(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-25
(45)【発行日】2024-08-02
(54)【発明の名称】治療用バクテリオファージ
(51)【国際特許分類】
C12N 7/00 20060101AFI20240726BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240726BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240726BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240726BHJP
A23K 10/10 20160101ALI20240726BHJP
【ＦＩ】
C12N7/00
A61K35/76 ZNA
A61P31/00 171
A61P43/00 121
A23K10/10
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021515574
(86)(22)【出願日】2019-09-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-12
(86)【国際出願番号】 GB2019052695
(87)【国際公開番号】W WO2020065302
(87)【国際公開日】2020-04-02
【審査請求日】2022-09-22
(31)【優先権主張番号】1815483.1
(32)【優先日】2018-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
【微生物の受託番号】NCTC NCTC 18080701
【微生物の受託番号】NCTC NCTC 18080702
【微生物の受託番号】NCTC NCTC 18080703
【微生物の受託番号】NCTC NCTC 18080704
【微生物の受託番号】NCTC NCTC 18080705
【微生物の受託番号】NCTC NCTC 18080706
(73)【特許権者】
【識別番号】512237475
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ レスター
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＬＥＩＣＥＳＴＥＲ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100181847
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 かおり
(72)【発明者】
【氏名】マーサ クロキー
(72)【発明者】
【氏名】アニシャ タンキ
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１４－２１７３３６（ＪＰ，Ａ）
【文献】J. Virol.，2011年，Vol.85, No.24，pp.13470-13471
【文献】J. Virol.，2016年，Vol.90, No.22，pp.10284-10298
【文献】hypothetical protein SEGD1_039 [Enterobacteria phage SEGD1]，NCBI，2016年，Acc. AMR59688.1，<URL;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AMR59688.1>
【文献】International Journal of Pharmaceutics，2017年，Vol.521，pp.141-149
【文献】International Journal of Pharmaceutics，2018年，Vol.542，pp.1-7
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ７／００－７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
バクテリオファージのパネルであって、2、3、または4以上のバクテリオファージを含み、該バクテリオファージは、マイオウイルス科ファミリーのメンバーであって、寄託番号LR535921（NCTC 18080701）、LR535902（NCTC 18080702）、LR535908（NCTC 18080703）、LR535912（NCTC 18080704）、LR535914（NCTC 18080705）、または、LR535916（NCTC 18080706)を有するファージであり、前記バクテリオファージのパネルは、家禽、ブタまたはウシにおけるサルモネラ感染を予防するための治療法に使用するためのものである、パネル。
【請求項2】
前記バクテリオファージが、家禽、ブタおよび／またはウシに関連するサルモネラ菌株を溶解することができる、請求項1に記載のパネル。
【請求項3】
前記サルモネラ菌株が、以下の血清型：a)25 S. Typhimurium、
b)15 S. 4, 12:i:-、
c)10 S. 4.5, 12:i:-、
d)10 S. Bovismorbificans、および
e)10 S. Derby
のいずれか1つまたは複数を含む、請求項2に記載のパネル。
【請求項4】
寄託番号LR535908（NCTC 18080703）およびLR535912（NCTC 18080704）を有するバクテリオファージを含む、請求項1に記載のパネル。
【請求項5】
請求項1～4のいずれかに記載のパネルを含む、医薬組成物。
【請求項6】
請求項1～4のいずれかに記載のパネル、または、請求項5に記載の医薬組成物を含む、動物飼料。
【請求項7】
請求項1～4のいずれかに記載のパネル、請求項5に記載の医薬組成物または請求項6に記載の動物飼料のいずれかを含む、予防的治療法に使用するための、組成物であって、前記予防的治療法が、家禽、ブタまたはウシにおけるサルモネラ感染を予防するためのものである、組成物。
【請求項8】
バクテリオファージ溶液を乾燥して粉末を形成する方法であって、前記バクテリオファージ溶液が、請求項1～4のいずれかに記載のパネル、または、請求項5に記載の医薬組成物を含み、
前記方法は、
a)バクテリオファージと、
(i) 糖であって、該糖はトレハロースである、および／または
(ii) 糖アルコールであって、該糖アルコールはマンニトールである、および／または
(iii) アミノ酸であって、該アミノ酸はロイシンである、および／または
(iv) ポリマーであって、該ポリマーはオイドラギット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）（登録商標）である、
のいずれか1つ以上と、を混合し、
b)前記混合したものを乾燥させる、
ことを含む、方法。
【請求項9】
a)前記乾燥が噴霧乾燥によるものである、および／またはb)前記乾燥した粉末から丸剤またはペレットを製造することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項10】
前記バクテリオファージ溶液が、請求項1～4のいずれかに記載のパネル、または請求項5の医薬組成物を含む、請求項8～9のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
ファージ、糖、糖アルコール、アミノ酸およびポリマーを含む、バクテリオファージ組成物であって、バクテリオファージが、請求項1～4のいずれかに記載のパネル、または、請求項5に記載の医薬組成物を含む、バクテリオファージ組成物。
【請求項12】
熱安定性ファージであって、請求項1のパネルを構成するバクテリオファージのいずれかである、熱安定性ファージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、治療用バクテリオファージ、そのようなファージのパネル、およびサルモネラ感染を予防または治療するために使用することができるそのようなファージの医薬組成物に関する。本発明はまた、バクテリオファージ溶液を乾燥させ、熱安定性バクテリオファージを製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
非チフス性サルモネラ菌種は、世界中の食中毒の主要原因であり、英国では33,000例のヒトのサルモネラ症の発生率が毎年報告されている。European Food Safety Authority (EFSA)は、記録されているヒトのサルモネラ症症例の11.7%が豚肉製品の摂取によって引き起こされていると推定している。英国動植物健康(APHA)による疫学監視により、英国のブタに関連する最も多い5種類のサルモネラ血清型は、S. Typhimurium（サルモネラ・チフ
ィリウム）、S. 4.5, 12:i＞、S. 4:5:12、S. Derby（サルモネラ・ダービー）、S. Bovismorbificans（サルモネラ・ボビスモルビフィカンス）であることが確認されている。S.
Derby、S. 4.5, 12:i＞およびS. Typhimuriumは、また、米国で最も蔓延している上位5
種類以内の血清型である。EUのS. Typhimuriumに加えて、S. 4:5:12:i＞、S. 4:5:12、およびS. DerbyがEFSAにより報告されている最も優勢なサルモネラ血清型である。
ィリウム）、S. 4.5, 12:i＞、S. 4:5:12、S. Derby（サルモネラ・ダービー）、S. Bovismorbificans（サルモネラ・ボビスモルビフィカンス）であることが確認されている。S.
Derby、S. 4.5, 12:i＞およびS. Typhimuriumは、また、米国で最も蔓延している上位5
種類以内の血清型である。EUのS. Typhimuriumに加えて、S. 4:5:12:i＞、S. 4:5:12、およびS. DerbyがEFSAにより報告されている最も優勢なサルモネラ血清型である。
【0003】
諸研究から、サルモネラの保菌率および排泄は離乳期および市場体重のブタが農場を離れ、屠殺のために食肉処理場に運ばれる際に特に増大することが示されており、屠殺体汚染の可能性が最終消費者用豚肉製品に増大する。この問題は、多剤耐性(MDR)サルモネラ
菌株がブタから分離されているため、特に懸念されている。ブタのサルモネラを治療するために利用可能な抗生物質のレパートリーは減少しており、MDRの透過またはヒトの食物
連鎖における抗生物質残留の存在の主要な懸念がある。
菌株がブタから分離されているため、特に懸念されている。ブタのサルモネラを治療するために利用可能な抗生物質のレパートリーは減少しており、MDRの透過またはヒトの食物
連鎖における抗生物質残留の存在の主要な懸念がある。
【発明の概要】
【0004】
サルモネラ感染を制御するためには、抗生物質の代替薬が緊急に必要であることは明らかである。
【0005】
本発明者らはブタおよびニワトリに関連する多剤耐性サルモネラ菌株を標的とするバク
テリオファージ(特定の細菌種を標的とし、殺傷する細菌の天然ウイルス)を単離し、特徴付けている。
テリオファージ(特定の細菌種を標的とし、殺傷する細菌の天然ウイルス)を単離し、特徴付けている。
【0006】
従って、本発明は、200kbp以上の長さで、円形に変更された二本鎖DNAのゲノムを含む
、マイオウイルス科ファミリーのバクテリオファージであって、
以下のいずれか1つまたは複数の特徴を有するバクテリオファージを提供する：
a) ホリン遺伝子をもたない、並びに／または
b) サルモネラリポ多糖に結合する、並びに／または
c) 尾部線維タンパク質が1つのみある、
並びに、
d)配列番号7と少なくとも95%の配列同一性を有する配列および／または配列番号8と少
なくとも80%の配列同一性を有する配列を有する。
、マイオウイルス科ファミリーのバクテリオファージであって、
以下のいずれか1つまたは複数の特徴を有するバクテリオファージを提供する：
a) ホリン遺伝子をもたない、並びに／または
b) サルモネラリポ多糖に結合する、並びに／または
c) 尾部線維タンパク質が1つのみある、
並びに、
d)配列番号7と少なくとも95%の配列同一性を有する配列および／または配列番号8と少
なくとも80%の配列同一性を有する配列を有する。
【0007】
適切には特徴a)～d)のうちの少なくとも2つが提供され、適切には特徴a)～d)のうちの
少なくとも3つが提供され、適切には特徴a)～d)のうちの少なくとも4つが提供される。
少なくとも3つが提供され、適切には特徴a)～d)のうちの少なくとも4つが提供される。
【0008】
例えば、a)およびb)、a)およびc)、a)およびd)、b)およびc)、b)およびd)、または
a)、b)、およびc)；または、a)、b)、およびd)；または、b)、c)、およびd)；または、a)、c)、およびd)。
a)、b)、およびc)；または、a)、b)、およびd)；または、b)、c)、およびd)；または、a)、c)、およびd)。
【0009】
好ましくは、バクテリオファージが家禽、ブタおよび／または牛に関連する3以上のサ
ルモネラ菌株を溶解することができる。例えば、a) 25 S. Typhimurium、b) 15 S. 4,12:i＞、c) 10 S. 4.5, 12:i＞、d) 10 S. Bovismorbificans、e) 10 S. Derby、f) 3 S. 13,23:i＞、g) 5 S. Enteritidis（サルモネラ・エンテリティディス）、h) 4 S. Infantis（サルモネラ・インファンティス）、i) 3 S. Ohio（サルモネラ・オハイオ）、およびj)
3 S. Seftenberg（サルモネラ・セフテンバーグ）のいずれか1つ以上である。
ルモネラ菌株を溶解することができる。例えば、a) 25 S. Typhimurium、b) 15 S. 4,12:i＞、c) 10 S. 4.5, 12:i＞、d) 10 S. Bovismorbificans、e) 10 S. Derby、f) 3 S. 13,23:i＞、g) 5 S. Enteritidis（サルモネラ・エンテリティディス）、h) 4 S. Infantis（サルモネラ・インファンティス）、i) 3 S. Ohio（サルモネラ・オハイオ）、およびj)
3 S. Seftenberg（サルモネラ・セフテンバーグ）のいずれか1つ以上である。
【0010】
適切には、バクテリオファージが、家禽、ブタおよび／またはウシに関連する4つ以上
、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上または10つ以上のサルモネラ菌株を溶
解することができる。
、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上または10つ以上のサルモネラ菌株を溶
解することができる。
【0011】
バクテリオファージは、寄託番号NCTC18080701、NCTC18080702、NCTC18080703、NCTC18080704、NCTC18080705、またはNCTC18080706を有するファージのいずれか1つと80～100%
の配列同一性を有し得る。
の配列同一性を有し得る。
【0012】
寄託はEuropean Collection of Authenticated Cell Cultures（欧州認証細胞培養物収集）により、寄託番号18080701、18080702、18080703、18080704、18080705、または18080706で、2018年8月7日に行われた。
【0013】
適切には、バクテリオファージが、寄託番号18080701、18080702、18080703、18080704、18080705、または18080706を有する、2018年8月7日のEuropean Collection of Authenticated Cell Culturesにおける寄託ファージから選択され得る。
【0014】
ファージは、2、3、4、5、6またはそれ以上の上記バクテリオファージを含むパネル物
中に存在してもよい。例えば、NCTC 18080703および18080704である。適切には、パネル
が18080701；18080702；18080703；18080704；18080705；または18080706のいずれか、またはそれらの組合せを含み得る
中に存在してもよい。例えば、NCTC 18080703および18080704である。適切には、パネル
が18080701；18080702；18080703；18080704；18080705；または18080706のいずれか、またはそれらの組合せを含み得る
【0015】
【表1】
【0016】
適切には、ファージが、SPFM1、3、10、14、15、17、および／または19、またはそれらの組み合わせから選択され得る。適切には、ファージが、SPFM1～22のいずれか1つ以上から選択され得る。適切には、ファージが、SPFM9およびSPFM11を含まないSPFM1～22のいずれか1つ以上から選択され得る。適切には、ファージが、SPFM2、4、10、14、17および／
または19のいずれか1つ以上から選択され得る。適切には最後の2ファージ、少なくとも3
ファージ、少なくとも4ファージはSPFM2、4、10、14、17および／または19から選択され
得る。適切には、SPFM 4および17、またはSPFM 10および14の組み合わせが提供されても
よい。適切には、SPFM 4、10、14、および17のうちの任意の2つを含む組み合わせが選択
され得る。適切には、pH3で安定である少なくとも1つのファージがパネル中に提供され得る。適切には、パネルに使用するためのファージが2、4、または19のうちの少なくとも1
つ、またはそれらの組合せから選択され得る。適切には、加熱による劣化に耐性のファージが使用され得る。適切には、SPFM 10および17から選択されるファージが選択され得る
。適切には、SPFM 10を選択することができる。
または19のいずれか1つ以上から選択され得る。適切には最後の2ファージ、少なくとも3
ファージ、少なくとも4ファージはSPFM2、4、10、14、17および／または19から選択され
得る。適切には、SPFM 4および17、またはSPFM 10および14の組み合わせが提供されても
よい。適切には、SPFM 4、10、14、および17のうちの任意の2つを含む組み合わせが選択
され得る。適切には、pH3で安定である少なくとも1つのファージがパネル中に提供され得る。適切には、パネルに使用するためのファージが2、4、または19のうちの少なくとも1
つ、またはそれらの組合せから選択され得る。適切には、加熱による劣化に耐性のファージが使用され得る。適切には、SPFM 10および17から選択されるファージが選択され得る
。適切には、SPFM 10を選択することができる。
【0017】
適切には、
SPFM4、10、および19
SPFM10、17、および19
SPFM2、17、および19
から選択される3つのファージの組み合わせ、を選択することができる。
SPFM4、10、および19
SPFM10、17、および19
SPFM2、17、および19
から選択される3つのファージの組み合わせ、を選択することができる。
【0018】
適切には、
SPFM10、14、17、19
SPFM2、10、14、19
SPFM2、4、10、19
から選択される4つのファージの組み合わせ、を選択することができる。
SPFM10、14、17、19
SPFM2、10、14、19
SPFM2、4、10、19
から選択される4つのファージの組み合わせ、を選択することができる。
【0019】
表1は、これらのファージについてのヌクレオチド受託番号の詳細を提供し、そしてフ
ァージの寄託は本明細書中に説明されるように、ブダペスト条約の下でなされた。
ァージの寄託は本明細書中に説明されるように、ブダペスト条約の下でなされた。
【0020】
ファージは、上記のバクテリオファージまたはパネル（単数または複数）のいずれかを含む医薬組成物の一部であってもよい。
【0021】
あるいは、ファージが、上記のバクテリオファージ、医薬組成物またはパネルのいずれかを含む動物飼料または消毒剤であってもよい。
【0022】
さらなる態様において、上記のファージ、パネル、医薬組成物または動物飼料は、治療方法、例えば、治療の予防的方法において使用され得る。治療または予防すべき疾患は、家禽、ブタまたは雌牛におけるサルモネラ感染であり得る。
【0023】
従って、サルモネラの治療に使用するための本発明のファージが提供される。適切には、ブタおよび／または家禽、例えばニワトリにおけるサルモネラの治療における使用に適している。
【0024】
バクテリオファージ溶液を乾燥して粉末を形成する方法であって、該方法は、
a)バクテリオファージと、
(i) 糖、および／または
(ii) 糖アルコール、および／または
(iii) アミノ酸、および／または
(iv) ポリマー、
のいずれか1つ以上と、を混合し、
b) 混合物を乾燥させる、
ことを含む、方法も提供される。
a)バクテリオファージと、
(i) 糖、および／または
(ii) 糖アルコール、および／または
(iii) アミノ酸、および／または
(iv) ポリマー、
のいずれか1つ以上と、を混合し、
b) 混合物を乾燥させる、
ことを含む、方法も提供される。
【0025】
適切には、方法の特徴は、
・乾燥が噴霧乾燥によるものである、および／またはb)乾燥粉末から丸剤またはペレットを製造することをさらに含む、
・糖がグルコースベースの糖、好ましくはトレハロースである、
・糖アルコールがマンニトールである、
・アミノ酸が脂肪族アミノ酸、好ましくはロイシンである、
を含む。
・乾燥が噴霧乾燥によるものである、および／またはb)乾燥粉末から丸剤またはペレットを製造することをさらに含む、
・糖がグルコースベースの糖、好ましくはトレハロースである、
・糖アルコールがマンニトールである、
・アミノ酸が脂肪族アミノ酸、好ましくはロイシンである、
を含む。
【0026】
前記方法の乾燥において使用されるバクテリオファージ溶液は、上記のバクテリオファージ、特許請求の範囲のパネル、または医薬組成物のいずれかを含むことができる。
【0027】
さらなる態様において、ファージ、糖、糖アルコール、アミノ酸およびポリマーを含むバクテリオファージ組成物が提供される。ファージ、糖、糖アルコール、アミノ酸またはポリマーは、上記のものいずれであってもよい。
【0028】
また、以下を含む熱安定性ファージが提供される：
a) 配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有する配列における多型1
b) 配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する配列における多型2
c) 配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する配列における多型3
d) 配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する配列における多型4。
a) 配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有する配列における多型1
b) 配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する配列における多型2
c) 配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する配列における多型3
d) 配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する配列における多型4。
【0029】
適切には、ファージが本明細書中に記載される多型1、2、3、または4を有し得、そして配列番号2に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少
なくとも99%の配列同一性を有する。
なくとも99%の配列同一性を有する。
【0030】
熱安定性ファージは、上記のファージのいずれであってもよい。
【0031】
さらなる態様において、ファージゲノムのヌクレオチド配列を以下のように変異させることを含む、熱安定性ファージを作製する方法が提供される:
a) 配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有する配列における塩基a、gまたはc～tからの多型1の位置、
b) 配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する配列における塩基a、tまたはc～gからの多型2の位置、
c) 配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する配列中の塩基a、gまたはt～cからの多型3の位置、
d) 配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する配列における塩基a、gまたはc～tからの多型4の位置。
ここで、該方法は、配列番号1および／または配列番号2をファージゲノムに導入する第1
の工程を任意に含む。
a) 配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有する配列における塩基a、gまたはc～tからの多型1の位置、
b) 配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する配列における塩基a、tまたはc～gからの多型2の位置、
c) 配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する配列中の塩基a、gまたはt～cからの多型3の位置、
d) 配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する配列における塩基a、gまたはc～tからの多型4の位置。
ここで、該方法は、配列番号1および／または配列番号2をファージゲノムに導入する第1
の工程を任意に含む。
【0032】
適切には、ファージが本明細書中に記載される多型1、2、3、または4を有し得、そしてそれぞれ配列番号1または2に対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少
なくとも97%、少なくとも99%の配列同一性を有する。
なくとも97%、少なくとも99%の配列同一性を有する。
【0033】
本発明は、単なる例として、および添付の実施例を参照して、以下にさらに記載される。
【発明を実施するための形態】
【0034】
バクテリオファージ
【0035】
一般にファージとも呼ばれるバクテリオファージはその標的細菌内で感染し、複製するウイルスである。ファージは、上記、テンペレートファージ／溶原性ファージ、ファージ様粒子(プラスミドなど)または溶菌ファージであり得る。
【0036】
プロファージ／テンペレート/溶原性ファージは、二本鎖または一本鎖DNAまたはRNAの
いずれかでできたバクテリオファージ粒子である。ファージゲノムは円形細菌DNA染色体
に挿入、組み込まれ、または、染色体外プラスミドとして存在することができる。これはファージの潜在型で、細菌細胞を破壊することなくウイルス遺伝子が細菌内に存在し、ときに細菌宿主の全体的な適応度に競合的な利点をもたらすことがある。
いずれかでできたバクテリオファージ粒子である。ファージゲノムは円形細菌DNA染色体
に挿入、組み込まれ、または、染色体外プラスミドとして存在することができる。これはファージの潜在型で、細菌細胞を破壊することなくウイルス遺伝子が細菌内に存在し、ときに細菌宿主の全体的な適応度に競合的な利点をもたらすことがある。
【0037】
溶菌性または毒性ファージは宿主細菌DNAとは別個に存在し、宿主細菌DNAとは別個に複製するウイルスDNA／RNAを含んでいる。溶菌ファージは感染細胞とその膜を破壊すると放出される。
【0038】
記載されるファージは溶解ファージであり、それらの自然環境から単離および／または精製される。
【0039】
ファージのモルフォロジー
【0040】
本明細書中に記載される22のバクテリオファージは等尺性の頭部および収縮性の尾部を有し、そしてCaudovirales（カウドウイルス）内のマイオウイルス科ファミリーのメンバーとして分類される。
【0041】
ファージの尾部は、約130～260nmで変化する。例えば、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240または250nmである。
【0042】
キャプシドの直径は、約70nm～160nmである。例えば、80、90、100、110、120、130、140または150nmである。
【0043】
ファージの遺伝学的解析
【0044】
ファージは直鎖状で環状に置換された二本鎖DNAゲノムをもつ。ゲノム長は約200～260kbpである。例えば、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250または255kbpである。すなわち、バクテリオファージはジャンボファージに分類される。
【0045】
ファージはホリン遺伝子をもたないこととしてもよく、および／またはファージは1つ
の尾部繊維タンパク質しかもたないこととしてもよく、および／またはファージレセプターはサルモネラリポ多糖(LPS)であってもよい。
の尾部繊維タンパク質しかもたないこととしてもよく、および／またはファージレセプターはサルモネラリポ多糖(LPS)であってもよい。
