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特許7527589切断型の変異型Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎに結合する抗体、及び骨髄増殖性腫瘍の診断、予防又は治療薬
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-26
(45)【発行日】2024-08-05
(54)【発明の名称】切断型の変異型Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎに結合する抗体、及び骨髄増殖性腫瘍の診断、予防又は治療薬
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20240729BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240729BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240729BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20240729BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240729BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240729BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
A61P35/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K39/395 Y
G01N33/574 A
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2021502656
(86)(22)【出願日】2020-02-28
(86)【国際出願番号】 JP2020008434
(87)【国際公開番号】W WO2020175689
(87)【国際公開日】2020-09-03
【審査請求日】2023-01-18
(31)【優先権主張番号】P 2019036119
(32)【優先日】2019-02-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】502285457
【氏名又は名称】学校法人順天堂
(73)【特許権者】
【識別番号】000006091
【氏名又は名称】Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】荒木 真理人
(72)【発明者】
【氏名】木原 慶彦
(72)【発明者】
【氏名】小松 則夫
【審査官】坂井田 京
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１７－０６２１２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５３７０１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０２６９０９２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Leukemia，2014年，Vol.28，pp.1811-1818
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
次の（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）から選ばれる、切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合する抗体又は切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合するその断片。（ｃ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１７、１８及び１９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７及び２８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
（ｄ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２０、２１及び２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０及び３１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
（ｅ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２３、２４及び２５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３及び３４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
【請求項2】
前記（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）から選ばれる、切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合する抗体が、次の（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）から選ばれる抗体である、請求項１記載の切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合する抗体又は切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合するその断片。（Ｃ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列において１～８個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において１～８個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
（Ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１～８個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列において１～８個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
（Ｅ）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列において１～８個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１～８個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
【請求項3】
請求項１又は２記載の抗体又は切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合するその断片を含有する医薬組成物。
【請求項4】
骨髄増殖性腫瘍の診断、予防又は治療薬である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項5】
請求項１又は２記載の抗体又は切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合するその断片を用いて、生体試料中の次の（ａ）のポリペプチドを免疫学的検出することを特徴とする変異型ＣＡＬＲ蛋白質の検出方法。（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項6】
請求項１又は２記載の抗体又は切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合するその断片を用いて、次の（ａ）のポリペプチドを認識する薬物をスクリーニングすることを特徴とする骨髄増殖性腫瘍治療薬のスクリーニング方法。（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項7】
請求項１又は２記載の抗体又は切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合するその断片の、骨髄増殖性腫瘍診断薬製造のための使用。
【請求項8】
請求項１又は２記載の抗体又は切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合するその断片の、骨髄増殖性腫瘍の予防又は治療薬製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、骨髄増殖性腫瘍の診断、予防及び治療薬に関する。
【背景技術】
【0002】
フィラデルフィア染色体陰性骨髄増殖性腫瘍（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ；ＭＰＮｓ）患者の一部では、Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ（ＣＡＬＲ）遺伝子の第９エクソンに、塩基欠失や挿入が見出される（非特許文献１、２）。ＣＡＬＲ変異遺伝子から産生される変異型ＣＡＬＲ蛋白質は、トロンボポエチン受容体を恒常的に活性化することで、単独で骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）を引き起こす腫瘍原性を有していることがすでに明らかにされている（非特許文献３～６）。
【0003】
ＭＰＮ患者で見出されるＣＡＬＲ遺伝子変異は、必ず最終エクソンの限局された場所におけるフレームシフト変異であり、フレームシフト変異によるアミノ酸の読み枠のずれは、必ず＋１である。これらのことから、変異型ＣＡＬＲ蛋白質のカルボキシル末端には、野生型に存在しない配列が存在し、特にそのカルボキシル末端の４４アミノ酸は、ほぼすべての変異型ＣＡＬＲ蛋白質に共通している。その例として、ＭＰＮ患者で見出されるＣＡＬＲ遺伝子変異の中で最も頻度の高い、５２塩基欠失型（Ｄｅｌ ５２）、その次に頻度が高い、５塩基挿入型（Ｉｎｓ ５）のカルボキシル末端の配列を、野生型ＣＡＬＲ蛋白質の当該領域と比較したものを図１に示した。
ＭＰＮを引き起こす原因である変異型ＣＡＬＲ蛋白質は、腫瘍細胞に発現していることから、フレームシフト変異により生じた変異型ＣＡＬＲ蛋白質に特異的な配列は、ネオ抗原として、診断時のマーカーや、治療標的となる可能性が示唆されていた（特許文献１～２）。
ＭＰＮを引き起こす原因である変異型ＣＡＬＲ蛋白質は、腫瘍細胞に発現していることから、フレームシフト変異により生じた変異型ＣＡＬＲ蛋白質に特異的な配列は、ネオ抗原として、診断時のマーカーや、治療標的となる可能性が示唆されていた（特許文献１～２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特表２０１６－５３７０１２号公報
【文献】国際公開第２０１６／０８７５１４号
【非特許文献】
【0005】
【文献】Klampfl T, Gisslinger H, Harutyunyan AS, et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. The New England journal of medicine. 2013; 369: 2379-90.
【文献】Nangalia J, Massie CE, Baxter EJ, et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. The New England journal of medicine. 2013; 369: 2391-405.
【文献】Araki M, Yang Y, Masubuchi N, et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. 2016; 127: 1307-16.
【文献】Elf S, Abdelfattah NS, Chen E, et al. Mutant Calreticulin Requires Both Its Mutant C-terminus and the Thrombopoietin Receptor for Oncogenic Transformation. Cancer Discov. 2016; 6: 368-81.
【文献】Marty C, Pecquet C, Nivarthi H, et al. Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. Blood. 2016; 127: 1317-24.
【文献】Vainchenker W, Kralovics R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 2017; 129: 667-79.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかし、前記のフレームシフト変異により出現する変異型ＣＡＬＲ蛋白質に特異的な配列（ネオ抗原）を認識する抗体では、細胞抽出液や細胞表面における変異型ＣＡＬＲ蛋白質を正確に検出できないことが判明した。
従って、本発明の課題は、ＭＰＮの変異型ＣＡＬＲ遺伝子及び蛋白質を正確に検出することができる検出手段、ＭＰＮの診断、予防又は治療薬、及びＭＰＮ治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
従って、本発明の課題は、ＭＰＮの変異型ＣＡＬＲ遺伝子及び蛋白質を正確に検出することができる検出手段、ＭＰＮの診断、予防又は治療薬、及びＭＰＮ治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者は、変異型ＣＡＬＲ蛋白質の機能解析をさらに重ねた結果、発現させた変異型ＣＡＬＲ蛋白質の多くが、変異型蛋白質に特異的な配列（図１）の中で切断され、ネオ抗原と考えられていた配列の大部分が失われた変異型ＣＡＬＲ蛋白質が多く発現していることを発見した。そこで、ネオ抗原中の、切断部位よりアミノ末端側に位置する極めて短いアミノ酸配列を特異的に認識する抗体を作成したところ、培養細胞のみならず、患者末梢血細胞、患者血小板においても、切断された変異型ＣＡＬＲ蛋白質の発現が確認された。さらに、この抗体を用いると、細胞表面における変異型ＣＡＬＲ蛋白質の検出感度が飛躍的に向上すること、さらには優れたＭＰＮ治療効果が得られることが明らかになった。これらのことから、ＣＡＬＲ遺伝子変異を有するＭＰＮ患者の診断や治療においては、全長型（未切断型）だけでなく、切断型を含む変異型ＣＡＬＲ蛋白質をも検出あるいは標的とすることで、より高性能の医薬品が開発できることが明らかになった。また、変異型ＣＡＬＲ蛋白質の切断を阻害することで、切断で失われる配列を標的とする医薬品の効果を増強させることが可能であることが強く示唆され、本発明を完成した。
【0008】
すなわち、本発明は、次の［１］～［１４］を提供するものである。
【0009】
