと一緒の使用のための（Ｂ）の１つ以上のカチオン性又はアニオン性の部分は、独立して、以下の一般式を有し得る：

【0081】

【化6】

式中、Ｒ_５は、Ａが求核生基を含む場合Ａに共有結合し得る求電子性基である。この場合におけるＲ_５としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
他の幾つかの中でもとりわけ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｃｌ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＳ、－Ｃ（＝ＮＨ_２ ^＋）ＯＭｅ、－Ｓ（＝Ｏ）ＯＣｌ－、－ＣＨ_２Ｂｒ、アルキルおよび芳香族エステル、末端アルキン、トシレート、およびメシレート。部分Ａが求電子末端基を含む場合、Ｒ_５は、－ＮＨ_２（第１級アミン）、－ＯＨ、－ＳＨ、Ｎ_３および第２級アインなどの求核性基を有する。

【0082】

詳細には、部分（Ｂ）がアニオン性カーゴと一緒に用いられるカチオン性部分（Ｂ）である場合、「有機基」は、ｍ≧１であるＣ_ｍＨ_２ｍおよび他のヘテロ原子から成る一般式を有する骨格を有し得、且つ以下を含む官能基の少なくとも１つを含まなければならない：式（ＸＩＩＩ）のアミジン、式（ＸＩＶ）の第４級アンモニウム、式（ＸＶ）の第１級アミン基、式（ＸＶＩ）の第２級アミン基、式（ＸＶＩＩ）の第３級アミン基（そのｐＫａ未満にプロトン化されている）、並びに式（ＸＶＩＩＩ）のイミダゾリウム。

【0083】

【化7】

【0084】

部分（Ｂ）がカチオン性カーゴと一緒に用いられるアニオン性部分（Ｂ）である実施形態において、「有機基」は、ｍ≧１であるＣ_ｍＨ_２ｍおよび他のヘテロ原子から成る一般式を有する骨格を有し得、且つ以下を含む官能基の少なくとも１つを含まなければならない：式（ＸＩＸ）のスルホネート、式（ＸＸ）のニトレート、式（ＸＸＩ）のカルボキシレート、並びに式（ＸＸＩＩ）のホスホネート。

【0085】

【化8】

【0086】

（Ｂ）がカルボキシレート（ＸＸＩ）によって構成される場合の実施形態において、第１級アミン又はヒドロキシル基を含む化合物もまた、ペプチド結合又はエステル結合の形成を介して結合され得る。

【0087】

（Ｂ）が式（ＸＶ）の第１級アミン基および／又は式（ＸＶＩ）の第２級アミン基から構成される場合の実施形態において、カルボン酸基を具組む化合物は、ペプチド結合の形成を介して結合され得る。

【0088】

幾つかの実施形態において、部分（Ｂ）は、独立して以下から選択される：

【0089】

【化9】

ここで、
ｑは、１～２０であり；且つ詳細には、５であってもよく、
ｐは、２０～２００であり；且つ
Ｌは、脱離基である。

【0090】

用語「脱離基」は、本明細書中で使用される場合、異方性結合解列において一対の電子を分離する分子断片を示す。詳細には、脱離基は、アニオン又は中性の分子であり、脱離基が分離する能力は、共役酸のｐＫ_ａに相関し、低いｐＫ_ａが、よりよい脱離基能力に関連する。アニオン性化合物の例としては、Ｃｌ^－、Ｂｒ^－およびＩ^－などのハロゲン化物およびスルホネートエステル、例えば、パラ－トルエンスルホネート又は「トシレート」（ＴｓＯ^－）が挙げられる。中性分子脱離基の例は、水（Ｈ_２Ｏ）、アンモニア（ＮＨ_３）およびアルコール（ＲＯＨ）である。

【0091】

詳細には、幾つかの実施形態において、Ｌは、塩素（Ｃｌ）、メトキシ（ＯＭｅ）、ｔブトキシ（ＯｔＢＵ）又はＮスクシンイミド（ＮＨＳ）であってもよい。

【0092】

幾つかの実施形態において、式（Ｉ）の構造単位は、以下の式を有し得る：

【0093】

【化10】

【0094】

幾つかの実施形態において、式（ＩＩ）の構造単位は、以下の式を有し得る：

【0095】

【化11】

【0096】

幾つかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の構造単位は、以下の式を有し得る：

【0097】

【化12】

の有機部分であり、ここで、
ｎは、１～２０であり；且つ詳細には、１～４である。

【0098】

幾つかの実施形態において、ポリオール含有ポリマーは、以下の式を有し得る：

【0099】

【化13】

【0100】

幾つかの実施形態において、ボロン酸含有ポリマーは、少なくとも１つの末端ボロン酸基を含み、以下の構造を有する：

【0101】

【化14】

式中、
Ｒ_３およびＲ_４は、任意の親水性有機ポリマーから独立して選択され、詳細には、独立して任意のポリ（エチレンオキシド）および双性イオン性ポリマーであってもよく、
Ｘ_１は、－ＣＨ、－Ｎ又は－Ｂの１つ以上を含有する有機部分であり、
Ｙ_１は、場合によりオレフィン基又はアルキニル基、又は芳香族基（例えば、フェニル、ビフェニル、ナフチル又はアントラセニル）を含むｍ≧１である式－Ｃ_ｍＨ_２ｍ－を有するアルキル基であってもよく、
ｒは、１～１０００であり；
ａは、０～３であり；且つ
ｂは、０～３であり；
且つ式中、官能基１および官能基２は、同一であるか又は異なっており、標的リガンドに結合可能であり、詳細には、タンパク質、抗体又はペプチド、又は－ＯＨ、－ＯＣＨ_３又は－（Ｘ_１）－（Ｙ_１）－Ｂ（ＯＨ）_２－などの末端基である。

【0102】

幾つかの実施形態において、Ｒ_３およびＲ_４は、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｔであり、ここで、ｔは、２～２０００であり、詳細には、１００～３００である。

【0103】

幾つかの実施形態において、Ｘ_１は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－又は－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－であり、且つ／又はＹ_１はフェニフェニル基である。

【0104】

幾つかの実施形態において、ｒは１であってもよく、ａは０であってもよく、且つｂは１であってもよい。

【0105】

幾つかの実施形態において、官能基１および官能基２は、同一であるか又は異なっており独立して、以下から選択される：－Ｂ（ＯＨ）_２、－ＯＣＨ_３、－ＯＨ。

【0106】

詳細には、式（ＸＸＸＩ）の官能基１および／又は２は、カーゴに結合可能な官能基であってもよく、詳細には、標的リガンド、例えば、タンパク質、抗体又はペプチドであってもよく、又は、－ＯＨ、－ＯＣＨ_３又は－（Ｘ）－（Ｙ）－Ｂ（ＯＨ）_２などの末端基であってもよい。

【0107】

用語「官能基」は、本明細書中で使用される場合、分子構造又はその一部の特徴的化学反応を担う、分子構造内又はその一部の原子の特定の群を示す。官能基の例としては、炭化水素、ハロゲン含有基、酸素含有基、窒素含有基並びにリンおよび硫黄含有基が挙げられ、全ては当業者によって同定され得る。詳細には、本開示の意味における官能基としては、カルボン酸、アミン、トリアリールホスフィン、アジド、アセチレン、スルホニルアジド、チオアジドおよびアルデヒドが挙げられる。詳細には、例えば、標的リガンドにおける対応する官能基に結合可能な官能基は、以下の結合パートナーを含むように選択され得る：カルボン酸基およびアミン基、アジドおよびアセチレン基、アジドおよびトリアリールホスフィン基、スルホニルアジドおよびチオアジド、並びにアルデヒドおよび第１級アミン。さらなる官能基は、本開示を読むことにより、当業者によって理解され得る。本明細書中で使用される場合、用語「対応する官能基」とは、別の官能基と反応し得る官能基をいう。従って、互いに反応し得る官能基は、対応する官能基ということができる。

【0108】

末端基は、マイクロ分子又はオリゴマー分子の末端である構造単位を示す。例えば、ＰＥＴポリエステルの末端基は、アルコール基又はカルボン酸基であり得る。末端基は、モル質量を決定するために使用され得る。末端基の例は、以下を含む：－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、ＮＨ_２およびＯＣＨ_３。

【0109】

幾つかの実施形態において、ボロン酸含有ポリマーは、以下の式を有し得る：

【0110】

【化15】

式中、ｓは、２０～３００である。

【0111】

本開示のナノ粒子に結合可能な薬剤および標的リガンドの例は、有機分子又は無機分子を含み、これらとしては、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、多糖類、マクロ分子複合体（タンパク質とポリヌクレオチド、糖類および／又は多糖類との混合物、ウイルス、放射性同位体を有する分子、抗体又は抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。

【0112】

用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、ヌクレオチド、ヌクレオシド又はそれらのアナログを含む２つ以上のモノマーから成る有機ポリマーを示す。用語「ヌクレオチド」は、プリン塩基又はピリミジン塩基、並びにリン酸基に結合したリボース糖又はデオキシリボース糖から成る幾つかの化合物のいずれかをいい、核酸の基本的構造単位である。用語「ヌクレオシド」は、デオキシリボース又はリボースと合わさったプリン塩基又はピリミジン塩基から成る化合物（例えば、グアノシン又はアデノシン）をいい、特に核酸において見出される。用語「ヌクレオチドアナログ」又は「ヌクレオシドアナログ」は、１つ以上の個々の原子が異なる原子又は異なる官能基と置き換えられているヌクレオチド又はヌクレオシドを、それぞれいう。従って、用語「ポリヌクレオチド」としては、任意の長さの核酸、詳細には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらのアナログおよび断片が、挙げられる。３つ以上のヌクレオチドのポリヌクレオチドはまた、「ヌクレオチドオリゴマー」又は「オリゴヌクレオチド」ともいう。

【0113】

用語「アプタマー」は、本明細書中で使用される場合、特定の標的に結合するオリゴ核酸又はペプチド分子を示す。詳細には、ムチン酸アプタマーは、例えば、インビトロ選択の繰り返し、すなわち、ＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を通して、種々の分子標的（例えば低分子、タンパク質、核酸、並びにさらに細胞、組織および生物ですら）に結合するよう操作されている核酸種を含み得る。アプタマーは、抗体のそれと競合する分子認識特性を提供するので、バイオテクノロジー用途および治療用途において有用である。ペプチドアプタマーは、細胞の内側のタンパク質－タンパク質相互作用に特異的に結合し且つこれらに干渉するように設計されているペプチドである。詳細には、ペプチドアプタマーは、例えば、酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）システムに由来する選択戦略に従って、引き出され得る。詳細には、この戦略に従い、転写因子結合ドメインに結合する可変ペプチドアプタマーループが、転写因子活性化ドメインに結合した標的タンパク質に対してスクリーニングされる。ペプチドアプタマーのその標的へのこの選択戦略を介したインビボ結合は、下流酵母マーカー遺伝子の発現として検出される。

【0114】

用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、２つ以上のアミノ酸モノマーおよび／又はそのアナログから構成される有機の直鎖状、環状又は分枝鎖状のポリマーを示す。兵庫「ポリペプチド」は、完全長のタンパク質およびペプチド、並びにそれらのアナログおよび断片を含む、任意の長さのアミノ酸ポリマーを含む。３以上のアミノ酸のポリペプチドもまた、タンパク質オリゴマー、ペプチド又はオリゴペプチドと呼ばれる。詳細には、用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、通常、５０未満のアミノ酸モノマーを有するポリペプチドを示す。本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」、「アミノ酸モノマー」又は「アミノ酸残基」は、２０の天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、および人工アミノ酸のいずれかをいい、ＤおよびＬの光学異性体の両方を含む。詳細には、天然に存在しないアミノ酸として、天然に存在するアミノ酸のＤ立体異性体が挙げられる。（これらは、有用なリガンド構築ブロックを含む。何故なら、酵素分解を受けにくいからである。）用語「人工アミノ酸」は、標準的アミノ酸カップリング科学を用いて容易にカップリングされ得るが、天然に存在するアミノ酸に似ていない分子構造を有する分子を示す。用語「アミノ酸アナログ」は、１つ以上の個々の原子が、異なる原子、同位体又は異なる官能基のいずれかと置換されているが、それ以外ではこのアナログが由来する元のアミノ酸と同一であるアミノ酸をいう。これらの全てのアミノ酸は、標準的アミノ酸カップリング化学を用いて、ペプチド又はポリペプチド内に合成的に組み込まれ得る。用語「ポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、１つ以上のモノマー又はアミノ酸モノマー以外の構築ブロックを含むポリマーを含む。モノマー、サブユニット、又は構築ブロックの用語は、適切な条件下で同じ又は異なる化学的性質の別のモノマーと化学的に結合してポリマーを形成できる化学化合物を示す。用語「ポリペプチド」は、１つ以上の構築ブロックが、アミド結合又はペプチド結合以外の化学的結合により互いに共有結合するポリマーを含むようさらに企図される。

【0115】

用語「タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、他のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、代謝物、ホルモン、ケモカインおよび低分子を含む他の生物分子との相互作用に参加できる、特定の二次構造および三次構造を有するポリペプチドを示すが、これらに限定されない。本明細書中で記載されるタンパク質の例は、抗体である。

【0116】

用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、抗原による刺激の後に活性型Ｂ細胞によって産生され、抗原に特異的に結合して生物学的システムにおける免疫応答を促進できる種類のタンパク質をいう。完全抗体は、代表的に、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む４つのサブユニットから成る。用語抗体は、天然および合成の抗体を含み、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又はそれらの断片を含むが、これらに限定されない。抗体の例としては、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭなどが挙げられる。断片の例としては、Ｆａｂ Ｆｖ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２等が挙げられる。モノクローナル抗体は、「エピトープ」と呼ばれる別の生物分子の１つの特定の空間的および極性の機構に対し特異的に結合可能であり、従って、相補的であると定義される抗体である。幾つかの形態において、モノクローナル抗体はまた、同じ構造を有してもよい。ポリクローナル抗体は、異なるモノクローナル抗体の混合物をいう。幾つかの形態において、ポリクローナル抗体は、少なくとも２つのモノクローナル抗体が異なる抗原性エピトープに結合する、モノクローナル抗体の混合物であってもよい。異なる抗原性エピトープは、同じ標的、異なる標的又は組み合わせに対するものであってもよい。抗体は、宿主の免疫化および血清の収集（ポリクローナル）、又は継続的ハイブリドーマ細胞株の調製および分泌タンパク質の収集（モノクローナル）などの当該分野で周知の技術によって、調製され得る。

【0117】

幾つかの実施形態において、ポリオールポリマーは、図１および２の図解に従って、１つ以上の送達される目的の化合物との非共有結合複合体を形成するか又は連結を形成する。

【0118】

幾つかの実施形態において、ナノ粒子構造は、薬剤およびポリオール含有ポリマーを含み、この薬剤は、共有結合によってポリオールポリマーに連結される。薬剤と結合体化したポリオールポリマーの例は、実施例１６～２１に詳細に説明される。これらの実施形態において、薬剤に結合体化したポリオールポリマー（本明細書中で「ポリオールポリマー－薬剤複合体」と呼ぶ）は、ナノ粒子を形成し、この構造は、その表面上に、ＢＡ分子との相互作用のために部位を提示する。

【0119】

幾つかの実施形態において、このナノ粒子は、立体安定性および／又はナノ粒子の標的官能性を提供するように形成されたＢＡポリマーをさらに含む。詳細には、これらの実施形態において、ＢＡポリマーの付加は、自己凝集および他のナノ粒子との望まぬ相互作用の最小化を可能にし、従って、塩安定性および血清安定性の向上を提供する。例えば、立体安定性は、本明細書中で、実施例１２において記載されるナノ粒子の例によって説明されるように、ＰＥＧを有するＢＡポリマーによって提供される。

【0120】

このような実施形態において、このナノ粒子の構造は、先行技術の薬剤送達方法を凌ぐ幾つかの利点、例えば、１つ以上の薬剤の制御放出を提供する能力を提供する。この特徴は、例えば、薬剤とポリオールポリマーとの間の生分解性エステル結合の使用によって、提供され得る。当業者は、この目的のために好適な、他の連結の可能性を理解する。これらの実施形態において、別の利点は、ＢＡポリマー部分を介した薬剤の特異的標的を提供することである。

【0121】

幾つかの実施形態において、ＢＡポリマーは、ＭＲＩ又は他の類似の技術において画像化剤として使用され得るフッ化ボロン酸（実施例７）又はフッ化開裂可能ボロン酸（実施例８）を含み得る。このような画像化剤は、ナノ粒子によって送達される薬剤の薬物動態学もしくは薬力学を追跡するために通用であり得る。

【0122】

幾つかの実施形態において、ナノ粒子構造は、薬剤およびポリオールポリマーを含み、ここで、このナノ粒子は、改変型リポソームである。これらの実施形態において、この改変型リポソームは、共有結合を介してポリオールポリマーと結合体化した脂質を含み、それによって、このリポソームの表面は、ポリオールポリマーを提示する。これらの実施形態において、薬剤を送達させるように形成された改変型リポソームは、リポソームナノ粒子内に含まれる。

【0123】

用語「リポソーム」は、本明細書中で使用される場合、脂質から構成される小胞性構造を示す。脂質は、代表的に、長い炭化水素鎖および親水性の頭部基を含む尾部基を有する。脂質は、内部が送達される薬剤を含むのに好適な水性環境である、脂質二重層を形成するように配置される。このようなリポソームは、好適な標的リガンド又は細胞表面レセプター又は他の目的の標的による特異的認識のための分子を含み得る外表面を提示する。

【0124】

用語「結合体化した」は、本明細書中で使用される場合、１つの分子が、第２の分子との共有結合を形成し、一重および多重（例えば、二重）結合（例えば、Ｃ＝Ｃ－Ｃ＝Ｃ－Ｃ）を含んで互いに影響し合い、電子非局在化をもたらすことを示す。

【0125】

本開示のなお他の実施形態において、ナノ粒子構造は、薬剤およびポリオールを含み、ここで、このナノ粒子は、改変型ミセルである。これらの実施形態において、改変型ミセルは、疎水性ポリマーブロックを含むように改変されたポリオールポリマーを含む。

【0126】

用語「疎水性ポリマーブロック」は、本開示において使用される場合、それ自体が疎水性であるポリマーのセグメントを示す。

【0127】

用語「ミセル」は、本明細書中で使用される場合、脂質中に分散した分子の凝集体をいう。水溶液中の代表的なミセルは、周囲溶媒と接触する領域における親水性「頭部」領域を有する凝集体を形成し、疎水性の一重尾部領域を、ミセル中心において隔離する。本開示において、頭部領域は、例えば、ポリオールポリマーの表面領域であってもよく、他方で、尾部領域は、例えば、ポリオールポリマーの疎水性ポリマーブロック領域であってもよい。

