特許 7526793 ヒト化抗ＣＡ ＩＸ抗体、およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-24

(45)【発行日】2024-08-01

(54)【発明の名称】ヒト化抗ＣＡ ＩＸ抗体、およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/40 20060101AFI20240725BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240725BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240725BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240725BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240725BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240725BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20240725BHJP

【ＦＩ】

C07K16/40

C07K16/46 ZNA

A61K39/395 T

A61P35/00

A61P35/02

A61P43/00 121

G01N33/574 A

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2022526425

(86)(22)【出願日】2019-11-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-06

(86)【国際出願番号】 IB2019059492

(87)【国際公開番号】W WO2021090046

(87)【国際公開日】2021-05-14

【審査請求日】2022-11-07

(73)【特許権者】

【識別番号】522178865

【氏名又は名称】マブプロ エー．エス．

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】ザトヴィコヴァ，ミリアム

(72)【発明者】

【氏名】パストレコヴァ，シルヴィア

(72)【発明者】

【氏名】タカコヴァ，マルティナ

(72)【発明者】

【氏名】バラソヴァ，モニカ

(72)【発明者】

【氏名】パストレク，ヤロミール

【審査官】井関 めぐみ

(56)【参考文献】

【文献】MIRIAM ZAT'OVICOVA; ET AL，MONOCLONAL ANTIBODIES GENERATED IN CARBONIC ANHYDRASE IX-DEFICIENT MICE RECOGNIZE 以下備考，JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS，NL，ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V.，2003年11月，VOL:282, NR:1-2，PAGE(S):117 - 134，http://dx.doi.org/10.1016/j.jim.2003.08.011，DIFFERENT DOMAINS OF TUMOUR-ASSOCIATED HYPOXIA-INDUCED CARBONIC ANHYDRASE IX

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １６／４６

Ｃ０７Ｋ １６／４０

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３５／０２

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ｇ０１Ｎ ３３／５７４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記ａ）およびｂ）を含む、ヒトＣＡ ＩＸを特異的に認識するヒト化抗体：
前記ヒト化抗体は、下記ａ）およびｂ）を含む
ａ）以下の配列を含む、または、有する重鎖可変領域アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＥＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７）、
ｂ）下記からなる群より選択される配列を含む、または、有する軽鎖可変領域アミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１２）、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＮＡＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＧＳＬＱＰＤＤＦＶＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１３）、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１４）、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＮＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＧＦＴＬＴＩＲＳＬＱＰＥＤＹＡＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５）、および、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１６）。

【請求項2】

前記ヒト化抗体は、下記のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗体：
－配列番号７の前記配列を含む、または、有する重鎖可変領域アミノ酸配列、および、配列番号１５の前記配列を含む、または、有する軽鎖可変領域アミノ酸配列。

【請求項3】

前記ヒト化抗体は、重鎖のアロタイプＧ１ｍ１７、１のヒトＩｇＧ定常領域、および、軽鎖のアロタイプＫｍ３のヒトκ定常領域を有する、請求項１または２のいずれか１項に記載のヒト化抗体。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗体の治療有効量、および、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含み、
前記ヒト化抗体は、ヒトＣＡ ＩＸを特異的に認識するものである、医薬組成物。

【請求項5】

疾病または障害の治療に使用するための、前記ヒト化抗体または前記医薬組成物であって、
前記疾病または障害は、細胞増殖性疾病または細胞増殖性障害から選択され、
ここで、前記疾病または障害は、好ましくは、扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、消化器（管）癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、子宮頸癌、脳腫瘍、胃癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、中皮腫、および、頭頚部癌からなる群より選択される癌である、請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗体または請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

ＣＡ ＩＸを発現する乳癌、中皮腫、または、多形性膠芽腫の前記治療における、請求項５に記載の使用するためのヒト化抗体または医薬組成物。

【請求項7】

請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗体の治療有効量の組み合わせを含み、
前記ヒト化抗体は、細胞増殖性疾病または細胞増殖性障害の前記治療に使用するための、ヒトＣＡ ＩＸを特異的に認識するものであり、
前記ヒト化抗体の１つが、第２のヒト化抗体の投与前または投与後に投与される、医薬組成物。

【請求項8】

ＣＡ ＩＸに対する前記ヒト化抗体の日用量または週用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である、請求項５～７のいずれか１項に記載の使用するためのヒト化抗体または医薬組成物。

【請求項9】

用量レジメンは、下記ｉ）～ｉｉｉ）を含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の使用するためのヒト化抗体または医薬組成物：
ｉ）前記ヒト化抗体の複数の同一、または、異なる用量；
ｉｉ）前記ヒト化抗体の複数の漸増用量；または、
ｉｉｉ）１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、または、５週間に１回投与する前記ヒト化抗体の用量。

【請求項10】

用量レジメンは、１～１０の投与サイクルを含み、
それぞれのサイクルは、ヒト化抗体を用いた、１～４週間毎の２～５投入／用量を含み、それぞれ２つのサイクルの間に１～８週間の中断が続く、請求項５～８のいずれか１項に記載の使用するためのヒト化抗体または医薬組成物。

【請求項11】

請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗体の少なくとも１つ、および、少なくとも１つのキャリア、希釈剤、または、賦形剤を含む、診断用組成物。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

〔技術分野〕
本発明は、ヒト炭酸脱水酵素ＩＸに特異的に結合することができるヒト化抗体に関する。より具体的には、本発明は、ＣＡ ＩＸに対する抗体に関する。当該抗体は、マウス由来の相補性決定領域、ならびに、ヒト化重鎖領域およびヒト化軽鎖領域を含む。

【0002】

〔発明の背景〕
ＣＡ ＩＸは、Ｚａｖａｄａ、Ｐａｓｔｏｒｅｋｏｖａ、Ｐａｓｔｏｒｅｋ（ＵＳ５３８７６７６）によって同定された癌関連炭酸脱水酵素である。当該ＣＡ ＩＸは、Ｍ７５モノクローナル抗体（Pastorekova et al,Virology,187:620e626,1992にて最初に説明された）を使用して同定される。当該抗体は、ｃＤＮＡおよびＣＡ ＩＸをコードする遺伝子のクローニング、腫瘍および正常組織におけるＣＡ ＩＸ発現の評価、ＣＡ ＩＸ調節の研究、ならびに、癌の進行および治療抵抗性とＣＡ ＩＸとの関係の研究において使用された。これら全ての研究により、ＣＡ ＩＸは発癌前の腫瘍マーカー／新生物の腫瘍マーカーとして診断および／または予後判定に使用することができ、かつ標的として治療に使用することができるという、最初のＵＳ５３８７６７６でなされた仮定が立証された。これら全ての研究により、Ｍ７５モノクローナル抗体は、種々の免疫学的検出方法および免疫標的アプローチに有用であり、価値あるＣＡ ＩＸに特異的な試薬であることが示された。

【0003】

ＣＡ ＩＸ（代替名：ＭＮタンパク質）は、二酸化炭素の重炭酸イオンおよびプロトンへの可逆的水和を触媒する亜鉛金属酵素の炭酸脱水酵素ファミリーに属する。１５個のヒトＣＡアイソフォームが存在し、そのうち３個は不活性であり、その他の１２個は弱い活性から非常に強い活性にわたる。大部分のアイソザイムは分化した細胞内で主に発現し、種々の組織および器官にて、特定の生理的な役割を果たす（例えば、Pastorekova et al, J Enzyme Inhib Med Chem 19, 199-229, 2004を参照のこと）。ＣＡ ＩＸは、癌、低酸素関連発現パターン、酸性最適ｐＫａ、および酵素の球状触媒領域から突出する余分なプロテオグリカン様領域（ＰＧ）との強い関連のために、特有のポジションを有する。触媒領域（ＣＡ）にて、ＣＡ ＩＸ酵素活性部位は細胞外空間に面し、原形質膜全体のｐＨ調整に寄与する。ＣＡ ＩＸは、ナトリウム依存性重炭酸塩輸送体ＮＢＣｅ１、およびナトリウム依存性重炭酸塩輸送体ＮＢＣｎ１、および乳酸塩、およびプロトン輸送モノカルボン酸塩輸送体ＭＣＴ１、およびプロトン輸送モノカルボン酸塩輸送体ＭＣＴ４、を含む多様な酸の放出体（extruders）および重炭酸塩の取り込み体（importers）と協働することが、現在十分に立証されている。ＣＡ ＩＸは、ｐＨ調節に関して、腫瘍表現型の支持に関与するという複数の結果を有する。ＣＡ ＩＸはまた、細胞接着の間および固体支持体上での拡散の間に、フォーカルアドヒージョンコンタクトの組立ておよび成熟の一因となる接着分子として作用する。一方で、ＣＡ ＩＸは、ベータカテニンへの競合的結合を介して、Ｅ－カドヘリンを細胞骨格固定から切り離すことにより、細胞間接着接触を不安定化することができる。実験エビデンスの蓄積により、ＣＡ ＩＸは、低酸素およびアシドーシスの条件下での癌細胞の生存保護、癌細胞の移動／浸潤の促進、転移性播種の助長、ホーミングおよび転移性病変の増殖を含む、癌発症の多様な態様に機能的に関与することが示唆されている。

【0004】

ＣＡ ＩＸは、低酸素化（無酸素症から中等度の低酸素症までの範囲）に対する最良の応答物の１つである。これは主に、転写開始部位近傍に局在する低酸素応答因子（ＨＲＥ）コンセンサス配列に結合する低酸素誘導因子ＨＩＦ－１による転写調節のためである（例えば、Wykoff et al,Cancer Res 60,7075-7083,2000を参照のこと）。ＨＩＦの分解を引き起こすｐＶＨＬ（von Hippel-Lindau）癌抑制タンパク質の不活性化により、腎臓腫瘍におけるＣＡ ＩＸ発現が上昇する（例えば、Ivanov et al,Proc Natl Acad Sci USA 95,12596-12601,1998を参照のこと）。さらに、低酸素は、ＣＡ ＩＸ ｍＲＮＡのスプライシングおよびＣＡ ＩＸタンパク質の細胞質尾部のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）媒介リン酸化を調節する。両方の場合において、それらはその酵素活性に影響を及ぼす（例えば、Barathova et al,Br J Cancer 98,129-136,2008; Ditte et al,Cancer Res 71,7558-7567,2011を参照のこと）。

【0005】

ＣＡ ＩＸは、低酸素およびカルシウム枯渇によって、ならびに、その細胞外部分に結合する特異的抗体によって、誘導されるエンドサイトーシスを介して、細胞表面から細胞質に内在化し得る（例えば、Zatovicova et al,Curr Pharm Des 16,3255-3263,2010を参照のこと）。ＣＡ ＩＸの外部領域は、マトリックスメタロプロテイナーゼＡＤＡＭ１７によって切断され、炭酸脱水酵素阻害剤または化学療法剤の低酸素症、アシドーシスおよび毒性障害に反応して微環境に放出され得る（例えば、Zatovicova et al,Br J Cancer 93,1267-1276,2005; Vidlickova et al,BMC Cancer 16,239,2016を参照のこと）。

【0006】

非癌組織におけるＣＡ ＩＸ発現はまれである。ＣＡ ＩＸ発現は、一般的に胃、胆のう、膵臓および腸の上皮に限定される。

【0007】

ＣＡ ＩＸの臨床的価値については、１０００を超える研究があり、多様な腫瘍の種類や状況において、バイオマーカーおよび／または治療の標的となり得ることが示唆されている（例えば、Pastorek and Pastorekova,Seminars in Cancer Biology 31,52-64,2015を参照のこと）。

【0008】

ＣＡ ＩＸは、ＶＨＬ癌抑制遺伝子の不活性化変異／欠失を有する明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）の９０％を超える細胞に高率に発現する。多くの他の腫瘍型では、ＣＡ ＩＸは、低酸素および／または酸性の領域で局所的に発現し、一般的には腫瘍の病期および悪性度の進行に伴って増加する。ＣＡ ＩＸは、癌患者の体液中にも検出することができ、癌患者の非侵襲的スクリーニングまたはモニタリングのために、臨床的に利用することができる。

【0009】

２４，０００人を超える非ＲＣＣ腫瘍患者を対象とした研究のメタアナリシスから、免疫組織化学により評価したＣＡ ＩＸ発現と、全てのエンドポイント（全生存、無病、局所領域制御、疾病特性、無転移生存、および無増悪生存）との間に強い有意な関連性が示された（例えば、van Kuijk et al,Front Oncol 6,69,2016を参照のこと）。サブグループ分析では、大部分の腫瘍部位および腫瘍型について、同様の関連性が示された。要するに、これらの結果は、高いＣＡ ＩＸ発現を伴う腫瘍を有する患者が、腫瘍型または腫瘍部位とは無関係に、疾病の進行、および転移発生のより高いリスクを有することを示す。さらに、ＣＡ ＩＸ陽性と、他の癌関連分子標的（例えば、ＨＥＲ－２（ヒト上皮増殖因子受容体２）、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、およびＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１））に向けた化学療法、放射線療法、さらには免疫療法に対する抵抗性との相関を示す研究が数多く存在する。これらの知見は、ＣＡ ＩＸ発現に基づいて患者の予後および治療転帰を決定する臨床検査の有用性を立証し、新しいＣＡ ＩＸ標的治療計画の発展のための理論的根拠を提供する。

【0010】

免疫療法に基づくＣＡ ＩＸ標的計画は、ＣＡ ＩＸの腫瘍関連発現パターンを利用する。このアプローチは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用する。従って、当該アプローチは、現在、化学的な化合物では獲得できないＣＡ ＩＸに対する高い特異性および選択性を保証する。抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を主な作用メカニズムとする場合、殺傷効果は速く、代償メカニズムの発達をサポートしない。ＣＡ ＩＸ特異的モノクローナル抗体を用いた従来の臨床試験では、患者の層別化（ＡＤＣＣ応答誘導ＧｃＧ２５０、Ｗｉｌｅｘ）が行われていなかったため、または許容不可能な毒性（抗体－薬物結合体ＭＭＡＥ－ＢＡＹ７９－４６２０、Ｂａｙｅｒ）が認められたため、主要エンドポイントを満たさなかった。このように、免疫療法の好ましい計画には、ＡＤＣＣおよびＣＡ ＩＸ発現レベルに基づく患者の層別化が含まれる。

【0011】

特異性は、特定のｍＡｂが癌治療にうまく使用され得るか否かに関する決定において重要な因子である。この特性は、ＣＡ ＩＸに特有の腫瘍関連発現パターンによって獲得される。一方で、この特性は、正常組織ではわずかに限定された発現のみである。ｃｃＲＣＣ研究の従来の臨床エビデンスは、ＣＡ ＩＸを標的とした抗体に基づく免疫療法が安全で、かつ耐容性も良好であることを示唆している（例えば、Chamie et al,JAMA Oncology 3:913-920,2017を参照のこと）。さらに、治療の安全性は、ＣＡ ＩＸ発現が腫瘍表現型と強く関連しており、ＣＡ ＩＸ発現がごく少数の非癌組織に限定され、当該非癌組織では、基底膜が静脈内投与された抗体を上皮細胞に到達させない、という複数の研究エビデンスと関連している。ＣＡ ＩＸ特異的キメラ抗体ｃＧ２５０（マウスＧ２５０の可変領域およびヒトＩｇＧに由来する定常領域を有し、ＲＥＮＣＡＲＥＸ（登録商標）またはＧＩＲＥＮＴＵＸＩＭＡＢ（登録商標）としても知られる）に関する文献データは、グレードＩＩＩおよびグレードＩＶ、ならびに、用量制限毒性を示さなかった。一方で、ＲＣＣにおける優れた蓄積、および中央値／全生存率の増加を示した（例えば、Steffens et al,J Clin Oncol 15:1529-1537,1997; Davis et al,Cancer Immunity 7:14-23 2007; Bleumer et al,Br J Cancer 90:985-990,2004を参照のこと）。さらに、ｃＧ２５０および低用量インターフェロンαの併用療法は、進行性転移性ＲＣＣ患者にとって安全で、耐容性が良好であり、臨床的に有用であった（例えば、Siebels et al,World J Urol 29:121-126,2011を参照のこと）。