［１］（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖、又は（ｂ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖中に抗原認識部位を有する、切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合する抗体又はその機能的断片。
［２］次の（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）から選ばれる、［１］記載の切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合する抗体又はその機能的断片。
（ｃ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１７、１８及び１９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７、１８及び１９に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７及び２８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２６、２７及び２８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
（ｄ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２０、２１及び２２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０、２１及び２２に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０及び３１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９、３０及び３１に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
（ｅ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２３、２４及び２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３、２４及び２５に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３及び３４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３２、３３及び３４に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
［３］次の（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）から選ばれる［１］又は［２］記載の切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合する抗体又はその機能的断片。
（Ｃ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
（Ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
（Ｅ）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
［４］切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質中の配列番号１で表されるアミノ酸配列部分への結合において、［２］又は［３］の抗体と競合する抗体又はその機能的断片。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を含有する医薬組成物。
［６］骨髄増殖性腫瘍の診断、予防又は治療薬である［５］記載の医薬組成物。
［７］生体試料中の次の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを検出することを特徴とする骨髄増殖性腫瘍に関連する変異型ＣＡＬＲ蛋白質の検出方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
［８］（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの検出が、［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を用いる免疫学的検出である［７］記載の変異型ＣＡＬＲ蛋白質の検出方法。
［９］次の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドに結合する薬物をスクリーニングすることを特徴とする骨髄増殖性腫瘍治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
［１０］生体試料中の次の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを検出することを特徴とする骨髄増殖性腫瘍の診断方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
［１１］（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの検出が、［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を用いる免疫学的検出である［１０］記載の診断方法。
［１２］［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を投与することを特徴とする骨髄増殖性腫瘍の予防又は治療方法。
［１３］骨髄増殖性腫瘍の診断に用いるための、［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
［１４］［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片の、骨髄増殖性腫瘍診断薬製造のための使用。
［２］次の（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）から選ばれる、［１］記載の切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合する抗体又はその機能的断片。
（ｃ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１７、１８及び１９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７、１８及び１９に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７及び２８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２６、２７及び２８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
（ｄ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２０、２１及び２２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０、２１及び２２に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０及び３１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９、３０及び３１に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
（ｅ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２３、２４及び２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３、２４及び２５に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３及び３４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３２、３３及び３４に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
［３］次の（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）から選ばれる［１］又は［２］記載の切断後の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合する抗体又はその機能的断片。
（Ｃ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
（Ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
（Ｅ）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
［４］切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質中の配列番号１で表されるアミノ酸配列部分への結合において、［２］又は［３］の抗体と競合する抗体又はその機能的断片。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を含有する医薬組成物。
［６］骨髄増殖性腫瘍の診断、予防又は治療薬である［５］記載の医薬組成物。
［７］生体試料中の次の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを検出することを特徴とする骨髄増殖性腫瘍に関連する変異型ＣＡＬＲ蛋白質の検出方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
［８］（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの検出が、［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を用いる免疫学的検出である［７］記載の変異型ＣＡＬＲ蛋白質の検出方法。
［９］次の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドに結合する薬物をスクリーニングすることを特徴とする骨髄増殖性腫瘍治療薬のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
［１０］生体試料中の次の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを検出することを特徴とする骨髄増殖性腫瘍の診断方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
［１１］（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの検出が、［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を用いる免疫学的検出である［１０］記載の診断方法。
［１２］［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を投与することを特徴とする骨髄増殖性腫瘍の予防又は治療方法。
［１３］骨髄増殖性腫瘍の診断に用いるための、［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
［１４］［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片の、骨髄増殖性腫瘍診断薬製造のための使用。
【発明の効果】
【0010】
前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド鎖中に抗原認識部位（エピトープ）を有する抗体を用いれば、変異型ＣＡＬＲ蛋白質の切断によって生じた変異型ＣＡＬＲ蛋白質を検出でき、細胞表面における変異型ＣＡＬＲ蛋白質の検出感度が飛躍的に向上する。従って、本発明のＭＰＮ診断薬を用いれば、ＭＰＮの検出感度が飛躍的に向上する。また、この抗体を用いれば、ＭＰＮが特異的に予防又は治療できる。また、（ａ）及び（ｂ）のポリペプチドに結合する薬物をスクリーニングすれば、ＭＰＮ治療薬をスクリーニングできる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】変異型ＣＡＬＲ蛋白質の特徴を示す図である。骨髄増殖性腫瘍患者の発症原因であるＣＡＬＲ遺伝子変異は、＋１フレームシフト変異であり、その結果できる変異型ＣＡＬＲ蛋白質のカルボキシル末端には、変異型蛋白質に共通したアミノ酸配列が見出される。ＳＰ：シグナル配列、Ｎ：Ｎドメイン、Ｐ：Ｐドメイン。矢印は、野生型（ＷＴ）と異なるアミノ酸配列が始まる部分を示している。
【図2】ＣＡＬＲ蛋白質のアミノ末端側と変異型ＣＡＬＲ蛋白質のカルボキシル末端側の配列を認識する抗体を示す図である。ＣＡＬＲ蛋白質のアミノ末端側の配列を認識する抗体は、変異型ＣＡＬＲ蛋白質の変異箇所よりアミノ末端側のアミノ酸配列を認識する市販の抗体（抗ＣＡＬＲ抗体）である。また、変異型ＣＡＬＲ蛋白質のカルボキシル末端の配列を認識する抗体は、ＣＡＬＲ蛋白質のカルボキシル末端側に塩基配列の変異により新たに形成されたアミノ酸配列を認識する市販の抗体（抗変異型ＣＡＬＲ抗体）である。
【図3】ＵＴ－７／ＴＰＯ細胞（Ｋｏｍａｔｓｕ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９６，８７，４５５２－４５５６）から分泌された蛋白質を、図２の抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す図である。ｖｅｃは、発現ベクターのみを導入した細胞であることから、ＵＴ－７／ＴＰＯ細胞／ＣＡＬＲ（ＷＴ）と同様に内在性のＣＡＬＲ蛋白質が検出される。Ｄｅｌ ５２型とＩｎｓ ５型では、抗変異型ＣＡＬＲ抗体により検出される全長型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質よりも分子量の小さな変異型ＣＡＬＲ蛋白質が、抗ＣＡＬＲ抗体でのみ検出される（図中のアスタリスク）。なお、Ｉｎｓ ５型では、全長型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質は、内在性の野生型ＣＡＬＲ蛋白質とほぼ同じ位置に泳動されるため、抗ＣＡＬＲ抗体で、特異的に検出することができない。
【図4】変異型ＣＡＬＲ蛋白質の代表的なＤｅｌ ５２型とＩｎｓ ５型のアミノ（Ｎ）末端とカルボキシル（Ｃ）末端にＦＬＡＧタグ（ＦＬＡＧ－ｔａｇ）を融合した蛋白質の模式図を示す。変異型特異的配列を黒色で、ＦＬＡＧタグを斜線で図示した。
【図5】抗ＦＬＡＧ抗体を用いたフローサイトメトリー解析により、細胞表面上における変異型ＣＡＬＲ蛋白質の量を測定した結果を示す図である。切断の有無によらず、タグの残存するＮ末端にＦＬＡＧタグを配した変異型ＣＡＬＲ蛋白質を発現する細胞では、変異型ＣＡＬＲ蛋白質特異的配列内で生じる切断によりＣ末端ＦＬＡＧが切り落とされる細胞に比べて、強いシグナルが検出された。なお、Ｄｅｌ ５２型の発現量がＩｎｓ ５型よりも低いことによる差が見られる。