【0128】

これらの実施形態において、疎水性ポリマーブロックを有するポリオールポリマーは、送達される薬剤と混合した際、ナノ粒子内に送達される薬剤を有する改変型ミセルであるナノ粒子を形成するように配置する。このようなナノ粒子実施形態は、ＢＡポリマーと相互作用するために好適なポリオールポリマーをその表面上に提示する。このＢＡポリマーは、前の実施形態に従う標的官能性を有するか又は有さない。これらの実施形態において、その目的のために使用可能なＢＡポリマーとしては、式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、親水性のＡおよび疎水性のＢを有するものが挙げられる。この相互作用は、上述の他のナノ粒子実施形態について提供された利点と同様又は類似の利点を提供する。

【0129】

幾つかの実施形態において、ナノ粒子又は関連の構成要素は、許容可能なビヒクルと一緒に、組成物中に含められてもよい。用語「ビヒクル」は、本明細書中で使用される場合、通常、活性成分として組成物中に含められるナノ粒子についての溶媒、キャリア、結合剤、賦形剤又は希釈剤として作用する種々の培地のいずれかを示す。

【0130】

この組成物が個体に投与される幾つかの実施形態において、この組成物は、製薬組成物であってもよく、許容可能なビヒクルは、製薬的に許容可能なビヒクルであってもよい。

【0131】

幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、製薬組成物中に、賦形剤又は希釈剤と一緒に含まれてもよい。詳細には、幾つかの実施形態において、製薬組成物は、ナノ粒子を、１つ以上の適合性且つ製薬的に許容可能なビヒクル、詳細には製薬的に許容可能な希釈剤又は賦形剤と組み合わせて含むことが、開示される。

【0132】

用語「賦形剤」は、本明細書中で使用される場合、医薬の活性成分のためのキャリアとして使用される不活性物質を示す。本明細書中で開示される製薬組成物のために好適な賦形剤は、このナノ粒子を吸収する個体の身体の能力を増強する、任意の物質を含む。好適な賦形剤はまた、ナノ粒子を含む処方物を、簡便且つ正確な投薬を可能にするよう嵩増しするために使用され得る任意の物質を含む。単回用量におけるその使用に加え、賦形剤は、ナノ粒子の操作を助けるために、製造手順において使用されてもよい。投与の経路および医薬の形態に依存し、異なる賦形剤が、使用され得る。賦形剤の例としては、粘着防止剤、結合剤、コーティング崩壊剤、フィラー、矯味矯臭剤（例えば、甘味料）および着色剤、滑剤、滑沢剤、保存料、吸着剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0133】

用語「希釈剤」は、本明細書中で使用される場合、組成物の活性成分を希釈するか又は運搬するために供される希釈する薬剤を示す。好適な希釈剤としては、医薬調製物の粘度を下げることができる任意の物質を含む。

【0134】

特定の実施形態において、組成物、詳細には、製薬組成物は、非経口投与、より詳細には静脈内投与、皮内投与および筋肉内投与を含む全身的投与のために処方され得る。

【0135】

非経口投与のための組成物の例としては、滅菌水溶液、注射可能な溶液又はナノ粒子を含む懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、非経口投与のための組成物は、使用の際に、フリーズドライ凍結乾燥形態に予め調製された粉末状組成物を、生物学的に適合性の水性液体（蒸留水、生理学的溶液又は他の水溶液）に溶解することよって調製されてもよい。

【0136】

用語「凍結乾燥」（フリーズドライ又は低温乾燥）は、代表的には、腐敗し易い物質を保存するか又はその物質をより輸送し易くするために使用される、脱水プロセスを示す。フリーズドライは、物質を凍結させ、次いで、周囲圧を減圧させ、物質内の凍結した水が固相から気体へ直接消化するために充分な充分な熱を加えることによって成される。

【0137】

製薬用途において、フリーズドライは、しばしば、ワクチンおよび他の注射用薬剤などの製品の使用期限を延ばすために使用される。物質から水を除去し、この物質をバイアル中に密封することによって、この物質は、容易に保存、輸送および注射のためにその元の形態に再構築可能である。

【0138】

幾つかの実施形態において、本明細書中で記載されるナノ粒子は、所定の標的に送達される。幾つかの実施形態において、この標的は、インビトロの生物システムであり、この方法は、標的を本明細書中で記載されるナノ粒子に接触されることを含む。

【0139】

幾つかの実施形態において、この方法は、個体への薬剤の送達のために提供され、ここで、この方法は、種々の本開示の実施形態に従って好適なナノ粒子を処方することを含む。このナノ粒子はまた、本開示の幾つかの実施形態に従って、製薬的に許容可能な組成物に処方されてもよい。この方法は、被検体にナノ粒子を送達することを含む。ナノ粒子を個体に送達するため、ナノ粒子又はナノ粒子処方物は、経口で与えられても、非経口で与えられても、局所的に与えられても、又は直腸的に与えられてもよい。これらは、各投与経路に好適な形態で送達される。例えば、ナノ粒子組成物は、丸剤又はカプセルの形態で投与されても、注射、吸入、目薬、軟膏、坐剤、点滴によって投与されても、坐剤によって直腸的に投与されてもよい。

【0140】

用語「個体」は、本明細書中で使用される場合、１つの生物を含み、これらとしては、植物又は動物が挙げられ、詳細には、より高等な動物が挙げられ、詳細には、脊椎動物、例えば哺乳動物が挙げられ、詳細には、ヒトが挙げられるが、これらに限定されない。

【0141】

語句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、本明細書中で使用される場合、経腸投与および局所投与以外の、通常、注射による投与の様式を意味し、非限定で、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内（intradennal）、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内および胸骨内（intrastemal）の、注射および点滴が挙げられる。

【0142】

語句「全身的投与」、「全身的に投与した」、「末梢投与」および「末梢に投与した」は、本明細書中で使用される場合、ナノ粒子又はその組成物を、中枢神経系内に直接投与する以外で投与することにより、それが個体のシステムに入り、従って、代謝などのプロセスを受ける投与、例えば皮下投与を意味する。

【0143】

本明細書中で記載される製薬組成物中の活性成分又は薬剤の実際の投薬レベルは、特定の個体、組成物および投与の様式について、この個体に毒となることなく所望の治療応答を達成するために有効な活性薬剤の量を得るために、変動し得る。

【0144】

これらの治療用ポリマー結合体は、ヒトおよび他の動物に、経口投与、スプレーによるなどの鼻投与、直腸投与、膣内投与、非経口投与、大槽内投与並びに粉末、軟膏又は滴剤などによる頬内および舌下を含む局所投与を含む、任意の好適な投与の経路によって、療法のために投与され得る。

【0145】

選択した投与の経路に関わりなく、好適な水和形態および／又は本発明の製薬の形態で使用され得る治療用ポリマー結合体は、陶業者に公知の従来方法により、製薬的に許容可能な投薬形態で処方され得る。

【0146】

詳細には、幾つかの実施形態において、送達される化合物は、個体の症状を処置するか又は予防するための薬物である。

【0147】

「薬物」又は「治療剤」は、個体における症状の処置、予防又は診断において使用され得るか、又はさもなければ、個体の物理的又は精神的に良好な状態を増強するために使用され得る、活性薬剤を示す。

【0148】

用語「症状」は、本明細書中で使用される場合、通常、完全な、物理的、精神的およびおそらく社会的に良好な状態に伴う、全体としてもしくは１つ以上のその部分の、個体の物理的状態と適合しない、全体としてもしくは１つ以上のその部分の、個体の身体の物理的状態を示す。本明細書中で記載される症状としては、障害および疾患が挙げられるがこれらに限定されない。ここで、用語「障害」は、身体もしくはその何らかの一部の機能異常を伴う生きている個体の症状を示し、並びに用語「疾患」は、身体もしくはその何らかの一部の正常機能が損なわれていて、代表的には、識別兆候又は症候によって顕在化する、生きている個体の症状を示す。症状の例としては、傷害、機能不全、障害（精神障害および身体障害を含む）、症候群、感染、個体の異常行動、並びに個体の身体又はその一部の構造および機能の異常変化が挙げられるが、これらに限定されない。

【0149】

「処置」は、本明細書中で使用される場合、症状に対する、薬学的又は外科的な、医学的手当ての一部である任意の活動を示す。

【0150】

用語「予防」は、本明細書中で使用される場合、個体の症状からの死亡率又は罹患率の負担を低減する、任意の活動を示す。これは、以下の一次、二次および三次の予防レベルで起こる：（ａ）一次予防は、疾患の発症を避ける；（ｂ）二次予防は、初期疾患処置を目指し、それにより、疾患の進行および症候の出現を予防する介入の機会を増やす；並びに（ｃ）三次予防は、機能の回復および疾患関連の合併症を軽減することによって、既に発症した疾患の悪影響を軽減する。

【0151】

本明細書中で記載されるナノ粒子によって送達され、薬物として好適である化合物の例は、電磁放射（例えば^１０Ｂ同位体）を発し、放射線処置において用いられることができる化合物（例えば、ホウ素中性子補足）を含む。さらなる治療剤は、任意の親油性又は親水性の、合成又は天然に存在する、生物学的に活性な治療剤（当該分野で公知のものを含む）を含む。Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，Ａｎ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，１３ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｊ．このような治療剤の例としては、低分子医薬品、抗生物質、ステロイド、ポリヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ウイルスおよびキメラポリヌクレオチド）、プラスミド、ペプチド、ペプチド断片、低分子（例えば、ドキソルビシン）、キレート剤（例えば、デフェロキサミン（ＤＥＳＦＥＲＡＬ））、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、天然産物（例えば、タキソール、アンホテリシン）、並びに他の生物学的に活性な高分子、例えば、タンパク質および酵素などが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で記載されたナノ粒子と共に治療剤として使用され得る活性剤（治療剤）を列挙した米国特許第６，０４８，７３６号もまた、参考にされたい。低分子治療剤は、混成粒子中の治療剤であるのみでなく、さらなる実施形態においては、混成物中のポリマーに共有結合し得る。幾つかの実施形態において、共有結合は、可逆的なであり（例えば、プロドラッグ形態又はジスルフィド結合などの生分解性連結を通す）、治療剤を送達する別の方法を提供する。幾つかの実施形態において、本明細書中で記載されるナノ粒子によって送達され得る治療剤としては、化学療法剤、例えばエポチロン、カンプトテシンベースの薬物、タキソール、又はプラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドアプタマーなどの核酸又はこれらの組み合わせ、並びに本開示を読んだ当業者によって同定され得る他の薬物が、挙げられる。

【0152】

幾つかの実施形態において、送達される化合物は、個体の細胞又は組織を画像化するために好適である。本明細書中で記載されるナノ粒子によって送達され得、且つ画像化のために好適な化合物の例は、例えばＭＲ画像化のための^１９Ｆ同位体、ＰＥＴ画像化のための^１８Ｆ又は^６４Ｃｕなどの同位体を含む化合物を含む。

【0153】

詳細には、本明細書中で記載されるナノ粒子は、^１９Ｆ含有ＢＡポリマーを含むように作られ得る。例えば、^１９Ｆ原子は、開裂不能又は開裂可能なＢＡポリマー化合物内に組み込まれ得る。^１９Ｆ原子が存在し得る他の位置は、ＢＡポリマー構成要素上、ポリオールポリマー構成要素上、又は送達される薬剤上である。これらおよび他の改変は、当業者に明らかである。

【0154】

幾つかの実施形態において、本明細書中で記載されるナノ粒子は、農産業において使用される化学物質を送達するために使用され得る。本発明の別の実施形態において、本明細書中で記載されるナノ粒子によって送達される薬剤は、微生物学および農業の有用性を有する、生物学的に活性な化合物である。これらの生物学的に活性な化合物としては、当該分野で公知のものが挙げられる。例えば、好適な農業的生物学的活性化合物としては、肥料、殺真菌剤、除草剤、殺昆虫剤および殺うどんこ病菌剤が挙げられるが、これらに限定されない。殺微生物剤はまた、都市用水および産業用水（例えば冷却水、製紙における白水系）のシステムを処理するためにも使用され得る。微生物の攻撃又は分解を受けやすい水性系はまた、革産業、織物産業、およびコーティング又は塗料産業においても見出される。このような殺微生物剤の例およびその使用は、個々に、および組み合わせて、米国特許第５，６９３，６３１号、同第６，０３４，０８１号、および同第６，０６０，４６６号に記載され、これらは、本明細書中で参考とし組み込まれる。上で記載されたものなどの活性薬剤を含む組成物は、活性成分事態が公知であるように、同じ様式で使用され得る。とりわけ、このような使用は製薬的な使用ではないので、混成物のポリマーは、製薬的使用において必要とされる毒性プロフィールに適合する必要はない。

【0155】

特定の実施形態において、ポリオールポリマーとＢＡポリマーとを含むナノ粒子はまた、示された化合物、詳細にはナノ粒子を用いる薬剤のいずれかを送達するために好適なシステムに、含まれてもよい。このシステムの幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、個体への投与のためのナノ粒子を調製するために好適な構成要素を提供する。

【0156】

本明細書中で記載されるシステムは、部分のキットの形態で提供されてもよい。例えば、ポリオールポリマーおよび／又はＢＡポリマーは、分子のみで含まれても、又は好適な賦形剤、ビヒクル又は希釈剤の存在下で含まれてもよい。

【0157】

部分のキットにおいて、ポリオールポリマー、ＢＡポリマーおよび／又は送達される薬剤は、独立して、おそらくは好適なビヒクルキャリア又は補助薬剤と一緒に組成物中含まれて、キット中に含められる。例えば、ポリオールポリマーおよび／又はＢＡポリマーは、１つ以上の組成物のみに含まれてもよく、および／又は好適なベクターに含まれてもよい。また、送達される薬剤は、好適なビヒクルキャリア又は補助剤と共に、組成物中に含まれてもよい。あるいは、この薬剤は、末端使用者によって与えられ、部分のキットに含まれなくてもよい。さらに、ポリオールポリマー、ＢＡポリマーおよび／又は薬剤は、ナノ粒子中への適切な組み込みに好適な種々の形態で含まれ得る。

【0158】

さらなる構成要素はまた、微小流体チップ、参照標準、緩衝液、および本開示を読んで当業者によって同定され得るさらなる構成要素に含まれ、これを構成し得る。

【0159】

本明細書中で開示される部分のキットにおいて、キットの構成要素は、好適な相互作用および本明細書中で開示される方法を実施するために必須の他の試薬と共に提供されてもよい。幾つかの実施形態において、個のキットは、別個の容器中に組成物を含んでもよい。アッセイを行うための指示書、例えば書かれたか又はオーディオの、紙上又は電子支持体（例えば、テープ又はＣＤ－ＲＯＭ）上の指示書もまた、キット中に含まれてもよい。このキットはまた、使用される特定の方法に依存して、他の包装の試薬および材料（例えば洗浄緩衝液など）を含んでもよい。

【0160】

組成物の好適なキャリア薬剤又は補助薬剤、および一般的にキットの製造および包装に関するさらなる詳細は、本開示を読んだ当業者によって同定され得る。

【0161】

幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、ナノ粒子の個々の構成要素を調製し、その後、所望の混成ナノ粒子構造に到達するように、この構成要素を種々の順番で混合することによって、調製され得る。構成要素の調製および混合は、当業者に公知の好適な溶液において実施される。

【0162】

用語「混合」は、本明細書中で使用される場合、目的の分子を含む１つの溶液と別の目的の分子を含む別の溶液との添加を示す。例えば、本開示の文脈において、ポリオールポリマーの水溶液が、ＢＡポリマーの水溶液と、混合され得る。

【0163】

用語「溶液」は、本明細書中で使用される場合、目的の分子を含む任意の液相サンプルを示す。例えば、ポリオールポリマーの水溶液は、水中又は任意の緩衝溶液、詳細には水溶液中に希釈されたポリオールポリマーを含み得る。

【0164】

幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、ポリオールポリマーを、送達される薬剤（図１および２）と混合し、ポリオールポリマー－薬剤ナノ粒子を形成することによって、調製され得る。他の実施形態において、ナノ粒子は、ＢＡポリマーをこのポリオールポリマー－薬剤ナノ粒子とさらに混合することによって、調製され得る。他の実施形態において、ナノ粒子は、ポリオールポリマーとＢＡポリマーとを混合し、その後、送達される薬剤を混合することによって、調製され得る。なお他の実施形態において、ナノ粒子は、ポリオールポリマーとＢＡポリマーと、送達される薬剤とを同時に混合することによって、調製され得る。

【0165】

幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、本開示の種々の実施形態に従ってポリオールポリマー－薬剤結合体を形成することによって、ポリオールポリマー－薬剤結合体から構成されるナノ粒子を調製することよって、調製される。他の実施形態において、ポリオールポリマー－薬剤結合体から構成されるナノ粒子は、このナノ粒子を好適な水溶液中に溶解することによって、調製され得る。なおさらなる実施形態において、ポリオールポリマー－薬剤結合体から構成されるナノ粒子は、ポリオールポリマー－薬剤結合体を、標的リガンドを提供するか又は提供しないＢＡポリマーと混合することによって、調製され得る。

【0166】

幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、ポリオールポリマーを送達される薬剤を有する疎水性ポリマーブロックと混合することにより、本開示の実施形態に従う改変型ミセルを調製することによって、調製され得る。他の実施形態において、ナノ粒子は、この改変型ミセルをＢＡポリマーとさらに混合することによって、調製され得る。なお他の実施形態において、ナノ粒子は、ポリオールポリマーとＢＡポリマーとを混合し、その後、送達される薬剤を混合することにより、改変型ミセルであるナノ粒子を調製することによって、調製され得る。

【0167】

本開示の幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、ポリオールポリマーに結合体化した脂質をＢＡポリマーとおよび／又は送達される薬剤と混合し、改変型リポソームを調製することによって、調製され得る。種々の実施形態において、ナノ粒子は、ポリオールポリマーと結合体化した脂質をＢＡポリマーとを混合し、その後、送達される薬剤を混合することによって、調製され得る。他の実施形態において、ナノ粒子は、ポリオールポリマーと結合体化した脂質を送達される薬剤を混合することによって、調製され得る。他の実施形態において、ナノ粒子は、ポリオールポリマーと結合体化した脂質を送達される薬剤と混合し、その後、ＢＡポリマーと混合して、改変型リポソームであるナノ粒子を調製することによって、調製され得る。

【0168】

本開示の幾つかの実施形態に従うナノ粒子の形成は、当業者に公知の技術および手順によって、分析され得る。例えば、幾つかの実施形態において、ゲルシフト法が、ナノ粒子内への核酸薬剤の取り込みをモニタリングして測定するために、使用される（実施例１０）。幾つかの実施形態において、好適なナノ粒子サイズおよび／又はゼータ電位が、公知の方法を用いて選択され得る（実施例１１）。