【0012】

ＷＯ２００３／１０００２９は、Ｃａｒ９遺伝子の標的破壊を伴う、ＣＡ ＩＸ欠損マウスにて生成されたＣＡ ＩＸ特異的マウスモノクローナル抗体を開示する。特異的ハイブリドーマ細胞によって産生される抗体セットは、ＶＩＩ／２０ｍＡｂおよびＩＶ／１８ｍＡｂを含む（Zatovicova et al,J Immunol Methods 282,117-134,2003に記載されるように）。ｍＡｂはＣＡ ＩＸに対して高度に選択的であり、正常な分化組織において主に発現するヒトＣＡＩ、ＣＡＩＩおよびＣＡＸＩＩタンパク質と交差反応しない。従って、両方のモノクローナル抗体は、腫瘍特異的効果を正確に有することが期待されている。

【0013】

抗体ＶＩＩ／２０は、ＣＡ ＩＸの触媒（ＣＡ）領域にてコンフォメーションエピトープに結合する。前記抗体は、ＣＡ ＩＸの内在化を誘導し、皮下腫瘍異種移植片を有するマウスモデルにて、強力な抗腫瘍効果をｉｎ ｖｉｖｏで示す（例えば、Zatovicova et al,Curr Pharm Des 16,3255-3263,2010を参照のこと）。抗体ＩＶ／１８は、ＣＡ ＩＸのプロテオグリカン様（ＰＧ）領域中にて線状エピトープに結合し、内在化を誘導しない。これら２つのｍＡｂの能力は、ＣＡ ＩＸの２つの別々の細胞外領域上にて抗原領域を認識し、有効な標的化の機会を提供する。ＶＩＩ／２０モノクローナル抗体およびＩＶ／１８モノクローナル抗体の両方が、ＣＡ ＩＸ欠損マウス中にて生成されるが、これらはもはや利用し得ない。従って、前記抗体は再生成することができず、その独自性を強調するに過ぎない。モノクローナル抗体に関する全ての前記特性は、抗癌免疫療法において、使用を意図したそれらヒト化のための理論的根拠を提供する。

【0014】

ＣＡ ＩＸに関連する状態（例えば、癌）の治療のために、ＣＡ ＩＸを標的とする、安全かつ有効な抗体に対する必要性が、当該分野において存在する。本発明はその必要性を満たし、かつ他の利点を提供する。

【0015】

〔発明の概要〕
本発明は、下記ａ）およびｂ）を含む、ヒトＣＡ ＩＸを特異的に認識するヒト化抗体を提供する：
ａ）下記の配列と同一であるＣＤＲ配列、または、下記の配列と１または２個のアミノ酸が異なるＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域配列：
ＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１）、および、
ＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧ（配列番号２）、および、
ＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶ（配列番号３）；または、
下記の配列と同一であるＣＤＲ配列、または、下記の配列と１または２個のアミノ酸が異なるＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域配列：
ＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨ（配列番号１７）、および、
ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号１８）、および、
ＶＣＧＳＷＦＡＹ（配列番号１９）；
および、
ｂ）下記の配列と同一であるＣＤＲ配列、または、下記の配列と１または２個のアミノ酸が異なるＣＤＲ配列を含む軽鎖可変領域配列：
ＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳ（配列番号９）、および、
ＱＡＳＮＬＨＴ（配列番号１０）、および、
ＱＱＧＱＳＹＰＦＴ（配列番号１１）；または、
下記の配列と同一であるＣＤＲ配列、または、下記の配列と１または２個のアミノ酸が異なるＣＤＲ配列を含む軽鎖可変領域配列：
ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号２５）、および、
ＦＴＳＴＲＱＳ（配列番号２６）、および、
ＱＱＨＹＳＩＰＬＴ（配列番号２７）。

【0016】

いくつかの実施形態では、本発明のヒト化抗体は、ＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨ（配列番号１）、および、ＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧ（配列番号２）、および、ＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶ（配列番号３）の前記配列と同一であるＣＤＲ配列、または、前記配列と１または２個のアミノ酸が異なるＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域配列；および、ＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳ（配列番号９）、および、ＱＡＳＮＬＨＴ（配列番号１０）、および、ＱＱＧＱＳＹＰＦＴ（配列番号１１）の前記配列と同一であるＣＤＲ配列、または、前記配列と１または２個のアミノ酸が異なる前記ＣＤＲ配列を含む軽鎖可変領域配列を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、本発明のヒト化抗体は、ＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨ（配列番号１７）、および、ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号１８）、および、ＶＣＧＳＷＦＡＹ（配列番号１９）の前記配列と同一であるＣＤＲ配列、または、前記配列と１または２個のアミノ酸が異なるＣＤＲ配列を含む重鎖可変領域配列；および、ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号２５）、および、ＦＴＳＴＲＱＳ（配列番号２６）、および、ＱＱＨＹＳＩＰＬＴ（配列番号２７）の前記配列と同一であるＣＤＲ配列、または、前記配列と１または２個のアミノ酸が異なる前記ＣＤＲ配列を含む軽鎖可変領域配列を含む。

【0018】

一態様では、本発明によるヒトＣＡ ＩＸを特異的に認識するヒト化抗体は、下記からなる群より選択される少なくとも１つの可変領域を含む：
－下記の配列を含む、または、有する重鎖可変領域：
Ｘ^１ＶＸ^２ＬＶＸ^３ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＸ^４ＳＬＲＬＳＣＸ^５ＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＸ^６ＧＬＥＷＸ^７Ｘ^８ ＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＸ^９Ｘ^１０Ｘ^１１Ｘ^１２Ｘ^１３Ｘ^１４ＹＬＱＭＮＳＬＸ^１５Ｘ^１６ＥＤＴＡＸ^１７ＹＹＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶＷＧＸ^１８ＧＴＸ^１９ＶＴＶＳＳ（配列番号３３）
ここで、
Ｘ^１＝Ｅ、または、Ｑ
Ｘ^２＝Ｑ、または、Ｒ
Ｘ^３＝Ｅ、または、Ｑ
Ｘ^４＝Ｇ、または、Ｒ
Ｘ^５＝Ａ、または、Ｔ
Ｘ^６＝Ｋ、または、Ｒ
Ｘ^７＝Ｖ、または、Ｌ
Ｘ^８＝Ａ、または、Ｇ
Ｘ^９＝Ｄ、または、Ｎ
Ｘ^１０＝Ｓ、または、Ａ
Ｘ^１１＝Ｋ、または、Ｔ、または、Ｅ
Ｘ^１２＝Ｎ、または、Ｔ
Ｘ^１３＝Ｓ、または、Ｉ
Ｘ^１４＝Ｌ、または、Ａ
Ｘ^１５＝Ｋ、または、Ｒ
Ｘ^１６＝Ｔ、または、Ａ、または、Ｉ
Ｘ^１７＝Ｖ、または、Ｉ
Ｘ^１８＝Ｑ、または、Ｋ
Ｘ^１９＝Ｔ、または、Ｌ、または、Ｍ；および、
－下記の配列を含む、または、有する軽鎖可変領域：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＸ^２０ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＸ^２１ＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＸ^２２ＡＰＸ^２３ＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＸ^２４ＦＴＸ^２５ＴＩＸ^２６ＳＬＱＰＸ^２７ＤＸ^２８Ｘ^２９ＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＸ^３０ＧＴＫＸ^３１ＥＩＫ（配列番号３４）
ここで、
Ｘ^２０＝Ｓ、または、Ｔ
Ｘ^２１＝Ｔ、または、Ｎ
Ｘ^２２＝Ｋ、または、Ｎ、または、Ｅ
Ｘ^２３＝Ｎ、または、Ｋ
Ｘ^２４＝Ｈ、または、Ｅ、または、Ｄ、または、Ｇ
Ｘ^２５＝Ｌ、または、Ｆ
Ｘ^２６＝Ｓ、または、Ｇ、または、Ｒ
Ｘ^２７＝Ｅ、または、Ｄ
Ｘ^２８＝Ｉ、または、Ｆ、または、Ｙ
Ｘ^２９＝Ａ、または、Ｖ
Ｘ^３０＝Ｑ、または、Ｇ
Ｘ^３１＝Ｖ、または、Ｌ；および、
－下記の配列を含む、または、有する重鎖可変領域：
Ｘ^３２ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＸ^３３ＶＱＰＧＸ^３４ＳＬＸ^３５ＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨＷＶＲＱＡＸ^３６ＧＸ^３７ＧＬＥＷＶＸ^３８ ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＸ^３９ＳＫＸ^４０ＴＸ^４１ＹＬＱＸ^４２ＮＳＬＸ^４３Ｘ^４４ＥＤＴＡＶＹＹＣＶＣＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＸ^４５ＶＴＶＳＳ（配列番号３５）
ここで、
Ｘ^３２＝Ｅ、または、Ｑ
Ｘ^３３＝Ｌ、または、Ｖ
Ｘ^３４＝Ｇ、または、Ｒ
Ｘ^３５＝Ｋ、または、Ｒ
Ｘ^３６＝Ｓ、または、Ｐ
Ｘ^３７＝Ｋ、または、Ｒ
Ｘ^３８＝Ａ、または、Ｇ
Ｘ^３９＝Ｄ、または、Ｎ
Ｘ^４０＝Ｎ、または、Ｓ
Ｘ^４１＝Ａ、または、Ｌ
Ｘ^４２＝Ｍ、または、Ｖ
Ｘ^４３＝Ｋ、または、Ｒ
Ｘ^４４＝Ｔ、または、Ａ
Ｘ^４５＝Ｌ、または、Ｔ；および、
－下記の配列を含む、または、有する軽鎖可変領域：
ＤＸ^４６Ｘ^４７ＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＸ^４８ＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＸ^４９ＱＱＫＰＧＱＸ^５０ＰＸ^５１Ｘ^５２Ｘ^５３ＩＹＦＴＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＸ^５４ＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＸ^５５ＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＸ^５６ＣＱＱＨＹＳＩＰＬＴＦＧＱＧＴＸ^５７Ｘ^５８ＥＩＫ（配列番号３６）
Ｘ^４６＝Ｖ、または、Ｉ
Ｘ^４７＝Ｖ、または、Ｑ
Ｘ^４８＝Ｖ、または、Ａ
Ｘ^４９＝Ｙ、または、Ｆ
Ｘ^５０＝Ｓ、または、Ｐ
Ｘ^５１＝Ｋ、または、Ｎ
Ｘ^５２＝Ｌ、または、Ｖ
Ｘ^５３＝Ｌ、または、Ｖ
Ｘ^５４＝Ｓ、または、Ｔ
Ｘ^５５＝Ｓ、または、Ｎ
Ｘ^５６＝Ｙ、または、Ｆ
Ｘ^５７＝Ｋ、または、Ｑ
Ｘ^５８＝Ｌ、または、Ｖ。

【0019】

好ましい実施形態では、配列番号３３の前記重鎖領域は、配列番号３４の前記軽鎖領域と組み合わされる。別の好ましい実施形態では、配列番号３５の前記重鎖領域は、配列番号３６の前記軽鎖領域と組み合わされる。

【0020】

好ましい一態様では、本発明はヒトＣＡ ＩＸを特異的に認識するヒト化抗体であって、下記ａ）～ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの可変領域を含む、ヒト化抗体を提供する：
ａ）下記からなる群より選択される配列を含む、または、有する重鎖可変領域アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＩＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号４）、
ＥＶＲＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＧＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＴＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＩＹＹＣＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５）、
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＴＩＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６）、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＥＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７）、および、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号８）；
ｂ）下記からなる群より選択される配列を含む、または、有する軽鎖可変領域アミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１２）、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＮＡＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＧＳＬＱＰＤＤＦＶＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１３）、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１４）、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＮＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＧＦＴＬＴＩＲＳＬＱＰＥＤＹＡＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５）、および、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１６）；
ｃ）下記からなる群より選択される配列を含む、または、有する重鎖可変領域アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＣＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２０）、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＣＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２１）、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＶＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＣＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２２）、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＣＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２３）、および、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＣＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２４）；および、
ｄ）下記からなる群より選択される配列を含む、または、有する軽鎖可変領域アミノ酸配列
ＤＶＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＦＴＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＨＹＳＩＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２８）、
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＮＬＶＩＹＦＴＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＦＣＱＱＨＹＳＩＰＬＴＦＧＱＧＴＱＶＥＩＫ（配列番号２９）、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＦＴＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＦＣＱＱＨＹＳＩＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３０）、
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＶＬＩＹＦＴＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＨＹＳＩＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３１）、および、
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＦＴＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＨＹＳＩＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３２）。

【0021】

好ましい実施形態では、１つの抗体中にて、ａ）に列挙される前記重鎖可変領域は、ｂ）に列挙される前記軽鎖可変領域と組み合わされる。

【0022】

別の好ましい実施形態では、１つの抗体中にて、ｃ）に列挙される前記重鎖可変領域は、ｄ）に列挙される前記軽鎖可変領域と組み合わされる。

【0023】

好ましくは、本発明のヒト化抗体は下記のアミノ酸配列を含む：
－配列番号７の前記配列を含む、または、有する重鎖可変領域アミノ酸配列；および、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および、配列番号１６からなる群より選択される前記配列を含む、または、有する軽鎖可変領域アミノ酸配列；
または、
－配列番号２２、および、配列番号２３からなる群より選択される前記配列を含む、または、有する重鎖可変領域アミノ酸配列；および、配列番号２８、配列番号２９、および、配列番号３２からなる群より選択される前記配列を含む、または、有する軽鎖可変領域アミノ酸配列。

【0024】

本発明の特に好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は下記のアミノ酸配列を含む：
－配列番号７の前記配列を含む、または、有する重鎖可変領域アミノ酸配列、および、配列番号１５の前記配列を含む、または、有する軽鎖可変領域アミノ酸配列；または、
－配列番号２３の前記配列を含む、または、有する重鎖可変領域アミノ酸配列、および、配列番号３２の前記配列を含む、または、有する軽鎖可変領域アミノ酸配列。

【0025】

好ましくは、本発明のヒト化抗体は、重鎖のヒトＩｇＧ定常領域（アロタイプＧ１ｍ１７、１）、および、軽鎖のヒトκ定常領域（アロタイプＫｍ３）を有する。

【0026】

本発明はさらに、前述のヒト化抗体、および、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。前記ヒト化抗体は、ヒトＣＡ ＩＸを特異的に認識する。

【0027】

本発明はまた、ＣＡ ＩＸタンパク質の発現、活性化、または、機能に関連する疾病または障害の治療に使用するための、前述の前記ヒト化抗体または前記医薬組成物を含む。前記疾病または障害は、一般的には、細胞増殖性疾病または細胞増殖性障害を含む。前記疾病および障害は、例えば、扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、消化器（管）癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、子宮頸癌、脳腫瘍、胃癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、中皮腫、および、頭頚部癌からなる群より選択される癌などが挙げられる。

【0028】

好ましくは、本発明は、ＣＡ ＩＸを発現する乳癌、中皮腫、または多形性膠芽腫の前記治療に使用するためのものである、前述のヒト化抗体または医薬組成物を提供する。

【0029】

医薬組成物の前記ヒト化抗体の医学的使用について、１つまたは複数のヒト化抗体を使用することができる。前記ヒト化抗体または前記ヒト化抗体を含む医薬組成物は、同時にまたは連続して投与することができる。好ましくは、前記医薬組成物は連続的に投与される。

