特許 7527038 カンナビノイド及び他のプレニル化化合物を産生するための生合成プラットフォーム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-25

(45)【発行日】2024-08-02

(54)【発明の名称】カンナビノイド及び他のプレニル化化合物を産生するための生合成プラットフォーム

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/10 20060101AFI20240726BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240726BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240726BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240726BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240726BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240726BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20240726BHJP

   C12P 7/42 20060101ALN20240726BHJP

【ＦＩ】

C12N9/10

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/54

C12P7/42 ZNA

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2022537303

(86)(22)【出願日】2020-12-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-06

(86)【国際出願番号】 US2020067032

(87)【国際公開番号】W WO2021134024

(87)【国際公開日】2021-07-01

【審査請求日】2022-07-06

(31)【優先権主張番号】62/953,719

(32)【優先日】2019-12-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ

(74)【代理人】

【識別番号】110003007

【氏名又は名称】弁理士法人謝国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】ボウイ、ジェームズ ユー

(72)【発明者】

【氏名】コーマン、タイラー ピー

(72)【発明者】

【氏名】ヴァリエール、ミーガン

【審査官】大西 隆史

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／１８３１５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１０／０２８５５０２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／１７３７７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】VALLIER, Meaghan A. et al.，Nature Communications，2019年02月04日，Vol. 10, Article No. 565，pp. 1-9，DOI: 10.1038/s41467-019-08448-y

【文献】CHATZIVASILEIOU, Alkiviadis Orfefs et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2018年12月24日，Vol. 116, No. 2，pp. 506-511，DOI: 10.1073/pnas.1812935116

【文献】GAGNE, Steve J. et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012年07月31日，Vol. 109, No. 31，pp. 12811-12816，DOI: 10.1073/pnas.1200330109

【文献】QIAN, Shuai et al.，Biotechnology and Bioengineering，2019年05月，Vol. 116, No. 5，pp. 1116-1127，DOI: 10.1002/bit.26932

【文献】ZHAO, Huimin and VAN DER DONK, Wilfred A.，Current Opinion in Biotechnology，2003年12月，Vol. 14, No. 6，pp. 583-589，DOI: 10.1016/j.copbio.2003.09.007

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Y288X、A232S、M14I、Y31W、T69P、T77I、T98I、S136A、E222D、G224S、N236T、及びG297K変異を有する、配列番号:30の配列であって、ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である配列を含む、組換えポリペプチドであって、前記配列が、1～20の保存的なアミノ酸置換をさらに含み、前記組換えポリペプチドは、NphB活性、および野生型NphBと比較して向上した熱安定性を有する、組換えポリペプチド。

【請求項2】

ゲラニルピロリン酸(GPP)およびオリベトリン酸塩（OA）またはジバリン酸（DA）、あるいはGPPおよび2,4-ジヒドロキシ安息香酸からカンナビゲロリン酸（CBGA）またはカンナビゲロバリン酸（CBG(V)A）を産生する方法であって、請求項１に記載の組換えポリペプチドをGPPおよびOAまたはDA、あるいはGPPおよび2,4-ジヒドロキシ安息香酸とインキュベートすることを含む、CBGAまたはCBG(V)Aを産生する方法。

【請求項3】

請求項１に記載の組換えポリペプチド、とイソプレノールまたはプレノールをゲラニルピロリン酸(GPP)に変換する複数の酵素とを含む、組換え経路における酵素組成物。

【請求項4】

アデノシン二リン酸（ADP）及び/またはアデノシン一リン酸（AMP）をアデノシン三リン酸（ATP）に変換するATP再生酵素をさらに含み、
前記ATP再生酵素が、アセチルリン酸を酢酸に変換する、請求項３に記載の酵素組成物。

【請求項5】

前記経路が、以下の酵素を含む、請求項３または４に記載の酵素組成物：
(i)アセチルリン酸転移酵素(PTA)；
(ii)マロン酸脱炭酸酵素αサブユニット(mdcA)；
(iii)アシル活性化酵素3(AAE3)；
(iv)オリベトール合成酵素(OLS)；
(v)オリベトリン酸環化酵素(OAC)；
(vi)ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ(ThiM)；
(vii)イソペンテニルキナーゼ(IPK)；
(viii)イソペンチル二リン酸異性化酵素(IDI)；
(ix)ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素αサブユニット(MDCa)；及び
(x)ゲラニル-PP合成酵素(GPPS)またはファルネシル-PP合成酵素変異体S82F (FPPS S82F)。

【請求項6】

前記経路には、BSAが補充される、請求項５に記載の酵素組成物。

【請求項7】

前記経路には、アセチルリン酸、マロネート、ヘキサノエートまたはブチレート、及びプレノールまたはイソプレノールが補充される、請求項５に記載の酵素組成物。

【請求項8】

前記経路が、カンナビジオール酸合成酵素をさらに含む、請求項７に記載の酵素組成物。

【請求項9】

前記経路が、カンナビジオール酸を産生する、請求項８に記載の酵素組成物。

【請求項10】

カンナビゲロリン酸またはカンナビゲロバリン酸の産生のための無細胞の酵素的システムであって、該経路は、
(i)アセチルリン酸転移酵素(PTA)；
(ii)マロン酸脱炭酸酵素αサブユニット(mdcA)；
(iii)アシル活性化酵素3(AAE3)；
(iv)オリベトール合成酵素(OLS)；
(v)オリベトリン酸環化酵素(OAC)；
(vi)ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ(ThiM)；
(vii)イソペンテニルキナーゼ(IPK)；
(viii)イソペンチル二リン酸異性化酵素(IDI)；
(ix)ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素αサブユニット(MDCa)；
(x)ゲラニル-PP合成酵素(GPPS)またはファルネシル-PP合成酵素変異体S82F (FPPS S82F)および
(xi)請求項１に記載の組換えポリペプチドを含む、無細胞の酵素的システム。

【請求項11】

請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。

【請求項12】

請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項13】

請求項１１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、組換え微生物。

【請求項14】

請求項１２に記載のベクターを含む、組換え微生物。

【発明の詳細な説明】

【関連出願への相互参照】

【0001】

本願は、2019年12月26日に出願された米国仮出願シリアル番号62/953,719の優先権を主張する。その開示の全てが参照により本明細書に組み込まれる。

【政府援助研究に関する陳述】

【0002】

本発明は、米国エネルギー省から助成番号DE-AR0000556の政府支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
（配列表）

【0003】

本願は、ASCIIフォーマットの電子形態で提出された配列表を含む。その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2020年12月24日に作成された該ASCIIコピーは、Sequence_Listing_ST25.txtと命名され、207,506バイトのサイズを有する。

【技術分野】

【0004】

適切な基質を、本開示の代謝的に修飾された微生物、または酵素的な調製物または組成物と接触させることによる、カンナビノイド及び他のプレニル化された化学物質や化合物を産生する方法が提供される。

【背景】

【0005】

天然化合物をプレニル化することによって、構造的な多様性が増し、生物学的活性が変化し、また治療的潜在力が高まる。プレニル化化合物は、しばしば、天然における存在量が少ないか、または単離が困難である。いくつかのプレニル化天然物には、薬効が実証された生物活性分子の大きなクラスが含まれる。その例としては、プレニルフラバノイド、プレニルスチルベノイド、及びカンナビノイドが挙げられる。

【0006】

カンナビノイドは、ヒトのエンドカンナビノイド系のカンナビノイド受容体(CB1及びCB2)を調節する天然物由来の生物活性植物の大きなクラスである。カンナビノイドは、有望な薬理学的作用を有し、抗ウイルス剤、抗痙攣薬、鎮痛薬、及び抗うつ薬としての治療効果を調べる100以上の臨床試験が行われている。さらに、3つのカンナビノイド製剤は、化学療法に誘発された悪心、MS痙攣、及び重症てんかん関連の発作を治療するためFDAに承認された。

【0007】

治療上の可能性にもかかわらず、医薬品級のカンナビノイド(>99%)の製造は、依然として大きな技術的課題に直面している。マリファナ及びアサのような大麻植物は、種々のより少量のカンナビノイドと共に、大量のテトラヒドロカンナビノール酸(THCA)及びカンナビジオール酸(CBDA)を産生する。しかし、汚染させるカンナビノイドと構造的によく類似し、また、作物によってカンナビノイドの組成が変動することから、CBDA及びTHCAのような大量に発現されたカンナビノイドでさえ単離することが困難である。稀なカンナビノイドを単離しようとする際に、これらの問題はさらに顕著に現れる。さらに、現在大麻の栽培は、重大な環境問題を直面している。従って、カンナビノイド及びその類縁物質を製造するための代替法の開発にはかなりの関心がある。

【概要】

【0008】

本開示は、CBG(V)Aを産生するための人工的なin vitro酵素経路を提供する。該経路は、以下を含む：(a)(1)プレノールとATPをプレノールリン酸とADPに変換する酵素、プレノールリン酸とATPをジメチルアリル二リン酸（DMAPP）に変換する酵素、及び/または(2)イソプレノールとATPをイソプレノールリン酸とADPに変換する酵素、イソプレノールリン酸とATPをイソペンテニル二リン酸（IPP）に変換する酵素；(b)DMAPPをIPPに、及び/またはIPPをDMAPPに異性化する酵素；(c)DMAPP及びIPPをゲラニルピロリン酸(GPP)に変換する酵素；及び(d)GPP及びオリベトリン酸またはジバリン酸または同様の化合物をCBG(V)Aまたはその変異体に変換する酵素。一実施形態では、インプット基質は、オリベトリン酸またはジバリン酸、プレノール及び/またはイソプレノールである。別のまたはさらなる実施形態では、該経路は、前記ADPを部分(a)からATPに変換するATP生成システムを含む。

【0009】

本開示はまた、図1A-Bに示された酵素スキームまたは経路も提供する。

【0010】

本開示はまた、以下からなる群から選択された配列を含む組換えポリペプチドを提供する：(i)Y288X、A232S、及びT69P、T98I、及びG224Sからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(ii)Y288X、A232S、及びT69P、T98I、G224S、及びT126Pからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(iii)Y288X、A232S、及びM14I、Y31W、T69P、T77I、T98I、S136A、E222D、G224S、N236T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(iv)Y288X、A232S、及びM14I、Y31W、T69P、T77I、E80A、D93S、T98I、T126P、M129L、G131Q、S136A、E222D、G224S、N236T、S277T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(v)Y288X、A232S、及びM14I、L33I、Y31W、T69P、T77I、V78A、E80A、D93S、T98I、E112G、T114V、T126P、M129L、G131Q、S136A、E222D、G224S、K225Q、N236T、S277T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(vi)1～20の保存的なアミノ酸置換をさらに含み、かつNphB活性を有する(i)～(iv)または(v) のいずれか；(vii)(i)～(iv)または(v)の配列と少なくとも85%、90%、95%、98%または99%同一であり、かつNphB活性を有する配列。

【0011】

本開示はまた、GPP及びオリベトリン酸塩（OA）またはジバリン酸（DA）からCBG(V)Aを産生する方法、または、GPP及び2,4-ジヒドロキシ安息香酸またはその誘導体からCBGXAを産生する方法を提供する。これら方法は、それぞれCBG(V)AまたはCBG(X)Aを産生する条件下で、GPP及びOAまたはDA、またはGPP及び2,4-ジヒドロキシ安息香酸誘導体を本開示の組換えポリペプチドとインキュベートすることを含む。

【0012】

本開示はまた、本開示のポリペプチド及びプレノールまたはイソプレノールをゲラニルピロリン酸(GPP)に変換する複数の酵素を含む組換え経路を提供する。一実施形態では、該経路は、ATP再生モジュールをさらに含む。別のまたはさらなる実施形態では、該ATP再生モジュールは、アセチルリン酸を酢酸に変換する。前述の実施形態のいずれかのさらに別のまたはさらなる実施形態では、該経路は、次の酵素を含む：(i)アセチルリン酸転移酵素(PTA)；(ii)マロン酸脱炭酸酵素αサブユニット(mdcA)；(iii)アシル活性化酵素3(AAE3)；(iv)オリベトール合成酵素（OLS）；(v)オリベトリン酸環化酵素（OAC）；(vi)ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ThiM）；(vii)イソペンテニルキナーゼ（IPK）；（viii）イソペンテニル二リン酸異性化酵素(IDI)；(ix)ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素αサブユニット(MDCa)；(x)ゲラニル-PP合成酵素(GPPS)またはファルネシル-PP合成酵素変異体S82F(FPPS S82F)；及び(xi)プレニル化活性を有する本開示の組換えポリペプチド。別のまたはさらなる実施形態では、該経路にはBSAが補充される。さらに別の実施形態では、該経路には、アセチルリン酸、マロネート、ヘキサノエート、またはブチレート、及びイソプレノールまたはプレノールが補充される。さらに別の実施形態では、該経路は、カンナビジオール酸合成酵素をさらに含む。別のまたはさらなる実施形態では、該経路は、カンナビジオール酸を産生する。

【0013】

本開示はまた、プレニル化活性を有する本開示の組換えポリペプチド及びプレノールまたはイソプレノールをゲラニルピロリン酸(GPP)に変換する複数の酵素を含む組換え経路を提供する。

【0014】

本開示はまた、ゲラニルピロリン酸を産生するための無細胞の酵素的システムを提供する。該経路は、以下を含む：(i)アセチルリン酸転移酵素(PTA)；(ii)マロン酸脱炭酸酵素αサブユニット(mdcA)；(iii)アシル活性化酵素3(AAE3)；(iv)オリベトール合成酵素(OLS)；(v)オリベトリン酸環化酵素（OAC）;(vi)ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ThiM）；(vii)イソペンテニルキナーゼ（IPK）；（viii）イソペンチル二リン酸異性化酵素(IDI)；(ix)ジホスホメバロン酸脱炭酸酵素αサブユニット(MDCa)；(x)ゲラニル-PP合成酵素(GPPS)またはファルネシル-PP合成酵素変異体S82F(FPPS S82F)；及び(xi)(a)Y288X、A232S、及びT69P、T98I、及びG224Sからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(b)Y288X、A232S、及びT69P、T98I、G224S、及びT126Pからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(c)Y288X、A232S、及びM14I、Y31W、T69P、T77I、T98I、S136A、E222D、G224S、N236T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(d)Y288X、A232S、及びM14I、Y31W、T69P、T77I、E80A、D93S、T98I、T126P、M129L、G131Q、S136A、E222D、G224S、N236T、S277T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(e)Y288X、A232S、及びM14I、L33I、Y31W、T69P、T77I、V78A、E80A、D93S、T98I、E112G、T114V、T126P、M129L、G131Q、S136A、E222D、G224S、K225Q、N236T、S277T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(f)1～20の保存的なアミノ酸置換をさらに含み、かつNphB活性を有する(a)～(d)または(e)のいずれか；(g)(a)～(d)または(e)の配列と少なくとも85%、90%、95%、98%または99%同一であり、かつNphB活性を有する配列からなる群から選択される配置を含む組換えポリペプチド。

【0015】

本開示はまた、(i)Y288X、A232S、及びT69P、T98I、及びG224Sからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(ii)Y288X、A232S、及びT69P、T98I、G224S、及びT126Pからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(iii)Y288X、A232S、及びM14I、Y31W、T69P、T77I、T98I、S136A、E222D、G224S、N236T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(iv)Y288X、A232S、及びM14I、Y31W、T69P、T77I、E80A、D93S、T98I、T126P、M129L、G131Q、S136A、E222D、G224S、N236T、S277T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(v)Y288X、A232S、及びM14I、L33I、Y31W、T69P、T77I、V78A、E80A、D93S、T98I、E112G、T114V、T126P、M129L、G131Q、S136A、E222D、G224S、K225Q、N236T、S277T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30（ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である）；(vi)1～20の保存的なアミノ酸置換をさらに含み、かつNphB活性を有する(i)～(iv)または(v)のいずれか；(vii)(i)～(iv)または(v)の配列と少なくとも85%、90%、95%、98%または99%同一であり、かつNphB活性を有する配列からなる群から選択されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0016】

本開示はまた、本開示の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

【0017】

本開示はまた、本開示の単離されたポリヌクレオチドまたは本開示のベクターを含む組換え微生物も提供する。

【0018】

本開示の1つ以上の実施形態の詳細は、添付図面及び以下の説明に記載されている。他の特徴、目的、及び利点は、こられの記載及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0019】

本明細書に組み込まれて、本明細書の一部を構成する添付図面は、本開示の1つ以上の実施形態を例示し、詳細な説明と共に、本発明の原理及び実施形態を説明する。

【0020】

【図1A-B】本開示のカンナビノイド産生のために設計された無細胞系を示す。(A)GPPは、イソプレノイドモジュール経路(暗青色の経路；左上)に由来する。芳香族ポリケチドOAまたはDAは、ヘキサノエート(またはブチレート)及びマロネート(緑色の経路)に由来する。マロニル-CoAは、MdcA(星印)を用いてアセチル-CoAからのCoAの非自然転写を介してマロネートから産生される。アセチルCoAは、アセチルリン酸に由来し、これはまた、ATPを再生するためにも使用される(赤色の経路；右上)。芳香族ポリケチドは、設計されたCBGA合成酵素を用いてイソプレノイドモジュールに由来するGPPからプレニル化され、これにより、CBG(V)カンナビノイドが得られる。この図は、無細胞系の一部ではないが、どのようにCBG(V)Aを単一の酵素ステップで多くの追加の医学的に興味深いカンナビノイドに変換することができるかを示す。使用される酵素及び略語は、表1に列挙されている。(B)は、本開示の経路の代替的な描写を示す。R=アルキル基；インプットは、オリベトリン酸塩、プレノールまたはイソプレノール、またはプレノールとイソプレノールの両方のような芳香族ポリケチドである。プレノール及びイソプレノールの両方が使用される場合、IDIは必要ではなく；異なるATP生成システムを使用することができ、これは、Zhaoら、"生体触媒で使用するための補助因子の再生"、Curr Opin Biotechnol., 14(6):583-9, 2003を含むが、これに限定されない。

