特許 7526195 ポリリボヌクレオチドの送達のための組成物、方法、及びキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-23

(45)【発行日】2024-07-31

(54)【発明の名称】ポリリボヌクレオチドの送達のための組成物、方法、及びキット

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20240724BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240724BHJP

   C12N 15/87 20060101ALI20240724BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20240724BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20240724BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240724BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20240724BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20240724BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20240724BHJP

   A61K 9/12 20060101ALI20240724BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20240724BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61K47/10

C12N15/87 Z ZNA

A61K38/00

A61K38/18

A61K9/08

A61K9/10

A61K9/107

A61K9/06

A61K9/12

A61P17/02

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2021551747

(86)(22)【出願日】2020-03-01

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-21

(86)【国際出願番号】 US2020020560

(87)【国際公開番号】W WO2020180751

(87)【国際公開日】2020-09-10

【審査請求日】2023-02-28

(31)【優先権主張番号】62/812,763

(32)【優先日】2019-03-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520445473

【氏名又は名称】フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】カーベジアン，アバク

(72)【発明者】

【氏名】プルギス，ニコラス・マッカートニー

(72)【発明者】

【氏名】デ ブール，アレクサンドラ・ソフィー

(72)【発明者】

【氏名】カルモナ，エレーセ・マリー

(72)【発明者】

【氏名】スチュアート，モラグ・ヘレン

(72)【発明者】

【氏名】ハジャール，ロジャー・ジョセフ

【審査官】大島 彰公

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１１－５２２０３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１４／０１３４６３６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】欧州特許出願公開第０１５９８４２１（ＥＰ，Ａ１）

【文献】特開平０５－０５８８６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５０６５４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１９－０８１７２１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ、Ｃ１２Ｎ、Ａ６１Ｐ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリリボヌクレオチド及びエタノールの混合物を含む医薬組成物であって、前記エタノールが、前記混合物の０．３％ｖ／ｖ～１５％ｖ／ｖを占め；且つ
前記医薬組成物が、脂肪酸及び脂質を含まず、且つ
前記ポリリボヌクレオチドが、タンパク質をコードする、医薬組成物。

【請求項2】

前記タンパク質が、治療用タンパク質である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記タンパク質が、創傷治癒タンパク質であり、任意選択により、前記創傷治癒タンパク質が、増殖因子である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記増殖因子が、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、又はＶＥＧＦである、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記医薬組成物が、液体、ゲル、ローション、ペースト、クリーム、泡、又は粘着物質である、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記ポリリボヌクレオチドが、直鎖状ポリリボヌクレオチド又はｍＲＮＡであり、且つ任意選択により、前記ポリリボヌクレオチドが、キャップ又はポリＡテールを欠く、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記ポリリボヌクレオチドが、環状ポリリボヌクレオチドであり、且つ任意選択により、修飾リボヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記医薬組成物が、
（ｉ）７のｐＨを有し；且つ／又は
（ｉｉ）水と同じ粘度を有し；且つ／又は
（ｉｉｉ）疎水性又は親油性基を含まず；且つ／又は
（ｉｖ）炭化水素を含まず；且つ／又は
（ｖ）カチオン性リポソームを含まず；且つ／又は
（ｖｉ）リポソーム、コレステロール、又はその任意の組合せを含まない、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法における使用のための、ポリリボヌクレオチド及びエタノールの混合物を含む組成物であって、前記方法は、ポリリボヌクレオチド及びエタノールの混合物を含む組成物を前記対象の表面領域に局所的に適用することを含み、前記エタノールが、前記混合物の０．３％ｖ／ｖ～１５％ｖ／ｖを占め、且つ前記組成物が、脂肪酸及び脂質を含まず、且つ前記ポリリボヌクレオチドが、タンパク質をコードする、組成物。

【請求項10】

適用ツール及び請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むキットであって、前記適用ツールが、前記医薬組成物を対象の表面領域に適用するように構成されるキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８１２，７６３号に対する優先権及び利益を主張するものであり、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

ポリリボヌクレオチドは、遺伝子発現、遺伝子調節、及び細胞性シグナル伝達などの生物活性のための重要な生体分子である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本明細書に記載される本発明は、ポリリボヌクレオチドの送達のための組成物、医薬組成物、及び方法を含む。ある種の実施形態では、組成物及び医薬組成物は、エタノール及びポリリボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、組成物及び医薬組成物は、アルコール及びポリリボヌクレオチドを含む。別の実施形態では、組成物及び医薬組成物は、細胞透過剤及びポリリボヌクレオチドを含む。方法は、これらの組成物及び医薬組成物を対象の表面領域に適用することを含む。

【0004】

本明細書に記載される本発明は、いずれの担体も含まない組成物を含み、且つポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む。組成物は、ポリリボヌクレオチドの送達のために上皮細胞に適用され得る。組成物は、表面領域への殺菌剤の適用の後に表面領域に適用され得る。

【0005】

いくつかの態様では、医薬組成物は、ポリリボヌクレオチド及びエタノールの混合物を含み、エタノールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、エタノールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ、又は少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、エタノールは、混合物の少なくとも約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又は少なくとも約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。

【0006】

いくつかの態様では、医薬組成物は、ポリリボヌクレオチド及びアルコールの混合物を含み、アルコールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、アルコールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ、又は少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、アルコールは、混合物の少なくとも約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又は少なくとも約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される。

【0007】

いくつかの態様では、医薬組成物は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤の混合物を含み、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ、又は少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又は少なくとも約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、アルコールである。いくつかの実施形態では、アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される。

【0008】

いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、創傷治癒タンパク質である。いくつかの実施形態では、創傷治癒タンパク質は、増殖因子である。いくつかの実施形態では、増殖因子は、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、又はＶＥＧＦである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、液体、ゲル、ローション、ペースト、クリーム、泡、又は粘着物質である。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、直鎖状ポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、キャップ又はポリＡテールを欠く。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、免疫原性である。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、非免疫原性である。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約７のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、水とほぼ同じである粘度を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、疎水性又は親油性基を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、炭化水素を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、カチオン性リポソームを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、脂肪酸、脂質、リポソーム、コレステロール、又はその任意の組合せを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、極性溶媒に可溶性である。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、極性溶媒に不溶性である。

【0009】

いくつかの態様では、治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含み、細胞透過剤は、局所投与のために構成される。いくつかの態様では、治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含み、アルコールは、局所投与のために構成される。

【0010】

いくつかの態様では、治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含み、ポリリボヌクレオチドは、ペイロード又はペイロードをコードする配列を含み、且つペイロードは、細胞に対する生物学的効果を有する。いくつかの態様では、治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含み、ポリリボヌクレオチドは、ペイロード又はペイロードをコードする配列を含み、且つペイロードは、細胞に対する生物学的効果を有する。

【0011】

いくつかの態様では、治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含み、ポリリボヌクレオチドは、細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在し、且つアルコールは、細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在する。いくつかの態様では、治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含み、ポリリボヌクレオチドは、細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在し、且つ細胞透過剤は、細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在する。

【0012】

いくつかの態様では、創傷を治療する方法は、創傷又は創傷の周囲の組織を、ポリリボヌクレオチド及びエタノールの混合物を含む組成物に接触させることを含み、エタノールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの態様では、創傷を治療する方法は、創傷又は創傷の周囲の組織を、ポリリボヌクレオチド及びアルコールの混合物を含む組成物に接触させることを含み、アルコールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの態様では、創傷を治療する方法は、創傷又は創傷の周囲の組織を、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤の混合物を含む組成物に接触させることを含み、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。

【0013】

いくつかの態様では、治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド、アルコール、及び局所送達賦形剤を含み、局所送達賦形剤は、安定剤を含む。いくつかの態様では、治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド、細胞透過剤、及び局所送達賦形剤を含み、局所送達賦形剤は、安定剤を含む。いくつかの実施形態では、安定剤は、グルコース（４．５ｇ／Ｌ）を含む。

【0014】

いくつかの態様では、坐剤又は他の脂質系製剤は、ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む。いくつかの態様では、坐剤又は他の脂質系製剤は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む。

【0015】

いくつかの態様では、吸入可能な組成物は、ポリリボヌクレオチド、アルコール、及び噴霧剤の混合物を含む。いくつかの態様では、吸入可能な組成物は、ポリリボヌクレオチド、細胞透過剤、及び噴霧剤の混合物を含む。

【0016】

いくつかの態様では、治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド及びアルコールで負荷された生分解性の足場を含む。いくつかの態様では、治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤で負荷された生分解性の足場を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、アルコールを含む。いくつかの実施形態では、アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アルコールは、エタノールである。

【0018】

いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法は、ａ）殺菌剤を対象の表面領域に適用すること；ｂ）いずれの担体も含まないポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む組成物を表面領域に適用することを含む。いくつかの実施形態では、殺菌剤は、アルコール、ＵＶ光、レーザー光、又は熱である。

【0019】

いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法は、ａ）アルコールを対象の表面領域に適用すること；ｂ）いずれの担体も含まないポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む組成物を表面に適用することを含む。

【0020】

いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドを上皮細胞に送達する方法は、いずれの担体も含まない希釈剤及び修飾されていないポリリボヌクレオチドを含む組成物を上皮細胞に適用することを含む。

【0021】

いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法は、ポリリボヌクレオチド及びエタノールの混合物を含む組成物を対象の表面領域に局所的に適用することを含み、エタノールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法は、ポリリボヌクレオチド及びアルコールの混合物を含む組成物を対象の表面領域に局所的に適用することを含み、アルコールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの態様では、ポリリボリボヌクレオチドを対象に送達する方法は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤の混合物を含む組成物を対象の表面領域に局所的に適用することを含み、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリリボヌクレオチドを対象の真皮又は上皮組織に送達する。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリリボヌクレオチドを対象の真皮又は上皮組織にイオン泳動を伴わずに送達する。

【0022】

いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドを細胞又は組織に送達する方法は、細胞又は組織を、ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む混合物に接触させることを含み、アルコールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドを細胞又は組織に送達する方法は、細胞又は組織を、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物に接触させることを含み、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。

【0023】

いくつかの態様では、治療用組成物を細胞又は組織に送達する方法は、細胞又は組織を、ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む治療用組成物に接触させることを含み、アルコールは、局所投与のために構成される。いくつかの態様では、治療用組成物を細胞又は組織に送達する方法は、細胞又は組織を、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む治療用組成物に接触させることを含み、細胞透過剤は、局所投与のために構成される。

【0024】

いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドのインビボ送達の方法は、ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む混合物を、対象の表面領域に適用することを含む。いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドのインビボ送達の方法は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を、対象の表面領域に適用することを含む。

【0025】

いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドの局所送達の方法は、ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む混合物を、対象の表面領域に適用することを含む。いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドの局所送達の方法は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を、対象の表面領域に適用することを含む。

【0026】

いくつかの態様では、治療用ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法は、治療用ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む混合物を上皮表面、内皮表面、露出された組織、又は開放創に局所的に接触させることを含む。いくつかの態様では、治療用ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法は、治療用ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を上皮表面、内皮表面、露出された組織、又は開放創に局所的に接触させることを含む。

【0027】

いくつかの態様では、治療の方法は、ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む混合物を、病態又は疾患を有する対象の表面領域に適用することを含む。いくつかの態様では、治療の方法は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を、病態又は疾患を有する対象の表面領域に適用することを含む。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、アルコールを含む。いくつかの実施形態では、アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アルコールは、エタノールを含む。いくつかの実施形態では、エタノール、アルコール、又は細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ、又は少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、エタノール、アルコール、又は細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又は少なくとも約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ポリリボヌクレオチドを細胞透過剤又はアルコールと混合することを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、混合の前に固体形態で存在する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、混合の前に凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、混合の前に液体形態で存在する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、混合の前に溶媒中で溶解される。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ペイロード又はペイロードをコードする配列を含み、且つペイロードは、細胞又は組織に対する生物学的効果を有する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、細胞に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在し、且つ細胞透過剤は、細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、タンパク質は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、タンパク質は、創傷治癒タンパク質である。いくつかの実施形態では、創傷治癒タンパク質は、増殖因子である。いくつかの実施形態では、増殖因子は、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、又はＶＥＧＦである。いくつかの実施形態では、組成物は、液体、ゲル、ローション、ペースト、クリーム、泡、又は粘着物質である。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、直鎖状ポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、キャップ又はポリＡテールを欠く。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、免疫原性である。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、非免疫原性である。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約７のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、組成物は、水とほぼ同じである粘度を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、疎水性又は親油性基を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、炭化水素を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、カチオン性リポソームを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、脂肪酸、脂質、リポソーム、コレステロール、又はその任意の組合せを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、極性溶媒に可溶性である。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、極性溶媒に不溶性である。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、薬学的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、送達は、全身性である。いくつかの実施形態では、送達は、局所的である。いくつかの実施形態では、表面領域は、皮膚、口腔、鼻腔、耳腔、胃腸管、気道、膣、子宮頸部、子宮内、尿路、及び眼の表面領域からなる群から選択される。表面領域が、口腔、鼻腔、胃腸管、気道、膣、子宮頸部、子宮内、尿路、及び眼である場合、送達は、非侵襲性の手段によるそのような表面領域の上皮内層に対するものである。いくつかの実施形態では、適用は、混合物の液滴を表面領域に直接的に置くことを含む。いくつかの実施形態では、適用は、表面領域を、混合物が包埋されたパッチ、ゲル、又はフィルムにより拭くことを含む。いくつかの実施形態では、適用は、混合物を表面領域に噴霧することを含む。いくつかの実施形態では、適用は、混合物をエアロゾル化により対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、適用は、混合物を坐剤により対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、適用は、混合物を、混合物を含有するカプセルの経口摂取を介して対象に投与することを含み、カプセルは、混合物を対象の胃腸管内部に放出するように構成される。いくつかの実施形態では、細胞は、上皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、直鎖状対応物より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍高い翻訳効率を有する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、直鎖状対応物より少なくとも５倍高い翻訳効率を有する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、短期間の生物学的効果を有する。

【0028】

いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、長期間の生物学的効果を有する。いくつかの実施形態では、混合物中のポリリボヌクレオチドの濃度は、少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１μｇ／ｍＬ、少なくとも約２μｇ／ｍＬ、少なくとも約３μｇ／ｍＬ、少なくとも約４μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬである。

【0029】

本発明はまた、本明細書に記載される医薬組成物を含むキットを提供する。いくつかの態様では、キットは、適用ツール及び前述の実施形態のいずれか１つの医薬組成物を含み、適用ツールは、医薬組成物を対象の表面領域に適用するように構成される。

【0030】

いくつかの態様では、キットは、第１の適用ツール、第２の適用ツール、殺菌剤、及びいずれの担体も含まないポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む組成物を含み、第１の適用ツールは、殺菌剤を対象の表面領域に適用するように構成され、且つ第２の適用ツールは、組成物を対象の表面領域に適用するように構成される。いくつかの実施形態では、殺菌剤は、アルコール、ＵＶ光、レーザー光、又は熱である。いくつかの実施形態では、アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第１の適用ツールは、ワイプである。いくつかの実施形態では、ワイプは、殺菌剤を含む。いくつかの実施形態では、第１の適用ツールは、ＵＶ光又はレーザー光を適用するデバイスである。いくつかの実施形態では、第１の適用ツールは、熱を適用するデバイスである。

【0031】

いくつかの態様では、キットは、適用ツール並びにポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を含み、その適用ツールは、混合物を対象の表面領域に適用するように構成される。いくつかの実施形態では、その適用ツール又は第２の適用ツールは、ピペットを含む。いくつかの実施形態では、その適用ツール又は第２の適用ツールは、基材を含み、基材は、混合物が包埋される。いくつかの実施形態では、基材は、天然又は人工繊維で作られる。

【0032】

ある種の実施形態では、キットは、坐剤を含む。いくつかの実施形態では、その適用ツール又は第２の適用ツールは、パッチを含む。いくつかの実施形態では、その適用ツール又は第２の適用ツールは、噴霧器を含む。いくつかの実施形態では、その適用ツール又は第２の適用ツールは、ネブライザーを含む。いくつかの実施形態では、その適用ツール又は第２の適用ツールは、混合物を対象の胃腸管内部に放出するように構成されるカプセルを含む。いくつかの実施形態では、その適用ツール又は第２の適用ツールは、混合物を制御された様式で放出するように構成される。いくつかの実施形態では、表面領域は、皮膚、口腔、鼻腔、胃腸管、及び気道の表面領域、並びにその任意の組合せからなる群から選択される。

【0033】

別の態様では、キットは、本明細書に記載される組成物及びアルコールワイプを含む。別の態様では、キットは、本明細書に記載される組成物及び対象の表面領域への適用のためのアルコールを含有するバイアルを含む。

【0034】

定義
本発明は、特定の実施形態及び特定の図面に関して記載されることになるが、本発明は、それに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。下記の用語は一般に、別段の指定がない限り、それらの一般的な意味において理解されることになる。

【0035】

本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」は、１つ以上の核酸サブユニット、又はヌクレオチドを含む分子を意味し、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」と互換的に使用され得る。ポリヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）、又はその変種から選択される１つ以上のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは、ヌクレオシド及び少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のリン酸（ＰＯ_３）基を含み得る。ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖（リボース又はデオキシリボースのいずれか）、及び１つ以上のリン酸基を含み得る。リボヌクレオチドは、糖がリボースであるヌクレオチドである。ポリリボヌクレオチド若しくはリボ核酸、又はＲＮＡは、ホスホジエステル結合を介して重合される複数のリボヌクレオチドを含む高分子を指し得る。デオキシリボヌクレオチドは、糖がデオキシリボースであるヌクレオチドである。

【0036】

ポリデオキシリボヌクレオチド又はデオキシリボ核酸、又はＤＮＡは、ホスホジエステル結合を介して重合される複数のデオキシリボヌクレオチドを含む高分子を意味する。ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸又はヌクレオシドポリリン酸であり得る。ヌクレオチドは、発光タグ又はマーカー（例えば、フルオロフォア）などの検出可能なタグを含む、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）ｄＮＴＰから選択され得る、例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などのデオキシリボヌクレオシドポリリン酸を意味する。ヌクレオチドは、伸長している核酸鎖に組み込まれ得る任意のサブユニットを含み得る。そのようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵ、又は１つ以上の相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵに特異的であるか、プリン（すなわち、Ａ若しくはＧ、又はその変種）又はピリミジン（すなわち、Ｃ、Ｔ若しくはＵ、又はその変種）に相補的な任意の他のサブユニットであり得る。いくつかの例において、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はその誘導体若しくは変種である。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、いくつか例を挙げると、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、前駆体ｍＲＮＡ（プレ－ｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）であり、ヌクレオチド配列及び一本鎖、二本鎖、三本鎖、らせん状、ヘアピンなどの任意のその構造実施形態の両方を包含する。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド分子は、環状である。ポリヌクレオチドは、様々な長さを有し得る。核酸分子は、少なくとも１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、１キロ塩基（ｋｂ）、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、又はそれ以上の長さを有し得る。ポリヌクレオチドは、細胞又は組織から単離され得る。本明細書で具体化されるとおり、ポリヌクレオチド配列は、単離され且つ精製されたＤＮＡ／ＲＮＡ分子、合成ＤＮＡ／ＲＮＡ分子、及び合成ＤＮＡ／ＲＮＡ類似体を含み得る。

【0037】

ポリヌクレオチド、例えば、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、及び／又は修飾ヌクレオチドを含む１つ以上のヌクレオチド変種を含み得る。修飾ヌクレオチドの例としては、ジアミノプリン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｄ４６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６－ジアミノプリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、ヌクレオチドは、三リン酸部分への修飾を含む、それらのリン酸部分における修飾を含み得る。そのような修飾の非限定的な例としては、より長いリン酸鎖（例えば、４、５、６、７、８、９、１０以上のリン酸部分を有するリン酸鎖）及びチオール部分を有する修飾（例えば、アルファ－チオ三リン酸及びベータ－チオ三リン酸）が挙げられる。核酸分子はまた、塩基部分（例えば、通常、相補的なヌクレオチドと水素結合を形成するために利用可能な１つ以上の原子及び／又は通常、相補的なヌクレオチドと水素結合を形成できない１つ以上の原子）、糖部分又はリン酸骨格で修飾され得る。核酸分子はまた、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）などのアミン反応性部分の共有結合を可能にするアミノアリル－ｄＵＴＰ（ａａ－ｄＵＴＰ）及びアミノヘキシルアクリルアミド－ｄＣＴＰ（ａｈａ－ｄＣＴＰ）などのアミン修飾基を含有し得る。本開示のオリゴヌクレオチドにおける標準的なＤＮＡ塩基対又はＲＮＡ塩基対に対する代替物は、ビット毎立方ｍｍ単位のより高い密度、より高い安全性（天然の毒素の偶発的又は意図的な合成に対して耐性）、光でプログラムされたポリメラーゼにおけるより容易な識別、又は二次構造の低減を提供し得る。デノボ及び／又は増幅合成のための天然並びに変異体ポリメラーゼと適合性のそのような代替の塩基対は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれるＢｅｔｚ Ｋ，Ｍａｌｙｓｈｅｖ ＤＡ，Ｌａｖｅｒｇｎｅ Ｔ，Ｗｅｌｔｅ Ｗ，Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ Ｋ，Ｄｗｙｅｒ ＴＪ，Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ Ｐ，Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ ＦＥ，Ｍａｒｘ Ａ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ；８（７）：６１２－４において記載される。

【0038】

ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。本明細書で使用する場合、用語「直鎖状ＲＮＡ」又は「直鎖状ポリリボヌクレオチド」は、互換的に使用され、遊離５’及び３’末端を有するポリリボヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、直鎖状ＲＮＡは、遊離５’末端又は３’末端を有する。いくつかの実施形態では、直鎖状ＲＮＡは、非共有結合的に連結した５’又は３’末端を有する。本明細書で使用する場合、用語「ｃｉｒｃＲＮＡ」又は「環状ポリリボヌクレオチド」又は「環状ＲＮＡ」は、互換的に使用され、共有結合又は非共有結合により環状構造を形成するポリリボヌクレオチドを意味する。いくつかの場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、対応する直鎖状ポリリボヌクレオチドの典型的な遊離５’及び３’末端が、共有結合若しくは非共有結合、又は非核酸リンカー（例えば、非核酸ポリマー又はタンパク質）のいずれかを介して合わせて結合される連続的なループを有する。いくつかの場合において、本明細書で提供される環状ポリリボヌクレオチドは、共有結合又は非共有結合を介して、連続的なループ構造を形成するように合わせて結合される２つ以上の直鎖状ポリリボヌクレオチドによって形成され得る。理論によって束縛されるものではないが、ＲＮＡの複数のセグメントは、１つの５’及び１つの３’遊離末端のみが残存しているときに最終的に環化され得る、ＲＮＡの「糸」を生成するためにアニールされるＤＮＡ並びにそれらの５’及び３’遊離末端から生成され得る。

【0039】

本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合ペプチド結合によって合わせて連結されたアミノ酸残基（天然又は非天然）のポリマーを意味する。本明細書で使用する場合、その用語は、任意のサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の等価物、バリアント、並びに前述の類似体を含み得る。ポリペプチドは、単一の分子であってもよいし、二量体、三量体又は四量体などの多分子複合体であってもよい。それらはまた、一本鎖又は抗体若しくはインスリンなどの複数鎖のポリペプチドを含んでもよく、且つ会合され得るか又は連結され得る。最も一般的なジスルフィド結合は、複数鎖のポリペプチドにおいて見出される。ポリペプチドという用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。

【0040】

本明細書で使用する場合、用語「混合物」は、混合される２種以上の異なる物質で作られた材料を意味する。いくつかの場合において、本明細書に記載される混合物は、２種以上の異なる物質の均一な混合物であってもよく、例えば、混合物は、混合物の任意の所与の試料全体にわたって同じ割合のその成分（例えば、２種以上の物質）を有してもよい。いくつかの場合において、本明細書で提供されるとおりの混合物は、２種以上の異なる物質の不均一な混合物であってもよく、例えば、混合物の成分（例えば、２種以上の物質）の割合は、混合物全体にわたって変動してもよい。いくつかの場合において、混合物は、液体溶液であり、例えば、混合物は、液相中に存在する。いくつかの場合において、液体溶液は、液体溶媒及び溶質を含むとみなされ得る。液体溶媒中で溶質を混合することは、「溶解」プロセスと呼ばれ得る。いくつかの場合において、液体溶液は、液体中の液体溶液（例えば、液体溶媒中で溶解される液体溶質）、液体中の固体溶液（例えば、液体溶媒中で溶解される固体溶質）、又は液体中の気体溶液（例えば、液体溶媒中で溶解される固体溶質）である。いくつかの場合において、２種以上の溶媒及び／又は２種以上の溶質が存在する。いくつかの場合において、混合物は、コロイド、液体懸濁液、又はエマルションである。いくつかの場合において、混合物は、固体混合物であり、例えば、混合物は、固相中に存在する。

【0041】

本明細書で使用する場合、用語「細胞透過剤」は、細胞に接触されるとき、細胞内への移行を促進する薬剤を意味する。いくつかの場合において、細胞透過剤は、例えば、細胞膜の負に荷電したリン脂質との直接的な静電相互作用、又は膜タンパク質若しくはリン脂質二重層において立体配置の変化を誘導することによる一過性の孔形成を介して、細胞膜の直接的な透過を促進する。いくつかの場合において、細胞透過剤は、エンドサイトーシスに媒介される細胞内への移行を促進する。例えば、ある種の状況下で、細胞透過剤は、エンドサイトーシスプロセスを起こすように細胞を刺激することができ、それにより細胞膜は、細胞内に内向きに折り畳むことができる。ある種の実施形態では、細胞透過剤は、細胞膜を横切って輸送する一過性の構造を形成するのを助ける。特定の理論に束縛されることなく、本明細書で提供されるとおりの細胞透過剤は、細胞膜の透過性を増大させることができるか又は分子の細胞内への内部移行を増大させることができ、その結果として、細胞内への送達は、細胞が細胞透過剤と同時に接触されるとき、細胞透過剤を伴わない他の同一の送達と比較して、より効率的であり得る。

【0042】

本明細書で使用する場合、用語「ペイロード」は、本明細書で開示されるとおりのポリリボヌクレオチドによって送達される任意の分子を意味する。いくつかの場合において、ペイロードは、核酸、タンパク質、化学物質、リボ核タンパク質、又はその任意の組合せである。いくつかの場合において、ペイロードは、本明細書で開示されるとおりのポリリボヌクレオチド内に直接的に含有される核酸配列である。いくつかの場合において、ペイロードは、例えば、相補的なハイブリダイゼーション、又はタンパク質－核酸相互作用を介して、本明細書で開示されるとおりのポリリボヌクレオチドに結合されるか又はそれと会合される。ある特定の場合において、ペイロードは、ポリリボヌクレオチド内に含有されるか、それに結合されるか、又はそれと会合される核酸配列によってコードされるタンパク質である。いくつかの場合において、「結合」は、２つの分子間の共有結合又は非共有結合性の相互作用を意味する。いくつかの場合において、ペイロードとポリリボヌクレオチドの間の相互作用の文脈において使用されるとき、「会合」は、ペイロードが、間にある１つ以上の他の分子を介してポリリボヌクレオチドに間接的に連結されることを意味する。いくつかの場合において、結合又は会合は、一過性であり得る。いくつかの場合において、ペイロードは、例えば、周囲のｐＨ条件又は刺激若しくは結合パートナーの有無に依存して、ある条件下でポリリボヌクレオチドに結合されるか又はそれと会合されるが、別の条件ではそのようにならない。

【0043】

用語「細胞に対する生物学的効果」は、変化、例えば、細胞上又は細胞中における形態学的変化又は機能的変化を引き起こし得る細胞に対する任意の効果を意味する。例えば、細胞に対する生物学的効果は、細胞増殖の加速若しくは減速、生存、アポトーシス、又は細胞の壊死、遺伝子転写及びｍＲＮＡ翻訳、並びに特定の分化された細胞の機能性（例えば、免疫細胞の活性化、ニューロンの興奮若しくは抑制、ホルモン分泌細胞からのホルモン分泌、又はマクロファージによる貪食活性）などであるがこれらに限定されない細胞機能に影響する細胞内部のシグナル伝達における変化、又は外来分子の細胞内への移行の効率における変化、例えば、外来分子に対する細胞透過性の増大若しくは低減を含み得るが、これらに限定されない。細胞に対する生物学的効果は、対象が罹患している疾患の１つ以上の症状の寛解、又は対象における疾患の治療若しくは根絶をもたらし得る。

【0044】

用語「組織に対する生物学的効果」は、変化、例えば、組織上又は組織中における形態学的変化又は機能的変化を引き起こし得る組織に対する任意の効果を意味する。例えば、組織に対する生物学的効果は、組織中の細胞増殖の加速若しくは減速、組織生存、組織中の細胞のアポトーシス、又は組織の壊死、組織中の細胞の遺伝子転写及びｍＲＮＡ翻訳、並びに特定の分化された組織の機能性などであるがこれらに限定されない細胞機能に影響するか又は組織機能に影響する組織内部のシグナル伝達における変化、又は外来分子の組織内への移行の効率における変化、例えば、外来分子に対する組織透過性の増大若しくは低減を含み得るが、これらに限定されない。組織に対する生物学的効果は、対象が罹患している疾患の１つ以上の症状の寛解、又は対象における疾患の治療若しくは根絶をもたらし得る。

【0045】

用語「アルコール」は、ヒドロキシル官能基（－ＯＨ）が炭素に結合されている任意の有機化合物を意味する。本明細書で論じられるとおりのアルコールは、一価アルコール、多価アルコール、不飽和脂肪族アルコール、及び脂環式アルコールを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの場合において、アルコールは、エタノールを指してもよい。いくつかの場合において、アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースを含み得るが、これらに限定されない。

【0046】

本明細書で使用する場合、対象の身体の用語「表面領域」は、外部環境の対象の身体に曝されているか又は曝される可能性を有する対象の任意の領域を意味する。対象の身体、例えば、哺乳動物の身体、例えば、ヒトの身体の表面領域は、皮膚、口腔、鼻腔、耳腔、胃腸管、気道、膣、子宮頸部、子宮内、尿路、及び眼の表面領域を含み得る。いくつかの場合において、対象の身体の表面領域は、多くの場合、上皮細胞が整列されている外側の領域を指し得る。例えば、皮膚は、本明細書で論じられるとおりの表面領域の１つの種類であってもよく、表皮及び真皮から構成され得るが、前者は同類の最外層を形成し、多くの他の種類の細胞の中で上皮細胞の組織化された集合体を含み得る。

【0047】

本明細書で使用する場合、用語「局所送達」は、非侵襲性の手段、例えば、腸管及び他の胃腸管（ＧＩ）上皮又は膣上皮を通して利用できる皮膚又は上皮層への物質の送達を意味する。医薬組成物の局所送達は、対象に対する局所的な薬力学的効果を有する場合があり、例えば、局所的に送達された医薬組成物は、医薬組成物が送達される身体（例えば、皮膚）の特定の部分で又はその近傍で薬力学的効果を有する。いくつかの他の実施形態では、本明細書で論じられるとおりの医薬組成物の局所送達は、送達様式（例えば、特定の表面領域への局所的）を指すためにのみ使用されるが、医薬組成物は局所的又は全身的な薬力学的効果を有することができる。例えば、医薬組成物は、投与部位又はその近傍に局所的に留まってもよいし、対象の身体の循環系（例えば、血液又はリンパ系）に入ってもよく、それを介して、医薬組成物は、循環系以外の経路を介して医薬組成物によって通常到達できない身体の遠隔部分に輸送され得る。

【0048】

本明細書で使用する場合、用語「全身送達」又は「全身投与」は、医薬組成物又は他の物質の循環系（例えば、血液又はリンパ系）への投与経路を意味する。全身投与は、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、舌下投与、直腸投与、経皮投与、又はその任意の組合せを含み得る。本明細書で使用する場合、用語「非全身送達」又は「非全身投与」は、医薬組成物又は他の物質の全身送達ではない任意の他の投与経路を指してもよく、例えば、送達される物質は、対象の身体の循環系（例えば、血液及びリンパ系）に入らない。

【0049】

本明細書で使用する場合、用語「発現配列」は、産物、例えば、ペプチド又はポリペプチドをコードする核酸配列、又は調節性核酸を意味する。ペプチド又はポリペプチドをコードする例示的な発現配列は、複数のヌクレオチドの三つ組を含んでもよく、その各々は、アミノ酸をコードすることができ、且つ「コドン」と呼ばれる。

【0050】

本明細書で使用する場合、用語「修飾リボヌクレオチド」は、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合に対して少なくとも１つの修飾を有するヌクレオチドを意味する。

【0051】

本明細書で使用する場合、用語「実質的に耐性」は、基準と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の耐性を有するものを意味する。

【0052】

本明細書で使用する場合、用語「免疫原性」は、物質に対して免疫応答を誘発する潜在力を意味する。いくつかの場合において、免疫応答は、生物の免疫系又はある種の型の免疫細胞が、免疫原性物質に曝されるときに誘発され得る。用語「非免疫原性」は、物質に対する検出可能な閾値を超える免疫応答の欠如又は非存在を指してもよい。いくつかの場合において、免疫応答は、生物の免疫系又はある種の型の免疫細胞が、非免疫原性物質に曝されるときに検出可能ではない。いくつかの場合において、本明細書で提供される非免疫原性ポリリボヌクレオチドは、免疫原性アッセイによって測定されるとき、既定の閾値を超える免疫応答を誘発しない。例えば、免疫原性アッセイを使用して、環状ポリリボヌクレオチドに対して産生される抗体を測定するとき、本明細書で提供されるとおりの非免疫原性ポリリボヌクレオチドは、既定の閾値より低いレベルで抗体の産生をもたらし得る。既定の閾値は、例えば、基準となる対照によって産生される抗体の最大で１．５倍、２倍、３倍、４倍、又は５倍のレベルであり得る。

