特許 7528242 血液がんを治療するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-26

(45)【発行日】2024-08-05

(54)【発明の名称】血液がんを治療するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/352 20060101AFI20240729BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240729BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240729BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240729BHJP

【ＦＩ】

A61K31/352

A61P35/02

A61K39/395 N

A61P43/00 121

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2022555613

(86)(22)【出願日】2019-11-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-16

(86)【国際出願番号】 US2019062184

(87)【国際公開番号】W WO2021101521

(87)【国際公開日】2021-05-27

【審査請求日】2022-06-27

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】510293969

【氏名又は名称】プロヴェクタス ファーマテック，インク．

(73)【特許権者】

【識別番号】507132329

【氏名又は名称】ユーティーアイ リミテッド パートナーシップ

(74)【代理人】

【識別番号】100086368

【弁理士】

【氏名又は名称】萩原 誠

(72)【発明者】

【氏名】エリック エー． ワクター

(72)【発明者】

【氏名】ドミニク ロドリゲス

(72)【発明者】

【氏名】アル ナレンドラン

(72)【発明者】

【氏名】サトビアー タークル

(72)【発明者】

【氏名】ルーシー スウィフト

(72)【発明者】

【氏名】チュンフェン ジャン

(72)【発明者】

【氏名】モヒト ジェイン

【審査官】堂畑 厚志

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２００３／０１３３９４０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０８３６３５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２９０３１８（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／３５２

Ａ６１Ｐ ３５／０２

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

白血病細胞を有する哺乳動物対象に第１のがん細胞毒性剤として静脈内（ＩＶ）投与されるための治療薬であって、
前記静脈内（ＩＶ）投与は、前記第１のがん細胞毒性剤を、
前記白血病細胞を有する前記哺乳動物対象に投与するステップ（Ａ）と、
前記白血病細胞の死を誘導するに十分な期間維持するステップ（Ｂ）とを含み、
前記第１のがん細胞毒性剤は、治療有効量のハロゲン化キサンテン、その薬学的に許容可能な塩またはそのＣ_１－Ｃ_４アルキルエステルであるローズベンガル二ナトリウム塩が薬学的に許容可能な水性媒体に溶解または分散されて構成される治療薬。

【請求項2】

前記ステップ（Ａ），（Ｂ）は繰り返し行われる、請求項１に記載の治療薬。

【請求項3】

前記白血病細胞は、急性Ｂ細胞またはＴ細胞リンパ芽球性白血病細胞、あるいは急性骨髄性白血病細胞である、請求項１に記載の治療薬。

【請求項4】

前記静脈内（ＩＶ）投与は、前記哺乳動物対象においてインビボで行われる、請求項１に記載の治療薬。

【請求項5】

前記哺乳動物対象は、ヒト、類人猿、サル、実験動物、コンパニオンアニマル、および食用動物からなる群から選択される、請求項４に記載の治療薬。

【請求項6】

前記薬学的に許容可能な水性媒体は、等張性の水溶液である、請求項１に記載の治療薬。

【請求項7】

前記ステップ（Ａ）の静脈内（ＩＶ）投与は、薬学的に許容可能な媒体に溶解または分散された、第２の治療有効量の第２の異なる作用のがん細胞毒性剤の前記哺乳動物対象への投与と併せて実施する、請求項１に記載の治療薬。

【請求項8】

前記第２のがん細胞毒性剤は、薬学的に許容可能な固体媒体に溶解または分散されている、請求項７に記載の治療薬。

【請求項9】

前記第２のがん細胞毒性剤を含有する前記薬学的に許容可能な固体媒体は、経口投与される、請求項８に記載の治療薬。

【請求項10】

前記第２のがん細胞毒性剤は、分子量が２００～１０００Ｄａの低分子である、請求項７に記載の治療薬。

【請求項11】

前記低分子は、前記第１のがん細胞毒性剤との相乗効果を示す、請求項７に記載の治療薬。

【請求項12】

前記第２のがん細胞毒性剤は、薬学的に許容可能な水性媒体に溶解または分散されている、請求項７に記載の治療薬。

【請求項13】

前記第２のがん細胞毒性剤を含有する前記薬学的に許容可能な水性媒体は、静脈内投与される、請求項１２に記載の治療薬。

【請求項14】

前記第２のがん細胞毒性剤は、無傷モノクローナル抗体またはそのパラトープ含有部分を含む、請求項１３に記載の治療薬。

【請求項15】

前記無傷モノクローナル抗体またはそのパラトープ含有部分は、免疫チェックポイントタンパク質阻害剤である、請求項１４に記載の治療薬。

【請求項16】

前記免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、およびＯＸ４０からなる群のうちの１つまたは複数から選択される１つまたは複数のタンパク質性物質に結合する、請求項１５に記載の治療薬。

【請求項17】

前記第１のがん細胞毒性剤および前記第２のがん細胞毒性剤は、同時に、または互いに約３時間以内に投与される、請求項７に記載の治療薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫などの血液がんを治療するための治療レジメンに係り、特に、小児においてそのような治療を実施するための治療レジメンに関する。

【背景技術】

【0002】

成人の血液には、１マイクロリットル（μＬ）あたり約７０００個の白血球が含まれる。これらの白血球のうち、約６５％が顆粒球（約４５００個／μＬ）、約３０％が単球（約２１００個／μＬ）、約５％がリンパ球（約３５０個／μＬ）である［非特許文献１］。上記の白血球数は、当然ながら、一般化された平均値であり、顆粒球数は正常な患者のものである。すなわち、疾患のない患者は、典型的には、約２０００個から約７０００個／μＬの顆粒球数を有する。

【0003】

慢性顆粒球性白血病（ＣＧＬ）とも呼ばれる慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、造血幹細胞の新生物疾患である。その初期段階では、白血球増加、末梢血中の未熟顆粒球数の増加、脾腫および貧血が特徴として生じる。これらの未熟顆粒球には、好塩基球、好酸球、および好中球が含まれる。未熟顆粒球は、骨髄、脾臓、肝臓、時には他の組織にも蓄積する。この病気に罹患している患者では、１マイクロリットル（μＬ）あたりの白血球数が７５０００を超えるのが特徴であり、その数は５０００００／μＬを超える場合もある。

【0004】

ＣＭＬは、米国において白血病全体の約２０％を占めている。毎年１００万人あたり約１５人の新規患者が報告され、年間で約３０００～４０００人の新規患者が発生している。この病気は、４５歳未満のヒトでは稀であり、６５歳までに急速に増加し、その後も高率に推移する。慢性骨髄性白血病患者の診断時からの寿命の中央値は、約４年である。

【0005】

ＣＭＬ患者の約６０～８０％は、急性転化を発症する。急性転化では急性白血病の症状が現れる。芽球細胞上に存在する特定のマーカにより、急性転化時のこれらの芽球細胞がリンパ系由来であることが示唆される場合がある。

【0006】

急性転化の治療に使用される化学療法剤は、他の急性白血病の治療に使用されるものと同じである。例えば、急性骨髄性白血病の治療に使用されるシタラビンとダウノルビシンは、ＣＭＬの急性転化の治療にも用いられる。また、急性リンパ性白血病に対して用いられる治療レジメであるプレドニゾンとビンクリスチンも、ＣＭＬの急性転化の治療に用いられる。しかし、ＣＭＬの急性転化段階におけるこれらの薬物療法の成功率は、他の急性白血病の治療の成功率よりもさらに低い。

