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特許7529639診断アッセイに使用するためのタンパク質抗原としてのＲＥＰタンパク質
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-29
(45)【発行日】2024-08-06
(54)【発明の名称】診断アッセイに使用するためのタンパク質抗原としてのＲＥＰタンパク質
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20240730BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240730BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20240730BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240730BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18
G01N33/53 D ZNA
G01N33/53 N
G01N33/531 A
C12N15/13
【請求項の数】
10
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2021190179
(22)【出願日】2021-11-24
(62)【分割の表示】P 2019519006の分割
【原出願日】2017-10-10
(65)【公開番号】P2022036996
(43)【公開日】2022-03-08
【審査請求日】2021-12-15
(31)【優先権主張番号】16193119.1
(32)【優先日】2016-10-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】512151403
【氏名又は名称】ドイッチェス・クレープスフォルシュングスツェントルム
【氏名又は名称原語表記】ＤＥＵＴＳＣＨＥＳ ＫＲＥＢＳＦＯＲＳＣＨＵＮＧＳＺＥＮＴＲＵＭ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ツーア ハオゼン、ハラルト
(72)【発明者】
【氏名】デ ヴィリエール、エテル － ミケーレ
(72)【発明者】
【氏名】ブント、ティモ
(72)【発明者】
【氏名】エイレブレヒト、セバスチャン
【審査官】田ノ上 拓自
(56)【参考文献】
【文献】欧州特許出願公開第０２９６６１７６（ＥＰ，Ａ１）
【文献】エピトープ，薬学用語解説 - 日本薬学会，2007年08月31日，p.1，https://www.pharm.or.jp/dictionary/wiki.cgi?エピトープ [検索日：2023年4月6日]
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｇ０１Ｎ ３３／５３１
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＤＮＡ複製関連（Ｒｅｐ）タンパク質に結合するモノクロナール抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２または９のアミノ酸配列に含まれるエピトープに結合し、前記ＤＮＡ複製関連（Ｒｅｐ）タンパク質のスペックルに結合する、モノクロナール抗体またはその抗原結合断片。
【請求項2】
Ｒｅｐタンパク質について患者又は健康な個体からのプローブをスクリーニングするための、請求項１に記載のモノクロナール抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項3】
スクリーニングされる対象の試料中に存在するＲｅｐタンパク質の量を、健康な個体からの試料中のＲｅｐタンパク質の量と比較する、請求項２に記載の使用。
【請求項4】
前記プローブを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、ルミネセンスイムノアッセイ（ＬＩＡ）、及びストリップアッセイからなる群から選択されるアッセイでスクリーニングする請求項２または３に記載の使用。
【請求項5】
Ｒｅｐタンパク質を、請求項１に記載するモノクロナール抗体またはその抗原結合断片により検出する工程を含む、Ｒｅｐタンパク質を検出する方法。
【請求項6】
前記モノクロナール抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２のアミノ酸配列に含まれるエピトープに結合する前記モノクロナール抗体またはその抗原結合断片と、配列番号９のアミノ酸配列に含まれるエピトープに結合する前記モノクロナール抗体またはその抗原結合断片とを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記Ｒｅｐタンパク質を、血清試料、血漿試料、又は組織試料からなる群から選択される試料から検出する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項8】
前記Ｒｅｐタンパク質は、免疫組織化学的方法又は免疫蛍光顕微鏡法によって組織試料中に検出される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
（ａ）配列番号２または９のアミノ酸配列に含まれるエピトープに結合し、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＤＮＡ複製関連（Ｒｅｐ）タンパク質のスペックルに結合する、モノクロナール抗体またはその抗原結合断片と、（ｂ）シグナル生成化合物と
を含む、Ｒｅｐタンパク質を検出するためのキット。
【請求項10】
前記シグナル生成化合物は、前記モノクロナール抗体またはその抗原結合断片に直接結合している、請求項９に記載のキット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、例えば多発性硬化症（ＭＳ）などの神経変性疾患の診断に使用するためのＤＮＡ複製関連（Ｒｅｐ）タンパク質又は抗Ｒｅｐ抗体の検出及び定量化に関する。特に、本発明は、ＭＳＢＩ１ゲノムコード化Ｒｅｐタンパク質に関する。
【背景技術】
【0002】
多発性硬化症（ＭＳ）の病因は、解決されていない。したがって、ＭＳの診断及び／若しくはＭＳの監視又はＭＳの治療及び／若しくはＭＳの素因の評価に使用することができるＭＳのバイオマーカーが求められている。
【0003】
多発性硬化症（ＭＳ）は、脳及び脊髄の神経細胞を損傷するＭＳ病変の脱髄によって特徴付けられる。ＭＳの症状は、突然悪化する症状（再発、悪化、発作、発病）として、又は経時的に徐々に悪化する症状（進行型）としてのいずれかで生じる。脱髄は、炎症過程を開始し、それがＴ細胞並びにサイトカイン及び抗体の放出を誘発する。ＭＳの診断のために、とりわけ、神経画像、脳脊髄液の分析、及び誘発電位が使用される。
【0004】
１７個の、異なるが、部分的に関連したＤＮＡ分子のスペクトルが、異なる試験材料（多発性硬化症（ＭＳ）脳組織、ウシ血清、乳）から分離された（Ｆｕｎｋ，Ｇｕｎｓｔ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｇｕｎｓｔ，Ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｌａｍｂｅｒｔｏ，Ｇｕｎｓｔ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｗｈｉｔｌｅｙ，Ｇｕｎｓｔ ｅｔ ａｌ．２０１４）。
【0005】
これらの分離株のうち、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）関連分離株Ｓｐｈｉｎｘ １．７６（１，７５８ｂｐ；受託番号ＨＱ４４４４０４、（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ Ｌ．２０１１））と密接に関連する２つのＤＮＡ分子がＭＳ患者からの脳組織から分離された。これらの分離株は、それぞれ「ＭＳＢＩ１ゲノム」及び「ＭＳＢＩ２ゲノム」と命名されたＭＳＢＩ１．１７６（ＭＳＢＩ、多発性硬化症脳分離株）（１，７６６ｂｐ）及びＭＳＢＩ２．１７６（１，７６６ｂｐ）であった。ＭＳＢＩ１，１７６は、Ｓｐｈｉｎｘ １．７６の配列と９８％のヌクレオチド類似性を共有する。分離株の大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、それらの間で高い類似性を共有する推定ＤＮＡ複製タンパク質をコードする。別の共通の特徴は、ｉｔｅｒｏｎ様タンデムリピートの存在である。この反復領域のアラインメントは、単一ヌクレオチドのコアにおける変動を示す。このｉｔｅｒｏｎ様反復は、Ｒｅｐタンパク質の結合部位を構成し得る。分離株の配列は、受託番号ＬＫ９３１４９１（ＭＳＢＩ１．１７６）及びＬＫ９３１４９２（ＭＳＢＩ２．１７６）（Ｗｈｉｔｌｅｙ Ｃ．ｅｔ ａｌ．２０１４）としてＥＭＢＬ Ｄａｔａｂａｎｋに寄託されており、国際公開第２０１６／００５０６４号に整列され、記載されている。
【0006】
さらなる分離株が牛乳から得られた。これらの牛乳分離株（ＣＭＩ）は、ＣＭＩ１．２５２、ＣＭＩ２．２１４、及びＣＭＩ３．１６８であり、それぞれ「ＣＭＩ１ゲノム」、「ＣＭＩ２ゲノム」、及び「ＣＭＩ３ゲノム」と命名された。分離株の配列は、受託番号ＬＫ９３１４８７（ＣＭＩ１．２５２）、ＬＫ９３１４８８（ＣＭＩ２．２１４）、及びＬＫ９３１４８９（ＣＭＩ３．１６８）としてＥＭＢＬ Ｄａｔａｂａｎｋに寄託されており、国際公開第２０１６／００５０６４号に整列され、記載されている。
【0007】
本発明者らは、ＭＳＢＩ１ゲノムが転写ＲＮＡの有意な産生を示し、ＭＳＢＩ１ゲノムコード化Ｒｅｐタンパク質がヒト細胞において発現されることを見出した。本発明者らは、ＭＳＢＩ１及びＭＳＢＩ２ゲノムコード化Ｒｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ及びＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ）が、病原性スクリーニングアッセイのためのバイオマーカーを表すことを見出した。ＤＮＡ複製関連タンパク質（ＲｅｐＢ）として、Ｒｅｐタンパク質は、ＤＮＡ結合活性を有し、エピソーム又はウイルスＤＮＡ分子の複製開始に必須であり得る。本発明によるＭＳＢＩ１ゲノムコード化Ｒｅｐと構造的に類似するＲｅｐタンパク質は、インビボ及びインビトロの原核生物系内に記載された自己オリゴマー化及び凝集の著しい可能性を示す（Ｇｉｒａｌｄｏ，Ｍｏｒｅｎｏ－Ｄｉａｚ ｄｅ ｌａ Ｅｓｐｉｎａ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｔｏｒｒｅｉｒａ，Ｍｏｒｅｎｏ－Ｄｅｌ Ａｌａｍｏ ｅｔ ａｌ．２０１５）。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、抗原としてのＲｅｐタンパク質の使用に基づく病原体特異的診断スクリーニングアッセイのためのプラットフォームを提供する。
【0009】
特定の実施形態では、分離されたＤＮＡ（例えばＭＳＢＩ１）剤の病原活性とＲｅｐタンパク質発現との関連のために、抗Ｒｅｐ抗体が病原マーカーとして使用される。抗Ｒｅｐ抗体の増加量を含有する患者血清は、Ｒｅｐ特異的免疫応答を開始するのに十分に長い期間中に、対応する患者がＲｅｐ関連タンパク質に確実に曝露されたか又は自分でＲｅｐを発現したことを示す。ヒト抗体の標的として、Ｒｅｐタンパク質が抗原として使用される。抗Ｒｅｐ抗体の量の定量化に基づいて、急性ＭＳ及びＭＳの素因を診断又は監視することができる。試料中の誘導された抗Ｒｅｐ抗体又は発現されたＲｅｐタンパク質の増加量が、ＭＳの発症及び／又は状態を示すことが認識されているので、抗Ｒｅｐ抗体及びＲｅｐタンパク質の増加量は、それぞれＭＳの診断のための病原性バイオマーカーとして使用することができる。
【0010】
有利には、ＭＳについての病原性バイオマーカーは、血清又は血漿試料などの血液試料中で検出することができ、脳脊髄液から試料を得る必要はない。
【0011】
したがって、本発明は、神経変性疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）の診断に使用するためのＤＮＡ複製関連（Ｒｅｐ）タンパク質を提供する。特定の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、ＭＳＢＩ１ゲノムによってコードされており、（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる配列番号１の断片；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
（ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる配列番号１の断片；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
【0012】
他の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、ＭＳＢＩ２ゲノムによってコードされており、（ｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる配列番号８の断片；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつ配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
（ｉｉ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる配列番号８の断片；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつ配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
【0013】
他の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、ＣＭＩ１ゲノムによってコードされており、（ｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる配列番号１０の断片；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
（ｉｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる配列番号１０の断片；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
【0014】
他の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、ＣＭＩ２ゲノムによってコードされており、（ｉ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる配列番号１１の断片；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
（ｉｉ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる配列番号１１の断片；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
【0015】
他の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、ＣＭＩ３ゲノムによってコードされており、（ｉ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる配列番号１２の断片；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
（ｉｉ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる配列番号１２の断片；又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるアミノ酸配列を含む。
【0016】
特定の実施形態では、対照試料中のＲｅｐタンパク質量と比較して、対象からの試料中のＲｅｐタンパク質の増加量は、神経変性疾患、例えば、ＭＳの診断と相関する、すなわちＭＳを示す。本発明によれば、神経変性疾患、例えばＭＳの診断又は神経変性疾患、例えばＭＳの素因は、対照試料と比較して、少なくとも２倍のＲｅｐタンパク質の増加量によって示される。
【0017】
他の実施形態では、対照試料中の抗Ｒｅｐ抗体量と比較して、対象からの試料中の抗Ｒｅｐ抗体の増加量は、神経変性疾患、例えば、ＭＳの診断と相関する、すなわちＭＳを示す。本発明によれば、神経変性疾患、例えばＭＳの診断又は神経変性疾患、例えばＭＳの素因は、対照試料と比較して、少なくとも２倍の抗Ｒｅｐ抗体の増加量によって示される。
【0018】
本発明のＲｅｐタンパク質は、抗体又は細胞性免疫応答を検出するために既知の抗原を用いる実質的に任意のアッセイフォーマットにおいて用いられ得る。したがって、本発明はまた、細胞媒介、例えばＲｅｐタンパク質に対するＴ細胞免疫応答の検出を包含する。
【0019】
特定の実施形態では、本発明は、
（ａ）対象からの試料をＲｅｐタンパク質とインキュベートする工程；
（ｂ）Ｒｅｐタンパク質と免疫学的複合体を形成する対象からの試料中の抗体の量を検出する工程；及び
（ｃ）対照試料中の量と比較して、Ｒｅｐタンパク質に結合した抗体の量を神経変性疾患の診断と相関させる工程を含む、対象における神経変性疾患を診断する方法を提供する。
（ａ）対象からの試料をＲｅｐタンパク質とインキュベートする工程；
（ｂ）Ｒｅｐタンパク質と免疫学的複合体を形成する対象からの試料中の抗体の量を検出する工程；及び
（ｃ）対照試料中の量と比較して、Ｒｅｐタンパク質に結合した抗体の量を神経変性疾患の診断と相関させる工程を含む、対象における神経変性疾患を診断する方法を提供する。
【0020】
特定の実施形態では、本発明は、
（ａ）対象からの試料をＲｅｐタンパク質とインキュベートする工程；
（ｂ）Ｒｅｐタンパク質と免疫学的複合体を形成する対象からの試料中の抗体の量を検出する工程；及び
（ｃ）対照試料中の量と比較して、Ｒｅｐタンパク質に結合した抗体の量をＭＳの診断と相関させる工程を含む、対象におけるＭＳを診断する方法を提供する。
（ａ）対象からの試料をＲｅｐタンパク質とインキュベートする工程；
（ｂ）Ｒｅｐタンパク質と免疫学的複合体を形成する対象からの試料中の抗体の量を検出する工程；及び
（ｃ）対照試料中の量と比較して、Ｒｅｐタンパク質に結合した抗体の量をＭＳの診断と相関させる工程を含む、対象におけるＭＳを診断する方法を提供する。
【0021】
特定の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、固定化され、例えば支持体又は担体に付着させた後、固定化Ｒｅｐタンパク質を対象からの試料とインキュベートする。
【0022】
他の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質を細胞内で発現させた後、その細胞を対象からの試料とインキュベートする。
【0023】
特定の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質と免疫学的複合体を形成する抗体の量は、免疫学的複合体の抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるシグナル生成化合物、例えば検出可能に標識された二次抗体、好ましくは抗ヒト抗体に結合した追加の結合剤によって定量される。
【0024】
他の実施形態では、対象からの試料中の抗体を固定化した後、規定量のＲｅｐタンパク質とインキュベートする。
【0025】
好ましくは、対象からの試料及び対照試料は、血清又は血漿試料などの血液試料である。
【0026】
他の実施形態では、本発明は、
（ａ）抗Ｒｅｐ抗体によって対象からの試料中のＲｅｐタンパク質の量を検出する工程、及び
（ｂ）対照試料中の量と比較して、工程（ａ）で対象からの試料中に検出されたＲｅｐタンパク質の量を神経変性疾患の診断と相関させる工程を含む、患者における神経変性疾患を診断する方法を提供する。
（ａ）抗Ｒｅｐ抗体によって対象からの試料中のＲｅｐタンパク質の量を検出する工程、及び
（ｂ）対照試料中の量と比較して、工程（ａ）で対象からの試料中に検出されたＲｅｐタンパク質の量を神経変性疾患の診断と相関させる工程を含む、患者における神経変性疾患を診断する方法を提供する。
【0027】
他の実施形態では、本発明は、
（ａ）抗Ｒｅｐ抗体によって対象からの試料中のＲｅｐタンパク質の量を検出する工程、及び
（ｂ）対照試料中の量と比較して、工程（ａ）で対象からの試料中に検出されたＲｅｐタンパク質の量をＭＳの診断と相関させる工程を含む、患者におけるＭＳを診断する方法を提供する。
（ａ）抗Ｒｅｐ抗体によって対象からの試料中のＲｅｐタンパク質の量を検出する工程、及び
（ｂ）対照試料中の量と比較して、工程（ａ）で対象からの試料中に検出されたＲｅｐタンパク質の量をＭＳの診断と相関させる工程を含む、患者におけるＭＳを診断する方法を提供する。
【0028】
そのような実施形態では、対象からの試料及び対照試料は、血清試料、血漿試料、又は組織試料からなる群から選択される。
【0029】
特定の実施形態では、抗Ｒｅｐ抗体は、配列番号１の１～１３６、１３７～２２９、及び２３０～３２４のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列内のエピトープに結合する。例えば、抗体は、配列番号２又は配列番号３に含まれるエピトープに結合する。
【0030】
さらなる実施形態では、本発明は、（ａ）Ｒｅｐタンパク質、特にＭＳＢＩ１、ＭＳＢＩ２、ＣＭＩ１、ＣＭＩ２、又はＣＭＩ３Ｒｅｐタンパク質、（ｂ）シグナル生成化合物に結合した追加の結合剤、例えば、検出可能な標識に結合し、本発明による抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる抗ヒト抗体、及び（ｃ）（ａ）によるＲｅｐタンパク質又は抗Ｒｅｐ抗体を固定化するのに好適な固体マトリックスを含み、補助抗体が、試料、特に血清又は血漿試料中に存在すると推測される、ＭＳの診断に使用するためのキットを提供する。
【0031】
特定の実施形態では、キットは、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、ルミネセンスイムノアッセイ（ＬＩＡ）、及びストリップアッセイからなる群から選択される免疫検定法における使用のためにまとめられる。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】１Ｄサイズ分解Ｒｅｐタンパク質膜ストライプの血清インキュベーションによる２×８試料の例示的な血清スクリーニングを示す図である。Ｒｅｐタンパク質を含有するニトロセルロースストライプを、それぞれＭＳ血清試料プール又は健康なドナー血漿プールの２つの異なる血清／血漿希釈（１：５００及び１：２０００）とインキュベートした。Ｒｅｐ結合ヒトＩｇＧを抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ結合二次抗体で検出した。全長Ｒｅｐタンパク質標的のサイズの抗体シグナル（右側のクマシータンパク質染色及び抗Ｒｅｐ ＷＢ対照参照）をデンシトメトリーにより定量した。
【図2】ＥＬＩＳＡスクリーニングに基づくＲｅｐ特異的血清反応の定量化を示す図である。９６ウェルあたり５０、１００、２００、４００、又は８００ｎｇのＲｅｐタンパク質（標的抗原）をスポットした。ブロッキング及び洗浄後、Ｒｅｐタンパク質抗原を、プールしたＭＳ血清試料又はプールした対照血漿試料のいずれかと１：５００の希釈で６時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。洗浄及びＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ二次抗体とのインキュベーション及び最後の洗浄工程後、Ｒｅｐ結合ヒトＩｇＧの存在をＴＭＢ基質反応及び４５０ｎｍでの吸光度測定によって定量した。定量化は、シグナル強度とＲｅｐタンパク質（抗原）の量との良好な相関関係を明らかにする。平均して、ＭＳプールのシグナル強度レベルは、対照プールの強度を少なくとも１．９倍上回る。一般に、ＥＬＩＳＡに基づく血清スクリーニングは、少なくとも１：１０００の血清希釈について検出可能な血清抗体を明らかにし（データは示さず）、そのためこの実験の力価は、１：２０００～１：４０００の領域で１：１０００以上、又はプラットフォームの最適化後はさらに高くなる可能性がある。
