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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-26
(45)【発行日】2024-08-05
(54)【発明の名称】ノロウイルス結合ペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20240729BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20240729BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06 ZNA
C12Q1/04
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2020093743
(22)【出願日】2020-05-28
(65)【公開番号】P2020196708
(43)【公開日】2020-12-10
【審査請求日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】P 2019100758
(32)【優先日】2019-05-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 淑貴
(72)【発明者】
【氏名】森本 拓也
(72)【発明者】
【氏名】熊地 重文
(72)【発明者】
【氏名】根本 直人
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１６／００６１８３５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２０１９－０４３９４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１５－０４２１５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／１８３７０７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１５３９９１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Biosensors and Bioelectronics，2017年，Vol.87，pp.164-170
【文献】Nucleic Acid Research，2009年，Vol.37, No.16，e108 (pp.1-13)
【文献】Biotechnology and Bioprocess Engineering，2019年05月18日，Vol.24，pp.318-325
【文献】Biosensors and Bioelectronics，2018年08月28日，Vol.123，pp.223-229
【文献】Journal of Biotechnology，2015年，Vol.212，pp.174-180
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ （ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１０３、２８３及び３０２から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
【請求項2】
請求項１記載のノロウイルス結合ペプチドを用いるノロウイルスの検出方法。
【請求項3】
請求項１記載のノロウイルス結合ペプチドを含有するノロウイルス検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ノロウイルスに親和性を有するノロウイルス結合ペプチドに関する。
【背景技術】
【0002】
ノロウイルスは従来ＳＲＳＶ（Ｓｍａｌｌ Ｒｏｕｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｖｉｒｕｓ：小型球形ウイルス）と呼ばれており、また、ＮＬＶ（Ｎｏｒｗａｌｋ－ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ：ノーウォーク関連ウイルス）ともいわれるウイルスであり、その遺伝子型によりＧＩ（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐＩ）からＧＶ（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ Ｖ）まで５つに分類され、このうちヒトに感染するのはＧＩ，ＧＩＩ，ＧＩＶである。ノロウイルスはヒトの腸管細胞内で増殖し、下痢、嘔吐、腹痛、吐き気、発熱等の症状を伴う食中毒の原因となるウイルスであり、主な感染源は食品で、しばしば生カキが問題となっている。また、近年ではウイルス保菌者の排泄物等によるヒトからヒトへの感染も多くなっている。
【0003】
現在、ノロウイルスの検出には、電子顕微鏡による観察の他、抗体を用いる方法、ノロウイルスＲＮＡの増幅産物量を測定する方法が存在する。また、最近では、ノロウイルスに対して親和性を有し、ノロウイルスの検出に有用な１８アミノ酸からなるポリペプチドも見出されているが、その結合力はこれまでに報告されているノロウイルス抗体と比べて低いことが報告されている（非特許文献１）。
【0004】
しかしながら、ＲＮＡを検出する方法は逆転写や増幅工程が必要であり、操作が煩雑で時間とコストがかかる。また、抗体においては、特異性が低い場合があること、動物や培養細胞を用いて作製・生産するために、品質が安定しない、コストがかかる、という問題が存在する。
したがって、より有効で、簡便なノロウイルスの特異的検出法、並びにノロウイルス感染の予防及び治療法の開発が求められている。
したがって、より有効で、簡便なノロウイルスの特異的検出法、並びにノロウイルス感染の予防及び治療法の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Ｈｙｅ Ｊｉｎ Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ. Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ８７（２０１７）１６４－１７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、ノロウイルスの特異的検出や感染制御に有用な、ノロウイルスに特異的に結合するペプチドを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の発明者は、１０１４オーダーのｃＤＮＡを包含するｃＤＮＡライブラリを作製し、これからｃＤＮＡディスプレイ法を用いて、ノロウイルスと特異的に結合するペプチドを取得することに成功し、本発明を完成した。
【0008】
すなわち、本発明は以下の１）～４）に係るものである。
１）配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
２）配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方にシステイン残基が付加したアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
３）上記１）又は２）のノロウイルス結合ペプチドを用いるノロウイルスの検出方法。
４）上記１）又は２）のノロウイルス結合ペプチドを含有するノロウイルス検出キット。
１）配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
２）配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方にシステイン残基が付加したアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
３）上記１）又は２）のノロウイルス結合ペプチドを用いるノロウイルスの検出方法。
４）上記１）又は２）のノロウイルス結合ペプチドを含有するノロウイルス検出キット。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、ノロウイルスと親和性が高いノロウイルス結合ペプチドが提供される。本発明のペプチドによれば、ノロウイルスを特異的に高感度で検出することができ、またノロウイルスのヒトへの感染を制御できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】ＶＬＰｓの作製フローを示す模式図。
【図2】ノロウイルス結合ペプチドのスクリーニングの概略を示す模式図。
【図3】ｍＲＮＡ－リンカー連結体を示す模式図（Ａ：セレクション用、Ｂ：解析用）。
【図4】ＥＬＩＳＡによる相互作用の評価結果。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明のノロウイルス結合ペプチドは、配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、１０アミノ酸で構成されるペプチドである（表１８～２０）。
当該ペプチドは、１０１４オーダーのｃＤＮＡを包含するｃＤＮＡライブラリからｃＤＮＡディスプレイ法を用いて、試験管内淘汰によりノロウイルスを標的分子としてスクリーニングされたものであり、ノロウイルスと特異的に結合する能力を持ったノロウイルス結合のペプチドアプタマーである。当該ペプチドは、疎水性アミノ酸が２７．６％、親水性アミノ酸が７２．４％からなるライブラリ配列から構成された１０アミノ酸である。本発明のノロウイルス結合ペプチドは、試験管内淘汰によりノロウイルスを標的分子としてスクリーニングされたノロウイルス結合ペプチドのうちアミノ酸配列の類似度によるクラスター解析でクラスターとして認められたもの、又は出現頻度が高いものである。クラスター解析の視点ではハミング距離が５以下に該当するクラスターのうち配列番号６～１０、２１～２５、３１～３５、７１～７５、１０１～１１０、１６４～１７２及び２０５～２６０から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドが好ましく、３文字列に分割したｑ－ｇｒａｍ距離が４以下で３配列以上のクラスターのうち配列番号２６１～２６３、２８２～２８４及び２８８～２９０から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドが好ましく、ノロウイルス結合ペプチド出現頻度の視点では配列番号３０１、３０２、３０５、３０８、３１０～３１２、３１６、３１７、３２０及び３２３のアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドが好ましい。また、これらの配列群のうち配列番号配列番号１０１～１０５、１６４～１７２、２０５～２６０、２６１～２６３、２８２～２８４、２８８～２９０及び３０２から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドがより好ましく、配列番号１０３、１６７、２０５、２６３、２８３、２８８及び３０２から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドが特に好ましい。
当該ペプチドは、１０１４オーダーのｃＤＮＡを包含するｃＤＮＡライブラリからｃＤＮＡディスプレイ法を用いて、試験管内淘汰によりノロウイルスを標的分子としてスクリーニングされたものであり、ノロウイルスと特異的に結合する能力を持ったノロウイルス結合のペプチドアプタマーである。当該ペプチドは、疎水性アミノ酸が２７．６％、親水性アミノ酸が７２．４％からなるライブラリ配列から構成された１０アミノ酸である。本発明のノロウイルス結合ペプチドは、試験管内淘汰によりノロウイルスを標的分子としてスクリーニングされたノロウイルス結合ペプチドのうちアミノ酸配列の類似度によるクラスター解析でクラスターとして認められたもの、又は出現頻度が高いものである。クラスター解析の視点ではハミング距離が５以下に該当するクラスターのうち配列番号６～１０、２１～２５、３１～３５、７１～７５、１０１～１１０、１６４～１７２及び２０５～２６０から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドが好ましく、３文字列に分割したｑ－ｇｒａｍ距離が４以下で３配列以上のクラスターのうち配列番号２６１～２６３、２８２～２８４及び２８８～２９０から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドが好ましく、ノロウイルス結合ペプチド出現頻度の視点では配列番号３０１、３０２、３０５、３０８、３１０～３１２、３１６、３１７、３２０及び３２３のアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドが好ましい。また、これらの配列群のうち配列番号配列番号１０１～１０５、１６４～１７２、２０５～２６０、２６１～２６３、２８２～２８４、２８８～２９０及び３０２から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドがより好ましく、配列番号１０３、１６７、２０５、２６３、２８３、２８８及び３０２から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるノロウイルス結合ペプチドが特に好ましい。
【0012】
本発明のペプチドには、一態様として、配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方にシステイン残基が付加したアミノ酸配列からなるものが包含される。そして、両末端にシステイン残基を有するペプチドは、当該システイン残基がジスルフィド結合し、環状ペプチドを形成することができる。
【0013】
また、本発明のペプチドには、別の一態様として、ノロウイルスとの特異的結合能力が保持される限りにおいて、上記の配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方にシステイン残基が付加したアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれか又は両方に、さらに１～２０個の任意のアミノ酸残基が付加したアミノ酸配列からなるものが包含される。
【0014】
ヒトに感染するノロウイルスに属するウイルスは、現在、Ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ Ｉ（ＧＩ）とＧｅｎｏｇｒｏｕｐ ＩＩ（ＧＩＩ）、及びＧｅｎｏｇｒｏｕｐ ＩＶ（ＧＩＶ）の３つの遺伝子群に分類され、感染が報告される事例の９割以上はＧＩＩ群である。また、各遺伝子型に対応した血清型があると考えられている。本発明においてノロウイルスには、斯かるノロウイルスに属するウイルスが包含される。また、ノロウイルスゲノムの構造蛋白質領域をバキュロウイルスに組み込み、昆虫細胞で発現させると、ウイルス粒子と酷似した中空ウイルス粒子（ＶＬＰｓ）を作出できる。ＶＬＰｓは構造がノロウイルスそのものであり、ウイルス粒子と同等の抗原性を有するが、内部にゲノムＲＮＡを持たず、中空で感染性はない。したがって、本発明においてノロウイルスには、斯かるＶＬＰｓも包含される。
ＶＬＰｓとしては、ＧＩＩ．４ Ｓａｇａ１株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ４４７４５６）、ＧＩＩ．４ Ｓｙｄｎｅｙ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＪＸ４５９９０８．１）、ＧＩＩ．３ ＴＣＨ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＫＦ００６２６５），ＧＩＩ．２ Ｅｈｉｍｅ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＬＣ１４５８０８）、ＧＩＩ．１７ Ｋａｗａｓａｋｉ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ９８３２１８）、ＧＩＩ．１７ Ｓａｉｔａｍａ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ１９６２８６．１）等のノロウイルスゲノムを用いて作成したＶＬＰｓが挙げられる。
