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特許7529284ＲＮＡのキャッピング方法、修飾ＲＮＡの製造方法、及び修飾ＲＮＡ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-29
(45)【発行日】2024-08-06
(54)【発明の名称】ＲＮＡのキャッピング方法、修飾ＲＮＡの製造方法、及び修飾ＲＮＡ
(51)【国際特許分類】
C12P 19/34 20060101AFI20240730BHJP
C07H 21/02 20060101ALI20240730BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20240730BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20240730BHJP
【ＦＩ】
C12P19/34 A
C07H21/02
C12N15/10 Z ZNA
C12N9/10
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2021512300
(86)(22)【出願日】2020-04-02
(86)【国際出願番号】 JP2020015168
(87)【国際公開番号】W WO2020204130
(87)【国際公開日】2020-10-08
【審査請求日】2023-03-07
(31)【優先権主張番号】P 2019073163
(32)【優先日】2019-04-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(74)【代理人】
【識別番号】100154852
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 太一
(74)【代理人】
【識別番号】100140774
【弁理士】
【氏名又は名称】大浪 一徳
(72)【発明者】
【氏名】齊藤 博英
(72)【発明者】
【氏名】大野 博久
(72)【発明者】
【氏名】赤峰 冴
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５２３７７７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５３５４３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５０００３４（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１７５１２９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】WARMINSKI, M., et al.，Applications of phosphate modification and labeling to study (m)RNA caps.，Topics in Current Chemistry，2017年，Vol.375:16，pp.1-29
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素の存在下で、下記一般式（１）で表される化合物（１）（但し、ＧＴＰを除く）と、ＲＮＡと、を反応させる工程（ａ）と、
前記ＲＮＡの３’末端に、下記一般式（Ａｋ－１）で表される化合物（Ａｋ－１）を結合させる工程（ｃ１）と、を含む、
修飾ＲＮＡの製造方法。
【化1】
【化2】
【請求項2】
前記工程（ａ）及び前記工程（ｃ１）の後、さらに、前記工程（ａ）により前記ＲＮＡの５’末端に導入されたアジド基と、前記工程（ｃ１）により前記ＲＮＡの３’末端に導入されたアルキニル基とを反応させて、環状ＲＮＡを生成する工程（ｄ１）を含む、
請求項１に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
【請求項3】
前記化合物（１）が、２’－アジド－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸、又は３’－アジド－２’，３’－ジデオキシグアノシン－５’－三リン酸である、請求項１又は２に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
【請求項4】
ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素の存在下で、下記一般式（１）で表される化合物（１）（但し、ＧＴＰを除く）と、ＲＮＡと、を反応させる工程（ａ）と、
前記ＲＮＡの３’末端に、下記一般式（Ａｚ－１）で表される化合物（Ａｚ－１）を結合させる工程（ｃ２）を含む、
修飾ＲＮＡの製造方法。
【化3】
【化4】
【請求項5】
前記工程（ａ）及び（ｃ２）の後、さらに、前記工程（ａ）により前記ＲＮＡの５’末端に導入されたアルキニル基と、前記工程（ｃ２）により前記ＲＮＡの３’末端に導入されたアジド基とを反応させて、環状ＲＮＡを生成する工程（ｄ２）を含む、
請求項４に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
【請求項6】
前記化合物（１）が、３’－（Ｏ－プロパギル）－グアノシン－５’－三リン酸である、請求項４又は５に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
【請求項7】
下記式（Ｃｉ－１）～（Ｃｉ－３）からなる群より選択される構造を含む、環状修飾ＲＮＡ。【化5】
【化6】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＲＮＡのキャッピング方法、修飾ＲＮＡの製造方法、及び修飾ＲＮＡに関する。
本願は、２０１９年４月５日に、日本に出願された特願２０１９－７３１６３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１９年４月５日に、日本に出願された特願２０１９－７３１６３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
人工ｍＲＮＡは、原理上ゲノムＤＮＡへ組み込まれる可能性が低いため、安全な遺伝子担体として、遺伝子治療及び分化細胞の初期化等の臨床研究及び生物学研究における遺伝子導入法として利用が期待されている。しかし、ＲＮＡは不安定な分子であるため、効果及び持続時間は限定的である。
【0003】
人工ｍＲＮＡには、翻訳の開始と分解の抑制をつかさどる、５’キャップと呼ばれる構造が必要である。この５’キャップに化学的な修飾を導入することで、分解酵素に対する抵抗性を高めたり、翻訳開始因子との親和性を向上させて翻訳活性を高めたりする試みが行われてきた（例えば、非特許文献１、２）。
しかしながら、非特許文献１及び２に記載の方法では、導入したい修飾ごとに、修飾されたキャップ構造を有するジヌクレオチドを化学的に合成する必要がある。また、試験管内転写反応による合成の際には、ＲＮＡ転写開始点に取り込ませる時にＧＴＰとの競合が起こるため、ＧＴＰ量を減らす必要がある。そのため、得られるＲＮＡ量が低下したり、修飾キャップを有さないＲＮＡが一定量生成されたりする、という問題がある。
上記の方法によりアジド基やアミノ基を５’キャップ部位に有するＲＮＡを作製し、それらの官能基特異的な化学反応によって、さらなる修飾を導入する方法も報告されているが（非特許文献３、４）、上記の問題点は解決されていない。
しかしながら、非特許文献１及び２に記載の方法では、導入したい修飾ごとに、修飾されたキャップ構造を有するジヌクレオチドを化学的に合成する必要がある。また、試験管内転写反応による合成の際には、ＲＮＡ転写開始点に取り込ませる時にＧＴＰとの競合が起こるため、ＧＴＰ量を減らす必要がある。そのため、得られるＲＮＡ量が低下したり、修飾キャップを有さないＲＮＡが一定量生成されたりする、という問題がある。
上記の方法によりアジド基やアミノ基を５’キャップ部位に有するＲＮＡを作製し、それらの官能基特異的な化学反応によって、さらなる修飾を導入する方法も報告されているが（非特許文献３、４）、上記の問題点は解決されていない。
【0004】
また、メチル基転移酵素とメチル基供与体（ＳＡＭ）の修飾アナログを利用して、５’キャップのグアニン塩基に化学修飾を導入する方法も報告されている（非特許文献５）。しかしながら、メチル基転移酵素及びＳＡＭアナログの準備が必要であること、メチル基転移酵素の基質特異性のため導入できる修飾が限られること、翻訳活性が低下する場合が多いこと等の多くの問題があり、一般的な修飾キャップＲＮＡ合成法とはなりえていない。
【0005】
また、クロレラウイルスＰＢＣＶに由来するキャッピング酵素を用いてＧＴＰアナログをＲＮＡの５’キャップに導入した例も報告されている（非特許文献６）。しかしながら、５’キャップに導入できない修飾ＧＴＰも多く、導入できたＧＴＰアナログについても導入効率は高くなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Stepinski J et al., Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl (3'-deoxy)GpppG. RNA(2001) 7:1486-95.
【文献】Grudzien-Nogalska E et al., Synthetic mRNAs with superior translation and stability properties. Methods Mol Biol(2013) 969:55-72.
【文献】Mamot A et al., Azido-Functionalized 5' Cap Analogues for the Preparation of Translationally Active mRNAs Suitable for Fluorescent Labeling in Living Cells. Angew Chem Int Ed Engl(2017) 56(49):15628-32.
【文献】Warminski M et al., Amino-Functionalized 5' Cap Analogs as Tools for Site-Specific Sequence-Independent Labeling of mRNA. Bioconjug Chem(2017) 28(7):1978-92.
【文献】Muttach F1, et al., Chemo-enzymatic modification of eukaryotic mRNA. Org Biomol Chem(2017) 15(2):278-84.
【文献】Issur M et al., Enzymatic synthesis of RNAs capped with nucleotide analogues reveals the molecular basis for substrate selectivity of RNA capping enzyme: impacts on RNA metabolism. PLoS One (2013) 8(9):e75310.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上記のように、ＲＮＡの５’キャップ部位に修飾を導入する従来の方法では、導入可能な修飾の種類が限られており、修飾の導入効率も高くない等の問題がある。さらに、５’キャップ部位に修飾を導入するための準備及び操作が煩雑である場合が多い。
そこで、本発明は、簡易に、種々の修飾を５’キャップ部位に導入可能なＲＮＡのキャッピング方法、前記キャッピング方法を利用した修飾ＲＮＡの製造方法、及び前記修飾ＲＮＡの製造方法により製造された新規修飾ＲＮＡを提供することを課題とする。
そこで、本発明は、簡易に、種々の修飾を５’キャップ部位に導入可能なＲＮＡのキャッピング方法、前記キャッピング方法を利用した修飾ＲＮＡの製造方法、及び前記修飾ＲＮＡの製造方法により製造された新規修飾ＲＮＡを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は以下の態様を含む。
［１］ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素の存在下で、下記一般式（１）で表される化合物（１）（但し、ＧＴＰを除く）と、ＲＮＡと、を反応させる工程を含む、ＲＮＡのキャッピング方法。
［１］ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素の存在下で、下記一般式（１）で表される化合物（１）（但し、ＧＴＰを除く）と、ＲＮＡと、を反応させる工程を含む、ＲＮＡのキャッピング方法。
【0009】
【化1】
［２］前記化合物（１）が、Ｎ７－メチルグアノシン－５’－三リン酸、Ｎ１－メチルグアノシン－５’－三リン酸、Ｏ６－メチルグアノシン－５’－三リン酸、６－クロログアノシン－５’－三リン酸、イノシン－５’－三リン酸、２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸、アラグアノシン－５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチルグアノシン－５’－三リン酸、３’－Ｏ－メチルグアノシン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシグアノシン－５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシグアノシン－５’－三リン酸、３’－（Ｏ－プロパギル）－グアノシン－５’－三リン酸、２’／３’－Ｏ－（２－アミノエチル－カルバモイル）－グアノシン－５’－三リン酸、及びグアノシン―５’－Ｏ－（１－チオ三リン酸）からなる群より選択される、［１］に記載のキャッピング方法。
［３］ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素の存在下で、下記一般式（１）で表される化合物（１）（但し、ＧＴＰを除く）と、ＲＮＡと、を反応させる工程（ａ）を含む、修飾ＲＮＡの製造方法。
【0010】
【化2】
［４］前記化合物（１）が、Ｎ７－メチルグアノシン－５’－三リン酸、Ｎ１－メチルグアノシン－５’－三リン酸、Ｏ６－メチルグアノシン－５’－三リン酸、６－クロログアノシン－５’－三リン酸、イノシン－５’－三リン酸、２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸、アラグアノシン－５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチルグアノシン－５’－三リン酸、３’－Ｏ－メチルグアノシン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシグアノシン－５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシグアノシン－５’－三リン酸、３’－（Ｏ－プロパギル）－グアノシン－５’－三リン酸、２’／３’－Ｏ－（２－アミノエチル－カルバモイル）－グアノシン－５’－三リン酸、及びグアノシン―５’－Ｏ－（１－チオ三リン酸）からなる群より選択される、［３］に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