【0046】
ファージのゲノムはさらに、これらの特徴の組み合わせを含めて、以下の特徴のいずれか1つ以上を有することとしてもよい：
・1つのtRNAのみをコードする、および／または
・異なるDNA配列をもつ1つ以上のRNAP(RNAポリメラーゼ)ベータサブユニットをコード
する。すなわち、RNAPベータサブユニットの配列同一性が50%以下である、および／また
は
・葉酸合成経路の遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよび／またはチミジル酸シンターゼおよび／またはチミジル酸キナーゼをコードする、および／または
・DNAアデニンメチラーゼ遺伝子、および／または
・ラジカルS-アデノシルメチオニン遺伝子。
・1つのtRNAのみをコードする、および／または
・異なるDNA配列をもつ1つ以上のRNAP(RNAポリメラーゼ)ベータサブユニットをコード
する。すなわち、RNAPベータサブユニットの配列同一性が50%以下である、および／また
は
・葉酸合成経路の遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよび／またはチミジル酸シンターゼおよび／またはチミジル酸キナーゼをコードする、および／または
・DNAアデニンメチラーゼ遺伝子、および／または
・ラジカルS-アデノシルメチオニン遺伝子。
【0047】
このファージは、Myrovidaeファミリーの他のメンバーであるサルモネラファージSPN3USおよびSEGD1と、いくつかのコア遺伝子および仮定上のタンパク質の配列同一性を共有している(ただし、コア遺伝子のいずれもこれらの既知のファージと100%の配列同一性を共
有していない)。
有していない)。
【0048】
いくつかのコア配列間の差異を以下に示す：
【0049】
配列番号3：エンドリシン。SPN3USおよびSEGD1と95%類似。機能：バクテリオファージ
が、複製サイクルの端部に、細菌宿主のペプチドグリカンを内部から分解するために用いる酵素で、細胞溶解と子孫ビリオンの放出をもたらす。
が、複製サイクルの端部に、細菌宿主のペプチドグリカンを内部から分解するために用いる酵素で、細胞溶解と子孫ビリオンの放出をもたらす。
【0050】
>MFRTILFLLVAMTTFNSNASYQTTSNKHQKEFVLIQDQFNEIKPLIVTASRKQGVHAGMLATTIYRESRFNKNVGKNKSSSASSVVQMTTGTKRSMIRLYGKQLNIPKNADLNKPKYAVQLAAVYMKHIEEHLTKQLKRKPSTAEIALGYRFGEGAAVAMIKKKSPVGKRWMASYRKDAAFYGAKMTPPKAETRQLAFAKEDHDQRVAELQKIWDTLYTKISPAAGTLLANNTIMKGALL
【0051】
配列番号4：アセチルトランスフェラーゼ(GNAT)ファミリータンパク質。95%はSPN3USに類似し、63%はSEGD1に類似している。機能：GNATは、抗生物質に対する耐性を含む一連の酵素機能を有することができる
【0052】
>MKTVAKLFRSSIRSAEFQNNVGTDTVRARRLKEFLKDETYSVYVVRNKETWEGYLVATYRHGDPTLTCHYFEEFVPGAFDKVGLALVLDHTGFEYMSCPAPTGDVEQKLVEKGFVLSDIVWACHSKLFDKVITASEIKIISGDAYAELSKDDKDVILNLVSGAICEELEYDVRGHYTHIGPLAETVIARIQHANVETAIWRDGRDIVGIAQMRLVAPGVVELSGLTVAPTHRKRGIGRRLMGALFDFAQRHSDQVYIETAADNNPANHLYGNILRCKQVLRTLTLKRDPELISWKRVKGNRADRVLKEEPSLPVETNPRPTINDMFQSGMRGC
【0053】
配列番号5：N-アセチルトランスフェラーゼ（acetyltrasferase）GCN5。SPN3usと67%、SEGD1と99%類似
【0054】
>MKIVFVTKPNSPYGKKYYADLLGLHNKLYDDQKIKLADLNGREGFNQISKLEEVWGEGTLCACAVDDRGVAVGFITFGYTKKGQRFLWVYNFFVDESVRSQGVGHELIEAVENYGKSKGCAWMQLNVLGNNDRAIAFYERFGFRTEYQDMVKEL
【0055】
配列番号6：Phikz様内部ヘッドタンパク質。35%はSPN3USに類似し、96%はSEGD1に類似
している。機能：ジャンボファージPhiKZに類似する頭部タンパク質。
している。機能：ジャンボファージPhiKZに類似する頭部タンパク質。
【0056】
>MANFVKSKLARESVEATGDVIDGLSNVEPAEENIDVQLAEVASIDGQLEQLDGDQETLAADTERTEAAIDAADEKIENGEEMPEEAIAHTEVAQESIRKRWAIDRTKLARESYRRGRGMTKAAQEGWKETLKDLFKRFVELCKAVIAKAKELKLKYINVGKSAQKRAKAYQEMLRKLGKQKKENISGGFISKLSIEGDFDVANSIAIAKELTGGKAKDAINKLSSQASESAVAITKTAEGTATAAKGAVDVALFGTAAKKLRTLPQFEDGEGGQKVLALPGNAYVQIGSKTLAGGQDFTAVAFLSTGDSTDTKEIATPAITALASAATALDAIGKGFEKVLQDFRSYDADVEKLEQAASKAAAALDKSNDEGEWEALRNARTAADQAVRNYQTLNRAVAHVGNTVISGLNGYIGAGIGAYEKSKA
【0057】
配列番号7：ファージ推定ATP依存性DNAヘリカーゼ：SEGD1に41%、SPN3USに92%類似
【0058】
>MVEIQMTYTSMGVRVEVPIRQAERAILAWAEENMHAPKMGKQHGRITTERGDAYYAHIPSLRTFIFHKVFAEKIKHILQRAAIEYAFQYKLTEHHPERGTPYSCTFDNYGFSMVESDPESRFYYQNEVVDAASDPNRPQTIFAIQTGRGKTKSCMKSMVKRGTRTALIHRPSYVPKWLFDVCDDETGLRILRDEVLVCTGVQAIYDALEMGKSGELDRRGIKVIILPTVSLQRFLKEYINTAATNPVDLDTFYDVLGVGLVAMDEVHEHFHLVYMAGIMLNPPASIEMSATLKPGSSKAFIAERYLERFPMEYRISIPIIPVVDVKALYYRLDDKKFAWWASKMTPYNHKLFEGKLIKENLHLEYANMIWDVVEKSFLKRYQPGQKCLLLFATVAMCEFFTEYVKDKLSRDPVFHPLMVAKYNAGDSYDDFIQADFSISTPGKAGTAVDKPGLVHMYISTPVEDQQLNEQMAGRPRKILHNEWGEIDPTVWLFHAYNVPKHCNYLNARQKSLKDVVLSFRIATSPYVVRKSHAHSAASSRATAALHRNDFSKFSRKHSKGVSRRRRRR
【0059】
配列番号8：SPN3USまたはSEGD1のいずれにも存在しないHsIVファミリータンパク質の推定ペプチダーゼ
【0060】
MTTIAFDGKVLAADGQLTRGSNICNLNTQKLFICPSDEEWWITGERIVAFGVSGDITGQLALLETVRLRPGYKGLTQSSQLPAKMDFTFLMLLASGKAIVGGKREDDVTLWWSEATPPLATGSGYEYALGAMKMGANAVRAVEIASECDIYTGGEISTYELR
【0061】
寄託番号
【0062】
本パネルに含まれるバクテリオファージは、寄託されたバクテリオファージの突然変異株および変異体を含むことができる。
【0063】
本発明のファージは、以下の表に従って本出願において言及される:
【0064】
【表2】
【0065】
寄託はNCTC／ECACCにおけるブダペスト条約に基づき、ブダペスト条約に従って運営さ
れる国際寄託機関(IDA)の規則に従って行われ、2018年8月7日の寄託日が与えられた。
れる国際寄託機関(IDA)の規則に従って行われ、2018年8月7日の寄託日が与えられた。
【0066】
寄託されたバクテリオファージのこのような突然変異株および変異体は、サルモネラを死滅させる能力を保持している。突然変異株および変異体は、本発明の寄託されたバクテリオファージの少なくともいずれか1つのゲノムと比較して、ゲノム全体にわたって少な
くとも80%、85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少な
くとも98%または少なくとも99%のヌクレオチド配列同一性を有する。
くとも80%、85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少な
くとも98%または少なくとも99%のヌクレオチド配列同一性を有する。
【0067】
このような突然変異株および変異体は、寄託されたバクテリオファージの核酸配列からのヌクレオチドの付加、欠失または置換（例えば、1、2、3、4または5ヌクレオチドの、
任意に連続するヌクレオチドの添加、欠失または置換）から生じ得る。
任意に連続するヌクレオチドの添加、欠失または置換）から生じ得る。
【0068】
任意に、突然変異株または変異体は、インテグラーゼ遺伝子および／または毒素遺伝子を含まない。サルモネラを殺す能力を保持することに加えて、突然変異株および変異体は、それが由来する寄託されたバクテリオファージについて記載される任意のさらなる特性を有し得る。
【0069】
パネル
【0070】
バクテリオファージのパネルは、本明細書中に提供されるファージの任意の組合せを含み得る。ファージは、別々の、連続的な、または同時の投与のために調製され得る。
【0071】
上記に列挙された群から選択され得るバクテリオファージの全ての組み合わせは、本パネルに含まれることが意図される。
【0072】
パネルは、追加のコンポーネント（成分）を有することができる。例えば、ファージでなくてもよいコンポーネントである。例えば、担体、賦形剤、治療薬剤（例えば、抗生物質などの非ファージ剤）である。
【0073】
任意選択で、パネルは、2つ以上の異なるバクテリオファージ、3つ以上の異なるバクテリオファージ、4つ以上の異なるバクテリオファージ、5つまたは6つ以上の異なるバクテ
リオファージを含むことができる。
リオファージを含むことができる。
【0074】
例えば、パネルは2つのファージを含むことができる。たとえば、SPFM10および14、SPFM2および4、SPFM10および17、またはSPFM2および10などである。
【0075】
例えば、パネルは、3つのファージを含み得る。例えば、SPFM4、10および19、SPFM10、17および19、またはSPFM2、17および19である。
【0076】
例えば、パネルは4つのファージを含むことができる。例えば、SPFM10、14、17および19、SPFM2、10、14および19、またはSPFM2、4、10および19である。
【0077】
例えば、パネルは、4つより多いファージを含み得る。例えば、SPFM10、14、17および19およびもう１つもしくは複数、SPFM2、10、14および19およびもう１つもしくは複数、またはSPFM2、4、10および19およびもう１つもしくは複数。
【0078】
例えば、パネルは、SPFM2、4、10、14、17および19を含み得る。
【0079】
血清型
【0080】
サルモネラ株は血清型分類によって分類される。
【0081】
血清型分類にはリボソームRNA遺伝子のサイズとコピー数の分析が含まれ、これにより
各株(血清型として知られる)の遺伝的プロファイルが確立される。血清型決定のための標準的なプロトコルは、アガロースゲル電気泳動と結合したPCR、または蛍光プライマーの
取り込み後のキャピラリー分析の両方を使用する。
各株(血清型として知られる)の遺伝的プロファイルが確立される。血清型決定のための標準的なプロトコルは、アガロースゲル電気泳動と結合したPCR、または蛍光プライマーの
取り込み後のキャピラリー分析の両方を使用する。
【0082】
本明細書中に記載されるファージは、以下の5つのサルモネラ血清型を標的とする：a)25 S. Typhimurium、b)15 S. 4, 12:i＞、c)10 S. 4.5, 12:i＞、d)10 S. Bovismorbificans、およびe)10 S. Derby。これらは英国のブタで最も流行している5つの血清型である。これらの血清型はすべて多剤耐性を示す。従って、本明細書中に記載されるファージのような新しい技術が、緊急に必要とされる。
【0083】
ファージの増殖および単離
【0084】
ファージの増殖および単離は、実施例のセクションに記載される。
【0085】
熱安定性ファージ
【0086】
ファージは、高温で、高められた安定性を有し得る。本明細書中に記載されるファージは、50、55、65、70、75、80、85または90℃で安定であり得る。
【0087】
ファージを4、10、20、30、40、50、60、70、80、90および100℃の温度に1時間暴露す
ることによって、熱安定性を試験し、そしてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)機械中でインキ
ュベートした。ファージ力価を決定するために、ファージ溶解物を10倍連続希釈し、小滴プラークアッセイ方法を、SL1344の菌叢を有するLB1%寒天プレート上で使用した。最終ファージ力価をPFU/mlとして表した。
ることによって、熱安定性を試験し、そしてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)機械中でインキ
ュベートした。ファージ力価を決定するために、ファージ溶解物を10倍連続希釈し、小滴プラークアッセイ方法を、SL1344の菌叢を有するLB1%寒天プレート上で使用した。最終ファージ力価をPFU/mlとして表した。
【0088】
安定とは、高温に暴露した場合の力価の損失が最小限であることを意味する。例えば、60℃、70℃、80℃または90℃での上記の熱安定性試験を用いた場合、0.0～3.5 log10 PFU/ml以下の損失である。例えば、0.0-0.05、0.1、0.3、0.6、0.9、1.0、1.3、1.6、1.9、2.0、2.3、2.6、2.9、3または3.5 log10 PFU/mlの損失。
【0089】
ファージ単独では不安定であるが、保存溶液は熱安定性を増加させることがある。したがって、熱安定性はまた、保存溶液に浸漬された後に高温に曝露された場合の力価の最小損失を指し得る。
【0090】
SPFM10、14および／または17と配列同一性を有するファージは、特に熱安定性である。例えば、ファージは、SPFM10、14または17と80、85、90、95または100%同一である配列同一性がある。
【0091】
遺伝学的解析により、このファージの安定性に関与していると考えられるSPFM10の特定の一塩基の相違が明らかになった。以下、これらについて説明する。
【0092】
ペクチン酸リアーゼであると予測されるSPFM10の以下の配列では、ゲノムの70890位に
、aの代わりにtが存在する(aが本出願で同定された熱安定性の低いSPFMファージに存在する)。この多型は、以下の配列番号1の第1行に太字および下線で示されている。これは、
特許請求の範囲において多型1(a～t)と呼ばれる。
、aの代わりにtが存在する(aが本出願で同定された熱安定性の低いSPFMファージに存在する)。この多型は、以下の配列番号1の第1行に太字および下線で示されている。これは、
特許請求の範囲において多型1(a～t)と呼ばれる。
【0093】
【0094】
配列番号1のアミノ酸配列を以下に示す。アデニンからスレオニンへのSNPは、下に下線を引いたように、セリンをスレオニンに変更させる(配列番号9の最後の2行目)。このセリンからスレオニンへの変異はファージをより熱安定にするかもしれない。
【0095】
配列番号9：
Met S I I L N W K Q Q P G Q T L D S I E I Y R Y D N P R Q S V N P V A P G E P I V T L P G N T T T Y E D K T T E A Y K T Y Q Y R I V A V K G T E K V Met G L P I V Q G D F P Met T G P G P Q E L I R G D W H R G Y F G T L T N E E F I L N H A E L N G L I G F N A W N Q A P T L F H K F V F K G R I L F I P D T V T R L G T T W N E Q Y Q Q G L A W G T D D Y G F P P R S V S T T N Q R R T F N K D G Y E Y V V R L P R L G D Y S Y G H S T Y L S S G G Y F Q D G E W H N T F A S L F R Y A G V V R R F G D L P T R S G G S P T D S S A T L F A N G Y D N A T P W Y Y R S N S P D S P S Y T T S T N S A S V V H V I E L V L S
Met S I I L N W K Q Q P G Q T L D S I E I Y R Y D N P R Q S V N P V A P G E P I V T L P G N T T T Y E D K T T E A Y K T Y Q Y R I V A V K G T E K V Met G L P I V Q G D F P Met T G P G P Q E L I R G D W H R G Y F G T L T N E E F I L N H A E L N G L I G F N A W N Q A P T L F H K F V F K G R I L F I P D T V T R L G T T W N E Q Y Q Q G L A W G T D D Y G F P P R S V S T T N Q R R T F N K D G Y E Y V V R L P R L G D Y S Y G H S T Y L S S G G Y F Q D G E W H N T F A S L F R Y A G V V R R F G D L P T R S G G S P T D S S A T L F A N G Y D N A T P W Y Y R S N S P D S P S Y T T S T N S A S V V H V I E L V L S
【0096】
別の推定上のペクチン酸リアーゼでは、さらなる多型が見出されている。この配列を以下に示す(配列番号2)。SPFM10では、以下の点で一塩基多型が存在する:
・74291位：SPFM10において、この位置にgが存在する。この位置のグアニンは、特許請求の範囲において多型2と称されている。
・74294位：SPFM10ではこの位置にcがある。この位置のシトシンは、特許請求の範囲では多型3と称されている。
・74295位：PSFM10では、この位置にtが存在する。この位置のスレオニンは、特許請求の範囲では多型4と称されている。
これらは、以下のSPFM10の配列番号2において太字および下線で示される(矢印が指す第2の線を参照のこと)。
・74291位：SPFM10において、この位置にgが存在する。この位置のグアニンは、特許請求の範囲において多型2と称されている。
・74294位：SPFM10ではこの位置にcがある。この位置のシトシンは、特許請求の範囲では多型3と称されている。
・74295位：PSFM10では、この位置にtが存在する。この位置のスレオニンは、特許請求の範囲では多型4と称されている。
これらは、以下のSPFM10の配列番号2において太字および下線で示される(矢印が指す第2の線を参照のこと)。
【0097】
【0098】
配列番号2のアミノ酸配列は：
配列番号10：
Met P I T L H F A Q R K P Q A L D S I E I Y R K T P G N A T I D V N A P G T P L A T L P G D A T S Y E D N A V E N N T T Y R Y W I A A V K D G E R V F N T P T A Q G F F L D T G P G P Q K L L Y G D W H A G Y F G T V T P A E L F T N T E L N G L V V N Met F S S A V G A W H K F I Y K N R I L F Met S D N S I I N A S P Q F I Y N Q G Met Met Y G Q D G N G Y V P G W A T A R N Q R R T V T K N G Y E Y V V R L P Y L F D Y K F W T S Y V G S G N T E L Y L D G E W F N T F A R L Y N Y S G Q F P R F D D I P V G P I D S V T A Q Q S A F F A A Met N N T S S Q W Y N S P P Y P E S P S W S N Y G T T T I R S I A V L E L V L P
である。
配列番号10：
Met P I T L H F A Q R K P Q A L D S I E I Y R K T P G N A T I D V N A P G T P L A T L P G D A T S Y E D N A V E N N T T Y R Y W I A A V K D G E R V F N T P T A Q G F F L D T G P G P Q K L L Y G D W H A G Y F G T V T P A E L F T N T E L N G L V V N Met F S S A V G A W H K F I Y K N R I L F Met S D N S I I N A S P Q F I Y N Q G Met Met Y G Q D G N G Y V P G W A T A R N Q R R T V T K N G Y E Y V V R L P Y L F D Y K F W T S Y V G S G N T E L Y L D G E W F N T F A R L Y N Y S G Q F P R F D D I P V G P I D S V T A Q Q S A F F A A Met N N T S S Q W Y N S P P Y P E S P S W S N Y G T T T I R S I A V L E L V L P
である。
【0099】
多型2：74291位のアデニン(SPFM4および17でみられる)からグアニン(SPFM10でみられる)へのSNPは、ロイシンからプロリンへの変化を生じる（上記のSSQWYNSPPY(配列番号11)）。このプロリンへの突然変異は、SPFM10をより熱安定性にすることができる。
【0100】
多型3：74294位のアデニン(SPFM2でみられる)からシトシン(SPFM10でみられる)へのSNPは、イソロイシンからセリンへの変化をもたらす(上記のSSQWYNSPPY(配列番号12))。このSPFM10におけるセリンへの変異は、このファージをより熱安定性にする可能性がある。
【0101】
多型4：74295位のグアニン(SPFM2、4および17でみられる)からスレオニン(SPFM10に見
られるよう)へのSNPは、上記の多型3と同じ位置のアルギニンからセリンへの変化をもた
らす。また、配列番号2のこの位置のセリンは、SPFM10をより熱安定性にすることができ
る。
られるよう)へのSNPは、上記の多型3と同じ位置のアルギニンからセリンへの変化をもた
らす。また、配列番号2のこの位置のセリンは、SPFM10をより熱安定性にすることができ
る。
【0102】
サルモネラ感染
【0103】
サルモネラ感染症は腸管を侵す一般的な細菌性疾患である。
【0104】
パネルは獣医学的使用のためのものである。すなわち、治療のための対象は動物体である。
動物は、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウおよび／またはウシであり得る。
動物は、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウおよび／またはウシであり得る。
【0105】
サルモネラ感染は、以下の血清型：S. Typhimurium、S. 4, 12:i＞、S. 4.5, 12:i＞、
S. Bovismorbificans、およびS. Derby由来のいずれか1つ以上の株によって引き起こされる可能性がある。これらの菌株はいずれも多剤耐性を示す。このファージは、これらの株のそれぞれからの分離株の80、85、90、95または100%を死滅させる可能性がある。
S. Bovismorbificans、およびS. Derby由来のいずれか1つ以上の株によって引き起こされる可能性がある。これらの菌株はいずれも多剤耐性を示す。このファージは、これらの株のそれぞれからの分離株の80、85、90、95または100%を死滅させる可能性がある。
【0106】
サルモネラ感染は、以下の血清型由来の株：S. 13,23:i＞、S. Enteritidis、S. Infantis、S. OhioおよびS. Seftenbergのいずれか1つ以上によって引き起こされる可能性がある。このファージは、これらの株のそれぞれからの分離株の33、100、50、60または33%を死滅させる可能性がある。
【0107】
医薬組成物
【0108】
この組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤および／または担体を含み得る。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は当業者に公知であるような、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤(例えば、抗
細菌剤、防黴剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤
、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香料、色素、そのような材料、それらのおよび組み合わせを含む(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing
Company, 1990, pp. 1289-1329を参照のこと)。
細菌剤、防黴剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤
、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香料、色素、そのような材料、それらのおよび組み合わせを含む(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing
Company, 1990, pp. 1289-1329を参照のこと)。
【0109】
処置の方法
【0110】
ファージは、サルモネラ、例えば、ブタ、ウシおよび家禽（例えばニワトリ）のような動物を処置する方法において使用され得る。
【0111】
組成物は、様々な投与経路のために調製することができる。例えば、ファージまたは医薬組成物は、動物飼料、例えばブタまたはニワトリ飼料に添加することができる。例えば、動物飼料は、ペレットのような圧縮飼料を含むことができる。他の経口組成物を使用することができる。あるいは、ファージをスプレーに添加して、ペンまたはカーカスを消毒することができる。
【0112】
予防的処置方法
【0113】
ファージのファージや薬理学的組成物は、サルモネラ菌に感染する前に動物に与えてもよい。例えば、離乳期の若齢ブタは非常に感染しやすい。したがって、このシナリオでは、予防的治療を施すことができる。
【0114】
治療的有効性
【0115】
ファージは一般に、意図される目的を達成するために、用量が有効な様式で使用される。疾患状態を処置または予防するための使用のために、本発明の分子、またはその医薬組成物は、治療有効量で投与または適用される。治療有効量は、治療される動物の症状を改善もしくは予防するか、またはその生存を延長するのに有効な量である。治療有効量の判定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【0116】
検出
【0117】
実験室ベースの方法、例えばELISAおよびPCRベースの方法は現在、サルモネラを検出するために使用されているが、これらの方法は特異性を欠くという報告がある。本願で述べられているファージは、サルモネラ菌株を診断する別のより特異的な方法として利用でき
る可能性がある。
る可能性がある。
【0118】
このような診断検査のためにブタまたは他の動物から採取した試料は糞便でよい。次に、タグをファージに付加することができる。例えば、蛍光タグである。ファージが標的サルモネラに感染/結合したら、標的サルモネラに結合したタグを検出できる。例えば、試
