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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-24
(45)【発行日】2024-08-01
(54)【発明の名称】新規ガンマ線照射処理物
(51)【国際特許分類】
C08B 37/00 20060101AFI20240725BHJP
C12P 19/04 20060101ALI20240725BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20240725BHJP
A61K 41/00 20200101ALI20240725BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240725BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240725BHJP
A61K 8/9722 20170101ALI20240725BHJP
A61K 8/73 20060101ALI20240725BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240725BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20240725BHJP
A61K 31/736 20060101ALI20240725BHJP
A61K 36/05 20060101ALN20240725BHJP
【ＦＩ】
C08B37/00 P
C12P19/04 Z
A23L33/10
A61K41/00
A61P43/00 111
A61P17/00
A61K8/9722
A61K8/73
A61Q19/00
A61Q19/08
A61K31/736
A61K36/05
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020060276
(22)【出願日】2020-03-30
(65)【公開番号】P2021155388
(43)【公開日】2021-10-07
【審査請求日】2022-12-14
(73)【特許権者】
【識別番号】591145335
【氏名又は名称】パナック株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100112874
【弁理士】
【氏名又は名称】渡邊 薫
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 剛毅
(72)【発明者】
【氏名】大木 利哉
(72)【発明者】
【氏名】小出 昌弘
(72)【発明者】
【氏名】安部 覚
(72)【発明者】
【氏名】木下 八州子
(72)【発明者】
【氏名】竹村 美香
【審査官】澤田 浩平
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１８－１９３４４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－２１６７５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１４－１０５２０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１４－０２５０３５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｌ，Ａ６１Ｋ，Ａ６１Ｐ，Ａ６１Ｑ，
Ｃ０８Ｂ，Ｃ１２Ｐ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物。
【請求項2】
前記多糖体のガンマ線照射処理物が、重量平均分子量１０，０００未満の分子量分布を有し、当該分布領域の割合が５０％以上である、請求項１記載のガンマ線照射処理物。
【請求項3】
前記多糖体のガンマ線照射処理物が、重量分子量１，０００以上１０，０００未満と、重量分子量１，０００未満の分子量分布とを少なくとも有し、それぞれの分布領域の割合が４５～６５％と１０～３０％とである、請求項１又は２記載のガンマ線照射処理物。
【請求項4】
前記ガンマ線照射が、照射強度１～１０００ｋＧｙでの照射である、請求項１～３の何れか一項に記載のガンマ線照射処理物。
【請求項5】
前記パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体が、多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースとで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体である、請求項１～４の何れか一項に記載のガンマ線照射処理物。
【請求項6】
前記パラクロレラ属単細胞緑藻類が、パラクロレラ属ケッセリである、請求項１～５の何れか一項に記載のガンマ線照射処理物。
【請求項7】
請求項１～６の何れか一項に記載のパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物を含む、組成物。
【請求項8】
前記組成物が、ヒアルロン酸産生促進用組成物又は皮膚外用剤である、請求項７記載の組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本技術は、新規ガンマ線照射処理物、及びこれを含む組成物などに関する。
【背景技術】
【0002】
ヒアルロン酸は、体組織への親和性を保つ多糖体の一種であり、グリコサミノグリカンに分類され、Ｎ－アセチルグルコサミンとＤ－グルクロン酸（－３）ＧｌｃＮＡｃβ（１－４）ＧｌｃＡβ（１－）が直鎖上に連結している酸性多糖体である。このヒアルロン酸は、例えば、眼の硝子体、ヘソの緒、皮膚、関節液などの結合組織に広く存在し、血管浸透性にも関与している。特に、ヒアルロン酸は、皮膚に多く存在し、細胞外マトリックスとして重要な役割を果たしている。このため、ヒアルロン酸は、肌のハリや弾力性、潤いなどに深く関与し、ヒアルロン酸の産生量が加齢や日焼けなどによって減少した場合には、乾燥肌、肌荒れ、シミ、シワなどの症状につながる。
【0003】
例えば、特許文献１では、レバン組成物を有効成分とする、ヒアルロン酸産生促進用組成物が提案されている。このレバンは、イネ科やユリ科植物の根などに含まれる多糖体であり、Ｄ－フラクトフラノース残基のみからできているホモ多糖体である。
例えば、特許文献２では、ヒネソールを有効成分とするヒアルロン酸産生促進用組成物が提案されている。このヒネソールは植物に含まれている精油成分（セスキテルペノイド）であり、従来抗コリン作用が知られている。
例えば、特許文献３では、トマトの搾汁液を乳酸菌によって発酵させた乳酸菌発酵物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進用組成物が提案されている。
例えば、特許文献２では、ヒネソールを有効成分とするヒアルロン酸産生促進用組成物が提案されている。このヒネソールは植物に含まれている精油成分（セスキテルペノイド）であり、従来抗コリン作用が知られている。
例えば、特許文献３では、トマトの搾汁液を乳酸菌によって発酵させた乳酸菌発酵物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進用組成物が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２０１９－００６７２５号公報
【文献】特開２０１８－５２８４３号公報
【文献】特開２０１７－１２８５３７号公報
【文献】特開２０１４－２５０３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本技術は、ヒアルロン酸産生促進作用を有する新たな素材を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来の多糖体に着目し、この多糖体のヒアルロン酸産生促進作用について検討を行った。
パラクロレラ属単細胞緑藻類を培養して得られた多糖体には、ヒアルロン酸産生促進作用が認められず、この酸加水分解物にもヒアルロン酸産生促進作用が認められなかった。
パラクロレラ属単細胞緑藻類を培養して得られた多糖体には、ヒアルロン酸産生促進作用が認められず、この酸加水分解物にもヒアルロン酸産生促進作用が認められなかった。
【0007】
しかしながら、本発明者は、さらに鋭意検討した結果、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体に対してガンマ線照射処理を行うことで、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体の新規なガンマ線照射処理物を得、当該ガンマ線照射処理物に、ヒアルロン酸産生促進作用が発現することを、新たに見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【0008】
本技術は、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物を提供する。
本技術は、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物を含む、組成物を提供する。
前記多糖体のガンマ線照射処理物が、重量平均分子量１０，０００未満の分子量分布を有し、当該分布領域の割合が５０％以上であってもよい。
前記多糖体のガンマ線照射処理物が、重量分子量１，０００以上１０，０００未満と、重量分子量１，０００未満の分子量分布とを少なくとも有し、それぞれの分布領域の割合が４５～６５％と１０～３０％とであってもよい。
前記ガンマ線照射が、照射強度１～１０００ｋＧｙでの照射であってもよい。
前記パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体が、多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースとで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体であってもよい
前記パラクロレラ属単細胞緑藻類が、パラクロレラ属ケッセリであってもよい。
前記組成物が、ヒアルロン酸産生促進用組成物又は皮膚外用剤であってもよい。
本技術は、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物を含む、組成物を提供する。
前記多糖体のガンマ線照射処理物が、重量平均分子量１０，０００未満の分子量分布を有し、当該分布領域の割合が５０％以上であってもよい。
前記多糖体のガンマ線照射処理物が、重量分子量１，０００以上１０，０００未満と、重量分子量１，０００未満の分子量分布とを少なくとも有し、それぞれの分布領域の割合が４５～６５％と１０～３０％とであってもよい。
前記ガンマ線照射が、照射強度１～１０００ｋＧｙでの照射であってもよい。
前記パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体が、多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースとで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体であってもよい
前記パラクロレラ属単細胞緑藻類が、パラクロレラ属ケッセリであってもよい。
前記組成物が、ヒアルロン酸産生促進用組成物又は皮膚外用剤であってもよい。
【発明の効果】
【0009】
本技術は、ヒアルロン酸産生促進作用を有する新たな素材を提供することができる。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本明細書に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物におけるＧＰＣ分析の測定結果の図を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本技術を実施するための好適な実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。また、各数値範囲の上限値と下限値は、所望により、任意に組み合わせることができる。