［５］前記一般式（１）中のＲｒ１又はＲｒ２が、アジド基であり、前記工程（ａ）の後、さらにアルキン化合物を反応させる工程（ｂ１）を含む、［３］に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
［６］前記化合物（１）が、２’－アジド－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸、又は３’－アジド－２’，３’－ジデオキシグアノシン－５’－三リン酸である、［５］に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
［７］前記アルキン化合物が機能性基を含む、［５］又は［６］に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
［８］前記一般式（１）中のＲｒ１又はＲｒ２が、－ＯＲ１Ｃ≡ＣＨであり、前記工程（ａ）の後、さらにアジド化合物を反応させる工程（ｂ２）を含む、［３］に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
［９］前記化合物（１）が、３’－（Ｏ－プロパギル）－グアノシン－５’－三リン酸である、［８］に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
［１０］前記アジド化合物が機能性基を含む、［８］又は［９］に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
［１１］前記一般式（１）中のＲｒ１又はＲｒ２が、アジド基であり、さらに、前記ＲＮＡの３’末端に、下記一般式（Ａｋ－１）で表される化合物（Ａｋ－１）を結合させる工程（ｃ１）を含む、［３］に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
【0011】
【化3】
［１２］前記工程（ａ）及び前記工程（ｃ１）の後、さらに、前記工程（ａ）により前記ＲＮＡの５’末端に導入されたアジド基と、前記工程（ｃ１）により前記ＲＮＡの３’末端に導入されたアルキニル基とを反応させて、環状ＲＮＡを生成する工程（ｄ１）を含む、［１１］に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
［１３］前記化合物（１）が、２’－アジド－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸、又は３’－アジド－２’，３’－ジデオキシグアノシン－５’－三リン酸である、［１１］又は［１２］に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
［１４］前記一般式（１）中のＲｒ１又はＲｒ２が、－ＯＲ１Ｃ≡ＣＨであり、
さらに、前記ＲＮＡの３’末端に、下記一般式（Ａｚ－１）で表される化合物（Ａｚ－１）を結合させる工程（ｃ２）を含む、［３］に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
【0012】
【化4】
［１５］前記工程（ａ）及び（ｃ２）の後、さらに、前記工程（ａ）により前記ＲＮＡの５’末端に導入されたアルキニル基と、前記工程（ｃ２）により前記ＲＮＡの３’末端に導入されたアジド基とを反応させて、環状ＲＮＡを生成する工程（ｄ２）を含む、［１４］に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
［１６］前記化合物（１）が、３’－（Ｏ－プロパギル）－グアノシン－５’－三リン酸である、［１４］又は［１５］に記載の修飾ＲＮＡの製造方法。
［１７］下記式（Ｃｐ－１）～（Ｃｐ－１３）からなる群より選択される構造を５’末端に有する、修飾ＲＮＡ。
【0013】
【化5】
【0014】
【化6】
【0015】
【化7】
［１８］下記式（Ｃａ－１）～（Ｃａ－３）からなる群より選択される構造を５’末端に有する、修飾ＲＮＡ。
【0016】
【化8】
［各式中、ｍ７Ｇは、Ｎ７－メチルグアニンを表し；＊は、隣接するヌクレオチド残基の５’位の炭素原子に結合する結合手を表す。Ｒａ１およびＲａ２は、それぞれ独立に、水素原子又は有機基を表す。但し、Ｒａ１及びＲａ２の少なくとも１つは有機基である。Ｒａ１及びＲａ２の両方が有機基である場合、それらは相互に結合して環構造を形成してもよい。Ｒａ３は有機基を表す。］
［１９］下記式（Ｃｉ－１）～（Ｃｉ－３）からなる群より選択される構造を含む、環状修飾ＲＮＡ。
【0017】
【化9】
【0018】
【化10】
［式中、ｍ７Ｇは、Ｎ７－メチルグアニンを表し；Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して、２価の連結基を表し；Ｂａｓｅは、それぞれ独立して、ヌクレオチド塩基を表し、＊は、隣接するヌクレオチド残基の５’位の炭素原子に結合する結合手を表し、＊＊は、隣接するヌクレオチド残基の３’位の炭素原子に結合する結合手を表す。］
【発明の効果】
【0019】
本発明によれば、簡易に、種々の修飾を５’キャップ部位に導入可能なＲＮＡのキャッピング方法、前記キャッピング方法を利用した修飾ＲＮＡの製造方法、及び前記修飾ＲＮＡの製造方法により製造された新規修飾ＲＮＡが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ＶＣＥ（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｐｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）を用いた、ＧＴＰによるＲＮＡのキャッピング反応を示す。ＶＣＥが転写産物の５’末端にＧＴＰ（上）を付加し、グアニンの７位にＳＡＭ（Ｓ－ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）のメチル基を転移させることで、ｍ７Ｇ（Ｎ７－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ）キャップを有するＲＮＡが生じる。
【図2】実施例で使用したＧＴＰアナログの修飾部位を示す。修飾部位に応じて、「Ｂａｓｅ」、「Ｒｉｂｏｓｅ」、「Ｂａｓｅ ａｎｄ ｒｉｂｏｓｅ」及び「Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ」に分類した。図２では、修飾部位の構造のみ示した。
【図3】実施例１において、各ＧＴＰアナログのキャッピング効率を評価した結果を示す図である。各ＧＴＰアナログのキャッピング効率は、ＧＴＰアナログが付加したＲＮＡの量と未反応ＲＮＡの量から算出した。
【図4】図３でキャッピング効率の低かったＧＴＰアナログについて、ＧＴＰアナログの濃度を２倍に、又はＧＴＰアナログ及びＶＣＥの濃度を２倍にしてキャッピング反応を行ったときの各ＧＴＰアナログのキャッピング効率を示す図である。
【図5A】実施例２において、各ＧＴＰアナログでキャップしたｍＲＮＡの細胞内での翻訳活性を評価した結果を示す。各ＧＴＰアナログでキャップしたｍＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡画像（スケールバー：２００μｍ）である。
【図5B】実施例２において、各ＧＴＰアナログでキャップしたｍＲＮＡのＨｅＬａ細胞内での翻訳活性を評価した結果を示す。トランスフェクションコントロールとして共導入した赤色蛍光タンパク質ｉＲＦＰ６７０を発現している細胞について、フローサイトメーターで測定したＡｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ蛍光レベルの平均値を、同様に求めたｉＲＦＰ６７０の発現レベルで補正した。
【図6A】実施例２において、各ＧＴＰアナログでキャップしたｍＲＮＡの細胞内での翻訳活性を評価した結果を示す。各ＧＴＰアナログでキャップしたｍＲＮＡをトランスフェクションした２９３ＦＴ細胞の蛍光顕微鏡画像（スケールバー：２００μｍ）である。
【図6B】実施例２において、各ＧＴＰアナログでキャップしたｍＲＮＡの２９３ＦＴ細胞内での翻訳活性を評価した結果を示す。トランスフェクションコントロールとして共導入した赤色蛍光タンパク質ｉＲＦＰ６７０を発現している細胞について、フローサイトメーターで測定したＡｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ蛍光レベルの平均値を、同様に求めたｉＲＦＰ６７０の発現レベルで補正した。
【図7】実施例３で用いた、ＤＢＣＯ－ｂｉｏｔｉｎ及びＤＢＣＯ－ＡＦ６４７の化学構造式を示す。
【図8】ＳＰＡＡＣ反応を利用して、アジド基を有するキャップをＤＢＣＯ－ｄｙｅ／ｂｉｏｔｉｎで修飾する反応のスキームを示す図である。
【図9】実施例３において、アジド基をキャップに有するＲＮＡに、ＳＰＡＡＣ反応によりＤＢＣＯ－ｄｙｅ／ｂｉｏｔｉｎを導入した結果を示す図である。
【図10】実施例３で作製したｍＲＮＡのアジド基を有するキャップに、ＤＢＣＯ－ＡＦ６４７が導入されたことを示す、変性ＰＡＧＥのゲル写真である。
【図11】実施例３において、ＡＦ６４７標識ｍＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の共焦点蛍光顕微鏡画像である。左端は明視野画像、その右の３列は、それぞれ、核（Ｈｏｅｃｈｓｔによる染色）、Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ（緑色蛍光タンパク質）、及びＡＦ６４７（赤色蛍光色素）の蛍光を観察したものである。図中、「Ｍｏｃｋ」はＲＮＡなしでトランスフェクション処理したものを示し、「Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ」はトランスフェクション処理を行っていないものを示す。
【図12】実施例４における環状ＲＮＡ生成のスキームを説明する図である。
【図13】実施例４における変性ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本明細書及び本特許請求の範囲において、化学式で表される構造によっては、不斉炭素が存在し、エナンチオ異性体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）やジアステレオ異性体（ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒ）が存在し得るものがある。その場合は一つの化学式でそれら異性体を代表して表す。それらの異性体は単独で用いてもよいし、混合物として用いてもよい。
【0022】
［ＲＮＡのキャッピング方法］
１態様において、本発明は、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素の存在下で、下記一般式（１）で表される化合物（１）（但し、ＧＴＰを除く）と、ＲＮＡと、を反応させる工程を含む、ＲＮＡのキャッピング方法を提供する。
１態様において、本発明は、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素の存在下で、下記一般式（１）で表される化合物（１）（但し、ＧＴＰを除く）と、ＲＮＡと、を反応させる工程を含む、ＲＮＡのキャッピング方法を提供する。
【0023】
【化11】
「式中、Ｒｂ１は、オキソ基、炭素数１～３のアルコキシ基、又はハロゲン原子を表し；Ｒｂ２は、存在しないか、又は炭素数１～３のアルキル基を表し；Ｒｂ３は、アミノ基又は水素原子を表し；Ｒｂ４は、存在しないか、水素原子、又は炭素数１～３のアルキル基を表し；Ｒｒ１は、ヒドロキシ基、炭素数１～３のアルコキシ基、アミノ基、アジド基、－ＯＲ１Ｃ≡ＣＨ、又は－Ｒ２Ｒ３を表し；Ｒｒ２は、水素原子、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、炭素数１～３のアルコキシ基、アミノ基、アジド基、－ＯＲ１Ｃ≡ＣＨ、又は－Ｒ２Ｒ３を表し；Ａ１は、酸素原子又は硫黄原子を表す。Ｒ１は炭素数１～３のアルキレン基を表し、Ｒ２は－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－、－Ｏ－又は単結合を表し；Ｒ３は炭素数１～３のアミノアルキル基を表す。実線及び点線からなる二重線は、単結合又は二重結合を表す。」
【0024】
本態様にかかるキャッピング方法では、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を用いて、キャッピング反応を行う。後述の実施例で示されるように、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素は、幅広い範囲のＧＴＰアナログに適用可能であり、種々の修飾をＲＮＡのキャップ部位に導入することができる。キャップ部位の構造は、ＲＮＡの安定性、及び翻訳活性等に影響する。そのため、本態様にかかるキャッピング方法によりＲＮＡのキャッピングを行うことにより、安定性及び翻訳活性の異なる種々のＲＮＡを得ることができる。
【0025】
＜ワクシニアウイルスのキャッピング酵素：ＶＣＥ＞
「ワクシニアウイルスのキャッピング酵素」とは、ワクシニアウイルスが有するキャッピング酵素である（Martin SA, et al., J Biol Chem (1976) 251(23):7313-7321.; Fuchs AL, et al., RNA (2016) 22(9):1454-1466.）。キャッピング酵素は、ＲＮＡの５’末端にキャップを付加することのできる酵素である。キャップは、ＲＮＡの５’末端に三リン酸結合を介してグアノシン又はグアノシン誘導体が結合した構造をしており、細胞内でのＲＮＡの安定化や翻訳開始などに関与している。ワクシニアウイルスのキャッピング酵素は、大サブユニット（Ｇｅｎｅ ＩＤ：３７０７５６２）及び小サブユニット（Ｇｅｎｅ ＩＤ：３７０７５１５）の２つのサブユニットから構成されている。
「ワクシニアウイルスのキャッピング酵素」とは、ワクシニアウイルスが有するキャッピング酵素である（Martin SA, et al., J Biol Chem (1976) 251(23):7313-7321.; Fuchs AL, et al., RNA (2016) 22(9):1454-1466.）。キャッピング酵素は、ＲＮＡの５’末端にキャップを付加することのできる酵素である。キャップは、ＲＮＡの５’末端に三リン酸結合を介してグアノシン又はグアノシン誘導体が結合した構造をしており、細胞内でのＲＮＡの安定化や翻訳開始などに関与している。ワクシニアウイルスのキャッピング酵素は、大サブユニット（Ｇｅｎｅ ＩＤ：３７０７５６２）及び小サブユニット（Ｇｅｎｅ ＩＤ：３７０７５１５）の２つのサブユニットから構成されている。