料から残りのファージを溶出し、サルモネラ内のタグまたは結合したタグを検出することによる。次いで、残りの試料中に存在するタグの量を評価することができる。これは、存在する細菌細胞の数の指標を与えることができる。例えば、試料から結合していないファージの残りを洗い流した後に残っている蛍光の量。
料から残りのファージを溶出し、サルモネラ内のタグまたは結合したタグを検出することによる。次いで、残りの試料中に存在するタグの量を評価することができる。これは、存在する細菌細胞の数の指標を与えることができる。例えば、試料から結合していないファージの残りを洗い流した後に残っている蛍光の量。
【0119】
配列同一性
【0120】
配列同一性は、ファージ寄託物、例えば、寄託されたファージと80、85、90、95または100%のヌクレオチドまたはアミノ酸配列同一性とすることができる。
【0121】
あるいは、配列同一性は、配列番号1～10のいずれかを参照し得る。例えば、配列番号1～10のいずれかと80、85、90、95または100%のヌクレオチドまたはアミノ酸配列同一性である。配列同一性は、配列番号に関して全配列長にわたって計算される。
【0122】
多型
【0123】
本明細書においてSNPとも呼ばれる一塩基多型は、一塩基の違いを表す。例えば、SNPの結果として、ヌクレオチドシトシン(C)は、DNAの特定の延伸においてヌクレオチドチミン(T)で置換され得る。
【0124】
ファージを乾燥させる方法
【0125】
ファージは、動物および患者へのより便利な投与方法を提供するために乾燥され得る。乾燥はまた、ファージの貯蔵寿命を増加させる。例えば、乾燥ファージが飼料に添加される場合、余分な水分は添加されない。これは、製品の貯蔵寿命をさらに延ばす。
【0126】
乾燥のための調製において、ファージは、約1010 pfu/ml以上の力価まで濃縮され得る
。
。
【0127】
ファージは、乾燥中にそれらを保護するために保存溶液と混合される。保存溶液は以下に記載されるように、糖、および場合によりアミノ酸およびポリマーを含み得る。
【0128】
ファージは、1:10v/v濃度(ファージ：ミックス)で溶液と混合することができる。
【0129】
糖・糖アルコール
【0130】
1つ以上の糖を保存組成物に使用することができる。例えば、グルコースまたはマンニ
トールのようなグルコースベースの糖である。グルコースベースとは、グルコースを含む二糖または多糖類を意味する。
トールのようなグルコースベースの糖である。グルコースベースとは、グルコースを含む二糖または多糖類を意味する。
【0131】
糖は二糖であってもよい。
【0132】
保存溶液は、単独で、または1つ以上の糖に加えて、糖アルコールを含み得る。適切な
糖アルコールには、マンニトールが含まれる。他の6炭素糖アルコールも好適である。
糖アルコールには、マンニトールが含まれる。他の6炭素糖アルコールも好適である。
【0133】
例えば、保存溶液は、トレハロース、マンニトールおよびロイシンのうちの1つ以上を
含み得る。
含み得る。
【0134】
アミノ酸
【0135】
糖および／または糖アルコールに加えて、1つ以上のアミノ酸を保存溶液に添加しても
よい。
よい。
【0136】
アミノ酸は、非極性脂肪族アミノ酸であってもよい。例えば、アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、メチオニンまたはフェニルアラニンであり得る。
【0137】
ポリマー
【0138】
ポリマーを保存溶液に添加して、ファージのコーティングを助け、動物の腸内にいる間にファージが死滅しないことを確実にすることもできる。ポリマーはまた、ファージが働くことが必要とされる腸へのファージの標的化を補助し得る。
【0139】
ポリマーは、アクリル酸およびメタクリル酸のエステルから誘導されるコポリマーを含み得る。ポリマーは、活性成分のpH依存性放出を可能にする酸性またはアルカリ性基を含んでもよい。
【0140】
例示的保存液
【0141】
保存溶液は、トレハロース、マンニトールおよびロイシンを含み得る。
【0142】
例えば、保存溶液は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19また
は20%以上のトレハロース、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15%のマンニトー
ルおよび0.5、1、2、3、4または5%のロイシンを含み得る。例えば、8%トレハロース、8%
マンニトールおよび1%ロイシンである。
は20%以上のトレハロース、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15%のマンニトー
ルおよび0.5、1、2、3、4または5%のロイシンを含み得る。例えば、8%トレハロース、8%
マンニトールおよび1%ロイシンである。
【0143】
Eudragit S100(Evonik Health Care, Germanyから購入)と呼ばれるポリマーは、ファージを保護するのにさらに役立つことが見出された。例えば、8%トレハロース、8%マンニトールおよび1%ロイシンを含む保存溶液に2% Eudragitを添加した。
【0144】
混合物の乾燥
【0145】
次いで、得られたファージおよび糖、ならびに場合によりアミノ酸の溶液を乾燥させて粉末を形成し、これを圧縮して丸薬またはペレットを形成することができる。
【0146】
溶液を乾燥させるために、噴霧乾燥を使用することができる。
【0147】
粉末を乾燥させるために使用される温度は、70、75、80、85、90、95または100度であ
ってもよい。
ってもよい。
【0148】
ファージの粉末は、ファージの乾燥から生じる。
【0149】
方法によりもたらされるファージ
【0150】
したがって、ファージ／パネル／医薬組成物または動物飼料は、上記の糖、糖アルコー
ル、アミノ酸および／またはポリマーの組合せのいずれかをさらに含んでもよい。
ル、アミノ酸および／またはポリマーの組合せのいずれかをさらに含んでもよい。
【0151】
例えば、ファージ溶液または粉末(乾燥後)は、上記の糖、糖アルコール、アミノ酸および／またはポリマーの組み合わせのいずれかを含み得る。例えば、トレハロース、マンニトールおよびロイシンを含むファージ溶液または粉末である。
【0152】
明細書全体を通して、文脈上別段の要求がない限り、用語「含む（comprise）」もしくは「含む（include）」、または「含む（comprises）」もしくは「含むこと（comprising）」、「含む（includes）」もしくは「含む（including）」のようなバリエーションは
、方法またはキットが記載された整数もしくは整数のグループを含むことを意味すると理解されるが、他の整数もしくは整数のグループを除外するものではない。
、方法またはキットが記載された整数もしくは整数のグループを含むことを意味すると理解されるが、他の整数もしくは整数のグループを除外するものではない。
【0153】
本文中で引用される各文書、参照、特許出願または特許は参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれ、これは読者が本文の一部として読まれ、考慮されるべきであることを意味する。本文中に引用された文書、参考文献、特許出願、または特許は、本文中では単に簡潔さのために繰り返されないことを意味する。本文に含まれる引用された資料または情報への言及は、その資料または情報が一般常識の一部であるか、またはいずれかの国で知られていたという譲歩として理解されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0154】
【図1】図1は、サルモネラSPFMファージが分離された英国のサンプルサイトとその表現型構造を示している。A. 複数のサンプルを、ファージ単離のために英国から入手した。(1) Hampshireのイノシシのいる自然保護区(SPFM1-SPFM3)、(2) Essexの食品加工工場(SPFM4-SPFM11)、(3) Warwick, Warwickshireの養豚場(SPFM12-SPFM15)、(4) Hinckley, Leicestershireの養豚場 (SPFM16-SPFM20)、(5) West Sussexのブタのいる自然保護区(SPFM21-SPFM22)。UK mapは、Crown Copyright and Database Right[2017]の許可を得て作成した。Ordnance Survey (Digimap Licence). B. 22個の単離ファージすべてが透過型電子顕微鏡(TEM)で同定されたマイオウイルスであり、代表的な顕微鏡写真を提示する。黒いバーは100nmを表す。
【図2】図2は、21のサルモネラ SPFMファージの宿主範囲分析およびそれらのプレーティング効率を示す。A.宿主範囲分析が多抗生物質耐性株に対するSPFMファージの溶解プロファイルに基づいた：Typhimurium、15 S. 4,12:i＞、10 S. 4,5,12:i＞、10 S. Bovismorbificans、および10 S. Derbyおよび完全溶解は、それぞれ、橙色、赤色、緑色、青色および紫色のバー(左から右へ)によって示される。すべての株がブタから分離された。濁りの消失は明るいオレンジ色のバー(左側の列)で示され、感染なしは明るい紫色(右側のバー)で示された。B. サルモネラ分離株11株に対するSPFMファージのプレート法の効率および提示されたデータを、主成分分析により分析した。バイオプロットは、5種類のブタ関連サルモネラ血清型からの代表的な分離株2株およびファージの増殖ホストS. Typhimurium SL1344(計11株)でのEOPについて、SPFMファージのEOP（黒丸でラベルされている）について最も分散(合計59.3%の分散)を含む2つの根本となる成分を表している。ファージはそれらのEOPに応じて色分けされ、赤色(左側)のファージはすべての分離株で同じEOPを示し、緑色(右側)のファージは特定の株でEOPが高く、個々の株により近い位置にあるファージである(黒矢印および記載)。宿主域解析(A)およびEOP解析(B)のいずれについても、全菌株について3回の生体情報複製を行い、提示したデータは全3回の平均である。
【図3】SPFMファージの実施例として提示されているのは、ファージSPFM1のゲノムである。内側の黒丸はGC含有量を示し、外円は基づかせるオープンリーディングフレームを示し、スケール単位は塩基対である。それに応じて異なるカテゴリーに属する機能遺伝子を色分けする。赤色は構造タンパク質、緑色はDNA複製と転写に関与する遺伝子、黄色はパッケージング遺伝子、オレンジ色は溶菌遺伝子、ハイライトされた紫色は追加遺伝子、tRNAは青色で表示する(右端の列から2番目)。未標識ORFは、仮想タンパク質を表す。
【図4】アクセサリー遺伝子の有無に基づく階層的クラスター分析から作成した21のサルモネラSPFMファージの樹状図。ジャッカード距離(ファージ間の相違の測定値)を、46のアクセサリー遺伝子の有無データに基づいて計算し、階層的にクラスター化した。単位0は同一の遺伝子の存在を示し、1は最大の変異を示している。
【図5】図5A.本研究の21のSPFMファージを含むNCBIデータベースの158の全ゲノム配列決定サルモネラファージの対平均ヌクレオチドアイデンティティ(ANI)値のヒートマップ。値は0(0%)ANI～1(100% ANI)の範囲であり、それぞれ紫色から緑色および黄色に色分けされ、後者は非常に類似したファージのクラスターを表し、分枝は異なるクラスターを表す。SPFMファージは全てヒートマップ上で一緒にクラスター化し、クラスターは右上に位置する(白い矢印で示す塗りつぶされた黄色のボックス)。
【図6】図6.系統樹は、21のSPFMファージとクラスター内の2つの類似した腸内細菌ファージSEGD1およびSPN3USとの関連性を表す。この系統樹は、塩基配列が決定された23のファージすべてが共有する188のコア遺伝子のコドンアラインメントから得た一塩基多型(SNP)から構築され、系統樹は一定の縮尺で描かれている。
【図7】異なる温度(a)およびpH(b)の範囲でのサルモネラファージの安定性。ファージを異なる温度およびpHで1時間インキュベートし、増殖ホストで滴定した。青色Bで示されるファージSPFM2、紫色Pで示されるSPFM4、赤色Rで示されるSPFM10、緑色Gで示されるSPFM14、橙色Oで示されるSPFM17、および銀Sで示されるSPFM19の安定性(順序を示すためにグラフの上に沿った色参照)示されるデータは3つの生体情報反復からの平均であり、それぞれ3つの技術的反復を伴い、エラーバーは、平均の標準誤差(SEM)を表す。テーブル4も参照。
【図8】MDR S01160-12 Sの低減における1、2、3および4ファージカクテルの異なる組み合わせの有効性。Typhimurium株のin vitro 細菌培養物を、100のMOIで異なるファージカクテル(a～f)に感染させ、細菌数(CFU/ml)を、6時間にわたって1時間毎に測定した。示されたデータは3つの生体的繰り返しからの平均であり、各々は3つの技術的繰り返しを有し、エラーバーはSEMを表す。
【図9】MDR S01160-12 Sに対するファージカクテルの有効性。幼虫感染モデルにおけるTyphimurium株。試験したファージカクテルは、SPFM10-SPFM14を含む2ファージ(赤色の線/バー)；SPFM4-SPFM10-SPFM19を含む3ファージ(青色の線/バー)；および4ファージSPFM2-SPFM10-SPFM14-SPFM19(緑色の線/バー)であった。幼虫を105 CFU/幼虫でサルモネラに感染させ、P-1～P-3(a、cおよびe)に感染する1時間前にファージカクテルで予防的に処理するか、またはファージおよびサルモネラ CoI-1～CoI-3(b、dおよびf)を同時に投与した。(a)(b)は72時間にわたって幼虫の生存を示す。オレンジ色の線はC-1群の非感染、健康な幼虫を示し、灰色の線はC-2群のみにPBSを投与した幼虫を示し、黒色の線はC-6群のサルモネラにのみ感染した幼虫の生存を示す。ボックスプロット(c)と(d)(左から右に、明るい黒、赤、青、緑の順)は異なる幼虫処置群におけるサルモネラ菌数の変化を示し、黒のバーはサルモネラに感染した幼虫のみの菌数を表している。ボックスプロット(e)と(f)(左から右への色順、赤、青、緑)は、予防および同時感染治療に用いたファージカクテルの合計ファージ数を示す。エラーバーはSEMを示し、サルモネラ菌のみに感染しファージで処理した幼虫間の統計的有意差をグラフに表示する(* p ≦ 0.05、** p ≦ 0.01および*** p ≦ 0.001)。
【図10】幼虫感染モデルから分離したサルモネラコロニーに対するファージのプラーク形成効率。幼虫をMDR S01160-12 Sに感染させた。Typhimurium株を用い、2ファージ(SPFM10およびSPFM14)、3ファージ(SPFM4、SPFM10およびSPFM19)または4ファージカクテル(SPFM2、SPFM10、SPFM14およびSPFM19)のいずれかで処置した。72時間後にサルモネラが回収された場合は、コロニーを拾い上げ、各群ファージプラーク形成効率からカクテル中のファージに対して10コロニーを評価した。そして、プラーク形成効率を、野生型株でのファージのプラーク形成効率と比較した。赤色エラーバーは幼虫を2ファージカクテルで処理した後に採取したコロニーを表し、青色エラーバーは3ファージカクテルで、緑色エラーバーは4ファージカクテルで処理した後に採取したコロニーを表す。平均プラーク形成効率は、3つの生体的複製から示され、エラーバーはSEMを表す。
【0155】
ここで、本発明の態様および実施形態を、単なる例として、以下の実験を参照して説明する。
【0156】
本研究で単離した21のサルモネラファージ(SPFMファージと称される)の特徴付けに関するデータを示す。英国の農場における流行から分離された流行中および関連する循環多剤耐性の英国ブタサルモネラ菌株に対してファージ殺傷活性を検査した。プレーティングの効率および宿主範囲を、すべてのSPFMファージについて決定した。また、それらは配列決定され、NCBIデータベースのすべての以前に配列決定されたサルモネラファージと比較して、系統解析により検討し、それらの陽性に選択された遺伝子を同定した。本研究は、英国のブタ関連サルモネラ菌株を標的としたファージの大規模コレクションを完全に特徴付け、配列決定した最初の研究である。
【0157】
実験手順
【0158】
細菌株と増殖条件
【0159】
本研究では合計68株のサルモネラ菌株を用いた。参照株として、Salmonella enterica
（サルモネラ・エンテリカ）亜種、enterica serovar Typhimurium SL1344(受託番号FQ312003)を用いた。残りの67のSalmonella enterica亜種、エンテリカ株は、2012年から2015年の間に英国のブタから英国のWeybridgeのAnimal and Plant health Agency(APHA)によ
りが分離された。これらの株から、血清型は：22 S. Typhimurium; 15 S. 4,12:i＞; 10 S. 4,5,12:i＞; 10 S. Bovismorbificans および10 S. Derbyであった。すべての菌株は
、次の抗生物質の少なくとも1つに耐性があった：ナリジクス酸、テトラサイクリン、ネ
オマイシン、アンピシリン、フラゾリドン、セフタジジム、スルファメトキサゾールトリメトプリム、クロラムフェニコール、アミカシン、アモキシシリン/クラブラン酸、ゲン
タマイシン、ストレプトマイシン、化合物スルホンアミド、セフォタキシム、アプラマイシンとシプロフロキサシン。
（サルモネラ・エンテリカ）亜種、enterica serovar Typhimurium SL1344(受託番号FQ312003)を用いた。残りの67のSalmonella enterica亜種、エンテリカ株は、2012年から2015年の間に英国のブタから英国のWeybridgeのAnimal and Plant health Agency(APHA)によ
りが分離された。これらの株から、血清型は：22 S. Typhimurium; 15 S. 4,12:i＞; 10 S. 4,5,12:i＞; 10 S. Bovismorbificans および10 S. Derbyであった。すべての菌株は
、次の抗生物質の少なくとも1つに耐性があった：ナリジクス酸、テトラサイクリン、ネ
オマイシン、アンピシリン、フラゾリドン、セフタジジム、スルファメトキサゾールトリメトプリム、クロラムフェニコール、アミカシン、アモキシシリン/クラブラン酸、ゲン
タマイシン、ストレプトマイシン、化合物スルホンアミド、セフォタキシム、アプラマイシンとシプロフロキサシン。
【0160】
全てのサルモネラ菌株を、－80℃で50%グリセロールブロス(Abtek Biologicals Ltd., UK)中に保存した。株を、Xylose Lysine Deoxycholate(XLD)寒天(Oxoid, UK)上で、37℃
で18時間慣用的に増殖させた後、NZCYMブロス(Melford Biolaboratories Ltd, UK)中で、37℃、100rpmで18時間継代培養した。
で18時間慣用的に増殖させた後、NZCYMブロス(Melford Biolaboratories Ltd, UK)中で、37℃、100rpmで18時間継代培養した。
【0161】
ファージの単離、精製および増殖（伝搬）
【0162】
すべての試料は、2015年7月から12月まで英国の5つの地理的位置から収集した。ハンプシャー州の自然界のイノシシ保護区から計15試料；エスセックス州の食品加工工場から10試料；ワルウィックシャー州の仕上げ期の養豚場から15試料；子ブタと仕上げ期のブタを飼育しているライエスターシャー州の養豚場から18試料；西サセックス州の野生ブタを飼育している自然保護区から7試料を採取した(図1A)。
【0163】
すべての試料を同じ濃縮手順を用いて処理し、1mlまたは1gの試料を9mlのNZCYMブロス
と混合し、100μlの指数関数的に増殖するサルモネラ培養物を添加した。ファージ単離を最大にするために、同じサンプルをアリコートし、12の異なるMDRサルモネラ宿主株で個
別に濃縮した。濃縮物を振盪しながら(100rpmで)37℃で12時間インキュベートし、その後、試料を4 000x gで15分間、室温で遠心分離した。上清を孔径0.22μmの注射器フィルタ(Millipore, UK)で濾過し、濾過した試料をさらに使用するまで4℃で保存した。ろ液を、
小滴プラークアッセイ方法(Mazzocco et al., 2009)によってファージについてスクリー
ニングした。簡潔には、10μlの濃縮サンプルを、最上層としてNZCYM 0.5%(w/v)寒天を有するLuria-Bertani(LB)1%(w/v)寒天プレート(Fisher Scientific, UK)上にスポットし、
これを、100μlの指数関数的に増殖するサルモネラ培養物と混合した。プレートを37℃で18時間インキュベートし、そしてクリアリングまたはファージプラークの存在のいずれかによってファージ溶解について試験した。
と混合し、100μlの指数関数的に増殖するサルモネラ培養物を添加した。ファージ単離を最大にするために、同じサンプルをアリコートし、12の異なるMDRサルモネラ宿主株で個
別に濃縮した。濃縮物を振盪しながら(100rpmで)37℃で12時間インキュベートし、その後、試料を4 000x gで15分間、室温で遠心分離した。上清を孔径0.22μmの注射器フィルタ(Millipore, UK)で濾過し、濾過した試料をさらに使用するまで4℃で保存した。ろ液を、
小滴プラークアッセイ方法(Mazzocco et al., 2009)によってファージについてスクリー
ニングした。簡潔には、10μlの濃縮サンプルを、最上層としてNZCYM 0.5%(w/v)寒天を有するLuria-Bertani(LB)1%(w/v)寒天プレート(Fisher Scientific, UK)上にスポットし、
これを、100μlの指数関数的に増殖するサルモネラ培養物と混合した。プレートを37℃で18時間インキュベートし、そしてクリアリングまたはファージプラークの存在のいずれかによってファージ溶解について試験した。
【0164】
ファージ精製のために、個々のプラークを1μlループでピックし、500μlのSM緩衝液とゼラチン(100mM NaCl、8mM MgS04.7H2O、50mM Tris-Clおよび0.01%(w/v)ゼラチン)と混合し、21,000×gで10分間遠心分離した。得られた上清を、二重寒天オーバーレイプラーク
アッセイ(Kropinski et al., 2009)によるファージ精製の次のラウンドのために使用し、このプロセスを7回繰り返して、クローンファージストックを作製した。
アッセイ(Kropinski et al., 2009)によるファージ精製の次のラウンドのために使用し、このプロセスを7回繰り返して、クローンファージストックを作製した。
【0165】
精製ファージ溶解物の体積の増加は、107 PFU/mlファージに感染したサルモネラのSL1344(107 CFU/ml)の指数関数的増殖液培養物を、NZCYM培養液中、37℃で、振盪(100rpm)し
ながら6時間混合することによって行った。ファージ培養物を4,200×gで15分間遠心分離
し、上清を孔径0.22μmのフィルタで濾過し、ファージ溶解物を4℃で保存した。ファージ力価を決定するために、ファージ溶解物を10倍連続希釈し、小滴プラークアッセイ方法(Mazzocco et al., 2009)をLB1%寒天プレート上で使用した。最終ファージ力価をPFU/mlと
して表した。
ながら6時間混合することによって行った。ファージ培養物を4,200×gで15分間遠心分離
し、上清を孔径0.22μmのフィルタで濾過し、ファージ溶解物を4℃で保存した。ファージ力価を決定するために、ファージ溶解物を10倍連続希釈し、小滴プラークアッセイ方法(Mazzocco et al., 2009)をLB1%寒天プレート上で使用した。最終ファージ力価をPFU/mlと
して表した。
【0166】
透過電子顕微鏡
【0167】
ファージ溶解物を濃縮した後、透過型電子顕微鏡(TEM)分析を、21,000×gで1時間の遠
心分離により行い、ペレットを0.1M酢酸アンモニウム(Fisher Scientific, UK)で再懸濁
し、21,000×gで1時間遠心分離し、0.1M酢酸アンモニウム溶液で再懸濁した。高濃度ファージ(1011 PFU/ml)を1%酢酸ウラニル(w/v)で10秒間ネガティブ染色し、3mmカーボンコー
ティング銅グリッド(Agar Scientific Ltd, UK)に適用した。ファージはEOL 1220(Joel UK LtD, UK)で試験され、80 kVで流し、そして画像を、解析ソフト(Olympus Soft Imaging
Solutions, Germany)(Ackermann 2009)を用いてSIS Megaview IIIカメラによって取得した。TEM分析は、Dr Ali Ali and Natalie Allcock, Core Biotechnology Services, University of Leicester, UKによって行われた。
心分離により行い、ペレットを0.1M酢酸アンモニウム(Fisher Scientific, UK)で再懸濁
し、21,000×gで1時間遠心分離し、0.1M酢酸アンモニウム溶液で再懸濁した。高濃度ファージ(1011 PFU/ml)を1%酢酸ウラニル(w/v)で10秒間ネガティブ染色し、3mmカーボンコー
ティング銅グリッド(Agar Scientific Ltd, UK)に適用した。ファージはEOL 1220(Joel UK LtD, UK)で試験され、80 kVで流し、そして画像を、解析ソフト(Olympus Soft Imaging
Solutions, Germany)(Ackermann 2009)を用いてSIS Megaview IIIカメラによって取得した。TEM分析は、Dr Ali Ali and Natalie Allcock, Core Biotechnology Services, University of Leicester, UKによって行われた。
【0168】
ファージホストレンジ分析とプレーティングの効率化
【0169】
個々のファージの宿主範囲を、異なるSalmonella enterica亜種血清型に対する小滴プ
ラークアッセイ方法(Mazzocco et al., 2009)によって測定し、37℃で18時間インキュベ
ートした。プレートはクリアリング（クリア化）もしくはプラークを介したバクテリア溶解、または感染がないかのいずれかについて検査し、それぞれ3つの技術的反復試験によ
り3つの生体情報反復試験から平均観察を記録した。
ラークアッセイ方法(Mazzocco et al., 2009)によって測定し、37℃で18時間インキュベ
ートした。プレートはクリアリング（クリア化）もしくはプラークを介したバクテリア溶解、または感染がないかのいずれかについて検査し、それぞれ3つの技術的反復試験によ
り3つの生体情報反復試験から平均観察を記録した。
【0170】
コロニー形成率（EOP）は、5つのサルモネラ血清型からの2つの代表的なMDR株で実施された：S. Typhimurium、S. 4, 12:i＞、S. 4.5, 12:i＞、S. Bovismorbificans、およびS. Derby。EOPはファージ増殖ホストS1344上でも確立された。EOPについては、小滴プラークアッセイ方法を使用し、ファージ溶解物を10倍連続希釈し、バクテリア菌叢上にスポッ
トした(Kutter, 2009)。平均PFU/ml EOP値を、それぞれ3つの技術的反復を用いて3つの生体情報反復から計算した。Rベースパッケージ(R Core Team, 2017)においてprcomp機能を用いてスクリーニングしたすべての株について、すべてのファージのEOP値について主成
分分析を行い、ggplot2パッケージ(Wickham, 2009)からの自動プロット機能を用いてバイプロットとしてプロットした。
トした(Kutter, 2009)。平均PFU/ml EOP値を、それぞれ3つの技術的反復を用いて3つの生体情報反復から計算した。Rベースパッケージ(R Core Team, 2017)においてprcomp機能を用いてスクリーニングしたすべての株について、すべてのファージのEOP値について主成
分分析を行い、ggplot2パッケージ(Wickham, 2009)からの自動プロット機能を用いてバイプロットとしてプロットした。
【0171】
ファージDNAの抽出、配列決定およびアノテーション（注釈付け）
【0172】
高力価ファージライセート(1010 PFU/ml)を使用して、以前に記載された改訂フェノー
ル-クロロホルム-イソアミル法を使用してDNAを抽出した(Nale et al., 2016)。抽出後、最終DNAペレットを5mM Tris HClに溶解し、Qubit二本鎖HSキット(Thermo Scientific, UK)を用いてQubit蛍光光度計を用いて定量し、Illumina MiSeqプラットホームにより配列決定した。NexteraXTライブラリーを、1ngの投入DNAを使用して、製造業者の命令に従って
調製した。SPAdes v3.9.1(Bankevich et al., 2012)とのアセンブリの前に、Sickle v1.33(Joshi and Fass, 2011)で読み取りを切り取った。Prokka v1.11(Seemann 2014)を用い