【0012】
＜１．本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物＞
本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体は、以下、「本技術のパラクロレラ多糖体」ともいう。
本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物は、「本技術のガンマ線照射処理物」ともいう。
本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体は、以下、「本技術のパラクロレラ多糖体」ともいう。
本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物は、「本技術のガンマ線照射処理物」ともいう。
【0013】
本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物は、食してもよい単細胞緑藻類を利用した処理物である。このことから、本技術のガンマ線照射処理物は、安全性に優れ、長期間、連続的に投与しても副作用を心配する必要性も少ないため、非常に有用である。さらに、他の成分や他の組成物との併用においても安全性が高い。
本技術の処理物の形態は、液状、流動状、固形状、粉末状などが挙げられるが、特に限定されない。
本技術の処理物の形態は、液状、流動状、固形状、粉末状などが挙げられるが、特に限定されない。
【0014】
本技術におけるパラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物は、ＧＰＣ分析（標品プルラン）において、重量平均分子量１０，０００以上の分子量分布を有し、当該分布領域の割合は特に限定されないが、その好適な下限値は好ましくは１％以上、より好ましくは５％以上、さらに好ましくは１０％以上であり、高分子多糖体によって皮膚表面を保護する観点から、好適である。また、その好適な上限値は、好ましくは５０％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下であり、浸透作用やヒアルロン酸産生促進作用の観点から、好適である。
【0015】
本技術におけるパラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物は、ＧＰＣ分析（標品プルラン）において、重量平均分子量１０，０００未満の分子量分布を有し、当該分布領域の割合は特に限定されないが、その好適な下限値は５０％以上であることが好ましく、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上であり、またその好適な上限値は、好ましくは９５％以下、より好ましくは９０％以下、さらに好ましくは８５％以下である。これにより、皮膚浸透作用やヒアルロン酸産生促進作用が発揮しやすく、本技術の効能を発揮することができる。
【0016】
また、本技術におけるパラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物は、ＧＰＣ分析（標品プルラン）において、重量平均分子量３，０００未満の分子量分布を有し、当該分布領域の割合は特に限定されないが、その好適な下限値が、２０％以上であることが好ましく、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、より好ましくは４５％以上であり、また、その好適な上限値が、好ましくは７０％以下、より好ましくは６５％以下、さらに好ましくは６０％以下である。
【0017】
また、本技術におけるパラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物は、ＧＰＣ分析（標品プルラン）において、重量平均分子量１，０００未満の分子量分布を有し、当該分布領域の割合は特に限定されないが、その好適な下限値が、５％以上であることが好ましく、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上であり、また、その好適な上限値が、好ましくは４０％以下、より好ましくは３５％以下、さらに好ましくは３０％以下である。
【0018】
また、本技術におけるパラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物は、ＧＰＣ分析（標品プルラン）において、重量平均分子量５００未満の分子量分布を有し、当該分布領域の割合は特に限定されないが、その好適な下限値が、１％以上であることが好ましく、より好ましくは３％以上、さらに好ましくは５％以上、より好ましくは８％以上であり、また、その好適な上限値が、好ましくは２５％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下である。
【0019】
また、本技術におけるパラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物は、ＧＰＣ分析（標品プルラン）において、重量平均分子量３，０００以上１０，０００未満の分子量分布を有し、当該分布領域の割合は特に限定されないが、その好適な下限値が、５％以上であることが好ましく、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上であり、また、その好適な上限値が、好ましくは４５％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３５％以下である。
【0020】
また、本技術におけるパラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物は、ＧＰＣ分析（標品プルラン）において、重量平均分子量１，０００以上３，０００未満の分子量分布を有し、当該分布領域の割合は特に限定されないが、その好適な下限値が、５％以上であることが好ましく、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上であり、また、その好適な上限値が、好ましくは４５％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３５％以下である。
【0021】
また、本技術におけるパラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物は、ＧＰＣ分析（標品プルラン）において、重量平均分子量５００以上１，０００未満の分子量分布を有し、当該分布領域の割合は特に限定されないが、その好適な下限値が、１％以上であることが好ましく、より好ましくは３％以上、さらに好ましくは５％以上、より好ましくは８％以上であり、また、その好適な上限値が、好ましくは２５％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下である。
【0022】
本技術において、上述した各重量平均分子量の分布領域の割合と各重量平均分子量の分布領域の割合とを、適宜組み合わせることができる。
前記多糖体のガンマ線照射処理物が、ＧＰＣ分析（標品プルラン）において、重量分子量１，０００以上１０，０００未満と、重量分子量１，０００未満の分子量分布とを少なくとも有し、それぞれの分布領域の割合が４０～７０％と１０～３０％とであることが好適であり、より好適には５５～６５％と１５～２５％とである。本技術における重量分子量１，０００未満の分布領域の処理物は、経皮吸収がされやすい傾向にあり、さらに真皮領域にまで浸透しやすい利点がある。
前記多糖体のガンマ線照射処理物が、ＧＰＣ分析（標品プルラン）において、重量分子量１，０００以上１０，０００未満と、重量分子量１，０００未満の分子量分布とを少なくとも有し、それぞれの分布領域の割合が４０～７０％と１０～３０％とであることが好適であり、より好適には５５～６５％と１５～２５％とである。本技術における重量分子量１，０００未満の分布領域の処理物は、経皮吸収がされやすい傾向にあり、さらに真皮領域にまで浸透しやすい利点がある。
【0023】
＜２．本技術におけるパラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物の製造方法＞
本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物の製造方法として、以下に一例を示すが、本技術は以下の製造方法に限定されない。
本技術のガンマ線照射処理物は、本技術のパラクロレラ多糖体に対して、ガンマ線照射処理を行うことにより、得ることができる。これによりパラクロレラ多糖体の低分子化が可能である。さらに、これにより、ヒアルロン酸産生促進作用や経皮吸収性向上作用を得ることができる。
本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物の製造方法として、以下に一例を示すが、本技術は以下の製造方法に限定されない。
本技術のガンマ線照射処理物は、本技術のパラクロレラ多糖体に対して、ガンマ線照射処理を行うことにより、得ることができる。これによりパラクロレラ多糖体の低分子化が可能である。さらに、これにより、ヒアルロン酸産生促進作用や経皮吸収性向上作用を得ることができる。
【0024】
＜２－１．本技術のパラクロレラ多糖体に対するガンマ線照射処理＞
【0025】
＜２－１－１．本技術のガンマ線照射処理に用いられるパラクロレラ多糖体＞
本技術に用いられるパラクロレラ多糖体は、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来の多糖体であれば特に限定されない。例えば、後述する製造方法（例えば、特許文献４：特開２０１４－２５０３５号公報参照）にて得ることができ、また、市販品のパラクロレラエキス（パナック社製）などを用いてもよい。
本技術に用いられるパラクロレラ多糖体は、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来の多糖体であれば特に限定されない。例えば、後述する製造方法（例えば、特許文献４：特開２０１４－２５０３５号公報参照）にて得ることができ、また、市販品のパラクロレラエキス（パナック社製）などを用いてもよい。
【0026】
パラクロレラ多糖体の形態は、特に限定されず、溶液又は粉末の何れでもよいが、溶液であることが好適であり、当該溶液は、水溶液がより好適である。
【0027】
当該溶液の溶媒は、特に限定されないが、有機溶媒及び／又は水溶媒が好ましく、さらに好ましくは水溶性有機溶媒、水溶媒である。当該水溶性有機溶媒として、例えば低級アルコール（炭素数１～３程度）、多価アルコール類、アセトンなどが挙げられる。当該低級アルコールとして、メタノール、エタノール、ｎ－ブタノールなどが挙げられる。当該多価アルコールとして、１，３－ブチレングリコール、エチレングリコールなどの二価アルコール；グリセリンなどの三価アルコールなどが挙げられる。当該溶媒のうち、これらからなる群から選択される１種又は２種以上を使用することができる。当該溶媒中の水の含有量は、好適には９５質量％以上、より好適には９９質量％以上、さらに好適には１００質量％（すなわち水のみ）である。
【0028】
パラクロレラ多糖体の溶液中の濃度として、特に限定されないが、その好適な下限値として、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０５質量％以上、さらに好ましくは０．１質量％以上であり、また、その好適な上限値として、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下、さらに好ましくは３質量％以下である。当該好適な数値範囲として、より好ましくは０．０５～５質量％、さらに好ましくは０．１～１．０質量％である。
【0029】
＜２－１－２．本技術のガンマ線照射処理条件＞
本技術におけるガンマ線照射処理条件は特に限定されず、ガンマ線照射量（例えば、ガンマ線照射強度、ガンマ線照射線量率、照射時間など）、温度などを適宜調整しながら、多糖体の低分子化を行うことができる。このようにして、本技術のパラクロレラ多糖体に対して、ガンマ線照射を行うことで、本技術のガンマ線照射処理物を得ることができる。
