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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-29
(45)【発行日】2024-08-06
(54)【発明の名称】抗ＨＥＲ２抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20240730BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240730BHJP
A61K 31/5513 20060101ALI20240730BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240730BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20240730BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20240730BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68 ZNA
A61K39/395 T
A61K31/5513
A61P35/00
A61P15/00
A61P1/18
【請求項の数】
34
(21)【出願番号】P 2021509431
(86)(22)【出願日】2020-03-24
(86)【国際出願番号】 JP2020012885
(87)【国際公開番号】W WO2020196475
(87)【国際公開日】2020-10-01
【審査請求日】2023-01-10
(31)【優先権主張番号】P 2019057128
(32)【優先日】2019-03-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】307010166
【氏名又は名称】第一三共株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】原田 直弥
(72)【発明者】
【氏名】米田 耕三
(72)【発明者】
【氏名】早川 市郎
【審査官】参鍋 祐子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／０７５５８１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１１／０８４４９６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５３４９９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００９／０１４９４４９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５２６６１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１３７５５６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Protein&Cell，2018年，Vol.9(1)，pp.33-46
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
次式；【化1】
Dは、以下の群から選択されるいずれか一つであり、
【化2】
Lは、AbのAsn297に結合する糖鎖（N297糖鎖）とDを連結するリンカーであり、
N297糖鎖はリモデリングされていてもよく、
Abは、以下の（a）～（c）のいずれかに記載のCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖、ならびに、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の抗原結合断片であることを示す；
（a）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
（b）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は
（c）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3。）
で示される抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項2】
Lは、-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-＊で示され、ここで、式中、アステリスク＊はDと結合していることを示し、
Bは、1，4-フェニル基、2, 5-ピリジル基、3，6-ピリジル基、2，5-ピリミジル基又は2，5-チエニル基であり、
Lpは、以下の群；
-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、及び、-GGPL-、
から選択されるいずれか一つを示し、
Laは、以下の群；
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、及び、-OC(=O)-、
から選択されるいずれか一つを示し、ならびに、
Lbは、次式で示され、
【化3】
【化4】
【化5】
【請求項3】
Lが、以下の群;-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及び
-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-
から選択されるいずれか一つを示し、
ここで、Bは、1，4－フェニル基を示し、
Z1は、以下の構造式；
【化6】
Z2は、以下の構造式；
【化7】
Z3は、以下の構造式；
【化8】
ここで、Z1、Z2及びZ3の構造式において、アステリスク＊は隣接するC(=O)、OC(=O)又はCH2と結合していることを示し、波線はN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖と結合していることを示す、請求項1又は2に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項4】
Lが、以下の群；-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及び、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
から選択されるいずれか一つを示し、
ここで、Bは1，4－フェニル基であり、
Z1は以下の構造式；
【化9】
ここで、上記Z1の構造式において、アステリスク＊はZ1に隣接するC(=O)と結合していることを示し、波線はN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖と結合していることを示す、請求項3に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項5】
Dは、以下の群から選択されるいずれかである、請求項１～4のいずれかに一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；【化10】
【請求項6】
抗体が、以下の（a）～（d）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び（e）～（i）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項1～5のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート；（a）配列番号13に記載のアミノ酸配列、
（b）配列番号17に記載のアミノ酸配列、
（c）（a）又は（b）の配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（d）（a）又は（b）の配列における各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、及び、
（e）配列番号21に記載のアミノ酸配列、
（f）配列番号25に記載のアミノ酸配列、
（g）配列番号29に記載のアミノ酸配列、
（h）（e）～（g）の配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び、
（i）（e）～（g）の配列における各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
【請求項7】
抗体が、以下の（a）～（c）に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項6に記載の抗体－薬物コンジュゲート；（a）配列番号17に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号25に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（b）配列番号13に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号29に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は
（c）配列番号13に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号21に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。
【請求項8】
抗体が、キメラ抗体である、請求項1～7のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項9】
抗体が、ヒト化抗体である、請求項1～7のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項10】
抗体が、ヒトIgG1、ヒトIgG2又はヒトIgG4の重鎖定常領域を含む、請求項8又は9に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項11】
抗体の重鎖定常領域がヒトIgG1の重鎖定常領域であり、該重鎖定常領域においてEU Indexにより示される234位及び235位のロイシンがアラニンに置換されている、請求項10に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項12】
抗体が、以下の（a）又は（b）に記載の重鎖及び軽鎖を含む、請求項9～11のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート；（a）配列番号15のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号23のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖（H01L02）、又は、
（b）配列番号11のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号27のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖（HwtL05）。
【請求項13】
抗体が、以下の（a）又は（b）に記載の重鎖及び軽鎖を含む、請求項9～11のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート；（a）配列番号11においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号19においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は、
（b）配列番号31においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号32においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖。
【請求項14】
抗体が、N－結合型糖鎖付加、O－結合型糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、N末におけるメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、及び重鎖のカルボキシル末端における1つ又は2つのアミノ酸残基の欠失からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む、請求項1～13のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項15】
抗体の重鎖のカルボキシル末端において1つ又は数個のアミノ酸残基が欠失している、請求項14に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項16】
抗体の2本の重鎖の双方のカルボキシル末端において1つのアミノ酸残基が欠失している、請求項15に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項17】
N297糖鎖が、リモデリングされた糖鎖である、請求項1～16に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項18】
N297糖鎖が、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGのいずれか一つであることを示す、請求項1～17に記載の抗体－薬物コンジュゲート；【化11】
【化12】
【化13】
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)n5-＊を示し、
ここで、n5は2～5の整数であることを示し、左端のアミノ基がN297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、アステリスク＊は、LにおけるZ1のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す。
【請求項19】
n5が３である、請求項18に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項20】
次式；【化14】
Abは、以下の（a）～（c）のいずれかに記載のCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖、ならびに、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の抗原結合断片であることを示し；
（a）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
（b）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は
（c）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
N297糖鎖は、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
【化15】
【化16】
【化17】
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*であることを示し、
ここで、左端のアミノ基が、N297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク＊は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項21】
次式；【化18】
（上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数であることを示し、
Abは、以下の（a）～（c）のいずれかに記載のCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖、ならびに、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の抗原結合断片であることを示し；
（a）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
（b）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は
（c）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
N297糖鎖は、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
【化19】
【化20】
【化21】
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*であることを示し、
ここで、左端のアミノ基が、N297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク＊は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項22】
次式；【化22】
Abは、以下の（a）～（c）のいずれかに記載のCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖、ならびに、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の抗原結合断片であることを示し；
（a）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
（b）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は
（c）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
N297糖鎖は、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
【化23】
【化24】
【化25】
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*であることを示し、
ここで、左端のアミノ基が、N297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク＊は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項23】
次式；【化26】
Abは、以下の（a）～（c）のいずれかに記載のCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖、ならびに、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の抗原結合断片であることを示し；
（a）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
（b）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は
（c）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
N297糖鎖は、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
【化27】
【化28】
【化29】
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*であることを示し、
ここで、左端のアミノ基が、N297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク＊は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）示される抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項24】
抗体が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、請求項20～23のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項25】
抗体が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、請求項20～23のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項26】
抗体が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、請求項20～23のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項27】
抗体が、配列番号17に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号25に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項20～24のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項28】
抗体が、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号29に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項20～23及び25のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項29】
抗体が、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号21に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項20～23及び26のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項30】
抗体が、配列番号15のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号23のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項20～24及び27のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項31】
抗体が、配列番号11のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号27のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項20～23、25及び28のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項32】
抗体が、配列番号11においてアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号19においてアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項20～23、26及び29のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項33】
抗体が、配列番号31においてアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号32においてアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項20～23、26及び29のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【請求項34】
抗体が、N－結合型糖鎖付加、O－結合型糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、N末におけるメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、及び重鎖のカルボキシル末端における1つ又は2つのアミノ酸残基の欠失からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む、請求項20～33のいずれか一項に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規抗HER2抗体及び当該抗体を含む抗体－薬物コンジュゲートに関する。
【背景技術】
【0002】
抗体－薬物コンジュゲート（Antibody-Drug Conjugate；ADC）は、がん治療等において使用されており、例えば、癌細胞表面に発現している抗原に結合し、その結合によって抗原を細胞内に内在化できる抗体に、細胞傷害活性を有する薬物を結合させたものである。ADCは、癌細胞に効率的に薬物を送達できることによって、癌細胞内に薬物を蓄積させ、癌細胞を死滅させることが期待できる。
ADCに用いられる薬物として有用なものの一つにピロロベンゾジアゼピン（PBD）が挙げられる。PBDはDNA小溝のPuGPu配列などに結合することによって細胞毒性を示す。天然由来のPBDであるanthramycinは1965年に初めて発見され、それ以降様々な天然由来、またその類縁体のPBDが発見された（非特許文献1～4）。
PBDの一般的な構造式は下式
ADCに用いられる薬物として有用なものの一つにピロロベンゾジアゼピン（PBD）が挙げられる。PBDはDNA小溝のPuGPu配列などに結合することによって細胞毒性を示す。天然由来のPBDであるanthramycinは1965年に初めて発見され、それ以降様々な天然由来、またその類縁体のPBDが発見された（非特許文献1～4）。
PBDの一般的な構造式は下式
【0003】
【化1】
【0004】
で示される。PBDはそれぞれA，C環部において置換基の数、種類、部位において異なり、また、それぞれB，C環部の不飽和度が異なるものが知られている。
PBDは二量体構造にすることにより、飛躍的に細胞毒性が向上することが知られており（非特許文献5、6）、二量体PBDをADC化したものも種々報告されている（特許文献1～15）。しかしながら、C2位においてスピロ環を有するPBD又はそのADC体は知られていない。
ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)は、受容体蛋白質チロシンキナーゼの上皮増殖因子受容体サブファミリーに属する膜貫通受容体である(非特許文献7～12）。
HER2は乳がん、胃がん等様々ながん種において過剰発現しており(非特許文献13～18)、乳がんにおいては負の予後因子であることが報告されている（非特許文献19、20）。HER2過剰発現がんに対し有効な抗HER2薬として、トラスツズマブ、カドサイラ、ペルツヅマブ、ラパチニブ等が知られている。
しかしながら、応答性や活性の強さ、並びに適応範囲は未だ十分ではなく、HER2を標的とする未充足ニーズが存在している。
PBDは二量体構造にすることにより、飛躍的に細胞毒性が向上することが知られており（非特許文献5、6）、二量体PBDをADC化したものも種々報告されている（特許文献1～15）。しかしながら、C2位においてスピロ環を有するPBD又はそのADC体は知られていない。
ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)は、受容体蛋白質チロシンキナーゼの上皮増殖因子受容体サブファミリーに属する膜貫通受容体である(非特許文献7～12）。
HER2は乳がん、胃がん等様々ながん種において過剰発現しており(非特許文献13～18)、乳がんにおいては負の予後因子であることが報告されている（非特許文献19、20）。HER2過剰発現がんに対し有効な抗HER2薬として、トラスツズマブ、カドサイラ、ペルツヅマブ、ラパチニブ等が知られている。
しかしながら、応答性や活性の強さ、並びに適応範囲は未だ十分ではなく、HER2を標的とする未充足ニーズが存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第2013／173496号
【文献】国際公開第2014／130879号
【文献】国際公開第2017／004330号
【文献】国際公開第2017／004025号
【文献】国際公開第2017／020972号
【文献】国際公開第2016／036804号
【文献】国際公開第2015／095124号
【文献】国際公開第2015／052322号
【文献】国際公開第2015／052534号
【文献】国際公開第2016／115191号
【文献】国際公開第2015／052321号
【文献】国際公開第2015／031693号
【文献】国際公開第2011／130613号
【文献】国際公開第2005／040170号
【文献】国際公開第2017／137556号
【非特許文献】
【0006】
【文献】Angewandte Chemie Internationl Edition 2016,55,2-29
【文献】Chemical Reviews 2010, 111, 2815-2864
【文献】In Antibiotics III. Springer Verlag, New York, pp.3-11
【文献】Accounts of Chemical Research 1986, 19, 230
【文献】Journal of the American Chemical Society 1992, 114, 4939
【文献】Journal of Organic Chemistry 1996, 61, 8141
【文献】Science. 1985; 230(4730): 1132-1139.
【文献】EMBO J. 1997;16:1647-1655.
【文献】EMBO J. 1996;15:254-264.
【文献】J Biom Chem. 1994; 269: 14661-14665.
【文献】Science. 1987; 237: 178-182.
【文献】Proc Natl Acad Sci U S A. 1987; 84: 7159-7163.
【文献】Eur. J Surg Oncol. 1997 (23):30-35.
【文献】Oncogene. 2008;27(47):6120-6130.
【文献】Oncol Rep. 2006; 15(1): 65-71.
【文献】Science. 1987; 235: 177-182.
【文献】Ann Oncol 19: 1523-1529, 2008.
【文献】Mol Cell Biol 6: 955-958, 1986.
【文献】Science. 1989; 244: 707-712.
【文献】Diagn Mol Pathol 10: 139-152, 2001.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、新規な抗HER2抗体及び該抗体－ピロロベンゾジアゼピン（PBD）誘導体コンジュゲート、ならびに新規PBD誘導体を提供するものである。
また、本発明は、抗腫瘍活性を有する抗HER2抗体及び抗HER2抗体－PBD誘導体コンジュゲート、ならびに新規PBD誘導体を含有する医薬組成物を提供するものである。
さらに、本発明は、抗HER2抗体及び抗HER2抗体－PBD誘導体コンジュゲート、ならびに新規PBD誘導体を用いた癌の治療方法を提供するものである。
また、本発明は、抗腫瘍活性を有する抗HER2抗体及び抗HER2抗体－PBD誘導体コンジュゲート、ならびに新規PBD誘導体を含有する医薬組成物を提供するものである。
さらに、本発明は、抗HER2抗体及び抗HER2抗体－PBD誘導体コンジュゲート、ならびに新規PBD誘導体を用いた癌の治療方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、鋭意検討した結果、新規な抗HER2抗体－ピロロベンゾジアゼピン（PBD）誘導体コンジュゲートが、強い抗腫瘍活性を有することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本願発明は、以下に関するものである。
すなわち本願発明は、以下に関するものである。
【0009】
［1］次式；
【化2】
【0010】
（式中、m1は1又は2の整数を示し、
Dは、以下の群から選択されるいずれか一つであり、
Dは、以下の群から選択されるいずれか一つであり、
【0011】
【化3】
【0012】
ここで、式中、アステリスク（＊）はLと結合していることを示し、
Lは、AbのAsn297に結合する糖鎖（N297糖鎖）とDを連結するリンカーであり、
N297糖鎖はリモデリングされていてもよく、
Abは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、及び、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の機能性断片であることを示す。）
で示される抗体－薬物コンジュゲート。
［2］Lは、-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-＊で示され、
ここで、式中、アステリスク（＊）はDと結合していることを示し、
Bは、1，4-フェニル基、2, 5-ピリジル基、3，6-ピリジル基、2，5-ピリミジル基又は2，5-チエニル基であり、
Lpは、以下の群；
-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、及び、-GGPL-、
から選択されるいずれか一つを示し、
Laは、以下の群；
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、及び、-OC(=O)-、
から選択されるいずれか一つを示し、ならびに、
Lbは、次式で示され、
Lは、AbのAsn297に結合する糖鎖（N297糖鎖）とDを連結するリンカーであり、
N297糖鎖はリモデリングされていてもよく、
Abは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、及び、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の機能性断片であることを示す。）
で示される抗体－薬物コンジュゲート。
［2］Lは、-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-＊で示され、
ここで、式中、アステリスク（＊）はDと結合していることを示し、
Bは、1，4-フェニル基、2, 5-ピリジル基、3，6-ピリジル基、2，5-ピリミジル基又は2，5-チエニル基であり、
Lpは、以下の群；
-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、及び、-GGPL-、
から選択されるいずれか一つを示し、
Laは、以下の群；
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、及び、-OC(=O)-、
から選択されるいずれか一つを示し、ならびに、
Lbは、次式で示され、
【0013】
【化4】
【0014】
【化5】
【0015】
【化6】
【0016】
ここで、上記で示されるLbの構造式において、アステリスク（＊）はLaと結合していることを示し、波線はN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖と結合していることを示す、［1］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［3］Lが、以下の群;
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及び
-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-
から選択されるいずれか一つを示し、
ここで、Bは、1，4－フェニル基を示し、
Z1は、以下の構造式；
［3］Lが、以下の群;
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及び
-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-
から選択されるいずれか一つを示し、
ここで、Bは、1，4－フェニル基を示し、
Z1は、以下の構造式；
【0017】
【化7】
【0018】
を示し、
Z2は、以下の構造式；
Z2は、以下の構造式；
【0019】
【化8】
【0020】
を示し、
Z3は、以下の構造式；
Z3は、以下の構造式；
【0021】
【化9】
【0022】
を示し、
ここで、Z1、Z2及びZ3の構造式において、アステリスク（＊）は隣接するC(=O)、OC(=O)又はCH2と結合していることを示し、波線はN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖と結合していることを示す、［1］又は［2］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［4］Lが、以下の群；
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及び、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
から選択されるいずれか一つを示し、
ここで、Bは1，4－フェニル基であり、
Z1は以下の構造式；
ここで、Z1、Z2及びZ3の構造式において、アステリスク（＊）は隣接するC(=O)、OC(=O)又はCH2と結合していることを示し、波線はN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖と結合していることを示す、［1］又は［2］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［4］Lが、以下の群；
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及び、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
から選択されるいずれか一つを示し、
ここで、Bは1，4－フェニル基であり、
Z1は以下の構造式；
【0023】
【化10】
【0024】
を示し、
ここで、上記Z1の構造式において、アステリスク（＊）はZ1に隣接するC(=O)と結合していることを示し、波線はN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖と結合していることを示す、［3］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［5］Dは、以下の群から選択されるいずれかである、［1］～［4］のいずれかに一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；
ここで、上記Z1の構造式において、アステリスク（＊）はZ1に隣接するC(=O)と結合していることを示し、波線はN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖と結合していることを示す、［3］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［5］Dは、以下の群から選択されるいずれかである、［1］～［4］のいずれかに一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；