【図6】変異型ＣＡＬＲ蛋白質特異的配列（黒色）内で生じる蛋白質の切断部位よりもアミノ末端側にある、変異型特異的配列を認識する抗体を示す。
【図7】図６の抗体を用いて、図３で用いた細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示す。ＦＬＡＧタグの付加した位置による、認識力の違いが消失した。なお、Ｄｅｌ ５２型の発現量がＩｎｓ ５型よりも低いことによる差が見られる。
【図8】骨髄増殖性腫瘍患者細胞における切断型ＣＡＬＲ蛋白質の検出を示す図である。変異型ＣＡＬＲ蛋白質特異的配列内で生じる蛋白質の切断部位よりもアミノ末端側にあるアミノ酸配列を認識する抗体を用いて、患者細胞より調製した細胞抽出液をイムノブロット法で解析した。ＣＡＬＲ遺伝子変異を有する骨髄増殖性腫瘍患者の末梢血単核球細胞や血小板において、当該抗体で認識できる切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質の発現が検出された。
【図9】クローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体いずれも全長型と切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を認識することを示す図である。ＵＴ－７／ＴＰＯ細胞から分泌された蛋白質を、クローンＢ３抗体と、クローンＣ６、Ｇ１抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す図である。アミノ末端のシグナル配列の下流にＦＬＡＧタグを付加したＤｅｌ ５２型とＩｎｓ ５型の全長型と、より低分子量の切断型の両方が、抗ＦＬＡＧ抗体と同様に、Ｂ３、Ｃ６、Ｇ１いずれの抗体を用いても検出される。
【図10】クローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体いずれも細胞表面の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を認識することを示す図である。ＦＬＡＧタグを付加したＤｅｌ ５２型あるいはＩｎｓ ５型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を発現するＵＴ－７／ＴＰＯ細胞、発現ベクターのみを導入したＵＴ－７／ＴＰＯ／ｖｅｃ細胞に対して、クローンＢ３抗体と、クローンＣ６、Ｇ１抗体を用いたフローサイトメトリー解析を行い、細胞表面上における変異型ＣＡＬＲ蛋白質の量を測定した結果を示す図である。なお、Ｄｅｌ ５２型は、Ｉｎｓ ５型よりも、発現量が低いために、変異の型によるシグナル強度の差が見られる。
【図11】クローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に対する結合能の評価結果を示す図である。クローンＢ３抗体と、クローンＣ６、Ｇ１抗体、コントロールのラットＩｇＧを用いて、Ｄｅｌ ５２型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に対する結合特異性をＥＬＩＳＡ法により評価した。クローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体、いずれも濃度依存的な変異型ＣＡＬＲ蛋白質との特異的な結合が検出された。
【図12】クローンＢ３抗体と抗体の作成に用いた抗原に対する結合強度を、表面プラズモン共鳴解析法により評価した結果を示す図である。クローンＢ３抗体と抗体の作成に用いた抗原に対する結合強度を、表面プラズモン共鳴解析法により評価した。
【図13A】イムノブロット法による、クローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体の抗原認識配列の同定結果を示す図である。Ｄｅｌ ５２型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質において、図中に記したアミノ酸をアラニン（Ａ）に置換した蛋白質を発現し、それぞれの抗体の反応性をイムノブロット法を用いて評価した。Ｉｎｔａｃｔは、アミノ酸置換をしていないＤｅｌ ５２型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を示している。黒太線で囲まれたアミノ酸は、抗体の作成に使用した抗原配列を示している。
【図13B】ＥＬＩＳＡ法による、クローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体の抗原認識配列の同定結果を示す図である。図１３Ａと同じ蛋白質に対するそれぞれの抗体の反応性を、ＥＬＩＳＡ法を用いて評価した。Ｉｎｔａｃｔは、アミノ酸置換をしていないＤｅｌ ５２型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を示している。黒太線で囲まれたアミノ酸は、抗体の作成に使用した抗原配列を示している。
【図14】本発明抗体（Ｂ３、Ｃ６、Ｇ１）の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。
【図15】本発明抗体（Ｂ３、Ｃ６、Ｇ１）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。
【図16】本発明抗体（Ｂ３、Ｃ６、Ｇ１）の重鎖可変領域の塩基配列を示す図である。
【図17】本発明抗体（Ｂ３、Ｃ６、Ｇ１）の軽鎖可変領域の塩基配列を示す図である。
【図18】Ｂ３マウスキメラ抗体によるＭＰＮモデルマウスに対する治療効果を示す図である。Ｄｅｌ ５２型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を発現させた造血幹細胞を移植して作出した骨髄増殖性腫瘍モデルマウス（ＣＡＬＲ Ｄｅｌ ５２マウス）、あるいはコントロールベクターを導入した造血幹細胞を移植して作成したコントロールマウスに、移植後９週目から、毎週、Ｂ３キメラ抗体あるいは、溶媒（ＰＢＳ）を投与し、骨髄増殖性腫瘍モデルマウスに特徴的な血小板増多の抑制効果を評価した。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明のＭＰＮに関連する変異型ＣＡＬＲ蛋白質の検出及び診断方法並びにＭＰＮの予防又は治療の標的として用いられる前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドは、変異型ＣＡＬＲ蛋白質に特異的な配列（図１中の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に共通する４４アミノ酸）中で切断されて残存するカルボキシル末端側のポリペプチドである。
野生型ＣＡＬＲ蛋白質は、図１に示すアミノ酸配列（配列番号２）を有する。また、ＣＡＬＲ遺伝子変異の中で最も頻度の高い５２塩基欠失型（Ｄｅｌ ５２）は、図１に示すアミノ酸配列（配列番号３）を有する。また、ＣＡＬＲ遺伝子変異の中で、次に頻度の高い５塩基挿入型（Ｉｎｓ ５）は、図１に示すアミノ酸配列（配列番号４）を有する。また、図１中の枠で囲んだ領域は、変異型ＣＡＬＲ蛋白質に共通するアミノ酸配列である。切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質は、この共通領域のアミノ末端側のわずか１３アミノ酸のみを含む。この共通領域が切断され切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質が生じること、共通領域の大部分が変異型ＣＡＬＲ蛋白質から失われることは、本発明者が初めて見出したことである。
野生型ＣＡＬＲ蛋白質は、図１に示すアミノ酸配列（配列番号２）を有する。また、ＣＡＬＲ遺伝子変異の中で最も頻度の高い５２塩基欠失型（Ｄｅｌ ５２）は、図１に示すアミノ酸配列（配列番号３）を有する。また、ＣＡＬＲ遺伝子変異の中で、次に頻度の高い５塩基挿入型（Ｉｎｓ ５）は、図１に示すアミノ酸配列（配列番号４）を有する。また、図１中の枠で囲んだ領域は、変異型ＣＡＬＲ蛋白質に共通するアミノ酸配列である。切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質は、この共通領域のアミノ末端側のわずか１３アミノ酸のみを含む。この共通領域が切断され切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質が生じること、共通領域の大部分が変異型ＣＡＬＲ蛋白質から失われることは、本発明者が初めて見出したことである。
【0013】
ポリペプチド（ａ）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる。ポリペプチド（ｂ）における、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、配列番号１において１～４個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましく、１～３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列がより好ましい。より具体的には、配列番号１のカルボキシ末端側から３アミノ酸が欠失したアミノ酸配列がより好ましい。また、ポリペプチド（ｂ）のアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列の同一性は、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましい。
【0014】
本発明のＭＰＮに関連する変異型ＣＡＬＲ蛋白質の検出方法及びＭＰＮ診断、予防、治療方法においては、生体試料中の前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドに結合する抗体又はその機能的断片が用いられる。
【0015】
前記抗体としては、（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド鎖中に抗原認識部位（エピトープ）を有する抗体であればよいが、切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質にのみ結合するものであっても、切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質と全長型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質の両方に結合するものであってもよく、切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質と全長型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質の両方に結合する「変異型ＣＡＬＲ蛋白質」に特異的な抗体であることが好ましい。具体例としては、次の（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）から選ばれる抗体が挙げられる。
（ｃ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１７、１８及び１９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７、１８及び１９に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７及び２８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２６、２７及び２８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
（ｄ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２０、２１及び２２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０、２１及び２２に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０及び３１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９、３０及び３１に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
（ｅ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２３、２４及び２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３、２４及び２５に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３及び３４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３２、３３及び３４に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
（ｃ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１７、１８及び１９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１７、１８及び１９に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２６、２７及び２８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２６、２７及び２８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
（ｄ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２０、２１及び２２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２０、２１及び２２に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２９、３０及び３１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９、３０及び３１に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
（ｅ）免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号２３、２４及び２５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２３、２４及び２５に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、かつ、免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３２、３３及び３４に示されるアミノ酸配列、又は配列番号３２、３３及び３４に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである抗体。