て、全てのファージタンパク質(Dec,2017)およびhmmscanから構築されたカスタムデータ
ベースを用いて注釈付けを行い、pVOGを同定した(Grazziotin et al., 2017)。ファージ
ゲノムに割り当てられた受入番号をテーブル1に示す。ファージゲノムをヨーロッパヌク
レオチドアーカイブ(ENA)にアップロードする際に誤差があり、ファージ名が間違ってい
た。そうであっても、テーブル1に列挙された受託番号は正しく、ファージ間を区別する
ことを可能にする。ENAは現在問題を解決中であり、正しい名前の正しいファイルはこの
リンクhttp://s3.climb.ac.uk/Sinfo/SPFM_genome.tar.gzで見つけることができる。
ル-クロロホルム-イソアミル法を使用してDNAを抽出した(Nale et al., 2016)。抽出後、最終DNAペレットを5mM Tris HClに溶解し、Qubit二本鎖HSキット(Thermo Scientific, UK)を用いてQubit蛍光光度計を用いて定量し、Illumina MiSeqプラットホームにより配列決定した。NexteraXTライブラリーを、1ngの投入DNAを使用して、製造業者の命令に従って
調製した。SPAdes v3.9.1(Bankevich et al., 2012)とのアセンブリの前に、Sickle v1.33(Joshi and Fass, 2011)で読み取りを切り取った。Prokka v1.11(Seemann 2014)を用い
て、全てのファージタンパク質(Dec,2017)およびhmmscanから構築されたカスタムデータ
ベースを用いて注釈付けを行い、pVOGを同定した(Grazziotin et al., 2017)。ファージ
ゲノムに割り当てられた受入番号をテーブル1に示す。ファージゲノムをヨーロッパヌク
レオチドアーカイブ(ENA)にアップロードする際に誤差があり、ファージ名が間違ってい
た。そうであっても、テーブル1に列挙された受託番号は正しく、ファージ間を区別する
ことを可能にする。ENAは現在問題を解決中であり、正しい名前の正しいファイルはこの
リンクhttp://s3.climb.ac.uk/Sinfo/SPFM_genome.tar.gzで見つけることができる。
【0173】
サルモネラファージゲノム間のANIの算出
【0174】
本研究で新たに配列決定した両ファージからサルモネラ感染ファージ由来の158のゲノ
ムを採取し、先行研究からファージの配列を決定した。(Goris et al., 2007)によって定義される平均ヌクレオチドアイデンティティを、pyaniパッケージ(Pritchard et al., 2016)におけるBLASTN配向オプションを使用してファージゲノムの全ての対の組み合わせの
間で測定し、ヒートマップリー（heatmaply）(Galili et al., 2017)を使用してインタラクティブなヒートマップにプロットした。
ムを採取し、先行研究からファージの配列を決定した。(Goris et al., 2007)によって定義される平均ヌクレオチドアイデンティティを、pyaniパッケージ(Pritchard et al., 2016)におけるBLASTN配向オプションを使用してファージゲノムの全ての対の組み合わせの
間で測定し、ヒートマップリー（heatmaply）(Galili et al., 2017)を使用してインタラクティブなヒートマップにプロットした。
【0175】
タンパク質オルソログ（相同分子種）クラスタリング
【0176】
Prokkaによって注釈付けされたファージタンパク質配列を、1e-5のBLASTP e-value閾値を使用するget_homologs.plスクリプト(Vinuesa and Contreras-Moreira, 2015)に実装されたCOGトライアングルアルゴリズム(Kristensen et al., 2010)を使用して、オルソログ群にクラスター化した。各ファージゲノム間のJaccard距離は、ファージタンパク質配列
のCOGクラスタ化から求めた遺伝子の有無に基づいた。Jaccard距離は塩基R dist機能を使用して計算され、デンドログラムは塩基hclust機能を使用して距離から構築され、デンドログラムはRにおけるggdendroパッケージを使用してプロットされた(VriesおよびRipley
、2016)。Orthologクラスタリングデータは、Thanki AM, Brown N, Millard AD, Clokie MRJ. Genomic Characterization of Jumbo Salmonella Phages That Effectively Target
United Kingdom Pig-Associated Salmonella Serotypes. Front Microbiol. 2019;10:1491に公開されている補足表4に示されている。2019年７月2日公開。doi:10.3389/fmicb.2019.01491。
のCOGクラスタ化から求めた遺伝子の有無に基づいた。Jaccard距離は塩基R dist機能を使用して計算され、デンドログラムは塩基hclust機能を使用して距離から構築され、デンドログラムはRにおけるggdendroパッケージを使用してプロットされた(VriesおよびRipley
、2016)。Orthologクラスタリングデータは、Thanki AM, Brown N, Millard AD, Clokie MRJ. Genomic Characterization of Jumbo Salmonella Phages That Effectively Target
United Kingdom Pig-Associated Salmonella Serotypes. Front Microbiol. 2019;10:1491に公開されている補足表4に示されている。2019年７月2日公開。doi:10.3389/fmicb.2019.01491。
【0177】
コア遺伝子に基づいた系統発生樹の仮定
【0178】
Seoulvirus（ソウルウイルス）属ファージゲノム由来のタンパク質配列を含むCOGを用
いて、MUSCLE v3.8.31 (Edgar, NAR 32(5))およびpal2nal.pl script (Suyama et al., 2006)を有する対応する核酸配列のコドン認識配向を構築した。コドン認識ヌクレオチドアラインメントからのSNPをsnp部位で抽出し(Page et al., 2016)、ヌクレオチド進化を一
般化した時間可逆モデルによるFastTree v.2.1.10 SSE3(Price et al., 2010)を用いて、系統樹を構築するために使用した。
いて、MUSCLE v3.8.31 (Edgar, NAR 32(5))およびpal2nal.pl script (Suyama et al., 2006)を有する対応する核酸配列のコドン認識配向を構築した。コドン認識ヌクレオチドアラインメントからのSNPをsnp部位で抽出し(Page et al., 2016)、ヌクレオチド進化を一
般化した時間可逆モデルによるFastTree v.2.1.10 SSE3(Price et al., 2010)を用いて、系統樹を構築するために使用した。
【0179】
ポジティブセレクションの測定
【0180】
ポジティブセレクションについての試験を、HyPhyパッケージ(Pondら、2005)を使用し
て、各オルソログクラスターの各コドンで行った。特に、MUSCLE v3.8.31からの各オルソログクラスターのタンパク質アラインメントを用いて、各クラスターからの核酸配列のコドン認識アラインメントの構築を導いた。HyPhyパッケージに実装されたGARDアルゴリズ
ム(Pond et al., 2006)を用いて、各コドン認識配向における組換えブレークポイントを
検出し、分割配向およびツリーを各ブレークポイントの両側に構築した。これらのパーティションを、各部位がポジティブセレクション下にある事後確率(すなわち、dN/dSが1よ
り大きい)を返すHyPhyパッケージに実装されたBayesian FUBARアルゴリズム(Murrell et al., 2013)を用いて、各部位でのポジティブセレクションについて試験した。サンプルサイズが小さすぎて、個々のコドンにおけるdN/dSの正確な推定を可能にしないので、事後
確率値は、dN/dS値と共に与えられる。仮説検定はポジティブセレクションを検出するの
に十分な感度を有し、PSRF/ N有効比は0.006未満に維持され、その結果、ポジティブセレクションの事後確率はソリューションに収束した。
て、各オルソログクラスターの各コドンで行った。特に、MUSCLE v3.8.31からの各オルソログクラスターのタンパク質アラインメントを用いて、各クラスターからの核酸配列のコドン認識アラインメントの構築を導いた。HyPhyパッケージに実装されたGARDアルゴリズ
ム(Pond et al., 2006)を用いて、各コドン認識配向における組換えブレークポイントを
検出し、分割配向およびツリーを各ブレークポイントの両側に構築した。これらのパーティションを、各部位がポジティブセレクション下にある事後確率(すなわち、dN/dSが1よ
り大きい)を返すHyPhyパッケージに実装されたBayesian FUBARアルゴリズム(Murrell et al., 2013)を用いて、各部位でのポジティブセレクションについて試験した。サンプルサイズが小さすぎて、個々のコドンにおけるdN/dSの正確な推定を可能にしないので、事後
確率値は、dN/dS値と共に与えられる。仮説検定はポジティブセレクションを検出するの
に十分な感度を有し、PSRF/ N有効比は0.006未満に維持され、その結果、ポジティブセレクションの事後確率はソリューションに収束した。
【0181】
結果
【0182】
いくつかのin vitroおよびin vivo試験では、ファージは食品環境およびブタにおいて
サルモネラ菌種数を有意に低下させることができ、したがって食の安全性を向上させるためにブタのサルモネラ菌種.を低下させるための実行可能な選択肢を提供できることが示
されている。しかし、現在までに発表されている検討のすべてが、感染能および配列決定の観点から、そのファージの特徴を完全に明らかにしているわけではない。塩基配列決定法はファージが絶対的に溶菌性であること、毒素遺伝子をもたないこと、ホストからの抗生物質耐性遺伝子の拡散を促進することが知られている特定のファージ属(Felixo1virus
属など)に属していないこと、ファージ療法カクテルを合理的に最適化するのに役立つこ
となどから、療法に用いられるファージに有用である。本発明者らは、ブタに一般的に関連するサルモネラ菌種を再び標的とする環境源から単離された21の新しい溶解ジャンボSPFMサルモネラファージを特徴付けた。すべてのSPFMファージはブタから分離された臨床的に重要な英国のMDR サルモネラ株に対して広宿主域と高いEOPを有しており、ファージ療
法に利用でき、食品安全性の向上に役立つ可能性がある。
サルモネラ菌種数を有意に低下させることができ、したがって食の安全性を向上させるためにブタのサルモネラ菌種.を低下させるための実行可能な選択肢を提供できることが示
されている。しかし、現在までに発表されている検討のすべてが、感染能および配列決定の観点から、そのファージの特徴を完全に明らかにしているわけではない。塩基配列決定法はファージが絶対的に溶菌性であること、毒素遺伝子をもたないこと、ホストからの抗生物質耐性遺伝子の拡散を促進することが知られている特定のファージ属(Felixo1virus
属など)に属していないこと、ファージ療法カクテルを合理的に最適化するのに役立つこ
となどから、療法に用いられるファージに有用である。本発明者らは、ブタに一般的に関連するサルモネラ菌種を再び標的とする環境源から単離された21の新しい溶解ジャンボSPFMサルモネラファージを特徴付けた。すべてのSPFMファージはブタから分離された臨床的に重要な英国のMDR サルモネラ株に対して広宿主域と高いEOPを有しており、ファージ療
法に利用でき、食品安全性の向上に役立つ可能性がある。
【0183】
ファージの単離、プラークの形態と増殖
【0184】
ファージ単離のための試料を、2015年7月から12月の間に、イギリスの野生および家畜
のブタおよびイノシシから、食品加工工場から収集した。65個のサンプルをスクリーニングし、21個のファージを単離し、これをSPFM1～SPFM22と命名した。ファージSPFM18は、
ゲノム配列が不完全であったため、分析から除外した。15SPFMファージは5つの異なるSalmonella enterica血清型Typhimurium株で分離され、残りの7つはSalmonella enterica血
清型4,12:i＞株で分離された。3個のファージはイノシシの糞便、8個は食品加工工場、10個はWarwickshire、HinckleyおよびWest Sussexの農場から入手した仕上げ期のブタおよ
び子ブタの糞便に由来していた(図1Aおよびテーブル1)。
のブタおよびイノシシから、食品加工工場から収集した。65個のサンプルをスクリーニングし、21個のファージを単離し、これをSPFM1～SPFM22と命名した。ファージSPFM18は、
ゲノム配列が不完全であったため、分析から除外した。15SPFMファージは5つの異なるSalmonella enterica血清型Typhimurium株で分離され、残りの7つはSalmonella enterica血
清型4,12:i＞株で分離された。3個のファージはイノシシの糞便、8個は食品加工工場、10個はWarwickshire、HinckleyおよびWest Sussexの農場から入手した仕上げ期のブタおよ
び子ブタの糞便に由来していた(図1Aおよびテーブル1)。
【0185】
プラーク形態に関しては、S. Typhimurium株上でファージSPFM9、SPFM10およびSPFM11
が分離され、直径約1mmの明瞭なプラークを産生し、残りの18ファージは直径約0.5mmの明瞭なプラークを産生した。すべてのファージをS. Typhimurium SL1344上で増殖させて、
高力価(1010プラーク形成単位(PFU)/ml)ストックを作製した。これに対する主な動機は、元々の分離株がプロファージを自然放出することであり、これは下流側の特性評価を複雑にしているが、SL1344からのプロファージ放出は観察されなかった。
が分離され、直径約1mmの明瞭なプラークを産生し、残りの18ファージは直径約0.5mmの明瞭なプラークを産生した。すべてのファージをS. Typhimurium SL1344上で増殖させて、
高力価(1010プラーク形成単位(PFU)/ml)ストックを作製した。これに対する主な動機は、元々の分離株がプロファージを自然放出することであり、これは下流側の特性評価を複雑にしているが、SL1344からのプロファージ放出は観察されなかった。
【0186】
【表3】
b すべてのゲノム配列は、http://s3.climb.ac.uk/Sinfo/SPFM_genome.tar.gz.から入手
できる。
【0187】
ファージモルフォロジー
【0188】
TEM解析の結果、21のファージは等角頭部と収縮性尾部を有しており、そのためカウド
ウイルス科内のマイオウイルスファミリーのメンバーとして分類された(図1B)。ファージSPFM1、SPFM2、SPFM6、SPFM7、SPFM10、SPFM12、SPFM14、SPFM15、SPFM16、SPFM17、SPFM20およびSPFM22は、160±20nmのテール長および100±15nmのキャプシド直径を有する。ファージSPFM3、SPFM4、SPFM5、SPFM8、SPFM9、SPFM11、SPFM19およびSPFM21は、200±20nmのテール長および105±15nmのキャプシド直径を有する。ファージSPFM13は140±10nmで最も長いテールを有し、135±7nmのキャプシド直径を有した。
ウイルス科内のマイオウイルスファミリーのメンバーとして分類された(図1B)。ファージSPFM1、SPFM2、SPFM6、SPFM7、SPFM10、SPFM12、SPFM14、SPFM15、SPFM16、SPFM17、SPFM20およびSPFM22は、160±20nmのテール長および100±15nmのキャプシド直径を有する。ファージSPFM3、SPFM4、SPFM5、SPFM8、SPFM9、SPFM11、SPFM19およびSPFM21は、200±20nmのテール長および105±15nmのキャプシド直径を有する。ファージSPFM13は140±10nmで最も長いテールを有し、135±7nmのキャプシド直径を有した。
【0189】
宿主範囲分析
【0190】
SPFMファージの有効性をブタから分離された67のMDR Salmonella enterica亜種enterica株について試験した。67株はすべて、英国のブタ関連サルモネラ血清型上位5種、すなわちS. Typhimurium、S. 4, 12:i＞、S. 4.5, 12:i＞、S. Bovismorbificans、およびS. Derbyの代表株である。すべてのファージは広い溶菌スペクトルをもち、それぞれ80%以上の株が溶菌する(図2A)。ファージSPFM1、SPFM3、SPFM10、SPFM14、SPFM15、SPFM17およびSPFM19は、スクリーニングされたサルモネラ菌株の100%を溶解することができた。ファージSPFM2、SPFM7、SPFM21およびSPFM22は、67/68の株(99%)を溶解した。対照的に、SPFM9お
よびSPFM11はそれぞれ84%および81%の株のみを溶解し、バクテリアを溶解する場合でも、少なくとも1株では溶解が混濁していた。
よびSPFM11はそれぞれ84%および81%の株のみを溶解し、バクテリアを溶解する場合でも、少なくとも1株では溶解が混濁していた。
【0191】
プレーティングの効率(EOP)
【0192】
ファージ感染が臨床的に重要な株にどの程度効率的であるかを明らかにするため、そして最終的にどのファージがファージカクテルを構成すべきかを決定するために、SPFMファージのEOPをサルモネラ血清型S. Typhimurium、S. 4, 12:i＞、S. 4.5, 12:i＞S. Bovismorbificans、およびS. Derby由来の2つの代表的なMDRブタ株について実施した。その増殖ホストであるS. Typhimurium SL1344のファージのEOPを対照として含めた。EOPデータセ
ット内のパターンを同定するために、主成分分析(PCA)を用いたところ、ファージは2つの異なるグループにクラスターを形成することが明らかになった(図2B)；(i)すべての株でEOPが類似しているファージ、(ii)特定のサルモネラ菌株および血清型でEOPがより高いフ
ァージである。ファージSPFM4、SPFM5、SPFM8、SPFM9、SPFM12、SPFM13、SPFM14、SPFM15、SPFM16、SPFM17およびSPFM20は群(i)を形成し、それらのEOPは、5つの血清型すべての
間で有意に異ならず、T試験によって確認された。残りの10個のファージは群(ii)を形成
した。グループ(ii)を拡大すると、S. Bovismorbificans分離株AではファージSPFM10のEOPが高く、S. Bovismorbificans全株ではファージSPFM1、SPFM11およびSPFM12が高かった
。ファージSPFM19およびSPFM21は、S.4,12:i＞株の双方でEOPが高く、S. Derby分離株BではSPFM3、S. 4,5,12:i＞分離株AではSPFM22、S. Derby分離株AではSPFM6およびSPFM7の両方でEOPが高かった。
ット内のパターンを同定するために、主成分分析(PCA)を用いたところ、ファージは2つの異なるグループにクラスターを形成することが明らかになった(図2B)；(i)すべての株でEOPが類似しているファージ、(ii)特定のサルモネラ菌株および血清型でEOPがより高いフ
ァージである。ファージSPFM4、SPFM5、SPFM8、SPFM9、SPFM12、SPFM13、SPFM14、SPFM15、SPFM16、SPFM17およびSPFM20は群(i)を形成し、それらのEOPは、5つの血清型すべての
間で有意に異ならず、T試験によって確認された。残りの10個のファージは群(ii)を形成
した。グループ(ii)を拡大すると、S. Bovismorbificans分離株AではファージSPFM10のEOPが高く、S. Bovismorbificans全株ではファージSPFM1、SPFM11およびSPFM12が高かった
。ファージSPFM19およびSPFM21は、S.4,12:i＞株の双方でEOPが高く、S. Derby分離株BではSPFM3、S. 4,5,12:i＞分離株AではSPFM22、S. Derby分離株AではSPFM6およびSPFM7の両方でEOPが高かった。
【0193】
SPFMファージのゲノム特性評価
【0194】
SPFMファージセットは、Illumina MiSeqプラットホームを用いて配列決定した。21ファージはすべて、233Kb～242Kbの範囲の線状、環状に置換されたdsDNAゲノムを有し、258～307コード配列(CDS)をコードする(テーブル1)。すべてのゲノムは200Kbより大きいので、ジャンボファージに分類され、既知の溶原性関連遺伝子がないことから、すべて溶菌性で
あると予測される。
あると予測される。
【0195】
SPFMゲノムサイズの変異にもかかわらず、それらはすべて1つのtRNAをコードし、平均GC含有量は48.5%(テーブル1)、平均遺伝子長は0.860±0.010Kb、遺伝子密度は1.074/Kbを
有し、遺伝子コード領域はゲノムの93%を構成する。ファージは構造も含有量も遺伝的に
類似しているので、SPFM1の代表的なゲノムマップを図3に示す。予測される遺伝子の大部分は機能がわかっていないタンパク質をコードしており、推定される役割は遺伝子の約30%にしか割り当てることができなかった。他のファージとの相同性によって認識可能な遺
伝子には、主要なキャプシドタンパク質、尾部繊維タンパク質および尾部被覆タンパク質などの構造タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。パッケージングタンパク質ターミナーゼにコードされる遺伝子も同定され、ファージエンドリシンも同定された。DNA複製
および転写に関与する産物をコードするいくつかの遺伝子、例えば、エンドデオキシリボヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、推定ヌクレアーゼSbcCD Dサブユニット、推定リボヌクレア
ーゼHおよび6つのRNAPベータ(β/β')マルチサブユニットを同定することができた。RNAP多層サブユニットをコードする遺伝子の長さは0.240から4.206Kbまで様々であり、6つの
サブユニットすべてがサルモネラSPN3US(受入番号：JN641803.1)、ErwiniaファージvB(受入番号：KX397364.1)およびCronobacterファージCR5(受入番号：JX094500)(Lee et al,. 2016)に対してそれぞれ99%、80%および55%の平均ヌクレオチドアイデンティティ(ANI)を
有していた。
有し、遺伝子コード領域はゲノムの93%を構成する。ファージは構造も含有量も遺伝的に
類似しているので、SPFM1の代表的なゲノムマップを図3に示す。予測される遺伝子の大部分は機能がわかっていないタンパク質をコードしており、推定される役割は遺伝子の約30%にしか割り当てることができなかった。他のファージとの相同性によって認識可能な遺
伝子には、主要なキャプシドタンパク質、尾部繊維タンパク質および尾部被覆タンパク質などの構造タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。パッケージングタンパク質ターミナーゼにコードされる遺伝子も同定され、ファージエンドリシンも同定された。DNA複製
および転写に関与する産物をコードするいくつかの遺伝子、例えば、エンドデオキシリボヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、推定ヌクレアーゼSbcCD Dサブユニット、推定リボヌクレア
ーゼHおよび6つのRNAPベータ(β/β')マルチサブユニットを同定することができた。RNAP多層サブユニットをコードする遺伝子の長さは0.240から4.206Kbまで様々であり、6つの
サブユニットすべてがサルモネラSPN3US(受入番号：JN641803.1)、ErwiniaファージvB(受入番号：KX397364.1)およびCronobacterファージCR5(受入番号：JX094500)(Lee et al,. 2016)に対してそれぞれ99%、80%および55%の平均ヌクレオチドアイデンティティ(ANI)を
有していた。
【0196】
他の遺伝子はすべてのSPFMファージゲノムで同定され、感染中のそれらの細菌宿主への依存性を軽減できる可能性があった。特に関心遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、チミジル酸シンターゼおよびチミジル酸キナーゼを含み、これらはすべて、ファージ感染中のホスト代謝の増強に関与する葉酸合成およびラジカルS‐アデノシルメチオニン(SAM)遺伝子に使用されると予測されている(Lee et al,. 2011)。さらに、宿主の制限修飾系に対して防御を提供しうるDNAアデニンメチラーゼ遺伝子がSPFMファージで同定された。
【0197】
単離されたSPFMファージの階層的クラスター分析
【0198】
ヌクレオチドBLASTとのペアワイズ局所配向(NCBI, 1988)を用いてゲノムを比較したと
ころ、すべてのSPFMファージは遺伝的に約95%のANIで互いに非常に類似していることが観察された。ゲノム内の変異についての洞察を得るために、46の共有アクセサリー遺伝子の有無に基づいて系統樹を構築した(図4)。階層クラスター分析は、ファージSPFM5、SPFM15、SPFM17、SPFM19、SPFM21が互いに最も類似していることを同定した。ファージSPFM2、SPFM6、SPFM9、SPFM12およびSPFM14は第2のグループを形成し、同じアクセサリー遺伝子およびコア遺伝子を共有した。残りの11個のファージはアクセサリー遺伝子間の変異を示し、最も差が大きかったのはファージSPFM1、SPFM13、SPFM16およびSPFM20間であった。こ
れらのファージはすべて、他のSPFMファージと比較してゲノムサイズにも差があった(テ
ーブル1)。
ころ、すべてのSPFMファージは遺伝的に約95%のANIで互いに非常に類似していることが観察された。ゲノム内の変異についての洞察を得るために、46の共有アクセサリー遺伝子の有無に基づいて系統樹を構築した(図4)。階層クラスター分析は、ファージSPFM5、SPFM15、SPFM17、SPFM19、SPFM21が互いに最も類似していることを同定した。ファージSPFM2、SPFM6、SPFM9、SPFM12およびSPFM14は第2のグループを形成し、同じアクセサリー遺伝子およびコア遺伝子を共有した。残りの11個のファージはアクセサリー遺伝子間の変異を示し、最も差が大きかったのはファージSPFM1、SPFM13、SPFM16およびSPFM20間であった。こ
れらのファージはすべて、他のSPFMファージと比較してゲノムサイズにも差があった(テ
ーブル1)。
【0199】
SPFMファージと以前に配列決定されたサルモネラファージとの比較
【0200】
SPFMファージが、(2017年12月まで)Genbankに寄託された以前に配列決定されたサルモ
ネラファージとどの程度類似しているかを明らかにするため、完全に配列決定された158
のサルモネラファージゲノムに対する全対全比較解析を実施した(図5)。分析に用いたす
べてのサルモネラファージのゲノムサイズは～33～240Kbであり、分析に用いたすべての
ファージを表Bに示す。クラスター分析は21の別個の群を同定し、ここで、クラスターは
、クラスターの他のメンバーとそれらのANIの>50%を共有するファージとして定義される
。21のSPFMファージはすべて、異なる研究で分離されたファージSPN3US(受入番号：JN641803.1)(Lee et al,. 2011)およびSEGD1（受入番号：KU726251.1）とともに1つのクラスタ
ーにグループ化される。ファージSPN3USとSEGD1も約240Kbのゲノムを有し、すべてのSPFMファージと約95～97%のANIをもつ。ファージSPN3USおよびSEGD1はSPN3USウイルス属(Adriaenssens et al,. 2017)の一部であり、これは現在Seoulvirus属に更新されている。これは、95%を超えるANIの現在の標準に基づいており、SPFMファージもこの属に入る。Seoulvirus属クラスター内のファージは、phiKZ様ファージとして分類される。phiKZ様ファージのはっきりとした特徴は、すべて2つの複数サブユニットからなるRNAポリメラーゼをもっていることである。最初のマルチサブユニットは、ファージ転写プログラムの初期遺伝子を転写する「ビリオン」RNAPと、後期遺伝子の転写に関与するゲノムの2番目の「非ビリ
オン」RNAPとしてキャプシドにパッケージされています。