【0021】

【図2A-F】OA/DA合成試験を示す。(A)OA/DA産生を試験するための簡略化されたMatB経路。(B)MatB経路を用いた経時的なOA(■)またはDA(●)力価。(C) 添加剤のMatB経路を用いたOAまたはDA産生への効果。時間ゼロで添加剤を反応に加え、対照と比較した4時間でのOAまたはDA力価をプロットした。エラーバーは、生物的反復の標準偏差を表す。(D)MdcAを用いて、ヘキサノエート、マロネート及びAcpから、マロニル-CoAを産生するOA/DA産生のためのスキーム。(E)パネルDにおけるMdcAシステムを用いた芳香族ポリケチドOA(■)及びDA(●)の産生。時間経過は、BSAの存在下（塗りつぶされた形状）または非存在下（輪郭の形状）で実行された。(F)イソプレノール及びそれぞれ添加されたOAまたはDAからのCBGA(■)及びCBGVA(●)の産生。エラーバーは、生物的反復の標準偏差を表す。

【0022】

【図3A-C】カンナビノイド全合成のシステムの実施を示す。(A)インプットのイソプレノール、アセチルリン酸、マロネート、ヘキサノエート(またはブチレート)をCBGA(■)またはCBGVA(●)に変換する時間経過。(B)全システムにおける中間体の産生。OA産生(黒色の●)、CBGA産生(緑色の▲)、及びGPP産生(青色■)について、CBGAを産生する反応を監視した。(C)酵素のリサイクル。6時間で、CBGA産生の反応から酵素を濃縮し、洗浄して代謝物を除去した。新鮮なインプットと補助因子で新たな反応を設定し、さらに31時間後に反応を停止させた。初期反応の力価(初期値)及び初期反応及びリサイクル反応の総力価を示す(リサイクルされた酵素)。エラーバーは、生物複製の標準偏差を表す。

【0023】

【図4】生成物特異性に対するOLS及びAAE3濃度の効果を示す。CsOLS濃度対生成物特異性は、3つの異なるAAE3濃度でプロットされる。CsOLSまたはCsAAE3濃度が増加すると、生成物特異性の低下が観察された。

【0024】

【図5A-B】は、酵素活性のOA及びDA阻害を示す。(A)4種の酵素について、5 mM OA(青色)とDA(緑色)における残存活性の百分率を示す。(B)反応の関連条件において、CsOLSは、OAに最も阻害される。

【0025】

【図6】GPPによるOA及びCBGA産生の阻害を示す。RpMatB反応系は、OAを産生するために使用され、このOAは、添加されたGPPによってプレニル化され、NphBM31^sによって触媒され得る。GPPの増加は、OA及びCBGAの全体的な産生の減少をもたらし、これは、GPPが該OA経路を阻害することを示す。

【0026】

【図7】CBGA力価を初期AcP濃度の関数として示す。AcP濃度を、50 mMを超えて増加させると、CBGA力価が低下するため、50 mMの初期AcP濃度を使用した。

【0027】

【図8】MdcAを用いてマロニル-CoAを産生するOA力価に対するBSAの効果を示す。BSA滴定データに示されたように、BSAが40 mg/mLに増加したときに最小限の改善しかなかったため、20 mg/mLのBSAを後続の反応で使用する必要がある。

【0028】

【図9】CBGA産生に対する酢酸塩及びリン酸塩の効果を示す。酢酸塩またはリン酸塩の初期濃度を0から100 mMまで変化させても、インプットとしてイソプレノール及びOAを使用した場合、CBGA産生に対する効果は最小限であった。

【0029】

【図10】NphB M31の安定化を示す。親酵素NphB M31及び新酵素NphB M31^sについて、種々の温度で20分間インキュベートした後の残存活性が示されている。

【発明の詳細な説明】

【0030】

本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用されるように、単数形"1つの"及び"該"は、文脈が明確に指示しない限り、複数の参照対象を含む。従って、例えば、"1つのポリヌクレオチド"に言及することは、複数のこのようなポリヌクレオチドを含み、また、"該酵素"に言及することは、1つ以上の酵素を参照することを含む等。

【0031】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料と類似または同等のものを用いて、本開示の方法及び組成物を実施できるが、本明細書には例示的な方法、装置及び材料が記載されている。

【0032】

また、特に断らない限り、"または"は、"及び/または"に意味する。同様に、"含む"、"含んでいる"、"包含する"、及び"包含している"は、交換可能であり、限定を意図するものではない。

【0033】

さらに理解されたいこととして、様々な実施形態の記載において"含んでいる"という表現が用いられる場合、当業者は、特定の場合では"本質的に・・・からなる"または"・・・からなる"との表現を用いて一実施形態を代替的に記述できることを理解するであろう。

【0034】

上記及び本文を通して論じられる刊行物は、本願の出願日以前の開示のためのみ提供される。本明細書のいかなるものも、本発明者が事前の開示により、そのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。

【0035】

本明細書で使用されるように、酵素の"活性"は、代謝物を産生する反応を触媒する能力の尺度であり、即ち"機能"することであり、該反応の代謝物が生成される速度として表され得る。例えば、酵素活性は、単位時間あたりまたは酵素単位(例えば、濃度または重量)あたりに生成される代謝物の量、または親和性または解離定数で表すことができる。

【0036】

"細菌"、または"真正細菌"は、原核生物のドメインを指す。細菌は、次の少なくとも11の明確なグループを含む：(1)グラム陽性(グラム+)細菌、それに２つの主要な下位区分がある：(i)高G+C群(放線菌、マイコバクテリア、ミクロコッカス、その他)、(ii)低G+C群(バチルス、クロストリジウム、乳酸菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、マイコプラズマ)、(2)プロテオバクテリア、例えば、紫色光合成+非光合成グラム陰性細菌(最も"一般的な"グラム陰性細菌を含む)；(3)シアノバクテリア、例えば、酸素産生の光合成生物；(4)スピロヘータ及び関連種；(5)プランクトミー；(6)バクテロイド、フラボバクテリア；(7)クラミジア；(8)緑色硫黄細菌；(9)緑色非硫黄細菌(嫌気性光合成生物も含む)；(10)Radioresistant micrococci及び関連族；及び(11)サーモトガ属及びサーモシフォ好熱菌。

【0037】

用語"生合成経路"は、"代謝経路"とも呼ばれるが、1つの化学種を別の化学種に変換(変異)するための同化または異化生化学反応のセットを指す(例えば、図1を参照)。遺伝子産物は、並行してまたはシリーズで、同じ基質上に作用し、同じ産物を生成する場合、または同じ基質と代謝物末端生成物との間の代謝中間体(即ち、代謝物)に作用するか、または産生する場合、同じ"代謝経路"に属する。本開示は、所望の生成物または中間体の生成のための代謝的に遺伝子操作された経路を有する組換え微生物を提供する。

【0038】

"保存的なアミノ酸置換"は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。次の6つのグループには、それぞれ、相互に保存的に置換されたアミノ酸が含まれる：1)セリン(S)、スレオニン(T)；2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；4)アルギニン(R)、リジン(K)；5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アラニン(A)、バリン(V)；及び6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。

【0039】

"酵素"は、典型的には、1種以上の化学的または生化学的反応をある程度で特異的に触媒または促進するタンパク質またはポリペプチドを構成する全てまたは大部分のアミノ酸から構成される任意の物質を意味する。

【0040】

遺伝子またはポリヌクレオチドに関する用語"発現"は、遺伝子またはポリヌクレオチドの転写、また適切な場合では、得られたmRNA転写物のタンパク質またはポリペプチドへの翻訳を指す。従って、文脈から明らかになるように、タンパク質またはポリペプチドの発現は、オープンリーディングフレームの転写及び翻訳に起因する。

【0041】

"グラム陰性細菌"は、球菌、非腸内杆状体、及び腸内杆状体を含む。グラム陰性細菌の属には、例えば、Neisseria、Spirillum、Pasteurella、Brucella、Yersinia、Francisella、Haemophilus、Bordetella、Escherichia、Salmonella、Shigella、Klebsiella、Proteus、Vibrio、Pseudomonas、Bacteroides、Acetobacter、Aerobacter、Agrobacterium、Azotobacter、Spirilla、Serratia、Vibrio、Rhizobium、Chlamydia、Rickettsia、Treponema、及びFusobacteriumが含まれる。

【0042】

"グラム陽性細菌"は、球菌、非胞子化杆状体、及び胞子形成杆状体を含む。グラム陽性細菌の属には、例えば、Actinomyces、Bacillus、Clostridium、Corynebacterium、Erysipelothrix、Lactobacillus、Listeria、Mycobacterium、Myxococcus、Nocardia、Staphylococcus、Streptococcus、及びStreptomycesが含まれる。

【0043】

タンパク質をコードする核酸配列が、第2タンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有する場合、該タンパク質は、第2タンパク質との"相同性"を有し、またはそれと"相同"である。あるいは、2つのタンパク質が"類似の"アミノ酸配列を有する場合、該タンパク質は、第2タンパク質と相同性を有する（従って、用語"相同なタンパク質"は、2つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味するように定義される)。

【0044】

本明細書で使用される場合、2つのタンパク質(または該タンパク質の領域)の配列が、少なくとも約30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する場合に、該2つのアミノ酸配列は、実質的に相同である。2つのアミノ酸配列の同一性の百分率、または2つの核酸配列の同一性の百分率を測定するために、最適に比較するように該配列を整列する(例えば、ギャップを、最適な整列のために第1及び第2のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入することができ、相同ではない配列は、比較のため無視することができる)。一実施形態では、比較するために整列された基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも30%、典型的には少なくとも40%、より典型的には少なくとも50%、さらに典型的には少なくとも60%、さらにより典型的には少なくとも70%、80%、90%、100%である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。最初の配列の位置が2番目の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、該分子はその位置で同一である(本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸の"同一性"は、アミノ酸または核酸の"相同性"と同等である)。2つの配列間の同一性の百分率は、配列で共有される同一の位置の数、2つの配列の最適な整列のために導入される必要のあるギャップの数、及び各ギャップの長さの関数である。

【0045】

タンパク質またはペプチドに関して"相同な"が使用される場合、同一ではない残基位置は、しばしば保存的なアミノ酸置換によって異なることが認識される。"保存的なアミノ酸置換"は、アミノ酸残基が、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖(R基)を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的なアミノ酸置換は、タンパク質の機能的な特性を実質的に変化させない。2つまたはそれ以上のアミノ酸配列が保存的な置換によって互いに異なる場合には、配列同一性の百分率または相同性の程度を上方に修正し、置換の保存的性質のため補正することができる。該修正の手段は当業者に周知されている(例えば、Pearsonら、1994、参照により本明細書に組み込まれる)。

【0046】

さらに、上記のように、代謝物を生成するのに有用な酵素の相同体が、本明細書で提供される微生物及び方法に包含される。第1のファミリーまたは種のオリジナル酵素または遺伝子に関して使用される用語"相同体"は、機能的、構造的またはゲノム的な解析により、第1ファミリーまたは種のオリジナル酵素または遺伝子に対応する第2ファミリーまたは種の酵素または遺伝子であることと測定される第2のファミリーまたは種の明確な酵素または遺伝子を指す。最も多くの場合、相同体は、機能的、構造的またはゲノム的な類似性有するであろう。遺伝子プローブ及びPCRを用いて酵素または遺伝子の相同体を容易にクローニングすることができる技術が知られている。相同体としてのクローン化配列の同一性は、機能的なアッセイ及び/または遺伝子のゲノムマッピングを用いて確認することができる。

【0047】

配列同一性の百分率とも呼ばれるポリペプチドの配列相同性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、遺伝学コンピューターグループ(GCG)の配列分析ソフトウェアパッケージ(910 University Avenue, Madison, Wis. 53705,ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター)を参照されたい。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的なアミノ酸置換を含む種々の置換、欠失及び他の改変に割り当てられた相同性の測定を用いて、類似の配列と一致する。例えば、GCGは、"Gap"及び"Bestfit"のようなプログラムを含む。これらのプログラムを初期状態のパラメータと共に用いて、異なる生物種、または野生型タンパク質とそのムテインとの間からの相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を測定することができる。例えば、GCGバージョン6.1を参照されたい。

【0048】

異なる生物由来の大量な配列を含むデータベースと分子配列を比較するために使用される典型的なアルゴリズムは、コンピュータプログラムBLAST(Altschul,1990；Gish,1993；Madden,1996；Altschul,1997；Zhang,1997)であり、特にblastpまたはtblastn(Altschul,1997)である。BLASTpの典型的なパラメータは以下の通りである：期待値：10(初期状態)；フィルター：seg(初期状態)；ギャップを開始するコスト：11(初期状態)；ギャップを拡大するコスト：1(初期状態)；最大整列：100(初期状態)；ワードサイズ：11(初期状態)；記載数：100(初期状態)；ペナルティマトリックス：BLOWSUM62。

【0049】

多数の異なる生物から配列を含むデータベースを探索する場合、アミノ酸配列を比較することが典型的である。アミノ酸配列を用いたデータベース検索は、当該技術分野で知られているBLASTp以外に、アルゴリズムによって測定することができる。例えば、ポリペプチド配列を、FASTA（GCGバージョン6.1のプログラム）用いて比較することができる。FASTAは、クエリーと検索配列との間の最良の重複領域の整列及び配列同一性百分率を提供する(Pearson、1990、参照により本明細書に組み込まれる)。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性百分率は、GCGバージョン6.1（参照により本明細書に組み込まれる）の初期状態パラメータ(ワードサイズ2及びPAM250スコリング化マトリクス)を有するFASTAを用いて測定できる。

【0050】

いくつかの例では、同じ機能変換/反応を実行するには、"アイソザイム"を使用することができる。しかし、これらは構造的に非常に異なるため、通常は"相同"ではないと判定される。

【0051】

本明細書で使用されるように、"代謝的に操作された"または"代謝工学"という用語は、微生物中、部分的に微生物中、無細胞系の中、及び/または無細胞系と微生物の組み合わせの中において、GPP及び/またはOA、CBG(V)Aまたは他の化学物質等の所望の代謝物の生産のための、生合成遺伝子、オペロンに関連する遺伝子、及びそのようなポリヌクレオチドの制御要素の合理的な経路設計及び組み立てを含む。"代謝的に操作された"は、所望の経路に通じる中間体と競合する競合の代謝経路の、遺伝子工学及び適切な培養条件を用いて、転写、翻訳、タンパク質安定性及びタンパク質機能の調節及び最適化による代謝フラックスの最適化をさらに含むことができる。生合成遺伝子は、宿主に外来性であるか、または突然変異誘発、組換え、及び/または内因性宿主細胞における異種発現制御配列との結合によって修飾されることによって、宿主微生物に対して異種であり得る。ポリヌクレオチドが宿主生物に対して異種遺伝的である実施形態では、該ポリヌクレオチドは、コドン最適化され得る。

【0052】

"代謝物"は、代謝または酵素経路によって生成される任意の物質、または所望の代謝物、化学物質等を生じさせる特定の代謝プロセスまたは経路に必要な、またはそれに参加する物質を指す。代謝物は、代謝または酵素経路の出発物質（例えば、イソプレノール等）、中間体（例えば、IP）、または最終生成物（例えば、GPP）である有機化合物であってもよい。代謝物は、より複雑な分子を構築するために使用することができ、またはより簡単なものに分解することができる。中間体の代謝物は、他の代謝物から合成され得、おそらくより複雑な物質を作製するために使用されるか、または化学エネルギーの放出を伴うより単純な化合物に分解され得る。

【0053】

用語"微生物"は、原核生物及びドメイン古細菌、細菌、及び真核生物からの真核生物の微生物種を含む。後者には、酵母、糸状菌、原生動物、藻類、またはより高等な原生生物が含まれる。用語"微生物細胞"及び"微生物(microbes)"は、用語微生物と互換的に使用される。

【0054】

"突然変異"は、変異タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、または細胞をもたらす任意のプロセスまたはメカニズムを意味する。これは、タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、または遺伝子配列が改変される任意の突然変異、及びそのような変異から生じる細胞における任意の検出可能な変化を含む。典型的には、突然変異は、点突然変異、欠失、または単一または複数のヌクレオチド残基の挿入によって、ポリヌクレオチドまたは遺伝子配列に起きる。突然変異には、遺伝子のタンパク質をコードする領域内で生じるポリヌクレオチドの変化、ならびにこれらに限定されないが、調節配列またはプロモーター配列等のタンパク質をコードする配列の外側の領域の変化が含まれる。遺伝子における突然変異は、"サイレント"であってもよく、即ち、発現の際にアミノ酸変化に反映されず、遺伝子の"配列保存的"変異体につながる。一般的に、これは、1つのアミノ酸が1以上のコドンに対応する場合に生じる。タンパク質の異なる一次配列をもたらす突然変異を、変異タンパク質またはタンパク質変異体と呼ぶことができる。

【0055】

"天然の"または"野生型"タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、または細胞は、自然界に存在するタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、または細胞を意味する。

【0056】

"親微生物"は、組換え微生物を生成するために使用される細胞を指す。一実施形態では、用語"親微生物"は、自然界に存在する細胞、即ち、遺伝的に改変されていない"野生型の"細胞を指す。用語"親微生物"は、さらに、さらなる遺伝子操作のために"親"として機能する細胞を指す。この後者の実施形態では、該細胞は、遺伝子操作されていてもよいが、さらなる遺伝子操作のための供給源として機能する。

【0057】

例えば、野生型の微生物を、第1標的酵素を発現または過剰発現するように遺伝的に改変することができる。該微生物は、第2標的酵素を発現または過剰発現するように改変された微生物の生成において、親微生物として作用することができる。また、該微生物は、第3標的酵素等を発現または過剰発現するように改変することができる。本明細書で使用されるように、"発現"または"過剰発現"は、所望の遺伝子産物の表現型発現を指す。一実施形態では、生物中の天然に存在する遺伝子を、異種プロモーターまたは調節ドメインに連結するように遺伝子操作することができ、ここで、該調節ドメインは、遺伝子の発現を引き起こし、それによって野生型の生物に対する正常な発現を改変する。あるいは、該生物を遺伝子操作して、遺伝子上の抑制因子の機能を除去または減少させ、それによってその発現を改変できる。さらに別の実施形態では、所望の発現制御/調節要素に作動可能に連結された遺伝子配列を含むカセットが、微生物に遺伝子操作される。