ＶＬＰｓとしては、ＧＩＩ．４ Ｓａｇａ１株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ４４７４５６）、ＧＩＩ．４ Ｓｙｄｎｅｙ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＪＸ４５９９０８．１）、ＧＩＩ．３ ＴＣＨ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＫＦ００６２６５），ＧＩＩ．２ Ｅｈｉｍｅ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＬＣ１４５８０８）、ＧＩＩ．１７ Ｋａｗａｓａｋｉ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ９８３２１８）、ＧＩＩ．１７ Ｓａｉｔａｍａ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ１９６２８６．１）等のノロウイルスゲノムを用いて作成したＶＬＰｓが挙げられる。
【0015】
本発明のペプチドは、ノロウイルス（中空ウイルス粒子；ＶＬＰｓ）を標的分子として、当該分野で公知の試験管内進化法、例えばｃＤＮＡディスプレイ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ｖｏｌ３７, Ｎｏ.１６, ｅ１０８（２００９））を用いて作製することができる。すなわち、ｃＤＮＡを包含するｃＤＮＡライブラリ（ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ結合体のライブラリ）を作製し、これを、ｃＤＮＡディスプレイ法を用いて試験管内選別することにより作製することができる。
具体的には、以下のａ）～ｃ）の工程により製造できる（図２参照）。
ａ）所望のランダムペプチドライブラリをコードするＤＮＡ断片（コンストラクト）の準備工程
ｂ）前記工程で準備されたコンストラクトを使用し、ｃＤＮＡディスプレイ法を用いてペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをインビトロで作製するｃＤＮＡディスプレイ作製工程
ｃ）前記工程で得られたｃＤＮＡディスプレイをＶＬＰｓと混合させ、ＶＬＰｓと結合したｃＤＮＡディスプレイを回収し、ＶＬＰｓ結合ｃＤＮＡディスプレイをスクリーニングする選択工程
具体的には、以下のａ）～ｃ）の工程により製造できる（図２参照）。
ａ）所望のランダムペプチドライブラリをコードするＤＮＡ断片（コンストラクト）の準備工程
ｂ）前記工程で準備されたコンストラクトを使用し、ｃＤＮＡディスプレイ法を用いてペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをインビトロで作製するｃＤＮＡディスプレイ作製工程
ｃ）前記工程で得られたｃＤＮＡディスプレイをＶＬＰｓと混合させ、ＶＬＰｓと結合したｃＤＮＡディスプレイを回収し、ＶＬＰｓ結合ｃＤＮＡディスプレイをスクリーニングする選択工程
【0016】
ａ．コンストラクトの準備工程
ノロウイルス結合ペプチドの作製用コンストラクトとして、５’側から３’側に向かって、プライマー領域と、プロモーター領域と、非翻訳領域と、ランダム領域と、タグ領域とを含む、所望のランダムペプチドライブラリをコードするＤＮＡ断片が構築される。ここで、プライマー領域として使用するＤＮＡ配列は、市販されている一般的なものを使用することができる。また、プロモーター領域としては、Ｔ７、ＳＰ６等を使用することができる。非翻訳領域としては、Ω配列等を使用することができる。
ノロウイルス結合ペプチドの作製用コンストラクトとして、５’側から３’側に向かって、プライマー領域と、プロモーター領域と、非翻訳領域と、ランダム領域と、タグ領域とを含む、所望のランダムペプチドライブラリをコードするＤＮＡ断片が構築される。ここで、プライマー領域として使用するＤＮＡ配列は、市販されている一般的なものを使用することができる。また、プロモーター領域としては、Ｔ７、ＳＰ６等を使用することができる。非翻訳領域としては、Ω配列等を使用することができる。
【0017】
ランダム領域は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンからなる疎水性アミノ酸が２７．６％、グリシン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システインからなる極性アミノ酸が３６．０％、リジン、アルギニン、ヒスチジンからなる塩基性アミノ酸が１８．４％、アスパラギン酸、グルタミン酸からなる酸性アミノ酸が１２．０％となるようにＤＮＡが構成されている。
【0018】
ｂ．ｃＤＮＡディスプレイ作製工程
ｃＤＮＡディスプレイの作製は、図２に示すように、（ｂ１）ｍＲＮＡ調製工程と；（ｂ２）リンカー－ｍＲＮＡ連結体形成工程と；（ｂ３）ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体形成工程と；（ｂ４）粒子結合工程と；（ｂ５）ｃＤＮＡディスプレイ形成工程と；（ｂ６）ペプチドの架橋工程と；（ｂ７）ｃＤＮＡディスプレイ遊離工程を備える。
ｃＤＮＡディスプレイの作製は、図２に示すように、（ｂ１）ｍＲＮＡ調製工程と；（ｂ２）リンカー－ｍＲＮＡ連結体形成工程と；（ｂ３）ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体形成工程と；（ｂ４）粒子結合工程と；（ｂ５）ｃＤＮＡディスプレイ形成工程と；（ｂ６）ペプチドの架橋工程と；（ｂ７）ｃＤＮＡディスプレイ遊離工程を備える。
【0019】
（ｂ１）ｍＲＮＡ調製工程では、前記のコンストラクトから転写によってｍＲＮＡを調製する。そして、（ｂ２）前記ｍＲＮＡ調製工程で得られたｍＲＮＡを、ピューロマイシンを結合させたリンカーに結合させて、リンカー－ｍＲＮＡ連結体を形成する。
次に、（ｂ３）無細胞翻訳系により翻訳された前記ｍＲＮＡ配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドをピューロマイシンに結合させ、ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体を形成する。
次いで、（ｂ４）粒子結合工程において、上記のようにして得られたペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体を、磁性粒子に結合させる。
続いて、（ｂ５）前記磁性粒子と結合したペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体のｍＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを形成させ、ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを得る（「ｃＤＮＡディスプレイ」）。
次に、（ｂ６）前記工程で得られたｃＤＮＡディスプレイにおけるペプチドのランダム領域のＮ末端とＣ末端にあるシステインに対して架橋反応を施して架橋する。
次に、（ｂ７）複合体遊離工程において、前記工程で得られたｃＤＮＡディスプレイを前記磁性粒子から遊離させ、必要に応じて精製が行われる。
次に、（ｂ３）無細胞翻訳系により翻訳された前記ｍＲＮＡ配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドをピューロマイシンに結合させ、ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体を形成する。
次いで、（ｂ４）粒子結合工程において、上記のようにして得られたペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体を、磁性粒子に結合させる。
続いて、（ｂ５）前記磁性粒子と結合したペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体のｍＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを形成させ、ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを得る（「ｃＤＮＡディスプレイ」）。
次に、（ｂ６）前記工程で得られたｃＤＮＡディスプレイにおけるペプチドのランダム領域のＮ末端とＣ末端にあるシステインに対して架橋反応を施して架橋する。
次に、（ｂ７）複合体遊離工程において、前記工程で得られたｃＤＮＡディスプレイを前記磁性粒子から遊離させ、必要に応じて精製が行われる。
【0020】
ｃ．ＶＬＰｓ結合ｃＤＮＡディスプレイの選択工程
ＶＬＰｓ結合ｃＤＮＡディスプレイの選択は、（ｃ１）溶液添加工程と、（ｃ２）分離工程と；（ｃ３）回収工程とを備える。
（ｃ１）溶液添加工程では、ＶＬＰｓ溶液に、ｃＤＮＡディスプレイ含有溶液が添加される。引き続き、（ｃ２）分離工程で、ＶＬＰｓとｃＤＮＡディスプレイ溶液との混合液を、例えば１３０，０００×ｇで５分間遠心してＶＬＰｓを沈殿させることで、ＶＬＰｓと結合しなかったｃＤＮＡディスプレイと分離される。その後、（ｃ３）回収工程で、ＶＬＰｓに結合したｃＤＮＡディスプレイがＶＬＰｓごと回収される。
ＶＬＰｓ結合ｃＤＮＡディスプレイの選択は、（ｃ１）溶液添加工程と、（ｃ２）分離工程と；（ｃ３）回収工程とを備える。
（ｃ１）溶液添加工程では、ＶＬＰｓ溶液に、ｃＤＮＡディスプレイ含有溶液が添加される。引き続き、（ｃ２）分離工程で、ＶＬＰｓとｃＤＮＡディスプレイ溶液との混合液を、例えば１３０，０００×ｇで５分間遠心してＶＬＰｓを沈殿させることで、ＶＬＰｓと結合しなかったｃＤＮＡディスプレイと分離される。その後、（ｃ３）回収工程で、ＶＬＰｓに結合したｃＤＮＡディスプレイがＶＬＰｓごと回収される。
【0021】
本発明のペプチドは、以上のようにして、所定のＤＮＡライブラリから試験管内選別可能である。
また、本発明のペプチドは、液相法、固相法、液相法と固相法を組み合わせたハイブリッド法等の化学合成法；遺伝子組み換え法等、公知のペプチドの製造方法によって製造することができる。
また、本発明のペプチドは、液相法、固相法、液相法と固相法を組み合わせたハイブリッド法等の化学合成法；遺伝子組み換え法等、公知のペプチドの製造方法によって製造することができる。
【0022】
本発明のペプチドは、ノロウイルスに特異的に結合することから、これを、ノロウイルスを含有するか、または含有する可能性のあるサンプルと接触させることによって、サンプル中にノロウイルスが存在すること、あるいは存在しないことを確認できる。
すなわち、例えば、ＥＬＩＳＡ法等のイムノアッセイにおける抗ノロウイルス抗体に代えて、本発明のペプチドを用いて試料中のノロウイルスを検出することができる。
検出薬として用いる場合、本発明のペプチドは、検出可能に標識され得る。ペプチドの標識は、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素の他、放射性物質、蛍光物質、発光物質等が用いられる。その他、金コロイド、量子ドット等のナノ粒子を用いることもできる。また、イムノアッセイでは、本発明のペプチドをビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる。
すなわち、例えば、ＥＬＩＳＡ法等のイムノアッセイにおける抗ノロウイルス抗体に代えて、本発明のペプチドを用いて試料中のノロウイルスを検出することができる。
検出薬として用いる場合、本発明のペプチドは、検出可能に標識され得る。ペプチドの標識は、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素の他、放射性物質、蛍光物質、発光物質等が用いられる。その他、金コロイド、量子ドット等のナノ粒子を用いることもできる。また、イムノアッセイでは、本発明のペプチドをビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる。
【0023】
イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法は、簡便且つ迅速に抗原を測定することができる点で好ましい。本発明のペプチドを用い、ＥＬＩＳＡ法によってノロウイルスを検出する場合、例えば、固相担体にノロウイルスを固定化し、そこへ予めビオチン標識したペプチドを結合させる。洗浄後、アビジン修飾した酵素をビオチンに結合させ、その後酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、ノロウイルスを検出することができる。または本発明のペプチドを固相化し、そこへノロウイルスを結合させる。洗浄後、酵素標識した抗ノロウイルス抗体または、抗ノロウイルス抗体及び酵素標識した二次抗体を結合させた後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定する事により、ノロウイルスを検出することが出来る。
酵素基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合、p-ニトロフェニルリン酸（ＮＰＰ）等を用いることができ、ペルオキシターゼの場合は、３、３’、５，５’－テトラメチルベンジジン等を用いることができる。また、固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。本発明のペプチド等の前記固相担体への固定は、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用する方法等、公知の方法に従って結合させることにより行うことができる。
酵素基質としては、酵素がアルカリホスファターゼの場合、p-ニトロフェニルリン酸（ＮＰＰ）等を用いることができ、ペルオキシターゼの場合は、３、３’、５，５’－テトラメチルベンジジン等を用いることができる。また、固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。本発明のペプチド等の前記固相担体への固定は、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用する方法等、公知の方法に従って結合させることにより行うことができる。
【0024】
本発明のペプチドは、ノロウイルス検出用キットの構成成分となり得る。当該検出キットは、本発明のペプチドの他、検出に必要な試薬及び器具、例えば抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットの対象となるサンプルとしては、例えば、ノロウイルスを含むか又は含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例えば患者より採取された糞便や吐しゃ物等の臨床材料や、分離されたウイルス培養液及び、カキ等の食品や上下水道水等を挙げることができる。
当該検出キットの対象となるサンプルとしては、例えば、ノロウイルスを含むか又は含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例えば患者より採取された糞便や吐しゃ物等の臨床材料や、分離されたウイルス培養液及び、カキ等の食品や上下水道水等を挙げることができる。
【0025】
また、本発明のペプチドは、ノロウイルスのカプシドタンパク質等に特異的に結合し、ウイルスの細胞への結合を阻害することが考えられる。したがって、本発明のペプチドは、抗ノロウイルス製剤として、またノロウイルスの予防用または治療用の医薬として利用することも可能である。
本発明のペプチドを医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸入による投与も可能である。
本発明のペプチドを医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸入による投与も可能である。
【0026】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
＜２＞配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方にシステイン残基が結合したアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
＜３＞配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端にシステイン残基が結合したものである、＜２＞のノロウイルス結合ペプチド。
＜４＞配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端及びＣ末端に結合したシステイン残基がジスルフィド結合し環を形成してなる、＜３＞のノロウイルス結合ペプチド。