【0169】

組成物の好適なキャリア薬剤又は補助薬剤、および一般的にキットの製造および包装に関するさらなる詳細は、本開示を読んだ当業者によって同定され得る。

【0170】

ニトロフェニルボロン酸を有するポリマーを有するナノ粒子
ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーに結合体化したポリオール含有ポリマーを有するナノ粒子が、本明細書中で記載される。記載される標的されたナノ粒子のポリオールナノ粒子部分を含むポリマーが、以下の構造単位の任意の１つの１つ以上を有し得る：

【0171】

【化16】

Ａは、以下の式：

【0172】

【化17】

ここで、Ｒ_１およびＲ_２は、約１０ｋＤａ以下の分子量を有する任意の炭素ベースの基又は有機基のいずれかから独立して選択され；Ｘは、－Ｈ、－Ｆ、－Ｃ、－Ｎ又は－Ｏの１つ以上を含む脂肪族基から選択され；且つＹは、－ＯＨ又は－ＯＨを提示する有機部分から独立して選択され、且つＢは、第１部分ＡのＲ_１およびＲ_２の１つに連結する有機部分であり、第２部分ＡのＲ_１およびＲ_２をポリマー中に有する。幾つかの実施形態において、Ｘは、Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１であってもよく、ここで、ｎは、０～５の任意の１つの数であり、Ｙは、－ＯＨである。幾つかの実施形態において、Ａは、以下のいずれか１つであり得る：

【0173】

【化18】

ここで、スペーサーは、任意の有機基から独立して選択され；アミノ酸は、遊離のアミンおよび遊離のカルボン酸基を有する有機基から選択され；ｎは、１～２０の任意の単一番号であり；且つＺ_１は、－ＮＨ_２，－ＯＨ、－ＳＨおよび－ＣＯＯＨから独立して選択され；Ｒ_１およびＲ_２は、独立して以下の式を有し得：

【0174】

【化19】

式中、ｄは、０～１００の任意の単一番号であり、ｅは、０～１００の任意の単一番号であり、ｆは、０～１００の任意の単一番号であり、Ｚは、１つの有機部分を別の有機部分に連結する共有結合であり、且つＺ_１は、－ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＳＨおよび－ＣＯＯＨから独立して選択され；Ｂは、以下のいずれか１つであってもよく：

【0175】

【化20】

ここで、ｑは、１～２０の任意の単一番号であり；ｐは、２０～２００の任意の単一番号であり；且つＬは、遊離基であり、これらのＢサブユニットは、上述のＡサブユニットのいずれか１つと対合される。より詳細な実施形態において、式（Ｉ）の構造単位に示される標的化ナノ粒子のポリオールナノ粒子セグメントを含有するポリマーは、以下：

【0176】

【化21】

より詳細な実施形態において、式（ＩＩ）の構造単位に示される標的化ナノ粒子のポリオールナノ粒子セグメントを含有するポリマーは、以下：

【0177】

【化22】

であり、そして
式（ＩＩＩ）の構造単位に示される標的化ナノ粒子のポリオールナノ粒子セグメントを含有するポリマーは、以下：

【0178】

【化23】

であり、
ここで、ｎは、１～２０の任意の単一番号である。記載の標的化ナノ粒子の幾つかの実施形態において、ポリオール含有ポリマーは、以下である：

【0179】

【化24】

【0180】

まとめると、下位部分Ａについての式（式ＶＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩ）のいずれかは、下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれかと組み合わされて、記載のナノ粒子のポリオール含有ポリマーを形成し得る。本明細書中で記載される特定の局面において、ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得る。

【0181】

幾つかの実施形態において、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーは、ニトロフェニルボロン酸基を含み、以下の一般式を有する：

【0182】

【化25】

ここで、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して親水性有機ポリマーであり、Ｘ_１は、－Ｃ、－Ｎ又は－Ｂの１つ以上を含む有機部分であり、Ｙ_１は、ｍが≧１である式－Ｃ_ｍＨ_２ｍ－のアルキル基又は芳香族基であり、ｒは、１～１０００の任意の単一番号であり、ａは、０～３の任意の単一番号であり、且つｂは、０～３の任意の単一番号であり、且つ官能基１および官能基２は、同一であるか又は異なっており、－Ｂ（ＯＨ）_２、－ＯＣＨ_３又は－ＯＨのいずれか１つから独立して選択され得る。幾つかの実施形態において、記載のニトロフェニルボロン酸含有ポリマーのこれらの可変の下位部分は、以下から選択され得る：Ｒ_３およびＲ_４は、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｔであり得、ここで、ｔは、２～２０００の任意の単一番号であり；Ｘ_１は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－又は－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－のいずれか１つであり、且つＹ_１は、ニトロフェニル基である。幾つかの実施形態において、記載のニトロフェニルボロン酸含有ポリマーのこれらの可変の下位部分は、以下から選択され得る：Ｒ_３およびＲ_４は、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｔであり、ここで、ｔは、２～２０００の任意の単一番号であり；Ｘ_１は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－又は－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－のいずれか１つであり、且つＹ_１は、ニトロフェニル基であり、且つｒは、１の値を有し得、ａは、０の値を有し得、且つｂは、１の値を有し得る。ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーの実施形態のそれぞれにおいて、ニトロ基は、オルト位、メタ位、又はパラ位のいずれであってもよい。なおさらなる実施形態において、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーは、フェニル環上に存在する、メチル基などのさらなる基を有し得る。詳細な実施形態において、本明細書中で記載される標的化ナノ粒子は、以下の式のいずれか１つを有するニトロフェニルボロン酸含有ポリマーを含み得る：

【0183】

【化26】

ここで、ｓは、２０～３００の任意の単一番号である。式ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶおよびＸＸＸＶのポリマーは、フェニル環上のＰＥＧの位置を、ボロン酸基に関連してオルト位、メタ位、又はパラ位に変えるようにさらに改変され得る。

【0184】

まとめると、下位部分Ａについての式（式ＶＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩ）のいずれか１つは、下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つと組み合わされて、記載のナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成し得、得られたポリオール含有ポリマーは、次いで、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。幾つかの実施形態において、記載のポリオール含有ポリマーと記載のニトロフェニルボロン酸含有ポリマーとの間の結合体化は、ボロン酸基の少なくとも１つのヒドロキシル基によって媒介される。本明細書中で記載される特定の局面において、ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、次いで、式ＸＸＸを有するボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。本明細書中で記載される幾つかの実施形態において、ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、次いで、式ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのいずれか１つに対応するボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。

【0185】

本明細書中で記載されるナノ粒子は、さらに、化合物を含み得る。幾つかの実施形態において、この化合物は、１つ以上の治療剤、例えば低分子化学療法剤又はポリヌクレオチドであってもよい。幾つかの実施形態において、このポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は干渉ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）のいずれか１つ以上であってもよい。幾つかの実施形態において、低分子化学療法剤は、カンプトテシン、エポチロン又はタキサンの１つ以上であってもよい。本明細書中で記載されるナノ粒子は、ポリヌクレオチドと１つ以上の低分子との組み合わせを含んでもよい。この点に関して、下位部分Ａのポリマー（式ＶＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩ）のいずれか１つは、下位部分Ｂのポリマー（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つと組み合わされて、記載のナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成し得、得られたポリオール含有ポリマーは、次いで、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。下位部分Ａのポリマー、下位部分Ｂのポリマー又はニトロフェニルボロン酸を有するポリマーは、１つ以上の治療剤、例えば低分子化学療法剤又はポリヌクレオチドと共に形成され得る。幾つかの実施形態において、下位部分Ａのポリマー（式ＶＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩ）は、下位部分Ｂのポリマー（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つと組み合わされて、記載のナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成し得、得られたポリオール含有ポリマーは、次いで、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。下位部分Ａのポリマー、下位部分Ｂのポリマー又はニトロフェニルボロン酸を有するポリマーは、１つ以上のＤＮＡ、ＲＮＡ又は干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）と共に形成され得る。幾つかの実施形態において、下位部分Ａのポリマー（式ＶＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩ）は、下位部分Ｂのポリマー（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つと組み合わされて、記載のナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成し得、得られたポリオール含有ポリマーは、次いで、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。下位部分Ａのポリマー、下位部分Ｂのポリマー又はニトロフェニルボロン酸を有するポリマーは、１つ以上の化学療法剤と共に形成され得る。幾つかの実施形態において、下位部分Ａのポリマー（式ＶＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩ）は、下位部分Ｂのポリマー（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つと組み合わされて、記載のナノ粒子のポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントを形成し得、得られたポリオール含有ポリマーは、次いで、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。下位部分Ａのポリマー、下位部分Ｂのポリマー又はニトロフェニルボロン酸を有するポリマーは、１つ以上のＤＮＡ、ＲＮＡ又は干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）と共に形成され得る。幾つかの実施形態において、記載のポリオール含有ポリマーと記載のニトロフェニルボロン酸含有ポリマーとの間の結合体化は、ニトロフェニルボロン酸基の少なくとも１つのヒドロキシル基によって媒介される。本明細書中で記載される幾つかの実施形態において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、次いで、式ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのいずれか１つに対応するニトロフェニルボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。

【0186】

標的化ナノ粒子
任意の５、４、３、２又は１の標的リガンドに結合体化したポリオール含有ポリマーを有する標的化ナノ粒子が、本明細書中で記載される。記載される標的されたナノ粒子のポリオールナノ粒子部分を含むポリマーが、以下の構造単位の任意の１つの１つ以上を有し得る：

【0187】

【化27】

Ａは、以下の式：

【0188】

【化28】

ここで、Ｒ_１およびＲ_２は、約１０ｋＤａ以下の分子量を有する任意の炭素ベースの基又は有機基のいずれかから独立して選択され；Ｘは、－Ｈ、－Ｆ、－Ｃ、－Ｎ又は－Ｏの１つ以上を含む脂肪族基から選択され；且つＹは、－ＯＨ又は－ＯＨを提示する有機部分から独立して選択され、且つＢは、第１部分ＡのＲ_１およびＲ_２の１つに連結する有機部分であり、第２部分ＡのＲ_１およびＲ_２をポリマー中に有する。幾つかの実施形態において、Ｘは、Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１であってもよく、ここで、ｎは、０～５の任意の１つの数であり、Ｙは、－ＯＨである。幾つかの実施形態において、Ａは、以下のいずれか１つであり得る：

【0189】

【化29】

ここで、スペーサーは、任意の有機基から独立して選択され；アミノ酸は、遊離のアミンおよび遊離のカルボン酸基を有する有機基から選択され；ｎは、１～２０の任意の単一番号であり；且つＺ_１は、－ＮＨ_２，－ＯＨ、－ＳＨおよび－ＣＯＯＨから独立して選択され；Ｒ_１およびＲ_２は、独立して以下の式を有し得：

【0190】

【化30】

式中、ｄは、０～１００の任意の単一番号であり、ｅは、０～１００の任意の単一番号であり、ｆは、０～１００の任意の単一番号であり、Ｚは、１つの有機部分を別の有機部分に連結する共有結合であり、且つＺ_１は、－ＮＨ_２、－ＯＨ、－ＳＨおよび－ＣＯＯＨから独立して選択され；Ｂは、以下のいずれか１つであってもよく：

【0191】

【化31】

ここで、ｑは、１～２０の任意の単一番号であり；ｐは、２０～２００の任意の単一番号であり；且つＬは、遊離基であり、これらのＢサブユニットは、上述のＡサブユニットのいずれか１つと対合される。より詳細な実施形態において、式（Ｉ）の構造単位に示される標的化ナノ粒子のポリオールナノ粒子セグメントを含有するポリマーは、以下：

【0192】

【化32】

より詳細な実施形態において、式（ＩＩ）の構造単位に示される標的化ナノ粒子のポリオールナノ粒子セグメントを含有するポリマーは、以下：

【0193】

【化33】

式（ＩＩＩ）の構造単位に示される標的化ナノ粒子のポリオールナノ粒子セグメントを含有するポリマーは、以下：

【0194】

【化34】

であり、
ここで、ｎは、１～２０の任意の単一番号である。記載の標的化ナノ粒子の幾つかの実施形態において、ポリオール含有ポリマーは、以下である：

【0195】

【化35】

【0196】

まとめると、下位部分Ａについての式（式ＶＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩ）のいずれかは、下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれかと組み合わされて、記載の標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーを形成し得る。本明細書中で記載される特定の局面において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得る。

【0197】

所望の標的化ナノ粒子はまた、ポリオール含有ポリマーに可逆的共有結合でカップリングしたボロン酸含有ポリマーをも有し得る。幾つかの実施形態において、このナノ粒子は、ボロン酸含有ポリマーがナノ粒子の外部の環境に存在するように構成される。なおさらなる実施形態において、ボロン酸含有ポリマーは、ナノ粒子と反対のその末端において、標的リガンドに結合体化される。幾つかの実施形態において、ボロン酸含有ポリマーは、少なくとも１つの末端ボロン酸基を含み、以下の一般式を有する：

【0198】

【化36】

ここで、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して親水性有機ポリマーであり、Ｘ_１は、－Ｃ、－Ｎ又は－Ｂの１つ以上を含む有機部分であり、Ｙ_１は、ｍが≧１である式－Ｃ_ｍＨ_２ｍ－のアルキル基又は芳香族基であり、ｒは、１～１０００の任意の単一番号であり、ａは、０～３の任意の単一番号であり、且つｂは、０～３の任意の単一番号であり、且つ官能基１および官能基２は、同一であるか又は異なっており、－Ｂ（ＯＨ）_２、－ＯＣＨ_３又は－ＯＨのいずれか１つから独立して選択され得る。幾つかの実施形態において、記載のボロン酸含有ポリマーのこれらの可変の下位部分は、以下から選択され得る：Ｒ_３およびＲ_４は、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｔであり、ここで、ｔは、２～２０００の任意の単一番号であり；Ｘ_１は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－又は－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－のいずれか１つであり、且つＹ_１は、フェニル基である。幾つかの実施形態において、記載のボロン酸含有ポリマーのこれらの可変の下位部分は、以下から選択され得る：Ｒ_３およびＲ_４は、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｔであり、ここで、ｔは、２～２０００の任意の単一番号であり；Ｘ_１は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－又は－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－のいずれか１つであり、且つＹ_１は、フェニル基であり、且つｒは、１の値を有し得、ａは、０の値を有し得、且つｂは、１の値を有し得る。詳細な実施形態において、本明細書中で記載される標的化ナノ粒子は、以下の式を有するボロン酸含有ポリマーを含み得る：

【0199】

【化37】

ここで、ｓは、２０～３００の任意の単一番号である。

【0200】

幾つかの実施形態において、ボロン酸含有ポリマーは、ニトロフェニルボロン酸を有する。幾つかの実施形態において、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーは、ニトロフェニルボロン酸基を含み、以下の一般式を有する：

【0201】

【化38】

ここで、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して親水性有機ポリマーであり、Ｘ_１は、－Ｃ、－Ｎ又は－Ｂの１つ以上を含む有機部分であり、Ｙ_１は、ｍが≧１である式－Ｃ_ｍＨ_２ｍ－のアルキル基又は芳香族基であり、ｒは、１～１０００の任意の単一番号であり、ａは、０～３の任意の単一番号であり、且つｂは、０～３の任意の単一番号であり、且つ官能基１および官能基２は、同一であるか又は異なっており、－Ｂ（ＯＨ）_２、－ＯＣＨ_３又は－ＯＨのいずれか１つから独立して選択され得る。幾つかの実施形態において、記載のボロン酸含有ポリマーのこれらの可変の下位部分は、以下から選択され得る：Ｒ_３およびＲ_４は、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｔであり得、ここで、ｔは、２～２０００の任意の単一番号であり；Ｘ_１は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－又は－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－のいずれか１つであり、且つＹ_１は、ニトロフェニル基である。幾つかの実施形態において、記載のニトロフェニルボロン酸含有ポリマーのこれらの可変の下位部分は、以下から選択され得る：Ｒ_３およびＲ_４は、（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｔであり、ここで、ｔは、２～２０００の任意の単一番号であり；Ｘ_１は、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－又は－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－のいずれか１つであり、且つＹ_１は、ニトロフェニル基であり、且つｒは、１の値を有し得、ａは、０の値を有し得、且つｂは、１の値を有し得る。ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーの実施形態のそれぞれにおいて、ニトロ基は、オルト位、メタ位、又はパラ位のいずれであってもよい。なおさらなる実施形態において、ニトロフェニルボロン酸含有ポリマーは、フェニル環上に存在する、メチル基などのさらなる基を有し得る。詳細な実施形態において、本明細書中で記載される標的化ナノ粒子は、以下の式のいずれか１つを有するボロン酸含有ポリマーを含み得る：

【0202】

【化39】

ここで、ｓは、２０～３００の任意の単一番号である。式ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶおよびＸＸＸＶのポリマーは、フェニル環上のＰＥＧの位置を、ボロン酸基に関連してオルト位、メタ位、又はパラ位に変えるようにさらに改変され得る。

【0203】

まとめると、下位部分Ａについての式（式ＶＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩ）のいずれか１つは、下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つと組み合わされて、記載の標的化ナノ粒子のポリオールナノ粒子セグメントを含有するポリマーを形成し得、得られたポリオール含有ポリマーは、次いで、ボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得、ここで、このボロン酸含有ポリマーは、フェニルボロン酸又はニトロフェニルボロン酸のいずれかである。幾つかの実施形態において、記載のポリオール含有ポリマーと記載のボロン酸含有ポリマーとの間の結合体化は、ボロン酸基の少なくとも１つのヒドロキシル基によって媒介される。本明細書中で記載される特定の局面において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、次いで、式ＸＸＸを有するボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。本明細書中で記載される幾つかの実施形態において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、次いで、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのいずれか１つに対応するボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。