【0026】
図１は、キャッピング酵素によるＲＮＡのキャッピング反応を模式的に示した図である。キャッピング酵素の存在下で、ＲＮＡにＧＴＰを反応させると、ＧＴＰからＲＮＡの５’末端にＧＭＰが転移して結合するとともに、ピロリン酸（ＰＰｉ）が分離する。さらに、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）からグアニン塩基の７位の窒素原子にメチル基が転移して、Ｎ７－メチルグアニン（ｍ７Ｇ）の塩基を含むキャップがＲＮＡの５’末端に形成される。図１において、ＧＴＰに替えて、ＧＴＰアナログ（修飾ＧＴＰ）を用いることにより、種々の構造を有するキャップをＲＮＡの５’末端に導入することができる。
【0027】
ワクシニアウイルスのキャッピング酵素は、公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから配列情報を取得することができる。ワクシニアウイルスのキャッピング酵素遺伝子の大サブユニット及び小サブユニットの塩基配列としては、例えば、配列番号２及び配列番号４に記載の配列がそれぞれ挙げられる。また、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素の大サブユニット及び小サブユニットのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号３（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＹＰ＿２３２９８８．１）及び配列番号５（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＹＰ＿２３２９９９．１）に記載の配列がそれぞれ挙げられる。例えば、当該配列情報に基づいて、適切なプライマーを設計し、ワクシニアウイルスのＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等を行うことにより、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素遺伝子を得ることができる。さらに、当該酵素遺伝子を適切な細胞に導入して発現させ、当該細胞から公知の酵素精製手段を用いて精製することにより、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を得ることができる。酵素遺伝子からのキャッピング酵素の合成には、無細胞タンパク質合成系を用いてもよい。
また、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素は、市販品を用いてもよい。市販品としては、例えば、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）が挙げられる。
また、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素は、市販品を用いてもよい。市販品としては、例えば、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）が挙げられる。
【0028】
以下、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を「ＶＣＥ」と記載することがある。
【0029】
＜化合物（１）＞
化合物（１）は、上記一般式（１）で表される化合物である。本態様にかかるキャッピング方法において、化合物（１）は、ＧＴＰに替えて用いられるものであり、ＲＮＡの５’末端にキャップとして導入される。上記一般式（１）で表される化合物は、ＧＴＰを包含するが、ＧＴＰは化合物（１）から除かれる。すなわち、一般式（１）において、Ｒｂ１がオキソ基、Ｒｂ２が存在せず、Ｒｂ３がアミノ基、Ｒｂ４が水素原子、Ｒｒ１がヒドロキシ基、Ｒｒ２がヒドロキシ基、且つＡ’が酸素原子である組合せとなることはない。
化合物（１）は、上記一般式（１）で表される化合物である。本態様にかかるキャッピング方法において、化合物（１）は、ＧＴＰに替えて用いられるものであり、ＲＮＡの５’末端にキャップとして導入される。上記一般式（１）で表される化合物は、ＧＴＰを包含するが、ＧＴＰは化合物（１）から除かれる。すなわち、一般式（１）において、Ｒｂ１がオキソ基、Ｒｂ２が存在せず、Ｒｂ３がアミノ基、Ｒｂ４が水素原子、Ｒｒ１がヒドロキシ基、Ｒｒ２がヒドロキシ基、且つＡ’が酸素原子である組合せとなることはない。
【0030】
上記一般式（１）中、Ｒｂ１は、オキソ基、炭素数１～３のアルコキシ基、又はハロゲン原子を表す。前記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられ、中でも、塩素原子が好ましい。前記炭素数１～３のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、及びプロポキシ基が挙げられ、メトキシ基又はエトキシ基が好ましく、メトキシ基がより好ましい。
上記一般式（１）中、Ｒｂ２は、存在しないか、又は炭素数１～３のアルキル基を表す。前記炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、及びプロピル基が挙げられ、メチル基又はエチル基が好ましく、メチル基がより好ましい。Ｒｂ２が炭素数１～３のアルキル基となる場合、一般式（１）中のＲｂ２が結合する窒素原子は正電荷を帯びる。
上記一般式（１）中、Ｒｂ３は、アミノ基又は水素原子を表す。
上記一般式（１）中、Ｒｂ４は、存在しないか、水素原子、又は炭素数１～３のアルキル基を表す。前記炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、及びプロピル基が挙げられ、メチル基又はエチル基が好ましく、メチル基がより好ましい。
上記一般式（１）中、Ｒｂ２は、存在しないか、又は炭素数１～３のアルキル基を表す。前記炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、及びプロピル基が挙げられ、メチル基又はエチル基が好ましく、メチル基がより好ましい。Ｒｂ２が炭素数１～３のアルキル基となる場合、一般式（１）中のＲｂ２が結合する窒素原子は正電荷を帯びる。
上記一般式（１）中、Ｒｂ３は、アミノ基又は水素原子を表す。
上記一般式（１）中、Ｒｂ４は、存在しないか、水素原子、又は炭素数１～３のアルキル基を表す。前記炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、及びプロピル基が挙げられ、メチル基又はエチル基が好ましく、メチル基がより好ましい。
【0031】
上記一般式（１）中、Ｒｒ１は、ヒドロキシ基、炭素数１～３のアルコキシ基、アミノ基、アジド基、－ＯＲ１Ｃ≡ＣＨ、又は－Ｒ２Ｒ３を表す。
前記炭素数１～３のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、及びプロポキシ基が挙げられ、メトキシ基又はエトキシ基が好ましく、メトキシ基がより好ましい。
前記－ＯＲ１Ｃ≡ＣＨ中のＲ１は、炭素数１～３のアルキレン基を表す。前記炭素数１～３のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、及びプロピレン基が挙げられ、メチレン基又はエチレン基が好ましく、メチレン基がより好ましい。
前記－Ｒ２Ｒ３中のＲ２は、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－、－Ｏ－又は単結合を表す。Ｒ２は、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－又は単結合が好ましく、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－がより好ましい。前記－Ｒ２Ｒ３中のＲ３は、炭素数１～３のアミノアルキル基を表す。前記炭素数１～３アミノアルキル基としては、アミノメチル基、アミノエチル基、及びアミノプロピル基が挙げられ、アミノメチル基又はアミノエチル基が好ましく、アミノエチル基がより好ましい。－Ｒ２Ｒ３は、アミノエチルカルバモイルオキシ基であることが特に好ましい。
前記炭素数１～３のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、及びプロポキシ基が挙げられ、メトキシ基又はエトキシ基が好ましく、メトキシ基がより好ましい。
前記－ＯＲ１Ｃ≡ＣＨ中のＲ１は、炭素数１～３のアルキレン基を表す。前記炭素数１～３のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、及びプロピレン基が挙げられ、メチレン基又はエチレン基が好ましく、メチレン基がより好ましい。
前記－Ｒ２Ｒ３中のＲ２は、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－、－Ｏ－又は単結合を表す。Ｒ２は、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－又は単結合が好ましく、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－がより好ましい。前記－Ｒ２Ｒ３中のＲ３は、炭素数１～３のアミノアルキル基を表す。前記炭素数１～３アミノアルキル基としては、アミノメチル基、アミノエチル基、及びアミノプロピル基が挙げられ、アミノメチル基又はアミノエチル基が好ましく、アミノエチル基がより好ましい。－Ｒ２Ｒ３は、アミノエチルカルバモイルオキシ基であることが特に好ましい。
【0032】
上記一般式（１）中、Ｒｒ２は、水素原子、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、炭素数１～３のアルコキシ基、アミノ基、アジド基、－ＯＲ１Ｃ≡ＣＨ、又は－Ｒ２Ｒ３を表す。前記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられ、中でも、フッ素原子が好ましい。－ＯＲ１Ｃ≡ＣＨ中のＲ１は、上記と同様である。Ｒ２Ｒ３中のＲ２及びＲ３は、それぞれ上記と同様である。
上記一般式（１）中、Ａ１は、酸素原子又は硫黄原子を表す。
上記一般式（１）中、実線及び点線からなる二重線は、単結合又は二重結合を表す。
上記一般式（１）中、Ａ１は、酸素原子又は硫黄原子を表す。
上記一般式（１）中、実線及び点線からなる二重線は、単結合又は二重結合を表す。
【0033】
一般式（１）中の塩基部分をＢａｓｅ、糖部分をＳｕｇａｒとして表すと、化合物（１）は、下記一般式（１’）で表すことができる。
【0034】
【化12】
【0035】
前記一般式（１’）中のＢａｓｅの具体例としては、以下の式（Ｂ－１）～（Ｂ－５）のいずれかで表される塩基が挙げられる。式中、＊は、式（１’）中のＳｕｇａｒに結合する結合手を表す。
【0036】
【化13】
【0037】
前記一般式（１’）中のＳｕｇａｒの具体例としては、以下の式（Ｒ－１）～（Ｒ－１２）のいずれかで表される塩基が挙げられる。式中、＊は、式（１’）中のＢａｓｅに結合する結合手を表す。＊＊は、式（１’）中の酸素原子に結合する結合手を表す。
【0038】
【化14】
【0039】
【化15】
【0040】
化合物（１）の好ましい具体例としては、例えば、Ｎ７－メチルグアノシン－５’－三リン酸（以下、「ｍ７ＧＴＰ」ともいう）、Ｎ１－メチルグアノシン－５’－三リン酸（以下、「ｍ１ＧＴＰ」ともいう）、Ｏ６－メチルグアノシン－５’－三リン酸（以下、「ｍ６ＧＴＰ」ともいう）、６－クロログアノシン－５’－三リン酸（以下、「Ｃｌ６ＧＴＰ」ともいう）、イノシン－５’－三リン酸（以下、「ＩＴＰ」ともいう）、２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸（以下、「ｄＧＴＰ」ともいう）、アラグアノシン－５’－三リン酸（以下、「ａｒａＧＴＰ」ともいう）、２’－フルオロ－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸（以下、「ｆＧＴＰ」ともいう）、２’－Ｏ－メチルグアノシン－５’－三リン酸（以下、「Ｏｍ２’ＧＴＰ」ともいう）、３’－Ｏ－メチルグアノシン－５’－三リン酸（以下、「Ｏｍ３’ＧＴＰ」ともいう）、２’－アミノ－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸（以下、「ＮＨ２
２’ＧＴＰ」ともいう）、３’－アミノ－２’，３’－ジデオキシグアノシン－５’－三リン酸（以下、「ＮＨ２
３’ｄＧＴＰ」ともいう）、２’－アジド－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸（以下、「Ｎ３
２’ＧＴＰ」ともいう）、３’－アジド－２’，３’－ジデオキシグアノシン－５’－三リン酸（以下、「Ｎ３
３’ｄＧＴＰ」ともいう）、３’－（Ｏ－プロパギル）－グアノシン－５’－三リン酸（以下、「Ｏｐｐ３’ＧＴＰ」ともいう）、２’／３’－Ｏ－（２－アミノエチル－カルバモイル）－グアノシン－５’－三リン酸（以下、「ＥＤＡ２’／３’ＧＴＰ」ともいう）、及びグアノシン―５’－Ｏ－（１－チオ三リン酸）（以下、「ＧＴＰαＳ」ともいう）等が挙げられる。ＥＤＡ２’／３’ＧＴＰは、糖の２’位又は３’位がＯ－（２－アミノエチル－カルバモイル）基で置換された化合物の混合物である。
これらの中でも、キャッピング効率の観点からは、ｍ７ＧＴＰ、ｍ１ＧＴＰ、ｍ６ＧＴＰ、Ｃｌ６ＧＴＰ、ｄＧＴＰ、ａｒａＧＴＰ、ｆＧＴＰ、Ｏｍ２’ＧＴＰ、Ｏｍ３’ＧＴＰ、ＮＨ２ ２’ＧＴＰ、ＮＨ２ ３’ｄＧＴＰ、Ｎ３ ２’ＧＴＰ、Ｎ３ ３’ｄＧＴＰ、Ｏｐｐ３’ＧＴＰ、ＥＤＡ２’／３’ＧＴＰ、ＧＴＰαＳが好ましい。
化合物（１）は、市販品を用いることができる。
これらの中でも、キャッピング効率の観点からは、ｍ７ＧＴＰ、ｍ１ＧＴＰ、ｍ６ＧＴＰ、Ｃｌ６ＧＴＰ、ｄＧＴＰ、ａｒａＧＴＰ、ｆＧＴＰ、Ｏｍ２’ＧＴＰ、Ｏｍ３’ＧＴＰ、ＮＨ２ ２’ＧＴＰ、ＮＨ２ ３’ｄＧＴＰ、Ｎ３ ２’ＧＴＰ、Ｎ３ ３’ｄＧＴＰ、Ｏｐｐ３’ＧＴＰ、ＥＤＡ２’／３’ＧＴＰ、ＧＴＰαＳが好ましい。
化合物（１）は、市販品を用いることができる。
【0041】
＜ＲＮＡ＞
ＲＮＡは、特に限定されず、いかなる配列及び鎖長のものであってもよいが、５’末端にキャップを有しないものを用いる。
ＲＮＡは、公知の方法で合成することができる。例えば、ＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロの方法により、鋳型ＤＮＡからｍＲＮＡを転写して得ることができる。この場合、鋳型ＤＮＡには、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが認識し得るプロモーター配列（Ｔ７プロモーター配列）を導入することが好ましい。インビトロＲＮＡ転写系としては、各種市販品（例えば、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ等）が入手可能である。そのため、これらの市販品を用いて鋳型ＤＮＡからＲＮＡを合成してもよい。合成したＲＮＡは、ＤＮａｓｅ処理等でＤＮＡを除去した後、市販のＲＮＡ精製キット（例えば、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）等を用いて精製することができる。