＜５＞＜１＞～＜４＞のいずれかのペプチドのＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方に１～２０個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
＜６＞＜１＞～＜５＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチドを用いるノロウイルスの検出方法。
＜７＞＜１＞～＜５＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチドを含有するノロウイルス検出キット。
＜８＞配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、配列番号６～１０、２１～２５、３１～３５、７１～７５、１０１～１１０、１６４～１７２、２０５～２６３、２８２～２８４、２８８～２９０、３０１、３０２、３０５、３０８、３１０～３１２、３１６、３１７、３２０及び３２３から選ばれるいずれかのアミノ酸配列である、＜１＞～＜６＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット。
＜９＞配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１０１～１０５、１６４～１７２、２０５～２６０、２６１～２６３、２８２～２８４、２８８～２９０及び３０２から選ばれるいずれかのアミノ酸配列である、＜１＞～＜６＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット。
＜１０＞配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１０３、１６７、２０５、２６３、２８３、２８８及び３０２から選ばれるいずれかのアミノ酸配列である、＜１＞～＜６＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット。
＜１＞配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
＜２＞配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方にシステイン残基が結合したアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
＜３＞配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端にシステイン残基が結合したものである、＜２＞のノロウイルス結合ペプチド。
＜４＞配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端及びＣ末端に結合したシステイン残基がジスルフィド結合し環を形成してなる、＜３＞のノロウイルス結合ペプチド。
＜５＞＜１＞～＜４＞のいずれかのペプチドのＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方に１～２０個のアミノ酸が結合したアミノ酸配列からなる、ノロウイルス結合ペプチド。
＜６＞＜１＞～＜５＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチドを用いるノロウイルスの検出方法。
＜７＞＜１＞～＜５＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチドを含有するノロウイルス検出キット。
＜８＞配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、配列番号６～１０、２１～２５、３１～３５、７１～７５、１０１～１１０、１６４～１７２、２０５～２６３、２８２～２８４、２８８～２９０、３０１、３０２、３０５、３０８、３１０～３１２、３１６、３１７、３２０及び３２３から選ばれるいずれかのアミノ酸配列である、＜１＞～＜６＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット。
＜９＞配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１０１～１０５、１６４～１７２、２０５～２６０、２６１～２６３、２８２～２８４、２８８～２９０及び３０２から選ばれるいずれかのアミノ酸配列である、＜１＞～＜６＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット。
＜１０＞配列番号１～３２７から選ばれるいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１０３、１６７、２０５、２６３、２８３、２８８及び３０２から選ばれるいずれかのアミノ酸配列である、＜１＞～＜６＞のいずれかのノロウイルス結合ペプチド、又は＜７＞のノロウイルス検出キット。
【実施例】
【0027】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
参考例 ＶＬＰｓの作製
（１）ｐＤＥＳＴ８へのＶＰ１、ＶＰ２遺伝子の導入
ノロウイルス（以下、ＮｏＶと略す場合がある） ＧＩＩ．４ Ｓａｇａ１株 （Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＢ４４７４５６）、ＧＩＩ．３ ＴＣＨ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＫＦ００６２６５）、ＧＩＩ．１７ Ｓａｉｔａｍａ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ１９６２８６．１）の構造タンパク質領域であるＶＰ１，ＶＰ２領域をコードするＤＮＡについては株式会社ファスマックにて人工合成を委託し、ｐＵＣＦａプラスミドのｌａｃＺα領域である５’－ＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＴ／ＡＴＣＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＴＡＡＧ－３’(配列番号３２８)のスラッシュをクローニングサイトとして目的遺伝子を導入した。ＧＩＩ．４について、合成したｐＵＣ－Ｓａｇａ１(図１)ＤＮＡを鋳型として、プライマー１（５’－ＣＡＴＣＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＡ－３’：配列番号３２９）及びプライマー２（５’－ＴＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴ－３’：配列番号３３０）を用いてＰＣＲ反応を行い、断片（図１－Ａ）を得た。ＧＩＩ．３については合成したｐＵＣ－ＴＣＨのＤＮＡを鋳型として、プライマー３（５’－ＡＴＣＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡ－３’：配列番号３３１）及びプライマー４（５’－ＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＣＧＣＧＡＡ－３’：配列番号３３２）を用いてＰＣＲ反応を行い、断片（図１－Ａ）を得た。また、ｐＤＥＳＴ８プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型として、プライマー５（５’－ＡＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡＴＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＡＧＴＡ－３’：配列番号３３３）及びプライマー６（５’－ＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＣＣＧＣＧＣＣＣＧＡＴ－３’：配列番号３３４）を用いてＰＣＲ反応を行い、断片（図１－Ｂ）を得た。得られたＰＣＲ断片Ａ及び断片Ｂを混合し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて反応を行い、得られたＤＮＡ（図１－Ｃ）１ｎｇを用いて、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有したＬＢ寒天平板培地にて選択を行い、得られたコロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、得られた細胞からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いてプラスミドの抽出を行った。得られたＮｏＶ遺伝子導入プラスミドは、ＤＮＡシークエンサーを用いて配列の決定を行い、目的の配列が挿入されていることの確認を行った。
ＧＩＩ．１７についてはＶＰ１領域の開始コドンから４塩基上流にａｔｔＬ１配列（５’－ｃｃｃｃａａａｔａａｔｇａｔｔｔｔａｔｔｔｔｇａｃｔｇａｔａｇｔｇａｃｃｔｇｔｔｃｇｔｔｇｃａａｃａａａｔｔｇａｔｇａｇｃａａｔｇｃｔｔｔｔｔｔａｔａａｔｇｃｃａａｃｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔ－３’：配列番号３３５）を、またＶＰ２領域の終止コドンから５５塩基下流にポリアデニンを３０配列と、続いてａｔｔＬ２配列(５’－ａｇｃｔｔａｃｃｃａｇｃｔｔｔｃｔｔｇｔａｃａａａｇｔｔｇｇｃａｔｔａｔａａｇａａａｇｃａｔｔｇｃｔｔａｔｃａａｔｔｔｇｔｔｇｃａａｃｇａａｃａｇｇｔｃａｃｔａｔｃａｇｔｃａａａａｔａａａａｔｃａｔｔａｔｔｔｇ－３’：配列番号３３６)を導入した配列を人工合成し、得られたｐＵＣ－Ｓａｉｔａｍａと、ｐＤＥＳＴ８とを等量混合し、表１の通り混合し２５℃で１時間反応させた。反応後、１μＬのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（タカラバイオ製）を加え３７℃で１０分反応させた。反応液１ｎｇを用いて、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ寒天平板培地にて選択を行い、得られたコロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、得られた細胞からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いて精製し、ＧＩＩ．１７をコードしたｐＤＥＳＴ８を得た。
参考例 ＶＬＰｓの作製
（１）ｐＤＥＳＴ８へのＶＰ１、ＶＰ２遺伝子の導入
ノロウイルス（以下、ＮｏＶと略す場合がある） ＧＩＩ．４ Ｓａｇａ１株 （Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ：ＡＢ４４７４５６）、ＧＩＩ．３ ＴＣＨ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＫＦ００６２６５）、ＧＩＩ．１７ Ｓａｉｔａｍａ株（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ１９６２８６．１）の構造タンパク質領域であるＶＰ１，ＶＰ２領域をコードするＤＮＡについては株式会社ファスマックにて人工合成を委託し、ｐＵＣＦａプラスミドのｌａｃＺα領域である５’－ＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＴ／ＡＴＣＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＴＡＡＧ－３’(配列番号３２８)のスラッシュをクローニングサイトとして目的遺伝子を導入した。ＧＩＩ．４について、合成したｐＵＣ－Ｓａｇａ１(図１)ＤＮＡを鋳型として、プライマー１（５’－ＣＡＴＣＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＡ－３’：配列番号３２９）及びプライマー２（５’－ＴＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴ－３’：配列番号３３０）を用いてＰＣＲ反応を行い、断片（図１－Ａ）を得た。ＧＩＩ．３については合成したｐＵＣ－ＴＣＨのＤＮＡを鋳型として、プライマー３（５’－ＡＴＣＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＣＡ－３’：配列番号３３１）及びプライマー４（５’－ＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＣＧＣＧＡＡ－３’：配列番号３３２）を用いてＰＣＲ反応を行い、断片（図１－Ａ）を得た。また、ｐＤＥＳＴ８プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型として、プライマー５（５’－ＡＣＡＡＧＴＧＧＴＧＡＴＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＧＡＡＧＴＡ－３’：配列番号３３３）及びプライマー６（５’－ＧＴＡＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＡＴＧＡＴＣＣＧＣＧＣＣＣＧＡＴ－３’：配列番号３３４）を用いてＰＣＲ反応を行い、断片（図１－Ｂ）を得た。得られたＰＣＲ断片Ａ及び断片Ｂを混合し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて反応を行い、得られたＤＮＡ（図１－Ｃ）１ｎｇを用いて、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有したＬＢ寒天平板培地にて選択を行い、得られたコロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、得られた細胞からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いてプラスミドの抽出を行った。得られたＮｏＶ遺伝子導入プラスミドは、ＤＮＡシークエンサーを用いて配列の決定を行い、目的の配列が挿入されていることの確認を行った。
ＧＩＩ．１７についてはＶＰ１領域の開始コドンから４塩基上流にａｔｔＬ１配列（５’－ｃｃｃｃａａａｔａａｔｇａｔｔｔｔａｔｔｔｔｇａｃｔｇａｔａｇｔｇａｃｃｔｇｔｔｃｇｔｔｇｃａａｃａａａｔｔｇａｔｇａｇｃａａｔｇｃｔｔｔｔｔｔａｔａａｔｇｃｃａａｃｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔ－３’：配列番号３３５）を、またＶＰ２領域の終止コドンから５５塩基下流にポリアデニンを３０配列と、続いてａｔｔＬ２配列(５’－ａｇｃｔｔａｃｃｃａｇｃｔｔｔｃｔｔｇｔａｃａａａｇｔｔｇｇｃａｔｔａｔａａｇａａａｇｃａｔｔｇｃｔｔａｔｃａａｔｔｔｇｔｔｇｃａａｃｇａａｃａｇｇｔｃａｃｔａｔｃａｇｔｃａａａａｔａａａａｔｃａｔｔａｔｔｔｇ－３’：配列番号３３６)を導入した配列を人工合成し、得られたｐＵＣ－Ｓａｉｔａｍａと、ｐＤＥＳＴ８とを等量混合し、表１の通り混合し２５℃で１時間反応させた。反応後、１μＬのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（タカラバイオ製）を加え３７℃で１０分反応させた。反応液１ｎｇを用いて、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ寒天平板培地にて選択を行い、得られたコロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、得られた細胞からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いて精製し、ＧＩＩ．１７をコードしたｐＤＥＳＴ８を得た。
【0028】
【表1】
【0029】
（２）ｂＭＯＮ１４２７２ Ｂａｃｍｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）へのＶＰ１、ＶＰ２遺伝子の導入
得られたプラスミドは製品添付のプロトコルに従い下記の方法でＢａｃｍｉｄへの導入を行った（図１－Ｄ）。