【図3】ＥＬＩＳＡスクリーニングに基づくＲｅｐ特異的血清反応の定量化を示す図である。９６ウェルあたり２００ｎｇのＲｅｐタンパク質（標的抗原）をスポットした。ブロッキング及び洗浄後、Ｒｅｐタンパク質抗原を７つの個々のＭＳ血清又は７つの個々の対照血清のいずれかと１：５００の希釈、室温（ＲＴ）で６時間、２連でインキュベートした。洗浄及びＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ二次抗体とのインキュベーション及び最後の洗浄工程後、Ｒｅｐ結合ヒトＩｇＧの存在をＴＭＢ基質反応及び４５０ｎｍでの吸収測定によって定量した。ＭＳ試料の平均強度は、対照血清の平均強度を少なくとも８倍超えており、いくつかのＭＳ試料は、平均対照強度に対して１０～１６倍を示している。
【図4】ｙ座標上に示される抗Ｒｅｐ抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ１、及びＤ２の使用によって得られた免疫蛍光画像データを示す図である。
【図5】ｙ座標上に示される抗Ｒｅｐ抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ１、及びＤ２の使用によって得られた免疫蛍光画像データを示す図である。
【図6】ｙ座標上に示される抗Ｒｅｐ抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ１、及びＤ２の使用によって得られた免疫蛍光画像データを示す図である。
【図7】Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ１が、用いられた抗Ｒｅｐ抗体の群を示す、ウエスタンブロット分析を示す図である。
【図8】「最適化」（＝配列番号１３）対「原初」（＝野生型；配列番号１５）ＭＳＢＩ１配列の配列アラインメントを示す図である。最適化されたコドンは、マークされている。
【0033】
本発明は、病原性マーカーとしての抗Ｒｅｐ抗体の存在についての診断スクリーニングアッセイを提供する。抗Ｒｅｐ抗体の増加量を含有する試料は、Ｒｅｐタンパク質特異的免疫応答を誘導するのに十分に長い期間中に対応する対象がＲｅｐ関連タンパク質に明確に曝露されたか又は自らＲｅｐタンパク質を発現したことを示す。そのようなスクリーニングアッセイを用いて、抗Ｒｅｐ抗体の定量化に基づくＭＳの診断、予後、及び監視を実施することができる。代替の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、抗Ｒｅｐ抗体によって試料中で直接検出及び定量され得る。
【0034】
本明細書で使用される「Ｒｅｐタンパク質」は、ＤＮＡ複製関連タンパク質（ＲｅｐＢ）を指す。Ｒｅｐタンパク質は、ＤＮＡ結合活性を含み、エピソーム／ウイルスＤＮＡ分子の複製開始に必須であり得る。一般に、Ｒｅｐタンパク質は、スモールスフィンクスゲノムの群からのＲｅｐタンパク質を指す（Ｗｈｉｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。特に、Ｒｅｐタンパク質は、ＭＳＢＩ１ゲノムコード化Ｒｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ）、ＭＳＢＩ２ゲノムコード化Ｒｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ）、ＣＭＩ１ゲノムコード化Ｒｅｐタンパク質（ＣＭＩ１ Ｒｅｐ）、ＣＭＩ２ゲノムコード化Ｒｅｐタンパク質（ＣＭＩ２ Ｒｅｐ）、又はＣＭＩ３ゲノムコード化Ｒｅｐタンパク質（ＣＭＩ３ Ｒｅｐ）である。好ましくは、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質は、受託番号ＬＫ９３１４９１の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されたＭＳＢＩ１．１７６によってコードされ、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するか、又はＲｅｐタンパク質は、受託番号ＬＫ９３１４９２の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されたＭＳＢＩ２．１７６によってコードされるＭＳＢＩ２であり、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する（Ｗｈｉｔｌｅｙ，Ｇｕｎｓｔ ｅｔ ａｌ．２０１４）。別の好ましい実施形態では、ＣＭＩ１ Ｒｅｐタンパク質は、受託番号ＬＫ９３１４８７の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されているＣＭＩ１．２５２によってコードされ、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、ＣＭＩ２ Ｒｅｐタンパク質は、受託番号ＬＫ９３１４８８の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されているＣＭＩ２．２１４によってコードされ、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、ＣＭＩ３ Ｒｅｐタンパク質は、受託番号ＬＫ９３１４８９の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されているＣＭＩ３．１６８によってコードされ、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する。特に好ましい実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、配列番号１の１～２２９のアミノ酸から本質的になるスモールスフィンクスゲノム間で保存されたＮ末端領域、及び配列番号１の２３０～３２４のアミノ酸から本質的になるＭＳＢＩ１．１７６に特異的なＣ末端可変領域を含む。Ｎ末端保存領域は、配列番号１の１～１３６のアミノ酸から本質的になる推定の第１のＤＮＡ結合ドメイン及び配列番号１の１３７～２２９のアミノ酸から本質的になる第２の推定ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【0035】
「Ｒｅｐタンパク質」はまた、配列番号１又は配列番号８のアミノ酸配列を有するＲｅｐタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる、配列番号１又は配列番号８を有するタンパク質の断片及び変異体も包含する。好ましくは、そのような断片は、配列番号１又は配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質の免疫原性断片であり、これは、配列番号１又は配列番号８のＲｅｐタンパク質に対する抗Ｒｅｐタンパク質抗体に対する少なくとも１つのエピトープを包含し、好ましくは少なくとも７、８、９、１０、１５、２０、２５、又は５０個の連続アミノ酸を含む。特定の実施形態では、断片は、Ｒｅｐタンパク質のドメイン、例えばＮ末端保存領域、Ｃ末端可変領域、第１若しくは第２のＤＮＡ結合ドメインを含むか、又はそれらから本質的になる。配列番号１又は配列番号８を有するタンパク質の変異体は、配列番号１と比較して１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、又は付加を含み、配列番号１又は配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有し、変異体は、配列番号１又は配列番号８のアミノ酸配列を有するＲｅｐタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる。変異体の定義内に含まれるのは、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体を含有するポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む）、置換結合を有するポリペプチド、並びに当技術分野で既知の他の修飾、天然に存在するもの及び天然に存在しないものの両方である。Ｒｅｐタンパク質という用語は、異種アミノ酸配列、リーダー配列、又はＴａｇ配列などとの融合タンパク質を含む。本発明の特定の実施形態では、タンパク質タグは、上記のＲｅｐタンパク質、例えばＭＳＢＩ１、ＭＳＢＩ２、ＣＭＩ１、ＣＭＩ２、又はＣＭＩ３からなる群から選択されるＲｅｐタンパク質に遺伝的に移植される。特に、少なくとも１つのタンパク質タグが、配列番号１～３、８～１２、１４のうちのいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列からなるポリペプチドに付着している。そのようなタンパク質タグは、化学薬品又は酵素的手段によって除去可能であり得る。タンパク質タグの例は、精製のためのアフィニティータグ又はクロマトグラフィータグである。例えば、Ｒｅｐタンパク質は、例えばＨｉｓ６－タグ（配列番号４）、Ｔ７－タグ（配列番号５）、ＦＬＡＧ－タグ（配列番号６）、及びＳｔｒｅｐ－ＩＩ－タグ（配列番号７）、Ｈｉｓ－タグ（配列番号４）、Ｔ７－タグ（配列番号５）、ＦＬＡＧ－タグ（配列番号６）、又はＳｔｒｅｐＩＩ－タグ（配列番号７）からなる群から選択されるタグ配列に融合されてもよい。さらに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体などの蛍光タグを本発明によるＲｅｐタンパク質に付着させてもよい。
【0036】
特に好ましい実施形態では、ＭＳＢＩ１ゲノムコード化Ｒｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ）は、ヒト細胞株（例えば、ＨＥＫ－２９３、ＨＥＫ２９３ＴＴ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨａＣａＴ、ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、ＣａＳｋｉ、ＨＤＭＥＣ、Ｌ１２３６、Ｌ４２８、ＢＪＡＢ、ＭＣＦ７、Ｃｏｌｏ６７８、任意の初代細胞株）、及びウシ（例えば、ＭＡＣ－Ｔ）又はマウス細胞株（例えば、ＧＴ１－７）における産生についてコドン最適化されている。コドン最適化に関して、抗原をコードするヌクレオチド配列は、抗原が産生される対象の遺伝子において使用されるコドンを用いるように設計され得る。好ましい実施形態では、使用されるコドンは、「ヒト化」コドンである。そのようなコドン使用は、ヒト細胞における抗原の効率的な発現を提供する。コドン最適化の任意の好適な方法が使用され得る。そのような方法及びそのような方法の選択は、当業者に周知である。本発明によれば、ＭＳＢＩ１ゲノムコード化Ｒｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ）のそのようなコドン最適化変異体は、配列番号１３に示されるような配列を含むか又は有し、配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列を含むか又は有する。合計で、Ｒｅｐタンパク質をコードする９２７ヌクレオチドのＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ遺伝子の６８６ヌクレオチド（開始コドンから終止コドンまで）がコドン使用を改善するために置換された。例えばヒトのコドン使用に対する最適適応を伴う完全なコドン使用は、１のコドン適応指数（ＣＡＩ）によって記載され、これは全てのコドンがヒト発現に最適化されていることを示す。原初のＭＳＢＩ１コード化Ｒｅｐ遺伝子について、ヒト系について０．６７のＣＡＩが計算され、これは０．８のＣＡＩをはるかに下回っており、これは良好なコドン適応のためのより低い閾値と考えられる。ＭＳＢＩ１ ｒｅｐ遺伝子のコドン最適化後、０．９４のＣＡＩが最適化されたＤＮＡについて計算され、これはヒト系にとってほぼ最適なコドン適応を示す。特に、めったに使用されない１８個のコドンが変更され、それらのほとんどは、ヒト系において非常に低い使用頻度（１０％未満）でロイシンをコードするコドンを表す。配列番号１３のコドン最適化ＭＳＢＩ１配列対配列番号１５の野生型ＭＳＢＩ１配列の配列アラインメントを図８に示す。
【0037】
上記のＲｅｐ断片及びＲｅｐ変異体を含む本発明のＲｅｐタンパク質は、古典的な化学合成によって調製することができる。合成は、均一溶液中又は固相中で行うことができる。本発明によるポリペプチドはまた、組換えＤＮＡ技術によっても調製することができる。本発明によるＲｅｐタンパク質の産生及び精製の例は、例１に示されている。
【0038】
本明細書で使用される「対象」は、マウス、畜牛、例えばウシ、サル、及びヒトを含む哺乳動物の個体又は患者を指す。好ましくは、対象はヒト患者である。
【0039】