【0025】
【化11】
【0026】
ここで、式中、アステリスク（＊）はLと結合していることを示す。
［6］抗体が、以下の（a）～（c）に記載のCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖、ならびにCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、［1］～［5］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
（b）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は、
（c）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3。
［7］抗体が、以下の（a）～（d）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び（e）～（i）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［1］～［6］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号13に記載のアミノ酸配列、
（b）配列番号17に記載のアミノ酸配列、
（c）（a）又は（b）の配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（d）（a）又は（b）の配列における各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、及び、
（e）配列番号21に記載のアミノ酸配列、
（f）配列番号25に記載のアミノ酸配列、
（g）配列番号29に記載のアミノ酸配列、
（h）（e）～（g）の配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び、
（i）（e）～（g）の配列における各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
［8］抗体が、以下の（a）～（c）に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、［7］に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号17に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号25に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（b）配列番号13に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号29に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は、
（c）配列番号13に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号21に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。
［9］抗体が、キメラ抗体である、［1］～［8］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［10］抗体が、ヒト化抗体である、［1］～［8］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［11］抗体が、ヒトIgG1、ヒトIgG2又はヒトIgG4の重鎖定常領域を含む、［9］又は［10］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［12］抗体の重鎖定常領域がヒトIgG1の重鎖定常領域であり、該重鎖定常領域において、EU Indexにより示される234位及び235位のロイシンがアラニンに置換されている、［11］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［13］抗体が、以下の（a）又は（b）に記載の重鎖及び軽鎖を含む、［10］～［12］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号15のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号23のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖（H01L02）、
（b）配列番号11のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号27のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖（HwtL05）。
［14］抗体が、以下の（a）又は（b）に記載の重鎖及び軽鎖を含む、［10］～［12］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号11においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号19においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は、
（b）配列番号31においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号32においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖。
［15］抗体が、N－結合型糖鎖付加、O－結合型糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、N末におけるメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、及び重鎖のカルボキシル末端における1つ又は2つのアミノ酸残基の欠失からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む、［1］～［14］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［16］抗体の重鎖のカルボキシル末端において1つ又は数個のアミノ酸残基が欠失している、［15］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［17］抗体の2本の重鎖の双方のカルボキシル末端において1つのアミノ酸残基が欠失している、［16］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［18］抗体が、［6］～［17］のいずれか一つに記載の抗体と、HER2への結合において競合するか、又は、［6］～［17］のいずれか一つに記載の抗体が認識するHER2上の部位に結合する、［1］～［5］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［19］N297糖鎖が、リモデリングされた糖鎖である、［1］～［18］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［20］N297糖鎖が、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGのいずれか一つであることを示す、［1］～［19］に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
［6］抗体が、以下の（a）～（c）に記載のCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖、ならびにCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、［1］～［5］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
（b）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は、
（c）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3。
［7］抗体が、以下の（a）～（d）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び（e）～（i）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［1］～［6］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号13に記載のアミノ酸配列、
（b）配列番号17に記載のアミノ酸配列、
（c）（a）又は（b）の配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（d）（a）又は（b）の配列における各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、及び、
（e）配列番号21に記載のアミノ酸配列、
（f）配列番号25に記載のアミノ酸配列、
（g）配列番号29に記載のアミノ酸配列、
（h）（e）～（g）の配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び、
（i）（e）～（g）の配列における各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
［8］抗体が、以下の（a）～（c）に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、［7］に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号17に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号25に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（b）配列番号13に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号29に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は、
（c）配列番号13に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号21に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。
［9］抗体が、キメラ抗体である、［1］～［8］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［10］抗体が、ヒト化抗体である、［1］～［8］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［11］抗体が、ヒトIgG1、ヒトIgG2又はヒトIgG4の重鎖定常領域を含む、［9］又は［10］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［12］抗体の重鎖定常領域がヒトIgG1の重鎖定常領域であり、該重鎖定常領域において、EU Indexにより示される234位及び235位のロイシンがアラニンに置換されている、［11］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［13］抗体が、以下の（a）又は（b）に記載の重鎖及び軽鎖を含む、［10］～［12］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号15のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号23のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖（H01L02）、
（b）配列番号11のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号27のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖（HwtL05）。
［14］抗体が、以下の（a）又は（b）に記載の重鎖及び軽鎖を含む、［10］～［12］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート；
（a）配列番号11においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号19においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は、
（b）配列番号31においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号32においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖。
［15］抗体が、N－結合型糖鎖付加、O－結合型糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、N末におけるメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、及び重鎖のカルボキシル末端における1つ又は2つのアミノ酸残基の欠失からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む、［1］～［14］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［16］抗体の重鎖のカルボキシル末端において1つ又は数個のアミノ酸残基が欠失している、［15］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［17］抗体の2本の重鎖の双方のカルボキシル末端において1つのアミノ酸残基が欠失している、［16］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［18］抗体が、［6］～［17］のいずれか一つに記載の抗体と、HER2への結合において競合するか、又は、［6］～［17］のいずれか一つに記載の抗体が認識するHER2上の部位に結合する、［1］～［5］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［19］N297糖鎖が、リモデリングされた糖鎖である、［1］～［18］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［20］N297糖鎖が、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGのいずれか一つであることを示す、［1］～［19］に記載の抗体－薬物コンジュゲート；
【0027】
【化12】
【0028】
【化13】
【0029】
【化14】
【0030】
上記式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)n5-＊を示し、
ここで、n5は2～5の整数であることを示し、左端のアミノ基がN297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、LにおけるZ1のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す。
［21］n5が３である、［20］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［22］次式；
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)n5-＊を示し、
ここで、n5は2～5の整数であることを示し、左端のアミノ基がN297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、LにおけるZ1のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す。
［21］n5が３である、［20］に記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［22］次式；
【0031】
【化15】
【0032】
（上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数であることを示し、
Abは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、及び、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の機能性断片であることを示し、
N297糖鎖は、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
Abは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、及び、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の機能性断片であることを示し、
N297糖鎖は、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
【0033】
【化16】
【0034】
【化17】
【0035】
【化18】
【0036】
式中、波線は、抗体のAsn297に結合していることを示し、
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*であることを示し、
ここで、左端のアミノ基が、N297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
［23］次式；
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*であることを示し、
ここで、左端のアミノ基が、N297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
［23］次式；
【0037】
【化19】
【0038】
（上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数であることを示し、
Abは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、及び、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の機能性断片であることを示し、
N297糖鎖は、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
Abは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、及び、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の機能性断片であることを示し、
N297糖鎖は、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
【0039】
【化20】
【0040】
【化21】
【0041】
【化22】
【0042】
式中、波線は、抗体のAsn297に結合していることを示し、
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*であることを示し、
ここで、左端のアミノ基が、N297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
［24］次式；
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*であることを示し、
ここで、左端のアミノ基が、N297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
［24］次式；
【0043】
【化23】
【0044】
（上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数であることを示し、
Abは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、及び、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の機能性断片であることを示し、
N297糖鎖は、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
Abは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、及び、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の機能性断片であることを示し、
N297糖鎖は、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
【0045】
【化24】
【0046】
【化25】
【0047】
【化26】
【0048】
式中、波線は、抗体のAsn297に結合していることを示し、
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*であることを示し、
ここで、左端のアミノ基が、N297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
［25］次式；
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*であることを示し、
ここで、左端のアミノ基が、N297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
［25］次式；
【0049】
【化27】
【0050】
（上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数であることを示し、
Abは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、及び、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の機能性断片であることを示し、
N297糖鎖は、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
Abは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、及び、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の機能性断片であることを示し、
N297糖鎖は、次式で示される構造を有するN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、
【0051】
【化28】
【0052】
【化29】
【0053】
【化30】
【0054】
式中、波線は、抗体のAsn297に結合していることを示し、
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*であることを示し、
ここで、左端のアミノ基が、N297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
［26］抗体が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、［22］～［25］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［27］抗体が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、［22］～［25］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［28］抗体が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、［22］～［25］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［29］抗体が、配列番号17に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号25に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［22］～［26］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［30］抗体が、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号29に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［22］～［25］及び［27］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［31］抗体が、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号21に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［22］～［25］及び［28］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［32］抗体が、配列番号15のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号23のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［22］～［26］及び［29］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［33］抗体が、配列番号11のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号27のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［22］～［25］、［27］及び［30］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［34］抗体が、配列番号11においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号32においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［22］～［25］、［28］及び［31］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［35］抗体が、配列番号31においてアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号32においてアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［22］～［25］、［28］及び［31］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［36］抗体が、N－結合型糖鎖付加、O－結合型糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、N末におけるメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、及び重鎖のカルボキシル末端における1つ又は2つのアミノ酸残基の欠失からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む、［22］～［35］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［37］配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、及び、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の機能性断片。
［38］以下の（a）又は（b）に記載のCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖、ならびにCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖を含む、［37］に記載の抗体又は該抗体の機能性断片；
（a）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は、
（b）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3。
［39］以下の（a）～（e）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び（f）～（k）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［37］又は［38］に記載の抗体又は該抗体の機能性断片；
（a）配列番号13に記載のアミノ酸配列、
（b）配列番号17に記載のアミノ酸配列、
（c）（a）又は（b）の配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（d）（a）又は（b）の配列における各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、及び、
（e）配列番号25に記載のアミノ酸配列、
（f）配列番号29に記載のアミノ酸配列、
（g）（e）又は（f）の配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び
（h）（e）又は（f）の配列における各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
［40］以下の（a）又は（b）に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、［39］に記載の抗体又は該抗体の機能性断片；
（a）配列番号17に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号25に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は、
（b）配列番号13に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号29に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。
［41］キメラ抗体又はヒト抗体である、［37］～［40］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［42］ヒト化抗体である、［37］～［40］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［43］ヒトIgG1、ヒトIgG2又はヒトIgG4の重鎖定常領域を含む、［41］又は［42］に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［44］重鎖定常領域がヒトIgG1の重鎖定常領域であり、該重鎖定常領域において、EU Indexにより示される234位及び235位のロイシンがアラニンに置換されている、［43］に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［45］以下の（a）又は（ｂ）に記載の重鎖及び軽鎖を含む、［42］～［44］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片；
（a）配列番号15のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号23のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖（H01L02）、又は、
（b）配列番号11のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号27のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖（HwtL05）。
［46］［37］～［45］のいずれか一つに記載の抗体と、HER2への結合において競合するか、又は、［37］～［45］のいずれか一つに記載の抗体が認識するHER2上の部位に結合する、抗体又は該抗体の機能性断片。
［47］［37］～［46］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片をコードするポリヌクレオチド。
［48］［47］に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
［49］［48］に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
［50］宿主細胞が、真核細胞である［49］に記載の宿主細胞。
［51］宿主細胞が、動物細胞である［49］又は［50］に記載の宿主細胞。
［52］［49］～［51］のいずれか一つに記載の宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含むことを特徴とする、［37］～［46］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片の製造方法。
［53］［52］に記載の製造方法により得られることを特徴とする抗体又は該抗体の機能性断片。
［54］N－結合型糖鎖付加、O－結合型糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、N末におけるメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、及び重鎖のカルボキシル末端における1つ又は2つのアミノ酸残基の欠失からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む、［37］～［46］及び［53］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［55］重鎖のカルボキシル末端において1つ又は数個のアミノ酸残基が欠失している、［54］に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［56］2本の重鎖の双方のカルボキシル末端において1つのアミノ酸残基が欠失している、［55］に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［57］重鎖のカルボキシル末端のプロリン残基が更にアミド化されている、［53］～［56］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［58］以下の工程；
i）［49］～［51］のいずれか一つに記載の宿主細胞を培養し、得られた培養物から目的の抗体を採取する工程、
ii）工程i)で得られた抗体を加水分解酵素で処理し、(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を製造する工程、及び、
iii）MSG(9)又はSG(10)のシアル酸の2位のカルボン酸のカルボニル基にアジド基を有するPEGリンカーを導入し、且つ、還元末端をオキサゾリン化して得た糖鎖ドナー分子と、糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を反応させる工程、を含む糖鎖リモデリング抗体の製造方法。
［59］更に、工程ii）の反応液を、ハイドロキシアパタイトカラムによる精製により(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を精製する工程を含む、［58］に記載の製造方法。
［60］［58］又は［59］に記載の製造方法で得られることを特徴とする、糖鎖リモデリング抗体。
［61］［60］に記載の糖鎖リモデリング抗体を薬物リンカーと反応させる工程を含む、［1］～［36］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲートの製造方法。
［62］［60］に記載の製造方法で得られることを特徴とする、抗体－薬物コンジュゲート。
［63］該抗体が、［53］～［57］及び［60］に記載のいずれか一つに記載の抗体である、［1］～［36］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［64］N297糖鎖が、N297-(Fuc)MSG1である、［1］～［36］、［62］及び［63］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［65］m1が、1の整数である、［1］～［36］及び［62］～［64］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［66］抗体―薬物コンジュゲートにおける抗体１分子あたりの平均薬物結合数が、1～3又は3～5である、［1］～［36］及び［62］～［65］のいずれか一つに記載の抗体―薬物コンジュゲート。
［67］［1］～［36］及び［62］～［66］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート、又は、［37］～［47］、［53］～［57］及び［60］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片を含むことを特徴とする医薬組成物。
［68］抗腫瘍薬であることを特徴とする、［67］に記載の医薬組成物。
［69］腫瘍が、HER2を発現していることを特徴とする、［68］に記載の医薬組成物。
［70］［1］～［36］及び［62］～［66］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート、又は、［37］～［47］、［53］～［57］及び［60］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片を個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。
［71］腫瘍が、HER2を発現していることを特徴とする、［70］に記載の腫瘍の治療方法。
［72］［1］～［36］及び［62］～［66］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート、又は、［37］～［47］、［53］～［57］及び［60］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片を含む医薬組成物、及び少なくとも一つの抗腫瘍薬を、同時に、別々に又は連続して個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。
［73］さらなる化合物とコンジュゲートされた［37］～［47］、［53］～［57］及び［60］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
N297糖鎖中のL(PEG)は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-*であることを示し、