得られたＮｏＶ遺伝子導入プラスミドとＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ１０Ｂａｃ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用い、ＮｏＶ ＶＰ１，ＶＰ２領域をｂＭＯＮ１４２７２ ｂａｃｍｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）へ導入した（図１－Ｄ）。ｂａｃｍｉｄへの遺伝子導入の有無は４０μｇ／ｍＬ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ： Ｗａｋｏ製），１００ μｇ／ｍＬ Ｘ－Ｇａｌ （５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｌｙｌ β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：Ｗａｋｏ製）、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、７μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン含有ＬＢ培地にて選択を行い（ｂＭＯＮ１４２７２にカナマイシン耐性遺伝子、ＤＨ１０Ｂａｃ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ内に存在するヘルパープラスミドにテトラサイクリン耐性遺伝子、ｐＤＥＳＴのｂａｃｍｉｄへ挿入される領域にゲンタマイシン耐性遺伝子がそれぞれコードされている）、さらにカラーセレクションで目的部位への断片挿入を確認した。得られた白色コロニーを、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、７μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、得られた細胞からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いてｂａｃｍｉｄの抽出を行った。抽出したDNA溶液の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）にて確認した。
得られたプラスミドは製品添付のプロトコルに従い下記の方法でＢａｃｍｉｄへの導入を行った（図１－Ｄ）。
得られたＮｏＶ遺伝子導入プラスミドとＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ１０Ｂａｃ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用い、ＮｏＶ ＶＰ１，ＶＰ２領域をｂＭＯＮ１４２７２ ｂａｃｍｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）へ導入した（図１－Ｄ）。ｂａｃｍｉｄへの遺伝子導入の有無は４０μｇ／ｍＬ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ： Ｗａｋｏ製），１００ μｇ／ｍＬ Ｘ－Ｇａｌ （５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｌｙｌ β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：Ｗａｋｏ製）、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、７μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン含有ＬＢ培地にて選択を行い（ｂＭＯＮ１４２７２にカナマイシン耐性遺伝子、ＤＨ１０Ｂａｃ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ内に存在するヘルパープラスミドにテトラサイクリン耐性遺伝子、ｐＤＥＳＴのｂａｃｍｉｄへ挿入される領域にゲンタマイシン耐性遺伝子がそれぞれコードされている）、さらにカラーセレクションで目的部位への断片挿入を確認した。得られた白色コロニーを、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、７μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン含有ＬＢ液体培地にて培養し、得られた細胞からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いてｂａｃｍｉｄの抽出を行った。抽出したDNA溶液の濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）にて確認した。
【0030】
（３）ＮｏＶ ＶＰ１，ＶＰ２導入Ｂａｃｍｉｄのトランスフェクションによる組み換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）の生産
ＮｏＶ ＶＰ１，ＶＰ２遺伝子を導入したｂａｃｍｉｄを、Ｌｉｐｏｆｅｃｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ ＆ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用い、添付のプロトコルに従い、Ｓｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）にトランスフェクションした（図１－Ｅ）。トランスフェクションした細胞はＳｆ９００ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）培地を用いて２７℃で１週間培養した。培養後培地を遠心し、上清を回収してＮｏＶ遺伝子を有する組み換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を得た。
ＮｏＶ ＶＰ１，ＶＰ２遺伝子を導入したｂａｃｍｉｄを、Ｌｉｐｏｆｅｃｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ ＆ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用い、添付のプロトコルに従い、Ｓｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）にトランスフェクションした（図１－Ｅ）。トランスフェクションした細胞はＳｆ９００ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）培地を用いて２７℃で１週間培養した。培養後培地を遠心し、上清を回収してＮｏＶ遺伝子を有する組み換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を得た。
【0031】
（４）ｒＢＶ感染によるＮｏＶ ＶＬＰの生産
Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞 （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）１．０×１０７ ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋに対し、ＭＯＩ＝２になるよう１．０×１０７ ｐｆｕ／ｍＬのｒＢＶを添加して感染させ、Ｅｘｐｒｅｓｓ ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）培地を用いて２７ ℃で培養した（図１－Ｆ）。感染７日後に遠心によって培養上清を回収し、さらに回収した上清を１０，０００ｘｇで１時間遠心し、バキュロウイルスをペレットダウンし、細胞上清を回収した。更にＮｏＶ ＶＬＰを含む回収した上清を、ＳＷ３２Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を用い３２，０００ｒｐｍで２時間遠心し、ＮｏＶ ＶＬＰをペレットダウンさせた。上清を除いたペレットは１．９ｍｇのＣｓＣｌ（密度勾配遠心用、ＷＡＫＯ製）をＥｘｐｒｅｓｓ ｆｉｖｅ培地に溶解させたＳＷ５５Ｔｉ（Ｂｅｃｈｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を用い４０，０００ｒｐｍで２０時間遠心して分離精製を行い、白色光の照射により目視で確認された画分を回収した。回収画分は再度ＳＷ３２Ｔｉローターで３２，０００ｒｐｍで遠心しペレットダウンを行い、上清を除き、Ｅｘｐｒｅｓｓ ｆｉｖｅ培地５００μＬに懸濁した。ＶＬＰ濃度はｂｒａｄｆｏｒｄ法で定量した。標準タンパク質はＢＳＡ（ＷＡＫＯ製）を用いた。
Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞 （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）１．０×１０７ ｃｅｌｌｓ／ｆｌａｓｋに対し、ＭＯＩ＝２になるよう１．０×１０７ ｐｆｕ／ｍＬのｒＢＶを添加して感染させ、Ｅｘｐｒｅｓｓ ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）培地を用いて２７ ℃で培養した（図１－Ｆ）。感染７日後に遠心によって培養上清を回収し、さらに回収した上清を１０，０００ｘｇで１時間遠心し、バキュロウイルスをペレットダウンし、細胞上清を回収した。更にＮｏＶ ＶＬＰを含む回収した上清を、ＳＷ３２Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を用い３２，０００ｒｐｍで２時間遠心し、ＮｏＶ ＶＬＰをペレットダウンさせた。上清を除いたペレットは１．９ｍｇのＣｓＣｌ（密度勾配遠心用、ＷＡＫＯ製）をＥｘｐｒｅｓｓ ｆｉｖｅ培地に溶解させたＳＷ５５Ｔｉ（Ｂｅｃｈｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を用い４０，０００ｒｐｍで２０時間遠心して分離精製を行い、白色光の照射により目視で確認された画分を回収した。回収画分は再度ＳＷ３２Ｔｉローターで３２，０００ｒｐｍで遠心しペレットダウンを行い、上清を除き、Ｅｘｐｒｅｓｓ ｆｉｖｅ培地５００μＬに懸濁した。ＶＬＰ濃度はｂｒａｄｆｏｒｄ法で定量した。標準タンパク質はＢＳＡ（ＷＡＫＯ製）を用いた。
【0032】
実施例１ ノロウイルス結合ペプチドの製造（図２参照）
（１）ＤＮＡライブラリの作製
ペプチドライブラリは、長さ１０アミノ酸のものとなるようにＤＮＡライブラリをデザインした。
(ＤＮＡライブラリの塩基配列)
５’－ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＣＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＴＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＡ－３’（配列番号３３７）
（１）ＤＮＡライブラリの作製
ペプチドライブラリは、長さ１０アミノ酸のものとなるようにＤＮＡライブラリをデザインした。
(ＤＮＡライブラリの塩基配列)
５’－ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＣＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＴＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＡ－３’（配列番号３３７）
【0033】
【表2】
【0034】
上記ＤＮＡライブラリは、Ｔ７－ＰＲＯ－Ω領域（配列番号３３８）、ランダム領域（配列番号３３９）及びＨｉｓ－Ｙｔａｇ領域（配列番号３４０）という３種類のＤＮＡ配列断片を、伸長ＰＣＲによって結合することで作製した。このライブラリはランダム領域のＮ末端とＣ末端にシステインが出現するよう設計している。ランダム領域、Ｈｉｓ－Ｙｔａｇ領域及びＴ７－ＰＲＯ－Ω領域は、つくばオリゴサービス（株）に、それぞれＤＮＡ合成を依頼して入手した。これらを用いて下記伸長ＰＣＲを行ない、上記のＤＮＡライブラリを作製した。
【0035】
[配列番号３３８]
５’ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ３’
５’ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ３’
【0036】
[配列番号３３９]
５’－ＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＣＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＴＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ－３’
５’－ＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＣＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＱＲＳＴＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡ－３’
【0037】
上記配列中の、ＡＴＣＧ以外の塩基の出現頻度の割合（Ａ：Ｔ：Ｇ：Ｃ）は以下の通りである。
Ｑ： Ａ＝０．１,Ｔ＝０．２,Ｇ＝０．３,Ｃ＝０．４
Ｒ： Ａ＝０．４,Ｔ＝０．１,Ｇ＝０．３,Ｃ＝０．２
Ｓ： Ａ＝０．４,Ｔ＝０．２,Ｇ＝０．２,Ｃ＝０．２
Ｑ： Ａ＝０．１,Ｔ＝０．２,Ｇ＝０．３,Ｃ＝０．４
Ｒ： Ａ＝０．４,Ｔ＝０．１,Ｇ＝０．３,Ｃ＝０．２
Ｓ： Ａ＝０．４,Ｔ＝０．２,Ｇ＝０．２,Ｃ＝０．２
【0038】
[配列番号３４０]
５’ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＣＣ ３’
５’ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＣＣ ３’
【0039】
合成１段階目の伸長ＰＣＲは、下記表３に示す組成の反応液を超純水で５０μＬに調製し、ランダム領域とＨｉｓ－Ｙｔａｇ領域が結合したＤＮＡ断片を以下のＰＣＲプログラムで増幅させた。ＰＣＲプログラムは、（ａ）９６℃（２分）、（ｂ）９４℃（２０秒）、（ｃ）６９℃（５秒）、（ｄ）７２℃（２０秒）、及び（ｅ）７２℃（２分）とし、ステップ（ｂ）～（ｄ）を５サイクル行った。
【0040】
【表3】
【0041】
２段階目伸長ＰＣＲは、下記表４に示す組成の反応液を超純水で５０μＬに調製し、以下のＰＣＲプログラムでＴ７－ＰＲＯ－ＳＤ領域を伸長させることで、ＤＮＡライブラリを増幅させた。ＰＣＲプログラムは、（ａ）９６℃（２分）、（ｂ）９４℃（２０秒）、（ｃ）５９℃（５秒）、（ｄ）７２℃（３０秒）及び（ｅ）７２℃（２分）とし、ステップ（ｂ）～（ｄ）を１５サイクル行った。その後、Ｐｏｌｙ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＡＧＥ）によりＤＮＡライブラリを精製した。
【0042】
【表4】
【0043】
（２）ＤＮＡライブラリの転写
ＤＮＡライブラリの転写はＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ -Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を使用し、付属するプロトコルに従い行った。反応スケールは、１μｇのＤＮＡライブラリを使用して２０μＬで行った。転写反応により得られたｍＲＮＡは、Ａｆｔｅｒ Ｔｒｉ－Ｒｅａｇｅｎｔ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｋｉｔ （Ｆａｖｏｇｅｎ製）を使用して精製した。
ＤＮＡライブラリの転写はＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ -Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を使用し、付属するプロトコルに従い行った。反応スケールは、１μｇのＤＮＡライブラリを使用して２０μＬで行った。転写反応により得られたｍＲＮＡは、Ａｆｔｅｒ Ｔｒｉ－Ｒｅａｇｅｎｔ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｋｉｔ （Ｆａｖｏｇｅｎ製）を使用して精製した。
【0044】