本明細書で使用される「試料」は、液体試料及び固体試料を包含する生物学的試料を指す。液体試料は、例えば血清、血漿、及び脳脊髄液（ＣＳＦ）などの血液液体を包含する。固体試料は、組織培養物又は生検標本などの組織試料を包含する。
【0040】
本明細書で使用される「と相関する」は、例えばＭＳの疾患状態と有意な相関関係を有する、それぞれ抗Ｒｅｐ抗体及びＲｅｐタンパク質の量、すなわちレベル又は力価を指す。相関関係は、試験される対象及び対照試料からの試料中に存在する量の差の程度を検出することによって決定される。「対照試料」とは、単一の試料又は様々な、すなわち２つより多い対照試料の平均を意味する。対照は、ＭＳと診断されていない健康な個人から得られる。あるいは、相関関係は、所定のカットオフ値を用いて試験される対象について試料中に存在する量の差の程度を検出することによって理論的に決定され得る。カットオフ値は、異なる疾患状態間、例えば健康状態と病気の状態との間の統計的に有意な分離を伴う基準値である。カットオフ値は、当技術分野で既知の統計的試験による、病歴を有する患者からの試験試料及び健康な試験群からの試料の十分に大きなパネルの統計分析によって決定することができる。
【0041】
特定の実施形態では、例えばＭＳの診断は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、又は１０００倍のタンパク質の増加量、すなわち対照試料と比較して、対象からの試料中のＲｅｐタンパク質及び抗Ｒｅｐ抗体それぞれによって示される。
【0042】
本明細書で使用される「抗Ｒｅｐ抗体」は、本発明の方法において検出可能なレベルでＲｅｐタンパク質に結合する抗体を指し、その親和性は、非Ｒｅｐタンパク質に対するよりも本発明のＲｅｐタンパク質に対してより強い。好ましくは、Ｒｅｐタンパク質に対する抗原親和性は、バックグラウンド結合よりも少なくとも２倍大きい。特に、抗Ｒｅｐ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ又はＭＳＢＩ２ Ｒｅｐに特異的である。特定の実施形態では、抗体は、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ、ＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ、ＣＭＩ１ Ｒｅｐ、ＣＭＩ２ Ｒｅｐ、及び／又はＣＭＩ３ Ｒｅｐに交差特異的である。特定の実施形態では、抗Ｒｅｐ抗体は、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ、ＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ、ＣＭＩ１ Ｒｅｐ、ＣＭＩ２ Ｒｅｐ、及び／又はＣＭＩ３ Ｒｅｐの少なくとも２つ、好ましくは全てに対して交差特異的であり、配列番号１の１～１３６のアミノ酸内のエピトープに結合する。
【0043】
全てのアッセイの共通の特徴は、Ｒｅｐタンパク質が、試料中に存在する任意のそのような抗体に結合することを可能にする条件下で、抗Ｒｅｐタンパク質抗体を含有すると推測される試料と接触することである。そのような条件は、典型的には、生理的温度、ｐＨ、及び過剰のＲｅｐタンパク質を使用するイオン強度である。Ｒｅｐタンパク質を試料とインキュベートした後、抗原を含む免疫複合体を検出する。特定の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質がシグナル生成化合物、例えば、検出可能な標識と結合するか、又は、シグナル生成化合物に結合した追加の結合剤、例えば二次抗ヒト抗体が、免疫複合体を検出するために使用される。
【0044】
抗Ｒｅｐ抗体は、タンパク質抗原としてのＲｅｐタンパク質に基づくアッセイにおいて検出及び定量することができ、それは試料中に推測される哺乳動物、例えばヒトの抗体の標的として役立つ。好ましくは、Ｒｅｐタンパク質は、精製され（例えば例１参照）、試料は、例えば血清又は血漿試料であり得る。本方法は、マトリックス上へのＲｅｐタンパク質の固定化、続いて固定化Ｒｅｐタンパク質の試料とのインキュベーションを含む。最後に、Ｒｅｐタンパク質と試料の抗体との間に形成された免疫学的複合体のＲｅｐ結合抗体は、シグナル生成化合物に結合された検出結合剤、例えば、ＨＲＰ－基質に基づく定量化を可能にする二次ＨＲＰ－（セイヨウワサビ－ペルオキシダーゼ）結合検出抗体によって定量される。このシグナル生成化合物又は標識は、それ自体が検出可能であるか、又は追加の化合物と反応して検出可能な生成物を生成し得る。
【0045】
他の実施形態では、抗Ｒｅｐ抗体は、最初に試料の抗体をマトリックス上に固定化し、続いて標識され得るか又はＴａｇタンパク質を含み得る規定量のＲｅｐタンパク質とインキュベートすることによって間接的に定量され、マトリックス上に固定化されて存在する抗Ｒｅｐ抗体は、タンパク質－試料液体混合物からＲｅｐタンパク質を捕捉し、続いて結合Ｒｅｐタンパク質を定量する。
【0046】
他の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質を細胞内で発現させることができ、これらの細胞を試料とインキュベートする。その後、細胞によって発現されたＲｅｐタンパク質に結合した試料からの抗Ｒｅｐ抗体を検出し定量する。
【0047】
イムノアッセイの設計は、かなり変動を受け、多くのフォーマットが当技術分野で既知である。プロトコルは、例えば、固体支持体又は免疫沈降を使用し得る。ほとんどのアッセイは、シグナル生成化合物、例えば標識抗体又は標識Ｒｅｐタンパク質に結合した結合剤の使用を伴い、標識は、例えば、酵素分子、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、又は染料分子であり得る。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイもまた既知であり、その例は、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジンを利用するアッセイ、並びにＥＬＩＳＡアッセイなどの酵素標識及び媒介イムノアッセイである。
【0048】
イムノアッセイは、異種又は同種のフォーマットであり得、標準タイプ又は競合タイプであり得る。不均一フォーマットでは、ポリペプチド（Ｒｅｐタンパク質又は抗Ｒｅｐ抗体）は、典型的には、インキュベーション後のポリペプチドからの試料の分離を容易にするために、固体マトリックス又は支持体又は担体に結合される。使用できる固体支持体の例は、ニトロセルロース（例えば、膜又はマイクロタイターウェル形態）、ポリ塩化ビニル（例えば、シート又はマイクロタイターウェル）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）、ポリフッ化ビニリデン（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎとして既知）、ジアゾ紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、プロテインＡビーズである。抗原性ポリペプチドを含有する固体支持体は、典型的には、それを試験試料から分離した後、結合した抗Ｒｅｐ抗体を検出する前に洗浄される。標準フォーマット及び競合フォーマットの両方が当技術分野において既知である。
【0049】
均一フォーマットでは、試験試料を溶液中のＲｅｐタンパク質とインキュベートする。例えば、それは、形成される任意のＲｅｐタンパク質－抗体複合体を沈殿させる条件下にあり得る。これらのアッセイのための標準フォーマット及び競合フォーマットの両方が当技術分野において既知である。
【0050】
標準フォーマットでは、抗体－Ｒｅｐタンパク質複合体中の抗Ｒｅｐ抗体の量は、直接監視される。これは、抗Ｒｅｐ抗体上のエピトープを認識する（標識された）抗異種（例えば抗ヒト）抗体が複合体形成により結合するかどうかを決定することにより達成され得る。競合フォーマットでは、試料中の抗Ｒｅｐ抗体の量は、複合体中の既知量の標識抗体（又は他の競合配位子）の結合に対する競合効果を監視することによって推論される。
【0051】
抗Ｒｅｐ抗体（又は競合アッセイの場合には競合抗体の量）を含んで形成された複合体は、フォーマットに応じて、いくつかの既知の技術のいずれかによって検出される。例えば、複合体中の非標識抗Ｒｅｐ抗体は、標識（例えば、ＨＲＰなどの酵素標識）と複合体を形成した抗異種Ｉｇの接合体を使用して検出され得る。
【0052】
免疫沈降又は凝集アッセイフォーマットでは、Ｒｅｐタンパク質と抗Ｒｅｐ抗体との間の反応は、溶液又は懸濁液から沈殿するネットワークを形成し、沈殿物の可視層又はフィルムを形成する。試料中に抗Ｒｅｐ抗体が存在しない場合、目に見える沈殿物は、形成されない。
【0053】
選択される固相は、ポリマービーズ又はガラスビーズ、ニトロセルロース、微粒子、反応トレイのマイクロウェル、試験管、及び磁気ビーズを含むことができる。シグナル生成化合物は、酵素、発光化合物、色原体、放射性元素、及び化学発光化合物を含むことができる。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、及びβ－ガラクトシダーゼが挙げられる。エンハンサー化合物の例としては、ビオチン、抗ビオチン、及びアビジンが挙げられる。エンハンサー化合物結合メンバーの例としては、ビオチン、抗ビオチン、及びアビジンが挙げられる。
【0054】
さらなる実施形態では、本発明は、試料中のＲｅｐタンパク質の増加量が神経変性疾患、例えばＭＳの診断又は素因と相関するか、又は疾患、例えばＭＳを監視するために、又は疾患、例えばＭＳの治療を監視するために使用される方法を提供する。そのような実施形態では、試料中のＲｅｐタンパク質は、抗Ｒｅｐ抗体によって検出される。
【0055】
そのような方法は、
（ａ）抗Ｒｅｐ抗体によって対象からの試料中のＲｅｐタンパク質の量を検出する工程、及び
（ｂ）対照試料中の量と比較して、工程（ａ）で対象からの試料中に検出されたＲｅｐタンパク質の量を神経変性疾患、例えばＭＳの診断と相関させる工程を含む。
（ａ）抗Ｒｅｐ抗体によって対象からの試料中のＲｅｐタンパク質の量を検出する工程、及び
（ｂ）対照試料中の量と比較して、工程（ａ）で対象からの試料中に検出されたＲｅｐタンパク質の量を神経変性疾患、例えばＭＳの診断と相関させる工程を含む。
【0056】
血清又は血漿試料中のＲｅｐタンパク質の検出のためのそのような方法において使用することができるアッセイの例としては、免疫沈降、免疫蛍光、ドットブロッティング、及びウエスタンブロットが挙げられるが、これらに限定されない。
【0057】
例えば、血清試料を試料中のＲｅｐタンパク質を捕捉するために抗Ｒｅｐタンパク質抗体とインキュベートし、続いてＲｅｐタンパク質を免疫沈降させる工程、その後ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより検出する工程が行われ得る。
【0058】
さらなる例では、ドットブロット膜を血清とインキュベートし、続いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットの工程が行われ得る。
【0059】
さらなる例では、試料の血清希釈をＳＤＳ－Ｐａｇｅに充填し、続いてウエスタンブロットする。
【0060】
さらなる実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、免疫組織化学的方法又は免疫蛍光顕微鏡法によって組織試料中に検出される。
【0061】
特定の実施形態では、抗Ｒｅｐ抗体は、試料中のＲｅｐタンパク質の検出又は捕捉のために使用される。
【0062】
「抗体」という用語は、好ましくは、異なるエピトープ特異性を有するプールされたポリクローナル抗体から本質的になる抗体、及び別個のモノクローナル抗体調製物に関する。本明細書で使用される場合、「抗体」（Ａｂ）又は「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）という用語は、無傷の免疫グロブリン分子並びにＲｅｐタンパク質に特異的に結合することができる抗体断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片など）を含むことを意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、無傷の抗体のＦｃ断片を欠いており、循環からより迅速に取り除かれ、無傷の抗体よりも非特異的でない組織結合を有し得る。したがって、これらの断片、及びＦＡＢ又は他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物が好ましい。さらに、本発明の目的に有用な抗体としては、キメラ、一本鎖、多機能（例えば二重特異性）、及びヒト化抗体、又はヒト抗体が挙げられる。