【0030】

さらに、本発明は、ＣＡ ＩＸタンパク質の発現、活性化、または、機能に関連する疾病または障害の治療方法を提供する。前記方法は、それを必要とする対象に、前述のヒト化抗体または医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む。前記疾病または障害は、一般的には、細胞増殖性疾病または細胞増殖性障害を含む。前記疾病および障害は、例えば、扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、消化器（管）癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、子宮頸癌、脳腫瘍、胃癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、中皮腫、および、頭頚部癌からなる群より選択される癌などが挙げられる。

【0031】

好ましくは、本発明は、ＣＡ ＩＸを発現する乳癌、中皮腫、または多形性膠芽腫の治療方法を提供する。前記方法は、それを必要とする対象に、前述のヒト化抗体または医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む。

【0032】

さらに、本発明は、対象の腫瘍の侵襲性を低減する、または、抑制する方法を提供する。前記方法は、前述のヒト化抗体または医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与して、その結果、対象内の腫瘍の侵襲性を低減する、または、抑制する工程を含む。

【0033】

ＣＡ ＩＸに対する前記ヒト化抗体の患者に投与する適切な日用量または週用量は、好ましくは、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～１５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。

【0034】

ＣＡ ＩＸに対する前記ヒト化抗体は、多くの実行可能なレジメンで投与することができる。一般的には、下記ｉ）～ｉｉｉ）のレジメンが適し得る：
ｉ）前記ヒト化抗体の複数の同一、または、異なる用量；
ｉｉ）前記ヒト化抗体の複数の漸増用量；または、
ｉｉｉ）１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、または、５週間に１回投与する前記ヒト化抗体の用量。

【0035】

いくつかの実施形態では、前述のＣＡ ＩＸに対する前記ヒト化抗体または前記医薬組成物の投与は、１～１０の投与サイクルを含む。前記投与サイクルはそれぞれ、ヒト化抗体を用いた、１～４週間毎の２～５投入／用量を含む。前記投与サイクルは、それぞれ２つのサイクルの間に１～８週間の中断が続く。

【0036】

本発明はさらに、本明細書中で前述したヒト化抗体の少なくとも１つ、および、少なくとも１つのキャリア、希釈剤、または、賦形剤を含む、診断用組成物を提供する。

【0037】

本発明の抗体を用いる適切な診断アッセイには、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、親和分離法、免疫組織化学、および、ウェスタンブロッティング法など）が挙げられる。

【0038】

従って、本発明は、それを必要とする対象の癌を診断するための方法を提供する。前記方法は、本明細書に記載の前記診断用組成物を、前記対象に由来する、または、前記対象から得られた生物学的サンプルと接触させる工程を含む。ここで、規定の閾値を超える複合体の形成は、前記対象内の癌を示す。

【0039】

診断用組成物にて、または対象の癌を診断するための前記方法にて、前記ヒト化抗体は、常磁性、放射性、または、蛍光性である部分に対して、連結、結合、または、共役され得る。前記部分は、イメージング時に検出可能なものである。

【0040】

〔図面の簡単な説明〕
図１：肺転移形成に対するマウスＩＶ／１８モノクローナル抗体の効果。（Ａ）全放射効率は、対照群またはＩＶ／１８ｍＡｂ処置群のいずれかのマウス肺のＨＴ１０８０－ＲＦＰ癌細胞の量を反映する。（Ｂ）対照マウスおよびＩＶ／１８ｍＡｂ処置マウスの、蛍光の肺転移の代表的なｅｘ ｖｉｖｏ画像。

【0041】

図２：ＥＬＩＳＡにより測定したＣＡ ＩＸ陽性（Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ）抗原またはＣＡ ＩＸ陰性（Ｃ－３３ａ＿ｎｅｏ）抗原のいずれかを有する、２５個のＣＡ９ｈｕ－１変異体およびＣＡ９ｈｕ－２変異体の反応度。抗体希釈剤のみを含有するサンプルは、「抗体なし」と記す。親ＶＩＩ／２０（Ａ）または親ＩＶ／１８（Ｂ）（「マウス抗体」と記す）、ならびにキメラＨＣ０ＬＣ０（マウス可変領域およびヒトＩｇ定常領域を有する）抗体を、参照サンプルとして使用した。グラフ中のデータは、誘導の倍数として表される。前記データは、（ＣＡ ＩＸ陽性抗原から４９２ｎｍで測定された吸光度のＯ．Ｄ．値）／（ＣＡ ＩＸ陰性抗原から４９２ｎｍで測定された吸光度のＯ．Ｄ．値）として計算される。

【0042】

図３：ＣＡ ＩＸ陽性（Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ）細胞またはＣＡ ＩＸ陰性（Ｃ－３３ａ＿ｎｅｏ）細胞のいずれかを用いた、抗体依存性細胞障害に関するＣＡ９ｈｕ－１およびＣＡ９ｈｕ－２の２５個のヒト化変異体のスクリーニング。キメラＨＣ０ＬＣ０（マウス可変領域およびヒトＩｇ定常領域を有する）抗体を、参照サンプルとして使用した。グラフ中のデータは、相対発光単位（ＲＬＵ）での発光として表される。前記データは、平均±標準偏差値を表す。

【0043】

図４：ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５の存在下で、ヒトＰＢＭＣと共に培養したＢＴ－２０スフェロイドの３Ｄモデル。ＢＴ－２０スフェロイド内のＰＢＭＣ細胞の突起（両方とも、ＣｅｌｌＢｒｉｔｅ 染料を使用して予め染色した）は、処置３日後にスフェロイド体積を横切ってＺスタック切片から得た（図の上部）。ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５が、スフェロイド形態に及ぼす影響に関する免疫組織化学分析。ＰＢＭＣと共培養し、ヒト化抗体変異体と１１日間処置した、ＢＴ－２０スフェロイドの代表的な切片。ＣＡ ＩＸ染色の特徴的なパターンがＢＴ－２０スフェロイドを横切る膜内で観察された（図の下部）。

【0044】

図５：選択されたヒト化抗体（ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５）を使用した、ポリ－ＨＥＭＡコーティング皿上での、２４時間および７２時間後のＣ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸの多細胞凝集の分析。ヒト化抗体の非存在下でインキュベートしたＣ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ細胞は、「陰性対照」と記す。

【0045】

図６：選択されたヒト化抗体（ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５）を使用した、ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによる、７２時間処置後のＣ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ細胞の分析。ヒト化抗体の非存在下でインキュベートしたＣ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ細胞は、「陰性対照」と記す。

【0046】

〔発明の詳細な説明〕
＜略語＞
本発明の詳細な説明および実施例の全体にわたって、下記の略語が使用される：
３Ｄ 三次元
ＡＤＣＣ 抗体依存性細胞障害
ｃｃＲＣＣ 明細胞腎細胞癌
ＣＡ ＩＸ 炭酸脱水酵素ＩＸ
ＣＤＣ 補体依存性細胞障害
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＣＲＡ サイトカイン放出アッセイ
ＤＯＸ ドキソルビシン
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＣＳ 胎仔血清
ＦＲ フレームワーク領域
ＨＥＲ－２ ヒト上皮増殖因子受容体２
ＨＩＦ－１ 低酸素誘導因子１
ＨＲＥ 低酸素応答因子
ＨＶＲ 超可変領域
ＩＦＮγ インターフェロンγ
ＩＬ インターロイキン
ＩＭＧＴ 免疫遺伝学情報システム
ＩＮＮ 国際一般名
ｋＤａ キロダルトン
Ｋ_Ｄ 解離定数
ｍＡｂ モノクローナル抗体
Ｍ モーラー
ＭＣＴ モノカルボン酸輸送体
ＭＨＣ 主要組織適合遺伝子複合体
ＰＢＭＣ 末梢血単核球
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＤ－１ プログラム細胞死タンパク質１
ＰＤ－Ｌ１ プログラム細胞死リガンド１
ＰＧ プロテオグリカン様領域
ＰＫＡ プロテインキナーゼＡ
ＰＰＡ プロテオームプロファイラアレイ
ＲＦＰ 赤色蛍光タンパク質
ＳＥＢ ブドウ球菌エンテロトキシンＢ
ＳＰＲ 表面プラズモン共鳴
ＴＮＢＣ トリプルネガティブ乳癌
ＴＮＦα 腫瘍壊死因子α
Ｖ_Ｈ 免疫グロブリン重鎖可変領域
Ｖ_Ｌ 免疫グロブリン軽鎖可変領域
ＶＥＧＦ 血管内皮細胞増殖因子
ＶＨＬ フォンヒッペルリンドウ病
ＷＨＯ 世界保健機関
＜細胞株＞
８－ＭＧ－ＢＡ ヒト膠芽腫癌細胞（Ｃｅｌｌｏｓａｕｒｕｓ ＣＶＣＬ＿１０５２）
４２－ＭＧ－ＢＡ ヒト膠芽腫癌細胞（Ｃｅｌｌｏｓａｕｒｕｓ ＣＶＣＬ＿１７９８）
ＢＴ－２０ ヒト乳癌細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１９）
Ｃ－３３ａ ヒト子宮頸癌細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３１）
ＪＩＭＴ－１ ヒト乳癌細胞（ＨＭＳ ＬＩＮＣＳデータベースＩＤ：５１１１８）
ＨＴ１０８０ ヒト線維肉腫癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１２１）
＜定義＞
本発明をより容易に理解することができるように、特定の技術用語および科学用語を下記に具体的に定義する。本明細書の他の箇所で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。

【0047】

用語「ＣＡ ＩＸ」は、ＣＡ９遺伝子のタンパク質産物を指すために使用される（例えば、ＮＰ＿００１２０７．２）。

【0048】

用語「抗ＣＡ ＩＸ抗体」、「ＣＡ ＩＸを認識する抗体」、「ＣＡ ＩＸに対する抗体」、および「ＣＡ ＩＸへの抗体」は互換性がある。それらは本明細書にて、ＣＡ ＩＸタンパク質に結合する抗体を指すために使用される（その結果、前記抗体は、ＣＡ ＩＸを標的化する場合に、診断薬および／または治療薬として有用である）。

【0049】

本明細書で使用される用語「抗原」は、抗体形成を誘導し、抗体による結合を受けやすい分子または分子の一部を指す。抗原は、１つまたは複数のエピトープを有し得る。特異的反応は、抗原が高度に選択的な方法でその対応する抗体と反応し、他の抗原によって誘導され得る多数の他の抗体とは反応しないことを示すことを意味する。本発明による抗原は、ＣＡ ＩＸタンパク質またはその断片である。

【0050】

本明細書で使用される用語「抗原決定基」または「エピトープ」は、特定の抗体と特異的に反応する抗原分子の領域を指す。エピトープに由来するペプチド配列は、動物に免疫性を与え、さらなる抗体またはモノクローナル抗体を産生するために、当該分野で公知の方法を適用して、単独で、または、キャリア部分と共に使用することができる。エピトープに由来する単離されたペプチドは、抗体を検出するための診断方法において、前記抗体の抑制が必要とされる場合の治療薬として使用することができる。

【0051】

本明細書で使用される用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、ジスルフィド結合によって共に連結された２つの重鎖および２つの軽鎖の組成物を指す。それぞれの軽鎖は、「Ｙ」字形配置のジスルフィド結合によって、それぞれの重鎖に連結されている。抗体のタンパク質分解消化は、Ｆｖ（断片可変）およびＦｃ（断片結晶）領域を生じる。抗原結合領域Ｆａｂは、ポリペプチド配列が変化する領域を含む。用語Ｆ（ａｂ'）２は、ジスルフィド結合によって共に連結された２つのＦａｂ’アームを表す。抗体の中心軸は、Ｆｃ断片と呼ばれる。それぞれの重鎖は、一端に可変領域（Ｖ_Ｈ）と、それに続く多数の定常領域（Ｃ_Ｈ）とを有する。それぞれの軽鎖可変は、一方の端に可変領域（Ｖ_Ｌ）を有し、他方の端に定常領域（Ｃ_Ｌ）を有する。軽鎖可変領域は、重鎖可変領域とアラインされ、軽鎖定常領域は、重鎖の最初の定常領域とアラインされている。軽鎖および重鎖のそれぞれの対の可変領域は、抗原結合部位を形成する。軽鎖上および重鎖上の領域は、同じ一般構造を有しており、それぞれの領域は、４つのフレームワーク領域を含む。これらの配列は比較的保存されており、相補性決定領域（ＣＤＲ１～３）として知られる３つの超可変領域によって連結されている。これらの領域は、抗原結合部位の特異性および親和性に寄与する。重鎖のアイソタイプ（γ、α、δ、εまたはμ）は、免疫グロブリンクラス（それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ）を決定する。軽鎖は、全ての抗体クラスにおいて見出される２つのアイソタイプ（カッパ、κまたはラムダ、λ）のいずれかである。

【0052】

「単離された」抗体は、自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施形態では、抗体は、９５％または９９％を超える純度まで精製される（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィーによって測定される場合）。

【0053】

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の母集団から得られる抗体を指す。すなわち、母集団を構成する個々の抗体は、少しの頻度で生じ得る自然発生的な突然変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原に対するものである。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。

【0054】

本明細書で使用される用語「キメラ抗体」は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残部が異なる供給源に由来する抗体を指す。

【0055】

本明細書で使用される用語「ヒト化抗体」は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含む抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は少なくとも１つ、一般的には２つの可変領域の実質的に全てを含む。ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全ては、非ヒト化抗体の可変領域に対応する。ＦＲの全てまたは実質的に全ては、ヒト化抗体の可変領域に対応する。ヒト化抗体は、ヒト化抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を任意に含んでいてもよい。抗体の「ヒト化形態」（例えば、非ヒト化抗体）は、ヒト化を経た抗体を指す。

【0056】

本明細書で使用される用語「アクセプターヒトフレームワーク」は、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）フレームワークまたは軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、またはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化の数は、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下である。いくつかの実施形態では、Ｖ_Ｌアクセプターヒトフレームワークは、配列中にてＶ_Ｌヒトイムノグロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。

【0057】

本明細書で使用される用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、それぞれの抗体可変領域を指す。当該超可変領域は配列中にて超可変であり、および／または、構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する。一般に、本来の４鎖抗体は、６つのＨＶＲ、３つのＶ_Ｈ、３つのＶ_Ｌを含む。ＨＶＲは一般に、超可変ループおよび／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含む。後者は最も高い配列変異性であり、および／または抗原認識に関与する。

【0058】

本明細書で使用される用語「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の強度の総計を指す。本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、「結合親和性」は、結合ペア（例えば、抗体および抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。パートナーＹに対するＸ分子の親和性は、一般に解離定数（Ｋ_Ｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。

【0059】

本明細書で使用される用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。当該エフェクター機能は、抗体クラスによって変化する。抗体エフェクター機能の例として、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）が挙げられる。

【0060】

本明細書で使用される用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。

【0061】

本明細書で使用される用語である、薬剤（例えば、医薬製剤）の「有効量」は、所望の治療的転帰または予防的転帰を達成するために必要な用量および必要な期間における、有効な量を指す。

【0062】

本明細書で使用される用語「医薬製剤」は、調製物を指す。当該医薬製剤は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効となるような形態である。前記医薬製剤は、製剤が投与される対象に対して、許容できない毒性を有するさらなる成分を含まない。

【0063】

本明細書で使用される用語「処置（treatment）」は、処置を受ける個々の自然経過を変化させる試みにおける、臨床的な介入を指す。当該処置は、予防の間、または臨床病理の経過の間のいずれかで実施され得る。処置の望ましい効果としては、疾病の発生または再発の防止、症状の緩和、疾病の直接的または間接的な病理的転帰の減少、転移の防止、疾病進行速度の低下、病状の改善または緩和、ならびに寛解または予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、疾病の発症を遅らせる（delay）ために、または疾病の進行を遅延させる（slow）ために使用される。

【0064】

本明細書で使用される用語「対象」または「個体」は、哺乳動物を指す。哺乳動物には、家畜化された動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、および、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルのようなヒト以外の霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウス、および、ラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、対象または個体はヒトである。