次いで、得られたｍＲＮＡと後述するピューロマイシンリンカーとのライゲーションを、以下のようにして行った（図３（Ａ））。まず、ピューロマイシンリンカー及びｍＲＮＡを各２０ｐｍｏｌ、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を４μＬ、１Ｍ ＮａＣｌを４μＬ混合し、超純水で２０μＬにメスアップした。反応液を９０℃で２分及び７０℃で１分インキュベートした後、４℃まで降温させた後２５℃で１時間アニーリングさせた。その後、ＣＬ－１０００ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒを用いて、波長３６５ｎｍの紫外光を４０５ｍＪ／ｃｍ２の条件で照射してピューロマイシンリンカーと架橋を行った。
【0045】
＜ピューロマイシンリンカーのＤＮＡ＞
ピューロマイシンリンカーＤＮＡ１（図３（Ａ））は、２つのセグメント（ピューロマイシンセグメント（ＰＳ）と短いビオチンセグメント（ＳＢＳ））をＥＭＣＳ（Ｎ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド：同仁化学製）を用いて、化学架橋させて合成した。リンカーは文献（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ Ｙ., Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ., Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｋ., Ｎｅｍｏｔｏ Ｎ．． （２０１５） Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ－ｌｉｎｋｅｒ ｕｓｉｎｇ ｃｎｖＫ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ. Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２１２，１７４－８０.）に記載のものを用いた。
ピューロマイシンリンカーＤＮＡ１（図３（Ａ））は、２つのセグメント（ピューロマイシンセグメント（ＰＳ）と短いビオチンセグメント（ＳＢＳ））をＥＭＣＳ（Ｎ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド：同仁化学製）を用いて、化学架橋させて合成した。リンカーは文献（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ Ｙ., Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ., Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｋ., Ｎｅｍｏｔｏ Ｎ．． （２０１５） Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ－ｌｉｎｋｅｒ ｕｓｉｎｇ ｃｎｖＫ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ. Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２１２，１７４－８０.）に記載のものを用いた。
【0046】
ピューロマイシンセグメント（ＰＳ）の配列構造を以下に示す。
５’－（Ｓ）－ＴＣＴＣＴＣ（Ｆ）－（ＰＥＧ）（ＰＥＧ）－ＣＣ－（Ｐｕｒｏ）－３’
ここで、（Ｓ）は５’-チオールモディファイヤーＣ６（化合物名：Ｓ－Ｔｒｉｔｙｌ－６－ｍｅｒｃａｐｔｏｈｅｘｙｌ－１－［（２－ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）－（Ｎ,Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］－ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ, Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製）を表し、（Ｆ）はフルオレセイン－ｄＴを表す。（Ｐｕｒｏ）はピューロマイシンＣＰＧ（５’－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ－Ｎ－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ－ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，２’－ｓｕｃｃｉｎｏｙｌ－ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ａｌｋｙｌａｍｉｎｏ－ＣＰＧ、Ｇｌｅｎ ｒｅｓａｒｃｈ製）を表す。
５’－（Ｓ）－ＴＣＴＣＴＣ（Ｆ）－（ＰＥＧ）（ＰＥＧ）－ＣＣ－（Ｐｕｒｏ）－３’
ここで、（Ｓ）は５’-チオールモディファイヤーＣ６（化合物名：Ｓ－Ｔｒｉｔｙｌ－６－ｍｅｒｃａｐｔｏｈｅｘｙｌ－１－［（２－ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）－（Ｎ,Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］－ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ, Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製）を表し、（Ｆ）はフルオレセイン－ｄＴを表す。（Ｐｕｒｏ）はピューロマイシンＣＰＧ（５’－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ－Ｎ－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ－ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ，２’－ｓｕｃｃｉｎｏｙｌ－ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ａｌｋｙｌａｍｉｎｏ－ＣＰＧ、Ｇｌｅｎ ｒｅｓａｒｃｈ製）を表す。
【0047】
続いて短いビオチンセグメント（ＳＢＳ）の配列構造を以下に示す。
５’（Ｂ）－ＡＡ－（ｒＧ）－ＡＡＴＴＴＣＣＡ（Ｋ）ＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧ（Ｙ）ＣＣＴ－３’（配列番号３４１）
ここで、（Ｙ）はアミノモディファイヤーＣ６ デオキシチミン（５’－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ－５－［Ｎ－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）－３－ａｃｒｙｌｉｍｉｄｏ］－２’－ｄｅｏｘｙＵｒｉｄｉｎｅ，３’－［（２－ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）－（Ｎ,Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］－ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ, Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製)）を表し、（Ｋ）は３－Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（ｃｎｖＫ） を表し、（Ｂ）は、Ｂｉｏｔｉｎ－Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＴＥＧ）, Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製）を表し、（ｒＧ）はリボグアニン（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製）を表す。ＰＳ及びＳＢＳはつくばオリゴ社に合成を委託し、常法に従い合成した。
５’（Ｂ）－ＡＡ－（ｒＧ）－ＡＡＴＴＴＣＣＡ（Ｋ）ＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧ（Ｙ）ＣＣＴ－３’（配列番号３４１）
ここで、（Ｙ）はアミノモディファイヤーＣ６ デオキシチミン（５’－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ－５－［Ｎ－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）－３－ａｃｒｙｌｉｍｉｄｏ］－２’－ｄｅｏｘｙＵｒｉｄｉｎｅ，３’－［（２－ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）－（Ｎ,Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］－ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ, Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製)）を表し、（Ｋ）は３－Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（ｃｎｖＫ） を表し、（Ｂ）は、Ｂｉｏｔｉｎ－Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＴＥＧ）, Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製）を表し、（ｒＧ）はリボグアニン（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製）を表す。ＰＳ及びＳＢＳはつくばオリゴ社に合成を委託し、常法に従い合成した。
【0048】
上記ＰＳの５’チオール基を、１００μＬの５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．０）中にて、室温で６時間、１ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ：Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）で還元し、その後、ＮＡＰ－５カラム（ＧＥヘルスケア製）で要時脱塩した。総量１０ｎｍｏｌのビオチンループ及び２μｍｏｌのＥＭＣＳを、１００μＬの０．２Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に加えた。引き続き、混合物を、３７℃で３０分インキュベートし、４℃でエタノール沈殿を行い、過剰なＥＭＣＳを除去した。
【0049】
この沈殿を予め氷浴中で冷却しておいた７０％エタノール５００μＬで２回洗浄し、予め冷却しておいた０．２Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）１０μＬに溶解した。還元されたＰＳを直ちに加えて、４℃で終夜撹拌した。４ｍＭのＴＣＥＰを加えて、１５分間３７℃でインキュベートすることにより、この反応を停止させた。その後、エタノール沈殿を行い、過剰なＰＳを室温で除去した。ビオチンループ及び未架橋のビオチンループ－ＥＭＣＳ複合体を除去するために、沈殿を０．１ＭのＴＥＡＡ（Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ Ａｃｅｔａｔｅ：Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ製）又はリン酸バッファーに溶解し、Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムを用いて以下の条件で精製した。
【0050】
カラム：ＡＲ－３００，４．６ｘ２５０ｍｍ（ナカライテスク製）溶媒：溶媒Ａ：０．１ＭのＴＥＡＡ；溶媒Ｂ：アセトニトリル／水（８０：２０，ｖ／ｖ）グラジエント：Ｂ／Ａ（１５－３５％，３３分）流速：０．５ｍＬ／分 検出波長：吸光度２５４ｎｍ及び４９０ｎｍ
【0051】
吸光度２５４ｎｍでの最終ピークからの画分（吸光度４９０ｎｍでの単一のピークに対応する）からの画分を集めた。乾燥後、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水に再懸濁し、保存した。以上のようにして、ピューロマイシン－リンカーＤＮＡ１を得ることができた。
【0052】
＜ｍＲＮＡとピューロマイシンリンカーＤＮＡ１との結合＞
転写により得られたｍＲＮＡ ２０ｐｍｏｌあたり、ピューロマイシンリンカーＤＮＡ１ ２０ｐｍｏｌ、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）４μＬ、１Ｍ ＮａＣｌ ４μＬを加え、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで合計２０μＬとなるように調製した（表５）。９０℃で１ｍｉｎインキュベートした後に７０℃で１ｍｉｎインキュベートし、０．０４℃／ｓのスピードで２５℃まで温度を下げた。紫外線（３６５ｎｍ）を４０５ｍｊ照射し、ｃｎｖＫとｍＲＮＡ中のウラシルと共有結合させることでｍＲＮＡ－リンカー連結体を得た。ここは各ラウンドで必要量合成した。
転写により得られたｍＲＮＡ ２０ｐｍｏｌあたり、ピューロマイシンリンカーＤＮＡ１ ２０ｐｍｏｌ、０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）４μＬ、１Ｍ ＮａＣｌ ４μＬを加え、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで合計２０μＬとなるように調製した（表５）。９０℃で１ｍｉｎインキュベートした後に７０℃で１ｍｉｎインキュベートし、０．０４℃／ｓのスピードで２５℃まで温度を下げた。紫外線（３６５ｎｍ）を４０５ｍｊ照射し、ｃｎｖＫとｍＲＮＡ中のウラシルと共有結合させることでｍＲＮＡ－リンカー連結体を得た。ここは各ラウンドで必要量合成した。
【0053】
【表5】
【0054】
＜翻訳＞
上記のｍＲＮＡ－リンカー連結体を無細胞翻訳系により以下のように翻訳した。下記表６に示す組成の比率の反応液を超純水で５０μＬに調製し、３７℃で１５分間反応させて、この反応液に、２４μＬの３Ｍ ＫＣｌ及び６μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２を加えた。その後、この溶液を更に３７℃で２０分間反応させ、翻訳されたペプチドのＣ末端とピューロマイシンを結合させることでｍＲＮＡ－ペプチド連結体を得た。
上記のｍＲＮＡ－リンカー連結体を無細胞翻訳系により以下のように翻訳した。下記表６に示す組成の比率の反応液を超純水で５０μＬに調製し、３７℃で１５分間反応させて、この反応液に、２４μＬの３Ｍ ＫＣｌ及び６μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２を加えた。その後、この溶液を更に３７℃で２０分間反応させ、翻訳されたペプチドのＣ末端とピューロマイシンを結合させることでｍＲＮＡ－ペプチド連結体を得た。
【0055】
【表6】
【0056】
（３）磁性体ビーズによる精製
ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を説明書に従って洗浄し、上記ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体を固定するのに必要な量をエッペンドルフチューブにとり、磁気スタンド上に１分間静置した。その後、上清を除去し、溶液Ａ（１００ｍＭ ＮａＯＨ，５０ｍＭ ＮａＣｌ）で再懸濁した。タッピングを１～２分間行った後に、磁気スタンド上に１分間静置した。その後、溶液Ａでもう１回、同様の操作を行い、溶液Ｂ（１００ｍＭ ＮａＣｌ）で１回、同様の操作を行った。
ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を説明書に従って洗浄し、上記ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体を固定するのに必要な量をエッペンドルフチューブにとり、磁気スタンド上に１分間静置した。その後、上清を除去し、溶液Ａ（１００ｍＭ ＮａＯＨ，５０ｍＭ ＮａＣｌ）で再懸濁した。タッピングを１～２分間行った後に、磁気スタンド上に１分間静置した。その後、溶液Ａでもう１回、同様の操作を行い、溶液Ｂ（１００ｍＭ ＮａＣｌ）で１回、同様の操作を行った。
【0057】