本技術におけるガンマ線照射処理条件は特に限定されず、ガンマ線照射量（例えば、ガンマ線照射強度、ガンマ線照射線量率、照射時間など）、温度などを適宜調整しながら、多糖体の低分子化を行うことができる。このようにして、本技術のパラクロレラ多糖体に対して、ガンマ線照射を行うことで、本技術のガンマ線照射処理物を得ることができる。
【0030】
本技術のガンマ線照射強度（ｋＧｙ）として、特に限定されないが、その好適な下限値として、好ましくは１ｋＧｙ以上、より好ましくは１０ｋＧｙ以上、さらに好ましくは３０ｋＧｙ以上、より好ましくは５０ｋＧｙ以上、より好ましくは６０ｋＧｙ以上であり、また、その好適な上限値として、好ましくは１０００ｋＧｙ以下、より好ましくは５００ｋＧｙ以下、さらに好ましくは２００ｋＧｙ以下、より好ましくは１５０ｋＧｙ以下、より好ましくは１００ｋＧｙ以下、より好ましくは９０ｋＧｙ以下、より好ましくは８５ｋＧｙ以下、より好ましくは８０ｋＧｙ以下である。当該数値範囲として、より好ましくは１～１０００ｋＧｙ、さらに好ましくは１０～５００ｋＧｙ、より好ましくは６０～１００ｋＧｙ、より好ましくは５０～９０ｋＧｙである。
【0031】
本技術のガンマ線照射線量率（ｋＧｙ／ｈｒ）として、特に限定されないが、その好適な下限値として、好ましくは０．１（ｋＧｙ／ｈｒ）以上、より好ましくは１（ｋＧｙ／ｈｒ）以上、さらに好ましくは３（ｋＧｙ／ｈｒ）以上、より好ましくは５（ｋＧｙ／ｈｒ）以上であり、また、その好適な上限値として、好ましくは５０（ｋＧｙ／ｈｒ）以下、より好ましくは３０（ｋＧｙ／ｈｒ）以下、さらに好ましくは２０（ｋＧｙ／ｈｒ）以下、より好ましくは１５（ｋＧｙ／ｈｒ）以下である。当該数値範囲として、より好ましくは０．１～５０（ｋＧｙ／ｈｒ）、さらに好ましくは１～３０（ｋＧｙ／ｈｒ）、よりさらに好ましくは５～１５（ｋＧｙ／ｈｒ）である。
【0032】
本技術のガンマ線照射時間（ｈｒ）として、特に限定されないが、その好適な下限値として、好ましくは１時間以上、より好ましくは３時間以上、さらに好ましくは５時間以上であり、また、その好適な上限値として、好ましくは１００時間以下、好ましくは５０時間以下、好ましくは４０時間以下、好ましくは２０時間以下、より好ましくは１５時間以下、さらに好ましくは１０時間以下である。当該数値範囲として、より好ましくは１～２０時間、さらに好ましくは５～１０時間、よりさらに好ましくは７～８時間である。
【0033】
本技術のガンマ線照射する際の雰囲気の種類として、特に限定されないが、窒素、希ガスなどの不活性ガス；空気、二酸化炭素などが挙げられる。
本技術のガンマ線照射する際の雰囲気の温度として、特に限定されないが、常温（２０～３０℃程度）が好ましく、溶液の場合には水温が２０～３０℃程度の常温が好ましい。
本技術のガンマ線照射する際の雰囲気の温度として、特に限定されないが、常温（２０～３０℃程度）が好ましく、溶液の場合には水温が２０～３０℃程度の常温が好ましい。
【0034】
本技術のパラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物は、適宜、公知の分離・精製技術、例えば液々分液、固液分液、ろ過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂などを用いてもよい。これによって、当該ガンマ線照射処理物から不活性な不純物を除去したり、当該ガンマ線照射処理物を更に所望とする分子量範囲の画分になるように分離・精製してもよい。
【0035】
＜２－２．本技術のパラクロレラ多糖体＞
本技術のガンマ線照射処理に用いられるパラクロレラ多糖体は、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来の多糖体であれば特に限定されない。当該パラクロレラ多糖体は、多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトース（以下「Ｇａｌ」ともいう）とマンノース（以下「Ｍａｎ」ともいう）とを主体として構成されるものが好適である。当該ガラクトースはＤ－Ｇａｌが好ましく、また、当該マンノースはＤ－マンノースが好ましい。当該ガラクトースは、少なくともフラノース型が存在するのがより好適であり、当該多糖体のガラクトースの主体（９割以上）は、Ｄ－ガラクトフラノースであることが好ましい。当該多糖体は、１，５－β－Ｄ－ガラクトフラノースの構造を有することがより好適である。
本技術のガンマ線照射処理に用いられるパラクロレラ多糖体は、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来の多糖体であれば特に限定されない。当該パラクロレラ多糖体は、多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトース（以下「Ｇａｌ」ともいう）とマンノース（以下「Ｍａｎ」ともいう）とを主体として構成されるものが好適である。当該ガラクトースはＤ－Ｇａｌが好ましく、また、当該マンノースはＤ－マンノースが好ましい。当該ガラクトースは、少なくともフラノース型が存在するのがより好適であり、当該多糖体のガラクトースの主体（９割以上）は、Ｄ－ガラクトフラノースであることが好ましい。当該多糖体は、１，５－β－Ｄ－ガラクトフラノースの構造を有することがより好適である。
【0036】
前記マンノースとガラクトースとの糖残基の比率は、特に限定されないが、好適には、マンノースを１としたときに、好ましくはＭａｎ １：Ｇａｌ ２～４、より好ましくはＭａｎ １：Ｇａｌ ２．５～３．５である。
【0037】
前記ガラクトースの含有量は、多糖体の中性単糖組成の全量を１００質量％としたとき（以下、「全中性糖中」とする）に、好ましくは５０～７９質量％であり、より好ましくは６０～７９質量％である。
本開示の多糖体の中性単糖組成は、マンノース及びガラクトースの他に、アラビノース（以下、「Ａｒａ」ともいう）、ラムノース（以下、「Ｒｈａ」ともいう）及びキシロース（以下、「Ｘｙｌ」ともいう）が含まれてもよい。
本開示の多糖体の中性単糖組成は、マンノース及びガラクトースの他に、アラビノース（以下、「Ａｒａ」ともいう）、ラムノース（以下、「Ｒｈａ」ともいう）及びキシロース（以下、「Ｘｙｌ」ともいう）が含まれてもよい。
【0038】
これらの含有量は、多糖体の中性単糖組成の全量を１００質量％としたとき（以下、「全中性糖中」とする）に、好ましくは０～１６質量％、より好ましくは５～１６質量％である。さらに、アラビノース、ラムノース及びキシロースの含有量は、全中性糖中、それぞれ、アラビノース ３～７質量％、ラムノース ２～６質量％、キシロース ０～３質量％であるのが好適である。
このときマンノース及びガラクトースのこれら含有量は、全中性糖中、好ましくは８４～１００質量％である。このマンノースの含有量は、全中性糖中、好ましくは１９～２５質量％であり、またガラクトースの含有量は、全中性糖中、好ましくは６５～７５質量％である。
このときマンノース及びガラクトースのこれら含有量は、全中性糖中、好ましくは８４～１００質量％である。このマンノースの含有量は、全中性糖中、好ましくは１９～２５質量％であり、またガラクトースの含有量は、全中性糖中、好ましくは６５～７５質量％である。
【0039】
本技術のパラクロレラ多糖体の分子量は、特に限定されないが、ＧＰＣ測定において、好ましくは１０４～１０6であり、より好ましくは３～５０×１０４、より好ましくは４～２０×１０４である。
また、本技術のパラクロレラ多糖体は水溶性のものが、様々な分野の用途で利用しやすいので、好適である。
また、本技術のパラクロレラ多糖体は、酸性多糖体の分類に属さいない多糖体（例えば、中性多糖体）であることが好適である。
また、本技術のパラクロレラ多糖体は水溶性のものが、様々な分野の用途で利用しやすいので、好適である。
また、本技術のパラクロレラ多糖体は、酸性多糖体の分類に属さいない多糖体（例えば、中性多糖体）であることが好適である。
【0040】
本技術のパラクロレラ多糖体は、パラクロレラ属単細胞藻類を用いることにより得ることができる。
より好適には、パラクロレラ属単細胞緑藻類を炭素源含有培養培地で好気的な条件下で従属培養し、多糖体を生産することが好適であり、さらに当該多糖体を回収することがより好適であり、当該緑藻類は改変したものでもよい。
前記培養の溶存酸素濃度が、３～１３ｐｐｍであることが好適である。
前記培養後、遠心分離及びろ過を単独で又は２種組み合わせて藻体を除去した後に凍結乾燥し、さらに水溶液に溶解後、水溶性画分を回収することが好適である。
より好適には、パラクロレラ属単細胞緑藻類を炭素源含有培養培地で好気的な条件下で従属培養し、多糖体を生産することが好適であり、さらに当該多糖体を回収することがより好適であり、当該緑藻類は改変したものでもよい。
前記培養の溶存酸素濃度が、３～１３ｐｐｍであることが好適である。
前記培養後、遠心分離及びろ過を単独で又は２種組み合わせて藻体を除去した後に凍結乾燥し、さらに水溶液に溶解後、水溶性画分を回収することが好適である。
【0041】
＜２－３．本技術のパラクロレラ多糖体の製造方法＞
本技術のパラクロレラ多糖体の製造方法は、パラクロレラ多糖体を産生することが可能であれば、その手段は特に限定されないが、細菌や藻類などの微生物又はこの改変体を用いることが好適である。当該改変体とは、本技術のパラクロレラ多糖体を産生することが可能な機能を有する微生物の遺伝子組み換え体、突然変異体などであり、必要に応じて生産性や耐久性などを向上させてもよい。
本技術のパラクロレラ多糖体の製造方法は、パラクロレラ多糖体を産生することが可能であれば、その手段は特に限定されないが、細菌や藻類などの微生物又はこの改変体を用いることが好適である。当該改変体とは、本技術のパラクロレラ多糖体を産生することが可能な機能を有する微生物の遺伝子組み換え体、突然変異体などであり、必要に応じて生産性や耐久性などを向上させてもよい。
【0042】
前記パラクロレラ属単細胞緑藻類は特に限定されないが、このパラクロレラ属のなかで、好ましくはパラクロレラ属ケッセリ（Parachlorella kessreli）である。
当該パラクロレラ属ケッセリは特に限定されないが、このケッセリのなかで、より好ましくはParachlorella kessleri-PNC1株(FERM BP-11493)が好適である。
本技術において、使用する藻株と実質的に同質の藻株であればよい。実質的に同質の藻株とは、その１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、それぞれ９９．５％以上（好適には９９．８％以上、さらに好適には１００％）一致し、かつ好ましくは上述した藻株と同一の藻類学的性質（形態観察及び細胞外多糖体産生）を有する。さらに本技術の藻株は、本技術の効果（特に本技術のパラクロレラ多糖体の産生能）を同など程度以上に有する限り、上述した藻株又はそれと実質的に同質の藻株から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択などによって育種された藻株であってもよい。
当該パラクロレラ属ケッセリは特に限定されないが、このケッセリのなかで、より好ましくはParachlorella kessleri-PNC1株(FERM BP-11493)が好適である。
本技術において、使用する藻株と実質的に同質の藻株であればよい。実質的に同質の藻株とは、その１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が、それぞれ９９．５％以上（好適には９９．８％以上、さらに好適には１００％）一致し、かつ好ましくは上述した藻株と同一の藻類学的性質（形態観察及び細胞外多糖体産生）を有する。さらに本技術の藻株は、本技術の効果（特に本技術のパラクロレラ多糖体の産生能）を同など程度以上に有する限り、上述した藻株又はそれと実質的に同質の藻株から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択などによって育種された藻株であってもよい。
【0043】