【0204】

本明細書中で記載される幾つかの局面において、本明細書中で記載されるポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメント又はポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントとボロン酸含有ポリマーとの組み合わせのいずれかから形成されるナノ粒子は、標的リガンドと結合体化して、標的リガンド対ナノ粒子の比が３：１である標的化ナノ粒子を形成する。本明細書中で記載される幾つかの局面において、本明細書中で記載されるポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメント又はポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントとボロン酸含有ポリマーとの組み合わせのいずれかから形成されるナノ粒子は、標的リガンドと結合体化して、標的リガンド対ナノ粒子の比が１：１である標的化ナノ粒子を形成する。本明細書中で記載される幾つかの局面において、本明細書中で記載されるポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメント又はポリオール含有ポリマーナノ粒子セグメントとボロン酸含有ポリマーとの組み合わせのいずれかから形成されるナノ粒子は、１つの単一標的リガンドと結合体化して、標的化ナノ粒子を形成する。幾つかの局面において、記載の標的リガンドは、ボロン酸含有ポリマーに、ボロン酸と反対の末端において結合体化する。記載の標的化ナノ粒子に結合体化した標的リガンドは、タンパク質、タンパク質断片、アミノ酸ペプチド、又はアミノ酸又はポリヌクレオチドのいずれかに由来するアプタマー、又は目的の標的に結合することが公知である他の高親和性分子のいずれか１つであってもよい。幾つかの実施形態において、タンパク質又はタンパク質断片である標的リガンドは、抗体、細胞性レセプター、細胞性レセプターについてのリガンド（例えば、トランスフェリン）、あるいはその一部を有するタンパク質又はキメラタンパク質のいずれか１つであってもよい。標的リガンドが抗体である場合、この抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、非ヒト霊長類、イヌ、又はげっ歯類の抗体であるか。これらの抗体の任意の２つから成るキメラであってもよい。さらに、この抗体は、ＣＤＲセグメント又はＣＤＲセグメントを含む可変領域の小さな一部のみが非ヒト抗体であり、抗体の残りはヒト抗体であるように、ヒト化されていてもよい。本明細書中で記載される抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ又は哺乳類によって産生されることがわかっている別の型のイソ型などの、任意のイソ型のものであってもよい。幾つかの実施形態において、標的リガンドは、その標的への結合を担う抗体、細胞性レセプター、細胞性レセプターについてのリガンド由来のアミノ酸ペプチドのみを含んでもよい。

【0205】

幾つかの局面において、下位部分Ａについての式（ＶＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩ）のいずれか１つから形成されたナノ粒子は、下位部部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つと合わせられて、記載の標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーセグメントを形成し、さらに、５、４、３、２又は１のいずれかの、標的リガンドと結合体化したボロン酸、例えばフェニルボロン酸又はニトロフェニルボロン酸含有ポリマーにカップリングした。

【0206】

幾つかの局面において、下位部分Ａについての式（ＶＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩ）のいずれか１つから形成されたナノ粒子は、下位部部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つと合わせられて、記載の標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーセグメントを形成し、さらに標的リガンドと結合体化した単一のボロン酸、例えばフェニルボロン酸又はニトロフェニルボロン酸含有ポリマーにカップリングした。

【0207】

本明細書中で記載される特定の局面において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、５、４、３、２又は１のいずれかの、ボロン酸の反対の末端にて標的リガンドとカップリングした式ＸＸＸのボロン酸含有ポリマーにカップリングされ得る。

【0208】

本明細書中で記載される特定の局面において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し、ボロン酸の反対の末端にて標的リガンドとカップリングした式ＸＸＸのボロン酸含有ポリマーにカップリングされ得る。

【0209】

幾つかの局面において、下位部分Ａについての式（ＶＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩ）のいずれか１つから形成されたナノ粒子は、下位部部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つと合わせられて、記載の標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーセグメントを形成し、さらに５、４、３、２又は１のボロン酸含有ポリマー、例えば標的リガンドと結合体したフェニルボロン酸又はニトロフェニルボロン酸にカップリングした。ここで、得られた標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドとのみ結合体化する。

【0210】

幾つかの局面において、下位部分Ａについての式（ＶＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩ）のいずれか１つから形成されたナノ粒子は、下位部部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つと合わせられて、記載の標的化ナノ粒子のポリオール含有ポリマーセグメントを形成し、さらに標的リガンドと結合体化した単一のボロン酸含有ポリマー、例えばフェニルボロン酸又はニトロフェニルボロン酸にカップリングした。ここで、得られた標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドとのみ結合体化する。

【0211】

本明細書中で記載される特定の局面において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、ボロン酸の反対の末端にて標的リガンドとカップリングした、５、４、３、２又は１のいずれかの式ＸＸＸを有するボロン酸含有ポリマーにカップリングされ得る。ここで、得られた標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドとのみ結合体化する。

【0212】

本明細書中で記載される特定の局面において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、ボロン酸の反対の末端にて標的リガンドとカップリングした式ＸＸＸを有するボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。ここで、得られた標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドとのみ結合体化する。

【0213】

幾つかの実施形態において、本明細書中で記載される標的化ナノ粒子は、任意の標的リガンドに結合体化する。幾つかの実施形態において、本明細書中で記載される標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドに結合体化する。本明細書中で記載される幾つかの実施形態において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、次いで、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのいずれか１つに対応する、５、４、３、２又は１のいずれかのボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。これは、さらに、タンパク質、タンパク質断片、アミノ酸ペプチド又はアプタマーの１つ以上から選択される標的リガンドに結合体化する。

【0214】

幾つかの実施形態において、本明細書中で記載される標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドに結合体化する。本明細書中で記載される幾つかの実施形態において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、次いで、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのいずれか１つに対応するボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。これは、さらに、タンパク質、タンパク質断片、アミノ酸ペプチド又はアプタマーから選択される単一の標的リガンドに結合体化する。

【0215】

幾つかの実施形態において、本明細書中で記載される標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドに結合体化する。本明細書中で記載される幾つかの実施形態において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、次いで、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのいずれか１つに対応する、任意の５、４、３、２又は１のボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。これはさらに、抗体、細胞性レセプター、細胞性レセプターについてのリガンド、又はタンパク質又はその一部を有するキメラタンパク質に結合体化される。

【0216】

本明細書中で記載される幾つかの実施形態において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、次いで、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのいずれか１つに対応するボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。これはさらに、単一の抗体、細胞性レセプター、細胞性レセプターのリガンド、又はタンパク質もしくはその一部を有するキメラタンパク質に結合体化される。

【0217】

幾つかの実施形態において、本明細書中で記載される標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドに結合体化する。本明細書中で記載される幾つかの実施形態において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、次いで、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのいずれか１つに対応するボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。これはさらに、タンパク質、タンパク質断片、アミノ酸ペプチド又はアプタマーから選択される単一の標的リガンドに結合体化され、ここで、得られた標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドのみにしか結合体化されない。

【0218】

幾つかの実施形態において、本明細書中で記載される標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドに結合体化される。本明細書中で記載される幾つかの実施形態において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、次いで、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのいずれか１つに対応する、任意の５、４、３、２又は１のボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。これはさらに、抗体、細胞性レセプター、細胞性レセプターのリガンド、又はタンパク質又はその一部を有するキメラタンパク質に結合体化される。ここで、得られた標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドのみにしか結合体化されない。

【0219】

本明細書中で記載される幾つかの実施形態において、標的化ナノ粒子は、下位部分Ａについての式（ＩＸ、Ｘ又はＸＩ）のいずれか１つと下位部分Ｂについての式（式ＸＸＩＩＩ又はＸＩＶ）のいずれか１つとの組み合わせから形成されるポリオール含有ポリマーを有し得、これは、次いで、式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ、又はＸＸＸＶのいずれか１つに対応するボロン酸含有ポリマーとカップリングされ得る。これはさらに、単一の抗体、細胞性レセプター、細胞性レセプターのリガンド、又はタンパク質又はその一部を有するキメラタンパク質に結合体化され、ここで、得られた標的化ナノ粒子は、単一の標的リガンドにのみ結合体化される。

【0220】

本明細書中で記載される標的化ナノ粒子は、さらに、化合物を含み得る。幾つかの実施形態において、この化合物は、１つ以上の治療剤、例えば低分子化学療法剤もしくはポリヌクレオチドであってもよい。幾つかの実施形態において、このポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は干渉ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）のいずれか１つ以上であってもよい。幾つかの実施形態において、低分子化学療法剤は、カンプトテシン、エポチロン又はタキサンの１つ以上であってもよい。本明細書中で記載される標的化ナノ粒子は、ポリヌクレオチドと１つ以上の低分子化学療法剤との組み合わせを含んでもよい。

【0221】

本明細書中で記載される構成要素を用いて産生され得る種々の型のナノ粒子および標的化ナノ粒子を考察してきたが、以下の詳細な実施形態が、産生され得る。１つの実施形態において、記載の標的化ナノ粒子は、ムチン酸含有ポリマー、カンプトテシン、エポチロン、タキサン又は干渉ＲＮＡ配列から選択される治療剤、可逆的共有結合にてムチン酸ポリマーとカップリンされた式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ又はＸＸＸＶを有するフェニルボロン酸含有ポリマーを有する。この標的化ナノ粒子は、フェニルボロン酸含有ポリマーをナノ粒子の外部環境に提示するように構成され、ここで、このフェニルボロン酸含有ポリマーは、ナノ粒子と反対の末端において標的リガンドに結合体化し、ここで、この標的化ナノ粒子は、１つの単一標的リガンドを含む。

【0222】

１つの実施形態において、記載の標的化ナノ粒子は、ムチン酸含有ポリマー、カンプトテシン、エポチロン、タキサン又は干渉ＲＮＡ配列から選択される治療剤、可逆的共有結合にてムチン酸ポリマーとカップリンされた式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ又はＸＸＸＶを有するフェニルボロン酸含有ポリマーを有する。この標的化ナノ粒子は、フェニルボロン酸含有ポリマーをナノ粒子の外部環境に提示するように構成され、ここで、このフェニルボロン酸含有ポリマーは、ナノ粒子と反対の末端において標的リガンドに結合体化し、ここで、この標的化ナノ粒子は、１つの単一抗体を含む。

【0223】

１つの実施形態において、記載の標的化ナノ粒子は、ムチン酸含有ポリマー、カンプトテシン、エポチロン、タキサン又は干渉ＲＮＡ配列から選択される治療剤、可逆的共有結合にてムチン酸ポリマーとカップリンされた式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ又はＸＸＸＶを有するフェニルボロン酸含有ポリマーを有する。この標的化ナノ粒子は、フェニルボロン酸含有ポリマーをナノ粒子の外部環境に提示するように構成され、ここで、このフェニルボロン酸含有ポリマーは、ナノ粒子と反対の末端において、ヒト抗体、マウス抗体、ウサギ抗体、非ヒト霊長類抗体、イヌ抗体、又はげっ歯類抗体、又はこれらの任意の２つの抗体から成るキメラ抗体（ここで、抗体は、ＩｇＧ，ＩｇＤ，ＩｇＭ，ＩｇＥ，ＩｇＡ又はＩｇＹのイソ型のいずれか１つである）のいずれか１つに結合体化し、ここで、この標的化ナノ粒子は、１つの単一抗体を含む。

【0224】

１つの実施形態において、記載の標的化ナノ粒子は、ムチン酸含有ポリマー、カンプトテシン、エポチロン、タキサン又は干渉ＲＮＡ配列から選択される治療剤、可逆的共有結合にてムチン酸ポリマーとカップリンされた式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ又はＸＸＸＶを有するフェニルボロン酸含有ポリマーを有する。この標的化ナノ粒子は、フェニルボロン酸含有ポリマーをナノ粒子の外部環境に提示するように構成され、ここで、このフェニルボロン酸含有ポリマーは、ナノ粒子と反対の末端において細胞性レセプターに結合体化し、ここで、この標的化ナノ粒子は、１つの単一の細胞性レセプターを含む。

【0225】

１つの実施形態において、記載の標的化ナノ粒子は、ムチン酸含有ポリマー、カンプトテシン、エポチロン、タキサン又は干渉ＲＮＡ配列から選択される治療剤、可逆的共有結合にてムチン酸ポリマーとカップリンされた式ＸＸＸＩ、ＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ又はＸＸＸＶを有するフェニルボロン酸含有ポリマーを有する。この標的化ナノ粒子は、フェニルボロン酸含有ポリマーをナノ粒子の外部環境に提示するように構成され、ここで、このフェニルボロン酸含有ポリマーは、ナノ粒子と反対の末端においてレセプターリガンドに結合体化し、ここで、この標的化ナノ粒子は、１つの単一レセプターリガンドを含む。

【実施例】

【0226】

本明細書中で記載される方法システムは、以下の実施例においてさらに説明される。これは、説明のために提供されるが、限定を企図しない。当業者は、核酸検出および他の標的、例えばタンパク質、抗原、真核生物細胞又は原核生物細胞などの検出の方法について詳細に記載される、特徴の適応性を理解する。

【0227】

全ての化学試薬は、商業的供給者から得られ、さらなる精製なしに入手したままに使用された。ポリマーサンプルを、示差屈折率（ＲＩ）検出器、示差粘度計および低角光散乱検出器から成るＴＤＡ ３０２三重検出器アレイを備えたＶｉｓｃｏｔｅｋ ＧＰＣ Ｓｙｓｔｅｍにおいて分析した。７．５％酢酸溶液を、流速１ｍＬ／分にて、溶離液として用いた。

【0228】

ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドであるｐＧＬ３を、ｐＧＬ３を発現する細菌から抽出し、精製した。ｓｉＧＬ３を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（配列を以下に提供する）から購入した。ｓｉＣＯＮ１（配列を以下に提供する）を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入した。ＨｅＬａ細胞を使用し、カチオン性ムチン酸ジアミン－ＤＭＳポリマーにより、ｐＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ送達の有効性を決定した。

【0229】

【表1】

【0230】

実施例１：ムチン酸ジメチルエステルの合成、（１）
５ｇ（２２．８ｍｍｏｌ）のムチン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１２０ｍＬのメタノールおよび０．４ｍＬの濃硫酸を含む５００ｍＬ丸底フラスコに加えた。この混合物を８５℃にて一晩、絶え間ない撹拌の下で還流させた。この混合物を、その後濾過し、メタノールで洗浄し、次いで、８０ｍＬメタノールおよび０．５ｍＬトリエチルアミンの混合物から再結晶化させた。真空下で一晩の乾燥の後、８．０ｇ（３３．６ｍｍｏｌ，７１％）のムチン酸ジメチルエステルを得た。^１Ｈ ＮＭＲ（（ＣＤ_３）_２ＳＯ）δ ４．８８～４．９１（ｄ，２Ｈ），４．７８～４．８１（ｍ，２Ｈ），４．２８～４．３１（ｄ，２Ｈ），３．７７～３．７８（ｄ，２Ｈ），３．６３（ｓ，６Ｈ）．ＥＳＩ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２６１．０［Ｍ＋Ｎａ］^＋

【0231】

【化40】

【0232】

実施例２：Ｎ－ＢＯＣ－保護ムチン酸ジアミン、（２）
８ｇ（３３．６ｍｍｏｌ）のムチン酸ジメチルエステル（１；実施例１）、１２．４ｍＬ（８８．６ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンおよび１６０ｍＬのメタノールの混合物を、絶え間なく撹拌した５００ｍＬの丸底フラスコ内で還流下で８５℃にて、０．５時間にわたって加熱し、その後、メタノール（３２ｍＬ）中に溶解した１４．２ｇ（８８．６ｍｍｏｌ）Ｎ－ＢＯＣジアミン（Ｆｌｕｋａ）を加えた。この反応懸濁液を、次いで、還流に戻した。一晩の還流の後、この混合物を濾過し、メタノールで洗浄し、メタノールから再結晶させ、真空下で乾燥させて、９．４ｇ（１９ｍｍｏｌ，５７％）のＮ－ＢＯＣ－保護ムチン酸ジアミンを得た。^１Ｈ ＮＭＲ（（ＣＤ_３）_２ＳＯ）δ ７．６６（ｍ，２Ｈ），６．７９（ｍ，２Ｈ），５．１３～５．１５（ｄ，２Ｈ），４．３５～４．３８（ｄ，２Ｈ），４．０８～４．１１（ｍ，２Ｈ），３．７８～３．８０（ｄ，２Ｈ），２．９５～３．１５（ｍ，８Ｈ），１．３８（ｓ，１８）．ＥＳＩ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：５１７．１［Ｍ＋Ｎａ］^＋

【0233】

【化41】

【0234】

実施例３：ムチン酸ジアミンの合成、（３）
８ｇ（１６．２ｍｍｏｌ）のＮ－ＢＯＣ－保護ムチン酸ジアミン（２；実施例２）を、メタノール（１６０ｍＬ）中の３Ｍ ＨＣｌを含む５００ｍＬ丸底フラスコに移し、一晩８５℃にて、絶え間なく撹拌したがら還流させた。その後、沈殿物を濾過し、メタノールで洗浄して一晩真空下で乾燥させ、５．７ｇ（１５．６ｍｍｏｌ，９６％）のムチン酸ジアミンを得た。^１Ｈ ＮＭＲ（（ＣＤ_３）_２ＳＯ）δ ７．９７（ｍ，８Ｈ），５．３５～５．３８（ｍ，２Ｈ），４．１８～４．２０（ｍ，２Ｈ），３．８２（ｍ，２Ｈ），３．３５～３．４２（ｍ，８Ｈ），２．８２～２．９０（ｍ，４Ｈ）．ＥＳＩ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２９４．３［Ｍ］^＋，３１７．１［Ｍ＋Ｎａ］^＋，３３３．０［Ｍ＋Ｋ］^＋

【0235】

【化42】

【0236】

実施例４：ムチン酸ジアミン－ＤＭＳコポリマー（ＭＡＰ）、（４）
１．５ｍＬエッペンドルフ管に、０．８ｍＬの０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３中の実施例３の８５．５ｍｇ（０．２３３ｍｍｏｌ）のビス（ヒドロクロリド）塩を、入れた。ジメチルスベリミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＳ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，６３．６ｍｇ，０．２３３ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液をボルテックスし、遠心分離して、構成要素を溶解させた。得られた混合物を、室温にて１５時間にわたって撹拌した。次いで、この混合物を、８ｍＬの水で希釈し、１Ｎ ＨＣｌの添加によって、ｐＨを４にした。次いで、この溶液を、３５００ＭＷＣＯ透析膜（Ｐｉｅｒｃｅ ｐｌｅａｔｅｄ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｔｕｂｉｎｇ）を用いて、ｄｄＨ_２Ｏにおいて２４時間にわたって透析した。透析溶液を、乾燥するまで凍結乾燥させ、４９ｍｇの白いふわふわした粉末を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｄＤＭＳＯ）δ ９．１５（ｂｓ），７．９２（ｂｓ），５．４３（ｂｓ），４．５８（ｂｓ），４．１７（ｂｓ），３．８２（ｂｓ），３．３７（ｂｓ），３．２８（ｂｓ），２．８２（ｂｓ），２．４１（ｂｓ），１．６１（ｂｓ），１．２８（ｂｓ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ｄＤＭＳＯ）δ １７４．８８（ｓ，１Ｈ），１６８．３８（ｓ，１Ｈ），７１．４５（ｓ，４Ｈ），７１．２２（ｓ，３Ｈ），４２．３４（ｓ，２Ｈ），３６．９６（ｓ，３Ｈ），３２．７４（ｓ，３Ｈ），２８．０９（ｓ，４Ｈ），２６．９０（ｓ，４Ｈ）．Ｍｗ［ＧＰＣ］＝２５２０，Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１５．