【0016】
前記配列番号１７～３４に示されるアミノ酸配列における、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、配列番号１７～３４において１～４個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましく、１～３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列がより好ましく、１～２個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列がさらに好ましい。また、配列番号１７～３４に示されるアミノ酸配列と、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列の同一性は、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましい。
【0017】
前記の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド鎖中に抗原認識部位（エピトープ）を有する抗体としては、さらに次の（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）から選ばれる抗体であるのが好ましい。
（Ｃ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
（Ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
（Ｅ）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
（Ｃ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
（Ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号６に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号９に示されるアミノ酸配列、又は配列番号９に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
（Ｅ）配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＨ鎖、及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる免疫グロブリンＶＬ鎖を有する抗体。
【0018】
前記配列番号５～１０に示されるアミノ酸配列における、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、配列番号５～１０において１～１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましく、１～８個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列がより好ましく、１～５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列がさらに好ましい。また、配列番号５～１０に示されるアミノ酸配列と、配列番号５～１０に示されるアミノ酸配列の１～数個が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列の同一性は、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましい。
【0019】
本発明の抗体は、前記（ｃ）～（ｅ）の各ＣＤＲの配列、又は（Ｃ）～（Ｅ）の免疫グロブリンＶＨ領域及びＶＬ領域の配列を有するものであって、これらの領域以外の領域のアミノ酸配列は特に制限されない。従って、本発明の抗体は、ヒト抗体のようなラット以外の哺乳動物抗体でもよく、ヒト化抗体でもよい。より具体的には、ヒト以外の哺乳動物、例えば、ラット抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなるキメラ抗体であっても良く、この様な抗体はラット抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばラット抗体のＣＤＲをヒト抗体のＣＤＲへ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体例として、ラット抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のＦＲのアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１－８５６．）。
【0020】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原又は所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１－５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
【0021】
抗体のクラスは特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。精製の容易性等を考慮すると好ましくはＩｇＧである。
【0022】
機能的断片としては、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物が挙げられる。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙなどを挙げることができる。
【0023】
また、本発明の抗体のうち、前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの検出に用いる抗体はこれらのポリペプチドに結合すればよい。一方、ＭＰＮの予防又は治療に用いる抗体は、前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドに結合し、細胞傷害活性を有する抗体が好ましい。
【0024】
切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合する抗体としては、配列番号１で表される配列を有するポリペプチド鎖に結合する抗体であればよいが、切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質中の配列番号１で表されるアミノ酸配列部分への結合において、少なくとも前記抗体又はその機能的断片のいずれか一つと競合する抗体であることが好ましい。
【0025】
ここで、前記検出に用いられる生体試料としては、例えば被験者から採取された生体試料であって、（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドが含まれる試料が挙げられる。具体的には、全血、血漿、血清、リンパ球、リンパ液、血小板、単核球、顆粒球、唾液や尿などの体液、骨髄生検により得られる組織標本（骨髄液、骨髄組織）などが挙げられる。
【0026】
（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの検出手段としては、液体クロマトグラフィー質量分析法、免疫学的法、特異的結合能を有する低／中分子や核酸あるいは核酸誘導体を用いた方法等が挙げられるが、簡便かつ測定感度が高い免疫学的方法が好ましい。
【0027】
免疫学的方法としては、（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド鎖中に抗原認識部位（エピトープ）を有する抗体又はその機能的断片を用いる免疫学的方法が好ましい。（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド鎖中のエピトープとしては、（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド鎖中に存在する配列であればよく、（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド鎖中の連続する３アミノ酸以上のアミノ酸を有するペプチドが好ましく、（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド鎖中の連続する５アミノ酸以上のアミノ酸を有するペプチドがより好ましい。
【0028】
免疫学的方法に用いる抗体は、例えば（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド鎖中の連続する３アミノ酸以上のアミノ酸を有するペプチドを抗原として用いて得られる抗体であればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。ここでモノクローナル抗体は、例えば（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド鎖中の連続する３アミノ酸以上のアミノ酸を有するペプチドを感作することにより得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを作成し、目的とする抗体を産生するクローンを選択し、この細胞を増殖させて製造することができる。
【0029】
免疫学的方法としては、イムノクロマト法、酵素標識免疫学的測定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、凝集法、比濁法、フローサイトメトリー法、組織免疫染色法、ウェスタンブロット等のイムノブロット法等のいずれも用いることができる。ここでイムノブロット法は、ポリペプチドをメンブレンに転写し、メンブレン上のポリペプチドを抗体で検出する方法である。抗体の検出には、酵素標識、蛍光標識等が用いられる。
【0030】
生体試料中に（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドが検出されれば、当該生体試料は骨髄増殖性腫瘍患者由来の生体試料であると判定することができる。
【0031】
本発明のＭＰＮ診断薬は、前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド鎖中に抗原認識部（エピトープ）を有する抗体を含有する。この抗体は、前述の抗体であるのが好ましい。
また、本発明のＭＰＮ診断薬には、前記抗体の他、緩衝液、測定実施プロトコール等が含まれていてもよい。
また、本発明のＭＰＮ診断薬には、前記抗体の他、緩衝液、測定実施プロトコール等が含まれていてもよい。
【0032】
本発明のＭＰＮ予防又は治療薬等の医薬組成物は、前記の抗体を含有すればよいが、薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化して製造することができる。
【0033】
本発明の医薬組成物の予防又は治療対象となるＭＰＮは、変異型ＣＡＬＲが検出されるＭＰＮであるのが好ましい。
【0034】
経口投与用の好適な製剤は、本発明抗体を、水、生理食塩水のような希釈剤に有効量溶解させた液剤、有効量を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量を懸濁させた懸濁液剤、有効量を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【0035】
非経口投与用には、本発明抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の抗体を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、本発明の医薬は、油性又は水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、又は乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、本発明抗体を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、本発明抗体を粉末化し、ラクトース又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、本発明抗体をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
【0036】
本発明のＭＰＮ治療薬のスクリーニング法は、前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを認識する抗体や蛋白質、低／中分子、核酸あるいは核酸誘導体をスクリーニングすることを特徴とする。具体的には、（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを認識する抗体を用いた抗体依存性細胞傷害活性や補体依存性細胞傷害活性を有する抗体医薬の開発が挙げられる。前記本発明の抗体が、本発明のスクリーニング法により得られた、抗体医薬の例である。この他にも、（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドに特異的に結合する低分子あるいは中分子化合物、核酸あるいは核酸誘導体、蛋白質などを作出し、殺細胞効果を有する低分子あるいは中分子化合物、核酸あるいは核酸誘導体、蛋白質などを腫瘍細胞特異的に送達する抗腫瘍薬の開発が挙げられる。
【実施例】
【0037】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されない。
【0038】
［試験例１］
（１）材料及び試験方法
［１］抗ＣＡＬＲ抗体
Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製ウサギモノクローナル抗体クローンＤ３Ｅ６（Ｃａｔ＃１２２３８）
（１）材料及び試験方法
［１］抗ＣＡＬＲ抗体
Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製ウサギモノクローナル抗体クローンＤ３Ｅ６（Ｃａｔ＃１２２３８）
【0039】
［２］抗変異型ＣＡＬＲ抗体
Ｄｉａｎｏｖａ社製マウスモノクローナル抗体クローンＣＡＬ２（Ｃａｔ＃ＤＩＡ－ＣＡＬ）
Ｄｉａｎｏｖａ社製マウスモノクローナル抗体クローンＣＡＬ２（Ｃａｔ＃ＤＩＡ－ＣＡＬ）
【0040】
［３］切断部位よりもアミノ末端側の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を認識する抗体
配列番号１に含まれるアミノ酸配列（ＲＲＭＭＲＴＫＭＲ）のカルボキシル末端あるいはアミノ末端にシステインを付加したペプチドを合成し、キャリアー蛋白質キーホールリンペットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）と結合させてから、８週齢のメスのＷＫＹ／Ｉｚｍラットに免疫し、追加免疫後にリンパ球を回収した。リンパ球をマウスミエローマＳＰ２細胞とＰＥＧ法により細胞融合させてから、選択培地で培養しハイブリドーマを取得した。培養上清中の抗体の特異性を、免疫したペプチドや精製蛋白質を用いたＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングすることで、切断型を含む変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合する抗体を産生するハイブリドーマ（クローンＢ３、Ｃ６及びＧ１）を取得した。これらのハイブリドーマから産生された抗体を精製し、試験に用いた（Ｂ３抗体、Ｃ６抗体及びＧ１抗体）。