前記パラクロレラ属単細胞緑藻類を培養して多糖体を製造させる際に用いる培地として、一般的な単細胞緑藻類が培養可能な基礎培地に、グルコースなどの炭素源を含有させた炭素源含有の培養培地が好適である。単細胞緑藻類が培養可能な基礎培地とは、例えば、〔Appl Microbiol Biotechnol. 2011 Jul;91(1):31-46. Best practices in heterotrophic high-cell-density microalgal processes: achievements, potential and possible limitations.Bumbak F, Cook S, Zachleder V, Hauser S, Kovar K〕に記載されている培地が挙げられる。
【0044】
基礎培地中の無機塩としてＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４などの微量無機成分が挙げられ、窒素源としては硫酸アンモニウム、尿素などが挙げられる。この基礎培地として、本技術のパラクロレラ属単細胞緑藻類を培養する際に好適なものとしては表１に示す培地の組成が挙げられ、各成分の含有量は±１０％の範囲であることが好ましい。
前記炭素源として、グルコース、果糖などの単糖類；ショ糖などのオリゴ糖などが挙げられる。これらからなる群から選択される１種又は２種以上を使用して基礎培地に添加してもよい。
前記炭素源の濃度は、特に限定されないが、培養培地中、好ましくは０．１～３０質量％、より好ましくは１～１０質量％とするのが好適である。
前記炭素源として、グルコース、果糖などの単糖類；ショ糖などのオリゴ糖などが挙げられる。これらからなる群から選択される１種又は２種以上を使用して基礎培地に添加してもよい。
前記炭素源の濃度は、特に限定されないが、培養培地中、好ましくは０．１～３０質量％、より好ましくは１～１０質量％とするのが好適である。
【0045】
本技術のパラクロレラ多糖体を製造するための培養に際し、好気的な条件下で培養することが、当該多糖体を安定的に生産させることができるので好適である。通気培養することが、多糖体の生産性を向上させる点で、好ましい。通気手段として、例えば、撹拌、振盪、通気、及びバブリングなどが挙げられる。これらからなる群から選択される１種又は２種以上を使用することが可能である。これにより、培養培地中に適度な気体が混合されるようになる。
培養培地中の溶存酸素（ＤＯ）は、好気的な条件になるように調整すればよく、好ましくは３ｐｐｍ以上、より好ましくは５～１３ｐｐｍとするのが好適である。
培養培地中の溶存酸素（ＤＯ）は、好気的な条件になるように調整すればよく、好ましくは３ｐｐｍ以上、より好ましくは５～１３ｐｐｍとするのが好適である。
【0046】
培養温度は、特に限定されないが、５～４０℃の常温程度であればよい。
また、培養培地中のｐＨ（２０℃）は、好ましくは４～９、より好ましくは５～８とするのが好適である。
培養期間は、特に限定されないが、４日～２週間程度を１サイクルとするのが、多糖体を産出させるのが好適である。また、前培養及び本培養を行う際には、本培養の期間は、４日～１週間程度であればよい。この際、光照射を行なってもよいが、光照射を行わなくとも、多糖体を生産することが可能である。
また、独立栄養培養条件下にて藻体数を多くする場合、太陽光；植物栽培用ランプ、ＬＥＤなどの人工光源などの光を用いることが可能であり、炭酸ガスの補給と撹拌をすることが好ましい。
また、培養培地中のｐＨ（２０℃）は、好ましくは４～９、より好ましくは５～８とするのが好適である。
培養期間は、特に限定されないが、４日～２週間程度を１サイクルとするのが、多糖体を産出させるのが好適である。また、前培養及び本培養を行う際には、本培養の期間は、４日～１週間程度であればよい。この際、光照射を行なってもよいが、光照射を行わなくとも、多糖体を生産することが可能である。
また、独立栄養培養条件下にて藻体数を多くする場合、太陽光；植物栽培用ランプ、ＬＥＤなどの人工光源などの光を用いることが可能であり、炭酸ガスの補給と撹拌をすることが好ましい。
【0047】
また、本技術のパラクロレラ多糖の生産方法は、バッチ式、連続式の何れでもよいが、連続式が生産性向上のため好ましい。また、開放系培養及び閉鎖系培養の何れでもよく、例えば、培養タンク内の密閉培養及び開放系の露天培養などが挙げられる。培養条件管理の点で、閉鎖系培養が好ましい。
【0048】
本技術のパラクロレラ多糖体を前記単細胞緑藻類に産生させた後に、水溶液洗浄、超音波、遠心分離、ろ過などの物理的手段及び化学的手段にて、藻体から多糖体を分離し、本技術のパラクロレラ多糖体が含まれる上清液を得るのが好適である。
得られた本技術のパラクロレラ多糖体は、希釈液、濃縮液又は乾燥物などの状態に適宜調整してもよい。乾燥手段として凍結乾燥が好ましい。
得られた本技術のパラクロレラ多糖体は、希釈液、濃縮液又は乾燥物などの状態に適宜調整してもよい。乾燥手段として凍結乾燥が好ましい。
【0049】
本技術のパラクロレラ多糖体は、適宜公知の分離・精製技術、例えば液々分液、固液分液、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂などの方法によって不活性な不純物を除去し、さらに精製してもよい。
【0050】
＜２．本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物の用途＞
後記実施例に示すように、本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物又はこれを含む組成物は、ヒアルロン酸産生促進作用や皮膚浸透作用などを有し、当該ヒアルロン酸産生促進作用や皮膚浸透作用などを発揮することで予防、改善、又は治療できる症状又は疾患に対して有効である。当該症状又は疾患としては、加齢、紫外線暴露などに起因するヒアルロン酸産生能の低下；乾燥肌、肌荒れ、シミ、シワなどの症状からなる群から選択される１種又は２種以上が挙げられる。また、本技術のガンマ線照射処理物は、細胞や組織に注入するようなインジェクションの投与剤や経口摂取する経口剤でもよいが、皮膚浸透作用を有することから、皮膚や粘膜に、噴霧、塗布や付着などを用いて接触させるような皮膚外用剤などが好ましい。
従って、本技術の組成物、ヒアルロン酸産生促進用組成物又は皮膚外用剤などは、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物を少なくとも含有する。本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物は、組成物、ヒアルロン酸産生促進用組成物又は皮膚外用剤に、有効成分として、含有させて、用いることができる。
後記実施例に示すように、本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物又はこれを含む組成物は、ヒアルロン酸産生促進作用や皮膚浸透作用などを有し、当該ヒアルロン酸産生促進作用や皮膚浸透作用などを発揮することで予防、改善、又は治療できる症状又は疾患に対して有効である。当該症状又は疾患としては、加齢、紫外線暴露などに起因するヒアルロン酸産生能の低下；乾燥肌、肌荒れ、シミ、シワなどの症状からなる群から選択される１種又は２種以上が挙げられる。また、本技術のガンマ線照射処理物は、細胞や組織に注入するようなインジェクションの投与剤や経口摂取する経口剤でもよいが、皮膚浸透作用を有することから、皮膚や粘膜に、噴霧、塗布や付着などを用いて接触させるような皮膚外用剤などが好ましい。
従って、本技術の組成物、ヒアルロン酸産生促進用組成物又は皮膚外用剤などは、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物を少なくとも含有する。本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物は、組成物、ヒアルロン酸産生促進用組成物又は皮膚外用剤に、有効成分として、含有させて、用いることができる。
【0051】
本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物は、各成分自体を単独としてそのままの状態で用いることが可能であり、又は生理的若しくは薬学的に許容される通常の単体若しくは希釈剤などと共に混合して用いることもできる。
【0052】
また、本技術は、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物が発揮しうる作用又は目的のために用いる、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物若しくはこれを含む組成物、又はその使用を提供することができる。
また、本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物又はこれを含む組成物は、当該処理物が発揮しうる方法の有効成分として用いることができる。
また、本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物又はこれを含む組成物は、当該処理物が発揮しうる作用を有する又は使用目的のために各種製剤又は各種組成物などの製造のために使用することができる。
前記ガンマ線照射処理物が発揮しうる作用又は目的としては、例えば、ヒアルロン酸産生促進作用；皮膚浸透作用；加齢、紫外線暴露などに起因するヒアルロン酸産生能の低下の予防、改善、抑制又は治療；乾燥肌、肌荒れ、シミ、シワなどの症状の予防、改善、抑制又は治療などが挙げられるが、これらに限定されない。
また、本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物又はこれを含む組成物は、当該処理物が発揮しうる方法の有効成分として用いることができる。
また、本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物又はこれを含む組成物は、当該処理物が発揮しうる作用を有する又は使用目的のために各種製剤又は各種組成物などの製造のために使用することができる。
前記ガンマ線照射処理物が発揮しうる作用又は目的としては、例えば、ヒアルロン酸産生促進作用；皮膚浸透作用；加齢、紫外線暴露などに起因するヒアルロン酸産生能の低下の予防、改善、抑制又は治療；乾燥肌、肌荒れ、シミ、シワなどの症状の予防、改善、抑制又は治療などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0053】
また、本技術におけるラパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物又はこれを含む組成物は、皮膚外用剤、化粧品、医薬品、医薬部外品、食品や機能性食品（例えば特定保健用食品など）などの種々の用途及び種々の組成物に使用できる。また、当該用途又は組成物の形態は、特に限定されず、液状、ペースト状、ゲル状、固形状、粉末状などの何れの形態でもよい。
本技術において、皮膚への高い浸透作用、及び／又はヒアルロン酸産生作用の観点から、皮膚外用剤、化粧品、医薬部外品に用いるのが好ましく、皮膚に塗布などに接触させる製剤が好適である。
本技術において、皮膚への高い浸透作用、及び／又はヒアルロン酸産生作用の観点から、皮膚外用剤、化粧品、医薬部外品に用いるのが好ましく、皮膚に塗布などに接触させる製剤が好適である。
【0054】
本技術におけるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物又はこれを含む組成物は、適宜、任意成分を組み合わせて使用してもよい。任意成分として、医薬品、皮膚外用剤、飲食品又は飼料などにおいて許容される成分を適宜使用すればよい。任意成分として、例えば、細胞賦活剤、抗酸化剤、保湿剤、紫外線防止剤、溶剤（水、アルコール類など）、油剤、界面活性剤、増粘剤、粉体、キレート剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、安定化剤、着色剤、光沢剤、矯味剤、矯臭剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、香料などが挙げられ、これらを目的とする製剤や組成物に応じて配合すればよい。