【0237】

【化43】

【0238】

ポリマー４は、カチオン性Ａ－Ｂ型（反復構造は、ＡＢＡＢＡＢ．．．である）ポリオール含有ポリマーの例である。

【0239】

実施例５：ボロン酸－アミド－ＰＥＧ_５０００，（５）
実施例４のポリマーは、核酸、例えばｓｉＲＮＡと共に集められ、ナノ粒子を形成する。これらのナノ粒子は、哺乳動物において使用される立体安定性を有する必要があり、必要に応じて、これらは、含まれる標的薬剤を有し得た。これらの２つの機能を行うために、このナノ粒子は、立体安静性およびＰＥＧ－標的リガンドのために、ＰＥＧで装飾されてもよい。このようにするために、ボロン酸を含有するＰＥＧ化合物が、調製される。例えば、ボロン酸含有ＰＥＧは、以下の実施例に従って、合成され得る。

【0240】

３３２ｍｇの４－カルボキシフェニルボロン酸（２ｍｍｏｌ）を、８ｍＬのＳＯＣｌ_２中に溶かした。これに、数滴のＤＭＦを加え、この混合物を、アルゴン下で２時間還流した。過剰なＳＯＣｌ_２を減圧下で除去し、得られた個体を、１０ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶かした。この溶液に、５００ｍｇのＰＥＧ_５０００－ＮＨ_２（２ｍｍｏｌ）および４１８μＬの５ｍＬのジクロロメタン中に溶かしたトリエチルアミン（６０ｍｍｏｌ）を、０℃にてアルゴン下で溶解した。この混合物を、室温まで加温し、撹拌を一晩つづけた。ジクロロメタン中に溶かした溶媒を、減圧下で除去し、そして得られた液体を、２０ｍＬのジエチルエーテルで析出させた。沈殿物を、濾過し、乾燥させ、そしてｄｄＨ_２Ｏ中で再溶解させた。次いで、この水溶液を、０．４５μｍフィルターで濾過し、３５００ＭＷＣＯ透析膜（Ｐｉｅｒｃｅ ｐｌｅａｔｅｄ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｔｕｂｉｎｇ）で、ｄｄＨ_２Ｏ中に２４時間にわたって透析した。透析した溶液を、乾燥するまで凍結乾燥した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄＤＭＳＯ）δ ７．９２－７．７７（ｍ），４．４４（ｄ），４．３７（ｔ），３．４９（ｍ），２．９７（ｓ）。

【0241】

【化44】

【0242】

実施例６：ボロン酸－ジスルフィド－ＰＥＧ_５０００，（６）
実施例５のＰＥＧ化合物の（還元条件下で）開裂可能なバージョンもまた、以下のように合成され得る。

【0243】

２５０ｍｇのＰＥＧ_５０００－ＳＨ（０．０５ｍｍｏｌ，ＬａｙＳａｎＢｉｏ Ｉｎｃ．）を、スターラーを備えたガラスバイアルに加えた。これに、４ｍＬのメタノール中に溶解した１１０ｍｇのアルドリチオール－２（０．５ｍｍｏｌ，Ａｌｄｒｉｃｈ）を、加えた。この溶液を、１ｍＬのメタノール中の７７ｍｇのメルカプトフェニルボロン酸（０．５ｍｍｏｌ，Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えたのち、室温にて２時間にわたって撹拌した。得られた溶液を、さらに２時間、室温にて撹拌した。メタノールを、真空下で除去し、そして残渣を、２ｍＬのジクロロメタン中に溶かした。１８ｍＬのジエチルエーテルを、ジクロロメタン溶液に加え、この混合物を、１時間にわたって静置した。生じた析出物を、遠心分離を介して収集し、ジエチルエーテルで数回洗浄して、乾燥させた。この乾燥個体を水中に再溶解し、０．４５μｍフィルターで濾過し、３５００ＭＷＣＯ透析膜（Ｐｉｅｒｃｅ ｐｌｅａｔｅｄ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｔｕｂｉｎｇ）で、ｄｄＨ_２Ｏ中に１５時間にわたって透析した。透析した溶液を、乾燥するまで凍結乾燥した。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄＤＭＳＯ）δ ８．１２－８．００（ｍ），７．８３－７．７２（ｍ），７．７２－７．６１（ｍ），７．６１－７．４３（ｍ），３．７２（ｄ，Ｊ＝５．４），３．６８－３．１５（ｍ），３．０１－２．８３（ｍ）。

【0244】

【化45】

【0245】

実施例７：（２，３，５，６）－テトラフルオロフェニルボロン酸－ＰＥＧ_５０００の合成、（７）
実施例５のボロン酸含有ＰＥＧ化合物のフッ化バージョンを、合成し得、治療用ナノ粒子を有する画像化剤として使用できる。画像化のためのフッ素原子は、以下に記載され説明されるように、組み込まれ得る。

【0246】

（２，３，５，６）－フルオロカルボキシフェニルボロン酸を、過剰なＳＯＣｌ_２（約１００等量）中に溶解し、これに、数滴のＤＭＦを加えた。この混合物を、アルゴン下で２時間にわたって還流した。過剰なＳＯＣｌ_２を、減圧下で除去し、得られた残渣を、無水ジクロロメタン中に溶かした。この溶液に、ジクロロメタン中に溶かしたＰＥＧ_５０００－ＮＨ_２（１等量）およびトリエチルアミン（３０等量）を、０℃にてアルゴン下で加えた。得られた混合物を、室温まで加温し、撹拌を一晩つづけた。ジクロロメタン溶媒を、減圧下で除去し、そして得られた液体を、ジエチルエーテルで析出させた。沈殿物を、濾過し、乾燥させ、そしてｄｄＨ_２Ｏ中で再溶解させた。次いで、この水溶液を、０．４５μｍフィルターで濾過し、３５００ＭＷＣＯ透析膜（Ｐｉｅｒｃｅ ｐｌｅａｔｅｄ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｔｕｂｉｎｇ）で、ｄｄＨ_２Ｏ中に２４時間にわたって透析した。透析した溶液を、乾燥するまで凍結乾燥した。

【0247】

【化46】

【0248】

フッ素含有化合物は、ナノ粒子中に^１９Ｆを提供するために有用である。^１９Ｆは、標準患者ＭＲＩを用いて磁気共鳴分光学によって検出され得る。^１９Ｆの添加は、ナノ粒子の画像化を可能にする（単なる画像化のためにされても、治療剤の添加により画像化および治療を可能にしてもよい）。

【0249】

実施例８：（２，３，５，６）－テトラフルオロフェニルボロン酸－ジスルフィド－ＰＥＧ_５０００の合成、（８）
実施例５のボロン酸含有開裂可能ＰＥＧ化合物のフッ化バージョンを、合成し得、治療用ナノ粒子を有する画像化剤として使用できる。画像化のためのフッ素原子は、以下に記載され説明されるように、組み込まれ得る。

【0250】

２５０ｍｇのＰＥＧ_５０００－ＳＨ（０．０５ｍｍｏｌ，ＬａｙＳａｎＢｉｏ Ｉｎｃ．）を、スターラーを備えたガラスバイアルに加える。これに、４ｍＬのメタノール中に溶解した１１０ｍｇのアルドリチオール－２（０．５ｍｍｏｌ，Ａｌｄｒｉｃｈ）を、加える。この溶液を、１ｍＬのメタノール中の７７ｍｇの（２，３，５，６）－フルオロ－４－メルカプトフェニルボロン酸（０．５ｍｍｏｌ）を加えたのち、室温にて２時間にわたって撹拌する。得られた溶液を、さらに２時間、室温にて撹拌する。メタノールを、真空下で除去し、そして残渣を、２ｍＬのジクロロメタン中に溶かした。１８ｍＬのジエチルエーテルを、ジクロロメタン溶液に加え、この混合物を、１時間にわたって静置する。生じた析出物を、遠心分離を介して収集し、ジエチルエーテルで数回洗浄して、乾燥させる。この乾燥個体を水中に再溶解し、０．４５μｍフィルターで濾過し、３５００ＭＷＣＯ透析膜（Ｐｉｅｒｃｅ ｐｌｅａｔｅｄ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｔｕｂｉｎｇ）で、ｄｄＨ_２Ｏ中に１５時間にわたって透析する。透析した溶液を、乾燥するまで凍結乾燥する。

【0251】

【化47】

【0252】

実施例９：ボロン酸－ＰＥＧ_５０００－トランスフェリンの合成、（９）
標的薬剤は、例えば、トランスフェリン付加を参照する、図１２に図解されるアプローチに従って、実施例５～８の化合物におけるボロン酸由来のＰＥＧの他の末端に置かれてもよい。

【0253】

従って、核酸を治療剤として含むシステムの構成要素は、（標的リガンドは、トランスフェリン（図１２）、抗体、又は抗体断片の様なタンパク質、ＲＧＤ又はＬＨＲＨの様なペプチド、葉酸又はガラクトースの様な低分子、などであってもよい）であってもよい。ボロン酸ペグ化標的薬剤は、以下のように合成され得る。

【0254】

詳細には、図１２において図解されるアプローチに従って、ボロン酸ＰＥＧ_５０００－トランスフェリンを合成するために、以下の手順を実施した。１０ｍｇ（０．１３μｍｏｌ）ノヒトホロ－トランスフェリン（鉄リッチ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の、１ｍＬの０．１Ｍ ＰＢＳ緩衝液（ｐ．Ｈ．７．２）中溶液を、３．２ｍｇのＯＰＳＳ－ＰＥＧ_５０００－ＳＶＡ（５等量，０．６４μｍｏｌ，ＬａｙｓａｎＢｉｏ Ｉｎｃ．）に添加した。得られた溶液を、室温で２時間にわたって撹拌した。ペグ化トランスフェリンを、未反応のＯＰＳＳ－ＰＥＧ_５０００－ＳＶＡから、Ｕｌｔｒａｃｅｌ ５０，０００ＭＷＣＯ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、並びに未反応のトランスフェリンから、ゲル濾過カラムＧ３０００ＳＷｘｌ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｅｐ）を用いて精製した（ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析によって確認した）。次いで、１００μＬ中１００μｇのＯＰＳＳ－ＰＥＧ_５０００ペグ化トランスフェリンを、室温で、２０μＬの４－メルカプトフェニルボロン酸（１μｇ／μＬ，２０μｇ，１００等量）と共に、１時間にわたって室温でインキュベートした。インキュベーションの後、この溶液を、ＹＭ－３０，０００ＮＭＷＩデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で２回透析し、過剰な４－メルカプトフェニルボロン酸およびピリジル－２－チオン副産物を除去した。

【0255】

実施例１０：ＭＡＰ－核酸粒子の処方－ゲルシフトアッセイ
図１において図示されるように、ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素非含有水中の１μｇのプラスミドＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ（０．１μｇ／μＬ，１０μＬ）を、１０μＬのＭＡＰと、ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素非含有水中の種々の濃度で混合し、０．５、１、１．５、２、２．５および５の電荷比（ポリマー上の「＋」電荷対核酸上の「－」電荷）を得た。得られた混合物を、室温にて３０分間にわたってインキュベートした。図３および４に示されるように、２０μＬの溶液の１０μＬを、１％アガロースゲル上に、３．５μＬのローディング緩衝液と共にローディングし、ゲルを、８０Ｖにて４５分間にわたって電気泳動した。ナノ粒子中に含まれない核酸は、ゲル上を移動する。これらの結果は、ナノ粒子内の核酸含有物について必須の電荷比についての誘導を与える。

【0256】

実施例１１：ＭＡＰ－核酸粒子の粒子サイズおよびゼータ電位
ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素非含有水中１μｇのプラスミドＤＮＡ（０．１μｇ／μＬ，１０μＬ）を、１０μＬのＭＡＰと、ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素非含有水中の種々の濃度で混合し、０．５、１、１．５、２、２．５および５の電荷比を得た。得られた混合物を、室温にて３０分間にわたってインキュベートした。次いで、２０μＬの混合物を、粒子サイズ測定のために、ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素非含有水で、７０μＬまで希釈した。次いで、この７０μＬ溶液を、ゼータ電位測定のために、１ｍＭ ＫＣｌで１４００μＬまで希釈した。粒子サイズおよびゼータ電位の測定を、ＺｅｔａＰａｌｓ動的光拡散（ＤＬＳ）装置（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、行った。結果を図５に示す。

【0257】

実施例１２：ボロン酸ＰＥＧ_５ｋを用いたペグ化による粒子サイズ安定化
図２において図示されるように、ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素非含有水中の２μｇのプラスミドＤＮＡ（０．４５μｇ／μＬ，４．４μＬ）を、ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素非含有水中８０μＬに、希釈した。このプラスミド溶液を、４．８９μｇのＭＡＰ（０．５μｇ／μＬ，９．８μＬ）と混合し、また、ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素非含有水中８０μＬに希釈して、３＋／－の電荷比および０．０１２５μｇ／μＬの最終プラスミド濃度を得た。得られた混合物を、室温にて３０分間にわたってインキュベートした。この溶液に、４８０μｇのボロン酸ＰＥＧ_５Ｋ（化合物６；実施例６）、（２０μｇ／μＬ，２４μＬ）を加えた。次いで、この混合物を、さらに３０分間インキュベートし、ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素非含有水中で、０．５ｍＬ １００，０００ＭＷＣＯ膜（ＢＩＯＭＡＸ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて２回透析し、ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素非含有水１６０μＬ中で再構築した。この溶液の半分を、ゼータ電位測定のために、１．４ｍＬの１ｍＭ ＫＣｌで希釈した（図６）。ＢＡ含有ナノ粒子のゼータ電位は、これを含まないナノ粒子よりも低いゼータ電位を示したことに、留意されたい。これらの結果は、ＢＡ含有ナノ粒子は、ナノ粒子の外側にＢＡを局在させるという結論を、支持する。もう半分を、粒子サイズを測定するために用いた。粒子サイズを、１０．２μＬの１０Ｘ ＰＢＳを添加して最終的に１Ｘ ＰＢＳ中９０．２μＬの溶液を得た後の５分間について、毎分測定した。次いで、図７に示されるように、粒子サイズを、別の１０分間にわたって、毎分測定した。非粒子構成要素から（濾過によって）分離されたＢＡ含有ナノ粒子は、ＰＢＳ中で安定であるが、ＢＡを有さない粒子は、安定ではない。これらの結果は、ＢＡ含有ナノ粒子は、ＰＢＳ中で凝集に対し安定的であるので、その外側に局在するＢＡを有するという結論を、支持する。

【0258】

実施例１３：ＭＡＰ／ｐＤＮＡ粒子のＨｅＬａ細胞内へのトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、トランスフェクションの４８時間前に、ウェルあたり２０，０００個の細胞で、２４ウェルプレート内にまき、１０％ ＦＢＳを補充した培地中で成長させた。ＭＡＰ粒子を、１μｇのｐＧＬ３を２００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ中に、種々のポリマー対ｐＤＮＡの電荷比で含むように処方した（実施例９を参照されたい）。成長培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして粒子処方物を加えた。その後、細胞を、３７℃、５％ ＣＯ_２にて５時間インキュベートした後、８００μＬの１０％ ＦＢＳを補充した成長培地を加えた。４８時間のインキュベーションの後、細胞の画分を、ＭＴＳアッセイを用いた細胞生存率について分析した。残った細胞を、１００μＬの１Ｘルシフェラーゼ培養細胞溶解試薬中で溶解した。ルシフェラーゼ活性を、１０ｕｌの細胞溶解物に１００μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を加えることによって決定し、生物蛍光を、Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて定量した。その後、ルシフェラーゼ活性を、１０，０００個の細胞あたりの相対光単位（ＲＬＵ）として報告する。結果を、図８および図９に示す。

【0259】

実施例１４：ＭＡＰ／ｐＤＮＡ粒子および／又はｓｉＲＮＡ粒子のＨｅＬａ細胞内への同時トランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、トランスフェクションの４８時間前に、ウェルあたり２０，０００個の細胞で、２４ウェルプレート内にまき、１０％ ＦＢＳを補充した培地中で成長させた。ＭＡＰ粒子を、１μｇのｐＧＬ３および５０ｎＭのｓｉＧＬ３を、５＋／－の電荷比で２００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ中に含むように処方した。ｐＧＬ３又はｐＧＬ３およびｓｉＣＯＮのみを含む粒子を、対照として使用した。成長培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして粒子処方物を加えた。その後、細胞を、３７℃、５％ ＣＯ_２にて５時間インキュベートした後、８００μＬの１０％ ＦＢＳを補充した成長培地を加えた。４８時間のインキュベーション後、細胞を、ルシフェラーゼ活性および細胞生存率について、実施例１２に記載したようにアッセイした。結果は図１０に示される。ＲＬＵは、ｓｉＧＬ３（正しい配列）によるトランスフェクションにおいてより低く、ｓｉＧＬ３およびｐＧＬ３の両方が、同時送達されなければならない。

【0260】

実施例１５：ＭＡＰ／ｓｉＧＬ３のＨｅＬａ細胞内へのトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、トランスフェクションの４８時間前に、ウェルあたり２０，０００個の細胞で、２４ウェルプレート内にまき、１０％ ＦＢＳを補充した培地中で成長させた。ＭＡＰ粒子を、５０および１００ｎＭのｓｉＧＬ３を、５＋／－の電荷比で２００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ中に含むように処方した。成長培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして粒子処方物を加えた。その後、細胞を、３７℃、５％ ＣＯ_２にて５時間インキュベートした後、８００μＬの１０％ ＦＢＳを補充した成長培地を加えた。４８時間のインキュベーション後、細胞を、ルシフェラーゼ活性および細胞生存率について、実施例１２に記載したようにアッセイした。結果は図１１に示される。ＲＬＵは、ｓｉＧＬ３の濃度の上昇に伴って低下するので、これらのデータは、内在性遺伝子の疎外が起こり得ることを示唆する。

【0261】

実施例１６：ムチン酸ジヨージドの合成、（１０）
１ｇ（２．７ｍｍｏｌ）のムチン酸ジアミン（実施例３）を、３．８ｍＬ（２７．４ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンおよび５０ｍＬの無水ＤＭＦと混合し、その後、１．２ｍＬ（１３．７ｍｍｏｌ）ヨードアセチルクロリドの滴下を、２５０ｍＬ丸底フラスコにおいて行った。この混合物を、絶え間なく撹拌しながら、室温で一晩反応させた。その後、この溶媒を、バキュームポンプによって除去し、生成物を濾過し、メタノールで洗浄し、真空下で乾燥させて、０．８ｇ（１．３ｍｍｏｌ，４６％）のムチン酸ジヨージドを得た。^１Ｈ ＮＭＲ（（ＣＤ_３）_２ＳＯ）δ ８．２０（ｓ ２Ｈ），２Ｈ），７．７７（ｓ，２Ｈ），４．１１（ｍ，２Ｈ），４．０３（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｍ，２Ｈ），３．１１－３．１７（ｍ，２Ｈ），１．７８（ｄ，２Ｈ）．ＥＳＩ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：６５２．８［Ｍ＋Ｎａ］^＋