【0063】
特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、シグナル生成化合物と結合しており、例えば検出可能な標識を担持している。抗体又はその抗原結合断片は、例えば放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、又は酵素で直接若しくは間接的に検出可能に標識することができる。当業者は、抗体に結合するための他の好適な標識が既知であるか、又は日常的な実験を使用してそれを確認することができる。
【0064】
抗Ｒｅｐ抗体は、好ましくは、当業者に周知の方法によって、配列番号１若しくは配列番号８のアミノ酸配列を有するＲｅｐタンパク質又はその断片に対して発生される（生成される）。
【0065】
特定の実施形態では、スモールスフィンクスゲノム（抗スモールスフィンクス様Ｒｅｐ抗体又は抗ＳＳＬＲｅｐ抗体）の群からのいくつか又は全ての種類のＲｅｐタンパク質に結合することができる抗Ｒｅｐ抗体を本発明の方法において使用する。そのような抗ＳＳＬＲｅｐ抗体は、配列番号１のアミノ酸１～２２９からのＲｅｐタンパク質の保存Ｎ末端領域内のエピトープに結合する。特定の実施形態では、配列番号２（配列番号１のアミノ酸３２～４９）又は配列番号３（配列番号１のアミノ酸１９７～２１６）内のエピトープに結合する抗ＳＳＬＲｅｐ型の抗Ｒｅｐ抗体が使用される。配列番号２及び配列番号３のペプチド断片は、スモールスフィンクスゲノムグループからのＲｅｐタンパク質の間で高度に保存されており、それらの親水性のために露出されているように見える。抗ＳＳＬＲｅｐ型の抗Ｒｅｐ抗体は、例えばマウス若しくはモルモットを、配列番号２若しくは３に示すようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドによって、又は配列番号１のアミノ酸１～２２９の保存Ｎ末端Ｒｅｐタンパク質領域に由来する、好ましくは少なくとも８～１５個のアミノ酸を含む、他の免疫原性断片によって、免疫化することによって産生させ得る。
【0066】
さらなる実施形態では、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体が使用される。そのような抗体は、例えば、マウス又はモルモットなどの哺乳動物を、配列番号１のアミノ酸配列を有する全長Ｒｅｐタンパク質で免疫化することによって産生され得る。
【0067】
好ましくは、本発明の方法は、例えば血液、血清、髄液、又は脳液などの異なる種類の体液中でピコグラムからフェムトグラムまでの範囲のＲｅｐタンパク質を検出することができる抗Ｒｅｐ抗体を使用する。
【0068】
本発明の方法では、特定の種類の抗Ｒｅｐ抗体又は２種類以上の異なる種類の抗Ｒｅｐ抗体のプールのいずれかを使用してもよい。異なる種類の抗Ｒｅｐ抗体のプールが使用される場合、抗Ｒｅｐ抗体プールは、Ｒｅｐタンパク質の異なるドメイン、例えば第１のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸１～１３６）、第２のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、配列番号２のアミノ酸１３７～２２９）、及び／又は可変ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸２３０～３２４）、特にＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質（配列番号１）の異なるエピトープに結合する異なる抗Ｒｅｐ抗体を含み得る。
【0069】
さらなる実施形態では、抗Ｒｅｐ抗体は、Ｒｅｐタンパク質について患者及び／又は健康な個体からのプローブのスクリーニングに使用される。例えば神経変性疾患の患者の組織中のＲｅｐタンパク質の選択的検出は、試料中で検出されたＲｅｐタンパク質の分離されたＤＮＡゲノムと試料が由来する患者の疾患との間の因果関係を示している。
【0070】
抗Ｒｅｐ抗体法によるＲｅｐタンパク質の検出のために、例えば、ウエスタンブロット、免疫蛍光顕微鏡法、又は免疫組織化学的方法などが適用され得る。
【0071】
特定の実施形態では、特定の細胞内局在でＲｅｐタンパク質を検出することができる抗Ｒｅｐ抗体が使用される。例えば、抗Ｒｅｐ抗体は、細胞質、核膜、及び核中のＲｅｐタンパク質を検出し得るか、又は細胞質中のスペックルを検出し得る。そのような抗Ｒｅｐ抗体群の例を表１に示す：
【0072】
【表1】
【0073】
Ａ群の抗Ｒｅｐ抗体は、配列番号３に示されるアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸１９８～２１７）内にエピトープを有し、スモールスフィンクスゲノム群（例えばＭＳＢＩ２、ＣＭＩ１、ＣＭＩ４）のこの保存されたエピトープを含むＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質及びＲｅｐタンパク質を検出することができる。免疫蛍光アッセイにおいて、そのような抗Ｒｅｐ抗体は、特異的Ｒｅｐ局在パターンを検出し、主な局在は、細胞質及び核膜にわたって均一に分布しており、核内には、追加の弱く均一に分布した局在が見られる。そのようなＡ群抗体の例は、例においてＡ群抗体として用いられた抗体ＡＢ０１ ５２３－１－１（ＤＳＭ ＡＣＣ３３２７）である。
【0074】
Ｂ群の抗Ｒｅｐ抗体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸３３～５０）内にエピトープを有し、スモールスフィンクスゲノム群（例えばＭＳＢＩ２、ＣＭＩ１、ＣＭＩ４）のこの保存されたエピトープを含むＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質及びＲｅｐタンパク質を検出することができる。免疫蛍光アッセイにおいて、そのような抗Ｒｅｐ抗体は、Ｒｅｐタンパク質のスペックル（細胞質凝集体）（しばしば核膜の周辺にある）を特異的に検出する。そのようなＢ群抗体の例は、例においてＢ群抗体として用いられたＡＢ０２ ３０４－４－１（ＤＳＭ ＡＣＣ３３２８）と命名された抗体である。
【0075】
Ｃ群の抗Ｒｅｐ抗体は、ＭＳＢＩ１（配列番号１）の構造的エピトープを特異的に検出する。免疫蛍光アッセイにおいて、そのような抗Ｒｅｐ抗体は、特異的Ｒｅｐ局在パターンを検出し、主な局在は、細胞質及び核膜にわたって均一に分布しており、核内には、追加の弱く均一に分布した局在が見られる。そのようなＣ群抗体の例は、例においてＣ群抗体として用いられた抗体ＭＳＢＩ１ ３８１－６－２（ＤＳＭ ＡＣＣ３３２９）である。
【0076】
Ｄ群の抗Ｒｅｐ抗体は、ＭＳＢＩ１（配列番号１）の構造的エピトープを特異的に検出し、「Ｄ１」と命名された抗体ＭＳＢＩ１ ９６１－２－２は、ＭＳＢＩ１のＣ末端ドメインにおいて配列番号９（アミノ酸配列２８１～２８７）に示されるエピトープを検出する。「Ｄ２」と命名された抗体ＭＳＢＩ１ ７６１－５－１（ＤＳＭ ＡＣＣ３３２８）は、インビボ条件下で排他的にアクセス可能であり、ウエスタンブロットではアクセス不可能であるＭＳＢＩ１の３Ｄ構造エピトープを検出する。免疫蛍光アッセイにおいて、そのような抗Ｒｅｐ抗体は、Ｒｅｐタンパク質のスペックル（細胞質凝集体）（しばしば核膜の周辺にある）を特異的に検出する。
【0077】
特定の実施形態では、Ａ、Ｂ、Ｃ、若しくはＤ群の抗Ｒｅｐ抗体；又は少なくとも２つの異なるＡ、Ｂ、Ｃ、若しくはＤ群の抗Ｒｅｐ抗体の組み合わせを使用して、プローブ中のＲｅｐタンパク質局在化の種類及びそのようなＲｅｐタンパク質局在化が病原体機能と相関するか否かを決定する。例えば、スペックルが存在するか否かなどである。特定の実施形態、すなわち本発明の方法又はキットでは、Ａ及びＢ群から選択される少なくとも１つの抗Ｒｅｐ抗体は、Ｃ及びＤ群から選択される少なくとも１つの抗Ｒｅｐ抗体と組み合わされる。特定の実施形態、すなわち本発明の方法又はキットでは、Ａ群の抗Ｒｅｐ抗体は、Ｂ、Ｃ、及びＤ群から選択される少なくとも１つのさらなる抗Ｒｅｐ抗体と組み合わされる。例えば、Ａ群の抗Ｒｅｐ抗体は、Ｃ群及びＤ群のさらなる抗Ｒｅｐ抗体と組み合わせてもよい。異なる群の抗Ｒｅｐ抗体のそのような組み合わせは、特にＭＳの診断に関して、診断評価の明確さを増大させる。これらのＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤ群抗体は、ＭＳの診断における使用に好ましい。
【0078】
以下の抗体は、２０１７年９月２８日にドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）（ＤＳＭＺ）［ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）］に寄託された：
ＤＳＭ ＡＣＣ３３２７に基づく抗体ＡＢ０１ ５２３－１－１；
ＤＳＭ ＡＣＣ３３２８に基づく抗体ＡＢ０２ ３０４－４－１；
ＤＳＭ ＡＣＣ３３２９に基づく抗体ＭＳＢＩ１ ３８１－６－２；
ＤＳＭ ＡＣＣ３３３０に基づく抗体ＭＳＢＩ１ ７６１－５－１。
抗体ＭＳＢＩ１ ９６１－２－２（ＤＳＭ ＡＣＣ３３３１）は、２０１７年１０月６日にＤＳＭＺに寄託された。
ＤＳＭ ＡＣＣ３３２７に基づく抗体ＡＢ０１ ５２３－１－１；
ＤＳＭ ＡＣＣ３３２８に基づく抗体ＡＢ０２ ３０４－４－１；
ＤＳＭ ＡＣＣ３３２９に基づく抗体ＭＳＢＩ１ ３８１－６－２；
ＤＳＭ ＡＣＣ３３３０に基づく抗体ＭＳＢＩ１ ７６１－５－１。
抗体ＭＳＢＩ１ ９６１－２－２（ＤＳＭ ＡＣＣ３３３１）は、２０１７年１０月６日にＤＳＭＺに寄託された。
【0079】
さらなる実施形態では、ＭＳの診断に使用するためのキットが提供される。キットは、抗Ｒｅｐ抗体及び／又はＲｅｐタンパク質を検出するための材料を、ＭＳの診断のためのアッセイにおける材料の使用のための説明書と共に含み得る。キットは、以下の構成要素：本発明によるバイオマーカー、すなわち、Ｒｅｐタンパク質及び抗Ｒｅｐ抗体、例えば、それぞれ表１の抗体；シグナル生成化合物、捕捉剤を付着させるための固体マトリックス、試料用の希釈剤、洗浄緩衝液のうちの１つ以上を含み得る。シグナル生成化合物は、本発明のバイオマーカーに結合することができる追加の結合剤に結合しているか、又は本発明のバイオマーカーと直接結合しているかのいずれかである検出可能な標識を指す。
【0080】
以下の例により本発明をさらに説明するが、これらに限定されない。
【0081】
例１：
ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質精製
ＭＳＢＩ１ゲノム内で同定された全長Ｒｅｐオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするヌクレオチド酸分子を、大腸菌高収率無細胞インビトロ翻訳系（Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）無細胞大腸菌発現システム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づくタンパク質発現を可能にする発現プラスミド（ｐＥＸＰ５－ＣＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。インビトロ翻訳反応内で配列番号１のアミノ酸配列を有する合成Ｒｅｐタンパク質を、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０の５ｍＭイミダゾールを含有する２０反応容積の８Ｍ尿素試料緩衝液ｐＨ８．０を添加することによって変性させる。Ｒｅｐタンパク質は、その後、Ｒｅｐタンパク質に融合したＣ末端Ｈｉｓ６－タグに基づく変性条件下（洗浄用に２０ｍＭイミダゾール及びタンパク質溶出用に３００ｍＭイミダゾール）で精製される。精製の質は、クマシータンパク質染色及び抗Ｒｅｐタンパク質抗体を用いたウエスタンブロッティングによって決定される。Ｒｅｐタンパク質純度は、デンシトメトリーで計算され、９５％以上である。精製タンパク質を直接ＥＬＩＳＡに基づく血清スクリーニングに使用するか、又はＳＤＳ－Ｐａｇｅに供し、続いてニトロセルロース膜上に転写ブロッティングして、１Ｄサイズ分解Ｒｅｐタンパク質膜ストライプの血清インキュベーションを行う。
ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質精製