【0055】
なお、本技術のパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物は、適用対象であるヒト若しくは非ヒト動物（好適には霊長類）に使用してもよく、ヒト及びペットが好ましく、より好ましくはヒトである。
【0056】
また、本技術は、治療目的使用であっても、非治療目的使用であってもよい。
「非治療目的」とは、医療行為、すなわち、医師による人体への処置行為を含まない概念である。非治療目的として、例えば、健康増進、生活習慣病予防（例えば、境界領域の予備軍）などが挙げられる。
「予防」とは、適用対象における疾患若しくは症状の発症の防止や遅延、又は適用対象の疾患若しくは症状の危険性の低下をいう。
「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転；悪化の防止又は遅延；進行の逆転、防止又は遅延をいう。
「非治療目的」とは、医療行為、すなわち、医師による人体への処置行為を含まない概念である。非治療目的として、例えば、健康増進、生活習慣病予防（例えば、境界領域の予備軍）などが挙げられる。
「予防」とは、適用対象における疾患若しくは症状の発症の防止や遅延、又は適用対象の疾患若しくは症状の危険性の低下をいう。
「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転；悪化の防止又は遅延；進行の逆転、防止又は遅延をいう。
【0057】
本技術の組成物に含まれるパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物の量は、特に制限されないが、好ましくは０．０００１～５０質量％、より好ましくは０．００１～１質量％、さらに好ましくは０．００１～０．０１質量％である。
【0058】
本技術の組成物における本技術のパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物の使用量は、適宜決定すればよい。
なお、１回当たりの本技術のパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物の量は、投与対象者又は摂取対象者の性別、年齢、状態、患者であれば疾患の重篤度などに応じて適宜決定すればよい。
本技術のパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物の使用量が、例えば、０．１～１００００ｍｇ／日とすることが好ましく、１～２０００ｍｇ／日とすることがより好ましく、１０～１０００ｍｇ／日とすることがさらにより好ましい。体重１ｋｇ当たりの換算量としては、０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日とすることが好ましく、０．１～２００ｍｇ／ｋｇ体重／日とすることがより好ましく、１～１００ｍｇ／ｋｇ体重／日とすることがよりさらに好ましい。
なお、１回当たりの本技術のパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物の量は、投与対象者又は摂取対象者の性別、年齢、状態、患者であれば疾患の重篤度などに応じて適宜決定すればよい。
本技術のパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物の使用量が、例えば、０．１～１００００ｍｇ／日とすることが好ましく、１～２０００ｍｇ／日とすることがより好ましく、１０～１０００ｍｇ／日とすることがさらにより好ましい。体重１ｋｇ当たりの換算量としては、０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日とすることが好ましく、０．１～２００ｍｇ／ｋｇ体重／日とすることがより好ましく、１～１００ｍｇ／ｋｇ体重／日とすることがよりさらに好ましい。
【0059】
また、本技術のパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物の用法（投与又は摂取方法、この回数及び期間）は特に限定されない。本技術が、医薬品用、飲食品用、飼料用の場合でも、当該本技術の用法と同様にして行うことが好ましい。
本技術のパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物の１日当たりの投与又は摂取回数は特に制限されず、１日当たりの本技術のパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物の投与量又は摂取量に応じて適宜決定することが可能である。
本技術のパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物の１日当たりの投与又は摂取回数は特に制限されず、１日当たりの本技術のパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物の投与量又は摂取量に応じて適宜決定することが可能である。
【0060】
また、本技術は、以下の構成を採用することも可能である。
〔１〕 パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。当該ガンマ線照射処理物又は当該組成物は、好適には、ヒアルロン酸産生促進用、皮膚浸透用、又は皮膚外用である。
〔２〕 前記多糖体のガンマ線照射処理物が、重量平均分子量１０，０００未満の分子量分布を有し、当該分布領域の割合が５０％以上である、前記〔１〕記載のガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。
〔３〕 前記多糖体のガンマ線照射処理物が、重量分子量１，０００以上１０，０００未満と、重量分子量１，０００未満の分子量分布とを少なくとも有し、それぞれの分布領域の割合が４５～６５％と１０～３０％とである、前記〔１〕又は〔２〕記載のガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。
〔４〕 前記ガンマ線照射が、１～１０００ｋＧｙ照射である、前記〔１〕～〔３〕の何れか１つ記載のガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。
〔５〕 前記パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体が、多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体である、前記〔１〕～〔４〕の何れか１つ記載のガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。
〔６〕 前記パラクロレラ属単細胞緑藻類が、パラクロレラ属ケッセリである、前記〔１〕～〔５〕の何れか１つ記載のガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。
〔１〕 パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。当該ガンマ線照射処理物又は当該組成物は、好適には、ヒアルロン酸産生促進用、皮膚浸透用、又は皮膚外用である。
〔２〕 前記多糖体のガンマ線照射処理物が、重量平均分子量１０，０００未満の分子量分布を有し、当該分布領域の割合が５０％以上である、前記〔１〕記載のガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。
〔３〕 前記多糖体のガンマ線照射処理物が、重量分子量１，０００以上１０，０００未満と、重量分子量１，０００未満の分子量分布とを少なくとも有し、それぞれの分布領域の割合が４５～６５％と１０～３０％とである、前記〔１〕又は〔２〕記載のガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。
〔４〕 前記ガンマ線照射が、１～１０００ｋＧｙ照射である、前記〔１〕～〔３〕の何れか１つ記載のガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。
〔５〕 前記パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体が、多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体である、前記〔１〕～〔４〕の何れか１つ記載のガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。
〔６〕 前記パラクロレラ属単細胞緑藻類が、パラクロレラ属ケッセリである、前記〔１〕～〔５〕の何れか１つ記載のガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。
【0061】
〔７〕 前記〔１〕～〔６〕の何れか１つ記載のパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体が、多糖の基本構造の糖残基が少なくともガラクトースとマンノースとで構成されており、当該ガラクトースにフラノース型が存在する多糖体であることが好適である。
当該ガラクトースの含有量が、全中性糖中、５０～７９質量％であることがより好適である。
〔８〕 前記〔１〕～〔７〕の何れか１つ記載の前記多糖体の重量分子量が、１０の４乗から８乗のオーダーであることが好適である。
〔９〕 前記〔１〕～〔８〕の何れか１つ記載の前記多糖体が有するガラクトースとマンノースの糖残基の比率が２．５～３．５：１であることが好適である。
〔１０〕 前記〔１〕～〔９〕の何れか１つ記載の前記多糖体は、パラクロレラ属ケッセリ（Parachlorella kessreli）由来の多糖体であり、より好適には前記多糖体は水溶性である。
当該ガラクトースの含有量が、全中性糖中、５０～７９質量％であることがより好適である。
〔８〕 前記〔１〕～〔７〕の何れか１つ記載の前記多糖体の重量分子量が、１０の４乗から８乗のオーダーであることが好適である。
〔９〕 前記〔１〕～〔８〕の何れか１つ記載の前記多糖体が有するガラクトースとマンノースの糖残基の比率が２．５～３．５：１であることが好適である。
〔１０〕 前記〔１〕～〔９〕の何れか１つ記載の前記多糖体は、パラクロレラ属ケッセリ（Parachlorella kessreli）由来の多糖体であり、より好適には前記多糖体は水溶性である。
【0062】
〔１１〕 前記〔１〕～〔１０〕の何れか１つ記載の前記多糖体は、パラクロレラ属単細胞藻類又は改変体を炭素源含有培養培地で好気的な条件下で従属培養し、生産される多糖体を回収する多糖体の製造方法にて得られたものが好適である。
〔１２〕 前記〔１〕～〔１１〕の何れか１つ記載の多糖体は、パラクロレラ属単細胞藻類のうちパラクロレラ属ケッセリ（Parachlorella kessreli）を用いる多糖体の製造方法にて得られたものが好適である。
〔１２〕 前記〔１〕～〔１１〕の何れか１つ記載の多糖体は、パラクロレラ属単細胞藻類のうちパラクロレラ属ケッセリ（Parachlorella kessreli）を用いる多糖体の製造方法にて得られたものが好適である。
【0063】
〔１３〕 前記〔１〕～〔１２〕の何れか１つ記載のパラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。
〔１４〕 前記ガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物が、ヒアルロン酸産生促進用、皮膚浸透用、又は皮膚外用である、前記〔１〕～〔１３〕の何れか１つ記載の前記ガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。
〔１４〕 前記ガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物が、ヒアルロン酸産生促進用、皮膚浸透用、又は皮膚外用である、前記〔１〕～〔１３〕の何れか１つ記載の前記ガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物。
【0064】
〔１５〕 前記〔１〕～〔１４〕の何れか１つ記載の前記ガンマ線照射処理物、又は当該処理物を含む組成物を投与する、ヒアルロン酸産生促進方法、皮膚浸透促進方法、又は皮膚塗布方法。