前記ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体に、２×結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２ｍＭ ＥＤＴＡ，２Ｍ ＮａＣｌ，０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０，５００ｍＭ ＥＤＴＡ）を等量加えて、上記ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子と室温で３０分インキュベートした。エッペンドルフチューブを磁気スタンド上に１分間静置した後に、上清を除去した。１×結合バッファーを２００μＬ加え、タッピングを１～２分間行った後に、磁気スタンド上に１分間静置して上清を除去した。この操作をさらに２回繰り返し、ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子に固定化されたペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体を得た。
【0058】
（４）逆転写反応によるｃＤＮＡの合成
上記固定化ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体に、下記表７の反応液の比率で使用したストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子と同体積の溶液を入れ、４２度で３０分間インキュベートして逆転写を行い、ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子に固定化された状態のまま、ｃＤＮＡディスプレイを調製した。
上記固定化ペプチド－リンカー－ｍＲＮＡ連結体に、下記表７の反応液の比率で使用したストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子と同体積の溶液を入れ、４２度で３０分間インキュベートして逆転写を行い、ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性粒子に固定化された状態のまま、ｃＤＮＡディスプレイを調製した。
【0059】
【表7】
【0060】
（５）ペプチドの架橋反応
上記ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズに固定化されたｃＤＮＡディスプレイを架橋バッファー（１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０２５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む）で１回洗浄したのち、１０ｍＭ トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ： Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）及び４ｍＭ ビスマレイミドエタン（ＢＭＯＥ：Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を含む架橋バッファー１２５μＬを加え２５℃で１時間インキュベートしてランダム領域のＮ末端とＣ末端にあるシステインに対し架橋反応を行った。
上記ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズに固定化されたｃＤＮＡディスプレイを架橋バッファー（１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４），０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０２５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む）で１回洗浄したのち、１０ｍＭ トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ： Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）及び４ｍＭ ビスマレイミドエタン（ＢＭＯＥ：Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を含む架橋バッファー１２５μＬを加え２５℃で１時間インキュベートしてランダム領域のＮ末端とＣ末端にあるシステインに対し架橋反応を行った。
【0061】
（６）磁性体ビーズによる精製からの溶出
上記ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズに固定化されたｃＤＮＡディスプレイを、１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファー（１０～３０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４），０．２５～０．７５Ｍ ＮａＣｌ，５～３０ｍＭ イミダゾール，０．０２５～０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む）で１回洗浄したのち、１０ＵのＲＮａｓｅ Ｔ１（Ａｍｂｉｏｎ製）を含む３０μＬの１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファーを加え、３７℃で１５分間インキュベートし、ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズからリンカー中の切断部位（リボＧ）から切断されたｃＤＮＡディスプレイを溶出させた。
上記ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズに固定化されたｃＤＮＡディスプレイを、１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファー（１０～３０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４），０．２５～０．７５Ｍ ＮａＣｌ，５～３０ｍＭ イミダゾール，０．０２５～０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む）で１回洗浄したのち、１０ＵのＲＮａｓｅ Ｔ１（Ａｍｂｉｏｎ製）を含む３０μＬの１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファーを加え、３７℃で１５分間インキュベートし、ストレプトアビジン（ＳＡ）磁性ビーズからリンカー中の切断部位（リボＧ）から切断されたｃＤＮＡディスプレイを溶出させた。
【0062】
（７）Ｎｉ－ＮＴＡによる精製
Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ（Ｈｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ：ＧＥヘルスケア製）１０μＬをエッペンドルフチューブにとり、磁気スタンド上に１分間静置した。その後、上清を除去し１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファーで再懸濁した。タッピングを１～２分間行った後に、磁気スタンド上に１分間静置した。その後、もう一度同じ作業を行った。
Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ（Ｈｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ：ＧＥヘルスケア製）１０μＬをエッペンドルフチューブにとり、磁気スタンド上に１分間静置した。その後、上清を除去し１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファーで再懸濁した。タッピングを１～２分間行った後に、磁気スタンド上に１分間静置した。その後、もう一度同じ作業を行った。
【0063】
前記ｃＤＮＡディスプレイを上記Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズと室温で３０分インキュベートした。エッペンドルフチューブを磁気スタンド上に１分間静置した後に、上清を除去した。１×Ｈｉｓ－タグ洗浄バッファーを２００μＬ加え、タッピングを１～２分間行った後に、磁気スタンド上に１分間静置して上清を除去した。この操作をさらに繰り返した後、Ｈｉｓ－タグ溶出バッファー（１０～３０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）， ０．２５～０．７５Ｍ ＮａＣｌ，２５０～５００ｍＭ イミダゾール，０．０２５～０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む）を１０μＬ加え、室温で１５分インキュベートすることでｃＤＮＡディスプレイの精製を行った。
【0064】
（８）試験管内淘汰サイクル
下記表８に従い上記ｃＤＮＡディスプレイとＶＬＰｓを混合し選択用のバッファー（１０～３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．１～０．３Ｍ ＮａＣｌを含む）で１ｍＬにした後２５℃で３０分間インキュベートした。
下記表８に従い上記ｃＤＮＡディスプレイとＶＬＰｓを混合し選択用のバッファー（１０～３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．１～０．３Ｍ ＮａＣｌを含む）で１ｍＬにした後２５℃で３０分間インキュベートした。
【0065】
【表8】
【0066】
＜遠心沈殿法によるＶＬＰ－ｃＤＮＡディスプレイ複合体の分離＞
遠心管に上記混合物を加え、超遠心機（日立製、ＣＳ１５０ＦＮＸ）を用いて４℃で約２時間の間１３０，０００×ｇで遠心した。上清を除去し、１ｍＬの選択用のバッファーで壁面を洗浄した後に上清を除去した。１００μＬのＲＮａｓｅフリー水を加えて沈殿物を再溶解した。
遠心管に上記混合物を加え、超遠心機（日立製、ＣＳ１５０ＦＮＸ）を用いて４℃で約２時間の間１３０，０００×ｇで遠心した。上清を除去し、１ｍＬの選択用のバッファーで壁面を洗浄した後に上清を除去した。１００μＬのＲＮａｓｅフリー水を加えて沈殿物を再溶解した。
【0067】
＜透析法によるＶＬＰ－ｃＤＮＡディスプレイ複合体の分離＞
作製したｃＤＮＡディスプレイとＶＬＰｓを下記の表９の濃度になるように透析用選択バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬ中で２５℃、３０分間インキュベートした。その後、透析用選択バッファーで１ｍＬにメスアップしＦｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｇ２ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅ ＣＥ， １０００ ｋＤ ＭＷＣＯ（スペクトラム・ラボラトリーズ製）に加え、外液１Ｌの透析用選択バッファーで、２５℃で透析した。途中、２時間おきに３回外液を入れ替えて４回目に一晩（８時間）透析した。透析産物をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １００Ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いて１４，０００×ｇ、５分により濃縮した。
作製したｃＤＮＡディスプレイとＶＬＰｓを下記の表９の濃度になるように透析用選択バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬ中で２５℃、３０分間インキュベートした。その後、透析用選択バッファーで１ｍＬにメスアップしＦｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｇ２ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｄｅｖｉｃｅ ＣＥ， １０００ ｋＤ ＭＷＣＯ（スペクトラム・ラボラトリーズ製）に加え、外液１Ｌの透析用選択バッファーで、２５℃で透析した。途中、２時間おきに３回外液を入れ替えて４回目に一晩（８時間）透析した。透析産物をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １００Ｋ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を用いて１４，０００×ｇ、５分により濃縮した。
【0068】
（９）ＧＩＩ．３，ＧＩＩ．１７ ＶＬＰを対象としたセレクション
イムノプレート（Ｃ－ＢＯＴＴＯＭ，ＣＬＥＡＲ，ＭＩＣＲＯＬＯＮ（登録商標），ＨＩＧＨ ＢＩＮＤＩＮＧ，Ｇｒｅｉｎｅｒ社）に３μｇ／ｍＬのＧＩＩ．３またはＧＩＩ．１７ ＶＬＰ溶液を１００μＬ加え、４℃、Ｏ．Ｎ．で固定化した。その後、溶液を捨てて２００μＬのブロッキング試薬（ＥＭＤ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＴＭ ＢｌoｋＴＭ ＮＳＢ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を加え、室温で２時間穏やかに攪拌することでブロッキングした。この際に、ＶＬＰを固定していないウェルもプレセレクションで使用するために同様にブロッキングを行った。
ウェルから溶液を捨てて、２００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（１０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４），１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄後、１００μＬのｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ（１．５ ｐｍｏｌのｍＲＮＡ－Ｌｉｎｋｅｒから作製）をＶＬＰが固定されていないウェルに投入し、室温で３０分穏やかに攪拌してプレセレクションを行った。その後、ブロッキング剤に結合しなかったｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙを含む上澄をＶＬＰが固定されているウェルに投入し、室温で３０分穏やかに攪拌することでＶＬＰと結合させた。上澄を捨てた後、１００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄後、１００μＬの５％ ＳＤＳ溶液を加え、５０℃で１５分インキュベートすることで結合したｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙを溶出した。
イムノプレート（Ｃ－ＢＯＴＴＯＭ，ＣＬＥＡＲ，ＭＩＣＲＯＬＯＮ（登録商標），ＨＩＧＨ ＢＩＮＤＩＮＧ，Ｇｒｅｉｎｅｒ社）に３μｇ／ｍＬのＧＩＩ．３またはＧＩＩ．１７ ＶＬＰ溶液を１００μＬ加え、４℃、Ｏ．Ｎ．で固定化した。その後、溶液を捨てて２００μＬのブロッキング試薬（ＥＭＤ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＴＭ ＢｌoｋＴＭ ＮＳＢ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を加え、室温で２時間穏やかに攪拌することでブロッキングした。この際に、ＶＬＰを固定していないウェルもプレセレクションで使用するために同様にブロッキングを行った。
ウェルから溶液を捨てて、２００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（１０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４），１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄後、１００μＬのｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ（１．５ ｐｍｏｌのｍＲＮＡ－Ｌｉｎｋｅｒから作製）をＶＬＰが固定されていないウェルに投入し、室温で３０分穏やかに攪拌してプレセレクションを行った。その後、ブロッキング剤に結合しなかったｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙを含む上澄をＶＬＰが固定されているウェルに投入し、室温で３０分穏やかに攪拌することでＶＬＰと結合させた。上澄を捨てた後、１００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄後、１００μＬの５％ ＳＤＳ溶液を加え、５０℃で１５分インキュベートすることで結合したｃＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙを溶出した。