【0262】

【化48】

【0263】

実施例１７：ムチン酸ジシステインの合成、（１１）
７ｍＬの０．１Ｍ脱気炭酸ナトリウムを、１７ｍｇのＬ－システインおよび０．４ｇのムチン酸ジヨージドに加えた。得られた懸濁液を、１５０℃で５時間にわたり、溶液が透明になるまで還流させた。次いで、この混合物を、室温まで冷やし、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ ３に調整した。次いで、アセトンのゆっくりした添加を、生成物の析出のために行った。濾過、アセトンによる洗浄、およびバキューム乾燥の後、６０ｍｇの粗生成物を得た。

【0264】

【化49】

【0265】

実施例１７：ムチン酸ジシステインの合成、（１１）
２０ｍＬの、ｐＨ ７．５における５０ｍＬ丸底フラスコ中の０．１Ｍ脱気リン酸ナトリウム緩衝液を、０．３８ｇのＬ－システイン（３．２ｍｍｏｌ）および０．４０ｇ（０．６ｍｍｏｌ）のムチン酸ジヨージドに加えた。得られた懸濁液を、７５℃にて一晩還流させ、室温まで冷やして、凍結乾燥させた。その後、８０ｍＬのＤＭＦを、この凍結乾燥した明るい茶色の粉末に加え、不溶性の過剰な試薬およびリン酸塩の可溶の生成物からの分離を、濾過によって達成した。ＤＭＦを、減圧下で除去し、そしてこの生成物をバキューム乾燥して、１２ｍｇ（０．０２ｍｍｏｌ，３％）のムチン酸ジシステインを得た。

【0266】

【化50】

【0267】

実施例１８：ポリマー合成、（ポリ（ムチン酸－ＤｉＣｙｓ－ＰＥＧ））（１２）
１２ｍｇ（２１．７μｍｏｌ）のムチン酸ジシステインおよび７４ｍｇ（２１．７μｍｏｌ）のＰＥＧ－ＤｉＳＰＡ ３４００を、真空下で乾燥させ、その後、０．６ｍＬの無水ＤＭＳＯを、アルゴン下で、２首１０ｍＬ丸底フラスコにおいて加えた。１０分間の撹拌の後、９μＬ（６５．１μｍｏｌ）の無水ＤＩＥＡを、アルゴン下で反応容器に移した。この混合物を、アルゴン下で一晩撹拌した。次いで、このポリマー含有溶液を、１０ｋＤａ膜遠心分離機を用いて透析し、そして凍結乾燥して、４７ｍｇ（５８％）のポリ（ムチン酸－ＤｉＣｙｓ－ＰＥＧ）を得た。

【0268】

【化51】

【0269】

このポリオール含有ポリマーは、アニオン性ＡＢポリマーである。

【0270】

実施例１９：薬物（カンプトテシン、ＣＰＴ）ムチン酸ポリマーへの共有結合、（１３）
１０ｍｇ（２．７μｍｏｌの反復単位）のポリ（ムチン酸－ＤｉＣｙｓ－ＰＥＧ）を、ガラス瓶内の１．５ｍＬの無水ＤＭＳＯ中に溶解した。１０分間の撹拌の後、１．１μＬのＤＩＥＡ（６．３μｍｏｌ）、３．３ｍｇ（６．３μｍｏｌ）のＴＦＡ－Ｇｌｙ－ＣＰＴ、１．６ｍｇ（８．１μｍｏｌ）のＥＤＣおよび０．７ｍｇ（５．９μｍｏｌ）のＮＨＳを、反応混合物に加えた。８時間にわたる撹拌の後、１．５ｍＬのエタノールを加え、溶媒を減圧下で除去した。析出物を、水中に溶解し、そして不要な物質を、０．２μｍフィルターを通した濾過によって除去した。次いで、ポリマー溶液を、１０ｋＤａ膜を介して水に対して透析し、その後、凍結乾燥して、ポリ（ムチン酸－ＤｉＣｙｓ－ＰＥＧ）－ＣＰＴ結合体を得た。

【0271】

【化52】

【0272】

実施例２０：ＣＰＴ－ムチン酸ポリマー（１３）を有するナノ粒子の水中における処方（２０）
ポリ（ムチン酸－ＤｉＣｙｓ－ＰＥＧ）およびポリ（ムチン酸－ＤｉＣｙｓ－ＰＥＧ）－ＣＰＴ結合体の有効な径を、このポリマーを再蒸留水中に処方し（０．１～１０ｍｇ／ｍＬ）、ＺｅｔａＰＡＬＳ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ）装置を用いた動的光拡散（ＤＬＳ）を介して評価した。各１分間の連続３回のランを、その後記録し、平均化した。両化合物のゼータ電位を、１．１ｍＭ ＫＣｌ溶液中で、ＺｅｔａＰＡＬＳ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ）装置を用いて測定した。次いで、０．０１２の標的残余における連続１０回の自動化したランを行い、結果を平均化した（図４）。詳細には、これらの２つの分布を、ポリ（ムチン酸－ＤｉＣｙｓ－ＰＥＧ）－ＣＰＴ結合体について測定し、主要な分布は、５７ｎｍ（全粒子集団の６０％）であった。２番目に少ない分布もまた、２３３ｎｍにおいて測定される。

【0273】

実施例２１：ＣＰＴ－ムチン酸ポリマーを有するボロン酸－ペグ化ナノ粒子（１３）ボロン酸－ジスルフィド－ＰＥＧ_５０００（６）の水中における処方
ボロン酸ペグ化ポリ（ムチン酸－ＤｉＣｙｓ－ＰＥＧ）－ＣＰＴナノ粒子を、このポリマーを再蒸留水中に０．１ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解し、その後、やはり水中のポリマー６（ＢＡ－ＰＥＧ）を添加して、ポリ（ムチン酸－ＤｉＣｙｓ－ＰＥＧ）－ＣＰＴ結合体におけるムチン酸糖上のＰＢＡ－ＰＥＧ対ジオールの比を１：１にする。この混合物を、３０分間にわたってインキュベートし、その後、有効な径およびゼータ電位を、ＺｅｔａＰＡＬＳ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ）装置を用いて測定する。

【0274】

実施例２２：マウスにおけるｐＤＮＡ送達のための標的化ナノ粒子
プラスミドｐＡｐｏＥ－ＨＣＲＬｕｃは、ルシフェラーゼを発現する遺伝子を含み、肝臓特異的プロモーターの制御下にある。ポリマー（ＭＡＰ）４（０．７３ｍｇ）、ポリマー６（７３ｍｇ）およびポリマー９（０．０７３ｍｇ）を、５ｍＬの水中で合わせ、次いで、１．２ｍＬのｐＡｐｏＥ－ＨＣＲＬｕｃプラスミド含有水を、添加した（＋３のポリマー４対プラスミドの電荷比を得る）。この粒子を、連続的スピン濾過およびその後のＤ５Ｗの添加によって、Ｄ５Ｗ（水中５％グルコース）中に置いた（水中にある開始処方物から始める）。ヌードマウスに、Ｈｅｐａ－１－６肝癌細胞を移植し、腫瘍を、約２００ｍｍ^３の大きさになるまで増殖させた。標的化ナノ粒子の注射を、５ｍｇ／プラスミドｋｇマウスに等しい量で、尾静脈においてｉ．ｖ．で行った。マウスを、注射の２４時間後に画像化した。マウスは、毒性の兆候を示さず、腫瘍の領域においてルシフェラーゼ発現が検出され、肝臓の領域では検出されなかった。

【0275】

実施例２３：ＰＢＡ－ＰＥＧおよびニトロＰＢＡ－ＰＥＧの合成およびｐＫａの測定
安定化した標的化ナノ粒子を調製するため、ボロン酸とＭＡＰとの間の可逆的共有結合特性を用いた。フェニルボロン酸（ＰＢＡ）のｐＫａは、８．８の高さである。ｐＫａを低下させるため、フェニル環において電子吸引性基を有するＰＢＡを、ホウ素原子の酸性度を増すために使用した。市販の３－カルボキシＰＢＡおよび３－カルボキシ５－ニトロＰＢＡを、塩化オキサリルを用いて塩化アシルに変換した。次いで、これらの塩化アシル種を、ＮＨ_２－ＰＥＧと反応させて、ＰＢＡ－ＰＥＧおよびニトロＰＢＡ－ＰＥＧをそれぞれ形成した。ＤＭＦおよびＤＩＰＥＡの塩基の付加は、合成反応を進めるために必要であった。しかし、これらの塩基の存在は、酸性のＰＢＡによって四面体付加物形成を生じた。これらの付加物を除くため、０．５Ｎ ＨＣｌにおける作業およびその後の水に対する透析による中性ｐＨへの平衡化を、行った。

【0276】

ＰＢＡ－ＰＥＧ ２００ｍｇ（１．２１ｍＭ）の合成のために、５ｍＬの無水テトラヒドロフラン中に溶解した３－カルボキシフェニルボロン酸を、アルゴン下で、１８．７μｌ（０．２４ｍＭ）の無水ジメチルホルムアミドに加えた。反応容器を、氷浴に移し、１９５μｌ（２．８９ｍＭ）の塩化オキサリルを、アルゴン下でゆっくりと加えた。反応を、ベント下で、絶え間ない撹拌と共に、室温で２時間進めた。溶媒および過剰な試薬を、真空下で除去した。３７ｍｇ（０．２ｍＭ）の絵れれた乾燥塩化アシル化合物を、１５ｍｌの無水ジクロロメタン中に、アルゴン下で溶かした。次いで、５００ｍｇ（０．１ｍＭ）のＮＨ２－ＰＥＧ５ｋＤａ－ＣＯ２Ｈおよび５２μｌ（０．３ｍＭ）の乾燥ＤＩＰＥＡを、アルゴン下で加えた。絶え間ない撹拌の下での一晩の反応の後、溶媒を、真空下で除去し、乾燥した生成物を、０．５Ｎ ＨＣｌ中で再構築した。この溶液を、０．２μｍフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標））を通し、一定のｐＨを獲得するまで、３ｋＤａ ＭＷＣＯ膜フィルターデバイス（Ａｍｉｃｏｎ（商標））を用いて、水に対して透析した。次いで、上清を、０．２μｍフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標））を用いて濾過し、凍結乾燥して、３７７ｍｇ（７３％）の ＰＢＡ－ＰＥＧ－ＣＯ２Ｈを得た。１Ｈ ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ １２．５２（ｓ，１Ｈ），８．３９（ｔ，１Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，２Ｈ），７．８８（ｄ，１Ｈ），７．８２（ｄ，１Ｈ），７．３９（ｔ，１Ｈ），３．９９（ｓ，２Ｈ），３．３５－３．６２（ＰＥＧピーク）．ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：５６００ｇ／ｍｏｌ（ＮＨ２－ＰＥＧ５ｋＤａ－ＣＯ２Ｈ，５４００ｇ／ｍｏｌ）。

【0277】

【化53】

【0278】

ニトロＰＢＡ－ＰＥＧ－ＣＯ２Ｈの合成を、ＰＢＡ－ＰＥＧ－ＣＯ２Ｈについて、開始物質が３－カルボキシ５－ニトロフェニルボロン酸であるほかは、同じように実施した。この反応は、３９３ｍｇ（７６％）のニトロＰＢＡ－ＰＥＧ－ＣＯ２Ｈを生じた。１Ｈ ＮＭＲ（（ＣＤ３）２ＳＯ）δ １２．５２（ｓ，１Ｈ），８．８９（ｔ，１Ｈ），８．７２（ｓ，１Ｈ），８．６８（ｓ，１Ｈ），８．６４（ｓ，１Ｈ），８．６１（ｓ，２Ｈ），３．９９（ｓ，２Ｈ），３．３５－３．６２（ＰＥＧピーク）．ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（ｍ／ｚ）：５６００ｇ／ｍｏｌ（ＮＨ２－ＰＥＧ５ｋＤａ－ＣＯ２Ｈ，５４００ｇ／ｍｏｌ）。

【0279】

【化54】

【0280】

合成したＰＢＡ化合物のｐＫａは、三方晶立体構造（ｐＨが低い）から四面体立体構造（ｐＨが高い）に変換されたＰＢＡの吸光度における変化の測定によって見出された。０．１Ｍ ＰＢＳ中１０～３Ｍ ＰＢＡの溶液に対し、ｐＨ ７．４を、１Ｎ ＮａＯＨを用いて滴定した。ｐＨを記録し、そして対応するサンプルを、２６８ｎｍにおける吸光度測定のために採取した。

【0281】

【表2】

【0282】

実施例２４：ニトロＰＢＡ－ＰＥＧに対する抗体結合体化
ニトロＰＢＡ－ＰＥＧの生成後、得られた化合物を、抗体に結合体化させた。結合体化のために、３６ｍｇ（６．４μＭ）のニトロＰＢＡ－ＰＥＧ－ＣＯ２Ｈ，１２．３ｍｇ（６４μＭ）の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および１１．１ｍｇ（９６μＭ）のＮＨＳを、２．４ｍｌの０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ ６．０中に溶かした。この混合物を、１５分間にわたって、室温にてロータリーシェイカー上で反応させた。過剰な反応物を、３ｋＤａ分子量カットオフ膜フィルターデバイス（Ａｍｉｃｏｎ（商標））によって透析して除いた。この活性型カルボン酸ＰＥＧ化合物を、０．１Ｍ ＰＢＳ，ｐＨ ７．２中２０ｍｇ（０．１４ｍＭ）のヒトＩｇＧ１抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））に添加した。反応を、回転シェイカー上で、室温で２時間行い、次いで、５０ｋＤａ分子量カットオフ膜フィルターデバイス（Ａｍｉｃｏｎ（商標））を用いて１ｘ ＰＢＳに対してｐＨ ７．４にて４回透析した。質量分析による（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）は、１つの抗体あたり平均１～２個のニトロＰＢＡ－ＰＥＧ化合物の結合体を示した。

【0283】

実施例２６：標的化ＭＡＰナノ粒子の処方および性質決定
ナノ粒子処方および安定性におけるＰＢＡ－ＰＥＧおよびニトロＰＢＡ－ＰＥＧの効果を、試験した。ＰＢＡ－ＰＥＧの溶液を、ＭＡＰの溶液に、３＋／－の電荷比（ｓｉＲＮＡ由来の負電荷あたりのＭＡＰ由来の正電荷）にて、ｐＨ ７．４のリン酸緩衝液中で加えた。この混合物を、ＰＢＡ－ＰＥＧとジオール含有ＭＡＰとの錯体形成のために、室温に１０分間にわたって静置した。次いで、これを、等容量の水中ｓｉＲＮＡに加え、ピペッティングにより混合した。１０分間後、試験および性質決定を行った。粒子の処方物を、ニトロＰＢＡ－ＰＥＧにて安定化し、異なる電荷比を同じ様式で行った。ＰＢＡ－ＰＥＧの複合体形成は、１５０～３００ｎｍの大きさのＭＡＰ／ｓｉＲＮＡ粒子を形成した。ＭＡＰ－４（電荷中心（アミジン）と結合部位（ポリオール）との間の４つのメチレン単位を示す）は、ＭＡＰ－２が使用された場合よりも小さなナノ粒子をもたらした。しかし、塩の添加の際、凝集した全ての粒子が、ＰＢＡ－ＰＥＧがナノ粒子に充分な安定性を与えられないことを示した。ニトロＰＢＡ－ＰＥＧを使用した場合、試験した全ての電荷比、１および３（＋／－）において、粒子は、安定化したナノ粒子を実証した。ＰＢＡ－ＰＥＧとニトロＰＢＡ－ＰＥＧとによって付与された粒子安定性における相違は、ペグ化ボロン酸化合物をポリオールに対するより強い結合を有するよう改変することの重要性を示す。

【0284】

安定化剤ＰＥＧの非存在下でＭＡＰ－４と縮合したｓｉＲＮＡについて、＋３２ｍＶの高いゼータ電位での６４０ｎｍの粒子サイズを観察した。ニトロＰＢＡ－ＰＥＧを添加して粒子を安定化させた場合、径は、１３０ｎｍに減少し、－４ｍＶの負の表面電荷を有した。負電荷は、ボロン酸とジオールとの間の結合の結果である。ニトロＰＢＡ－ＰＥＧと結合体化した０．２５ｍｏｌ％ ＩｇＧ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））を導入した場合、興味深いことに、粒子サイズはさらに８２ｎｍにまで減少し、このとき、ゼータ電位は同様のままであった。

【0285】

種々のＰＥＧ基が結合したＭＡＰ－４／ｓｉＲＮＡナノ粒子についての塩安定性を、評価した。粒子サイズを、ゼータ電位分析器（ＤＬＳ ＺｅｔａＰＡＬＳ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、１分にての５回のランについて、記録した。測定を停止し、１０ｘ ＰＢＳ溶液を添加して粒子を処方したので、得られた粒子は１ｘ ＰＢＳを含んだ。その後測定を再開し、各１分間の１０回の連続したランを記録して、粒子安定性に対する塩添加の効果を研究した。図１６において示されるように、安定化剤ＰＥＧの非存在下で、粒子が凝集した。ニトロＰＢＡ－ＰＥＧが存在した場合、粒子は、塩条件下でも安定したままであった。

【0286】

実施例２７：標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の処方および性質決定
標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子を調製するため、ボロン酸とＭＡＰ（ジオール含有）との間の可逆的共有結合特性を用いた。ＰＢＡとＭＡＰとの間の結合定数は、約２０Ｍ^－１の低さである。結合定数を増大させるため、フェニル環において電子吸引性基を有するＰＢＡを、ホウ素原子の酸性度を増し、ＭＡＰの結合定数を評価するために使用した。市販の３－カルボキシＰＢＡおよび３－カルボキシ５－ニトロＰＢＡを、塩化オキサリルを用いて塩化アシルに変換した。次いで、これらの塩化アシル種を、ＮＨ２－ＰＥＧ－ＣＯ_２Ｈと反応させて、ＰＢＡ－ＰＥＧ－ＣＯ_２ＨおよびニトロＰＢＡ－ＰＥＧ－ＣＯ_２Ｈをそれぞれ形成した。ＤＭＦおよびＤＩＰＥＡの塩基の付加は、合成反応を進めるために必要であった。しかし、これらの塩基の存在は、酸性のＰＢＡによって四面体付加物形成を生じた。これらの付加物を除くため、０．５Ｎ ＨＣｌにおける作業およびその後の水に対する透析による中性ｐＨへの平衡化を、行った。