配列番号１に含まれるアミノ酸配列（ＲＲＭＭＲＴＫＭＲ）のカルボキシル末端あるいはアミノ末端にシステインを付加したペプチドを合成し、キャリアー蛋白質キーホールリンペットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）と結合させてから、８週齢のメスのＷＫＹ／Ｉｚｍラットに免疫し、追加免疫後にリンパ球を回収した。リンパ球をマウスミエローマＳＰ２細胞とＰＥＧ法により細胞融合させてから、選択培地で培養しハイブリドーマを取得した。培養上清中の抗体の特異性を、免疫したペプチドや精製蛋白質を用いたＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングすることで、切断型を含む変異型ＣＡＬＲ蛋白質に結合する抗体を産生するハイブリドーマ（クローンＢ３、Ｃ６及びＧ１）を取得した。これらのハイブリドーマから産生された抗体を精製し、試験に用いた（Ｂ３抗体、Ｃ６抗体及びＧ１抗体）。
【0041】
［４］試験方法
ヒト巨核芽球性白血病細胞株ＵＴ－７／ＴＰＯに、Ｄｅｌ ５２あるいはＩｎｓ ５型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を発現させることで腫瘍性に増殖するＵＴ－７／ＴＰＯ／ＣＡＬＲ Ｄｅｌ ５２、ＵＴ－７／ＴＰＯ／ＣＡＬＲ Ｉｎｓ ５細胞と、コントロールとして野生型ＣＡＬＲを発現させたＵＴ－７／ＴＰＯ／ＣＡＬＲ（ＷＴ）、遺伝子導入に使用したベクターのみを導入したＵＴ－７／ＴＰＯ／ｖｅｃ細胞を、６．０×１０５個／ｍＬの密度でＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社Ｃａｔ＃３１９８５０７０）に播種し、５％ＣＯ２存在下において３７℃で３２時間培養した。この際、ＵＴ－７／ＴＰＯ／ＣＡＬＲ ＷＴとＵＴ－７／ＴＰＯ／ｖｅｃ細胞は、１０ｎｇ／ｍＬ トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＰＯ）を含む培地で培養した。培養液から細胞を遠心分離（１５，０００ｇ×１０分、４℃）により除去した培養上清を取得し、得られた分画を還元剤存在下で加熱処理したあと、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、５％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔ溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）と室温で１時間反応させてから、野生型と変異型の両方を認識する抗体（ウサギモノクローナル抗体Ｄ３Ｅ６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社Ｃａｔ＃１２２３８）あるいは、変異型のカルボキシル末端配列を認識する市販の抗体（マウスモノクローナル抗体ＣＡＬ２，Ｄｉａｎｏｖａ社Ｃａｔ＃ ＤＩＡ－ＣＡＬ－２５０）を含む５％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ溶液と４℃において一晩反応させた。ＴＢＳ－Ｔ溶液による洗浄を行なった後、ペルオキシダーゼ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社Ｃａｔ＃ｓｃ－２０３０）あるいはペルオキシダーゼ標識された抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社Ｃａｔ＃ｓｃ－２００５）を含む５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ溶液中において、室温で１時間反応を行なった。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ－Ｔ溶液で洗浄した後に、ペルオキシダーゼ発光試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｃａｔ＃３４０９４）と反応させて得られたシグナルを、ＦＵＳＩＯＮ撮像装置（Ｖｉｌｂｅｒ－Ｌｏｕｒｍａｔ 社製）を使用して検出した。
ヒト巨核芽球性白血病細胞株ＵＴ－７／ＴＰＯに、Ｄｅｌ ５２あるいはＩｎｓ ５型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を発現させることで腫瘍性に増殖するＵＴ－７／ＴＰＯ／ＣＡＬＲ Ｄｅｌ ５２、ＵＴ－７／ＴＰＯ／ＣＡＬＲ Ｉｎｓ ５細胞と、コントロールとして野生型ＣＡＬＲを発現させたＵＴ－７／ＴＰＯ／ＣＡＬＲ（ＷＴ）、遺伝子導入に使用したベクターのみを導入したＵＴ－７／ＴＰＯ／ｖｅｃ細胞を、６．０×１０５個／ｍＬの密度でＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社Ｃａｔ＃３１９８５０７０）に播種し、５％ＣＯ２存在下において３７℃で３２時間培養した。この際、ＵＴ－７／ＴＰＯ／ＣＡＬＲ ＷＴとＵＴ－７／ＴＰＯ／ｖｅｃ細胞は、１０ｎｇ／ｍＬ トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＰＯ）を含む培地で培養した。培養液から細胞を遠心分離（１５，０００ｇ×１０分、４℃）により除去した培養上清を取得し、得られた分画を還元剤存在下で加熱処理したあと、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、５％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔ溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）と室温で１時間反応させてから、野生型と変異型の両方を認識する抗体（ウサギモノクローナル抗体Ｄ３Ｅ６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社Ｃａｔ＃１２２３８）あるいは、変異型のカルボキシル末端配列を認識する市販の抗体（マウスモノクローナル抗体ＣＡＬ２，Ｄｉａｎｏｖａ社Ｃａｔ＃ ＤＩＡ－ＣＡＬ－２５０）を含む５％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ溶液と４℃において一晩反応させた。ＴＢＳ－Ｔ溶液による洗浄を行なった後、ペルオキシダーゼ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社Ｃａｔ＃ｓｃ－２０３０）あるいはペルオキシダーゼ標識された抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社Ｃａｔ＃ｓｃ－２００５）を含む５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ溶液中において、室温で１時間反応を行なった。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ－Ｔ溶液で洗浄した後に、ペルオキシダーゼ発光試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｃａｔ＃３４０９４）と反応させて得られたシグナルを、ＦＵＳＩＯＮ撮像装置（Ｖｉｌｂｅｒ－Ｌｏｕｒｍａｔ 社製）を使用して検出した。
【0042】
アミノ末端のシグナル配列の下流にヒスチジンタグを挿入したＤｅｌ ５２型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で発現させて、分泌された変異型ＣＡＬＲ蛋白質を含む培養上清を遠心分離（１５，０００ｇ×１０分、４℃）により調製した。得られた上清をＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥヘルスケア社Ｃａｔ＃１７５３１９０１）にアプライし、２０ｍＭイミダゾールを含有する精製バッファー（０．３Ｍ塩化ナトリウム、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４）でカラムを洗浄後、５０ｍＭイミダゾールを含有する精製バッファーを用いて変異型ＣＡＬＲ蛋白質を精製した。精製蛋白質は、２－ｎｉｔｒｏ－５－ｔｈｉｏｃｙａｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＮＴＣＢ）と反応させることでシステイン残基をシアノ化した後、アルカリ性条件下で断片化した後、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計を用いて、蛋白質断片の質量を同定し、Ｄｅｌ ５２型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質のペプチド配列情報から、切断部位を決定した。
【0043】
アミノ末端のシグナル配列の下流にＦＬＡＧタグで標識、あるいは、カルボキシル末端をＦＬＡＧタグで標識したＤｅｌ ５２型あるいはＩｎｓ ５型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を、ＵＴ－７／ＴＰＯ細胞において発現させ、ウシ胎児非働化血清１０％を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ（ＩＭＤＭ）培地を用いて、５％ＣＯ２存在下において３７℃で培養した。増殖期の細胞１×１０５個をＰＢＳ（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２７ｍＭ塩化カリウムを含むリン酸緩液）で洗浄後に２％ ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液中で、マウス抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ ｔａｇ抗体（富士フイルム和光純薬社Ｃａｔ＃０１４－２２３８３）あるいは、切断部位よりもアミノ末端側を認識するラット抗変異型ＣＡＬＲ抗体と、氷上で３０分間反応させた。反応後、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液を用いて細胞を洗浄したあと、２次抗体として、それぞれ抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｃａｔ＃Ａ２１２３５）と抗ラットＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｃａｔ＃Ａ２１２４７）を２％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液中において氷上で３０分間反応させた。反応終了後に遠心により回収した細胞に、２％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ溶液を、氷上で１５分反応させた。最後に、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液を加えてから、遠心分離（４００ｇ×５分、４℃）し、上清を廃棄することで細胞を洗浄し、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液を３００μＬ加え、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてフローサイトメトリー解析により、シグナルを定量した。
【0044】
ヒト末梢血単核球細胞は、凝固防止剤の含まれるスピッツ管に採血された末梢血を遠心分離（５００ｇ×１０分、４℃）して得られる細胞画分をＰＢＳ溶液に懸濁した上で、リンパ球分離液Ｌｙｍｐｈｏｓｅｐ（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社Ｃａｔ＃１１４４４８１５）の上に重層し、遠心分離（１５００ｒｐｍ×３０分、室温）することでバフィーコートを取得した。得られたバフィーコートにＰＢＳ溶液を加え、再懸濁した後、遠心分離（１５００ｒｐｍ×１０分、室温）し、上清を除去することで、末梢血単核球細胞を取得した。得られた細胞をＲＩＰＡ溶液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ－４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、２ｍＭオルトバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、１０ｍＭ β－グリセロリン酸、１μｇ／ｍＬアプロチニン、２μｇ／ｍＬ Ｅ－６４、１μｇ／ｍＬロイペプチン、０．６７μｇ／ｍＬベスタチン、０．６７μｇ／ｍＬペプスタチン、４３．５μｇ／ｍＬ ＰＭＳＦ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に懸濁した後、超音波破砕してから、遠心分離（１５０００ｇ×１５分、４℃）して上清を回収し、細胞抽出液を調製した。得られた細胞抽出液を還元剤存在下で加熱処理したあと、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、５％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔ溶液と室温で１時間反応させてから、切断部位よりもアミノ末端側を認識するラット抗変異型ＣＡＬＲ抗体を含む５％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ溶液と４℃において一晩反応させた。ＴＢＳ－Ｔ溶液による洗浄を行なった後、ペルオキシダーゼ標識された抗ラットＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社Ｃａｔ＃ｓｃ－２００６）を含む５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ溶液と室温で１時間反応を行なった。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ－Ｔ溶液で洗浄した後に、ペルオキシダーゼ発光試薬と反応させて得られたシグナルを、ＦＵＳＩＯＮ撮像装置を使用して検出した。
【0045】