ここで、左端のアミノ基が、N297糖鎖のβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側又は／及び1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、上記構造式中のトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す）で示される抗体－薬物コンジュゲート。
［26］抗体が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、［22］～［25］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［27］抗体が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、［22］～［25］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［28］抗体が、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、［22］～［25］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［29］抗体が、配列番号17に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号25に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［22］～［26］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［30］抗体が、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号29に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［22］～［25］及び［27］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［31］抗体が、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号21に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［22］～［25］及び［28］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［32］抗体が、配列番号15のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号23のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［22］～［26］及び［29］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［33］抗体が、配列番号11のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号27のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［22］～［25］、［27］及び［30］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［34］抗体が、配列番号11においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号32においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［22］～［25］、［28］及び［31］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［35］抗体が、配列番号31においてアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号32においてアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［22］～［25］、［28］及び［31］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［36］抗体が、N－結合型糖鎖付加、O－結合型糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、N末におけるメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、及び重鎖のカルボキシル末端における1つ又は2つのアミノ酸残基の欠失からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む、［22］～［35］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［37］配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖、及び、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖を含んでなる、HER2に特異的に結合する抗体又は該抗体の機能性断片。
［38］以下の（a）又は（b）に記載のCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む重鎖、ならびにCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む軽鎖を含む、［37］に記載の抗体又は該抗体の機能性断片；
（a）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は、
（b）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3。
［39］以下の（a）～（e）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び（f）～（k）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［37］又は［38］に記載の抗体又は該抗体の機能性断片；
（a）配列番号13に記載のアミノ酸配列、
（b）配列番号17に記載のアミノ酸配列、
（c）（a）又は（b）の配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（d）（a）又は（b）の配列における各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、及び、
（e）配列番号25に記載のアミノ酸配列、
（f）配列番号29に記載のアミノ酸配列、
（g）（e）又は（f）の配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び
（h）（e）又は（f）の配列における各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
［40］以下の（a）又は（b）に記載の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、［39］に記載の抗体又は該抗体の機能性断片；
（a）配列番号17に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号25に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は、
（b）配列番号13に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号29に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。
［41］キメラ抗体又はヒト抗体である、［37］～［40］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［42］ヒト化抗体である、［37］～［40］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［43］ヒトIgG1、ヒトIgG2又はヒトIgG4の重鎖定常領域を含む、［41］又は［42］に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［44］重鎖定常領域がヒトIgG1の重鎖定常領域であり、該重鎖定常領域において、EU Indexにより示される234位及び235位のロイシンがアラニンに置換されている、［43］に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［45］以下の（a）又は（ｂ）に記載の重鎖及び軽鎖を含む、［42］～［44］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片；
（a）配列番号15のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号23のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖（H01L02）、又は、
（b）配列番号11のアミノ酸番号20～469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号27のアミノ酸番号21～234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖（HwtL05）。
［46］［37］～［45］のいずれか一つに記載の抗体と、HER2への結合において競合するか、又は、［37］～［45］のいずれか一つに記載の抗体が認識するHER2上の部位に結合する、抗体又は該抗体の機能性断片。
［47］［37］～［46］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片をコードするポリヌクレオチド。
［48］［47］に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
［49］［48］に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
［50］宿主細胞が、真核細胞である［49］に記載の宿主細胞。
［51］宿主細胞が、動物細胞である［49］又は［50］に記載の宿主細胞。
［52］［49］～［51］のいずれか一つに記載の宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含むことを特徴とする、［37］～［46］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片の製造方法。
［53］［52］に記載の製造方法により得られることを特徴とする抗体又は該抗体の機能性断片。
［54］N－結合型糖鎖付加、O－結合型糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、N末におけるメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化、及び重鎖のカルボキシル末端における1つ又は2つのアミノ酸残基の欠失からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む、［37］～［46］及び［53］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［55］重鎖のカルボキシル末端において1つ又は数個のアミノ酸残基が欠失している、［54］に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［56］2本の重鎖の双方のカルボキシル末端において1つのアミノ酸残基が欠失している、［55］に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［57］重鎖のカルボキシル末端のプロリン残基が更にアミド化されている、［53］～［56］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
［58］以下の工程；
i）［49］～［51］のいずれか一つに記載の宿主細胞を培養し、得られた培養物から目的の抗体を採取する工程、
ii）工程i)で得られた抗体を加水分解酵素で処理し、(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を製造する工程、及び、
iii）MSG(9)又はSG(10)のシアル酸の2位のカルボン酸のカルボニル基にアジド基を有するPEGリンカーを導入し、且つ、還元末端をオキサゾリン化して得た糖鎖ドナー分子と、糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を反応させる工程、を含む糖鎖リモデリング抗体の製造方法。
［59］更に、工程ii）の反応液を、ハイドロキシアパタイトカラムによる精製により(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を精製する工程を含む、［58］に記載の製造方法。
［60］［58］又は［59］に記載の製造方法で得られることを特徴とする、糖鎖リモデリング抗体。
［61］［60］に記載の糖鎖リモデリング抗体を薬物リンカーと反応させる工程を含む、［1］～［36］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲートの製造方法。
［62］［60］に記載の製造方法で得られることを特徴とする、抗体－薬物コンジュゲート。
［63］該抗体が、［53］～［57］及び［60］に記載のいずれか一つに記載の抗体である、［1］～［36］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［64］N297糖鎖が、N297-(Fuc)MSG1である、［1］～［36］、［62］及び［63］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［65］m1が、1の整数である、［1］～［36］及び［62］～［64］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート。
［66］抗体―薬物コンジュゲートにおける抗体１分子あたりの平均薬物結合数が、1～3又は3～5である、［1］～［36］及び［62］～［65］のいずれか一つに記載の抗体―薬物コンジュゲート。
［67］［1］～［36］及び［62］～［66］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート、又は、［37］～［47］、［53］～［57］及び［60］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片を含むことを特徴とする医薬組成物。
［68］抗腫瘍薬であることを特徴とする、［67］に記載の医薬組成物。
［69］腫瘍が、HER2を発現していることを特徴とする、［68］に記載の医薬組成物。
［70］［1］～［36］及び［62］～［66］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート、又は、［37］～［47］、［53］～［57］及び［60］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片を個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。
［71］腫瘍が、HER2を発現していることを特徴とする、［70］に記載の腫瘍の治療方法。
［72］［1］～［36］及び［62］～［66］のいずれか一つに記載の抗体－薬物コンジュゲート、又は、［37］～［47］、［53］～［57］及び［60］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片を含む医薬組成物、及び少なくとも一つの抗腫瘍薬を、同時に、別々に又は連続して個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。
［73］さらなる化合物とコンジュゲートされた［37］～［47］、［53］～［57］及び［60］のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
【発明の効果】
【0055】
本発明の提供する新規な抗HER2抗体－ピロロベンゾジアゼピン（PBD）誘導体コンジュゲートは優れた抗腫瘍活性と安全性を有するため、抗腫瘍剤として有用である。また、本発明の新規HER2抗体は腫瘍細胞に発現している抗原を認識又は当該抗原に結合するため、該コンジュゲートの抗体として有用である。
【図面の簡単な説明】
【0056】
【図1】本発明の抗体－薬物コンジュゲート（（I）の分子）を模式的に表したものである。（a）は薬物D、（b）はリンカーL、（c）はN3-L(PEG)-、（d）はN297糖鎖（ここで、白の楕円はNeuAc(Sia)、白の六角形はMan、塗りつぶした六角形はGlcNAc、白のひし形はGal、及び、白の逆三角形はFuc）、をそれぞれ表す。（b）と（c）は（c）のアジド基（黒の涙型）と（b）のスペーサー（白の半円）におけるアルキン構造が反応し、トリアゾール環を形成して結合している。Y字型は、抗体Abを表す。また、本模式図では、N297糖鎖を便宜上N297-(Fuc)MSGとして表示し、N297糖鎖それぞれの一方の分岐鎖においてのみアジド基を有するPEGリンカー(N3-L(PEG)-)が結合したシアル酸を有し、他方の分岐鎖の非還元末端にシアル酸を持たない態様を示しているが、N297-(Fuc)SGを採用することで、両方の分岐鎖の非還元末端にアジド基を有するPEGリンカーが結合したシアル酸を有する態様でもよい。このような表示方法は、特に言及がない限り、本明細書の全体を通じて適用される。
【図2】本発明の抗体－薬物コンジュゲートの製造中間体である、(Fucα1,6)GlcNAc-抗体（図2Aの（II）の分子）、及び、MSG型糖鎖リモデリング抗体（図2Bの（III）の分子）の構造を示す模式図である。両方の図において、Y字型は図1と同様に抗体Abを表す。図2Aにおいて、（e）はFucの1位と、6位においてαグリコシド結合したGlcNAcのみからなるN297糖鎖を示す。図2Bにおいて、（d）は図1と同様のN297糖鎖を表し、（f）は、アジド基を有するPEGリンカー部分の構造であり、末端にリンカーLとの結合に供されるアジド基を表す。アジド基を有するPEGリンカーの結合様式は、図1の説明と同様である。
【図3】動物細胞で産生された抗体からMSG型糖鎖リモデリング抗体を製造する工程の模式図である。図中の分子(II)、(III)は、図2と同様に、(Fucα1，6)GlcNAc－抗体及びMSG型糖鎖リモデリング抗体をそれぞれ表す。（IV）の分子は動物細胞で産生された抗体であり、N297糖鎖が不均一な分子の混合物である。図3Aは、（IV）の不均一なN297糖鎖を、EndoSのような加水分解酵素で処理することで、均一な（Fucα1,6）GlcNAc－抗体（II）が作製される工程を示す。図3Bは、抗体（II）のN297糖鎖のGlcNAcに対して、EndoS D233Q/Q303L変異体のような糖転移酵素を用いて、MSG型糖鎖ドナー分子の糖鎖を糖鎖転移させることで、（III）のMSG型糖鎖リモデリング抗体が作製される工程を示す。ここで用いられるMSG型糖鎖ドナー分子は、MSGの非還元末端のシアル酸がアジド基を有するPEGリンカーで修飾されたものであり、作製されるMSG型N297糖鎖リモデリング抗体においても、図2Bで説明したとおり、非還元末端のシアル酸が同様の修飾を受けたものとなる。図3Bにおいては、便宜上ドナー分子としてMSGを表示しているが、SG（10）を糖鎖ドナーとすることで、（III）のリモデリング抗体はN297糖鎖の両方の非還元末端にアジド基を有するリンカー分子が結合した糖鎖リモデリング抗体が合成される。
【図4】Trastuzumab A1、A2及びHwtL05抗体重鎖(Hwt)のCDRH1～3のアミノ酸配列（配列番号1～3）を示す。
【図5】H01L02抗体重鎖(H01)のCDRH1～3のアミノ酸配列（配列番号1,2,4）を示す。
【図6】Trastuzumab A1、A2の軽鎖のCDRL1～3のアミノ酸配列（配列番号5,6(アミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列),7）を示す。
【図7】H01L02抗体及びHwtL05抗体軽鎖(L02,L05)のCDRL1～3のアミノ酸配列（配列番号5,6,8）を示す。
【図8】Trastuzumab A1の重鎖(Hwt)のアミノ酸配列（配列番号11）を示す。
【図9】A1、A2及びHwtL05の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号13）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。
【図10】H01L02抗体重鎖(H01)のアミノ酸配列（配列番号15）を示す。
【図11】H01L02抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号17）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。
【図12】Trastuzumab A1の軽鎖(Lwt)のアミノ酸配列（配列番号19）を示す。
【図13】Trastuzumab A1、A2の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号21）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。
【図14】H01L02抗体軽鎖(L02)のアミノ酸配列（配列番号23）を示す。
【図15】H01L02抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号25）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。
【図16】HwtL05抗体軽鎖(L05)のアミノ酸配列（配列番号27）を示す。
【図17】HwtL05抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号29）を示す。アミノ酸配列における下線はCDR配列を示す。
【図18】皮下移植したヒト乳癌株であるKPL－4細胞への抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC1、及び、ADC2の効果を示す。
【図19】皮下移植したヒト乳癌株であるJIMT-1細胞への抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC1、及び、ADC2の効果を示す。
【図20】皮下移植したヒト膵臓癌株であるCFPAC-1細胞への抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC1、及び、ADC2の効果を示す。
【図21】Trastuzumab A2の重鎖のアミノ酸配列（配列番号31）を示す。
【図22】Trastuzumab A2の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号32）を示す。
【図23】皮下移植したヒト乳癌株であるKPL－4細胞への抗HER2抗体－薬物コンジュゲートADC5の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0057】
〔抗体－薬物コンジュゲート〕
本発明の抗HER2抗体－薬物コンジュゲートは、腫瘍細胞に発現している抗原を認識又は当該抗原に結合できる抗体に、リンカー構造部分を介して抗腫瘍性化合物を結合させた抗腫瘍性薬物である。
本発明の抗HER2抗体－薬物コンジュゲートは、腫瘍細胞に発現している抗原を認識又は当該抗原に結合できる抗体に、リンカー構造部分を介して抗腫瘍性化合物を結合させた抗腫瘍性薬物である。
【0058】
本発明の抗体―薬物コンジュゲートは、次式；
【0059】
【化31】
【0060】
で示され、
m1は1又は2の整数（好ましくは、1）であり、Dは薬物、LはN297糖鎖とDを連結するリンカー、Abは抗体又は該抗体の機能性断片、N297糖鎖は前記抗体のAsn297の側鎖に結合する糖鎖を示す。N297糖鎖はリモデンリングされた糖鎖でも良い。
m1は1又は2の整数（好ましくは、1）であり、Dは薬物、LはN297糖鎖とDを連結するリンカー、Abは抗体又は該抗体の機能性断片、N297糖鎖は前記抗体のAsn297の側鎖に結合する糖鎖を示す。N297糖鎖はリモデンリングされた糖鎖でも良い。
【0061】
＜薬物＞
本発明の薬物Dは抗腫瘍性化合物であることが好ましい。本抗腫瘍性化合物は、本発明の抗体－薬物コンジュゲートのリンカーの一部又は全部が腫瘍細胞内で切断され抗腫瘍性化合物部分が遊離されて抗腫瘍効果が発現される。
本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物すなわちPBD誘導体は、以下の群から選択されるいずれか一つであり、
本発明の薬物Dは抗腫瘍性化合物であることが好ましい。本抗腫瘍性化合物は、本発明の抗体－薬物コンジュゲートのリンカーの一部又は全部が腫瘍細胞内で切断され抗腫瘍性化合物部分が遊離されて抗腫瘍効果が発現される。
本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物すなわちPBD誘導体は、以下の群から選択されるいずれか一つであり、
【0062】
【化32】
【0063】
ここで、式中、アステリスク（＊）はLと結合していることを示す。
【0064】
本発明のPBD誘導体は下記部分構造I(a)又はI(b)で示すように、11’位に不斉炭素が存在するため、光学異性体が存在する。
【0065】
【化33】
【0066】
従って、上記の本発明のPBD誘導体は、それぞれ、光学異性体及び光学異性体の任意の割合での混合物を含む。PBD誘導体の11’位の絶対立体配置は結晶性の生成物又は中間体もしくはそれらの誘導体のＸ線結晶構造解析やMosher法等のNMRにより決定することができる。その際、立体配置が既知である不斉中心を持つ試薬で誘導体化された結晶性の生成物又は中間体を用いて絶対立体配置を決定してもよい。立体異性体は、合成した本発明に係る化合物を所望により通常の光学分割法又は分離法を用いて単離することにより得ることができる。
本発明の抗体－薬物コンジュゲート、その遊離薬物もしくはその製造中間体には、立体異性体あるいは不斉炭素原子に由来する光学異性体、幾何異性体、互変異性体又はｄ体、ｌ体、アトロプ異性体等の光学異性体が存在することもあるが、これらの異性体、光学異性体及びこれらの混合物のいずれも本発明に含まれる。
本発明のPBD誘導体の部分構造としては、上記I(a)が好ましい。例えば、以下の群から選択されるいずれか一つである。
本発明の抗体－薬物コンジュゲート、その遊離薬物もしくはその製造中間体には、立体異性体あるいは不斉炭素原子に由来する光学異性体、幾何異性体、互変異性体又はｄ体、ｌ体、アトロプ異性体等の光学異性体が存在することもあるが、これらの異性体、光学異性体及びこれらの混合物のいずれも本発明に含まれる。
本発明のPBD誘導体の部分構造としては、上記I(a)が好ましい。例えば、以下の群から選択されるいずれか一つである。
【0067】
【化34】
【0068】
ここで、式中、アステリスク（＊）はLと結合していることを示す。
【0069】
＜リンカー構造＞
本発明のリンカーLは、N297糖鎖とDを連結するリンカーである。
当該リンカーLは、次式で示される。
－Lb－La－Lp－NH－B－CH2－O（C＝O）－＊
アステリスク（＊）は、薬物DのN10’位の窒素原子と結合していることを示し、Lbは、LaとN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖を結合するスペーサーを示す。
本発明のリンカーLは、N297糖鎖とDを連結するリンカーである。
当該リンカーLは、次式で示される。
－Lb－La－Lp－NH－B－CH2－O（C＝O）－＊
アステリスク（＊）は、薬物DのN10’位の窒素原子と結合していることを示し、Lbは、LaとN297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖を結合するスペーサーを示す。
【0070】
Bは、フェニル基又はヘテロアリール基を示し、好ましくは、1，4－フェニル基、2，5－ピリジル基、3，6－ピリジル基、2，5－ピリミジル基、2，5－チエニル基であり、より好ましくは、1，4－フェニル基である。
【0071】
Lpは、生体内又は標的細胞において切断可能なアミノ酸配列からなるリンカーを示す。Lpは、例えば、エステラーゼやペプチダーゼ等の酵素の作用によって、切断される。
Lpは、2から7個（好ましくは、2から4個）のアミノ酸で構成されるペプチド残基である。すなわち、2から7個のアミノ酸がペプチド結合したオリゴペプチドの残基によって構成される。
Lpは、N末端においてLb－La－のLaのカルボニル基に結合し、C末端においてリンカーの－NH－B－CH2－O（C＝O）－部分のアミノ基（－NH－）とアミド結合を形成する。前記エステラーゼ等の酵素によって、LpのC末端と－NH－間の結合が切断される。
Lpは、2から7個（好ましくは、2から4個）のアミノ酸で構成されるペプチド残基である。すなわち、2から7個のアミノ酸がペプチド結合したオリゴペプチドの残基によって構成される。
Lpは、N末端においてLb－La－のLaのカルボニル基に結合し、C末端においてリンカーの－NH－B－CH2－O（C＝O）－部分のアミノ基（－NH－）とアミド結合を形成する。前記エステラーゼ等の酵素によって、LpのC末端と－NH－間の結合が切断される。
【0072】
Lpを構成するアミノ酸は、特に限定されないが、例えば、L－又はD－アミノ酸であり、好ましくはL－アミノ酸である。また、α－アミノ酸の他、β－アラニン、ε－アミノカプロン酸、γ－アミノ酪酸等の構造のアミノ酸であってもよく，さらには例えばN－メチル化されたアミノ酸等の非天然型のアミノ酸であってもよい。
【0073】
Lpのアミノ酸配列は、特に限定されないが、構成するアミノ酸として、グリシン（Gly；G）、バリン（Val；V）、アラニン（Ala；A）、フェニルアラニン（Phe；F）、グルタミン酸（Glu；E）、イソロイシン（Ile；I）、プロリン（Pro；P）、シトルリン（Cit）、ロイシン（Leu；L）、セリン（Ser；S）、リシン（Lys；K）及びアスパラギン酸（Asp；D）等を挙げることができる。これらのうちで好ましくは、グリシン（Gly；G）、バリン（Val；V）、アラニン（Ala；A）、シトルリン（Cit）である。
これらのアミノ酸は重複してもよく、任意に選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。また、アミノ酸の種類によって、薬物遊離のパターンをコントロールすることができる。
これらのアミノ酸は重複してもよく、任意に選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。また、アミノ酸の種類によって、薬物遊離のパターンをコントロールすることができる。
【0074】
リンカーLpの具体例として、
-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-、-EGGVA、-PI-、-GGF-、-DGGF-、(D-)D-GGF-、-EGGF-、-SGGF-、-KGGF-、-DGGFG-、-GGFGG-、-DDGGFG-、-KDGGFG-、-GGFGGGF-
を挙げることができる。
ここで、上記の『（D-）V』はD－バリン、『（D-）P』はD-プロリン、『(D-)D』はD-アスパラギン酸を意味する。
-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-、-EGGVA、-PI-、-GGF-、-DGGF-、(D-)D-GGF-、-EGGF-、-SGGF-、-KGGF-、-DGGFG-、-GGFGG-、-DDGGFG-、-KDGGFG-、-GGFGGGF-
を挙げることができる。
ここで、上記の『（D-）V』はD－バリン、『（D-）P』はD-プロリン、『(D-)D』はD-アスパラギン酸を意味する。
【0075】
リンカーLpは、好ましくは、以下である。
-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-
-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-
【0076】
リンカーLpは、より好ましくは、以下である。
-GGVA-、-GGVCit-、-VA-
-GGVA-、-GGVCit-、-VA-
【0077】
Laは、以下の群から選択されるいずれか一つを示す。
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-、
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-、
-C(=O)-(CH2CH2)n2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(=O)-、-(CH2)n4-O-C(=O)-
ここで、式中、n2は1～3の整数（好ましくは、1又は2）、n3は1～5の整数（好ましくは、2～4の整数、より好ましくは、2又は4）、n4は0～2の整数（好ましくは、0又は1）を示す。
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-、
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-、
-C(=O)-(CH2CH2)n2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(=O)-、-(CH2)n4-O-C(=O)-
ここで、式中、n2は1～3の整数（好ましくは、1又は2）、n3は1～5の整数（好ましくは、2～4の整数、より好ましくは、2又は4）、n4は0～2の整数（好ましくは、0又は1）を示す。
【0078】
Laは、好ましくは、以下の群から選択されるいずれか一つを示し、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、
-CH2-OC(=O)-、及び、-OC(=O)-
Laは、より好ましくは、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、又は、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-である。
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、
-CH2-OC(=O)-、及び、-OC(=O)-
Laは、より好ましくは、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、又は、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-である。
【0079】
Lbのスペーサーは、特に限定されないが、例えば、次式で示されるスペーサーが挙げられる。
【0080】
【化35】
【0081】
【化36】
【0082】
【化37】
【0083】
上記で示されるLbのそれぞれの構造式において、アステリスク（＊）はLaの左端の-(C＝O）、又は-(CH2)n4と結合していることを示し、波線はAbの糖鎖又はリモデリングされた糖鎖と結合していることを示す。
上記で示されるLb(Lb-1、Lb-2又はLb-3)のそれぞれの構造式において、アジド基とDBCO(Dibenzocyclooctyne)のclick reactionで形成されるトリアゾール環部位は、幾何異性構造を有し、1つのLbは、これら２種類の構造のいずれか一方、又は、それらの混合物として存在する。すなわち、本発明の抗体－薬物コンジュゲート1分子中には2又は4個(m1は1又は2)の『－L－D』が存在し、2又は4個それぞれの『－L－D』におけるL中のそれぞれのLb(Lb-1、Lb-2又はLb-3)は、これら2種類の構造のいずれか一方、又は、その両方が混在している。
上記で示されるLb(Lb-1、Lb-2又はLb-3)のそれぞれの構造式において、アジド基とDBCO(Dibenzocyclooctyne)のclick reactionで形成されるトリアゾール環部位は、幾何異性構造を有し、1つのLbは、これら２種類の構造のいずれか一方、又は、それらの混合物として存在する。すなわち、本発明の抗体－薬物コンジュゲート1分子中には2又は4個(m1は1又は2)の『－L－D』が存在し、2又は4個それぞれの『－L－D』におけるL中のそれぞれのLb(Lb-1、Lb-2又はLb-3)は、これら2種類の構造のいずれか一方、又は、その両方が混在している。
【0084】
Lは、好ましくは、－Lb－La－Lp－NH－B－CH2－O（C＝O）－＊で示され、
Bは、1，4－フェニル基であり、
Lpは、以下の群から選択されるいずれか一つを示し、
-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GGPL-
Laは、以下の群から選択されるいずれか一つを示し、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、-OC(=O)-
Lbは、上記で示されるLbのいずれかの構造式を示す。
Bは、1，4－フェニル基であり、
Lpは、以下の群から選択されるいずれか一つを示し、
-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GGPL-
Laは、以下の群から選択されるいずれか一つを示し、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、-OC(=O)-
Lbは、上記で示されるLbのいずれかの構造式を示す。
【0085】
Lは、より好ましくは、以下の群から選択されるいずれか一つである。
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-
ここで、Z1は、上記Lbの以下で示される構造式；
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-
ここで、Z1は、上記Lbの以下で示される構造式；
【0086】
【化38】
【0087】
を示し、Z2は、上記Lbの以下で示される構造式：
【0088】
【化39】
【0089】
【化40】
【0090】
Lは、最も好ましくは、以下のいずれかである。
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及び
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
ここで、Bは1，4－フェニル基であり、
Z1は上記Lbの以下で示される構造式：
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及び
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
ここで、Bは1，4－フェニル基であり、