【0287】

改変ＰＢＡのｐＫａ値を、ｐＨの上昇を伴うＰＢＡの三方晶から四面体形態への立体構造変化に起因する吸光度変化によって決定した（表２）。求電子基を有するＰＢＡは、低いｐＫａをもたらし、最も低い６．８のｐＫａを有するニトロＰＢＡ－ＰＥＧ－ＣＯ_２Ｈをもたらした。従って、生理学的ｐＨにおいて、ＰＢＡの殆どは、反応性のアニオン性四面体形態で存在する。ＰＢＡとＭＡＰとの間の結合定数は、０．１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ ７．４中でのＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓとの競合的結合によって見出された。ニトロＰＢＡ－ＰＥＧ－ＣＯ_２Ｈについて観察したＭＡＰの、低いｐＫａ値および高い結合定数ゆえに、これを、ＩｇＧ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））とＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子との間のリンカーとして選択した。

【0288】

ＩｇＧ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））とニトロＰＢＡ－ＰＥＧ－ＣＯ_２Ｈとの間の結合体化反応を、ＥＤＣカップリング（上述）を介して進めた。ＩｇＧ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））抗体１つあたり、平均１～２のＰＥＧが結合した。

【0289】

【表3】

^ａムチン酸ジ（Ａｓｐ－アミン）あたり等量のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を加えた。^ｂＭＷ、（Ｍｗ＋Ｍｎ）／２として決定した分子量；Ｍｗ，重量平均分子量；Ｍｎ，数平均分子量。^ｃＭｗ／Ｍｎとして決定した多分散性。

【0290】

約４０ｎｍの平均サイズが、標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子について、ＤＬＳおよびｃｒｙｏ－ＥＭ（表３）によって観察された。非標的化ナノ粒子からの約１０ｎｍの増大は、ＩｇＧ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））のナノ粒子への結合を示す（量は、ナノ粒子１つあたり約１のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）であった）。実際、ｃｒｙｏ－ＥＭ画像から、標的化ナノ粒子は、球形ではなく、抗体の結合を示す突出を有することがわかった。標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の表面電荷は、ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子よりも、ｐＨ ７．４におけるハーセプチンの正電荷の存在に起因して、わずかに高かった（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のｐＩ，９．２）。

【0291】

実施例２８：細胞取り込み研究
ＨＥＲ２を過剰発現するヒト乳癌細胞株（ＢＴ－４７４）を、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子対非標的化ナノ絵融資の細胞取り込みを試験するために使用した。ＨＥＲ２ネガティブな乳癌細胞株（ＭＣＦ－７）を、ネガティブ対照として使用した。これらの研究のために、２４ウェルプレートに、それぞれＢＴ－４７４（１０％ウシ胎仔血清を補ったＲＰＭＩ－１６４０培地中）又はＭＣＦ－７（１０％ウシ胎仔血清を補ったダルベッコ改変イーグル培地）（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、ウェルあたり２０，０００個の細胞でまき、５％ ＣＯ_２を有する湿潤化オーブン内で３７℃に保った。４０時間後、培地を、０．３ｍｌの新鮮な培地と入れ替えた。培地はそれぞれ、培地ＭＡＰ－ＣＰＴ（４０μｇ ＣＰＴ／ｍｌ）、遊離のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を１０ｍｇ／ｍｌで含む培地ＭＡＰ－ＣＰＴ、種々の標的密度での標的化ＭＡＰ－ＣＰＴ（４０μｇ ＣＰＴ／ｍｌ）又は遊離のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を１０ｍｇ／ｍｌで含む標的化ＭＡＰ－ＣＰＴ含んだ。トランスフェクションを、３０分間にわたって３７℃にて実施した。処次いで、処方物を除去し、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞の脱着および溶解のために、１ウェルあたり２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えた。次いで、溶解した細胞を、４℃にて１５分間にわたってインキュベートし、１４，０００ｇにて１０分間にわたり４℃にて遠心分離した。上清の一部を、ＢＣＡアッセイによるタンパク質定量のために用いた。別のタンパク質に、等量の０．１Ｎ ＮａＯＨを加え、室温で一晩インキュベートして、蛍光を３７０／４４０ｎｍにて、既知の濃度のＭＡＰ－ＣＰＴを標準として用いて測定した。

【0292】

ＢＴ－４７４細胞株において、非標的化ナノ粒子と比較して約７０％高い取り込みを達成するために、ナノ粒子あたり１つのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）－ＰＥＧ－ニトロＰＢＡが充分であることを、観察した（図１７Ａ）。標的化ＭＡＰ－ＣＰＴのＢＴ－４７４細胞における取り込みは、遊離のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の存在下での疎外を示した（図１７Ｂ）。対照的に、ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子のＭＣＦ－７における取り込みは、遊離のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の存在下で、標的化への依存を示さなかった（図２Ｂ）。これらのデータは、ＢＴ－４７４細胞において、標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子による、ＨＥＲ２レセプターの結合を介する、レセプター媒介型取り込みが存在することを示す。標的化および非標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の両方の細胞取り込みはまた、非特異的液相エンドサイトーシスを介しても起こった。

【0293】

実施例２９：インビトロ放出研究
短型、中型、長型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子からのＣＰＴの放出を評価する実験を行った。これらの研究を、１ｘ ＰＢＳ中０．３２ｍｇ ＣＰＴ／ｍｌ（ｐＨ ６．５，７又は７．４）；３ｍｇ／ｍｌの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を含むＢＡＬＢ／ｃマウス血漿、ヒト血漿、および１ｘ ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）、又は１００単位／ｍｌのブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣＨＥ）又はＬＤＬとＢＣＨＥとの組み合わせを用いて行った。

【0294】

平衡化のために、９６ウェルプレートにピペット分配した培地を、３７℃にて、湿潤化オーブン内で、２時間にわたってインキュベートした。処方物を、対応する培地中に混合し、オーブン内に戻した。サンプルを、所定の時点で取り出し、分析の時点まで、－８０℃で直ちに凍結した。ＢＡＬＢ／ｃマウス血漿およびヒト血漿中の放出について、インキュベーションを、湿潤化オーブン内で、３７℃にて５％ ＣＯ_２を（生理的ｐＨレベルにて血漿中での主要なｐＨ緩衝系である炭酸／二酸化炭素緩衝系を維持するために）用いて行った。

【0295】

未結合体化ＣＰＴの量を、まず、１０μｌのサンプルを１０μｌの０．１Ｎ ＨＣｌと混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、８０μｌのメタノールを添加し、この混合物を、タンパク質沈殿のために、室温で３時間にわたってインキュベートした。この混合物を、１４，０００ｇにて１０分間にわたって４℃にて遠心分離し、上清を、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＬＨ）で濾過し、メタノールで２０倍に希釈し、そして得られた溶液の１０μｌを、ＨＰＬＣに注入した。溶出したＣＰＴ（７．８分にて）のピーク面積を、対照のそれと比較した。ＣＰＴの全量を測定するため、１０μｌのサンプルを、６．５μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨと混合した。この溶液を、室温で１時間にわたってインキュベートし、ＣＰＴを親ポリマーから放出させた。次いで、１０μｌの０．１Ｎ ＨＣｌを添加し、カルボキシレートＣＰＴ形態をラクテート状態に変換した。その後、７３．５μｌのメタノールを添加し、そして混合物を、３時間にわたって室温でインキュベートした。次いで、サンプルを遠心分離し、上のように処理した。ポリマー結合ＣＰＴ濃度を、全ＣＰＴ濃度と未結合体化ＣＰＴ濃度との差から決定した。

【0296】

ＣＰＴの短型、中型および長型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子からの放出は、全て、一次速度論を示した。ＣＰＴの短型、中型および長型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子からの放出半減期は、試験した全ての条件において類似していた。他方で、標的化ＭＡＰ－ＣＰＴについては、より長い半減期を観察した（表４）。放出速度とｐＨとの強い依存性を観察した。ｐＨが６．５から７．４に上昇するに伴い、放出半減期は、短型、中型および長型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子について、３３８時間から５８時間に短縮した。これらのデータは、加水分解が、ＣＰＴの放出において重要な役割を果たすことを示す。短型、中型および長型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子について、５９時間の放出半減期を、ＢＡＬＢ／ｃマウス血漿中で観察し、他方で、著しく短い３８時間の半減期を、ヒト血漿中で観察した。マウス血漿は、ヒト血漿よりも高いエステラーゼ活性を有し、他方、ヒト血漿は、マウス血漿よりも「高脂肪」であることが公知である。従って、ヒト血漿とマウス血漿との間の放出速度の相違を知るために、エステラーゼおよび脂肪のＣＰＴ放出速度に対する寄与を、個別に試験した。ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣＨＥ）は、マウス血漿およびヒト血漿の両方に存在し、これを、放出速度に対するエステラーゼの寄与を試験するために使用した。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を、「脂肪」の放出速度に対する寄与を紙面するために、選択した。これらの構成要素を、ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）中に含めた。ＢＣＨＥの存在は、放出速度に影響しないことが見出された（短型、中型および長ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子ナノ粒子についての、ＰＢＳ中ｐＨ ７．４における５８時間と比較して、６１時間の半減期だった）。しかし、ＬＤＬの添加は、放出速度を劇的に伸ばした。この効果は、おそらく、競合的疎水性相互作用によるナノ粒子破壊に起因する。従って、「脂肪」の存在によるナノ粒子破壊およびその後の加水分解によるＣＰＴ開裂は、ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子からのＣＰＴ放出の主なメカニズムとは異なると考えられる。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子からの放出は、非標的化バージョンよりも長い半減期を示す。９．２のｐＩを有するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の存在は、静電相互作用により、およびそれによって競合する疎水性相互作用の幾つかからナノ粒子を保護するので、負に帯電したナノ粒子の安定性を増大することができる。

【0297】

【表4】

【0298】

略語：ＰＢＳ、リン酸緩衝化生理食塩水；ＬＤＬ，低密度リポタンパク質；ＢＣＨＥ，ブチリルコリンエステラーゼ^ａＰＢＳ，ｐＨ ７．４，３ｍｇ／ｍｌ ＬＤＬ含有^ｂＰＢＳ，ｐＨ ７．４，１００単位／ｍｌ ＢＣＨＥ含有^ｃＰＢＳ，ｐＨ ７．４，３ｍｇ／ｍｌ ＬＤＬおよび１００単位／ｍｌ ＢＣＨＥ含有

【0299】

実施例３０：細胞毒性アッセイ
中型ＭＡＰ、ニトロＰＢＡ－ＰＥＧ、ＣＰＴ、中型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子、標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のインビトロ細胞毒性を、２つのＨＥＲ２＋乳癌細胞株（ＢＴ－４７４，ＳＫＢＲ－３）および２つのＨＥＲ２－乳癌細胞株（ＭＣＦ－７，ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）において評価した（表５）。これらの研究のために、５％ ＣＯ_２を有する湿潤化オーブン内で、細胞を３７℃に保った。ＢＴ－４７４、ＭＣＦ－７、ＳＫＢＲ－３およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ダルベッコ改変イーグル培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ改変培地、並びにダルベッコ改変イーグル培地において、それぞれインキュベートした（全て、１０％ウシ胎仔血清を補った）。ウェルあたり３，０００この細胞を、９６ウェルプレートにプレート培養した。２４時間後、培地を除去し、種々の濃度の中型ＭＡＰ、ニトロＰＢＡ－ＰＥＧ、ＣＰＴ、中型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子、標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子又はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）新鮮な培地と置き換えた。７２時間のインキュベーション後、処方物を、新鮮な培地と置き換え、２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ウェルあたりに加えた。これを、２時間にわたって３７℃にて５％ ＣＯ_２の湿潤化オーブン内でインキュベートし、その後、４９０ｎｍにて吸光度の測定を行った。未処理細胞を含むウェルを、対照として用いた。

【0300】

中型ＭＡＰおよびニトロＰＢＡ－ＰＥＧは、それぞれ５００μＭおよび１０００μＭ（試験した最も高い濃度）のＩＣ_５０値を与え、これは、最小の細胞毒性を示す。ＣＰＴ、中型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子のＩＣ_５０濃度は、ＣＰＴの含量に基づく。ＣＰＴは、中型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子から、徐々に放出されたことに留意されたい（インビトロ放出研究を参照されたい）。さらに、細胞によるナノ粒子取り込みは、エンドソームの酸性の性質に起因して、長い放出時間をもたらした。これらの因子は、中型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子について観察した、ＣＰＴよりＩＣ_５０値に寄与する（表５）。ＨＥＲ２＋細胞株において、標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子は、ＭＡＰ－ＣＰＴ単独と比較して低いＩＣ_５０値をもたらした。他方、ＨＥＲ２－細胞株は、標的化はＩＣ_５０に影響を及ぼさなかった。ＢＴ－４７４は、ＣＰＴに対し、従って中型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子に対し、最も耐性の細胞株であった。ハーセプチンの、０．００１～０．５μＭの濃度での、ＢＴ－４７４細胞又はＳＫＢＲ－３細胞への添加は、未処理対照と比較して、約６０％の一定の細胞生存率をもたらした。これらの細胞株についてのこの濃度範囲にわたる真のＩＣ_５０値の欠如は、これまでに観察されている（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８，９２８０～９２９０（２００８））。０．５μＭまでのハーセプチン濃度において、ＨＥＲ２－細胞株は、何ら効果が観察されなかった。

【0301】

【表5】

^ａｎｏ ｖａｌｕｅ、０．００１～０．５μＭの濃度範囲にわたり、ＩＣ_５０値が得られなかった。

【0302】

実施例３１：薬物動態学研究
短型、中型および長型のＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の、１０ｍｇ／ｋｇ（ＣＰＴに基づく）注射における血漿薬物動態学研究を、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて行った（図１８）。これらの研究のために、０．９ｗｔ％ ＮａＣｌ（非標的化ナノ粒子）又はＰＢＳ（標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子）中に処方されたナノ粒子を、ボーラス尾静脈注射を介して、１２～１６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した。所定の時点で、伏在静脈を介して血液採集管（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ＣＢ ３００ ＥＤＴＡ，Ｓａｒｓｔｅｄｔ）で血液を採集した。直ちに、サンプルを、１０，０００ｇ、４℃で、１５分間にわたって遠心分離し、上清を取り出し、分析の時点まで－８０℃で保存した。未結合体化およびポリマー結合ＣＰＴの分析は、以下であった。未結合体化ＣＰＴの量を、まず、１０μｌのサンプルを１０μｌの０．１Ｎ ＨＣｌと混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、８０μｌのメタノールを添加し、この混合物を、タンパク質沈殿のために、室温で３時間にわたってインキュベートした。この混合物を、１４，０００ｇにて１０分間にわたって４℃にて遠心分離し、上清を、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＬＨ）で濾過し、メタノールで２０倍に希釈し、そして得られた溶液の１０μｌを、ＨＰＬＣに注入した。溶出したＣＰＴ（７．８分にて）のピーク面積を、対照のそれと比較した。ＣＰＴの全量を測定するため、１０μｌのサンプルを、６．５μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨと混合した。この溶液を、室温で１時間にわたってインキュベートし、ＣＰＴを親ポリマーから放出させた。次いで、１０μｌの０．１Ｎ ＨＣｌを添加し、カルボキシレートＣＰＴ形態をラクテート状態に変換した。その後、７３．５μｌのメタノールを添加し、そして混合物を、３時間にわたって室温でインキュベートした。次いで、サンプルを遠心分離し、上のように処理した。ポリマー結合ＣＰＴ濃度を、全ＣＰＴ濃度と未結合体化ＣＰＴ濃度との差から決定した。Ｓｕｍｍｉｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｍｏｎｔｒｏｓｅ，ＣＯ）によるＮｏｎ－ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌモデリングソフトウェアＰＫ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ２．０を、薬物動態学データ分析のために使用した。全ての動物を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅによって処理し、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる認可を得た。

【0303】

全てのナノ粒子についてのポリマー結合ＣＰＴは、迅速な再分布相（α）および長い消去相（β）を有する二相性プロフィールを示した（図１８Ａ）。中型および長型のＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の消去相は、特に、半減期をそれぞれ１６．６時間および１７．６時間に延長し、それぞれ２２９８および３６３６μｇ×時間／ｍｌの高い曲線化面積（ＡＵＣ）値を与えた。さらに、これらは、低容量の分布率およびクリアランス率を示した。注射の２４時間後、中型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の注射用量の１１．３％および長型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の２０．５％が、ポリマー結合ＣＰＴとして、なおも血漿中の循環に残っていた。対照的に、ＣＰＴのみを１０ｍｇ／ｋｇで注射されたマウスは、たったの１．６μｇ×時間／ｍｌのＡＵＣおよび８時間後に循環中に残存する用量０．０１％である、迅速なクリアランスを示した。中型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の標的化は、再分布相を増大し、消去相を２１．２時間まで延長し、２７６６μｇ×時間／ｍｌの高いＡＵＣ値を伴って、薬物動態学に影響を及ぼした。全てのナノ粒子についての血漿中の未結合ＣＰＴの量は、全ての時点において、低かった（図１８Ｂ）。

【0304】

実施例３２：ヌードマウスにおける最大許容用量（ＭＴＤ）の決定
ＭＴＤ値を、雌Ｎｃｒヌードマウスにおいて決定し、１５％未満の体重減少を伴い且つ処置関連の死をもたらさない最高の用量として規定した。これらの実験において、１２週齢の雌ＮＣｒヌードマウスを、無作為に、各郡５匹を含む１３の群に分けた。処方物中型ＭＡＰ又はニトロＰＢＡ－ＰＥＧを２００ｍｇ／ｋｇ、短型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子を１０、１５又は２０ｍｇ／ｋｇ（ＣＰＴに基づく）、中型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子を８、１０又は１５ｍｇ／ｋｇ（ＣＰＴに基づく）、長型ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子を５、８又は１０ｍｇ／ｋｇ（ＣＰＴに基づく）および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子を８又は１０ｍｇ／ｋｇ（ＣＰＴに基づく）、０日目および７日目に、尾静脈の静脈内注射を介して投与した。標的化ＭＡＰ－ＣＰＴを除く全ての注射を、０．９ｗ／ｖ％生理食塩水中に処方し、標的化ＭＡＰ－ＣＰＴを、ＰＢＳ，ｐＨ ７．４中に処方した。処置の開始から２週間にわたり、マウスの体重および健康を記録し、モニタリングした。ＭＴＤを、１５％未満の体重減少を伴い且つ処置関連の死をもたらさない最高の用量として規定した。動物を、ＭＴＤについての基準を超えたか、又は研究の最後に、ＣＯ_２窒息によって安楽死させた。