【0053】

本明細書で使用する場合、用語「複合体」は、互いに親和性を有する少なくとも２つの部分（例えば、化学物質又は生化学物質）の間の会合を意味する。

【0054】

「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され、共有結合（例えば、アミド結合）により結合された２つ以上のアミノ酸のポリマーを意味する。本明細書に記載されるとおりのポリペプチドは、全長タンパク質（例えば、完全にプロセシングされたタンパク質）及びより短いアミノ酸配列（例えば、天然に存在するタンパク質の断片又は合成ポリペプチド断片）を含み得る。ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸（例えば、天然で合成されるペプチドにおいて一般に見出され、且つ１文字の略称Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶによって知られる２０種のアミノ酸のうちの１つ）及び天然に存在しないアミノ酸（例えば、合成アミノ酸、アミノ酸類似体、修飾アミノ酸、及びアミノ酸模倣物を含む、天然で合成されるペプチドにおいて一般に見出される２０種のアミノ酸のうちの１つではないアミノ酸）を含み得る。

【0055】

本明細書で使用する場合、用語「担体」は、環状ポリリボヌクレオチドの共有結合性の修飾、部分的若しくは完全なカプセル化剤を介して、又はその組合せによって、組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）の細胞内への輸送又は送達を促進する化合物、組成物、試薬、又は分子を意味する。担体の非限定的な例としては、炭水化物担体（例えば、無水物で修飾されたフィトグリコーゲン又はグリコーゲン型材料）、ナノ粒子（例えば、環状ポリリボヌクレオチドをカプセル化するか又はそれに共有結合されるナノ粒子）、リポソーム、フソソーム、エクスビボ分化された網状赤血球、エクソソーム、タンパク質担体（例えば、環状ポリリボヌクレオチドに共有結合されるタンパク質）、又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー又はトランスフェクション試薬）が挙げられる。

【0056】

本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」及び「治療的に許容される」は、互換的に使用される。「薬学的に許容される」成分は、生物学的に又はその他の点で望ましくない成分ではない成分を意味し、例えば、成分は、本発明の医薬製剤に組み込まれてもよいし、本明細書に記載されるとおりの患者に投与されてもよく、いずれの重大な望ましくない生物学的作用も引き起こさないか又はそれが含有される製剤の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用しない。用語「治療的に許容される」が、賦形剤を指すために使用されるとき、それは、成分が毒性試験及び製造試験の要求される基準を満たしていることを意味するか、又は成分が米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって作成された不活性成分のガイドに含まれることを意味する。

【0057】

本明細書で使用する場合、用語「裸の送達」又は「裸のＲＮＡ」は、担体の助けを借りず且つ細胞への送達を助ける部分に対する共有結合性の修飾を伴わない、細胞への送達のためのＲＮＡの製剤を意味する。裸の送達製剤は、いずれのトランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体も含まない。例えば、環状ポリリボヌクレオチドの裸の送達製剤は、共有結合性の修飾を有しない環状ポリリボヌクレオチドを含み、且つ担体を含まない製剤である。

【0058】

本明細書で使用する場合、用語「希釈剤」は、本明細書に記載される組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物）が、希釈され得るか又は溶解され得る不活性溶媒を含む媒体を意味する。希釈剤は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝液、等張化剤、又はその混合物であり得る。希釈剤は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。液体希釈剤の非限定的な例としては、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びに１，３－ブタンジオールが挙げられる。固体希釈剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、又は粉砂糖が挙げられる。

【0059】

本明細書で使用する場合、用語「殺菌剤」は、静菌性、殺菌性であり、且つ／又は積極的に微生物を殺すか、微生物を不活性化するか、又は微生物の増殖を妨げる任意の薬剤を意味する。微生物を殺す殺菌剤は、抗菌剤及び／又は防腐剤であり得る。いくつかの実施形態では、殺菌剤は、アルコール、ヨウ素、又は過酸化水素などの液体である。いくつかの実施形態では、殺菌剤は、ＵＶ光又はレーザー光である。いくつかの実施形態では、殺菌剤は、電気的に送達されるか又は他の手段（例えば、蒸気、接触）による熱である。

【0060】

参照による組込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、又は特許出願が具体的且つ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同程度に参照により本明細書に組み込まれる。

【0061】

本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、添付した図面とともに読む場合により十分に理解されることになる。本発明を説明するために、本明細書で例示される実施形態が図面において示される。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことが理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0062】

【図1】例示的な直鎖状及び環状ＲＮＡの両方が、マウスの耳の皮膚に局所的に送達され、耳組織におけるそれらのＲＮＡレベルが送達後６時間～３日間にわたって試験された例を示す。

【図2】図２Ａおよび２Ｂは、Ｂｏｏｓｔ（エタノール）の助けを借りた直鎖状又は環状ＲＮＡの局所的な送達後６時間、１日、３日、又は１２日のマウスの耳パンチからのｑＰＣＲ結果を要約しているプロットである。図２Ａは、直鎖状及び環状ＲＮＡの両方の検出のためのプライマーを使用するｑＰＣＲアッセイからの結果を示す。図２Ｂは、直鎖状ＲＮＡではなく環状ＲＮＡの検出のためのプライマーを使用するｑＰＣＲアッセイからの結果を示す。

【図3】図３Ａおよび３Ｂは、Ｂｏｏｓｔ（エタノール）及びＴｒａｎｓＩＴ ｍＲＮＡ試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ，ＬＬＣ）、カチオン性、非リポソームポリマー脂質移行薬剤の両方の助けを借りた直鎖状又は環状ＲＮＡの局所的な送達後６時間、１日、３日、又は１２日のマウスの耳パンチからのｑＰＣＲ結果を要約しているプロットである。図３Ａは、直鎖状及び環状ＲＮＡの両方の検出のためのプライマーを使用するｑＰＣＲアッセイからの結果を示す。図３Ｂは、直鎖状ＲＮＡではなく環状ＲＮＡの検出のためのプライマーを使用するｑＰＣＲアッセイからの結果を示す。

【図4】ＤＭＳＯゲル（ＲＮＡ）又はＤＭＳＯゲル単独（溶媒）を使用して局所的に投与されたＲＮＡからのタンパク質発現を示す。

【図5】Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎベビーローション（ＲＮＡ）又はＪｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎベビーローション単独（溶媒）で製剤化された局所的に投与されたＲＮＡからのタンパク質発現を示す。

【図6】エタノール（ＲＮＡ）又はエタノール単独（溶媒）により局所的に投与されたＲＮＡからのタンパク質発現を示す。

【図7】ｃｉｒｃＲＮＡ－Ｃｙ５の局所投与により組織へのＲＮＡ送達がもたらされる蛍光画像（Ｂ／Ｗ）を示す。

【図8】ｃｉｒｃＲＮＡ－Ｃｙ５の局所投与により組織へのＲＮＡ送達がもたらされる蛍光画像の定量化を示す。

【図9】ｍＲＮＡ－Ｃｙ５の局所投与により組織へのＲＮＡ送達がもたらされる蛍光画像（Ｂ／Ｗ）を示す。

【図10】ｍＲＮＡ－Ｃｙ５の局所投与により組織へのＲＮＡ送達がもたらされる蛍光画像の定量化を示す。

【図11】組織が適用の前にエタノールワイプで拭かれるとき、ｍＲＮＡの局所投与が、投与後の１日目及び４日目に組織へのＲＮＡ送達をもたらすことを示す。

【図12】組織が適用の前にイソプロピルアルコールワイプで拭かれるとき、ｍＲＮＡの局所投与が、投与後の１日目及び４日目に組織へのＲＮＡ送達をもたらすことを示す。

【図13】組織が適用の前にエタノールワイプで拭かれるとき、環状ＲＮＡの局所投与が、投与後の１日目及び４日目に組織へのＲＮＡ送達をもたらすことを示す。

【図14】１０％エタノールと混合された環状ＲＮＡの局所投与が、投与後の１日目及び４日目に組織へのＲＮＡ送達をもたらすことを示す。

【図15】１０％イソプロピルアルコールと混合された環状ＲＮＡの局所投与が、投与後の１日目及び４日目に組織へのＲＮＡ送達をもたらすことを示す。

【図16】組織が適用の前にイソプロピルアルコールワイプで拭かれるとき、環状ＲＮＡの局所投与が、投与後の１日目及び４日目に組織へのＲＮＡ送達をもたらすことを示す。

【図17】ＰＢＳ、ＰＢＳ及び１０％エタノール、又はＰＢＳ及び１０％イソプロピルアルコールと混合された直鎖状ｍＲＮＡの局所投与が、投与後の１日目に組織へのＲＮＡ送達をもたらし、ＰＢＳ及び１０％エタノール又はＰＢＳ及び１０％イソプロピルアルコールと混合された直鎖状ｍＲＮＡの局所投与が、投与後の４日目に組織へのＲＮＡ送達をもたらすことを示す。

【図18】組織が適用の前にエタノールワイプで拭かれるとき、ｃｉｒｃＲＮＡの局所投与が、組織における機能性タンパク質の発現をもたらすことを示す。

【図19】ｃｉｒｃＲＮＡが１０％エタノールとともに投与されるとき、ｃｉｒｃＲＮＡの局所投与が、組織へのＲＮＡ送達をもたらすことを示す。

【図20】ｃｉｒｃＲＮＡが１０％イソプロピルアルコールとともに投与されるとき、ｃｉｒｃＲＮＡの局所投与が、組織へのＲＮＡ送達をもたらすことを示す。

【図21】皮膚が適用の前にエタノールワイプで拭かれるとき、ｍＲＮＡの局所投与が、組織へのＲＮＡ送達をもたらすことを示す。

【図22】ｍＲＮＡがＰＢＳのみと投与されるとき、ｍＲＮＡの局所投与が、組織へのＲＮＡ送達をもたらすことを示す。

【図23】ｍＲＮＡが１０％イソプロピルアルコールとともに投与されるとき、ｍＲＮＡの局所投与が、組織へのＲＮＡ送達をもたらすことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0063】

本開示は一般に、ポリリボヌクレオチドの医薬組成物、調製物、及び送達並びにその適用に関する。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状ポリリボヌクレオチド、環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）、又はその組合せであり得る。

【0064】

いくつかの態様では、本開示は、ポリリボヌクレオチドを細胞に送達するための組成物及び方法を提供する。いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物及び方法は、ポリリボヌクレオチドをエクスビボ又はインビボで細胞内に送達する。ある種の実施形態では、本明細書で提供される組成物及び方法は、対象の細胞内へのポリリボヌクレオチドの局所送達に特に有用である。いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物及び方法は、対象における疾患の予防又は治療などの治療適用のためにポリリボヌクレオチドを送達する。

【0065】

本明細書で開示される組成物は、ポリリボヌクレオチド及びエタノールなどのアルコールの混合物を含み得る。本明細書で開示される方法は、ポリリボヌクレオチド及びエタノールなどのアルコールの混合物を含む組成物においてポリリボヌクレオチドを送達することを含み得る。いくつかの態様では、本開示は、ポリリボヌクレオチド及びポリリボヌクレオチドを細胞内に送達するためのアルコール（例えば、エタノール）を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、殺菌剤を含む。特定の実施形態では、キットは、ポリリボヌクレオチド及びアルコールワイプ（例えば、エタノールワイプ、イソプロピルワイプ）を含む。

【0066】

本明細書で開示される組成物は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤の混合物を含み得る。本明細書で開示される方法は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤の混合物を含む組成物においてポリリボヌクレオチドを送達することを含み得る。いくつかの態様では、本開示は、ポリリボヌクレオチド及びポリリボヌクレオチドの細胞内への送達のための細胞透過剤を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、殺菌剤を含む。

【0067】

本明細書で開示される組成物は、いずれの担体も含まないポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む組成物であり得る。この組成物は、上皮細胞への送達の方法において使用され得る。

【0068】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物、治療用組成物、又は医薬組成物は、表面領域（例えば、局所表面領域）に直接的に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物、治療用組成物、又は医薬組成物は、殺菌剤の適用の後に対象の表面領域に適用される。

【0069】

本明細書で提供される組成物、方法、及びキットは、ポリリボヌクレオチドを細胞内に送達するための単純且つ効果的な解決策を提供することができる。ポリリボヌクレオチドは、細胞透過剤の非存在下より細胞透過剤の存在下でより効率的に細胞内に送達され得る。いくつかの場合において、本明細書に記載される細胞透過剤は、細胞透過剤の非存在下でのポリヌクレオチドの送達の効率と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、８０００％、１０，０００％、２０，０００％、又は５０，０００％ポリヌクレオチドの送達の効率を増大させることができる。

【0070】

ポリリボヌクレオチド送達のための組成物
いくつかの態様では、本開示は、ポリリボヌクレオチドを送達するための組成物又は医薬組成物を提供する。組成物又は医薬組成物は、ポリリボヌクレオチドを細胞に送達するためのアルコール（例えば、エタノール）を含み得る。組成物又は医薬組成物は、細胞透過剤を含み得る。細胞透過剤は、ポリリボヌクレオチドの細胞内への送達を高めるように構成される。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0071】

いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、治療適用に好適であり、例えば、ポリリボヌクレオチドは、組成物が対象に投与されるときに治療効果を有する治療用ポリリボヌクレオチドである。いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドは、創傷治癒を促進するタンパク質をコードする。

【0072】

ある種の態様では、本開示は、治療用組成物及び本明細書に記載される組成物、治療用組成物、又は医薬組成物を投与する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物、治療用組成物、又は医薬組成物は、表面領域（例えば、局所表面領域）に直接的に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物、治療用組成物、又は医薬組成物は、殺菌剤の適用の後に対象の表面領域に適用される。

【0073】

細胞透過剤は、ポリリボヌクレオチドの細胞内への送達を高めるように構成される。いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物は、治療適用に好適であり、例えば、ポリリボヌクレオチドは、組成物が対象に投与されるときに治療効果を有する治療用ポリリボヌクレオチドである。態様において、本開示は、治療用組成物及び本明細書に記載される治療用組成物を投与する方法を提供する。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0074】

本明細書に記載されるとおりの組成物又は医薬組成物は、創傷治療のために使用され得る。例えば、創傷を治療する方法は、創傷、又は創傷の周囲の組織を、本明細書に記載されるとおりの組成物又は医薬組成物に接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物又は医薬組成物のポリリボヌクレオチドは、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、又はＶＥＧＦなどの増殖因子をコードする配列を含む。

【0075】

アルコール
本明細書に記載されるとおりのアルコールは、ポリリボヌクレオチドの細胞内への送達のために使用され得る。アルコールは、ポリリボヌクレオチドの細胞内への送達のために、本明細書に記載されるとおりのポリリボヌクレオチドとの混合物中に存在し得る。混合物は、アルコールを少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ含み得る。アルコールは、エタノールであってもよい。いくつかの実施形態では、混合物は、対象の表面領域に適用される。いくつかの実施形態では、混合物は、医薬組成物である。

【0076】

アルコールは、１つ以上のヒドロキシル官能基を含む任意のアルコールであり得る。いくつかの場合において、アルコールは、一価アルコール、多価アルコール、不飽和脂肪族アルコール、又は脂環式アルコールであるが、これらに限定されない。アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、又はヒドロキシエチルセルロースのうちの１つ以上を含み得る。ある種の実施形態では、アルコールは、エタノールである。

【0077】

他の場合において、本明細書で提供される組成物、医薬組成物、及び方法は、アルコールを含むだけであり、ポリリボヌクレオチドの細胞内への送達を高めるいずれの他の薬剤も有しないか又は使用しない。いくつかの場合において、アルコールはエタノールであり、組成物、医薬組成物、及び方法は、ポリリボヌクレオチドの細胞内への送達を高めるいずれの他の薬剤も有しないか又は使用しない。いくつかの場合において、アルコールは、細胞透過剤である。いくつかの場合において、アルコールは、細胞透過剤ではない。

【0078】

本明細書で開示される組成物は、アルコール及びポリリボヌクレオチドの混合物を含み得る。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、アルコールと予め混合された混合物中に存在する。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、細胞への接触の前にアルコールとは別々に提供される。これらの場合において、ポリリボヌクレオチドは、細胞に適用されるときにアルコールと接触され、ポリリボヌクレオチドの細胞内への送達のために合わせて混合される。特定の理論に束縛されることなく、混合物中のアルコールの濃度は、送達の効率に寄与し得る。したがって、いくつかの場合において、アルコールは、混合物中において既定の濃度で提供される。いくつかの他の場合において、アルコール及びポリリボヌクレオチドが、最初は別々であるが、送達のために適用されているときに合わせて混合されるとき、アルコールは、ポリリボヌクレオチドに対して十分な量で提供され、混合物中で最小の既定濃度に達することを確保することになる。

【0079】

いくつかの場合において、アルコールは、混合物の少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０２％、少なくとも約０．０３％、少なくとも約０．０４％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．０６％、少なくとも約０．０７％、少なくとも約０．０８％、少なくとも約０．０９％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の体積当たりの体積（ｖ／ｖ）を占める。いくつかの場合において、アルコールは、混合物の最大約０．０１％、最大約０．０２％、最大約０．０３％、最大約０．０４％、最大約０．０５％、最大約０．０６％、最大約０．０７％、最大約０．０８％、最大約０．０９％、最大約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％ｖ／ｖを占める。いくつかの場合において、アルコールは、混合物の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、又は約１００％ｖ／ｖを占める。

【0080】

いくつかの場合において、アルコールは、混合物の少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０２％、少なくとも約０．０３％、少なくとも約０．０４％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．０６％、少なくとも約０．０７％、少なくとも約０．０８％、少なくとも約０．０９％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の重量当たりの重量（ｗ／ｗ）を占める。いくつかの場合において、アルコールは、混合物の最大約０．０１％、最大約０．０２％、最大約０．０３％、最大約０．０４％、最大約０．０５％、最大約０．０６％、最大約０．０７％、最大約０．０８％、最大約０．０９％、最大約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％ｗ／ｗを占める。いくつかの場合において、細胞透過剤は、混合物の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約９８％ｗ／ｗを占める。いくつかの場合において、アルコールは、混合物の約１０％ｖ／ｖを占める。

【0081】

いくつかの実施形態では、アルコールは、混合物の少なくとも約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、若しくは少なくとも約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又はそれらの間の任意のパーセンテージｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、アルコールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ、若しくは少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ、又はそれらの間の任意のパーセンテージｖ／ｖを占める。

【0082】

いくつかの場合において、本明細書に記載される混合物は、液体溶液である。例えば、アルコールは、液体物質そのものである。これらの場合において、ポリリボヌクレオチドもまた、液体溶液中で溶解され得る。

【0083】

いくつかの場合において、エタノールは、混合物の少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の体積当たりの体積（ｖ／ｖ）を占める。いくつかの場合において、エタノールは、混合物の最大約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％ｖ／ｖを占める。いくつかの場合において、エタノールは、混合物の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、又は約１００％ｖ／ｖを占める。いくつかの場合において、エタノールは、混合物の約１０％ｖ／ｖを占める。

【0084】

いくつかの実施形態では、エタノールは、混合物の少なくとも約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、若しくは少なくとも約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又はそれらの間の任意のパーセンテージｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、エタノールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ、若しくは少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ、又はそれらの間の任意のパーセンテージｖ／ｖを占める。

【0085】

細胞透過剤
本明細書に記載される細胞透過剤は、ポリリボヌクレオチドの細胞内への送達を高める任意の物質を含み得る。細胞透過剤は、有機化合物又は無機分子を含み得る。いくつかの場合において、細胞透過剤は、アルカン、アルケン、及びアレン；ハロゲン置換アルカン、アルケン、及びアレン；アルコール、フェノール（ベンゼンの誘導体）、エーテル、アルデヒド、ケトン、及びカルボン酸；アミン及びニトリルなどであるが、これらに限定されない１つ以上の官能基を有する有機化合物である。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、極性溶媒に可溶性である。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、極性溶媒に不溶性である。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0086】

細胞透過剤は、１つ以上のヒドロキシル官能基を有するアルコールなどの有機化合物を含み得る。いくつかの場合において、細胞透過剤は、一価アルコール、多価アルコール、不飽和脂肪族アルコール、及び脂環式アルコールなどであるがこれらに限定されないアルコールを含む。細胞透過剤は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、又はヒドロキシエチルセルロースのうちの１つ以上を含み得る。ある種の実施形態では、細胞透過剤は、エタノールを含む。

【0087】

他の場合において、本明細書で提供される組成物及び方法は、細胞透過剤としてアルコールを含むだけであり、ポリリボヌクレオチドの細胞内への送達を高めるいずれの他の薬剤も有しないか又は使用しない。いくつかの場合において、細胞透過剤は、エタノール及びポリリボヌクレオチドの細胞内への送達を高めることができる任意の他のアルコールを含む。いくつかの場合において、細胞透過剤は、エタノール及びポリリボヌクレオチドの細胞内への送達を高めることができる任意の他の有機又は無機分子を含む。いくつかの場合において、細胞透過剤は、エタノール並びに各々が全体として参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３００６８２５号パンフレット、国際公開第２０１６０３６７３５号パンフレット、国際公開第２０１８１１２２８２Ａ１号パンフレット、及び国際公開第２０１２０３１０４３Ａ１号パンフレットにおいて記載されるものなどのリポソーム又はナノ粒子を含む。いくつかの場合において、細胞透過剤は、エタノール並びに各々が全体として参照により本明細書に組み込まれるＢｅｃｈａｒａ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：２０ ｙｅａｒｓ ｌａｔｅｒ，ｗｈｅｒｅ ｄｏ ｗｅ ｓｔａｎｄ？ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８７（１２）：１６９３－１７０２（２０１３）；Ｌａｎｇｅｌ，Ｃｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ ＦＬ，２００２）；Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１１（２８）：３５９７－６１１（２００３）；Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２（１６）：１８３９－４９（２００５）、米国特許出願公開第２０１３０１２９７２６号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１３７６４４号明細書及び米国特許出願公開第２０１３０１６４２１９号明細書において記載されるものなどの細胞浸透ペプチド又はタンパク質を含む。いくつかの場合において、エタノールと他の細胞透過剤の比は、約１：０．００１、１：０．００２、１：００５、１：００８、１：０．０１、１：０．０２、１：０．０５、１：０．０８、１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１、１：１．２、１：１．５、１：１．８、１：２、１：２．５、１：３、１：３．５、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：１２０、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：５００、又は１：１０００である。いくつかの場合において、エタノールと他の細胞透過剤の比は、少なくとも約１：０．００１、１：０．００２、１：００５、１：００８、１：０．０１、１：０．０２、１：０．０５、１：０．０８、１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１、１：１．２、１：１．５、１：１．８、１：２、１：２．５、１：３、１：３．５、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：１２０、１：１５０、１：２００、１：２５０、又は１：５００である。

【0088】

本明細書で開示される組成物は、細胞透過剤及びポリリボヌクレオチドの混合物を含み得る。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、細胞透過剤と予め混合された混合物中に存在する。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、細胞への接触の前に細胞透過剤とは別々に提供される。これらの場合において、ポリリボヌクレオチドは、細胞に適用されるときに細胞透過剤と接触され、ポリリボヌクレオチドの細胞内への送達のために合わせて混合される。特定の理論に束縛されることなく、混合物中の細胞透過剤の濃度は、送達の効率に寄与し得る。したがって、いくつかの場合において、細胞透過剤は、混合物中において既定の濃度で提供される。いくつかの他の場合において、細胞透過剤及びポリリボヌクレオチドが、最初は別々であるが、送達のために適用されているときに合わせて混合されるとき、細胞透過剤は、ポリリボヌクレオチドに対して十分な量で提供され、混合物中で最小の既定濃度に達することを確保することになる。

【0089】

いくつかの場合において、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０２％、少なくとも約０．０３％、少なくとも約０．０４％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．０６％、少なくとも約０．０７％、少なくとも約０．０８％、少なくとも約０．０９％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の体積当たりの体積（ｖ／ｖ）を占める。いくつかの場合において、細胞透過剤は、混合物の最大約０．０１％、最大約０．０２％、最大約０．０３％、最大約０．０４％、最大約０．０５％、最大約０．０６％、最大約０．０７％、最大約０．０８％、最大約０．０９％、最大約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％ｖ／ｖを占める。いくつかの場合において、細胞透過剤は、混合物の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、又は約１００％ｖ／ｖを占める。

【0090】

いくつかの場合において、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０２％、少なくとも約０．０３％、少なくとも約０．０４％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．０６％、少なくとも約０．０７％、少なくとも約０．０８％、少なくとも約０．０９％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の重量当たりの重量（ｗ／ｗ）を占める。いくつかの場合において、細胞透過剤は、混合物の最大約０．０１％、最大約０．０２％、最大約０．０３％、最大約０．０４％、最大約０．０５％、最大約０．０６％、最大約０．０７％、最大約０．０８％、最大約０．０９％、最大約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％ｗ／ｗを占める。いくつかの場合において、細胞透過剤は、混合物の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、又は約９８％ｗ／ｗを占める。いくつかの場合において、細胞透過剤は、混合物の約１０％ｖ／ｖを占める。

【0091】

いくつかの場合において、本明細書に記載される混合物は、液体溶液である。例えば、細胞透過剤は、液体物質そのものである。或いは、細胞透過剤は、固体、液体、又は気体物質であり、液体担体、例えば、水中に溶解される。これらの場合において、ポリリボヌクレオチドもまた、液体溶液中で溶解され得る。

【0092】

いくつかの場合において、エタノールは、混合物の少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％の体積当たりの体積（ｖ／ｖ）を占める。いくつかの場合において、エタノールは、混合物の最大約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％ｖ／ｖを占める。いくつかの場合において、エタノールは、混合物の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、又は約１００％ｖ／ｖを占める。いくつかの場合において、エタノールは、混合物の約１０％ｖ／ｖを占める。

【0093】

ポリリボヌクレオチド
本開示の態様は、エクスビボ又はインビボのいずれかで、ポリリボヌクレオチドを細胞内に送達するための組成物及び方法に関する。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドのいずれかであり得る。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドが投与される細胞又は対象に対する生物学的効果を有する。本開示の態様は、組成物が対象における細胞内に送達されるとき（例えば、直接的な投与）、又は対象に投与されることになる細胞内に送達されるとき（例えば、細胞移植又は細胞注入）、対象に対して治療効果を有するポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。本明細書に記載されるとおりのポリリボヌクレオチドは、医薬組成物中でアルコール（例えば、エタノール）と混合され得る。本明細書に記載されるとおりのポリリボヌクレオチドは、いずれの担体も含まない組成物中で希釈剤と混合され得る。

【0094】

ポリリボヌクレオチドは、発現産物のための配列を含み得る。或いは又は加えて、ポリリボヌクレオチドは、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド）、小分子（例えば、薬物）、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、リン脂質（例えば、ＰＩ（４，５）Ｐ_２）、炭水化物、抗体、ウイルス、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、他の細胞部分、その任意の断片、及びその任意の組合せなどの他の実体（例えば、標的）に結合するための配列を含む。ポリリボヌクレオチドに由来する配列の発現及び／又は標的へのポリリボヌクレオチドの結合は、様々な生物学的効果を有し得る。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、細胞機能を、例えば、一過性に又は長期間調節する。ある種の実施形態では、細胞機能は、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はその間の任意の時間持続する調節など、安定に改変される。ある種の実施形態では、細胞機能は、例えば、約３０分～約７日間以下、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下、又はその間の任意の時間持続する調節など、一過性に改変される。

【0095】

ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、又は少なくとも約１，０００ヌクレオチドであり得る。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドに由来する配列の発現に関するリボソームのための結合部位を収容するのに十分なサイズのものである。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡの翻訳の阻害、標的ｍＲＮＡの分解、標的ＲＮＡのスプライシングの調節、及び標的受容体とそのリガンドの間の結合の促進などのポリリボヌクレオチドの調節機能を示すための標的に関する結合部位を収容するのに十分なサイズのものである。当業者は、直鎖状又は環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズが、直鎖状又は環状ポリリボヌクレオチドを生成し、且つ／又は環状ポリリボヌクレオチドを使用することの技術的制約の範囲内の大きさであり得ることを認識し得る。いくつかの場合において、本明細書で提供される直鎖状又は環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、ＲＮＡをパッケージ化し且つ標的に送達する能力によって制限され得る。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドのサイズは、有用なポリペプチドをコードするのに十分な長さであり、したがって、約２０，０００ヌクレオチド未満、約１５，０００ヌクレオチド未満、約１０，０００ヌクレオチド未満、約７，５００ヌクレオチド未満、又は約５，０００ヌクレオチド未満、約４，０００ヌクレオチド未満、約３，０００ヌクレオチド未満、約２，０００ヌクレオチド未満、約１，０００ヌクレオチド未満、約５００ヌクレオチド未満、約４００ヌクレオチド未満、約３００ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満の長さが有用であり得る。

【0096】

本明細書で提供されるポリリボヌクレオチドは、参照配列、特に、親ポリリボヌクレオチドと比較して、置換、挿入及び／又は付加、欠失、並びに共有結合性の修飾などの１つ以上の修飾を有し得る。例えば、ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の転写後修飾（例えば、キャップ形成、切断、ポリアデニル化、スプライシング、ポリＡ配列、メチル化、アシル化、リン酸化、リジン及びアルギニン残基のメチル化、アセチル化、並びにチオール基及びチロシン残基のニトロシル化など）を含む。ポリリボヌクレオチドは、ピリジン－４－オン リボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、及び４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含み得る。いくつかの場合において、ｍＲＮＡは、５－アザ－シチジン、プロイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プロイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プロイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プロイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プロイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プロイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プロイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プロイドイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－プロイドイソシチジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。いくつかの場合において、ｍＲＮＡは、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。いくつかの場合において、ｍＲＮＡは、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、キャップを欠く。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ポリＡテールを欠く。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、非免疫原性である。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、免疫原性である。

【0097】

ポリリボヌクレオチドは、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合（例えば、結合しているリン酸／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格）に対するものなどの任意の有用な修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の１つ以上の原子は、任意選択により置換されたアミノ、任意選択により置換されたチオール、任意選択により置換されたアルキル（例えば、メチル又はエチル）、又はハロ（例えば、クロロ又はフルオロ）で置き換えられ得るか又は置換され得る。ある種の実施形態では、修飾（例えば、１つ以上の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合の各々において存在する。修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）又はそのハイブリッドに対するリボ核酸（ＲＮＡ）の修飾であってもよい。さらなる修飾が本明細書に記載される。

【0098】

異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、及び／又はヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）は、本明細書で提供されるポリリボヌクレオチド中の様々な部位で存在し得る。当業者は、ヌクレオチド類似体又は他の修飾が、ポリリボヌクレオチドの機能が実質的に低減されないように、ポリリボヌクレオチドの任意の部位で位置してもよいことを認識することになる。ポリリボヌクレオチドは、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（全体的なヌクレオチド含量に関して、又はヌクレオチドの１つ以上の種類、例えば、Ａ、Ｇ、Ｕ、又はＣの任意の１つ以上に関して）又は間にある任意のパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）を含み得る。

【0099】

いくつかの場合において、混合物中のポリリボヌクレオチドの濃度は、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約０．２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１μｇ／ｍＬ、少なくとも約２μｇ／ｍＬ、少なくとも約３μｇ／ｍＬ、少なくとも約４μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約３０μｇ／ｍＬ、少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬである。いくつかの場合において、混合物中のポリリボヌクレオチドの濃度は、最大約０．１ｎｇ／ｍＬ、最大約０．２ｎｇ／ｍＬ、最大約０．５ｎｇ／ｍＬ、最大約１ｎｇ／ｍＬ、最大約５ｎｇ／ｍＬ、最大約１０ｎｇ／ｍＬ、最大約２０ｎｇ／ｍＬ、最大約５０ｎｇ／ｍＬ、最大約１００ｎｇ／ｍＬ、最大約２００ｎｇ／ｍＬ、最大約５００ｎｇ／ｍＬ、最大約１μｇ／ｍＬ、最大約２μｇ／ｍＬ、最大約３μｇ／ｍＬ、最大約４μｇ／ｍＬ、最大約５μｇ／ｍＬ、最大約１０μｇ／ｍＬ、最大約２０μｇ／ｍＬ、最大約３０μｇ／ｍＬ、最大約４０μｇ／ｍＬ、最大約５０μｇ／ｍＬ、最大約１００μｇ／ｍＬ、最大約２００μｇ／ｍＬ、最大約３００μｇ／ｍＬ、最大約４００μｇ／ｍＬ、最大約５００μｇ／ｍＬ、最大約１ｍｇ／ｍＬ、最大約２ｍｇ／ｍＬ、最大約５ｍｇ／ｍＬ、最大約１０ｍｇ／ｍＬ、最大約２０ｍｇ／ｍＬ、最大約５０ｍｇ／ｍＬ、又は最大約１００ｍｇ／ｍＬである。

【0100】

いくつかの場合において、混合物中のポリリボヌクレオチドの濃度は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．２ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約１００ｍｇ／ｍＬである。

【0101】

組成物は、ポリリボヌクレオチド及びアルコール（例えば、エタノール）を含み得る。ある種の特定の実施形態では、組成物は、直鎖状ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む。ある種の特定の実施形態では、組成物は、環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）及びアルコールを含む。環状構造に起因して、ｃｉｒｃＲＮＡは、対応する直鎖状ＲＮＡと比較して、安定性の向上、半減期の増大、免疫原性の低減、及び／又は機能性（例えば、本明細書に記載される機能の）の向上を有する。

【0102】

組成物は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含み得る。ある種の特定の実施形態では、組成物は、直鎖状ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む。ある種の特定の実施形態では、組成物は、環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）及び細胞透過剤を含む。環状構造に起因して、ｃｉｒｃＲＮＡは、対応する直鎖状ＲＮＡと比較して、安定性の向上、半減期の増大、免疫原性の低減、及び／又は機能性（例えば、本明細書に記載される機能の）の向上を有する。

【0103】

いくつかの場合において、本明細書で提供される環状ポリリボヌクレオチドは、直鎖状対応物、例えば、直鎖状発現配列、又は直鎖状環状ポリリボヌクレオチドの少なくともその半減期を有する。いくつかの場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、直鎖状対応物のものより増大されている半減期を有する。いくつかの場合において、半減期は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又はそれ以上増大される。いくつかの場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はその間の任意の時間の細胞中での半減期又は持続性を有する。ある種の実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０分～約７日間以下、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下、又はその間の任意の時間の細胞中での半減期又は持続性を有する。