【0007】

小児のがんは稀であり、その発生率は、年間１００万人（年齢１５歳未満）あたり１４０～１５５人である。これは、毎年７０００人に１人の小児ががんと診断されていることを意味する。がんは稀であるにもかかわらず、悪性新生物は、５歳から１４歳の小児において事故の次に多く見られる死亡原因であり、死亡率の２３％を占める。小児がんは、化学療法以前の時代には多くが致命的であったが、その生存率は、１９６０年代の２０～３０％から１９７０年代には６２％、最近では８３％と劇的に向上している［非特許文献２］。

【0008】

白血病は最も多く見られる小児がんであり、小児（１～１４歳）がんの診断全体の約３０％を占めている。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）は小児がんの約２５％を占め、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は残りの約５％を占めている。非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）とホジキンリンパ腫は、それぞれ小児がんの約６％と約４％を占める。(非特許文献２)

【0009】

ＡＬＬに対する現在の治療法には、ペグ化アスパラギナーゼ、リポソームダウノルビシン、リポソームアナマイシン、スフィンゴソームビンクリスチン、およびリポソームシタラビンが含まれる。ＡＭＬに対する現在の治療法には、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、三酸化ヒ素、ＡＴＲＡと組み合わせたアントラサイクリン、および大量シタラビンと組み合わせたイダルビシンの使用が含まれる。ソラフェニブ（マルチキナーゼ阻害剤）とクロファラビンおよびシタラビンとの併用は、第Ｉ相試験で成功を収めており［非特許文献３］、カリケアマイシン結合ＣＤ３３抗体であるゲムツズマブオゾガマイシン（商品名：マイロターグ（登録商標））は有望であるとされている［非特許文献４］。

【0010】

成人の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は一般に低・中悪性度であるが、小児のＮＨＬは高悪性度であることが多い。ＮＨＬは、表現型（Ｂ細胞／Ｔ細胞）と分化度によって分類可能であり、次の３つのカテゴリーに分類される：（Ｉ）バーキット／バーキット様リンパ腫やびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を含む成熟Ｂ細胞ＮＨＬ；（ＩＩ）リンパ芽球性リンパ腫（ＬＬ）（ほとんどが前駆Ｔ細胞）；（ＩＩＩ）未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）（成熟Ｔ細胞またはヌル細胞）。バーキットリンパ腫（ＢＬ）が最も多く、小児ＮＨＬの１／３を占める［非特許文献２］。

【0011】

リツキシマブ（ＣＤ２０抗体）の単独使用および化学療法との併用は、ＢＬ患者およびＤＬＢＣＬ患者を対象に臨床試験が行われている［非特許文献５および６］。ＣＤ３０キメラ抗体とモノメチルアウリスタチンＥとからなるブレンツキシマブベドチンは、成人の第ＩＩ相試験で奏効と寛解を示しており［非特許文献７］、一方クリゾチニブおよびＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）阻害剤は、第Ｉ相試験で９人中８人のＡＬＣＬ患者に奏効をもたらしている［非特許文献８］。

【0012】

ホジキンリンパ腫（ＨＬ）は、１５歳から１９歳の年齢層に最も多く見られるがんであり、１５歳未満の年齢層よりも４～５倍高い頻度で発生している。ＨＬは一般的に、古典的ＨＬと結節性リンパ球優位型ＨＬに分類される。

【0013】

ＨＬは、ＭＯＰＰ（ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、プロカルバジン、およびプレドニゾンを含む）化学療法レジメンが導入された１９６０年代までは、致死的な病気であった。小児ＨＬの治癒率は過去２０年間で９０％を超え、最も治癒が見込める小児がんの一つとなっている。残念ながら、小児ＨＬの生存者は、治療に関連した重大な長期疾病リスクおよび長期死亡リスクにさらされている。

【0014】

従前の治療では、化学療法と共に放射線を使用することが一般的であったため、以前に治療を受けた女性において乳がんが多く発見されるようになっていた。最近のアプローチでは、迅速初期奏効者（ＲＥＲ）と呼ばれる２サイクルの化学療法後に完全奏効した患者には放射線の使用を制限し、低リスクのＲＥＲには領域照射療法（ＩＦＲＴ）を省略するとともに、男性には性腺毒性の低いアルキル化療法を用い、女性にはＩＦＲＴを避けるという、性別に基づいた治療法の変更が行われている。

【0015】

小児白血病の生存率は大幅に改善されているものの、再発は治療失敗の主要な原因となっている。小児ＡＬＬ患者の約１５～２０％、および小児ＡＭＬ患者の約３０～４０％が再発しており、ＡＬＬの再発は４番目に多く見られる小児悪性腫瘍とされている。

【0016】

再発小児白血病の治療には、化学療法レジメンの強化や骨髄移植（ＢＭＴ）の利用が含まれる。しかし、併用化学療法の強化や第二選択薬の導入は、累積毒性を伴うことが多く、効果の増分はわずかである。

【0017】

小児がんに対する免疫系の相互作用を理解するには、適切な動物モデルを利用できることが重要な要素である。現在の異種移植モデルは、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを用いて確立されているため、免疫系の寄与に関する情報を得ることができないという限界がある。また、免疫正常動物におけるヒト造血幹細胞の再構築などのアプローチは、煩雑でコストが高く、複雑な生物学的変数をシステムに導入してしまうことが多い。

【0018】

近年、マウス胎児をヒト腫瘍細胞に対して寛容化することで、免疫正常マウスを用いた新たな異種移植腫瘍モデルが開発された［非特許文献９］。このモデルを使用することで、異種移植技術を通じてがん細胞と免疫系との複雑な相互作用をよりよく説明することができるため、有利である。

【0019】

成人のがん性腫瘍に有用な抗がん剤グループの１つは、ハロゲン化キサンテン、またはその薬学的に許容可能な塩である。特許文献１～７を参照されたい。これらのハロゲン化キサンテンのうち、ローズベンガル二ナトリウム（４，５，６，７－テトラクロロ－２’，４’，５’，７’－テトラヨードフルオレセイン二ナトリウム；ＲＢ）は特に効果的で容易に利用できることがわかっている。

【0020】

ＰＶ－１０は、０．９％生理食塩水中のＲＢの１０％無菌溶液であり、乳幼児の肝機能を測定するために臨床的に使用されている［非特許文献１０］。これまでの研究では、ＰＶ－１０ががん細胞のリソソームに蓄積し［非特許文献１１］、様々な成人がんで細胞死を誘導することが示されている［非特許文献１２～１６］。

【0021】

ＰＶ－１０は、単体の抗がん剤として、また低分子抗がん剤やモノクローナル抗体抗がん剤との併用で、多くの臨床試験で使用されている。そのうちのいくつかの試験について以下に述べる。細胞毒性剤としてＰＶ－１０を単独で使用した第Ｉ相および第ＩＩ相臨床試験では、「有害事象は主に軽度から中等度で治療部位に限局しており、治療に関連したグレード４または５の有害事象は生じなかった」［非特許文献１７］、「試験治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）は、各薬剤の既存のパターンと一致しており、主にＰＶ－１０に起因するグレード１～２の注射部位反応とペムブロリズマブに起因するグレード１～３の免疫媒介反応であり、大きな重複や予想外の毒性は見られなかった：・・・」［非特許文献１８］と例示的に報告されている。このように、ＲＢはがん細胞に対しては毒性があるが、非がん細胞に対しては無毒であるように思われる。