血小板は、ＥＤＴＡを含むスピッツ管に採血された末梢血を遠心分離（５００ｇ×１０分、４℃）して得られる上清を、遠心分離（２０００×ｇ、１５分、４℃）して得られた沈殿物を、血小板洗浄溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％デキストロース、ｐＨ７．４）５００μＬで２回リンスすることで調製した。得られた血小板をＲＩＰＡ溶液に懸濁した後、超音波破砕してから、遠心分離（１５０００ｇ×１５分、４℃）して上清を回収し、細胞抽出液を調製した。得られた細胞抽出液を還元剤存在下で加熱処理したあと、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、５％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔ溶液と室温で１時間反応させてから、切断部位よりもアミノ末端側を認識するラット抗変異型ＣＡＬＲ抗体（Ｂ３抗体）を含む５％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ溶液と４℃において一晩反応させた。ＴＢＳ－Ｔ溶液による洗浄を行なった後、ペルオキシダーゼ標識された抗ラットＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社Ｃａｔ＃ｓｃ－２００６）を含む５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ溶液と室温で１時間反応を行なった。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ－Ｔ溶液で洗浄した後に、ペルオキシダーゼ発光試薬と反応させて得られたシグナルを、ＦＵＳＩＯＮ撮像装置を使用して検出した。
【0046】
（２）結果
ヒト巨核芽球性白血病細胞株ＵＴ－７／ＴＰＯに、Ｄｅｌ ５２あるいはＩｎｓ ５型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を発現させることで腫瘍性に増殖するＵＴ－７／ＴＰＯ／ＣＡＬＲ Ｄｅｌ ５２、ＵＴ－７／ＴＰＯ／ＣＡＬＲ Ｉｎｓ ５細胞と、コントロールとして野生型ＣＡＬＲを発現させたＵＴ－７／ＴＰＯ／ＣＡＬＲ（ＷＴ）、遺伝子導入に使用したベクターのみを導入したＵＴ－７／ＴＰＯ／ｖｅｃの培養上清中に含まれるＣＡＬＲ蛋白質を、野生型と変異型の両方を認識する抗体（モノクローナル抗体Ｄ３Ｅ６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社Ｃａｔ＃１２２３８）と、変異型のカルボキシル末端配列を認識する市販の抗体（モノクローナル抗体ＣＡＬ２，Ｄｉａｎｏｖａ社Ｃａｔ＃ ＤＩＡ－ＣＡＬ－２５０）で評価した（図２）。その結果、図２に示すように、野生型と変異型ＣＡＬＲ蛋白質を認識する抗体（Ｂ３抗体）を用いたイムノブロットにおいて、変異型ＣＡＬＲ蛋白質を発現する細胞では、内在性のＣＡＬＲの他に、変異型抗体で認識できないバンドが検出された（図３）。
ヒト巨核芽球性白血病細胞株ＵＴ－７／ＴＰＯに、Ｄｅｌ ５２あるいはＩｎｓ ５型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を発現させることで腫瘍性に増殖するＵＴ－７／ＴＰＯ／ＣＡＬＲ Ｄｅｌ ５２、ＵＴ－７／ＴＰＯ／ＣＡＬＲ Ｉｎｓ ５細胞と、コントロールとして野生型ＣＡＬＲを発現させたＵＴ－７／ＴＰＯ／ＣＡＬＲ（ＷＴ）、遺伝子導入に使用したベクターのみを導入したＵＴ－７／ＴＰＯ／ｖｅｃの培養上清中に含まれるＣＡＬＲ蛋白質を、野生型と変異型の両方を認識する抗体（モノクローナル抗体Ｄ３Ｅ６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社Ｃａｔ＃１２２３８）と、変異型のカルボキシル末端配列を認識する市販の抗体（モノクローナル抗体ＣＡＬ２，Ｄｉａｎｏｖａ社Ｃａｔ＃ ＤＩＡ－ＣＡＬ－２５０）で評価した（図２）。その結果、図２に示すように、野生型と変異型ＣＡＬＲ蛋白質を認識する抗体（Ｂ３抗体）を用いたイムノブロットにおいて、変異型ＣＡＬＲ蛋白質を発現する細胞では、内在性のＣＡＬＲの他に、変異型抗体で認識できないバンドが検出された（図３）。
【0047】
ＮＴＣＢを用いてシステイン残基のアミノ末端側で断片化したペプチド断片のうち、変異型ＣＡＬＲ蛋白質（Ｄｅｌ ５２型を使用）の切断型にのみ見出されたペプチド断片の分子量として、２５８２７．７と２５４１８．４を得た。この数値と、切断されたシステイン残基の位置から求めた推定分子量を比較することで、Ｄｅｌ ５２型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質の切断部位として、３８０番目のメチオニン残基と３８１番目のアルギニン残基の間と、３７７番目のメチオニン残基と３７８番目のアルギニン残基の間、を同定した。
【0048】
アミノ末端のシグナル配列の下流にＦＬＡＧタグで標識、あるいは、カルボキシル末端をＦＬＡＧタグで標識したＤｅｌ ５２型あるいはＩｎｓ ５型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を、ＵＴ－７／ＴＰＯ細胞において発現させ、細胞表面における、変異型ＣＡＬＲ蛋白質の発現について、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたフローサイトメトリー解析を行うと、アミノ末端のＦＬＡＧタグを有する変異型ＣＡＬＲ蛋白質を発現する細胞では、カルボキシル末端をＦＬＡＧタグ標識した変異型ＣＡＬＲ蛋白質を発現する細胞に比べて、より強いシグナルが得られた（図４、５）。次に、切断部位よりもアミノ末端側で、かつ変異型ＣＡＬＲ蛋白質に特異的な配列を含むペプチドを免疫して得られた抗体を用いて、図４、５の解析に用いた細胞株のフローサイトメトリー解析を行うと、ＦＬＡＧタグの付加位置による検出量の違いが消失した（図６、７）。これにより、変異型ＣＡＬＲ蛋白質に特異的な配列中で切断されて残存するカルボキシル末端側に抗原認識部位を設定することが、より高感度な検査薬あるいは、より強力な治療薬の創作に重要であることが示された。
【0049】
実際に、切断部位よりもアミノ末端側の変異型ＣＡＬＲ特異的抗体を用いて、ＣＡＬＲ遺伝子変異陽性の患者から得られた末梢血単核球や血小板の細胞抽出液をイムノブロット法を用いて解析したところ、細胞株の場合と同様に、切断された変異型ＣＡＬＲ蛋白質の発現が確認された（図８）。これらのことから、実際に、患者細胞でも、同様の切断が生じていること、切断されて残存するカルボキシル末端側に抗原認識部位を設定することが、より高感度な検査薬あるいは、より強力な治療薬の創作に重要であることが示された。
【0050】
［試験例２］
（１）３種の抗体が、全長型と切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を認識することの確認
アミノ末端のシグナル配列の下流にＦＬＡＧタグを挿入したＤｅｌ ５２型あるいはＩｎｓ ５型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を発現するＵＴ－７／ＴＰＯ細胞を培養し、分泌された変異型ＣＡＬＲ蛋白質を含む培養上清を遠心分離（１，６００ｇ×５分、４℃）により調製した。得られた培養上清をＳＤＳと還元剤存在下で加熱処理したあと、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、５％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔ溶液と室温で１時間反応させてから、ラットクローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体、あるいはマウス抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ ｔａｇ抗体（富士フイルム和光純薬社Ｃａｔ＃０１４－２２３８３）を含む５％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ溶液と４℃において一晩反応させた。ＴＢＳ－Ｔ溶液による洗浄を行なった後、それぞれ、ペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．社Ｃａｔ＃１１２－０３５－００３）、あるいはペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．社Ｃａｔ＃１１５－０３５－００３）を含む５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ溶液と室温で１時間反応を行なった。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ－Ｔ溶液で洗浄した後に、ペルオキシダーゼ発光試薬と反応させて得られたシグナルを、ＦＵＳＩＯＮ撮像装置を使用して検出した。
その結果、図９に示すように、クローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体いずれも全長型と切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を認識することが確認された。
（１）３種の抗体が、全長型と切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を認識することの確認
アミノ末端のシグナル配列の下流にＦＬＡＧタグを挿入したＤｅｌ ５２型あるいはＩｎｓ ５型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を発現するＵＴ－７／ＴＰＯ細胞を培養し、分泌された変異型ＣＡＬＲ蛋白質を含む培養上清を遠心分離（１，６００ｇ×５分、４℃）により調製した。得られた培養上清をＳＤＳと還元剤存在下で加熱処理したあと、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に電気的に転写し、５％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔ溶液と室温で１時間反応させてから、ラットクローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体、あるいはマウス抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ ｔａｇ抗体（富士フイルム和光純薬社Ｃａｔ＃０１４－２２３８３）を含む５％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ溶液と４℃において一晩反応させた。ＴＢＳ－Ｔ溶液による洗浄を行なった後、それぞれ、ペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．社Ｃａｔ＃１１２－０３５－００３）、あるいはペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．社Ｃａｔ＃１１５－０３５－００３）を含む５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ溶液と室温で１時間反応を行なった。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ－Ｔ溶液で洗浄した後に、ペルオキシダーゼ発光試薬と反応させて得られたシグナルを、ＦＵＳＩＯＮ撮像装置を使用して検出した。
その結果、図９に示すように、クローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体いずれも全長型と切断型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を認識することが確認された。
【0051】
（２）３種の抗体が、細胞表面の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を認識することの確認
アミノ末端のシグナル配列の下流にＦＬＡＧタグで標識したＤｅｌ ５２型あるいはＩｎｓ ５型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を、ＵＴ－７／ＴＰＯ細胞において発現させ、ウシ胎児非働化血清１０％を含むＩＭＤＭ培地を用いて、５％ＣＯ２存在下において３７℃で培養した。増殖期の細胞１×１０５個をＰＢＳで洗浄後に２％ ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液中で、マウス抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ ｔａｇ抗体（富士フイルム和光純薬社Ｃａｔ＃０１４－２２３８３）あるいは、ラットクローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体と、氷上で３０分間反応させた。反応後、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液を用いて細胞を洗浄したあと、２次抗体として、それぞれ抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｃａｔ＃Ａ２１２３５）と抗ラットＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｃａｔ＃Ａ２１２４７）を２％ ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液中において氷上で３０分間反応させた。反応終了後に遠心により回収した細胞に、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ溶液を、氷上で１５分反応させた。最後に、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液を加えてから、遠心分離（４００ｇ×５分、４℃）し、上清を廃棄することで細胞を洗浄し、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液を３００μＬ加え、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてフローサイトメトリー解析により、シグナルを定量した。
その結果、図１０に示すように、クローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体いずれも、細胞表面の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を認識することが確認された。
アミノ末端のシグナル配列の下流にＦＬＡＧタグで標識したＤｅｌ ５２型あるいはＩｎｓ ５型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を、ＵＴ－７／ＴＰＯ細胞において発現させ、ウシ胎児非働化血清１０％を含むＩＭＤＭ培地を用いて、５％ＣＯ２存在下において３７℃で培養した。増殖期の細胞１×１０５個をＰＢＳで洗浄後に２％ ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液中で、マウス抗ＤＹＫＤＤＤＤＫ ｔａｇ抗体（富士フイルム和光純薬社Ｃａｔ＃０１４－２２３８３）あるいは、ラットクローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体と、氷上で３０分間反応させた。反応後、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液を用いて細胞を洗浄したあと、２次抗体として、それぞれ抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｃａｔ＃Ａ２１２３５）と抗ラットＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｃａｔ＃Ａ２１２４７）を２％ ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液中において氷上で３０分間反応させた。反応終了後に遠心により回収した細胞に、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ溶液を、氷上で１５分反応させた。最後に、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液を加えてから、遠心分離（４００ｇ×５分、４℃）し、上清を廃棄することで細胞を洗浄し、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ溶液を３００μＬ加え、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてフローサイトメトリー解析により、シグナルを定量した。