【0104】

ペイロード及び生物学的効果
いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、細胞又は対象への送達時又は送達後に細胞又は対象に対する生物学的効果を有する少なくとも１つのペイロードを含む。ペイロードは、ポリリボヌクレオチドにおいてコードされる１つ以上の配列であってもよく、これらは、発現され、標的分子（例えば、タンパク質、核酸、小分子、又はリボザイム）、又は標的細胞などの標的実体に結合する。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。細胞に対する生物学的効果は、変化、例えば、細胞上又は細胞中における形態学的変化又は機能的変化を引き起こす細胞に対する様々な分子及び細胞性の変化を含み得る。例えば、細胞に対する生物学的効果は、細胞増殖の加速若しくは減速、生存、アポトーシス、又は細胞の壊死、遺伝子転写及びｍＲＮＡ翻訳、並びに特定の分化された細胞の機能性（例えば、免疫細胞の活性化、ニューロンの興奮若しくは抑制、ホルモン分泌細胞からのホルモン分泌、又はマクロファージによる貪食活性）などであるがこれらに限定されない細胞機能に影響する細胞内部のシグナル伝達における変化、又は外来分子の細胞内への移行の効率における変化、例えば、外来分子に対する細胞透過性の増大若しくは低減を含み得るが、これらに限定されない。対象に対する生物学的効果はまた、対象の生理機能に対する様々な変化、例えば、任意の１つ以上の組織又は器官に対する構造的又は機能的変化を含み得る。対象に対する生物学的効果は、ＥＣＧ、血糖、血圧、体温、血球数、ＨｂＣＯ、及びＭｅｔＨｂなどの、対象から測定され得る１つ以上の生理学的パラメーターにおける変化を引き起こし得る。生物学的効果はまた、対象が罹患している疾患の１つ以上の症状の寛解、又は対象における疾患の治療若しくは根絶も含み得る。生物学的効果はまた、創傷治癒を含み得る。

【0105】

発現配列
いくつかの場合において、本明細書に記載されるとおりのポリリボヌクレオチドは、ペプチド又はポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。ペプチドは、タンパク質、小さいペプチド、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、及びアミノ酸類似体を含み得るが、これらに限定されない。ペプチドは、直鎖状又は分岐状であり得る。ペプチドは、１モル当たり分子量約５００，０００グラム未満、１モル当たり分子量約２００，０００グラム未満、１モル当たり分子量約１００，０００グラム未満、１モル当たり分子量約５０，０００グラム未満、１モル当たり分子量約２０，０００グラム未満、１モル当たり分子量約１０，０００グラム未満、１モル当たり分子量約５，０００グラム未満、１モル当たり分子量約２，０００グラム未満、１モル当たり分子量約１，０００グラム未満、１モル当たり分子量約５００グラム未満、並びにそのような化合物の塩、エステル、及び他の薬学的に許容される形態を有し得る。ペプチドは、例えば、神経伝達物質、ホルモン、薬物、毒素、ウイルス又は微生物粒子、合成分子、及びそのアゴニスト又はアンタゴニストを含み得る。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0106】

本明細書で提供されるポリリボヌクレオチドにより発現されるペプチド又はポリペプチドのいくつかの例は、蛍光タグ又はマーカー、抗原、ペプチド治療薬、天然の生理活性ペプチドに由来する合成又は類似体ペプチド、アゴニスト又はアンタゴニストペプチド、抗微生物ペプチド、孔形成ペプチド、二環式ペプチド、標的化又は細胞傷害性ペプチド、分解又は自己破壊ペプチド、及び分解又は自己破壊ペプチド（複数）を含む。本明細書に記載されるペプチドはまた、抗原結合ペプチド、例えば、抗原結合抗体又は一本鎖抗体、ナノボディ（例えば、Ｓｔｅｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂｉｇ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ：２１（７）：１０７６－１１３を参照のこと）などの抗体様断片を含み得る。そのような抗原結合ペプチドは、サイトゾル抗原、核抗原、オルガネラ内抗原に結合し得る。

【0107】

いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、治療用タンパク質をコードする発現配列を含む。治療用タンパク質のいくつかの例としては、タンパク質の置き換え、タンパク質補給、ワクチン投与、抗原（例えば、腫瘍抗原、ウイルス、細菌）、ホルモン、サイトカイン、抗体、免疫療法（例えば、癌）、細胞初期化／分化転換因子、転写因子、キメラ抗原受容体、トランスポサーゼ又はヌクレアーゼ、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を及ぼす）、調節されたデスエフェクタータンパク質（例えば、アポトーシス又は壊死の誘導因子）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、腫瘍性タンパク質の阻害剤）、エピジェネティック修飾剤、エピジェネティック酵素、転写因子、ＤＮＡ又はタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核内受容体活性化剤又は阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素についての競合的阻害剤、タンパク質合成エフェクター又は阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質断片又はドメイン、リガンド又は受容体、及びそのＣＲＩＳＰＲシステム又は成分が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、タンパク質又は治療用タンパク質は、増殖因子などの創傷治癒タンパク質である。例えば、増殖因子は、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、又はＶＥＧＦである。

【0108】

いくつかの実施形態では、タンパク質又は治療用タンパク質は、創傷治癒の方法において使用される。例えば、創傷を治療する方法は、創傷、又は創傷の周囲の組織を、本明細書に記載されるとおりの組成物又は医薬組成物に接触させることを含むことができ、組成物又は医薬組成物のポリリボヌクレオチドは、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、又はＶＥＧＦなどの増殖因子をコードする配列を含む。

【0109】

いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、調節エレメント、例えば、環状ポリリボヌクレオチド又は直鎖状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を修飾する配列を含む。調節エレメントは、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列をコードし得る。調節エレメントは、隣接配列に作動可能に連結され得る。調節エレメントは、調節エレメントの存在を伴わずに発現された産物の量と比較して、発現される産物の量を増加させることができる。加えて、１つの調節エレメントは、直列に結合された複数の発現配列に関して発現される産物の量を増加させることができる。したがって、１つの調節エレメントは、１つ以上の発現配列の発現を増強できる。複数の調節エレメントが、当業者によく知られている。

【0110】

いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、翻訳開始配列、例えば、開始コドンを含む。いくつかの場合において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガーノ配列である。

【0111】

いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、第１の開始コドンではないコドン、例えば、ＡＵＧで開始する。ポリリボヌクレオチドの翻訳は、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧなどであるが、これらに限定されない代替的な翻訳開始配列で開始し得る。いくつかの場合において、翻訳は、真核生物開始因子４Ａ（ｅＩＦ４Ａ）によって開始される。他の実施形態では、翻訳は、ポリリボヌクレオチドの配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントから開始される。ＩＲＥＳエレメントは、真核生物リボソームを結合できるＲＮＡ配列を含み得る。いくつかの場合において、ＩＲＥＳエレメントは、少なくとも約５ｎｔ、少なくとも約８ｎｔ、少なくとも約９ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約２００ｎｔ、少なくとも約２５０ｎｔ、少なくとも約３５０ｎｔ、又は少なくとも約５００ｎｔである。一実施形態では、ＩＲＥＳエレメントは、ウイルス、哺乳動物、及びショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を含むが、これらに限定されない生物のＤＮＡに由来する。そのようなウイルスＤＮＡは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ｃＤＮＡ及びポリオウイルスｃＤＮＡとともに、ピコルナウイルス相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に由来し得るが、これに限定されない。一実施形態では、ＩＲＥＳエレメントが由来するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＤＮＡは、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のアンテナペディア遺伝子を含むが、これに限定されない。

【0112】

いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、各発現配列は、終結エレメントを有してもよいし、有しなくてもよい。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、発現配列は、終結エレメントを欠く。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドが持続的に翻訳されるように終結エレメントを欠く環状ポリリボヌクレオチドである。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列の末端で終結エレメントを含む。いくつかの場合において、１つ以上の発現配列は、終結エレメントを欠く。一般に、終結エレメントは、翻訳の終結を合図するインフレームのヌクレオチドトリプレット、例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧを含む。

【0113】

ポリリボヌクレオチドは、例えば、内在性遺伝子及び／又は外来遺伝子の発現を修飾する調節核酸を含み得る。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、調節核酸をコードする（例えば、それに相補的である）１つ以上の発現配列を含む。調節核酸としては、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、及びｈｎＲＮＡなどであるがこれらに限定されない、非コードＲＮＡが挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0114】

一例において、調節核酸は、宿主遺伝子を標的化する。調節核酸としては、内在性遺伝子にハイブリダイズする核酸（例えば、本明細書の他の箇所に記載されるとおりのｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ）、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡなどの外来核酸にハイブリダイズする核酸、ＲＮＡにハイブリダイズする核酸、遺伝子転写を妨害する核酸、ＲＮＡ翻訳を妨害する核酸、分解のための標的化を介するものなど、ＲＮＡを安定化するか又はＲＮＡを不安定化する核酸、及びＤＮＡ又はＲＮＡ結合因子を調節する核酸が挙げられ得るが、これらに限定されない。一実施形態では、配列は、ｍｉＲＮＡである。

【0115】

いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などの調節核酸を含む。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡを含むか又はガイドＲＮＡをコードする。ｇＲＮＡは、ユーザーによって定義されたゲノム標的のための約２０個のヌクレオチド標的化配列に結合するのに必要な「足場」配列で構成される短い合成ＲＮＡであり得る。ｇＲＮＡは、特定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子のプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、又はリプレッサーに隣接するか又はその内部にある配列）を認識できる。ｇＲＮＡは、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲシステムの一部であり得る。遺伝子編集のために、ポリリボヌクレオチドは、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含むように設計され得る；例えば、各々が全体として参照により本明細書に組み込まれるＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９－８２３；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，８：２２８１－２３０８を参照されたい。

【0116】

ポリリボヌクレオチドは、内在性遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）の全て又は断片に実質的に相補的であるか、又は完全に相補的である調節核酸をコードし得る。調節核酸は、特定の遺伝子の新たに生成された核ＲＮＡ転写物の転写のためのｍＲＮＡへの成熟を妨げるイントロンとエクソン間の境界、エクソン間、又はエクソンの隣の配列に相補的であり得る。特定の遺伝子に相補的である調節核酸は、当該遺伝子に関するｍＲＮＡとハイブリダイズすることができ、且つその翻訳を妨げることができる。アンチセンス調節核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその誘導体若しくはハイブリッドであり得る。いくつかの場合において、調節核酸は、内在性遺伝子又は外来遺伝子の発現の調節に関与するタンパク質に結合するタンパク質結合部位を含む。

【0117】

いくつかの場合において、本明細書で提供されるとおりの環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率は、参照、例えば、直鎖状対応物、直鎖状発現配列、又は直鎖状環状ポリリボヌクレオチドより高い。いくつかの場合において、本明細書で提供されるとおりの環状ポリリボヌクレオチドは、参照のものより少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７０％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％、１０００００％、又はそれ以上高い翻訳効率を有する。いくつかの場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、直鎖状対応物のものより１０％高い翻訳効率を有する。いくつかの場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、直鎖状対応物のものより３００％高い翻訳効率を有する。

【0118】

いくつかの場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、化学量論的な比の発現産物を生成する。ローリングサークル翻訳は、実質的に同じ比で発現産物を連続的に生成する。いくつかの場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、化学量論的な翻訳効率を有し、その結果、発現産物は、実質的に同じ比で生成される。いくつかの場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、複数の発現産物、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又はそれ以上の発現配列からの産物の化学量論的な翻訳効率を有する。

【0119】

いくつかの場合において、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されると、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも１ラウンドの翻訳が終わる前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。いくつかの場合において、本明細書に記載されるとおりの環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル翻訳の能力を有する。いくつかの場合において、ローリングサークル翻訳の間、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されると、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２ラウンド、少なくとも３ラウンド、少なくとも４ラウンド、少なくとも５ラウンド、少なくとも６ラウンド、少なくとも７ラウンド、少なくとも８ラウンド、少なくとも９ラウンド、少なくとも１０ラウンド、少なくとも１１ラウンド、少なくとも１２ラウンド、少なくとも１３ラウンド、少なくとも１４ラウンド、少なくとも１５ラウンド、少なくとも２０ラウンド、少なくとも３０ラウンド、少なくとも４０ラウンド、少なくとも５０ラウンド、少なくとも６０ラウンド、少なくとも７０ラウンド、少なくとも８０ラウンド、少なくとも９０ラウンド、少なくとも１００ラウンド、少なくとも１５０ラウンド、少なくとも２００ラウンド、少なくとも２５０ラウンド、少なくとも５００ラウンド、少なくとも１０００ラウンド、少なくとも１５００ラウンド、少なくとも２０００ラウンド、少なくとも５０００ラウンド、少なくとも１００００ラウンド、少なくとも１０^５ラウンド、又は少なくとも１０^６ラウンドの翻訳が終わる前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。

【0120】

いくつかの場合において、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの２ラウンド以上の翻訳から翻訳されるポリペプチド産物（「連続的な」発現産物）の生成をもたらす。いくつかの場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、交互交替的なエレメント（例えば、翻訳中にリボソームの休止をもたらすエレメント）を含み、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの１ラウンドの翻訳又は１ラウンド未満の翻訳から生成されるポリペプチド産物の生成をもたらす（「別個の」発現産物の生成を可能にする）。いくつかの場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル翻訳の間に生成される全ポリペプチドの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％（モル濃度／モル濃度）が、別個のポリペプチドであるように構成される。いくつかの場合において、全ポリペプチドに対する別個の産物の量の比は、インビトロ翻訳系において試験される。いくつかの場合において、量の比の試験のために使用されるインビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球のライセートを含む。いくつかの場合において、量の比は、真核細胞又は原核細胞、培養細胞又は生物中の細胞などのインビボ翻訳系において試験される。

【0121】

いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されない。いくつかの場合において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流にあり得る。いくつかの場合において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。いくつかの場合において、第１の発現配列に関するあるＵＴＲは、第２の発現配列に関する別のＵＴＲと同じであるか、連続的であるか、又は重複している。いくつかの場合において、イントロンは、ヒトイントロンである。いくつかの場合において、イントロンは、完全長ヒトイントロン、例えば、ＺＫＳＣＡＮ１である。

【0122】

いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、アデノシン及びウリジンが埋め込まれた１つ以上の区間を有するＵＴＲを含む。これらのＡＵに富む特性は、発現産物の回転率を増大させ得る。

【0123】

ＵＴＲのＡＵに富むエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、又は修飾は、ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節するのに有用であり得る。特定のポリリボヌクレオチドを設計するとき、ＡＲＥの１つ以上のコピーがポリリボヌクレオチドに導入されてもよく、ＡＲＥのコピーは、発現産物の翻訳及び／又は生成を調節し得る。同様に、ＡＲＥは、同定され且つ除去され得るか、又は細胞内安定性を調節し、したがって、結果として生じるタンパク質の翻訳及び生成に影響を及ぼすようにポリリボヌクレオチド内に設計され得る。

【0124】

任意の遺伝子に由来する任意のＵＴＲは、ポリリボヌクレオチドのそれぞれの隣接領域に組み込まれ得ることが理解されるべきである。非限定的な例として、組み込まれ得るＵＴＲ又はその断片は、各々の内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／７７５，５０９号明細書及び同第６１／８２９，３７２号明細書、又は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２号明細書において列挙されるＵＴＲである。さらに、任意の既知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲが利用され得る。野生型遺伝子のバリアントではない人工的なＵＴＲを提供することも本発明の範囲内である。これらのＵＴＲ又はその部分は、それらが方向づけ又は位置において選択されたか又は改変され得る転写物におけるものと同じ方向づけにおいて配置され得る。したがって、５’又は３’ＵＴＲは、反転され得るか、短縮され得るか、延長され得るか、１つ以上の他の５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲとキメラが作製され得る。本明細書で使用する場合、用語「改変される」は、それがＵＴＲ配列に関する場合、ＵＴＲが参照配列に対していくつかの方法で変えられていることを意味する。例えば、３’又は５’ＵＴＲは、上で教示されるとおりの方向づけ又は位置における変化によって野生型又は天然のＵＴＲに対して改変されてもよいし、追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換又は転位によって改変されてもよい。「改変された」ＵＴＲ（３’又は５’）を生成するこれらの変化のいずれかは、バリアントＵＴＲを含む。

【0125】

一実施形態では、５’又は３’ＵＴＲなどの二重、三重、又は四重ＵＴＲが使用されてもよい。本明細書で使用する場合、「二重」ＵＴＲは、同じＵＴＲの２つのコピーが連続して又は実質的に連続してコードされるものである。例えば、二重ベータ－グロビン３’ＵＴＲは、内容が全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１００１２９８７７号明細書において記載されるとおりに使用され得る。

【0126】

いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を含み得る。いくつかの場合において、ポリＡ配列の長さは、１０を超えるヌクレオチド長である。一実施形態では、ポリＡ配列は、１５を超えるヌクレオチド長（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００又はこれらを超えるヌクレオチド）である。いくつかの場合において、ポリＡ配列は、約１０～約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～７５０、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～２，０００、３０～２，５００、５０～１００、５０～２５０、５０～５００、５０～７５０、５０～１，０００、５０～１，５００、５０～２，０００、５０～２，５００、５０～３，０００、１００～５００、１００～７５０、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～２，０００、１００～２，５００、１００～３，０００、５００～７５０、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～２，５００、５００～３，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～２，５００、１，０００～３，０００、１，５００～２，０００、１，５００～２，５００、１，５００～３，０００、２，０００～３，０００、２，０００～２，５００、及び２，５００～３，０００）である。

【0127】

一実施形態では、ポリＡ配列は、全体的なポリリボヌクレオチドの長さに対して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴又は領域（第１の領域又は隣接領域など）の長さに基づいてもよいし、ポリリボヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づいてもよい。この文脈において、ポリＡ配列は、環状ポリリボヌクレオチド又はその特徴より１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％長い長さであってもよい。ポリＡ配列はまた、それが属するポリリボヌクレオチドの部分として設計され得る。この文脈において、ポリＡ配列は、コンストラクトの全長又はコンストラクトの全長からポリＡ配列を除いたものの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０％以上であり得る。さらに、ポリＡ結合タンパク質のための環状ポリリボヌクレオチドの操作された結合部位及びコンジュゲーションは、発現を増強し得る。

【0128】

一実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ－Ｇカルテットを含むように設計される。Ｇカルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方におけるＧに富む配列によって形成され得る４つのグアニンヌクレオチドの環状の水素結合された配列であり得る。一実施形態では、Ｇカルテットは、ポリＡ配列の末端に組み込まれる。いくつかの場合において、ポリＡ－Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチドのポリＡ配列を単独で使用して見られるものの少なくとも７５％に相当するタンパク質生成をもたらす。

【0129】

いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、ポリＡを含むか、ポリＡを欠くか、又はポリリボヌクレオチドの１つ以上の特徴を調節するための改変されたポリＡを有する。いくつかの場合において、ポリＡを欠くか又は改変されたポリＡを有するポリリボヌクレオチドは、１つ以上の機能的な特徴、例えば、免疫原性、半減期、発現効率などを向上させる。

【0130】

足場
いくつかの場合において、本明細書で提供されるポリリボヌクレオチドは、１つ以上の標的に結合する。一実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡ標的及びタンパク質標的の両方に結合し、且つ例えば、転写を媒介する。別の実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、タンパク質複合体を引き合わせ、且つ例えば、シグナル伝達を媒介する。別の実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、タンパク質などの２つ以上の異なる標的に結合し、且つ例えば、これらのタンパク質を細胞質に輸送する。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0131】

いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質のうちの少なくとも１つに結合し、それにより細胞プロセスを調節する（例えば、タンパク質発現を変化させる）。いくつかの実施形態では、合成ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの部分、例えば、選択されたＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質の結合部分との相互作用のための結合部位を含み、それにより内在性の対応物との結合において競合する。

【0132】

一実施形態では、合成ポリリボヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡに結合し且つ／又はそれを捕捉する。別の実施形態では、合成ポリリボヌクレオチドは、タンパク質に結合し且つ／又はそれを捕捉する。一実施形態では、合成ポリリボヌクレオチドは、ｍＲＮＡに結合し且つ／又はそれを捕捉する。一実施形態では、合成ポリリボヌクレオチドは、リボソームに結合し且つ／又はそれを捕捉する。別の実施形態では、合成ポリリボヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドに結合し且つ／又はそれを捕捉する。別の実施形態では、合成ポリリボヌクレオチドは、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）又は任意の他の非コードＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、ｓｈＲＮＡに結合し且つ／又はそれを捕捉する。結合及び／又は捕捉部位に加えて、ポリリボヌクレオチドは、結合され且つ／又は捕捉されたＲＮＡ及び／又はタンパク質の分解をもたらす分解エレメントを含み得る。

【0133】

一実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ｌｎｃＲＮＡ又はｌｎｃＲＮＡの配列を含み、例えば、ポリリボヌクレオチドは、天然に存在する非環状ｌｎｃＲＮＡ又はその断片の配列を含む。一実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ又はｌｎｃＲＮＡの配列は、スペーサー配列を伴って又は伴わずに環状化されて、合成環状ポリリボヌクレオチドを形成する。

【0134】

一実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、リボザイム活性を有する。一実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、リボザイムとして作用し、且つ病原性又は内在性ＲＮＡ、ＤＮＡ、小分子又はタンパク質を切断する。一実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、酵素活性を有する。一実施形態では、合成ポリリボヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ）を特異的に認識し、且つ切断する。別の実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、タンパク質を特異的に認識し、且つ切断する。別の実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、小分子を特異的に認識し、且つ分解する。

【0135】

一実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、破壊、自己切断、又は切断可能ポリリボヌクレオチドである。一実施形態では、ポリリボヌクレオチドを使用して、ＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを送達することができる。一実施形態では、合成ポリリボヌクレオチドは、（１）自己切断可能エレメント（例えば、ハンマーヘッド型スプライシングエレメント）、（２）切断動員部位（例えば、ＡＤＡＲ）、（３）分解性リンカー（グリセロール）、（４）化学的リンカー、及び／又は（５）スペーサー配列によって隔てられたマイクロＲＮＡで作られる。別の実施形態では、合成ポリリボヌクレオチドは、（１）自己切断可能エレメント（例えば、ハンマーヘッド型スプライシングエレメント）、（２）切断動員部位（例えば、ＡＤＡＲ）、（３）分解性リンカー（グリセロール）、（４）化学的リンカー、及び／又は（５）スペーサー配列によって隔てられたｓｉＲＮＡで作られる。

【0136】

一実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、転写／複製能があるポリリボヌクレオチドである。このポリリボヌクレオチドは、任意の型のＲＮＡをコードできる。一実施形態では、合成ポリリボヌクレオチドは、アンチセンスｍｉＲＮＡ及び転写エレメントを含む。一実施形態では、転写の後、直鎖状の機能性ｍｉＲＮＡが、環状ポリリボヌクレオチドから生成される。

【0137】

一実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、翻訳エレメントと組み合わせて上の属性のうちの１つ以上を含む。

【0138】

ポリリボヌクレオチドは、標的の結合部分のための少なくとも１つの結合部位を含み得る。標的としては、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド）、小分子（例えば、薬物）、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、ウイルス、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、他の細胞部分、その任意の断片、及びその任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。（例えば、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０：４７３－７７；Ｇｕｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（２００４）ＰＮＡＳ，１０１：８４２０－２４を参照されたい）。例えば、標的は、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、１つ以上の二本鎖領域及び１つ以上の一本鎖領域を含むＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド、小分子、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、抗体断片、抗体の混合物、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、細胞部分、その任意の断片、又はその任意の組合せである。

【0139】

いくつかの実施形態では、標的は、ポリペプチド、タンパク質、又はその任意の断片である。例えば、標的は、精製されたポリペプチド、単離されたポリペプチド、融合タグ付きポリペプチド、細胞若しくはウイルス若しくはビリオンの膜に結合されたか又はそれを架橋しているポリペプチド、細胞質タンパク質、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、アロマターゼ、ヘリカーゼ、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、グリコシラーゼ、細胞外マトリックスタンパク質、リガーゼ、イオントランスポーター、チャネル、孔、アポトーシスタンパク質、細胞接着タンパク質、病原性タンパク質、異常に発現されたタンパク質、転写因子、転写調節因子、翻訳タンパク質、シャペロン、分泌タンパク質、リガンド、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、核タンパク質、受容体、膜貫通受容体、シグナルトランスデューサー、抗体、膜タンパク質、膜内在性タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞壁タンパク質、球状タンパク質、繊維状タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、染色体タンパク質、その任意の断片、又はその任意の組合せである。いくつかの実施形態では、標的は、異種ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、標的は、トランスフェクションなどの分子的技術を使用して細胞において過剰発現されたタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的は、組換えポリペプチドである。例えば、標的は、細菌（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母、哺乳動物、又は昆虫細胞から生成される試料中に存在する（例えば、生物によって過剰発現されるタンパク質）。いくつかの実施形態では、標的は、変異、挿入、欠失、又は多型を有するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、標的は、生物を免疫化するか又は抗体産生のためなど、生物において免疫応答を引き起こすために使用されるポリペプチドなどの抗原である。

【0140】

いくつかの実施形態では、標的は、抗体である。抗体は、別の分子の特定の空間的且つ極性の構成に特異的に結合できる。抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、又は組換え抗体であってもよく、宿主の免疫化及び血清の回収（ポリクローナル）などの当該技術分野においてよく知られる技術によって、又は持続的なハイブリッド細胞株を調製し、分泌タンパク質（モノクローナル）を回収することによって、又は天然抗体の特異的な結合に必要となるアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列、若しくはその変異誘発されたバージョンをクローニングし、発現することによって調製され得る。天然に存在する抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質であり得る。各重鎖は、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び重鎖定常領域を含み得る。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３を含み得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）及び軽鎖定常領域を含み得る。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣ_Ｌで構成され得る。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存されている領域が挿入された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域に細分され得る。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に整列した、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含み得る：ＦＲ_１、ＣＤＲ_１、ＦＲ_２、ＣＤＲ_２、ＦＲ_３、ＣＤＲ_３、及びＦＲ_４。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織への結合、又は免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む因子への結合を媒介し得る。抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１及びＩｇＡ_２）、サブクラス又はその改変されたバージョンのものであり得る。抗体は、完全な免疫グロブリン又はその断片を含み得る。抗体断片は、抗原などの結合部分に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指すことができる。加えて、免疫グロブリン又はそれらの断片の凝集体、ポリマー、及びコンジュゲートもまた、特定の分子に関する結合親和性が維持される限り含まれる。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ及びＣ_Ｈ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）_２断片、ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；Ｖ_Ｈ及びＣ_Ｈ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶ_Ｌ及びＶ_ＨドメインからなるＦｖ断片；Ｖ_Ｈドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－４６）；並びにＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域が対になって、一価分子を形成する単離されたＣＤＲ及び一本鎖断片（ｓｃＦｖ）（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：５８７９－８３を参照のこと）が挙げられる。したがって、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂなどを含む。２つのドメインＶ_Ｌ及びＶ_Ｈは、別々の遺伝子によってコードされ得るが、それらは、それらを単一のタンパク質鎖にすることが可能な人工ペプチドリンカーによって、組換え法を使用して結合され得る。そのような一本鎖抗体は、１つ以上の抗原結合部分を含む。これらの抗体断片は、当業者に知られる従来の技術を使用して得ることができ、断片は、インタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされ得る。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、単離されたもの、イヌ、ネコ、ロバ、若しくはヒツジ、又は任意の植物、動物、若しくは哺乳動物のものであり得る。

【0141】

いくつかの実施形態では、標的は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）などのリボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、又はシトシン）のポリマー形態である。ＤＮＡは、直鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミド、及び染色体において見出される二本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド標的は、一本鎖、二本鎖、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、染色体、遺伝子、非コードゲノム配列、ゲノムＤＮＡ（例えば、断片化されたゲノムＤＮＡ）、精製されたポリヌクレオチド、単離されたポリヌクレオチド、ハイブリダイズされたポリヌクレオチド、転写因子結合部位、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、真核生物ポリヌクレオチド、原核生物ポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、結合されたポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、核酸類似体を含有するポリヌクレオチド、メチル化ポリヌクレオチド、脱メチル化ポリヌクレオチド、その任意の断片、又はその任意の組合せである。いくつかの実施形態では、標的は、組換えポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的は、異種ポリヌクレオチドである。例えば、標的は、細菌（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母、哺乳動物、又は昆虫細胞から生成されるポリヌクレオチド（例えば、当該生物に対して異種のポリヌクレオチド）である。いくつかの実施形態では、標的は、変異、挿入、欠失、又は多型を有するポリヌクレオチドである。

【0142】

いくつかの実施形態では、標的は、アプタマーである。アプタマーは、タンパク質などの結合部分に対して高い特異性及び親和性を有して結合する単離された核酸分子である。アプタマーは、その所与の標的に特異的に結合するための化学的接触をもたらすある種の立体配座において保持された三次元構造である。アプタマーは、核酸に基づく分子であるが、アプタマーと遺伝子及びｍＲＮＡなどの他の核酸分子の間には根本的相違が存在する。後者において、核酸構造は、その直鎖状の塩基配列により情報をコードし、したがって、この配列は、情報保管の機能に重要である。対照的に、標的分子の特異的な結合に基づくアプタマー機能は、保存された直鎖状の塩基配列（非コード配列）に完全に依存しているわけではなく、むしろ特定の二次／三次／四次構造に依存する。アプタマーが有し得るいずれかのコード化潜在力は、全くの偶然であり、アプタマーのその同族標的に対する結合の際にまったく役割を果たさない。アプタマーはまた、ある種のタンパク質に結合する天然に存在する核酸配列と区別されなければならない。これらの後者の配列は、生物のゲノム内に埋め込まれた天然に存在する配列であり、天然に存在する核酸の転写、翻訳、及び輸送に関与するタンパク質の特殊なサブグループ（例えば、核酸結合タンパク質）に結合する。他方で、アプタマーは、短い単離された天然に存在しない核酸分子である。核酸結合タンパク質に結合するアプタマーが同定され得るが、ほとんどの場合、そのようなアプタマーは、天然の核酸結合タンパク質によって認識される配列に対する配列同一性をほとんど又は全く有しない。さらに重要なこととして、アプタマーは実質的に任意のタンパク質（核酸結合タンパク質に限らない）及び小分子、炭水化物、ペプチドなどを含むほとんど全ての目的のパートナーと結合できる。ほとんどのパートナーに関して、タンパク質であっても、それが結合する天然に存在する核酸配列は存在しない。そのような配列を有するそれらのパートナー、例えば、核酸結合タンパク質に関して、そのような配列は、天然で使用される結合親和性が強固に結合するアプタマーと比較して相対的に低いため、アプタマーとは異なり得る。アプタマーは、選択されたパートナーに特異的に結合し、且つパートナーの活性又は結合相互作用を調節することができ、例えば、結合を通して、アプタマーは、パートナーが機能する能力を遮断し得る。パートナーに対する特異的な結合の機能的特性は、アプタマーに固有の特性である。典型的なアプタマーは、６～３５ｋＤａのサイズ（２０～１００ヌクレオチド）であり、マイクロモル濃度からナノモル濃度以下の親和性を有してそのパートナーに結合し、且つ密接に関係する標的に対して識別し得る（例えば、アプタマーは、同じ遺伝子ファミリーに由来する関連タンパク質に選択的に結合し得る）。アプタマーは、水素結合、静電相補性、疎水性接触、及び立体排除などの一般的に見られる分子間相互作用を使用して、特定のパートナーに結合することができる。アプタマーは、高い特異性及び親和性、低い免疫原性、生物学的有効性、及び優れた薬物動態特性を含む治療学及び診断学としての使用のためのいくつかの望ましい特徴を有する。アプタマーは、共有結合される相補的なポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションから形成される分子的なステム及びループ構造（例えば、ヘアピンループ構造）を含み得る。ステムは、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドを含み、ループは、２つの相補的なポリヌクレオチドを共有結合する領域である。

【0143】

いくつかの実施形態では、標的は、小分子である。例えば、小分子は、大環状分子、阻害剤、薬物、又は化学物質であり得る。いくつかの実施形態では、小分子は、５個以下の水素結合ドナーを含有する。いくつかの実施形態では、小分子は、１０個以下の水素結合アクセプターを含有する。いくつかの実施形態では、小分子は、５００ダルトン以下の分子量を有する。いくつかの実施形態では、小分子は、約１８０～５００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態では、小分子は、５以下のオクタノール／水分配係数ｌｏｐ Ｐを含有する。いくつかの実施形態では、小分子は、－０．４～５．６の分配係数ｌｏｇ Ｐを有する。いくつかの実施形態では、小分子は、４０～１３０のモル屈折率を有する。いくつかの実施形態では、小分子は、約２０～７０個の原子を含有する。いくつかの実施形態では、小分子は、１４０オングストローム^２以下の極性表面積を有する。

【0144】

いくつかの実施形態では、標的は、細胞である。例えば、標的は、無処置の細胞、化合物（例えば、薬物）で処理された細胞、固定された細胞、溶解された細胞、又はその任意の組合せである。いくつかの実施形態では、標的は、単一の細胞である。いくつかの実施形態では、標的は、複数の細胞である。

【0145】

いくつかの実施形態では、単一の標的又は複数の（例えば、２つ以上の）標的は、複数の結合部分を有する。一実施形態では、単一の標的は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の結合部分を有し得る。一実施形態では、２つ以上の標的は、標的の混合物又はライブラリーなどの試料中に存在し、試料は、２つ以上の結合部分を含む。いくつかの実施形態では、単一の標的又は複数の標的は、複数の異なる結合部分を含む。例えば、複数は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、又は３０，０００個の結合部分を含み得る。

【0146】

標的は、少なくとも２つの異なる結合部分を含む複数の結合部分を含み得る。例えば、結合部分は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、又は２５，０００個の異なる結合部分を含む複数の結合部分を含み得る。