〔１６〕 医薬、飲食、給餌、皮膚外用剤、ヒアルロン酸産生促進、皮膚浸透促進、又は皮膚塗布のために用いる、前記〔１〕～〔１４〕の何れか１つ記載の前記ガンマ線照射処理物若しくは当該処理物を含む組成物、又はその使用。非治療目的の使用であってもよい。
〔１７〕 組成物、医薬品、飲食品、飼料、皮膚外用剤、ヒアルロン酸産生促進用組成物、皮膚浸透促進用組成物、又は皮膚塗布用組成物を製造するための、前記〔１〕～〔１４〕の何れか１つ記載の前記ガンマ線照射処理物若しくは当該処理物を含む組成物、又はその使用。非治療目的の使用であってもよい。
〔１６〕 医薬、飲食、給餌、皮膚外用剤、ヒアルロン酸産生促進、皮膚浸透促進、又は皮膚塗布のために用いる、前記〔１〕～〔１４〕の何れか１つ記載の前記ガンマ線照射処理物若しくは当該処理物を含む組成物、又はその使用。非治療目的の使用であってもよい。
〔１７〕 組成物、医薬品、飲食品、飼料、皮膚外用剤、ヒアルロン酸産生促進用組成物、皮膚浸透促進用組成物、又は皮膚塗布用組成物を製造するための、前記〔１〕～〔１４〕の何れか１つ記載の前記ガンマ線照射処理物若しくは当該処理物を含む組成物、又はその使用。非治療目的の使用であってもよい。
【実施例】
【0065】
以下、試験例、実施例などに基づいて本技術をさらに詳細に説明する。なお、以下に説明する試験例、実施例などは、本技術の代表的な実施例などの一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【0066】
＜試験例１：パラクロレラ属単細胞緑藻類由来の多糖体の製造方法＞
パラクロレラ属単細胞緑藻類として、Parachlorella kessleri-PNC1株(FERM BP-11493)を用いて、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来の多糖体を製造した。
本試験例における多糖体の製造方法、多糖体の解析方法（加水分解、メチル化分析、ＮＭＲ解析、ウロン酸定量など）は、特許文献４：特開２０１４－２５０３５号公報を参照して行った。
（１）Parachlorella kessleri-PNC1株(FERM BP-11493)（受託日：2012年 7月19日） 寄託先：〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター中央第6、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（NITE-IPOD）。
パラクロレラ属単細胞緑藻類として、Parachlorella kessleri-PNC1株(FERM BP-11493)を用いて、パラクロレラ属単細胞緑藻類由来の多糖体を製造した。
本試験例における多糖体の製造方法、多糖体の解析方法（加水分解、メチル化分析、ＮＭＲ解析、ウロン酸定量など）は、特許文献４：特開２０１４－２５０３５号公報を参照して行った。
（１）Parachlorella kessleri-PNC1株(FERM BP-11493)（受託日：2012年 7月19日） 寄託先：〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター中央第6、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（NITE-IPOD）。
【0067】
Parachlorella kessleri-PNC1株(FERM BP-11493)を含むスラント状培地（５０ｍＬ）を、グルコース含有培養培地２５０ｍＬを含む３Ｌ容バッフル付き三角フラスコに添加し、照度８０００～１００００ｌｕｘ、２８℃で、１６０ｒｐｍにて４日間前培養した。なお、前培養前に、予備的に藻体数を増やしてもよい。
なお、グルコース含有培養培地は、表１の基礎培地１Ｌ当たりにグルコース１０ｇを含有させたものである。
なお、グルコース含有培養培地は、表１の基礎培地１Ｌ当たりにグルコース１０ｇを含有させたものである。
【0068】
【表1】
【0069】
前培養物２４０ｍＬを３０Ｌ容のジャーファメンターに移して１２日間本培養を行い、これを本培養物とした。このときの培養条件は、３０℃、２３０ｒｐｍ、通気０．５６ｖｖｍ、内圧０．３ｋｇｆ／ｃｍ２、ｐＨ７．２の好気的な条件下であり、光照射は行わなかった。
本培養物を、遠心分離（７０００ｒｐｍ（６５００Ｇ）、２５℃）し、目的とする多糖体を含有する上清液と藻体とに分離した。さらに分画分子量６０００のＵＦ膜（ＳＩＰ１０１３）を用いて、原液を２Ｌまで濃縮した。濃縮物（２Ｌ）に、陰イオン交換樹脂２００ｍＬを添加し、ブリックス０．１まで回収し、ＵＦ膜ろ過にて、５００ｍＬ濃縮し、凍結乾燥して、パラクロレラ由来の多糖体（以下、「パラクロレラ多糖体」ともいう）を得た。収率は、培養液１Ｌ当たり、０．２～０．４ｇであった。
本培養物を、遠心分離（７０００ｒｐｍ（６５００Ｇ）、２５℃）し、目的とする多糖体を含有する上清液と藻体とに分離した。さらに分画分子量６０００のＵＦ膜（ＳＩＰ１０１３）を用いて、原液を２Ｌまで濃縮した。濃縮物（２Ｌ）に、陰イオン交換樹脂２００ｍＬを添加し、ブリックス０．１まで回収し、ＵＦ膜ろ過にて、５００ｍＬ濃縮し、凍結乾燥して、パラクロレラ由来の多糖体（以下、「パラクロレラ多糖体」ともいう）を得た。収率は、培養液１Ｌ当たり、０．２～０．４ｇであった。
【0070】
さらに、パラクロレラ由来の多糖体１ｇに蒸留水４０ｍＬを添加して混合撹拌し、懸濁液を得た。この懸濁液を４℃にて一晩放置し、この懸濁液を遠心分離（７０００ｒｐｍ、６５００ｇ、５分間）し、上清と沈殿部とに分け、上清について凍結乾燥し、易水溶性のパラクロレラ多糖体（以下、「水溶性パラクロレラ多糖体」ともいう）を得た（０．４～０．５ｇ）。
【0071】
＜試験例２：パラクロレラ多糖体の構造解析＞
水溶性パラクロレラ多糖体を、２Ｍ－ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、１２０℃、２時間で加水分解した。この加水分解物を、室温、ＮａＢＨ４にて還元し、さらに（無水酢酸：１－メチルイミダゾール ９：１）にてアセテート化し、アルジトールアセテート誘導体を得た。アルジトールアセテート誘導体は、ＧＣで分析を行った。
ＧＣ測定は、GL Science GC-353ガスクロマトグラフ（カラム SP-2330 (Spelco)；検出器 FID；220 ℃の恒温分析）にて、行った。
このＧＣ結果、水溶性パラクロレラ多糖体には、アラビノース（４．７％）、ラムノース（４．０％）、キシロース（１．７％）、マンノース（２２．５％）、ガラクトース（６７．１％）が認められた。
水溶性パラクロレラ多糖体を、２Ｍ－ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、１２０℃、２時間で加水分解した。この加水分解物を、室温、ＮａＢＨ４にて還元し、さらに（無水酢酸：１－メチルイミダゾール ９：１）にてアセテート化し、アルジトールアセテート誘導体を得た。アルジトールアセテート誘導体は、ＧＣで分析を行った。
ＧＣ測定は、GL Science GC-353ガスクロマトグラフ（カラム SP-2330 (Spelco)；検出器 FID；220 ℃の恒温分析）にて、行った。
このＧＣ結果、水溶性パラクロレラ多糖体には、アラビノース（４．７％）、ラムノース（４．０％）、キシロース（１．７％）、マンノース（２２．５％）、ガラクトース（６７．１％）が認められた。
【0072】
また、水溶性パラクロレラ多糖体について、メチル化分析を行った。多糖試料をメチル化してメチル化多糖を得た。メチル化多糖を、２Ｍ－ＴＦＡ中１２０℃で２時間加水分解し、ＮａＢＤ４で還元後、無水酢酸と１－メチルイミダゾールでアセチル化した。得られた誘導体はＧＣ－ＭＳで分析した。
GC-MSは、Shimadzu QP-5000 GC-MS ガスクロマトグラフ質量分析装置〔カラム：SPB-50(0.32 x 30 m)〕を行った。
本多糖体のマンノース残基として、非還元末端、１，２－結合、１，３－結合した残基が認められた。また、本多糖体のガラクトース残基の大部分はフラノースであり、また、本多糖体のガラクトース残基として、非還元末端、１，２－結合フラノース、１，５－結合フラノース、１，６－結合フラノース、１，２，６－結合フラノース、そして１，３－結合ピラノースが認められた。
GC-MSは、Shimadzu QP-5000 GC-MS ガスクロマトグラフ質量分析装置〔カラム：SPB-50(0.32 x 30 m)〕を行った。
本多糖体のマンノース残基として、非還元末端、１，２－結合、１，３－結合した残基が認められた。また、本多糖体のガラクトース残基の大部分はフラノースであり、また、本多糖体のガラクトース残基として、非還元末端、１，２－結合フラノース、１，５－結合フラノース、１，６－結合フラノース、１，２，６－結合フラノース、そして１，３－結合ピラノースが認められた。
【0073】
また、１Ｈ-ＮＭＲ分析（Varian Unity plus 500、１Ｈ：５００ＭＨｚ，１３Ｃ：１２５ＭＨｚ、〔溶媒：重水（Ｄ２Ｏ）、測定温度は３０℃、内部標準：ＤＳＳ〕）により、水溶性パラクロレラ多糖体のガラクトース残基の多くは、フラノース型で存在することが認められた。
また、水溶性パラクロレラ多糖体のタンパク質含量（ローリー法）及びウロン酸含量（カルバゾール－硫酸法）にて測定を行った結果、タンパク質及びウロン酸の存在は、ほとんど認められなかった。
また、水溶性パラクロレラ多糖体のタンパク質含量（ローリー法）及びウロン酸含量（カルバゾール－硫酸法）にて測定を行った結果、タンパク質及びウロン酸の存在は、ほとんど認められなかった。
【0074】
酸性多糖体を回収する際に第４級アンモニウム塩沈殿法を一般的に使用している。これを利用して、第４級アンモニウム塩の一種である塩化セチルピリジニウムを用いて多糖体の沈殿の有無を確認した。試験管に０．２％多糖体を含む水溶液（Ｗ／Ｖ）２０ｍＬを入れ、この水溶液に対しＣＰＣ１０ｇを添加し、混合したのち１２時間放置し、遠心分離後に、目視にて沈殿の有無を確認した。その結果、水溶性パラクロレラ多糖体は第４級アンモニウム塩に沈殿しなかった。このことより、水溶性パラクロレラ多糖体は、ウロン酸やエステル硫酸を多く含むような酸性多糖には該当しないと考えた。
【0075】
水溶性パラクロレラ多糖体に存在するガラクトース及びマンノースのＤＬを、加水分解、トリメチルシリル化し得られた誘導体をＧＣで分析し、調べた。その結果、Ｄ－ガラクトース及びＤ－マンノースが認められた。
【0076】
このことから、パラクロレラ由来における多糖の基本構造の糖残基は、少なくともガラクトースとマンノースを主体として構成されており、当該ガラクトースのほとんどがフラノース型で存在するものと推定した。また、本多糖体は、１，５－β－Ｄ－ガラクトフラノースの構造を有すると推定した。
【0077】
＜試験例３：パラクロレラ属単細胞緑藻類由来多糖体のガンマ線照射処理物＞
〔製造例１：パラクロレラ多糖体の製造方法及び重量平均分子量〕
本培養における培養期間を４日間から１週間にした以外は試験例１の製造方法と同様にして、多糖体を得た。
〔製造例１：パラクロレラ多糖体の製造方法及び重量平均分子量〕
本培養における培養期間を４日間から１週間にした以外は試験例１の製造方法と同様にして、多糖体を得た。
【0078】
製造例１で得られたパラクロレラ多糖体及び水溶性パラクロレラ多糖体について、ＧＰＣ分析にて多糖体の重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。ＧＰＣ分析の結果、パラクロレラ多糖体は、保持時間２７．２分に最も高いピークがあり、保持時間２６．２分にショルダーピークがあり、これらの保持時間（ピーク）及び標品（プルラン）から、それぞれの重量平均分子量を求めた。重量平均分子量（Ｍｗ）は、それぞれ４９，０００～５４，０００と１７０，０００～１９０，０００であり、全体として約５～２０×１０４の重量平均分子量（Ｍｗ）であった。重量平均分子量１００，０００未満の領域には、ピークが認められなかった。
ガンマ線照射前のパラクロレラ多糖体は、ＧＰＣ分析において、重量平均分子量が１０の４～５乗オーダーの範囲であった。超音波処理で、パラクロレラ多糖体をより溶解させた場合には、重量平均分子量が１０の４乗オーダーの範囲であった。