【0058】

従って、親微生物は、連続的な遺伝的改変事象のための参照細胞として機能する。各改変事象は、1以上の核酸分子を参照細胞に導入することによって達成され得る。該導入は、1つ以上の標的酵素の発現または過剰発現、または1つ以上の標的酵素の減少または除去を促進する。理解されるように、用語"促進する"は、例えば親微生物におけるプロモーター配列の遺伝的改変によって標的酵素をコードする内因性ポリヌクレオチドの活性化を包含する。さらに理解されるように、用語"促進する"は、標的酵素を親微生物にコードする外因性ポリヌクレオチドの導入を包含する。

【0059】

"親酵素またはタンパク質"とは、変異型の酵素またはタンパク質を生成するために使用される酵素またはタンパク質を指す。一実施形態では、用語"親酵素"(またはタンパク質)は、天然に生じる酵素またはタンパク質を指す。例えば、遺伝的に改変されていない"野生型"の酵素またはタンパク質である。用語"親酵素"(またはタンパク質)は、さらなる遺伝子操作のための"親"となる細胞を指す。この後者の実施形態では、前記酵素またはタンパク質は、遺伝子操作されていてもよいが、さらなる遺伝子操作のための供給源として機能する。

【0060】

用語"ポリヌクレオチド"、"核酸"または "組換え核酸"は、デオキシリボ核酸(DNA)、及び適切な場合では、リボ核酸(RNA)のようなポリヌクレオチドを指す。

【0061】

相同体、変異体、断片、関連する融合タンパク質、またはその機能的等価物を含む代謝物の生成に有用な酵素をコードするポリヌクレオチドは、細菌または酵母細胞のような適切な宿主細胞において、このようなポリペプチドの発現を誘導する組換え核酸分子に使用される。本明細書に提供される配列及び受託番号から、当業者は、容易に入手可能なソフトウェア及び生物学の基礎知識を用いて、本開示の様々な酵素のコード配列を得ることができる。

【0062】

当業者が分かるように、遺伝子コードの縮重性質のために、それらのヌクレオチド配列が異なる種々のコドンを用いて、所定のアミノ酸をコードすることができる。上記で説明した生合成酵素またはポリペプチドをコードする特定のポリヌクレオチドまたは遺伝子配列は、単に本開示の実施形態を例示するために参照される。また本開示は、本開示の方法で利用される酵素のポリペプチド及びタンパク質の同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする任意の配列のポリヌクレオチドを含む。同様に、ポリペプチドは、典型的には、所望の活性を失う、または著しく失うことなく、そのアミノ酸配列における1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、及び挿入を許容することができる。本開示は、代替のアミノ酸配列を有するこのようなポリペプチドを含み、また、本明細書に示されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列は、本開示の例示的な実施形態を単に例示するにすぎない。

【0063】

本開示は、本明細書の他の場所でより詳細に記載されるように、1つ以上の標的酵素をコードする組換えDNA発現ベクターまたはプラスミドの形態でのポリヌクレオチドを提供する。一般に、このようなベクターは、宿主微生物の細胞質中で複製するか、または宿主微生物の染色体DNAの中に組み込むことができる。いずれの場合においても、該ベクターは、安定なベクター(即ち、該ベクターは、選択的な圧力のみでさえも、多くの細胞分裂にわたって存在したままである)、または一過性のベクター(即ち、該ベクターは、細胞分裂の数が増加することにつれて、宿主微生物によって徐々に失われる)であり得る。本開示は、単離された状態(即ち、純粋ではないが、天然に見られない存在及び/または濃度の調製物中に存在する)及び精製された状態(即ち、実質的に汚染物質を含まないか、または対応するDNAが天然に見出される物質を実質的に含まない)でのDNA分子を提供する。

【0064】

標準的なPCR増幅技術及び以下の実施例の項に記載された手順に従って、cDNA、mRNAまたは代替的にゲノムDNAを鋳型及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして用いて、本開示のポリヌクレオチドを増幅することができる。このように増幅された核酸を適切なベクターにクローニングし、DNA配列解析によって特徴づけすることができる。さらに、ゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術（例えば、DNA自動合成器を用いて）によって調製することができる。

【0065】

本開示は、本願に付随する配列表において、多数のポリペプチド配列を提供する。この配列表及び遺伝子コードの縮重を用いてポリヌクレオチド配列を設計、合成、及び/または単離することができる。また、公的に入手可能なデータベースを用いてコーディング配列を検索することができる。

【0066】

また理解されるように、1つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失が、コードされたタンパク質に導入されるように、1つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に導入することで、本明細書に記載の酵素に相同なポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子は生成され得る。部位特異的突然変異誘発及びPCRにより媒介される突然変異誘発のような標準的な技術により、突然変異をポリヌクレオチドに導入することができる。非保存的なアミノ酸置換を行うことが望ましい位置とは対照的に、いくつかの位置において保存的なアミノ酸置換を行うことが好ましい。

【0067】

当業者に理解されるように、特定の宿主におけるその発現を増強するためにコード配列を改変することが有利であり得る。遺伝子コードは、64個の可能なコドンで冗長であるが、ほとんどの生物は、典型的には、これらのコドンのサブセットを使用する。ある種において最も頻繁に利用されるコドンは、最適なコドンと呼ばれ、頻繁に利用されないコドンは、希少または低使用コドンとして分類される。コドンは、宿主の好ましいコドン使用を反映するように置換することができる。これは、時々"コドン最適化"、または"種コドンバイアスの制御"と呼ばれるプロセスである。

【0068】

特定の原核細胞または真核生物宿主に好まれるコドンを含む最適化されたコーディング配列(Murrayら、(1989) Nucl. Acids Res. 17:477-508も参照)を調製し、例えば、翻訳速度を増加させるか、または最適化されていない配列から生成される転写物と比べて、より長い半減期のような望ましい特性を有する組換えRNA転写物を生成することができる。翻訳停止コドンはまた、宿主の好みを反映するように改変することができる。例えば、S.cerevisiae及び哺乳動物の典型的な停止コドンは、それぞれUAA及びUGAである。単子葉植物の典型的な停止コドンは、UGAであるが、昆虫及び大腸菌は、通常UAAを停止コドンとして使用する(Dalphinら,(1996) Nucl. Acids Res. 24:216-218)。植物における発現のためのヌクレオチド配列の最適化方法は、例えば、米国特許第6,015,891号及びその引用文献に提供されている。

【0069】

理解されるように、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、"遺伝子"を含み、また、上記の核酸分子は、"ベクター"または"プラスミド"を含む。

【0070】

用語"原核生物"は、当該分野において認識されており、核または他の細胞小器官を含まない細胞を指す。一般に、原核生物は、2つのドメイン、即ち、細菌及び古細菌のうちの1つに分類される。古細菌の生物と細菌ドメインとの間の定義上の差異は、16SリボソームRNAにおけるヌクレオチド塩基配列での基本的な差異に基づいている。

【0071】

本明細書で互換的に使用される"タンパク質"または"ポリペプチド"は、ペプチド結合と呼ばれる化学結合によって互いに連結されたアミノ酸と呼ばれる化学的構築ブロックの1つ以上の鎖を含む。タンパク質またはポリペプチドは、酵素として機能することができる。

【0072】

用語"基質"または"適切な基質"は、酵素の作用により他の化合物に変換されまたは変換されるように意図される任意の物質または化合物を指す。該用語は、単一の化合物だけでなく、溶液、混合物、及び少なくとも1つの基質またはその誘導体を含む他の材料のような化合物の組合せも含む。さらに、用語"基質"は、出発原料を提供する化合物だけでなく、本明細書に記載の代謝的に遺伝子操作された微生物に関連する経路で用いられる中間体及び最終生成物の代謝物も提供する化合物も包含する。

【0073】

"形質変換"は、ベクターを宿主細胞に導入するプロセスを指す。形質転換(または形質導入、または遺伝子導入)は、電気穿孔法、微量注入法、遺伝子銃（または粒子ガン法による送達）、またはアグロバクテリウム属による形質変換を含む多くの手段のいずれかによって達成され得る。

【0074】

"ベクター"は、一般に、生物、細胞、または細胞成分の間で増殖及び/または転移できるポリヌクレオチドを指す。ベクターには、"エピソーム"であり、即ち、自律的に複製するか、宿主細胞の染色体に統合できるウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、及びYAC(酵母人工染色体)、BAC(細菌人工染色体)、及びPLAC(植物人工染色体)等の人工染色体が含まれる。また、ベクターは、本質的にエピソームではないか、またはアグロバクテリウムまたは細菌等の上記のポリヌクレオチド構築物の1つ以上を含む生物であり得る裸のRNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同一鎖内のDNA及びRNAの両方からなるポリヌクレオチド、ポリ-リジン-共役DNAまたはRNA、ペプチド-結合DNAまたはRNA、リポソーム-共役DNA等であってもよい。

【0075】

発現ベクターの様々な成分は、ベクターの意図される用途及びベクターが複製または駆動発現を意図する宿主細胞に依存して、大きく変化することができる。遺伝子の発現及び大腸菌、酵母、ストレプトミセス及び他の一般的に使用される細胞におけるベクターの維持に適した発現ベクター成分は、広く知られており、商業的に入手可能である。例えば、本開示の発現ベクターに含めるのに適したプロモーターには、真核生物または原核生物の宿主微生物において機能するものが含まれる。プロモーターは、宿主微生物の増殖に対する発現の調節を可能にするか、または化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフさせる調節配列を含むことができる。大腸菌及び特定の他の細菌宿主細胞の場合、生合成酵素、抗生物質耐性付与酵素、及びファージタンパク質の遺伝子に由来するプロモーターを使用することができる。これらには、例えば、ガラクトース、ラクトース(lac)、マルトース、トリプトファン(trp)、β-ラクタマーゼ(bla)、バクテリオファージラムダPL、及びT5プロモーターが含まれる。さらに、tacプロモーター(米国特許第4,551,433号、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)のような合成プロモーターも使用できる。大腸菌発現ベクターの場合、pUC、plP、pl、及びpBRからのような大腸菌に由来する複製を含むことが有用である。

【0076】

従って、組換え発現ベクターは、少なくとも1つの発現系を含む。該発現系は、プロモーターに作動可能に連結された遺伝子コード配列の少なくとも一部、及び任意に適合した宿主細胞におけるコード配列の発現を影響するように動作する終結配列から構成される。宿主細胞は、本開示の組換えDNA発現ベクターで形質転換することにより改変され、染色体外要素としてまたは染色体に組み込まれた発現系配列を含むことができる。

【0077】

本開示は、in vitro系で使用するための組換え微生物及びタンパク質の産生に有用な種々の遺伝子、相同体及び変異体のための受託番号及び配列を提供する。理解されるべきこととして、本明細書に記載の相同体及び変異体は例示的であり、非限定的である。当業者には、例えば、ウェブ上でアクセス可能な国立バイオテクノロジーインフォメーションセンター(NCBI)のようなものを含む種々のデータベースを用いて、付加的な相同体、変異体及び配列は入手可能である。

【0078】

本明細書に記載の配列及び受託番号を利用し、本明細書で使用されるポリペプチドのいずれかに使用または置換され得る相同体及びアイソザイムを同定することは、当業者のスキル範囲内である。実際に、本明細書において提供されるいずれの配列をBLASTで検索することで、複数の関連相同体の識別は可能であろう。

【0079】

本願に添付された配列表は、本明細書に記載の方法において有用な例示的なポリペプチドを提供する。理解されるように、非機能性または非コード配列(例えば、ポリHISタグ)の追加のような、ポリペプチド分子の活性を変化させない配列の追加は、塩基性分子の保存的な変化である。

【0080】

カンナビノイドは、制吐剤、抗痙攣剤、抗うつ剤、抗がん剤、及び鎮痛剤としての100を超える進行中の臨床試験により、計り知れない治療の可能性を示している。それにもかかわらず、プレニル天然物の治療上の可能性にもかかわらず、それらの研究及び使用は、費用効果の高い製造方法の欠如によって制限されている。

【0081】

植物に基づくカンナビノイドの製造法を代替する2つの主要な方法は、有機合成法及び代謝的に遺伝子操作された宿主(例えば、植物、酵母、または細菌)における製造法である。いくつかのカンナビノイド（例えば、THCA及びCBDA）の製造には、全合成法が解明されているが、これらは、医薬品製造には実用的でないものが多い。さらに、該合成法は、モジュール化されておらず、各カンナビノイドに独自の合成法を必要とする。天然の生合成経路を用いることでモジュール化された方法が得られるであろう。

【0082】

3大カンナビノイド(THCA、CBDA、及びカニビクロメンまたはCBCA)は、一つの前駆体CBGAに由来する。さらに、存在量が少ない3種のカンナビノイドがCBGVAに由来する(図1)。従って、異種ホストにおいてCBGA及びCBGVAを製造できることは、カンナビノイド系の製造につながる。残念ながら、微生物を遺伝子操作してCBGA及びCBGVAを製造することは極めて困難であることが証明されている。

【0083】

カンナビノイドは、脂肪酸、ポリケチド及びテルペン生合成経路の組み合わせから誘導され、これは、ゲラニルピロリン酸(GPP)及びオリベトリン酸(OA)をブロックする鍵構築物を生成する(図1)。高レベルのCBGA生合成は、長い、本質的かつ高度に調節された経路の再ルーティングを必要とする。さらに、GPPは、細胞に対して毒性があり、微生物における高レベルの産生に対して顕著な障壁を形成する。

【0084】

酵素の混合物を用いて複雑な生化学的変換が無細胞で実施される合成生化学は、従来の代謝工学よりも潜在的な利点をもたらす。具体的に、経路設計におけるより高度な柔軟性、成分の最適化をより制御できること、設計-構築-テストのサイクルをより迅速に行うこと、及び中間体または生成物の細胞毒性から解放されることが含まれる。本開示は、カンナビノイドを産生するための無細胞系を提供する。留意されたいこととして、"全"経路は、無細胞系内にある必要はなく(即ち、経路の一部を細胞内で実施することができ、それらの生成物は無細胞系に提供される)、またはその逆である。

【0085】

本開示は、カンナビノイドを産生するための酵素変異体及びこのような変異体を含む経路を提供する。また、本明細書に記載の生合成経路は、"パージバルブ"または"再生バルブ"を用いて、補因子の利用可能性（例えば、ATPレベル、NADH/NAD⁺レベル、及びNADPH/NADP⁺レベル）を調節する。

【0086】

多くの他の重要なカンナビノイドが、CBG(V)Aから単一のよく確立された酵素工程(図1)で得ることができるため、本開示は、中心的なカンナビノイドCBGVA及びCBGA (CBG(V)Aと略称する)を産生するための無細胞系を提供する。本開示の代謝経路は、様々なモジュールに分解することができる。イソプレノイド(ISO)モジュールは、単純化されたイソプレノイド経路を用いて、イソプレノールからゲラニルピロリン酸(GPP)を構築する。芳香族ポリケチド(AP)モジュールは、インプットのマロネート及びヘキサノエート(またはブチレート)を、オリベトリン酸(OA)またはジバリン酸(DA)に変換する。他の脂肪酸のインプットも、関連する芳香族ポリケチドを産生するために利用することができる。カンナビノイド(CAN)モジュールは、ISO モジュールからGPPを受け、APモジュールからのOA/DAをプレニル化し、中心的なカンナビノイドCBG(V)Aを生成する。システム全体は、ATP再生(AR)モジュール内で行われるATPにより駆動される。アセチルリン酸(AcP)は、無水酢酸物とリン酸から安価に産生できるので、ATP再生のための犠牲基質として使用された。犠牲基質を用いてATPを生成する他の方法も使用し得る。それらは、文献(例えば、Zhao Hら、"生体触媒における使用のための補助因子の再生"、Curr Opin Biotechnol. 14(6):583-9、2003を参照)でよく知られている。

【0087】

ATPの必要量を減少させるために、前記経路は、マロニル-CoA産生のため、"再生バルブ"としての非天然経路を使用する。マロネートからの通常のマロニル-CoAの生成は、酵素マロニル-CoA合成酵素(MatB；配列番号:16、またはそれと少なくとも85%の同一性を有する配列、例えば85%、87%、90%、92%、95%、98%、99%または100%)の作用を介して、使用されるマロネートあたり2 ATP当量を必要とする。産生されたOA/DAあたりに3つのマロネートは必要とされるので、マロネート活性化のATP寄与は6 ATPである。ATPの必要量を減少させるために、チオエステル転移が熱力学的に好まれるため、本開示は、CoAをアセチル-CoAからマロネートへ直接に転写し、酢酸及びマロニル-CoAを産生する方法を提供する。アセチルCoAは、ホスホトランスデアセチラーゼを用いてインプットのAcPから直接に誘導することができるので、このアプローチは、OA/DAあたり3 ATP当量を節約するであろう。トランスフェラーゼ反応を実行する天然酵素はないが、酵素マロン酸脱炭酸酵素（MdcA）の単離されたαサブユニットは、単独で発現された場合、偶然にもこの反応を触媒することができる。従って、本開示は、MdcA(またはその相同体；配列番号:6、またはそれと少なくとも50%以上の配列同一性を有する配列)を全経路設計に組み込んでいる。

【0088】

図1に合成生化学アプローチは概説されている。一実施形態では、GPPは、イソプレノールまたはプレノールから誘導される。一実施形態では、GPPは、イソプレノールから誘導される。さらに別の実施形態では、GPPへのイソプレノール経路は、ATP再生システムと結合される。例えば、該経路は、クレアチンキナーゼATP生成システム、酢酸キナーゼシステム、解糖システム、及び他のシステムと結合することができる。一実施形態では、ATP再生システムは、酢酸塩キナーゼを含む。図1の酵素(核酸コード配列及びポリペプチド)は、配列番号:54～65に提供される(例えば、PRK酵素は、配列番号:54～57に提供され；IPK酵素は、配列番号:58～61に提供され；IDI酵素は、配列番号:20～27及び62～63に提供され、また、FPPS酵素は、配列番号:64～65に提供される)。