また、短鎖ＲＮＡ（例えば、１００塩基長以下）の場合には、ホスホロアミダイト法等の公知のＲＮＡ合成法により合成してもよい。
ＲＮＡは、特に限定されず、いかなる配列及び鎖長のものであってもよいが、５’末端にキャップを有しないものを用いる。
ＲＮＡは、公知の方法で合成することができる。例えば、ＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロの方法により、鋳型ＤＮＡからｍＲＮＡを転写して得ることができる。この場合、鋳型ＤＮＡには、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが認識し得るプロモーター配列（Ｔ７プロモーター配列）を導入することが好ましい。インビトロＲＮＡ転写系としては、各種市販品（例えば、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ等）が入手可能である。そのため、これらの市販品を用いて鋳型ＤＮＡからＲＮＡを合成してもよい。合成したＲＮＡは、ＤＮａｓｅ処理等でＤＮＡを除去した後、市販のＲＮＡ精製キット（例えば、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）等を用いて精製することができる。
また、短鎖ＲＮＡ（例えば、１００塩基長以下）の場合には、ホスホロアミダイト法等の公知のＲＮＡ合成法により合成してもよい。
【0042】
＜反応工程＞
本態様にかかるキャッピング方法は、ＶＣＥの存在下で、化合物（１）と、ＲＮＡと、を反応させる工程を含む。前記反応は、キャッピング反応に一般的に用いられる条件で行うことができる。例えば、適当な緩衝液に、ＶＣＥ、化合物（１）、及びＲＮＡを添加し、３０～３８℃、好ましくは３５～３７℃で反応させる。反応時間は、特に限定されないが、例えば、３０分～５０時間を例示することができ、好ましくは１～３０時間が挙げられる。好ましい反応時間は、使用する化合物（１）の種類に応じて変動するため、使用する化合物（１）の種類に応じて反応時間を設定してもよい。例えば、化合物（１）として、ｍ７ＧＴＰ、ｍ１ＧＴＰ、ｍ６ＧＴＰ、ｄＧＴＰ、ａｒａＧＴＰ、Ｏｍ３’ＧＴＰ、ＮＨ２ ２’ＧＴＰ、ＮＨ２ ３’ｄＧＴＰ、Ｎ３ ３’ ｄＧＴＰ、Ｏｐｐ３’ＧＴＰ、又はＥＤＡ２’／３’ＧＴＰを用いる場合には、反応時間を３０～１２０分程度、好ましくは５０～７０分程度とすることができる。一方、化合物（１）として、Ｃｌ６ＧＴＰ、ＩＴＰ、ｆＧＴＰ、Ｏｍ２’ＧＴＰ、Ｎ３ ２’ＧＴＰ、又はＧＴＰαＳを用いる場合には、反応時間を１０～３０時間程度、好ましくは２０～３０時間程度とすることができる。
本態様にかかるキャッピング方法は、ＶＣＥの存在下で、化合物（１）と、ＲＮＡと、を反応させる工程を含む。前記反応は、キャッピング反応に一般的に用いられる条件で行うことができる。例えば、適当な緩衝液に、ＶＣＥ、化合物（１）、及びＲＮＡを添加し、３０～３８℃、好ましくは３５～３７℃で反応させる。反応時間は、特に限定されないが、例えば、３０分～５０時間を例示することができ、好ましくは１～３０時間が挙げられる。好ましい反応時間は、使用する化合物（１）の種類に応じて変動するため、使用する化合物（１）の種類に応じて反応時間を設定してもよい。例えば、化合物（１）として、ｍ７ＧＴＰ、ｍ１ＧＴＰ、ｍ６ＧＴＰ、ｄＧＴＰ、ａｒａＧＴＰ、Ｏｍ３’ＧＴＰ、ＮＨ２ ２’ＧＴＰ、ＮＨ２ ３’ｄＧＴＰ、Ｎ３ ３’ ｄＧＴＰ、Ｏｐｐ３’ＧＴＰ、又はＥＤＡ２’／３’ＧＴＰを用いる場合には、反応時間を３０～１２０分程度、好ましくは５０～７０分程度とすることができる。一方、化合物（１）として、Ｃｌ６ＧＴＰ、ＩＴＰ、ｆＧＴＰ、Ｏｍ２’ＧＴＰ、Ｎ３ ２’ＧＴＰ、又はＧＴＰαＳを用いる場合には、反応時間を１０～３０時間程度、好ましくは２０～３０時間程度とすることができる。
【0043】
キャッピング反応の反応液には、ＶＣＥ、化合物（１）、及びＲＮＡに加えて、ＳＡＭ、及びＲＮａｓｅインヒビター等を添加することができる。
また、反応液中のＶＣＥ、化合物（１）、及びＲＮＡの濃度は、化合物（１）の種類に応じて、適宜設定することができる。
また、反応液中のＶＣＥ、化合物（１）、及びＲＮＡの濃度は、化合物（１）の種類に応じて、適宜設定することができる。
【0044】
キャッピング反応後は、キャップ化されていないＲＮＡの除去処理を行ってもよい。キャップ化されていないＲＮＡの除去方法は、特に限定されないが、例えば、アルカリホスファターゼ等による脱リン酸化と、ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化とにより、キャップ化されていないＲＮＡの５’末端を一リン酸化した後、５’一リン酸化ＲＮＡを特異的に分解するエキソヌクレアーゼにより一リン酸化ＲＮＡを分解する方法等が挙げられる。
上記のように適宜キャップ化されていないＲＮＡの除去処理を行った後、市販のＲＮＡ精製キット等を用いてＲＮＡの精製を行ってもよい。
上記のように適宜キャップ化されていないＲＮＡの除去処理を行った後、市販のＲＮＡ精製キット等を用いてＲＮＡの精製を行ってもよい。
【0045】
本態様にかかるキャッピング方法は、後述の修飾ＲＮＡの製造方法に利用することができる。
【0046】
［修飾ＲＮＡの製造方法］
一態様において、本発明は、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素の存在下で、上記一般式（１）で表される化合物（１）（但し、ＧＴＰを除く）と、ＲＮＡと、を反応させる工程（ａ）を含む、修飾ＲＮＡの製造方法を提供する。
一態様において、本発明は、ワクシニアウイルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）のキャッピング酵素の存在下で、上記一般式（１）で表される化合物（１）（但し、ＧＴＰを除く）と、ＲＮＡと、を反応させる工程（ａ）を含む、修飾ＲＮＡの製造方法を提供する。
【0047】
＜工程（ａ）＞
工程（ａ）は、上記態様のＲＮＡのキャッピング方法における反応工程と同様に行うことができる。ＶＣＥ、化合物（１）、及びＲＮＡについても、上記で説明したものと同様であり、好ましい例も同様である。
工程（ａ）は、上記態様のＲＮＡのキャッピング方法における反応工程と同様に行うことができる。ＶＣＥ、化合物（１）、及びＲＮＡについても、上記で説明したものと同様であり、好ましい例も同様である。
【0048】
本態様の製造方法により得られる修飾ＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端にキャップとして化合物（１）が導入されたＲＮＡである。本明細書において、「修飾ＲＮＡ」とは、５’末端にｍ７Ｇ以外の構造のキャップを有するＲＮＡを意味する。
工程（ａ）により、化合物（１）からピロリン酸が除去されたものが、ＲＮＡの５’末端の三リン酸に結合してキャップを形成する。これにより、化合物（１）のヌクレオシド構造が５’－５’三リン酸結合を介して５’末端に結合した修飾ＲＮＡを得ることができる。
工程（ａ）により、化合物（１）からピロリン酸が除去されたものが、ＲＮＡの５’末端の三リン酸に結合してキャップを形成する。これにより、化合物（１）のヌクレオシド構造が５’－５’三リン酸結合を介して５’末端に結合した修飾ＲＮＡを得ることができる。
【0049】
＜任意工程＞
本態様の製造方法は、上記工程（ａ）に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、工程（ａ）で得られた修飾ＲＮＡに、さらなる修飾を行う工程等が挙げられる。さらなる修飾は、特に限定されないが、例えば、クリックケミストリーを利用した修飾等が挙げられる。より具体的には、クリックケミストリーを利用して、工程（ａ）で得られた修飾ＲＮＡに、機能性基を導入する工程、あるいは工程（ａ）で得られた修飾ＲＮＡを環状化する工程等が挙げられる。
本態様の製造方法は、上記工程（ａ）に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、工程（ａ）で得られた修飾ＲＮＡに、さらなる修飾を行う工程等が挙げられる。さらなる修飾は、特に限定されないが、例えば、クリックケミストリーを利用した修飾等が挙げられる。より具体的には、クリックケミストリーを利用して、工程（ａ）で得られた修飾ＲＮＡに、機能性基を導入する工程、あるいは工程（ａ）で得られた修飾ＲＮＡを環状化する工程等が挙げられる。
【0050】
≪機能性基の導入≫
本態様の製造方法は、上記工程（ａ）の後、さらに、アルキン化合物又はアジド化合物を導入する工程を含んでいてもよい。そのような工程の具体例としては、下記工程（ｂ１）及び工程（ｂ２）が挙げられる。また、前記アルキン化合物又はアジド化合物に活性分子を結合させておくことにより、修飾ＲＮＡに機能性基を導入することができる。
本態様の製造方法は、上記工程（ａ）の後、さらに、アルキン化合物又はアジド化合物を導入する工程を含んでいてもよい。そのような工程の具体例としては、下記工程（ｂ１）及び工程（ｂ２）が挙げられる。また、前記アルキン化合物又はアジド化合物に活性分子を結合させておくことにより、修飾ＲＮＡに機能性基を導入することができる。
【0051】
（工程（ｂ１））
例えば、化合物（１）が、上記一般式（１）中のＲｒ１又はＲｒ２が、アジド基（－Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ－）である化合物（以下、化合物（１－ａｚ）ともいう。）である場合、本態様にかかる製造方法は、上記工程（ａ）の後、さらに、アルキン化合物を反応させる工程（ｂ１）を含むことができる。
例えば、化合物（１）が、上記一般式（１）中のＲｒ１又はＲｒ２が、アジド基（－Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ－）である化合物（以下、化合物（１－ａｚ）ともいう。）である場合、本態様にかかる製造方法は、上記工程（ａ）の後、さらに、アルキン化合物を反応させる工程（ｂ１）を含むことができる。
【0052】
化合物（１－ａｚ）の具体例としては、Ｎ３
２’ＧＴＰ及びＮ３
３’ｄＧＴＰが挙げられる。
【0053】
本明細書において、「アルキン化合物」とは、分子中に炭素－炭素三重結合（－Ｃ≡Ｃ－)を有する化合物を意味する。アルキン化合物の構造は、特に限定されず、所望の分子に三重結合を導入したものであってよい。例えば、アルキン化合物は、機能性基を含むものであることができる。「機能性基」とは、１つ以上の機能を有する原子団を意味し、当該機能としては、例えば、蛍光活性、発光活性、結合活性、酵素活性、酵素阻害活性、生理活性、接着活性、各種薬剤活性等が挙げられるが、これらに限定されない。機能性基は、機能性分子をアルキン化合物に結合させることによって生じる化合物において、当該機能性分子に由来する原子団から構成される基（機能性分子から誘導される基）であってもよい。また、機能性基は、タンパク質、糖、核酸等の生体高分子から誘導される基であってもよい。前記機能性分子の具体例としては、例えば、蛍光分子、発光分子、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、酵素、糖、ポリエチレングリコール、ステロイド、カルボン酸、アミン、コハク酸イミド等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0054】
化合物（１）が化合物（１－ａｚ）である場合、工程（ａ）により得られる修飾ＲＮＡにはキャップ部位にアジド基が導入されている。工程（ｂ１）では、前記アジド基に対して、銅触媒型アジド-アルキン環化付加（Ｃｕ－ｃａｔａｌｙｚｅｄ ａｚｉｄｅ ａｌｋｙｎｅ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ：ＣｕＡＡＣ）反応、又は歪み促進型アジド－アルキン付加環化（ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ ａｚｉｄ－ａｌｋｙｎｅ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ：ＳＰＡＡＣ）反応により、アルキン化合物を反応させることができる。例えば、アルキン化合物がプロパルギル基を有する場合には、ＣｕＡＡＣ反応を利用することができ、銅触媒下で反応を行うことができる。また、アルキン化合物が環状アルキン構造を含む化合物である場合、ＳＰＡＡＣ反応を利用することができ、銅触媒の非存在下で反応を行うことができる。これらの反応における反応条件は、特に限定されず、ＣｕＡＡＣ反応又はＳＰＡＡＣ反応に一般的に用いられる反応条件を用いることができる。例えば、これらの反応は常温（２０～３８℃程度）で行うことができ、反応時間としては３０～１２０分等が挙げられる。
【0055】
（工程（ｂ２））
例えば、化合物（１）が、上記一般式（１）中のＲｒ１又はＲｒ２が、－ＯＲ１Ｃ≡ＣＨである化合物（以下、化合物（１－ｐｒ）ともいう。）である場合、本態様にかかる製造方法は、上記工程（ａ）の後、さらに、アジド化合物を反応させる工程（ｂ２）を含むことができる。
例えば、化合物（１）が、上記一般式（１）中のＲｒ１又はＲｒ２が、－ＯＲ１Ｃ≡ＣＨである化合物（以下、化合物（１－ｐｒ）ともいう。）である場合、本態様にかかる製造方法は、上記工程（ａ）の後、さらに、アジド化合物を反応させる工程（ｂ２）を含むことができる。
【0056】
化合物（１－ｐｒ）において、前記－ＯＲ１Ｃ≡ＣＨは、プロパルギルオキシ基であることが好ましい。化合物（１－ｐｒ）の具体例としては、Ｏｐｐ３’ＧＴＰが挙げられる。
【0057】
本明細書において、「アジド化合物」とは、分子中にアジド基（－Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ－)を有する化合物を意味する。アジド化合物の構造は、特に限定されず、所望の分子にアジド基を導入したものであってよい。例えば、アジド化合物は、機能性基を含むものであることができる。機能性基としては、上記で挙げたものと同様のものが挙げられる。
【0058】
化合物（１）が化合物（１－ｐｒ）である場合、工程（ａ）により得られる修飾ＲＮＡにはキャップ部位にプロパルギル基（－ＣＨ２－Ｃ≡ＣＨ）が導入されている。工程（ｂ２）では、前記プロパルギル基に対して、ＣｕＡＡＣ反応により、アジド化合物を反応させることができる。反応条件としては、上記と同様のものが挙げられる。
【0059】
≪環状ＲＮＡの形成≫
本態様の製造方法は、上記工程（ａ）に加えて、さらに、ＲＮＡの３’末端にアルキン化合物又はアジド化合物を導入する工程を含んでいてもよい。そのような工程の具体例としては、例えば、下記工程（ｃ１）及び（ｃ２）が挙げられる。さらに、その後、環状ＲＮＡを生成する工程を含んでいてもよい。そのような工程の具体例としては、例えば、下記工程（ｄ１）及び（ｄ２）が挙げられる。