ガンマ線照射前のパラクロレラ多糖体は、ＧＰＣ分析において、重量平均分子量が１０の４～５乗オーダーの範囲であった。超音波処理で、パラクロレラ多糖体をより溶解させた場合には、重量平均分子量が１０の４乗オーダーの範囲であった。
【0079】
＜ＧＰＣ分析＞
測定カラム：TSKgel GMPWXL(7.8mmID x 300 mm：東ソー株式会社)の2本直列
測定温度：50℃
移動相：0.1 M NaNO3
HPLCシステム：島津 Shodex GPC-101システム
検出器：示差屈折計 RI-71S
標準物質：プルラン（昭和電工 Shodex standard P-82）
使用ソフト（GPC計算）：システム・インスツルメンツ 480IIデータステーションGPCプログラム
プルラン（P-82）による基点分子量及び溶出時間：100,000/12.2分、30,000/13.7分、10,000/15.0分、3,000/16.4分、1,000/17.7分、500/18.6分
測定カラム：TSKgel GMPWXL(7.8mmID x 300 mm：東ソー株式会社)の2本直列
測定温度：50℃
移動相：0.1 M NaNO3
HPLCシステム：島津 Shodex GPC-101システム
検出器：示差屈折計 RI-71S
標準物質：プルラン（昭和電工 Shodex standard P-82）
使用ソフト（GPC計算）：システム・インスツルメンツ 480IIデータステーションGPCプログラム
プルラン（P-82）による基点分子量及び溶出時間：100,000/12.2分、30,000/13.7分、10,000/15.0分、3,000/16.4分、1,000/17.7分、500/18.6分
【0080】
〔製造例２：ガンマ線照射処理物及びその製造方法〕
前記〔製造例１〕にて、得られたパラクロレラ多糖体をイオン交換水に溶解し、０．１質量％水溶液及び１．０質量％水溶液を得た。当該０．１質量％水溶液に対して、線量率１０ｋＧｙ／ｈｒ、照射時間７～８ｈｒ、照射強度７０ｋＧｙにて、ガンマ線を照射したγ線照射処理物１を得た。また、当該１．０質量％水溶液（２０～３０℃）に対しても、０．１質量％水溶液のときと同様の条件（照射強度７０ｋＧｙ）にて、ガンマ線を照射し、ガンマ線照射分解物２を得た。
前記〔製造例１〕にて、得られたパラクロレラ多糖体をイオン交換水に溶解し、０．１質量％水溶液及び１．０質量％水溶液を得た。当該０．１質量％水溶液に対して、線量率１０ｋＧｙ／ｈｒ、照射時間７～８ｈｒ、照射強度７０ｋＧｙにて、ガンマ線を照射したγ線照射処理物１を得た。また、当該１．０質量％水溶液（２０～３０℃）に対しても、０．１質量％水溶液のときと同様の条件（照射強度７０ｋＧｙ）にて、ガンマ線を照射し、ガンマ線照射分解物２を得た。
【0081】
パラクロレラ多糖体（０．１質量％水溶液）のガンマ線照射処理物１について、上記＜ＧＰＣ分析＞を用いて、測定した（図１の下段参照）。このときの各分子量分布の結果を表２に示す。
図１及び表２に示すように、パラクロレラ多糖体をガンマ線照射処理することで、パラクロレラ多糖体は分解され、低分子化された。
図１及び表２に示すように、パラクロレラ多糖体をガンマ線照射処理することで、パラクロレラ多糖体は分解され、低分子化された。
【0082】
【表2】
【0083】
＜試験例４：ヒアルロン酸の産生促進試験（実施例１及び比較例１～２）＞
各試料のヒアルロン酸の産生促進試験は、線維芽細胞を用い、定量的ＰＣＲ法により行った。試料として、ガンマ線照射処理前の製造例１の多糖体（比較例１）、製造例２のガンマ線照射処理物１（実施例１）、製造例１の多糖体の酸加水分解物（比較例２）を用いた。
表３に、多糖体のガンマ線照射分解物（実施例１）、多糖体の酸加水分解後の酸分解物（比較例２）における、それぞれのヒアルロン酸合成酵素ＨＡＳ２の相対発現量を示した。ネガティブコントロールを１としたときの、各相対発現量を示した。
なお、酸加水分解は、製造例１のパラクロレラ多糖体（０．１質量％水溶液）を、２Ｍ－ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、３時間、１００℃で加水分解したものである。
試験例４のヒアルロン酸の産生促進試験について、以下により具体的に説明し、この結果を表３に示した。
各試料のヒアルロン酸の産生促進試験は、線維芽細胞を用い、定量的ＰＣＲ法により行った。試料として、ガンマ線照射処理前の製造例１の多糖体（比較例１）、製造例２のガンマ線照射処理物１（実施例１）、製造例１の多糖体の酸加水分解物（比較例２）を用いた。
表３に、多糖体のガンマ線照射分解物（実施例１）、多糖体の酸加水分解後の酸分解物（比較例２）における、それぞれのヒアルロン酸合成酵素ＨＡＳ２の相対発現量を示した。ネガティブコントロールを１としたときの、各相対発現量を示した。
なお、酸加水分解は、製造例１のパラクロレラ多糖体（０．１質量％水溶液）を、２Ｍ－ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、３時間、１００℃で加水分解したものである。
試験例４のヒアルロン酸の産生促進試験について、以下により具体的に説明し、この結果を表３に示した。
【0084】
＜ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進作用評価試験＞
以下のようにして、試料のヒアルロン酸合成酵素ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
以下のようにして、試料のヒアルロン酸合成酵素ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
【0085】
（１）細胞培養と試料の添加
10%FBS（ウシ胎児血清（Fetal bovine serum）、SIGMA社製)、及び1％ペニシリン－ストレプトマイシン（ペニシリン－ストレプトマイシン-L-グルタミン溶液（×100）、富士フイルム和光純薬株式会社製）を含むD-MEM（Dulbecco's minimal essential medium（低グルコース、Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）、富士フイルム和光純薬株式会社製）培地を用いて、コラーゲンコートされた１２ウェルプレートに、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、倉敷紡績株式会社製）を、それぞれ２×１０５個／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２の下で２４時間培養した。
10%FBS（ウシ胎児血清（Fetal bovine serum）、SIGMA社製)、及び1％ペニシリン－ストレプトマイシン（ペニシリン－ストレプトマイシン-L-グルタミン溶液（×100）、富士フイルム和光純薬株式会社製）を含むD-MEM（Dulbecco's minimal essential medium（低グルコース、Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）、富士フイルム和光純薬株式会社製）培地を用いて、コラーゲンコートされた１２ウェルプレートに、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、倉敷紡績株式会社製）を、それぞれ２×１０５個／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２の下で２４時間培養した。
【0086】
また、ガンマ線処理物１を、各０．０１及び０．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように、１％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤ－ＭＥＭ培地に溶解し、これらをそれぞれ実施例１～２の被験試料（被験試料１～２）とした。また、対照例１として、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤ－ＭＥＭ培地（対照試料１）を準備した。
【0087】
正常ヒト皮膚線維芽細胞の播種から２４時間後、被験試料１、被験試料２、対照試料１を、それぞれ上記の正常ヒト皮膚線維芽細胞を播種したウェルに、１ｍＬずつ置換し、３７℃で、５％ＣＯ２の下でさらに７２時間培養した。
【0088】
培養終了後、総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡの抽出は、ウェルから培地を吸引除去した後、RNeasy Mini Kit（QIAGEN製）を用いて、当該キットの操作マニュアルに従って行った。
【0089】
（２）ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成は、ｃＤＮＡ合成キット（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ、タカラバイオ株式会社製）及びマスターサイクラー（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＤｉｃｅＲ Ｔｏｕｃｈ、タカラバイオ株式会社製）を使用して行った。具体的には、上記抽出により得られた、被験試料１～２及び対照試料１の総ＲＮＡ（約２５０ｎｇ／μＬ）をそれぞれ用い、ｃＤＮＡ合成キットの使用マニュアルに従って反応液を調製し、マスターサイクラーにより３７℃で１５分間、８５℃で５秒間反応させ、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現量を測定するリアルタイムＰＣＲの鋳型に使用するｃＤＮＡを合成した。
ｃＤＮＡの合成は、ｃＤＮＡ合成キット（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ、タカラバイオ株式会社製）及びマスターサイクラー（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＤｉｃｅＲ Ｔｏｕｃｈ、タカラバイオ株式会社製）を使用して行った。具体的には、上記抽出により得られた、被験試料１～２及び対照試料１の総ＲＮＡ（約２５０ｎｇ／μＬ）をそれぞれ用い、ｃＤＮＡ合成キットの使用マニュアルに従って反応液を調製し、マスターサイクラーにより３７℃で１５分間、８５℃で５秒間反応させ、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現量を測定するリアルタイムＰＣＲの鋳型に使用するｃＤＮＡを合成した。
【0090】
（３）インターカレーション法を用いたリアルタイムＰＣＲ反応
ＨＡＳ２遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを使用した。
センスプライマー：５’－ＡＣＣＧＧＧＧＴＡＡＡＡＴＴＴＧＧＡＡＣ－ ３’（配列番号１）
アンチセンスプライマー：５’－ＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＴ－ ３’（配列番号２）
また、内部標準としてのＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを使用した。
センスプライマー：５’－ＣＡＧＣＣＴＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡ－ ３’（配列番号３）
アンチセンスプライマー：５’－ＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡ－ ３’（配列番号４）
ＨＡＳ２遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを使用した。
センスプライマー：５’－ＡＣＣＧＧＧＧＴＡＡＡＡＴＴＴＧＧＡＡＣ－ ３’（配列番号１）
アンチセンスプライマー：５’－ＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＴ－ ３’（配列番号２）