【0065】

本明細書で使用される用語「癌」および「癌性」は、制御されていない細胞増殖を典型的な特徴とする、哺乳動物における生理的な状態を指すか、または記載する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、消化器（管）癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、子宮頸癌、脳腫瘍、胃癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、中皮腫、および、頭頚部癌が挙げられる。本発明に従って処置することができる特に好ましい癌は、試験された組織サンプル中にて、ＣＡ ＩＸ発現の上昇によって特徴付けられる癌が挙げられる。

【0066】

本明細書で使用される用語「抗腫瘍組成物」は、腫瘍の増殖または機能を抑制または予防することができ、および／または、腫瘍細胞の破壊を引き起こすことができる少なくとも１つの活性治療剤を含む癌の治療に有用な組成物を指す。癌を治療するための抗腫瘍組成物に適切な治療薬には、化学療法剤、放射性同位体、毒素、サイトカイン（例えば、インターフェロン）および、サイトカイン、サイトカイン受容体または腫瘍細胞に関連する抗原を標的とする拮抗剤、が挙げられるが、これらに限定されない。

【0067】

本明細書で使用される用語「診断する」は、病理の存在または非存在を決定すること、病理または症状を分類すること、病理の重症度を決定すること、病理の進行をモニタリングすること、病理の結果を予測すること、および／または、回復の見込みを指す。

【0068】

本発明の記載との関連において（特に、下記の特許請求の範囲との関連において）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の指示対象の使用は、本明細書に別段の指示がないか、あるいは明らかに状況に矛盾しない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、および「含む（containing）」は、別段の指示がない限り、限定されない用語として解釈されるべきである（すなわち、「含む（including）が、これに限定されない」を意味する）。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書で別段の指示がない限り、単に範囲内に含まれるそれぞれ別の値を、個々に指す簡潔な方法として機能することを意図する。それぞれ別の値は、あたかもそれが本明細書に個々に列挙されているかのように、明細書に組み込まれる。

【0069】

本明細書で記載された全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、あるいは明らかに状況に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行してもよい。本明細書で提供される任意のおよび全ての実施例または例示的な言い回し（例えば、「例えば」）の使用は、単に本発明をより明確にすることを意図しており、別段の記載がない限り、本発明の範囲に対する限定を提示するものではない。本明細書のいかなる言葉も、請求項に記載されていない構成要素を本発明の実行に不可欠なものを示すものとして解釈されるべきではない。

【0070】

＜医薬製剤＞
本発明の医薬組成物は、抗体のためのキャリア、望ましくは薬学的に許容可能なキャリアを含む。薬学的に許容可能なキャリアは、任意の適切な薬学的に許容可能なキャリアであり得る。本明細書で使用される用語「薬学的に許容可能なキャリア」は、ヒトまたは家畜の患者への投与に適した、１つまたは複数の適合性の固体充填剤または液体充填材、希釈剤、他の賦形剤、またはカプセル化物質を意味する（例えば、生理的に許容されるキャリア、または薬理的に許容されるキャリア）。用語「キャリア」は、適用を容易にするために活性成分が組み合わされた、天然または合成の有機成分または無機成分を意味する。所望の薬学的効力を実質的に損なわないような方法で、組成物中に１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアが存在する場合、薬学的に許容可能なキャリアは、１つまたは複数の活性成分（例えば、ハイブリッド分子）と、互いに同時混合することができる。「薬学的に許容可能な」材料は、一般的には望ましくない生理的な反応（例えば、悪心、めまい、発疹、または胃の不調）を有意に生じることなく、患者に投与することができる。例えば、薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物は、治療を目的としてヒト患者に投与する場合、免疫原性でないことが望ましい。

【0071】

医薬組成物は、適切な緩衝剤（例えば、酢酸またはその塩、クエン酸またはその塩、ホウ酸またはその塩、およびリン酸またはその塩）を含み得る。医薬組成物はまた、任意に適切な防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、およびチメロサール）を含み得る。

【0072】

本明細書の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要不可欠な１つまたは複数の活性化合物を含むことができる。当該製剤は、好ましくは、互いに有害な影響を及ぼすことのない補完的な活性を有するものである。そのような分子は、意図される目的のために有効な量を組み合わせた中にて適切に存在する。

【0073】

非経口投与に適した組成物は、本発明の組成物の滅菌された水性調製物を任意に含む。当該組成物は、好ましくは、レシピエントの血液と等張である。この水性調製物は、適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を使用して、公知の方法に従って製剤化することができる。滅菌された注射調製物はまた、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中（例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液として）の、滅菌された注射溶液または懸濁液であってもよい。使用し得る許容可能な媒介物および溶媒中には、水、リンガー溶液、および生理食塩水が存在する。さらに、滅菌された不揮発性油を溶媒または懸濁媒として常用できる。この目的のために、任意の無刺激の不揮発性油（例えば、合成モノ－グリセリド、またはジ－グリセリド）を使用することができる。さらに、脂肪酸（例えば、オレイン酸）を注射剤の調製に使用することができる。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に適したキャリア製剤は、下記参照に見出すことができる（例えば、Remington Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co,Easton,PA,22nd edition,2013を参照のこと）。

【0074】

ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に行うことができる。

【0075】

＜抗ＣＡ ＩＸ抗体の診断的使用＞
本発明は、少なくとも１つのヒト化抗体を含む、診断用組成物を提供する。当該ヒト化抗体は、前述のようにヒトＣＡ ＩＸを特異的に認識する。

【0076】

別の態様では、本発明は、さらにそれを必要とする対象の癌を診断するための方法を提供する。当該方法は、前記対象に由来するか、または前記対象から得られた生物学的サンプルを診断用組成物と接触させる工程を含む。ここで、規定の閾値を超える複合体の形成は、前記対象体内の癌を示す。

【0077】

別の態様では、本発明は、ＣＡ ＩＸの発現を決定するための方法をさらに提供する。当該方法は、生物学的サンプルを前述の抗体と接触させる工程、および免疫複合体形成のレベルを測定する工程を含む。

【0078】

別の態様では、本発明は、ＣＡ ＩＸタンパク質の発現に関連する疾病または障害を診断するための方法をさらに提供する。当該方法は、生物学的サンプルを前述のヒト化抗体とインキュベートする工程；検出可能なプローブを使用して結合したＣＡ ＩＸタンパク質を検出する工程；結合したＣＡ ＩＸタンパク質の量を参照サンプルから得られた標準曲線と比較する工程；標準曲線から生物学的サンプル中のＣＡ ＩＸタンパク質の量を計算する工程；および患者に適切な治療を任意に施す工程を含む。

【0079】

別の態様では、本発明は、癌に関連する疾病または障害の診断のための診断用組成物の調製のための、前述のヒト化抗体の使用を提供する。

【0080】

別の態様では、本発明は、合成分子に対する本発明の抗体の結合体をさらに提供する。合成分子は標識であり得る。標識は診断用途に役立ち得る（例えば、造影剤）。造影剤は、放射性同位元素標識（例えば、ヨウ素（^１３１Ｉまたは^１２５Ｉ）、インジウム（^１１１Ｉｎ）、テクネチウム（^９９Ｔｃ）、リン（^３２Ｐ）、炭素（^１４Ｃ）、トリチウム（^３Ｈ）、他の放射性同位元素（例えば、放射性イオン）または前記に列挙した治療用放射性同位元素）であり得る。さらに、造影剤としては、放射線不透過性材料、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）剤、および超音波画像剤、ならびに身体を撮像する装置による検出に適した任意の他の造影剤を挙げることができる。合成分子はまた、蛍光標識、生物学的に活性な酵素標識、発光標識、または発色団標識であり得る。

【0081】

＜抗ＣＡ ＩＸ抗体の治療的使用＞
本明細書に提供されるいずれの抗ＣＡ ＩＸ抗体をも、治療方法にて使用してもよい。

【0082】

一態様では、薬剤として使用するための抗ＣＡ ＩＸ抗体が提供される。特定の実施形態では、治療方法で使用するための抗ＣＡ ＩＸ抗体が提供される。

【0083】

さらなる態様では、本発明は、薬剤の製造または調製における抗ＣＡ ＩＸ抗体の使用のために提供する。

【0084】

さらなる態様では、本発明は、本明細書に提供される任意の抗ＣＡ ＩＸ抗体を含む医薬製剤を提供する。一実施形態では、医薬製剤が本明細書に提供される任意の抗ＣＡ ＩＸ抗体および薬学的に許容可能なキャリアを含む。

【0085】

本発明の抗体は、治療において、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と共に投与してもよい。

【0086】

前述のこのような併用療法は、併用投与を含む（ここで、２つより多い治療薬は、同じまたは別々の製剤に含まれる）。当該併用療法では、投与を分割する。その場合、本発明の抗体は、追加の治療剤および／またはアジュバントの、投与前、投与時、および／または投与後に投与され得る。本発明の抗体はまた、放射線療法と組み合わせて使用され得る。

【0087】

本発明はまた、ＣＡ ＩＸレベルの上昇に関連する障害を有する対象を、治療する方法を提供する。一般に、当該方法は、本発明の単離ヒト化抗体の治療有効量を対象に投与する工程を含む。前記抗体は、前述した本発明の任意の抗ＣＡ ＩＸ抗体であり得る。前記抗体は、他の薬剤（例えば、細胞毒性、細胞増殖抑制性、抗血管新生性、免疫チェックポイント阻害剤または治療用放射性同位元素）と組み合わせて投与することができる。

【0088】

本発明の抗体（および、任意のさらなる治療剤）は、任意の適切な手段（非経口、肺内および鼻腔内を含む）によって、ならびに局所治療のために所望される場合には、病変内投与によって、投与され得る。非経口輸液には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が挙げられる。投与が短期間であるか、慢性であるかに部分的に依存して、投薬は任意の適切な経路（例えば、静脈内注射または皮下注射のような注射による）によることができる。様々な時点にわたる単回投与または複数回投与、ボーラス投与、ならびにパルス注入が挙げられるが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書で企図される。

【0089】

本発明の抗体は、良好な医療行為と一致した方法で処方され、投薬され、そして投与され得る。この関連について考慮すべき因子としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジューリング、および、医師に公知の他の因子が挙げられる。抗体は問題の障害を予防または治療するために、現在使用されている１つまたは複数の薬剤と共に処方される必要はないが、任意で共に処方される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害の型または治療の型、および前述の他の因子に依存する。これらは一般に、本明細書に記載されるのと同じ用量および投与経路で、または適切であると経験的／臨床的に決定される任意の用量および任意の経路で使用される。

【0090】

疾病の治療のために、本発明の抗体の適切な用量（単独で、または１つまたは複数の他のさらなる治療剤と組み合わせる場合）は、治療される疾病の型、抗体の型、疾病の重症度および経過、抗体が予防目的または治療目的のために投与されるか否か、過去の治療、患者の臨床歴および抗体に対する応答、ならびに主治医の判断に依存する。抗体は一度に、または一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾病の型および重症度に応じて、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇの抗体が（例えば、１回または複数回の別々の投与によるか、または持続注入によるかに関わらず）、患者への投与の最初の候補用量であり得る。数日以上にわたる反復投与の間、状態に依存して、治療は疾病症状の所望の抑制が生じるまで一般的に継続される。このような用量は間欠的に（例えば、１週間毎または３週間毎に）投与され得る。初期により高い負荷用量、続いて１つまたは複数のより低い用量が投与されてもよい。この治療の経過は、従来の技術およびアッセイにより容易にモニターされる。

【0091】

〔実施例〕
実施された実験および得られた結果を含む下記の実施例は、例示の目的のためにのみ提供されるものであって、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0092】

本実施例で言及する市販の試薬は、別段の指示がない限り、製造業者の指示に従って使用した。

【0093】

〔実施例１：親としてのＶＩＩ／２０ｍＡｂに由来するヒト化抗体〕
本実施例は、ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１の構築および特徴付けを実証する。

【0094】

ヒト化工程は、抗体構造に関する最新の研究と、成熟ヒトＩｇＧ配列の最新のデータベースとを組み合わせた、標準的なＣＤＲグラフト技術の組み合わせを利用した。最初に、ＶＩＩ／２０マウス抗体可変領域を配列決定した。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標））またはＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（例えば、Lefranc et al,Nucleic Acid Res 27:209-212,1999; Lefranc et al,Dev Comp Immunol 27:55-77,2003; Kabat et al,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edition,1991を参照のこと）を使用して同定した。ＣＤＲループコンフォーメーションを最適に保持するために、両方のナンバリングシステムを使用して、マウス可変重領域（Ｖ_Ｈ）内ならびにマウス可変軽領域（Ｖ_Ｌ）内のＣＤＲを同定した。続いて、多数のヒトフレームワーク配列を同定して、ＣＤＲ配列の「アクセプター」フレームワークとして使用した（下記本文参照）。それぞれのＶ_Ｈ領域を、ヒトＩｇＧアイソタイプ定常領域配列（アロタイプＧ１ｍ１７，１）を使用してインフレームで合成した。さらに、それぞれのＶ_Ｌ領域を、ヒトＩｇＫアイソタイプ定常領域配列（アロタイプＫｍ３）を使用してインフレームで合成した。全ての重鎖配列および全ての軽鎖配列では、コドンを最適化し、ＤＮＡ配列を検証した。

【0095】

５つのＶ_Ｈ鎖および５つのＶ_Ｌ鎖の組み合わせは、ヒト化可変領域（下記本文では、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）と記す）ならびにヒトＩｇ定常領域を有する、２５個のヒト化変異体の生成をもたらした。２５個のヒト化抗体変異体を特徴付けるために、ＭＨＣ ＣｌａｓｓＩＩ結合エピトープ、Ｆｖグリコシル化モチーフ、および、脱アミド化モチーフについて、全ての配列をスクリーニングした。

【0096】

ＣＡ ＩＸの触媒領域に対するマウスモノクローナル抗体ＶＩＩ／２０（アイソタイプＩｇＧ２ａ）を、ＣＡ ＩＸ欠損マウスにて作製した（例えば、WO2003/100029; Zatovicova et al,J Immunol Methods 282,117-134,2003を参照のこと）。ＶＩＩ／２０抗体は、ＣＡ ＩＸに結合すると、癌細胞の細胞表面を形成するＣＡ ＩＸ分子の枯渇をもたらす、効率的な受容体媒介内在化を受ける（例えば、Zatovicova et al,Curr Pharm Des 16,3255-3263,2010を参照のこと）。ＶＩＩ／２０ｍＡｂの生物学的特性、および、抗癌効果をもたらす能力を、大腸癌のマウス異種移植片モデルにて評価した（例えば、Zatovicova et al,Curr Pharm Des 16,3255-3263,2010を参照のこと）。即時治療および遅延治療（postponed treatment）は、腫瘍増殖を有意に減少させる。これは、ＶＩＩ／２０ｍＡｂによる免疫療法が、大腸腫瘍細胞に対して有効であり、従って、ＶＩＩ／２０ｍＡｂが免疫療法計画のためのツールとして役立ち得ることを示唆する。さらに、ＨＴ－２９異種移植片への抗体の取り込みを確認するために、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－７５０を使用して、ＶＩＩ／２０抗体を標識した。ＨＴ－２９異種移植片を使用した非治療ヌードマウスへの静脈注射の１日後および３日後に、前記抗体を、７２０ｅｘｃ／７９０ｅｍで、Ｋｏｄａｋ Ｉｎ－Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ＦＸ中にて可視化した。蛍光標識されたｍＡｂ ＶＩＩ／２０シグナルは、異種移植片内に蓄積された。このことは、腫瘍細胞におけるその取り込みを示唆する。興味深いことに、抗体はその注入後３日目でさえ、腫瘍内部で検出可能であった。

【0097】

重鎖
マウスＶ_Ｈ領域は、下記の配列を含んでいた。マウスＶ_Ｈ領域は、マウスシグナルペプチド配列を含まない：
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＴＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＰＰＧＭＡＬＥＷＬＡＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＶＳＱＴＩＬＹＬＱＭＮＴＬＲＰＥＤＳＡＴＹＹＣＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号３７）
ＣＤＲ残基（下線）は、ＩＭＧＴ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍまたはＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを使用して同定した。