本態様の製造方法は、上記工程（ａ）に加えて、さらに、ＲＮＡの３’末端にアルキン化合物又はアジド化合物を導入する工程を含んでいてもよい。そのような工程の具体例としては、例えば、下記工程（ｃ１）及び（ｃ２）が挙げられる。さらに、その後、環状ＲＮＡを生成する工程を含んでいてもよい。そのような工程の具体例としては、例えば、下記工程（ｄ１）及び（ｄ２）が挙げられる。
【0060】
（工程（ｃ１））
化合物（１）が、化合物（１－ａｚ）である場合、本態様にかかる製造方法は、上記工程（ａ）に加えて、さらに、ＲＮＡの３’末端に、下記一般式（Ａｋ－１）で表される化合物（以下、「化合物（Ａｋ－１）」という）を結合させる工程（ｃ１）を含むことができる。
化合物（１）が、化合物（１－ａｚ）である場合、本態様にかかる製造方法は、上記工程（ａ）に加えて、さらに、ＲＮＡの３’末端に、下記一般式（Ａｋ－１）で表される化合物（以下、「化合物（Ａｋ－１）」という）を結合させる工程（ｃ１）を含むことができる。
【0061】
【化16】
【0062】
前記一般式（Ａｋ－１）中、Ｙ１は、２価の連結基を表す。前記２価の連結基としては、置換基を有していてもよい炭化水素基が挙げられる。前記炭化水素基は、脂肪族炭化水素基であってもよく、芳香族炭化水素基であってもよいが、脂肪族炭化水素基が好ましい。前記脂肪族炭化水素基は、炭素数３～５０であることが好ましく、炭素数３～３０であることがより好ましく、炭素数３～２５であることがさらに好ましい。
前記脂肪族炭化水素基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよく、環状であってもよいが、直鎖状又は分岐鎖状の脂肪族炭化水素基が好ましく、直鎖状脂肪族炭化水素基がより好ましい。前記脂肪族炭化水素基は、飽和脂肪族炭化水素基であってもよく、不飽和脂肪族炭化水素基であってもよいが、飽和脂肪族炭化水素基であることが好ましい。好ましくは、Ｙ１は、直鎖状の飽和脂肪族炭化水素基である。
前記脂肪族炭化水素基は、置換基を有していてもよい。前記置換基は、水素原子（－Ｈ）を１価の基で置換するものであってもよく、メチレン基を２価の基で置換するものであってもよい。前記水素原子を置換する１価の基としては、例えば、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、及びアルコキシ基等が挙げられるが、これらに限定されない。前記メチレン基を置換する２価の基としては、例えば、－Ｏ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、及び－Ｃ（－Ｏ）－等が挙げられるが、これらに限定されない。前記脂肪族炭化水素基は、水素原子が置換されていないことが好ましく、メチレン基の一部が２価の基で置換されていることが好ましい。中でも、Ｙ１は、メチレン基の一部が、－Ｏ－、又は－ＮＨＣ（＝Ｏ）－で置換された直鎖状の飽和脂肪族炭化水素基であることが好ましい。Ｙ１の具体例としては、例えば、－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨＣ（＝Ｏ）－（ＣａＨ２ａＯ）ｎ－が挙げられる。前記ｍ及びｎは、それぞれ独立して、１以上の整数であり、１～１５の整数が挙げられる。ｍは、１～１０の整数であることが好ましく、２～８の整数であることがより好ましく、３～７の整数であることがさらに好ましく、５又は６が特に好ましく、６が最も好ましい。前記ｎは、１～１０の整数であることが好ましく、２～８の整数であることがより好ましく、３～７の整数であることがさらに好ましく、５又は６が特に好ましく、５が最も好ましい。ａは、１～３の整数であり、１又は２が好ましく、２がより好ましい。
前記脂肪族炭化水素基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよく、環状であってもよいが、直鎖状又は分岐鎖状の脂肪族炭化水素基が好ましく、直鎖状脂肪族炭化水素基がより好ましい。前記脂肪族炭化水素基は、飽和脂肪族炭化水素基であってもよく、不飽和脂肪族炭化水素基であってもよいが、飽和脂肪族炭化水素基であることが好ましい。好ましくは、Ｙ１は、直鎖状の飽和脂肪族炭化水素基である。
前記脂肪族炭化水素基は、置換基を有していてもよい。前記置換基は、水素原子（－Ｈ）を１価の基で置換するものであってもよく、メチレン基を２価の基で置換するものであってもよい。前記水素原子を置換する１価の基としては、例えば、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、及びアルコキシ基等が挙げられるが、これらに限定されない。前記メチレン基を置換する２価の基としては、例えば、－Ｏ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－、－ＮＨ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、及び－Ｃ（－Ｏ）－等が挙げられるが、これらに限定されない。前記脂肪族炭化水素基は、水素原子が置換されていないことが好ましく、メチレン基の一部が２価の基で置換されていることが好ましい。中でも、Ｙ１は、メチレン基の一部が、－Ｏ－、又は－ＮＨＣ（＝Ｏ）－で置換された直鎖状の飽和脂肪族炭化水素基であることが好ましい。Ｙ１の具体例としては、例えば、－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨＣ（＝Ｏ）－（ＣａＨ２ａＯ）ｎ－が挙げられる。前記ｍ及びｎは、それぞれ独立して、１以上の整数であり、１～１５の整数が挙げられる。ｍは、１～１０の整数であることが好ましく、２～８の整数であることがより好ましく、３～７の整数であることがさらに好ましく、５又は６が特に好ましく、６が最も好ましい。前記ｎは、１～１０の整数であることが好ましく、２～８の整数であることがより好ましく、３～７の整数であることがさらに好ましく、５又は６が特に好ましく、５が最も好ましい。ａは、１～３の整数であり、１又は２が好ましく、２がより好ましい。
【0063】
前記一般式（Ａｋ－１）中、Ｂａｓｅはヌクレオチド塩基を表す。ヌクレオチド塩基は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシル、並びにこれらの誘導体からなる群より選択される。前記誘導体は、ＲＮＡの３’末端への結合が阻害されない限り特に限定されず、グアニン、シトシン、アデニン、又はウラシルの公知の誘導体を用いることができる。ヌクレオチド塩基は、好ましくは、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルからなる群より選択され、より好ましくはシトシンである。
【0064】
化合物（Ａｋ－１）の具体例としては、ｐＣｐ－ａｌｋｙｎｅが挙げられる。
【0065】
【化17】
【0066】
化合物（１－ａｚ）の具体例としては、Ｎ３
２’ＧＴＰ及びＮ３
３’ｄＧＴＰが挙げられる。
【0067】
ＲＮＡの３’末端への、前記化合物（Ａｋ－１）の結合は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼの存在下で行うことができる。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼは、核酸の５’末端のリン酸基を３’末端のヒドロキシ基に結合させる酵素であり、各種市販品（例えば、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標） Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ等）が利用可能である。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼによるＲＮＡの３’末端への化合物（Ａｋ－１）の結合反応（ライゲーション反応）は、ＡＴＰ存在下で行うことが好ましい。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼによるライゲーション反応は、市販のＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いる場合には、当該製品において推奨される条件に従って行えばよい。例えば、適当な緩衝液中で、ＲＮＡ、化合物（Ａｋ－１）、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、及びＡＴＰを混合し、ライゲーション反応を行う。反応温度としては、例えば、３～２０℃、反応時間としては、例えば、１６～９６時間等が挙げられる。
ライゲーション反応後は、市販のＲＮＡ精製キット等を用いて、ＲＮＡの精製を行ってもよい。
ライゲーション反応後は、市販のＲＮＡ精製キット等を用いて、ＲＮＡの精製を行ってもよい。
【0068】
工程（ｃ１）は、下記Ｓｈｅｍｅ（ｃ１－１）に示すように、前記工程（ａ）の後に行ってもよい。あるいは、下記Ｓｈｅｍｅ（ｃ１－２）に示すように、工程（ａ）の前に行ってもよい。なお、下記Ｓｈｅｍｅでは、化合物（１）がＮ３
３’ｄＧＴＰである場合を例として記載している。下記Ｓｈｅｍｅ中、「５’－３’」における太線はＲＮＡ鎖を示す。
【0069】
【化18】
【0070】
【化19】
【0071】
工程（ｃ１）を行うことで、ＲＮＡの３’末端に、アルキニル基を導入することができる。
【0072】
（工程（ｄ１））
本態様にかかる製造方法は、前記工程（ａ）及び工程（ｃ１）の後、さらに、前記工程（ａ）によりＲＮＡの５’末端に導入されたアジド基と、前記工程（ｃ１）によりＲＮＡの３’末端に導入されたアルキニル基とを反応させて、環状修飾ＲＮＡを生成する工程（ｄ１）を含んでいてもよい。
本態様にかかる製造方法は、前記工程（ａ）及び工程（ｃ１）の後、さらに、前記工程（ａ）によりＲＮＡの５’末端に導入されたアジド基と、前記工程（ｃ１）によりＲＮＡの３’末端に導入されたアルキニル基とを反応させて、環状修飾ＲＮＡを生成する工程（ｄ１）を含んでいてもよい。
【0073】
前記アジド基とアルキニル基との反応は、上述のＣｕＡＡＣ反応により行うことができる。ＣｕＡＡＣ反応における反応条件は、特に限定されず、ＣｕＡＡＣ反応に一般的に用いられる反応条件を用いることができる。例えば、反応は常温（２０～３８℃程度）で行うことができ、反応時間としては３０～１２０分等が挙げられる。
【0074】
ＣｕＡＡＣ反応により、ＲＮＡの５’末端のアジド基と、３’末端のアルキニル基とを結合させることで、環状ＲＮＡを得ることができる。環状ＲＮＡは、遊離末端を有さないため、エキソヌクレアーゼによる分解を受けず、生体内での安定性の向上が見込まれる。
【0075】
（工程（ｃ２））
化合物（１）が、化合物（１－ｐｒ）である場合、本態様にかかる製造方法は、上記工程（ａ）に加えて、さらに、ＲＮＡの３’末端に、下記一般式（Ａｚ－１）で表される化合物（以下、「化合物（Ａｚ－１）」という）を結合させる工程（ｃ２）を含むことができる。
化合物（１）が、化合物（１－ｐｒ）である場合、本態様にかかる製造方法は、上記工程（ａ）に加えて、さらに、ＲＮＡの３’末端に、下記一般式（Ａｚ－１）で表される化合物（以下、「化合物（Ａｚ－１）」という）を結合させる工程（ｃ２）を含むことができる。
【0076】
【化20】
【0077】
前記一般式（Ａｚ－１）中、Ｙ２は、２価の連結基を表す。前記２価の連結基としては、前記一般式（Ａｋ－１）中のＹ１における２価の連結基と同様のものが挙げられ、好ましい例も同様のものが例示される。中でも、Ｙ２は、メチレン基の一部が、－Ｏ－、又は－ＮＨＣ（＝Ｏ）－で置換された直鎖状の飽和脂肪族炭化水素基であることが好ましい。Ｙ２の具体例としては、例えば、－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨＣ（＝Ｏ）－（ＣａＨ２ａＯ）ｎ－（ＣＨ２）２－が挙げられる。前記ｍ及びｎは、前記一般式（Ａｋ－１）中のＹ１で説明したものと同様である。中でも、ｍは５又は６が好ましく、６がより好ましい。ｎは３～７の整数が好ましく、３～６の整数がより好ましく、４がさらに好ましい。前記ａは、前記一般式（Ａｋ－１）中のＹ１で説明したものと同様である。ａは、１又は２が好ましく、２がより好ましい。
【0078】
前記一般式（Ａｚ－１）中、Ｂａｓｅはヌクレオチド塩基を表す。ヌクレオチド塩基は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシル、並びにこれらの誘導体からなる群より選択される。前記誘導体は、ＲＮＡの３’末端への結合が阻害されない限り特に限定されず、グアニン、シトシン、アデニン、又はウラシルの公知の誘導体を用いることができる。ヌクレオチド塩基は、好ましくは、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルからなる群より選択され、より好ましくはシトシンである。
【0079】
化合物（Ａｚ－１）の具体例としては、ｐＣｐ－ａｚｉｄｅが挙げられる。
【0080】
【化21】
【0081】
化合物（１－ｐｒ）において、前記－ＯＲ１Ｃ≡ＣＨは、プロパルギルオキシ基であることが好ましい。化合物（１－ｐｒ）の具体例としては、Ｏｐｐ３’ＧＴＰが挙げられる。
【0082】
ＲＮＡの３’末端への、前記化合物（Ａｚ－１）の結合は、上記工程（ｃ１）と同様に、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼの存在下で行うことができる。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼによるライゲーション反応は、上記工程（ｃ１）と同様に行うことができる。
ライゲーション反応後は、市販のＲＮＡ精製キット等を用いて、ＲＮＡの精製を行ってもよい。
ライゲーション反応後は、市販のＲＮＡ精製キット等を用いて、ＲＮＡの精製を行ってもよい。
【0083】
工程（ｃ２）は、下記Ｓｃｈｅｍｅ（ｃ２－１）に示すように、前記工程（ａ）の後に行ってもよい。あるいは、下記Ｓｃｈｅｍｅ（ｃ２－２）に示すように、工程（ａ）の前に行ってもよい。なお、下記Ｓｃｈｅｍｅでは、化合物（１）がＯｐｐ３’ＧＴＰである場合を例として記載している。下記Ｓｈｅｍｅ中、「５’－３’」における太線はＲＮＡ鎖を示す。
【0084】
【化22】
【0085】
【化23】
【0086】
工程（ｃ２）を行うことで、ＲＮＡの３’末端に、アジド基を導入することができる。
【0087】
（工程（ｄ２））
本態様にかかる製造方法は、前記工程（ａ）及び工程（ｃ２）の後、さらに、前記工程（ａ）によりＲＮＡの５’末端に導入されたアルキニル基と、前記工程（ｃ２）によりＲＮＡの３’末端に導入されたアジド基とを反応させて、環状修飾ＲＮＡを生成する工程（ｄ２）を含んでいてもよい。
本態様にかかる製造方法は、前記工程（ａ）及び工程（ｃ２）の後、さらに、前記工程（ａ）によりＲＮＡの５’末端に導入されたアルキニル基と、前記工程（ｃ２）によりＲＮＡの３’末端に導入されたアジド基とを反応させて、環状修飾ＲＮＡを生成する工程（ｄ２）を含んでいてもよい。
【0088】