ＭＳＢＩ１ゲノム内で同定された全長Ｒｅｐオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするヌクレオチド酸分子を、大腸菌高収率無細胞インビトロ翻訳系（Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）無細胞大腸菌発現システム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づくタンパク質発現を可能にする発現プラスミド（ｐＥＸＰ５－ＣＴ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。インビトロ翻訳反応内で配列番号１のアミノ酸配列を有する合成Ｒｅｐタンパク質を、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０の５ｍＭイミダゾールを含有する２０反応容積の８Ｍ尿素試料緩衝液ｐＨ８．０を添加することによって変性させる。Ｒｅｐタンパク質は、その後、Ｒｅｐタンパク質に融合したＣ末端Ｈｉｓ６－タグに基づく変性条件下（洗浄用に２０ｍＭイミダゾール及びタンパク質溶出用に３００ｍＭイミダゾール）で精製される。精製の質は、クマシータンパク質染色及び抗Ｒｅｐタンパク質抗体を用いたウエスタンブロッティングによって決定される。Ｒｅｐタンパク質純度は、デンシトメトリーで計算され、９５％以上である。精製タンパク質を直接ＥＬＩＳＡに基づく血清スクリーニングに使用するか、又はＳＤＳ－Ｐａｇｅに供し、続いてニトロセルロース膜上に転写ブロッティングして、１Ｄサイズ分解Ｒｅｐタンパク質膜ストライプの血清インキュベーションを行う。
【0082】
例２：
血清マスタープレートの生成
血清試料を最初に等分して、試料の凍結融解サイクルを低減する。次いで、Ｕ字型９６ウェルプレート中、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム最終濃度で安定化されたＰＢＳ ｐＨ７．２中に１：１希釈の血清を生成することによってマスタープレートを確立する。このプレートは、４℃で保管し、滅菌条件下で取り扱うと少なくとも２ヶ月間安定であり、個々のスクリーニング実験の前にさらなる血清希釈（１：２０の最終希釈）のためのテンプレートとして使用される。
血清マスタープレートの生成
血清試料を最初に等分して、試料の凍結融解サイクルを低減する。次いで、Ｕ字型９６ウェルプレート中、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム最終濃度で安定化されたＰＢＳ ｐＨ７．２中に１：１希釈の血清を生成することによってマスタープレートを確立する。このプレートは、４℃で保管し、滅菌条件下で取り扱うと少なくとも２ヶ月間安定であり、個々のスクリーニング実験の前にさらなる血清希釈（１：２０の最終希釈）のためのテンプレートとして使用される。
【0083】
例３：
１Ｄサイズ分解Ｒｅｐタンパク質膜ストライプの血清インキュベーションによる血清スクリーニング
１Ｄ分解Ｒｅｐタンパク質膜ストライプと血清とのインキュベーションに基づくスクリーニングアッセイのために、２０μｇ精製Ｒｅｐタンパク質をＳｉｇｍａ Ｔｒｕ－ＰＡＧＥ ４～２０％プレキャストゲルに充填する。ゲルポケットを分離する壁は、ゲル充填の前に除去され、サイズマーカーのための１つの大きなポケット及び１つのポケットが生じる。１Ｄサイズ分解ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、標準的な湿式／タンク転写ブロットプロトコルを使用してタンパク質をニトロセルロース膜上に転写ブロットする。その後、ブロット膜上のタンパク質（約４０ｋＤａのランニングハイトにある全長Ｒｅｐタンパク質の本質的に１つのバンド）をＰｏｎｃｅａｕＳで可視化して転写品質をチェックし、完全な１Ｄサイズ分解膜の幅２ｍｍ及び高さ２ｍｍの膜ストライプのカットを準備する。次いで、ストライプを各５００μｌの無血清ブロッキング試薬（Ｇｅｎｅｔｅｘ Ｔｒｉｄｅｎｔユニバーサルブロッキング試薬）で１時間ブロッキングする。その後、血清は、２つの異なる血清希釈に基づいて特徴付けられる。血清インキュベーションを４℃で１４時間（一晩）線形振盪装置で実行する。その後、膜ストリップを室温で３×５分間、ＰＢＳ－Ｔ ｐＨ７．２の０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０で洗浄する。血清内のＲｅｐ特異的結合ヒトＩｇＧの検出は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体と室温で１時間インキュベートすることによって行われる。室温で３×５分間、ＰＢＳ－Ｔ ｐＨ７．２の０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄した後、各個々の血清インキュベーションのストリップをプラスチックホイル上にテープで固定する。次いで、ホイルをＥＣＬ基質（Ｂｉｏｒａｄ Ｃｌａｒｉｔｙ）とインキュベートして、ＢｉｏＲａｄ ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ検出システムで結合ヒトＩｇＧを可視化する。タンパク質膜上のＲｅｐバンドに特異的に結合するＩｇＧの量に対応するシグナルをデンシトメトリーによって定量する。
１Ｄサイズ分解Ｒｅｐタンパク質膜ストライプの血清インキュベーションによる血清スクリーニング
１Ｄ分解Ｒｅｐタンパク質膜ストライプと血清とのインキュベーションに基づくスクリーニングアッセイのために、２０μｇ精製Ｒｅｐタンパク質をＳｉｇｍａ Ｔｒｕ－ＰＡＧＥ ４～２０％プレキャストゲルに充填する。ゲルポケットを分離する壁は、ゲル充填の前に除去され、サイズマーカーのための１つの大きなポケット及び１つのポケットが生じる。１Ｄサイズ分解ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、標準的な湿式／タンク転写ブロットプロトコルを使用してタンパク質をニトロセルロース膜上に転写ブロットする。その後、ブロット膜上のタンパク質（約４０ｋＤａのランニングハイトにある全長Ｒｅｐタンパク質の本質的に１つのバンド）をＰｏｎｃｅａｕＳで可視化して転写品質をチェックし、完全な１Ｄサイズ分解膜の幅２ｍｍ及び高さ２ｍｍの膜ストライプのカットを準備する。次いで、ストライプを各５００μｌの無血清ブロッキング試薬（Ｇｅｎｅｔｅｘ Ｔｒｉｄｅｎｔユニバーサルブロッキング試薬）で１時間ブロッキングする。その後、血清は、２つの異なる血清希釈に基づいて特徴付けられる。血清インキュベーションを４℃で１４時間（一晩）線形振盪装置で実行する。その後、膜ストリップを室温で３×５分間、ＰＢＳ－Ｔ ｐＨ７．２の０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０で洗浄する。血清内のＲｅｐ特異的結合ヒトＩｇＧの検出は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体と室温で１時間インキュベートすることによって行われる。室温で３×５分間、ＰＢＳ－Ｔ ｐＨ７．２の０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄した後、各個々の血清インキュベーションのストリップをプラスチックホイル上にテープで固定する。次いで、ホイルをＥＣＬ基質（Ｂｉｏｒａｄ Ｃｌａｒｉｔｙ）とインキュベートして、ＢｉｏＲａｄ ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ検出システムで結合ヒトＩｇＧを可視化する。タンパク質膜上のＲｅｐバンドに特異的に結合するＩｇＧの量に対応するシグナルをデンシトメトリーによって定量する。
【0084】
１Ｄサイズ分解Ｒｅｐタンパク質膜ストライプの結果の例を図１に示し、血清陽性血清／血漿試料の定量化を表２に示す：血清試料のほぼ５０％が両方の希釈（１：５００及び１：２０００）に対して非常に強いシグナルを与え、２１個のうち３個だけが完全に陰性であった。血漿対照のうち、７個の試料が１：５００希釈で中間シグナルを与え（非常に低いシグナルを有するいくつかの追加のもの）、一方１：２０００希釈では３個の試料のみが非常に弱いシグナルを与えたが、他の全ては、血清陰性であった。全ての定量化は、ＭＳ－血清強度が対照血漿強度と比較したとき少なくとも３０倍過剰のシグナルを示す傾向を維持する。
【0085】
【表2】
表２：血清陽性血清／血漿試料の定量化。
【0086】
Ｒｅｐ特異的ヒトＩｇＧを検出した血清／血漿を、ＭＳ血清プール及び健常対照血漿プール（それぞれ合計２１個）について、血清／血漿希釈１：５００及び１：２０００のシグナル強度に従って計数した。血清試料のほぼ５０％が両方の希釈（１：５００及び１：２０００）に対して非常に強いシグナルを与え、２１個のうち３個のみが完全に陰性であった。血漿対照のうち、７個の試料が１：５００希釈で中間シグナルを与え（非常に低いシグナルを有するいくつかの追加のもの）、一方１：２０００希釈では３個の試料のみが非常に弱いシグナルを与えたが、他の全ては、血清陰性であった。全ての定量化は、ＭＳ－血清強度が対照血漿強度と比較したとき少なくとも３０倍過剰のシグナルを示す傾向を維持する。
【0087】
例４：
ＥＬＩＳＡによる血清スクリーニング
適量の精製Ｒｅｐタンパク質（通常、１ウェルあたり５０～２００ｎｇ）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に予め分注した８Ｍ尿素ｐＨ８．０とＰＢＳ ｐＨ７．２との１：１混合物に添加する。タンパク質を線形振盪装置上で４℃で１４時間プレートマトリックスに結合させる。次いで、プレートをＰＢＳ－Ｔ ｐＨ７．２の０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０によって室温で３×５分間洗浄し、続いて４℃で少なくとも１４時間、０．０２％アジ化ナトリウムを最終的に含有するＰＢＳ ｐＨ７．２の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロッキングする。その後、血清を１：５００の希釈で添加し、インキュベーションを室温で６時間実行する。その後、プレートをＰＢＳ－Ｔ ｐＨ７．２の０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０によって室温で３×５分間洗浄する。血清内のＲｅｐ特異的結合ヒトＩｇＧの検出は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体と室温で１時間インキュベートすることによって行われる。室温でＰＢＳ－Ｔ ｐＨ７．２の０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０で３×５分間３回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＨＲＰ感受性）基質溶液をウェルごとに添加して、室温で５分インキュベートする。１００μｌの８Ｍ酢酸／１Ｍ硫酸を添加して反応を停止させる。シグナル強度は、４５０ｎｍで吸光度を測定することにより、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥＬＩＳＡ適合装置で定量化される。
ＥＬＩＳＡによる血清スクリーニング
適量の精製Ｒｅｐタンパク質（通常、１ウェルあたり５０～２００ｎｇ）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に予め分注した８Ｍ尿素ｐＨ８．０とＰＢＳ ｐＨ７．２との１：１混合物に添加する。タンパク質を線形振盪装置上で４℃で１４時間プレートマトリックスに結合させる。次いで、プレートをＰＢＳ－Ｔ ｐＨ７．２の０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０によって室温で３×５分間洗浄し、続いて４℃で少なくとも１４時間、０．０２％アジ化ナトリウムを最終的に含有するＰＢＳ ｐＨ７．２の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロッキングする。その後、血清を１：５００の希釈で添加し、インキュベーションを室温で６時間実行する。その後、プレートをＰＢＳ－Ｔ ｐＨ７．２の０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０によって室温で３×５分間洗浄する。血清内のＲｅｐ特異的結合ヒトＩｇＧの検出は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体と室温で１時間インキュベートすることによって行われる。室温でＰＢＳ－Ｔ ｐＨ７．２の０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０で３×５分間３回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＨＲＰ感受性）基質溶液をウェルごとに添加して、室温で５分インキュベートする。１００μｌの８Ｍ酢酸／１Ｍ硫酸を添加して反応を停止させる。シグナル強度は、４５０ｎｍで吸光度を測定することにより、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥＬＩＳＡ適合装置で定量化される。