【0089】

NphBは、10-カーボンゲラニル基の芳香族基質への付着を触媒する芳香族プレニル転移酵素である。NphBは、豊富な基質選択性及び生成物の位置選択性を示す。ストレプトマイセスから同定されたNphBは、多数の小さな有機芳香族基質への10-カーボンゲラニル基の付加を触媒する。NphBは、2つの基質分子、ゲラニル二リン酸(GPP)及び1,6-ジヒドロキシナフタレン(1,6-DHN)を結合させることができる空間的及び溶媒にアクセス可能な結合ポケットを有する。GPPは、その負に荷電された二リン酸部分といくつかのアミノ酸側鎖（Mg²⁺の他にLysll9、Thr/Gln171、Arg228、Tyr216、及びLys284を含む）との間の相互作用を介して安定化される。Mg²⁺補助因子は、NphBの活性に必要である。ストレプトマイセスからのNphBは、配列番号:30に示される配列を有する。

【0090】

NovQ(受託番号AAF67510は、参照により本明細書に組み込まれる)は、プレニル転移酵素のCloQ/NphBクラスのメンバーである。novQ遺伝子は、ストレプトマイセスニベス(Streptomyces niveus)からクローン化することができ、これは、アミノクマリン抗生物質であるノボビオシンを産生する。組換えNovQは、大腸菌で発現させ、均質に精製することができる。精製された酵素は、2価の陽イオンとは独立して、ジメチルアリル基の4-ヒドロキシフェニルピルベート(4-HPP)への転移を触媒して、ノボビオシンの中間体である3-ジメチルアリル-4-HPPを生じる可溶性単量体40-kDaタンパク質である。NovQは、4-HPPのプレニル化に加えて、フェニルプロパノイド、フラボノイド、及びジヒドロキシナフタレンの多様なコレクションの炭素-炭素ベース及び炭素-酸素ベースのプレニル化を触媒した。その触媒の約束にもかかわらず、NovQ触媒のプレニル化は、位置特異的な方法で生じた。NovQは、p-クマル酸やコーヒー酸等のフェニルプロパノイド及びフラボノイドのB環の両方へのジメチルアリル基の転移を触媒できる最初に報告されたプレニル転移酵素である。NovQは、プレニル化フェニルプロパノイド及びプレニル化フラボノイドを合成するための有用な生体触媒として機能することができる。

【0091】

アスペルギルステレウス(Aspergillus terreus)芳香族プレニル転移酵素(AtaPT；受託番号AMB20850、参照により本明細書に組み込まれる)は、種々の芳香族化合物のプレニル化に関与している。組換えAtaPTは、大腸菌で過剰発現させることができ、精製することができる。アスペルギルステレウス芳香族プレニル転移酵素(AtaPT)は、異なるプレニル二リン酸の存在下で、主にアシルフロログルシノールのC-モノプレニル化を触媒する。

【0092】

変異実験をNphB上で行って、基質特異性及び安定性を改善した。本開示は、Y288X、A232S、及びT69P、T98I、及びG224Sからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30(ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である)；Y288X、A232S、及びT69P、T98I、G224S、及びT126Pからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30(ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である)；Y288X、A232S、及びM14I、Y31W、T69P、T77I、T98I、S136A、E222D、G224S、N236T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30(ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である)を含むNphB変異体を提供する。別の実施形態では、本開示は、Y288X、A232S、及びM14I、Y31W、T69P、T77I、E80A、D93S、T98I、T126P、M129L、G131Q、S136A、E222D、G224S、N236T、S277T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30(ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である)を含むNphB変異体を提供する。別の実施形態では、本開示は、Y288X、A232S、及びM14I、L33I、Y31W、T69P、T77I、V78A、E80A、D93S、T98I、E112G、T114V、T126P、M129L、G131Q、S136A、E222D、G224S、K225Q、N236T、S277T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30(ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である)を含むNphB変異体を提供する。

【0093】

従って、本開示は、(i)Y288X、A232S、及びT69P、T98I、及びG224Sからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30(ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である)；(ii)Y288X、A232S、及びT69P、T98I、G224S、及びT126Pからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30(ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である)；(iii)Y288X、A232S、及びM14I、Y31W、T69P、T77I、T98I、S136A、E222D、G224S、N236T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30(ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である)；(iv)Y288X、A232S、及びM14I、Y31W、T69P、T77I、E80A、D93S、T98I、T126P、M129L、G131Q、S136A、E222D、G224S、N236T、S277T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30(ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である)；(v)Y288X、A232S、及びM14I、L33I、Y31W、T69P、T77I、V78A、E80A、D93S、T98I、E112G、T114V、T126P、M129L、G131Q、S136A、E222D、G224S、K225Q、N236T、S277T、及びG297Kからなる群から選択された変異、前述の変異の任意の組み合わせ、及び前述の変異の全てを有する配列番号:30(ここで、XがA、N、S、V、または１つの非天然アミノ酸である)；(vi) 1～20（例えば、2、5、10、15、20、または1～20の任意の値）の保存的なアミノ酸置換をさらに含み、かつNphB活性を有する(i)～(v) のいずれか；(vii)(i)～(v)のいずれの配列と少なくとも85%、90%、95%、98%または99%同一であり、かつNphB活性を有する配列を含む変異NphB変異体を提供する。"NphB活性"は、酵素が基質をプレニル化する能力、より具体的には、OAからCBGAを産生することを意味する。

【0094】

以下は、種々の変異体(その全てが生物学的効果を有する;配列番号:40、41、42、43、44）の整列及び野生型配列(配列番号:30)を提供する：
1ZB6_designed_4_a MSEAADVERVYAAIEEAAGLLGVACARDKIWPLLSTFQDTLVEGGSVVVFSMASGRHSTE 60
1ZB6_designed_5_a MSEAADVERVYAAIEEAAGLLGVACARDKIWPLLSTFQDTLVEGGSVVVFSMASGRHSTE 60
1ZB6_designed_6_a MSEAADVERVYAAIEEAAGLLGVACARDKIWPLLSTFQDTLVEGGSVVVFSMASGRHSTE 60
1ZB6_designed_7_a MSEAADVERVYAAIEEAAGLLGVACARDKIWPILSTFQDTLVEGGSVVVFSMASGRHSTE 60
NPHBM31 MSEAADVERVYAAMEEAAGLLGVACARDKIYPLLSTFQDTLVEGGSVVVFSMASGRHSTE 60
WTNPHB MSEAADVERVYAAMEEAAGLLGVACARDKIYPLLSTFQDTLVEGGSVVVFSMASGRHSTE 60
*************:****************:*:***************************

1ZB6_designed_4_a LDFSISVPTSHGDPYATVVEKGLFPATGHPVDDLLADIQKHLPVSMFAIDGEVTGGFKKT 120
1ZB6_designed_5_a LDFSISVPPSHGDPYAIVVEKGLFPATGHPVDDLLADIQKHLPVSMFAIDGEVTGGFKKT 120
1ZB6_designed_6_a LDFSISVPPSHGDPYAIVVAKGLFPATGHPVDSLLADIQKHLPVSMFAIDGEVTGGFKKT 120
1ZB6_designed_7_a LDFSISVPPSHGDPYAIAVAKGLFPATGHPVDSLLADIQKHLPVSMFAIDGGVVGGFKKT 120
NPHBM31 LDFSISVPTSHGDPYATVVEKGLFPATGHPVDDLLADTQKHLPVSMFAIDGEVTGGFKKT 120
WTNPHB LDFSISVPTSHGDPYATVVEKGLFPATGHPVDDLLADTQKHLPVSMFAIDGEVTGGFKKT 120
******** ******* .* ************.**** ************* *.******

1ZB6_designed_4_a YAFFPTDNMPGVAELAAIPSMPPAVAENAELFARYGLDKVQMTSMDYKKRQVNLYFSELS 180
1ZB6_designed_5_a YAFFPTDNMPGVAELAAIPSMPPAVAENAELFARYGLDKVQMTSMDYKKRQVNLYFSELS 180
1ZB6_designed_6_a YAFFPPDNLPQVAELAAIPSMPPAVAENAELFARYGLDKVQMTSMDYKKRQVNLYFSELS 180
1ZB6_designed_7_a YAFFPPDNLPQVAELAAIPSMPPAVAENAELFARYGLDKVQMTSMDYKKRQVNLYFSELS 180
NPHBM31 YAFFPTDNMPGVAELSAIPSMPPAVAENAELFARYGLDKVQMTSMDYKKRQVNLYFSELS 180
WTNPHB YAFFPTDNMPGVAELSAIPSMPPAVAENAELFARYGLDKVQMTSMDYKKRQVNLYFSELS 180
***** **:* ****:********************************************

1ZB6_designed_4_a AQTLEAESVLALVRELGLHVPNELGLKFCKRSFSVYPTLNWDTSKIDRLCFAVISTDPTL 240
1ZB6_designed_5_a AQTLEAESVLALVRELGLHVPNELGLKFCKRSFSVYPTLNWDTSKIDRLCFAVISTDPTL 240
1ZB6_designed_6_a AQTLEAESVLALVRELGLHVPNELGLKFCKRSFSVYPTLNWDTSKIDRLCFAVISTDPTL 240
1ZB6_designed_7_a AQTLEAESVLALVRELGLHVPNELGLKFCKRSFSVYPTLNWDTSQIDRLCFAVISTDPTL 240
NPHBM31 AQTLEAESVLALVRELGLHVPNELGLKFCKRSFSVYPTLNWETGKIDRLCFSVISNDPTL 240
WTNPHB AQTLEAESVLALVRELGLHVPNELGLKFCKRSFSVYPTLNWETGKIDRLCFAVISNDPTL 240
*****************************************:*.:******:***.****

1ZB6_designed_4_a VPSSDEGDIEKFHNYATKAPYAYVGEKRTLVYGLTLSPKEEYYKLGAYYHITDVQRKLLK 300
1ZB6_designed_5_a VPSSDEGDIEKFHNYATKAPYAYVGEKRTLVYGLTLSPKEEYYKLGAYYHITDVQRKLLK 300
1ZB6_designed_6_a VPSSDEGDIEKFHNYATKAPYAYVGEKRTLVYGLTLTPKEEYYKLGAYYHITDVQRKLLK 300
1ZB6_designed_7_a VPSSDEGDIEKFHNYATKAPYAYVGEKRTLVYGLTLTPKEEYYKLGAYYHITDVQRKLLK 300
NPHBM31 VPSSDEGDIEKFHNYATKAPYAYVGEKRTLVYGLTLSPKEEYYKLGAVYHITDVQRGLLK 300
WTNPHB VPSSDEGDIEKFHNYATKAPYAYVGEKRTLVYGLTLSPKEEYYKLGAYYHITDVQRGLLK 300
************************************:********** ******** ***

1ZB6_designed_4_a AFDSLED 307
1ZB6_designed_5_a AFDSLED 307
1ZB6_designed_6_a AFDSLED 307
1ZB6_designed_7_a AFDSLED 307
NPHBM31 AFDSLED 307
WTNPHB AFDSLED 307
*******

【0095】

本明細書には、本開示の改変/変異NphBポリペプチドを産生及び単離するための組換え方法が記載されている。前記ポリペプチドは、組換え産生の他に、固相技術を使用した直接ペプチド合成（例えば、Stewartら,1969）；固相ペプチド合成（WH Freeman Co, サンフランシスコ）;及びMerrifield法(J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963)用いて産生することができる。ペプチド合成は、手動技術または自動化によって行うことができる。自動合成は、例えば、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer、Foster City、Calif.)を用いて、製造業者によって提供された取扱説明書に従って達成され得る。

【0096】

本明細書で使用されるように、非天然アミノ酸は、N-メチルアミノ酸(例えば、N-メチルl-アラニン、N-メチルL-バリン等)またはα-メチルアミノ酸、β-ホモアミノ酸、ホモ-アミノ酸、及びD-アミノ酸等の天然には存在しないアミノ酸を指す。特定の実施形態では、本開示に有用な非天然アミノ酸は、小さな疎水性の非天然アミノ酸(例えば、N-メチルl-アラニン、N-メチルL-バリン等)を含む。

【0097】

また、本開示は、本明細書に記載のNphB変異体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。遺伝コードの縮重のために、実際のコーディング配列は、NphB突然変異体及び変異体について列挙されたポリペプチドになお到達しながら変化し得る。当然に、遺伝コードの縮重により、特定のポリペプチドを依然としてコードしながら、ポリヌクレオチド配列間の同一性百分率が大きく変化し得る。アミノ酸配列からポリヌクレオチド配列を産生することは、当該技術分野において日常的である。

【0098】

本開示はまた、組換え宿主細胞及び本開示のNphB変異体酵素のいずれかを含む無細胞系を提供する。いくつかの実施形態では、該組換え細胞及び無細胞系は、プレニル化プロセスを実施するために使用される。

【0099】

本開示の目的の一つは、プレノール及び/またはイソプレノールから前駆体GPPを産生することであり、これを用いて、本開示の変異NphBを用いて添加OA をプレニル化し、それによってCBG(V)を産生することができる。

【0100】

従って、本開示は、プレノール及び/またはイソプレノイドをゲラニルピロリン酸に変換する複数の酵素工程を含む無細胞系を提供する。一実施形態では、該経路は、ATP再生モジュールを含む。

【0101】

図1に示されるように、本開示の経路は、4つのモジュールを含む。第1のモジュールは、イソプレノールまたはプレノールをGPPに変換するイソプレノイドモジュールである。該経路は、複数の酵素工程を含む。例えば、最初の酵素反応では、イソプレノールは、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（ThiM; EC 2.7.1.50）等のキナーゼ活性を持つ酵素によってリン酸化され、イソペンテニル一リン酸（IP）を形成する。該Thimは、配列番号:2に示されるポリペプチド配列、またはそれと少なくとも85%、87%、90%、92%、95%、97%、または99%の同一性を有する配列を有し、イソプレノールをリン酸化することができる。

【0102】

いくつかの実施形態では、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼは、配列番号:2に関して1～約20または1～約10のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼは、配列番号:2のアミノ酸配列に関して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または50より多くのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼは、配列番号:2のアミノ酸配列に関して少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、または少なくとも45のアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾は、アミノ酸の置換、挿入、及び欠失から独立して選択することができる。

【0103】

前記経路の第2ステップは、例えば、イソペンテニルリン酸キナーゼ(IPK)によって触媒され得る。該IPKは、イソペンテニルモノホスフェートをイソペンテニル二リン酸(IPP)に変換する。いくつかのイソペンテニルリン酸キナーゼが知られているが、いくつかの実施形態では、組換えイソペンテニルリン酸キナーゼは、配列番号:59（Methanocaldococcus jannaschii IPK）（M. themoacetophilaからの配列番号:61も参照）のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えイソペンテニルリン酸キナーゼは、配列番号:59のアミノ酸配列と50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%、または前記値の2つの間の任意の範囲で同一である。いくつかの実施形態では、前記組換え酵素は、配列番号:59のアミノ酸配列と少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一である。いくつかの実施形態では、前記組換え酵素は、配列番号:59のアミノ酸配列と少なくとも50%同一である。

【0104】

いくつかの実施形態では、イソペンテニルリン酸キナーゼは、配列番号:59に関して1～約20または1～約10のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、イソペンテニルリン酸キナーゼは、配列番号:59に関して1～5のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、イソペンテニルリン酸キナーゼは、配列番号:59のアミノ酸配列に関して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または50より多くのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、イソペンテニルリン酸キナーゼは、配列番号:59のアミノ酸配列に関して少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、または少なくとも45のアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾は、アミノ酸の置換、挿入、及び欠失から独立して選択することができる。

【0105】

イソプレノイドモジュールにおける第3の酵素工程は、イソペンテニルピロリン酸異性化酵素(IDI)活性を有する酵素を用いて、IPPをジメチルアリル二リン酸(DMAPP)に変換すること、またはその逆にすることを含む。イソペンテニルピロリン酸異性化酵素(IDI)は、細菌IDIまたは酵母IDIであってもよい。いくつかの実施形態では、IDIは、IPPをDMAPPに異性化し、及び/またはDMAPPをIPPに異性化する。いくつかのイソペンテニルピロリン酸異性化酵素が知られているが、いくつかの実施形態では、該イソペンテニルピロリン酸異性化酵素は、配列番号:63(Escherichia coli IDI)のアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、イソペンテニルピロリン酸異性化酵素は、配列番号:63のアミノ酸配列と50%、55%、60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%、または上記値のうちのいずれか2つの間の任意の範囲で同一である。いくつかの実施形態では、イソペンテニルピロリン酸異性化酵素は、配列番号:63のアミノ酸配列と少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一である。

【0106】

いくつかの実施形態では、イソペンテニルピロリン酸異性化酵素は、配列番号:63に関して1～約20または1～約10のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、イソペンテニルピロリン酸異性化酵素は、配列番号:63に関して1～5のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、イソペンテニルピロリン酸異性化酵素は、配列番号:63のアミノ酸配列に関して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または50より多くのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、イソペンテニルピロリン酸異性化酵素は、配列番号:63のアミノ酸配列に関して少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、または少なくとも45のアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾は、アミノ酸の置換、挿入、及び欠失から独立して選択することができる。

【0107】

第4の酵素反応では、ゲラニルピロリン酸(GPP)は、ソプレノイドモジュールでは、配列番号:65に対してS82F変異を有するファルネシル-PP合成酵素の存在下でDMAPPとイソペンテニルピロリン酸（IPP）の組み合わせから形成される。一実施形態では、ファルネシル-二リン酸合成酵素は、S82F変異を有する配列番号:65と少なくとも95%、98%、99%または100%同一の配列を有し、DMAPP及びイソペンチルピロリン酸からゲラニルピロリン酸を形成することができる。

【0108】

いくつかの実施形態では、ファルネシル-PP合成酵素は、配列番号:65に関して1～約20または1～約10のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、ファルネシル-PP合成酵素は、配列番号:65に関して1～5のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、ファルネシル-PP合成酵素は、配列番号:65に関してのアミノ酸配列に関して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または50より多くのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、ファルネシル-PP合成酵素は、配列番号:65のアミノ酸配列に関して少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、または少なくとも45のアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾は、アミノ酸の置換、挿入、及び欠失から独立して選択することができる。