前記アルキニル基とアジド基との反応は、上述のＣｕＡＡＣ反応により行うことができる。ＣｕＡＡＣ反応における反応条件は、特に限定されず、前記工程（ｄ１）と同様に、ＣｕＡＡＣ反応に一般的に用いられる反応条件を用いることができる。
【0089】
ＣｕＡＡＣ反応により、ＲＮＡの５’末端のアルキニル基と、３’末端のアジド基とを結合させることで、環状ＲＮＡを得ることができる。
【0090】
本態様にかかる製造方法は、さらに、キャップ化されていないＲＮＡを除去する工程、及び修飾ＲＮＡを精製する工程等を含んでいてもよい。
【0091】
本態様にかかる修飾ＲＮＡの製造方法は、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を用いることにより、種々のＧＴＰアナログがキャップに導入された、種々の修飾ＲＮＡを得ることができる。後述する実施例で示すとおり、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素は、ＧＴＰアナログに対して幅広い基質特異性を示すため、種々のＧＴＰアナログをＲＮＡの５’末端に導入することができる。本態様にかかる製造方法では、所望のＧＴＰアナログを準備する以外は、煩雑な有機合成を行う必要はなく、簡易に、種々の修飾ＲＮＡを得ることができる。
【0092】
本態様にかかる製造方法により得られる修飾ＲＮＡは、キャップ部位に種々の修飾を有し得る。そのため、安定性や翻訳活性の異なる修飾ＲＮＡを得ることができる。そのため、所望の安定性や翻訳活性を有する修飾ＲＮＡを選択して、発現ベクターとして用いることができる。例えば、遺伝子治療用ベクター、幹細胞作製用ベクター、遺伝子編集用ベクター等として用いることができる。
【0093】
さらに、クリックケミストリーを利用して、所望の機能を有する機能性基を導入することにより、所望の機能を修飾ＲＮＡに付加することができる。例えば、修飾ＲＮＡに、ＡＦ６４７等の蛍光分子を導入することにより、細胞内でのＲＮＡの局在や動態を観察することができ、相互作用分子の同定等にも利用することができる。
【0094】
さらに、クリックケミストリーを利用して、環状ＲＮＡを生成することにより、エキソヌクレアーゼに対する耐性を高め、生体内での安定性を向上させることができる。
従来の方法で作製された環状ＲＮＡは、５’キャップを有さないため、翻訳を開始させるために、ＲＮＡ配列中にＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）を導入する必要があった（例えば、Wesselhoeft RA et al., Nat Commun. 2018 Jul 6;9(1):2629.）。ＩＲＥＳは、修飾塩基（例えば、ψ（シュードウラシル）、ｍ１ψ、ｍ５Ｃなど）の使用により翻訳活性がなくなることがあり、ＩＲＥＳを用いる場合には修飾塩基の使用が制限される場合がある。
一方、本態様にかかる製造方法で得られる環状ＲＮＡは、５’キャップを有するため、ＲＮＡ配列中にＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）を導入しなくても、翻訳が可能である。そのため、修飾塩基の導入による安定性の向上等の種々の改良を行い得る。
従来の方法で作製された環状ＲＮＡは、５’キャップを有さないため、翻訳を開始させるために、ＲＮＡ配列中にＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）を導入する必要があった（例えば、Wesselhoeft RA et al., Nat Commun. 2018 Jul 6;9(1):2629.）。ＩＲＥＳは、修飾塩基（例えば、ψ（シュードウラシル）、ｍ１ψ、ｍ５Ｃなど）の使用により翻訳活性がなくなることがあり、ＩＲＥＳを用いる場合には修飾塩基の使用が制限される場合がある。
一方、本態様にかかる製造方法で得られる環状ＲＮＡは、５’キャップを有するため、ＲＮＡ配列中にＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）を導入しなくても、翻訳が可能である。そのため、修飾塩基の導入による安定性の向上等の種々の改良を行い得る。
【0095】
［修飾ＲＮＡ］
一態様において、本発明は、下記式（Ｃｐ－１）～（Ｃｐ－１３）からなる群より選択される構造を５’末端に有する、修飾ＲＮＡを提供する。
一態様において、本発明は、下記式（Ｃｐ－１）～（Ｃｐ－１３）からなる群より選択される構造を５’末端に有する、修飾ＲＮＡを提供する。
【0096】
【化24】
【0097】
【化25】
【0098】
【化26】
【0099】
上記式（Ｃｐ－１）～（Ｃｐ－１３）でそれぞれ表される構造を５’末端に有する修飾ＲＮＡ（ＲＮＡ（Ｃｐ－１）～（Ｃｐ－１３））は、上記態様の修飾ＲＮＡの製造方法により製造することができる。ＲＮＡ（Ｃｐ－１）～（Ｃｐ－１３）は、ＶＣＥの存在下で、ＲＮＡに、ｄＧＴＰ、ａｒａＧＴＰ、ｆＧＴＰ、Ｏｍ２’ＧＴＰ、Ｏｍ３’ＧＴＰ、ＮＨ２
２’ＧＴＰ、ＮＨ２
３’ｄＧＴＰ、Ｎ３
２’ＧＴＰ、Ｎ３
３’ ｄＧＴＰ、Ｏｐｐ３’ＧＴＰ、ＥＤＡ２’／３’ＧＴＰ（ＲＮＡ（Ｃｐ－１１）及びＲＮＡ（Ｃｐ－１２）を生成）、及びＧＴＰαＳをそれぞれ反応させることにより得ることができる。これらの構造を有するＲＮＡは、安定性の向上が期待できる。また、ヒドロキシ基、アミノ基、アジド基、又はプロパルギル基等を利用して、任意の分子を導入することができる。
【0100】
中でも、ＲＮＡ（Ｃｐ－８）～（Ｃｐ－１０）は、クリックケミストリーを利用して所望の分子を導入することができる。例えば、上記工程（ｂ１）又は工程（ｂ２）のように、クリックケミストリーを使用して、下記一般式（Ｃａ－１）～（Ｃａ－３）でそれぞれ表される構造を５’末端に有する修飾ＲＮＡを得ることができる。したがって、一実施形態において、本発明は、下記一般式（Ｃａ－１）～（Ｃａ－３）からなる群より選択される構造を５’末端に有する修飾ＲＮＡもまた提供する。
【0101】
【化27】
【0102】
上記式（Ｃａ－１）又は（Ｃａ－２）中、Ｒａ１及びＲａ２は、それぞれ独立に、水素原子又は有機基を表す。前記有機基は、特に限定されず、所望の構造であることができる。好ましい態様において、Ｒａ１及びＲａ２のいずれか一方は、機能性基を含む有機基である。また、Ｒａ１及びＲａ２の両方が、機能性基を含む有機基であってもよい。前記有機基が含む機能性基の数は、特に限定されず、所望の数とすることができる。Ｒａ１及びＲａ２が複数の機能性基を含む場合、前記複数の機能性基は、互いに同じものであってもよく、異なるものであってもよい。機能性基としては、上記「［修飾ＲＮＡの製造方法］」で例示したものと同様のものが挙げられる。
Ｒａ１及びＲａ２は、ともに水素原子となることはなく、少なくとも一方は有機基である。また、Ｒａ１及びＲａ２の両方が有機基である場合、Ｒａ１及びＲａ２は、相互に結合して環構造を形成してもよい。
Ｒａ１及びＲａ２は、ともに水素原子となることはなく、少なくとも一方は有機基である。また、Ｒａ１及びＲａ２の両方が有機基である場合、Ｒａ１及びＲａ２は、相互に結合して環構造を形成してもよい。
【0103】
上記式（Ｃａ－３）中、Ｒａ３は、有機基である。前記有機基は、特に限定されず、所望の構造であることができる。好ましい態様において、Ｒａ３は、機能性基を含む有機基である。Ｒａ３が含む機能性基の数は、特に限定されず、所望の数とすることができる。Ｒａ３が複数の機能性基を含む場合、前記複数の機能性基は、互いに同じものであってもよく、異なるものであってもよい。機能性基としては、上記「［修飾ＲＮＡの製造方法］」で例示したものと同様のものが挙げられる。
【0104】
上記式（Ｃａ－１）で表される構造の具体例としては、例えば、下記式（Ｃａ－１－１）で表される構造が例示される。また、上記式（Ｃａ－２）で表される構造の具体例としては、例えば、下記式（Ｃａ－２－１）で表される構造が例示される。したがって、本発明は、下記式（Ｃａ－１－１）及び（Ｃａ－２－１）からなる群より選択される構造を５’末端に有する修飾ＲＮＡもまた提供する。
【0105】
【化28】
【0106】
また、式（Ｃｐ－８）～（Ｃｐ－１０）でそれぞれ表される構造を５’末端に有するＲＮＡは、クリックケミストリーを利用して、環状ＲＮＡとすることができる。例えば、上記工程（ｃ１）及び工程（ｄ１）あるいは上記工程（ｃ２）及び工程（ｄ２）のように、クリックケミストリーを使用して、下記一般式（Ｃｉ－１）～（Ｃｉ－３）でそれぞれ表される構造を有する環状修飾ＲＮＡを得ることができる。したがって、一実施形態において、本発明は、下記一般式（Ｃｉ－１）～（Ｃｉ－３）からなる群より選択される構造を有する環状修飾ＲＮＡもまた提供する。
【0107】
【化29】
【0108】
【化30】
【0109】
前記式（Ｃｉ－１）及び（Ｃｉ－２）中、Ｙ１は、上記一般式（Ａｋ－１）中のＹ１と同様であり、好ましい例も同様のものが挙げられる。中でも、Ｙ１の好ましい例としては、＊１－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨＣ（＝Ｏ）－（ＣＨ２Ｏ）ｎ－＊２が挙げられる。前記式中、＊１は、式（Ｃｉ－１）又は（Ｃｉ－２）中の酸素原子に結合する結合手であり、＊２には、式（Ｃｉ－１）又は（Ｃｉ－２）中のメチレン基における炭素原子に結合する結合手である。Ｙ１の具体例としては、＊１－（ＣＨ２）６－ＮＨＣ（＝Ｏ）－（ＣＨ２Ｏ）５－＊２が挙げられる。
Ｂａｓｅは、それぞれ独立して、ヌクレオチド塩基を表し、前記式（Ａｋ－１）中のＢａｓｅと同様であり、好ましい例も同様のものが挙げられる。Ｂａｓｅの具体例としては、シトシンが挙げられる。
Ｂａｓｅは、それぞれ独立して、ヌクレオチド塩基を表し、前記式（Ａｋ－１）中のＢａｓｅと同様であり、好ましい例も同様のものが挙げられる。Ｂａｓｅの具体例としては、シトシンが挙げられる。
【0110】
前記式（Ｃｉ－３）中、Ｙ２は、上記一般式（Ａｚ－１）中のＹ２と同様であり、好ましい例も同様のものが挙げられる。中でも、Ｙ２の好ましい例としては、＊３－（ＣＨ２）ｍ－ＮＨＣ（＝Ｏ）－（ＣＨ２Ｏ）ｎ－（ＣＨ２）２－＊４が挙げられる。前記式中、＊３は、式（Ｃｉ－３）中の酸素原子に結合する結合手であり、＊４には、式（Ｃｉ－３）中の窒素原子に結合する結合手である。Ｙ２の具体例としては、＊３－（ＣＨ２）６－ＮＨＣ（＝Ｏ）－（ＣＨ２Ｏ）４－（ＣＨ２）２－＊４が挙げられる。
Ｂａｓｅは、それぞれ独立して、ヌクレオチド塩基を表し、前記式（Ａｋ－１）中のＢａｓｅと同様であり、好ましい例も同様のものが挙げられる。Ｂａｓｅの具体例としては、シトシンが挙げられる。
Ｂａｓｅは、それぞれ独立して、ヌクレオチド塩基を表し、前記式（Ａｋ－１）中のＢａｓｅと同様であり、好ましい例も同様のものが挙げられる。Ｂａｓｅの具体例としては、シトシンが挙げられる。
【0111】
本態様にかかるＲＮＡは、遺伝子治療や幹細胞作製のためのベクターとして用いたり、ＲＮＡの細胞内動態の観察、及び相互作用分子の探索等に用いたりすることができる。
【実施例】
【0112】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0113】
［材料］
（修飾ヌクレオチド）
ｍ７ＧＴＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｄＧＴＰ（Ｔｏｙｏｂｏ）、Ｏｐｐ３’ＧＴＰ、及びＥＤＡ２’／３’ＧＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。他のＧＴＰアナログは、ＴｒｉＬｉｎｋ社から購入した。
（修飾ヌクレオチド）
ｍ７ＧＴＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｄＧＴＰ（Ｔｏｙｏｂｏ）、Ｏｐｐ３’ＧＴＰ、及びＥＤＡ２’／３’ＧＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。他のＧＴＰアナログは、ＴｒｉＬｉｎｋ社から購入した。
【0114】
（酵素）
Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ由来のキャッピング酵素（ＶＣＥ）としては、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）を使用した。
Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ由来のキャッピング酵素（ＶＣＥ）としては、ＳｃｒｉｐｔＣａｐ ｍ７Ｇ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ）を使用した。
【0115】
［実施例１］ＧＴＰアナログのキャッピング効率の評価
＜方法＞
様々なＧＴＰアナログを用いて、ＶＣＥによるＲＮＡのキャッピング反応を行い、ＧＴＰアナログのキャッピング効率を評価した。ＲＮＡに対するキャップの付加を明瞭に検出するために、１１ヌクレオチド長（ｎｔ）の短鎖ＲＮＡ（５’－ＧＧＧＣＧＡＡＵＵＡＡ－３’（配列番号１）：レポーターｍＲＮＡの５’ＵＴＲの５’末端と同じ配列）を合成して使用した。目的配列の上流にＴ７プロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡを転写用テンプレートとして準備し、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、一晩、転写反応を行った。転写時に生じる、ＲＮＡの３’端への余分なヌクレオチドの付加を抑制するために、転写反応は４２℃で行った。転写反応後、転写反応物の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（変性ＰＡＧＥ）を行い、目的サイズのＲＮＡを切り出して精製した。
＜方法＞
様々なＧＴＰアナログを用いて、ＶＣＥによるＲＮＡのキャッピング反応を行い、ＧＴＰアナログのキャッピング効率を評価した。ＲＮＡに対するキャップの付加を明瞭に検出するために、１１ヌクレオチド長（ｎｔ）の短鎖ＲＮＡ（５’－ＧＧＧＣＧＡＡＵＵＡＡ－３’（配列番号１）：レポーターｍＲＮＡの５’ＵＴＲの５’末端と同じ配列）を合成して使用した。目的配列の上流にＴ７プロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡを転写用テンプレートとして準備し、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、一晩、転写反応を行った。転写時に生じる、ＲＮＡの３’端への余分なヌクレオチドの付加を抑制するために、転写反応は４２℃で行った。転写反応後、転写反応物の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（変性ＰＡＧＥ）を行い、目的サイズのＲＮＡを切り出して精製した。
【0116】