Z1は上記Lbの以下で示される構造式：
【0091】
【化41】
【0092】
＜遊離薬物＞
本発明の抗体－薬物コンジュゲートの遊離薬物は、以下の群から選ばれる一つである。
本発明の抗体－薬物コンジュゲートの遊離薬物は、以下の群から選ばれる一つである。
【0093】
【化42】
【0094】
本発明の遊離薬物は、本発明の抗体－薬物コンジュゲートが腫瘍細胞内に移行した後、抗体－薬物コンジュゲートにおけるリンカーL部分が切断されて生成する。当該遊離薬物は抗腫瘍細胞効果が確認された。
【0095】
＜抗体＞
本発明において、「癌」と「腫瘍」は同じ意味に用いている。
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列、またはその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列またはその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、DNA、mRNA、cDNA、RNA等は「遺伝子」の意味に含まれる。「HER2遺伝子」としては、例えば、HER2蛋白質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるDNA、mRNA、cDNA、cRNA等をあげることができる。
本発明において、「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」又は「ヌクレオチド配列」と「核酸」は同義であり、例えば、DNA、RNA、プローブ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プライマー等も「ヌクレオチド」又は「ヌクレオチド配列」の意味に含まれる。
本発明においては、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「蛋白質」は区別せずに用いている。
本発明において、「HER2」は、HER2蛋白質と同じ意味で用いている。
本発明において、「癌」と「腫瘍」は同じ意味に用いている。
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列、またはその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列またはその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、DNA、mRNA、cDNA、RNA等は「遺伝子」の意味に含まれる。「HER2遺伝子」としては、例えば、HER2蛋白質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるDNA、mRNA、cDNA、cRNA等をあげることができる。
本発明において、「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」又は「ヌクレオチド配列」と「核酸」は同義であり、例えば、DNA、RNA、プローブ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プライマー等も「ヌクレオチド」又は「ヌクレオチド配列」の意味に含まれる。
本発明においては、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「蛋白質」は区別せずに用いている。
本発明において、「HER2」は、HER2蛋白質と同じ意味で用いている。
【0096】
本発明において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
本発明において、「細胞傷害活性」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化を引き起こすことをいい、直接的な外傷にとどまらず、DNAの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷を引き起こすことをいう。
本発明において、「細胞傷害活性」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化を引き起こすことをいい、直接的な外傷にとどまらず、DNAの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷を引き起こすことをいう。
【0097】
本発明において、「エピトープ」とは、特定の抗体（例えば、抗HER2抗体）が結合する抗原の部分ペプチド又は部分立体構造（例えば、HER2の部分ペプチド又は部分立体構造）を意味する。前記の部分ペプチド（例えば、HER2の部分ペプチド）であるエピトープは免疫アッセイ法等当業者にはよく知られている方法によって、決定することができる。
【0098】
本発明における「CDR」とは、相補性決定領域（CDR：Complementarity determining region）を意味する。抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ3箇所のCDRがあることが知られている。CDRは、超可変領域（hypervariable region）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ3ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体のCDRについて、重鎖のCDRを重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からCDRH1、CDRH2、CDRH3と表記し、軽鎖のCDRを軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からCDRL1、CDRL2、CDRL3と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
【0099】
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ExpressHyb Hybridization Solution（クロンテック社）中、68℃でハイブリダイズすること、又はDNAを固定したフィルターを用いて0.7-1.0MのNaCl存在下68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1－2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度SSCとは150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリウムからなる）を用い、68℃で洗浄することによって同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
本発明において、「1～数個」とは、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個又は1～2個を意味する。
本発明において、「1～数個」とは、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個又は1～2個を意味する。
【0100】
本発明において、HER2を認識する又は結合する抗体を、「抗HER2抗体」と標記することがある。かかる抗体には、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等が含まれる。
【0101】
抗体の腫瘍細胞への結合性は、フローサイトメトリーを用いて確認できる。腫瘍細胞内への抗体の取り込みは、(1)治療抗体に結合する二次抗体（蛍光標識）を用いて細胞内に取り込まれた抗体を蛍光顕微鏡で可視化するアッセイ(Cell Death and Differentiation (2008)15, 751-761)、(2)治療抗体に結合する二次抗体(蛍光標識)を用いて細胞内に取り込まれた蛍光量を測定するアッセイ(Molecular Biology of the Cell Vol.15, 5268-5282, December 2004）又は（3）治療抗体に結合するイムノトキシンを用いて、細胞内に取り込まれると毒素が放出されて細胞増殖が抑制されるというMab－ZAPアッセイ(Bio Techniques 28:162-165, January 2000)を用いて確認できる。イムノトキシンとしては、ジフテリア毒素の触媒領域とプロテインGとのリコンビナント複合蛋白質も使用可能である。
本発明において、「高い内在化能」とは、当該抗体とサポリン標識抗マウス又はラットIgG抗体を添加した標的抗原発現細胞(例えば、HER2発現細胞)の生存率(抗体未添加時の細胞生存率を100％とした相対率で表したもの）が、好ましくは70％以下、より好ましくは60％以下であることを意味する。
本発明において、「高い内在化能」とは、当該抗体とサポリン標識抗マウス又はラットIgG抗体を添加した標的抗原発現細胞(例えば、HER2発現細胞)の生存率(抗体未添加時の細胞生存率を100％とした相対率で表したもの）が、好ましくは70％以下、より好ましくは60％以下であることを意味する。
【0102】
以下に、本発明において使用される抗HER2抗体について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【0103】
1．HER2
ヒトHER2蛋白は、N末端22アミノ酸残基からなるシグナル配列、630アミノ酸残基からなる細胞外ドメイン、23アミノ酸残基からなる細胞膜貫通ドメイン、580アミノ酸残基からなる細胞内ドメインから構成されている。
ヒトHER2のアミノ酸配列及びDNA配列は公的データベース上に公開されており、例えば、M11730(Genbank)、NP＿004439.2（NCBI）等のアクセッション番号により参照可能である。
ヒトHER2蛋白は、N末端22アミノ酸残基からなるシグナル配列、630アミノ酸残基からなる細胞外ドメイン、23アミノ酸残基からなる細胞膜貫通ドメイン、580アミノ酸残基からなる細胞内ドメインから構成されている。
ヒトHER2のアミノ酸配列及びDNA配列は公的データベース上に公開されており、例えば、M11730(Genbank)、NP＿004439.2（NCBI）等のアクセッション番号により参照可能である。
【0104】
2．抗HER2抗体
本発明の抗HER2抗体は腫瘍細胞を標的にできる抗体であり、すなわち腫瘍細胞を認識できる特性、腫瘍細胞に結合できる特性、そして腫瘍細胞内に取り込まれて内在化する特性等を備えている。したがって、本発明の抗HER2抗体と抗腫瘍活性を有する化合物を、リンカーを介して結合させて抗体－薬物コンジュゲートとすることができる。
本発明の抗HER2抗体は抗腫瘍活性を有していてもよい。
本発明の抗HER2抗体は腫瘍細胞を標的にできる抗体であり、すなわち腫瘍細胞を認識できる特性、腫瘍細胞に結合できる特性、そして腫瘍細胞内に取り込まれて内在化する特性等を備えている。したがって、本発明の抗HER2抗体と抗腫瘍活性を有する化合物を、リンカーを介して結合させて抗体－薬物コンジュゲートとすることができる。
本発明の抗HER2抗体は抗腫瘍活性を有していてもよい。
【0105】
本発明の抗HER2抗体は、この分野で通常実施される方法を用いて、抗原となるポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、前記公知の方法に従って、抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによってハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
【0106】
本発明の抗HER2抗体としては、以下の特性を有するものが望ましい。
（1）以下（a）及び（b）の特性を有することを特徴とする抗体；
（a）HER2を認識又は結合する。
本発明の抗体はHER2を認識する。言い換えれば、本発明の抗体はHER2に結合する。本発明の抗体は、好ましくはHER2に結合し、より好ましくは、HER2に特異的に結合する。
本発明において「特異的な認識」、すなわち「特異的な結合」とは、非特異的な吸着ではない結合を意味する。結合が特異的であるか否かの判定基準としては、例えば、解離定数（Dissociation Constant：以下、「KDという」）をあげることができる。本発明の好適な抗体のHER2に対するKD値は1×10－5M以下、5×10－6M以下、2×10－6M以下または1×10－6M以下、より好適には5×10－7M以下、2×10－7M以下または1×10－7M以下である。
本発明における抗原と抗体の結合は、ELISA法、RIA法、Surface Plasmon Resonance（以下、「SPR」という）解析法等により測定または判定することができる。細胞表面上に発現している抗原と抗体との結合は、フローサートメトリー法等により測定することができる。
（b）HER2と結合することによってHER2発現細胞に内在化する活性を有する。
（2）HER2がヒトHER2である上記（1）に記載の抗体。
（1）以下（a）及び（b）の特性を有することを特徴とする抗体；
（a）HER2を認識又は結合する。
本発明の抗体はHER2を認識する。言い換えれば、本発明の抗体はHER2に結合する。本発明の抗体は、好ましくはHER2に結合し、より好ましくは、HER2に特異的に結合する。
本発明において「特異的な認識」、すなわち「特異的な結合」とは、非特異的な吸着ではない結合を意味する。結合が特異的であるか否かの判定基準としては、例えば、解離定数（Dissociation Constant：以下、「KDという」）をあげることができる。本発明の好適な抗体のHER2に対するKD値は1×10－5M以下、5×10－6M以下、2×10－6M以下または1×10－6M以下、より好適には5×10－7M以下、2×10－7M以下または1×10－7M以下である。
本発明における抗原と抗体の結合は、ELISA法、RIA法、Surface Plasmon Resonance（以下、「SPR」という）解析法等により測定または判定することができる。細胞表面上に発現している抗原と抗体との結合は、フローサートメトリー法等により測定することができる。
（b）HER2と結合することによってHER2発現細胞に内在化する活性を有する。
（2）HER2がヒトHER2である上記（1）に記載の抗体。
【0107】
本発明の抗HER2抗体は、HER2を認識又は結合する抗体であれば特に制限はないが、好ましくは本願の配列表で示されたアミノ酸配列で特定される抗体である。
【0108】
本発明の抗HER2モノクローナル抗体の取得方法は、通常、下記のような工程を経るが、これに限定されない。
（ハイブリドーマを用いる方法）
（a）抗原として使用する生体高分子の精製、又は抗原発現細胞の調製、及び当該生体高分子又は抗原発現細胞の動物への投与、
（b）免疫反応を誘起された上述の動物より、抗体産生細胞を含む組織（例えばリンパ節）を採取、
（c）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）（例えば、マウスミエローマSP2／0－ag14細胞）の調製、
（d）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（e）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（f）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（g）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（h）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性（内在化活性）、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定
ここで用いられる抗体価の測定法としては、例えば、フローサイトメトリー又はCell-ELISA法を挙げることができるがこれらの方法に制限されない。
（ハイブリドーマを用いる方法）
（a）抗原として使用する生体高分子の精製、又は抗原発現細胞の調製、及び当該生体高分子又は抗原発現細胞の動物への投与、
（b）免疫反応を誘起された上述の動物より、抗体産生細胞を含む組織（例えばリンパ節）を採取、
（c）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）（例えば、マウスミエローマSP2／0－ag14細胞）の調製、
（d）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（e）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（f）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（g）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（h）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性（内在化活性）、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定
ここで用いられる抗体価の測定法としては、例えば、フローサイトメトリー又はCell-ELISA法を挙げることができるがこれらの方法に制限されない。
【0109】
さらに、「抗HER2抗体の製造」（a）～（h）の工程を再度実施して別途に独立してモノクローナル抗体を取得した場合や他の方法によって別途にモノクローナル抗体を取得した場合においても、前記方法により得られた抗HER2抗体と同等の内在化活性を有する抗体を取得することが可能である。このような抗体の一例として、前記方法により得られた抗HER2抗体と同一のエピトープに結合する抗体を挙げることができる。新たに作製されたモノクローナル抗体が、前記抗HER2抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に結合すれば、該モノクローナル抗体が同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、前記抗HER2抗体のHER2に対する結合に対して該モノクローナル抗体が競合する（即ち、該モノクローナル抗体が、前記抗HER2抗体とHER2の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、該モノクローナル抗体が抗HER2抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。エピトープが同一であることが確認された場合、該モノクローナル抗体が前記抗HER2抗体と同等の抗原結合能、生物活性及び／又は内在化活性を有していることが強く期待される。
【0110】
本発明の抗体には、上記HER2に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等も含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
（1）キメラ抗体
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984)等）。
（2）ヒト化抗体
ヒト化抗体としては、相補性決定領域（CDR;complementarity determining region）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Nature(1986)321,p.522-525等）、CDR移植法によって、CDRの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体(WO90/07861)、更に、一部のCDRのアミノ酸配列を改変した抗体（WO2012/075581、WO2011/084496、US2018/0501692）、遺伝子変換突然変異誘発(gene conversion mutagenesis)ストラテジーを用いてヒト化した抗体（US5821337）を挙げることができる。CDRのアミノ酸配列は、Kabatの定義、Chothiaの定義、Abmの定義、IMGT等公知の方法によって決めることができるが、本発明におけるCDRはいずれの方法によって定義されたものでもよい。
本発明のヒト化抗HER2抗体としては、H01L02抗体、HwtL05抗体又はTrastuzumab A1(HwtLwt)、Trastuzumab A2を挙げることができる。本発明の抗HER2抗体としてはH01L02抗体、HwtL05抗体、Trastuzumab A1(HwtLwt)又はTrastuzumab A2の6種全てのCDR配列を保持し、HER2結合活性を有する限り、特定のヒト化抗体に限定されず、更に1～数個（好ましくは、1～2個、より好ましくは1個）のCDRのアミノ酸配列を改変したヒト化抗体変異体もHER2蛋白質を認識する又は該抗体のHER2蛋白質結合活性を有する限り、特定のヒト化抗体に限定されない。
本発明の抗HER2ヒト化抗体又はその機能性断片としては、例えば、
配列表の配列番号1（図4）に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH1、
配列表の配列番号2（図4）に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH2、及び、
配列表の配列番号3（図4）に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む可変領域を有する重鎖、
並びに、
配列表の配列番号5（図6）に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL1、
配列表の配列番号6（図6）のアミノ酸番号1～3に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL2、及び、
配列表の配列番号7（図6）に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む可変領域を有する軽鎖を含み、
本発明のHER2蛋白質を認識する又は該抗体のHER2蛋白質結合活性を有する抗体又は該抗体の機能性断片等を挙げることができる。
上記抗HER2ヒト化抗体又はその機能性断片におけるCDRのアミノ酸置換の例としては、好ましくは、上記CDLH3又はCDRL3の1～数個（好ましくは、1～2個もしくは1個）のアミノ酸置換が挙げられ、配列表の配列番号3のアミノ酸番号9番のアミノ酸を置換した配列表の配列番号4（図5）に示されるCDRH3、又は配列表の配列番号7のアミノ酸番号4番のアミノ酸を置換した配列表の配列番号8（図7）に示されるCDRL3を例示できる。
本発明のCDRH1、CDRH2、CDRH3を含む重鎖及びCDRL1、CDRL2、CDRL3を含む軽鎖を含んでなる抗体として、以下(a)及び(b)を含む抗体を例示できる。
（a）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3(H01L02)、
（b）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3(HwtL05)、
（c）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3(Trastuzumab A1又はA2)。
（1）キメラ抗体
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984)等）。
（2）ヒト化抗体
ヒト化抗体としては、相補性決定領域（CDR;complementarity determining region）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Nature(1986)321,p.522-525等）、CDR移植法によって、CDRの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体(WO90/07861)、更に、一部のCDRのアミノ酸配列を改変した抗体（WO2012/075581、WO2011/084496、US2018/0501692）、遺伝子変換突然変異誘発(gene conversion mutagenesis)ストラテジーを用いてヒト化した抗体（US5821337）を挙げることができる。CDRのアミノ酸配列は、Kabatの定義、Chothiaの定義、Abmの定義、IMGT等公知の方法によって決めることができるが、本発明におけるCDRはいずれの方法によって定義されたものでもよい。
本発明のヒト化抗HER2抗体としては、H01L02抗体、HwtL05抗体又はTrastuzumab A1(HwtLwt)、Trastuzumab A2を挙げることができる。本発明の抗HER2抗体としてはH01L02抗体、HwtL05抗体、Trastuzumab A1(HwtLwt)又はTrastuzumab A2の6種全てのCDR配列を保持し、HER2結合活性を有する限り、特定のヒト化抗体に限定されず、更に1～数個（好ましくは、1～2個、より好ましくは1個）のCDRのアミノ酸配列を改変したヒト化抗体変異体もHER2蛋白質を認識する又は該抗体のHER2蛋白質結合活性を有する限り、特定のヒト化抗体に限定されない。
本発明の抗HER2ヒト化抗体又はその機能性断片としては、例えば、
配列表の配列番号1（図4）に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH1、
配列表の配列番号2（図4）に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH2、及び、
配列表の配列番号3（図4）に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRH3を含む可変領域を有する重鎖、
並びに、
配列表の配列番号5（図6）に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL1、
配列表の配列番号6（図6）のアミノ酸番号1～3に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL2、及び、
配列表の配列番号7（図6）に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の1～数個（好ましくは、1～2個）のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるCDRL3を含む可変領域を有する軽鎖を含み、
本発明のHER2蛋白質を認識する又は該抗体のHER2蛋白質結合活性を有する抗体又は該抗体の機能性断片等を挙げることができる。
上記抗HER2ヒト化抗体又はその機能性断片におけるCDRのアミノ酸置換の例としては、好ましくは、上記CDLH3又はCDRL3の1～数個（好ましくは、1～2個もしくは1個）のアミノ酸置換が挙げられ、配列表の配列番号3のアミノ酸番号9番のアミノ酸を置換した配列表の配列番号4（図5）に示されるCDRH3、又は配列表の配列番号7のアミノ酸番号4番のアミノ酸を置換した配列表の配列番号8（図7）に示されるCDRL3を例示できる。
本発明のCDRH1、CDRH2、CDRH3を含む重鎖及びCDRL1、CDRL2、CDRL3を含む軽鎖を含んでなる抗体として、以下(a)及び(b)を含む抗体を例示できる。
（a）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3(H01L02)、
（b）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号8に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3(HwtL05)、
（c）配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、ならびに、配列番号5に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号6のアミノ酸番号1～3に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3(Trastuzumab A1又はA2)。
【0111】
上記CDRH1～3を有するヒト化抗体の重鎖可変領域として、配列表の配列番号13（図9）に示されるアミノ酸配列及び配列表の配列番号17（図11）に示されるアミノ酸配列を例示でき、上記CDRL1～3を有するヒト化抗体の軽鎖可変領域として配列表の配列番号21（図13）に示されるアミノ酸配列、配列表の配列番号25（図15）に示されるアミノ酸配列、及び配列表の配列番号29（図17）に示されるアミノ酸配列を例示できる。
【0112】
上記、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せを含むヒト化抗体として、
配列表の配列番号17（図11）に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号25（図15）に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことからなるヒト化抗体(H01L02)、
配列表の配列番号13（図9）に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、および、配列表の配列番号29（図17）に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことからなるヒト化抗体(HwtL05)、
配列表の配列番号13（図9）に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、および、配列表の配列番号21（図13）に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことからなるヒト化抗体(Trastuzumab A1(HwtLwt)、Trastuzumab A2)、
に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことからなるヒト化抗体を好適に例示できる。
配列表の配列番号17（図11）に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列表の配列番号25（図15）に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことからなるヒト化抗体(H01L02)、
配列表の配列番号13（図9）に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、および、配列表の配列番号29（図17）に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことからなるヒト化抗体(HwtL05)、
配列表の配列番号13（図9）に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、および、配列表の配列番号21（図13）に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことからなるヒト化抗体(Trastuzumab A1(HwtLwt)、Trastuzumab A2)、
に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むことからなるヒト化抗体を好適に例示できる。
【0113】
上記重鎖可変領域を含む重鎖及び軽鎖可変領域を含む軽鎖の組み合わせを含むことからなるヒト化抗体として、
配列表の配列番号15（図10）のアミノ酸番号20～469に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号23（図14）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（H01L02）、
配列表の配列番号11（図8）のアミノ酸番号20～469に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号27（図16）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（HwtL05）、
配列表の配列番号11（図8）のアミノ酸番号20～469に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号19（図12）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（Trastuzumab A1(HwtLwt)）、及び、
配列表の配列番号31（図21）のアミノ酸番号20～469に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号32（図22）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（Trastuzumab A2）を例示できる。
配列表の配列番号15（図10）のアミノ酸番号20～469に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号23（図14）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（H01L02）、
配列表の配列番号11（図8）のアミノ酸番号20～469に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号27（図16）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（HwtL05）、
配列表の配列番号11（図8）のアミノ酸番号20～469に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号19（図12）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（Trastuzumab A1(HwtLwt)）、及び、
配列表の配列番号31（図21）のアミノ酸番号20～469に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号32（図22）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（Trastuzumab A2）を例示できる。
【0114】
上記ヒト化抗体H01L02、HwtL05、Trastuzumab A1、Trastuzumab A2の重鎖のカルボキシル末端は、後述のように、1又は2つのアミノ酸が欠失していてもよく、当該欠失体も本発明に含まれる。
欠失体の重鎖として、配列表の配列番号11、15、31のアミノ酸番号20～468番目に記載のアミノ酸配列を含む重鎖が挙げられる。
当該欠失体として、
配列表の配列番号15（図10）のアミノ酸番号20～468に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号23（図14）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（H01L02）、
配列表の配列番号11（図8）のアミノ酸番号20～468に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号27（図16）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（HwtL05）、
配列表の配列番号11（図8）のアミノ酸番号20～468に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号19（図12）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（Trastuzumab A1(HwtLwt)）、及び、
配列表の配列番号31（図21）のアミノ酸番号20～468に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号32（図22）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（Trastuzumab A2）を例示できる。
欠失体の重鎖として、配列表の配列番号11、15、31のアミノ酸番号20～468番目に記載のアミノ酸配列を含む重鎖が挙げられる。
当該欠失体として、
配列表の配列番号15（図10）のアミノ酸番号20～468に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号23（図14）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（H01L02）、
配列表の配列番号11（図8）のアミノ酸番号20～468に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号27（図16）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（HwtL05）、
配列表の配列番号11（図8）のアミノ酸番号20～468に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号19（図12）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（Trastuzumab A1(HwtLwt)）、及び、
配列表の配列番号31（図21）のアミノ酸番号20～468に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び、配列表の配列番号32（図22）のアミノ酸番号21～234に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含むことからなるヒト化抗体（Trastuzumab A2）を例示できる。
【0115】
なお、配列表の配列番号11（図8）、15（図10）又は31（図21）に示される重鎖アミノ酸配列中で、1～19番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、20～139番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は重鎖可変領域であり、140～469番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は重鎖定常領域である。
また、配列表の配列番号19（図12）、23（図14）、27（図16）又は32（図22）に示される軽鎖アミノ酸配列中で、1～20番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、21～127番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、128～234番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖定常領域である。