【0098】

ＣＤＲ１ ＶＨ ＶＩＩ／２０（配列番号１）
ＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨ
ＣＤＲ２ ＶＨ ＶＩＩ／２０（配列番号２）
ＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧ
ＣＤＲ３ ＶＨ ＶＩＩ／２０（配列番号３）
ＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶ。

【0099】

ヒトＩｇＧ配列のオンラインデータベースを、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用して、マウスＶ_Ｈ領域との対比のために検索した。ヒト可変領域候補を、上位２００のＢＬＡＳＴの結果から選択した。これらを５つの候補に還元し（フレームワーク相同性の組み合わせに基づき、主要なフレームワーク残基およびカノニカルループ構造を維持する）、ＣＤＲを移植した。

【0100】

５つのアクセプターフレームワークは、下記である：
ＡＧＰ０１６２２（配列番号４１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＨＹＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＨＩＲＮＱＴＨＳＹＲＴＤＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＩＥＤＴＡＶＹＹＣＴＳＰＧＩＴＧＳＰＧＴＡＧＩＳＥＹＹＤＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＡＥＸ２９７２８（配列番号４２）
ＥＶＲＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＨＹＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＧＲＩＲＫＫＬＮＳＹＴＴＱＹＡＴＳＶＱＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＴＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＶＳＤＧＴＷＨＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＣＡＡ８５５５０（配列番号４３）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＧＤＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＦＩＲＳＫＡＹＧＧＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＴＩＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＤＹＳＳＴＶＴＴＰＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＭＫ７０３２５（配列番号４４）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＴＹＥＭＮＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＹＩＳＧＮＹＮＮＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＥＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＥＧＰＴＨＹＤＩＦＹＹＹＭＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＩＧＨＶ３－７２ （配列番号４５）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＨＹＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＲＴＲＮＫＡＮＳＹＴＴＥＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＡＦＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ。

【0101】

マウスＶ_ＨのＣＤＲがこれらのアクセプターフレームワークに移植されると、当該アクセプターフレームワークは、ヒト化変異体になる：
ＨＣ１ ＣＡ９ｈｕ－１（配列番号４）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＩＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＨＣ２ ＣＡ９ｈｕ－１（配列番号５）
ＥＶＲＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＧＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＴＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＩＹＹＣＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＨＣ３ ＣＡ９ｈｕ－１（配列番号６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＴＩＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＨＣ４ ＣＡ９ｈｕ－１（配列番号７）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＥＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＨＣ５ ＣＡ９ｈｕ－１（配列番号８）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＦＩＲＮＫＡＳＧＹＴＰＱＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＧＧＨＡＧＳＮＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ。

【0102】

【表1】

【0103】

軽鎖
マウスＶ_Ｌ領域は、下記の配列を含んでいた。マウスＶ_Ｌ領域は、マウスシグナルペプチド配列を含まない：
ＤＩＱＭＮＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＴＩＴＩＡＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＮＩＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＴＧＳＧＳＧＴＧＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３８）
ＣＤＲ残基（下線）は、ＩＭＧＴ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍまたはＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを使用して同定した。

【0104】

ＣＤＲ１ ＶＬ ＶＩＩ／２０（配列番号９）
ＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳ
ＣＤＲ２ ＶＬ ＶＩＩ／２０（配列番号１０）
ＱＡＳＮＬＨＴ
ＣＤＲ３ ＶＬ ＶＩＩ／２０（配列番号１１）
ＱＱＧＱＳＹＰＦＴ。

【0105】

ヒトＩｇκ配列のオンラインデータベースを、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用して、マウスＶ_Ｌ領域との対比のために検索した。ヒト可変領域候補を、上位２００のＢＬＡＳＴの結果から選択した。これらを５つの候補に還元し（フレームワーク相同性の組み合わせに基づき、主要なフレームワーク残基およびカノニカルループ構造を維持する）、ＣＤＲを移植した。

【0106】

５つのアクセプターフレームワークは、下記である：
ＡＰＺ８５３０７（配列番号４６）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＧＩＳＲＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＩＴ３８５６２（配列番号４７）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＮＡＰＫＬＬＩＹＫＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＧＳＬＱＰＤＤＦＶＴＹＹＣＱＱＹＮＳＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＢＡＨ０４８６７（配列番号４８）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＡＮＶ２１９３９（配列番号４９）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＮＣＲＡＳＱＳＩＮＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＲＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＧＦＴＬＴＩＲＳＬＱＰＥＤＹＡＴＹＹＣＱＱＳＹＲＴＰＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＩＧＫＶ１－３３（配列番号５０）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＣＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。

【0107】

第３アクセプター配列および第４アクセプター配列について、フレームワーク内の特定の残基を変異させて、重鎖および軽鎖における荷電残基間の相互作用を最適化した。マウスＶ_ＬのＣＤＲがこれらのアクセプターフレームワークに移植されると、当該アクセプターフレームワークは、ヒト化変異体になる：
ＬＣ１ ＣＡ９ｈｕ－１（配列番号１２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＬＣ２ ＣＡ９ｈｕ－１（配列番号１３）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＮＡＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＧＳＬＱＰＤＤＦＶＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＬＣ３ ＣＡ９ｈｕ－１（配列番号１４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＬＣ４ ＣＡ９ｈｕ－１（配列番号１５）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＮＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＥＡＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＧＦＴＬＴＩＲＳＬＱＰＥＤＹＡＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＬＣ５ ＣＡ９ｈｕ－１（配列番号１６）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＶＳＱＮＩＮＶＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。

【0108】

【表2】

【0109】

＜ヒト化試験＞
ヒト化変異体は、ヒト化抗体の世界保健機関（ＷＨＯ）の定義に従って、ヒト化されたか否かを決定するために試験された：ヒト化鎖の可変領域は、他の種よりもヒトに近いＶ領域アミノ酸配列を有する。これは、全体として分析される（ＩＭＧＴ（登録商標）ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ ｔｏｏｌを使用して評価される）（例えば、Ehrenmann et al,Nucleic Acids Res 38,D301-307,2010を参照のこと）。

【0110】

【表3】

【0111】

＜Ｔ細胞エピトープスクリーニング＞
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ） ＣｌａｓｓＩＩ分子の溝にペプチド配列が提示されると、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および免疫原性応答が起こる。この応答を減少させるために、治療タンパク質は、ＭＨＣ ＣｌａｓｓＩＩ分子への結合の親和性を減少させることによって、Ｔ細胞を活性化し得る「Ｔ細胞エピトープ」の取り込みを回避するように設計され得る。

【0112】

オリジナルなマウス抗体Ｖ_Ｈおよびマウス抗体Ｖ_Ｌ、ならびにヒト化変異体配列を、ＭＨＣ ＩＩ結合ペプチドについてスクリーニングした。これにより、ヒト化工程は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏアルゴリズムを使用して、高親和性でペプチド配列を除去したことを明らかにした。下記の８つの対立遺伝子は、世界人口の９９％以上を占める。当該対立遺伝子は、ＭＨＣ ＣｌａｓｓＩＩエピトープの予測に用いられる標準的な対立遺伝子セットである：ＤＲＢ１^＊０１：０１；ＤＲＢ１^＊０３：０１；ＤＲＢ１^＊０４：０１；ＤＲＢ１^＊０７：０１；ＤＲＢ１^＊０８：０２；ＤＲＢ１^＊１１：０１；ＤＲＢ１^＊１３：０２；ＤＲＢ１^＊１５：０１（例えば、Nielsen et al,BMC Bioinformatics 8:238,2007; Wang et al,BMC Bioinformatics 11:568,2010; Gonzalez-Galarza et al,Nucleic Acid Research 39,D913-D919,2011; Greenbaum et al, Immunogenetics 63(6): 325-35, 2011を参照のこと）。

【0113】

Ｖ_Ｈ領域については、ヒト化変異体ＨＣ２、ＨＣ３、およびＨＣ５は、Ｔ細胞エピトープスクリーニングの観点で、上位であった。しかしながら、相同性のみによると、ヒト化変異体ＨＣ１およびＨＣ４は、アラインメントに関してより高く順位付けされた。

【0114】

Ｖ_Ｌ領域については、ヒト化変異体ＬＣ１は、Ｔ細胞エピトープスクリーニングから最良に順位付けされた。アラインメントヒト化変異体ＬＣ３に続いて、全てのＬＣ４およびＬＣ５は、マウス軽鎖に最も相同であった。

【0115】

＜翻訳後修飾のスクリーニング＞
Ｆｖグリコシル化
Ｎ結合グリコシル化モチーフは、ＮＸＳ／Ｔである。ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である。このモチーフは、ＶＩＩ／２０ｍＡｂ Ｖ_Ｈのマウスまたはヒト化変異体には存在しない。モチーフＮＱＳは、マウス変異体ＬＣ０のフレームワーク１領域に存在する。このモチーフは、ヒト化工程の間に除去され、ヒト化軽鎖変異体のいずれにも存在しない。

【0116】

脱アミド化
アミノ酸モチーフＳＮＧ、ＥＮＮ、ＬＮＧ、およびＬＮＮは、アスパラギンのアスパラギン酸への脱アミド化を起こしやすい傾向にあり得る（例えば、Chelius et al,Anal Chem 77(18):6004-11,2005を参照のこと）。他のモチーフ内のアスパラギンは、脱アミド化の傾向がない。これら４つのモチーフは、ＶＩＩ／２０ｍＡｂのＶ_ＨまたはＶ_Ｌに由来するマウスまたはヒト化変異体には存在しない。

【0117】

前述のデータは、ヒト化可変領域およびヒトＩｇ定常領域を有する２５個のヒト化変異体（下記本文では、ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣｘＬＣｘと記す）の生成を実証する。

【0118】

〔実施例２：ＩＶ／１８ｍＡｂ由来のヒト化抗体〕
本実施例は、ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－２の構築および特徴付けを実証する。

【0119】

ヒト化工程は、抗体構造に関する最新の研究と、成熟ヒトＩｇＧ配列の最新のデータベースとを組み合わせた、標準的なＣＤＲグラフト技術の組み合わせを利用した。最初に、ＶＩＩ／２０マウス抗体可変領域を配列決定した。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標））またはＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを使用して同定した。ＣＤＲループコンフォーメーションを最適に保持するために、両方のｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを使用し、マウス可変重領域（Ｖ_Ｈ）内ならびにマウス可変軽領域（Ｖ_Ｌ）内のＣＤＲを同定した。続いて、多数のヒトフレームワーク配列を同定し、ＣＤＲ配列のための「アクセプター」フレームワークとして使用した（下記本文参照）。それぞれのＶ_Ｈ領域を、ヒトＩｇＧアイソタイプ定常領域配列（アロタイプＧ１ｍ１７，１）を使用して、インフレームで合成した。さらに、それぞれのＶ_Ｌ領域を、ヒトＩｇＫアイソタイプ定常領域配列（アロタイプＫｍ３）を使用して、インフレームで合成した。全ての重鎖および軽鎖配列では、コドンを最適化し、ＤＮＡ配列を検証した。

【0120】

５つのＶ_Ｈ鎖および５つのＶ_Ｌ鎖の組み合わせは、ヒト化可変領域（下記本文では、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）と記す）ならびにヒトＩｇ定常領域を有する、２５個のヒト化変異体の生成をもたらした。２５個のヒト化抗体変異体を特徴付けるために、ＭＨＣ ＣｌａｓｓＩＩ結合エピトープ、Ｆｖグリコシル化モチーフおよび脱アミド化モチーフについて、全ての配列をスクリーニングした。

【0121】

ＣＡ ＩＸのプロテオグリカン（ＰＧ）様領域に対するマウスモノクローナル抗体ＩＶ／１８（アイソタイプＩｇＧ２ａ）を、ＣＡ ＩＸ欠損マウスにおいて作製した（例えば、WO2003/100029; Zatovicova et al,J Immunol Methods 282,117-134,2003を参照のこと）。低酸素腫瘍細胞をＩＶ／１８ｍＡｂとプレインキュベーションすると、マウス肺コロニー形成モデルの肺転移数が減少した（図１Ａ）。ＰＢＳ潅流マウス肺における蛍光標識ＨＴ１０８０赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）細胞の転移コロニーを、ＩＶＩＳ Ｃａｌｉｐｅｒ画像化システムを使用して、１２日後にｅｘ ｖｉｖｏで画像化した（図１Ｂ）。全放射効率は、マウス肺の癌細胞の量を反映する。ＨＴ１０８０－ＲＦＰ細胞を、ＩＶ／１８ｍＡｂとプレインキュベーションした。続いて、最初の静脈注射（１，５００，０００細胞／マウス、１グループあたり１０マウス）から１２日間後に、３用量の抗体（５０μｇ／マウス）を投与した。これにより、ＩＶＩＳによる蛍光シグナルによって決定される、これらの細胞による肺コロニー形成は、顕著に減少する結果となった。転移コロニーは静脈接種直後に評価した。血管外遊出を減少させる手段が、転移形成減少の主な要因であった。これらのデータは、腫瘍細胞の血管外遊出および転移形成の減弱における、抗ＣＡ ＩＸ療法にて生じ得る有益性を示唆している。

【0122】

重鎖
マウスＶ_Ｈ領域は、下記の配列を含んでいた。マウスＶ_Ｈ領域は、マウスシグナルペプチド配列を含まない：
ＥＶＱＬＶＥＴＧＧＧＬＶＱＰＫＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＭＬＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＭＹＹＣＶＣＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号３９）
ＣＤＲ残基（下線）は、ＩＭＧＴ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍまたはＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを使用して同定した。

【0123】

ＣＤＲ１ ＶＨ ＩＶ／１８（配列番号１７）
ＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨ
ＣＤＲ２ ＶＨ ＩＶ／１８（配列番号１８）
ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤ
ＣＤＲ３ ＶＨ ＩＶ／１８（配列番号１９）
ＶＣＧＳＷＦＡＹ。

【0124】

ヒトＩｇＧ配列のオンラインデータベースを、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用して、マウスＶ_Ｈ領域との対比のために検索した。ヒト可変領域候補を、上位２００のＢＬＡＳＴの結果から選択した。これらを５つの候補に還元し（フレームワーク相同性の組み合わせに基づき、主要なフレームワーク残基およびカノニカルループ構造を維持する）、ＣＤＲを移植した。

【0125】

５つのアクセプターフレームワークは、下記である：
ＡＧＰ０１２８６（配列番号５１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＧＳＡＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＡＮＳＹＡＴＡＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＬＶＧＡＩＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＥＸ２９０８７（配列番号５２）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＮＦＳＧＰＡＩＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＡＫＮＦＡＴＡＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＴＴＳＳＳＩＮＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＣＳ９５８６２（配列番号５３）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＦＩＲＳＤＧＳＮＴＹＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＶＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＦＧＧＤＹＹＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＢＡＣ０１５１６（配列番号５４）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＧＲＴＧＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＩＧＨＶ３－７３（配列番号５５）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＧＳＡＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＡＮＳＹＡＴＡＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。

【0126】

マウスＶ_ＨのＣＤＲがこれらのアクセプターフレームワークに移植されると、当該アクセプターフレームワークは、ヒト化変異体になる：
ＨＣ１ ＣＡ９ｈｕ－２（配列番号２０）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＣＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＨＣ２ ＣＡ９ｈｕ－２（配列番号２１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＣＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＨＣ３ ＣＡ９ｈｕ－２（配列番号２２）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＶＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＣＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＨＣ４ ＣＡ９ｈｕ－２（配列番号２３）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＣＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＨＣ５ ＣＡ９ｈｕ－２（配列番号２４）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＮＡＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＳＮＮＹＴＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＶＣＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ。