また、内部標準としてのＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーとして、下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを使用した。
センスプライマー：５’－ＣＡＧＣＣＴＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡ－ ３’（配列番号３）
アンチセンスプライマー：５’－ＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡ－ ３’（配列番号４）
【0091】
被験試料（実施例１、比較例１～２）のそれぞれについて、培養細胞から調製したｃＤＮＡについて、上記プライマーセットを使用して、リアルタイムＰＣＲ装置（ＥｃｏTMリアルタイムＰＣＲシステム、アズワン株式会社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（ＴＢ Ｇｒｅｅｎ（Ｒ） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑTMＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）及びその説明書、タカラバイオ株式会社製）により、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。反応は、９５℃で３０秒間保温の後、９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間の反応を４０サイクル繰り返し、１サイクルごとのＴＢ Ｇｒｅｅｎの発光量を測定した。
【0092】
（４）解析
各サイクルごとのＴＢ Ｇｒｅｅｎの発光量に基づいて、ＨＡＳ２及びＧＡＰＤＨのそれぞれをコードするＤＮＡ断片の増幅曲線を作成し、ＧＡＰＤＨを内部標準遺伝子として、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用いて上記発光量を相対的に定量した。
各サイクルごとのＴＢ Ｇｒｅｅｎの発光量に基づいて、ＨＡＳ２及びＧＡＰＤＨのそれぞれをコードするＤＮＡ断片の増幅曲線を作成し、ＧＡＰＤＨを内部標準遺伝子として、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を用いて上記発光量を相対的に定量した。
【0093】
【表3】
【0094】
＜試験例４の結果＞
比較例１におけるパラクロレラ多糖体では、ヒアルロン酸合成酵素ＨＡＳ２の発現量は増加しなかった。このようにパラクロレラ多糖体は、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮できなかった。
パラクロレラ多糖体を酸加水分解した比較例２の酸加水分解物（酸分解物）では、低分子化したにもかかわらず、ヒアルロン酸合成酵素ＨＡＳ２の発現量は増加しなかった。このように、パラクロレラ多糖体を酸加水分解で低分子化しても、ヒアルロン酸産生促進効果は発揮できなかった。
比較例１におけるパラクロレラ多糖体では、ヒアルロン酸合成酵素ＨＡＳ２の発現量は増加しなかった。このようにパラクロレラ多糖体は、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮できなかった。
パラクロレラ多糖体を酸加水分解した比較例２の酸加水分解物（酸分解物）では、低分子化したにもかかわらず、ヒアルロン酸合成酵素ＨＡＳ２の発現量は増加しなかった。このように、パラクロレラ多糖体を酸加水分解で低分子化しても、ヒアルロン酸産生促進効果は発揮できなかった。
【0095】
これに対し、パラクロレラ多糖体をガンマ線照射によって低分子化させた場合（実施例１）には、ヒアルロン酸合成酵素ＨＡＳ２の発現量が約１．４～１．５倍も際立って増加した。このように、パラクロレラ多糖体に対してガンマ線照射を用いて低分子化することによって、パラクロレラ多糖体では発揮できなかったヒアルロン酸産生促進効果が新たに発揮できるようになった。このように、パラクロレラ多糖体の新規なガンマ線分解物は、顕著なヒアルロン酸産生促進効果を新たに発揮できることを見出した。
【0096】
＜試験例５：ブタ皮膚を用いたin-vitro 皮膚透過試験＞
皮膚透過試験は、ブタ皮膚を用いたin-vitro皮膚透過試験により、行った。検体として、前記製造例２のγ線処理物１を１質量％水溶液になるように調製したγ線処理物１水溶液を用いた。試験例５の皮膚透過試験について、以下により具体的に説明し、この結果を表３に示した。
皮膚透過試験は、ブタ皮膚を用いたin-vitro皮膚透過試験により、行った。検体として、前記製造例２のγ線処理物１を１質量％水溶液になるように調製したγ線処理物１水溶液を用いた。試験例５の皮膚透過試験について、以下により具体的に説明し、この結果を表３に示した。
【0097】
ブタ皮膚を直径３．０ｃｍの円形にカットし、フランツ型拡散セル（開口部直径２．０ｃｍ、レセプター容積 約２．４ｍＬ）に角質層をｄｏｎｏｒ側に向け装着した。装着後、ｄｏｎｏｒ 側とｒｅｃｅｐｔｏｒ側をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で満たし電気抵抗値を測定して皮膚損傷の有無を確認した。正常な皮膚状態であることを確認した後、コットンで角質層側の余分な水分を軽くふき取り、検体１ｍＬを角質層側に投与した。検体投与後、ｒｅｃｅｐｔｏｒ側緩衝液の温度は３２℃に保った状態で皮膚透過試験を行った。試験を開始して６時間後レセプター溶液を１ｍＬサンプリングし、多糖定量を行った。
【0098】
多糖定量値(mg/ｍＬ)は、フェノール硫酸法（標準Ｇｌｃ水溶液、測定吸光度４９０ｎｍ）を用いて測定した。
透過濃度算出方法は、アクティブからブランクの数値を引いた値を、透過濃度(mg/ｍＬ)とした。
透過率算出方法は、「透過率（％）＝（透過濃度÷処理前の１質量％γ線処理物の多糖定量値）×１００」にて算出した。例として、（アクティブの表皮・真皮抽出液の透過濃度「０．０３７ｍｇ／ｍＬ」÷処理前のγ線処理物の多糖定量値「０．６３ｍｇ／ｍＬ」）×１００＝５．８７％であった。
透過濃度算出方法は、アクティブからブランクの数値を引いた値を、透過濃度(mg/ｍＬ)とした。
透過率算出方法は、「透過率（％）＝（透過濃度÷処理前の１質量％γ線処理物の多糖定量値）×１００」にて算出した。例として、（アクティブの表皮・真皮抽出液の透過濃度「０．０３７ｍｇ／ｍＬ」÷処理前のγ線処理物の多糖定量値「０．６３ｍｇ／ｍＬ」）×１００＝５．８７％であった。
【0099】
〔６時間後における角質層浸透量〕
上記透過試験終了後、皮膚表面の残存液を除去し、濡れたコットンで皮膚表面をふき取り、セルから皮膚を取り出し、セロハンテープで角質層を１５回剥離した（１回目の剥離テープは皮膚表面に付着した検体が含まれている可能性があるため廃棄した）。１４枚のセロハンテープを５０ｍＬ遠心管に入れ、純水：エタノール＝１：１（ｖ／ｖ）混合液を１５ｍＬ加え超音波処理による抽出を１時間行った。抽出液を１００ｍＬビーカーに移し、７０℃恒温槽にて蒸発させ、１ｍＬの純水を加え再溶解し、遠心分離操作（１２，０００ｒｐｍ，５分）を行った。上清液をマイクロチューブに回収し、多糖定量を行った。
上記透過試験終了後、皮膚表面の残存液を除去し、濡れたコットンで皮膚表面をふき取り、セルから皮膚を取り出し、セロハンテープで角質層を１５回剥離した（１回目の剥離テープは皮膚表面に付着した検体が含まれている可能性があるため廃棄した）。１４枚のセロハンテープを５０ｍＬ遠心管に入れ、純水：エタノール＝１：１（ｖ／ｖ）混合液を１５ｍＬ加え超音波処理による抽出を１時間行った。抽出液を１００ｍＬビーカーに移し、７０℃恒温槽にて蒸発させ、１ｍＬの純水を加え再溶解し、遠心分離操作（１２，０００ｒｐｍ，５分）を行った。上清液をマイクロチューブに回収し、多糖定量を行った。
【0100】
〔６時間後における表皮・真皮浸透量〕
角質層を除いた表皮・真皮層を細かくカットし、破砕用チューブ２本に分けて入れ、各チューブに純水を０．５ｍＬ加え、破砕機で２０分間破砕した。その後、２本のチューブから５０ｍＬの遠心管に回収し、さらに破砕用チューブ１本につき０．５ｍＬで３回洗浄した洗液も加え、中にエタノール１０ｍＬを加えた後、よく混合し、遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分）を行った。遠心後、上清液を１００ｍＬのビーカーに移し、７０℃恒温槽にて蒸散させた。蒸散後、残留物に純水１ｍＬを加え再溶解し、遠心分離操作（１２，０００ｒｐｍ，５分）を行った。上清液をマイクロチューブに回収し、多糖定量を行った。
角質層を除いた表皮・真皮層を細かくカットし、破砕用チューブ２本に分けて入れ、各チューブに純水を０．５ｍＬ加え、破砕機で２０分間破砕した。その後、２本のチューブから５０ｍＬの遠心管に回収し、さらに破砕用チューブ１本につき０．５ｍＬで３回洗浄した洗液も加え、中にエタノール１０ｍＬを加えた後、よく混合し、遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分）を行った。遠心後、上清液を１００ｍＬのビーカーに移し、７０℃恒温槽にて蒸散させた。蒸散後、残留物に純水１ｍＬを加え再溶解し、遠心分離操作（１２，０００ｒｐｍ，５分）を行った。上清液をマイクロチューブに回収し、多糖定量を行った。
【0101】
【表4】
【0102】
＜試験例５の結果＞
毛乳頭細胞が存在する真皮領域まで、パラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物が浸透していることを確認できた。これにより、ガンマ線照射処理によって低分子化することで、経皮浸透性を向上することができる。さらに、パラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物が線維芽細胞の存在する真皮領域まで浸透していることが確認できたため、本技術のパラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物を実際の皮膚に塗布した場合、本技術のパラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物はヒアルロン酸産生の促進をすることが期待できる。
毛乳頭細胞が存在する真皮領域まで、パラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物が浸透していることを確認できた。これにより、ガンマ線照射処理によって低分子化することで、経皮浸透性を向上することができる。さらに、パラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物が線維芽細胞の存在する真皮領域まで浸透していることが確認できたため、本技術のパラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物を実際の皮膚に塗布した場合、本技術のパラクロレラ多糖体のガンマ線照射処理物はヒアルロン酸産生の促進をすることが期待できる。
【0103】
一般的に皮膚バリアによって細菌などの侵入を防いでいるが、逆にこの皮膚バリアによって効能成分を浸透させにくい状態になっている。このため、通常インビトロ試験で有益な効能成分でも、皮膚浸透性が低い場合には、皮膚外用剤として適していないことがある。
これに対し、本技術のガンマ線照射処理物は、高い皮膚浸透性を有し、かつ、上述のように、ヒアルロン酸産生促進作用をも有する。このように本技術であれば経皮投与によっても、ヒアルロン酸産生促進に関与する各種効能を効率よく発揮させることができるという非常に優れた利点を有する。また、本技術は低分子化されているので、経口摂取や注射投与でも、効率よく効能を発揮させることができると考える。
これに対し、本技術のガンマ線照射処理物は、高い皮膚浸透性を有し、かつ、上述のように、ヒアルロン酸産生促進作用をも有する。このように本技術であれば経皮投与によっても、ヒアルロン酸産生促進に関与する各種効能を効率よく発揮させることができるという非常に優れた利点を有する。また、本技術は低分子化されているので、経口摂取や注射投与でも、効率よく効能を発揮させることができると考える。
【図1】
【配列表】