【0147】

いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、１つの結合部位を含む。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの結合部位を含む。例えば、ポリリボヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上の結合部位を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、１つ以上の標的の１つ以上の結合部分に結合する分子的な足場である。各標的は、異なるか又は同じ核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド）、小分子（例えば、薬物）、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、ウイルス、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、細胞部分、その任意の断片、及びその任意の組合せであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部位は、同じ標的の１つ以上の結合部分に結合する。いくつかの実施形態では、１つ以上の結合部位は、異なる標的の１つ以上の結合部分に結合する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上の標的の１つ以上の結合部分のための足場として作用する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の標的の１つ以上の結合部分に特異的に結合することによって細胞プロセスを調節する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、目的の１つ以上の特異的な標的のための結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、目的の各結合部分のための複数の結合部位又は結合部位の組合せを含む。例えば、ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどのポリリボヌクレオチド標的のための結合部位を含む。例えば、ポリリボヌクレオチドは、ｍＲＮＡ標的のための結合部位を含む。例えば、ポリリボヌクレオチドは、ｒＲＮＡ標的のための結合部位を含む。例えば、ポリリボヌクレオチドは、ｔＲＮＡ標的のための結合部位を含む。例えば、ポリリボヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ標的のための結合部位を含む。

【0148】

いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡに対する結合部分のための結合部位を含む。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡに対する結合部分のための結合部位を含む。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、抗体に対する結合部分のための結合部位を含む。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、ウイルス粒子に対する結合部分のための結合部位を含む。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、小分子に対する結合部分のための結合部位を含む。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、細胞中又は細胞上の結合部分のための結合部位を含む。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドに対する結合部分のための結合部位を含む。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、メチル化ポリヌクレオチドに対する結合部分のための結合部位を含む。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、非メチル化ポリヌクレオチドに対する結合部分のための結合部位を含む。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、アプタマーに対する結合部分のための結合部位を含む。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチドに対する結合部分のための結合部位を含む。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質断片、タグ付きタンパク質、抗体、抗体断片、小分子、ウイルス粒子（例えば、膜貫通タンパク質を含むウイルス粒子）、又は細胞に対する結合部分のための結合部位を含む。

【0149】

いくつかの場合において、結合部分は、少なくとも２つのアミド結合を含む。いくつかの場合において、結合部分は、ホスホジエステル結合を含まない。いくつかの場合において、結合部分は、ＤＮＡ又はＲＮＡではない。

【0150】

本明細書で提供されるポリリボヌクレオチドは、複合体に対する結合部分のための１つ以上の結合部位を含み得る。本明細書で提供されるポリリボヌクレオチドは、複合体を形成する標的のための１つ以上の結合部位を含み得る。本明細書で提供されるポリリボヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドと標的の間で複合体を形成し得る。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、単一の標的と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、２つ以上の標的の複合体と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、３つ以上の標的の複合体と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、２つ以上のポリリボヌクレオチドは、単一の標的と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、２つ以上のポリリボヌクレオチドは、２つ以上の標的と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第１のｃｉｒｃＲＮＡは、第１の標的の第１の結合部分及び第２の標的の第２の異なる結合部分と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、第１のポリリボヌクレオチドは、第１の標的の第１の結合部分と複合体を形成し、第２のポリリボヌクレオチドは、第２の標的の第２の結合部分と複合体を形成する。

【0151】

いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の抗体－ポリペプチド複合体、ポリペプチド－ポリペプチド複合体、ポリペプチド－ＤＮＡ複合体、ポリペプチド－ＲＮＡ複合体、ポリペプチド－アプタマー複合体、ウイルス粒子－抗体複合体、ウイルス粒子－ポリペプチド複合体、ウイルス粒子－ＤＮＡ複合体、ウイルス粒子－ＲＮＡ複合体、ウイルス粒子－アプタマー複合体、細胞－抗体複合体、細胞－ポリペプチド複合体、細胞－ＤＮＡ複合体、細胞－ＲＮＡ複合体、細胞－アプタマー複合体、小分子－ポリペプチド複合体、小分子－ＤＮＡ複合体、小分子－アプタマー複合体、小分子－細胞複合体、小分子－ウイルス粒子複合体、及びその組合せに対する１つ以上の結合部分のための結合部位を含み得る。

【0152】

いくつかの場合において、結合部分は、ポリペプチド、タンパク質、又はその断片上にある。いくつかの実施形態では、結合部分は、ポリペプチド、タンパク質、又はその断片のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分を含む。例えば、結合部分は、単離されたポリペプチド、細胞のポリペプチド、精製されたポリペプチド、又は組換えポリペプチドのドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分を含む。例えば、結合部分は、抗体又はその断片のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分を含む。例えば、結合部分は、転写因子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は部分を含む。例えば、結合部分は、受容体のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は部分を含む。例えば、結合部分は、膜貫通受容体のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は部分を含む。結合部分は、単離されたポリペプチド、精製されたポリペプチド、及び／又は組換えポリペプチドのドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあり得るか又はそれを含み得る。結合部分は、分析物（例えば、ライセート）の混合物のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあるか又はそれを含む結合部分を含み得る。例えば、結合部分は、複数の細胞又は単一の細胞のライセートに由来するドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあるか又はそれを含む。

【0153】

いくつかの場合において、結合部分は、小分子のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあるか又はそれを含む。例えば、結合部分は、薬物のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあるか又はそれを含む。例えば、結合部分は、化合物のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあるか又はそれを含む。例えば、結合部分は、有機化合物のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあるか又はそれを含む。いくつかの場合において、結合部分は、９００ダルトン以下の分子量を有する小分子のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあるか又はそれを含む。いくつかの場合において、結合部分は、５００ダルトン以上の分子量を有する小分子のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあるか又はそれを含む。結合部分は、例えば、コンビナトリアルの手段を介して生成される化合物のライブラリー、例えば、多様性コンビナトリアルライブラリーを含む、天然に存在する分子又は合成分子のライブラリーから得られてもよい。コンビナトリアルライブラリー並びにそれらの生成及びスクリーニングのための方法は、当該技術分野において知られており、開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７４１，７１３号明細書；同第５，７３４，０１８号明細書；同第５，７３１，４２３号明細書；同第５，７２１，０９９号明細書；同第５，７０８，１５３号明細書；同第５，６９８，６７３号明細書；同第５，６８８，９９７号明細書；同第５，６８８，６９６号明細書；同第５，６８４，７１１号明細書；同第５，６４１，８６２号明細書；同第５，６３９，６０３号明細書；同第５，５９３，８５３号明細書；同第５，５７４，６５６号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，５６５，３２４号明細書；同第５，５４９，９７４号明細書；同第５，５４５，５６８号明細書；同第５，５４１，０６１号明細書；同第５，５２５，７３５号明細書；同第５，４６３，５６４号明細書；同第５，４４０，０１６号明細書；同第５，４３８，１１９号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書において記載される。

【0154】

結合部分は、特異的な結合対のメンバー（例えば、リガンド）のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあり得るか又はそれを含み得る。結合部分は、一価（モノエピトープ）又は多価（ポリエピトープ）のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあり得るか又はそれを含み得る。結合部分は、抗原性又はハプテンであり得る。結合部分は、単一の分子又は少なくとも１つの共通のエピトープ若しくは決定基部位を共有する複数の分子のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあり得るか又はそれを含み得る。結合部分は、細胞（例えば、細菌細胞、植物細胞、又は動物細胞）の一部のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあり得るか又はそれを含み得る。結合部分は、自然環境（例えば、組織）、培養細胞、又は微生物（例えば、細菌、真菌、原生動物、又はウイルス）、又は溶解された細胞のいずれかにおいてあり得る。結合部分を、修飾して（例えば、化学的に）、色素（例えば、蛍光色素）、リン酸基、炭化水素基などのポリペプチド修飾部分、又はメチル基などのポリヌクレオチド修飾部分などであるがこれらに限定されない、１つ以上の追加の結合部位を提供することができる。

【0155】

いくつかの場合において、結合部分は、宿主由来の試料において見出される分子のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあるか又はそれを含む。宿主由来の試料は、体液（例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、脳脊髄液、涙、粘液など）を含む。試料は、直接的に試験されてもよいし、結合部分をより容易に検出可能にするように調製されてもよい。試料は、生物又は生物の死体に由来するある量の物質を含み得る。試料は、天然、組換え体、合成、又は天然に存在しないものであり得る。結合部分は、天然に又は組換えで細胞から発現されるもの、細胞ライセート若しくは細胞培養培地中のもの、インビトロで翻訳された試料、又は試料（例えば、細胞ライセート）からの免疫沈降である上記のいずれかであり得る。

【0156】

いくつかの場合において、標的の結合部分は、無細胞系又はインビトロで発現される。例えば、標的の結合部分は、細胞抽出物中にある。いくつかの場合において、標的の結合部分は、ＤＮＡ鋳型、並びに転写及び翻訳のための試薬とともに細胞抽出物中にある。使用され得る細胞抽出物の例示的な供給源としては、コムギ胚芽、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ウサギ網状赤血球、超好熱菌、ハイブリドーマ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）が挙げられる。標的ポリペプチドを発現する（例えば、アレイ上で標的ポリペプチドを生成する）ために使用され得る例示的な無細胞法としては、タンパク質インサイチュアレイ（ＰＩＳＡ）、多重スポッティング技術（ＭＩＳＴ）、自己組織化ｍＲＮＡ翻訳、核酸プログラマブルタンパク質アレイ（ＮＡＰＰＡ）、ナノウェルＮＡＰＰＡ、ＤＮＡ ａｒｒａｙ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｒａｙ（ＤＡＰＡ）、膜のないＤＡＰＡ、ナノウェルコピー及びμＩＰ－マイクロインタリオプリンティング、及びｐＭＡＣ－タンパク質マイクロアレイコピー（Ｋｉｌｂ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０１４，１４，３５２－３６４を参照のこと）が挙げられる。

【0157】

いくつかの場合において、標的の結合部分は、ＤＮＡ鋳型からインサイチュで（例えば、アレイの固体基材上で）合成される。いくつかの場合において、複数の結合部分は、複数の対応するＤＮＡ鋳型から並行して又は単一の反応においてインサイチュで合成される。インサイチュでの標的ポリペプチド発現のための例示的な方法としては、Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ８（９）：Ｒ１７７－Ｒ１８５（２０００）；Ｋａｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）：１５０－６．（２００５）；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１）：４－９．（２００８）；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５（５６８０）：８６－９０．（２００４）；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１５）：Ｅ７３－３（２００１）；Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ５（９）：１６５８－６６（２００６）；Ｔａｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４（１０）：１２５３－４（２００６）；Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６（７）：１８４４－９（２００４）；Ｋｉｎｐａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３６（２）：１４９－５４（２００４）；Ｔａｋｕｌａｐａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（８）：４３８２－９１（２０１２）；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５（２）：１７５－７（２００８）；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ａｎｄ Ｊ．ＬａＢａｅｒ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７（４）：３３４－３３６（２００６）；Ｈｅ ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ ２４（４）：３７５－８０（２００７）；及びＨｅ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７４（１－２）：２６５－７０（２００３）において記載されるものが挙げられる。

【0158】

いくつかの場合において、核酸標的の結合部分は、少なくとも６個のヌクレオチド、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００個のヌクレオチドの区間を含む。いくつかの場合において、タンパク質標的の結合部分は、連続的な一続きのヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、タンパク質標的の結合部分は、非連続的な一続きのヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、核酸標的の結合部分は、核酸配列におけるヌクレオチドの欠失、付加、交換、又は短縮化を含む、変異又は機能的変異の部位を含む。

【0159】

いくつかの場合において、タンパク質標的の結合部分は、少なくとも６個のアミノ酸、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００個のアミノ酸の区間を含む。いくつかの場合において、タンパク質標的の結合部分は、連続的な一続きのアミノ酸を含む。いくつかの場合において、タンパク質標的の結合部分は、非連続的な一続きのアミノ酸を含む。いくつかの場合において、タンパク質標的の結合部分は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の欠失、付加、交換、又は短縮化を含む、変異又は機能的変異の部位を含む。

【0160】

いくつかの実施形態では、結合部分は、膜結合タンパク質のドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあるか又はそれを含む。例示的な膜結合タンパク質としては、ＧＰＣＲ（例えば、アドレナリン受容体、アンジオテンシン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ニューロテンシン受容体、ガラニン受容体、ドーパミン受容体、オピオイド受容体、エロトニン（ｅｒｏｔｏｎｉｎ）受容体、ソマトスタチン受容体など）、イオンチャネル（例えば、ニコチン性アセチルコリン受容体、ナトリウムチャネル、カリウムチャネルなど）、受容体チロシンキナーゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニル酸シクラーゼ、増殖因子及びホルモン受容体（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体）などが挙げられるが、これらに限定されない。結合部分はまた、膜結合型タンパク質の変異体又は改変されたバリアントのドメイン、断片、エピトープ、領域、若しくは部分上にあり得るか又はそれを含み得る。例えば、ＧＰＣＲのいくつかの単一又は複数の点変異は、機能を保持し、疾患に関与する（例えば、Ｓｔａｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １８：４３０－３７を参照のこと）。

【0161】

いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、他の細胞内分子に結合するための他の結合モチーフを含み得る。ｃｉｒｃＲＮＡなどのポリリボヌクレオチドの適用の非限定的な例は、表１に列挙される。

【0162】

【表1】

【0163】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、細胞プロセスを調節する標的、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び他の細胞成分を捕捉する。目的の標的のための結合部位を有するポリリボヌクレオチドは、内在性の結合パートナーと標的の結合と競合し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡを捕捉する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、ｍＲＮＡを捕捉する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、タンパク質を捕捉する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、リボソームを捕捉する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、他のポリリボヌクレオチドを捕捉する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、非コードＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを捕捉する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、捕捉された標的、例えば、ポリリボヌクレオチドに結合されたＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、又は他の細胞成分を分解する分解エレメントを含む。ｃｉｒｃＲＮＡなどのポリリボヌクレオチドの捕捉適用の非限定的な例は、表２に列挙される。

【0164】

【表2】

【0165】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドを使用する方法のいずれかは、翻訳エレメントと組み合わせることができる。翻訳エレメントを含む本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、ＲＮＡをタンパク質に翻訳することができる。例えば、タンパク質発現は、配列特異的ＲＮＡ結合モチーフ、配列特異的ＤＮＡ結合モチーフ、タンパク質特異的結合モチーフ、及び調節性ＲＮＡモチーフを含むポリリボヌクレオチドによって促進される。調節性ＲＮＡモチーフは、ＲＮＡ転写及びタンパク質発現を開始することができる。

【0166】

エンクリプトゲン（Ｅｎｃｒｙｐｔｏｇｅｎ）
本明細書に記載されるとおり、ポリリボヌクレオチドは、細胞の自然免疫応答を低減するか、逃れるか、又は回避するエンクリプトゲンを含み得る。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物によって誘発される応答と比較して、宿主からの免疫応答の低減をもたらし、例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、対応する直鎖状ポリヌクレオチド又はエンクリプトゲンを含む直鎖状ポリヌクレオチドと比較して免疫応答の低減をもたらし、エンクリプトゲンを欠く対応する直鎖状ポリリボヌクレオチドと比較して免疫応答の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、エンクリプトゲンを欠く対応物より低い免疫原性を有する。

【0167】

いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて非免疫原性である。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞において複製することができる。

【0168】

いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、配列又は発現産物を含む。

【0169】

いくつかの実施形態では、エンクリプトゲンを含むポリリボヌクレオチドは、エンクリプトゲンを欠く対応物の半減期と少なくとも同じである。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、対応物のものより増大した半減期を有する。いくつかの実施形態では、半減期は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又はそれ以上増大される。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はその間の任意の時間の細胞中での半減期又は持続性を有する。ある種の実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、約１０分～約７日間以下、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下、又はその間の任意の時間の細胞中での半減期又は持続性を有する。

【0170】

いくつかの実施形態では、エンクリプトゲンを含むポリリボヌクレオチドは、細胞機能を、例えば、一過性に又は長期間調節する。ある種の実施形態では、細胞機能は、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はその間の任意の時間持続する調節など、安定に改変される。ある種の実施形態では、細胞機能は、例えば、約３０分～約７日間以下、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下、又はその間の任意の時間持続する調節など、一過性に改変される。

【0171】

いくつかの実施形態では、エンクリプトゲンを含むポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０塩基対、少なくとも約３０塩基対、少なくとも約４０塩基対、少なくとも約５０塩基対、少なくとも約７５塩基対、少なくとも約１００塩基対、少なくとも約２００塩基対、少なくとも約３００塩基対、少なくとも約４００塩基対、少なくとも約５００塩基対、又は少なくとも約１，０００塩基対である。いくつかの実施形態では、エンクリプトゲンを含むポリリボヌクレオチドは、リボソームのための結合部位を収容するのに十分なサイズのものであり得る。当業者は、エンクリプトゲンを含むポリリボヌクレオチドの最大サイズが、ポリリボヌクレオチドを生成し、且つ／又はポリリボヌクレオチドを使用することの技術的制約の範囲内の大きさであり得ることを認識し得る。

【0172】

いくつかの実施形態では、エンクリプトゲンを含む環状ポリリボヌクレオチドは、直鎖状対応物、例えば、直鎖状発現配列、又は直鎖状環状ポリリボヌクレオチドの半減期と少なくとも同じである。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、直鎖状対応物のものより増大されている半減期を有する。いくつかの実施形態では、半減期は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又はそれ以上増大される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はその間の任意の時間の細胞中での半減期又は持続性を有する。ある種の実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０分～約７日間以下、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下、又はその間の任意の時間の細胞中での半減期又は持続性を有する。

【0173】

いくつかの実施形態では、エンクリプトゲンを含む環状ポリリボヌクレオチドは、細胞機能を、例えば、一過性に又は長期間調節する。ある種の実施形態では、細胞機能は、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はその間の任意の時間持続する調節など、安定に改変される。ある種の実施形態では、細胞機能は、例えば、約３０分～約７日間以下、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下、又はその間の任意の時間持続する調節など、一過性に改変される。

【0174】

いくつかの実施形態では、エンクリプトゲンを含む環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０塩基対、少なくとも約３０塩基対、少なくとも約４０塩基対、少なくとも約５０塩基対、少なくとも約７５塩基対、少なくとも約１００塩基対、少なくとも約２００塩基対、少なくとも約３００塩基対、少なくとも約４００塩基対、少なくとも約５００塩基対、又は少なくとも約１，０００塩基対である。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソームのための結合部位を収容するのに十分なサイズのものであり得る。当業者は、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズが、環状ポリリボヌクレオチドを生成し、且つ／又は環状ポリリボヌクレオチドを使用することの技術的制約の範囲内の大きさであり得ることを認識し得る。理論によって束縛されるものではないが、ＲＮＡの複数のセグメントは、１つの５’及び１つの３’遊離末端のみが残存しているときに最終的に環化され得る、ＲＮＡの「糸」を生成するためにアニールされるＤＮＡ並びにそれらの５’及び３’遊離末端から生成され得る可能性がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、ＲＮＡをパッケージ化し且つ標的に送達する能力によって制限され得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドのサイズは、有用なポリペプチドをコードするのに十分な長さであり、したがって、約２０，０００塩基対未満、約１５，０００塩基対未満、約１０，０００塩基対未満、約７，５００塩基対未満、又は約５，０００塩基対未満、約４，０００塩基対未満、約３，０００塩基対未満、約２，０００塩基対未満、約１，０００塩基対未満、約５００塩基対未満、約４００塩基対未満、約３００塩基対未満、約２００塩基対未満、約１００塩基対未満の長さが有用であり得る。

【0175】

切断配列
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの切断配列を含む。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。いくつかの実施形態では、切断配列は、発現配列に隣接する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、破壊ポリリボヌクレオチド、切断可能ポリリボヌクレオチド、又は自己切断ポリリボヌクレオチドにおけるものなどの切断配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の切断配列を含み、ポリリボヌクレオチドの複数の産物、例えば、ｍｉＲＮＡ、直鎖状ＲＮＡ、より小さい環状ポリリボヌクレオチドなどへの分離をもたらす。

【0176】

いくつかの実施形態では、切断配列は、リボザイムＲＮＡ配列を含む。リボザイム（ＲＮＡ酵素又は触媒ＲＮＡとも呼ばれるリボ核酸酵素に由来する）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然のリボザイムは、それら自体のホスホジエステル結合の１つの加水分解、又は他のＲＮＡにおける結合の加水分解のいずれかを触媒するが、それらはまた、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することが見出されている。触媒ＲＮＡは、インビトロ法によって「進化され」得る。上で論じられるリボスイッチ活性と同様に、リボザイム及びそれらの反応産物は、遺伝子発現を調節することができる。いくつかの実施形態では、触媒ＲＮＡ又はリボザイムは、リボザイムが嵩体積からの分子の化学変換のために細胞内に多くのコピーで存在するように、より大きい非コードＲＮＡ内に配置され得る。いくつかの実施形態では、アプタマー及びリボザイムは両方ともに、同じ非コードＲＮＡにおいてコードされ得る。

【0177】

破壊配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、破壊ポリリボヌクレオチド、切断可能ポリリボヌクレオチド、又は自己切断ポリリボヌクレオチドを含む。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。ポリリボヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む細胞成分を送達することができる。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、（ｉ）自己切断可能エレメント；（ｉｉ）切断動員部位；（ｉｉｉ）分解性リンカー；（ｉｖ）化学的リンカー；及び／又は（ｖ）スペーサー配列によって隔てられるｍｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、（ｉ）自己切断可能エレメント；（ｉｉ）切断動員部位（例えば、ＡＤＡＲ）；（ｉｉｉ）分解性リンカー（例えば、グリセロール）；（ｉｖ）化学的リンカー；及び／又は（ｖ）スペーサー配列によって隔てられるｓｉＲＮＡを含む。自己切断可能エレメントの非限定的な例としては、ハンマーヘッド、スプライシングエレメント、ヘアピン、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｖａｒｋｕｄサテライト（ＶＳ）、及びｇｌｍＳリボザイムが挙げられる。ｃｉｒｃＲＮＡなどのポリリボヌクレオチドの無調節適用の非限定的な例は、表３に列挙される。

【0178】

【表3】

【0179】

リボスイッチ
いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のリボスイッチを含む。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0180】

リボスイッチは通常、小さい標的分子に直接的に結合できるポリリボヌクレオチドの一部であり、その標的の結合がＲＮＡの翻訳、発現産物の安定性及び活性に影響を及ぼすと考えられている（Ｔｕｃｋｅｒ Ｂ Ｊ，Ｂｒｅａｋｅｒ Ｒ Ｒ（２００５），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １５（３）：３４２－８）。したがって、リボスイッチを含むポリリボヌクレオチドは、その標的分子の有無に応じて、それ自体の活性の調節に直接的に関与する。いくつかの場合において、リボスイッチは、別々の分子のためのアプタマー様親和性の領域を有する。したがって、本発明のより広い文脈において、非コード核酸に含まれる任意のアプタマーが、嵩体積からの分子の捕捉のために使用され得る。「（リボ）スイッチ」活性を介する事象の下流伝達は、特に有利であり得る。

【0181】

いくつかの場合において、リボスイッチは、転写終結、翻訳開始の阻害、ｍＲＮＡ自己切断、及び真核生物におけるスプライシング経路の改変を含むが、これらに限定されない遺伝子発現に対する作用を有し得る。リボスイッチは、リボスイッチを含むポリリボヌクレオチドを、リボスイッチを活性化するか、不活性化するか又は遮断する条件にさらして発現を変化させることによるものなど、トリガー分子の結合又は除去によって遺伝子発現を制御する機能を有し得る。発現は、例えば、転写の終結又はＲＮＡに対するリボソーム結合の遮断の結果として、変化させられる。トリガー分子又はその類似体の結合は、リボスイッチの性質に応じて、ＲＮＡ分子の発現を低減するか若しくは妨げるか又はＲＮＡ分子の発現を促進するか若しくは増加させることができる。リボスイッチのいくつかの例は、本明細書に記載される。

【0182】

いくつかの場合において、リボスイッチは、アデノシルコバラミン（ビタミンＢ_１２の補酵素形態）に結合して、コバラミン及び同様の代謝産物の生合成及び輸送を調節するコバラミンリボスイッチ（Ｂ_１２－エレメントでもある）である。

【0183】

いくつかの場合において、リボスイッチは、環状ジ－ＧＭＰに結合して、様々な遺伝子を調節する環状ジ－ＧＭＰリボスイッチである。２つの構造的に関連しないクラスが存在する（環状ジ－ＧＭＰ－Ｉ及び環状ジ－ＧＭＰ－ＩＩ）。

【0184】

いくつかの場合において、リボスイッチは、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）に結合して、リボフラビン生合成及び輸送を調節するＦＭＮリボスイッチ（ＲＦＮ－エレメントでもある）である。

【0185】

いくつかの場合において、リボスイッチは、十分な濃度のグルコサミン－６－リン酸が存在するときに自己切断するｇｌｍＳリボスイッチである。

【0186】

いくつかの場合において、リボスイッチは、グルタミンに結合して、グルタミン及び窒素代謝に関与する遺伝子を調節するグルタミンリボスイッチである。それらはまた、未知の機能の短いペプチドに結合する。そのようなリボスイッチは２つのクラスに分類され、それらは構造的に関連する：ｇｌｎＡ ＲＮＡモチーフ及び下流－ペプチドモチーフ。

【0187】

いくつかの場合において、リボスイッチは、グリシンに結合して、グリシン代謝遺伝子を調節するグリシンリボスイッチである。それは、同じｍＲＮＡにおいて２つの隣接するアプタマードメインを含み、協同的な結合を示す唯一の既知の天然ＲＮＡである。

【0188】

いくつかの場合において、リボスイッチは、リジンに結合して、リジン生合成、異化及び輸送を調節するリジンリボスイッチ（Ｌ－ボックスでもある）である。

【0189】

いくつかの場合において、リボスイッチは、プレキューオシンに結合して、合成に関与する遺伝子又はこの前駆体のキューオシンへの輸送を調節するＰｒｅＱ１リボスイッチである。２つの完全に異なるクラスのＰｒｅＧＩリボスイッチが知られている：ＰｒｅＱ１－Ｉリボスイッチ及びＰｒｅＱ１－ＩＩリボスイッチ。ＰｒｅＱ１－Ｉリボスイッチの結合ドメインは、天然に存在するリボスイッチの中でも異常に小さい。ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属及びラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属における特定の種においてのみ見出されるＰｒｅＧＩ－ＩＩリボスイッチは、完全に異なる構造を有し、且つより大きい。

【0190】

いくつかの場合において、リボスイッチは、プリンに結合して、プリン代謝及び輸送を調節するプリンリボスイッチである。プリンリボスイッチの異なる形態は、グアニン（Ｇ－ボックスとして元来知られる形態）又はアデニンに結合する。グアニン又はアデニンのいずれに関する特異性も、Ｙ７４位でのリボスイッチにおける単一のピリミジンとのワトソン－クリック相互作用に完全に依存する。グアニンリボスイッチにおいて、この残基は、シトシン（すなわち、Ｃ７４）であり、アデニンの残基において、それは常にウラシル（すなわち、Ｕ７４）である。同属の型のプリンリボスイッチは、デオキシグアノシンに結合するが、単一ヌクレオチドの変異より著しい差を有する。

【0191】

いくつかの場合において、リボスイッチは、Ｓ－アデノシルホモシステインに結合して、Ｓ－アデノシルメチオニンがメチル化反応において使用されるときに生成されるこの代謝産物の再利用に関与する遺伝子を調節するＳＡＨリボスイッチである。

【0192】

いくつかの場合において、リボスイッチは、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に結合して、メチオニン及びＳＡＭの生合成及び輸送を調節するＳＡＭリボスイッチである。３つの異なるＳＡＭリボスイッチが知られている：ＳＡＭ－Ｉ（元来Ｓ－ボックスと呼ばれる）、ＳＡＭ－ＩＩ及びＳ_ＭＫボックスリボスイッチ。ＳＡＭ－Ｉは、細菌において一般的であるが、ＳＡＭ－ＩＩは、α－、β－及び少数のγ－プロテオバクテリアにおいてのみ見出される。Ｓ_ＭＫボックスリボスイッチは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）目においてのみ見出される。リボスイッチのこれらの３つの変種は、配列又は構造に関して明らかな類似性を有しない。４番目の変種であるＳＡＭ－ＩＶは、異なる足場の文脈においてであるが、ＳＡＭ－Ｉのものと同様のリガンド結合コアを有するように見える。

【0193】

いくつかの場合において、リボスイッチは、ＳＡＭ及びＳＡＨの両方に同様の親和性で結合するＳＡＭ－ＳＡＨリボスイッチである。それらは、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を調節する位置において常に見出されるため、それらのＳＡＭとの結合のみが、生理学的に適切であることが提案された。

【0194】

いくつかの場合において、リボスイッチは、テトラヒドロ葉酸に結合して、合成及び輸送遺伝子を調節するテトラヒドロ葉酸リボスイッチである。

【0195】

いくつかの場合において、リボスイッチは、テオフィリン結合リボスイッチ又はチミンピロリン酸結合リボスイッチである。

【0196】

いくつかの場合において、リボスイッチは、グルコサミン－６リン酸を感知するＴ．テングコンジェンシス（Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）ｇｌｍＳ触媒リボスイッチである（Ｋｌｅｉｎ ａｎｄ Ｆｅｒｒｅ－Ｄ’Ａｍａｒｅ ２００６）。

【0197】

いくつかの場合において、リボスイッチは、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）に結合して、チアミン生合成及び輸送、並びに同様の代謝産物の輸送を調節するＴＰＰリボスイッチ（ＴＨＩ－ボックスでもある）である。それは、真核生物においてこれまで見出された唯一のリボスイッチである。

【0198】

いくつかの場合において、リボスイッチは、モリブデン補助因子に結合して、この補助因子の生合成及び輸送に関与する遺伝子、並びに補助因子としてそれ又はその誘導体を使用する酵素を調節するＭｏｃｏリボスイッチである。

【0199】

いくつかの場合において、リボスイッチは、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）のアデニンデアミナーゼをコードする遺伝子の５’ＵＴＲにおいて見出されるアデニン感知ａｄｄ－Ａリボスイッチである。

【0200】

アプタザイム
いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムを含む。アプタザイムは、アプタマー領域が、アロステリック制御エレメントとして使用され、且つ触媒ＲＮＡの領域に結合される条件的発現のためのスイッチである。いくつかの場合において、アプタザイムは、細胞型に特異的な翻訳において活性である。いくつかの場合において、アプタザイムは、細胞状態に特異的な翻訳下で、例えば、ウイルス感染した細胞又はウイルス核酸若しくはウイルスタンパク質の存在下で活性である。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0201】

リボザイム（ＲＮＡ酵素又は触媒ＲＮＡとも呼ばれるリボ核酸酵素に由来する）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然のリボザイムは、それら自体のホスホジエステル結合の１つの加水分解、又は他のＲＮＡにおける結合の加水分解のいずれかを触媒するが、それらはまた、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することが見出されている。より最近、触媒ＲＮＡが、インビトロ法によって「進化され」得ることが示されている［１．Ａｇｒｅｓｔｉ Ｊ Ｊ，Ｋｅｌｌｙ Ｂ Ｔ，Ｊａｓｃｈｋｅ Ａ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ Ａ Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ ｔｈａｔ ｃａｔａｌｙｓｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｔｕｒｎｏｖｅｒ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００５，１０２：１６１７０－１６１７５；２．Ｓｏｏｔｅｒ Ｌ Ｊ，Ｒｉｅｄｅｌ Ｔ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ Ｅ Ａ，Ｌｅｖｙ Ｍ，Ｃｏｘ Ｊ Ｃ，Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ Ａ Ｄ：Ｔｏｗａｒｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｎｚｙｍｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１，３８２（９）：１３２７－１３３４．］。Ｗｉｎｋｌｅｒらは［Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｗ Ｃ，Ｎａｈｖｉ Ａ，Ｒｏｔｈ Ａ，Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｊ Ａ，Ｂｒｅａｋｅｒ Ｒ Ｒ：Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｒｉｂｏｚｙｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ ２００４，４２８：２８１－２８６］、上で論じられたリボスイッチ活性と同様に、リボザイム及びそれらの反応産物が、遺伝子発現を調節できることを示した。本発明の文脈において、リボザイムが嵩体積からの分子の化学変換のために細胞内に多くのコピーで存在するように、より大きい非コードＲＮＡ内に触媒ＲＮＡ又はリボザイムを配置することが特に有利であり得る。さらに、同じ非コードＲＮＡ中にアプタマー及びリボザイムの両方をコードすることが、特に有利であり得る。

【0202】

リボザイムのいくつかの非限定的な例としては、ハンマーヘッド型リボザイム、ＶＬリボザイム、リードザイム（ｌｅａｄｚｙｍｅ）、ヘアピンリボザイムが挙げられる。

【0203】

いくつかの場合において、アプタザイムは、ＲＮＡ配列を切断し、且つリガンド／モジュレーターに結合する結果として調節され得るリボザイムである。リボザイムはまた、自己切断リボザイムであってもよい。そのため、それらは、リボザイム及びアプタマーの特性を組み合わせる。アプタザイムは、それらのトランスでの活性に関する潜在力、それらが触媒的に作用して発現を不活性化するという事実、及びそれら自体の又は異種性転写物の切断に起因する不活性化が不可逆であるという事実のために従来のアプタマーを超える利点を提供する。

【0204】

いくつかの場合において、アプタザイムは、ポリリボヌクレオチド、例えば、直鎖状又は環状ポリリボヌクレオチドの非翻訳領域に含まれ、且つリガンド／モジュレーターの非存在下で不活性であり、導入遺伝子の発現を可能にする。発現は、リガンドの添加により遮断され得る（又は下方制御され得る）。特定のモジュレーターの存在に応答して下方制御されるアプタザイムは、制御系において使用されてもよく、モジュレーターに応答した遺伝子発現の上方制御が望ましいことに留意すべきである。

【0205】

アプタザイムはまた、ポリリボヌクレオチド発現の自己調節のための系の開発も可能にし得る。例えば、特定の小分子の合成における律速酵素である環状ポリリボヌクレオチドのタンパク質産物は、その分子の存在下で触媒活性の増大を有するように選択されたアプタザイムを含むように改変されて、それにより、その合成に関する自己調節的フィードバックループをもたらし得る。或いは、アプタザイム活性は、環状ポリリボヌクレオチド由来のタンパク質産物の蓄積、又は任意の他の細胞高分子に感受性であるように選択され得る。