【0109】

イソプレノールからGPPへの変換は、ATPを利用する。図1の経路は、アセチルキナーゼ(AckA)を用いて、アセチルリン酸及びADPを酢酸及びATPに変換するATP再生モジュールを含む第2のモジュールを含む。該経路では、"ATP再生"モジュールによって生成されたATPをイソプレノイド経路及び芳香族ポリケチドモジュールに使用することができる。酢酸キナーゼは、AckAにより大腸菌中でコードされる。AckAは、アセチル-coAの酢酸塩への変換に関与している。具体的には、AckAは、アセチルリン酸の酢酸塩への変換を触媒する。AckA相同体及び変異体が知られている。NCBIデータベースは、約1450のポリペプチドを細菌性酢酸キナーゼとしてリストする。例えば、このような相同体及び変異体には、酢酸キナーゼ(Streptomyces coelicolor A3(2)) gi|21223784|ref|NP_629563.1|(21223784);酢酸キナーゼ(Streptomyces coelicolor A3(2)) gi|6808417|emb|CAB70654.1|(6808417);酢酸キナーゼ (Streptococcus pyogenes M1 GAS) gi|15674332|ref|NP_268506.1|(15674332); 酢酸キナーゼ(Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168) gi|15792038|ref|NP_281861.1|(15792038);酢酸キナーゼ(Streptococcus pyogenes M1 GAS) gi|13621416|gb|AAK33227.1|(13621416);酢酸キナーゼ (Rhodopirellula baltica SH 1) gi|32476009|ref|NP_869003.1|(32476009); 酢酸キナーゼ(Rhodopirellula baltica SH 1) gi|32472045|ref|NP_865039.1|(32472045);酢酸キナーゼ(Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168) gi|112360034|emb|CAL34826.1|(112360034);酢酸キナーゼ(Rhodopirellula baltica SH 1) gi|32446553|emb|CAD76388.1|(32446553);酢酸キナーゼ (Rhodopirellula baltica SH 1) gi|32397417|emb|CAD72723.1|(32397417); AckA (Clostridium kluyveri DSM 555) gi|153954016|ref|YP_001394781.1|(153954016);酢酸キナーゼ (Bifidobacterium longum NCC2705) gi|23465540|ref|NP_696143.1|(23465540); AckA (Clostridium kluyveri DSM 555) gi|146346897|gb|EDK33433.1|(146346897);酢酸キナーゼ (Corynebacterium diphtheriae) gi|38200875|emb|CAE50580.1|(38200875); 酢酸キナーゼ(Bifidobacterium longum NCC2705) gi|23326203|gb|AAN24779.1|(23326203);酢酸キナーゼ(Acetokinase) gi|67462089|sp|P0A6A3.1|ACKA_大腸菌(67462089);及びAckA (Bacillus licheniformis DSM 13) gi|52349315|gb|AAU41949.1|(52349315)が含まれる。このような受託番号に関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0110】

図1は、さらに、第3のモジュール、"芳香族ポリケチドモジュール"を示す。該モジュールは、オリベトリン酸(OA)を産生する。一般に、芳香族ポリケチドOA またはDAは、ヘキサノエート(またはブチレート)及びマロネートから誘導される。マロニル-CoAは、マロネートからMdcAを用いてアセチル-CoAからのCoAの非自然転移を介して産生される。

【0111】

第1の酵素工程では、ヘキサノエートまたはブチレートは、アシル活性化酵素3（AAE3）を使用してヘキサノイル-CoAに変換される。いくつかの実施形態では、AAE3ポリペプチドは、配列番号:4に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、AAE3ポリペプチドは、C.sativaから得られる。別のまたはさらなる実施形態では、AAE3ポリペプチドは、配列番号:4(配列番号:66～69の相同配列も参照)と少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%、少なくとも99.9%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0112】

いくつかの実施形態では、アシル活性化酵素3(AAE3)は、配列番号:4に関して1～約20または1～約10のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、アシル活性化酵素3(AAE3)は、配列番号:4に関して1～5のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、アシル活性化酵素3(AAE3)は、配列番号:4のアミノ酸修飾に関して1、2、3、4, 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または50より多くのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、アシル活性化酵素3(AAE3)は、配列番号:4のアミノ酸修飾に関して少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、または少なくとも45のアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾は、アミノ酸の置換、挿入、及び欠失から独立して選択することができる。

【0113】

ポリケチドモジュールの第2の酵素工程では、マロネート及びアセチル-CoAは、マロネート脱炭酸酵素活性を有する酵素のサブユニットを用いてマロニル-CoAに変換される。一実施形態では、マロネート脱炭酸酵素は、マロネート脱炭酸酵素のαサブユニットを含む。別のまたは他の実施形態では、該マロン酸脱炭酸酵素αサブユニット(MdcA)は、ゲオバチルス属から得られる。別の実施形態では、該MdcAは、配列番号:6と少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%、少なくとも99.9%、または100%のアミノ酸配列同一性を有し、かつCoAをマロネートに変換できるアミノ酸配列を含む。

【0114】

いくつかの実施形態では、マロン酸脱炭酸酵素αサブユニット(MdcA)は、配列番号:6に関して1～約20または1～約10のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、マロン酸脱炭酸酵素αサブユニット(MdcA)は、配列番号:6に関して1～5のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、マロン酸脱炭酸酵素αサブユニット(MdcA)は、配列番号:6のアミノ酸配列に関して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または50より多くのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、マロン酸脱炭酸酵素αサブユニット(MdcA)は、配列番号:6のアミノ酸配列に関して少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、または少なくとも45のアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾は、アミノ酸の置換、挿入、及び欠失から独立して選択することができる。

【0115】

ポリケチドモジュールは、アセチルリン酸及びcoAをアセチル-CoAに変換する第3の酵素工程を含む。該酵素工程は、アセチル-CoA+リン酸からCoA+アセチルリン酸への化学反応、及びその逆の化学反応を触媒するリン酸アセチル転移酵素(PTA)(EC 2.3.1.8)を使用する。リン酸アセチル転移酵素は、G.stearothermophilus(配列番号:8、受託番号WP_053532564)にコードされる。PTA 相同体及び変異体は知られている。NCBIでは、約1075種の細菌性リン酸アセチル転移酵素が利用可能である。例えば、このような相同体及び変異体には、リン酸アセチル転移酵素Pta(Rickettsia felis URRWXCal2) gi|67004021|gb|AAY60947.1|(67004021);リン酸アセチル転移酵素(Buchnera aphidicola str. Cc (Cinara cedri)) gi|116256910|gb|ABJ90592.1|(116256910); pta (Buchnera aphidicola str. Cc (Cinara cedri))gi|116515056|ref|YP_802685.1|(116515056);pta (Wigglesworthia glossinidia endosymbiont of Glossina brevipalpis) gi|25166135|dbj|BAC24326.1|(25166135); Pta (Pasteurella multocida subsp. multocida str. Pm70) gi|12720993|gb|AAK02789.1|(12720993);Pta (Rhodospirillum rubrum) gi|25989720|gb|AAN75024.1|(25989720);pta (Listeria welshimeri serovar 6b str. SLCC5334) gi|116742418|emb|CAK21542.1|(116742418); Pta (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10) gi|41398816|gb|AAS06435.1|(41398816);リン酸アセチル転移酵素(pta) (Borrelia burgdorferi B31) gi|15594934|ref|NP_212723.1|(15594934);リン酸アセチル転移酵素(pta) (Borrelia burgdorferi B31) gi|2688508|gb|AAB91518.1|(2688508);リン酸アセチル転移酵(pta) (Haemophilus influenzae Rd KW20) gi|1574131|gb|AAC22857.1|(1574131);リン酸アセチル転移酵素Pta (Rickettsia bellii RML369-C) gi|91206026|ref|YP_538381.1|(91206026);リン酸アセチル転移酵素Pta (Rickettsia bellii RML369-C) gi|91206025|ref|YP_538380.1|(91206025);リン酸アセチル転移酵素pta (Mycobacterium tuberculosis F11) gi|148720131|gb|ABR04756.1|(148720131);リン酸アセチル転移酵素pta (Mycobacterium tuberculosis str. Haarlem) gi|134148886|gb|EBA40931.1|(134148886);リン酸アセチル転移酵素pta (Mycobacterium tuberculosis C) gi|124599819|gb|EAY58829.1|(124599819); リン酸アセチル転移酵素Pta (Rickettsia bellii RML369-C) gi|91069570|gb|ABE05292.1|(91069570);リン酸アセチル転移酵素Pta (Rickettsia bellii RML369-C) gi|91069569|gb|ABE05291.1|(91069569);リン酸アセチル転移酵素(pta) (Treponema pallidum subsp. pallidum str. Nichols) gi|15639088|ref|NP_218534.1|(15639088); 及びリン酸アセチル転移酵素(pta)(Treponema pallidum subsp. pallidum str. Nichols) gi|3322356|gb|AAC65090.1|(3322356)が含まれる。前記受託番号に関連する各配列は、その全体を参照して、本明細書に組み込まれる。

【0116】

ポリケチドモジュールは、オリベトリン酸(OA)への酵素変換において、基質としてヘキサノイル-CoA及びマロニル-CoAを使用する。該経路は、例えば、C.sativaオリベトール合成酵素（OLS）（BAG14339.1;配列番号:10;配列番号:70～73も参照）による、初期プライマーとしてのヘキサノイル-CoA及びエクステンダーユニットとしてのマロニル-CoAの凝縮から始まって、3,5,7-トリオキソドデカノイル-CoAを産生する。そして、C.sativaオリベトリン酸環化酵素(OAC)(AFN42527.1、配列番号:12または活性を改善する残基の非保存的置換を含むいくつかの変異体、配列番号:74～75を参照)は、3,5,7-トリオキソドデカノイル-CoAをオリベトリン酸に環化する。

【0117】

いくつかの実施形態では、オリベトール合成酵素(OLS)及び/またはオリベトリン酸環化酵素(OAC)は、配列番号:10または12に関してそれぞれ1～約20または1～約10のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、該OAC及び/またはOLSは、それぞれ、配列番号:10または12に関してそれぞれ1～5のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、該OAC及び/またはOLSは、配列番号:10または12のアミノ酸配列に関してそれぞれ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または50より多くのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、該OAC及び/またはOLSは、配列番号:10または12のアミノ酸配列に関してそれぞれ少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、または少なくとも45のアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾は、アミノ酸の置換、挿入、及び欠失から独立して選択することができる。

【0118】

GPPは、プレニル-フラバノイド、ゲラニル-フラバノイド、プレニルスチルベノイド、ゲラニル-スチルベノイド、CBGA、CBGVA、CBDA、CBDVA、CBCA、CBCVA、THCA、及びTHCVAを導く多数の経路のための基質として使用することができる。

【0119】

例えば、上記のように、NphB変異体を使用して、GPP及びOAからCBG(V)Aを産生する機能を実行した。CBGAを抽出するための反応にノナンオーバーレイを使用することができ、CBGAは、ノナンよりも水に可溶であり、これは、簡単なオーバーレイで抽出することができるCBGAの量を制限する。このようにして、ノナン層からCBGAを捕捉し、それを別の貯水槽にトラップするフローシステムを使用できる。このフローシステムを実施することにより、CBGAのより低い濃度を反応容器内に維持して、酵素の沈殿を緩和することができる。

【0120】

一実施形態では、本開示は、GPP産生のための無細胞系を提供する。さらに、本開示は、本開示の変異NphBの基質を使用することにより、変異NphBを含むがこれに限定されないプレニル化酵素と組み合わせてGPP経路を使用して、純粋なカンナビノイド及び他のプレニル化天然物のアレイを産生するための無細胞アプローチを提供する。該方法の成功は、活性があり、安定で、特異的であり、天然の膜貫通型プレニル転移酵素の必要性を排除した、本開示の操作されたプレニル転移酵素（例えば、上記のようなNphB変異体）を使用する。ここに提供される合成生化学プラットフォームのモジュール性及び柔軟性は、バイオベースのアプローチの利点を有するが、生存システムを満足する複雑さを排除する。例えば、GPPの毒性は、設計プロセスには影響を与えなかった。また、OAは酵母では摂取されないので、細胞内で外因的に添加するアプローチは必ずしも可能ではない。実際、無細胞系の柔軟性は、さらなる最適化、追加の経路酵素、及び試薬や補助因子の変更に必要とされる設計-構築-試験のサイクルを大幅に容易にすることができる。

【0121】

図1の全経路に目を向けると、本開示は、"基質"を生成物に変換するために酵素によって触媒されるいくつかの工程を提供する。いくつかの例では、工程は補助因子を利用してもよいが、いくつかの工程は、補助因子(例えば、NAD(P)H、ATP/ADP等)を使用しない。表1は、(上記及び他の場所に記載されたものに加えて)酵素、生物及び使用された反応量ならびに受託番号(このような受託番号に関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる)のリストを提供する。

【0122】

表1：酵素プラットフォームに用いられる酵素

**報告されたNCBI受託番号は、WT NphB酵素のものである。NphB M31^S配列は、本明細書の他の場所で記載されている。

【0123】

上記のように、GPPによるオリベトリン酸塩のプレニル化は、ここ及び上記で記載される変異NphBポリペプチドの活性により行われる。

【0124】

図1は、様々な"モジュール"(例えば、イソプレノイドモジュール、カンナビノイドモジュール、ポリケチドモジュール)としての経路を示す。例えば、イソプレノイドモジュールは、単純化されたイソプレノイド経路を介してイソプレノールからイソプレノイドゲラニルピロリン酸(GPP)を産生する。芳香族ポリケチド(AP)モジュールは、インプットのマロネート及びヘキサノエート(またはブチレート)をオリベトリン酸(OA)またはジバリン酸(DA)に変換する。カンナビノイドモジュールは、イソプレノイドモジュール及びポリケチドモジュールからの生成物を使用して、カンナビゲロリン酸を産生し、これは、その後カンナビノイド合成酵素により最終のカンナビノイドに変換される。

【0125】

本開示は、プレニル化化合物を産生するin vitro方法、さらに、カンナビノイド及びカンナビノイド前駆体(例えば、CBGA、CBGVAまたはCBGXA、ここで、"X'は、2,4-ジヒドロキシ安息香酸足場の6位の任意の化学基を指す)を産生するin vitro方法を提供する。本開示の一実施形態では、無細胞製剤は、例えば、3つの異なる方法で作製することができる。第1の実施形態では、前記経路の酵素は、本明細書に記載のように、購入され、適切な緩衝液中で混合され、適切な基質が添加され、（場合によっては）プレニル化化合物、カンナビノイド、またはカンナビノイド前駆体の産生に適した条件下でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、前記酵素は、支持体に結合され、またはファージディスプレイまたは他の表面発現システムで発現されることができ、例えば、代謝経路のサイクル内のポイントに対応する流体経路に固定されることができる。

【0126】

第2の実施形態では、経路の1つ以上の酵素をコードする1つ以上のポリヌクレオチドが、酵素が発現される条件下で、1つ以上の微生物にクローン化される。その後、細胞を溶解し、該細胞由来の1種以上の酵素を含む溶解調製物を、適切な緩衝液及び基質(必要な場合には、さらに経路の1種以上の追加の酵素)と組み合わせ、プレニル化化合物、カンナビノイド、またはカンナビノイド前駆体を産生する。あるいは、前記酵素を前記溶解調製物から単離し、次いで適切な緩衝液中で再度組み合わせることができる。

【0127】

第3の実施形態では、購入した酵素と発現された酵素との組み合わせを用いて、適切な緩衝液中の経路を提供する。一実施形態では、該経路の熱安定化ポリペプチド/酵素は、クローン化され、発現される。一実施形態では、該経路の酵素は、好熱性微生物から誘導される。次いで、該次に微生物を溶解し、該調製物を、経路の熱安定化ポリペプチドが活性であり、他のポリペプチド（対象ではない）が変性して不活性になる温度に加熱する。それにより、該調製物は、微生物中の全ての酵素のサブセットを含み、活性熱安定性酵素を含む。次いで、該調製物を用いて、該経路を実施し、プレニル化化合物、カンナビノイド、またはカンナビノイド前駆体を産生することができる。

【0128】

例えば、in vitro系を構築するために、全ての酵素を商業的に入手するか、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、活性について試験し、適切に選択された反応緩衝液中で一緒に混合することができる。

【0129】

また、組換え微生物を得るため、微生物に遺伝子操作された生合成経路中の前記酵素の全部または一部を使用するin vitro系も企図される。

【0130】

本開示はまた、プレニル化化合物の産生のための変異NphBを含む、代謝的に操作された生合成経路を含む組換え生物を提供し、さらに、カンナビノイドを産生するための酵素を発現する1つ以上の他の微生物(例えば、部分的な経路を発現する1セットの微生物と該経路のさらに別の部分または最後の部分を発現するもう1セットの微生物等との共培養)を含んでもよい。

【0131】

一実施形態では、本開示は、親微生物と比較して、少なくとも1つの標的酵素の上昇した発現を含み、または親生物に見出されない酵素をコードする組換え微生物を提供する。別のまたはさらなる実施形態では、微生物は、所望の代謝物の産生に必要な代謝物と競合し、または望ましくない生成物を産生する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子の減少、破壊またはノックアウトを含む。前記組換え微生物は、例えばプレニル化化合物、カンナビノイド、またはカンナビノイド前駆体を産生するための生合成経路に関与する少なくとも1種の代謝物を産生する酵素を発現する。一般に、前記組換え微生物は、標的酵素を含む少なくとも1つの組換え代謝経路を含み、競合的な生合成経路における酵素の活性または発現の低下をさらに含んでもよい。該経路は、例えば、プレニル化化合物、カンナビノイド、またはカンナビノイド前駆体の産生における基質または代謝中間体を修飾するように作用する。前記標的酵素は、適切な生物学的供給源から誘導されたポリヌクレオチドによってコードされ、そしてそれから発現される。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、植物、細菌または酵母源由来の遺伝子を含み、本開示の微生物に組換え的に操作される。別の実施形態では、所望の標的酵素をコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するが、天然の発現レベルと比較して過剰発現されるように組換え的に操作される。

【0132】

本明細書で提供される組換え微生物の増殖及び維持に適した培養条件は公知である(例えば、FreshneyとWiley-Lissによる"動物細胞の培養-基本的な技術のマニュアル"、N.Y. (1994)、第3版)。当業者は、そのような条件が各微生物の要求に適合するように改変され得ることを認識するであろう。