【0127】

【表4】

【0128】

軽鎖
マウスＶ_Ｌ領域は、下記の配列を含んでいた。マウスＶ_Ｌ領域は、マウスシグナルペプチド配列を含まない：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＡＭＳＬＧＱＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＶＹＦＴＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＩＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＤＹＦＣＱＱＨＹＳＩＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号４０）
ＣＤＲ残基（下線）は、ＩＭＧＴ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍまたはＫａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを使用して同定した。

【0129】

ＣＤＲ１ ＶＬ ＩＶ／１８（配列番号２５）
ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡ
ＣＤＲ２ ＶＬ ＩＶ／１８（配列番号２６）
ＦＴＳＴＲＱＳ
ＣＤＲ３ ＶＬ ＩＶ／１８（配列番号２７）
ＱＱＨＹＳＩＰＬＴ。

【0130】

ヒトＩｇκ配列のオンラインデータベースを、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを使用して、マウスＶ_Ｌ領域との対比のために検索した。ヒト可変領域候補を、上位２００のＢＬＡＳＴの結果から選択した。これらを５つの候補に還元し（フレームワーク相同性の組み合わせに基づき、主要なフレームワーク残基およびカノニカルループ構造を維持する）、ＣＤＲを移植した。

【0131】

５つのアクセプターフレームワークは、下記である：
ＡＡＷ６９１６４（配列番号５６）
ＤＶＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＮＴＳＮＮＫＮＹＬＶＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＬＡＳＴＲＥＦＧＶＰＤＲＦＳＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＨＳＳＰＨＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＣＡＩ９９８３９（配列番号５７）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＮＳＮＮＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＮＬＶＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＦＣＬＱＹＹＳＴＰＬＴＦＧＱＧＴＱＶＥＩＫ
ＡＭＫ７０３９２（配列番号５８）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＡＳＱＳＶＬＹＳＳＫＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＴＲＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＦＣＱＱＹＹＳＴＰＱＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＡＬＶ８７８５４（配列番号５９）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＲＳＫＮＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＶＬＩＹＳＴＳＴＲＡＳＧＶＰＤＲＦＴＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＬＱＹＹＩＴＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＩＧＫＶ４－１（配列番号６０）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。

【0132】

マウスＶ_ＬのＣＤＲがこれらのアクセプターフレームワークに移植されると、当該アクセプターフレームワークは、ヒト化変異体になる：
ＬＣ１ ＣＡ９ｈｕ－２（配列番号２８）
ＤＶＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＶＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＦＴＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＨＹＳＩＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＬＣ２ ＣＡ９ｈｕ－２（配列番号２９）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＮＬＶＩＹＦＴＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＦＣＱＱＨＹＳＩＰＬＴＦＧＱＧＴＱＶＥＩＫ
ＬＣ３ ＣＡ９ｈｕ－２（配列番号３０）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＦＴＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＦＣＱＱＨＹＳＩＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＬＣ４ ＣＡ９ｈｕ－２（配列番号３１）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＶＬＩＹＦＴＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＨＹＳＩＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＬＣ５ ＣＡ９ｈｕ－２（配列番号３２）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＦＴＳＴＲＱＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＨＹＳＩＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。

【0133】

【表5】

【0134】

＜ヒト化試験＞
ヒト化変異体は、ヒト化抗体の世界保健機関（ＷＨＯ）の定義に従って、ヒト化されたか否かを決定するために試験された：ヒト化鎖の可変領域は、他の種よりもヒトに近いＶ領域アミノ酸配列を有する。これは、全体として分析される。

【0135】

【表6】

【0136】

＜Ｔ細胞エピトープスクリーニング＞
ＭＨＣ ＣｌａｓｓＩＩ分子の溝にペプチド配列が提示されると、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および免疫原性応答が起こる。この応答を減少させるために、治療タンパク質は、ＭＨＣ ＣｌａｓｓＩＩ分子への結合の親和性を減少させることによって、Ｔ細胞を活性化し得る「Ｔ細胞エピトープ」の取り込みを回避するように設計され得る。

【0137】

オリジナルなマウス抗体Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ、ならびにヒト化変異体配列を、ＭＨＣＩＩ結合ペプチドについてスクリーニングした。これにより、ヒト化工程は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏアルゴリズムを使用して、高親和性でペプチド配列を除去したことを決定した。下記の８つの対立遺伝子は、世界人口の９９％以上を占める。これらは、ＭＨＣ ＣｌａｓｓＩＩエピトープの予測に用いられる標準的な対立遺伝子セットである：ＤＲＢ１^＊０１：０１、ＤＲＢ１^＊０３：０１、ＤＲＢ１^＊０４：０１、ＤＲＢ１^＊０７：０１、ＤＲＢ１^＊０８：０２、ＤＲＢ１^＊１１：０１、ＤＲＢ１^＊１３：０２、ＤＲＢ１^＊１５：０１。

【0138】

Ｖ_Ｈ領域については、全てのヒト化変異体がＴ細胞エピトープスクリーニングの観点で良好に機能し、ＨＣ３は最小の生殖細胞系Ｔ細胞エピトープを有すると予測された。相同性のみによる分析では、ＨＣ２およびＨＣ１は親マウス配列に最も近く順位付けされた。

【0139】

Ｖ_Ｌ領域については、全てのヒト化変異体は、Ｔ細胞エピトープスクリーニングから等しく順位付けされた。相同性のみにより、ＬＣ１およびＬＣ４は上位にランク付けされた。

【0140】

＜翻訳後修飾のスクリーニング＞
Ｆｖグリコシル化
Ｎ結合グリコシル化モチーフは、ＮＸＳ／Ｔである。ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である。このモチーフＮＹＴは、マウスＣＤＲ２ Ｖ_Ｈ変異体中に存在し、ＣＤＲ全体が移植された際に、全てのヒト化変異体に運ばれた。

【0141】

モチーフＮＳＳは、軽鎖のマウスＣＤＲ１に存在する。再度、このモチーフは、全てのヒト化変異体に運ばれた。

【0142】

脱アミド化
アミノ酸モチーフＳＮＧ、ＥＮＮ、ＬＮＧ、およびＬＮＮは、アスパラギンのアスパラギン酸への脱アミド化を起こしやすい傾向にあり得る。他のモチーフ内のアスパラギンは、脱アミド化の傾向がない。これら４つのモチーフはいずれも、ＩＶ／１８ｍＡｂのＶ_ＨまたはＶ_Ｌのマウスまたはヒト化変異体には存在しない。

【0143】

前述のデータは、ヒト化可変領域およびヒトＩｇ定常領域を有する２５個のヒト化変異体（下記本文では、ＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣｘＬＣｘと記す）の生成を実証する。

【0144】

〔実施例３：ヒト化抗体の結合能の特徴〕
本実施例は、炭酸脱水酵素ＩＸに対する２５個のＣＡ９ｈｕ－１ヒト化変異体、および２５個のＣＡ９ｈｕ－２ヒト化変異体の望ましい結合特性を実証する。抗原結合特異性および親和性を、それぞれ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて決定した。

【0145】

ＥＬＩＳＡ
抗原結合特異性を評価するために、２５個のＣＡ９ｈｕ－１ヒト化変異体およびＣＡ９ｈｕ－２ヒト化変異体の全てを、ＣＡ ＩＸ陽性抗原またはＣＡ ＩＸ陰性抗原のいずれかを使用して、ＥＬＩＳＡに供した。抗原は、ＣＡ ＩＸを発現する安定にトランスフェクトされたＣ－３３ａ細胞株（Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ）、および、ＣＡ ＩＸ発現を伴わない親の偽トランスフェクトされたＣ－３３ａ細胞（Ｃ－３３ａ＿ｎｅｏ）から調製した。

【0146】

ＲＩＰＡ溶解緩衝液（ＰＢＳ中、０．１％デオキシコール酸、１％トリトンＸ－１００およびプロテアーゼインヒビターカクテル）を使用して、細胞単層からタンパク質を抽出した。タンパク質濃度は、製造業者の指示に従って、ビシンコニン酸アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ ＵＳＡ）によって決定した。タンパク質抽出物をＰＢＳ中にて最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。ＥＬＩＳＡによって試験される抗原－抗体特異的相互作用のスクリーニングにおける、使用される抗原サンプルのタンパク質濃度は、さもなければ分析全体にわたって妨害し得る界面活性剤の低い含有量について、要件を満たす。５０μｌのＣＡ ＩＸ陽性抗原またはＣＡ ＩＸ陰性抗原のいずれかを、３７℃で一晩、マイクロプレートウェルの表面上にコーティングした。ＰＢＳ ｐＨ７．２中に０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ－Ｔを用いて洗浄した後、ＣＡ９ｈｕ－１およびＣＡ９ｈｕ－２の全てのヒト化変異体（１０％ＦＣＳを含むＰＢＳ－Ｔ中で濃度５μｇ／ｍｌに希釈）５０μｌを添加し、室温で２時間インキュベートした。ペルオキシダーゼ標識ブタ抗ヒトＩｇＧ（ＰＢＳ-Ｔ中、１０％のＦＣＳで１：５０００に希釈；Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ ＵＳＡ）を検出に使用した。親ＶＩＩ／２０または親ＩＶ／１８抗体（「マウス抗体」と記す）ならびにキメラＨＣ０ＬＣ０抗体（マウス可変領域およびヒトＩｇ定常領域を有する）を、参照サンプルとして使用した。結果を誘導の倍数として表し、（ＣＡ ＩＸ陽性抗原から４９２ｎｍで測定した吸光度のＯ．Ｄ．値）／（ＣＡ ＩＸ陰性抗原から４９２ｎｍで測定した吸光度のＯ．Ｄ．値）として計算する。

【0147】

図２は、抗ＣＡ ＩＸ抗体の２５個のヒト化変異体の特異的かつ有効な結合を示す。ＣＡ９ｈｕ－１ヒト化抗体のセットのうち、５つ全てのＨＣ４変異体がＣＡ ＩＸに対して非常に高い結合効率を有した。ＣＡ９ｈｕ－２ヒト化変異体の大部分にて、有意に高い結合効率が観察された（図２）。

【0148】

ここで、本発明者らは、その抗原に特異的に結合するヒト化抗体を設計した。

【0149】

ＳＰＲ
Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（ＣＡ９ｈｕ-２の場合、Ｔ２００）装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ ＵＳＡ）を使用して、ＣＡ ＩＸに結合する抗体の解離定数（Ｋ_Ｄ）の測定をＳＰＲによって行った。これにより、ヒト化変異体の抗原結合親和性を決定した。それぞれのヒト化抗体変異体を、ＣＭ５センサーチップ上に捕捉し、抗原としての組換えヒトＣＡ ＩＸ（ｒｈ ＣＡ ＩＸ； ４２ｋＤａ； Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ、ＵＳＡ）タンパク質を、チップ上に流れる緩衝液に添加した。ヒト化抗体とｒｈ ＣＡ ＩＸとの間の定量的相互作用分析の詳細な設定は、下記の通りであった：流速３０μｌ／分；分析温度２５℃；分析緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｎＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）。ＳＰＲ分析の結果は、解離定数（Ｋ_Ｄ）で表される（表７）。

【0150】

【表7】

【0151】

ＳＰＲ分析では、組換えヒトＣＡ ＩＸタンパク質とそれらの結合動態とをリアルタイムでモニターすることによって、２５個のヒト化抗体変異体全てを検証することが可能であった。Ｋ_Ｄ値が小さいほど、分析された抗体の結合親和性は大きい。表７に示すように、全ての抗体変異体は、低ナノモル範囲（１０^－７～１０^－９）のＫ_Ｄ値を有する。これは一般に、高親和性抗体の範囲であると考えられている。さらに、ＣＡ９ｈｕ－１由来のいくつかの抗体変異体（ＨＣ４ＬＣ１、ＨＣ４ＬＣ２、ＨＣ４ＬＣ３、ＨＣ４ＬＣ４およびＨＣ４ＬＣ５）は、キメラ変異体よりもさらに高い親和性を示した。

【0152】

ＣＡ ＩＸに対する最も高い親和性のＥＬＩＳＡおよびＳＰＲ分析を介して得られた結果により、下記の抗体変異体を、ＣＡ９ｈｕ－１から選択した：ＨＣ４ＬＣ１、ＨＣ４ＬＣ２、ＨＣ４ＬＣ３、ＨＣ４ＬＣ４、およびＨＣ４ＬＣ５、ならびに、ＣＡ９ｈｕ－２から選択した：ＨＣ３ＬＣ１、ＨＣ３ＬＣ２、ＨＣ４ＬＣ１、ＨＣ４ＬＣ２、およびＨＣ４ＬＣ５。

【0153】

前述の結果は、ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１およびＣＡ９ｈｕ－２が、それらの抗原に対して望ましい特異性および親和性を保持し、ＣＡ ＩＸを発現する腫瘍細胞を特異的に識別するために使用され得ることを実証する。

【0154】

〔実施例４：ヒト化抗体のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）およびＣＤＣ（補体依存性細胞障害）効果〕
本実施例は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）における抗ＣＡ ＩＸ抗体のヒト化変異体の望ましい関与を実証する。

【0155】

ＡＤＣＣ
細胞障害効果を媒介するヒト化抗体変異体の能力を評価するために、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ、ＵＳＡ）を適用した。ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイシステムは、ＡＤＣＣ作用メカニズムにおける治療用抗体薬剤による経路活性化に関する生物学的活性を定量するための生物発光レポーターアレイを示す（例えば、Chung et al,Monoclonal Antibodies 4:326-40,2012を参照のこと）。当該ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイシステムは、エフェクター細胞として、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体、Ｖ１５８高親和性変異体、およびホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）応答因子を安定に発現する、操作されたＪｕｒｋａｔ細胞を使用する。従って、ＡＤＣＣ作用メカニズムは、ＮＦＡＴ活性化の結果として、ルシフェラーゼ産生を介して定量される。

【0156】

ＡＤＣＣレポーターアッセイは、Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸならびにＣ－３３ａ＿ｎｅｏ細胞を使用して、製造業者の指示に従って行った。両方の細胞（１２，５００細胞／ウェル）を無菌９６ウェルプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩、培養培地中にてインキュベートした。ヒト化抗体変異体（ＣＡ９ｈｕ－１またはＣＡ９ｈｕ－２）をＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌに希釈し、ウェル当たり７５，０００個のエフェクター細胞（推奨されるエフェクター：標的比６：１に従う）を使用した。６時間インキュベートした後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ^ＴＭルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してホタルルシフェラーゼの検出を行った。ヒト化抗体を添加しない、ＡＤＣＣアッセイ緩衝液とエフェクター細胞を使用したサンプルとの混合物を、「抗体なし」と記す。抗体およびエフェクター細胞を含まないサンプルの混合物は、「抗体なし、ＥＣなし」と記す。これは、「プレートバックグラウンド」として役立つ。結果は、相対発光単位（ＲＬＵ）での発光として表され、誘導の倍数として計算される（ヒト化抗体変異体によって誘導されるＲＬＵ／抗体のないＲＬＵ）。

【0157】

図３に示すように、ＣＡ９ｈｕ－１変異体は、高い発光シグナルを示し、従って、Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ発現細胞に対して高い細胞障害性を示した。サンプルのＲＬＵがプレートバックグラウンドＲＬＵ（「抗体なし、ＥＣなし」と記す）よりも１００倍高かったという事実により、サンプルＲＬＵからプレートバックグラウンドを差し引く必要はなかった。ＣＡ９ｈｕ－２変異体は、ＣＡ９ｈｕ－１抗体よりも有効性が低いように思われたが、Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ発現細胞に対するＡＤＣＣを介した細胞障害性経路を活性化する能力は、Ｃ－３３ａ＿ｎｅｏ細胞よりも依然として２倍高い（図３）。