【0206】

いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、アプタマー配列を含み得る。いくつかの非限定的な例としては、ＲＮＡアプタマー結合リゾチーム、高い特異性及び親和性でトロンビンに結合する２’フルオロピリミジンヌクレオチドを含むＲＮＡアプタマーであるＴｏｇｇｌｅ－２５ｔ、ヒト免疫不全ウイルストランス作用応答エレメント（ＨＩＶ ＴＡＲ）に結合するＲＮＡＴａｔ、ＲＮＡアプタマー結合ヘミン、ＲＮＡアプタマー結合インターフェロンγ、ＲＮＡアプタマー結合血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＲＮＡアプタマー結合前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＲＮＡアプタマー結合ドーパミン、及び非古典的癌遺伝子、熱ショック因子１（ＨＳＦ１）に結合するＲＮＡアプタマーが挙げられる。

【0207】

他の試薬
いくつかの場合において、組成物又は医薬組成物は、アルコール又は細胞透過剤及びポリリボヌクレオチドに加えて、試薬を含む。例えば、組成物又は医薬組成物はさらに、ポリリボヌクレオチドに加えて、１つ以上のペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ）、タンパク質（例えば、抗体又はその断片）、ＡＰＣ、ウイルス、小分子化合物、プロドラッグ、又はその組合せなどの１つ以上の活性薬剤、例えば、治療薬を含んでもよい。いくつかの場合において、１つ以上の活性薬剤、例えば、治療薬を含む組成物又は医薬組成物は、例えば、１つ以上の活性薬剤の投与され得る製剤への加工を容易にする賦形剤、希釈剤、及び／又は補助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して製剤化され得る。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0208】

いくつかの場合において、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物はさらに、治療的に許容される賦形剤、担体、希釈剤、アジュバント、他の補助媒体、緩衝液、安定剤、又は足場を含み得る。組成物又は医薬組成物はさらに、塩濃度、重量オスモル濃度、ｐＨ、疎水性／親水性、及び溶解性などであるが、これらに限定されない適切な物理学的又は化学的特性を維持する他の試薬を含み得る。例えば、組成物は、安定剤、例えば、適切な濃度、例えば、約４．５ｇ／Ｌでグルコースを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、非免疫原性である。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、免疫原性である。組成物又は医薬組成物はさらに、ポリリボヌクレオチドの免疫原性を増強し得るか又は抑制し得る適切なアジュバント又は他の薬剤を含み得る。

【0209】

治療的に許容される担体の非限定的な例としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、生理食塩水、アカシアガム、ケラチン、尿素、麦芽、米粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、保水剤（例えば、尿素）、グリコール（例えば、プロピレングリコール）、脂肪酸（例えば、オレイン酸）、界面活性剤（例えば、ミリスチン酸イソプロピル及びラウリル硫酸ナトリウム）、ピロリドン、モノラウリン酸グリセロール、スルホキシド、テルペン（例えば、メントール）、アミン、アミド、アルカン、アルカノール、水、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、ポリエチレングリコールなどのポリマー、及び水が挙げられる。必要があれば、担体はまた、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝液を含有してもよい。

【0210】

安定性
本明細書で提供されるポリリボヌクレオチドは、細胞又は組織への送達後に安定であることができ、ポリリボヌクレオチドが送達された細胞又は組織に対する生物学的効果をもたらすポリリボヌクレオチドの翻訳を可能にする。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、直鎖状ポリリボヌクレオチドであり、短期間の生物学的効果、例えば、少なくとも１時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、又はその間の任意の時間続く生物学的効果のために使用される。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドであり、長期間の生物学的効果、例えば、少なくとも３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、若しくはそれ以上、又はその間の任意の時間続く生物学的効果のために使用される。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、分解、例えば、エキソヌクレアーゼに対して実質的に耐性である。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、自己分解に対して耐性である。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、酵素切断部位、例えば、ダイサー切断部位を欠く。

【0211】

いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、細胞分裂の間に細胞中で残存する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、有糸分裂の後に娘細胞中で残存する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製され、娘細胞に渡される。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドの自己複製を媒介する複製エレメントを含む。いくつかの実施形態では、複製エレメントは、環状ポリリボヌクレオチドの環状ポリリボヌクレオチドに相補的な直鎖状ポリリボヌクレオチド（直鎖状相補物）への転写を媒介する。いくつかの実施形態では、直鎖状の相補的なポリリボヌクレオチドは、細胞中において相補的な環状ポリリボヌクレオチドへとインビボで環状化され得る。いくつかの実施形態では、相補的なポリリボヌクレオチドはさらに、出発環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は同様のヌクレオチド配列を有する別の環状ポリリボヌクレオチドに自己複製できる。自己複製エレメントの一例としては、ＨＤＶ複製ドメイン（Ｂｅｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌ，２０１４，４５０－４５１：１６５－１７３によって記載されるとおりの）が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも１つのポリリボヌクレオチドを少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で娘細胞に渡す。いくつかの実施形態では、減数分裂を起こしている細胞は、ポリリボヌクレオチドを少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で娘細胞に渡す。いくつかの実施形態では、減数分裂を起こしている細胞は、ポリリボヌクレオチドを娘に渡す。

【0212】

組成物及び送達経路
本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、組成物の目的の投与経路に部分的に基づいて製剤化され得る。本開示のある種の態様では、本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、対象の特定の部位又はその近傍で局所的に投与され得る。組成物は、本明細書に記載されるとおりであってもよく、且つ薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。例えば、粘稠な液体、溶液、懸濁液、ゲル、ゼリー、クリーム、ローション、軟膏剤、坐剤、泡、又はエアロゾルスプレーの直接的な局所適用は、局所投与のために使用され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、全身投与のために製剤化される。そのような製剤化のための薬学的に適切な媒体としては、例えば、低級脂肪族アルコール、ポリグリコール（例えば、グリセロール又はポリエチレングリコール）、脂肪酸のエステル、油、脂肪、シリコンなどが挙げられる。そのような製剤はまた、必要に応じて、保存剤（例えば、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル）及び／又は抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸及びトコフェロール）を含み得る。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0213】

組成物又は医薬組成物は、アルコール（例えば、エタノール）及びポリリボヌクレオチドを含み得る。組成物又は医薬組成物は、細胞透過剤及びポリリボヌクレオチドを含み得る。組成物又は医薬組成物は、希釈剤及びポリリボヌクレオチドを含むことができ、組成物又は医薬組成物は、いずれの担体も含まない。

【0214】

本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、皮膚、爪、口腔、鼻腔、耳腔、膣、子宮頸部、子宮内、尿路、及び眼の表面領域などの対象の表面領域上への直接的な投与のために製剤化され得る。

【0215】

本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、懸濁液、シロップ、又はエリキシル剤などの液体調製物であり得る。いくつかの場合において、水溶液は、そのまま使用するために包装されるか、又は凍結乾燥され、凍結乾燥された調製物は、投与の前に無菌溶液と合わせられる。組成物は、溶液として又は懸濁液として送達され得る。一般に、ゲル（例えば、ＤＭＳＯゲル）、ゼリー、クリーム、ローション（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎローション）、坐剤及び軟膏剤などの製剤は、１つ以上の活性薬剤に対してより広範な暴露を伴う領域をもたらすことができる一方で、溶液、例えば、スプレー中の製剤は、より迅速な短期間の暴露をもたらすことができる。

【0216】

本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、約７のｐＨを有し得る。いくつかの実施形態では、組成物又は医薬組成物は、水とほぼ同じ粘度を有する。組成物又は医薬組成物は、疎水性又は親油性基を実質的に含み得ない。いくつかの実施形態では、組成物又は医薬組成物は、炭化水素を実質的に含まない。組成物又は医薬組成物は、脂肪酸、脂質、リポソーム、コレステロール、又はその任意の組合せを実質的に含み得ない。

【0217】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるとおりのポリリボヌクレオチドの送達の方法は、ポリリボヌクレオチド及びエタノールの混合物を含む組成物を対象の表面領域に局所的に適用することを含み、エタノールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるとおりのポリリボヌクレオチドの送達の方法は、ポリリボヌクレオチド及びアルコールの混合物を含む組成物を対象の表面領域に局所的に適用することを含み、アルコールは、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるとおりのポリリボヌクレオチドの送達の方法は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤の混合物を含む組成物を対象の表面領域に局所的に適用することを含み、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、エタノール、アルコール、又は細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ、若しくは少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ、又はそれらの間の任意のパーセンテージｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、エタノール、アルコール、又は細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、若しくは少なくとも約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又はそれらの間の任意のパーセンテージｖ／ｖを占める。

【0218】

多くの場合、本明細書に記載されるとおりの組成物又は医薬組成物は、ポリリボヌクレオチドを対象の真皮又は上皮組織に送達する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、イオン泳動を伴わずに送達される。

【0219】

経皮投与
局所投与のための製剤は、液体、半固体剤形（例えば、ペースト、クリーム、ローション、粉末、軟膏剤又はゲル）、パッチ、フィルム、又はスプレーの形態を利用し得る。いくつかの場合において、局所組成物は、それを必要とする対象の皮膚の患部に適用され得るクリーム又はゲルであり得る（例えば、経皮又は真皮投与）。異なる放出プロファイルは、制御放出、遅延放出、長期放出、又は持続放出などであるが、これらに限定されない異なる形態で達成され得る。局所医薬組成物は、１日に複数回、１日に１回、又は必要に応じて何回でも適用され得る。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0220】

いくつかの場合において、組成物又は医薬組成物は、皮膚領域上での直接的な適用のために製剤化される（例えば、経皮又は真皮投与）。本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、皮膚科学的に許容される希釈剤を含み得る。そのような希釈剤は、皮膚、爪、粘膜、組織、及び／又は毛髪と適合性であり、且つこれらの要件を満たす任意の皮膚科学的な希釈剤を含み得る。そのような希釈剤は、当業者によって容易に選択され得る。皮膚軟膏剤を製剤化する際、１つ以上の薬剤は、油性炭化水素基剤、無水吸収基剤、油中水型の吸収基剤、水中油型の水除去可能基剤及び／又は水溶性基剤中で製剤化され得る。

【0221】

軟膏剤及びクリームは、例えば、好適な増粘剤及び／又はゲル化剤の添加を伴う水性又は油性基剤で製剤化される。ローションは、水性又は油性基剤で製剤化されてもよく、一般に、１つ以上の乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、又は着色剤も含むことになる。医薬品の送達のための経皮パッチの構築及び使用は、当該技術分野で知られている。そのようなパッチは、医薬品の連続的な、パルス状の、又は応需型の送達のために構築され得る。

【0222】

組成物及び剤形を形成するために使用され得る潤滑剤は、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、軽油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、他のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、水素化植物油（例えば、ピーナッツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及びダイズ油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル（ｅｔｈｙｌ ｌａｕｒｅａｔｅ）、寒天、又はその混合物を含み得る。追加の潤滑剤としては、例えば、ｓｙｌｏｉｄシリカゲル、合成シリカの凝固エアロゾル、又はその混合物が挙げられる。潤滑剤は、任意選択により、組成物の約１重量パーセント未満の量で加えられ得る。

【0223】

本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、水溶液、水－アルコール性溶液又は油性溶液、ローション又は血清分散体、水性、無水又は油性ゲル、水相中の脂肪相の分散体により得られるエマルション（Ｏ／Ｗ又は水中油型）又は逆に（Ｗ／Ｏ又は油中水型）、マイクロエマルション或いはマイクロカプセル、イオン型及び／又は非イオン型の微粒子又は脂質小胞分散体を含む、局所投与に好適な任意の形態中にあり得る。ポリリボヌクレオチド及び他の活性成分以外の本明細書で提供される組成物の様々な構成要素の量は、当該技術分野で使用されるものであり得る。これらの組成物は、顔、手、身体及び／若しくは粘膜のための、又は皮膚を浄化するための保護、治療又はケア用クリーム、ミルク、ローション、ゲル又は泡を構成し得る。組成物はまた、セッケン又はクレンジングバーを構成する固体調製物からなり得る。

【0224】

局部／局所投与のための本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、四級アンモニウム化合物、有機水銀、ｐ－ヒドロキシ安息香酸塩、芳香族アルコール、クロロブタノールなどの１つ以上の抗菌保存剤を含み得る。

【0225】

吸入（例えば、鼻腔投与又は経口吸入）
本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、対象の鼻道を介する投与のために製剤化され得る。担体が固体である鼻腔投与に好適な製剤としては、例えば、鼻に近づけた粉末の容器から鼻道を通した迅速な吸入によって鼻から吸う様式で投与され得る、例えば、約１０～約５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含み得る。製剤は、鼻内噴霧、点鼻液、又はネブライザーによるエアロゾル投与によるものであり得る。製剤は、ポリリボヌクレオチドの水溶液又は油性溶液を含み得る。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0226】

本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、エアロゾル製剤として製剤化され得る。エアロゾル製剤は、例えば、エアロゾル溶液、懸濁液又は乾燥粉末であり得る。エアロゾルは、呼吸器系又は鼻道を通して投与され得る。例えば、組成物は、適切な担体、例えば、薬学的に許容される噴霧剤中に懸濁されてもよいし、溶解されてもよく、且つ鼻内噴霧又は吸入剤を使用して肺に直接的に投与されてもよい。例えば、１つ以上の活性薬剤を含むエアロゾル製剤は、例えば、鼻内噴霧又は吸入剤としての投与のために、噴霧剤又は溶媒及び噴霧剤の混合物中で溶解されるか、懸濁されるか、又は乳化される。エアロゾル製剤は、薬学的に許容される噴霧剤などの圧力下で任意の許容される噴霧剤を含み得る。

【0227】

鼻腔投与のためのエアロゾル製剤は、液滴又は噴霧において鼻道に投与されるように設計された水溶液であり得る。経鼻溶液は、それらが、等張性であり、且つ約５．５～約６．５のｐＨを維持するようにわずかに緩衝され得るという点で鼻汁と同様であり得る。いくつかの場合において、この範囲の外のｐＨ値が使用されてもよい。

【0228】

吸入のためのエアロゾル製剤は、鼻腔又は口腔の呼吸器経路により投与されるとき、１つ以上の活性薬剤が対象者の呼吸器系、例えば、気道、例えば、鼻腔、口、咽頭、喉頭、気管、一次気管支、及び肺に沿って運ばれるように設計され得る。吸入溶液は、例えば、ネブライザーによって投与される。微粉状又は液体組成物を含む吸入剤又は吹入剤は、噴霧剤中の薬剤又は薬剤の組合せの溶液又は懸濁液の医薬エアロゾルとして呼吸器系に送達されて、例えば、分配の一助となり得る。噴霧剤は、含ハロゲン炭素化合物、例えば、フッ化塩化炭化水素などのフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、及びヒドロクロロカーボン、並びに炭化水素及び炭化水素エーテルを含む液化性ガスであり得る。

【0229】

エアロゾル製剤はまた、他の成分、例えば、界面活性剤又は油及び洗剤などの他の成分を含み得る。これらの成分は、製剤を安定化し、且つ／又はバルブ構成要素を潤滑するように機能し得る。

【0230】

エアロゾル製剤は、圧力下で包装されてもよく、溶液、懸濁液、エマルション、粉末、及び半固体調製物を使用してエアロゾルとして製剤化されてもよい。例えば、溶液エアロゾル製剤は、（実質的に）純粋な噴霧剤中において又は噴霧剤及び溶媒の混合物としてなど、活性薬剤の溶液を含み得る。溶媒は、１つ以上の活性薬剤を溶解し、且つ／又は噴霧剤の蒸発を遅らせるために使用され得る。溶媒は、例えば、水、及びグリコールを含み得る。好適な溶媒の任意の組合せは、保存剤、抗酸化剤、及び／又は他のエアロゾル成分と任意選択により組み合わせた使用であり得る。

【0231】

エアロゾル製剤は、分散体又は懸濁液であり得る。懸濁液のエアロゾル製剤は、１つ以上の活性薬剤、例えば、ポリリボヌクレオチドの懸濁液、及び分散剤を含み得る。分散剤は、例えば、ソルビタントリオレアート、オレイルアルコール、オレイン酸、レシチン、及びトウモロコシ油を含み得る。懸濁液のエアロゾル製剤はまた、潤滑剤、保存剤、抗酸化剤、及び／又は他のエアロゾル成分を含み得る。

【0232】

エアロゾル製剤はまた、エマルションとして製剤化され得る。エマルションのエアロゾル製剤は、例えば、界面活性剤、水、及び噴霧剤、並びに活性薬剤又は活性薬剤の組合せ、例えば、１つ以上のペプチドを含み得る。界面活性剤は、非イオン性、アニオン性、又はカチオン性であり得る。エマルションのエアロゾル製剤の一例は、例えば、界面活性剤、水、及び噴霧剤を含む。エマルションのエアロゾル製剤の別の例は、例えば、植物油、モノステアリン酸グリセリル、及びプロパンを含む。

【0233】

経口投与
いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、経口投与のために製剤化され得る。場合によっては、組成物又は医薬組成物は、細胞透過剤及びポリリボヌクレオチドの混合物を含む足場（例えば、丸剤、糖衣錠、カプセル、トローチ剤、ハードキャンデー、液体、ゲル、シロップ、スラリー、粉末、懸濁液、エリキシル剤、ウエハ）を含み得る。いくつかの場合において、足場は、胃腸管に沿ってどこでも混合物を放出するように構成される。他の場合において、足場は、胃腸管の特定の位置、例えば、咽頭、食道、胃、腸管、又は結腸のうちの１つ以上の位置で混合物を放出するように構成される。異なる放出プロファイルは、制御放出、遅延放出、長期放出、又は持続放出などであるが、これらに限定されない経口投与のための異なる足場で達成され得る。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0234】

経口投与のために、本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、混合物を当該技術分野で知られる薬学的に許容される希釈剤と組み合わせることによって容易に製剤化され得る。そのような希釈剤により、活性薬剤が、治療されることになる患者による経口摂取のために、咀嚼錠、丸剤、糖衣錠、カプセル、トローチ剤、ハードキャンデー、液体、ゲル、シロップ、スラリー、粉末、懸濁液、エリキシル剤、ウエハなどを含む錠剤として製剤化されることが可能になる。そのような製剤は、固体希釈剤又は充填剤を含む薬学的に許容される希釈剤、無菌水性媒体及び様々な無毒の有機溶媒を含み得る。固体希釈剤は、希釈剤、香味料、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤、又はカプセル化剤として作用し得る１つ以上の物質であり得る。

【0235】

経口使用のための液体混合物は、混合物を懸濁剤（例えば、メチルセルロース）、湿潤剤（例えば、レシチン、リゾレシチン、及び／又は長鎖脂肪アルコール）、並びに着色剤、保存剤、香味料などの薬学的に許容される賦形剤とともに含み得るカプセルにおいて製剤化され得る。油又は非水性溶媒は、例えば、大きい親油性部分の存在のために、１つ以上の活性薬剤を溶液にするのに必要とされ得る。或いは、エマルション、懸濁液、又は他の調製物が使用され得る。

【0236】

経口使用され得る医薬調製物としては、ゼラチンで作られたプッシュフィットカプセル、並びにゼラチン及びグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤で作られた軟質の密封されたカプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／又はタルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、並びに任意選択により安定剤との混合物中において細胞透過剤及びポリリボヌクレオチドの混合物を含み得る。軟カプセルは、脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの賦形剤を含み得る。加えて、安定剤が加えられ得る。経口投与のための全ての製剤は、投与に好適な投与量であり得る。

【0237】

経口投与のための化合物を製剤化するとき、胃に保持される製剤を利用して、胃腸管からの吸収を高めることが望ましい場合がある。胃の中で数時間保持される製剤は、細胞透過剤及びポリリボヌクレオチドの混合物をゆっくりと放出し、本明細書で使用され得る持続放出をもたらすことができる。胃の中で数時間保持される製剤は、アルコール及びポリリボヌクレオチドの混合物をゆっくりと放出し、本明細書で使用され得る持続放出をもたらすことができる。膨張性、浮遊性及び生体接着性の技術を利用して、胃腸管の表面領域への混合物の適用を最大化することができる。

【0238】

点眼
本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、眼を通して投与されてもよく、例えば、点眼薬又は軟膏剤において送達されてもよい。眼に対する組成物の局所適用により、眼中の細胞、例えば、網膜を細胞透過剤及びポリリボヌクレオチドの混合物と接触させることができる。眼に対する組成物の局所適用により、眼中の細胞、例えば、網膜をアルコール（例えば、エタノール）及びポリリボヌクレオチドの混合物と接触させることができる。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0239】

点眼薬は、混合物が液相自体にある場合、細胞透過剤及びポリリボヌクレオチド単独の混合物によって調製され得る。点眼薬は、混合物が液相自体にある場合、アルコール（例えば、エタノール）及びポリリボヌクレオチド単独の混合物によって調製され得る。或いは、点眼薬は、生理食塩水、緩衝溶液などの無菌水溶液中で細胞透過剤及びポリリボヌクレオチドの固体混合物を溶解することによって、又は使用前に溶解されることになる粉末組成物を組み合わせることによって調製され得る。或いは、点眼薬は、生理食塩水、緩衝溶液などの無菌水溶液中でアルコール（例えば、エタノール）及びポリリボヌクレオチドの固体混合物を溶解することによって、又は使用前に溶解されることになる粉末組成物を組み合わせることによって調製され得る。他の媒体は、当該技術分野において知られるとおり、平衡塩溶液、生理食塩水、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリエーテル、ポリビニルアルコール及びポビドンなどのポリビニル、メチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体、鉱油及び白色ワセリンなどの石油誘導体、ラノリンなどの動物性脂肪、カルボキシポリメチレンゲルなどのアクリル酸のポリマー、ピーナッツ油などの植物性脂肪及びデキストランなどの多糖類、並びにヒアルロン酸ナトリウムなどのグリコサミノグリカンを含むがこれらに限定されないものから選択され得る。必要があれば、点眼薬において通常使用される添加剤が加えられ得る。そのような添加剤としては、イオン化剤（例えば、塩化ナトリウムなど）、緩衝液（例えば、ホウ酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノールなど）、増粘剤（例えば、ラクトース、マンニトール、マルトースなどの糖類；例えば、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウムなどのその塩；例えば、コンドロイチン硫酸などのムコ多糖；例えば、ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、架橋ポリアクリル酸塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、又は当業者に知られる他の薬剤）が挙げられる。

【0240】

他の投与
いくつかの場合において、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、坐剤としての投与のために製剤化される。直腸適用に関して、組成物のための好適な剤形としては、坐剤（エマルション又は懸濁液型）、及び直腸ゼラチンカプセル（溶液又は懸濁液）が挙げられる。例示的な坐剤製剤において、本明細書で提供される組成物は、カカオバター、エステル化脂肪酸、グリセリン処理されたゼラチン、及びポリエチレングリコールのような様々な水溶性又は分散性基剤などの適切な薬学的に許容される坐剤基剤と組み合わされる。様々な添加剤、賦活薬、又は界面活性剤が組み込まれ得る。例えば、トリグリセリドの混合物、脂肪酸グリセリド、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ Ｓ５５（Ｄｙｎａｍｉｔｅ Ｎｏｂｅｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｇｅｒｍａｎｙの登録商標）、又はカカオバターなどの低融点のワックスが、最初に融解されてもよく、混合物は、例えば、撹拌することによって均一に分散され得る。次に、溶融した均一な混合物を、好都合なサイズの型枠に注ぎ、冷却させ、凝固させることができる。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0241】

いくつかの場合において、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、粘膜投与のために製剤化される。

【0242】

いくつかの場合において、本明細書に記載される組成物又は医薬組成物は、膣投与のために製剤化される。いくつかの場合において、膣坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡、又は噴霧剤は、本明細書に記載されるもの又は組成物を含有する。

【0243】

いくつかの場合において、組成物又は医薬組成物は、上皮細胞への投与のために製剤化される。この組成物又は医薬組成物は、いずれの担体も含まなくてもよく、本明細書に記載されるとおりの希釈剤及びポリリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、この組成物又は医薬組成物は、ポリリボヌクレオチドの送達のために上皮細胞に直接的に適用される。

【0244】

前処理
本明細書に記載されるとおりの組成物又は医薬組成物は、当該表面への殺菌剤の適用（例えば、ポリリボヌクレオチドの送達のための殺菌剤による表面の前処理）後に表面に適用され得る。表面は、対象の表面領域であり得る。対象の表面領域は、上皮細胞などの細胞を含む。

【0245】

殺菌剤は、殺菌性、静菌性であり、且つ／又は活発に微生物を殺し、微生物を不活性化するか、又は微生物の増殖を妨げる任意の薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、殺菌剤は、アルコール、ヨウ素、又は過酸化水素である。殺菌剤は、ＵＶ光又はレーザー光であり得る。いくつかの実施形態では、殺菌剤は、電気的に又は蒸気若しくは接触などによる他の手段を介して送達される熱である。

【0246】

殺菌剤は、様々な非侵襲性の方法によって対象の表面領域に適用され得る。例えば、殺菌剤は、殺菌剤を含むワイプ又はスワブによって適用され得る。いくつかの実施形態では、殺菌剤は、噴霧剤として適用される。様々なデバイスを使用して、殺菌剤を適用することができる。例えば、ＵＶ光又はレーザー光を生成するデバイスが使用され得る。他の実施形態では、熱を生成するデバイスが使用され得る。

【0247】

前処理後に表面領域に適用される組成物又は医薬組成物は、いずれの担体も含まなくてもよく、ポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含んでもよい。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドであり得る。

【0248】

保存剤
本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、単回投与のための材料を含んでもよいし、多回投与のための材料を含んでもよい（例えば、「多用量」キット）。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。組成物又は医薬組成物は、チオメルサール又は２－フェノキシエタノールなどの１つ以上の保存剤を含んでもよい。保存剤を使用して、使用中の微生物汚染を防ぐことができる。好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、Ｏｎａｍｅｒ Ｍ、又は当業者に知られる他の薬剤が挙げられる。点眼用生成物において、例えば、そのような保存剤は、０．００４％～０．０２％のレベルで利用され得る。本明細書に記載される組成物において、保存剤、例えば、塩化ベンザルコニウムは、重量による０．００１％～０．０１％未満、例えば、０．００１％～０．００８％、好ましくは、約０．００５％のレベルで利用され得る。

【0249】

ポリリボヌクレオチドは、周囲環境に豊富に存在し得るＲＮａｓｅに感受性であり得る。本明細書で提供される組成物は、ＲＮａｓｅ活性を阻害し、それによりポリリボヌクレオチドの分解を防ぐ試薬を含み得る。いくつかの場合において、組成物又は医薬組成物は、当業者に知られる任意のＲＮａｓｅ阻害剤を含む。或いは又は加えて、本明細書で提供される組成物中のポリリボヌクレオチド、並びに細胞透過剤及び／又は薬学的に許容される希釈剤若しくは担体、媒体、賦形剤、若しくは他の試薬は、ＲＮａｓｅを含まない環境において調製され得る。組成物は、ＲＮａｓｅを含まない環境において製剤化され得る。

【0250】

いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物は、無菌であり得る。組成物は、当該技術分野において知られる好適な媒体中で無菌溶液又は懸濁液として製剤化され得る。組成物は、従来の既知の殺菌技術によって殺菌されてもよく、例えば、組成物は、無菌濾過され得る。

【0251】

塩
いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、１つ以上の塩を含む。浸透圧を制御するために、ナトリウム塩などの生理学的塩が、本明細書で提供される組成物に含まれ得る。他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、及び／又は塩化マグネシウムなどを含み得る。いくつかの場合において、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される塩とともに製剤化される。１つ以上の薬学的に許容される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムイオンなどの無機イオンのものを含み得る。そのような塩は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酢酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マンデル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、又はマレイン酸などの無機酸又は有機酸との塩を含み得る。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0252】

緩衝液／ｐＨ
本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、トリス緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液（例えば、水酸化アルミニウムアジュバントを伴う）；又はクエン酸緩衝液などの１つ以上の緩衝液を含み得る。いくつかの場合において、緩衝液は、５～２０ｍＭの範囲で含まれる。

【0253】

本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、約５．０～約８．５の間、約６．０～約８．０の間、約６．５～約７．５の間、又は約７．０～約７．８の間のｐＨを有し得る。組成物又は医薬組成物は、約７のｐＨを有し得る。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0254】

洗剤／界面活性剤
本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、目的の投与経路に応じて、１つ以上の洗剤及び／又は界面活性剤を含んでもよく、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎｓ」と一般的に呼ばれる）、例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０；直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなどのＤＯＷＦＡＸ（商標）登録商標の下で販売されるエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；反復エトキシ（オキシ１，２－エタンジイル）基の数が変動し得るオクトキシノール、例えば、オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、又はｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズなどのノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）などのラウリル、セチル、ステアリル及びオレイルアルコール（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られる）に由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル；並びにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）及びソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（「ＳＰＡＮ」として一般に知られる）、オクトキシノール（オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）又はｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、又はデオキシコール酸ナトリウムである。１つ以上の洗剤及び／又は界面活性剤は、微量でのみ存在し得る。いくつかの場合において、組成物は、１ｍｇ／ｍｌ未満のオクトキシノール－１０及びポリソルベート８０の各々を含み得る。非イオン性界面活性剤が、本明細書で使用され得る。界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性平衡）によって分類され得る。いくつかの場合において、界面活性剤は、少なくとも１０、少なくとも１５、及び／又は少なくとも１６のＨＬＢを有する。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0255】

効果的な送達
本明細書で提供される組成物、医薬組成物、方法、及びキットは、ポリリボヌクレオチドの細胞内への送達のために簡単に操作でき且つ効果的な解決策を提供することができる。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドの細胞内への送達は、治療的である。いくつかの場合において、送達効率は、アルコールを伴わない送達と比較して、本明細書に記載されるアルコールの存在下で相対的に高くなり得る。いくつかの場合において、送達効率は、細胞透過剤を伴わない送達と比較して、本明細書に記載される細胞透過剤の存在下で相対的に高くなり得る。いくつかの場合において、送達効率は、前処理を伴わない送達と比較して、本明細書に記載される殺菌剤（例えば、アルコール）を使用する前処理の後に相対的に高くなり得る。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0256】

いくつかの場合において、送達効率は、細胞と接触される全ポリリボヌクレオチドの量に対する細胞内に送達されるポリリボヌクレオチドの量の比として表される。いくつかの場合において、送達効率は、細胞の近くに投与される全ポリリボヌクレオチドの量（例えば、ポリリボヌクレオチドが皮膚領域に直接的に適用されるときに皮膚細胞内に送達される量）に対する細胞内に送達されるポリリボヌクレオチドの量の比として表される。本明細書で提供される方法の送達効率は、少なくとも約０．５％、１％、１．５％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％であり得る。いくつかの場合において、本明細書で提供される方法の送達効率は、約０．５％、１％、１．５％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％であり得る。

【0257】

いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物及び方法の薬学的効果は、投与後の対象から観察される生物学的効果に関して測定される。例えば、対象又は対象の１つ以上の細胞（例えば、血液試料又は組織生検）中のポリリボヌクレオチドの存在量が測定され得る。他の場合において、発現産物は、組成物が、対象において発現されることになるタンパク質をコードする発現配列を含む場合、本明細書で提供される組成物及び方法の送達効率の指標として利用され得る。

【0258】

本明細書で提供される組成物及び方法は、直鎖状ポリリボヌクレオチドと比較して、環状ポリリボヌクレオチドの送達に特により効果的であり得る。細胞に送達される環状ポリリボヌクレオチドの量は、直鎖状ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物とともに細胞に接触される直鎖状ポリリボヌクレオチドの量より少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２、２．４、２．５、２．６、２．８、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、又は１０．０倍高い。いくつかの場合において、細胞に送達される環状ポリリボヌクレオチドの量は、直鎖状ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物とともに細胞に接触される直鎖状ポリリボヌクレオチドの量より少なくとも１．１倍高い。

【0259】

インビボで投与されるとき、ポリリボヌクレオチドは、本明細書で提供される方法に従って、投与経路に応じて対象の表面領域に近接する任意の型の細胞内に送達され得る。例えば、ポリリボヌクレオチドは、本明細書で提供される方法によって、皮膚下、腔又は管（例えば、口、鼻腔、咽頭、ＧＩ管、気道、又は膣）の表面上に位置する上皮細胞に送達され得る。上皮細胞の非限定的な型としては、単層扁平上皮、単層立方上皮、単層円柱上皮、偽重層円柱上皮、重層扁平上皮、重層立方上皮、重層円柱上皮、及び移行上皮が挙げられる。ポリリボヌクレオチドは、本明細書で提供される方法によって、角化細胞、メルケル細胞、メラニン細胞、ランゲルハンス細胞、線維芽細胞、マクロファージ、及び脂肪細胞を含むが、これらに限定されない表面領域、例えば、皮膚の下の任意の型の細胞に送達され得る。ポリリボヌクレオチドは、本明細書で提供される方法によって、表皮、基底膜、真皮、及び皮下組織などの皮膚の下の組織の任意の部分に送達され得る。

【0260】

例えば、ポリリボヌクレオチドは、投与位置に近接する血管及び／又は血液に入り得る。例えば、ポリリボヌクレオチドは、皮膚の下の毛細血管壁中の上皮細胞内に送達され得る。いくつかの場合において、送達は、全身性であり、例えば、ポリリボヌクレオチドは、血管内部に送達され、且つ赤血球、白血球、及び血小板などの血液細胞にトランスフェクトされる。これらの場合において、ポリリボヌクレオチドは、身体の任意の部分に広がることができる循環細胞内に送達され得るが、これはポリリボヌクレオチドの全身送達として認識され得る。