また、配列表の配列番号19（図12）、23（図14）、27（図16）又は32（図22）に示される軽鎖アミノ酸配列中で、1～20番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、21～127番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、128～234番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖定常領域である。
【0116】
上記ヒト化抗体H01L02の重鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号16、軽鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号24、
ヒト化抗体HwtL05の重鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号12、軽鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号28、
ヒト化抗体Trastuzumab A1の重鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号12、軽鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号20で示されるポリヌクレオチドである。
上記ヒト化抗体H01L02の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号18、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号26、
ヒト化抗体HwtL05の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号14、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号30、
ヒト化抗体Trastuzumab A1の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号14、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号22で示されるポリヌクレオチドである。
なお、配列表の配列番号12、16に示される各ヌクレオチド配列の1～57番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該ヒト化抗体重鎖のシグナル配列をコードしており、58～417番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該ヒト化抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードしており、418～1407番目の塩基配列のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該抗体重鎖定常領域をコードしている。
また、配列表の配列番号20、24、28に示される各ヌクレオチド配列の1～60番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該ヒト化抗体軽鎖のシグナル配列をコードしており、61～381番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該ヒト化抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードしており、382～702番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該抗体軽鎖定常領域をコードしている。
ヒト化抗体HwtL05の重鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号12、軽鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号28、
ヒト化抗体Trastuzumab A1の重鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号12、軽鎖アミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号20で示されるポリヌクレオチドである。
上記ヒト化抗体H01L02の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号18、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号26、
ヒト化抗体HwtL05の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号14、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号30、
ヒト化抗体Trastuzumab A1の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号14、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号22で示されるポリヌクレオチドである。
なお、配列表の配列番号12、16に示される各ヌクレオチド配列の1～57番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該ヒト化抗体重鎖のシグナル配列をコードしており、58～417番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該ヒト化抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードしており、418～1407番目の塩基配列のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該抗体重鎖定常領域をコードしている。
また、配列表の配列番号20、24、28に示される各ヌクレオチド配列の1～60番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該ヒト化抗体軽鎖のシグナル配列をコードしており、61～381番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該ヒト化抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードしており、382～702番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は該抗体軽鎖定常領域をコードしている。
【0117】
上記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せを含むことからなる抗体、又は、上記重鎖及び軽鎖の組合せを含むことからなる抗体のアミノ酸配列との同一性又は相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、更に好ましくは97％以上、最も好ましくは99％以上である抗体もHER2への結合活性を有する限り、本発明の抗体に含まれる。
また、上記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せを含むことからなる抗体、又は、上記重鎖及び軽鎖の組合せを含むことからなる抗体のCDRと同一のアミノ酸配列からなるCDRを有し、かつ該抗体のCDRのアミノ酸配列を除いたアミノ酸配列の同一性又は相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、更に好ましくは97％以上、最も好ましくは99％以上である抗体もHER2への結合活性を有する限り、本発明の抗体に含まれる。
更に、重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列に1～数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上記の各抗体と同等の生物活性を有する抗体を選択することが可能である。また、本明細書中におけるアミノ酸の置換としては保存的アミノ酸置換が好ましい（WO2013154206等）。
保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である。かかるアミノ酸置換は元のアミノ酸配列を有する物質の特性を低下させない範囲で行うのが好ましい。
二種類のアミノ酸配列間の相同性は、Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaaffer, JinghuiZhang, ZhengZhang, Webb Miller, and David J.Lipman(1997),「Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Blast algorithmは、インターネットでアクセスすることによっても使用することができる（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）。
（3）ヒト抗体
本発明の抗体としては、さらに、HER2に結合する、ヒト抗体を挙げることができる。抗HER2ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を含む。抗HER2ヒト抗体は、公知の方法によって得ることができる
（Nature Genetics(1997)16,p.133-143、Nucl.Acids Res.(1998)26, p.3447-3448、Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects vol.10,p.69-73、Kluwer AcademicPublishers,1999、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722-727、Investigative Ophthalmology&Visual Science.(2002) 43(7), p.2301-2308、Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002), 1(2),p.189-203、Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431、Nature Biotechnology(2005),23,(9), p.1105-1116、WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12, p.433-455等)。
また、上記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せを含むことからなる抗体、又は、上記重鎖及び軽鎖の組合せを含むことからなる抗体のCDRと同一のアミノ酸配列からなるCDRを有し、かつ該抗体のCDRのアミノ酸配列を除いたアミノ酸配列の同一性又は相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、更に好ましくは97％以上、最も好ましくは99％以上である抗体もHER2への結合活性を有する限り、本発明の抗体に含まれる。
更に、重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列に1～数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を組み合わせることによっても、上記の各抗体と同等の生物活性を有する抗体を選択することが可能である。また、本明細書中におけるアミノ酸の置換としては保存的アミノ酸置換が好ましい（WO2013154206等）。
保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である。かかるアミノ酸置換は元のアミノ酸配列を有する物質の特性を低下させない範囲で行うのが好ましい。
二種類のアミノ酸配列間の相同性は、Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaaffer, JinghuiZhang, ZhengZhang, Webb Miller, and David J.Lipman(1997),「Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Blast algorithmは、インターネットでアクセスすることによっても使用することができる（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）。
（3）ヒト抗体
本発明の抗体としては、さらに、HER2に結合する、ヒト抗体を挙げることができる。抗HER2ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を含む。抗HER2ヒト抗体は、公知の方法によって得ることができる
（Nature Genetics(1997)16,p.133-143、Nucl.Acids Res.(1998)26, p.3447-3448、Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects vol.10,p.69-73、Kluwer AcademicPublishers,1999、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722-727、Investigative Ophthalmology&Visual Science.(2002) 43(7), p.2301-2308、Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002), 1(2),p.189-203、Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431、Nature Biotechnology(2005),23,(9), p.1105-1116、WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12, p.433-455等)。
【0118】
以上の方法によって得られたキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体等は、公知の方法等によって抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。
抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カロリメトリー（DSC）は、蛋白の相対的構造安定性のよい指標となる熱変性中点（Tm）を素早く、また正確に測定することができる装置である。DSCを用いてTm値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265-273）、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗体を選抜する必要がある。
抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カロリメトリー（DSC）は、蛋白の相対的構造安定性のよい指標となる熱変性中点（Tm）を素早く、また正確に測定することができる装置である。DSCを用いてTm値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265-273）、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗体を選抜する必要がある。
【0119】
本発明の抗体は、本発明の提供する抗HER2抗体と「同一の部位に結合する抗体」も含む。すなわち、本発明のTrastuzumab A1(HwtLwt)、Trastuzumab A2、H10L02抗体又はH02L05抗体が認識するHER2蛋白質上の部位に結合する抗体も本発明に含まれる。
【0120】
本発明の抗体には抗体の修飾体も含まれる。当該修飾体とは、本発明の抗体に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、N－結合又はO－結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、N－結合又はO－結合型糖鎖付加、N末又はC末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによってN末にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、本発明の抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティ標識体もかかる修飾体の意味に含まれる。このような本発明の抗体の修飾体は、抗体の安定性及び血中滞留性の改善、抗原性の低減、抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコース化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、WO1999/54342、WO2000/61739、WO2002/31140、WO2007/133855、WO2013/120066等が知られているが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体には当該糖鎖修飾を調節された抗体も含まれる。
かかる修飾には、抗体又はその機能性断片における任意の位置に、または所望の位置においても施されてもよく、1つ又は2つ以上の位置に同一又は2種以上の異なる修飾がなされていてもよい。
本発明において「抗体断片の修飾体」は「抗体の修飾体の断片」をもその意味に含むものである。
また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコース化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、WO1999/54342、WO2000/61739、WO2002/31140、WO2007/133855、WO2013/120066等が知られているが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体には当該糖鎖修飾を調節された抗体も含まれる。
かかる修飾には、抗体又はその機能性断片における任意の位置に、または所望の位置においても施されてもよく、1つ又は2つ以上の位置に同一又は2種以上の異なる修飾がなされていてもよい。
本発明において「抗体断片の修飾体」は「抗体の修飾体の断片」をもその意味に含むものである。
【0121】
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列等をコードする遺伝子、及び軽鎖配列等をコードする遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子等と軽鎖配列遺伝子等は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。
真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。特に動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるCOS細胞（Cell(1981)23,p.175-182、ATCC CRL-1650）、マウス線維芽細胞NIH3T3（ATCC No.CRL-1658）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO細胞、ATCC CCL-61）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220）、FreeStyle 293F細胞（Invitrogen社）を挙げることができる。
原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。
これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換によって導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することによって抗体が得られる。当該培養においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。よって、本発明の抗体には、上記形質転換された宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体又は当該抗体の機能性断片を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体の製造方法によって得られる抗体も含まれる。
真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。特に動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるCOS細胞（Cell(1981)23,p.175-182、ATCC CRL-1650）、マウス線維芽細胞NIH3T3（ATCC No.CRL-1658）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（CHO細胞、ATCC CCL-61）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220）、FreeStyle 293F細胞（Invitrogen社）を挙げることができる。
原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。
これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換によって導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することによって抗体が得られる。当該培養においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。よって、本発明の抗体には、上記形質転換された宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体又は当該抗体の機能性断片を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体の製造方法によって得られる抗体も含まれる。
【0122】
上記抗体遺伝子は、好ましくは、以下の（a）～（e）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。
（a）H1L02抗体、HwtL05抗体、Trastuzumab A1(HwtLwt)、Trastuzumab A2のいずれか一つの抗体の重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと軽鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの組み合わせ
（b）H1L02抗体、HwtL05抗体、Trastuzumab A1(HwtLwt)、Trastuzumab A2のいずれか一つの抗体のCDRH1～CDRH3を含む重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとCDRL1～CDRL3を含む軽鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの組み合わせ
（c）H1L02抗体、HwtL05抗体、Trastuzumab A1(HwtLwt)、Trastuzumab A2のいずれか一つの抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む軽鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの組み合わせ
（d）（a）～（c）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、HER2に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、及び、
（e）（a）～（c）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドにおいて1～50個、1～45個、1～40個、1～35個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～8個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1若しくは2個、または1個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなるポリペプチドのアミノ酸配列をコードし、且つ、HER2に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
本発明は、本発明の抗体もしくはその機能性断片又はその修飾体をコードするヌクレオチド、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子又は該ベクターが導入された細胞を含む。
また、本発明は、前記細胞を培養する工程、及び、その培養物から抗体もしくはその機能性断片又はその修飾体を回収する工程を含む、抗体もしくはその機能性断片又はその修飾体の製造方法も含む。
（a）H1L02抗体、HwtL05抗体、Trastuzumab A1(HwtLwt)、Trastuzumab A2のいずれか一つの抗体の重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと軽鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの組み合わせ
（b）H1L02抗体、HwtL05抗体、Trastuzumab A1(HwtLwt)、Trastuzumab A2のいずれか一つの抗体のCDRH1～CDRH3を含む重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとCDRL1～CDRL3を含む軽鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの組み合わせ
（c）H1L02抗体、HwtL05抗体、Trastuzumab A1(HwtLwt)、Trastuzumab A2のいずれか一つの抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む軽鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの組み合わせ
（d）（a）～（c）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、HER2に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、及び、
（e）（a）～（c）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドにおいて1～50個、1～45個、1～40個、1～35個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～8個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1若しくは2個、または1個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなるポリペプチドのアミノ酸配列をコードし、且つ、HER2に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
本発明は、本発明の抗体もしくはその機能性断片又はその修飾体をコードするヌクレオチド、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子又は該ベクターが導入された細胞を含む。
また、本発明は、前記細胞を培養する工程、及び、その培養物から抗体もしくはその機能性断片又はその修飾体を回収する工程を含む、抗体もしくはその機能性断片又はその修飾体の製造方法も含む。
【0123】
なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリシン残基が欠失することが知られており(Journal of Chromatography A,705:129-134(1995))、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リシンの2アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Analytical Biochemistry,360:75-83(2007)）。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用等）には影響を及ぼさない。従って、本発明に係る抗体には、当該修飾を受けた抗体及び当該抗体の機能性断片も含まれ、重鎖カルボキシル末端において1又は2つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）等も包含される。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体を構成する2本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であってもよいし、いずれか二種を組み合わせたものであってもよい。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては2本の重鎖の双方でカルボキシル末端の1つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
【0124】
本発明の抗HER2抗体のアイソタイプとしては、例えばIgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）等を挙げることができるが、好ましくはIgG1、IgG2又はIgG4を挙げることができる。
本発明の抗体のアイソタイプとしてIgG1を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、エフェクター機能を調整することが可能である。エフェクター機能を低減又は減弱させたIgG1の変異体としては、IgG1 LALA（IgG1-L234A、L235A）、IgG1 LAGA（IgG1-L235A、G237A）等が挙げられ、好ましくはIgG1 LALAである。なお、前記L234A，L235AはEU index(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., Vol.63, No.1(May 15,1969), p.78-85)により特定される234位、235位のロイシンのアラニンへの置換、G237AはEU indexにより特定される237位のグリシンのアラニンへの置換を示す。
本発明の抗体のアイソタイプとしてIgG1を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、エフェクター機能を調整することが可能である。エフェクター機能を低減又は減弱させたIgG1の変異体としては、IgG1 LALA（IgG1-L234A、L235A）、IgG1 LAGA（IgG1-L235A、G237A）等が挙げられ、好ましくはIgG1 LALAである。なお、前記L234A，L235AはEU index(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., Vol.63, No.1(May 15,1969), p.78-85)により特定される234位、235位のロイシンのアラニンへの置換、G237AはEU indexにより特定される237位のグリシンのアラニンへの置換を示す。
【0125】
抗体の生物活性としては、一般的には抗原結合活性、抗原と結合することによって該抗原を発現する細胞に内在化する活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性を挙げることができるが、本発明に係る抗体が有する機能は、HER2に対する結合活性であり、好ましくはHER2と結合することによってHER2発現細胞に内在化する活性である。
【0126】
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996);Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))が、これらに限定されるものではない。
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。
これらのクロマトグラフィーは、HPLCやFPLC等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムを挙げることができる。
また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。
これらのクロマトグラフィーは、HPLCやFPLC等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムを挙げることができる。
また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
【0127】
＜N297糖鎖＞
近年、不均一な抗体の糖タンパク質を、酵素反応等によってリモデリングし、官能基を有する糖鎖を均一に導入する方法が報告されている（ACS Chemical Biology 2012, 7, 110、ACS Medicinal Chemistry Letters 2016, 7, 1005、Bioconjugate Chemistry 2015, 26, 2233、Angew.Chem.Int.Ed. 2016,55,2361-2367、US2016361436）。
近年、不均一な抗体の糖タンパク質を、酵素反応等によってリモデリングし、官能基を有する糖鎖を均一に導入する方法が報告されている（ACS Chemical Biology 2012, 7, 110、ACS Medicinal Chemistry Letters 2016, 7, 1005、Bioconjugate Chemistry 2015, 26, 2233、Angew.Chem.Int.Ed. 2016,55,2361-2367、US2016361436）。
【0128】
本発明の糖鎖のリモデリングはまず加水分解酵素を利用して、蛋白質（抗体等）に付加されている不均一な糖鎖を末端のGlcNAcのみ残して切除し、GlcNAcが付加した均一な蛋白質部分を調製する（以下、「アクセプター」と言う）。次に、別途調製した任意の糖鎖を用意し（以下、「ドナー」と言う）、このアクセプターとドナーを糖転移酵素を用いて連結する。これにより、任意の糖鎖構造を持った均一な糖蛋白質を合成できる。
【0129】
本発明において、「糖鎖」とは、2つ以上の単糖がグリコシド結合により結合された構造単位を意味する。具体的な単糖や糖鎖を、例えば”GlcNAc－”、”MSG－”のように、略号として標記することがある。構造式中でこれらの略号で記載した場合、還元末端で別の構造単位とのグリコシド結合に帰属する酸素原子又は窒素原子は、特別な定義がある場合を除き、当該糖鎖を表す略号には含まれないものとして表示される。
【0130】
本発明において、糖鎖の基本単位となる単糖の記載は、別に定める場合を除き、便宜上、その環構造において、環を構成する酸素原子に結合し、且つ、水酸基（又はグリコシド結合に帰属する酸素原子）と直接結合した炭素原子を1位（シアル酸においてのみ2位）として表記する。実施例化合物の名称は、化学構造全体として付されたものであり、このルールは必ずしも適用されない。
【0131】
本発明において、糖鎖を記号（例えば、GLY、SG、MSG、GlcNAc等）として記載する場合、別に定義される場合を除き、還元末端の炭素までを、当該記号に含めるものとし、N－又はO－グリコシド結合に帰属するN又はOは、当該記号には含まれないものとする。
【0132】
本発明において、特別な記載がない限り、アミノ酸の側鎖において糖鎖と連結した場合の部分構造は、側鎖部分を括弧で表示し、例えば、「（SG－）Asn」のように表記するものとする。
【0133】
本発明の抗体―薬物コンジュゲートは、次式
【0134】
【化43】
【0135】
で示され、抗体Ab又はその機能性断片は、N297糖鎖又はリモデリングされたN297糖鎖からLに結合しており、好ましくは、AbのリモデリングされたN297糖鎖からLに結合している。
【0136】
本発明におけるAbの糖鎖は、N結合型糖鎖やO結合型糖鎖であり、好ましくは、N結合型糖鎖である。
N結合型糖鎖はNグリコシド結合、O結合型糖鎖はOグリコシド結合により、抗体のアミノ酸側鎖と結合している。
N結合型糖鎖はNグリコシド結合、O結合型糖鎖はOグリコシド結合により、抗体のアミノ酸側鎖と結合している。
【0137】
IgGはその重鎖のFc領域における297番目のアスパラギン残基（以下、「Asn297又はN297」という）によく保存されたN結合型糖鎖を有しており、抗体分子の活性や動態等に寄与することが知られている（Biotechnol.Prog.、2012,28, 608-622、 Anal.Chem.,2013,85,715-736）。
【0138】
IgGの定常領域におけるアミノ酸配列はよく保存されており、Edelman et al.,（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., Vol.63, No.1(May 15,1969),p.78-85）において、それぞれのアミノ酸がEu番号（Eu INDEX）で特定されている。例えば、Fc領域においてN結合型糖鎖が付加するAsn297は、Eu番号において297位に相当するものであり、分子の断片化や領域欠損によって実際のアミノ酸位置が変動した場合であってもEu番号で表示することによってアミノ酸が一義的に特定される。
【0139】
本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおいて、より好ましくは、抗体又はその機能性断片はそのAsn297の側鎖に結合する糖鎖（以下、「N297糖鎖」という）からLに結合しており、更に好ましくは、抗体又はその機能性断片は前記N297糖鎖からLに結合しており、当該N297糖鎖がリモデリングされたN297糖鎖である。
【0140】
SGPはSialyl GlycoPeptideの略であり、N結合型複合糖鎖の代表的なものである。鶏卵の卵黄から、SGPは、例えば、WO2011／0278681に記載の方法に従って単離、精製することができる。また、SGPの精製品が市販（東京化成（株）、（株）伏見製薬所）されており、購入することができる。SGの糖鎖部分において還元末端のGlcNAcが一つ欠損した糖鎖（以下、「SG（10）」）のみからなるジシアロオクタサッカリド（東京化成（株））などが市販されている。
【0141】
本発明において、SG（10）のβ－Manの分岐鎖のいずれか一方のみで非還元末端のシアル酸が欠失した糖鎖構造をMSG（9）といい、分岐鎖の1－3糖鎖のみにシアル酸を有するものをMSG1、分岐鎖の1－6糖鎖のみにシアル酸を有するものをMSG2、とそれぞれ表記するものとする。