【0158】

本発明のヒト化抗体変異体のエフェクター機能（ＡＤＣＣレポーターアッセイによる）ならびにそれらの抗原結合活性および特異性（ＳＰＲおよびＥＬＩＳＡによる）の評価は、潜在的候補として、下記の抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ ＨＣ４ＬＣ５の選択をもたらした。

【0159】

ＣＡ ＩＸを自然発現する癌細胞について抗体依存性細胞障害を証明するために、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株ＢＴ－２０およびＪＩＭＴ－１、ならびに膠芽腫細胞株８－ＭＧ－ＢＡおよび４２－ＭＧ－ＢＡを分析した。分析の２４時間前に、癌細胞株（４８時間インキュベートしたＪＩＭＴ－１細胞を除く）を低酸素中でプレインキュベートして、最も高いＣＡ ＩＸ発現を確保した。低酸素のプレインキュベーション後、１２，５００細胞／ウェルを無菌９６ウェルプレート上にプレートし、３７℃で一晩、培養培地中にてインキュベートした。ＡＤＣＣスクリーニングの場合と同様に、ＡＤＣＣレポーターアッセイを製造業者の指示に従って行った。ヒト化抗体変異体をＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌに希釈し、ウェル当たり７５，０００個のエフェクター細胞（推奨されるエフェクター：標的比６：１に従う）を使用した。６時間インキュベートした後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ^ＴＭルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して、ホタルルシフェラーゼの検出を行った。

【0160】

【表8】

【0161】

ＡＤＣＣレポーターアッセイは、エフェクター細胞における遺伝子転写のＮＦＡＴが媒介する活性化を介した、ＡＤＣＣ経路の初期のポイントを分析することを可能にする。表８は、選択されたヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５がＡＤＣＣ経路を活性化し、ＣＡ ＩＸを発現するターゲット細胞について細胞障害効果を媒介する能力を保持することを明確に示す。抗体のない処置と比較して、癌細胞をＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５抗体変異体とインキュベートした後、ＡＤＣＣレポーター活性は上昇した。ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４抗体による治療後に、ＴＮＢＣ細胞ＢＴ－２０で最も高い誘導（＞２５倍）が観察された。

【0162】

ＣＤＣ
ＣＤＣに関与するヒト化抗体変異体の能力を評価するために、細胞力価青色生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を適用した。当該細胞力価青色生存率アッセイは、指示薬色素レザズリンを介して生存細胞の数を推定するための、従って、細胞の生存率の指標としての細胞の代謝能力の測定のための、均質蛍光測定法を提供する。生存細胞において、レザズリンは、蛍光シグナルを生成する高度に蛍光性のレゾルフィンに還元される。当該レゾルフィンは、測定可能であり得る（５３０_Ｅｘ／５９０_Ｅｍ）。従って、細胞力価青色試薬由来の蛍光シグナルは、生存細胞の数に比例する。

【0163】

Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸならびにＣ－３３ａ＿ｎｅｏ細胞を使用して、製造業者の指示に従って、細胞力価青色アッセイを行った。両方の細胞（２００，０００細胞／ウェル）を無菌９６ウェルプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩、培養培地中にてインキュベートした。５μｇ／ｍｌに希釈したヒト化抗体変異体を両方の細胞株に添加した。ウサギ補体血清（総容量から１０％、ＢＡＧ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、Ｌｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をそれぞれのウェルに添加し、混合し、インキュベートした。細胞生存率を定量し、２４時間後に分析した。結果は、５３０_Ｅｘ／５９０_Ｅｍで測定した蛍光で表す。

【0164】

【表9】

【0165】

表９は、ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５が補体の存在下でＣＡＩＸ発現細胞の生存率に影響を及ぼす能力を示す。補体の存在下で、ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５変異体と２４時間のインキュベーションした後、Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ細胞は、それぞれ４６％および６４％の生存率しか示さなかった。Ｃ－３３ａ＿ｎｅｏ細胞の生存率はほとんど影響を受けなかった。

【0166】

前述の結果は、ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１およびＣＡ９ｈｕ－２を使用して、ＣＡ ＩＸを発現する腫瘍細胞上で、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを介して細胞障害応答を特異的に区別し、結果として媒介し得ることを実証する。

【0167】

〔実施例５：３次元スフェロイドにおける末梢血単核細胞を介したヒト化抗体のＡＤＣＣ効果〕
本実施例は、三次元培養においてＡＤＣＣ活性を媒介するヒト化抗体の望ましい特性を実証する。

【0168】

多細胞スフェロイドのような三次元（３Ｄ）培養は、より現実的な条件下で、細胞生物学および生理学を研究するための基礎研究で使用されることが増えている。３Ｄシステムにて癌細胞に対する細胞障害効果の媒介におけるヒト化抗体の効率を検証するために、ＴＮＢＣ ＢＴ－２０細胞と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）との共培養を行った。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する密度勾配遠心分離によって、ヒト末梢血（健康なドナー）から単離した。スフェロイド内のＰＢＭＣを可視化するために、単離された細胞をＣｅｌｌＢｒｉｔｅオレンジ細胞質膜標識色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｈａｙｗａｒｄ ＣＡ、ＵＳＡ）で染色した。ＢＴ－２０細胞を、最初に、ＣｅｌｌＢｒｉｔｅ緑色細胞質膜標識色素で染色した。続いて、ＢＴ－２０スフェロイドを、３７℃で７日間、組織培養皿の蓋にぶら下げたドロップ中にて、２５μｌの培養培地当たり１０，０００個の細胞から、予め形成した。培養１０日後、予め染色したＰＢＭＣ／オレンジ細胞（２，０００，０００）を４０個のＢＴ－２０スフェロイドと共にペトリ皿に添加し、ヒト化抗体（ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４またはＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５；２５μｇ／ｍｌ）と混合した。ヒト化抗体なしで培養したスフェロイドをＰＢＳ（陰性対照）で処置した。スフェロイド内の予め染色されたＰＢＭＣ細胞の分布を、処置の３日後に、共焦点レーザー走査顕微鏡Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ Ｍｅｔａにて分析した。

【0169】

ＰＢＭＣ細胞との長期（１１日間）共培養の効果を確認するために、ＢＴ－２０スフェロイドを回収し、Ｃａｒｎｏｙ固定液中で２時間固定し、標準的な組織学的手順に従ってパラフィン中に包埋した。スフェロイドブロックを４μｍの薄切片にスライスし、製造業者の推奨に従って、ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋ Ｓｙｓｔｅｍ－ＨＲＰ（ＤＡＢ；ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、免疫組織化学染色に供した。ＣＡ ＩＸマウスモノクローナルＭ７５に特異的な一次抗体を希釈し（１μｇ／ｍｌ）、室温で６０分間インキュベートした。染色をＤＡＢ溶液で可視化した。最後に、切片をマイヤーヘマトキシリンで対比染色した。染色した切片をＬｅｉｃａＤＭ４５００Ｂ顕微鏡で検査し、Ｌｅｉｃａ ＤＦＣ４８０カメラで写真撮影した。

【0170】

図４は、ＢＴ－２０スフェロイド内への予め染色されたＰＢＭＣの組み込みを明確に示す。共焦点顕微鏡による可視化は、ヒト化抗体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５での治療後、ＰＢＭＣのより強力な取り込みを明らかにした。ＰＢＭＣからの陽性シグナルの割合を、ＩｍａｇｅＪ １．３８ｘソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ、Ｗ．Ｓ．、ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ、ＵＳＡ）によって、ＢＴ－２０スフェロイド全体について評価した。ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５で処置した後、スフェロイド全体におけるＰＢＭＣ染色ピクセルの割合は、それぞれ３．８１１％および６．６２４％であった。未処置のスフェロイドの場合、２．７８１％のＰＢＭＣ陽性ピクセルのみが明らかにされた。ＰＢＭＣおよびヒト化抗体によるＢＴ－２０スフェロイドの長期処置の効果を、１１日後に調べた。図４に示すように、ＢＴ－２０スフェロイドをヒトＰＢＭＣと共に培養し、ヒト化抗体で処置した後、有意な形態的変化が観察された。免疫組織化学分析を使用して、ＢＴ－２０スフェロイドにわたるＣＡ ＩＸ発現を可視化した。

【0171】

前述の結果は、本発明のヒト化抗体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５が、３Ｄ培養物－スフェロイドにてＡＤＣＣ応答を促進することを実証する。

【0172】

〔実施例６：ヒト化抗体の細胞生存率への影響〕
本実施例は、ヒト化抗体が細胞生存率に影響を及ぼさないという望ましい特性を実証する。

【0173】

細胞生存率に対するヒト化抗体の影響を推定するために、Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸおよびＣ－３３ａ＿ｎｅｏ細胞を使用して、実施例４（補体の非存在下）と同様に、製造業者の指示に従って、細胞力価青色生存率アッセイを行った。両方の細胞（２００，０００細胞／ウェル）を無菌９６ウェルプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩、培養培地中にてインキュベートした。５μｇ／ｍｌに希釈したヒト化抗体変異体（ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５）を、両方の細胞株に添加し、２４時間後に細胞生存率を測定した。細胞力価青色試薬由来の蛍光シグナルは、生存細胞の数に比例する。

【0174】

【表10】

【0175】

表１０に示すように、細胞力価青色生存率アッセイは、処置されたＣ－３３ａ細胞の生存率（ＣＡ ＩＸ陽性でもなく、ＣＡ ＩＸ陰性でもない）が２４時間後に影響を受けないことを明らかにした。

【0176】

前述のデータは、本発明のヒト化抗体変異体（ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５）が処置された癌細胞に対して毒性効果を発揮しないことを実証する。

【0177】

〔実施例７：サイトカイン放出アッセイ（「サイトカインストーム」）によるヒト化抗体の安全性の予測〕
本実施例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカイン放出アッセイにて、選択されたヒト化抗体変異体の望ましい特性を実証する。

【0178】

サイトカイン放出アッセイ（ＣＲＡ）は、危険有害性の同定には最良に使用されるが、リスクの定量化には使用されない。当該サイトカイン放出アッセイは、潜在的なリスクを理解し、リスク軽減計画を知らせるのに役立ち得る（例えば、Vidal et al,Cytokine 51: 213-215,2010を参照のこと）。ＣＲＡは予測された安全性によって治療方法を順位付けする際に使用でき、ヒトにおけるサイトカイン放出の潜在的なメカニズムに関する追加データを提供することができる。膜結合型抗原または膜結合型受容体を標的とする薬剤は、可溶性分子を標的とする薬剤よりもサイトカイン放出を誘導するリスクが高い。サイトカイン放出の測定は、対照として高応答および低応答を引き起こすことが知られている薬剤化合物と比較して行われる。アッセイの結果は、危険有害性の同定および相対リスクの推定を知らせ得る。完全なサイトカイン応答プロファイルのために、下記のサイトカインを測定する：インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、および、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）（例えば、Suntharalingam et al,N Engl J Med 355(10): 1018-1028,2006を参照のこと）。

【0179】

本発明のヒト化抗体に関連するサイトカイン放出を評価するために、ＣＲＡ（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）を実施し、２０人の健康なドナーの新鮮な全血サンプルを使用して分析した。希釈していない全血サンプルを、種々の濃度（１００、１０、１、および０．１μｇ／ｍｌ）の試験された抗体の存在下で、３７℃で２４時間インキュベートした。サイトカイン放出の測定は、ＰｒｏＡｒｒａｙ Ｕｌｔｒａ（登録商標）マイクロアレイアッセイによって実施した。全てのサイトカインを、公知の濃度の標準曲線に対して定量した。２つの対照抗体（低応答対照として、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）／Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、および、高応答対照として、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）／Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）もまた、ＣＲＡに含まれた。ＰＢＳはアッセイの陰性対照として使用された。アッセイの正の対照であるブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を使用して、全てのドナーについてサイトカイン放出の上昇を誘導した。これによって、当該アッセイが、予想の範囲内で実施されることを確認した。

【0180】

表１１は、サイトカイン放出アッセイの結果を、それぞれの薬剤／用量の組み合わせについての中央値（ｐｇ／ｍｌ）で示す。全てのサイトカインについて、ＳＥＢに対する応答の中央値はゼロを超えており、ドナー細胞がサイトカインを産生する機能的能力を有することが実証された。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）は全体的に低レベルのサイトカイン放出を誘導したが、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）の適用により、ドナーの大半でＩＬ－６、ＩＬ－８およびＩＦＮγの放出レベルが上昇した（臨床的に、この薬剤はサイトカイン放出症候群と関連している）。Ｅｒｂｉｔｕｘの場合と同様に、ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４は、試験されたサイトカインの放出に影響を及ぼさず、この特定のヒト化変異体の有益な特性を示す。一方で、ＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５では、最も高い２つの濃度でのみＩＬ－６およびＩＬ－８のレベル上昇が観察された。この結果は、ＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５に対するサイトカイン応答の上昇を示した。従って、本発明の抗体の用量ならびに適切な使用が考慮されるべきである。

【0181】

【表11】

【0182】

本アッセイで得られたサイトカイン放出情報は、臨床の転帰の予測因子とみなすことはできない。ここで得られたデータは、より幅広い危険有害性特定計画の一部を構成するものでなければならず、調査中の化合物に関する他の全ての公知のまたは入手可能な情報との関連において考慮されるべきである。

【0183】

前述の結果は、ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５がサイトカイン応答を誘導しない（またはＣＡ９ｈｕ－２の場合には最高濃度でごくわずかである）という望ましい特性を実証する。

【0184】

〔実施例８：ヒト化抗体ＣＡ９ｈｕ－１の内在化〕
本実施例は、内在化を誘導するヒト化変異体ＣＡ９ｈｕ－１の望ましい特性を実証する。それは、癌免疫療法の効率的なツールを表す。

【0185】

癌治療におけるモノクローナル抗体の有効な応用は、癌組織を特異的に標的とし、受容体媒介インターナリゼーションを介して細胞内空間に入るという、モノクローナル抗体の能力に依存する。２つのマウスモノクローナル抗体のうち、ＣＡ ＩＸの触媒領域に向けられたＶＩＩ／２０ｍＡｂのみが、抗体媒介エンドサイトーシスを誘導することができる。

【0186】

インターナリゼーションを誘導する本発明のヒト化抗体の能力を調べるために、本発明者らはフローサイトメトリーを行った。ＴＮＢＣ細胞、ＪＩＭＴ－１、ならびにＢＴ－２０（５００，０００細胞／６０ｍｍペトリ皿）を低酸素中で４８時間インキュベートして、最高レベルのＣＡ ＩＸタンパク質発現を誘導した。続いて、細胞を、ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４（２５μｇ／ｍｌ；「処置された細胞」と記す）と共に、４℃で３０分間インキュベートして、細胞表面にＣＡ９ｈｕ－１－ＣＡ ＩＸ複合体を補充した。結合していない抗体を除去するために、細胞を洗浄した。次いで３７℃で３時間移し、内在化させた。インターナリゼーション期間の終わりに、細胞をトリプシン処置した。さらに、チューブに移し、ＣＡ ＩＸに向けられたマウスモノクローナル抗体Ｍ７５（１μｇ／ｍｌ）と共に、室温で１０分間インキュベートした。細胞表面のＣＡ ＩＸタンパク質の発現量を決定するために、ＴＮＢＣ細胞（「未処置細胞」と記す）をＭ７５抗体と共にインキュベートした（処置された細胞の場合と同様に）。最後に、処置された細胞および未処置細胞の両方を、Ａｌｅｘａ ４８８結合二次抗体（１：１，０００に希釈した；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に、室温で１０分間インキュベートした。続いて、フローサイトメトリーによって分析した。