ネラファージとどの程度類似しているかを明らかにするため、完全に配列決定された158
のサルモネラファージゲノムに対する全対全比較解析を実施した(図5)。分析に用いたす
べてのサルモネラファージのゲノムサイズは～33～240Kbであり、分析に用いたすべての
ファージを表Bに示す。クラスター分析は21の別個の群を同定し、ここで、クラスターは
、クラスターの他のメンバーとそれらのANIの>50%を共有するファージとして定義される
。21のSPFMファージはすべて、異なる研究で分離されたファージSPN3US(受入番号：JN641803.1)(Lee et al,. 2011)およびSEGD1（受入番号：KU726251.1）とともに1つのクラスタ
ーにグループ化される。ファージSPN3USとSEGD1も約240Kbのゲノムを有し、すべてのSPFMファージと約95～97%のANIをもつ。ファージSPN3USおよびSEGD1はSPN3USウイルス属(Adriaenssens et al,. 2017)の一部であり、これは現在Seoulvirus属に更新されている。これは、95%を超えるANIの現在の標準に基づいており、SPFMファージもこの属に入る。Seoulvirus属クラスター内のファージは、phiKZ様ファージとして分類される。phiKZ様ファージのはっきりとした特徴は、すべて2つの複数サブユニットからなるRNAポリメラーゼをもっていることである。最初のマルチサブユニットは、ファージ転写プログラムの初期遺伝子を転写する「ビリオン」RNAPと、後期遺伝子の転写に関与するゲノムの2番目の「非ビリ
オン」RNAPとしてキャプシドにパッケージされています。
【0201】
Seoulvirus属ファージクラスター
【0202】
SPFMファージがサルモネラファージSPN3USおよびSEGD1とどの程度密接な関係している
かを調べるために、共有されている188のコア遺伝子内の一塩基多型(SNP)に基づく系統解析を構築した(図6)(Thanki AM, Brown N, Millard AD, Clokie MRJ. Genomic Characterization of Jumbo Salmonella Phages That Effectively Target United Kingdom Pig-Associated Salmonella Serotypes. Front Microbiol. 2019;10:1491。2019年7月2日発行。doi:10.3389/fmicb.2019.01491で公開された補足表3に記載されているデータ)。これによ
り、ファージSPFM5、SPFM9、SPFM10、SPFM11は、同じSNPを共有していることが明らかに
なった。コア遺伝子のSNPによるこのファージのクラスタリングは、アクセサリー遺伝子
の有無に基づく階層的クラスター解析とは異なる。他のファージは(SPFM1を除いて)まと
まっており、それらのコア遺伝子にはほとんど、あるいはまったく変異がなかった。SPFM1コア遺伝子のSNPは、他の20のSPFMファージとは別のクレードとしてこのファージをグループ分けした。ファージSPN3USおよびSEGD1は、SPFMファージとは異なるより緊密なサブ
クレードを形成した(図4)。
かを調べるために、共有されている188のコア遺伝子内の一塩基多型(SNP)に基づく系統解析を構築した(図6)(Thanki AM, Brown N, Millard AD, Clokie MRJ. Genomic Characterization of Jumbo Salmonella Phages That Effectively Target United Kingdom Pig-Associated Salmonella Serotypes. Front Microbiol. 2019;10:1491。2019年7月2日発行。doi:10.3389/fmicb.2019.01491で公開された補足表3に記載されているデータ)。これによ
り、ファージSPFM5、SPFM9、SPFM10、SPFM11は、同じSNPを共有していることが明らかに
なった。コア遺伝子のSNPによるこのファージのクラスタリングは、アクセサリー遺伝子
の有無に基づく階層的クラスター解析とは異なる。他のファージは(SPFM1を除いて)まと
まっており、それらのコア遺伝子にはほとんど、あるいはまったく変異がなかった。SPFM1コア遺伝子のSNPは、他の20のSPFMファージとは別のクレードとしてこのファージをグループ分けした。ファージSPN3USおよびSEGD1は、SPFMファージとは異なるより緊密なサブ
クレードを形成した(図4)。
【0203】
ポジティブセレクションを受けているファージ遺伝子
【0204】
どの遺伝子が進化的選択圧下にあるかを決定するために、ポジティブセレクション下にある遺伝子をSeoulvirus属クラスター内で同定した。これは、21個のSPFMファージ、SPN3USおよびSEGD1のコアオルソログの対比較の非同義置換率(dN/dS)に対する同義置換率(dN/dS)の比率を測定することによって行われた(Thanki AM, Brown N, Millard AD, Clokie MRJ. Genomic Characterization of Jumbo Salmonella Phages That Effectively Target United Kingdom Pig-Associated Salmonella Serotypes. Front Microbiol. 2019;10:1491。2019年7月2日発行。doi:10.3389/fmicb.2019.01491に掲載された補足表5）テーブル2
に示したデータは、ポジティブセレクションを受けている予測遺伝子とそのオルソログクラスター数について、＞0.900を超える事後確率値を示している。解析の結果、33の遺伝
子がポジティブセレクションを受けていることが予測された。これらの遺伝子のうち22遺伝子は推定ビリオン構造蛋白質であり、1つは推定エンドデオキシリボヌクレアーゼRusA
、2つはチミジル酸シンターゼをコードし、8つは仮想蛋白質である。ポジティブセレクション下の推定ビリオン構造タンパク質について、HHpred(Zimmermann et al., 2017)を使
用して、構造タンパク質がファージ尾部（ファージテール）またはキャプシドアセンブリに関与するかどうかを決定した。このプログラムでは、75%以上の確率で、これらが推定
上のベースプレートウェッジタンパク質であり、したがってファージ尾部の集合に関与している可能性が高いと予測された。さらに、オーソログクラスター数201(補足表5のオー
ソログクラスター数に関連する)は、ファージ尾部ファイバー形成の一部でもあるC-末端
ペクチン酸リアーゼドメインに対して98.26%の確率のヒットを有した。ポジティブセレクションを受けているすべての遺伝子が機能をアサインされているわけではないが、オルソログクラスター番号106、108、129、130および211を有する以下の仮定上のタンパク質は
ゲノム上の他の推定上の構造タンパク質に近い位置にあるため、推定上のビリオン構造タ
ンパク質である可能性があると予測し得る。同様に、オルソログクラスター数92をもつ仮定上のタンパク質は、DNA複製および転写遺伝子がクラスターを形成している位置に近く
、この機能に関与している可能性が高い。
に示したデータは、ポジティブセレクションを受けている予測遺伝子とそのオルソログクラスター数について、＞0.900を超える事後確率値を示している。解析の結果、33の遺伝
子がポジティブセレクションを受けていることが予測された。これらの遺伝子のうち22遺伝子は推定ビリオン構造蛋白質であり、1つは推定エンドデオキシリボヌクレアーゼRusA
、2つはチミジル酸シンターゼをコードし、8つは仮想蛋白質である。ポジティブセレクション下の推定ビリオン構造タンパク質について、HHpred(Zimmermann et al., 2017)を使
用して、構造タンパク質がファージ尾部（ファージテール）またはキャプシドアセンブリに関与するかどうかを決定した。このプログラムでは、75%以上の確率で、これらが推定
上のベースプレートウェッジタンパク質であり、したがってファージ尾部の集合に関与している可能性が高いと予測された。さらに、オーソログクラスター数201(補足表5のオー
ソログクラスター数に関連する)は、ファージ尾部ファイバー形成の一部でもあるC-末端
ペクチン酸リアーゼドメインに対して98.26%の確率のヒットを有した。ポジティブセレクションを受けているすべての遺伝子が機能をアサインされているわけではないが、オルソログクラスター番号106、108、129、130および211を有する以下の仮定上のタンパク質は
ゲノム上の他の推定上の構造タンパク質に近い位置にあるため、推定上のビリオン構造タ
ンパク質である可能性があると予測し得る。同様に、オルソログクラスター数92をもつ仮定上のタンパク質は、DNA複製および転写遺伝子がクラスターを形成している位置に近く
、この機能に関与している可能性が高い。
【0205】
【表4】
、75%以上の確率で注釈を提示した。
b試料の大きさは個々のコドンにおけるdN/dSの正確な推定を可能にするには小さすぎるが、仮説検定(事後確率)はポジティブセレクションを検出するのに十分な感度である。
【0206】
本発明者らは、21の新しいサルモネラファージを特徴付けた。すべてのファージは、ブタから分離された代表的なMDR株に感染する可能性があった。検査したサルモネラ分離株
の100%に感染可能な7種類の毒性ファージが同定された。これらのファージの高い感染能
の説明として考えられるのは、ファージがS. Typhimuriumに感染することにつれて、遺伝的に近縁であるその単相変形例にも感染可能であることである(Moreno et al., 2013)。
これらの血清型由来株に付着するのに、ファージは同じバクテリアレセプターを利用している可能性が高い。これらの7つのファージは、それらの宿主範囲およびプレーティング
の効率に基づいて、治療用途に理想的であるように思われる。
の100%に感染可能な7種類の毒性ファージが同定された。これらのファージの高い感染能
の説明として考えられるのは、ファージがS. Typhimuriumに感染することにつれて、遺伝的に近縁であるその単相変形例にも感染可能であることである(Moreno et al., 2013)。
これらの血清型由来株に付着するのに、ファージは同じバクテリアレセプターを利用している可能性が高い。これらの7つのファージは、それらの宿主範囲およびプレーティング
の効率に基づいて、治療用途に理想的であるように思われる。
【0207】
2つのファージSPFM9とSPFM11は、スクリーニングした株の約80%しか感染できなかった
。さらに、両方のファージは、菌株の5分の1で濁りクリアリングを生成し、これは、濁りクリアリングが溶原性ファージの特徴であることが多いため、潜在的な溶原性を示している可能性がある(Gallet et al., 2011)。配列分析により、両方のファージに既知の溶原
性モジュールがなく、溶解性ファージである可能性が高いことが確認されたが、遺伝子の約30％のみが既知の機能に割り当てられているため、未知の溶原性モジュールが存在する可能性がある。なぜ濁りクリアリングが観察されたかについての可能な説明は、スクリーニングされた細菌株がファージに対して部分的に耐性であったかもしれないので、細胞の亜集団のみが感染され、これは濁りクリアリングをもたらしたことであり得る(Bull et al., 2014)。別の説明はファージがこれらの株内にプロファージを誘導することであり、
それが濁りクリアリングをもたらした可能性がある(Campoy et al., 2006)。濁りクリア
リングは観察されたが、SPFM9およびSPFM11は溶菌感染を示すEOP分析のスクリーニングを行った11株に感染し、複製することができた。潜在的に不完全な溶解およびプロファージの耐性または誘導の問題のために、ファージSPFM9およびSPFM11は療法のための良好な候
補ではない(Chan et al., 2013; Abedon et al., 2017)。
。さらに、両方のファージは、菌株の5分の1で濁りクリアリングを生成し、これは、濁りクリアリングが溶原性ファージの特徴であることが多いため、潜在的な溶原性を示している可能性がある(Gallet et al., 2011)。配列分析により、両方のファージに既知の溶原
性モジュールがなく、溶解性ファージである可能性が高いことが確認されたが、遺伝子の約30％のみが既知の機能に割り当てられているため、未知の溶原性モジュールが存在する可能性がある。なぜ濁りクリアリングが観察されたかについての可能な説明は、スクリーニングされた細菌株がファージに対して部分的に耐性であったかもしれないので、細胞の亜集団のみが感染され、これは濁りクリアリングをもたらしたことであり得る(Bull et al., 2014)。別の説明はファージがこれらの株内にプロファージを誘導することであり、
それが濁りクリアリングをもたらした可能性がある(Campoy et al., 2006)。濁りクリア
リングは観察されたが、SPFM9およびSPFM11は溶菌感染を示すEOP分析のスクリーニングを行った11株に感染し、複製することができた。潜在的に不完全な溶解およびプロファージの耐性または誘導の問題のために、ファージSPFM9およびSPFM11は療法のための良好な候
補ではない(Chan et al., 2013; Abedon et al., 2017)。
【0208】
SPFMファージをさらに特徴づけ、治療的に使用するための理想的な形質を有するものを絞り込むために、EOP分析が行われた(Mirzaei and Nilsson, 2015)。データから、5種類
の異なる血清型から全ての代表的な株間でEOPに差がないファージ群が明らかになり、菌
株間で感染能に差がないことから、これらのファージは治療適用の理想的な候補であると思われる。特に、ファージSPFM14、SPFM15およびSPFM17は優勢な英国サルモネラ血清型由来のすべての代表株に感染可能であり、スクリーニングした株でEOPが高かったことから
、良好な候補であると考えられる。
の異なる血清型から全ての代表的な株間でEOPに差がないファージ群が明らかになり、菌
株間で感染能に差がないことから、これらのファージは治療適用の理想的な候補であると思われる。特に、ファージSPFM14、SPFM15およびSPFM17は優勢な英国サルモネラ血清型由来のすべての代表株に感染可能であり、スクリーニングした株でEOPが高かったことから
、良好な候補であると考えられる。
【0209】
全ての単離されたSPFMファージは233Kbを超えるゲノムを有し、NCBI(YuanおよびGao、2017)で入手可能な～170個のジャンボファージゲノムに数および多様性を有意に付加する
。SPFMファージのゲノムも、162,910bpのゲノムサイズを有するmyovirus vB_SalM_SJ_ (Wall et al., 2010; Zhang et al., 2010; Saez et al., 2011; Zhang et al., 2014)および48,110bpのゲノムサイズを有するpodovirus UAB_78(Bardina et al., 2016)などの他のサルモネラファージと比較してサイズが大きかった。Jumboファージは単離するのがまれ
であり、より小さいゲノムサイズのファージに偏り得る従来の方法によって頻繁に単離されない(Hillyard et al., 2016; Saad et al., 2018; Salmond および Fineran, 2015; Serwer et al., 2009)。しかしながら、これまでに報告されているファージ全体の約2%が
ジャンボであることから、ジャンボファージがこれまで述べたように本当にまれであり、実際に過少評価されているわけではないと主張することができる。
。SPFMファージのゲノムも、162,910bpのゲノムサイズを有するmyovirus vB_SalM_SJ_ (Wall et al., 2010; Zhang et al., 2010; Saez et al., 2011; Zhang et al., 2014)および48,110bpのゲノムサイズを有するpodovirus UAB_78(Bardina et al., 2016)などの他のサルモネラファージと比較してサイズが大きかった。Jumboファージは単離するのがまれ
であり、より小さいゲノムサイズのファージに偏り得る従来の方法によって頻繁に単離されない(Hillyard et al., 2016; Saad et al., 2018; Salmond および Fineran, 2015; Serwer et al., 2009)。しかしながら、これまでに報告されているファージ全体の約2%が
ジャンボであることから、ジャンボファージがこれまで述べたように本当にまれであり、実際に過少評価されているわけではないと主張することができる。
【0210】
異なるサルモネラ菌株を濃縮に使用し、様々な環境源からの試料を収集したにもかかわらず、すべてのSPFMファージは互いに遺伝的に類似していた(Jurczak-Kurek et al., 2016)。SPFMファージは、宿主相互作用タンパク質に存在し得るSNPが異なる。これは、細胞
表面へのファージの付着動力学に影響を及ぼし得、宿主特異性の変化を導き得る(Switt e
t al., 2013)。このことは、SPFMファージ間で宿主域およびEOPに差が観察された理由を
説明できる可能性がある。同様の観察結果が、90%が遺伝的に同一のシュードモナスファ
ージで記述され、同様にSNPがファージ間の表現型の違いをもたらす(Ceyssens et al., 2011)。ファージSPFM5、SPFM9、SPFM10およびSPFM11は同じSNPを共有しており、これらはSNPのクローン化を表すことを示唆している可能性があることに注意すべきである。SNPは
増殖宿主によって誘導された可能性があり、このこともともとファージが単離された宿主とは異なっていた。
表面へのファージの付着動力学に影響を及ぼし得、宿主特異性の変化を導き得る(Switt e
t al., 2013)。このことは、SPFMファージ間で宿主域およびEOPに差が観察された理由を
説明できる可能性がある。同様の観察結果が、90%が遺伝的に同一のシュードモナスファ
ージで記述され、同様にSNPがファージ間の表現型の違いをもたらす(Ceyssens et al., 2011)。ファージSPFM5、SPFM9、SPFM10およびSPFM11は同じSNPを共有しており、これらはSNPのクローン化を表すことを示唆している可能性があることに注意すべきである。SNPは
増殖宿主によって誘導された可能性があり、このこともともとファージが単離された宿主とは異なっていた。
【0211】
SPFMファージを、配列決定されたすべてのサルモネラファージと比較したところ、中国南部でニワトリの糞便から分離された他の既知のジャンボサルモネラファージSPN3US(Lee
et al., 2011)および韓国で分離されたSEGD1とそれぞれクラスターを形成した。SPFMフ
ァージが英国で分離されたがクラスターを形成し、異なる大陸で分離されたファージと遺伝的に類似していることは非常に興味深い。同様に、87%の遺伝的に類似しているシュー
ドモナスファージが、米国および欧州の異なる国から分離された(Ceyssens et al., 2011)。
et al., 2011)および韓国で分離されたSEGD1とそれぞれクラスターを形成した。SPFMフ
ァージが英国で分離されたがクラスターを形成し、異なる大陸で分離されたファージと遺伝的に類似していることは非常に興味深い。同様に、87%の遺伝的に類似しているシュー
ドモナスファージが、米国および欧州の異なる国から分離された(Ceyssens et al., 2011)。
【0212】
ジャンボファージのゲノムサイズが大きいことから、SPFMファージがすべて有する6つ
のRNAPベータサブユニットなど、より小さなゲノムサイズのファージには存在しない多数の遺伝子の保有が可能である17)。ファージSPN3USの複数のRNAPサブユニットは最近の出
版物／2017)で広く研究されており、phiKZ様ファージのRNAPベータサブユニットと非常に類似している。ファージ遺伝子のアンバー突然変異体の構築により、ファージSPN3USにおいてさらに3つのRNAPサブユニットが最近予測された。SPFMファージでも、3つの予測サブユニットすべてが同定された：nvRNAP β'、C末端に存在するvRNAP β、C末端に存在するvRNAP β'である(表A)。さらに、予測された3つのRNAPサブユニットは、ファージ間で共
有されるコア遺伝子の一部である。複数のRNAPベータサブユニットの存在は、V. coralliilyticusファージBONAISHI; Ralstonia solanacearumファージRP12および08RP31において生物情報学的に同定されている7つのRNAPベータサブユニットなど、配列決定された他の
ジャンボファージと一致している。ジャンボファージにおける余分な遺伝子の存在は全体として、ファージのライフサイクルに関連するその細菌宿主の必須タンパク質への依存性を低下させることができ、その結果、ファージ宿主域を広げるのに役立つ可能性がある。これは、すべてのSPFMファージが複数の臨床的に関連するサルモネラ分離株に感染する理由を説明する可能性があり、SPFMファージをファージ療法の理想的な候補にする可能性がある。
のRNAPベータサブユニットなど、より小さなゲノムサイズのファージには存在しない多数の遺伝子の保有が可能である17)。ファージSPN3USの複数のRNAPサブユニットは最近の出
版物／2017)で広く研究されており、phiKZ様ファージのRNAPベータサブユニットと非常に類似している。ファージ遺伝子のアンバー突然変異体の構築により、ファージSPN3USにおいてさらに3つのRNAPサブユニットが最近予測された。SPFMファージでも、3つの予測サブユニットすべてが同定された：nvRNAP β'、C末端に存在するvRNAP β、C末端に存在するvRNAP β'である(表A)。さらに、予測された3つのRNAPサブユニットは、ファージ間で共
有されるコア遺伝子の一部である。複数のRNAPベータサブユニットの存在は、V. coralliilyticusファージBONAISHI; Ralstonia solanacearumファージRP12および08RP31において生物情報学的に同定されている7つのRNAPベータサブユニットなど、配列決定された他の
ジャンボファージと一致している。ジャンボファージにおける余分な遺伝子の存在は全体として、ファージのライフサイクルに関連するその細菌宿主の必須タンパク質への依存性を低下させることができ、その結果、ファージ宿主域を広げるのに役立つ可能性がある。これは、すべてのSPFMファージが複数の臨床的に関連するサルモネラ分離株に感染する理由を説明する可能性があり、SPFMファージをファージ療法の理想的な候補にする可能性がある。
【0213】
Seoulvirus属の中で、ポジティブセレクション下にある遺伝子が、ファージが共有するコア遺伝子から同定された。ポジティブセレクション下にある遺伝子には、ベースプレートウェッジタンパク質と予測される2つの推定ビリオン構造タンパク質のような宿主相互
作用タンパク質が含まれ、尾部繊維の形成に関与しており、いずれもファージの細菌細胞への結合に関与している。これらの宿主相互作用タンパク質は、異なる細菌宿主に適応しなければならず、このことはなぜそれらがポジティブセレクションを受けているのかを説明できるだろう。これらの結果は、SPFMファージ間の宿主域とEOPで観察された差異につ
いても合理的な説明を与えることができた。他のファージ研究でも、ベースプレートタンパク質をコードし、宿主特異性に関与する可能性が高い遺伝子gp6など、宿主相互作用タ
ンパク質がポジティブセレクションを受けていることが同定されている。その重要性を理解するために、ポジティブセレクション下にあるファージ遺伝子の特徴を明らかにするために、さらなる遺伝学的および突然変異の研究が必要である。
作用タンパク質が含まれ、尾部繊維の形成に関与しており、いずれもファージの細菌細胞への結合に関与している。これらの宿主相互作用タンパク質は、異なる細菌宿主に適応しなければならず、このことはなぜそれらがポジティブセレクションを受けているのかを説明できるだろう。これらの結果は、SPFMファージ間の宿主域とEOPで観察された差異につ
いても合理的な説明を与えることができた。他のファージ研究でも、ベースプレートタンパク質をコードし、宿主特異性に関与する可能性が高い遺伝子gp6など、宿主相互作用タ
ンパク質がポジティブセレクションを受けていることが同定されている。その重要性を理解するために、ポジティブセレクション下にあるファージ遺伝子の特徴を明らかにするために、さらなる遺伝学的および突然変異の研究が必要である。
【0214】
本発明者らの研究は英国のブタに一般的に関連するサルモネラ菌株を溶解することができる、21の遺伝的に類似した溶解性ジャンボファージを記載し、特徴づけた。包括的な宿主域解析およびEOPにより、食物安全性を改善するためのファージ療法の理想的な候補と
なる数多くのファージが同定された。
以下に述べる研究は、in vitroとin vivoの両方でサルモネラを最大限に減少させる最
良のファージまたはファージカクテルを同定している。
なる数多くのファージが同定された。
以下に述べる研究は、in vitroとin vivoの両方でサルモネラを最大限に減少させる最
良のファージまたはファージカクテルを同定している。
【0215】
方法および材料
【0216】
細菌株と増殖条件
【0217】
本研究では、２つのSalmonella enterica亜種、enterica血清型Typhimurium株：SL1344(受託番号FQ312003)、実験室参照株、およびAnimal and Plant Health Agency(Weybridge, UK)によって2012年にブタから単離されたS01 160-12ファージ型DT193(Card et al. 2016)を使用した。S01 160-12は多剤耐性株であり、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、スルファメトキサゾール、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、化合物スルホンアミドおよびアプラマイシンに耐性である。両方のサルモネラ分離株を、Xylose Lysine Deoxycholate(XLD)寒天(Oxoid, UK)上で、37℃で18時間、およびNZCYMブロス(Milford Biolaboratories Ltd, UK)に接種した液体培養物についてルーチン的に増殖させ、37℃、100rpmで18時間増殖させた。
【0218】
ファージの増殖と滴定
【0219】
ファージSPFM2、SPFM4、SPFM10、SPFM14、SPFM17およびSPFM19を増殖させた。簡潔には、NZCYM培養液中で増殖するサルモネラ SL1344の簡易的な指数関数的増殖液培養物(107 CFU/ml)を、107プラーク形成単位(PFU)/mlファージで感染させ、37℃で、100rpm/分で6時
間インキュベートした。ファージ培養物を4,200×gで15分間遠心分離し、上清を0.22μm
フィルタで濾過し、ファージ溶解物を4℃で保存した。ファージ力価を決定するために、
ファージ溶解物を10倍連続希釈し、小滴プラークアッセイ方法(Mazzocco et al., 2009)
を、SL1344の細菌ローンを有するLB1%寒天プレート上で使用した。最終ファージ力価をPFU/mlとして表した。
間インキュベートした。ファージ培養物を4,200×gで15分間遠心分離し、上清を0.22μm
フィルタで濾過し、ファージ溶解物を4℃で保存した。ファージ力価を決定するために、
ファージ溶解物を10倍連続希釈し、小滴プラークアッセイ方法(Mazzocco et al., 2009)
を、SL1344の細菌ローンを有するLB1%寒天プレート上で使用した。最終ファージ力価をPFU/mlとして表した。
【0220】
ワンステップ増殖アッセイ
【0221】
光学密度(OD600)0.2および細胞密度107 CFU/mlのSL1344の指数関数的培養物を、0.01の感染多重度、すなわち1:0.01のバクテリア細胞対ファージ比でファージと混合した。ファージを37℃で5分間吸着させ、結合していないファージを4200×gで10分間遠心分離することによって除去した。ペレットをNZCYMブロスで再懸濁し、100rpmで振盪しながら37℃で
インキュベートした。アリコートを10分毎に1.5時間採取し、小滴プラークアッセイ方法
を用いてPFU/mlカウントを決定した(Mazzocco et al., 2009)。3つの生体情報反復を、それぞれ3つの技術的反復を用いて行った。
インキュベートした。アリコートを10分毎に1.5時間採取し、小滴プラークアッセイ方法
を用いてPFU/mlカウントを決定した(Mazzocco et al., 2009)。3つの生体情報反復を、それぞれ3つの技術的反復を用いて行った。
【0222】
ファージ受容体分析
【0223】
Sangryeol Ryuは、鞭毛生産遺伝子(flgK)；ビタミンB12取り込み外膜タンパク質(butB)をコードする遺伝子；およびLPS関連O抗原産生(rfaL)に関与する遺伝子に欠失を有するS.