【0142】
本発明のリモデリングされた糖鎖は、N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはN297-(Fuc)MSG1とN297-(Fuc)MSG2の混合物、又はN297-(Fuc)SGであり、好ましくは、N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2又はN297-(Fuc)SGであり、より好ましくはN297-(Fuc)MSG1又はN297-(Fuc)MSG2である。
【0143】
N297-(Fuc)MSG1は以下の構造式又は配列式で示される。
【0144】
【化44】
【0145】
【化45】
【0146】
上記式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
L（PEG）は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2) n5-*を示し、左端のアミノ基がN297糖鎖のβ－Manの分岐鎖の1－3鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、前記リンカーLにおけるLbの1,2,3－トリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示し、
ここで、n5は2～10の整数であり、好ましくは、2～5の整数である。
L（PEG）は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2) n5-*を示し、左端のアミノ基がN297糖鎖のβ－Manの分岐鎖の1－3鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、前記リンカーLにおけるLbの1,2,3－トリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示し、
ここで、n5は2～10の整数であり、好ましくは、2～5の整数である。
【0147】
N297-(Fuc)MSG2は以下の構造式又は配列式で示される。
【化46】
【0148】
【化47】
【0149】
上記式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
L（PEG）は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2) n5-*を示し、左端のアミノ基がN297糖鎖のβ－Manの分岐鎖の1－6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、前記リンカーLにおけるLbの1,2,3－トリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示し、
ここで、n5は2～10の整数であり、好ましくは、2～5の整数である。
L（PEG）は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2) n5-*を示し、左端のアミノ基がN297糖鎖のβ－Manの分岐鎖の1－6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、前記リンカーLにおけるLbの1,2,3－トリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示し、
ここで、n5は2～10の整数であり、好ましくは、2～5の整数である。
【0150】
N297-(Fuc)SGは以下の構造式又は配列式で示される。
【化48】
【0151】
【化49】
【0152】
上記式中、波線は抗体のAsn297に結合していることを示し、
L（PEG）は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2) n5-*を示し、左端のアミノ基がN297糖鎖のβ－Manの分岐鎖の1－3鎖側及び1－6鎖側の両方の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、前記リンカーLにおけるLbの1,2,3－トリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示し、
ここで、n5は2～10の整数であり、好ましくは、2～5の整数である。
L（PEG）は、-NH-CH2CH2-(O-CH2CH2) n5-*を示し、左端のアミノ基がN297糖鎖のβ－Manの分岐鎖の1－3鎖側及び1－6鎖側の両方の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、前記リンカーLにおけるLbの1,2,3－トリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示し、
ここで、n5は2～10の整数であり、好ましくは、2～5の整数である。
【0153】
本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体のN297糖鎖が、N297-(Fuc)MSG1もしくはN297-(Fuc)MSG2又はそれらの混合物である場合、抗体は二量体であるため、抗体―薬物コンジュゲートは2つの薬物リンカー(-L-D)が結合された分子（上記m1＝1）となる（図1参照）。
例えば、実施例9：ADC1はN297糖鎖がN297-(Fuc)MSG1の場合である。
例えば、実施例9：ADC1はN297糖鎖がN297-(Fuc)MSG1の場合である。
【0154】
本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体のN297糖鎖が、N297-(Fuc)SGである場合、抗体は二量体であるため、抗体－薬物コンジュゲートは4つの薬物リンカー(-L-D)が結合された分子（上記m1＝2）となる。
【0155】
N297糖鎖は、好ましくは、N297-(Fuc)MSG1もしくはN297-(Fuc)MSG2又はN297-(Fuc)SGであり、より好ましくは、N297-(Fuc)MSG1もしくはN297-(Fuc)MSG2であり、最も好ましくは、N297-(Fuc)MSG1である。
N297糖鎖がN297-(Fuc)MSG1もしくはN297-(Fuc)MSG2又はN297-(Fuc)SGである場合、均一な品質のADCを取得することができる。
N297糖鎖がN297-(Fuc)MSG1もしくはN297-(Fuc)MSG2又はN297-(Fuc)SGである場合、均一な品質のADCを取得することができる。
【0156】
本発明は、以下i）～iii）の工程を含む糖鎖リモデリング抗体又は該抗体の機能性断片の製造方法を提供する。
i)上述の宿主細胞（例えば、動物細胞（CHO細胞等））を培養し、得られた培養物から目的の抗体を採取する工程、
ii)工程i)で得られた抗体を加水分解酵素で処理し、N297糖鎖が(Fucα1,6)GlcNAcである抗体((Fucα1,6)GlcNAc－抗体)を製造する工程（図3A）、
好ましくは、更に当該反応液を、ハイドロキシアパタイトカラムによる精製を含む工程により(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を精製する工程、及び、
iii)MSG（9）又はSG（10）のシアル酸の2位のカルボン酸のカルボニル基にアジド基を有するPEGリンカー－(N3－L(PEG))を導入し、且つ、還元末端をオキサゾリン化した糖鎖ドナー分子と、糖転移酵素存在下で（Fucα1,6）GlcNAc－抗体を反応させ、シアル酸にアジド基が導入された糖鎖リモデリング抗体を合成する工程(図3B）。
また、かかる製造方法により得られた糖鎖リモデリング抗体もしくはその機能性断片、又はそれらの修飾体も本発明に含まれる。
i)上述の宿主細胞（例えば、動物細胞（CHO細胞等））を培養し、得られた培養物から目的の抗体を採取する工程、
ii)工程i)で得られた抗体を加水分解酵素で処理し、N297糖鎖が(Fucα1,6)GlcNAcである抗体((Fucα1,6)GlcNAc－抗体)を製造する工程（図3A）、
好ましくは、更に当該反応液を、ハイドロキシアパタイトカラムによる精製を含む工程により(Fucα1,6)GlcNAc－抗体を精製する工程、及び、
iii)MSG（9）又はSG（10）のシアル酸の2位のカルボン酸のカルボニル基にアジド基を有するPEGリンカー－(N3－L(PEG))を導入し、且つ、還元末端をオキサゾリン化した糖鎖ドナー分子と、糖転移酵素存在下で（Fucα1,6）GlcNAc－抗体を反応させ、シアル酸にアジド基が導入された糖鎖リモデリング抗体を合成する工程(図3B）。
また、かかる製造方法により得られた糖鎖リモデリング抗体もしくはその機能性断片、又はそれらの修飾体も本発明に含まれる。
【0157】
前記本抗体―薬物コンジュゲートの製造中間体はDBCO（Dibenzocyclooctyne）等のアジド基と反応するアルキン構造を有する（実施例2-3参照）。従って、当該製造中間体を前記i）～iii）の工程で得られる糖鎖のシアル酸にアジド基を有するPEGリンカーが導入されたMSG1型、MSG2型又はSG型糖鎖リモデリング抗体又は該抗体の機能性断片と反応させることで、本発明の抗体―薬物コンジュゲートを製造することができる。
【0158】
本発明のN297糖鎖において、還元末端のフコース付加したGlcNAc-（Fucα1，6）GlcNAc）は、動物細胞で産生された抗体に由来し、それより非還元末端側の糖鎖は、上述したMSG（MSG1、MSG2）又はSGと同様の糖鎖構造にリモデリングされたものが好ましい。いずれもその非還元末端のシアル酸2位に結合したカルボン酸を利用して、L（PEG）と結合している。
このようなMSG（MSG1、MSG2）又はSG型N297糖鎖を有する糖鎖リモデリング抗体は、例えばWO2013／120066などに記載の方法に準じて、図3に示すような方法で製造することができる。公知の方法に準じて宿主として動物細胞を用いて、遺伝子組み換え蛋白質として抗体を産生させた場合（上記工程i）、N297糖鎖は、基本構造としてフコース付加したN結合型糖鎖構造を有するが、非還元末端の構造や構成糖に多様な修飾がされた様々な構造からなる糖鎖を有する抗体またはその断片の混合物として得られる（図3AのIV）。このように動物細胞で産生された抗体は、EndoSなどの加水分解酵素で処理することによって、還元末端のキトビオース構造のGlcNAcβ1－4GlcNAcの間のグリコシド結合が加水分解され、N297糖鎖として（Fucα1,6）GlcNAcのみを有する単一の糖鎖構造を有する抗体分子(「（Fucα1,6）GlcNAc-抗体」という、図2のA参照)が得られる(図3A)(上記工程ii))。
このようなMSG（MSG1、MSG2）又はSG型N297糖鎖を有する糖鎖リモデリング抗体は、例えばWO2013／120066などに記載の方法に準じて、図3に示すような方法で製造することができる。公知の方法に準じて宿主として動物細胞を用いて、遺伝子組み換え蛋白質として抗体を産生させた場合（上記工程i）、N297糖鎖は、基本構造としてフコース付加したN結合型糖鎖構造を有するが、非還元末端の構造や構成糖に多様な修飾がされた様々な構造からなる糖鎖を有する抗体またはその断片の混合物として得られる（図3AのIV）。このように動物細胞で産生された抗体は、EndoSなどの加水分解酵素で処理することによって、還元末端のキトビオース構造のGlcNAcβ1－4GlcNAcの間のグリコシド結合が加水分解され、N297糖鎖として（Fucα1,6）GlcNAcのみを有する単一の糖鎖構造を有する抗体分子(「（Fucα1,6）GlcNAc-抗体」という、図2のA参照)が得られる(図3A)(上記工程ii))。
【0159】
N297糖鎖の加水分解反応に用いる酵素としては、Endo S又はその加水分解活性を保持した変異酵素などを用いることができる。
【0160】
上記の加水分解反応により得られた（Fucα1,6）GlcNAc－抗体を糖鎖アクセプター分子として、EndoS D233Q又はEndoS D233Q/Q303L変異体のような糖転移酵素（WO2017010559等）を用いてMSG（MSG1、MSG2）又はSG型糖鎖ドナー分子と反応させることによって、上述の構造からなるMSG（MSG1、MSG2）又はSG型N297糖鎖を有する抗体（図2のB参照）を得ることができる（図3B）（上記工程iii）-1、iii)-2）。
【0161】
抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体1分子あたりの薬物結合数m1が1の場合、糖鎖としてMSG（MSG1、MSG2）を有する糖鎖ドナー分子を採用する。このような糖鎖は、市販のmonosialo-Asn free(1S2G/1G2S-10NC-Asn、（株）糖鎖工学研究所、以下、「（MSG-）Asn」と言う）を原料に実施例3に記載の方法に準じて（MSG-）Asn1又は（MSG2-）Asnを分離して採用することもできるし、分離せずに混合物として採用することもできる。
【0162】
抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体1分子あたりの薬物結合数m1が2の場合、この糖転移反応には糖鎖としてSG（10）を有する糖鎖ドナー分子を用いる。このようなSG（10）糖鎖は、例えばSGPから加水分解等によって取得されたものを用いても良く、市販のジシアロオクタサッカリド（東京化成工業（株））のようなSG（10）糖鎖を用いてもよい。
【0163】
ドナー分子に含まれるMSG（MSG1、MSG2）又はSG型糖鎖はそのシアル酸の2位にアジド基を含むPEGリンカー（N3-L（PEG））を有する。
【0164】
ドナー分子に含まれるMSG（MSG1、MSG2）又はSG型糖鎖の還元末端のGlcNAcは、例えば2－クロロ－1，3－ジメチル－1H－ベンズイミダゾール－3－イウム－クロライド処理によるオキサゾリン化のような形で活性化されたものを用いることが好ましい(J.Org.Chem.,2009,74(5),2210-2212.)。
【0165】
糖転移反応に用いる酵素（糖転移酵素）としては、N297糖鎖に複合型糖鎖を転移させる活性を有するものであれば様々なものが採用できるが、好ましいものはEndoSの233番目のAspをGlnに置換することで加水分解反応を抑制した改変体であるEndoS D233Qである。EndoS D233Qを用いた糖転移反応については、WO2013/120066などに記載されている。また、EndoS D233Qに対して、さらに変異を加えたEndoS D233Q/Q303Lのような改変体酵素（WO2017010559）を利用してもよい。
【0166】
抗体の糖鎖リモデリング（糖加水分解、及び糖鎖転移反応）後の抗体の精製操作は、反応に使用した低分子化合物及び酵素との分離を目的とし、このような精製には、通常、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが使用されるが、更にハイドロキシアパタイトカラムによる追加精製を行ってもよい。すなわち、本発明は、抗体の糖加水分解後の反応液からの中間体の精製工程において、更にハイドロキシアパタイトカラムによる精製工程を含む、抗体－薬物コンジュゲートの製造方法を提供する。糖鎖リモデリング報告例(JACS. 2012, 134,12308-12318.、Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367)に従うと、抗体を加水分解酵素で処理した反応液をプロテインAカラム（アフィニティクロマトグラフィーカラム）で精製するのみであるが、この精製方法では、加水分解酵素（EndoS等）が完全には除去できず、残留酵素が影響して、次の糖転移反応に影響を与えることが判明した。ここで、精製法を検討した結果、抗体を加水分解酵素で処理した反応液をプロテインAカラム、ハイドロキシアパタイトカラム（CHTカラム、Bio-Rad Laboratories, Inc.）の順に精製することによって、残留酵素の影響なく、次の糖鎖転移反応の反応効率が向上した。
【0167】
本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、最も好ましくは、次の群から選ばれる1の抗体－薬物コンジュゲートである。
【0168】
【化50】
【0169】
【化51】
【0170】
【化52】
【0171】
【化53】
【0172】
【化54】
【0173】
【化55】
【0174】
【化56】
【0175】
【化57】
【0176】
上記で示されるそれぞれの構造式において、m1は1又は2の整数（好ましくは、m1は1の整数）であることを示し、
抗体Abは前記抗HER2抗体又はその機能性断片であり、
N297糖鎖は、N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物又は N297-(Fuc)SG（好ましくは、N297-(Fuc)MSG1）のいずれか一つであることを示し、
L（PEG）は、-NH-CH2CH2-（O-CH2CH2）3-＊であることを示し、左端のアミノ基がN297糖鎖のβ－Manの分岐鎖の1－3鎖側又は／及び1－6鎖側（好ましくは、1－3鎖側）の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、前記リンカーLにおけるLbのトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す。
便宜上、上記最も好ましい抗体－薬物コンジュゲートとして、コンジュゲート1分子中に「N297糖鎖がL中のLbのトリアゾール環上の1位の窒素原子と結合した『-(N297糖鎖)-L-D』（『(N297糖鎖)-(N1Lb)L-D』）を2又は4個（m1＝1又は2）有するか、「N297糖鎖がL中のLbのトリアゾール環上の3位の窒素原子と結合した『-(N297糖鎖)-L-D』（『(N297糖鎖)-(N3Lb)L-D』）」を2又は4個（m1＝1又は2）有する構造を記載しているが、コンジュゲート1分子中に『(N297糖鎖)-(N1Lb)L-D』(m1＝1の場合、1個、m1＝2の場合、1,2,3個)及び『(N297糖鎖)-(N3Lb)L-D』(m1＝1の場合、1個、m1＝2の場合、3,2,1個)の両方を有する抗体－薬物コンジュゲートも含む。すなわち、コンジュゲート1分子中に『(N297糖鎖)-(N1Lb)L-D』か『(N297糖鎖)-(N3Lb)L-D』のいずれか一方のみ、又は、その両方が混在している。
抗体Abは前記抗HER2抗体又はその機能性断片であり、
N297糖鎖は、N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物又は N297-(Fuc)SG（好ましくは、N297-(Fuc)MSG1）のいずれか一つであることを示し、
L（PEG）は、-NH-CH2CH2-（O-CH2CH2）3-＊であることを示し、左端のアミノ基がN297糖鎖のβ－Manの分岐鎖の1－3鎖側又は／及び1－6鎖側（好ましくは、1－3鎖側）の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合を介して結合しており、右端のアステリスク（＊）は、前記リンカーLにおけるLbのトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す。
便宜上、上記最も好ましい抗体－薬物コンジュゲートとして、コンジュゲート1分子中に「N297糖鎖がL中のLbのトリアゾール環上の1位の窒素原子と結合した『-(N297糖鎖)-L-D』（『(N297糖鎖)-(N1Lb)L-D』）を2又は4個（m1＝1又は2）有するか、「N297糖鎖がL中のLbのトリアゾール環上の3位の窒素原子と結合した『-(N297糖鎖)-L-D』（『(N297糖鎖)-(N3Lb)L-D』）」を2又は4個（m1＝1又は2）有する構造を記載しているが、コンジュゲート1分子中に『(N297糖鎖)-(N1Lb)L-D』(m1＝1の場合、1個、m1＝2の場合、1,2,3個)及び『(N297糖鎖)-(N3Lb)L-D』(m1＝1の場合、1個、m1＝2の場合、3,2,1個)の両方を有する抗体－薬物コンジュゲートも含む。すなわち、コンジュゲート1分子中に『(N297糖鎖)-(N1Lb)L-D』か『(N297糖鎖)-(N3Lb)L-D』のいずれか一方のみ、又は、その両方が混在している。
【0177】
本発明の抗HER2抗体もしくは抗HER2抗体－薬物コンジュゲートは、強い腫瘍活性（in vivo抗腫瘍活性、in vitro抗細胞活性）、良好な体内動態及び物性を示し、かつ安全性が高いため、医薬品として有用である。
【0178】
本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおいて、抗体1分子への薬物の結合数は、その有効性、安全性に影響する重要因子である。抗体－薬物コンジュゲートの製造は、薬物の結合数が一定の数となるよう、反応させる原料・試薬の使用量等の反応条件を規定して実施されるが、低分子化合物の化学反応とは異なり、異なる数の薬物が結合した混合物として得られるのが通常である。抗体1分子への薬物の結合数は平均値、すなわち、平均薬物結合数（DAR:Drug to Antibody Ratio）として特定することができる。抗体分子へのピロロベンゾジアゼピン誘導体の結合数はコントロール可能であり、1抗体あたりの平均薬物結合数(DAR)として、1から10の範囲のピロロベンゾジアゼピン誘導体を結合させることができるが、好ましくは1から8個であり、より好ましくは1から5個である。
本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおいて、抗体が、抗体のリモデリングされた糖鎖からLに結合している場合、抗体―薬物コンジュゲートにおける抗体1分子あたりの薬物結合数m2は1または2の整数である。当該糖鎖がN297糖鎖であり、糖鎖がN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2又はN297-(Fuc)MSG1とN297-(Fuc)MSG2の混合物の場合、m2は1であり、DARは1～3の範囲（好ましくは、1.0～2.5の範囲、より好ましくは、1.2～2.2もしくは1.6～2.2の範囲）である。N297糖鎖が、N297-(Fuc)SGの場合、m2は2であり、DARは3～5の範囲（好ましくは、3.2～4.8の範囲であり、より好ましくは、3.5～4.2の範囲）である。
なお、当業者であれば本願の実施例の記載から抗体に必要な数の薬物を結合させる反応を設計することができ、ピロロベンゾジアゼピン誘導体の結合数をコントロールした抗体を取得することができる。
本発明の抗体－薬物コンジュゲートにおいて、抗体が、抗体のリモデリングされた糖鎖からLに結合している場合、抗体―薬物コンジュゲートにおける抗体1分子あたりの薬物結合数m2は1または2の整数である。当該糖鎖がN297糖鎖であり、糖鎖がN297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2又はN297-(Fuc)MSG1とN297-(Fuc)MSG2の混合物の場合、m2は1であり、DARは1～3の範囲（好ましくは、1.0～2.5の範囲、より好ましくは、1.2～2.2もしくは1.6～2.2の範囲）である。N297糖鎖が、N297-(Fuc)SGの場合、m2は2であり、DARは3～5の範囲（好ましくは、3.2～4.8の範囲であり、より好ましくは、3.5～4.2の範囲）である。
なお、当業者であれば本願の実施例の記載から抗体に必要な数の薬物を結合させる反応を設計することができ、ピロロベンゾジアゼピン誘導体の結合数をコントロールした抗体を取得することができる。
【0179】
なお、本発明の抗体－薬物コンジュゲート、遊離薬物又は製造中間体は、大気中に放置したり、又は再結晶することにより、水分を吸収し、吸着水がついたり、水和物になる場合があり、そのような水を含む化合物及び塩も本発明に包含される。
【0180】
本発明の抗体－薬物コンジュゲート、遊離薬物又は製造中間体が、アミノ基等の塩基性基を有する場合、所望により医薬的に許容される塩とすることができる。そのような塩としては、例えば塩酸塩、ヨウ化水素酸塩等のハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩等の低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、p－トルエンスルホン酸塩等のアリ－ルスルホン酸塩；ギ酸、酢酸、りんご酸、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及びオルニチン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等のアミノ酸塩を挙げることができる。
【0181】
本発明の抗体－薬物コンジュゲート、遊離薬物又は製造中間体が、カルボキシ基等の酸性基を有する場合、一般的に塩基付加塩を形成することが可能である。医薬的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩等の無機塩；ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、N－メチルグルカミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N，N’－ジベンジルエチレンジアミン塩、ジエタノールアミン塩、N－ベンジル－N－（2－フェニルエトキシ）アミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩等の有機アミン塩、等を挙げることができる。
【0182】
本発明の抗体－薬物コンジュゲート、遊離薬物又は製造中間体は、空気中の水分を吸収すること等により水和物として存在することもある。本発明の溶媒和物としては、医薬的に許容し得るものであれば特に限定されないが、具体的には、水和物、エタノール和物、2－プロパノール和物等が好ましい。また、本発明の抗体－薬物コンジュゲート、遊離薬物又は製造中間体中に窒素原子が存在する場合にはN－オキシド体となっていてもよく、これら溶媒和物及びN－オキシド体も本発明の範囲に含まれる。
【0183】
また、本発明には、種々の放射性または非放射性同位体でラベルされた化合物も包含される。本発明の抗体－薬物コンジュゲート、遊離薬物又は製造中間体を構成する原子の1以上に、原子同位体の非天然割合も含有し得る。原子同位体としては、例えば、重水素（2H）、トリチウム（3H）、ヨウ素－125（125I）または炭素－14（14C）等を挙げることができる。また、本発明化合物は、例えば、トリチウム（3H）、ヨウ素－125（125I）または炭素－14（14C）のような放射性同位体で放射性標識され得る。放射性標識された化合物は、治療または予防剤、研究試薬、例えば、アッセイ試薬、及び診断剤、例えば、インビボ画像診断剤として有用である。本発明の抗体－薬物コンジュゲートの全ての同位体変異種は、放射性であると否とを問わず、本発明の範囲に包含される。
【0184】
【0185】
【化58】
【0186】
R－1工程 還元末端のキトビオース構造のGlcNAcβ1-4GlcNAcの間のグリコシド結合の加水分解
本工程は目的の抗体に対して、公知の酵素反応を用いて抗体のアミノ酸配列297番目のアスパラギンに結合するN結合型糖鎖（N297結合糖鎖）を切断し、糖鎖切断抗体を調製する工程である。
目的の抗体（20mg／ml）を緩衝溶液（50mMリン酸緩衝溶液等）中、0℃から40℃までにおいて、EndoS酵素等の加水分解酵素を用いて還元末端のキトビオース構造のGlcNAcβ1と4GlcNAcの間のグリコシド結合の加水分解反応を実施する。反応時間は10分から72時間、好ましくは1時間から6時間である。野生型EndoS酵素は抗体100mgに対して、0.1から10mg、好ましくは0.1から3mgを用いる。反応終了後、後述するアフィニティークロマトグラフィー精製及び／又はハイロドキシアパタイトカラム精製を実施することでGlcNAcβ1と4GlcNAcの間の糖鎖が加水分解された（Fucα1,6）GlcNAc-抗体を製造することができる。
本工程は目的の抗体に対して、公知の酵素反応を用いて抗体のアミノ酸配列297番目のアスパラギンに結合するN結合型糖鎖（N297結合糖鎖）を切断し、糖鎖切断抗体を調製する工程である。
目的の抗体（20mg／ml）を緩衝溶液（50mMリン酸緩衝溶液等）中、0℃から40℃までにおいて、EndoS酵素等の加水分解酵素を用いて還元末端のキトビオース構造のGlcNAcβ1と4GlcNAcの間のグリコシド結合の加水分解反応を実施する。反応時間は10分から72時間、好ましくは1時間から6時間である。野生型EndoS酵素は抗体100mgに対して、0.1から10mg、好ましくは0.1から3mgを用いる。反応終了後、後述するアフィニティークロマトグラフィー精製及び／又はハイロドキシアパタイトカラム精製を実施することでGlcNAcβ1と4GlcNAcの間の糖鎖が加水分解された（Fucα1,6）GlcNAc-抗体を製造することができる。
【0187】
R－2工程 糖鎖転移反応
本工程は上述の（Fucα1,6）GlcNAc-抗体に対し、酵素反応を用いてアジド基を含むPEGリンカーを有するMSG（MSG1、MSG2）又はSG型糖鎖オキサゾリン体（以下、「アジド糖鎖オキサゾリン体」）を結合させ、糖鎖リモデリング抗体を製造する工程である。
上記の糖鎖切断抗体を緩衝溶液（リン酸緩衝溶液等）中、0℃から40℃までにおいて、触媒量のEndoS（D233Q／Q303L）等の糖転移酵素存在下、アジド糖鎖オキサゾリン体と反応させることで、糖鎖転移反応を実施する。反応時間は10分から72時間、好ましくは1時間から6時間である。EndoS酵素（D233Q／Q303L）は抗体100mgに対して、1から10mg、好ましくは1から3mgを用い、アジド糖鎖オキサゾリン体は2から過剰当量、好ましくは2から20当量を使用する。
反応終了後、アフィニティークロマトグラフィー精製とハイロドキシアパタイトカラム精製を実施することで精製した糖鎖リモデリング抗体を得ることができる。
アジド糖鎖オキサゾリン体は実施例3～5に記載の方法に従い調製できる。MSG（MSG(9)、MSG1、MSG2）又はジシアロオクタサッカリド（SG(10)、東京化成工業（株））に有機合成科学分野で公知の反応（縮合反応等）を利用して、アジド基を含むPEGリンカー（N3-L(PEG)）であるN3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2を導入することができる。すなわち、シアル酸2位へのカルボン酸とN3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2の右末端のアミノ基が公知の縮合反応によりアミド結合を形成する。
なお、MSG、MSG1又はMSG2は、前記（MSG－）Asn又は分離精製した（MSG1－）Asnもしくは（MSG2－）AsnをEndoM等の加水分解酵素で加水分解することにより得ることができる。
本工程は上述の（Fucα1,6）GlcNAc-抗体に対し、酵素反応を用いてアジド基を含むPEGリンカーを有するMSG（MSG1、MSG2）又はSG型糖鎖オキサゾリン体（以下、「アジド糖鎖オキサゾリン体」）を結合させ、糖鎖リモデリング抗体を製造する工程である。
上記の糖鎖切断抗体を緩衝溶液（リン酸緩衝溶液等）中、0℃から40℃までにおいて、触媒量のEndoS（D233Q／Q303L）等の糖転移酵素存在下、アジド糖鎖オキサゾリン体と反応させることで、糖鎖転移反応を実施する。反応時間は10分から72時間、好ましくは1時間から6時間である。EndoS酵素（D233Q／Q303L）は抗体100mgに対して、1から10mg、好ましくは1から3mgを用い、アジド糖鎖オキサゾリン体は2から過剰当量、好ましくは2から20当量を使用する。
反応終了後、アフィニティークロマトグラフィー精製とハイロドキシアパタイトカラム精製を実施することで精製した糖鎖リモデリング抗体を得ることができる。
アジド糖鎖オキサゾリン体は実施例3～5に記載の方法に従い調製できる。MSG（MSG(9)、MSG1、MSG2）又はジシアロオクタサッカリド（SG(10)、東京化成工業（株））に有機合成科学分野で公知の反応（縮合反応等）を利用して、アジド基を含むPEGリンカー（N3-L(PEG)）であるN3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2を導入することができる。すなわち、シアル酸2位へのカルボン酸とN3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2の右末端のアミノ基が公知の縮合反応によりアミド結合を形成する。
なお、MSG、MSG1又はMSG2は、前記（MSG－）Asn又は分離精製した（MSG1－）Asnもしくは（MSG2－）AsnをEndoM等の加水分解酵素で加水分解することにより得ることができる。
【0188】
上記の糖鎖リモデリング抗体の調製において、抗体水溶液の濃縮、濃度測定、バッファー交換は以下の共通操作A乃至Cに従って行うことができる。
（共通操作A：抗体水溶液の濃縮）
Amicon Ultra(30,000乃至50,000, MWCO,Millipore Co.）の容器内に抗体又は抗体－薬物コンジュゲート溶液を入れ、遠心機（Allegra X-15R,Beckman Coulter,Inc.）を用いた遠心操作（2000G乃至4000Gで5乃至20分間遠心）にて、抗体および後述する抗体－薬物コンジュゲート溶液を濃縮した。
（共通操作B：抗体の濃度測定）
UV測定器（Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて、メーカー規定の方法に従い、抗体濃度の測定を行った。その際に、抗体ごとに異なる280nm吸光係数（1.3mLmg-1cm-1乃至1.8mLmg-1cm-1）を用いた。
（共通操作C：抗体のバッファー交換）
抗体水溶液は緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）、リン酸緩衝液（pH6.0）等）を加え共通操作Aを用いて濃縮した。この操作を数回行った後、共通操作Bを用いて抗体濃度の測定を行い、緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）、リン酸緩衝液（pH6.0）等）を用いて10mg/mLに抗体濃度を調整した。
（共通操作A：抗体水溶液の濃縮）
Amicon Ultra(30,000乃至50,000, MWCO,Millipore Co.）の容器内に抗体又は抗体－薬物コンジュゲート溶液を入れ、遠心機（Allegra X-15R,Beckman Coulter,Inc.）を用いた遠心操作（2000G乃至4000Gで5乃至20分間遠心）にて、抗体および後述する抗体－薬物コンジュゲート溶液を濃縮した。
（共通操作B：抗体の濃度測定）
UV測定器（Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて、メーカー規定の方法に従い、抗体濃度の測定を行った。その際に、抗体ごとに異なる280nm吸光係数（1.3mLmg-1cm-1乃至1.8mLmg-1cm-1）を用いた。
（共通操作C：抗体のバッファー交換）
抗体水溶液は緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）、リン酸緩衝液（pH6.0）等）を加え共通操作Aを用いて濃縮した。この操作を数回行った後、共通操作Bを用いて抗体濃度の測定を行い、緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）、リン酸緩衝液（pH6.0）等）を用いて10mg/mLに抗体濃度を調整した。
【0189】
S法：コンジュゲーション
本製造法は、上述の糖鎖リモデリング抗体と製造中間体(2)をSPAAC反応(strain-promoted alkyne azide cycloaddition: JACS. 2004, 126,15046-15047)により結合させ、抗体－薬物コンジュゲートを製造する方法である。
本製造法は、上述の糖鎖リモデリング抗体と製造中間体(2)をSPAAC反応(strain-promoted alkyne azide cycloaddition: JACS. 2004, 126,15046-15047)により結合させ、抗体－薬物コンジュゲートを製造する方法である。
【0190】
【化59】
【0191】
式中Abは糖鎖リモデリング抗体を示し、
La’、Lp’、B’は、La、Lp、Bと同義であり、
Ｊは、以下で示されるいずれかの構造式を示し、
式中、アステリスク（＊）はLa’と結合していることを示す。
La’、Lp’、B’は、La、Lp、Bと同義であり、
Ｊは、以下で示されるいずれかの構造式を示し、
式中、アステリスク（＊）はLa’と結合していることを示す。
【0192】
【化60】
【0193】
J-La’-Lp’-NH-B’-CH2-O(C=O)-PBDは実施例2-1～2-6に記載の方法等により合成することができる。
【0194】
抗体Abの緩衝溶液（酢酸ナトリウム溶液、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム溶液等またはそれらの混合物）と、化合物（2）を適当な溶媒（ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルアセトアミド（DMA）、N－メチル－2－ピリドン（NMP）、プロピレングリコール（PG）等またはそれらの混合物）に溶解させた溶液を混合することで、SPAAC反応は進行する。
抗体1モルに対し、化合物（2）は2モルから過剰モル、好ましくは1モルから30モルであり、有機溶媒の比率は、抗体の緩衝液に対し1乃至200％v／vが好ましい。反応温度は0℃乃至37℃、好ましくは10℃から25℃であり、反応時間は1から150時間、好ましくは6時間から100時間である。反応時のpHは5乃至9が好ましい。
抗体1モルに対し、化合物（2）は2モルから過剰モル、好ましくは1モルから30モルであり、有機溶媒の比率は、抗体の緩衝液に対し1乃至200％v／vが好ましい。反応温度は0℃乃至37℃、好ましくは10℃から25℃であり、反応時間は1から150時間、好ましくは6時間から100時間である。反応時のpHは5乃至9が好ましい。
【0195】
抗体－薬物コンジュゲートは、前述の共通操作A乃至Cおよび後述の共通操作D乃至Fによってバッファー交換、精製、抗体濃度、及び抗体一分子あたりの平均薬物結合数の測定を行い、抗体－薬物コンジュゲートの同定を行うことができる。
【0196】
(共通操作D：抗体－薬物コンジュゲートの精製)
市販のSorbitol（5％）を含む酢酸緩衝液（10mM，pH5.5；本明細書でABSと称する）でNAP－25カラムを平衡化させた。このNAP－25カラムに、抗体－薬物コンジュゲート反応水溶液（約1.5～2.5mL）をのせ、メーカー規定の量の緩衝液で溶出させることで、抗体画分を分取した。この分取画分を再びNAP－25カラムにのせ、緩衝液で溶出させるゲルろ過精製操作を計2乃至3回繰り返すことで、未結合の薬物リンカーやジメチルスルホキシド、プロピレングリコールを除いた抗体－薬物コンジュゲートを得た。必要に応じて、共通操作AおよびCにより抗体－薬物コンジュゲート溶液の濃度を調製した。
（共通操作E：抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体濃度の測定）
抗体－薬物コンジュゲートにおける結合薬物濃度は、下記に示すランベルト・ベールの法則を用いて、算出することができる。