【0022】

成人の腫瘍と小児の腫瘍とではしばしば動態が大きく異なるため、ＲＢおよび類似のハロゲン化キサンテンを小児のがん細胞、特にがん性血液細胞に対して使用した場合に有効であるかどうかは不明であった。細胞培養物中の神経芽細胞腫細胞株に対し、ＲＢを単独でまたは既知の抗がん剤と組み合わせて添加した予備的なインビトロ試験、およびマウスへ病巣内注射した異種移植試験において、がん細胞の死滅が示されたことが、本発明者の一人および共同研究者によって報告された［非特許文献１９］。

【0023】

また、ハロゲン化キサンテンを腫瘍内に病巣内投与することで、活性な細胞毒性剤を最高濃度で腫瘍に直接供給することができる。現在企図されている後述の治療法では、標的のがん性血液細胞から離れた場所に投与する場合が多いため、殺がん効果のあるハロゲン化キサンテン剤の有効性は低下する可能性がある。

【0024】

しかし、難治性転移性悪性黒色腫患者を対象とした第ＩＩ相臨床試験において、ＰＶ－１０の病巣内（ＩＬ）注射は腫瘍の退縮を誘導し、全奏効率は５１％であった［非特許文献１７］。ＰＶ－１０は、in-transitまたは転移性悪性黒色腫患者を対象とした第ＩＩ相臨床試験において、放射線治療との併用でも有効性を実証し、全奏効率は８６．６％であった［非特許文献２０］。

【0025】

直接的ながん細胞死の誘導に加えて、ＰＶ－１０は、マウス研究［非特許文献１２、１３、２１］とヒト臨床試験［非特許文献９、２２、２３、２４］の両方において、腫瘍特異的免疫反応を誘導することも示されている。悪性黒色腫のマウスモデルでは、ＰＶ－１０による治療は、悪性黒色腫細胞の壊死と単核腫瘍浸潤リンパ球の局所的な増加を誘導した［非特許文献２２］。

【0026】

腫瘍抗原を近くの抗原提示細胞（ＡＰＣ）に放出する、ＰＶ－１０誘導性の免疫原性細胞死によって、抗腫瘍Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化が促進されたことが示唆されている。同系のマウス大腸がんモデルでは、ＰＶ－１０によりインビトロで処理したがん細胞を同じ腫瘍を持つマウスに注入したところ、腫瘍の増殖が遅くなった［非特許文献１２］。さらに、同系のマウス悪性黒色腫モデルでは、病巣内ＰＶ－１０と抗ＰＤ１抗体との併用治療により、腫瘍の増殖が遅延し、Ｔ細胞の活性化が促進された［非特許文献２４］。

【0027】

以下の開示では、企図される発明を説明するとともに、小児白血病の治療においてＰＶ－１０等のハロゲン化キサンテンを使用した研究の結果を提供する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0028】

【文献】米国特許第６３３１２８６号

【文献】米国特許第７３９０６６８号

【文献】米国特許第７６４８６９５号

【文献】米国特許第９１０７８８７号

【文献】米国特許第９８０８５２４号

【文献】米国特許第９８３９６８８号

【文献】米国特許第１０１３０６５８号

【文献】米国特許第５９９８５９７号

【文献】米国特許第６４９３５７０号

【文献】米国特許第８９７４３６３号

【文献】米国特許第１０４７１１４４号

【非特許文献】

【0029】

【文献】Geyton, Textbook of Medical Physiology, Seventh ed., W. B. Saunders Co., Philadelphia (1986)

【文献】Saletta et al., Transl Pediatr 3(2):156-182 (2014)

【文献】Inaba et al., J Clin Oncol 29:3293-3300 (2011)

【文献】Zwaan et al., Br J Haematol 148:768-776 (2010)

【文献】Windebank et al., Pediatr Blood Cancer 53:392-396 (2009)

【文献】Gross et al., AmJ Transplant 12:3069-3075 (2012)

【文献】Pro et al., J Clin Oncol 30:2190-2196 (2012)

【文献】Mosse' et al., Lancet Oncol 14:472-480 (2013)

【文献】Basel et al., Cancer Lett. 412:256-263 (2018)

【文献】Yvart et al., Eur J Nucl Med 6:355-359 (1981)

【文献】Wachter, et al., Proceedings of SPIE, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences II, Periasamy, A. and So, P.T.C. (eds), Bellingham, Washington: 4620: 143-147 (2002)

【文献】Qin et al., Cell Death Dis 8:e2584 (2017)

【文献】Toomey et al., PLoS ONE 8(7):e68561 (2013)

【文献】Koevary et al., Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol 4(2):99-107 (2012)

【文献】Thompson et al., Melanoma Res 18(6):405-411 (2008)

【文献】Zamani et al., J Immunotoxic 11(4):367-375 (2014)

【文献】Thompson et al., Ann Surg Oncol 22(7):2135-2142 (2015)

【文献】Agarwala et al., J Clin Oncol 37(15) suppl 9559-9559 (May 26, 2019)

【文献】Swift et al., Oncotargets Ther, 12:1293-1307 (February 2019)

【文献】Foote et al., J Surg Oncol 115(7):891-897 (2017)

【文献】Liu et al., Oncotarget 7(25):37893-37905 (2016)

【文献】Lippey et al., J Surg Oncol 114(3):380-384 (2016)

【文献】Ross, J Surg Oncol 109(4):314-319 (2104)

【文献】Liu et al., PLoS ONE 13(4):e0196033 (2018)

【文献】Darvin et al., Exp Mol Med, 50:165 (2018)

【文献】Berge, J. Pharm. Sci. 1977 68(1):1-19

【文献】Swift et al., OncoTargets and Therapy 12:1-15 (2019)

【文献】Howard et al., N Engl J Med 364(19):1844-1854 (May 12, 2011)

【文献】Akbarzadeh et al., Nanoscale Res Lett, 8:102 (2013)

【文献】DiJoseph et al., Blood 103:1807-1814 (2004)

【文献】ApexBio Technology Product Catalog (2013)

【文献】Francisco et al., Blood 102:1458-1465 (2003)

【文献】Dornan et al., Blood 114:2721-2729 (2009)

【文献】Swift et al., Blood, 132, No. Suppl 1: 5207 (November 21, 2018)

【発明の概要】

【0030】

本発明は、血液系非腫瘍性がん細胞を有する哺乳動物対象を治療する方法を企図する。例示的な血液系非腫瘍性がんには、白血病、リンパ腫、および骨髄腫が含まれる。本方法は、（Ａ）上記のような哺乳動物対象に、治療有効量のハロゲン化キサンテン、その薬学的に許容可能な塩またはそのＣ_１－Ｃ_４アルキルエステルを、薬学的に許容可能な水性媒体に溶解または分散された第１のがん細胞毒性剤として投与するステップを含む。哺乳動物対象は、血液系非腫瘍性がん細胞の死を誘導するのに十分な期間維持される。企図される投与は通常、繰り返し行われる。