【0088】
ＥＬＩＳＡスクリーニングに基づくＲｅｐ特異的血清反応の定量化の例の結果を図２に示す：定量化は、シグナル強度とＲｅｐタンパク質（抗原）の量との良好な相関関係を明らかにする。平均して、ＭＳプールのシグナル強度レベルは、対照プールの強度を少なくとも１．９倍上回る。一般に、ＥＬＩＳＡに基づく血清スクリーニングは、少なくとも１：１０００の血清希釈について検出可能な血清抗体を明らかにし（データは示さず）、そのためこの実験の力価は、１：２０００～１：４０００の領域で１：１０００以上、又はプラットフォームの最適化後はさらに高くなる可能性がある。
【0089】
例５：
免疫蛍光分析
ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞（１２５．０００／ウェル）を、ＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ（１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を補充した）中の免疫蛍光８ウェルチャンバー中で２４時間培養し、続いて自己蛍光マーカータンパク質ＺｓＧｒｅｅｎを発現する対照プラスミドＺｓＧｒｅｅｎ１ＣＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、又はＺｓＧｒｅｅｎ－Ｒｅｐ融合タンパク質をコードする３’末端に全長ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ＯＲＦを有する同じプラスミドのいずれかのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によりＤＮＡトランスフェクションを行った。ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で２０分間４％ＰＦＡ ＰＢＳを用いて室温で固定し、振盪装置上で室温にて１０分間ＰＢＳ ０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ブロッキングをＰＢＳ １％ＢＳＡで室温にて４５分間実行した。マウスモノクローナル抗Ｒｅｐ抗体（表１参照）とのインキュベーションを、１：５００抗体希釈を含むＰＢＳ １％ＢＳＡ（一次抗体を欠く対照を含めた）中で３７℃にて１時間実行した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ １％ＢＳＡと室温で１５分間インキュベートした。次いで、二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６ヤギ抗マウス、１：５００；ＤＮＡマーカーＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、１：５．０００）とのインキュベーションを、ＰＢＳ １％ＢＳＡ中、室温で４５分間実行した。カバースリップ（Ｄａｋｏマウント培地）でマウントする前に、細胞をＰＢＳ １％ＢＳＡで３回及びＰＢＳで３回洗浄した。免疫蛍光画像をＺｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒで撮影した（対物レンズ２０倍、試料及び対照デュブレットの固定露光時間）。
免疫蛍光分析
ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞（１２５．０００／ウェル）を、ＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ（１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を補充した）中の免疫蛍光８ウェルチャンバー中で２４時間培養し、続いて自己蛍光マーカータンパク質ＺｓＧｒｅｅｎを発現する対照プラスミドＺｓＧｒｅｅｎ１ＣＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、又はＺｓＧｒｅｅｎ－Ｒｅｐ融合タンパク質をコードする３’末端に全長ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ＯＲＦを有する同じプラスミドのいずれかのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によりＤＮＡトランスフェクションを行った。ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で２０分間４％ＰＦＡ ＰＢＳを用いて室温で固定し、振盪装置上で室温にて１０分間ＰＢＳ ０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ブロッキングをＰＢＳ １％ＢＳＡで室温にて４５分間実行した。マウスモノクローナル抗Ｒｅｐ抗体（表１参照）とのインキュベーションを、１：５００抗体希釈を含むＰＢＳ １％ＢＳＡ（一次抗体を欠く対照を含めた）中で３７℃にて１時間実行した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ １％ＢＳＡと室温で１５分間インキュベートした。次いで、二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６ヤギ抗マウス、１：５００；ＤＮＡマーカーＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、１：５．０００）とのインキュベーションを、ＰＢＳ １％ＢＳＡ中、室温で４５分間実行した。カバースリップ（Ｄａｋｏマウント培地）でマウントする前に、細胞をＰＢＳ １％ＢＳＡで３回及びＰＢＳで３回洗浄した。免疫蛍光画像をＺｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒで撮影した（対物レンズ２０倍、試料及び対照デュブレットの固定露光時間）。
【0090】
免疫蛍光画像（図４）は、Ａ群及びＣ群の抗体による抗体処理が、凝集体の検出なしに細胞質＋核膜（＋核）局在化標的タンパク質の特異的検出をもたらすことを示す。対照的に、Ｂ群及びＤ群の抗体は、スペックルタンパク質と特異的な共局在を示し、０～弱レベルの細胞質シグナルを示す。ＺｓＧｒｅｅｎ融合タンパク質単独での抗体の対照インキュベーションは、有意なシグナル検出をもたらさなかった（抗体シグナルの可視化に使用されたのと同じ曝露時間）。
【0091】
例６：
免疫蛍光分析
ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞（１２５．０００／ウェル）を、ＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ（１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を補充した）中の免疫蛍光８ウェルチャンバー中で２４時間培養し、続いて自己蛍光マーカータンパク質ＺｓＧｒｅｅｎを発現する対照プラスミドＺｓＧｒｅｅｎ１ＣＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、又はＺｓＧｒｅｅｎ－Ｒｅｐ融合タンパク質をコードする３’末端に全長ＣＭＩ１ Ｒｅｐ ＯＲＦを有する同じプラスミドのいずれかのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によりＤＮＡトランスフェクションを行った。ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で２０分間４％ＰＦＡ ＰＢＳを用いて室温で固定し、振盪装置上で室温にて１０分間ＰＢＳ ０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ブロッキングをＰＢＳ １％ＢＳＡで室温で４５分間実行した。マウスモノクローナル抗Ｒｅｐ抗体（表１）とのインキュベーションを、１：５００抗体希釈を含むＰＢＳ １％ＢＳＡ（一次抗体を欠く対照を含めた）中で３７℃にて１時間実行した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ １％ＢＳＡと室温で１５分間インキュベートした。次いで、二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６ヤギ抗マウス、１：５００；ＤＮＡマーカーＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、１：５．０００）とのインキュベーションを、ＰＢＳ １％ＢＳＡ中、室温で４５分間実行した。カバースリップ（Ｄａｋｏマウント培地）でマウントする前に、細胞をＰＢＳ １％ＢＳＡで３回及びＰＢＳで３回洗浄した。免疫蛍光画像をＺｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒで撮影した（対物レンズ２０倍、試料及び対照デュブレットの固定露光時間）。
免疫蛍光分析
ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞（１２５．０００／ウェル）を、ＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ（１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を補充した）中の免疫蛍光８ウェルチャンバー中で２４時間培養し、続いて自己蛍光マーカータンパク質ＺｓＧｒｅｅｎを発現する対照プラスミドＺｓＧｒｅｅｎ１ＣＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、又はＺｓＧｒｅｅｎ－Ｒｅｐ融合タンパク質をコードする３’末端に全長ＣＭＩ１ Ｒｅｐ ＯＲＦを有する同じプラスミドのいずれかのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によりＤＮＡトランスフェクションを行った。ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で２０分間４％ＰＦＡ ＰＢＳを用いて室温で固定し、振盪装置上で室温にて１０分間ＰＢＳ ０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ブロッキングをＰＢＳ １％ＢＳＡで室温で４５分間実行した。マウスモノクローナル抗Ｒｅｐ抗体（表１）とのインキュベーションを、１：５００抗体希釈を含むＰＢＳ １％ＢＳＡ（一次抗体を欠く対照を含めた）中で３７℃にて１時間実行した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ １％ＢＳＡと室温で１５分間インキュベートした。次いで、二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６ヤギ抗マウス、１：５００；ＤＮＡマーカーＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、１：５．０００）とのインキュベーションを、ＰＢＳ １％ＢＳＡ中、室温で４５分間実行した。カバースリップ（Ｄａｋｏマウント培地）でマウントする前に、細胞をＰＢＳ １％ＢＳＡで３回及びＰＢＳで３回洗浄した。免疫蛍光画像をＺｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒで撮影した（対物レンズ２０倍、試料及び対照デュブレットの固定露光時間）。
【0092】
免疫蛍光画像（図５）は、Ａ群抗体が、凝集物を検出することなく細胞質＋核膜（＋核）局在化標的タンパク質を特異的に検出するが、Ｂ群抗体は、細胞質局在化標的タンパク質のバックグラウンドが最小限であるスペックル標的タンパク質を検出することを示す。Ｃ群及びＤ群のＭＳＢＩ１特異的抗体は、シグナルの特異的検出をもたらさない。抗体Ｄ１及びＤ２は、両方とも「Ｄ」群に属するが、わずかに異なるエピトープ認識を有する。