【0069】
この後、上記で得られたＶＬＰ－ｃＤＮＡディスプレイ複合体を１００μＬに透析用選択バッファーでメスアップした後、共沈剤（Ｑｕｉｃｋ－Ｐｒｅｃｉｐ Ｐｌｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ＥｄｇｅＢｉｏ製）を１０μＬ、１００％エタノールを２２０μＬ加え、２０，０００×ｇ、５分遠心した。その後、上澄を捨て７０％エタノールを１ｍＬ加えリンスを行った。チューブを１０分間乾燥させた後に２０μＬのＲＮａｓｅフリー水で溶出し、フォワードプライマーとしてＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡ（配列番号３４２）、リバースプライマーとしてＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ（配列番号３４３）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプログラムは（ａ）９８℃２分、（ｂ）９５℃２０秒、（ｃ）６９℃２０秒、（ｄ）７２℃２０秒（ｂ～ｄを２５サイクル）、（ｅ）７２℃１分とした。
【0070】
【表9】
【0071】
得られたＰＣＲ産物を次のサイクルのライブラリＤＮＡとして用い、（２）に記載したライブラリの転写から同様の操作を行い、淘汰サイクルを繰り返した。
【0072】
＜遺伝子配列情報の解析＞
上記試験管内淘汰サイクル（ＧＩＩ．４を対象とした７サイクル及びＧＩＩ．４透析法により得られた７サイクルのライブラリを基に、ＧＩＩ．３，ＧＩＩ．１７を対象とした５サイクル）後、以下に示す方法で、シークエンスライブラリーの調製を行い、配列情報を解析した。シーケンスライブラリーの調製及びシーケンスは１６Ｓ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ製）に従い行った。
上記試験管内淘汰サイクル（ＧＩＩ．４を対象とした７サイクル及びＧＩＩ．４透析法により得られた７サイクルのライブラリを基に、ＧＩＩ．３，ＧＩＩ．１７を対象とした５サイクル）後、以下に示す方法で、シークエンスライブラリーの調製を行い、配列情報を解析した。シーケンスライブラリーの調製及びシーケンスは１６Ｓ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ製）に従い行った。
【0073】
１） Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲ
表１０の試薬を混合し、以下のプログラムによりＰＣＲを行った。
・９５℃で３分間
・以下の反応を２３サイクル
－９５℃で３０秒間
－５５℃で３０秒間
－７２℃で３０秒間
・７２℃で５分間
・４℃でHold
表１０の試薬を混合し、以下のプログラムによりＰＣＲを行った。
・９５℃で３分間
・以下の反応を２３サイクル
－９５℃で３０秒間
－５５℃で３０秒間
－７２℃で３０秒間
・７２℃で５分間
・４℃でHold
【0074】
【表10】
【0075】
２）Ｃｌｅａｎ ｕｐ
Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲ産物はＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を用いて精製した。ＰＣＲ産物を含むプレートにＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを２０μＬ加え、マイクロピペットで穏やかに１０回ピペッティング後室温で５分静置した。プレートをマグネットスタンド上に置き、２分間静置後、上清を廃棄した。プレートをマグネットスタンド上に置いたまま８０％エタノールを各ウェルに２００μＬずつ添加し、３０秒静置後上清を廃棄した。これを２度繰り返した。１０分間静置してエタノールを風乾後、プレートをマグネットスタンドから取り出し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５溶液を各ウェルに５２．５μＬずつ添加して室温で２分間静置した。プレートをマグネットスタンド上に置き、再度２分間静置後、新しい９６ウェルＰＣＲプレートの対応するウェルへ５０μＬずつ移した。
Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲ産物はＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を用いて精製した。ＰＣＲ産物を含むプレートにＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを２０μＬ加え、マイクロピペットで穏やかに１０回ピペッティング後室温で５分静置した。プレートをマグネットスタンド上に置き、２分間静置後、上清を廃棄した。プレートをマグネットスタンド上に置いたまま８０％エタノールを各ウェルに２００μＬずつ添加し、３０秒静置後上清を廃棄した。これを２度繰り返した。１０分間静置してエタノールを風乾後、プレートをマグネットスタンドから取り出し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５溶液を各ウェルに５２．５μＬずつ添加して室温で２分間静置した。プレートをマグネットスタンド上に置き、再度２分間静置後、新しい９６ウェルＰＣＲプレートの対応するウェルへ５０μＬずつ移した。
【0076】
３）Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲ
精製したＡｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲ産物にシークエンスのためのアダプターとＩｎｄｅｘ配列を付与するためのＰＣＲ反応を行った。
表１１の試薬を混合し、以下のプログラムによりＰＣＲを行った。
・９５℃で３分間
・以下の反応を８サイクル
－９５℃で３０秒間
－５５℃で３０秒間
－７２℃で３０秒間
・７２℃で５分間
・４℃でHold
精製したＡｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲ産物にシークエンスのためのアダプターとＩｎｄｅｘ配列を付与するためのＰＣＲ反応を行った。
表１１の試薬を混合し、以下のプログラムによりＰＣＲを行った。
・９５℃で３分間
・以下の反応を８サイクル
－９５℃で３０秒間
－５５℃で３０秒間
－７２℃で３０秒間
・７２℃で５分間
・４℃でHold
【0077】
【表11】
【0078】
用いたＩｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒのセットは下記表１２に示す。
【0079】
【表12】
【0080】
４）Ｃｌｅａｎ ｕｐ２
Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲ産物はＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を用いて精製した。ＰＣＲ産物を含むプレートにＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを５６μＬ加え、マイクロピペットで穏やかに１０回ピペッティング後室温で５分静置した。プレートをマグネットスタンド上に置き、２分間静置後、上清を廃棄した。プレートをマグネットスタンド上に置いたまま８０％エタノールを各ウェルに２００μＬずつ添加し、３０秒静置後上清を廃棄した。これを２度繰り返した。１０分間静置してエタノールを風乾後、プレートをマグネットスタンドから取り出し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５溶液を各ウェルに２５μＬずつ添加して室温で２分間静置した。プレートをマグネットスタンド上に置き、再度２分間静置後、新しい９６ウェルＰＣＲプレートの対応するウェルへ５０μＬずつ移した。
精製したＩｎｄｅｘ ＰＣＲ産物はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ １０００ ｃｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いてバリデーションを行った。
Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲ産物はＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を用いて精製した。ＰＣＲ産物を含むプレートにＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを５６μＬ加え、マイクロピペットで穏やかに１０回ピペッティング後室温で５分静置した。プレートをマグネットスタンド上に置き、２分間静置後、上清を廃棄した。プレートをマグネットスタンド上に置いたまま８０％エタノールを各ウェルに２００μＬずつ添加し、３０秒静置後上清を廃棄した。これを２度繰り返した。１０分間静置してエタノールを風乾後、プレートをマグネットスタンドから取り出し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５溶液を各ウェルに２５μＬずつ添加して室温で２分間静置した。プレートをマグネットスタンド上に置き、再度２分間静置後、新しい９６ウェルＰＣＲプレートの対応するウェルへ５０μＬずつ移した。
精製したＩｎｄｅｘ ＰＣＲ産物はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ １０００ ｃｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いてバリデーションを行った。
【0081】
５）ｑＰＣＲ
精製したＩｎｄｅｘ ＰＣＲ産物はＫａｐａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(日本ジェネティクス製)を用いてｑＰＣＲを行った。
Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘを予め添加したＫａｐａ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １２μＬと、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｗａｔｅｒ ４μＬ、Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲ産物の１００倍希釈物を４μＬを混合しｑＰＣＲに供した。検量線用のサンプルはキット付属のＳｔｄ１～６を用いた。
以下のプログラムによりＰＣＲを行った。
・９５℃で５分
以下の反応を３５サイクル
・９５℃で３０秒
・６０℃で４５秒
Ｓｔｄ１～６のＣｔ値から検量線を引き、サンプル濃度を算出した。
精製したＩｎｄｅｘ ＰＣＲ産物はＫａｐａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(日本ジェネティクス製)を用いてｑＰＣＲを行った。
Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘを予め添加したＫａｐａ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １２μＬと、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｗａｔｅｒ ４μＬ、Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲ産物の１００倍希釈物を４μＬを混合しｑＰＣＲに供した。検量線用のサンプルはキット付属のＳｔｄ１～６を用いた。
以下のプログラムによりＰＣＲを行った。
・９５℃で５分
以下の反応を３５サイクル
・９５℃で３０秒
・６０℃で４５秒
Ｓｔｄ１～６のＣｔ値から検量線を引き、サンプル濃度を算出した。
【0082】
６）Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｍｉｓｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｖ３ １５０ ｃｙｃｌｅｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ製）のＲｅａｇｅｎｔ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを水浴中で解凍させ、付属のＨＴ１バッファーは常温で解凍させ、氷冷した。
ｑＰＣＲによって濃度既知のＩｎｄｅｘ ＰＣＲ産物は、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｗａｔｅｒを用いて４ｎＭに希釈した。このサンプル４ｎＭ希釈物５μＬと、０．２Ｎ ＮａＯＨ（１０Ｎ ＮａＯＨ水溶液（Ｗａｋｏ製）をＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｗａｔｅｒを用いて０．２Ｎに希釈したものを使用）５μＬとを混合し、室温で５分間静置した。その後氷冷ＨＴ１バッファー９９０μＬを添加し、２０ｐＭの変性済みライブラリ１ｍＬを得た。
変性済み２０ｐＭライブラリ１８０μＬと、氷冷ＨＴ１バッファー４２０μＬとを混合し、６ｐＭライブラリ６００μＬを得た。また、予め変性させておいた２０ｐＭ ＰｈｉＸ ＤＮＡ ３０μＬと氷冷ＨＴ１バッファー１０μＬとを混合させ、１５ｐＭ 変性済みＰｈｉＸを得た。１５ｐＭ変性済みＰｈｉＸ３０μＬと、６ｐＭ変性済みライブラリ５７０μＬとを混合させ、水浴で解凍させたＲｅａｇｅｎｔ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅの「Ｌｏａｄ Ｓａｍｐｌｅｓ」(１７番)に６００μＬ全量を添加した。
Ｍｉｓｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｖ３ １５０ ｃｙｃｌｅｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ製）のＲｅａｇｅｎｔ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを水浴中で解凍させ、付属のＨＴ１バッファーは常温で解凍させ、氷冷した。
ｑＰＣＲによって濃度既知のＩｎｄｅｘ ＰＣＲ産物は、ＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｗａｔｅｒを用いて４ｎＭに希釈した。このサンプル４ｎＭ希釈物５μＬと、０．２Ｎ ＮａＯＨ（１０Ｎ ＮａＯＨ水溶液（Ｗａｋｏ製）をＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｗａｔｅｒを用いて０．２Ｎに希釈したものを使用）５μＬとを混合し、室温で５分間静置した。その後氷冷ＨＴ１バッファー９９０μＬを添加し、２０ｐＭの変性済みライブラリ１ｍＬを得た。
変性済み２０ｐＭライブラリ１８０μＬと、氷冷ＨＴ１バッファー４２０μＬとを混合し、６ｐＭライブラリ６００μＬを得た。また、予め変性させておいた２０ｐＭ ＰｈｉＸ ＤＮＡ ３０μＬと氷冷ＨＴ１バッファー１０μＬとを混合させ、１５ｐＭ 変性済みＰｈｉＸを得た。１５ｐＭ変性済みＰｈｉＸ３０μＬと、６ｐＭ変性済みライブラリ５７０μＬとを混合させ、水浴で解凍させたＲｅａｇｅｎｔ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅの「Ｌｏａｄ Ｓａｍｐｌｅｓ」(１７番)に６００μＬ全量を添加した。
【0083】
７）Ｓｔａｒｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｕｎ
０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０によるＭａｉｎｔａｉｎａｎｃｅ Ｗａｓｈ済みのＭｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ製）にＭｉｌｌｉＱ水及び９９．５％エタノールで洗浄したＦｌｏｗ Ｃｅｌｌをセットし、ＰＲ２ボトル及び試薬がアプライされたＣａｒｔｒｉｄｇｅをセットしてシーケンシングを行った。