【0031】

企図される治療方法は、当該哺乳動物対象への、薬学的に許容可能な媒体に溶解または分散された、第２の治療有効量の第２の異なる作用のがん細胞毒性剤の投与と併せて実施することもできる。第２のがん細胞毒性剤は、低分子、無傷抗体、またはパラトープ含有抗体部分であり得る。第１および第２のがん細胞毒性剤は、同一のまたは異なる媒体中で一緒に、または異なる時間に投与することができる。第２のがん細胞毒性剤は、固形のタブレット、カプセル、錠剤等の形態で、または液体の媒体を用いて投与することができる。

【0032】

一態様において、分子量が約２００～約１０００Ｄａである低分子がん細胞毒性剤の使用が企図される。ドキソルビシン、エトポシド、ビンクリスチンなどの、ハロゲン化キサンテンと相乗作用する化合物が好ましい。無傷抗体、またはパラトープ含有抗体部分は、がん細胞毒性剤の第２のグループである。これらの薬剤の中で好ましいのは、免疫チェックポイント阻害剤と呼ばれるものである。［例えば、非特許文献２５参照］

【0033】

本発明はまた、血液系非腫瘍性がん細胞を有する哺乳動物対象の治療のための、薬学的に許容可能な水性媒体に溶解または分散された第１のがん細胞毒性剤としての治療有効量のハロゲン化キサンテン、その薬学的に許容可能な塩またはそのＣ_１－Ｃ_４アルキルエステルの使用も企図し、ハロゲン化キサンテンは、血液系非腫瘍性がん細胞の死を誘導するのに十分な期間、哺乳動物対象において維持される。更なる実施形態において、第１のがん細胞毒性剤であるハロゲン化キサンテン、その薬学的に許容可能な塩またはそのＣ_１－Ｃ_４アルキルエステルは、ローズベンガル、その薬学的に許容可能な塩またはそのＣ_１－Ｃ_４アルキルエステルである。更に別の実施形態において、ローズベンガルはローズベンガル二ナトリウム塩である。更に、血液系非腫瘍性がん細胞は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。更に、血液系非腫瘍性がん細胞、白血病、リンパ腫、または骨髄腫は、急性Ｂ細胞またはＴ細胞リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、およびホジキンリンパ腫からなる群から選択される。

【発明を実施するための形態】

【0034】

一態様において、本発明は、白血病、リンパ腫、および骨髄腫等の血液系非腫瘍性がん細胞の治療（殺傷）に用いるための医薬組成物を企図する。企図される医薬組成物は、（液体である）水性媒体中に、ハロゲン化キサンテン、ハロゲン化キサンテンの生理的に許容可能な塩、またはそのＣ_１－Ｃ_４アルキルエステルである第１のがん細胞毒性剤を、０．１％（ｗ／ｖ）から約２０％（ｗ／ｖ）の濃度で含有する。特に好ましいハロゲン化キサンテン塩は、ＰＶ－１０中に存在するようなローズベンガル（４，５，６，７－テトラクロロ－２’，４’，５’，７’－テトラヨードフルオレセイン）二ナトリウム塩である。本組成物は、白血病、リンパ腫、および骨髄腫等の血液系非腫瘍性がん性疾患、より具体的には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、またはホジキンリンパ腫（ＨＬ）を有するヒトなどの哺乳動物に対し、治療有効量の第１のがん細胞毒性剤を供給するために投与される。

【0035】

哺乳動物対象は、血液系非腫瘍性がん細胞を死滅させるのに十分な時間維持される。がんが死滅したという事実、及び死滅したがんの相対的な量は、血液系非腫瘍性がんの状態を分析するための通常の手段によって判定することができる。

【0036】

哺乳動物対象は、典型的にはその後再び治療され、通常は複数回治療される。維持の期間、および更なる投与を実施するという判断は、いずれも哺乳動物の種、個々の哺乳動物対象、疾患の重症度、疾患の種類、対象の年齢および健康状態などに応じて決定することが可能である。これらの要素は通常、血液系非腫瘍性がんを治療する技術に熟練した医師によって検討される。

【0037】

また、通常は検出可能ながん細胞を体から取り除くことが望まれるが、常にそれが可能であるとは限らない。時には、疾患を安定した状態でコントロールするのに十分な量のがん細胞を死滅させるか、または他の治療が実施できるようにがんによる細胞の負荷を軽減することで十分な場合もある。

【0038】

以下に提供されるデータは、いくつかの白血病細胞株に対してインビトロでＲＢを使用する場合のＩＣ_５０値が約５０～約１００μＭであることを示している。ＲＢの分子量が１０１８ｇ／ｍｏｌであることを考えると、上記のＩＣ_５０値では、１リットル当たりに約５０～約１００ｍｇのＲＢが含まれる計算となる。インビボ治療中にがん細胞と接触させる際には、この濃度を達成することが好ましい。

【0039】

古典的な静脈内（ＩＶ）での診断用途でＲＢを用いる場合には、１回１００ｍｇのＲＢをＩＶ投与していた。ＰＶ－１０の臨床試験では、ＲＢは１５００ｍｇのＩＶ投与で耐容性が確認されている。標準的な成人の血液量は約５Ｌである。したがって、血流中でＩＣ_５０値を達成するべく血中濃度を１００ｍｇ／Ｌとするには、成人患者には約５００ｍｇのＲＢをＩＶ投与する必要がある。ＲＢは循環血液から短時間で排出されるため（ｔ_１／２は約３０分）、ＩＶ投与では、循環血液中のＲＢのピークレベルを維持するために、継続的な（すなわち、最大で数時間以上の）注入が必要となる。

【0040】

ＩＣ_５０値レベルでの投与は、循環しているすべての血液系非腫瘍性がん細胞に対して毒性があるわけではない。つまり、ＩＣ_５０値では約半数の細胞のみが影響を受ける。したがって、約１５００ｍｇ（すなわち、３００μＭ）までの、ＩＣ_５０値の倍数の量でＲＢを投与することが好ましいといえる。

【0041】

代替的には、残存腫瘍負荷に対する機能的免疫反応を開始させるために、ほんの一部のがん細胞のみを死滅させれば十分な場合もある。後者のケースは、毒性反応（すなわち、急速に死滅したがん細胞が大量に存在することによる、いわゆる「腫瘍崩壊症候群」）を回避するために好ましいと考えられる。この場合、ハロゲン化キサンテンががん細胞に細胞毒性を与えることによって生じたがん細胞の残骸が免疫反応を誘導し、その結果、がん性の血液系非腫瘍性細胞がさらに死滅する。

【0042】

以下に列挙する同様に有用なハロゲン化キサンテン化合物およびその薬学的に許容可能な塩は、互いに約３倍異なる分子量を有し得る（特許文献２の第１５～１６欄の表３を参照）。ＲＢ以外のハロゲン化キサンテンの正確な使用量は、そのような各化合物の公開されている分子量とＲＢの分子量とに基づいて計算されることが好ましい。