【0133】

理解されることとして、多くの微生物を改変して、プレニル化化合物、カンナビノイド、またはカンナビノイド前駆体の産生に適した組換え代謝経路の全部または一部を含むことができる。また、理解されることとして、種々の微生物が、本明細書に提供される組換え微生物での使用に適した標的酵素をコードする遺伝物質のための"供給源"として作用することができる。

【0134】

前述のように、ベクター、プロモーター及び多くの他の関連トピックの使用を含む本明細書で有用な分子生物学的技術を説明する一般的なテキストには、BergerとKimmel, 分子クローニング技術ガイド、酵素学の方法、第152巻, (Academic Press, Inc., San Diego, Calif.) ("Berger"); Sambrookら,分子クローニング-実験マニュアル,第2版,第1～3巻,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ("Sambrook")及び分子生物学の現在のプロトコル, F. M. Ausubelら編集、現在のプロトコル、Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.との合弁事業, (1999年補足版) ("Ausubel")が含まれ、いずれも、その全体を参照して本明細書に組み込まれる。

【0135】

重合酵素連鎖反応（PCR）、連結酵素連鎖反応（LCR）、Qβ-複製酵素増幅、及びその他のRNA重合酵素媒介技術（NASBA等）を含むin vitro増幅法で本開示の核酸と相同の核酸を産生するため、当業者に指示するのに十分なプロトコルの例は、以下の文献に見出すことができる：Berger, Sambrook及びAusubel,並びにMullisら(1987) 米国特許第4,683,202号；Innisら編集、(1990) PCR プロトコル:方法と応用ガイド(Academic Press Inc. San Diego, Calif.) ("Innis"); Arnheim & Levinson (Oct. 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81-94; Kwohら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173; Guatelliら (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87:1874; Lomellら (1989) J. Clin. Chem 35:1826; Landegrenら (1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291-294; WuとWallace (1989) Gene 4:560; Barringerら(1990) Gene 89:117;及びSooknananとMalek(1995) Biotechnology 13:563-564。

【0136】

in vitroで増幅された核酸をクローニングするための改良された方法は、Wallaceらの米国特許第5,264,039号に記載されている。

【0137】

PCRによる大核酸を増幅するための改良された方法は、Chengら(1994) Nature 369：684-685及びそこに引用された文献に要約されており、該方法では40 kbまでのPCRアンプリコンが産生される。当業者は、本質的に任意のRNAを、制限消化、PCR伸長及び逆転写酵素及び重合酵素を用いた配列決定に適した二本鎖DNAに変換できることを理解するであろう。例えば、上記のAusubel、Sambrook、Bergerを参照されたい。

【0138】

本発明は、以下の実施例に示されている。これらの実施例は、例示のために提供され、限定を意図するものではない。

【実施例】

【0139】

試薬
ジバリン酸(DA)及びオリベトリン酸(OA)は、それぞれEnamine and Toron Research Chemicals社から購入した。カンナビゲロリン酸(CBGA)標準品は、Sigma Aldrich社から購入した。補助因子は、Thermo Fisher Scientific社またはSigma Aldrich社から購入した。ウシ血清アルブミン(BSA)、S.cerevisiaeヘキソキナーゼ(ScHex)、及び乳酸脱水素酵素を用いたピルビン酸キナーゼ(PKLDH)は、Sigma Aldrich社から購入した。

【0140】

酵素のクローニング、発現及び精製
大腸菌ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ(EcThiM)、R.palustris MatB、(RpMatB)、及びG.thermodenitrificans ADK(GtADK)の遺伝子を、HotStart Taq Mastermix (Denville)を用いてゲノムDNAから増幅し、その後、改変Gibson法を用いてPCR増幅したベクターにクローニングした。PCRサイクルパラメータは以下の通りであった：95℃で3分間；95℃で15秒間、63℃で30秒間（1℃/サイクルを下げる）、72℃で1分間を10サイクル；95℃で15秒間、55℃で30秒間、72℃で1分間を30サイクル；続いて72℃で10分間。ThiMとMatBのクローニングに使用したプライマーを表2に示す。Mj IPK、Gs MdcA、NphB M31^s、CsAAE3、CsOLS、及びCsOACを合成し、ツイストバイオサイエンスによってNde1/Xho1制限部位を持つpET28(+)ベクターにクローン化された。EcIDI、GsFPPS-S82F、及びGsPpaseの発現プラスミドは、以前に記載された通りである(Kormanら、Nat. Commun. 8:15526, 2017)。

【0141】

表2：タンパク質、核酸及びプライマーの配列
>EcThiM (配列番号:1)
ATGCAAGTCGACCTGCTGGGTTCAGCGCAATCTGCGCACGCGTTACACCTTTTTCACCAACATTCCCCTCTTGTGCACTGCATGACCAATGATGTGGTGCAAACCTTTACCGCCAATACCTTGCTGGCGCTCGGTGCATCGCCAGCGATGGTTATCGAAACCGAAGAGGCCAGTCAGTTTGCGGCTATCGCCAGTGCCTTGTTGATTAACGTTGGCACACTGACGCAGCCACGCGCTCAGGCGATGCGTGCTGCCGTTGAGCAAGCAAAAAGCTCTCAAACACCCTGGACGCTTGATCCAGTAGCGGTGGGTGCGCTCGATTATCGCCGCCATTTTTGTCATGAACTTTTATCTTTTAAACCGGCAGCGATACGTGGTAATGCTTCGGAAATCATGGCATTAGCTGGCATTGCTAATGGCGGACGGGGAGTGGATACCACTGACGCCGCAGCTAACGCGATACCCGCTGCACAAACACTGGCACGGGAAACTGGCGCAATCGTCGTGGTCACTGGCGAGATGGATTATGTTACCGATGGACATCGTATCATTGGTATTCACGGTGGTGATCCGTTAATGACCAAAGTGGTAGGAACTGGCTGTGCATTATCGGCGGTTGTCGCTGCCTGCTGTGCGTTACCAGGCGATACGCTGGAAAATGTCGCATCTGCCTGTCACTGGATGAAACAAGCCGGAGAACGCGCAGTCGCCAGAAGCGAGGGGCCAGGCAGTTTTGTTCCACATTTCCTTGATGCGCTCTGGCAATTGACGCAGGAGGTGCAGGCATAA

>CsAAE3 (配列番号:3)
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGAAAAGAGTGGCTACGGACGCGACGGTATTTACCGTAGCCTGCGTCCTCCTTTACACCTGCCAAACAATAACAATTTGAGTATGGTCTCATTCCTGTTCCGTAACAGCAGCAGCTATCCACAGAAACCGGCGTTGATCGATAGCGAGACTAATCAAATTTTATCTTTTAGTCATTTTAAAAGCACCGTGATCAAGGTCTCCCATGGCTTCTTAAACCTGGGGATCAAAAAGAATGACGTGGTTTTAATCTACGCACCCAATTCGATCCACTTTCCCGTATGCTTCCTTGGCATTATTGCTTCTGGGGCGATCGCCACTACTTCAAATCCATTATACACCGTGAGTGAGTTGTCGAAACAAGTAAAGGACTCGAACCCTAAATTGATTATCACAGTCCCTCAGTTATTGGAAAAGGTCAAGGGTTTCAATCTGCCAACTATCCTTATCGGCCCTGATTCTGAGCAGGAATCGTCTAGTGATAAAGTAATGACTTTCAATGATCTGGTCAATCTGGGAGGAAGTTCGGGTAGCGAATTCCCTATCGTCGACGATTTCAAGCAATCCGACACCGCCGCACTGTTGTACTCAAGTGGCACGACAGGTATGAGCAAGGGGGTCGTTCTGACGCACAAAAATTTTATTGCCTCATCGTTGATGGTAACAATGGAACAGGACTTGGTCGGCGAGATGGACAATGTGTTCCTGTGTTTCCTTCCTATGTTTCACGTCTTTGGCTTAGCCATTATTACGTATGCTCAGTTACAGCGCGGTAATACCGTGATTTCAATGGCCCGCTTTGACTTGGAAAAGATGTTAAAAGATGTTGAAAAGTACAAAGTTACCCACCTTTGGGTCGTACCCCCAGTTATCTTAGCGTTGTCGAAGAACTCAATGGTGAAAAAATTCAATTTGTCATCCATCAAGTATATTGGTTCAGGCGCTGCGCCATTAGGAAAGGATCTGATGGAAGAATGCTCTAAGGTGGTTCCTTACGGAATCGTGGCTCAAGGATATGGCATGACGGAAACGTGCGGAATCGTATCCATGGAAGACATCCGCGGCGGGAAACGCAATTCAGGGTCGGCCGGAATGTTGGCAAGTGGGGTAGAAGCTCAGATCGTGAGTGTGGACACCTTAAAACCCCTTCCCCCGAATCAATTAGGGGAAATCTGGGTAAAAGGTCCAAATATGATGCAAGGCTATTTCAACAATCCTCAAGCGACCAAACTTACCATTGATAAAAAGGGTTGGGTTCATACTGGCGACTTGGGGTATTTCGACGAAGACGGACACTTATATGTTGTAGACCGTATTAAGGAGCTTATTAAATACAAGGGATTCCAAGTTGCGCCTGCGGAACTGGAGGGATTATTAGTTAGTCACCCCGAGATCTTAGACGCGGTAGTTATTCCCTTCCCCGATGCTGAGGCAGGCGAAGTCCCGGTGGCATACGTTGTTCGCTCGCCTAACAGTTCGTTGACCGAAAATGACGTTAAAAAATTCATCGCCGGTCAGGTCGCCTCCTTTAAGCGTCTGCGCAAGGTTACTTTTATTAATTCCGTCCCCAAGAGCGCAAGTGGGAAGATTCTGCGCCGCGAGCTTATTCAAAAGGTTCGCTCTAACATGTAA

>GsMdcA (配列番号:5)
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAATAGAATACACCGGTCTAAACGTTCATGGACAACGCGTCGCGATGCGAAGGCAAAGCGAATGGCAAAATTGGAGCGAGTCGTGAACGGAAAAATTATACCAACAGATAAAATTGTAGAGGCATTAGAAGCGGTTATTGCTCCAGGGGATCGTGTTGTGTTAGAAGGAAATAATCAAAAACAAGCTTCGTTTCTATCCAAGGCATTATCCAAAGTTAACCCTGAGAAAGTGAACGGATTACATATGATTATGTCCAGTGTATCGCGACCAGAGCATTTAGATATATTTGAAAAAGGAATCGCTAGAAAAATTGATTTTTCTTATGCCGGCCCACAAAGTCTTCGCATGTCACAAATGCTGGAAGACGGAAAGCTTATTATAGGGGAAATCCATACCTATCTTGAGCTATATGGGCGGTTATTTATTGATTTGACTCCGTCTGTTGCACTAGTGGCGGCGGATAAAGCAGACCGATCGGGCAATTTGTATACAGGACCTAATACAGAGGAAACTCCAACGCTTGTTGAAGCTACGGCATTCCGGGACGGAATCGTTATAGCCCAAGTAAATGAACTGGCAGATGAACTGCCACGGGTAGATATACCTGGCTCTTGGATTGATTTTATCGTTGTTGCTGACCAGCCTTATGAATTAGAACCTCTTTTTACAAGAGATCCTCGCCTTATTACAGAAATCCAGATTCTTATGGCGATGATGACGATTAGAGGGATATATGAACGTCATAACATCCAATCTCTCAACCATGGAATCGGATTTAATACTGCGGCGATTGAGTTATTGCTTCCAACGTACGGAGAATCATTAGGATTGAAGGGGAAAATTTGCAGACATTGGGCATTGAATCCGCATCCTACCCTTATACCAGCTATTGAAACAGGATGGGTAGAAAGCATTCATTGTTTTGGAGGAGAAGTAGGAATGGAAAAGTATATTGCGGCACGTCCCGATGTGTTCTTTACTGGAAAAGATGGGAGTTTACGTTCAAACCGGGCATTATCCCAAGTAGCTGGACAGTATGCTGTCGATCTTTTTATCGGTTCTACTCTACAGATGGATAGGGATGGGAATTCTTCAACAGTAACGATTGGAAGACTGGCAGGATTCGGCGGGGCACCAAACATGGGGCATGATCCTCGTGGACGGCGCCATTCCACTCCTGCATGGCTAGATATGATAACGTCCGATCATCCGATCGCGAAAGGAAAAAAATTAGTCGTGCAGATAGTAGAAACGTTTCAAAAAGGAAATCGACCGGTATTTGTTGAGTCTTTAGATGCGATTGAAGTAGGGAAAAAGGCGAATTTGGCGACAGCGCCAATTATGATATATGGGGATGATGTGACCCATGTTGTCACTGAAGAAGGAATCGCATATTTGTATAAGGCGAATAGTTTAGAAGAACGCCGTCAGGCCATTGCGGCAATCGCCGGAGTCACACCGATTGGGCTAGAACATGATCCAAAAAGAACTGAGCAGTTGCGAAGGGATGGATTGGTGGCGTTTCCGGAGGATTTAGGCATACGCCGTACCGATGCCAAACGTTCTTTATTAGCAGCAAAAAGCATTGAAGAACTGGTTGAATGGTCGGAGGGATTGTATGAACCGCCGGCTAGATTTCGCAGCTGGTAA

>GsPTA (配列番号:7)
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGACAACCGATTTATTTACGGCATTAAAAGCGAAAGTAACCGGTACGGCTCGAAAAATCGTGTTTCCCGAGGGAACCGATGACCGCATCTTAACGGCGGCGAGCCGTTTGGCGACGGAGCAAGTGCTTCAGCCGATCGTCCTTGGCGATGAGCAAGCGATAAGGGTGAAAGCAGCTGCGCTTGGCTTGCCGCTTGAAGGGGTGGAGATTGTCAACCCGCGCCGCTACGGCGGGTTTGATGAGCTAGTTTCGGCGTTTGTGGAGCGGCGCAAAGGGAAAGTGACAGAAGAAACGGCGCGCGAGTTGCTTTTCGATGAAAACTATTTCGGTACGATGCTCGTTTATATGGGAGCGGCCGACGGCCTCGTCAGCGGGGCGGCACATTCGACGGCGGATACGGTCCGACCAGCCTTGCAAATCATTAAAACGAAGCCAGGCGTTGACAAAACGTCCGGCGTGTTCATCATGGTGCGCGGCGACGAAAAATATGTGTTTGCCGATTGCGCCATCAACATTGCTCCTAACAGTCATGATTTGGCTGAAATCGCGGTCGAGAGCGCCCGGACGGCCAAAATGTTCGGCCTTAAGCCGCGCGTAGTGCTGTTAAGCTTTTCCACGAAAGGGTCGGCCTCGTCGCCGGAGACGGAAAAAGTCGTTGAGGCGGTGCGGTTGGCGAAAGAAATGGCGCCGGATCTGATCCTTGACGGTGAGTTTCAATTTGACGCCGCGTTTGTGCCAGAGGTGGCGAAAAAGAAAGCGCCGGACTCGGTCATTCAAGGGGACGCAAATGTCTTTATTTTCCCGAGCCTTGAGGCGGGCAACATCGGCTACAAAATCGCCCAGCGCCTTGGCGGCTTTGAAGCGGTTGGCCCGATTTTGCAAGGGCTGAACAAGCCGGTTAACGACCTATCGCGCGGCTGCAGCGCCGAAGACGCCTACAAGCTCGCGCTCATCACCGCGGCGCAGTCGCTTGGGGAG

>CsOLS (配列番号:9)
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAATCATCTGCGTGCTGAAGGACCAGCTTCCGTATTGGCAATTGGAACAGCTAACCCTGAGAACATTCTTCTTCAGGATGAGTTTCCCGACTATTACTTCCGCGTGACAAAGAGCGAACACATGACACAGCTTAAAGAGAAGTTCCGTAAGATCTGTGACAAAAGCATGATCCGCAAACGTAACTGCTTCCTTAACGAGGAGCATCTGAAGCAGAATCCCCGTCTTGTTGAACATGAGATGCAGACCTTGGATGCTCGCCAGGACATGTTGGTTGTTGAGGTCCCTAAGCTGGGCAAAGATGCGTGTGCAAAAGCGATTAAAGAGTGGGGGCAGCCTAAAAGCAAAATTACTCATCTGATTTTCACAAGCGCCAGTACAACCGATATGCCCGGTGCGGACTACCATTGTGCAAAATTATTGGGTTTATCGCCTTCAGTAAAACGTGTTATGATGTACCAGTTAGGATGCTACGGTGGTGGCACCGTACTTCGTATTGCGAAGGACATCGCCGAGAACAACAAAGGAGCCCGTGTACTTGCTGTATGTTGTGATATCATGGCGTGCCTTTTTCGCGGCCCCAGCGAGAGTGACCTTGAGTTACTTGTGGGGCAGGCCATCTTCGGAGACGGTGCCGCAGCCGTCATTGTTGGCGCAGAGCCCGATGAATCCGTTGGCGAGCGCCCGATCTTTGAGCTTGTAAGTACAGGACAAACTATCTTGCCCAACTCTGAGGGGACTATCGGCGGACATATTCGTGAGGCGGGCTTGATTTTTGACCTTCACAAGGATGTTCCAATGCTTATCTCCAATAATATTGAAAAATGTCTTATCGAAGCATTCACTCCGATTGGTATCTCCGATTGGAATTCGATTTTTTGGATCACCCATCCTGGTGGGAAAGCTATTTTAGACAAGGTGGAGGAGAAATTACATCTTAAGTCAGATAAGTTTGTCGACAGTCGCCACGTGTTGTCGGAACATGGCAACATGTCATCGTCAACCGTCTTGTTCGTTATGGACGAATTACGTAAACGCAGTTTAGAAGAGGGTAAGAGTACGACGGGGGACGGGTTCGAGTGGGGAGTCTTATTCGGGTTCGGTCCAGGATTGACAGTGGAACGCGTCGTGGTTCGCAGTGTCCCCATTAAGTACTAA