【0187】

【表12】

【0188】

表１２は、ヒト化変異体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４によるＢＴ－２０およびＪＩＭＴ－１癌細胞の治療後の細胞表面のＣＡ ＩＸの枯渇を示す。非競合的Ｍ７５モノクローナル抗体の存在下でのみインキュベートした未処置細胞を、癌細胞の表面上でのＣＡ ＩＸタンパク質発現の定量のために使用した（表中、「１００％」と記す）。未処置細胞と比較した場合、ＣＡ ＩＸの細胞表面の発現の量は、本発明のヒト化抗体での処置後、ＢＴ－２０では３２．３８％、ＪＩＭＴ－１細胞では４４．４９％に減少した。取り込まれたＣＡ ＩＸの割合は、ＢＴ－２０ではほぼ６８％、ＪＩＭＴ－１細胞では５５．５％であった。

【0189】

前述のデータは、ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４が内在化を誘導する能力を保持していることを実証し、ヒト化がこの望ましい特性に影響を及ぼさなかったという事実を証明する。

【0190】

〔実施例９：ヒト化抗体の多細胞凝集に及ぼす効果〕
本実施例は、分離状態の間の多細胞凝集を阻害するヒト化抗体変異体の驚くべき特性を実証する。

【0191】

処置された細胞が多細胞凝集体を形成する能力に対する本発明のヒト化抗体の効果を実証するために、本発明者らは多細胞凝集分析を実施した。マトリックス沈着および細胞接着を阻害する非イオン性酸ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）（ポリ－ＨＥＭＡ； Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１０ｍｇ／ｍｌで９９％エタノールに溶解した。６ウェル組織培養プレートを０．５ｍｌのポリＨＥＭＡ溶液でコーティングし、乾燥させ、ＰＢＳで洗浄し、４℃で保存した。Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ細胞（４００，０００細胞／ウェル）を、ポリ－ＨＥＭＡコーティングウェルに添加し、ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４またはＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５（３０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、２４時間および７２時間培養した。多細胞凝集体を形成するＣ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ細胞の能力を評価するために、処置された細胞および未処置細胞のいずれかの画像を取得し、累積画素密度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定した。より長い処置（７２時間）の終わりに、Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ細胞を回収し、遠心分離した。続いて、死細胞を染色するためにヨウ化プロピジウムを使用するフローサイトメトリーによって分析した。

【0192】

細胞外マトリックス（ＥＣＭ）剥離中の癌細胞の多細胞凝集は、アノイキス阻害の効率的なメカニズムを表す。図５は、本発明のヒト化抗体変異体が、ポリ－ＨＥＭＡでコーティングされた皿上での分離状態の間に、Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ細胞が多細胞凝集体を形成する能力を阻害することを明確に示す。多細胞凝集体の累積画素密度を調べると、ＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５抗体での治療の７２時間後に、ほぼ５６％の減少が観察された。ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４抗体による処置は、あまり有効ではないようであった（未処置細胞と比較して、ほぼ１３％の減少）。しかし、ＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５の場合と同様に、２４時間後および７２時間後に減少が観察された。

【0193】

本発明者は、フローサイトメトリーおよびヨウ化プロピジウム染色を行った。これにより、ヒト化抗体を使用した治療の後、Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ細胞のアノイキスに対する増強された感受性を確認した。

【0194】

図６は、本発明の両方の抗体変異体（ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５）が、分離状態で７２時間増殖した後、処置されたＣ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ細胞の生存率に影響を及ぼすことを示す。ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣで処置された死細胞の割合は、それぞれ３７．３％および３５．１％であった。抗体処置なしのＣ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ細胞（「陰性対照」）の場合には、１５．７％のみの死細胞が観察された。

【0195】

前述のデータは、本発明のヒト化抗体が、Ｃ－３３ａ ＣＡ ＩＸ発現癌細胞の多細胞凝集を阻害し（分離状態の間）、続いて、アノイキスに対するそれらの感受性を増強する能力を実証する。この作用メカニズムは、非常に有益な特性を表す。さらに、ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５の両方は、処置された細胞の生存率を低下させる。ヒト化抗体の存在下で培養された死細胞の割合は、対照細胞と比較した場合に、より高かった。

【0196】

〔実施例１０：影響を受けた細胞のプロテオーム／セクレトームならびにトランスクリプトームに対するヒト化抗体の効果〕
本実施例は、サイトカインパターンならびに抗腫瘍免疫の回避に関与するタンパク質の発現に影響を及ぼす、ヒト化抗体の予想外の特性を実証する。

【0197】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでのサイトカインパターンに対するヒト化抗体変異体の影響を、プロテオームプロファイラサイトカインアレイ（ＰＰＡ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）を使用して分析した。ＰＰＡは、ニトロセルロース膜上のサンプル間のサイトカイン差を同時に検出するための、迅速、高感度、および経済的ツールである。ＰＰＡサイトカインアレイは、製造業者の指示に従って、低酸素中で７２時間インキュベートしたＴＮＢＣ細胞株ＢＴ－２０を使用して実施した。ＢＴ－２０ 細胞を１２ウェルプレート（２００，０００細胞／ウェル）に播種し、ヒト化抗体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５（５０μｇ／ｍｌ）の存在下で、または非存在下でインキュベートした。続いて、細胞溶解物（ＢＴ－２０＿プロテオーム）ならびに細胞培養上清（ＢＴ－２０＿セクレトーム）を調製し、分析した。希釈したサンプルをＰＰＡ膜と共に一晩インキュベートし、洗浄し（結合していない物質を除去するために）、ビオチン化検出抗体のカクテルと共にインキュベートした。次いで、ストレプトアビジン－ＨＲＰおよび化学発光検出試薬を加え、発現させた。シグナルは、結合したタンパク質の量に対応して、それぞれの捕捉スポットで生成される。現像されたＸ線フィルム上の画素密度を収集し、ＩｍａｇｅＪ １．３８ｘソフトウェアによって分析した。それぞれのサンプルを表す二重スポットのペアの平均シグナル（ピクセル密度）を決定し、続いて、平均バックグラウンドシグナルをそれぞれのスポットから差し引いた。結果を、抗体処置後の倍数変化として表す（表１３）。

【0198】

【表13】

【0199】

予想通り、プロテオームプロファイラサイトカインアレイは、いくつかの異なる影響を受けたサイトカイン（アップレギュレートまたはダウンレギュレート）発現（ＢＴ－２０＿プロテオーム）または放出（ＢＴ－２０＿セクレトーム）を明らかにした。ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５ヒト化抗体での処置は、わずかに異なる発現パターンをもたらした。しかしながら、ＩＬ－８およびＶＥＧＦの発現は、ヒト化抗体の存在下でのＢＴ－２０細胞のインキュベーション後に、セクレトームならびにプロテオームの場合に、一貫してダウンレギュレートされた（表１３）。

【0200】

処置された細胞の転写プロファイルに対するヒト化抗体の効果を検証するために、逆転写定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を使用した。このように、抗腫瘍免疫の回避を担うタンパク質をコードする遺伝子の発現を、ＴＮＢＣ細胞株ＢＴ－２０を用いて定量し、分析した。ＢＴ－２０ スフェロイド中で予め形成された細胞を、最初に、化学療法薬ドキソルビシン（ＤＯＸ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に、濃度１μＭで４日間曝露した。その後、ＤＯＸなしで３日間培養した。ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４またはＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５（２５μｇ／ｍｌ）での処置を期間全体（７日間）にわたって実施した。同時に、ＤＯＸで前処置しないＢＴ－２０細胞を、ヒト化抗体に７日間曝露した。ＴＲＩｚｏｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、全てのＲＮＡを抽出した。続いて、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ、ＵＳＡを適用）で転写した。Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを適用）、ＣＤ４７およびプログラムされた細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の遺伝子特異的プライマー、ならびに内部対照として作用するβ－アクチンのプライマーを使用して、ＳｔｅｐＯｎｅリアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを適用）で、定量ＰＣＲを実施した。プライマーは、下記の通りであった：ＣＤ４７センス：５’－ＡＧＡＡＧＧＴＧＡＡＡＣＧＡＴＣＡＴＣＧＡＧＣ－３’（配列番号６１）およびＣＤ４７アンチセンス：５’－ＣＴＣＡＴＣＣＡＴＡＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＴ－３’（配列番号６２）；ＰＤ-Ｌ１センス：５’－ＴＧＧＣＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴＴ－３’（配列番号６３）およびＰＤ－Ｌ１アンチセンス：５’－ＡＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＴＣＴＡＡＴＴＧＴ－３’（配列番号６４）；β－アクチンセンス：５’－ＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣ－３’（配列番号６５）およびβ－アクチンアンチセンス：５’－ＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴ－３’（配列番号６６）。結果を、抗体処置後の倍数変化として表す（表１４）。

【0201】

【表14】

【0202】

表１４に示すように、ヒト化抗体で７日間処置されたＢＴ－２０細胞から単離された全てのＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲ分析は、ＰＤ－Ｌ１と同様にＣＤ４７の発現の減少を明らかにした。両方のｍＲＮＡのダウンレギュレーションは、ドキソルビシンに曝露された（ＤＯＸ＋）ＢＴ－２０細胞でより明らかであり、ＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５ヒト化抗体による処置の後、ＰＤ－Ｌ１発現およびＣＤ４７発現は、それぞれ略４０％の減少、および、３０％以上の減少をもたらした。

【0203】

前述のデータは、癌細胞のサイトカインプロファイルに影響を及ぼすヒト化抗体ＣＡ９ｈｕ－１およびＣＡ９ｈｕ－２の能力を実証する。ＶＥＧＦおよびＩＬ－８は、乳癌細胞から分泌される２つの強力な血管新生因子である。それらは、腫瘍新生血管系の確立および拡大に寄与する。血管新生は腫瘍進行に極めて重要であり、ＶＥＧＦおよびＩＬ－８のような血管新生促進分子が癌治療の潜在的標的として検討されている。本発明のヒト化抗体を使用したＴＮＢＣ細胞での処置が、いくつかの間接的効果（例えば、ＶＥＧＦ発現およびＩＬ－８発現のダウンレギュレーション）を誘導する能力があることを考慮すると、ＣＡ ＩＸ標的化療法は、患者にさらなる治療上の利益をもたらすことができると想定される。

【0204】

癌細胞が免疫系（自然免疫応答と適応応答との両方）を回避する能力は、癌の再燃および転移においてきわめて重要な役割を果たす。ＣＤ４７は、マクロファージ上のシグナル調節タンパク質αと相互作用して貪食作用を遮断する細胞表面タンパク質である。その発現は、癌細胞による自然免疫の回避を媒介する主要なメカニズムを表している。ＰＤ－Ｌ１は、ＣＤ２７４としても知られており、抗原提示細胞および腫瘍細胞の表面上に一般的に発現される膜貫通タンパク質である。ＰＤ－Ｌ１は、その受容体ＰＤ－１に特異的に結合する。当該受容体ＰＤ－１は、免疫関連リンパ球の表面に発現している。ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用の破綻は、Ｔ細胞の活性化、増殖、サイトカイン生成および癌細胞排除につながる。従って、本発明のヒト化抗体を使用して処置された、化学療法曝露癌細胞中における、腫瘍ＰＤ－Ｌ１およびＣＤ４７発現のダウンレギュレーションは、癌細胞増殖の阻害をもたらし得る。それらは、本発明のヒト化抗体の予想外の特性を提示する。さらに、ドキソルビシンに曝露されたＢＴ－２０細胞のヒト化抗体治療に応答したＰＤ－Ｌ１およびＣＤ４７発現の同等の阻害は、癌患者の転帰を向上するために、本発明の化学療法および抗ＣＡ ＩＸ抗体を組み合わせるための理論的根拠を提供する。

【0205】

結論として、本発明のヒト化抗体は、抗原結合特異性を保持し、エフェクター機能（ＡＤＣＣ、ＣＤＣ）を有することが実証された。さらに、２０人のドナーの新鮮な全血サンプルを使用して、ヒト化抗体の使用の望ましい安全性を、サイトカイン放出アッセイによって決定した。特異的特性（例えば、ＶＩＩ／２０ｍＡｂに由来するヒト化変異体の内在化）は、癌免疫療法の効率的なツールであることが証明された。さらに重要なことには、ヒト化抗体の予期せぬ驚くべき性質が、分離状態の間の多細胞凝集アッセイ、ならびに、プロテオームプロファイラアレイおよびＲＴ－ｑＰＣＲを使用した、処置された癌細胞のプロテオーム、セクレトーム、およびトランスクリプトームの分析において明らかにされた。

【図面の簡単な説明】

【0206】

【図1】肺転移形成に対するマウスＩＶ／１８モノクローナル抗体の効果。（Ａ）全放射効率は、対照群またはＩＶ／１８ｍＡｂ処置群のいずれかのマウス肺のＨＴ１０８０-ＲＦＰ癌細胞の量を反映する。（Ｂ）対照マウスおよびＩＶ／１８ｍＡｂ処置マウスの、蛍光の肺転移の代表的なｅｘ ｖｉｖｏ画像。

【図2】ＥＬＩＳＡにより測定したＣＡ ＩＸ陽性（Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ）抗原またはＣＡ ＩＸ陰性（Ｃ－３３ａ＿ｎｅｏ）抗原のいずれかを有する、２５個のＣＡ９ｈｕ－１変異体およびＣＡ９ｈｕ－２変異体の反応度。抗体希釈剤のみを含有するサンプルは、「抗体なし」と記す。親ＶＩＩ／２０（Ａ）または親ＩＶ／１８（Ｂ）（「マウス抗体」と記す）、ならびにキメラＨＣ０ＬＣ０（マウス可変領域およびヒトＩｇ定常領域を有する）抗体を、参照サンプルとして使用した。グラフ中のデータは、誘導の倍数として表される。前記データは、（ＣＡ ＩＸ陽性抗原から４９２ｎｍで測定された吸光度のＯ．Ｄ．値）／（ＣＡ ＩＸ陰性抗原から４９２ｎｍで測定された吸光度のＯ．Ｄ．値）として計算される。

【図3】ＣＡ ＩＸ陽性（Ｃ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ）細胞またはＣＡ ＩＸ陰性（Ｃ－３３ａ＿ｎｅｏ）細胞のいずれかを用いた、抗体依存性細胞障害に関するＣＡ９ｈｕ－１およびＣＡ９ｈｕ－２の２５個のヒト化変異体のスクリーニング。キメラＨＣ０ＬＣ０（マウス可変領域およびヒトＩｇ定常領域を有する）抗体を、参照サンプルとして使用した。グラフ中のデータは、相対発光単位（ＲＬＵ）での発光として表される。前記データは、平均±標準偏差値を表す。

【図4】ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５の存在下で、ヒトＰＢＭＣと共に培養したＢＴ－２０スフェロイドの３Ｄモデル。ＢＴ-２０スフェロイド内のＰＢＭＣ細胞の突起（両方とも、ＣｅｌｌＢｒｉｔｅ染料を使用して予め染色した）は、処置３日後にスフェロイド体積を横切ってＺスタック切片から得た（図の上部）。ヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ‐１＿ＨＣ４ＬＣ４およびヒト化抗体変異体ＣＡ９ｈｕ‐２＿ＨＣ４ＬＣ５が、スフェロイド形態に及ぼす影響に関する免疫組織化学分析。ＰＢＭＣと共培養し、ヒト化抗体変異体と１１日間処置した、ＢＴ-２０スフェロイドの代表的な切片。ＣＡ ＩＸ染色の特徴的なパターンがＢＴ-２０スフェロイドを横切る膜内で観察された（図の下部）。

【図5】選択されたヒト化抗体（ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５）を使用した、ポリ－ＨＥＭＡコーティング皿上での、２４時間および７２時間後のＣ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸの多細胞凝集の分析。ヒト化抗体の非存在下でインキュベートしたＣ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ細胞は、「陰性対照」と記す。

【図6】選択されたヒト化抗体（ＣＡ９ｈｕ－１＿ＨＣ４ＬＣ４およびＣＡ９ｈｕ－２＿ＨＣ４ＬＣ５）を使用した、ヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによる、７２時間処置後のＣ－３３ａ＿ＣＡ ＩＸ細胞の分析。ヒト化抗体の非存在下でインキュベートしたＣ-３３ａ＿ＣＡ ＩＸ細胞は、「陰性対照」と記す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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