【0261】

本明細書で提供される組成物、医薬組成物、方法、及びキットは、ポリリボヌクレオチドの長期送達に好適であり得る。例えば、ポリリボヌクレオチド及びアルコール（例えば、エタノール）は、長期放出、制御放出、遅延放出、又は持続放出のために製剤化され得るが、その結果、特定の治療効果が達成され得るか又はポリリボヌクレオチドが対象の所望の位置に送達され得る。例えば、ポリリボヌクレオチド及びアルコールは、長期間、例えば、少なくとも約２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１５時間、２０時間、２４時間、３６時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、４週間、５週間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、又はそれ以上対象の皮膚領域に接着されることになるパッチの形態で製剤化され得る。いくつかの場合において、パッチ中のポリリボヌクレオチド及びアルコールは、例えば、パッチが皮膚領域に接着されている限り、長期間かけて送達される。他の実施形態では、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤は、長期放出、制御放出、遅延放出、又は持続放出のために製剤化され得るが、その結果、特定の治療効果が達成され得るか又はポリリボヌクレオチドが対象の所望の位置に送達され得る。例えば、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤は、長期間、例えば、少なくとも約２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１５時間、２０時間、２４時間、３６時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、４週間、５週間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、又はそれ以上対象の皮膚領域に接着されることになるパッチの形態で製剤化され得る。いくつかの場合において、パッチ中のポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤は、例えば、パッチが皮膚領域に接着されている限り、長期間かけて送達される。

【0262】

いくつかの場合において、組成物、医薬組成物、方法、及びキットは、細胞内に送達され且つ長期間かけて生物学的効果を有するポリリボヌクレオチドを提供する。例えば、いくつかのポリリボヌクレオチドは、ＲＮａｓｅに対してほとんど又は全く感受性を有しないか又はそれらは、使用される細胞内部で非常に長い半減期を有し得る。結果として、ポリリボヌクレオチドは、長期間、例えば、少なくとも約２４時間、３６時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、４週間、５週間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１年間、２年間、３年間、又はそれ以上にわたって存在し、且つ潜在的に活性であり得る。いくつかの場合において、ポリリボヌクレオチドは、ほぼ約２４時間、３６時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、４週間、５週間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１年間、２年間、又は３年間である半減期を有し得る。ある特定の場合において、例えば、ポリリボヌクレオチドが、長寿命であるか又は子孫細胞（例えば、幹細胞又は他の前駆細胞）を生成できる寿命を有する細胞において遺伝子編集目的で投与されるとき、ポリリボヌクレオチドの生物学的効果は、細胞又は対象の寿命にわたって延長する。

【0263】

キット及び適用ツール
異なる目的の投与経路に応じて、本明細書で提供される組成物は、異なる様式において、及び／又はいくつかの場合では、組成物及び目的の経路を介して対象に組成物を投与するように構成される１つ以上の適用ツールを含む異なるキットにおいてパッケージ化され得る。上で論じられるとおり、本明細書で提供される組成物は、直接的な局所投与（例えば、経皮、坐剤、粘膜、及び膣内）、吸入、及び経口摂取を含む異なる経路を通して投与されるために製剤化され得る。態様において、本開示は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む組成物の投与のためのキットを提供する。態様において、本開示は、ポリリボヌクレオチド及びアルコール含む組成物の投与のためのキットを提供する。態様において、本開示は、ポリリボヌクレオチド及びエタノール含む組成物の投与のためのキットを提供する。態様において、本開示は、本明細書に記載されるとおりの前処理の後に、いずれの担体も含まないポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む組成物の投与のためのキットを提供する。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0264】

キットは、直接的な局所投与、例えば、皮膚に対する直接的な適用のために構成され得る。いくつかの場合において、キットは、本明細書で提供されるとおりの組成物を含む基材又は足場を含む。基材又は足場は、対象の皮膚表面上への組成物の直接的な適用を可能にするパッチ、ワイプ、Ｑ－チップの形態、又は任意の他の形態であり得る。基材又は足場は、使い捨ての材料、又は生分解性の材料で作られ得る。いくつかの場合において、基材は、繊維層、例えば、非エラストマー原材料を使用し、且つ少なくとも一方向の伸長性を有するように構成された繊維層、例えば、綿、ユーカリ又はバイオセルロースであり得る。繊維層として、紙、又は不織布、織物などが利用され得る。繊維層は、親水性であり、且つ液体保持特性を有し得る。繊維層は、親水性原材料を使用し、且つ非エラストマー原材料又はそれから形成される繊維から得られる親水性繊維で作られ得る。いくつかの場合において、キットは、本明細書で提供される液体組成物及び液体組成物を移行させるか又は分注するように構成される移行ツールを含む。移行ツールは、藁、耳刷毛、又は移行ペプチドのような単純なものであり得る。移行ツールはまた、目盛、発動、アラームシステム、又は自動分注システムなどの追加の特徴を有するように設計され得る。

【0265】

キットは、本明細書で提供される組成物の吸入投与のために構成され得る。いくつかの場合において、キットは、吸入器及び組成物を含む。いくつかの場合において、吸入器は、液体組成物をエアロゾルに変換するように構成されるネブライザーである。組成物は、液体形態、又はエアロゾル化及び吸入のための溶媒中で溶解される準備のできた固体形態中にパッケージ化され得る。ネブライザーの非限定的な例としては、呼吸活性化又は呼吸駆動ネブライザー、手持ち式吸入器デバイス、ジェットネブライザー、振動メッシュ式ネブライザー、各々が全体として参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願番号国際公開第２００４／０７１３６８号パンフレット、米国特許出願公開第２００４／００１１３５８号明細書及び同第２００４／００３５４１３号明細書において記載されるとおりのネブライザーが挙げられる。ネブライザーは、圧縮空気源を有し得る。いくつかの場合において、ネブライザーは、ミクロン又はサブミクロンサイズの孔に通して医薬品を押し出すことによって、又は超音波をかけることによって、液体薬物をエアロゾルに変換する。いくつかの場合において、吸入器は、固体組成物をエアロゾルに変換する乾燥粉末エアロゾル化デバイスである。乾燥粉末エアロゾル化デバイスは、能動的又は受動的乾燥粉末吸入器などの乾燥粉末吸入器であり得る。例示的な乾燥粉末吸入器としては、各々が全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，０６９，８１９号明細書及び同第４，９９５，３８５号明細書、米国特許第３，９９１，７６１号明細書、米国特許第３，９９１，７６１号明細書において記載されるとおりのものを含む。

【0266】

キットは、本明細書で提供される組成物の経口投与のために構成され得る。経口投与、例えば、経口摂取のための組成物は、咀嚼錠、丸剤、糖衣錠、カプセル、トローチ剤、ハードキャンデー、液体、ゲル、シロップ、スラリー、粉末、懸濁液、エリキシル剤、ウエハなどを含む錠剤などの様々な形態において製剤化され得る。

【0267】

本明細書で提供されるキットはさらに、製剤化された組成物を含有するボトル、箱、カプセル、又はディスペンサーなどの容器を含み得る。開示される容器は、適用ツールでもあり得る。いくつかの場合において、ディスペンサーは、本明細書に記載される組成物の液体又は固体製剤を分注するために提供される。例えば、移行ピペットを使用して、皮膚表面又は眼内送達のために眼に液体を滴下することができる。他の場合において、ディスペンサーは、適用の前に無菌で保存されることが要求され得るカプセルを分注するために利用され得る。無菌性、湿度、及び／又は温度は、必要に応じて本明細書に記載されるとおりの容器中で維持され得る。いくつかの場合において、上で論じられるとおりの吸入器は、必要に応じてその液体、固体、又はエアロゾル形態中に組成物を保管するための容器であり得る。ある種の実施形態では、容器及び適用ツールは、別々に提供され得る。

【0268】

本明細書で提供されるキットは、第１の適用ツール、第２の適用ツール、殺菌剤、及びいずれの担体も含まないポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む組成物を含むことができ、第１の適用ツールは、殺菌剤を対象の表面領域に適用するように構成され、且つ第２の適用ツールは、組成物を対象の表面領域に適用するように構成される。無菌剤は、アルコール、ヨウ素、過酸化水素、ＵＶ光、レーザー光、又は熱であり得る。いくつかの実施形態では、アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される。第１の適用ツールは、ワイプ又はスワブであってもよく、ワイプ又はスワブは、無菌剤を含む。或いは、第１の適用ツールは、ＵＶ光又はレーザー光を適用するデバイス、又は熱を適用するデバイスであってもよい。第２の適用ツールは、ピペットを含んでもよい。いくつかの実施形態では、第２の適用ツールは、基材を含み、基材は、混合物が包埋される。多くの場合、基材は、天然又は人工繊維で作られる。いくつかの実施形態では、第２の適用ツールは、パッチ、噴霧器、又はネブライザーを含む。いくつかの場合において、第２の適用ツールは、制御された様式で混合物を放出するように構成される。適用のための表面領域は、皮膚、口腔、鼻腔、胃腸管、及び気道の表面領域、並びにその任意の組合せからなる群から選択され得る。

【0269】

生成の方法
いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物又は医薬組成物中のポリリボヌクレオチドは、天然に存在せず、且つ組換えＤＮＡ技術（下に詳細に記載される方法；例えば、ＤＮＡプラスミドを使用してインビトロで得られる）又は化学合成を使用して生成され得るデオキシリボ核酸配列を含む。ポリリボヌクレオチドは、直鎖状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0270】

ＲＮＡ環を生成するために使用されるＤＮＡ分子が、天然に存在する本来の核酸配列のＤＮＡ配列、その改変バージョン、又は天然で通常見出されない合成ポリペプチド（例えば、キメラ分子又は融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を含み得ることは本発明の範囲内である。ＤＮＡ分子は、部位特異的変異誘発、変異を誘発する核酸分子の化学的処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片のライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択された領域の変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物を「構築する」混合群のライゲーション並びにその組合せなどの古典的な変異誘発技術及び組換えＤＮＡ技術を含むがこれらに限定されない、様々な技術を使用して改変され得る。

【0271】

ポリリボヌクレオチドは、化学合成及び酵素的合成を含むがこれらに限定されない任意の利用可能な技術に従って調製され得る。いくつかの場合において、直鎖状ポリリボヌクレオチドは、リボヌクレオチドから合成され得るか又はＤＮＡコンストラクトから転写され得る。ＤＮＡコンストラクトからの転写は、当業者に利用可能な技術を使用して、細胞内又はインビトロで起こり得る。

【0272】

いくつかの場合において、直鎖状の最初のコンストラクト又は直鎖状ｍＲＮＡは、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを作製するために環化され得るか、又はコンカテマー化され得る。環化又はコンカテマー化の機構は、化学的、酵素的、スプリントライゲーション、又はリボザイムに触媒される方法などであるがこれらに限定されない方法を介して起こり得る。新たに形成された５’－／３’－結合は、分子内結合又は分子間結合であり得る。

【0273】

本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法は、例えば、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ ＆ Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００２）；Ｚｈａｏ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＥｇｌｉ ＆ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１２）において記載される。

【0274】

環状ポリリボヌクレオチドを合成する様々な方法もまた、当該技術分野で記載されている（例えば、米国特許第６２１０９３１号明細書、米国特許第５７７３２４４号明細書、米国特許第５７６６９０３号明細書、米国特許第５７１２１２８号明細書、米国特許第５４２６１８０号明細書、米国特許出願公開第２０１００１３７４０７号明細書、国際公開第１９９２００１８１３号パンフレット及び国際公開第２０１００８４３７１号パンフレットを参照のこと；各々の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる）。

【0275】

本明細書で引用される全ての参考文献及び刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0276】

実施形態
いくつかの態様では、本開示の組成物は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤の混合物を含み、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖを占める。

【0277】

いくつかの態様では、本開示の治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含み、細胞透過剤は、局所投与のために構成される。

【0278】

いくつかの態様では、本開示の治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含み、ポリリボヌクレオチドは、ペイロード又はペイロードをコードする配列を含み、且つペイロードは、細胞に対する生物学的効果を有する。

【0279】

いくつかの態様では、本開示の治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含み、ポリリボヌクレオチドは、細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在し、且つ細胞透過剤は、細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在する。

【0280】

いくつかの態様では、本開示の治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド、細胞透過剤、及び局所送達賦形剤を含み、局所送達賦形剤は、安定剤を含む。いくつかの実施形態では、安定剤は、グルコース（４．５ｇ／Ｌ）を含む。

【0281】

いくつかの態様では、本開示の坐剤又は他の脂質系製剤は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む。

【0282】

いくつかの態様では、本開示の吸入可能な組成物は、ポリリボヌクレオチド、細胞透過剤、及び噴霧剤の混合物を含む。

【0283】

いくつかの態様では、本開示の治療用組成物は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤で負荷された生分解性の足場を含む。

【0284】

いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドを細胞又は組織に送達する方法は、細胞又は組織を、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物に接触させることを含み、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖを占める。

【0285】

いくつかの態様では、治療用組成物を細胞又は組織に送達する方法は、細胞又は組織を、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む治療用組成物に接触させることを含み、細胞透過剤は、局所投与のために構成される。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、アルコールを含む。いくつかの実施形態では、アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アルコールは、エタノールを含む。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は約１００％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、混合物の約１００％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ポリリボヌクレオチドを細胞透過剤と混合することを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、混合の前に固体形態で存在する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、混合の前に凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、混合の前に液体形態で存在する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、混合の前に溶媒中で溶解される。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、ペイロード又はペイロードをコードする配列を含み、且つペイロードは、細胞又は組織に対する生物学的効果を有する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、細胞に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在し、且つ細胞透過剤は、細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在する。

【0286】

いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドのインビボ送達の方法は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を、対象の表面領域に適用することを含む。

【0287】

いくつかの態様では、ポリリボヌクレオチドの局所送達の方法は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を、対象の表面領域に適用することを含む。

【0288】

いくつかの態様では、治療用ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法は、治療用ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を上皮表面、内皮表面、露出された組織、又は開放創に局所的に接触させることを含む。

【0289】

いくつかの態様では、治療の方法は、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を、病態又は疾患を有する対象の表面領域に適用することを含む。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、アルコールを含む。いくつかの実施形態では、アルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アルコールは、エタノールを含む。いくつかの実施形態では、送達は、全身性である。いくつかの実施形態では、送達は、局所的である。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、混合物の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は約１００％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、細胞透過剤は、混合物の約１０％ｖ／ｖを占める。いくつかの実施形態では、表面領域は、皮膚、口腔、鼻腔、耳腔、胃腸管、気道、膣、子宮頸部、子宮内、尿路、及び眼の表面領域からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、適用は、混合物の液滴を表面領域に直接的に置くことを含む。いくつかの実施形態では、適用は、表面領域を、混合物が包埋されたパッチ、ゲル、又はフィルムにより拭くことを含む。いくつかの実施形態では、適用は、混合物を表面領域に噴霧することを含む。いくつかの実施形態では、適用は、混合物をエアロゾル化により対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、適用は、混合物を坐剤により対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、適用は、混合物を、混合物を含有するカプセルの経口摂取を介して対象に投与することを含み、カプセルは、混合物を対象の胃腸管内部に放出するように構成される。いくつかの実施形態では、細胞は、上皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、血液細胞を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、直鎖状ポリリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、直鎖状対応物より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍高い翻訳効率を有する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、直鎖状より少なくとも５倍高い翻訳効率を有する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、短期間の生物学的効果を有する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、直鎖状ポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、長期間の生物学的効果を有する。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、混合物中のポリリボヌクレオチドの濃度は、少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１μｇ／ｍＬ、少なくとも約２μｇ／ｍＬ、少なくとも約３μｇ／ｍＬ、少なくとも約４μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬである。

【0290】

いくつかの態様では、本開示のキットは、適用ツール並びにポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を含み、その適用ツールは、混合物を対象の表面領域に適用するように構成される。いくつかの実施形態では、適用ツールは、ピペットを含む。いくつかの実施形態では、適用ツールは、基材を含み、基材は、混合物が包埋される。いくつかの実施形態では、基材は、天然又は人工繊維で作られる。いくつかの実施形態では、キットは、坐剤を含む。いくつかの実施形態では、適用ツールは、パッチを含む。いくつかの実施形態では、適用ツールは、噴霧器を含む。いくつかの実施形態では、適用ツールは、ネブライザーを含む。いくつかの実施形態では、適用ツールは、混合物を対象の胃腸管内部に放出するように構成されるカプセルを含む。いくつかの実施形態では、適用ツールは、制御された様式で混合物を放出するように構成される。いくつかの実施形態では、表面領域は、皮膚、口腔、鼻腔、胃腸管、及び気道の表面領域、並びにその任意の組合せからなる群から選択される。

【0291】

番号付けされた実施形態
［１］ ポリリボヌクレオチド及びエタノールの混合物を含む医薬組成物であって、エタノールが、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める医薬組成物。

【0292】

［２］ エタノールが、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ、又は少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖを占める、段落［１］の医薬組成物。

【0293】

［３］ エタノールが、混合物の少なくとも約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又は少なくとも約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める、段落［１］の医薬組成物。

【0294】

［４］ ポリリボヌクレオチド及びアルコールの混合物を含む医薬組成物であって、アルコールが、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める医薬組成物。

【0295】

［５］ アルコールが、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ、又は少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖを占める、段落［４］の医薬組成物。

【0296】

［６］ アルコールが、混合物の少なくとも約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又は少なくとも約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める、段落［４］の医薬組成物。

【0297】

［７］ アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される、段落［４］～［６］のいずれか１つの医薬組成物。

【0298】

［８］ ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤の混合物を含む医薬組成物であって、細胞透過剤が、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める医薬組成物。

【0299】

［９］ 細胞透過剤が、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ、又は少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖを占める、段落［８］の医薬組成物。

【0300】

［１０］ 細胞透過剤が、混合物の少なくとも約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又は少なくとも約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める、段落［８］の医薬組成物。

【0301】

［１１］ 細胞透過剤が、アルコールである、段落［８］～［１０］のいずれか１つの医薬組成物。

【0302】

［１２］ アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される、段落［１１］の医薬組成物。

【0303】

［１３］ ポリリボヌクレオチドが、タンパク質をコードする、段落［１］～［１２］のいずれか１つの医薬組成物。

【0304】

［１４］ タンパク質が、治療用タンパク質である、段落［１３］の医薬組成物。

【0305】

［１５］ タンパク質が、創傷治癒タンパク質である、段落［１３］又は［１４］の医薬組成物。

【0306】

［１６］ 創傷治癒タンパク質が、増殖因子である、段落［１５］の医薬組成物。

【0307】

［１７］ 増殖因子が、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、又はＶＥＧＦである、段落［１６］の医薬組成物。

【0308】

［１８］ 医薬組成物が、液体、ゲル、ローション、ペースト、クリーム、泡、又は粘着物質である、段落［１］～［１７］のいずれか１つの医薬組成物。

【0309】

［１９］ ポリリボヌクレオチドが、直鎖状ポリリボヌクレオチドである、段落［１］～［１８］のいずれか１つの医薬組成物。

【0310】

［２０］ ポリリボヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、段落［１］～［１９］のいずれか１つの医薬組成物。

【0311】

［２１］ ポリリボヌクレオチドが、キャップ又はポリＡテールを欠く、段落［１］～［２０］のいずれか１つの医薬組成物。

【0312】

［２２］ ポリリボヌクレオチドが、環状ポリリボヌクレオチドである、段落［１］～［１８］のいずれか１つの医薬組成物。

【0313】

［２３］ ポリリボヌクレオチドが、修飾リボヌクレオチドを含む、段落［１］～［２２］のいずれか１つの医薬組成物。

【0314】

［２４］ 医薬組成物が、約７のｐＨを有する、段落［１］～［２３］のいずれか１つの医薬組成物。

【0315】

［２５］ 医薬組成物が、水とほぼ同じである粘度を有する、段落［１］～［２４］のいずれか１つの医薬組成物。

【0316】

［２６］ 医薬組成物が、疎水性又は親油性基を実質的に含まない、段落［１］～［２５］のいずれか１つの医薬組成物。

【0317】

［２７］ 医薬組成物が、炭化水素を実質的に含まない、段落［１］～［２６］のいずれか１つの医薬組成物。

【0318】

［２８］ 医薬組成物が、カチオン性リポソームを実質的に含まない、段落［１］～［２７］のいずれか１つの医薬組成物。

【0319】

［２９］ 医薬組成物が、脂肪酸、脂質、リポソーム、コレステロール、又はその任意の組合せを実質的に含まない、段落［１］～［２８］のいずれか１つの医薬組成物。

【0320】

［３０］ 細胞透過剤が、極性溶媒に可溶性である、段落［４］～［２９］のいずれか１つの医薬組成物。

【0321】

［３１］ 細胞透過剤が、極性溶媒に不溶性である、段落［４］～［３０］のいずれか１つの医薬組成物。

【0322】

［３２］ ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む治療用組成物であって、アルコールが、局所投与のために構成される治療用組成物。

【0323】

［３３］ ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む治療用組成物であって、ポリリボヌクレオチドが、ペイロード又はペイロードをコードする配列を含み、且つペイロードが、細胞に対する生物学的効果を有する治療用組成物。

【0324】

［３４］ ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む治療用組成物であって、ポリリボヌクレオチドが、細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在し、且つアルコールが、細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在する治療用組成物。

【0325】

［３５］ ポリリボヌクレオチド、アルコール、及び局所送達賦形剤を含む治療用組成物であって、局所送達賦形剤が、安定剤を含む治療用組成物。

【0326】

［３６］ ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む坐剤又は他の脂質系製剤。

【0327】

［３７］ ポリリボヌクレオチド、アルコール、及び噴霧剤の混合物を含む吸入可能な組成物。

【0328】

［３８］ ポリリボヌクレオチド及びアルコールで負荷された生分解性の足場を含む治療用組成物。

【0329】

［３９］ ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む治療用組成物であって、細胞透過剤が、局所投与のために構成される治療用組成物。

【0330】

［４０］ ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む治療用組成物であって、ポリリボヌクレオチドが、ペイロード又はペイロードをコードする配列を含み、且つペイロードが、細胞に対する生物学的効果を有する治療用組成物。

【0331】

［４１］ ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む治療用組成物であって、ポリリボヌクレオチドが、細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在し、且つアルコールが、細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在する治療用組成物。

【0332】

［４２］ ポリリボヌクレオチド、細胞透過剤、及び局所送達賦形剤を含む治療用組成物であって、局所送達賦形剤が、安定剤を含む治療用組成物。

【0333】

［４３］ ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む坐剤又は他の脂質系製剤。

【0334】

［４４］ ポリリボヌクレオチド、細胞透過剤、及び噴霧剤の混合物を含む吸入可能な組成物。

【0335】

［４５］ ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤で負荷された生分解性の足場を含む治療用組成物。

【0336】

［４６］ 安定剤が、グルコース（４．５ｇ／Ｌ）を含む、段落［３５］又は段落［４２］の治療用組成物。

【0337】

［４７］ 細胞透過剤が、アルコールを含む、段落［３９］～［３８］のいずれか１つの治療用組成物、坐剤、他の脂質系製剤、又は吸入可能な組成物。

【0338】

［４８］ アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される、段落［３２］～［３８］又は［４７］のいずれか１つの治療用組成物、坐剤、他の脂質系製剤、又は吸入可能な組成物。

【0339】

［４９］ アルコールが、エタノールである、段落［４８］の治療用組成物、坐剤、他の脂質系製剤、又は吸入可能な組成物。

【0340】

［５０］ ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、
ａ）殺菌剤を対象の表面領域に適用すること；
ｂ）いずれの担体も含まないポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む組成物を表面領域に適用することを含む方法。

【0341】

［５１］ 殺菌剤が、アルコール、ＵＶ光、レーザー光、又は熱である、段落［５０］の方法。

【0342】

［５２］ ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、
ａ）アルコールを対象の表面領域に適用すること；
ｂ）いずれの担体も含まないポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む組成物を表面に適用することを含む方法。

【0343】

［５３］ ポリリボヌクレオチドを上皮細胞に送達する方法であって、いずれの担体も含まない希釈剤及び修飾されていないポリリボヌクレオチドを含む組成物を上皮細胞に適用することを含む方法。

【0344】

［５４］ ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、ポリリボヌクレオチド及びエタノールの混合物を含む組成物を対象の表面領域に局所的に適用することを含み、エタノールが、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める方法。

【0345】

［５５］ ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、ポリリボヌクレオチド及びアルコールの混合物を含む組成物を対象の表面領域に局所的に適用することを含み、アルコールが、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める方法。

【0346】

［５６］ ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤の混合物を含む組成物を対象の表面領域に局所的に適用することを含み、細胞透過剤が、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める方法。

【0347】

［５７］ 組成物が、ポリリボヌクレオチドを対象の真皮又は上皮組織に送達する、段落［５３］～［５６］のいずれか１つの方法。

【0348】

［５８］ 組成物が、ポリリボヌクレオチドを対象の真皮又は上皮組織にイオン泳動を伴わずに送達する、段落［５８］の方法。

【0349】

［５９］ ポリリボヌクレオチドを細胞又は組織に送達する方法であって、細胞又は組織を、ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む混合物に接触させることを含み、細胞透過剤又はアルコールが、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める方法。

【0350】

［６０］ 治療用組成物を細胞又は組織に送達する方法であって、細胞又は組織を、ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む治療用組成物に接触させることを含み、細胞透過剤又はアルコールが、局所投与のために構成される方法。

【0351】

［６１］ ポリリボヌクレオチドのインビボ送達の方法であって、ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む混合物を、対象の表面領域に適用することを含む方法。

【0352】

［６２］ ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む混合物を、対象の表面領域に適用することを含む方法。

【0353】

［６３］ 治療用ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、治療用ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む混合物を上皮表面、内皮表面、露出された組織、又は開放創に局所的に接触させることを含む方法。

【0354】

［６４］ 治療の方法であって、ポリリボヌクレオチド及びアルコールを含む混合物を、病態又は疾患を有する対象の表面領域に適用することを含む方法。

【0355】

［６５］ ポリリボヌクレオチドを細胞又は組織に送達する方法であって、細胞又は組織を、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物に接触させることを含み、細胞透過剤又はアルコールが、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める方法。

【0356】

［６６］ 治療用組成物を細胞又は組織に送達する方法であって、細胞又は組織を、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む治療用組成物に接触させることを含み、細胞透過剤又はアルコールが、局所投与のために構成される方法。

【0357】

［６７］ ポリリボヌクレオチドのインビボ送達の方法であって、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を、対象の表面領域に適用することを含む方法。

【0358】

［６８］ ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を、対象の表面領域に適用することを含む方法。

【0359】

［６９］ 治療用ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、治療用ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を上皮表面、内皮表面、露出された組織、又は開放創に局所的に接触させることを含む方法。

【0360】

［７０］ 治療の方法であって、ポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を、病態又は疾患を有する対象の表面領域に適用することを含む方法。

【0361】

［７１］ 創傷を治療する方法であって、創傷又は創傷の周囲の組織を、ポリリボヌクレオチド及びエタノールの混合物を含む組成物に接触させることを含み、エタノールが、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める方法。

【0362】

［７２］ 創傷を治療する方法であって、創傷又は創傷の周囲の組織を、ポリリボヌクレオチド及びエタノールの混合物を含む組成物に接触させることを含み、アルコールが、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める方法。

【0363】

［７３］ 創傷を治療する方法であって、創傷又は創傷の周囲の組織を、ポリリボヌクレオチド及びエタノールの混合物を含む組成物に接触させることを含み、細胞透過剤が、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める方法。

【0364】

［７４］ 細胞透過剤が、アルコールを含む、段落［６５］～［７０］又は［７３］のいずれか１つの方法。

【0365】

［７５］ アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される、段落［５１］～［６５］又は［７４］のいずれか１つの方法。

【0366】

［７６］ アルコールが、エタノールを含む、段落［５１］～［６５］、［７４］、又は［７５］の方法。

【0367】

［７７］ エタノール、アルコール、又は細胞透過剤が、混合物の少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約７０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約６０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖ、少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約１％ｖ／ｖ、又は少なくとも約０．３％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖを占める、段落［５９］～［７６］のいずれか１つの方法。

【0368】

［７８］ エタノール、アルコール、又は細胞透過剤が、混合物の少なくとも約０．５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約１５％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約２０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約３０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約４０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約５０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、少なくとも約６０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖ、又は少なくとも約７０％ｖ／ｖ～約７５％ｖ／ｖを占める、段落［５９］～［７６］のいずれか１つの方法。

【0369】

［７９］ ポリリボヌクレオチドを細胞透過剤と混合することをさらに含む、段落［６５］～［７８］のいずれか１つの方法。

【0370】

［８０］ ポリリボヌクレオチドをアルコールと混合することをさらに含む、段落［５９］～［６４］又は［７１］～［７８］のいずれか１つの方法。

【0371】

［８１］ ポリリボヌクレオチドが、混合の前に固体形態で存在する、段落［７９］又は［８０］の方法。

【0372】

［８２］ ポリリボヌクレオチドが、混合の前に凍結乾燥される、段落７８の方法。

【0373】

［８３］ ポリリボヌクレオチドが、混合の前に液体形態で存在する、段落［７９］又は［８０］の方法。

【0374】

［８４］ ポリリボヌクレオチドが、混合の前に溶媒中で溶解される、段落［７９］又は［８０］の方法。

【0375】

［８５］ ポリリボヌクレオチドが、ペイロード又はペイロードをコードする配列を含み、且つペイロードが、細胞又は組織に対する生物学的効果を有する、段落［５０］～［８４］のいずれか１つの方法。

【0376】

［８６］ ポリリボヌクレオチドが、細胞に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在し、且つ細胞透過剤が、細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量で存在する、段落［５０］～［８５］のいずれか１つの方法。

【0377】

［８７］ ポリリボヌクレオチドが、タンパク質をコードする、段落［５０］～［８６］のいずれか１つの方法。

【0378】

［８８］ タンパク質が、治療用タンパク質である、段落［８７］の方法。

【0379】

［８９］ タンパク質が、創傷治癒タンパク質である、段落［８７］又は［８８］の方法。

【0380】

［９０］ 創傷治癒タンパク質が、増殖因子である、段落［８９］の方法。

【0381】

［９１］ 増殖因子が、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、又はＶＥＧＦである、段落［９０］の方法。

【0382】

［９２］ 組成物が、液体、ゲル、ローション、ペースト、クリーム、泡、又は粘着物質である、段落［５０］～［９１］のいずれか１つの方法。

【0383】

［９３］ ポリリボヌクレオチドが、直鎖状ポリリボヌクレオチドである、段落［５０］～［９２］のいずれか１つの方法。

【0384】

［９４］ ポリリボヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、段落［５０］～［９３］のいずれか１つの方法。

【0385】

［９５］ ポリリボヌクレオチドが、キャップ又はポリＡテールを欠く、段落［５０］～［９４］のいずれか１つの方法。

【0386】

［９６］ ポリリボヌクレオチドが、環状ポリリボヌクレオチドである、段落［５０］～［９２］のいずれか１つの方法。

【0387】

［９７］ ポリリボヌクレオチドが、修飾リボヌクレオチドを含む、段落［５０］～［９６］のいずれか１つの方法。

【0388】

［９８］ 組成物が、約７のｐＨを有する、段落［５０］～［９７］のいずれか１つの方法。

【0389】

［９９］ 組成物が、水とほぼ同じである粘度を有する、段落［５０］～［９８］のいずれか１つの方法。

【0390】

［１００］ 組成物が、疎水性又は親油性基を実質的に含まない、段落［５０］～［９９］のいずれか１つの方法。

【0391】

［１０１］ 組成物が、炭化水素を実質的に含まない、段落［５０］～［１００］のいずれか１つの方法。

【0392】

［１０２］ 組成物が、カチオン性リポソームを実質的に含まない、段落［５０］～［１０１］のいずれか１つの方法。

【0393】

［１０３］ 組成物が、脂肪酸、脂質、リポソーム、コレステロール、又はその任意の組合せを実質的に含まない、段落［５０］～［１０２］のいずれか１つの方法。

【0394】

［１０４］ 細胞透過剤が、極性溶媒に可溶性である、段落［５９］～［１０３］のいずれか１つの方法。

【0395】

［１０５］ 細胞透過剤が、極性溶媒に不溶性である、段落［５９］～８７のいずれか１つの方法。

【0396】

［１０６］ 組成物がさらに、薬学的に許容される賦形剤を含む、段落［５０］～［１０５］のいずれか１つの方法。

【0397】

［１０７］ 送達が、全身性である、段落［５０］～［１０６］のいずれか１つの方法。

【0398】

［１０８］ 送達が、局所的である、段落［５０］～［１０６］のいずれか１つの方法。

【0399】

［１０９］ 表面領域が、皮膚、口腔、鼻腔、耳腔、胃腸管、気道、膣、子宮頸部、子宮内、尿路、及び眼の表面領域からなる群から選択される、段落［５０］～［１０８］のいずれか１つの方法。

【0400】

［１１０］ 適用が、混合物の液滴を表面領域に直接的に置くことを含む、段落［５０］～［５８］、［６１］、［６２］、又は［７１］～［１０９］のいずれか１つの方法。

【0401】

［１１１］ 適用が、表面領域を、混合物が包埋されたパッチ、ゲル、又はフィルムにより拭くことを含む、段落［５０］～［５８］、［６１］、［６２］、又は［７１］～［１０９］のいずれか１つの方法。

【0402】

［１１２］ 適用が、混合物を表面領域に噴霧することを含む、段落［５０］～［５８］、［６１］、［６２］、又は［７１］～［１０９］のいずれか１つの方法。

【0403】

［１１３］ 適用が、混合物をエアロゾル化により対象に投与することを含む、段落［５０］～［５８］、［６１］、［６２］、又は［７１］～［１０９］のいずれか１つの方法。

【0404】

［１１４］ 適用が、混合物を坐剤により対象に投与することを含む、段落［５０］～［５８］、［６１］、［６２］、又は［７１］～［１０９］のいずれか１つの方法。

【0405】

［１１５］ 適用が、混合物を、混合物を含有するカプセルの経口摂取を介して対象に投与することを含み、カプセルが、混合物を対象の胃腸管内部に放出するように構成される、段落［５０］～［５８］、［６１］、［６２］、又は［７１］～［１０９］のいずれか１つの方法。

【0406】

［１１６］ 細胞が、上皮細胞を含む、段落［５９］、［６０］、［６５］、［６６］、又は［７１］～［１１５］のいずれか１つの方法。

【0407】

［１１７］ 環状ポリリボヌクレオチドが、直鎖状対応物より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍高い翻訳効率を有する、段落［９６］～［１１６］のいずれか１つの方法。