>CsOAC (配列番号:11)
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCAGTCAAACACTTGATCGTGTTAAAGTTCAAAGATGAAATCACAGAGGCTCAGAAGGAAGAATTTTTCAAGACGTATGTAAACCTTGTTAATATCATCCCCGCTATGAAGGATGTGTATTGGGGTAAAGACGTGACACAGAAGAACAAAGAGGAAGGCTACACGCACATCGTAGAGGTCACATTTGAGAGCGTCGAAACTATTCAGGATTACATCATTCATCCCGCACACGTTGGATTCGGGGATGTGTATCGCTCTTTCTGGGAAAAATTGCTGATCTTCGACTATACACCGCGTAAGTAA

>GtADK (配列番号:13)
ATGAATTTAGTGCTGATGGGGCTGCCAGGTGCCGGCAAAGGCACGCAAGCCGAGAAAATCGTAGAAACGTATGGAATCCCACATATTTCAACCGGGGATATGTTTCGGGCGGCGATGAAAGAAGGCACACCGTTAGGATTGCAGGCAAAAGAATATATCGACCGTGGTGATCTTGTTCCGGATGAGGTGACGATCGGTATCGTCCGTGAACGGTTAAGCAAAGACGACTGCCAAAACGGCTTTTTGCTTGACGGATTCCCACGCACGGTTGCCCAAGCGGAGGCGCTGGAAGCGATGCTGGCTGAAATCGGCCGCAAGCTTGACTATGTCATCCATATCGATGTTCGCCAAGATGTGTTAATGGAGCGCCTCACAGGCAGACGAATTTGTCGCAACTGCGGAGCGACATACCATCTTGTTTTTCACCCACCGGCTCAGCCAGGCGTATGTGATAAATGCGGTGGCGAGCTTTATCAGCGCCCTGACGATAATGAAGCAACAGTGGCGAATCGGCTTGAGGTGAATACGAAACAAATGAAGCCATTGCTCGATTTCTATGAGCAAAAAGGCTATTTGCGCCACATTAACGGCGAACAAGAAATGGAAAAAGTGTTTAGCGACATTCGCGAATTGCTCGGGGGACTTACTCGATGA

>RpMatB (配列番号:15) ATGAACGCCAACCTGTTCGCCCGCCTGTTCGATAAGCTCGACGACCCCCACAAGCTCGCGATCGAAACCGCGGCCGGGGACAAGATCAGCTACGCCGAGCTGGTGGCGCGGGCGGGCCGCGTCGCCAACGTGCTGGTGGCACGCGGCCTGCAGGTCGGCGACCGCGTTGCGGCGCAAACCGAGAAGTCGGTGGAAGCGCTGGTGCTGTATCTCGCCACGGTGCGGGCCGGCGGCGTGTATCTGCCGCTCAACACCGCCTATACGCTGCACGAGCTCGATTACTTCATCACCGATGCCGAGCCGAAGATCGTGGTGTGCGATCCGTCCAAGCGCGACGGGATCGCGGCGATTGCCGCCAAGGTCGGCGCCACGGTGGAGACGCTTGGCCCCGACGGTCGGGGCTCGCTCACCGATGCGGCAGCTGGAGCCAGCGAGGCGTTCGCCACGATCGACCGCGGCGCCGATGATCTGGCGGCGATCCTCTACACCTCAGGGACGACCGGCCGCTCCAAGGGCGCGATGCTCAGCCACGACAATTTGGCGTCGAACTCGCTGACGCTGGTCGATTACTGGCGCTTCACGCCGGATGACGTGCTGATCCACGCGCTGCCGATCTATCACACCCATGGATTGTTCGTGGCCAGCAACGTCACGCTGTTCGCGCGCGGATCGATGATCTTCCTGCCGAAGTTCGATCCCGACAAGATCCTCGACCTGATGGCGCGCGCCACCGTGCTGATGGGTGTGCCGACGTTCTACACGCGGCTCTTGCAGAGCCCGCGGCTGACCAAGGAGACGACGGGCCACATGAGGCTGTTCATCTCCGGGTCGGCGCCGCTGCTCGCCGATACGCATCGCGAATGGTCGGCGAAGACCGGTCACGCCGTGCTCGAGCGCTACGGCATGACCGAGACCAACATGAACACCTCGAACCCGTATGACGGCGACCGCGTCCCCGGCGCGGTCGGCCCGGCGCTGCCCGGCGTTTCGGCGCGCGTGACCGATCCGGAAACCGGCAAGGAACTGCCGCGCGGCGACATCGGGATGATCGAGGTGAAGGGCCCGAACGTGTTCAAGGGCTACTGGCGGATGCCGGAGAAGACCAAGTCTGAATTCCGCGACGACGGCTTCTTCATCACCGGCGACCTCGGCAAGATCGACGAGCGCGGCTACGTCCACATCCTCGGCCGCGGCAAGGATCTGGTGATCACCGGCGGCTTCAACGTCTATCCGAAGGAAATCGAGAGCGAGATCGACGCCATGCCGGGCGTGGTCGAATCCGCGGTGATCGGCGTGCCGCACGCCGATTTCGGCGAGGGCGTCACTGCCGTGGTGGTGCGCGACAAGGGTGCCACGATCGACGAAGCGCAGGTGCTGCACGGCCTCGACGGTCAGCTCGCCAAGTTCAAGATGCCGAAGAAAGTGATCTTCGTCGACGACCTGCCGCGCAACACCATGGGCAAGGTCCAGAAGAACGTCCTGCGCGAGACCTACAAGGACATCTACAAGTAA

>GsPPase (配列番号:17)
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCCTTTGAGAATAAGATTGTCGAAGCGTTTATCGAAATTCCAACCGGCAGCCAAAACAAATACGAGTTCGACAAAGAGCGGGGCGTTTTCAAACTCGACCGCGTCTTGTACTCCCCGATGTTTTACCCGGCTGAGTACGGCTACTTGCAAAATACGCTGGCGCTCGATGGCGACCCGCTCGACATTTTGGTCATCACAACGAATCCGACATTCCCGGGCTGCGTCATCGATACGCGTGTCATCGGCTTTTTGAACATGGTCGACAGCGGTGAGGAGGACGCGAAGCTCATCGGCGTGCCAGTCGAAGACCCGCGCTTTGATGAAGTCCGCTCGATTGAAGACCTGCCGCAGCACAAGCTGAAAGAAATCGCCCACTTCTTTGAACGGTACAAAGACTTGCAAGGCAAGCGGACGGAAATCGGCACATGGGAAGGGCCGGAAGCTGCGGCAAAACTGATCGATGAGTGCATCGCCCGCTATAACGAACAAAAATAA

>GsFPPS-S82F (配列番号:19)
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCGCAGCTTTCAGTTGAACAGTTTCTCAACGAGCAAAAACAGGCGGTGGAAACAGCGCTCTCCCGTTATATAGAGCGCTTAGAAGGGCCGGCGAAGCTGAAAAAGGCGATGGCGTACTCATTGGAGGCCGGCGGCAAACGAATCCGTCCGTTGCTGCTTCTGTCCACCGTTCGGGCGCTCGGCAAAGACCCGGCGGTCGGATTGCCCGTCGCCTGCGCGATTGAAATGATCCATACGTACTTTTTGATCCATGATGATTTGCCGAGCATGGACAACGATGATTTGCGGCGCGGCAAGCCGACGAACCATAAAGTGTTCGGCGAGGCGATGGCCATCTTGGCGGGGGACGGGTTGTTGACGTACGCGTTTCAATTGATCACCGAAATCGACGATGAGCGCATCCCTCCTTCCGTCCGGCTTCGGCTCATCGAACGGCTGGCGAAAGCGGCCGGTCCGGAAGGGATGGTCGCCGGTCAGGCAGCCGATATGGAAGGAGAGGGGAAAACGCTGACGCTTTCGGAGCTCGAATACATTCATCGGCATAAAACCGGGAAAATGCTGCAATACAGCGTGCACGCCGGCGCCTTGATCGGCGGCGCTGATGCCCGGCAAACGCGGGAGCTTGACGAATTCGCCGCCCATCTAGGCCTTGCCTTTCAAATTCGCGATGATATTCTCGATATTGAAGGGGCAGAAGAAAAAATCGGCAAGCCGGTCGGCAGCGACCAAAGCAACAACAAAGCGACGTATCCAGCGTTGCTGTCGCTTGCCGGCGCGAAGGAAAAGTTGGCGTTCCATATCGAGGCGGCGCAGCGCCATTTACGGAACGCTGACGTTGACGGCGCCGCGCTCGCCTATATTTGCGAACTGGTCGCCGCCCGCGACCATTAA

>EcIDI (配列番号:20)
ATGCAAACGGAACACGTCATTTTATTGAATGCACAGGGAGTTCCCACGGGTACGCTGGAAAAGTATGCCGCACACACGGCAGACACCCGCTTACATCTCGCGTTCTCCAGTTGGCTGTTTAATGCCAAAGGACAATTATTAGTTACCCGCCGCGCACTGAGCAAAAAAGCATGGCCTGGCGTGTGGACTAACTCGGTTTGTGGGCACCCACAACTGGGAGAAAGCAACGAAGACGCAGTGATCCGCCGTTGCCGTTATGAGCTTGGCGTGGAAATTACGCCTCCTGAATCTATCTATCCTGACTTTCGCTACCGCGCCACCGATCCGAGTGGCATTGTGGAAAATGAAGTGTGTCCGGTATTTGCCGCACGCACCACTAGTGCGTTACAGATCAATGATGATGAAGTGATGGATTATCAATGGTGTGATTTAGCAGATGTATTACACGGTATTGATGCCACGCCGTGGGCGTTCAGTCCGTGGATGGTGATGCAGGCGACAAATCGCGAAGCCAGAAAACGATTATCTGCATTTACCCAGCTTAAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

>NphBM31^S (配列番号:35)
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGTCGGAAGCTGCCGATGTAGAACGTGTCTACGCCGCCATCGAAGAAGCCGCAGGTTTGTTGGGGGTCGCATGCGCACGCGATAAGATTTGGCCCTTGCTGTCAACATTCCAGGATACCTTGGTTGAGGGTGGAAGCGTAGTTGTTTTTAGCATGGCCTCGGGGCGTCACTCAACGGAGCTGGACTTCTCAATTTCCGTCCCGCCTAGTCATGGCGATCCGTACGCGATTGTGGTGGAAAAGGGCTTGTTCCCGGCAACTGGACATCCAGTTGATGACCTTCTGGCGGACATTCAGAAGCATCTTCCCGTATCTATGTTTGCGATTGACGGGGAAGTTACCGGGGGGTTCAAAAAAACTTATGCGTTCTTCCCGACCGATAACATGCCCGGTGTCGCGGAACTGGCGGCCATCCCATCGATGCCTCCTGCAGTCGCTGAAAATGCTGAACTGTTCGCGCGTTATGGCCTGGACAAGGTACAAATGACCTCGATGGATTATAAAAAACGTCAAGTGAACCTGTATTTCTCCGAACTGTCGGCTCAGACGCTGGAGGCTGAATCAGTACTTGCTTTAGTGCGTGAACTGGGTCTTCATGTCCCAAACGAGCTGGGTCTGAAATTTTGCAAACGCTCCTTCTCAGTATACCCAACATTAAACTGGGACACCTCGAAGATTGACCGCCTTTGCTTCTCTGTAATCAGTACAGATCCGACACTTGTACCTAGCTCAGACGAGGGAGACATTGAAAAATTTCACAATTACGCTACAAAGGCCCCCTATGCATATGTTGGAGAAAAGCGTACACTTGTTTACGGCTTGACTTTATCTCCCAAAGAGGAGTATTATAAATTGGGTGCCGTTTACCACATTACTGACGTACAACGCAAACTTTTGAAGGCGTTCGACAGCCTTGAGGATTAA

>Methanocaldococcus jannaschii IPK (配列番号:58)
ATGTTGACTATTCTTAAGTTGGGAGGGAGCATTCTGTCCGATAAAAACGTTCCATATAGCATTAAGTGGGATAACTTAGAACGTATTGCTATGGAAATCAAAAACGCGTTAGATTATTACAAGAACCAAAATAAAGAAATTAAGCTTATTCTGGTACATGGCGGCGGGGCATTTGGGCATCCAGTGGCCAAGAAATACCTGAAGATTGAAGACGGCAAAAAAATTTTCATCAACATGGAAAAAGGATTCTGGGAGATTCAGCGTGCGATGCGCCGTTTTAATAACATCATCATCGACACGCTTCAGAGTTACGATATCCCAGCGGTCTCGATTCAACCTTCCAGCTTTGTTGTTTTTGGCGACAAATTGATCTTCGACACCTCTGCGATCAAAGAGATGTTGAAACGCAACCTTGTACCCGTTATCCATGGGGATATCGTCATTGACGATAAAAATGGGTACCGTATTATCAGCGGTGACGACATCGTGCCATATTTAGCCAATGAACTGAAGGCAGATTTAATCCTTTATGCAACCGACGTGGACGGCGTATTGATTGACAACAAGCCCATTAAACGCATTGATAAGAATAATATCTACAAGATTTTGAATTATCTTTCGGGTAGCAATTCAATTGACGTCACGGGGGGGATGAAATACAAGATCGACATGATCCGTAAAAACAAATGCCGTGGTTTCGTGTTTAATGGCAACAAGGCAAACAACATTTATAAGGCGCTGCTTGGGGAAGTCGAGGGTACCGAAATCGACTTTTCTGAATAA

プライマー配列

EcThiM
FOR 5’ CCGCGCGGCAGCCATATGCAAGTCGACCTGCTGGGTTCAGCGCAATCTGC 3’(配列番号:28)
REV 5’ GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATGCCTGCACCTCCTGCGTCAATTGCCAGAGCGC 3’(配列番号:29)

RpMatB
FOR 5’ CCGCGCGGCAGCCATATGAACGCCAACCTGTTCGCCCGCCTGTTCG 3’(配列番号:31)
l REV 5’ GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTACTTGTAGATGTCCTTGTAGGTCTCGCGCAGG 3’(配列番号:32)

GtADK
FOR 5’GGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAATTTAGTGCTGATGGGGCTGCC 3’(配列番号:33)
REV 5’CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATCGAGTAAGTCCCCCGAGC 3’(配列番号:34)

【0142】

大部分の酵素は、大腸菌BL21 (DE3) Goldで発現されるが、例外として、CsOLS、CsAAE3、及びGsMdcAは、大腸菌C43 BL21(DE3)で発現される。50 μg/mLカナマイシンを含む1 LのLB培地に、1 mLの飽和培養液を接種し、OD₆₀₀ 0.6～0.8に増殖させた。IPTGを(1 mM)に添加することによりタンパク質発現を誘導し、培養物を18℃で一晩インキュベートした。2,500×gで遠心分離して細胞を採取し、20 mLの結合緩衝液(50 mM Tris pH8.0、150 mM NaCl、及び10 mMイミダゾール)に再懸濁した。該細胞を、Emulsiflex(Avestin)装置を用いて溶解し、20,000×gで20分間遠心分離することにより溶解物を清澄化した。20%エタノール中のNiNTA樹脂の50% v/v懸濁液を清澄化された溶解物(2 mL/1 L培養物)に添加し、4℃で30分間穏やかに混合しながらインキュベートした。清澄化された溶解物を重力フローカラムに移した。フロースルーを廃棄し、カラム容量の5～10倍の結合緩衝液でカラムを洗浄した。洗浄液を廃棄し、酵素をカラム容量の2～3倍の溶出緩衝液(50 mM Tris pH8.0、150 mM NaCl、250 mMイミダゾール、及び25% (v/v)グリセリン)で溶出させた。

【0143】

ATPase活性が高いことにより、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、CsAAE3、CsOLS、CsOAC、及びEcThiMをさらに精製した。3～6 mLのCsAAE3、CsOLS、及びEcThiMを16/600 Superdex 200カラムに負荷した。流速は、1 mL/分で、緩衝液は、50 mM Tris pH8.0及び200 mM NaClであった。2 mLの溶出画分を、10 kDa Amiconフィルター(Millipore Sigma)を用いて濃縮し、15%グリセロールを添加した。3～6 mLのOACを16/600 Superdex 75カラムに負荷した。流速は、1 mL/分で、緩衝液は、50 mM Tris pH8.0、200 mM NaCl、及び10%グリセロールであった。20%グリセロールを含まないOAC沈殿物、即ち2 mLの50 mM Tris pH8、200 mM NaCl及び40%グリセロールを画分収集チューブに添加し、最終グリセロール濃度を20%に調整した。次いで、5 kDaのAmiconフィルターを用いてOACを濃縮した。SEC精製後には、EcThim ATPase活性を依然として存在したため、溶出画分を50 mM Trisに3倍に希釈し、これを50 mM Tris pH8.0及び50 mM NaClで平衡化した5 mLのセファロースカラムに負荷した。該カラムを50 mM Tris pH8.0及び50 mM NaClで洗浄した後、100%の50 mM Tris pH8.0及び1M NaClまで直線勾配で溶出させた。Thimを含む画分を濃縮し、グリセロールを15%添加した。全ての酵素を必要になるまで-80℃に保存した。

【0144】

MatBを用いたOA/DA反応の条件
マロニル-CoAを産生するためのRpMatBを用いた反応の条件は、次の通りであった：15 mMマロネート、5 mMヘキサノエートまたは5 mMブチレート、1 mM CoA、4 mM ATP、25 mMクレアチンリン酸塩、10 mM KCl、5 mM MgCl₂、50 mM Tris pH8.0、1.3 μM RpMatB、4.9 μM CsAAE3、2.9 μM CsOLS、46.6 μM CsOAC、7.6 μM GsPpase、2.6 μM ADK、及び2単位のCPK(Sigma Aldrich社)。添加反応については、該反応を開始する前に、GPP(0.5～2 mM)、OA(0.25～2 mM)、及びDA(0.25～5 mM)を添加した。

【0145】

時間経過のため、5分から5時間までの様々な時点で反応を停止させた(下記参照)。添加剤との反応を4時間で停止させた。

【0146】

MdcAを用いたOA/DA反応の条件
MdcA経路を用いた実験のための反応条件は、以下の通りであった：4 mM ATP、1 mM CoA、5 mM MgCl₂、10 mM KC1、5 mMヘキサノエートまたはブチレート、15 mMマロネート、50 mMアセチルリン酸、50 mM Tris pH8.0、1.3 μM SeAckA、1.4 μM GsMdcA、4.5 μM CsAAE3、2.9 μM CsOLS、50 μM CsOAC、2.6 μM GtADK、2.6 μM GsPpase、1.6 μM GsPTA。BSAの作用は、BSAを該反応に滴定することによって試験した。時間経過反応は、20 mg/mL BSAを含有するか、BSAを含まない。BSA滴定反応を4時間で停止させた。時間経過の実験を0.5時間から5時間まで様々な時点で停止させた。