【0043】

企図されるハロゲン化キサンテンには、特に好適であるローズベンガル（４，５，６，７－テトラクロロ－２’，４’，５’，７’－テトラヨードフルオレセイン）、エリスロシンＢ、フロキシンＢ、４，５，６，７－テトラブロモ－２’，４’，５’，７’－テトラヨードフルオレセイン、２’，４，５，６，７－ペンタクロロ－４’，５’，７’－トリヨードフルオレセイン、４，４’，５，６，７－ペンタクロロ－２’，５’，７’－トリヨードフルオレセイン、２’，４，５，６，７，７’－ヘキサクロロ－４’，５’－ジヨードフルオレセイン、４，４’，５，５’，６，７－ヘキサクロロ－２’，７’－ジヨードフルオレセイン、２’，４，５，５’，６，７－ヘキサクロロ－４’，７’－ジヨードフルオレセイン、４，５，６，７－テトラクロロ－２’，４’，５’－トリヨードフルオレセイン、４，５，６，７－テトラクロロ－２’，４’，７’－トリヨードフルオレセイン、４，５，６，７－テトラブロモ－２’，４’，５’－トリヨードフルオレセイン、および４，５，６，７－テトラブロモ－２’，４’，７’－トリヨードフルオレセインが含まれる。医薬化合物と共に薬学的に許容可能な塩を形成する、一般的に使用される薬学的に許容可能な酸および塩基のリストについて、読者は非特許文献２６を参照されたい。

【0044】

上記ハロゲン化キサンテン化合物の内の１つのＣ_１－Ｃ_４アルキルエステルも使用することができ、Ｃ_２、すなわち、エチルエステルを使用することが好ましい。例えば、ＲＢ、エチルレッド３（エリスロシンエチルエステル；２’，４’，５’，７’－テトラヨード－フルオレセインエチルエステル）、４，５，６，７－テトラブロモ－２’，４’，５’，７’－テトラヨードフルオレセイン、およびエチルフロキシンＢ（４，５，６，７－テトラクロロ－２’，４’，５’，７’－テトラブロモフルオレセインエチルエステル）の各々を用いたインビトロ試験では、ＣＣＬ－１４２腎腺がんに対して同様の抗腫瘍作用が示された。

【0045】

ローズベンガルの好ましい形態は、以下の構造式を有するローズベンガル二ナトリウムである。

【0046】

【化1】

【0047】

上記のハロゲン化キサンテンを含む医薬組成物の医薬用途の更なる詳細は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１～１１に記載されている。

【0048】

企図されるハロゲン化キサンテンまたはその薬学的に許容可能な塩は、典型的には、水性医薬組成物中に溶解または分散した状態で使用される。ハロゲン化キサンテンは、典型的には、水性０．９％生理食塩水医薬組成物中に０．１％～約２０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。

【0049】

企図される医薬組成物は、通常、静脈内法などによる非経口投与を意図したものであるため、そのような組成物は電解質を含有するべきであり、好ましくはほぼ生理的な浸透圧およびｐＨ値を有すべきである。薬学的に許容可能な水性媒体中の一価電解質イオンの濃度は、好ましくは約０．５～約１．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約０．８～約１．２％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは約０．９％（ｗ／ｖ）である。約０．９％（ｗ／ｖ）の濃度は、ほぼ等張性の水溶液に相当するため、特に好ましい。更なる好ましい実施形態では、ケモアブレーション用医薬組成物中の電解質は、塩化ナトリウムである。

【0050】

上記のようなレベルの電解質は、薬学的に許容可能な水性媒体の浸透圧を増大させる。従って、電解質濃度の範囲を特定するかわりに、浸透圧を用いて組成物の電解質レベルをある程度特徴付けることができる。好ましくは、組成物の浸透圧は約１００ｍＯｓｍ／ｋｇより大きく、より好ましくは、組成物の浸透圧は約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇより大きく、最も好ましくは約３００～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇである。

【0051】

ハロゲン化キサンテンの水性賦形剤への溶解度を最大化し、生体組織への親和性を確保するには、薬学的に許容可能な水性媒体のｐＨ値は、約４～約９であることが好ましい。特に好ましいｐＨ値は、約５～約８であり、より好ましくは約６～約７．５の間である。これらのｐＨ値において、ハロゲン化キサンテンは通常、ｐＨ値が低いときに形成される水不溶性ラクトンではなく、二塩基性形態のままである。

【0052】

薬学的に許容可能な水性媒体のｐＨ値は、当業者に公知のあらゆる適切な手段によって制御又は調整することができる。酸又は塩基などの追加により、組成物を中和するか、またはｐＨ値を調整することができる。ハロゲン化キサンテン又はその生理的に許容可能な塩は弱酸であるから、ハロゲン化キサンテンの濃度及び／又は電解質の濃度によっては、組成物のｐＨ値のために中和剤及び／又はｐＨ調整剤を使用せずにすむ可能性がある。しかしながら、組成物は、投与されてから生体環境に適合できるよう、いかなる中和剤も含まないことが特に好ましい。

【0053】

本発明の目的は、細胞毒性濃度のハロゲン化キサンテンを最終的にがん細胞の周囲にもたらし、その中で、これらのがん細胞がハロゲン化キサンテンと接触できるようにすることであるため、本発明において、医薬組成物中のハロゲン化キサンテンの具体的な量は、組成物を腫瘍に病巣内注射する場合ほどには重要でないと考えられる。以下に提供されるデータは、インビトロ培養白血病細胞に対するローズベンガル二ナトリウムのＩＣ_５０濃度が、約５０～約１００μMであることを示している。

【0054】

インビトロ培養白血病細胞を用いた上記の結果からは、驚くべきことに、非特許文献２７によって報告された、培養ＳＫ－Ｎ－ＡＳ、ＳＫ－Ｎ－ＢＥ（２）、ＩＭＲ５、ＬＡＮ１、ＳＨＥＰ、およびＳＫ－Ｎ－ＳＨ神経芽細胞腫細胞、培養ＳＫ－Ｎ－ＭＣ神経上皮腫細胞、並びに、培養正常初代、ＢＪ、およびＷＩ３８線維芽細胞に対するインビトロ細胞毒性研究で得られたデータに類似するデータがもたらされた。当該文献の著者は、ＰＶ－１０処理細胞の処理後９６時間時点における半数阻害濃度（ＩＣ_５０）値について、試験を行った神経芽細胞腫細胞株では６５～８５μM、神経上皮腫株ＳＫ－Ｎ－ＭＣでは４９μMであった旨を報告している。また、著者は３つの組織源由来のヒト上皮細胞に対する毒性も検討し、ＩＣ_５０値は９３～１４３μMであった旨を報告している。

【0055】

白血病細胞に対するＩＣ_５０値は約５０～約１００μMであると仮定すると、成人の白血病細胞の約半数を死滅させるためのＲＢの投与量は、ＲＢ二ナトリウムの分子量１０１８ｇ／ｍｏｌに基づき、１リットル当たり約５０～約１００ｍｇであると計算される。古典的なＩＶでの診断用途でＲＢを用いる場合には、１回１００ｍｇのＲＢをＩＶ投与していた。標準的な成人の血液量は約５Ｌである。したがって、血流中でＩＣ_５０値を達成するべく血中濃度を１００ｍｇ／Ｌとするには、成人患者には約５００ｍｇのＲＢをＩＶ投与する必要がある。静脈内（ＩＶ）投与は、ハロゲン化キサンテン含有組成物を必要とする哺乳動物対象に投与するための好ましい方法である。

【0056】

ＰＶ－１０の臨床試験では、ＲＢは１５００ｍｇのＩＶ投与で耐容性が確認されている。ＲＢは循環血液から短時間で排出されるため（ｔ_１／２は約３０分）、ＩＶ投与では、単回投与の間、循環血液中のＲＢのピークレベルを維持するために、継続的な（すなわち、最大で数時間以上の）注入が必要となる。