【0305】

中型ＭＡＰ、ニトロＰＢＡ－ＰＥＧ、短型、中型および長型ＭＡＰ－ＣＰＴ並びに標的化ＭＡＰ－ＣＰＴで処置されたマウスを、０日目および７日目に、週２回、体重測定し、そして健康についてモニタリングした（表６）。マウスの体重および健康は、高用量の中型ＭＡＰ又はニトロＰＢＡ－ＰＥＧでの処置によって影響を受けず、このことは、これらのポリマー構成要素について毒性が最小限であることを示す。ＣＰＴを含む群について、最大の体重減少が、各処置の３～５日目に見られた。殆どの群が、減少した体重を取り戻した。体重減少が続き、平均１５％を超えた場合、研究をやめた。中型ＭＡＰ－ＣＰＴを１５ｍｇ／ｋｇおよび長型ＭＡＰ－ＣＰＴを１０ｍｇ／ｋｇで処置した幾匹かのマウスは、下痢を示し、弱って見えた。他のマウスは全て、健康に見えた。ＭＴＤ値は、短型、中型、長型ＭＡＰ－ＣＰＴおよび標的化ＭＡＰ－ＣＰＴについて、それぞれ２０、１０、８および８ｍｇ／ｋｇ（ＣＰＴに基づく）であると見出された（表６）。

【0306】

【表6】

^ａＭＡＰ－ＣＰＴを含む全ての群は、ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇに基づく。^ｂ最大体重減少百分率。^ｃ１５％を超える体重減少のために処分した動物。

【0307】

実施例３３：ヌードマウスにおける生体分布
マウスおいて標的化ナノ粒子の生体分布を評価するために、７週齢のＮＣｒヌードマウスに、１７β－エストラジオールペレットを皮下移植した。２日後、ＲＰＭＩ－１６４０培地中に浮遊させたＢＴ－４７４癌種細胞を、右前脇腹に、１０００万細胞／動物で皮下注射した。処置を、腫瘍が２６０ｍｍ^３の平均サイズに達した後に開始した。動物を、各群６匹の２つの群に無作為化し、尾静脈に静脈内注射によって、５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇのＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子（ＰＢＳ中，ｐＨ ７．４）又は５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇの標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子および２９ｍｇのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｋｇ（ＰＢＳ中，ｐＨ ７．４）で処置した。４時間後および２４時間後、各群のこれらの動物から、伏在静脈出血を介して血液を採集した。次いで、動物をＣＯ_２窒素によって安楽死させ、ＰＢＳに浸した。腫瘍、肺、心臓、脾臓、腎臓および肝臓を回収し、２つの同じ大きさの片に切り分けた。１片を、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ）中に包埋し、他をエッペンドルフ管に収集し、その両方を、直ちに－８０℃にて、処理の時点まで凍らせた。

【0308】

器官を、重量測定し、各１００ｍｇを、０．６４ｃｍ（１／４インチ）セラミック球（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ）を加えたＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ａホモジナイザー管内に置いた。１ｍｌのＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、そして組織を、ＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）－２４ホモジナイザー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ）を用いて６ｍ／秒にて３０秒間にわたってホモジナイズした。これを、各回の間の１分間の氷上での冷却と共に３回繰り返した。次いで、サンプルを、１４，０００ｇにて１５分間にわたり、４℃で遠心分離した。未結合体化ＣＰＴの量を、まず、１０μｌの上清を１０μｌの０．１Ｎ ＨＣｌと混合し、室温で３０分間にわたってインキュベートし、次いで、８０μｌのメタノールを加えて、タンパク質沈殿のために室温で３時間にわたってインキュベートすることによって、測定した。この混合物を、１４，０００ｇにて１０分間４℃で遠心分離し、上清を、０．４５μｍ フィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＬＨ）で濾過し、１０μｌの得られた混合物を、ＨＰＬＣに注入した。溶出したＣＰＴ（７．８分にて）のピーク面積を、対照のそれと比較した。ＣＰＴの全量を測定するため、１０μｌのサンプルを、６．５μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨと混合した。この溶液を、室温で１時間にわたってインキュベートし、ＣＰＴを親ポリマーから放出させた。次いで、１０μｌの０．１Ｎ ＨＣｌを加え、カルボキシレートＣＰＴ形態からラクトン形態に変換させた。その後、７３．５μｌのメタノールを添加し、そして混合物を、３時間にわたって室温でインキュベートした。次いで、サンプルを遠心分離し、上のように処理した。

【0309】

腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、腎臓および肺の１グラムあたりの全ＣＰＴの平均百分率注射用量（ＩＤ）を、図１９Ａに示す。投薬の４時間後、全ＣＰＴの５．３および５．２％ ＩＤが、それぞれ、ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子で処置したマウス腫瘍の１グラムあたりで存在した。処置の２４時間後、全ＣＰＴの２．６％ ＩＤが、ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子で処置されたマウスの腫瘍の１グラムあたりに存在し、他方、全ＣＰＴの３．２％ ＩＤが、標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子を受けたマウスの腫瘍１グラムあたりで存在した。これらのデータは、非標的化バージョンと実質的に同じサイズおよび表面電荷の標的化ナノ粒子が、非標的化バージョンの腫瘍局在よりも腫瘍局在を増大することなく、他の報告された観察と一致したことを示す。ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子で処置されたマウスは、心臓、肝臓、腎臓および肺において同様のＣＰＴ分布をもたらした。しかし、脾臓において、標的化ＭＡＰ＾ＣＰＴ対非標的化についての比較的高い量の全ＣＰＴ蓄積が、２４時間時点であった。この効果は、マウスにおけるヒト化抗体について、以前に観察されている。

【0310】

図１９Ｂは、腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、腎臓および肺のそれぞれの器官における未結合体化ＣＰＴの平均百分律を示す。心臓、肝臓、脾臓、腎臓および肺における未結合体化ＣＰＴの百分率は、４時間および２４時間の両時点において低かった。このことは、これらの器官からの遊離のＣＰＴの迅速なクリアランスを示す。２４時間時点の腫瘍において、４時間時点と比較して、ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の両方について有意に高い未結合体化ＣＰＴの百分率があった。腫瘍内における遊離のＣＰＴの保有率は、ＣＰＴの細胞性蓄積を示唆する。標的化ナノ粒子は、４時間および２４時間の両時点で、マウスの腫瘍において非標的化ナノ粒子よりも未結合体化ＣＰＴのわずかに高い百分率を示す。

【0311】

血漿におけるＣＰＴの全濃度および血漿中で全未結合体化であるＣＰＴの百分率は、ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の両方について、同様であった（図１９Ｃ）。４時間後、１７および２０μｇ／ｍｌの全ＣＰＴが、それぞれＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子についての血漿中に残留していた。２４時間後、血漿中に残留する全ＣＰＴの量は、ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子および標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子の両方について同じであり、１２μｇ／ｍｌであった。血漿中で未結合体化である全ＣＰＴの百分率は、全ての条件について３％未満であった。このことは、血漿からの未結合体化ＣＰＴのわずかな放出および迅速なクリアランスを示す（図１９Ｄ）。

【0312】

実施例３３：標的化ナノ粒子による腫瘍の処置
ＢＴ－４７４腫瘍保有Ｎｃｒヌードマウスを、ＭＡＰ－ＣＰＴ（５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ）又は標的化ＭＡＰ－ＣＰＴ（５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ，２９ｍｇハーセプチン／ｋｇ）のいずれかによって処置した。４時間および２４時間後、マウスを安楽死させ、そして腫瘍を切除し、クライオスタットを用いて、２０～３０μｍ厚の切片にした。腫瘍切片を、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライドガラス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ）上に置き、－８０℃にて処理の時点まで保存した。スライドガラスを解凍し、組織切片を、スライドガラス上で、１０％ホルマリン溶液で１５分間にわたり直接固定した。次いで、このスライドガラスを、ＰＢＳで各５分間３回洗浄し、５％ヤギ血清ブロッキング緩衝液中で１時間にわたりブロックした。ＣＰＴは、４４０ｎｍにおける発光で、天然に蛍光を発する。ＭＡＰの位置を同定するため、ＭＡＰ内のＰＥＧを、内部ＰＥＧ単位を認識するラット抗ＰＥＧ一次抗体で１４μｇ／ｍｌにて染色し、４℃で一晩インキュベートした。この後、３回のＰＢＳ洗浄および２μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ラットＩｇＭ二次抗体と共に１時間のインキュベーションを行った。次いで、このスライドガラスを、ＰＢＳで３回洗浄し、２μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体と共に１時間にわたってインキュベートして、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を可視化した。このスライドガラスを、ＰＢＳでさらに３回洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬でマウントして、画像化まで４℃で保存した。画像を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、６３ｘ Ｐｌａｎ－Ｎｅｏｆｌｕａｒ ｏｉｌ対物レンズを用いて撮影した。７２０ｎｍにおける２－光子励起（発光フィルターＢＰ ３９０－４６５ｎｍ）を用い、ＣＰＴを検出した。４８８ｎｍにおける励起（発光フィルターＬＰ ５３０）および６３３ｎｍ（発光フィルターＢＰ ６４５－７００ｎｍ）を用いて、それぞれＰＥＧおよびハーセプチンを検出した。全てのレーザーおよび獲得設定を、画像化の最初に設定し、変更しなかった。画像分析を、Ｚｅｉｓｓ ｌｓｍ画像ブラウザにおいて行った。

【0313】

図２０Ａは、ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子で処置した４時間後のマウスの腫瘍切片を示す。ＣＰＴシグナルが、散在していた。ＣＰＴおよびＭＡＰについてのシグナルが、重ねた画像において共に局在しているように見えた。注射の２４時間後、ＣＰＴシグナルの蓄積が、点状に存在した（図２０Ｂ）。重ねた画像は、ＣＰＴとＭＡＰとの一緒の局在を示唆した。標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子で処置したマウスについて、ＣＰＴ蓄積を示す点が、処置の４時間後および２４時間後の両方で観察された（図２０Ｃおよび２０Ｄ）。重ねた画像において、ＣＰＴシグナルとＭＡＰシグナルとの一緒の局在が存在した。標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子におけるハーセプチンの存在は、非標的化バージョンにおける弱いバックグラウンドシグナルと比較して、ハーセプチンチャネルにおける強い青色のシグナルによって示される。

【0314】

実施例３３：ヌードマウスにおける抗腫瘍効力研究
ＢＴ－４７４は、カンプトテシンを含む抗癌剤に対し最も抵抗性の乳癌の１つである。ヌードマウスにおける腫瘍増殖を促進するために、１７β－エストラジオールペレットを、７週齢のＮｃｒヌードマウスに移植し、２日後にＢＴ－４７４腫瘍細胞移植を行った。０日目（移植の５日後）、各群の腫瘍サイズは、平均２５０ｍｍであった。処置を、１日目に開始した。動物を、各群６～８匹ずつ９つの群に無作為化し、以下のいずれかで処置した：ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子、１ｍｇ又は８ｍｇ／ｋｇ（ＣＰＴに基づく、ＰＢＳ中、ｐＨ ７．４）；ＣＰＴ、８ｍｇ／ｋｇ（２０％ ＤＭＳＯ，２０％ ＰＥＧ ４００，３０％エタノールおよび３０％ １０ｍＭ ｐＨ ３．５リン酸中に溶解）；イリノテカン、８０ｍｇ／ｋｇ（５ｗ／ｖ％デキストロース溶液，Ｄ５Ｗ中）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、２．９又は５．９ｍｇ／ｋｇ（ＰＢＳ中，ｐＨ ７．４）；標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子、ＣＰＴ／ｋｇおよび２．９ｍｇ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｋｇ、又は１ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇおよび５．９ｍｇ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｋｇ（ＰＢＳ中，ｐＨ ７．４）；又は生理食塩水。全ての処置を、新鮮に調製し、尾静脈の静脈内注射を介して与えた。注射を、マウスの体重２０ｇあたり１５０μｌにて正規化した。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を含む処置を、１週間に１度２週間与え、全ての他の群を、１週間に１度３週間与えた。腫瘍サイズを、ノギス測定（長さ×幅^２／２）を用いて週に３回記録し、動物の健康を、連続的にモニタリングした。動物を、腫瘍体積が１０００ｍｍ^３を超えたときに安楽死させた。処置の開始から６週間後、動物を、ＣＯ_２窒息によって安楽死させた。この研究の結果を、図２１および表７に示す。

【0315】

生理食塩水を投与した対照群の動物の腫瘍は、迅速に成長した（図２１）。２８日後、８匹のうち５匹のマウスが、１０００ｍｍ^３のサイズ限界を超える腫瘍を有した。この群の全ての動物を、この時点で安楽死させた。

【0316】

ＣＰＴ（８ｍｇ／ｋｇ）で処置した群は、対照群と比較して、何ら腫瘍阻害をもたらさなかった（Ｐ＞０．０５）。１および３の処置関連死が、それぞれ９日目および１６日目に記録され、並びに、２８日目に、腫瘍のサイズ制限を超えたことによる４例の安楽死が記録された。研究の最終日まで生存した動物はなかった。

【0317】

イリノテカン８０ｍｇ／ｋｇで処置されたマウスは、対照群と比較して有意でない腫瘍阻害を示した（Ｐ＞０．０５）。１例の腫瘍関連死が、１１日目に起きた。研究の最終日に、腫瘍サイズは平均で５７５ｍｍ^３に達した。

【0318】

ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子を８ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇで受けた動物は、対照群の腫瘍阻害と比較して、非常に有意な腫瘍阻害を示した（Ｐ＜０．０１）。研究の最終日に、平均腫瘍サイズは、６３ｍｍ^３に達し、８匹のうち３匹は、腫瘍サイズが０にまで縮小した。ＭＡＰ－ＣＰＴ、８ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇで処置した非腫瘍保有ＮＣｒヌードマウスを用いたＭＴＤ研究において、死亡は発生しなかったが、研究の２１日目に、体重減少に起因する１例の死が起きた。このことは、この研究において腫瘍負荷を加えたことおよび／又はこの研究に使用したマウスが７週齢であり、他方で、ＭＴＤ研究においては、１２週齢のマウスが使用されたことによる可能性がある。

【0319】

Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）５．９ｍｇ／ｋｇで処置された動物は、対照群と比較して非常に有意な腫瘍阻害を示した（Ｐ＜０．０１）。処置の１１日目に、処置した８匹の動物のうち７匹が、０にまで縮小した腫瘍を有した。しかし、研究の最終日に、縮小した腫瘍のうちの２つは再発し、０容積の腫瘍を有する全部で５匹の動物を生じ、群平均腫瘍体積は６０ｍｍ^３であった（図２２）。ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子で１ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇにて処置したマウスを、抗腫瘍効果が観察されなかったことにより、早く処分した。それにもかかわらず、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、５．９ｍｇ／ｋｇを、ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子に対し、ニトロＰＢＡ－ＢＡリンカーを介して、標的薬剤として、１ｍｇ／ｋｇの低容量で加えた場合（標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子、５．９ｍｇＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｋｇおよび１ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇ）、全ての腫瘍は、処置の９日目に０に縮小し、研究の最終日までそのままであった（図２２）。１例の非腫瘍関連死が、３７日目に起きた。この結果は、対照群と比較して非常に有意である（Ｐ＜０．０１）。これらの３つの群について観察された結果の組み合わせは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の本来の活性に加えて、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）標的薬剤を加えることにより、効力の改善があったことを示す。

【0320】

Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）２．９ｍｇ／ｋｇで処置された動物は、研究の最終日までに、０まで縮小した腫瘍を有する２匹の動物を生じた。しかし、平均腫瘍サイズは、研究の開始から、２７８ｍｍ^３にまで増大した。この結果は、対照群と比較して有意である（０．０１≦Ｐ≦０．０５）。動物が、０．５ｍｇ ＣＰＴ／ｋｇおよび２．９ｍｇ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｋｇを含む標的化ＭＡＰ－ＣＰＴナノ粒子で処置された場合、２つの腫瘍が、０にまで縮小した。研究の最終日に、腫瘍サイズは平均で１４１ｍｍ^３に縮小した。この結果は、対照群と比較して非常に有意である（Ｐ＜０．０１）。これらの結果は、さらに、腫瘍阻害の標的化の利益を示唆する。

【0321】

１７β－エストラジオールペレット移植の５週間後、処置群に関係なく数匹のマウスが、膨張した膀胱および腹部膨満を有することが観察された。これは、無胸腺ヌードマウスにおいて水腎症および閉尿を生じる１７β－エストラジオールペレットを使用したことに起因する可能性が高い。処置の６週間後、症状は悪化し、多くのマウスが、膨張した膀胱および腹部膨満の発症を観察され、それにより、安楽死させて、研究を終了した。

【0322】

【表7】

^ａＮ_開始は、研究開始時の動物の数であり、Ｎ_終了は、研究の最後に生存していた動物の数である。^ｂＮ_ＴＲＤは、処置関連死の数、Ｎ_ＮＴＲＤは、非処置関連死の数、Ｎ_{ｅｕｔｈａｎ}は、腫瘍サイズ制限の１０００ｍｍ^３を超えたことによって安楽死させた動物の数である。^ｃＮ_{０まで縮小}は、研究の最終日に腫瘍が０まで縮小した動物の数である。

【0323】

上に示した実施例は、当業者に完全な開示および本開示の粒子、組成物、システムおよび方法の実施形態を作製および使用する方法を与えるために提供され、本開示に関して本発明者らが考える範囲を限定することを企図しない当業者に明らかな、本開示を実施する上述様式の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが企図される。本明細書中で言及された全ての特許および刊行物は、本開示が属する分野の当業者のレベルを示す。本開示に挙げられた全ての参考文献は、各参考文献の全体が個々に参考として組み込まれるのと同程度に、参考として組み込まれる。

【0324】

背景技術、概要、詳細な説明および実施例において挙げられた文献（特許、特許出願、雑誌、記事、研究所マニュアル、書籍又は他の開示を含む）の開示全体は、本明細書によって、参考として組み込まれる。

【0325】

本開示は、特定の組成物又は生物学的システムに限定されず、無論、変動し得ることが、理解される。本明細書で用いる用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのために用いられており、制限的な意図ではないということもまた理解されねばならない。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。用語「複数の」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、２以上の対象を含む。他で規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。

【0326】

本明細書中で起債されたものと類似又は同等である任意の方法および材料が、本明細書中で記載される適切な材料および方法の特定の例を試験するために、実際に使用されてもよい。

【0327】

本開示の多くの実施形態が、記載されている。しかし、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われ得ることが、理解される。従って、他の実施形態が、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

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