【0408】

［１１８］ 環状ポリリボヌクレオチドが、直鎖状対応物より少なくとも５倍高い翻訳効率を有する、段落［９６］～［１１７］のいずれか１つの方法。

【0409】

［１１９］ ポリリボヌクレオチドが、短期間の生物学的効果を有する、段落［５０］～［１１８］のいずれか１つの方法。

【0410】

［１２０］ ポリリボヌクレオチドが、長期間の生物学的効果を有する、段落［５０］～［１１９］のいずれか１つの方法。

【0411】

［１２１］ 混合物中のポリリボヌクレオチドの濃度が、少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも約１μｇ／ｍＬ、少なくとも約２μｇ／ｍＬ、少なくとも約３μｇ／ｍＬ、少なくとも約４μｇ／ｍＬ、少なくとも約５μｇ／ｍＬ、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬである、段落［５０］～［１２０］のいずれか１つの方法。

【0412】

［１２２］ 適用ツール及び段落［１］～［３１］のいずれか１つの医薬組成物を含むキットであって、適用ツールが、医薬組成物を対象の表面領域に適用するように構成されるキット。

【0413】

［１２３］ 第１の適用ツール、第２の適用ツール、殺菌剤、及びいずれの担体も含まないポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む組成物を含むキットであって、第１の適用ツールが、殺菌剤を対象の表面領域に適用するように構成され、且つ第２の適用ツールが、組成物を対象の表面領域に適用するように構成されるキット。

【0414】

［１２４］ 殺菌剤が、アルコール、ＵＶ光、レーザー光、又は熱である、段落［１２３］のキット。

【0415】

［１２５］ アルコールが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特別変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、及びヒドロキシエチルセルロースからなる群から選択される、段落［１２４］のキット。

【0416】

［１２６］ 第１の適用ツールが、ワイプである、段落［１２３］～［１２５］のいずれか１つのキット。

【0417】

［１２７］ ワイプが、殺菌剤を含む、段落［１２６］のキット。

【0418】

［１２８］ 第１の適用ツールが、ＵＶ光又はレーザー光を適用するデバイスである、段落［１２３］又は［１２４］のキット。

【0419】

［１２９］ 第１の適用ツールが、熱を適用するデバイスである、段落［１２３］又は［１２４］のキット。

【0420】

［１３０］ 適用ツール並びにポリリボヌクレオチド及び細胞透過剤を含む混合物を含むキットであって、その適用ツールが、混合物を対象の表面領域に適用するように構成されるキット。

【0421】

［１３１］ その適用ツール又は第２の適用ツールが、ピペットを含む、段落［１２２］～［１３０］のいずれか１つのキット。

【0422】

［１３２］ その適用ツール又は第２の適用ツールが、基材を含み、基材は、混合物が包埋される、段落［１２２］～［１３０］のいずれか１つのキット。

【0423】

［１３３］ 基材が、天然又は人工繊維で作られる、段落［１３２］のキット。

【0424】

［１３４］ キットが、坐剤を含む、段落［１３２］のキット。

【0425】

［１３５］ その適用ツール又は第２の適用ツールが、パッチを含む、段落［１２２］～［１３４］のいずれか１つのキット。

【0426】

［１３６］ その適用ツール又は第２の適用ツールが、噴霧器を含む、段落［１２２］～［１３４］のいずれか１つのキット。

【0427】

［１３７］ その適用ツール又は第２の適用ツールが、ネブライザーを含む、段落［１２２］～［１３４］のいずれか１つのキット。

【0428】

［１３８］ その適用ツール又は第２の適用ツールが、混合物を対象の胃腸管内部に放出するように構成されるカプセルを含む、段落［１２２］～［１３４］のいずれか１つのキット。

【0429】

［１３９］ その適用ツール又は第２の適用ツールが、制御された様式で混合物を放出するように構成される、段落［１２２］～［１３８］のいずれか１つのキット。

【0430】

［１４０］ 表面領域が、皮膚、口腔、鼻腔、胃腸管、及び気道の表面領域、並びにその任意の組合せからなる群から選択される、段落［１２２］～［１３９］のいずれか１つのキット。

【0431】

［１４１］ 創傷を治療する方法であって、創傷又は創傷の周囲の組織を、段落［１］～［３１］のいずれか１つを含む組成物に接触させることを含む方法。

【実施例】

【0432】

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく；当業者に知られる他の手順、方法論、又は技術を代替的に使用できることが、それらの例示的な性質によって理解されることになる。

【0433】

実施例１：局所送達のためのＲＮＡの製剤
この実施例は、局所送達のためのＲＮＡの製剤を示す。

【0434】

ＲＮＡの局所的効果を判断するため、ＲＮＡを、上皮組織への送達のために製剤化した。

【0435】

本明細書に記載されるとおり、ＲＮＡは、以下に従って細胞透過剤とともに製剤化された。
１０ｎｇ ＥＧＦ ＯＲＦを含むＲＮＡ直鎖状又は環状
５ｕＬ ８０％エタノール
３５ｕＬ ＰＢＳ＋グルコース（４．５ｇ／Ｌ）。

【0436】

実施例２：直鎖状ＲＮＡの局所送達
この実施例は、ＲＮＡの局所送達を実証する。

【0437】

局所送達の効果を判断するため、ＲＮＡを製剤化し、上皮組織に送達した。本明細書に記載されるとおり、細胞透過剤とともに製剤化された直鎖状ＲＮＡは、耳組織に局所的に送達された。

【0438】

直鎖状ＲＮＡの試料は、実施例１のように製剤化され（５０μＬ）、マウスの耳に適用された。試料の耳への適用の前に、耳をイソプロピルアルコールワイプで拭いた。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0439】

選択された時点（適用後６時間、１日、３日、又は１２日）で、耳組織（単一の耳パンチにより）が、各ＲＮＡ試料のために収集され、組織保管試薬中で保存された（例えば、凍結されていない試料中で環状ＲＮＡを安定化し、保護するために組織に浸透する）。

【0440】

実施例３：環状ＲＮＡの局所送達
この実施例は、ＲＮＡの局所送達を実証する。

【0441】

局所送達の効果を判断するため、ＲＮＡを製剤化し、上皮組織に送達した。本明細書に記載されるとおり、ＲＮＡは、細胞透過剤とともに製剤化され、耳組織に局所的に送達された。

【0442】

環状ＲＮＡの試料は、実施例１のように製剤化され（５０μＬ）、マウスの両耳に適用された。試料の耳への適用の前に、耳をイソプロピルアルコールワイプで拭いた。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって耳上で乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0443】

選択された時点（適用後６時間、１日、３日、又は１２日）で、耳組織（単一の耳パンチにより）が、各ＲＮＡ試料のために収集された。

【0444】

実施例４：局所送達後のＲＮＡの持続性
この実施例は、局所送達後のＲＮＡの持続性を実証する。

【0445】

ＲＮＡの持続性を判断するため、組織試料が、送達されたＲＮＡについて分析された。本明細書に記載されるとおり、耳パンチは、ＲＮＡの局所送達後の様々な時点で持続性について分析された。

【0446】

実施例３からの耳パンチ試料及び未処理の耳パンチ試料は、ＲＮＡ安定化試薬中に収集され、ＲＮＡは、標準的なＲＮＡ組織抽出キット（Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ ｓｉｍｐｌｙ ＲＮＡ）を使用して抽出された。

【0447】

２００μｌの体積の１－チオグリセロール／均質化溶液が、各試料に加えられた。標準溶液は、１ミリリットルの均質化溶液当たり２０μｌの１－チオグリセロールを加えることによって調製された。或いは、６００μｌの１－チオグリセロールが、３０ｍｌのビンの均質化溶液に加えられた。使用前に、１－チオグリセロール／均質化溶液が、氷上又は２～１０℃で冷却された。

【0448】

組織試料は、組織断片が見えなくなるまで、２００μｌの冷却された１－チオグリセロール／均質化溶液中で手持ち式ホモジナイザー及び無菌の乳棒によりホモジナイズされた。各試料は、完全な均質化のためにさらに１５～３０秒間ホモジナイズされた。

【0449】

異なる時点でのＲＮＡの存在について調べるため、試料は、ｑ－ＰＣＲを介してＲＮＡについて調べられた。ｑＰＣＲは、耳パンチ中の直鎖状及び環状ＲＮＡの両方の存在を測定するために使用された。直鎖状及び環状ＲＮＡを検出するため、Ｎｌｕｃ ＯＲＦを増幅したプライマーが使用された。（Ｆ：ＡＧＡＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＧＣ（配列番号７）、Ｒ：ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ（配列番号８））。環状ＲＮＡのみを検出するため、５’～３’接合部を増幅したプライマーが、直鎖状ではない環状ＲＮＡコンストラクトの検出を可能にした（Ｆ：ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣ（配列番号９）、Ｒ：ＣＣＡＡＡＡＧＡＣＧＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴ（配列番号１０））。

【0450】

直鎖状及び環状ＲＮＡは、局所送達後の６時間目、２４時間目、及び７２時間目に検出された。直鎖状ＲＮＡと比較してより高いレベルの環状ＲＮＡが、注射後３日目のマウスの耳において検出された（図１）。

【0451】

この実施例において示されるとおり、局所的に投与された直鎖状及び環状ＲＮＡは、インビボで検出可能であった。

【0452】

実施例５：局所送達後のｍＲＮＡのタンパク質発現
この実施例は、局所送達後のタンパク質の存在を記載する。

【0453】

局所送達されたＲＮＡが翻訳され得るかどうかを判断するため、組織試料は、ウエスタンブロットによって異なる時点でタンパク質発現について分析される。耳パンチは、ＲＮＡの局所送達後にタンパク質発現について分析される。

【0454】

要するに、耳パンチは、収集され、ＲＮＡ安定化試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に保存される。組織は、ＲＩＰＡ緩衝液中においてマイクロチューブホモジナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でホモジナイズされ、タンパク質が抽出される。各試料は、１４×ｇで１５分間遠心分離される。

【0455】

上清が取り除かれ、ペレットは、２×ＳＤＳ試料緩衝液（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％ ＳＤＳ、３０％グリセロール、５％ ２－メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）中において７０℃で１５分間溶解される。

【0456】

市販の標準物質（ＢｉｏＲａｄ）が、サイズマーカーとして使用される。セミドライ法を使用してポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動で転写させた後、ブロットは、化学発光キット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を使用して可視化される。

【0457】

ＧＦＰタンパク質は、耳パンチ試料中で可視化され、環状ＲＮＡ及び直鎖状ＲＮＡにおいて検出されることが予想される。

【0458】

実施例６：ＲＮＡの局所投与は、エタノールがＲＮＡ溶液中に含まれるときに組織へのＲＮＡ送達をもたらす
この実施例は、エタノールがＲＮＡ溶液中に含まれるときにインビボでの局所投与を介して細胞及び組織にＲＮＡを送達する能力を実証する。

【0459】

この実施例において、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。

【0460】

環状ＲＮＡは、インビトロで生成された。未修飾の直鎖状ＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された。転写されたＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製され、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理され、ＲＮＡ精製カラムで再び精製された。ＲｐｐＨ処理された直鎖状ＲＮＡは、スプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化した。次に、環状ＲＮＡは、尿素－ＰＡＧＥで精製され、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶出され、エタノール沈殿され、ＲＮＡ保管溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁された。この実施例において、環状ＲＮＡもまた、ＨＰＬＣ精製された。

【0461】

この実施例において、直鎖状ｍＲＮＡは、ナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。この実施例において、修飾された直鎖状ｍＲＮＡは、インビトロ転写によって社内で作製された。この実施例において、直鎖状ＲＮＡは、プソイド－ウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換され、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧでキャップされ、５’及び３’ヒトアルファ－グロビンＵＴＲが含まれ、ポリアデニル化される。

【0462】

次に、ＲＮＡは、ＰＢＳ／グルコース（４．５ｇ／Ｌ）及びエタノール（１０％ｖ／ｖ）中で希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、５０ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、３．５ｐモルであった。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製される。

【0463】

時点＝０で、５０μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。陰性対照として、未処理のマウスが使用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0464】

組織中のＲＮＡの持続性を判断するため、組織試料は、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して送達後の様々な時点でＲＮＡについて分析された。投与後の６時間目、１、３、１２日目に、２ｍｍの耳パンチが各動物から採取され、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０２０）中で保存された。全ＲＮＡが、トリゾール抽出を使用して耳パンチから単離された。水相は、イソプロパノールで沈殿され、ペレットは、製造業者の指示書に従って７０％ ＥＴＯＨで洗浄された。ｃＤＮＡは、全ＲＮＡから合成され、ＲＴ－ＰＣＲは、ＮＬｕｃ ＯＲＦに特異的なプライマーを使用してｃＤＮＡ鋳型上で実施された。全ての試料は、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラー上において三つ組でアッセイされた。次に、ＲＮＡレベルは、アクチン及び未処理の陰性対照に対して相対化された。

【0465】

環状ＲＮＡ及び直鎖状ＲＮＡは、局所投与後の６時間目並びに１、３及び１２日目に組織試料中で検出され、溶媒のみの対照より大きいシグナルを示した（図２Ａ及び図２Ｂ）。

【0466】

この実施例は、環状ＲＮＡ及び直鎖状ＲＮＡが、エタノールとともに送達されるときに組織への局所投与を介して順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続することを実証する。

【0467】

実施例７：ＲＮＡの局所投与は、ＴｒａｎｓＩＴで製剤化されるときに組織へのＲＮＡ送達をもたらす
この実施例は、ＴｒａｎｓＩＴを使用してＲＮＡ溶液を製剤化するときにインビボでの局所投与を介して細胞及び組織にＲＮＡを送達する能力を実証する。

【0468】

この実施例において、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。

【0469】

環状ＲＮＡは、インビトロで生成された。未修飾の直鎖状ＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された。転写されたＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製され、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理され、ＲＮＡ精製カラムで再び精製された。ＲｐｐＨ処理された直鎖状ＲＮＡは、スプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化した。次に、環状ＲＮＡは、尿素－ＰＡＧＥで精製され、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶出され、エタノール沈殿され、ＲＮＡ保管溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁された。この実施例において、環状ＲＮＡもまた、ＨＰＬＣ精製された。

【0470】

この実施例において、直鎖状ｍＲＮＡは、ナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。この実施例において、修飾された直鎖状ｍＲＮＡは、インビトロ転写によって社内で作製された。この実施例において、直鎖状ＲＮＡは、プソイド－ウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換され、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧでキャップされ、５’及び３’ヒトアルファ－グロビンＵＴＲが含まれ、ポリアデニル化される。

【0471】

ＲＮＡは、ＰＢＳ／グルコース（４．５ｇ／Ｌ）中で希釈されて、１０ｕＬの溶液中で３．５ｐモルになった。次に、ＲＮＡ溶液が、ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、ＭＩＲ５７００）（１０ｕＬ）、Ｂｏｏｓｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、ＭＩＲ５７００）（５ｕＬ）、及びＰＢＳ／グルコース（４．５ｇ／Ｌ）（２５ｕＬ）に加えられた。各試料についての全体の試料体積は、５０ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、３．５ｐモルであった。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製される。

【0472】

時点＝０で、５０μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。陰性対照として、未処理のマウスが使用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0473】

組織中のＲＮＡの持続性を判断するため、組織試料は、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して送達後の様々な時点でＲＮＡについて分析された。投与後の６時間目、１、３、１２日目に、２ｍｍの耳パンチが各動物から採取され、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０２０）中で保存された。全ＲＮＡが、トリゾール抽出を使用して耳パンチから単離された。水相は、イソプロパノールで沈殿され、ペレットは、製造業者の指示書に従って７０％ ＥＴＯＨで洗浄された。ｃＤＮＡは、全ＲＮＡから合成され、ＲＴ－ＰＣＲは、ＮＬｕｃ ＯＲＦに特異的なプライマーを使用してｃＤＮＡ鋳型上で実施された。全ての試料は、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラー上において三つ組でアッセイされた。次に、ＲＮＡレベルは、アクチン及び未処理の陰性対照に対して相対化された。

【0474】

環状ＲＮＡ及び直鎖状ＲＮＡは、局所投与後の６時間目、１、３及び１２日目に組織試料中で検出され、溶媒のみの対照より大きいシグナルを示した（図３Ａ及び図３Ｂ）。

【0475】

この実施例は、環状ＲＮＡ及び直鎖状ＲＮＡが、ＴｒａｎｓＩＴとともに送達されるときに組織への局所投与を介して順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続することを実証する。

【0476】

実施例８：インビボでのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ゲルで製剤化された修飾された直鎖状ＲＮＡの局所投与
この実施例は、ＤＭＳＯゲルで製剤化されるときに局所投与によってインビボで直鎖状ＲＮＡを送達する能力を実証する。

【0477】

この実施例に関して、ＲＮＡは、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦを含んだ。

【0478】

この実施例において、修飾された直鎖状ＲＮＡは、注文してＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成され、上に列挙される全てのモチーフを含んだ。この実施例において、ＲＮＡは、プソイド－ウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換され、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧでキャップされ、ポリアデニル化（１２０Ａ）される。ＤＭＳＯ Ｍｅｄｉ Ｇｅｌ（２１^ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．）は、市販されている。

【0479】

ＲＮＡは、ＲＮＡ保管溶液中で１ｐモル／μＬの濃度に希釈された。５ｐモルのＲＮＡは、適用当たり２５μＬの総量のために１９μＬのＤＭＳＯ Ｍｅｄｉ Ｇｅｌ（２１^ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．）及び１μＬのＲｎａｓｉｎ Ｐｌｕｓ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）と合わせられた。ＲＮＡを含まない製剤が、対照として使用された。

【0480】

時点＝０で、２５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してマウスの耳に局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0481】

組織中のＲＮＡ発現を判断するため、組織試料は、局所送達後の様々な時点でＲＮＡ発現について分析された。耳パンチは、送達後２４及び４８時間目にマウスから採取された。組織試料は、氷上で１×ルシフェラーゼ細胞溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中において３０分間置かれ、続いて凍結された。

【0482】

ガウシアルシフェラーゼの活性は、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して試験された。試料を解凍し、短時間回転させて、組織細片を除去した。２０μＬの緩衝溶液が、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３９９０）に加えられた。要するに、１×セレンテラジン基質が、各ウェルに加えられた。プレートは、基質添加及びルミノメーター機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）中での混合の直後に読み取られた。

【0483】

ガウシアルシフェラーゼ活性は、局所適用後の２４及び４８時間目に組織試料中で検出され、溶媒のみの対照より高く観察された（図４）。

【0484】

この実施例は、直鎖状ＲＮＡが、ＤＭＳＯ Ｍｅｄｉ Ｇｅｌ（２１^ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．）で製剤化されるときに局所投与を介して順調に送達され、長期間組織中で検出可能な機能性タンパク質を発現することができたことを実証した。

【0485】

実施例９：インビボでのクリーム系軟膏剤で製剤化された修飾された直鎖状ＲＮＡの局所投与
この実施例は、クリーム系軟膏剤、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎのベビーローションで製剤化されるときに局所投与によってインビボで直鎖状ＲＮＡを送達する能力を実証する。

【0486】

この実施例に関して、ＲＮＡは、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦを含んだ。

【0487】

この実施例において、修飾された直鎖状ＲＮＡは、注文してＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成され、上に列挙される全てのモチーフを含んだ。この実施例において、ＲＮＡは、プソイド－ウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換され、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧでキャップされ、ポリアデニル化（１２０Ａ）される。ベビーローション（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）は、市販されていた。

【0488】

ＲＮＡは、１ｐモル／μＬの濃度に希釈された。５ｐモルのＲＮＡは、適用当たり２５μＬの総量のために１９μＬのＪｏｈｎｓｏｎのベビーローション（芳香なし；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）及び１μＬのＲｎａｓｉｎ Ｐｌｕｓ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）と合わせられた。ＲＮＡを含まない製剤が、対照として使用された。

【0489】

時点＝０で、２５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してマウスの耳に局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0490】

組織中のＲＮＡ発現を判断するため、組織試料は、局所送達後の様々な時点でＲＮＡ発現について分析された。耳パンチは、送達後２４及び４８時間目にマウスから採取された。組織試料は、氷上で１×ルシフェラーゼ細胞溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中において３０分間置かれ、続いて凍結された。

【0491】

ガウシアルシフェラーゼの活性は、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して試験された。試料を解凍し、短時間回転させて、組織細片を除去した。２０μＬの緩衝溶液が、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３９９０）に加えられた。要するに、１×セレンテラジン基質が、各ウェルに加えられた。プレートは、基質添加及びルミノメーター機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）中での混合の直後に読み取られた。

【0492】

ガウシアルシフェラーゼ活性は、局所適用後の２４及び４８時間目に組織試料中で検出され、溶媒のみの対照より高く観察された（図５）。

【0493】

この実施例は、直鎖状ＲＮＡが、クリーム系軟膏剤で製剤化されるときに局所投与を介して順調に送達され、長期間組織中で検出可能な機能性タンパク質を発現することができたことを実証した。

【0494】

実施例１０：インビボでのエタノールを使用した修飾された直鎖状ＲＮＡの局所投与
この実施例は、エタノールを使用して局所投与によってインビボで直鎖状ＲＮＡを送達する能力を実証する。

【0495】

この実施例に関して、ＲＮＡは、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦを含んだ。

【0496】

この実施例において、修飾された直鎖状ＲＮＡは、注文してＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成され、上に列挙される全てのモチーフを含んだ。この実施例において、ＲＮＡは、プソイド－ウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換され、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧでキャップされ、ポリアデニル化（１２０Ａ）される。エタノール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）は、市販されていた。

【0497】

ＲＮＡは、ＲＮＡ保管溶液で１ｐモル／μＬの濃度に希釈された。５ｐモルのＲＮＡは、適用当たり２５μＬの総量のために１９μＬのエタノール及び１μＬのＲｎａｓｉｎ Ｐｌｕｓ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）と合わせられた。溶媒のみの対照が同様に調製されたが、ＲＮＡは含有しなかった。

【0498】

時点＝０で、２５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してマウスの耳に局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0499】

組織中のＲＮＡ発現を判断するため、組織試料は、局所送達後の様々な時点でＲＮＡ発現について分析された。耳パンチは、送達後２４及び４８時間目にマウスから採取された。組織試料は、氷上で１×ルシフェラーゼ細胞溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中において３０分間置かれ、続いて凍結された。

【0500】

ガウシアルシフェラーゼの活性は、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して試験された。試料を解凍し、短時間回転させて、組織細片を除去した。２０μＬの緩衝溶液が、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３９９０）に加えられた。要するに、１×セレンテラジン基質が、各ウェルに加えられた。プレートは、基質添加及びルミノメーター機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）中での混合の直後に読み取られた。

【0501】

ガウシアルシフェラーゼ活性は、局所適用後の２４及び４８時間目に組織試料中で検出され、溶媒のみの対照より高く観察された（図６）。

【0502】

この実施例は、直鎖状ＲＮＡが、エタノールを伴う局所投与を介して順調に送達され、長期間組織中で検出可能な機能性タンパク質を発現することができたことを実証した。

【0503】

実施例１１：環状ＲＮＡの局所投与は、組織へのＲＮＡ送達をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介して環状ＲＮＡを細胞及び組織に送達する能力を実証する。

【0504】

この実施例において、環状ＲＮＡは、エリスロポエチンタンパク質（ＥＰＯ）をコードするＯＲＦとともに設計された。

【0505】

環状ＲＮＡは、インビトロで生成された。直鎖状ＲＮＡは、上で列挙される全てのモチーフ、及び転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された。この実施例において、Ｃｙ５－ＵＴＰを使用して、Ｃｙ５－標識ＲＮＡを生成した。転写されたＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製され、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理され、ＲＮＡ精製カラムで再び精製された。ＲｐｐＨ処理された直鎖状ＲＮＡは、スプリントＤＮＡ及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化された。環状ＲＮＡは、尿素－ＰＡＧＥで精製され、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶出され、エタノール沈殿され、ＲＮＡ保管溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁された。

【0506】

環状ＲＮＡは、５％エタノールを含むＰＢＳ／グルコース（４．５ｇ／Ｌ）中で希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、２５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、１２ピコモルであった。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製された。

【0507】

時点＝０で、マウスの耳は、イソプロピルアルコールワイプで拭かれ、乾燥され、２５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0508】

組織への環状ＲＮＡ送達を判断するため、組織試料は、投与後の様々な時点で蛍光顕微鏡により分析された。投与後の６時間目、１日目、及び３日目に、２ｍｍの耳パンチが各動物から採取され、氷冷ＰＢＳ中で保存された。次に、組織試料は、ＥＶＯＳ ＩＩ蛍光顕微鏡の下で観察された。次に、画像は、ＩｍａｇｅＪを使用して蛍光について定量化された。

【0509】

Ｃｙ５シグナルは、局所投与後の６時間目、１及び３日目に組織試料中で検出され、いずれの蛍光も示さなかった陰性対照より大きいシグナルを示した（図７及び図８）。これは、環状ＲＮＡが組織に順調に送達されることを示す。

【0510】

この実施例は、環状ＲＮＡが、皮膚に局所投与を介して順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続することを実証する。

【0511】

実施例１２：ｍＲＮＡの局所投与は、組織へのＲＮＡ送達をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介してｍＲＮＡを細胞及び組織に送達する能力を実証する。

【0512】

この実施例において、ｍＲＮＡは、緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードするＯＲＦとともに設計された。この実施例において、修飾された直鎖状ｍＲＮＡは、注文してＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成され、上に列挙される全てのモチーフを含んだ。この実施例において、ＲＮＡは、プソイド－ウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換され、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧでキャップされ、５’及び３’ヒトアルファ－グロビンＵＴＲが含まれ、ポリアデニル化される。ｍＲＮＡは、３’末端で共有結合されたＣｙ５フルオロフォア標識を含んだ。

【0513】

ｍＲＮＡは、５％エタノールを含むＰＢＳ／グルコース（４．５ｇ／Ｌ）中で希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、２５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、１２ピコモルであった。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製された。

【0514】

時点＝０で、マウスの耳は、イソプロピルアルコールワイプで拭かれ、乾燥され、２５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0515】

組織へのＲＮＡ送達を判断するため、組織試料は、投与後の様々な時点で蛍光顕微鏡により分析された。投与後の６時間目、１日目、及び３日目に、２ｍｍの耳パンチが各動物から採取され、氷冷ＰＢＳ中で保存された。次に、組織試料は、ＥＶＯＳ ＩＩ蛍光顕微鏡の下で観察された。次に、画像は、ＩｍａｇｅＪを使用して蛍光について定量化された。

【0516】

Ｃｙ５シグナルは、局所投与後の６時間目、１日目、及び３日目に組織試料中で検出され、いずれの蛍光も示さなかった陰性対照より大きいシグナルを示した（図９及び図１０）。これは、ｍＲＮＡが組織に順調に送達されることを示す。

【0517】

この実施例は、ｍＲＮＡが、皮膚に局所投与を介して順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続することを実証する。

【0518】

実施例１３：未修飾のＲＮＡの鼻粘膜上皮への局所投与は、組織中におけるＲＮＡの持続性をもたらす
この実施例は、未修飾のＲＮＡを鼻粘膜上皮に局所投与を介して送達し、且つ局所投与を介して直鎖状及び環状ＲＮＡの取込みを達成する能力を記載する。

【0519】

この実施例に関して、ＩＲＥＳ、ナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサーエレメントが、ＲＮＡに含まれる。

【0520】

環状ＲＮＡは、インビトロで生成される。未修飾の直鎖状ＲＮＡは、上で列挙される全てのモチーフ、及び転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写される。転写されたＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製され、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理され、ＲＮＡ精製カラムで再び精製される。ＲｐｐＨ処理された直鎖状ＲＮＡは、スプリントＤＮＡ（５’－ＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１１））及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化される。環状ＲＮＡは、尿素－ＰＡＧＥで精製され、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶出され、エタノール沈殿され、ＲＮａＡ保管溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁される。直鎖状ＲＮＡ対応物が生成され、同じＮＬｕｃ ＯＲＦ及び上記のコード化成分を含んだ。

【0521】

ＲＮＡは、１ｐモル／ｕＬの濃度に希釈される。クエン酸塩緩衝液中の５ｐモルのＲＮＡが、無菌ＰＢＳと合わせられる。適用毎に使用されることになる全試料体積は、２０ｕＬである。溶媒のみの対照試料は、同様であるがＲＮＡを伴わずに調製される。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製される。

【0522】

滅菌されたフード中で、マウスは、それらの耳によって吊り下げられた位置に置かれる。時点＝０で、２０ｕＬ用量の各試料は、マイクロピペットを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻孔に徐々に放出される（各鼻孔において１０ｕＬ）。口及び他方の鼻孔を、適用中に閉じて、取込みを確実にした。マウスは、呼吸速度が正常に戻るまで、さらに数分間吊り下げられた位置で維持される。マウスは、標準的な条件下のケージに戻される。

【0523】

投与後の６、２４及び４８時間目に、マウスは屠殺され、鼻組織がマウスから採取される。各組織試料（約２ｍｇ）は、２００ｕＬの冷却された１－チオグリセロール／均質化溶液中に置かれ、組織断片が見えなくなるまで、手持ち式ホモジナイザー及び無菌の乳棒を使用してホモジナイズされる。各試料は、完全な均質化のためにさらに１５～３０秒間ホモジナイズされる。

【0524】

組織中でのＲＮＡの持続性を判断するため、組織試料は、ｑＰＣＲを使用して送達後の様々な時点でＲＮＡについて分析される。ｑＰＣＲを使用して、抽出された組織中の直鎖状及び環状ＲＮＡの両方を測定する。ＮＬｕｃ ＯＲＦを増幅するプライマーが使用される（Ｆ：ＡＧＡＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＧＣ（配列番号７）、Ｒ：ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ（配列番号８））。環状ＲＮＡのみを検出するため、５’～３’接合部を増幅するプライマーが、直鎖状ではない環状ＲＮＡコンストラクトの検出を可能にする（Ｆ：ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣ（配列番号９）、Ｒ：ＣＣＡＡＡＡＧＡＣＧＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴ（配列番号１０））。

【0525】

直鎖状及び環状ＲＮＡは、直鎖状及び環状ＲＮＡの局所投与後の６、２４及び４８時間目に鼻組織試料中で検出されることになり、溶媒のみの対照より高い発現を示すことになると予想される。

【0526】

この実施例は、ＲＮＡが、鼻側粘膜上皮に局所投与を介して順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続することを記載する。

【0527】

実施例１４：組織が適用の前にエタノールワイプで拭かれるとき、ｍＲＮＡの局所投与が、組織へのＲＮＡ送達をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介してｍＲＮＡを細胞及び組織に送達する能力を実証する。

【0528】

この実施例において、ｍＲＮＡは、ナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。この実施例において、修飾された直鎖状ｍＲＮＡは、インビトロ転写によって社内で作製された。この実施例において、ＲＮＡは、プソイド－ウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換され、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧでキャップされ、５’及び３’ヒトアルファ－グロビンＵＴＲが含まれ、ポリアデニル化される。

【0529】

次に、ＲＮＡは、ＰＢＳのみ、又はＰＢＳ及び１０％（ｖ／ｖ）エタノール中で希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、３５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、２０ピコモルであった。陰性対照として、溶媒のみの対照が、上記のとおりであるがＲＮＡを伴わずに調製された。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製される。

【0530】

時点＝０で、マウスの耳は、７０％エタノール中に浸された綿のスワブで拭かれ、乾燥され、３５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0531】

組織中のＲＮＡの持続性を判断するため、組織試料は、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して送達後の様々な時点でＲＮＡについて分析された。投与後の１及び４日目に、２ｍｍの耳パンチが各動物から採取され、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０２０）中で保存された。全ＲＮＡは、急冷し、ガラスの乳鉢及び乳棒で液体窒素中において組織をホモジナイズした後、トリゾール抽出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃ １５５９６０２６）によって耳パンチから単離された。水相は、イソプロパノールで沈殿され、ペレットは、製造業者の指示書に従って７０％ ＥＴＯＨで洗浄された。ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ １１７６６５００）を使用して全ＲＮＡから合成された。ＲＴ－ＰＣＲは、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、カタログ＃ １７２５１２４）及びＮＬｕｃ ＯＲＦ（Ｆ：ＣＣＧＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＣＧＧ（配列番号１２）、Ｒ：ＣＡＧＴＧＴＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＧＧＡ（配列番号１３））に特異的なプライマーを使用してｃＤＮＡ鋳型に対して実施された。全ての試料は、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラー上において三つ組でアッセイされた。次に、ＲＮＡレベルが、ハウスキーピング遺伝子（２８ｓ）に対して相対化された。

【0532】

ｍＲＮＡは、局所投与後にＰＢＳのみの中におけるｍＲＮＡについて１日目、及びＰＢＳ＋１０％ ＥｔＯＨ中におけるｍＲＮＡについて１及び４日目に組織試料中で検出され、陰性対照より大きいシグナルを示した（図１１）。

【0533】

この実施例は、ｍＲＮＡが、皮膚が投与の前にエタノールワイプで拭かれるときに局所投与を介して順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続することを実証する。

【0534】

実施例１５：組織が適用の前にイソプロピルアルコールワイプで拭かれるとき、ｍＲＮＡの局所投与が、組織へのＲＮＡ送達をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介してｍＲＮＡを細胞及び組織に送達する能力を実証する。

【0535】

この実施例において、ｍＲＮＡは、ナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。この実施例において、修飾された直鎖状ｍＲＮＡは、インビトロ転写によって社内で作製された。この実施例において、ＲＮＡは、プソイド－ウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換され、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧでキャップされ、５’及び３’ヒトアルファ－グロビンＵＴＲが含まれ、ポリアデニル化される。

【0536】

次に、ＲＮＡは、ＰＢＳのみの中において希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、３５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、２０ピコモルであった。陰性対照として、溶媒のみの対照が、上記のとおりであるがＲＮＡを伴わずに調製された。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製される。

【0537】

時点＝０で、マウスの耳は、市販のイソプロピルアルコールワイプ（ＣＶＳ、２９７５８４）で拭かれ、乾燥され、３５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0538】