【0057】

ＩＣ_５０レベルの循環ＲＢ濃度を達成するのに十分な量のＲＢを投与した場合、すべての循環白血病細胞に対して毒性があるわけではない（つまり、ＩＣ_５０では約半数の白血病細胞のみが影響を受ける）。いくつかの実施形態では、約１５００ｍｇ（すなわち、３００μＭ）までの、ＩＣ_５０レベルの倍数の量でＲＢを投与することが好ましい場合がある。しかしながら、代替的には、個々の投与によってほんの一部の腫瘍細胞のみを死滅させれば十分な場合もある。

【0058】

後者のケースは、急速に死滅した腫瘍細胞の負荷によって生じ得る毒性反応（すなわち、腫瘍崩壊症候群）を回避するために好ましいと考えられる。例えば、非特許文献２８によると、腫瘍崩壊症候群は、血液がんを治療する医師が最も多く遭遇する疾患関連の緊急事態である。

【0059】

治療が必要な白血病、リンパ腫、または骨髄腫を有し、ハロゲン化キサンテンまたはその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物を投与できる哺乳動物（哺乳動物対象）は、ヒトなどの霊長類、チンパンジーまたはゴリラなどの類人猿、カニクイザルまたはマカクなどのサル、ラット、マウスまたはウサギなどの実験動物、犬、猫、馬などのコンパニオンアニマル、あるいは、雌牛または去勢雄牛、羊、子羊、ブタ、ヤギ、ラマなどの食用動物であってよい。

【0060】

以下でより詳細に説明するように、残存がん細胞負荷に対する機能的免疫反応を開始させるために、１回の治療中に白血病細胞の一部のみを死滅させることも有利であり得る。ＲＢによって開始される機能的免疫系反応は、ＲＢによって生じた体内を循環する壊死性細胞破片が、免疫反応を誘導するという作用によって少なくとも部分的に引き起こされると考えられ、誘導された免疫反応により、ＲＢなどのハロゲン化キサンテンの初期投与の効果を延長することができる。

【0061】

誘導された免疫反応は、接触したがん細胞を即座に死滅させる場合よりも、進行するのに長い時間がかかりうる。このように効果が遅延する理由は、白血病細胞を攻撃して死滅させるのに適切なＢ細胞およびＴ細胞の集団の誘導や、循環を続けることで患者を再発から守ることが可能な長期記憶Ｔ細胞の誘導には、時間が必要となるためである。

【0062】

別の態様では、上記の医薬組成物は、第２の異なる作用の細胞障害性抗がん剤、すなわち、作用機序が第１の細胞毒性剤であるハロゲン化キサンテンとは異なる細胞障害性抗がん剤と組み合わせて使用される。前述のように、ハロゲン化キサンセンは、がん細胞のリソソームに局在し、細胞周期のＧ１期にある細胞の割合を増加させ、アポトーシスによる細胞死を誘導する［非特許文献１９］。

【0063】

第２の細胞毒性剤の第１のタイプは、いわゆる「低分子」である。このような低分子は、一般に非がん細胞よりもがん細胞をより特異的に死滅させるという点で、半特異的な細胞毒と見なすことができる。ほぼすべての低分子抗がん剤は、企図されるハロゲン化キサンテンよりもがん特異性が低いため、低分子抗がん剤のレシピエント被験者が治療レジメンから離脱する原因となり得る吐き気、脱毛、その他の苦痛を被験者に引き起こす可能性がある。

【0064】

これらの低分子の分子量は、典型的には約２００～約１０００ダルトン（Ｄａ）であり、好ましくは約２５０～約８５０Ｄａである。この低分子のグループには、カリケアマイシン（１３６８Ｄａ）、ビンブラスチン（８１１Ｄａ）、ビンクリスチン（８２５Ｄａ）、モノメチルアウリスタチン（７１８Ｄａ）、エトポシド（５８９Ｄａ）、ダウノルビシン（５２８Ｄａ）、ドキソルビシン（５４４Ｄａ）、アナマイシン（６４０Ｄａ）、ソラフェニブ（４６５Ｄａ）、クロファラビン（３０４Ｄａ）、シスプラチン（３００Ｄａ）、イリノテカン（５８７Ｄａ）、およびシタラビン（２４３Ｄａ）などの、血液がんを治療するために使用される多くの前述の分子が含まれる。これらの低分子の多くは、その塩、プロドラッグ、および／またはエステルとして使用され、その結果、上記の概数値よりも大きな分子量を有することに留意されたい。

【0065】

第２の細胞障害性抗がん剤を有する医薬組成物は、タンパク質、界面活性剤、および／またはポリ（エチレングリコール）［ＰＥＧ］のようなポリマーなどのより大きな分子に結合された、上記のような低分子を含むこともできる。このような結合により、しばしば、低分子の毒性が最小限に抑えられるとともに、がん細胞に結合する抗体を使用することで、送達の位置が向上する。さらに、がん細胞に特異的に結合するように、および／またはがん細胞内へエンドサイトーシスされるように適合させることが可能なリポソーム、ミセル、またはシクロデキストリン分子内に、低分子細胞毒性剤を封入することができる。この封入および結合された低分子のグループは、その活性細胞毒性剤が低分子であるため、先に述べた第２の細胞毒性剤の低分子のグループに含まれる。

【0066】

このような第２の細胞毒性剤の実例としては、リポソームダウノルビシン、リポソームアナマイシン、スフィンゴソームビンクリスチン、リポソームシタラビン、ゲムツズマブオゾガマイシンと称されるカリケアマイシン結合ＣＤ３３抗体、およびブレンツキシマブベドチンと称されるＣＤ３０キメラ抗体とモノメチルアウリスタチンＥとの組み合わせが挙げられる。

【0067】

簡潔に説明すると、リポソームは、コレステロールおよびリン脂質分子から通常調製される、一般的に球形の人工小胞であり、１つまたは２つの二重層を構成して、送達を補助するために低分子の第２の細胞毒性剤を封入する。非特許文献２９を参照されたい。

【0068】

カリケアマイシンは、高分子量の低分子（１３６８Ｄａ）であり、ベンゾチオエートのＳ－エステル結合によって中断された４つの連結した単糖類と、ＤＮＡ配列を切断するエンジイン基とを含む。カリケアマイシンは非常に毒性が強いため単体では使用できず、ヌードマウスにおけるＬＤ_５０は３２０μｇ／ｋｇである［非特許文献３０］。同様に、モノメチルアウリスタチンは、ＣＤ３０（細胞膜タンパク質であり、がんマーカであるＴＮＦ受容体ファミリーメンバ）に対する抗体への結合を介して、全身（広範囲）への高い毒性を示し［いくつかのがん細胞株において、ＩＣ_５０＜１ｎＭ；非特許文献３１］、大細胞リンパ腫およびホジキン病に対して有用であると報告された［非特許文献３２］一方で、モノメチルアウリスタチンの抗ＣＤ７９ｂモノクローナルへの結合は、ＮＨＬの３つの異種移植モデルの治療において有利であった［非特許文献３３］。

【0069】

低分子（非タンパク質性、約１０００グラム／モル未満）またはより大きなタンパク質性分子である全身性抗がん剤は、ハロゲン化キサンテンの病巣内投与によって行われる局所投与と比較して、薬剤が治療対象である哺乳動物対象の全身に行きわたるように哺乳動物対象に投与される。静脈内投与は、そのような薬剤の広がりを達成するための好ましい方法である。