その結果、図１０に示すように、クローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体いずれも、細胞表面の変異型ＣＡＬＲ蛋白質を認識することが確認された。
【0052】
［試験例３］
（抗体の抗原結合力の評価）
（１）ＥＬＩＳＡによる抗原結合力の評価
１ウエル当たり精製した１００ｎｇのＤｅｌ ５２型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質、あるいはコントロールのＢＳＡを吸着させたＥＬＩＳＡプレート（住友ベークライト Ｃａｔ＃ＭＳ－８８９６Ｆ）を、５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳで室温において１時間反応させた。ＰＢＳでウエルを洗浄したのち、０、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、２００、４００、８００ｎｇ／ｍＬのクローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体、あるいはラットＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社Ｃａｔ＃２０２６）と５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳを、室温で１時間反応させた。ＰＢＳでウエルを洗浄したのち、１６ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．社Ｃａｔ＃１１２－０３５－００３）と５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳを、室温で１時間反応させた。ＴＢＳ－Ｔ溶液でウエルを洗浄したのち、ＴＭＢ溶液（ナカライテスク Ｃａｔ＃０５２９８－８０）を添加して、室温で１５分間反応させてから、１Ｍ硫酸水溶液を添加し、４５０ｎｍと６２０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度の差を求めた上で、コントロールのＢＳＡで得られた値を減じた値を算出した。
その結果、図１１に示すように、本発明の抗体（Ｂ３、Ｃ６、Ｇ１）は、いずれも変異型ＣＡＬＲ蛋白質と低濃度から結合することがわかる。
（抗体の抗原結合力の評価）
（１）ＥＬＩＳＡによる抗原結合力の評価
１ウエル当たり精製した１００ｎｇのＤｅｌ ５２型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質、あるいはコントロールのＢＳＡを吸着させたＥＬＩＳＡプレート（住友ベークライト Ｃａｔ＃ＭＳ－８８９６Ｆ）を、５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳで室温において１時間反応させた。ＰＢＳでウエルを洗浄したのち、０、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、２００、４００、８００ｎｇ／ｍＬのクローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体、あるいはラットＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社Ｃａｔ＃２０２６）と５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳを、室温で１時間反応させた。ＰＢＳでウエルを洗浄したのち、１６ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．社Ｃａｔ＃１１２－０３５－００３）と５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳを、室温で１時間反応させた。ＴＢＳ－Ｔ溶液でウエルを洗浄したのち、ＴＭＢ溶液（ナカライテスク Ｃａｔ＃０５２９８－８０）を添加して、室温で１５分間反応させてから、１Ｍ硫酸水溶液を添加し、４５０ｎｍと６２０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度の差を求めた上で、コントロールのＢＳＡで得られた値を減じた値を算出した。
その結果、図１１に示すように、本発明の抗体（Ｂ３、Ｃ６、Ｇ１）は、いずれも変異型ＣＡＬＲ蛋白質と低濃度から結合することがわかる。
【0053】
（２）表面プラズモン共鳴解析による抗原結合力の評価
表面プラズモン共鳴解析装置Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥヘルスケア社）に表面プラズモン共鳴解析用のセンサーチップ（ＧＥヘルスケア社Ｃａｔ＃ＢＲ１００５３０）を装填してから、ＨＢＳ－ＥＰバッファー（ＧＥヘルスケア社Ｃａｔ＃ＢＲ１００６６９）で平衡化した。Ａｃｅｔａｔｅ ５．５（ＧＥヘルスケア社Ｃａｔ＃ＢＲ１００３５２）で１０μｇ／ｍＬの濃度に調製したクローンＢ３抗体を、Ａｍｉｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社Ｃａｔ＃ＢＲ１０００５０）を用いて、固定化量が２００ＲＵとなるよう固定化した。続いて、ＨＢＳ－ＥＰバッファーにより２０、１０、５、２．５、１．２５ｎＭの濃度に調製した、配列番号１に含まれるアミノ酸配列（ＲＲＭＭＲＴＫＭＲ）のアミノ末端にシステインを付加したペプチドを用いて、表面プラズモン共鳴を測定し、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより解離定数を取得した。
その結果、図１２に示すように、本発明の抗体は、変異型ＣＡＬＲ蛋白質と強力に結合することがわかる。
表面プラズモン共鳴解析装置Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥヘルスケア社）に表面プラズモン共鳴解析用のセンサーチップ（ＧＥヘルスケア社Ｃａｔ＃ＢＲ１００５３０）を装填してから、ＨＢＳ－ＥＰバッファー（ＧＥヘルスケア社Ｃａｔ＃ＢＲ１００６６９）で平衡化した。Ａｃｅｔａｔｅ ５．５（ＧＥヘルスケア社Ｃａｔ＃ＢＲ１００３５２）で１０μｇ／ｍＬの濃度に調製したクローンＢ３抗体を、Ａｍｉｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社Ｃａｔ＃ＢＲ１０００５０）を用いて、固定化量が２００ＲＵとなるよう固定化した。続いて、ＨＢＳ－ＥＰバッファーにより２０、１０、５、２．５、１．２５ｎＭの濃度に調製した、配列番号１に含まれるアミノ酸配列（ＲＲＭＭＲＴＫＭＲ）のアミノ末端にシステインを付加したペプチドを用いて、表面プラズモン共鳴を測定し、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより解離定数を取得した。
その結果、図１２に示すように、本発明の抗体は、変異型ＣＡＬＲ蛋白質と強力に結合することがわかる。
【0054】
［試験例４］
（抗体の抗原認識部位の同定）
クローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体がＣＡＬＲ変異蛋白質上で抗原に用いたアミノ酸配列を認識することを確認した。抗原に用いたアミノ酸とその周辺のアミノ酸を１つずつアラニンに置換した変異型ＣＡＬＲ蛋白質に対するそれぞれの抗体の反応性をイムノブロット法（図１３Ａ）とＥＬＩＳＡ法（図１３Ｂ）を用いて評価した。
（抗体の抗原認識部位の同定）
クローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体がＣＡＬＲ変異蛋白質上で抗原に用いたアミノ酸配列を認識することを確認した。抗原に用いたアミノ酸とその周辺のアミノ酸を１つずつアラニンに置換した変異型ＣＡＬＲ蛋白質に対するそれぞれの抗体の反応性をイムノブロット法（図１３Ａ）とＥＬＩＳＡ法（図１３Ｂ）を用いて評価した。
【0055】
（１）イムノブロット法
Ｄｅｌ ５２型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質の３６７番目のスレオニン（Ｔ）から３７８番目のアルギニン（Ｒ）までの領域のアミノ酸を、１アミノ酸ずつアラニン（Ａ）に置換した蛋白質、あるいは置換を行わなかった蛋白質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で発現させて、分泌された変異型ＣＡＬＲ蛋白質を含む培養上清を遠心分離（１，６００ｇ×５分、４℃）により調製した。得られた蛋白質溶液を、ＳＤＳと還元剤存在下で加熱処理したあと、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写し、５％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔ溶液と室温で１時間反応させてから、ペルオキシダーゼ標識したクローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体あるいは、マウス抗ＣＡＬＲ抗体（ａｂｃａｍ社Ｃａｔ＃ａｂ２２６８３）を含む５％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ溶液と４℃において一晩反応させた。マウス抗ＣＡＬＲ抗体と反応させたＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ－Ｔ溶液による洗浄を行なった後、ペルオキシダーゼ標識された抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．社Ｃａｔ＃１１５－０３５－００３）を含む５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ溶液中において、室温で１時間反応を行なった。続いて、すべてのＰＶＤＦ膜をＴＢＳ－Ｔ溶液で洗浄した後に、ペルオキシダーゼ発光試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｃａｔ＃３４０９４）と反応させて得られたシグナルを、ＦＵＳＩＯＮ撮像装置（Ｖｉｌｂｅｒ－Ｌｏｕｒｍａｔ社製）を使用して検出した。
その結果、図１３Ａに示すように、本発明の抗体が、配列番号１の１番目のアルギニンから９番目のアルギニンの間を認識していることがわかる。
Ｄｅｌ ５２型の変異型ＣＡＬＲ蛋白質の３６７番目のスレオニン（Ｔ）から３７８番目のアルギニン（Ｒ）までの領域のアミノ酸を、１アミノ酸ずつアラニン（Ａ）に置換した蛋白質、あるいは置換を行わなかった蛋白質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で発現させて、分泌された変異型ＣＡＬＲ蛋白質を含む培養上清を遠心分離（１，６００ｇ×５分、４℃）により調製した。得られた蛋白質溶液を、ＳＤＳと還元剤存在下で加熱処理したあと、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりゲル上に展開した上で、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写し、５％スキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔ溶液と室温で１時間反応させてから、ペルオキシダーゼ標識したクローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体あるいは、マウス抗ＣＡＬＲ抗体（ａｂｃａｍ社Ｃａｔ＃ａｂ２２６８３）を含む５％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ溶液と４℃において一晩反応させた。マウス抗ＣＡＬＲ抗体と反応させたＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ－Ｔ溶液による洗浄を行なった後、ペルオキシダーゼ標識された抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．社Ｃａｔ＃１１５－０３５－００３）を含む５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ溶液中において、室温で１時間反応を行なった。続いて、すべてのＰＶＤＦ膜をＴＢＳ－Ｔ溶液で洗浄した後に、ペルオキシダーゼ発光試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｃａｔ＃３４０９４）と反応させて得られたシグナルを、ＦＵＳＩＯＮ撮像装置（Ｖｉｌｂｅｒ－Ｌｏｕｒｍａｔ社製）を使用して検出した。
その結果、図１３Ａに示すように、本発明の抗体が、配列番号１の１番目のアルギニンから９番目のアルギニンの間を認識していることがわかる。
【0056】
（２）ＥＬＩＳＡ法
上記の方法で調製した変異型ＣＡＬＲ蛋白質を吸着させたＥＬＩＳＡプレートを、５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳで室温において１時間反応させた。ＰＢＳでウエルを洗浄したのち、２００ｎｇ／ｍＬのクローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体、あるいはマウス抗ＣＡＬＲ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社Ｃａｔ＃ｓｃ－３７３８６３）と５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳを、室温で１時間反応させた。ＰＢＳでウエルを洗浄したのち、１６ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．社Ｃａｔ＃１１２－０３５－００３）あるいはヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社Ｃａｔ＃ｓｃ－２００５）と５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳを、室温で１時間反応させた。ＴＢＳ－Ｔ溶液でウエルを洗浄したのち、ＴＭＢ溶液を添加して、室温で１５分間反応させてから、１Ｍ硫酸水溶液を添加し、４５０ｎｍと６２０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度の差を求めた。