【0093】
例７：
免疫蛍光分析
ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞（１２５．０００／ウェル）を、ＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ（１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を補充した）中の免疫蛍光８ウェルチャンバー中で２４時間培養し、続いて対照プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（－）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又は全長ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ＯＲＦ（配列番号１３）のコドン最適化変異体を発現する同じプラスミドのいずれかのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によるＤＮＡトランスフェクションを行った。ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で２０分間４％ＰＦＡ ＰＢＳを用いて室温で固定し、振盪装置上で室温にて１０分間ＰＢＳ ０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ブロッキングをＰＢＳ １％ＢＳＡで室温で４５分間実行した。マウスモノクローナル抗Ｒｅｐ抗体（表１）とのインキュベーションを、１：５００抗体希釈を含むＰＢＳ １％ＢＳＡ（一次抗体を欠く対照を含めた）中で３７℃にて１時間実行した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ １％ＢＳＡと室温で１５分間インキュベートした。次いで、二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウス、１：５００；ＤＮＡマーカーＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、１：５．０００）とのインキュベーションを、ＰＢＳ １％ＢＳＡ中、室温で４５分間実行した。カバースリップ（Ｄａｋｏマウント培地）でマウントする前に、細胞をＰＢＳ １％ＢＳＡで３回及びＰＢＳで３回洗浄した。免疫蛍光画像をＺｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒで撮影した（対物レンズ２０倍、試料及び対照デュブレットの固定露光時間）。
免疫蛍光分析
ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞（１２５．０００／ウェル）を、ＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ（１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を補充した）中の免疫蛍光８ウェルチャンバー中で２４時間培養し、続いて対照プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（－）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又は全長ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ＯＲＦ（配列番号１３）のコドン最適化変異体を発現する同じプラスミドのいずれかのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によるＤＮＡトランスフェクションを行った。ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で２０分間４％ＰＦＡ ＰＢＳを用いて室温で固定し、振盪装置上で室温にて１０分間ＰＢＳ ０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ブロッキングをＰＢＳ １％ＢＳＡで室温で４５分間実行した。マウスモノクローナル抗Ｒｅｐ抗体（表１）とのインキュベーションを、１：５００抗体希釈を含むＰＢＳ １％ＢＳＡ（一次抗体を欠く対照を含めた）中で３７℃にて１時間実行した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ １％ＢＳＡと室温で１５分間インキュベートした。次いで、二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウス、１：５００；ＤＮＡマーカーＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、１：５．０００）とのインキュベーションを、ＰＢＳ １％ＢＳＡ中、室温で４５分間実行した。カバースリップ（Ｄａｋｏマウント培地）でマウントする前に、細胞をＰＢＳ １％ＢＳＡで３回及びＰＢＳで３回洗浄した。免疫蛍光画像をＺｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒで撮影した（対物レンズ２０倍、試料及び対照デュブレットの固定露光時間）。
【0094】
免疫蛍光画像（図６）は、Ａ群及びＣ群の抗体による抗体処理が、凝集体の検出なしに細胞質＋核膜（＋核）局在化標的タンパク質の特異的検出をもたらすことを示す。対照的に、Ｂ群及びＤ群の抗体は、スペックルタンパク質と特異的な共局在を示し、０～弱レベルの細胞質シグナルを示す。ＺｓＧｒｅｅｎ融合タンパク質単独での抗体の対照インキュベーションは、有意なシグナル検出をもたらさなかった（抗体シグナルの可視化に使用されたのと同じ曝露時間）。
【0095】
例８：
ウエスタンブロット分析
ＨＥＫ２９３ＴＴ（１，５Ｍｉｏ／６ウェル）を、ＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ（１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を補充したもの）中の６ウェル細胞培養プレート中で２４時間培養し、続いてＮ末端ＺｓＧｒｅｅｎタグとの融合タンパク質として全長ＭＳＢＩ１、ＣＭＩ１、又はＭＳＢＩ２ Ｒｅｐタンパク質の過剰発現をコードするＺｓＧｒｅｅｎ１ＣＩプラスミドのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によりＤＮＡトランスフェクションを行った。ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により脱着し、ＰＢＳで再度洗浄し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で溶解した（９８℃で５分間煮沸）。試料を１つの大きなポケットを有するプレキャスト１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に充填した。転写ブロット後、ＰＢＳ ５％スキムミルクでブロッキングした後、表１の異なるマウスモノクローナル抗体（ＰＢＳ ５％スキムミルク中１：１０００希釈）とストライプを個々にインキュベートするために、膜の各２つのストライプを切断した。ストライプをＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ＨＲＰ結合抗マウス二次抗体とインキュベートして、Ｂｉｏｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ装置上で異なるＺｓＧｒｅｅｎ－Ｒｅｐ融合タンパク質を検出する抗体のウエスタンブロット分析を可能にした。ＺｓＧｒｅｅｎ抗体（ＯｒｉＧｅｎｅ、１：２０００）とのインキュベーションに基づいて陽性対照検出を実行した。
ウエスタンブロット分析
ＨＥＫ２９３ＴＴ（１，５Ｍｉｏ／６ウェル）を、ＤＭＥＭ １０％ＦＣＳ（１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）及び１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を補充したもの）中の６ウェル細胞培養プレート中で２４時間培養し、続いてＮ末端ＺｓＧｒｅｅｎタグとの融合タンパク質として全長ＭＳＢＩ１、ＣＭＩ１、又はＭＳＢＩ２ Ｒｅｐタンパク質の過剰発現をコードするＺｓＧｒｅｅｎ１ＣＩプラスミドのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によりＤＮＡトランスフェクションを行った。ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により脱着し、ＰＢＳで再度洗浄し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で溶解した（９８℃で５分間煮沸）。試料を１つの大きなポケットを有するプレキャスト１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に充填した。転写ブロット後、ＰＢＳ ５％スキムミルクでブロッキングした後、表１の異なるマウスモノクローナル抗体（ＰＢＳ ５％スキムミルク中１：１０００希釈）とストライプを個々にインキュベートするために、膜の各２つのストライプを切断した。ストライプをＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ＨＲＰ結合抗マウス二次抗体とインキュベートして、Ｂｉｏｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ装置上で異なるＺｓＧｒｅｅｎ－Ｒｅｐ融合タンパク質を検出する抗体のウエスタンブロット分析を可能にした。ＺｓＧｒｅｅｎ抗体（ＯｒｉＧｅｎｅ、１：２０００）とのインキュベーションに基づいて陽性対照検出を実行した。
【0096】
図７は、Ａ群及びＢ群の抗体がＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ融合タンパク質に加えてＣＭＩ１及びＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ融合タンパク質を含む３つ全てのＲｅｐ融合タンパク質を特異的に検出する一方、Ｃ群及びＤ群のＭＳＢＩ１特異的抗体は、ＭＳＢＩ１のみを検出することを示している。抗体Ｄ２は、おそらく、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける変性条件下で優勢ではない３Ｄ構造エピトープの検出に起因してＷＢ陰性であり、ここでは試験されなかった。
【0097】
配列概要
参考文献:
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
参考文献:
【配列表フリーテキスト】
【0098】
配列表１ ＜２２３＞ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質
配列表２ ＜２２３＞Ｒｅｐペプチド
配列表３ ＜２２３＞Ｒｅｐペプチド
配列表４ ＜２２３＞Ｈｉｓタグ
配列表５ ＜２２３＞Ｔ７タグ
配列表６ ＜２２３＞ＦＬＡＧタグ
配列表７ ＜２２３＞Ｔｒｅｐ ＩＩタグ
配列表８ ＜２２３＞ＭＳＢＩ２．１７６
配列表９ ＜２２３＞ＭＳＢＩ１エピトープ
配列表１０ ＜２２３＞ＣＭＩ１．２５２
配列表１１ ＜２２３＞ＣＭＩ２．２１４
配列表１２ ＜２２３＞ＣＭＩ３．１６８
配列表１３ ＜２２３＞コドン最適化ＭＳＢＩ１
配列表１４ ＜２２３＞ＭＳＢＩ１タンパク質
配列表１５ ＜２２３＞ＭＳＢＩ１野生型
配列表２ ＜２２３＞Ｒｅｐペプチド
配列表３ ＜２２３＞Ｒｅｐペプチド
配列表４ ＜２２３＞Ｈｉｓタグ
配列表５ ＜２２３＞Ｔ７タグ
配列表６ ＜２２３＞ＦＬＡＧタグ
配列表７ ＜２２３＞Ｔｒｅｐ ＩＩタグ
配列表８ ＜２２３＞ＭＳＢＩ２．１７６
配列表９ ＜２２３＞ＭＳＢＩ１エピトープ
配列表１０ ＜２２３＞ＣＭＩ１．２５２
配列表１１ ＜２２３＞ＣＭＩ２．２１４
配列表１２ ＜２２３＞ＣＭＩ３．１６８
配列表１３ ＜２２３＞コドン最適化ＭＳＢＩ１
配列表１４ ＜２２３＞ＭＳＢＩ１タンパク質
配列表１５ ＜２２３＞ＭＳＢＩ１野生型
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】