【0147】

イソプレノイド反応の条件
GPPを産生するためのイソプレノール経路の能力を試験した反応条件は、以下の通りであった：1 mM ATP、5 mM MgCl₂、5 mM OAまたはDA、50 mMアセチルリン酸、50 mM Tris pH8.0、15.2 μM EcThim、2.1 μM MjIPK、6.6 μM EcIDI、2.5 μM GsFPPS-S82F、13.2 μM NphB M31^s、1.3 μM SeAckA、及び20 mg/mL BSA。0.5時間から25時間までの様々な時点で該反応を停止させた。

【0148】

全経路の反応条件
全経路についての反応条件は次の通りであった：4 mM ATP、1 mM CoA、5 mM MgCl₂、10 mM KC1、5 mM ヘキサノエートまたはブチレート、15 mMマロネート、50 mMアセチルリン酸、50 mM Tris pH8.0、1.3 μM SeAckA、1.4 μM GsMdcA、4.5 μm CsAAE3、2.9 μM CsOLS、50 μM CsOAC、2.6 μM GtADK、2.6 μM GsPpase、1.6 μM GsPTA、5.2 μM EcThim、2.1 μM MjIPK、6.6 μM EcIDI、2.5 μM GsFPPS-S82F、13.2 μm NphB M31^s、及び20 mg/mL BSA。

【0149】

生成物の力価に対する添加剤の効果を試験するために、反応が開始される前に、酢酸塩(25～100 mM)またはリン酸塩(25～100 mM)を添加した。6時間で該反応を停止させた。時間経過について、0.5時間から10時間までの様々な時点で該反応を停止させた。また、AcPを25 mMから200 mMまで滴定して、最適な開始条件の使用を確保した。これらの反応を4時間で停止させた。

【0150】

リサイクルされた酵素の反応条件
反応条件は、上記した全経路の反応条件と同様であった。6時間後、200 μlの反応混合物を3 kDaタンパク質濃縮器に添加し、300 μLの緩衝液(50 mM Tris pH8.0、200 mM NaCl)を添加した。4℃で16,000×gで15分間遠心分離した後、試料体積を100μlまで減少させた。次いで、400 μLの緩衝液(50 mM Tris pH8.0、200 mMのNaCl)をタンパク質濃縮器に添加し、4℃で16,000×gでさらに15分間遠心分離した。その後、以下のようにして新たな反応を設定した。該タンパク質濃縮器からの100 μLの酵素、4 mM ATP、1 mM CoA、5 mM MgCl₂、10 mM KC1、5 mMヘキサノエート、15 mMマロネート、50 mMアセチルリン酸、及び50 mM Tris pH8.0。さらに31時間後(合計37時間)に2次反応を停止させた。

【0151】

試料のHPLC分析
全ての試料をメタノール中に4倍希釈(分析物の濃度が高い試料については、10倍希釈)することにより反応を停止させた。タンパク質沈殿物を16,000×gで5分間遠心分離して除去し、分析のため上清をLCバイアルに移した。

【0152】

Thermo Ultimate 3000 HPLCを用いて、Syncronis C8カラム(4.6×100 mm)を備えた逆相クロマトグラフィーにより試料を分析した。カラム温度は、40℃に設定し、流量は、1 mL/分であった。試料の注入量は、20 μL(フルループ)であった。水+0.1%TFA(溶媒A)及びアセトニトリル+0.1%TFA(溶媒B)を移動相とするグラジェエント溶出を用いて化合物を分離した。最初の1分間は、20%の溶媒Bを保持した。次いで、溶媒Bを4分間かけて95%まで上昇させ、それを3分間保持した。次いで、該カラムを20%の溶媒Bに3分間再平衡化し、合計分析時間を11分間とした。標準品を用いて保持時間を同定し、定量用の外部標準曲線を作成した。

【0153】

GPP定量アッセイ
反応の50 μL分量を150 μLのメタノール中で停止させた。遠心分離によりタンパク質を除去し、高速真空で上清を乾燥した。溶媒を除去すると、50 μLのTris pH8.0及び2単位のウシ腸アルカリ脱リン酸酵素(CIP)を添加した。該反応を16時間インキュベートし、100 μLのヘキサンで反応物を抽出した。反応抽出物を、Thermo Scientific TG-WAXMSカラム(30 m×0.32 mm×0.25 μM)を備えたThermo Scientific Trace 1310 GC-FID装置で分析した。キャリアガスはヘリウム(30 mL/分)で、スプリット比は1：1で、注入量は2 μLであった。注入温度は250℃に設定した。初期温度は80℃で6分間保持し、12℃/分の速度で260℃まで上昇し、そして260℃で3分間保持した。合計分析時間を24分間とした。GPPは、試料と同様にして調製した外部標準曲線に基づいて定量した。

【0154】

NphBの安定化
初期設定のパラメータを有するPROSSソフトウェアを使用して、以前に記載されたNphBM31酵素の安定化されたバージョンを開発した。出発モデルとして、ストレプトマイセス属CL190(RCSB：1ZB6)からの野生型Orf2の結晶構造の鎖Aを用いた。小分子リガンドMg²⁺(MG)及び1,6ジヒドロキシナフタレン(DHN)をインプットして、活性部位への変異を排除した。以下の変異を有するNphBM31Sと呼ばれる変異体は、酵素を熱不活性化に対して安定化することが見出された：
M14I、Y31W、T69P、T77I、T98I、S136A、E222D、G224S、A232S、N236T、Y288V、及びG297K。NphB M31とNphB M31^sの熱不活性化プロファイルを図10で比較している。熱不活性化プロファイルを得るために、1 mg/mLのNphB M31または親NphB M31^sのいずれかをエッペンドルフサーモサイクラーで303.1、306.7、311.6、314.2、316.9、319.3、323.3、325.6、328.3、及び333.1 Kで20分間加熱し、残存活性をアッセイした。

【0155】

ATPaseアッセイ
反応に付加されるATPase活性の量を測定するために、ATPase活性をPKLDHに結合させた。反応条件は以下の通りであった：5 mM PEP、2 mM ATP、1 mM NADH、5 mM MgCl₂、10 mM KC1、約1U PKLDH (Sigma)、及び全経路反応条件からの酵素マスターミックス。バックグラウンドATPase活性の尺度として、340 nmにおけるNADH 吸光度の低下を用いた。

【0156】

MatB活性アッセイ
結合酵素アッセイを用いて、OA及びDAの存在下でのMatBの活性を測定した。反応条件は以下の通りであった：2.5 mMマロネート、2 mM ATP、1 mM CoA、2.5 mMホスホエノールピルビン酸(PEP)、1 mM NADH、5 mM MgCl₂、10 mM KC1、0.35 mg/mL ADK、0.75 μg/mL MatB、1.6単位のPK及び2.5単位のLDH、及び50 mM Tris [pH8.0]。バックグラウンドATPase活性は、基質（マロネート）を除外することで制御し、1％エタノール、250 μMまたは5 mM OAまたは5 mM DAのいずれかを残りの反応に添加した。MatBの活性は、M2 SpctraMaxを用いて、NADH消費による340 nmにおける吸光度の低下をモニターすることにより測定した。MatBが5 mM OAまたはDAで制限していることを確実にするために、MatBを1.5 μg/mLに倍増させた。該反応の速度は倍増し、MatBが系内の制限成分であることを示した。5 mM OAと5 mM DAにおけるNADHの消費速度を1%エタノールの対照に正規化した。

【0157】

AAE3活性アッセイ
上記のものと同様の結合酵素アッセイを用いて、OA及びDAの存在下でのAAE3の活性を測定した。その条件は、以下の改変を行ったが、MatBアッセイと同様であった。マロネートの代わりに2.5 mMヘキサノエートを添加し、そして、MatBの代わりに15 μg/mL AAE3を添加した。AAE3が制限していることを確実にするために、AAE3を5 mM OAまたはDAの存在下で倍増させた。該反応の速度は倍増し、AAE3が制限していたことを示した。

【0158】

CPK活性アッセイ
結合酵素アッセイを用いて、OAまたはDAの存在下でCPKの活性を測定した。その反応条件は以下の通りであった：5 mMクレアチンリン酸塩、2 mM ADP、5 mMグルコース、2 mM NADP⁺、5 mM MgCl₂、5 mM KCl、0.3 mg/mL Zwf、0.1 mg/mL Sc Hex、及び0.08単位のCPK。陽性対照反応は1%エタノールを含み、残りの反応には5 mM OA またはDAのいずれかを添加した。340 nmにおけるNADPHの吸光度をモニターした。CPKが制限していることを確実にするために、CPKの添加量を5 mM OA及び5 mM DAで倍増させた。得られる速度は倍増し、CPKが高いOA及びDAであっても制限する事象であることを示した。

【0159】

ADK活性アッセイ
結合酵素アッセイを用いて、OA及びDAの存在下でADKの活性を測定した。その条件は、以下の改変を行ったが、MatBアッセイと同様であった。マロネートの代わりに2 mM AMPを添加し、CoAを添加せず、0.001 mg/mL ADKを添加した。ADKが5 mMのOA及びDAで制限試薬であることを確実にするために、ADKの量を倍増させた。速度は倍増し、ADKが制限因子であることを示した。

【0160】

OLS活性アッセイ
阻害実験のため、条件を以下のように変更した：1 mMマロニル-CoA、50 mMクエン酸緩衝液中の400 μMヘキサノイル-CoA、pH5.5、最終容量200 μL。1%エタノール、250 μM OAまたは1 mM DAのいずれかを反応に添加し、次いで0.65 mg/mL OLSを添加して反応を開始させた。2、4、6、及び8分で、50 μL分量を150 μLのメタノール中で急冷させた。該反応物を短時間撹拌し、16,000×gで2分間遠心分離して、タンパク質をペレット化した。その上清をHPLCで分析した。HTAL、PDAL、及びオリベトールの生ピーク面積を合計し、時間に対してプロットして速度を測定した。OAを補充した反応とDAを補充した反応の速度をエタノール対照に正規化した。

【0161】

CBGVA定量
確証的CBGVA標準品は直ちに利用できなかったため、CBGVA標準品を産生し、NMRで定量した。上記のイソプレノイド反応条件下で記載したように、入力としてAcP、イソプレノール、及びジバリン酸を使用して1 mLの反応を設定した。該反応物を3 mLのヘキサンで抽出し、該ヘキサンをアルゴン下で乾燥した。該試料を、1 mMの1,3,5-トリメトキシベンゼン(TMB)を内部標準として含有する500 μLの重水素化メタノールに再溶解した。Bruker AV400分光計を用いて該試料を分析した。NMRスペクトルは、以前に公開された結果と一致し、CBGVAは、6.27 ppmにおける一重線水素ピークを内部標準と比較することによって定量した。定量されたCBGVA試料を用いて、HPLC上の外部標準曲線を作成した。

【0162】

in vitroでOA/DAを合成する能力を試験し、トラブルシューティングするために、図2Aに示された切断されたシステム(MatBシステム)を構築した。その中で、MatBを用いて伝統的な方法でマロニル-CoAが産生され、また、アシル活性化酵素AAE3を用いてヘキサノイル-CoA(またはbutyrl-CoA)が産生された。ヘキサノイル-CoA(またはbutyryl-CoA)及びマロニル-CoAをオリベトリン酸合成酵素(OLS)に使用し、直鎖テトラケチイドを構築し、これは次に、オリベトリン酸環化酵素(OAC)によってOA/DAに変換される。該切断された試験系では、ATPは、アデニレートキナーゼ(ADK；配列番号:14またはそれと85%～100%の同一性を有する配列)とクレアチンキナーゼ(CPK)との組み合わせを用いてAMPから犠牲基質クレアチンリン酸塩と共に再生された。

【0163】

初期反応条件は、酵素特異的活性から選択され、5 mMまでのOAを産生するのに十分なインプットを提供した。MatBとAAE3はATPとCoAについて競合するので、ヘキサノイルCoAあたり3マロニルCoAを産生するおおよその比率を目標とした。各反応成分を個別に滴定しながら、残りの成分を一定に保つことにより、該経路を最適化した。OLSは、目的のテトラケチドに加えてデッドエンド副産物を放出する不正確な酵素であり、該最適化プロセスから得られた重要な発見の1つは、副産物の形成を抑制するためにOLSとAAE3の濃度のバランスを取ることの重要性であった。実験に示されたように、OLS及びAAE3の濃度が増加するにつれて、該システムは、OAに対する副産物のより高い割合をもたらし(図4)、それは、他の全ての反応成分に対してポリケチドの開始、伸長及び終結事象を同調させることが重要であることを示唆した。図2Bは、最適化されたMatBシステムの反応の時間経過を示しているOAの産生は、2.5時間で148±34 mg/L (660±150 μM)の最終力価に達し、 DAの産生は、4時間で78±12 mg/L (400±61 μM)の最終力価に達した。

【0164】

代謝物を可能な阻害についてスクリーニングし、OAとDAの両方の蓄積が該経路を阻害することを見出した。図2Cに示されたように、1 mM OAは、DAの産生を90%減少させた。一方、DAはそれほど強力な阻害剤ではなく、1 mM DAはOA産生を30％減少させた。阻害された酵素を同定するために、個々の酵素を該経路中でスクリーニングし、OA及びDAがOLS活性を強く阻害することを見出した(図5)。

【0165】

該反応は直接CBGA/CBGVAに変換することによって行うので、OA/DA阻害を減少させるために、実験を行って前記反応からOA/DAを除去した。このGPPを試験するために、安定化されたCBGA合成酵素を前記システムに添加した(図6)。使用されたCBGA合成酵素のNphB M31^sは、以前に設計された可溶性酵素 (Valliereら、Nat. Commun. 10:565, 2019)の安定化されたバージョンである。改善された力価の代わりに、より多くのGPPを添加することは、実際には少ないCBGAをもたらし、GPPはまた、該反応の成分を抑制できることを示した。OA産生におけるGPP濃度の影響を試験するための実験を行った。500 μM GPPでは、OA産生量は40%減少した(図2C)。まとめとして、これらの結果に示されたように、全経路における高レベルのカンナビノイドの産生には、反応過程における低濃度のOA/DA及びGPPを維持することが必要である。

【0166】

次に、APモジュールを、ATP消費を低減するためのMdcAを含むARモジュールで試験した(MdcAシステム、図2D)。図2Eに示されたように、完全なAPモジュールは、5時間で132±24 mg/LのOAまたは250±30 mg/L DAを生じ、マロニル-CoA産生のためにMatBを用いて観察されたものと同様であった。この結果はOLSが最も問題のある酵素であることを示唆しているため、カルコン合成酵素の既知の活性化因子（OLSと相同）に焦点を当てて、性能を高める可能性のある添加剤をスクリーニングした。ウシ血清アルブミン（BSA）の添加により、OAとDAの両方の産生が350±10 mg/Lに改善された(図2E)。

【0167】

次に、これらのISO/CANモジュールを、外部からOA/DAを結合されたISO/CANジュールに供給することによって、APモジュールとは別個に試験した。該結合されたISOモジュールとCANモジュールのシステムは、15時間で1350±160 mg/L のCBGAまたは2200±261 mg/LのCBGVAを産生した(図2F)。これらの結果に示唆されたように、ISO及びCANモジュールが、APモジュールの機能によって、全システムの性能が制限され得るように、効率的に機能することができる。

【0168】

次に、図1に示されたような全経路を組み立てる。数回の最適化の後、該システムは、10時間で480±12 mg/LのCBGAまたは580±38 mg/LのCBGVAを産生した(図3A)。AcPの開始濃度は、力価を低下させることなく50 mM以上には増加できなかったので、最適化における重要な因子であった(図7)。また、BSAを滴定して、20 mg/mLの理想な濃度を同定した(図8)。図3Bは、CBGA産生の時間経過における重要な中間体GPP及びOAを示している。OAの濃度は、早くスパイクし、その後のCBGAの産生と共に低減した。全てのOAが消費されると、GPPレベルの増加が観察された。これらの結果は、ISOモジュールが機能したままであるが、APモジュールが機能不全になるので、反応が停止することを示唆している。図9に示されたように、リン酸塩及び酢酸塩の構築物は、使用濃度での該反応に最小限の効果を有するであろう。該機能不全が他の代謝物の蓄積によるものであるかどうかを試験するために、6時間後に濾過により、CBGA産生システムから代謝物を除去し、新鮮なインプット及び補助因子で該反応を再開した。リサイクルされた酵素は、産生を継続し、合計で630±20 mg/LのCBGAを産生した。これは、該酵素が活性のままであることを示唆した(図3C)。

【0169】

有望なことに、本開示の無細胞系は、今までに酵母で報告されたものよりもほぼ2桁高いカンナビノイド力価を提供し、さらなる最適化の余地が残っている。さらに、無細胞アプローチの利点は、問題が十分に定義されていることである。特に、OLS酵素がシステム内の弱いリンクであることは明らかである。天然酵素は、誤りがちで、望ましくない副産物を容易に産生するだけでなく、該システム内の重要な中間体によって阻害される。OA/DA産生とGPP産生のバランスがOLS機能において重要な考慮事項であるので、プロセスの更なるチューニングが結果をさらに改善することが可能である。あるいは、遺伝子操作または指向された進化による改良には、OLSを標的とすべきである。同様の考慮事項は、天然の内在性膜酵素の代わりに、本明細書で採用されている効率的な水溶性のCBGA合成酵素の開発につながった。最近、OLSの構造が決定され、これにより遺伝子操作が改善され得る。理想的には、理想的には、微生物法と無細胞法の両方が最終的にコスト競争力を持ち、これらの医療的に重要な分子を産生するための多くの実行可能なオプションが存在することができる。

【0170】

以上、本発明の特定の実施形態について記載した。本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく種々の改変され得ることが理解されるであろう。他の実施形態は、以下の請求項の範囲内にある。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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