その結果、図１３Ｂに示すように、本発明の抗体が、配列番号１の１番目のアルギニンから９番目のアルギニンの間を認識していることがわかる。
上記の方法で調製した変異型ＣＡＬＲ蛋白質を吸着させたＥＬＩＳＡプレートを、５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳで室温において１時間反応させた。ＰＢＳでウエルを洗浄したのち、２００ｎｇ／ｍＬのクローンＢ３、Ｃ６、Ｇ１抗体、あるいはマウス抗ＣＡＬＲ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社Ｃａｔ＃ｓｃ－３７３８６３）と５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳを、室温で１時間反応させた。ＰＢＳでウエルを洗浄したのち、１６ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．社Ｃａｔ＃１１２－０３５－００３）あるいはヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社Ｃａｔ＃ｓｃ－２００５）と５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むＰＢＳを、室温で１時間反応させた。ＴＢＳ－Ｔ溶液でウエルを洗浄したのち、ＴＭＢ溶液を添加して、室温で１５分間反応させてから、１Ｍ硫酸水溶液を添加し、４５０ｎｍと６２０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度の差を求めた。
その結果、図１３Ｂに示すように、本発明の抗体が、配列番号１の１番目のアルギニンから９番目のアルギニンの間を認識していることがわかる。
【0057】
［試験例５］
（本発明抗体の配列情報の決定）
本発明の抗体（Ｂ３、Ｃ６、Ｇ１）の重鎖及び軽鎖の配列情報を、抗体を産生する細胞から、ＰｕｒｅＬｉｎｃ ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社Ｃａｔ＃１２１８３０２５）を使用して、ｍＲＮＡを調製した。得られたｍＲＮＡを鋳型に、重鎖あるいは軽鎖特異的な逆転写プライマーを用いて、Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ法によりｃＤＮＡを合成した後、プラスミドにクローニングした。得られたプラスミドをサンガーシークエンス解析することで、重鎖と軽鎖のｃＤＮＡの全長配列を決定した。
その結果を、図１４～図１７及び配列番号５～３４に示す。
（本発明抗体の配列情報の決定）
本発明の抗体（Ｂ３、Ｃ６、Ｇ１）の重鎖及び軽鎖の配列情報を、抗体を産生する細胞から、ＰｕｒｅＬｉｎｃ ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社Ｃａｔ＃１２１８３０２５）を使用して、ｍＲＮＡを調製した。得られたｍＲＮＡを鋳型に、重鎖あるいは軽鎖特異的な逆転写プライマーを用いて、Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ法によりｃＤＮＡを合成した後、プラスミドにクローニングした。得られたプラスミドをサンガーシークエンス解析することで、重鎖と軽鎖のｃＤＮＡの全長配列を決定した。
その結果を、図１４～図１７及び配列番号５～３４に示す。
【0058】
図１４は、本発明抗体（Ｂ３、Ｃ６、Ｇ１）の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。図１５は、本発明抗体（Ｂ３、Ｃ６、Ｇ１）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。図１６は、本発明抗体（Ｂ３、Ｃ６、Ｇ１）の重鎖可変領域の塩基配列を示す。図１７は、本発明抗体（Ｂ３、Ｃ６、Ｇ１）の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
【0059】
配列番号５は、Ｂ３抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。配列番号６は、Ｃ６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。配列番号７は、Ｇ１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。配列番号８は、Ｂ３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。配列番号９は、Ｃ６抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。配列番号１０は、Ｇ１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、Ｂ３抗体の重鎖可変領域の塩基配列を示す。配列番号１２は、Ｃ６抗体の重鎖可変領域の塩基配列を示す。配列番号１３は、Ｇ１抗体の重鎖可変領域の塩基配列を示す。配列番号１４は、Ｂ３抗体の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。配列番号１５は、Ｃ６抗体の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。配列番号１６は、Ｇ１抗体の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
配列番号１１は、Ｂ３抗体の重鎖可変領域の塩基配列を示す。配列番号１２は、Ｃ６抗体の重鎖可変領域の塩基配列を示す。配列番号１３は、Ｇ１抗体の重鎖可変領域の塩基配列を示す。配列番号１４は、Ｂ３抗体の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。配列番号１５は、Ｃ６抗体の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。配列番号１６は、Ｇ１抗体の軽鎖可変領域の塩基配列を示す。
【0060】
配列番号１７は、Ｂ３抗体のＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。配列番号１８は、Ｂ３抗体のＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。配列番号１９は、Ｂ３抗体のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号２０は、Ｃ６抗体のＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。配列番号２１は、Ｃ６抗体のＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。配列番号２２は、Ｃ６抗体のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号２３は、Ｇ１抗体のＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。配列番号２４は、Ｇ１抗体のＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。配列番号２５は、Ｇ１抗体のＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号２６は、Ｂ３抗体のＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。配列番号２７は、Ｂ３抗体のＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。配列番号２８は、Ｂ３抗体のＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号２９は、Ｃ６抗体のＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。配列番号３０は、Ｃ６抗体のＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。配列番号３１は、Ｃ６抗体のＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。配列番号３２は、Ｇ１抗体のＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。配列番号３３は、Ｇ１抗体のＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。配列番号３４は、Ｇ１抗体のＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
【0061】
［試験例６］
（治療効果の評価）
クローンＢ３抗体の重鎖と軽鎖の可変領域と、対応するマウスＩｇＧ２ａの重鎖と軽鎖の定常領域を融合したキメラＢ３抗体を作成し、Ｄｅｌ ５２型のＣＡＬＲ変異遺伝子を発現する造血幹細胞を移植して作出した骨髄増殖性腫瘍モデルマウスに投与し、キメラ抗体による治療効果を評価した。
クローンＢ３抗体の重鎖可変領域とマウスＩｇＧ２ａの定常領域をコードする遺伝子配列あるいは、クローンＢ３抗体の軽鎖可変領域とマウイムノグロブリンκの定常領域をコードする遺伝子配列を連結して、Ｂ３マウスキメラ重鎖と軽鎖遺伝子を組み込んだ発現ベクターを、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社Ｃａｔ＃Ａ２９１２７）に導入し、ＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社Ｃａｔ＃Ａ２９１０００１）を用いて、５％ＣＯ２存在下において３７℃で、１０日培養した。遠心分離（４，０００ｇ×３０分、４℃）により培養上清を回収してから、ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社Ｃａｔ＃２９０４８５８１）にキメラ抗体を吸着させたあと、０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を用いて溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）により中和した溶出画分を、ＰＢＳに透析してＢ３マウスキメラ抗体を調製した。
Ｂ３マウスキメラ抗体による治療効果の評価には、骨髄移植モデルマウスを用いた。８から１０週齢のＢ６．ＣＤ４５．１コンジェニックマウス（三協ラボ）の大腿骨から骨髄細胞を精製し、ＡＰＣ標識抗ｃ－ｋｉｔ抗体で標識されるｃ－ｋｉｔ陽性細胞を分取してから、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｇｒ－１、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ１１ｂ陰性で、ＣＤ１１７とＳｃａ１陽性のＬＳＫ細胞を分取し、Ｄｅｌ ５２型の変異型ＣＡＬＲ遺伝子を発現するｐＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰベクター、あるいはコントロールのベクターを包含するレトロウイルスを感染させた。感染７２時間後に、１匹あたり４０００個のＬＳＫ細胞を、６グレイｘ２回の放射線を照射した８から１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（オリエンタル酵母）に移植し、末梢血中の血小板数を多項目自動血球計数装置（シスメックス社 Ｃａｔ＃ｐｏｃＨ－１００ｉＶ Ｄｉｆｆ）により経時的に測定し、移植２ヶ月目に、変異型ＣＡＬＲ遺伝子の発現により引き起こされる骨髄増殖性腫瘍の表現型である血小板増多を確認してから、移植後９週目より毎週、上記のＢ３マウスキメラ抗体を１匹あたり２５０μｇ、あるいは溶媒（ＰＢＳ）を投与し、Ｂ３マウスキメラ抗体に特異的な血小板増多の抑制効果を評価した。
その結果、図１８に示すように、本発明抗体は、ＭＰＮに対して優れた治療効果を示した。
（治療効果の評価）
クローンＢ３抗体の重鎖と軽鎖の可変領域と、対応するマウスＩｇＧ２ａの重鎖と軽鎖の定常領域を融合したキメラＢ３抗体を作成し、Ｄｅｌ ５２型のＣＡＬＲ変異遺伝子を発現する造血幹細胞を移植して作出した骨髄増殖性腫瘍モデルマウスに投与し、キメラ抗体による治療効果を評価した。
クローンＢ３抗体の重鎖可変領域とマウスＩｇＧ２ａの定常領域をコードする遺伝子配列あるいは、クローンＢ３抗体の軽鎖可変領域とマウイムノグロブリンκの定常領域をコードする遺伝子配列を連結して、Ｂ３マウスキメラ重鎖と軽鎖遺伝子を組み込んだ発現ベクターを、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社Ｃａｔ＃Ａ２９１２７）に導入し、ＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社Ｃａｔ＃Ａ２９１０００１）を用いて、５％ＣＯ２存在下において３７℃で、１０日培養した。遠心分離（４，０００ｇ×３０分、４℃）により培養上清を回収してから、ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社Ｃａｔ＃２９０４８５８１）にキメラ抗体を吸着させたあと、０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ２．７）を用いて溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）により中和した溶出画分を、ＰＢＳに透析してＢ３マウスキメラ抗体を調製した。
Ｂ３マウスキメラ抗体による治療効果の評価には、骨髄移植モデルマウスを用いた。８から１０週齢のＢ６．ＣＤ４５．１コンジェニックマウス（三協ラボ）の大腿骨から骨髄細胞を精製し、ＡＰＣ標識抗ｃ－ｋｉｔ抗体で標識されるｃ－ｋｉｔ陽性細胞を分取してから、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｇｒ－１、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ１１ｂ陰性で、ＣＤ１１７とＳｃａ１陽性のＬＳＫ細胞を分取し、Ｄｅｌ ５２型の変異型ＣＡＬＲ遺伝子を発現するｐＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰベクター、あるいはコントロールのベクターを包含するレトロウイルスを感染させた。感染７２時間後に、１匹あたり４０００個のＬＳＫ細胞を、６グレイｘ２回の放射線を照射した８から１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（オリエンタル酵母）に移植し、末梢血中の血小板数を多項目自動血球計数装置（シスメックス社 Ｃａｔ＃ｐｏｃＨ－１００ｉＶ Ｄｉｆｆ）により経時的に測定し、移植２ヶ月目に、変異型ＣＡＬＲ遺伝子の発現により引き起こされる骨髄増殖性腫瘍の表現型である血小板増多を確認してから、移植後９週目より毎週、上記のＢ３マウスキメラ抗体を１匹あたり２５０μｇ、あるいは溶媒（ＰＢＳ）を投与し、Ｂ３マウスキメラ抗体に特異的な血小板増多の抑制効果を評価した。
その結果、図１８に示すように、本発明抗体は、ＭＰＮに対して優れた治療効果を示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】