０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０によるＭａｉｎｔａｉｎａｎｃｅ Ｗａｓｈ済みのＭｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ製）にＭｉｌｌｉＱ水及び９９．５％エタノールで洗浄したＦｌｏｗ Ｃｅｌｌをセットし、ＰＲ２ボトル及び試薬がアプライされたＣａｒｔｒｉｄｇｅをセットしてシーケンシングを行った。
【0084】
８）遺伝子情報の解析
得られたシーケンス配列のＦａｓｔｑファイルをＦａｓｔａファイルに変換し、ソフトウェアのＭＥＧＡを用いて、ライブラリ配列（配列番号３３７）の１１５番目の開始コドン先頭（ＡＴＧ）から１５６番目のシステインコドン末端（ＴＧＣ）までについて、得られた配列全てを一斉に翻訳した。翻訳後、Ｅｘｃｅｌのフィルター機能を用いて末端のシステインから７残基上流のアミノ酸をシステインでフィルタリングし、ペプチドアプタマー４３５７配列を得た。
得られたシーケンス配列のＦａｓｔｑファイルをＦａｓｔａファイルに変換し、ソフトウェアのＭＥＧＡを用いて、ライブラリ配列（配列番号３３７）の１１５番目の開始コドン先頭（ＡＴＧ）から１５６番目のシステインコドン末端（ＴＧＣ）までについて、得られた配列全てを一斉に翻訳した。翻訳後、Ｅｘｃｅｌのフィルター機能を用いて末端のシステインから７残基上流のアミノ酸をシステインでフィルタリングし、ペプチドアプタマー４３５７配列を得た。
【0085】
９）配列の選定
得られたペプチドアプタマー４３５７配列についてクラスター解析及び出現頻度解析を行い、配列番号１～３２７に示すペプチドをノロウイルスと特異的に結合するペプチドとして選定した。このうち、ハミング距離が５以下で５配列以上のクラスターを形成する条件に該当するペプチドアプタマー２６０配列を表１８に、３文字列に分割したｑ－ｇｒａｍ距離が４以下で３配列以上のクラスターを形成する条件に該当するペプチドアプタマー１０４配列を表１９に、出現頻度が１０以上のペプチドアプタマー３１配列を表２０に示す。
実施例２ ＶＬＰｓとの相互作用
得られたペプチドアプタマー４３５７配列についてクラスター解析及び出現頻度解析を行い、配列番号１～３２７に示すペプチドをノロウイルスと特異的に結合するペプチドとして選定した。このうち、ハミング距離が５以下で５配列以上のクラスターを形成する条件に該当するペプチドアプタマー２６０配列を表１８に、３文字列に分割したｑ－ｇｒａｍ距離が４以下で３配列以上のクラスターを形成する条件に該当するペプチドアプタマー１０４配列を表１９に、出現頻度が１０以上のペプチドアプタマー３１配列を表２０に示す。
実施例２ ＶＬＰｓとの相互作用
【0086】
＜ペプチドの合成＞
ペプチド自動合成装置Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（ＣＥＭ Ｊａｐａｎ製）を用い、窒素雰囲気下におけるＦｍｏｃ固相合成法によりペプチドを合成した。樹脂はＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）またはＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ（ペプチド研究所製）を用いた。溶媒はＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド：ＤＭＦ（和光純薬工業製）を用い、脱保護剤はピペリジン（和光純薬工業製）をＤＭＦで所定濃度に希釈して使用した。カップリング反応促進剤及び光学活性制御剤として、ジイソプロピルカルボジイミド（東京化成工業製）及びＥｔｈｙｌ ｃｙａｎｏｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ－２－ｏｘｉｍｅ：Ｏｘｙｍａ（渡辺化学工業製）をＤＭＦで所定濃度に希釈して使用した。合成反応は装置備え付けの合成プログラムに従って行った。
ペプチド自動合成装置Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ（ＣＥＭ Ｊａｐａｎ製）を用い、窒素雰囲気下におけるＦｍｏｃ固相合成法によりペプチドを合成した。樹脂はＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）またはＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｗａｎｇ Ｒｅｓｉｎ（ペプチド研究所製）を用いた。溶媒はＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド：ＤＭＦ（和光純薬工業製）を用い、脱保護剤はピペリジン（和光純薬工業製）をＤＭＦで所定濃度に希釈して使用した。カップリング反応促進剤及び光学活性制御剤として、ジイソプロピルカルボジイミド（東京化成工業製）及びＥｔｈｙｌ ｃｙａｎｏｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ－２－ｏｘｉｍｅ：Ｏｘｙｍａ（渡辺化学工業製）をＤＭＦで所定濃度に希釈して使用した。合成反応は装置備え付けの合成プログラムに従って行った。
【0087】
＜手動合成によるスペーサーの導入＞
合成反応はペプチド手動合成機Ｐｅｔｉｓｙｚｅｒ（ハイペップ研究所製）を用いて行った。樹脂にＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎを用いて合成したペプチドは、２０％Ｄｉｂｏｃ（東京化成工業製）のＤＭＦ溶液及び、合成したペプチドに対し１０当量のＮ，Ｎ－Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ：ＤＩＥＡ（渡辺化学工業製）の混合液を用い、室温で２時間接触させＮ末端をＢｏｃ化した。ＤＭＦ及びＤｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ：ＤＣＭ（和光純薬工業製）で洗浄後、トリフルオロ酢酸：ＴＦＡ（和光純薬工業製）、Ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ：ＴＩＳ（東京化成工業製）、ＤＣＭの混合液（ＴＦＡ：ＴＩＳ：ＤＣＭ＝２：５：９３）によりＭｔｔ基を脱保護した。
合成反応はペプチド手動合成機Ｐｅｔｉｓｙｚｅｒ（ハイペップ研究所製）を用いて行った。樹脂にＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎを用いて合成したペプチドは、２０％Ｄｉｂｏｃ（東京化成工業製）のＤＭＦ溶液及び、合成したペプチドに対し１０当量のＮ，Ｎ－Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ：ＤＩＥＡ（渡辺化学工業製）の混合液を用い、室温で２時間接触させＮ末端をＢｏｃ化した。ＤＭＦ及びＤｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ：ＤＣＭ（和光純薬工業製）で洗浄後、トリフルオロ酢酸：ＴＦＡ（和光純薬工業製）、Ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ：ＴＩＳ（東京化成工業製）、ＤＣＭの混合液（ＴＦＡ：ＴＩＳ：ＤＣＭ＝２：５：９３）によりＭｔｔ基を脱保護した。
【0088】
Ｍｔｔ基を脱保護したペプチドに、下記割合で調製した混合液（表１３）を加え、室温で１時間攪拌しＰＥＧ３配列を導入した。反応後ＤＭＦで洗浄し、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液によりＰＥＧ３に付加しているＦｍｏｃ基を脱保護した。
【0089】
【表13】
【0090】
続いて下記割合で調製した混合液（表１４）を用いて、室温で１時間攪拌しＰＥＧ３配列のＣ末端側にトリプトファンを導入した。反応後ＤＭＦで洗浄し、２０％ピペリジンＤＭＦ溶液によりトリプトファンに付加しているＦｍｏｃ基を脱保護した。
【0091】
【表14】
【0092】
更に下記割合で調製した混合液（表１５）を用いて、室温で１時間攪拌しトリプトファンののＣ末端側にビオチンを導入した。反応後ＤＭＦで洗浄した。
【0093】
【表15】
【0094】
樹脂にＦｍｏｃ－Ｃｙｓ－Ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎを用いて合成したペプチドは、Ｌｉｂｅｒｔｙ ＢｌｕｅによってＰＥＧ３配列及びトリプトファンの付加反応までを行った。ビオチンの付加反応は表１５の試薬を用い、Ｐｅｔｉｓｙｚｅｒによる手動合成にて行った。
【0095】
＜スペーサー配列を付与したペプチドの樹脂からの切断＞
スペーサー配列を付与したペプチドが結合している樹脂は、ジエチルエーテル（和光純薬工業製）を用いて洗浄・乾燥させた。この樹脂にＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５の混合液を室温で1時間接触させ、ペプチドを樹脂から切断した。ろ過により樹脂と溶液を分離し、溶液に5倍量の氷冷ジエチルエーテルを加え、転倒攪拌し沈殿を発生させた。生じた沈殿は１３，０００ｒｐｍ、２０℃、３分の条件で遠心分離し、再度ジエチルエーテルにより沈殿を洗浄・同条件による遠心を行った。沈殿物はドラフト内で乾燥させ、得られた粉体は４℃で保存した。
スペーサー配列を付与したペプチドが結合している樹脂は、ジエチルエーテル（和光純薬工業製）を用いて洗浄・乾燥させた。この樹脂にＴＦＡ：ＴＩＳ：Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５の混合液を室温で1時間接触させ、ペプチドを樹脂から切断した。ろ過により樹脂と溶液を分離し、溶液に5倍量の氷冷ジエチルエーテルを加え、転倒攪拌し沈殿を発生させた。生じた沈殿は１３，０００ｒｐｍ、２０℃、３分の条件で遠心分離し、再度ジエチルエーテルにより沈殿を洗浄・同条件による遠心を行った。沈殿物はドラフト内で乾燥させ、得られた粉体は４℃で保存した。
【0096】
＜ＥＬＩＳＡによる相互作用評価＞
ペプチドは１０％ＤＭＦ水溶液中に分散させた。吸光光度計により濃度を算出し、１０％ＤＭＦ水溶液により５０μＭに調整した。これをＰｉｅｒｃｅTM Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ， Ｃｌｅａｒ， ９６－Ｗｅｌｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し室温で１時間静置した。 上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０含有）２００μＬで３回洗浄後、ＰＢＳ－Ｔで１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４、ＧＩＩ．１７ ＶＬＰ溶液を１００μＬ添加し、室温で５０分静置した。上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔ２００μＬで３回洗浄後、ウサギ由来抗ノロウイルスＶＬＰポリクローナル抗体（ＧＩＩ．３，ＧＩＩ．１７ ＶＬＰの混合物を抗原としてユーロフィンジェノミクス株式会社へ提出し、作製依頼したもの）を１μｇ／ｍＬにブロッキング剤で希釈したものを１００μＬ添加し、室温で５０分静置した。上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔ２００μＬで３回洗浄後、ＨＲＰで標識した抗ウサギ由来ＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）をブロッキング液で１０００倍に希釈したものを１００μＬ添加し、室温で５０分静置した。上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔ２００μＬで３回洗浄後、３、３’、５、５’－テトラメチルベンジジン（Ａｂｃａｍ製）を１００μＬ添加し、室温で１５分静置した。反応停止液として０．５Ｍ硫酸を１００μＬ添加し、マルチプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図４に示す。
ペプチドは１０％ＤＭＦ水溶液中に分散させた。吸光光度計により濃度を算出し、１０％ＤＭＦ水溶液により５０μＭに調整した。これをＰｉｅｒｃｅTM Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ， Ｃｌｅａｒ， ９６－Ｗｅｌｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し室温で１時間静置した。 上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳに０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０含有）２００μＬで３回洗浄後、ＰＢＳ－Ｔで１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４、ＧＩＩ．１７ ＶＬＰ溶液を１００μＬ添加し、室温で５０分静置した。上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔ２００μＬで３回洗浄後、ウサギ由来抗ノロウイルスＶＬＰポリクローナル抗体（ＧＩＩ．３，ＧＩＩ．１７ ＶＬＰの混合物を抗原としてユーロフィンジェノミクス株式会社へ提出し、作製依頼したもの）を１μｇ／ｍＬにブロッキング剤で希釈したものを１００μＬ添加し、室温で５０分静置した。上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔ２００μＬで３回洗浄後、ＨＲＰで標識した抗ウサギ由来ＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）をブロッキング液で１０００倍に希釈したものを１００μＬ添加し、室温で５０分静置した。上清を除去し、ＰＢＳ－Ｔ２００μＬで３回洗浄後、３、３’、５、５’－テトラメチルベンジジン（Ａｂｃａｍ製）を１００μＬ添加し、室温で１５分静置した。反応停止液として０．５Ｍ硫酸を１００μＬ添加し、マルチプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図４に示す。
【0097】
＜Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：ＢＬＩ法によるＫＤ値の算出＞
装置はＢＬＩｔｚＴＭ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いた。ＳＡ ｃｈｉｐ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）の先端を精製水に１分間接触させ水和させた後、１％ＢＳＡ水溶液に１時間接触させブロッキングした。ブロッキング処理したＳＡ ｃｈｉｐをＢＬＩｔｚＴＭ本体の測定部にセットし、表１６のプログラムに従って測定を行った。ペプチドは配列番号１０３、１６７、２０５、２６３、２８３、２８８、３０２を用い、濃度は１００μＭに調整した。ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．１７各ＶＬＰ濃度は１、０．１、０．０１、０．００１ｍｇ／ｍＬに調整した。測定データは付属のソフトウェアを用いて解析し、Ｋａ、Ｋｄ値を基にＫＤ値を算出した。結果を表１７に示す。
装置はＢＬＩｔｚＴＭ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いた。ＳＡ ｃｈｉｐ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）の先端を精製水に１分間接触させ水和させた後、１％ＢＳＡ水溶液に１時間接触させブロッキングした。ブロッキング処理したＳＡ ｃｈｉｐをＢＬＩｔｚＴＭ本体の測定部にセットし、表１６のプログラムに従って測定を行った。ペプチドは配列番号１０３、１６７、２０５、２６３、２８３、２８８、３０２を用い、濃度は１００μＭに調整した。ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．１７各ＶＬＰ濃度は１、０．１、０．０１、０．００１ｍｇ／ｍＬに調整した。測定データは付属のソフトウェアを用いて解析し、Ｋａ、Ｋｄ値を基にＫＤ値を算出した。結果を表１７に示す。
【0098】
【表16】
【0099】
【表17】
【0100】
【表18】
【0101】
【表19】
【0102】
【表20】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】