前記の精製した短鎖ＲＮＡに対して、ＶＣＥを用いて、キャッピング反応を行った。２００ｐｍｏｌのＲＮＡに対して、２０ｎｍｏｌのＧＴＰアナログ及び８ｕｎｉｔのＶＣＥを使用し、３７℃で、１時間又は２４時間反応させた。キャッピング反応後、キャッピング反応物の変性ＰＡＧＥを行い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Ｌｏｎｚａ）で染色後、ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ７０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で観察した。キャッピング効率は、キャップ化されたＲＮＡとキャップ化されていないＲＮＡのバンド強度比から、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて計算した。各実験はそれぞれ３回以上行い、平均値と標準偏差を算出した。
【0117】
＜結果＞
図２に記載のＧＴＰアナログについて、キャッピング効率を確認した結果を図３に示す。各ＧＴＰアナログのキャッピング効率は、ＧＴＰアナログが付加したＲＮＡの量と未反応ＲＮＡの量から算出した。複数のＧＴＰアナログ（例えば、ｄＧＴＰ（＃１１）、Ｏｍ３’ＧＴＰ（＃１６）等）で、ＧＴＰと同等程度のキャッピング効率が確認された。
また、図３でキャッピング効率が低かったＧＴＰアナログについて、キャッピング反応におけるＧＴＰアナログ及びＶＣＥの濃度を変更したときのキャッピング効率を図４に示す。Ｏｍ２’ＧＴＰ（＃１５）では、ＧＴＰアナログの濃度を２倍にすることにより、キャッピング効率が大きく改善した。また、ＧＴＰアナログとともにＶＣＥ濃度を２倍にすることにより、ｍ１ＧＴＰ（＃２）、ｍ６ＧＴＰ（＃３）、及びＩＴＰ（＃９）のキャッピング効率が改善した。
図２に記載のＧＴＰアナログについて、キャッピング効率を確認した結果を図３に示す。各ＧＴＰアナログのキャッピング効率は、ＧＴＰアナログが付加したＲＮＡの量と未反応ＲＮＡの量から算出した。複数のＧＴＰアナログ（例えば、ｄＧＴＰ（＃１１）、Ｏｍ３’ＧＴＰ（＃１６）等）で、ＧＴＰと同等程度のキャッピング効率が確認された。
また、図３でキャッピング効率が低かったＧＴＰアナログについて、キャッピング反応におけるＧＴＰアナログ及びＶＣＥの濃度を変更したときのキャッピング効率を図４に示す。Ｏｍ２’ＧＴＰ（＃１５）では、ＧＴＰアナログの濃度を２倍にすることにより、キャッピング効率が大きく改善した。また、ＧＴＰアナログとともにＶＣＥ濃度を２倍にすることにより、ｍ１ＧＴＰ（＃２）、ｍ６ＧＴＰ（＃３）、及びＩＴＰ（＃９）のキャッピング効率が改善した。
【0118】
【0119】
【表1】
【0120】
［実施例２］キャップ修飾ｍＲＮＡの細胞内翻訳活性の評価
＜方法＞
（キャップ修飾ｍＲＮＡの作製）
蛍光タンパク質Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ（ｈｍＡＧ１）をコードするプラスミドを鋳型として、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用したＰＣＲを行い、ｍＲＮＡ転写用テンプレート用のＤＮＡ断片を増幅した。次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、増幅産物を精製した。前記増幅産物を転写用テンプレートとして、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、３７℃で、６時間、転写反応を行った。前記転写反応には、ＲＮＡを細胞に導入した際に起こる免疫応答を抑制するために、ＣＴＰ及びＵＴＰの代わりに、５－Ｍｅｔｈｙｌ－ＣＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ）及びＰｓｅｕｄｏ－ＵＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ）をそれぞれ使用した。前記転写反応により得られたｍＲＮＡは、ＤＮａｓｅ処理後、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてカラム精製した。
ＧＴＰ アナログによるｍＲＮＡのキャッピングは、ＶＣＥを使用して行った。５０ ｐｍｏｌのｍＲＮＡに対して、２０ ｎｍｏｌのＧＴＰアナログ及び８ ｕｎｉｔのＶＣＥを使用し、３７℃で、１時間又は２４時間反応させた。キャッピング効率の低いＧＴＰアナログによるキャッピング反応では、ＧＴＰアナログ及びＶＣＥの量を前記の量の２倍に増やした。
＜方法＞
（キャップ修飾ｍＲＮＡの作製）
蛍光タンパク質Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ（ｈｍＡＧ１）をコードするプラスミドを鋳型として、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用したＰＣＲを行い、ｍＲＮＡ転写用テンプレート用のＤＮＡ断片を増幅した。次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、増幅産物を精製した。前記増幅産物を転写用テンプレートとして、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、３７℃で、６時間、転写反応を行った。前記転写反応には、ＲＮＡを細胞に導入した際に起こる免疫応答を抑制するために、ＣＴＰ及びＵＴＰの代わりに、５－Ｍｅｔｈｙｌ－ＣＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ）及びＰｓｅｕｄｏ－ＵＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ）をそれぞれ使用した。前記転写反応により得られたｍＲＮＡは、ＤＮａｓｅ処理後、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてカラム精製した。
ＧＴＰ アナログによるｍＲＮＡのキャッピングは、ＶＣＥを使用して行った。５０ ｐｍｏｌのｍＲＮＡに対して、２０ ｎｍｏｌのＧＴＰアナログ及び８ ｕｎｉｔのＶＣＥを使用し、３７℃で、１時間又は２４時間反応させた。キャッピング効率の低いＧＴＰアナログによるキャッピング反応では、ＧＴＰアナログ及びＶＣＥの量を前記の量の２倍に増やした。
【0121】
キャッピング反応後、キャップ化されていないｍＲＮＡを分解して除去した。キャップ化されていないｍＲＮＡの除去は、以下のように行った。キャッピング反応を行ったｍＲＮＡに対して、Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）による脱リン酸化、及びＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）によるリン酸化を行い、キャップ化されていないｍＲＮＡの５’末端を一リン酸化した。次いで、一リン酸化されたＲＮＡのみを特異的に分解する酵素であるＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ ５’－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて、３０℃で、１時間、キャップ化されていないｍＲＮＡの分解反応を行った。これにより、キャップ修飾ｍＲＮＡを精製した。
【0122】
トランスフェクションコントロールとして、ｉＲＦＰ６７０ ｍＲＮＡを用いた。ｈｍＡＧ１ ｍＲＮＡと同様の方法で、ｉＲＦＰ６７０ ｍＲＮＡの転写用テンプレートを作製した。前記ｉＲＦＰ６７０ ｍＲＮＡの転写用テンプレートを用いて、ＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ ｃａｐ ａｎａｌｏｇ：ＴｒｉＬｉｎｋ）とＧＴＰとの混合物（４：１）をＧＴＰの代わりに加えて、転写反応を行った。ＡＲＣＡ存在下での転写反応では、５’末端にＡＲＣＡが取り込まれず、５’三リン酸を有するＲＮＡも生成される。前記５’リン酸基に由来する免疫応答や細胞死を防ぐために、転写産物は脱リン酸化処理を行ってからトランスフェクションに使用した。
【0123】
（ヒト細胞における翻訳活性の評価）
トランスフェクションの２４時間前に、２４ウェルプレートにＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を播種した。ＨｅＬａ細胞は０．５×１０５細胞／ウェルに、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は１．０×１０５細胞／ウェルになるようにした。作製した修飾キャップ化 ｈｍＡＧ１ ｍＲＮＡ（１００ｎｇ）を、ｉＲＦＰ６７０ ｍＲＮＡ（１００ｎｇ）とともに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクションした。トランスフェクションの４時間後に培地交換を行い、トランスフェクションの２４時間後に蛍光顕微鏡（ＩＸ８１：Ｏｌｙｍｐｕｓ）及びフローサイトメーター（ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、蛍光タンパク質の発現レベルを調べた。フローサイトメーターによる測定結果は、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎの発現レベルは、共導入したｉＲＦＰ６７０の発現レベルで標準化した。各実験は、それぞれ３回行った。
トランスフェクションの２４時間前に、２４ウェルプレートにＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を播種した。ＨｅＬａ細胞は０．５×１０５細胞／ウェルに、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は１．０×１０５細胞／ウェルになるようにした。作製した修飾キャップ化 ｈｍＡＧ１ ｍＲＮＡ（１００ｎｇ）を、ｉＲＦＰ６７０ ｍＲＮＡ（１００ｎｇ）とともに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクションした。トランスフェクションの４時間後に培地交換を行い、トランスフェクションの２４時間後に蛍光顕微鏡（ＩＸ８１：Ｏｌｙｍｐｕｓ）及びフローサイトメーター（ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、蛍光タンパク質の発現レベルを調べた。フローサイトメーターによる測定結果は、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎの発現レベルは、共導入したｉＲＦＰ６７０の発現レベルで標準化した。各実験は、それぞれ３回行った。
【0124】
＜結果＞
５’末端キャップの化学修飾は、翻訳開始やｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼし、翻訳活性を変化させる可能性がある。そこで、実施例１で高いキャッピング効率が確認されたＧＴＰアナログについて、当該ＧＴＰアナログによる５’末端キャップのキャップを有するｍＲＮＡを作製し、ヒト細胞にトランスフェクションして、ヒト細胞内での翻訳活性を調べた。
５’末端キャップの化学修飾は、翻訳開始やｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼし、翻訳活性を変化させる可能性がある。そこで、実施例１で高いキャッピング効率が確認されたＧＴＰアナログについて、当該ＧＴＰアナログによる５’末端キャップのキャップを有するｍＲＮＡを作製し、ヒト細胞にトランスフェクションして、ヒト細胞内での翻訳活性を調べた。
【0125】
結果を図５Ａ、Ｂ（ＨｅＬａ細胞）及び図６Ａ，Ｂ（２９３ＦＴ細胞）に示す。図５Ａ及び図６Ａは、蛍光顕微鏡による観察結果であり、図５Ｂ及び図６Ｂは、フローサイトメーターによる測定結果である。実施例１で、ＧＴＰによるキャップ構造と同じキャップ構造になるｍ７ＧＴＰ（＃１）のキャッピング効率がよいことが確認されたため、ｍ７ＧＴＰでキャップ化したｍＲＮＡをＲＮＡ ｓｔａｎｄａｒｄとして使用した。
ＨｅＬａ細胞及び２９３ＦＴ細胞での結果は、いずれも同様の傾向を示した。ｍ６ＧＴＰ（＃３）、ｄＧＴＰ（＃１１）、ｆＧＴＰ（＃１４）、Ｏｍ３’ＧＴＰ（＃１６）及びＧＴＰαＳ（＃２４）は、ｍ７ＧＴＰ（＃１）よりも高い翻訳活性を示した。Ｏｍ２’ＧＴＰ（＃１５）、及びＮＨ２ ２’ＧＴＰ（＃１７）は、ｍ７ＧＴＰ（＃１）と同程度の翻訳活性を示した。ａｒａＧＴＰ（＃１３）、Ｎ３ ２’ＧＴＰ（＃１９）、及びＮ３ ３’ｄＧＴＰ（＃２０）では、翻訳活性が若干低下したが、低下の幅は小さかった。ｍ１ＧＴＰ（＃２）、Ｃｌ６ＧＴＰ（＃６）、ＩＴＰ（＃９）、ＮＨ２ ３’ｄＧＴＰ（＃１８）、及びＯｐｐ３’ＧＴＰ（＃２１）では、翻訳活性が低下した。
以上の結果から、ＶＣＥ及び種々のＧＴＰアナログを用いて、ＲＮＡの５’末端に種々の構造のキャップを付加することにより、様々な翻訳活性を有するＲＮＡを作製できることが確認された。
ＨｅＬａ細胞及び２９３ＦＴ細胞での結果は、いずれも同様の傾向を示した。ｍ６ＧＴＰ（＃３）、ｄＧＴＰ（＃１１）、ｆＧＴＰ（＃１４）、Ｏｍ３’ＧＴＰ（＃１６）及びＧＴＰαＳ（＃２４）は、ｍ７ＧＴＰ（＃１）よりも高い翻訳活性を示した。Ｏｍ２’ＧＴＰ（＃１５）、及びＮＨ２ ２’ＧＴＰ（＃１７）は、ｍ７ＧＴＰ（＃１）と同程度の翻訳活性を示した。ａｒａＧＴＰ（＃１３）、Ｎ３ ２’ＧＴＰ（＃１９）、及びＮ３ ３’ｄＧＴＰ（＃２０）では、翻訳活性が若干低下したが、低下の幅は小さかった。ｍ１ＧＴＰ（＃２）、Ｃｌ６ＧＴＰ（＃６）、ＩＴＰ（＃９）、ＮＨ２ ３’ｄＧＴＰ（＃１８）、及びＯｐｐ３’ＧＴＰ（＃２１）では、翻訳活性が低下した。
以上の結果から、ＶＣＥ及び種々のＧＴＰアナログを用いて、ＲＮＡの５’末端に種々の構造のキャップを付加することにより、様々な翻訳活性を有するＲＮＡを作製できることが確認された。
【0126】
［実施例３］５’キャップの修飾
＜方法＞
（バイオコンジュゲーション）
実施例１で作製した短鎖ＲＮＡに対して、ＧＴＰ、Ｎ３ ２’ＧＴＰ、又はＮ３ ３’ｄＧＴＰを用いてＶＣＥによるキャッピング反応を行った。キャッピング反応は、ＧＴＰアナログとして前記のものを用いた以外は、実施例１と同様に行った。キャッピング反応後、変性ＰＡＧＥを行い、キャッピングされたＲＮＡ画分をゲルから切り出して精製した。得られたＲＮＡの２００ｐｍｏｌを、１００ｎｍｏｌのＤＢＣＯ－ｂｉｏｔｉｎ（Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ－ＰＥＧ４－ｂｉｏｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ａｌｄｒｉｃｈ）又はＤＢＣＯ－ＡＦ６４７（ＡＦ ６４７ ＤＢＣＯ、Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ）と混合し、１×ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ:５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１５０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７．６）、及び２５％ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を含む反応液中で、３７℃で、１時間反応させた。反応後、エタノール沈殿により未反応のＤＢＣＯを除去した後、変性ＰＡＧＥを行い、Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ７０００で観察した。