Typhimurium SL1344株を提供した。突然変異株は、ラムダ赤組換え方法(Shin et al. 2012)を用いて構築した。ファージが3つのいずれかを宿主受容体として使用するかどうかを決定するために、ファージ溶解物を10倍に希釈し、小滴プラークアッセイ方法(Mazzocco et al. 2009)を用いて突然変異株上にプレーティングした。3つの生体情報反復を、それ
ぞれ3つの技術的反復を用いて行った。
Typhimurium SL1344株を提供した。突然変異株は、ラムダ赤組換え方法(Shin et al. 2012)を用いて構築した。ファージが3つのいずれかを宿主受容体として使用するかどうかを決定するために、ファージ溶解物を10倍に希釈し、小滴プラークアッセイ方法(Mazzocco et al. 2009)を用いて突然変異株上にプレーティングした。3つの生体情報反復を、それ
ぞれ3つの技術的反復を用いて行った。
【0224】
温度およびpH安定性アッセイ
【0225】
ファージ溶解物の熱安定性を、ファージを4、10、20、30、40、50、60、70、80、90お
よび100℃の範囲の温度に1時間暴露することによって試験した。ファージをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)装置中でインキュベートした。pH検討のために、100μlのファージ溶解物
を、1～14のpH温度範囲に調整した900μlのSM緩衝液に添加した。異なる温度およびpHに
曝露した後のファージ力価を決定するために、ファージ溶解物を10倍連続希釈し、小滴プラークアッセイ方法を、SL1344の細菌菌叢（ローン）を有するLB1%寒天プレート上で使用した(Mazzocco et al. 2009)。最終ファージ力価をPFU/mlとして表し、3つの生体情報反
復を3つの技術的反復で行った。
よび100℃の範囲の温度に1時間暴露することによって試験した。ファージをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)装置中でインキュベートした。pH検討のために、100μlのファージ溶解物
を、1～14のpH温度範囲に調整した900μlのSM緩衝液に添加した。異なる温度およびpHに
曝露した後のファージ力価を決定するために、ファージ溶解物を10倍連続希釈し、小滴プラークアッセイ方法を、SL1344の細菌菌叢（ローン）を有するLB1%寒天プレート上で使用した(Mazzocco et al. 2009)。最終ファージ力価をPFU/mlとして表し、3つの生体情報反
復を3つの技術的反復で行った。
【0226】
ファージカクテルを用いたIn vitro殺菌アッセイ
【0227】
殺菌アッセイは、ファージ単独で、および等容量で混合した2、3および4個のファージ
からなるファージカクテルを用いて行った。種々の殺菌アッセイのために、S01 160-12のファージカクテル組み合わせ培養物を、0.2の光学濃度(OD600)まで増殖させ、その時点で、1つまたは複数のファージを100のMOIで添加した。さらに、2つの対照があった：1つはSL1344のみを含むバクテリア対照であり、もう1つはファージのみを含むファージ対照であった。対照試料および試験試料アリコートの両方を37℃、100rpmでインキュベートし、アリコートを0、1、2、3、4、5および6時間の時点で採取した。各時点について、細菌濃度(CFU/ml)をLB1%寒天プレート上で測定し、ファージ濃度(PFU/ml)を小滴プラークアッセイ
方法(Mazzocco et al., 2009)により測定した。CFU/mlおよびPFU/mlの両方について、3つの技術的複製を行い、プレートを37℃で16時間インキュベートした。3つの生体情報反復
を、各殺菌アッセイについて行った。殺菌アッセイのグラフはGraphPadプリズム6を用い
てプロットし、対のt検定を用いて、P≦0.5が有意であると考えられるデータの有意性を
決定した。
からなるファージカクテルを用いて行った。種々の殺菌アッセイのために、S01 160-12のファージカクテル組み合わせ培養物を、0.2の光学濃度(OD600)まで増殖させ、その時点で、1つまたは複数のファージを100のMOIで添加した。さらに、2つの対照があった：1つはSL1344のみを含むバクテリア対照であり、もう1つはファージのみを含むファージ対照であった。対照試料および試験試料アリコートの両方を37℃、100rpmでインキュベートし、アリコートを0、1、2、3、4、5および6時間の時点で採取した。各時点について、細菌濃度(CFU/ml)をLB1%寒天プレート上で測定し、ファージ濃度(PFU/ml)を小滴プラークアッセイ
方法(Mazzocco et al., 2009)により測定した。CFU/mlおよびPFU/mlの両方について、3つの技術的複製を行い、プレートを37℃で16時間インキュベートした。3つの生体情報反復
を、各殺菌アッセイについて行った。殺菌アッセイのグラフはGraphPadプリズム6を用い
てプロットし、対のt検定を用いて、P≦0.5が有意であると考えられるデータの有意性を
決定した。
【0228】
in vivo Galleria mellonella感染モデルにおけるファージカクテルの有効性の検証
【0229】
G. mellonellaの調製
【0230】
幼虫はLive Food UK Ltd.(Rooks Bridge, UK)から購入し、4℃で保存し、5日以内に使
用した。すべてのin vivo実験のために、約0.25～0.30gの重量の幼虫を選択し、70%エタ
ノールに浸漬した綿棒で表面滅菌した。
用した。すべてのin vivo実験のために、約0.25～0.30gの重量の幼虫を選択し、70%エタ
ノールに浸漬した綿棒で表面滅菌した。
【0231】
ファージカクテルで処理したサルモネラ感染G. mellonella
【0232】
全ての幼虫ファージ治療研究について、以前に記載された方法が使用された(Nale, Chutia, et al. 2016)。最終濃度105 CFUのサルモネラ菌株S01 160-12および最終濃度107 PFUのファージカクテルの両方を、経口経路を介して幼虫に投与した。109 CFU/mlを含むS01
160-12の培養液を最初に増殖させ、次いで4,200×gで10分間遠心分離することによって
、株S01160-12を調製した。上清を捨て、ペレットを0.1Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、4,200×gで10分間遠心分離した。上清を再度捨て、沈殿をPBSに再懸濁し、PBSで10倍に希釈して105 CFU/mlとした。幼虫に、10μlの細菌培養物およびファージカクテル
を、Hamiltonシリンジポンプを用いて経口経路で投与した。ファージカクテルは、感染の1時間前に予防的に投与するか、あるいはサルモネラと同時に投与した(テーブル3に詳述
されているすべての投与計画)。その後、幼虫を37℃で3日間インキュベートした。24時間毎に幼虫の生存率をモニターし、幼虫を屠殺してCFUおよびPFU数を測定した。このために、幼虫を-20℃で3時間保存し、解剖してそれらの血リンパを除去し、これを1mlのPBSに懸濁し、30秒間ボルテックスした(Nale et al. 2016)。PFUカウントのために、試料を5,000×gで5分間遠心分離した。次いで、ろ液を10倍希釈し、小滴プラークアッセイ方法(Mazzo
cco et al. 2009)により滴定した。CFUカウントのために、懸濁液を10倍希釈液で希釈し
、XLD寒天プレート上でスポット試験した。ファージカクテルへの暴露後に回収されたサ
ルモネラコロニーを、5μlループを用いて拾い、XLD寒天プレート上に画線し、XLD寒天上に3回再画線した。コロニーをNZCYMブロスに接種し、100rpmで、37℃で2時間増殖させた
。次いで、培養物を用いて菌叢を作製し、スポット試験を介してファージに対するそれらの感受性を決定した(Mazzocco et al., 2009)。108 PFU/mlのファージをスポットした。
単離されたコロニー上のファージのプレーティング効率を決定するために、ファージ溶解物を10倍希釈し、小滴プラークアッセイ法(Mazzocco et al. 2009)を用いてプレーティングした。
160-12の培養液を最初に増殖させ、次いで4,200×gで10分間遠心分離することによって
、株S01160-12を調製した。上清を捨て、ペレットを0.1Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、4,200×gで10分間遠心分離した。上清を再度捨て、沈殿をPBSに再懸濁し、PBSで10倍に希釈して105 CFU/mlとした。幼虫に、10μlの細菌培養物およびファージカクテル
を、Hamiltonシリンジポンプを用いて経口経路で投与した。ファージカクテルは、感染の1時間前に予防的に投与するか、あるいはサルモネラと同時に投与した(テーブル3に詳述
されているすべての投与計画)。その後、幼虫を37℃で3日間インキュベートした。24時間毎に幼虫の生存率をモニターし、幼虫を屠殺してCFUおよびPFU数を測定した。このために、幼虫を-20℃で3時間保存し、解剖してそれらの血リンパを除去し、これを1mlのPBSに懸濁し、30秒間ボルテックスした(Nale et al. 2016)。PFUカウントのために、試料を5,000×gで5分間遠心分離した。次いで、ろ液を10倍希釈し、小滴プラークアッセイ方法(Mazzo
cco et al. 2009)により滴定した。CFUカウントのために、懸濁液を10倍希釈液で希釈し
、XLD寒天プレート上でスポット試験した。ファージカクテルへの暴露後に回収されたサ
ルモネラコロニーを、5μlループを用いて拾い、XLD寒天プレート上に画線し、XLD寒天上に3回再画線した。コロニーをNZCYMブロスに接種し、100rpmで、37℃で2時間増殖させた
。次いで、培養物を用いて菌叢を作製し、スポット試験を介してファージに対するそれらの感受性を決定した(Mazzocco et al., 2009)。108 PFU/mlのファージをスポットした。
単離されたコロニー上のファージのプレーティング効率を決定するために、ファージ溶解物を10倍希釈し、小滴プラークアッセイ法(Mazzocco et al. 2009)を用いてプレーティングした。
【0233】
すべての投与群について、60匹の幼虫を合計で用い、20匹の幼虫の生存を評価し、24時間毎に解剖した。幼虫が、触るのに反応せず、淡褐色からブラックに変色した場合、幼虫は死んだと考えられた。同様に、対照群には60匹の幼虫を用い、24時間毎に20匹を乱切して、血リンパ中のCFUおよびPFU数を測定した。すべての実験に含まれた対照幼虫は、健康な幼虫；経口経路で107 PFUファージを投与された幼虫；経口経路で105 CFU S01160-12を投与された幼虫；およびPBSを投与された幼虫であった(テーブル3)。すべての対照を24時間毎に生残についてモニタリングし、その胃腸管をCFUおよびPFUカウントのために解剖した。
【0234】
【表5】
クし、PFUおよびCFUをカウントするために選択的に殺処分した。
2ファージカクテルは、2ファージSPFM10-SPFM14；3ファージSPFM4-SPFM10-SPFM19；およ
び4ファージSPFM2-SPFM10-SPFM14-SPFM19であった。
【0235】
生存曲線
【0236】
すべての実験について、3つの生体情報反復を行い、Kaplan-Meier法を用いてGraphpad Prismバージョン6(GraphPad Software Inc, USA)を使用して生存データをプロットした。
生存率の差はログ-rank(Mantel-Cox)検定を用いて評価した。
生存率の差はログ-rank(Mantel-Cox)検定を用いて評価した。
【0237】
バイオインフォマティクス解析
【0238】
ファージは以前にENAに寄託されており、それらの受託番号はSPFM2(LR535921)、SPFM4(LR535902)、SPFM10(LR535908)、SPFM14(LR535912)、SPFM17(LR535914)およびSPFM19(LR535916)である。このリンクhttp://s3.climb.ac.uk/Sinfo/SPFM_genome.tar.gzを介して、
注釈付きフェージゲノムも見つけることができる。SNP分析のために、90%を超える頻度および低いp値を考慮したが、頻度が低下した場合、さらなるSNPが同定された。
注釈付きフェージゲノムも見つけることができる。SNP分析のために、90%を超える頻度および低いp値を考慮したが、頻度が低下した場合、さらなるSNPが同定された。
【0239】
結果
【0240】
ファージバーストサイズ
【0241】
ファージ増殖曲線を、6つのSPFMファージについて行った。ファージSPFM10およびSPFM17は、細胞あたり175および162 PFU/細胞の大きなバーストサイズおよび20分の短い潜伏期間を有した。SPFM2、SPFM4、SPFM14およびSPFM19は、それぞれ、細胞あたり165、162、162および153 PFU/細胞のバーストサイズおよび30分のより長い潜伏期間を有した(テーブル4)。
【0242】
【表6】
れる。
【0243】
ファージの温度およびpH安定性
【0244】
加熱に対するファージSPFM2、SPFM4、SPFM10、SPFM14、SPFM17およびSPFM19の感受性を決定するために、ファージを温度4、10、20、30、40、50、60、70、80および90℃に1時間暴露した(図7)。全てのファージは50℃で安定であり、4℃で保存したファージと比較してファージ力価の低下はなかった。ファージを60℃でインキュベートした場合、ファージSPFM10およびSPFM17のみが生存し、力価の平均低下はそれぞれ0.0および6.5 log10 PFU/ml
であった。70℃および80℃でファージSPFM17については7.5 log10 PFU/mlの力価低下が続いたが、ファージは生存しなかった。比較において、SPFM10は60、70および80℃で力価の有意な低下を伴わずにより安定であったが、90℃ではファージ力価は4.5 log10 PFU/ml減少し、100℃では生存ファージは回収されなかった。ファージSPFM10の熱安定性を検証す
るために、ファージを、2つの異なる温度制御された装置：ヒートブロックおよび水浴を
使用してインキュベートし、ファージを、PCR機械を使用してインキュベートした場合に
収集された元のデータと比較した。3機すべてにより、結果は同一であり、更にSPFM10の
熱安定性を確認した。
であった。70℃および80℃でファージSPFM17については7.5 log10 PFU/mlの力価低下が続いたが、ファージは生存しなかった。比較において、SPFM10は60、70および80℃で力価の有意な低下を伴わずにより安定であったが、90℃ではファージ力価は4.5 log10 PFU/ml減少し、100℃では生存ファージは回収されなかった。ファージSPFM10の熱安定性を検証す
るために、ファージを、2つの異なる温度制御された装置：ヒートブロックおよび水浴を
使用してインキュベートし、ファージを、PCR機械を使用してインキュベートした場合に
収集された元のデータと比較した。3機すべてにより、結果は同一であり、更にSPFM10の
熱安定性を確認した。
【0245】
噴霧乾燥SPFMファージ
【0246】
噴霧乾燥の前に、ファージを、10kDaカットオフを有する50mlのAmicon Ultra-濃縮器(Millipore, UK)を使用して濃縮し、15mlのファージ溶解物を濃縮器に添加し、そして5,000×gで20分間回転させた。フロースルーを廃棄し、さらに15mlのファージ溶解物を濃縮機
に添加した。フィルタより上に収集した濃縮ファージを力価測定し、力価が約1010である場合、噴霧乾燥実験に使用した。
に添加した。フィルタより上に収集した濃縮ファージを力価測定し、力価が約1010である場合、噴霧乾燥実験に使用した。
【0247】
ファージ噴霧乾燥のために、pH 7.5の超純水に溶解した200ml容量の4%トレハロース(Oxoid, UK)賦形剤溶液を、0.2mlの濃ファージと、およそ5×1010PFU/mlの力価で混合した。賦形剤-ファージ溶液を、実験室規模のLabPlant Spray Dryer(UK)を用いて、0.5mmのオリフィス直径を有する噴霧用の2流体ノズルで噴霧乾燥した。3ml/分の一定供給速度を、6 l/分の噴霧空気流を用いて、全ての実験に使用した。乾燥注入口温度を80℃、85℃、90℃
または100℃の温度に加熱し、対応する出口温度を40℃から60℃まで変化させた。乾燥粉
末ファージをサイクロンに通し、100mlのガラス瓶に集め、使用するまで4℃で保存した。ファージ力価を決定するために、0.05gの乾燥粉末ファージを500μlのファージ懸濁緩衝
液に懸濁し、10倍に希釈し、そしてプラークアッセイによって力価測定した。
または100℃の温度に加熱し、対応する出口温度を40℃から60℃まで変化させた。乾燥粉
末ファージをサイクロンに通し、100mlのガラス瓶に集め、使用するまで4℃で保存した。ファージ力価を決定するために、0.05gの乾燥粉末ファージを500μlのファージ懸濁緩衝
液に懸濁し、10倍に希釈し、そしてプラークアッセイによって力価測定した。
【0248】
【表7】
【0249】
噴霧乾燥SPFMファージ
【0250】
6つのファージ全てを糖賦形剤トレハロースで噴霧乾燥した。噴霧乾燥プロセスの間、
ファージ-トレハロース液体を粉末に乾燥するために加熱空気を使用したので、ファージ
を熱ストレスに暴露した。液体を蒸発させるために、高い入口乾燥温度(手動で設定する
ことができる)を使用し、これにファージ-トレハロース溶液をミリ秒間暴露しただけであった。その後、粉末を収集し、注入口温度設定に依存するより低い出口温度に曝露した。本研究では、ファージを80、85、90、および100℃の異なる入口乾燥温度に供して、ファ
ージ力価の低下を最小限にする乾燥工程を最適化した。
ファージ-トレハロース液体を粉末に乾燥するために加熱空気を使用したので、ファージ
を熱ストレスに暴露した。液体を蒸発させるために、高い入口乾燥温度(手動で設定する
ことができる)を使用し、これにファージ-トレハロース溶液をミリ秒間暴露しただけであった。その後、粉末を収集し、注入口温度設定に依存するより低い出口温度に曝露した。本研究では、ファージを80、85、90、および100℃の異なる入口乾燥温度に供して、ファ
ージ力価の低下を最小限にする乾燥工程を最適化した。
【0251】
乾燥工程中に使用した入口温度にかかわらず、SPFM2、SPFM4、SPFM17およびSPFM19については、少なくとも1 log10 PFU/gファージ力価損失があった。SPFM2およびSPFM4は入口
温度を80℃に低下させた場合により安定であったが、SPFM4についてはすべての入口温度
において、ファージ力価の損失は3.00～3.16 log10 PFU/gの間で有意であった。SPFM17およびSPFM19のファージ力価損失は、注入口温度85℃および90℃でそれぞれ最低であった。ファージSPFM10およびSPFM14は6つから最も安定であり、80℃を注入口温度として使用し
た場合、0.02および0.35 log10 PFU/gの最小限ファージ力価損失を有した。SPFM14について入口温度を上昇させたるとさらなる力価損失が認められたが、SPFM10ファージ力価損失は0.2 log10 PFU/g未満のままであった。すべてのファージについて、回収された粉末乾
燥ファージの最終収率は0.2～0.5gの間で一貫して低く、その結果、ファージ回収率は試
験したすべての注入口温度について5～13%であった。
温度を80℃に低下させた場合により安定であったが、SPFM4についてはすべての入口温度
において、ファージ力価の損失は3.00～3.16 log10 PFU/gの間で有意であった。SPFM17およびSPFM19のファージ力価損失は、注入口温度85℃および90℃でそれぞれ最低であった。ファージSPFM10およびSPFM14は6つから最も安定であり、80℃を注入口温度として使用し
た場合、0.02および0.35 log10 PFU/gの最小限ファージ力価損失を有した。SPFM14について入口温度を上昇させたるとさらなる力価損失が認められたが、SPFM10ファージ力価損失は0.2 log10 PFU/g未満のままであった。すべてのファージについて、回収された粉末乾
燥ファージの最終収率は0.2～0.5gの間で一貫して低く、その結果、ファージ回収率は試
験したすべての注入口温度について5～13%であった。
【0252】
本研究で使用した6のSPFMファージは互いに遺伝的に95%類似しているが、in vitroおよびin vivoにおいてS. Typhimuriumに対する殺傷活性を組み合わせた場合にそれらの個々
から観察されるように、表現型的にはそれらは異なる特性を有する。ファージの組み合わせSPFM10-SPFM14、およびSPFM4、SPFM10およびSPFM19がなぜ最良であったかをさらに調べるために、ファージの温度安定性を測定することにより、6種類すべてのファージの表現
型解析を行った。以前に特徴付けられたファージと一致して、SPFM2、SPFM4、SPFM14およびSPFM19は50℃まで安定であった。ファージがより高温に曝されると、ファージタンパク質に不可逆的な損傷が生じ、それがその後のファージ感染能の喪失につながる可能性がある。興味深いことに、このファージにもかかわらず、SPFM10およびSPFM17は両方とも熱安定性であり、70℃まで活性を保持している。ファージSPFM17では、50℃を超える温度でのインキュベーション後にファージ力価の有意な低下が認められた。ファージSPFM10と比較して、80℃までのファージ力価の低下はなく、90℃に1時間暴露した後でさえ、55%のファージ活性が残った。ファージSPFM10は95℃に5分間暴露した後に20.5%のファージ活性しか保持しなかった報告されたE. coliファージvB_Eco4M-7よりも極端な温度で熱安定性が増
加し、有意に安定であった。ファージキャプシド内では、ジスルフィド架橋の形成が極端な温度の間のファージの安定化に関与し得るという仮説が立てられており、これはRNAフ
ァージPP7で確認されている。ファージSPFM10およびSPFM17のキャプシドにおけるジスル
フィド架橋が熱安定性の増加に寄与しているかどうかは不明である。
から観察されるように、表現型的にはそれらは異なる特性を有する。ファージの組み合わせSPFM10-SPFM14、およびSPFM4、SPFM10およびSPFM19がなぜ最良であったかをさらに調べるために、ファージの温度安定性を測定することにより、6種類すべてのファージの表現
型解析を行った。以前に特徴付けられたファージと一致して、SPFM2、SPFM4、SPFM14およびSPFM19は50℃まで安定であった。ファージがより高温に曝されると、ファージタンパク質に不可逆的な損傷が生じ、それがその後のファージ感染能の喪失につながる可能性がある。興味深いことに、このファージにもかかわらず、SPFM10およびSPFM17は両方とも熱安定性であり、70℃まで活性を保持している。ファージSPFM17では、50℃を超える温度でのインキュベーション後にファージ力価の有意な低下が認められた。ファージSPFM10と比較して、80℃までのファージ力価の低下はなく、90℃に1時間暴露した後でさえ、55%のファージ活性が残った。ファージSPFM10は95℃に5分間暴露した後に20.5%のファージ活性しか保持しなかった報告されたE. coliファージvB_Eco4M-7よりも極端な温度で熱安定性が増
加し、有意に安定であった。ファージキャプシド内では、ジスルフィド架橋の形成が極端な温度の間のファージの安定化に関与し得るという仮説が立てられており、これはRNAフ
ァージPP7で確認されている。ファージSPFM10およびSPFM17のキャプシドにおけるジスル
フィド架橋が熱安定性の増加に寄与しているかどうかは不明である。
【0253】
さらに、SPFM10の熱安定性と噴霧乾燥中のその増大した安定性との間に相関があるようである。ファージSPFM10は自然に非常に弾力性があり、賦形剤トレハロースと組み合わされた場合、ファージは、100℃の最高注入口温度に曝された場合、依然として活性を保持
する。驚くべきことに、ファージSPFM14は、並外れたな熱安定性はないが、噴霧乾燥中に非常に安定であった。対照的に、ファージSPFM17はもともと熱安定性であるので噴霧乾燥に耐え得ることが予想されたが、SPM2、SPFM4およびSPM19と同様に、試験した最高注入口温度で3 log10 PFU/gまでの減少があった。本研究は試験したファージが遺伝的に類似し