以下にランベルト・ベールの法則を用いた式（I）を示す。
市販のSorbitol（5％）を含む酢酸緩衝液（10mM，pH5.5；本明細書でABSと称する）でNAP－25カラムを平衡化させた。このNAP－25カラムに、抗体－薬物コンジュゲート反応水溶液（約1.5～2.5mL）をのせ、メーカー規定の量の緩衝液で溶出させることで、抗体画分を分取した。この分取画分を再びNAP－25カラムにのせ、緩衝液で溶出させるゲルろ過精製操作を計2乃至3回繰り返すことで、未結合の薬物リンカーやジメチルスルホキシド、プロピレングリコールを除いた抗体－薬物コンジュゲートを得た。必要に応じて、共通操作AおよびCにより抗体－薬物コンジュゲート溶液の濃度を調製した。
（共通操作E：抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体濃度の測定）
抗体－薬物コンジュゲートにおける結合薬物濃度は、下記に示すランベルト・ベールの法則を用いて、算出することができる。
以下にランベルト・ベールの法則を用いた式（I）を示す。
【0197】
【数1】
【0198】
ここで、A280は抗体－薬物コンジュゲート水溶液の280nmにおける吸光度を示し、ε280、は抗体－薬物コンジュゲートの280nmにおけるモル吸光係数を示し、C（mol・L－1）は抗体－薬物コンジュゲートのモル濃度を示す。
上記式（I）より抗体－薬物コンジュゲートのモル濃度C（mol・L－1）は以下の式（II）で求められる。
上記式（I）より抗体－薬物コンジュゲートのモル濃度C（mol・L－1）は以下の式（II）で求められる。
【0199】
【数2】
【0200】
さらに両辺に抗体-薬物コンジュゲートのモル質量MW（g・mol－1）を掛けることで、抗体－薬物コンジュゲートの重量濃度C’（mg・mL－1）を求めることができる（式（III））。
【0201】
【数3】
【0202】
以下に、上記式に用いて本実施例に適用した各値について記載する。
吸光度A280は、抗体－薬物コンジュゲート水溶液の280nmにおけるUV吸光度の実測値を用いた。モル質量MW（g・mol－1）は抗体のアミノ酸配列からより求められる抗体分子量の計算推定値を抗体-薬物コンジュゲートのモル質量の近似値として用いている。光路長l（cm）は1cmで測定した。
抗体薬物コンジュゲートのモル吸光係数ε280は、以下の式（IV）によって求めることができる。
吸光度A280は、抗体－薬物コンジュゲート水溶液の280nmにおけるUV吸光度の実測値を用いた。モル質量MW（g・mol－1）は抗体のアミノ酸配列からより求められる抗体分子量の計算推定値を抗体-薬物コンジュゲートのモル質量の近似値として用いている。光路長l（cm）は1cmで測定した。
抗体薬物コンジュゲートのモル吸光係数ε280は、以下の式（IV）によって求めることができる。
【0203】
【数4】
【0204】
ここで、εAb，280は280nmにおける抗体のモル吸光係数を示し、εDL，280は280nmにおける薬物のモル吸光係数を示す。
εAb，280は抗体のアミノ酸配列から、既知の計算方法（Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423）によって推定することができる。実施例において、Trastuzumab A1抗体εAb，280＝215057（計算推定値）を用いた。Trastuzumab A2のモル吸光係数は、εAb，280＝215380（計算推定値）を用いた。H01L02抗体のモル吸光係数は、εAb，280＝210014（計算推定値）、HwtL05抗体のモル吸光係数は、εAb，280＝212834（計算推定値）LPS抗体のモル吸光係数は、εAb，280＝230300（計算推定値）を用いた。
εDL，280は、都度UV測定で得た実測値より算出したものを使用した。すなわち、コンジュゲート前駆体（薬物）をあるモル濃度に溶解させた溶液の吸光度を測定し、ランベルト・ベールの法則、式（I）を適用することで得られる値を使用した。
εAb，280は抗体のアミノ酸配列から、既知の計算方法（Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423）によって推定することができる。実施例において、Trastuzumab A1抗体εAb，280＝215057（計算推定値）を用いた。Trastuzumab A2のモル吸光係数は、εAb，280＝215380（計算推定値）を用いた。H01L02抗体のモル吸光係数は、εAb，280＝210014（計算推定値）、HwtL05抗体のモル吸光係数は、εAb，280＝212834（計算推定値）LPS抗体のモル吸光係数は、εAb，280＝230300（計算推定値）を用いた。
εDL，280は、都度UV測定で得た実測値より算出したものを使用した。すなわち、コンジュゲート前駆体（薬物）をあるモル濃度に溶解させた溶液の吸光度を測定し、ランベルト・ベールの法則、式（I）を適用することで得られる値を使用した。
【0205】
（共通操作F：抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの平均薬物結合数の測定）
抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの平均薬物結合数は、以下の方法を用いる高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析によって求めることができる。
［F－1．HPLC分析用サンプルの調製（抗体－薬物コンジュゲートの還元）］
抗体－薬物コンジュゲート溶液（約1mg／mL、60μL）をジチオトレイトール（DTT）水溶液（100mM、15μL）と混合する。混合物を37℃で30分インキュベートすることで、抗体－薬物コンジュゲートのL鎖及びH鎖間のジスルフィド結合を切断したサンプルを、HPLC分析に用いる。
［F－2．HPLC分析］
HPLC分析を、下記の測定条件にて行う。
HPLCシステム：Agilent 1290 HPLCシステム（Agilent Technologies）
検出器：紫外吸光度計（測定波長：280nm、329nm）
カラム：BEH Phenyl（2.1×50mm、1.7μm、Waters Acquity）
カラム温度：75℃
移動相A：0．1％トリフルオロ酢酸（TFA），15％イソプロピルアルコール水溶液
移動相B：0．075％TFA、15％イソプロピルアルコールアセトニトリル溶液
グラジエントプログラム：14％－36％（0分－15分）、36％－80％（15－17分）、80％－14％（17分―17.1分）、14％－14％（17.1分―23分）
サンプル注入量：5μL
抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの平均薬物結合数は、以下の方法を用いる高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析によって求めることができる。
［F－1．HPLC分析用サンプルの調製（抗体－薬物コンジュゲートの還元）］
抗体－薬物コンジュゲート溶液（約1mg／mL、60μL）をジチオトレイトール（DTT）水溶液（100mM、15μL）と混合する。混合物を37℃で30分インキュベートすることで、抗体－薬物コンジュゲートのL鎖及びH鎖間のジスルフィド結合を切断したサンプルを、HPLC分析に用いる。
［F－2．HPLC分析］
HPLC分析を、下記の測定条件にて行う。
HPLCシステム：Agilent 1290 HPLCシステム（Agilent Technologies）
検出器：紫外吸光度計（測定波長：280nm、329nm）
カラム：BEH Phenyl（2.1×50mm、1.7μm、Waters Acquity）
カラム温度：75℃
移動相A：0．1％トリフルオロ酢酸（TFA），15％イソプロピルアルコール水溶液
移動相B：0．075％TFA、15％イソプロピルアルコールアセトニトリル溶液
グラジエントプログラム：14％－36％（0分－15分）、36％－80％（15－17分）、80％－14％（17分―17.1分）、14％－14％（17.1分―23分）
サンプル注入量：5μL
【0206】
［F－3．データ解析］
〔F－3－1〕薬物の結合していない抗体のH鎖（H0）に対して、薬物の結合したH鎖（薬物が一つ結合したH鎖：H1、薬物が二つ結合したH鎖：H2）は、結合した薬物の数に比例して疎水性が増して保持時間が大きくなることから、L0、H0、H1、H2、の順に溶出される。L0及びH0との保持時間比較により検出ピークをL0、H0、H1、H2のいずれかに割り当てることができる。また薬物の結合は、薬物の特長的な329nmの波長吸収でも確認できる。
〔F－3－2〕薬物リンカーにUV吸収があるため、薬物リンカーの結合数に応じて、L鎖、H鎖及び薬物リンカーのモル吸光係数を用いて下式に従ってピーク面積値の補正を行う。
〔F－3－1〕薬物の結合していない抗体のH鎖（H0）に対して、薬物の結合したH鎖（薬物が一つ結合したH鎖：H1、薬物が二つ結合したH鎖：H2）は、結合した薬物の数に比例して疎水性が増して保持時間が大きくなることから、L0、H0、H1、H2、の順に溶出される。L0及びH0との保持時間比較により検出ピークをL0、H0、H1、H2のいずれかに割り当てることができる。また薬物の結合は、薬物の特長的な329nmの波長吸収でも確認できる。
〔F－3－2〕薬物リンカーにUV吸収があるため、薬物リンカーの結合数に応じて、L鎖、H鎖及び薬物リンカーのモル吸光係数を用いて下式に従ってピーク面積値の補正を行う。
【0207】
【数5】
【0208】
ここで、各抗体におけるL鎖及びH鎖のモル吸光係数（280nm）は、既知の計算方法（Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423）によって、各抗体のL鎖及びH鎖のアミノ酸配列から推定される値を用いることができる。Trastuzumab A1の場合、そのアミノ酸配列に従ってH鎖のモル吸光係数として81488を推定値として用いた。Trastuzumab A2の場合、そのアミノ酸配列に従ってH鎖のモル吸光係数として81478を推定値として用いた。同様に、H01L02抗体の場合H鎖のモル吸光係数として79989を、HwtL05抗体の場合Ｈ鎖のモル吸光係数として81488を、LPS抗体の場合、H鎖のモル吸光係数として77470を、薬物リンカーのモル吸光係数（280nm）は、コンジュゲート前駆体である薬物リンカー1（実施例2-3）の実測のモル吸光係数（280nm）を用いた。
〔F－3－3〕 ピーク面積補正値合計に対する各鎖ピーク面積比（％）を下式に従って計算する。
〔F－3－3〕 ピーク面積補正値合計に対する各鎖ピーク面積比（％）を下式に従って計算する。
【0209】
【数6】
【0210】
〔F－3－4〕 抗体－薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの平均薬物結合数を、下式に従って計算する。
【0211】
【数7】
【0212】
＜医薬＞
本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、癌細胞に対して細胞傷害活性を示すことから、医薬として、特に癌に対する治療剤及び／又は予防剤として使用することができる。
本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、癌細胞に対して細胞傷害活性を示すことから、医薬として、特に癌に対する治療剤及び／又は予防剤として使用することができる。
【0213】
本発明の抗体－薬物コンジュゲートが適用される癌の種類としては、肺癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、乳癌、膀胱癌、胃癌、胃腸間質腫瘍、子宮頸癌、食道癌、扁平上皮癌、腹膜癌、肝臓癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、又は陰茎癌ならびにそれらの転移性形態等を挙げることができるが、治療対象となる癌細胞において抗体－薬物コンジュゲート中の抗体が認識できる蛋白質を発現している癌細胞であればこれらには限定されることはない。
【0214】
本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、哺乳動物に対して好適に投与することができるが、より好ましくはヒトである。
【0215】
本発明の抗体－薬物コンジュゲートが含まれる医薬組成物において使用される物質としては、投与量や投与濃度において、この分野において通常使用される製剤添加物その他から適宜選択して適用することができる。
【0216】
本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、1種以上の薬学的に適合性の成分を含む薬学的組成物として投与され得る。例えば、上記薬学的組成物は、代表的には、1種以上の薬学的キャリア（例えば、滅菌した液体（例えば、水および油（石油、動物、植物、または合成起源の油（例えば、ラッカセイ油、大豆油、鉱油、ごま油など）を含む））を含む。水は、上記薬学的組成物が静脈内投与される場合に、より代表的なキャリアである。食塩水溶液、ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液もまた、液体キャリアとして、特に、注射用溶液のために使用され得る。適切な薬学的賦形剤は、当該分野で公知である。上記組成物はまた、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝化剤を含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、E.W.Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載される。その処方は、投与の態様に対応する。
【0217】
種々の送達システムが公知であり、本発明の抗体－薬物コンジュゲートを投与するために使用され得る。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下の経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、例えば、注入またはボーラス注射によるものであり得る。特定の好ましい実施形態において、上記リガンド薬物結合体の投与は、注入によるものである。非経口的投与は、好ましい投与経路である。
【0218】
代表的実施形態において、上記薬学的組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した薬学的組成物として、常習的手順に従って処方される。代表的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌の等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要である場合、上記医薬はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるための局所麻酔剤（例えば、リグノカイン）を含み得る。一般に、上記成分は、（例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封してシールされた容器中の乾燥凍結乾燥粉末または無水の濃縮物として、別個に、または単位剤形中で一緒に混合して、のいずれかで供給される。上記医薬が注入によって投与される予定である場合、それは、例えば、滅菌の製薬グレードの水または食塩水を含む注入ボトルで投薬され得る。上記医薬が注射によって投与される場合、注射用滅菌水または食塩水のアンプルは、例えば、上記成分が投与前に混合され得るように、提供され得る。
【0219】
本発明の医薬組成物には本発明の抗体－薬物コンジュゲートのみを含む医薬組成物であってもよいし、抗体－薬物コンジュゲート及び少なくとも一つのこれ以外の癌治療剤を含む医薬組成物であってもよい。本発明の抗体－薬物コンジュゲートは、他の癌治療剤と共に投与することもでき、これによって抗癌効果を増強させることができる。このような目的で使用される他の抗癌剤は、抗体－薬物コンジュゲートと同時に、別々に、あるいは連続して個体に投与されてもよいし、それぞれの投与間隔を変えて投与してもよい。このような癌治療剤として、abraxane、carboplatin、cisplatin、gemcitabine、irinotecan(CPT-11)、paclitaxel、pemetrexed、sorafenib、vinblastin又はWO2003／038043号パンフレットに記載の薬剤、更にLH－RHアナログ（リュープロレリン、ゴセレリン等）、エストラムスチン・フォスフェイト、エストロジェン拮抗薬（タモキシフェン、ラロキシフェン等）、アロマターゼ阻害剤（アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン等）等を挙げることができるが、抗腫瘍活性を有する薬剤であれば限定されることはない。
【0220】
このような医薬組成物は、選択された組成と必要な純度を持つ製剤として、凍結乾燥製剤あるいは液状製剤として製剤化すればよい。凍結乾燥製剤として製剤化する際には、この分野において使用される適当な製剤添加物が含まれる製剤であってもよい。また液剤においても同様にして、この分野において使用される各種の製剤添加物を含む液状製剤として製剤化することができる。
【0221】
医薬組成物の組成及び濃度は投与方法によっても変化するが、本発明の医薬組成物に含まれる抗体－薬物コンジュゲートは、抗体－薬物コンジュゲートの抗原に対する親和性、すなわち、抗原に対する解離定数（Kd値）の点において、親和性が高い（Kd値が低い）ほど、少量の投与量であっても薬効を発揮させことができる。したがって、抗体－薬物コンジュゲートの投与量の決定に当たっては、抗体－薬物コンジュゲートと抗原との親和性の状況に基づいて投与量を設定することもできる。本発明の抗体－薬物コンジュゲートをヒトに対して投与する際には、例えば、約0.001～100mg／kgを1回あるいは1～180日間に1回の間隔で複数回投与すればよい。
【0222】
また、本発明の抗体又は該抗体の機能性断片もまた、医薬として使用することができる。この場合、上述の＜医薬＞に関する「抗体－薬物コンジュゲート」に関する記載を、適宜「抗体又は該抗体の機能性断片」に関する記載であると読み替えることができる。
【0223】
さらに、本発明の遊離薬物（新規PBD誘導体化合物）、その塩、又はそれらの水和物もまた、医薬として使用することができる。この場合、上述の＜医薬＞に関する「抗体－薬物コンジュゲート」に関する記載を、適宜「遊離薬物（新規PBD誘導体化合物）、その塩、又はそれらの水和物」に関する記載であると読み替えることができる。
【実施例】
【0224】
実施例１：Trastuzumab A2抗体及びTrastuzumab改変体
Trastuzumab A2抗体の作製
本明細書において、「Trastuzumab」はHERCEPTIN（登録商標）、huMAb4D5-8、rhuMAb4D5-8と呼ばれることもあり、配列番号33のアミノ酸番号1～450に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号34のアミノ酸番号1～214に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化ＩｇＧ１抗体である（US5821337）。
本明細書で使用したTrastuzumab A2抗体は、Trastuzumabの重鎖アミノ酸配列の237番目及び238番目のロイシン(L)をアラニン(A)に変異させた、Trastuzumabの定常領域改変IgG1抗体である。Trastuzumab の重鎖アミノ酸配列は配列番号33、軽鎖アミノ酸配列は配列番号34に記載されている。Trastuzumab A2抗体の重鎖アミノ酸配列は配列番号31、軽鎖アミノ酸配列は配列番号32に記載されている。
Trastuzumab A2抗体の作製
本明細書において、「Trastuzumab」はHERCEPTIN（登録商標）、huMAb4D5-8、rhuMAb4D5-8と呼ばれることもあり、配列番号33のアミノ酸番号1～450に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号34のアミノ酸番号1～214に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化ＩｇＧ１抗体である（US5821337）。
本明細書で使用したTrastuzumab A2抗体は、Trastuzumabの重鎖アミノ酸配列の237番目及び238番目のロイシン(L)をアラニン(A)に変異させた、Trastuzumabの定常領域改変IgG1抗体である。Trastuzumab の重鎖アミノ酸配列は配列番号33、軽鎖アミノ酸配列は配列番号34に記載されている。Trastuzumab A2抗体の重鎖アミノ酸配列は配列番号31、軽鎖アミノ酸配列は配列番号32に記載されている。
【0225】
Trastuzumab改変体（Trastuzumab A1（HwtLwt）、H01L02抗体及びHwtL05抗体）の設計
1－1：Trastuzumab改変体の設計
1－1－1：Trastuzumab A1の重鎖の設計
Trastuzumabの重鎖可変領域を有し、IgG1のアイソタイプであり、かつ、EU indexにより特定される234位、235位のロイシンをアラニンへ置換した重鎖を設計した（本明細書中、「Trastuzumab A1の重鎖」または「Hwt」と称する）。配列番号11のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号12に記載する。
1－1：Trastuzumab改変体の設計
1－1－1：Trastuzumab A1の重鎖の設計
Trastuzumabの重鎖可変領域を有し、IgG1のアイソタイプであり、かつ、EU indexにより特定される234位、235位のロイシンをアラニンへ置換した重鎖を設計した（本明細書中、「Trastuzumab A1の重鎖」または「Hwt」と称する）。配列番号11のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号12に記載する。
【0226】
1－1－2：Trastuzumabの可変領域改変体の調製
Hwtアミノ酸配列において、EU indexにより特定される105番目のチロシンをフェニルアラニンに置換した重鎖をH01と命名した。H01のアミノ酸配列を配列番号15に記載する。配列番号15のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号16に記載する。
Trastuzumabの軽鎖アミノ酸配列において、EU indexにより特定される92番目のチロシンをアラニンに置換した軽鎖をL02と命名した。L02のアミノ酸配列を配列番号23に記載する。配列番号23のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号24に記載する。
Trastuzumabの軽鎖アミノ酸配列において、EU indexにより特定される46番目のロイシンと92番目のチロシンをアラニンに置換した軽鎖をL05と命名した。L05のアミノ酸配列を配列番号27に記載する。配列番号27のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号28に記載する。
Hwtアミノ酸配列において、EU indexにより特定される105番目のチロシンをフェニルアラニンに置換した重鎖をH01と命名した。H01のアミノ酸配列を配列番号15に記載する。配列番号15のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号16に記載する。
Trastuzumabの軽鎖アミノ酸配列において、EU indexにより特定される92番目のチロシンをアラニンに置換した軽鎖をL02と命名した。L02のアミノ酸配列を配列番号23に記載する。配列番号23のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号24に記載する。
Trastuzumabの軽鎖アミノ酸配列において、EU indexにより特定される46番目のロイシンと92番目のチロシンをアラニンに置換した軽鎖をL05と命名した。L05のアミノ酸配列を配列番号27に記載する。配列番号27のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号28に記載する。
【0227】
1－1－3：重鎖及び軽鎖の組み合わせによるTrastuzumab改変体の設計
Hwt及びLwtからなる抗体を「Trastuzumab A1」、「HwtLwt抗体」又は「HwtLwt」と称する。H01及びL02からなる抗体を「H01L02抗体」又は「H01L02」と称する。Hwt及びL05からなる抗体を「HwtL05抗体」又は「HwtL05」と称する。
Hwt及びLwtからなる抗体を「Trastuzumab A1」、「HwtLwt抗体」又は「HwtLwt」と称する。H01及びL02からなる抗体を「H01L02抗体」又は「H01L02」と称する。Hwt及びL05からなる抗体を「HwtL05抗体」又は「HwtL05」と称する。
【0228】
1－2：Trastuzumab A1（HwtLwt）、H01L02抗体及びHwtL05抗体の作製
1－2－1：軽鎖発現プラスミドpCMA－LKの構築
プラスミドpcDNA3．3－TOPO／LacZ（Invitrogen社）を制限酵素XbaI及びPmeIで消化して得られる約5．4kbのフラグメントと、配列番号9に示すヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片をIn－Fusion HD PCRクローニングキット（Clontech社）を用いて結合して、pcDNA3.3／LKを作製した。pcDNA3.3／LKからネオマイシン発現ユニットを除去することによりpCMA－LKを構築した。
1－2－1：軽鎖発現プラスミドpCMA－LKの構築
プラスミドpcDNA3．3－TOPO／LacZ（Invitrogen社）を制限酵素XbaI及びPmeIで消化して得られる約5．4kbのフラグメントと、配列番号9に示すヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片をIn－Fusion HD PCRクローニングキット（Clontech社）を用いて結合して、pcDNA3.3／LKを作製した。pcDNA3.3／LKからネオマイシン発現ユニットを除去することによりpCMA－LKを構築した。
【0229】
1－2－2：IgG1LALAタイプ重鎖発現プラスミドpCMA－G1LALAの構築
pCMA－LKをXbaI及びPmeIで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたDNA断片と、配列番号10で示されるヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG1LALA定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片をIn－Fusion HD PCRクローニングキット（Clontech社）を用いて結合して、pCMA－G1LALAを構築した。
pCMA－LKをXbaI及びPmeIで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたDNA断片と、配列番号10で示されるヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG1LALA定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片をIn－Fusion HD PCRクローニングキット（Clontech社）を用いて結合して、pCMA－G1LALAを構築した。
【0230】
1－2－3：Trastuzumab A1重鎖発現プラスミドの構築
配列番号12に示すTrastuzumab A1の重鎖（Hwt）をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至434に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。In－Fusion HD PCRクローニングキット（Clontech社）を用いて、pCMA－G1LALAを制限酵素BlpIで切断した箇所に合成したDNA断片を挿入することにより発現プラスミドを構築した。
配列番号12に示すTrastuzumab A1の重鎖（Hwt）をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至434に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。In－Fusion HD PCRクローニングキット（Clontech社）を用いて、pCMA－G1LALAを制限酵素BlpIで切断した箇所に合成したDNA断片を挿入することにより発現プラスミドを構築した。
【0231】
1－2－4：H01発現プラスミドの構築
配列番号16に示すH01をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至434に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。実施例1－2－3と同様の方法で発現プラスミドを構築した。
配列番号16に示すH01をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至434に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。実施例1－2－3と同様の方法で発現プラスミドを構築した。
【0232】
1－2－5：Trastuzumab A1軽鎖発現プラスミドの構築
配列番号20に示すTrastuzumab A1の軽鎖（Lwt）をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号37乃至402に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。In－Fusion HD PCRクローニングキット（Clontech社）を用いて、pCMA－LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所に合成したDNA断片を挿入することにより発現プラスミドを構築した。
配列番号20に示すTrastuzumab A1の軽鎖（Lwt）をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド番号37乃至402に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。In－Fusion HD PCRクローニングキット（Clontech社）を用いて、pCMA－LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所に合成したDNA断片を挿入することにより発現プラスミドを構築した。
【0233】
1－2－6：L02発現プラスミドの構築
配列番号24に示すL02のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号37乃至402に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。実施例1－2－5と同様の方法で発現プラスミドを構築した。
配列番号24に示すL02のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号37乃至402に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。実施例1－2－5と同様の方法で発現プラスミドを構築した。
【0234】
1－2－7：L05発現プラスミドの構築
配列番号28に示すL05のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号37乃至402に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。実施例1－2－5と同様の方法で発現プラスミドを構築した。
配列番号28に示すL05のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号37乃至402に示されるDNA断片を合成した（GENEART社）。実施例1－2－5と同様の方法で発現プラスミドを構築した。
【0235】
1－3：Trastuzumab A1、H01L02抗体及びHwtL05抗体の調製
1－3－1：Trastuzumab A1、H01L02抗体及びHwtL05抗体の生産
FreeStyle 293F細胞（Invitrogen社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の1．2×109個のFreeStyle 293F細胞（Invitrogen社）を3L Fernbach Erlenmeyer Flask（CORNING社）に播種し、FreeStyle293 expression medium（Invitrogen社）で希釈して2．0×106細胞／mLに調製した。40mLのOpti－Pro SFM培地（Invitrogen社）に0.24mgの重鎖発現プラスミドと0.36mgの軽鎖発現プラスミドと1.8mgのPolyethyleneimine（Polyscience ＃24765）を加えて穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle 293F細胞に添加した。37℃、8％CO2インキュベーターで4時間、90rpmで振とう培養後に600mLのEX－CELL VPRO培地（SAFC Biosciences社）、18mLのGlutaMAX I（GIBCO社）、及び30mLのYeastolate Ultrafiltrate（GIBCO社）を添加し、37℃、8％CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposable Capsule Filter（Advantec ＃CCS－045－E1H）でろ過した。
実施例1－1－3に示した重鎖と軽鎖の組み合わせに対応する重鎖発現プラスミドと軽鎖発現プラスミドの組み合わせにより、Trastuzumab A1、H01L02抗体及びHwtL05抗体を生産した。
1－3－1：Trastuzumab A1、H01L02抗体及びHwtL05抗体の生産
FreeStyle 293F細胞（Invitrogen社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の1．2×109個のFreeStyle 293F細胞（Invitrogen社）を3L Fernbach Erlenmeyer Flask（CORNING社）に播種し、FreeStyle293 expression medium（Invitrogen社）で希釈して2．0×106細胞／mLに調製した。40mLのOpti－Pro SFM培地（Invitrogen社）に0.24mgの重鎖発現プラスミドと0.36mgの軽鎖発現プラスミドと1.8mgのPolyethyleneimine（Polyscience ＃24765）を加えて穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle 293F細胞に添加した。37℃、8％CO2インキュベーターで4時間、90rpmで振とう培養後に600mLのEX－CELL VPRO培地（SAFC Biosciences社）、18mLのGlutaMAX I（GIBCO社）、及び30mLのYeastolate Ultrafiltrate（GIBCO社）を添加し、37℃、8％CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposable Capsule Filter（Advantec ＃CCS－045－E1H）でろ過した。
実施例1－1－3に示した重鎖と軽鎖の組み合わせに対応する重鎖発現プラスミドと軽鎖発現プラスミドの組み合わせにより、Trastuzumab A1、H01L02抗体及びHwtL05抗体を生産した。
【0236】
1－3－2：Trastuzumab A1、H01L02抗体及びHwtL05抗体の精製
実施例1－3－1で得られた培養上清をrProtein Aアフィニティークロマトグラフィーの1段階工程で精製した。培養上清をPBSで平衡化したMabSelectSuReが充填されたカラム（GE Healthcare Bioscience社製）にアプライしたのちに、カラム容量の2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液（pH4.0）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Thermo Scientific社、Slide－A－Lyzer Dialysis Cassette）により50mMリン酸緩衝溶液（pH6.0）へのバッファー置換を行った。Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20（分画分子量UF10K，Sartorius社）で抗体を濃縮し、IgG濃度を20mg／ml以上に調製した。最後にMinisart－Plus filter（Sartorius社）でろ過し、精製サンプルとした。
実施例1－3－1で得られた培養上清をrProtein Aアフィニティークロマトグラフィーの1段階工程で精製した。培養上清をPBSで平衡化したMabSelectSuReが充填されたカラム（GE Healthcare Bioscience社製）にアプライしたのちに、カラム容量の2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液（pH4.0）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Thermo Scientific社、Slide－A－Lyzer Dialysis Cassette）により50mMリン酸緩衝溶液（pH6.0）へのバッファー置換を行った。Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20（分画分子量UF10K，Sartorius社）で抗体を濃縮し、IgG濃度を20mg／ml以上に調製した。最後にMinisart－Plus filter（Sartorius社）でろ過し、精製サンプルとした。
【0237】
1－4：Trastuzumab改変体の活性測定
1－4－1：Trastuzumab改変体の結合性評価