【0070】

例示的な低分子抗がん剤には、本明細書で使用したドキソルビシン、エトポシド、ビンクリスチン、シスプラチン、イリノテカン、およびシタラビンが含まれ、また、例示的なタンパク質性分子はペグアスパラギナーゼである。これらの薬剤のうち、ドキソルビシン、エトポシド、およびビンクリスチンは、致死未満量のＰＶ－１０による治療と相乗作用するようであり、好ましい。

【0071】

本明細書で論じられる第２のがん細胞毒性剤は、いずれも複数回投与可能であることを理解されたい。そのような複数回の投与は、治療を行う医師の監督下で行われ、第１のがん細胞毒性剤の投与と同時に行われるか、または別々に行われ得る。

【0072】

低分子の全身性抗がん剤の有用な有効量は、ＦＤＡ、国内機関、または国際機関が承認した薬剤の添付文書情報に記載されている用量である。一般的に、単剤療法の投与計画は、初期臨床試験において最大耐用量（ＭＴＤ）を決定することにより設定される。ＭＴＤ（またはそのバリエーションである近似の量）はその後、有効性の評価と、安全性のより詳細な評価のために、後期臨床試験に適用される（ｐｒｏｍｕｌｇａｔｅｄ）。これらのＭＴＤは、臨床試験終了後、治療用量として確立されることが多い。しかしながら、低分子の全身性抗がん剤はＰＶ－１０との併用が企図されているため、ＭＴＤは通常使用される最大量であり、その量は通常の手順に従って漸減される。

【0073】

本発明においてハロゲン化キサンテン療法と組み合わせることが可能な各種の全身性抗がん剤の投与計画例を、下記の表Ａに示す。なお、以下に挙げる薬剤のいくつかは、上記で定義された「低分子」であるのに対し、他の薬剤は、抗体などの大きなタンパク質性分子である。それでもなお、これらは全身投与される。

【0074】

【表1】

【0075】

本発明の併用療法および治療方法では、全身性薬剤を下記のようなＩＶ投与療法と組み合わせて使用するとき、相加効果または相乗効果によって、表Ａに記載するような全身性薬剤の典型的な投与計画以下のレベルで当該全身性薬剤を使用することが一般的に可能となる。しかしながら、表Ａに示される投与計画は、治療を開始する際の有用な指針を提供するものであり、そこから、個々の患者を担当する医師が適切と考える量へ投与量を漸減することが可能である。

【0076】

ハロゲン化キサンテンおよび第２の細胞障害性抗がん剤は、一緒に投与する必要はなく、同一の投与手段で投与する必要もないことに留意されたい。したがって、ハロゲン化キサンセンをＩＶ投与する一方で、錠剤またはカプセルを使用して第２の細胞障害性抗がん剤を投与することが可能である。当業者は、抗がん剤を投与するための様々な方法をよく承知している。

【0077】

ＰＶ－１０中に存在するようなハロゲン化キサンテンとの併用治療に有用である、第２の細胞毒性剤の第２のタイプは、特殊な全身性抗がん剤ともいえる免疫チェックポイント阻害剤である。免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞などの免疫系細胞や一部のがん細胞によって作られる特定のチェックポイントタンパク質に結合して、当該タンパク質をブロックする薬剤である。これらのタンパク質は、ブロックされていない状態では免疫反応を阻害するため、免疫反応が抑制され、Ｔ細胞によるがん細胞の殺傷が妨げられる。これらの免疫チェックポイントタンパク質をブロックすることで、免疫系の「ブレーキ」が解除されるため、Ｔ細胞が活性化し、がん細胞を殺傷することができるようになる。

【0078】

有用な免疫チェックポイント阻害剤は、好ましくは、投与されることで上記の特定のタンパク質の作用をブロックし、それによって、免疫系ががん細胞を異物として認識し、このがん細胞を体から排除する手助けを行うことを可能にする、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体、またはその結合部分である。免疫チェックポイント阻害剤としては、抗ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）モノクローナル抗体であるイピリムマブおよびトレメリムマブが挙げられ、これらは、ＣＴＬＡ－４の働きをブロックすることによって免疫系の下方制御に対抗し、がんに対するＴ細胞の反応を増強するように設計されている。同様に、ピジリズマブ、ニボルマブ、ラムブロリズマブ、およびペムブロリズマブなどのモノクローナル抗体は、ＰＤ－１（プログラム死１）受容体に結合して免疫系の下方制御に対抗し、がん細胞に対するＴ細胞の反応を増強する。ＰＤ－１受容体の免疫チェックポイントタンパク質リガンド（ＰＤ－Ｌ１）を標的とする抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブの３種類である。ＰＤ－１受容体のリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に対する抗体、例えばＰＤ－Ｌ１に対するＢＭＳ－９３６５５９やＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）等、に関する初期研究でも、免疫系の下方制御の抑制とがんに対するＴ細胞の反応の増強が示されている。

【0079】

チェックポイント阻害剤様作用を有する別の抗体のグループは、細胞表面受容体ＯＸ４０（ＣＤ１３４）と免疫反応して、メモリーＴリンパ球およびエフェクターＴリンパ球の増殖を促進することにより、がん細胞に対するＴ細胞媒介性免疫反応を活性化させる。このようなヒト化抗ＯＸ４０モノクローナル抗体の例としては、現在文献でｇｓｋ３１７４９９８（ＩｇＧ１）、ポガリズマブ（ＭＯＸＲ０９１６）、およびＭＥＤ１０５６２と呼ばれるものがあり、また、ヒト抗ＯＸ４０ ＩｇＧ２抗体としてはＰＦ－０４５１８６００（ＰＦ－８６００）と称されるものがある。

【0080】

無傷モノクローナル抗体、ならびに、Ｆａｂ領域、Ｆａｂ’領域、Ｆ（ａｂ’）_２領域、およびＦｖ領域などのそのパラトープ含有部分（結合部位含有部分）、更に、一本鎖ペプチド結合配列は、免疫チェックポイントタンパク質阻害剤として有用であり得る。無傷のチェックポイント阻害モノクローナル抗体は、ヒトの体内での半減期が約１～３週間であり［例えば、ヤーボイ（登録商標）（イピリムマブ）終末相ｔ_１／２＝１５．４日；添付文書１２／２０１３；キートルーダ（登録商標）（ペムブロリズマブ）終末相ｔ_１／２＝２３日；添付文書０３／２０１７］、一本鎖オリゴまたはポリペプチドのインビボでの半減期は、より短い傾向にある。

【0081】

低分子の第２の細胞障害性抗がん剤とハロゲン化キサンテン薬剤の半減期は比較的短いため、両薬剤は単一の組成物中で投与してもよいし、別々の組成物中で投与してもよい。別々に投与する場合、両タイプの抗がん剤を互いに数分から約３時間以内に投与することが好ましい。より好ましくは、両者を互いに１時間未満内に投与する。

【0082】

本明細書において、「投与」は治療レジメンの開始を意味するために使用される。したがって、錠剤または他の経口剤形を飲み込むことは、ＩＶフローが開始される時点と同様に、治療レジメンの始まりにあたる。第１および第２の細胞障害性抗がん剤の両方が同一且つ単一の組成物中に一緒に存在する場合、投与は、その単一の組成物が被験者の体内に入るときに開始される。