ており、すべてマイオウイルスであり、したがって同じ形態を有する場合であっても、噴霧乾燥中のファージの安定性は使用したファージに大きく依存することを強調している。以前に仮定されたマイオウイルスは長い尾部が収縮するか、または応力下でキャプシドが分離する可能性があるため、デリケートなビリオン構造のために、十分に噴霧乾燥しない。このことは、ファージSPM2、SPFM4、SPFM17およびSPM19では力価の消失が認められた理由を説明することができ、2.5 log10の低下が認められたStaphyloccusファージRomulusについても力価の消失が認められた。この仮説に対する例外は、ジャンボファージSPFM10、SPFM14およびシュードモナスファージKZである。
する。驚くべきことに、ファージSPFM14は、並外れたな熱安定性はないが、噴霧乾燥中に非常に安定であった。対照的に、ファージSPFM17はもともと熱安定性であるので噴霧乾燥に耐え得ることが予想されたが、SPM2、SPFM4およびSPM19と同様に、試験した最高注入口温度で3 log10 PFU/gまでの減少があった。本研究は試験したファージが遺伝的に類似し
ており、すべてマイオウイルスであり、したがって同じ形態を有する場合であっても、噴霧乾燥中のファージの安定性は使用したファージに大きく依存することを強調している。以前に仮定されたマイオウイルスは長い尾部が収縮するか、または応力下でキャプシドが分離する可能性があるため、デリケートなビリオン構造のために、十分に噴霧乾燥しない。このことは、ファージSPM2、SPFM4、SPFM17およびSPM19では力価の消失が認められた理由を説明することができ、2.5 log10の低下が認められたStaphyloccusファージRomulusについても力価の消失が認められた。この仮説に対する例外は、ジャンボファージSPFM10、SPFM14およびシュードモナスファージKZである。
【0254】
ファージをある範囲のpHに暴露して、pHに対する感受性を測定した(図7b)。全てのファージはpH4～12で安定であり、ファージ力価の有意な損失はなかった。pH3では、SPFM10、SPFM14およびSPFM17のファージ力価がそれぞれ5.44、3.12および2.51 log10 PFU/ml低下
した。しかしながら、ファージSPFM2、SPFM4およびSPFM19はpH3で安定であり、ファージ
力価に変化はなかった。全てのファージはpH1、2、13および14で不安定であり、プラークは回収されなかった。
した。しかしながら、ファージSPFM2、SPFM4およびSPFM19はpH3で安定であり、ファージ
力価に変化はなかった。全てのファージはpH1、2、13および14で不安定であり、プラークは回収されなかった。
【0255】
ファージレセプターの同定
【0256】
SL1344の異なる受容体変異株を用いてプレーティングの効率をスクリーニングし、ファージがサルモネラに結合するのに用いている細菌受容体を測定した(テーブル5)。このフ
ァージを、ビタミンB12取り込み外膜タンパク質をコードする遺伝子(SL1344 AbutB)に欠
失があり、鞭毛産生遺伝子(SL1344 AflgK)に欠失がある株で試験した。両株とも、野生型SL1344と比較した場合、プラーク形成効率に有意な変化は認められなかった。しかしながら、LPS関連O抗原産生に関与する遺伝子に欠失があるSL1344株ArfaLでは、すべてのファ
ージが感染できず、プラーク形成効率は0であった。このデータに基づいて、われわれは
、6つのファージすべてがLPSのO抗原を宿主レセプターとして使用していると予測する。
ァージを、ビタミンB12取り込み外膜タンパク質をコードする遺伝子(SL1344 AbutB)に欠
失があり、鞭毛産生遺伝子(SL1344 AflgK)に欠失がある株で試験した。両株とも、野生型SL1344と比較した場合、プラーク形成効率に有意な変化は認められなかった。しかしながら、LPS関連O抗原産生に関与する遺伝子に欠失があるSL1344株ArfaLでは、すべてのファ
ージが感染できず、プラーク形成効率は0であった。このデータに基づいて、われわれは
、6つのファージすべてがLPSのO抗原を宿主レセプターとして使用していると予測する。
【0257】
【表8】
【0258】
in vitroにおける6つのSPFMファージの感染動態
【0259】
ファージSPFM2、SPFM4、SPFM10、SPFM14、SPFM17およびSPFM19単独、ならびに2、3および4つのカクテルの組み合わせを、多層抗生物質耐性S. Typhimurium株の最高の減少を引
き起こす最適な組み合わせを決定するために試験した。殺傷は6時間の経時的に評価し、
非感染対照と比較した。図8に示すデータは、100の感染多重度(MOI)で行われた殺傷アッ
セイである。
き起こす最適な組み合わせを決定するために試験した。殺傷は6時間の経時的に評価し、
非感染対照と比較した。図8に示すデータは、100の感染多重度(MOI)で行われた殺傷アッ
セイである。
【0260】
単一ファージ懸濁液による細菌殺傷アッセイ
【0261】
ファージSPFM2、SPFM4、SPFM10、SPFM14、SPFM17およびSPFM19を単独で添加したMOI 100では、感染から1時間後に有意な低下を引き起こした(p≦0.05)。しかしながら、最大の
細菌細胞溶解は非感染培養後と比較して、感染2時間後に、それぞれ1.77、2.36、2.15、2.43、2.32および1.52 log10 CFU/mlの低下によって観察された(図8a)。特に、減少率は、ファージphiSPFM2、phiSPFM4、phiSPFM5およびphiSPFM6で非常に有意であった(p≦0.01)
。6時間後、細菌数の低下を維持した最も有効なファージはphiSPFM2、phiSPFM4、phiSPFM5およびphiSPFM6(p≦0.05)であり、それぞれ0.71、0.80、0.83および0.85 log10 CFU/ml
であった。
細菌細胞溶解は非感染培養後と比較して、感染2時間後に、それぞれ1.77、2.36、2.15、2.43、2.32および1.52 log10 CFU/mlの低下によって観察された(図8a)。特に、減少率は、ファージphiSPFM2、phiSPFM4、phiSPFM5およびphiSPFM6で非常に有意であった(p≦0.01)
。6時間後、細菌数の低下を維持した最も有効なファージはphiSPFM2、phiSPFM4、phiSPFM5およびphiSPFM6(p≦0.05)であり、それぞれ0.71、0.80、0.83および0.85 log10 CFU/ml
であった。
【0262】
2種類のファージカクテルを用いた殺菌アッセイ
【0263】
15種類の異なる2種類のファージカクテルを検査し、すべての組み合わせについて、非
感染培養と比較して、感染1時間後にS. Typhimuriumが1および3 log10 CFU/ml低下した(
図8bおよび8c)。単一ファージによる殺傷アッセイと同様に、ファージの組合せSPFM10-SPFM14、SPFM2-SPFM4、SPFM10-SPFM17およびSPFM2-SPFM10について、それぞれ4.43、4.46、4.34および4.36 log10 CFU/mlの統計的に有意な最大減少(p≦0.001)が2時間後に観察された。さらに、2時間後、ファージカクテルSPFM2-SPFM14、SPFM2-SPFM6、SPFM10-SPFM19お
よびSPFM2-SPFM19は、2.36、2.60、2.64および3.29 log10 CFU/mlのバクテリア低下(p≦0.001)を引き起こした。ファージSPFM10-SPFM14およびSPFM2-SPFM10による感染6時間後に
、それぞれ1.97および2.25 log10 CFU/mlまで有意なS. Typhimuriumの低下(p≦0.05)が維持された。他の12の2ファージの組み合わせは6時間後に効率が低く、0.5～1log10CFU/ml
のバクテリア低下は非感染対照と比較して認められた。
感染培養と比較して、感染1時間後にS. Typhimuriumが1および3 log10 CFU/ml低下した(
図8bおよび8c)。単一ファージによる殺傷アッセイと同様に、ファージの組合せSPFM10-SPFM14、SPFM2-SPFM4、SPFM10-SPFM17およびSPFM2-SPFM10について、それぞれ4.43、4.46、4.34および4.36 log10 CFU/mlの統計的に有意な最大減少(p≦0.001)が2時間後に観察された。さらに、2時間後、ファージカクテルSPFM2-SPFM14、SPFM2-SPFM6、SPFM10-SPFM19お
よびSPFM2-SPFM19は、2.36、2.60、2.64および3.29 log10 CFU/mlのバクテリア低下(p≦0.001)を引き起こした。ファージSPFM10-SPFM14およびSPFM2-SPFM10による感染6時間後に
、それぞれ1.97および2.25 log10 CFU/mlまで有意なS. Typhimuriumの低下(p≦0.05)が維持された。他の12の2ファージの組み合わせは6時間後に効率が低く、0.5～1log10CFU/ml
のバクテリア低下は非感染対照と比較して認められた。
【0264】
3種類のファージカクテルを用いた殺菌アッセイ
【0265】
単一ファージおよび2つのファージカクテルと比較して、試験した11の3つのファージの組み合わせは、感染後1時間(p≦0.01)により迅速に、約2.5 log10 CFU/mlだけバクテリア液培養物を除去した(図8dおよび8e)。死滅は2時間後にさらにブーストされ、最も効果的
な3つのファージカクテルは、それぞれ2.60、3.50および3.53 log10 CFU/mlの低下を引き起こしたSPFM4-SPFM10-SPFM19、SPFM10-SPFM17-SPFM19およびSPFM2-SPFM17-SPFM19であった(p≦0.001)。溶解は感染後6時間後に、試験した11の3つのファージの組み合わせのうちの2つ：SPFM10-SPFM17-SPFM19およびSPFM2-SPFM10-SPFM19(p≦0.05)により、1.10および1.70 log10 CFU/mlだけ延長された。
な3つのファージカクテルは、それぞれ2.60、3.50および3.53 log10 CFU/mlの低下を引き起こしたSPFM4-SPFM10-SPFM19、SPFM10-SPFM17-SPFM19およびSPFM2-SPFM17-SPFM19であった(p≦0.001)。溶解は感染後6時間後に、試験した11の3つのファージの組み合わせのうちの2つ：SPFM10-SPFM17-SPFM19およびSPFM2-SPFM10-SPFM19(p≦0.05)により、1.10および1.70 log10 CFU/mlだけ延長された。
【0266】
4種類のファージカクテルを用いた殺菌試験
【0267】
S. Typhimuriumにおいて1.5-2.5 log10 CFU/mlの低下を引き起こした急速なバクテリア溶解が、検査した4つのファージカクテル(p≦0.01)の4つすべてについて感染1時間後に観察された。4つの組み合わせから、3つの組み合わせ：SPFM10-SPFM14-SPFM17-SPFM19、SPFM2-SPFM10-SPFM14-SPFM19およびSPFM2-SPFM4-SPFM10-SPFM19は、感染2時間後の細菌数を
それぞれ3.51、3.40および3.38 log10 CFU/ml減少させるのに最も有効であった(図8f)。
第4のファージ組合せSPFM2-SPFM10-SPFM17-SPFM19は、2時間後に細菌密度の2.61 log10 CFU/ml減少を引き起こした。3つのファージカクテルと比較して、細菌不活化は6時間後に
、SPFM2-SPFM10-SPFM14-SPFM19およびSPFM2-SPFM4-SPFM10-SPFM19の組み合わせと、非感
染細菌対照と比較して、1.58および1.61 log10 CFU/ml一致した。
それぞれ3.51、3.40および3.38 log10 CFU/ml減少させるのに最も有効であった(図8f)。
第4のファージ組合せSPFM2-SPFM10-SPFM17-SPFM19は、2時間後に細菌密度の2.61 log10 CFU/ml減少を引き起こした。3つのファージカクテルと比較して、細菌不活化は6時間後に
、SPFM2-SPFM10-SPFM14-SPFM19およびSPFM2-SPFM4-SPFM10-SPFM19の組み合わせと、非感
染細菌対照と比較して、1.58および1.61 log10 CFU/ml一致した。
【0268】
in vivoにおけるファージカクテルの感染動態
【0269】
in vitroで観察された有効性の結果がin vivoで翻訳されるかどうかを判定するために
、Galleria mellonella感染モデルにおいてファージカクテル、SPFM10およびSPFM14(2フ
ァージ)；SPFM4、SPFM10およびSPFM19(3ファージ)；SPFM2、SPFM10、SPFM14およびSPFM19(4ファージ)の有効性を試験した。幼虫はMDR S. Typhimurium S01 160-12株に感染した。サルモネラに同時に投与したファージカクテルおよびファージの予防的治療の活性を評価した(図3)。ファージカクテルはin vitro殺傷アッセイ検討と一致するように、MOI 100で投与した。
、Galleria mellonella感染モデルにおいてファージカクテル、SPFM10およびSPFM14(2フ
ァージ)；SPFM4、SPFM10およびSPFM19(3ファージ)；SPFM2、SPFM10、SPFM14およびSPFM19(4ファージ)の有効性を試験した。幼虫はMDR S. Typhimurium S01 160-12株に感染した。サルモネラに同時に投与したファージカクテルおよびファージの予防的治療の活性を評価した(図3)。ファージカクテルはin vitro殺傷アッセイ検討と一致するように、MOI 100で投与した。
【0270】
ファージカクテルの予防的治療
【0271】
ファージカクテルを感染の1時間前に予防的に投与し、サルモネラ感染の治療における
有効性を調べた(図9aおよび9c)。24時間後、ファージを投与したすべての幼虫の平均生存率はサルモネラのみに感染した対照幼虫C-6の生存率81%に対し、90%であった。2-ファー
ジ(P-1)、3-ファージ(P-2)および4-ファージ(P-3)カクテルを予防的に投与した感染幼虫
の平均細菌数は、それぞれ2 log10、3.3 log10および3.8 log10 CFU/幼虫であった(テー
ブル3)。対照のC-6群は4.6 log10 CFU/幼虫のより高い平均細菌数であった。48時間後、C-6群のサルモネラ菌数は約4.8 log10 CFU/幼虫で、生存率は59%に低下した。サルモネラ
菌数のさらなる低下が、P-1群およびP-3群の幼虫では約3.3 log10 CFU/幼虫まで観察され、サルモネラ菌は両群の12/20幼虫で検出されなかった。対照群では、P-2は1.3 log10 CFU/幼虫のサルモネラ低下を示し、20匹中6匹の幼虫でサルモネラは検出されなかった。生
存率はP‐1、P‐2、P‐3でそれぞれ95%、81%、78%であった。C-6群の細菌数は72時間後にさらに増加して約5.7 log10 CFU/幼虫になり、生存率は3%に低下した。P1群、P2群、P3群の生存率はそれぞれ90%、68%、62%と有意に高かった。幼虫の生存率が高いことは、ファ
ージ群における細菌量のさらなる減少に反映されていた。P-1では平均サルモネラ数が1 log10 CFU/幼虫、P-2では2.4 log10 CFU/幼虫、P-3では2.0 log10 CFU/幼虫であった。さ
らに、サルモネラはP-1群では14/20匹、P-2群では10/20匹、P-3群では13/20匹から回収されなかったことから、これらの幼虫における感染の完全なクリアランスが強調される。
有効性を調べた(図9aおよび9c)。24時間後、ファージを投与したすべての幼虫の平均生存率はサルモネラのみに感染した対照幼虫C-6の生存率81%に対し、90%であった。2-ファー
ジ(P-1)、3-ファージ(P-2)および4-ファージ(P-3)カクテルを予防的に投与した感染幼虫
の平均細菌数は、それぞれ2 log10、3.3 log10および3.8 log10 CFU/幼虫であった(テー
ブル3)。対照のC-6群は4.6 log10 CFU/幼虫のより高い平均細菌数であった。48時間後、C-6群のサルモネラ菌数は約4.8 log10 CFU/幼虫で、生存率は59%に低下した。サルモネラ
菌数のさらなる低下が、P-1群およびP-3群の幼虫では約3.3 log10 CFU/幼虫まで観察され、サルモネラ菌は両群の12/20幼虫で検出されなかった。対照群では、P-2は1.3 log10 CFU/幼虫のサルモネラ低下を示し、20匹中6匹の幼虫でサルモネラは検出されなかった。生
存率はP‐1、P‐2、P‐3でそれぞれ95%、81%、78%であった。C-6群の細菌数は72時間後にさらに増加して約5.7 log10 CFU/幼虫になり、生存率は3%に低下した。P1群、P2群、P3群の生存率はそれぞれ90%、68%、62%と有意に高かった。幼虫の生存率が高いことは、ファ
ージ群における細菌量のさらなる減少に反映されていた。P-1では平均サルモネラ数が1 log10 CFU/幼虫、P-2では2.4 log10 CFU/幼虫、P-3では2.0 log10 CFU/幼虫であった。さ
らに、サルモネラはP-1群では14/20匹、P-2群では10/20匹、P-3群では13/20匹から回収されなかったことから、これらの幼虫における感染の完全なクリアランスが強調される。
【0272】
ファージカクテルの同時感染
【0273】
ファージカクテルとサルモネラを同時に幼虫に経口投与し、24時間毎に72時間にわたってモニタリングした(図9bおよび9d)。24時間後、2(CoI-1)、3(CoI-2)および4ファージ(CoI-3)カクテルに同時感染させた幼虫は、81%でC-6の生存率に対して約88%以上の生存率を
示した(テーブル3)。サルモネラ菌数の低下は、幼虫群CoI-1およびCoI-2では約2.2 log10
CFU/幼虫、群CoI-3では2.8 log10 CFU/幼虫で観察された。48時間後、60%の幼虫がC-6群で生存し、84%、72%、78%の幼虫がCoI-1、CoI-2、CoI-3群で生存した。幼虫群の平均サルモネラ数はCoI-1群が2.4 log10 CFU/幼虫、CoI-2群が2.8 log10 CFU/幼虫、CoI-3群が1.9
log10 CFU/幼虫であったのに対し、C-6群の平均サルモネラ数は4.8 log10 CFU/幼虫であった。さらに、CoI-2群およびCoI-3群のいずれにおいても12/20の幼虫からサルモネラは
分離されず、CoI-1群のサルモネラは3/20の幼虫からのみ分離されなかった。72時間後、
すべてのファージカクテルにより、C-6群の幼虫の平均数と比較して、約4 log10 CFU/幼
虫数が減少した。CoI-2群およびCoI-3群の幼虫の平均生存率は65%であり、CoI-1群では、C-6群のサルモネラのみに感染した幼虫の生存率が3%であったのに対し、72%であった。サルモネラはCoI-1群、CoI-2群およびCoI-3群のそれぞれ13/20、16/20および12/20の幼虫からは分離されなかったが、C-6群のすべての幼虫からサルモネラが分離された。
示した(テーブル3)。サルモネラ菌数の低下は、幼虫群CoI-1およびCoI-2では約2.2 log10
CFU/幼虫、群CoI-3では2.8 log10 CFU/幼虫で観察された。48時間後、60%の幼虫がC-6群で生存し、84%、72%、78%の幼虫がCoI-1、CoI-2、CoI-3群で生存した。幼虫群の平均サルモネラ数はCoI-1群が2.4 log10 CFU/幼虫、CoI-2群が2.8 log10 CFU/幼虫、CoI-3群が1.9
log10 CFU/幼虫であったのに対し、C-6群の平均サルモネラ数は4.8 log10 CFU/幼虫であった。さらに、CoI-2群およびCoI-3群のいずれにおいても12/20の幼虫からサルモネラは
分離されず、CoI-1群のサルモネラは3/20の幼虫からのみ分離されなかった。72時間後、
すべてのファージカクテルにより、C-6群の幼虫の平均数と比較して、約4 log10 CFU/幼
虫数が減少した。CoI-2群およびCoI-3群の幼虫の平均生存率は65%であり、CoI-1群では、C-6群のサルモネラのみに感染した幼虫の生存率が3%であったのに対し、72%であった。サルモネラはCoI-1群、CoI-2群およびCoI-3群のそれぞれ13/20、16/20および12/20の幼虫からは分離されなかったが、C-6群のすべての幼虫からサルモネラが分離された。
【0274】
対照幼虫群
【0275】
対照幼虫群C-1、C-2、C-3、C-4およびC-5は72時間後の生存率が100%であり、これらの
群ではサルモネラは検出されなかった。ファージはC-3、C-4およびC-5群からのみ回収し
、ファージカウントは24時間毎に72時間行った(図9eおよび9f)。予防的および同時感染試験のいずれについても、対照群C-3では24時間から48時間にかけて合計ファージ数が1ログ上昇した。対照群C-4およびC-5についてはファージ力価の有意な上昇は観察されず、総ファージ力価は72時間にわたって一定に維持された。
群ではサルモネラは検出されなかった。ファージはC-3、C-4およびC-5群からのみ回収し
、ファージカウントは24時間毎に72時間行った(図9eおよび9f)。予防的および同時感染試験のいずれについても、対照群C-3では24時間から48時間にかけて合計ファージ数が1ログ上昇した。対照群C-4およびC-5についてはファージ力価の有意な上昇は観察されず、総ファージ力価は72時間にわたって一定に維持された。
【0276】
幼虫モデルにおけるファージカクテル曝露後の回収サルモネラコロニーの感度
【0277】
72時間後に幼虫から168サルモネラコロニーを回収し、2ファージカクテルに暴露した後に56コロニー、3ファージカクテルに暴露した後に56コロニー、4ファージカクテルに暴露した後に56コロニーを回収した。これらのコロニーについて、それぞれのカクテル内の個々のファージに対する感受性を検査した。全てのコロニーはそれらが曝露されたカクテル内の個々のファージに対して感受性のままであり、これは、溶解の透明なゾーンが観察されたかどうかに基づいた。各ファージ処理由来の10のサルモネラコロニーを選択し、カクテル内での個々のファージのプレート法の効率を測定し、野生型S. Typhimurium S01 160-12株と比較した(図10)。一般に、プラーク効率はすべて約1.0であり、このファージがこのin vivoモデルにおいて依然として効率的であることを示している。
【0278】
2-ファージカクテルに曝露した後に単離された3/10コロニーのような、いくつかのスクリーニングされたコロニーについて、プレーキング効率の差が観察され、SPFM14のプラーキング効率は10～19%減少した。対照的に、4/10コロニーに対するSPFM10の効率は、10～26%改善された。3-ファージカクテル、SPFM4およびSPFM10に3/10コロニーを暴露した後に
単離されたコロニーについては、SPFM19のプラーキング効率は約15%低下した。しかし、4/10コロニーでは、SPFM4およびSPFM10のプラーキング効率は10%を超えて増加した。SPFM1
0およびSPFM19の4ファージカクテル活性に曝露したコロニーでは3/10コロニーで約－15%
減少したが、SPFM14は10コロニーすべてで一貫してより高いプラーキング効率を示した。
単離されたコロニーについては、SPFM19のプラーキング効率は約15%低下した。しかし、4/10コロニーでは、SPFM4およびSPFM10のプラーキング効率は10%を超えて増加した。SPFM1
0およびSPFM19の4ファージカクテル活性に曝露したコロニーでは3/10コロニーで約－15%
減少したが、SPFM14は10コロニーすべてで一貫してより高いプラーキング効率を示した。
【0279】
SPFMファージ6種間の遺伝的差異
【0280】