組織中のＲＮＡの持続性を判断するため、組織試料は、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して送達後の様々な時点でＲＮＡについて分析された。投与後の１及び４日目に、２ｍｍの耳パンチが各動物から採取され、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０２０）中で保存された。全ＲＮＡは、急冷し、ガラスの乳鉢及び乳棒で液体窒素中において組織をホモジナイズした後、トリゾール抽出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃ １５５９６０２６）によって耳パンチから単離された。水相は、イソプロパノールで沈殿され、ペレットは、製造業者の指示書に従って７０％ ＥＴＯＨで洗浄された。ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ １１７６６５００）を使用して全ＲＮＡから合成された。ＲＴ－ＰＣＲは、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、カタログ＃ １７２５１２４）及びＮＬｕｃ ＯＲＦ（Ｆ：ＣＣＧＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＣＧＧ（配列番号１２）、Ｒ：ＣＡＧＴＧＴＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＧＧＡ（配列番号１３））に特異的なプライマーを使用してｃＤＮＡ鋳型に対して実施された。全ての試料は、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラー上において三つ組でアッセイされた。次に、ＲＮＡレベルが、ハウスキーピング遺伝子（２８ｓ）に対して相対化された。

【0539】

ｍＲＮＡは、局所投与後の１及び４日目に組織試料中で検出され、陰性対照より大きいシグナルを示した（図１２）。

【0540】

この実施例は、ｍＲＮＡが、皮膚が投与の前にイソプロピルアルコールワイプで拭かれるときに局所投与を介して順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続することを実証する。

【0541】

実施例１６：組織が適用の前にエタノールワイプで拭かれるとき、環状ＲＮＡの局所投与が、組織へのＲＮＡ送達をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介して未修飾の環状ＲＮＡを細胞及び組織に送達する能力を実証する。

【0542】

この実施例において、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。

【0543】

環状ＲＮＡは、インビトロで生成された。未修飾の直鎖状ＲＮＡは、上で列挙される全てのモチーフ、及び転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された。転写されたＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製され、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理され、ＲＮＡ精製カラムで再び精製された。ＲｐｐＨ処理された直鎖状ＲＮＡは、スプリントＤＮＡ（５’－ＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１１））及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化された。環状ＲＮＡは、尿素－ＰＡＧＥで精製され、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶出され、エタノール沈殿され、ＲＮＡ保管溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁された。

【0544】

次に、ＲＮＡは、ＰＢＳのみ、又は１０％（ｖ／ｖ）エタノールを含むＰＢＳ中のいずれかで希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、３５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、２０ｐモルであった。陰性対照として、溶媒のみの対照が、上記のとおりであるがＲＮＡを伴わずに調製された。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製される。

【0545】

時点＝０で、マウスの耳は、エタノールワイプで拭かれ、乾燥され、３５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0546】

組織中のＲＮＡの持続性を判断するため、組織試料は、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して送達後の様々な時点でＲＮＡについて分析された。投与後の１及び４日目に、２ｍｍの耳パンチが各動物から採取され、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０２０）中で保存された。全ＲＮＡは、急冷し、ガラスの乳鉢及び乳棒で液体窒素中において組織をホモジナイズした後、トリゾール抽出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃ １５５９６０２６）によって耳パンチから単離された。水相は、イソプロパノールで沈殿され、ペレットは、製造業者の指示書に従って７０％ ＥＴＯＨで洗浄された。ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ １１７６６５００）を使用して全ＲＮＡから合成された。ＲＴ－ＰＣＲは、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、カタログ＃ １７２５１２４）及びＮＬｕｃ ＯＲＦ（Ｆ：ＣＣＧＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＣＧＧ（配列番号１２）、Ｒ：ＣＡＧＴＧＴＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＧＧＡ（配列番号１３））に特異的なプライマーを使用してｃＤＮＡ鋳型に対して実施された。全ての試料は、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラー上において三つ組でアッセイされた。次に、ＲＮＡレベルが、ハウスキーピング遺伝子（２８ｓ）に対して相対化された。

【0547】

環状ＲＮＡは、エタノールワイプで皮膚を拭いた後の局所投与後にＰＢＳのみの中における環状ＲＮＡについて１日目及び４日目、並びにＰＢＳ＋１０％ ＥｔＯＨ中における環状ＲＮＡについて１日目に組織試料中で検出され、適切な溶媒のみの対照より大きいシグナルを示した（図１３）。

【0548】

この実施例は、環状ＲＮＡが、皮膚が投与の前にエタノールワイプで拭かれるときに局所投与を介して順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続することを実証する。

【0549】

実施例１７：環状ＲＮＡの局所投与は、組織へのＲＮＡ送達をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介して未修飾の環状ＲＮＡを細胞及び組織に送達する能力を実証する。

【0550】

この実施例において、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。

【0551】

環状ＲＮＡは、インビトロで生成された。未修飾の直鎖状ＲＮＡは、上で列挙される全てのモチーフ、及び転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された。転写されたＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製され、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理され、ＲＮＡ精製カラムで再び精製された。ＲｐｐＨ処理された直鎖状ＲＮＡは、スプリントＤＮＡ（５’－ＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１１））及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化された。環状ＲＮＡは、尿素－ＰＡＧＥで精製され、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶出され、エタノール沈殿され、ＲＮＡ保管溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁された。

【0552】

次に、ＲＮＡは、１０％（ｖ／ｖ）エタノールを含むＰＢＳ中で希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、３５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、２０ｐモルであった。陰性対照として、溶媒のみの対照が、上記のとおりであるがＲＮＡを伴わずに調製された。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製された。

【0553】

時点＝０で、３５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0554】

組織中のＲＮＡの持続性を判断するため、組織試料は、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して送達後の様々な時点でＲＮＡについて分析された。投与後の１日目及び４日目に、２ｍｍの耳パンチが各動物から採取され、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０２０）中で保存された。全ＲＮＡは、急冷し、ガラスの乳鉢及び乳棒で液体窒素中において組織をホモジナイズした後、トリゾール抽出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃ １５５９６０２６）によって耳パンチから単離された。水相は、イソプロパノールで沈殿され、ペレットは、製造業者の指示書に従って７０％ ＥＴＯＨで洗浄された。ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ １１７６６５００）を使用して全ＲＮＡから合成された。ＲＴ－ＰＣＲは、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、カタログ＃ １７２５１２４）及びＮＬｕｃ ＯＲＦ（Ｆ：ＣＣＧＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＣＧＧ（配列番号１２）、Ｒ：ＣＡＧＴＧＴＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＧＧＡ（配列番号１３））に特異的なプライマーを使用してｃＤＮＡ鋳型に対して実施された。全ての試料は、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラー上において三つ組でアッセイされた。次に、ＲＮＡレベルが、ハウスキーピング遺伝子（２８ｓ）に対して相対化された。

【0555】

環状ＲＮＡは、局所投与後の１日目及び４日目に組織試料中で検出され、適切な陰性対照より大きいシグナルを示した（図１４）。

【0556】

この実施例は、環状ＲＮＡが、皮膚に対する局所投与を介して組織に順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続することを実証する。

【0557】

実施例１８：環状ＲＮＡの局所投与は、組織へのＲＮＡ送達をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介して未修飾の環状ＲＮＡを細胞及び組織に送達する能力を実証する。

【0558】

この実施例において、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。

【0559】

環状ＲＮＡは、インビトロで生成された。未修飾の直鎖状ＲＮＡは、上で列挙される全てのモチーフ、及び転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された。転写されたＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製され、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理され、ＲＮＡ精製カラムで再び精製された。ＲｐｐＨ処理された直鎖状ＲＮＡは、スプリントＤＮＡ（５’－ＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１１））及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化された。環状ＲＮＡは、尿素－ＰＡＧＥで精製され、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶出され、エタノール沈殿され、ＲＮＡ保管溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁された。

【0560】

次に、ＲＮＡは、１０％（ｖ／ｖ）イソプロピルアルコールを含むＰＢＳ中で希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、３５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、２０ｐモルであった。陰性対照として、溶媒のみの対照が、上記のとおりであるがＲＮＡを伴わずに調製された。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製された。

【0561】

時点＝０で、３５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0562】

組織中のＲＮＡの持続性を判断するため、組織試料は、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して送達後の様々な時点でＲＮＡについて分析された。投与後の１日目及び４日目に、２ｍｍの耳パンチが各動物から採取され、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０２０）中で保存された。全ＲＮＡは、急冷し、ガラスの乳鉢及び乳棒で液体窒素中において組織をホモジナイズした後、トリゾール抽出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃ １５５９６０２６）によって耳パンチから単離された。水相は、イソプロパノールで沈殿され、ペレットは、製造業者の指示書に従って７０％ ＥＴＯＨで洗浄された。ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ １１７６６５００）を使用して全ＲＮＡから合成された。ＲＴ－ＰＣＲは、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、カタログ＃ １７２５１２４）及びＮＬｕｃ ＯＲＦ（Ｆ：ＣＣＧＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＣＧＧ（配列番号１２）、Ｒ：ＣＡＧＴＧＴＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＧＧＡ（配列番号１３））に特異的なプライマーを使用してｃＤＮＡ鋳型に対して実施された。全ての試料は、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラー上において三つ組でアッセイされた。次に、ＲＮＡレベルが、ハウスキーピング遺伝子（２８ｓ）に対して相対化された。

【0563】

環状ＲＮＡは、局所投与後の１日目及び４日目に組織試料中で検出され、適切な陰性対照より大きいシグナルを示した（図１５）。

【0564】

この実施例は、環状のＲＮＡが、皮膚に対する局所投与を介して組織に順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続することを実証する。

【0565】

実施例１９：組織が適用の前にイソプロピルアルコールワイプで拭かれるとき、環状ＲＮＡの局所投与が、組織へのＲＮＡ送達をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介して未修飾の環状ＲＮＡを細胞及び組織に送達する能力を実証する。

【0566】

この実施例において、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。

【0567】

環状ＲＮＡは、インビトロで生成された。未修飾の直鎖状ＲＮＡは、上で列挙される全てのモチーフ、及び転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された。転写されたＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製され、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理され、ＲＮＡ精製カラムで再び精製された。ＲｐｐＨ処理された直鎖状ＲＮＡは、スプリントＤＮＡ（５’－ＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１１））及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化した。環状ＲＮＡは、尿素－ＰＡＧＥで精製され、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶出され、エタノール沈殿され、ＲＮＡ保管溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁された。

【0568】

次に、ＲＮＡは、ＰＢＳのみの中において希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、３５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、２０ｐモルであった。陰性対照として、溶媒のみの対照が、上記のとおりであるがＲＮＡを伴わずに調製された。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製される。

【0569】

時点＝０で、マウスの耳は、イソプロピルアルコールワイプ（ＣＶＳ、２９７５８４）で拭かれ、乾燥され、３５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。陰性対照として、イソプロピルアルコールワイプのみが使用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0570】

組織中のＲＮＡの持続性を判断するため、組織試料は、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して送達後の様々な時点でＲＮＡについて分析された。投与後の１日目及び４日目に、２ｍｍの耳パンチが各動物から採取され、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０２０）中で保存された。全ＲＮＡは、急冷し、ガラスの乳鉢及び乳棒で液体窒素中において組織をホモジナイズした後、トリゾール抽出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃ １５５９６０２６）によって耳パンチから単離された。水相は、イソプロパノールで沈殿され、ペレットは、製造業者の指示書に従って７０％ ＥＴＯＨで洗浄された。ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ １１７６６５００）を使用して全ＲＮＡから合成された。ＲＴ－ＰＣＲは、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、カタログ＃ １７２５１２４）及びＮＬｕｃ ＯＲＦ（Ｆ：ＣＣＧＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＣＧＧ（配列番号１２）、Ｒ：ＣＡＧＴＧＴＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＧＧＡ（配列番号１３））に特異的なプライマーを使用してｃＤＮＡ鋳型に対して実施された。全ての試料は、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラー上において三つ組でアッセイされた。次に、ＲＮＡレベルが、ハウスキーピング遺伝子（２８ｓ）に対して相対化された。

【0571】

環状ＲＮＡは、局所投与後の１日目及び４日目に組織試料中で検出され、溶媒のみの対照より大きいシグナルを示した（図１６）。

【0572】

この実施例は、環状のＲＮＡが、イソプロピルアルコールワイプで皮膚を拭いた後に局所投与を介して組織に順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続することを実証する。

【0573】

実施例２０：直鎖状ｍＲＮＡの局所投与は、組織へのＲＮＡ送達をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介してｍＲＮＡを細胞及び組織に送達する能力を実証する。

【0574】

この実施例において、ｍＲＮＡは、ナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。この実施例において、修飾された直鎖状ｍＲＮＡは、インビトロ転写によって社内で作製された。この実施例において、ＲＮＡは、プソイド－ウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換され、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧでキャップされ、５’及び３’ヒトアルファ－グロビンＵＴＲが含まれ、ポリアデニル化される。

【0575】

ＲＮＡは、（１）ＰＢＳのみ、（２）１０％（ｖ／ｖ）エタノールを含むＰＢＳ、（３）１０％（ｖ／ｖ）イソプロピルアルコールを含むＰＢＳ中で希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、３５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、２０ｐモルであった。陰性対照として、溶媒のみの対照が、上記のとおりであるがＲＮＡを伴わずに調製された。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製される。

【0576】

時点＝０で、３５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0577】

組織中のＲＮＡの持続性を判断するため、組織試料は、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して送達後の様々な時点でＲＮＡについて分析された。投与後の１日目及び４日目に、２ｍｍの耳パンチが各動物から採取され、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０２０）中で保存された。全ＲＮＡは、急冷し、ガラスの乳鉢及び乳棒で液体窒素中において組織をホモジナイズした後、トリゾール抽出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃ １５５９６０２６）によって耳パンチから単離された。水相は、イソプロパノールで沈殿され、ペレットは、製造業者の指示書に従って７０％ ＥＴＯＨで洗浄された。ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ １１７６６５００）を使用して全ＲＮＡから合成された。ＲＴ－ＰＣＲは、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、カタログ＃ １７２５１２４）及びＮＬｕｃ ＯＲＦ（Ｆ：ＣＣＧＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＣＧＧ（配列番号１２）、Ｒ：ＣＡＧＴＧＴＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＧＧＡ（配列番号１３））に特異的なプライマーを使用してｃＤＮＡ鋳型に対して実施された。全ての試料は、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラー上において三つ組でアッセイされた。次に、ＲＮＡレベルが、ハウスキーピング遺伝子（２８ｓ）に対して相対化された。

【0578】

ｍＲＮＡは、局所投与後にＰＢＳのみの中におけるｍＲＮＡについて１日目、及びＰＢＳ＋１０％ ＥｔＯＨ中におけるｍＲＮＡ及びＰＢＳ＋１０％ ｉＰｒＯＨ中におけるｍＲＮＡの両方について１日目及び４日目に組織試料中で検出され、適切な陰性対照より大きいシグナルを示した（図１７）。

【0579】

この実施例は、ｍＲＮＡが、皮膚に対する局所投与を介して組織に順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続することを実証する。

【0580】

実施例２１：組織が適用の前にエタノールワイプで拭かれるとき、環状ＲＮＡの局所投与が、組織中のタンパク質発現をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介して未修飾の環状ＲＮＡを細胞及び組織に送達し、その後のタンパク質発現を達成する能力を実証する。

【0581】

この実施例において、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。

【0582】

環状ＲＮＡは、インビトロで生成された。未修飾の直鎖状ＲＮＡは、上で列挙される全てのモチーフ、及び転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された。転写されたＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製され、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理され、ＲＮＡ精製カラムで再び精製された。ＲｐｐＨ処理された直鎖状ＲＮＡは、スプリントＤＮＡ（５’－ＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１１））及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化された。環状ＲＮＡは、尿素－ＰＡＧＥで精製され、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶出され、エタノール沈殿され、ＲＮＡ保管溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁された。

【0583】

次に、ＲＮＡは、ＰＢＳのみの中において希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、３５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、２０ｐモルであった。溶媒のみの対照試料は、同様であるがＲＮＡを伴わずに調製された。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製された。

【0584】

時点＝０で、マウスの耳は、エタノールワイプで拭かれ、乾燥され、３５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0585】

組織中のＲＮＡ発現を判断するため、組織試料は、局所送達後の様々な時点でＮＬｕｃ活性について分析された。耳パンチは、送達後の４日目にマウスから採取された。各組織試料は、断片に粉砕され、１×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む５０μＬの氷冷ＮＬｕｃ溶解アッセイ緩衝液中に置かれ、氷上に置かれた。次に、試料を、オービタルシェーカー上で７００ｒｐｍにて５分間インキュベートし、続いて室温で遠心分離して、組織細片を除去した。次に、５０ｕＬの上清は、組織ペレットをかき混ぜることなく新しいチューブに移された。５０μＬの各試料は、９６ウェルプレートに移され、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｎ１１１０）アッセイは、製造業者に従って実施された。要するに、１ｕＬのフリマジン基質及び４９ｕＬのＰＢＳが、各ウェルに加えられ、混合された。プレートは、基質添加及び混合の後に１０分間インキュベートされ、続いてルミノメーター機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で読み取られた。

【0586】

ナノルシフェラーゼ活性は、ＰＢＳのみの中における環状ＲＮＡについて局所適用後の４日目に組織試料中で検出され、適切な溶媒のみの対照より高く観察された（図１８）。

【0587】

この実施例は、環状ＲＮＡが、局所投与を介して順調に送達され、長期間組織中で検出可能な機能性タンパク質を発現することができたことを実証した。

【0588】

実施例２２：環状ＲＮＡの局所投与は、組織中でタンパク質発現をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介して未修飾の環状ＲＮＡを細胞及び組織に送達し、その後のタンパク質発現を達成する能力を実証する。

【0589】

この実施例において、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。

【0590】

環状ＲＮＡは、インビトロで生成された。未修飾の直鎖状ＲＮＡは、上で列挙される全てのモチーフ、及び転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された。転写されたＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製され、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理され、ＲＮＡ精製カラムで再び精製された。ＲｐｐＨ処理された直鎖状ＲＮＡは、スプリントＤＮＡ（５’－ＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１１））及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化された。環状ＲＮＡは、尿素－ＰＡＧＥで精製され、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶出され、エタノール沈殿され、ＲＮＡ保管溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁された。

【0591】

次に、ＲＮＡは、１０％（ｖ／ｖ）エタノールを含むＰＢＳ中で希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、３５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、２０ｐモルであった。陰性対照として、溶媒のみの対照が、上記のとおりであるがＲＮＡを伴わずに調製された。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製された。

【0592】

時点＝０で、３５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0593】

組織中のＲＮＡ発現を判断するため、組織試料は、局所送達後の様々な時点でＮＬｕｃ活性について分析された。耳パンチは、送達後の４日目にマウスから採取された。各組織試料は、断片に粉砕され、１×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む５０μＬの氷冷ＮＬｕｃ溶解アッセイ緩衝液中に置かれ、氷上に置かれた。次に、試料を、オービタルシェーカー上で７００ｒｐｍにて５分間インキュベートし、続いて室温で遠心分離して、組織細片を除去した。次に、５０ｕＬの上清は、組織ペレットをかき混ぜることなく新しいチューブに移された。５０μＬの各試料は、９６ウェルプレートに移され、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｎ１１１０）アッセイは、製造業者に従って実施された。要するに、１ｕＬのフリマジン基質及び４９ｕＬのＰＢＳが、各ウェルに加えられ、混合された。プレートは、基質添加及び混合の後に１０分間インキュベートされ、続いてルミノメーター機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で読み取られた。

【0594】

ナノルシフェラーゼ活性は、１０％エタノール（ｖ／ｖ）を含むＰＢＳ中における環状ＲＮＡについて局所投与後の４日目に組織試料中で検出され、適切な溶媒のみの対照より高く観察された（図１９）。

【0595】

この実施例は、環状ＲＮＡが、局所投与を介して順調に送達され、長期間組織中で検出可能な機能性タンパク質を発現することができたことを実証した。

【0596】

実施例２３：環状ＲＮＡの局所投与は、組織中でタンパク質発現をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介して未修飾の環状ＲＮＡを細胞及び組織に送達し、その後のタンパク質発現を達成する能力を実証する。

【0597】

この実施例において、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。

【0598】

環状ＲＮＡは、インビトロで生成された。未修飾の直鎖状ＲＮＡは、上で列挙される全てのモチーフ、及び転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写された。転写されたＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製され、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理され、ＲＮＡ精製カラムで再び精製された。ＲｐｐＨ処理された直鎖状ＲＮＡは、スプリントＤＮＡ（５’－ＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１１））及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化されることになる。環状ＲＮＡは、尿素－ＰＡＧＥで精製され、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶出され、エタノール沈殿され、ＲＮＡ保管溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁された。

【0599】

次に、ＲＮＡは、１０％（ｖ／ｖ）イソプロピルアルコールを含むＰＢＳ中で希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、３５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、２０ｐモルであった。陰性対照として、溶媒のみの対照が、上記のとおりであるがＲＮＡを伴わずに調製された。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製された。

【0600】

時点＝０で、３５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0601】

組織中のＲＮＡ発現を判断するため、組織試料は、局所送達後の様々な時点でＮＬｕｃ活性について分析された。耳パンチは、送達後の４日目にマウスから採取された。各組織試料は、断片に粉砕され、１×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む５０μＬの氷冷ＮＬｕｃ溶解アッセイ緩衝液中に置かれ、氷上に置かれた。次に、試料を、オービタルシェーカー上で７００ｒｐｍにて５分間インキュベートし、続いて室温で遠心分離して、組織細片を除去した。次に、５０ｕＬの上清は、組織ペレットをかき混ぜることなく新しいチューブに移された。５０μＬの各試料は、９６ウェルプレートに移され、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｎ１１１０）アッセイは、製造業者に従って実施された。要するに、１ｕＬのフリマジン基質及び４９ｕＬのＰＢＳが、各ウェルに加えられ、混合された。プレートは、基質添加及び混合の後に１０分間インキュベートされ、続いてルミノメーター機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で読み取られた。

【0602】

ナノルシフェラーゼ活性は、１０％イソプロピルアルコールを含むＰＢＳ中における環状ＲＮＡについて局所適用後の４日目に組織試料中で検出され、適切な溶媒のみの対照より高く観察された（図２０）。

【0603】

この実施例は、環状ＲＮＡが、局所投与を介して順調に送達され、長期間組織中で検出可能な機能性タンパク質を発現することができたことを実証した。

【0604】

実施例２４：直鎖状ｍＲＮＡの局所投与は、組織へのＲＮＡ送達及びその後のタンパク質発現をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介してｍＲＮＡを細胞及び組織に送達し、その後のタンパク質発現を達成する能力を実証する。

【0605】

この実施例において、ｍＲＮＡは、ナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。この実施例において、修飾された直鎖状ｍＲＮＡは、インビトロ転写によって社内で作製された。この実施例において、ＲＮＡは、プソイド－ウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換され、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧでキャップされ、５’及び３’ヒトアルファ－グロビンＵＴＲが含まれ、ポリアデニル化される。

【0606】

ＲＮＡは、１０％（ｖ／ｖ）エタノールを含むＰＢＳ中で希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、３５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、２０ｐモルであった。陰性対照として、溶媒のみの対照が、上記のとおりであるがＲＮＡを伴わずに調製された。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製される。

【0607】

時点＝０で、マウスの耳は、エタノールワイプで拭かれ、乾燥され、３５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0608】

組織中のＲＮＡ発現を判断するため、組織試料は、局所送達後の様々な時点でＮＬｕｃ活性について分析された。耳パンチは、送達後の４日目にマウスから採取された。各組織試料は、断片に粉砕され、１×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む５０μＬの氷冷ＮＬｕｃ溶解アッセイ緩衝液中に置かれ、氷上に置かれた。次に、試料を、オービタルシェーカー上で７００ｒｐｍにて５分間インキュベートし、続いて室温で遠心分離して、組織細片を除去した。次に、５０ｕＬの上清は、組織ペレットをかき混ぜることなく新しいチューブに移された。５０μＬの各試料は、９６ウェルプレートに移され、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｎ１１１０）アッセイは、製造業者に従って実施された。要するに、１ｕＬのフリマジン基質及び４９ｕＬのＰＢＳが、各ウェルに加えられ、混合された。プレートは、基質添加及び混合の後に１０分間インキュベートされ、続いてルミノメーター機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で読み取られた。

【0609】

ナノルシフェラーゼ活性は、１０％エタノールを含むＰＢＳ中における環状ＲＮＡについて局所適用後の４日目に組織試料中で検出され、各場合において、適切な溶媒のみの対照より高く観察された（図２１）。

【0610】

この実施例は、ｍＲＮＡが、皮膚が投与の前にエタノールワイプで拭かれるときに局所投与を介して皮膚に順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続し、機能性タンパク質を発現できることを実証する。

【0611】

実施例２５：直鎖状ｍＲＮＡの局所投与は、組織へのＲＮＡ送達及びその後のタンパク質発現をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介してｍＲＮＡを細胞及び組織に送達し、その後のタンパク質発現を達成する能力を実証する。

【0612】

この実施例において、ｍＲＮＡは、ナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計された。この実施例において、修飾された直鎖状ｍＲＮＡは、インビトロ転写によって社内で作製された。この実施例において、ＲＮＡは、プソイド－ウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換され、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧでキャップされ、５’及び３’ヒトアルファ－グロビンＵＴＲが含まれ、ポリアデニル化される。

【0613】

ＲＮＡは、（１）ＰＢＳのみ、又は（２）１０％（ｖ／ｖ）イソプロピルアルコールを含むＰＢＳ中で希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、３５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、２０ｐモルであった。陰性対照として、溶媒のみの対照が、上記のとおりであるがＲＮＡを伴わずに調製された。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製される。

【0614】

時点＝０で、３５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用された。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥された。マウスは、標準的な条件下のケージに戻された。

【0615】

組織中のＲＮＡ発現を判断するため、組織試料は、局所送達後の様々な時点でＮＬｕｃ活性について分析された。耳パンチは、送達後の４日目にマウスから採取された。各組織試料は、断片に粉砕され、１×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む５０μＬの氷冷ＮＬｕｃ溶解アッセイ緩衝液中に置かれ、氷上に置かれた。次に、試料を、オービタルシェーカー上で７００ｒｐｍにて５分間インキュベートし、続いて室温で遠心分離して、組織細片を除去した。次に、５０ｕＬの上清は、組織ペレットをかき混ぜることなく新しいチューブに移された。５０μＬの各試料は、９６ウェルプレートに移され、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｎ１１１０）アッセイは、製造業者に従って実施された。要するに、１ｕＬのフリマジン基質及び４９ｕＬのＰＢＳが、各ウェルに加えられ、混合された。プレートは、基質添加及び混合の後に１０分間インキュベートされ、続いてルミノメーター機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で読み取られた。

【0616】

ナノルシフェラーゼ活性は、ＰＢＳのみの中における直鎖状ｍＲＮＡ、及び１０％イソプロピルアルコールを含むＰＢＳ中における直鎖状ｍＲＮＡについて局所適用後の４日目に組織試料中で検出され、各場合において、適切な溶媒のみの対照より高く観察された（図２２及び図２３）。

【0617】

この実施例は、ｍＲＮＡが、皮膚に対する局所投与を介して組織に順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続し、機能性タンパク質を発現できることを実証する。

【0618】

実施例２６：組織が適用の前にポビドンヨウ素で拭かれるとき、環状ＲＮＡの局所投与が、組織へのＲＮＡ送達をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介して未修飾の環状ＲＮＡを細胞及び組織に送達する能力を記載する。

【0619】

この実施例において、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計される。

【0620】

環状ＲＮＡは、インビトロで生成される。未修飾の直鎖状ＲＮＡは、上で列挙される全てのモチーフ、及び転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写される。転写されたＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製され、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理され、ＲＮＡ精製カラムで再び精製される。ＲｐｐＨ処理された直鎖状ＲＮＡは、スプリントＤＮＡ（５’－ＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１１））及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化される。環状ＲＮＡは、尿素－ＰＡＧＥで精製され、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶出され、エタノール沈殿され、ＲＮＡ保管溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁される。

【0621】

次に、ＲＮＡは、ＰＢＳのみの中において希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、３５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、２０ｐモルである。陰性対照として、溶媒のみの対照が、上記のとおりであるがＲＮＡを伴わずに調製される。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製される。

【0622】

時点＝０で、マウスの耳は、殺菌剤である市販のポビドンヨウ素（１０％）で拭かれる。過剰なポビドンヨウ素は、無菌綿スワブで除去され、３５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用される。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥される。マウスは、標準的な条件下のケージに戻される。

【0623】

組織中のＲＮＡの持続性を判断するため、組織試料は、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して送達後の様々な時点でＲＮＡについて分析される。投与後の１日目及び４日目に、２ｍｍの耳パンチが各動物から採取され、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０２０）中で保存される。全ＲＮＡは、急冷し、ガラスの乳鉢及び乳棒で液体窒素中において組織をホモジナイズした後、トリゾール抽出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃ １５５９６０２６）によって耳パンチから単離される。水相は、イソプロパノールで沈殿され、ペレットは、製造業者の指示書に従って７０％ ＥＴＯＨで洗浄される。ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ １１７６６５００）を使用して全ＲＮＡから合成される。ＲＴ－ＰＣＲは、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、カタログ＃ １７２５１２４）及びＮＬｕｃ ＯＲＦ（Ｆ：ＣＣＧＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＣＧＧ（配列番号１２）、Ｒ：ＣＡＧＴＧＴＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＧＧＡ（配列番号１３））に特異的なプライマーを使用してｃＤＮＡ鋳型に対して実施される。全ての試料は、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラー上において三つ組でアッセイされる。次に、ＲＮＡレベルが、ハウスキーピング遺伝子（２８ｓ）に対して相対化される。

【0624】

環状ＲＮＡは、局所投与後の１日目及び４日目に組織試料中で検出され、溶媒のみの対照より大きいシグナルが観察されると予想される。

【0625】

この実施例は、環状ＲＮＡが、ポビドンヨウ素（１０％）で皮膚を拭いた後に局所投与を介して組織に順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続することを記載する。

【0626】

実施例２７：組織が適用の前に過酸化水素スプレーで噴霧されるとき、環状ＲＮＡの局所投与は、組織へのＲＮＡ送達をもたらす
この実施例は、インビボでの局所投与を介して未修飾の環状ＲＮＡを細胞及び組織に送達する能力を記載する。

【0627】

この実施例において、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ及びナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）をコードするＯＲＦとともに設計される。

【0628】

環状ＲＮＡは、インビトロで生成される。未修飾の直鎖状ＲＮＡは、上で列挙される全てのモチーフ、及び転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写される。転写されたＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮＡ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製され、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理され、ＲＮＡ精製カラムで再び精製される。ＲｐｐＨ処理された直鎖状ＲＮＡは、スプリントＤＮＡ（５’－ＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’（配列番号１１））及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用して環状化されることになる。環状ＲＮＡは、尿素－ＰＡＧＥで精製され、緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で溶出され、エタノール沈殿され、ＲＮＡ保管溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０００）中で再懸濁される。

【0629】

次に、ＲＮＡは、ＰＢＳのみの中において希釈され、その結果、各試料についての全体の試料体積は、３５ｕＬであり、各試料についての全ＲＮＡは、２０ｐモルである。陰性対照として、溶媒のみの対照が、上記のとおりであるがＲＮＡを伴わずに調製される。全ての試薬は、混合の前に室温にされ、混合物は、使用の直前に調製される。

【0630】

時点＝０で、マウスの耳は、殺菌剤である市販の過酸化水素（３％）で噴霧され、無菌綿スワブで乾燥され、３５μＬ用量の各試料が、ピペットチップを使用してＢＡＬＢ／ｃマウスの耳に滴下して局所的に適用される。試料は、滅菌されたフード中において耳を赤外線灯及び送風機に短時間曝すことによって乾燥される。マウスは、標準的な条件下のケージに戻される。

【0631】

組織中のＲＮＡの持続性を判断するため、組織試料は、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して送達後の様々な時点でＲＮＡについて分析される。投与後の１日目及び４日目に、２ｍｍの耳パンチが各動物から採取され、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ ＡＭ７０２０）中で保存される。全ＲＮＡは、急冷し、ガラスの乳鉢及び乳棒で液体窒素中において組織をホモジナイズした後、トリゾール抽出（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃ １５５９６０２６）によって耳パンチから単離される。水相は、イソプロパノールで沈殿され、ペレットは、製造業者の指示書に従って７０％ ＥＴＯＨで洗浄される。ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ＃ １１７６６５００）を使用して全ＲＮＡから合成される。ＲＴ－ＰＣＲは、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、カタログ＃ １７２５１２４）及びＮＬｕｃ ＯＲＦ（Ｆ：ＣＣＧＴＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＣＧＧ（配列番号１２）、Ｒ：ＣＡＧＴＧＴＧＣＣＡＴＡＧＴＧＣＡＧＧＡ（配列番号１３））に特異的なプライマーを使用してｃＤＮＡ鋳型に対して実施される。全ての試料は、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４サーマルサイクラー上において三つ組でアッセイされる。次に、ＲＮＡレベルが、ハウスキーピング遺伝子（２８ｓ）に対して相対化される。

【0632】

環状ＲＮＡは、局所投与後の１日目及び４日目に組織試料中で検出され、溶媒のみの対照より大きいシグナルが観察されると予想される。

【0633】

この実施例は、環状ＲＮＡが、過酸化水素（３％）で皮膚を噴霧した後に局所投与を介して組織に順調に送達され、長期間にわたって組織中で持続することを記載する。

【0634】

本明細書では、本発明の好ましい実施形態が示され且つ記載されているが、そのような実施形態が例示としてのみ提供されていることは、当業者に明らかであろう。ここで、多数の変形形態、変更、及び置換が、本発明を逸脱することなく当業者に見出されることになる。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替物は、本発明の実施に採用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造、並びにそれらの均等物はそれによって包含されることが意図される。

【0635】

配列
ナノルシフェラーゼＤＮＡ鋳型
配列番号１

【化1】

【0636】

ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
配列番号２

【化2】

【0637】

ガウシアルシフェラーゼＤＮＡ鋳型
配列番号３

【化3】

【0638】

ＥＰＯ ＤＮＡ鋳型
配列番号４

【化4】

【0639】

ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ ＤＮＡ鋳型
配列番号５

【化5】

【0640】

緑色蛍光タンパク質ＤＮＡ鋳型
配列番号６

【化6】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

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