【0083】

第２の細胞障害性抗がん剤がモノクローナル抗体などの免疫チェックポイント阻害剤である場合、ハロゲン化キサンテンと第２の細胞障害性抗がん剤である免疫チェックポイント阻害剤とは、一緒に投与しても、一方を先に投与してもよく、第２の細胞障害性抗がん剤である免疫チェックポイント阻害剤は、ハロゲン化キサンテンの最大約１ヶ月前に投与することが可能である。好ましくは、２つの細胞障害性抗がん剤を一緒に投与するか、または第２の細胞障害性抗がん剤である免疫チェックポイント阻害剤をハロゲン化キサンテンの投与後数日以内に投与する。第２の細胞障害性抗がん剤である免疫チェックポイント阻害剤は、ハロゲン化キサンテンの投与から約１ヶ月後に投与することも可能である。

【0084】

結果
ＰＶ－１０で処理を行った、原発性または再発小児白血病患者由来の市販の白血病細胞株１１種（表１）と、原発性白血病サンプル２種（表２）とからなるパネルを用いて実施された、予備的なインビトロ細胞培養生存率アッセイの結果を示す。

【0085】

細胞生存率は、処理の９６時間後にアラマーブルーアッセイによって測定した。ＰＶ－１０は、試験を行った小児白血病細胞株１１種（平均ＩＣ_５０値９２．８μＭ）および原発性白血病サンプル３種（平均ＩＣ_５０値１２２．５μＭ）において、濃度および時間依存的にがん細胞の生存率を低下させた。その結果、ＰＶ－１０は白血病細胞株に対して平均ＩＣ_５０値９２．８μＭで細胞毒性を示し（下記表１）、原発性白血病サンプル２種に対して平均ＩＣ_５０値１２２．５μＭで細胞毒性を示す（下記表２）ことが分かった。

【0086】

【表2】

【0087】

【表3】

【0088】

４種類の白血病細胞株（Ｍｏｌｍ－１３、ＭＶ４－１１、ＳＥＭ、ＴＩＢ－２０２）を位相差顕微鏡法およびタイムラプスビデオ顕微鏡法により観察した結果、ＰＶ－１０はがん細胞に対して細胞毒性であるとともに、がん細胞に対する細胞増殖抑制効果は有さないことが示された。タイムラプスビデオ顕微鏡実験に基づいて死細胞を定量化したところ、ＰＶ－１０は細胞株に対して濃度依存的に細胞毒性を示すことが明らかとなった。

【0089】

１００μＭのＰＶ－１０で処理した場合、処理後２４時間時点で、ＭＶ４－１１細胞の８８％、Ｍｏｌｍ－１３細胞の６９％、ＴＩＢ－２０２細胞の２７％、ＳＥＭ細胞の２５％が細胞死を起こしていた。ＰＶ－１０の濃度を２００μＭに上げた場合、処理後２４時間時点で、ＭＶ４－１１細胞およびＭｏｌｍ１３細胞の１００％、ＳＥＭ細胞の９４％、ＴＩＢ－２０２細胞の６０％が細胞死を起こしていた。

【0090】

さらに、タイムラプスビデオ顕微鏡法による観察では、ＰＶ－１０処理により細胞が収縮したことから、アポトーシスによる細胞の死滅が示唆された。ＰＶ－１０によるアポトーシスの誘導は、ウェスタンブロットで検出された用量および時間依存的なＰＡＲＰの切断によって立証された。［非特許文献３４］

【0091】

これらの研究は、小児白血病におけるＰＶ－１０の効果と作用機序について、前臨床データとして最初の証拠を提供している。これらのデータは、再発・難治性小児白血病患者を対象とした追加の研究および初期臨床試験の策定の根拠を提供している。

【0092】

方法
原発性または再発小児白血病患者由来の細胞株１１種（ＣＥＭ－Ｃ１、ＣＣＲＦ－ＳＢ、Ｋａｓｕｍｉ－１、ＫＯＰＮ８、Ｍｏｌｍ－１３、Ｍｏｌｔ－３、Ｍｏｌｔ－４、ＭＶ４－１１、ＳＥＭ、ＳＵＰ－Ｂ１５、およびＴＩＢ－２０２）と、原発性白血病患者検体３種の細胞（Ｔ－ＡＬＬ、ＡＭＬ、乳児ＡＭＬ）とからなるパネルに対し、濃度を高めながらＰＶ－１０での処理を行い、処理の９６時間後にアラマーブルーアッセイで細胞生存率を測定した。標的の調節と細胞死経路の誘導については、ウェスタンブロット、位相差顕微鏡法、およびタイムラプスビデオ顕微鏡法にて調査を行った。

【0093】

細胞周期の変化の解析およびアポトーシスの誘導は、フローサイトメトリによって測定を行った。ＰＶ－１０と相乗効果のある抗がん剤を特定するためには、併用試験が行われ、小児白血病に対するＰＶ－１０の効果をインビボで特定するためには、小児白血病の動物モデルが使用される。

【0094】

先行研究
先行研究により、先に述べたハロゲン化キサンテン化合物は、がん性腫瘍細胞に対して、ＲＢと同様の結果をもたらすことが示されている。

【0095】

先行研究の手順
Ａ．１×１０^４細胞／ｍＬをＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が治療可能な体積まで増殖するのに２～３週間を要した。
Ｂ．２０μＬから４０μＬのハロゲン化キサンテン溶液（０．０１、０．００１、または０．１％ｗ／ｖ）を、腫瘍に完全に浸潤するまで注射した。薬剤が注入されるにつれて腫瘍が赤色に変化していくのを確認することができた。
Ｃ．注射の２４時間後、腫瘍にレーザを照射した。レーザ：Ｃｏｈｅｒｅｎｔ社製、Ｖｅｒｄｉ ５Ｗ、５３２ｎｍ ＣＷレーザ、２００ｍＷ／ｃｍ^２、１００Ｊ／ｃｍ^２、処理領域：４ｃｍ^２。

【0096】

Ｄ．バイオアッセイによる特異性の確認：照射後に痂皮および体積減少が認められることによって明示される、腫瘍に限局した光力学的損傷の存在を確認することにより、腫瘍内注射から２４時間後の腫瘍における薬剤の保色性を判断した。また、原発部位における腫瘍の再発の有無を記録した。
Ｅ．蛍光による特異性の確認：ＣＷレーザで励起された腫瘍内のハロゲン化キサンテン剤の蛍光を目視で観察することにより、腫瘍内送達から２４時間後の腫瘍内における化合物の保持を確認した。５３２ｎｍの励起波長は、メレスグリオ社製フィルタ（部品番号：０３ ＦＩＭ ００８）を用いて除去した。化合物の蛍光は、オリンパス株式会社（登録商標）製デジタルカメラ（型番：０－３００－Ｌ）を用いて記録した。

【0097】

結果

【0098】

【表4】

【0099】

本明細書で引用した特許、特許出願、および論文の各々は、参照により組み込まれる。冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書において、その冠詞の文法的対象の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。本明細書で引用した特許、特許出願、および論文の各々は、参照により組み込まれる。

【0100】

前述の説明および実施例は、例示を目的としたものであり、限定として解釈されるべきではない。本発明の主旨および範囲内でさらに他の変更が可能であり、当業者はこれらの変更に容易に想到するであろう。