分離されたサルモネラファージは、平均ヌクレオチドアイデンティティに基づいて互いに95%類似していた。一塩基多型(SNP)分析を行い、熱安定性ファージSPFM10をSPFM2、SPFM4、SPFM14、SPFM17およびSPFM19と比較した。SNPデータをテーブル6に示し、ファージ間で同定されたSNPは全体的に非常にわずかであった。5つのファージすべてにわたって同定された一貫したSNPは、仮想的なタンパク質として注釈付けされた遺伝子の一部である70,890位であった。これは、ファージSPFM10とSPFM14との間で同定された唯一のSNP差であった。対照的に、SPFM10をSPFM2、SPFM4、SPFM17およびSPFM19と比較した場合、ファージ遺伝子中のSNPはそれぞれ計3、3、5および2個同定された。同定されたすべてのSNPは、染色体分配タンパク質Smcと注釈されたゲノム57985位におけるSPFM10とSPFM17の間のSNP差を
期待して、仮定上のタンパク質中にあった。さらに、このファージを2つのジャンボファ
ージであるSPN3USおよびSEGD1と比較した。約6900以上のSNPが同定され、少なくとも1つ
のSNPがすべての注釈付き遺伝子に存在した。
期待して、仮定上のタンパク質中にあった。さらに、このファージを2つのジャンボファ
ージであるSPN3USおよびSEGD1と比較した。約6900以上のSNPが同定され、少なくとも1つ
のSNPがすべての注釈付き遺伝子に存在した。
【0281】
【表9】
【0282】
サルモネラ属 は動物と人間の食品の安全性に関する主要な懸念事項であり、MDRサルモネラ菌株による感染症の増加により、感染症に取り組むには抗生物質の代替品が必要である。ファージは、代替物を提供することができる。英国のブタに関連する流行している血清型亜型の代表株を死滅させることができる21のジャンボファージが同定された。このコレクションから6ファージを、本明細書で同定され、本明細書で考察されるように寄託さ
れたそれらの広い宿主範囲に基づいて選択した。6つのファージは全て、治療に理想的で
あろう毒性ファージの特性の1つで大きなバーストサイズおよび短い潜伏期間を有した。
大きなバーストサイズは、ファージとその標的病原体との接触の確率も増加させる。このことは感染に必須である。さらに、バーストサイズが大きいと、ファージが複製できるよりも速くバクテリアを排除していることを意味し、ファージ耐性菌が選択されるリスクを低下させる可能性がある。クレブシエラファージvB_KleM-RaK2（Simoliunas et al. 2013）およびセラチアファージMAMA1（Matilla and Salmond 2014）を含む、40分未満の同様
の短い潜伏期間および感染細胞あたり140を超えるファージの大きなバーストサイズを有
する他のジャンボファージが単離されている。
れたそれらの広い宿主範囲に基づいて選択した。6つのファージは全て、治療に理想的で
あろう毒性ファージの特性の1つで大きなバーストサイズおよび短い潜伏期間を有した。
大きなバーストサイズは、ファージとその標的病原体との接触の確率も増加させる。このことは感染に必須である。さらに、バーストサイズが大きいと、ファージが複製できるよりも速くバクテリアを排除していることを意味し、ファージ耐性菌が選択されるリスクを低下させる可能性がある。クレブシエラファージvB_KleM-RaK2（Simoliunas et al. 2013）およびセラチアファージMAMA1（Matilla and Salmond 2014）を含む、40分未満の同様
の短い潜伏期間および感染細胞あたり140を超えるファージの大きなバーストサイズを有
する他のジャンボファージが単離されている。
【0283】
6つのファージはすべて95%が互いに遺伝的に類似しており、同じ細菌受容体に結合するが、pHと温度の安定性データから、ファージ間には表現型の違いがあることが強調された。pH安定性データは、6つのファージのうち3つについて、pH 3でのファージ力価の有意な減少を示した。さらに、すべてのファージは50℃で安定であったが、他の特徴付けられたファージと一致して、ファージSPFM10およびSPFM17のみが、70℃に暴露された後に活性を保持した。しかしながら、ファージSPFM17は、50℃を超える温度でのインキュベーション後にファージ力価の有意な減少を示した。ファージSPFM10と比較して、80℃までのファージ力価の低下はなく、90℃に1時間暴露した後でさえ、55%を超えるファージ活性が残った。これは、典型的にはファージが高温に曝露される場合、ファージタンパク質に不可逆的な損傷をもたらし得、その後、ファージ感染性の喪失をもたらし得るので、非常に珍しい（Ahmadi et al. 2017）。SPFM10の自然な熱安定性はまれであり、95℃で5分間曝露した
後に20.5%のファージ活性しか保持しなかったと報告されたE. coliファージvB_Eco4M-7よりも有意に安定である(Jurczak-Kurek et al. 2016)。ファージキャプシド内で、ジスル
フィド架橋の形成は、極端な温度の間のファージの安定化に関与し得る。ファージSPFM10およびSPFM17のキャプシドにおけるジスルフィド架橋は、熱安定性の増加に寄与している可能性がある。
後に20.5%のファージ活性しか保持しなかったと報告されたE. coliファージvB_Eco4M-7よりも有意に安定である(Jurczak-Kurek et al. 2016)。ファージキャプシド内で、ジスル
フィド架橋の形成は、極端な温度の間のファージの安定化に関与し得る。ファージSPFM10およびSPFM17のキャプシドにおけるジスルフィド架橋は、熱安定性の増加に寄与している可能性がある。
【0284】
治療に使用する理想的なファージまたはファージカクテルは標的細菌種の複数のサブグループを排除するのに有効であり、ファージ耐性変異体の発生を遅らせることができるものである。SPFMファージの組合せは、単一ファージ、2ファージ、3ファージ、4ファージ
としてin vitro試験が行われ、どの組合せが代表的なS. Typhimurium MDR分離株を迅速に溶解できるかが決定された(Agency 2014)。全てのファージは、個々に試験した場合、1時間後に細菌数の1 log10 CFU/mlの低下を引き起こした。サルモネラの再増殖は1時間後、6時間後までにファージ感染培養物のサルモネラ菌数は非感染対照と同程度であり、いずれの間にも有意な差は認められなかった。これらの結果は、サルモネラ菌に対する単一ファージを用いて実施された過去の殺菌試験と一致している。
としてin vitro試験が行われ、どの組合せが代表的なS. Typhimurium MDR分離株を迅速に溶解できるかが決定された(Agency 2014)。全てのファージは、個々に試験した場合、1時間後に細菌数の1 log10 CFU/mlの低下を引き起こした。サルモネラの再増殖は1時間後、6時間後までにファージ感染培養物のサルモネラ菌数は非感染対照と同程度であり、いずれの間にも有意な差は認められなかった。これらの結果は、サルモネラ菌に対する単一ファージを用いて実施された過去の殺菌試験と一致している。
【0285】
2、3および4つのファージ組合せのファージカクテルを試験し、バクテリア溶解は2時間後に約3～4log10CFU/ml減少に改善され、S. Typhimuriumの再増殖はそれほど顕著ではな
かった。合計36の異なるファージの組み合わせをin vitroで試験した。ファージカクテルSPFM10-SPFM14およびSPFM2-SPFM10はS. Typhimuriumを溶解するのに最も有効であり、フ
ァージ療法に使用するのに理想的な候補であろう。同様に、以前の研究において、3つ（Bardina et al. 2012）、6つ（Albino et al. 2014）および10つ（Zhang et al. 2010）のファージカクテルは、サルモネラ数を約2 log10 CFU/ml減少させ得る。これは、本研究で最良の2つのファージカクテルで観察された4 log10 CFU/ml低下とは異なる。このin vitroデータは2種類のジャンボファージカクテルがサルモネラを迅速に溶解するのに有効であり、いずれの組み合わせもスクリーニングした英国の上位のブタ関連血清型の代表的分離株の100%を溶解することができたことを強調している。興味深いことに、両方のカクテルはまた、天然の熱安定性ファージSPFM10を含み、これは、おそらく、それが他の5つのフ
ァージよりも毒性であることを示し得る。なぜ細菌殺菌が3つまたは4つのファージカクテルで改善されなかったかについての可能性のある説明は、ファージが等容量で混合されたので、ファージが最終的なMOIを達成するために希釈され、そのファージ毒性が希釈され
得たことであり得る。さらに、ファージはサルモネラ細胞上の同じ受容体部位をめぐって競合しているので、1つのファージはカクテル中の他のファージと競合した可能性がある
。他のファージを打ち負かしたファージはより迅速に再生するファージ(短い潜伏期間お
よび大きなバーストサイズを有する)であり得、そしてカクテル中の他のファージが打ち
負かされたので、それはカクテルの全体的な効力を減少させる。標的病原体を減少させる際に最適なミックスを決定するためには、異なるファージの組み合わせを評価することが
重要である。
かった。合計36の異なるファージの組み合わせをin vitroで試験した。ファージカクテルSPFM10-SPFM14およびSPFM2-SPFM10はS. Typhimuriumを溶解するのに最も有効であり、フ
ァージ療法に使用するのに理想的な候補であろう。同様に、以前の研究において、3つ（Bardina et al. 2012）、6つ（Albino et al. 2014）および10つ（Zhang et al. 2010）のファージカクテルは、サルモネラ数を約2 log10 CFU/ml減少させ得る。これは、本研究で最良の2つのファージカクテルで観察された4 log10 CFU/ml低下とは異なる。このin vitroデータは2種類のジャンボファージカクテルがサルモネラを迅速に溶解するのに有効であり、いずれの組み合わせもスクリーニングした英国の上位のブタ関連血清型の代表的分離株の100%を溶解することができたことを強調している。興味深いことに、両方のカクテルはまた、天然の熱安定性ファージSPFM10を含み、これは、おそらく、それが他の5つのフ
ァージよりも毒性であることを示し得る。なぜ細菌殺菌が3つまたは4つのファージカクテルで改善されなかったかについての可能性のある説明は、ファージが等容量で混合されたので、ファージが最終的なMOIを達成するために希釈され、そのファージ毒性が希釈され
得たことであり得る。さらに、ファージはサルモネラ細胞上の同じ受容体部位をめぐって競合しているので、1つのファージはカクテル中の他のファージと競合した可能性がある
。他のファージを打ち負かしたファージはより迅速に再生するファージ(短い潜伏期間お
よび大きなバーストサイズを有する)であり得、そしてカクテル中の他のファージが打ち
負かされたので、それはカクテルの全体的な効力を減少させる。標的病原体を減少させる際に最適なミックスを決定するためには、異なるファージの組み合わせを評価することが
重要である。
【0286】
MDR サルモネラ株を除去するためのファージカクテルの有効性をin vivo幼虫感染モデ
ルで試験し、ファージ効率をin vitroとin vivoで比較した。3つのカクテル：SPFM10-SPFM14；SPFM4-SPFM10-SPFM19；およびSPFM2-SPFM10-SPFM14-SPFM19を試験し、予防的に投与し、同時感染させた。in vitroデータと同様に、ファージカクテルSPFM10-SPFM14は両処
理を介して感染を除去するのに最も優れており、幼虫の生存率を有意に改善し、72時間後には、65%以上の幼虫からサルモネラが回収されなかった。この結果は、このカクテルが
治療に理想的であることを示すさらなる証拠を提供している。また、MOI 100で投与した6種類のファージカクテルのように、緑膿菌に感染する2時間前に、24時間後に幼虫の生存
率を80%向上させることができたなど、他の幼虫研究でも、標的細菌を除去するファージ
カクテルの同様の有効性が観察されている（Beeton et al. 2015）。別の独立した研究では、毒性P. aeruginosa株に感染させた場合、異なる6種類のカクテルにより幼虫の生存率が30%改善されることが示された(Forti et al. 2018)。in vitroでの3および4ファージカクテルの有効性は低かったにもかかわらず、いずれのカクテルも幼虫の生存率およびサルモネラクリアランスを改善したが、3ファージカクテルは同時感染した場合に効率が高か
った。結果はin vitro殺傷データがin vivoで一貫して相関しないことを強調し、幼虫感
染モデルにおけるファージカクテルのスクリーニング有効性はファージカクテルの毒性を評価する改善された方法であり得る（Seed and Dennis 2009; Nale, Chutia, et al. 2016; Abbasifar et al. 2014; Manohar, Nachimuthu, and Lopes 2018)。我々の知る限り、これは幼虫感染モデルにおいてMDR S. Typhimuriumに対するjumboファージの活性を評価
した最初の研究であり、jumboファージを使用した最初の研究である。
ルで試験し、ファージ効率をin vitroとin vivoで比較した。3つのカクテル：SPFM10-SPFM14；SPFM4-SPFM10-SPFM19；およびSPFM2-SPFM10-SPFM14-SPFM19を試験し、予防的に投与し、同時感染させた。in vitroデータと同様に、ファージカクテルSPFM10-SPFM14は両処
理を介して感染を除去するのに最も優れており、幼虫の生存率を有意に改善し、72時間後には、65%以上の幼虫からサルモネラが回収されなかった。この結果は、このカクテルが
治療に理想的であることを示すさらなる証拠を提供している。また、MOI 100で投与した6種類のファージカクテルのように、緑膿菌に感染する2時間前に、24時間後に幼虫の生存
率を80%向上させることができたなど、他の幼虫研究でも、標的細菌を除去するファージ
カクテルの同様の有効性が観察されている（Beeton et al. 2015）。別の独立した研究では、毒性P. aeruginosa株に感染させた場合、異なる6種類のカクテルにより幼虫の生存率が30%改善されることが示された(Forti et al. 2018)。in vitroでの3および4ファージカクテルの有効性は低かったにもかかわらず、いずれのカクテルも幼虫の生存率およびサルモネラクリアランスを改善したが、3ファージカクテルは同時感染した場合に効率が高か
った。結果はin vitro殺傷データがin vivoで一貫して相関しないことを強調し、幼虫感
染モデルにおけるファージカクテルのスクリーニング有効性はファージカクテルの毒性を評価する改善された方法であり得る（Seed and Dennis 2009; Nale, Chutia, et al. 2016; Abbasifar et al. 2014; Manohar, Nachimuthu, and Lopes 2018)。我々の知る限り、これは幼虫感染モデルにおいてMDR S. Typhimuriumに対するjumboファージの活性を評価
した最初の研究であり、jumboファージを使用した最初の研究である。
【0287】
幼虫感染モデルにおいて3種類の異なるファージカクテルに曝露された後に分離された
コロニーはカクテルを用いた個々のファージに対して感受性を維持したが、このことは我々がファージ耐性サルモネラ細胞を分離しなかったことを示している。さらに、ファージは回収されたコロニー上で依然として高いプラーク形成効率を有し、野生型株と比較した場合、同程度に感染する可能性があった。
コロニーはカクテルを用いた個々のファージに対して感受性を維持したが、このことは我々がファージ耐性サルモネラ細胞を分離しなかったことを示している。さらに、ファージは回収されたコロニー上で依然として高いプラーク形成効率を有し、野生型株と比較した場合、同程度に感染する可能性があった。
【0288】
6つのSPFMファージ間の表現型の相違のため、ファージ間の遺伝的相違を同定するため
にSNP分析を行った。耐熱性ファージSPFM10を他の5種類のSPFMファージと比較したところ、両者の間にSNPは非常に少ない。5つのファージすべてにおいて、ゲノム70890位の仮想
タンパク質にSNPが存在し、SNPはポジティブセレクションを受け、自然に突然変異を起こしやすいタンパク質に存在していた。HHpredを用いたさらなる分析から、この遺伝子はC-末端ペクチン酸リアーゼドメインにヒットし(確率98%)、ファージ尾部繊維の形成に関与
している可能性が高いと予測された。ペクチン酸リアーゼドメイン機能は、グリコシド結合を切断することが予測され、そしてサルモネラの表面上の多糖類の分解に関与し得、従って、ファージ宿主範囲において重要な役割を果たし得る。さらに、このSNPはSPFM10とSPFM14との間の唯一の相違として熱安定性において役割を果たす可能性があり、後者のフ
ァージは、SPFM10の90℃までの熱安定性に対し、は50℃でのみ安定である。SPFM10とファージSPFM2、SPFM4、SPFM17およびSPFM19の間のさらなるSNPが別の予測されたペクチン酸
リアーゼタンパク質で同定され、これもポジティブセレクション下にあることが示された。このタンパク質は宿主相互作用遺伝子である可能性が高いので、突然変異を起こしやすいはずである。SPFM10と比較した場合、SPFM17でのみ、染色体パーティションタンパク質と仮想タンパク質でさらに2つのSNPが同定された。SPFM17はまた、70℃までの高温に耐性であり、これらの2つのSNPの添加は、それらがファージに独特であるので、安定化において潜在的に役割を果たし得る。再び、さらなる突然変異誘発分析が、両方のSNPの存在が
熱安定性においてどれほど重要であるかを決定するために必要とされる。
にSNP分析を行った。耐熱性ファージSPFM10を他の5種類のSPFMファージと比較したところ、両者の間にSNPは非常に少ない。5つのファージすべてにおいて、ゲノム70890位の仮想
タンパク質にSNPが存在し、SNPはポジティブセレクションを受け、自然に突然変異を起こしやすいタンパク質に存在していた。HHpredを用いたさらなる分析から、この遺伝子はC-末端ペクチン酸リアーゼドメインにヒットし(確率98%)、ファージ尾部繊維の形成に関与
している可能性が高いと予測された。ペクチン酸リアーゼドメイン機能は、グリコシド結合を切断することが予測され、そしてサルモネラの表面上の多糖類の分解に関与し得、従って、ファージ宿主範囲において重要な役割を果たし得る。さらに、このSNPはSPFM10とSPFM14との間の唯一の相違として熱安定性において役割を果たす可能性があり、後者のフ
ァージは、SPFM10の90℃までの熱安定性に対し、は50℃でのみ安定である。SPFM10とファージSPFM2、SPFM4、SPFM17およびSPFM19の間のさらなるSNPが別の予測されたペクチン酸
リアーゼタンパク質で同定され、これもポジティブセレクション下にあることが示された。このタンパク質は宿主相互作用遺伝子である可能性が高いので、突然変異を起こしやすいはずである。SPFM10と比較した場合、SPFM17でのみ、染色体パーティションタンパク質と仮想タンパク質でさらに2つのSNPが同定された。SPFM17はまた、70℃までの高温に耐性であり、これらの2つのSNPの添加は、それらがファージに独特であるので、安定化において潜在的に役割を果たし得る。再び、さらなる突然変異誘発分析が、両方のSNPの存在が
熱安定性においてどれほど重要であるかを決定するために必要とされる。
【0289】
以下に述べる研究では、英国のニワトリに関連する上位の血清型に対するファージの感
染能について述べる。
染能について述べる。
【0290】
実験手順
【0291】
細菌株と増殖条件
【0292】
本研究では、合計18株のサルモネラ株を調べた。全Salmonella enterica亜種enterica
株が、2015年から2017年の間に英国のニワトリから英国のWeybridgeのAnimal and Plant health Agency(APHA)によりを分離された(テーブル7)。これらの株から、血清型は3 S. 13,23:i＞；5 S. Enteritidis；4 S. Infantis；3 S. Ohio および 3 S. Seftenbergであ
った。
株が、2015年から2017年の間に英国のニワトリから英国のWeybridgeのAnimal and Plant health Agency(APHA)によりを分離された(テーブル7)。これらの株から、血清型は3 S. 13,23:i＞；5 S. Enteritidis；4 S. Infantis；3 S. Ohio および 3 S. Seftenbergであ
った。
【0293】
【表10】
【0294】
ファージの単離、精製および増殖
【0295】
精製ファージ溶解物の体積の増加は、107 PFU/mlファージに感染したサルモネラのSL1344(107 CFU/ml)の指数関数的増殖液培養物を、NZCYM培養液中、37℃で、振盪(100rpm)し
ながら6時間混合することによって行った。ファージ培養物を4,200×gで15分間遠心分離
し、上清を孔径0.22μmのフィルタで濾過し、ファージ溶解物を4℃で保存した。ファージ力価を決定するために、ファージ溶解物を10倍連続希釈し、小滴プラークアッセイ法(Mazzocco et al., 2009)をLB1%寒天プレート上で使用した。最終ファージ力価をPFU/mlとし
て表した。
ながら6時間混合することによって行った。ファージ培養物を4,200×gで15分間遠心分離
し、上清を孔径0.22μmのフィルタで濾過し、ファージ溶解物を4℃で保存した。ファージ力価を決定するために、ファージ溶解物を10倍連続希釈し、小滴プラークアッセイ法(Mazzocco et al., 2009)をLB1%寒天プレート上で使用した。最終ファージ力価をPFU/mlとし
て表した。
【0296】
ファージホストレンジ分析とプレーティングの効率化
【0297】
個々のファージの宿主範囲を、異なるSalmonella enterica亜種enterica血清型に対す
る小滴プラークアッセイ法(Mazzocco et al., 2009)によって測定し、37℃で18時間イン
キュベートした。プレートはクリアリングまたはプラークを介したバクテリア溶解、または感染がないかのいずれかについて検査し、3つの生体情報反復試験から平均観察を記録
し、それぞれ3つの技術的反復試験を行った。
る小滴プラークアッセイ法(Mazzocco et al., 2009)によって測定し、37℃で18時間イン
キュベートした。プレートはクリアリングまたはプラークを介したバクテリア溶解、または感染がないかのいずれかについて検査し、3つの生体情報反復試験から平均観察を記録
し、それぞれ3つの技術的反復試験を行った。
【0298】
宿主範囲分析
【0299】
SPFM2、4、10、14、17および19のファージの有効性を、ニワトリから分離された18のSalmonella enterica亜種enterica株について試験した。18株はすべて、英国のブタ関連サ
ルモネラ血清型の上位を占める代表株、すなわちS. 13,23:i＞、S. Enteritidis、S. Infantis、S. OhioおよびS. Seftenbergである。すべてのファージはすべてのS. Enteritidis株に感染する可能性があった。ファージSPFM2、SPFM14およびSPFM19は、すべてのS. Infantis株で濁りクリアリングを生じ、血清型S. Seftenbergの代表株には感染できなかった。ファージSPFM4およびSPFM17はすべてのS. Infantis株を溶解でき、S. Seftenberg株の1/3しか溶解できなかった。
ルモネラ血清型の上位を占める代表株、すなわちS. 13,23:i＞、S. Enteritidis、S. Infantis、S. OhioおよびS. Seftenbergである。すべてのファージはすべてのS. Enteritidis株に感染する可能性があった。ファージSPFM2、SPFM14およびSPFM19は、すべてのS. Infantis株で濁りクリアリングを生じ、血清型S. Seftenbergの代表株には感染できなかった。ファージSPFM4およびSPFM17はすべてのS. Infantis株を溶解でき、S. Seftenberg株の1/3しか溶解できなかった。
【0300】
【表11】
【0301】
本発明は特定の例を参照して具体的に示され、説明されてきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細に様々な変更を加えることができることが、当業者には理解されよう。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図12-4】
【配列表】