＜方法＞
（バイオコンジュゲーション）
実施例１で作製した短鎖ＲＮＡに対して、ＧＴＰ、Ｎ３ ２’ＧＴＰ、又はＮ３ ３’ｄＧＴＰを用いてＶＣＥによるキャッピング反応を行った。キャッピング反応は、ＧＴＰアナログとして前記のものを用いた以外は、実施例１と同様に行った。キャッピング反応後、変性ＰＡＧＥを行い、キャッピングされたＲＮＡ画分をゲルから切り出して精製した。得られたＲＮＡの２００ｐｍｏｌを、１００ｎｍｏｌのＤＢＣＯ－ｂｉｏｔｉｎ（Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ－ＰＥＧ４－ｂｉｏｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ａｌｄｒｉｃｈ）又はＤＢＣＯ－ＡＦ６４７（ＡＦ ６４７ ＤＢＣＯ、Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ）と混合し、１×ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ:５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１５０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７．６）、及び２５％ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を含む反応液中で、３７℃で、１時間反応させた。反応後、エタノール沈殿により未反応のＤＢＣＯを除去した後、変性ＰＡＧＥを行い、Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ７０００で観察した。
【0127】
（ＨｅＬａ細胞における蛍光標識ｍＲＮＡの可視化）
実施例２で作製したｈｍＡＧ１のｍＲＮＡに対して、ＧＴＰ、Ｎ３ ２’ＧＴＰ、又はＮ３ ３’ｄＧＴＰを用いてＶＣＥによるキャッピング反応、及びキャッピングされていないＲＮＡの分解処理を行った。キャッピング反応及びキャッピングされていないＲＮＡの分解処理は、ＧＴＰアナログとして前記のものを用いた以外は、実施例２と同様に行った。前記ｍＲＮＡの約１１ｐｍｏｌを１００ｎｍｏｌのＤＢＣＯ－ＡＦ６４７と混合し、１×ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ:５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１５０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７．６）、及び２５％ＤＭＳＯを含む反応液中で、３７℃で、１時間反応させた。反応後、反応液のカラム精製を行った後、変性ＰＡＧＥを行い、ｍＲＮＡが蛍光標識されていること及び未反応色素の持ち込みがないことを確認した。
トランスフェクションの２４時間前に、０．５×１０５細胞／ウェルとなるようにＨｅＬａ細胞をガラスボトム２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸを使って、５００ｎｇのｈｍＡＧ１ ｍＲＮＡを前記細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの４時間後に、ＰＢＳで細胞を洗浄し、１％パラホルムアルデヒド溶液処理を２０分間行い固定した。その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で観察を行った。
実施例２で作製したｈｍＡＧ１のｍＲＮＡに対して、ＧＴＰ、Ｎ３ ２’ＧＴＰ、又はＮ３ ３’ｄＧＴＰを用いてＶＣＥによるキャッピング反応、及びキャッピングされていないＲＮＡの分解処理を行った。キャッピング反応及びキャッピングされていないＲＮＡの分解処理は、ＧＴＰアナログとして前記のものを用いた以外は、実施例２と同様に行った。前記ｍＲＮＡの約１１ｐｍｏｌを１００ｎｍｏｌのＤＢＣＯ－ＡＦ６４７と混合し、１×ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ:５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１５０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７．６）、及び２５％ＤＭＳＯを含む反応液中で、３７℃で、１時間反応させた。反応後、反応液のカラム精製を行った後、変性ＰＡＧＥを行い、ｍＲＮＡが蛍光標識されていること及び未反応色素の持ち込みがないことを確認した。
トランスフェクションの２４時間前に、０．５×１０５細胞／ウェルとなるようにＨｅＬａ細胞をガラスボトム２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸを使って、５００ｎｇのｈｍＡＧ１ ｍＲＮＡを前記細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの４時間後に、ＰＢＳで細胞を洗浄し、１％パラホルムアルデヒド溶液処理を２０分間行い固定した。その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で観察を行った。
【0128】
＜結果＞
ＶＣＥによりキャッピングに使用できたＧＴＰアナログの中には、一級アミノ基やアジド基、プロパルギル基（アルキン）を持つものが含まれていた。これらの官能基は、タンパク質や核酸といった生体分子に機能性分子を共有結合で連結させるバイオコンジュゲーションに広く利用されている。そのため、これらの官能基を有する５’末端キャップには、バイオコンジュゲーション技術によりさらなる修飾を施すことができると考えられる。そこで、典型的なクリックケミストリーの一種であるアジド－アルキン間の反応を利用し、キャップ中のアジド基に、機能性分子を導入することを試みた。アルキンとしてＤＢＣＯ（Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）を含む２種の機能性分子（ＤＢＣＯ－ｂｉｏｔｉｎ、ＤＢＣＯ－ＡＦ６４７：図７参照）を用い、ＳＰＡＡＣ（ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ ａｚｉｄｅ－ａｌｋｙｎｅ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）反応を利用して、アジド基を有するキャップ化ＲＮＡを修飾した（図８参照）。
その結果を図９に示す。アジド基を有するキャップ化ＲＮＡに対して、特異的にビオチン又は蛍光色素を付加することができた。
ＶＣＥによりキャッピングに使用できたＧＴＰアナログの中には、一級アミノ基やアジド基、プロパルギル基（アルキン）を持つものが含まれていた。これらの官能基は、タンパク質や核酸といった生体分子に機能性分子を共有結合で連結させるバイオコンジュゲーションに広く利用されている。そのため、これらの官能基を有する５’末端キャップには、バイオコンジュゲーション技術によりさらなる修飾を施すことができると考えられる。そこで、典型的なクリックケミストリーの一種であるアジド－アルキン間の反応を利用し、キャップ中のアジド基に、機能性分子を導入することを試みた。アルキンとしてＤＢＣＯ（Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）を含む２種の機能性分子（ＤＢＣＯ－ｂｉｏｔｉｎ、ＤＢＣＯ－ＡＦ６４７：図７参照）を用い、ＳＰＡＡＣ（ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ ａｚｉｄｅ－ａｌｋｙｎｅ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）反応を利用して、アジド基を有するキャップ化ＲＮＡを修飾した（図８参照）。
その結果を図９に示す。アジド基を有するキャップ化ＲＮＡに対して、特異的にビオチン又は蛍光色素を付加することができた。
【0129】
次に、アジド基を有するキャップ化ｍＲＮＡに、ＳＰＡＡＣ反応を利用して蛍光色素ＡＦ６４７を導入した。図１０に示すように、アジド基を有するキャップ化ＲＮＡに特異的に、ＡＦ６４７が導入（ＡＦ６４７標識）されていることが確認できた。
【0130】
次に、前記ＡＦ６４７標識ｍＲＮＡ又はＡＦ６４７非標識ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、細胞内で導入ｍＲＮＡを検出できるかを確認した。
その結果を図１１に示す。図１１は、ＡＦ６４７標識ｍＲＮＡ又はＡＦ６４７非標識ｍＲＮＡを導入した細胞の共焦点顕微鏡画像である。ＡＦ６４７標識ｍＲＮＡを導入した細胞では、細胞質中に顆粒状に存在するＡＦ６４７の赤色蛍光が検出できた。
以上の結果から、ＶＣＥによるＧＴＰアナログでのキャッピングとバイオコンジュゲーション技術を組み合わせることにより、様々な機能性分子をＲＮＡのキャップ部位に導入できることが示された。
その結果を図１１に示す。図１１は、ＡＦ６４７標識ｍＲＮＡ又はＡＦ６４７非標識ｍＲＮＡを導入した細胞の共焦点顕微鏡画像である。ＡＦ６４７標識ｍＲＮＡを導入した細胞では、細胞質中に顆粒状に存在するＡＦ６４７の赤色蛍光が検出できた。
以上の結果から、ＶＣＥによるＧＴＰアナログでのキャッピングとバイオコンジュゲーション技術を組み合わせることにより、様々な機能性分子をＲＮＡのキャップ部位に導入できることが示された。
【0131】
［実施例４］環状ＲＮＡの生成
＜方法＞
実施例２と同様に、ｈｍＡＧ１のｍＲＮＡを試験管内転写法で合成し、カラム精製を行った。前記ｍＲＮＡ １００ｐｍｏｌを、２００ｐｍｏｌのｐＣｐ－ａｌｋｙｎｅ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、２０ｕｎｉｔのＴ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）、及び５００ｐｍｏｌのＡＴＰを含む反応液中で、１６℃で４８時間反応させた。反応産物はＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。精製で得られたＲＮＡの５’端を、実施例２と同様の条件で、Ｎ３ ３’ｄＧＴＰでキャッピングし、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。得られたＲＮＡ １０ｐｍｏｌを、０．１ｍＭ ＣｕＳＯ４、０．５ｍＭ ＢＴＴＡＡ（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ）、２５ｍＭ リン酸バッファー、２０％ ＤＭＳ、及びＯ、５ｍＭ アスコルビン酸を含む反応液中で、２５℃で１時間反応させた。その後、エタノール沈殿で精製し、得られたＲＮＡを変性ＰＡＧＥで確認した。
＜方法＞
実施例２と同様に、ｈｍＡＧ１のｍＲＮＡを試験管内転写法で合成し、カラム精製を行った。前記ｍＲＮＡ １００ｐｍｏｌを、２００ｐｍｏｌのｐＣｐ－ａｌｋｙｎｅ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、２０ｕｎｉｔのＴ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）、及び５００ｐｍｏｌのＡＴＰを含む反応液中で、１６℃で４８時間反応させた。反応産物はＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。精製で得られたＲＮＡの５’端を、実施例２と同様の条件で、Ｎ３ ３’ｄＧＴＰでキャッピングし、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。得られたＲＮＡ １０ｐｍｏｌを、０．１ｍＭ ＣｕＳＯ４、０．５ｍＭ ＢＴＴＡＡ（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ）、２５ｍＭ リン酸バッファー、２０％ ＤＭＳ、及びＯ、５ｍＭ アスコルビン酸を含む反応液中で、２５℃で１時間反応させた。その後、エタノール沈殿で精製し、得られたＲＮＡを変性ＰＡＧＥで確認した。
【0132】
＜結果＞
Ｎ３ ３’ｄＧＴＰでキャッピングし、３’末端にｐＣｐ－ａｌｋｙｎｅを導入したＲＮＡにおいて、ＣｕＡＡＣ反応を行うことで、図１２に示すように環状化ＲＮＡが得られると考えられる。
変性ＰＡＧＥの結果、Ｎ３ ３’ｄＧＴＰでキャッピングし、３’末端にｐＣｐ－ａｌｋｙｎｅを導入したＲＮＡ（Ｎ３ ３’ｄＧ－ｈｍＡＧ１－ａｌｋｙｎｅ）では、電気泳動の易動度の小さいバンドが確認された（図１３参照）。一方、天然型のキャップを有するＲＮＡ（ｍ７Ｇ－ｈｍＡＧ１）、天然型のキャップを有するＲＮＡの３’末端にｐＣｐ－ａｌｋｙｎｅを導入したＲＮＡ（ｍ７Ｇ－ｈｍＡＧ１－ａｌｋｙｎｅ）、及びＮ３ ３’ｄＧＴＰでキャッピングし、３’末端にｐＣｐ－ａｌｋｙｎｅを導入していないＲＮＡ（Ｎ３ ３’ｄＧ－ｈｍＡＧ１）では、そのようなバンドは確認できなかった。この結果から、Ｎ３ ３’ｄＧＴＰでキャッピングし、３’末端にｐＣｐ－ａｌｋｙｎｅを導入したＲＮＡでは、環状ＲＮＡが生成していると考えられた。
Ｎ３ ３’ｄＧＴＰでキャッピングし、３’末端にｐＣｐ－ａｌｋｙｎｅを導入したＲＮＡにおいて、ＣｕＡＡＣ反応を行うことで、図１２に示すように環状化ＲＮＡが得られると考えられる。
変性ＰＡＧＥの結果、Ｎ３ ３’ｄＧＴＰでキャッピングし、３’末端にｐＣｐ－ａｌｋｙｎｅを導入したＲＮＡ（Ｎ３ ３’ｄＧ－ｈｍＡＧ１－ａｌｋｙｎｅ）では、電気泳動の易動度の小さいバンドが確認された（図１３参照）。一方、天然型のキャップを有するＲＮＡ（ｍ７Ｇ－ｈｍＡＧ１）、天然型のキャップを有するＲＮＡの３’末端にｐＣｐ－ａｌｋｙｎｅを導入したＲＮＡ（ｍ７Ｇ－ｈｍＡＧ１－ａｌｋｙｎｅ）、及びＮ３ ３’ｄＧＴＰでキャッピングし、３’末端にｐＣｐ－ａｌｋｙｎｅを導入していないＲＮＡ（Ｎ３ ３’ｄＧ－ｈｍＡＧ１）では、そのようなバンドは確認できなかった。この結果から、Ｎ３ ３’ｄＧＴＰでキャッピングし、３’末端にｐＣｐ－ａｌｋｙｎｅを導入したＲＮＡでは、環状ＲＮＡが生成していると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【0133】
本発明によれば、簡易に、種々の修飾を５’キャップ部位に導入可能なＲＮＡのキャッピング方法、前記キャッピング方法を利用した修飾ＲＮＡの製造方法、及び前記修飾ＲＮＡの製造方法により製造された新規修飾ＲＮＡが提供される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】