実施例1－3で調製したTrastuzumab A1、H01L02抗体、HwtL05抗体とヒトHER2の解離定数測定は、Biacore T200（GE Healthcare Bioscience社製）を使用し、Human Antibody Capture Kit（GE Healthcare Bioscience社製）を用いて固定化したAnti‐Human IgG（Fc）antibodyに抗体をリガンドとして捕捉（キャプチャー）し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。ランニングバッファーとしてHBS－EP＋（GE Healthcare Bioscience社製）、センサーチップとしてCM5（GE Healthcare Bioscience社製）を用いた。チップ上に0.1μg／mLまたは0.2μg／mLの抗体を10μL／分で60秒間添加した後、抗原としてRecombinant human HER2／ErbB2（ACRO Biosystems）の希釈系列溶液 （0．5～8μg／mL）を流速30μL／分で120秒間添加し、引き続きTrastuzumab A1に対して600秒間、H01L02に対して300秒間、HwtL05に対して120秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、3M magnesium chloride（GE Healthcare Bioscience社製）を流速20μL／分で30秒間添加した。データの解析には1：1結合モデルを用いて、結合速度定数ka、解離速度定数kd及び解離定数（KD；KD＝kd／ka）を算出した。結果を表1に示す。
1－4－1：Trastuzumab改変体の結合性評価
実施例1－3で調製したTrastuzumab A1、H01L02抗体、HwtL05抗体とヒトHER2の解離定数測定は、Biacore T200（GE Healthcare Bioscience社製）を使用し、Human Antibody Capture Kit（GE Healthcare Bioscience社製）を用いて固定化したAnti‐Human IgG（Fc）antibodyに抗体をリガンドとして捕捉（キャプチャー）し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。ランニングバッファーとしてHBS－EP＋（GE Healthcare Bioscience社製）、センサーチップとしてCM5（GE Healthcare Bioscience社製）を用いた。チップ上に0.1μg／mLまたは0.2μg／mLの抗体を10μL／分で60秒間添加した後、抗原としてRecombinant human HER2／ErbB2（ACRO Biosystems）の希釈系列溶液 （0．5～8μg／mL）を流速30μL／分で120秒間添加し、引き続きTrastuzumab A1に対して600秒間、H01L02に対して300秒間、HwtL05に対して120秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、3M magnesium chloride（GE Healthcare Bioscience社製）を流速20μL／分で30秒間添加した。データの解析には1：1結合モデルを用いて、結合速度定数ka、解離速度定数kd及び解離定数（KD；KD＝kd／ka）を算出した。結果を表1に示す。
【0238】
【表1】
【0239】
〔製造中間体（薬物リンカー）の合成〕
実施例2
［実施例2-1：中間体1］
実施例2
［実施例2-1：中間体1］
【0240】
【化61】
【0241】
工程1：ベンジル（6S)-6-（ヒドロキシメチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-5-カルボキシレート（1-2）
5-ベンジル 6-メチル（6S）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-5，6-ジカルボキシレート（1-1）（104mmol，WO2012087596）のテトラヒドロフラン（500mL）溶液に、水素化ホウ素リチウム（4.30g，178mmol）を0℃にて少量ずつ加えた。0℃にて30分撹拌した後、室温にて2時間撹拌した。0℃にて水（180mL）、2規定塩酸（186mL）を加え、減圧留去した。得られた残渣を酢酸エチルで4回抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣（1-2）（27.9g，90％）をそのまま次の反応に用いた。
5-ベンジル 6-メチル（6S）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-5，6-ジカルボキシレート（1-1）（104mmol，WO2012087596）のテトラヒドロフラン（500mL）溶液に、水素化ホウ素リチウム（4.30g，178mmol）を0℃にて少量ずつ加えた。0℃にて30分撹拌した後、室温にて2時間撹拌した。0℃にて水（180mL）、2規定塩酸（186mL）を加え、減圧留去した。得られた残渣を酢酸エチルで4回抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣（1-2）（27.9g，90％）をそのまま次の反応に用いた。
【0242】
工程2：ベンジル （6S）-6-（｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-5-カルボキシレート（1-3）
上記工程1にて得られた化合物（1-2）（27.9g，107mmol）とイミダゾール（14.5g，214mmol）のジクロロメタン（300mL）溶液に、室温にてtert-ブチルジメチルシリルクロリド（24.2g，160mmol）を加え、室温にて18時間撹拌した。反応溶液を飽和クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（1-3）（32.5g，81％）を得た。
MS (APCI)m/z:376(M+H)+
上記工程1にて得られた化合物（1-2）（27.9g，107mmol）とイミダゾール（14.5g，214mmol）のジクロロメタン（300mL）溶液に、室温にてtert-ブチルジメチルシリルクロリド（24.2g，160mmol）を加え、室温にて18時間撹拌した。反応溶液を飽和クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（1-3）（32.5g，81％）を得た。
MS (APCI)m/z:376(M+H)+
【0243】
工程3：（6S）-6-（｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン（1-4）
上記工程2で得られた化合物（1-3）（32.5g，86.5mmol）のエタノール（400mL）溶液に、室温にて7.5％パラジウム炭素触媒（54％水分、5.00g）を加え、室温、水素雰囲気下にて6時間撹拌した。反応溶液をセライト濾過し、濾液を減圧留去し、目的物（1-4）（21.3g，定量的）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:242(M+H)+
上記工程2で得られた化合物（1-3）（32.5g，86.5mmol）のエタノール（400mL）溶液に、室温にて7.5％パラジウム炭素触媒（54％水分、5.00g）を加え、室温、水素雰囲気下にて6時間撹拌した。反応溶液をセライト濾過し、濾液を減圧留去し、目的物（1-4）（21.3g，定量的）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:242(M+H)+
【0244】
工程4：［（6S）-6-（｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル］（5-メトキシ-2-ニトロ-4-｛［トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝フェニル）メタノン（1-5）
5-メトキシ-2-ニトロ-4-｛トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝安息香酸（52.2g，141mmol，US20150283262）と1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（23.8g，155mmol）のジクロロメタン（500mL）溶液に、氷冷下にてN，N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（35.0g，170mmol）を加えた。反応混合物を室温にて撹拌した。カルボン酸消失後、-60℃にて上記工程3にて得られた化合物（1-4）（34.1g，141mmol）とトリエチルアミン（29.4mL，212mmol）のジクロロメタン（100mL）溶液をゆっくりと滴下した。反応溶液を室温にて一晩撹拌した後、反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、反応混合物をクロロホルムで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧留去して得られた残渣に酢酸エチルとジエチルエーテルを加え、固体成分を濾過により取り除き、濾液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～25：75（v/v）］にて精製し、目的物（1-5）（55.0g，66％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:593(M+H)+
5-メトキシ-2-ニトロ-4-｛トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝安息香酸（52.2g，141mmol，US20150283262）と1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（23.8g，155mmol）のジクロロメタン（500mL）溶液に、氷冷下にてN，N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（35.0g，170mmol）を加えた。反応混合物を室温にて撹拌した。カルボン酸消失後、-60℃にて上記工程3にて得られた化合物（1-4）（34.1g，141mmol）とトリエチルアミン（29.4mL，212mmol）のジクロロメタン（100mL）溶液をゆっくりと滴下した。反応溶液を室温にて一晩撹拌した後、反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、反応混合物をクロロホルムで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧留去して得られた残渣に酢酸エチルとジエチルエーテルを加え、固体成分を濾過により取り除き、濾液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～25：75（v/v）］にて精製し、目的物（1-5）（55.0g，66％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:593(M+H)+
【0245】
工程5：（2-アミノ-5-メトキシ-4-｛［トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝フェニル）［（6S）-6-（｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル］メタノン（1-6）
上記工程4で得られた化合物（1-5）（55.0g，92.8mmol）のエタノール（300mL）溶液に、窒素雰囲気下にて、7.5％パラジウム炭素（10.0g）を加えた。窒素風船を直ちに水素風船に付け替え、反応混合物を水素雰囲気下、室温で激しく撹拌した。原料消失後、反応混合物を濾過し、濾液を減圧留去し、得られた目的物（1-6）（52.2g，100％）をそのまま次の反応に用いた。
MS(APCI、ESI)m/z:563(M+H)+
上記工程4で得られた化合物（1-5）（55.0g，92.8mmol）のエタノール（300mL）溶液に、窒素雰囲気下にて、7.5％パラジウム炭素（10.0g）を加えた。窒素風船を直ちに水素風船に付け替え、反応混合物を水素雰囲気下、室温で激しく撹拌した。原料消失後、反応混合物を濾過し、濾液を減圧留去し、得られた目的物（1-6）（52.2g，100％）をそのまま次の反応に用いた。
MS(APCI、ESI)m/z:563(M+H)+
【0246】
工程6：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-［4-（｛［（2-｛［（6S）-6-（｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル］カルボニル｝-4-メトキシ-5-｛［トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝フェニル）カルバモイル］オキシ｝メチル）フェニル］-L-アラニンアミド（1-7）
上記工程5で得られた化合物（1-6）（18.6g，33.0mmol）およびトリエチルアミン（6.26mL，45.2mmol）のTHF（300mL）溶液に、エタノール-氷浴上にて、トリホスゲン（4.22g，14.2mmol）をゆっくりと添加した。添加後、氷冷した反応混合物に、N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-［4-（ヒドロキシメチル）フェニル］-L-アラニンアミド（11.4g，30.2mmol，WO2011130598）とトリエチルアミン（6.26mL，45.2mmol）のテトラヒドロフラン（100mL）、N，N-ジメチルホルムアミド（30mL）混合溶液をゆっくりと滴下した。滴下後、氷浴をはずし、反応混合物を、窒素雰囲気下、40℃にて撹拌した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～40：60（v/v）］にて精製し、目的物（1-7）（23.5g，74％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:966(M+H)+
上記工程5で得られた化合物（1-6）（18.6g，33.0mmol）およびトリエチルアミン（6.26mL，45.2mmol）のTHF（300mL）溶液に、エタノール-氷浴上にて、トリホスゲン（4.22g，14.2mmol）をゆっくりと添加した。添加後、氷冷した反応混合物に、N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-［4-（ヒドロキシメチル）フェニル］-L-アラニンアミド（11.4g，30.2mmol，WO2011130598）とトリエチルアミン（6.26mL，45.2mmol）のテトラヒドロフラン（100mL）、N，N-ジメチルホルムアミド（30mL）混合溶液をゆっくりと滴下した。滴下後、氷浴をはずし、反応混合物を、窒素雰囲気下、40℃にて撹拌した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～40：60（v/v）］にて精製し、目的物（1-7）（23.5g，74％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:966(M+H)+
【0247】
工程7：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-［4-（｛［（2-｛［（6S）-6-（ヒドロキシメチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル］カルボニル｝-4-メトキシ-5-｛［トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝フェニル）カルバモイル］オキシ｝メチル）フェニル］-L-アラニンアミド（1-8）
上記工程6で得られた化合物（1-7）（23.5g，24.3mmol）のテトラヒドロフラン（50mL），メタノール（50mL），水（44mL）溶液に、室温下にて酢酸（200mL）を加えた。反応混合物を室温にて撹拌した。原料消失後、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～0：100（v/v）］にて精製し、目的物（1-8）（18.0g，87％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:852(M+H)+
上記工程6で得られた化合物（1-7）（23.5g，24.3mmol）のテトラヒドロフラン（50mL），メタノール（50mL），水（44mL）溶液に、室温下にて酢酸（200mL）を加えた。反応混合物を室温にて撹拌した。原料消失後、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～0：100（v/v）］にて精製し、目的物（1-8）（18.0g，87％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:852(M+H)+
【0248】
工程8：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-5’-オキソ-8’-｛［トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（1-9）
ジメチルスルホキシド（3.75mL，52.8mmol）のジクロロメタン（300mL）溶液に、窒素雰囲気下、-78℃にて、塩化オキサリル（2.17mL，25.3mmol）をゆっくりと滴下した。滴下後、反応混合物を-78℃にて撹拌した。反応混合物に、上記工程7で得られた化合物（1-8）（18.0g，21.1mmol）のジクロロメタン（50.0mL）溶液をゆっくりと滴下した。反応溶液に-78℃にて、トリエチルアミン（14.6mL，105mmol）を加えた。添加後、冷媒浴をはずし、室温までゆっくりと昇温した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物をクロロホルム（200mL）で抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～0：60（v/v）］にて精製し、目的物（1-9）（16.5g，92％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:850(M+H)+
ジメチルスルホキシド（3.75mL，52.8mmol）のジクロロメタン（300mL）溶液に、窒素雰囲気下、-78℃にて、塩化オキサリル（2.17mL，25.3mmol）をゆっくりと滴下した。滴下後、反応混合物を-78℃にて撹拌した。反応混合物に、上記工程7で得られた化合物（1-8）（18.0g，21.1mmol）のジクロロメタン（50.0mL）溶液をゆっくりと滴下した。反応溶液に-78℃にて、トリエチルアミン（14.6mL，105mmol）を加えた。添加後、冷媒浴をはずし、室温までゆっくりと昇温した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物をクロロホルム（200mL）で抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～0：60（v/v）］にて精製し、目的物（1-9）（16.5g，92％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:850(M+H)+
【0249】
工程9：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7’-メトキシ-5’-オキソ-8’-｛［トリ（プロパン-2-イル）シリル］オキシ｝-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（1-10）
上記工程8で得られた化合物（1-9）（12.0g，14.1mmol）および2，6-ルチジン（6.58mL，56.5mmol）のジクロロメタン（200mL）溶液に、窒素雰囲気下、0℃にて、トリフルオロメチルスルホン酸tert-ブチルジメチルシリル（9.73mL，42.3mmol）をゆっくりと滴下した。氷冷下、10分間撹拌した後に、氷浴をはずし、室温にて撹拌した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物をクロロホルムで抽出した水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～25：75（v/v）］にて精製し、目的物（1-10）（8.12g，60％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:964(M+H)+
上記工程8で得られた化合物（1-9）（12.0g，14.1mmol）および2，6-ルチジン（6.58mL，56.5mmol）のジクロロメタン（200mL）溶液に、窒素雰囲気下、0℃にて、トリフルオロメチルスルホン酸tert-ブチルジメチルシリル（9.73mL，42.3mmol）をゆっくりと滴下した。氷冷下、10分間撹拌した後に、氷浴をはずし、室温にて撹拌した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物をクロロホルムで抽出した水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～25：75（v/v）］にて精製し、目的物（1-10）（8.12g，60％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:964(M+H)+
【0250】
工程10：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-8’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（1-11）
上記工程9で得られた化合物（1-10）（8.12g，8.42mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（90mL）、水（2mL）溶液に、酢酸リチウム（0.611g，9.26mmol）を加え、室温下で撹拌した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～0：100（v/v）］にて精製し、目的物（1-11）（5.48g，81％）を得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3,20.9℃)δ:8.76-8.60(1H,m),7.45-7.44(2H,m),7.21(1H,s),7.10-7.09(2H,m),6.81-6.74(1H,m),6.65(1H,s),6.23(1H,s),6.01-5.99(1H,m),5.95-5.84(1H,m),5.41-5.20(2H,m),5.16(1H,m),4.84(1H,m),4.67-4.54(4H,m),4.05-4.03(1H,m),3.87(3H,s),3.71(1H,m),3.55-3.51(1H,m),3.26(1H,m),2.35(1H,m),2.18-2.12(1H,m),1.55-1.42(4H,m),0.97-0.92(6H,m),0.81(9H,s),0.76-0.61(4H,m),0.20-0.06(6H,m)
MS(APCI、ESI)m/z:808(M+H)+
上記工程9で得られた化合物（1-10）（8.12g，8.42mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（90mL）、水（2mL）溶液に、酢酸リチウム（0.611g，9.26mmol）を加え、室温下で撹拌した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～0：100（v/v）］にて精製し、目的物（1-11）（5.48g，81％）を得た。
1H-NMR(400MHz,CDCl3,20.9℃)δ:8.76-8.60(1H,m),7.45-7.44(2H,m),7.21(1H,s),7.10-7.09(2H,m),6.81-6.74(1H,m),6.65(1H,s),6.23(1H,s),6.01-5.99(1H,m),5.95-5.84(1H,m),5.41-5.20(2H,m),5.16(1H,m),4.84(1H,m),4.67-4.54(4H,m),4.05-4.03(1H,m),3.87(3H,s),3.71(1H,m),3.55-3.51(1H,m),3.26(1H,m),2.35(1H,m),2.18-2.12(1H,m),1.55-1.42(4H,m),0.97-0.92(6H,m),0.81(9H,s),0.76-0.61(4H,m),0.20-0.06(6H,m)
MS(APCI、ESI)m/z:808(M+H)+
【0251】
1H-NMR(500MHz,CDCl3,27℃)δ:8.76(1H,s),7.43(2H,brd),7.20(1H,s),7.08(2H,d,J=8.3Hz),7.00(1H,br),6.66(1H,s),6.44(1H,s),6.00(1H,H11’,d,J11’,11’a=9.2Hz),5.89(1H,m),5.53(1H,brd),5.30(1H,d,J=17.2Hz),5.20(1H,d,J=10.3Hz),5.15(1H,d,JABq=12.5Hz),4.85(1H,d,JABq=12.5Hz),4.66(1H,m),4.60-4.52(2H,m),4.07(1H,m),3.84(3H,s),3.71(1H,H-3’β,d,Jgem=11.7Hz),3.53(1H,H-11’a,m),3.26(1H,H-3’α,d,Jgem=11.7Hz),2.35(1H,H-1’β,dd,J1’β,11’a=8.30Hz,Jgem=13.1Hz),2.14(1H,m),1.54(1H,H-1’α,d,Jgem=13.1Hz),1.41(3H,d,J=6.90Hz),0.95(3H,d,J=6.80Hz),0.92(3H,d,J=6.80Hz),0.81(9H,s),0.80-0.70(1H,m),0.70-0.59(3H,m),0.2-0.06(6H,m)
【0252】
化合物（1-11）についてselective 1D ROESYスペクトルで得られた相関（下図）より、11’位の絶対立体配置の解析を行った。1’α-Hと11’-H、 3’α-Hと11’-H、および1’β-Hと3’β-H間に相関が認められることから、11’位の絶対立体配置はS 配置であることが分かった。
【0253】
【化62】
【0254】
従って、化合物(1-11)、それと同じ絶対立体配置を有する化合物(1-9）及び化合物(1-10)、化合物（1-11）を用いて合成された化合物(3-11)、化合物(3-12)、化合物(3-13)及び薬物リンカー1（化合物(3-14)）、化合物(4-9)、化合物(4-10)、化合物(4-11)及び薬物リンカー2（化合物(4-12)）、ならびに、化合物(6-10)、化合物(6-11)、化合物(6-12)及び薬物リンカー4（化合物(6-13)）における11’位の絶対立体配置はS配置であることが分かった。また、同様の合成手法で得られる化合物(5-9)、化合物(5-10)及び薬物リンカー3（化合物(5-11)）の11’位の絶対立体配置はS 配置であると決定した。
【0255】
［実施例2-2：中間体2］
【化63】
【0256】
工程1：N-［4-（11，12-ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン-5（6H）-イル）-4-オキソブタノイル］グリシルグリシン（2-2）
グリシルグリシン（0.328g，2.49mmol）、N，N-ジイソプロピルエチルアミン（0.433mL，2.49mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（20mL）溶液に、1-｛［4-（11，12-ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン-5（6H）-イル）-4-オキソブタノイル］オキシ｝ピロリジン-2，5-ジオン（2-1）（1.00g，2.49mmol，Click Chemistry Tools）、水（10mL）を室温にて加え、同温度にて一晩撹拌した。減圧留去し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム～クロロホルム：メタノール：水＝7：3：1（v/v/v）の分配有機層］にて精製し、目的物（0.930g，89％）を得た。
1H-NMR(DMSO-D6)δ:12.58(1H,s),8.14-8.12(1H,m),8.08-8.07(1H,m),7.69-7.68(1H,m),7.62-7.61(1H,m),7.53-7.45(3H,m),7.40-7.29(3H,m),5.05-5.01(1H,m),3.73-3.72(2H,m),3.66-3.60(3H,m),2.66-2.60(1H,m),2.33-2.24(1H,m),2.08-2.04(1H,m),1.81-1.77(1H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:420[(M+H)+].
グリシルグリシン（0.328g，2.49mmol）、N，N-ジイソプロピルエチルアミン（0.433mL，2.49mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（20mL）溶液に、1-｛［4-（11，12-ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン-5（6H）-イル）-4-オキソブタノイル］オキシ｝ピロリジン-2，5-ジオン（2-1）（1.00g，2.49mmol，Click Chemistry Tools）、水（10mL）を室温にて加え、同温度にて一晩撹拌した。減圧留去し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム～クロロホルム：メタノール：水＝7：3：1（v/v/v）の分配有機層］にて精製し、目的物（0.930g，89％）を得た。
1H-NMR(DMSO-D6)δ:12.58(1H,s),8.14-8.12(1H,m),8.08-8.07(1H,m),7.69-7.68(1H,m),7.62-7.61(1H,m),7.53-7.45(3H,m),7.40-7.29(3H,m),5.05-5.01(1H,m),3.73-3.72(2H,m),3.66-3.60(3H,m),2.66-2.60(1H,m),2.33-2.24(1H,m),2.08-2.04(1H,m),1.81-1.77(1H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:420[(M+H)+].
【0257】
［実施例2-3：薬物リンカー1］
【化64】
【0258】
工程1：（2R，11aS）-2-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-8-ヒドロキシ-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-2，3-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（3-2）
（2R，11aS）-8-（ベンジルオキシ）-2-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-2，3-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（3-1）（25.5g，41.6mmol，WO2016149546）のテトラヒドロフラン（150mL）、エタノール（150mL）溶液に、窒素雰囲気下、5％パラジウム炭素（54％水分、10.0g）を加えた後、反応溶液を水素雰囲気下、室温にて三日間撹拌した。反応溶液にクロロホルムを加え、セライト濾過した後、濾液を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（3-2）（19.4g，89％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:523(M+H)+
（2R，11aS）-8-（ベンジルオキシ）-2-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-2，3-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（3-1）（25.5g，41.6mmol，WO2016149546）のテトラヒドロフラン（150mL）、エタノール（150mL）溶液に、窒素雰囲気下、5％パラジウム炭素（54％水分、10.0g）を加えた後、反応溶液を水素雰囲気下、室温にて三日間撹拌した。反応溶液にクロロホルムを加え、セライト濾過した後、濾液を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（3-2）（19.4g，89％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:523(M+H)+
【0259】
工程2：（2R，11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-2-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-2，3-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（3-3）
上記工程1にて得られた化合物（3-2）（10.8g，20.7mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（30mL）溶液に、1，5-ジブロモペンタン（23.8g，103mmol）、炭酸カリウム（3.43g，24.8mmol）を室温で加えた。室温で3時間撹拌した後、反応溶液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝90：10（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（3-3）（14.5g，定量的）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:673[81Br,(M+H)+],671[79Br,(M+H)+].
上記工程1にて得られた化合物（3-2）（10.8g，20.7mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（30mL）溶液に、1，5-ジブロモペンタン（23.8g，103mmol）、炭酸カリウム（3.43g，24.8mmol）を室温で加えた。室温で3時間撹拌した後、反応溶液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝90：10（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（3-3）（14.5g，定量的）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:673[81Br,(M+H)+],671[79Br,(M+H)+].
【0260】
工程3：（2R，11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-2-ヒドロキシ-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-2，3-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（3-4）
上記工程2にて得られた化合物（3-3）（21.5mmol）のテトラヒドロフラン（40mL）溶液に、1mol/Lのテトラブチルアンモニウムフロリド テトラヒドロフラン溶液（28.0mL，28.0mmol）を0℃にて加えた。室温にて30分間撹拌した後、反応溶液に水を加え、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝97.5：2.5（v/v）～92.5：7.5（v/v）］にて精製し、目的物（3-4）（11.3g，94％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:559[81Br,(M+H)+],557[79Br,(M+H)+].
上記工程2にて得られた化合物（3-3）（21.5mmol）のテトラヒドロフラン（40mL）溶液に、1mol/Lのテトラブチルアンモニウムフロリド テトラヒドロフラン溶液（28.0mL，28.0mmol）を0℃にて加えた。室温にて30分間撹拌した後、反応溶液に水を加え、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝97.5：2.5（v/v）～92.5：7.5（v/v）］にて精製し、目的物（3-4）（11.3g，94％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:559[81Br,(M+H)+],557[79Br,(M+H)+].
【0261】
工程4：（11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-2，5，11（3H，10H，11aH）-トリオン（3-5）
上記工程3にて得られた化合物（3-4）（11.3g，20.2mmol）、テトラブチルアンモニウムブロミド（0.325g，1.01mmol）、臭化カリウム（0.240g，2.02mmol，）を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（60mL）、ジクロロメタン（60mL）に溶解させ、nor-AZADO（0.0279g，0.202mmol）、次亜塩素酸ナトリウム五水和物（2.03g，27.2mmol）を0℃にて加え、0℃にて30分間撹拌した。原料が残存したため、次亜塩素酸ナトリウム五水和物（1.00g、13.4mmol）を0℃にて加え、0℃にて15分撹拌した。さらに次亜塩素酸ナトリウム五水和物（0.300g、4.03mmol）を0℃にて加え、0℃にて15分撹拌し、原料の消失をTLCにて確認した。反応溶液にチオ硫酸ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝75：25（v/v）～40：60（v/v）］にて精製し、目的物（3-5）（9.74g，87％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:557[81Br,(M+H)+],555[79Br,(M+H)+].
上記工程3にて得られた化合物（3-4）（11.3g，20.2mmol）、テトラブチルアンモニウムブロミド（0.325g，1.01mmol）、臭化カリウム（0.240g，2.02mmol，）を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（60mL）、ジクロロメタン（60mL）に溶解させ、nor-AZADO（0.0279g，0.202mmol）、次亜塩素酸ナトリウム五水和物（2.03g，27.2mmol）を0℃にて加え、0℃にて30分間撹拌した。原料が残存したため、次亜塩素酸ナトリウム五水和物（1.00g、13.4mmol）を0℃にて加え、0℃にて15分撹拌した。さらに次亜塩素酸ナトリウム五水和物（0.300g、4.03mmol）を0℃にて加え、0℃にて15分撹拌し、原料の消失をTLCにて確認した。反応溶液にチオ硫酸ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝75：25（v/v）～40：60（v/v）］にて精製し、目的物（3-5）（9.74g，87％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:557[81Br,(M+H)+],555[79Br,(M+H)+].
【0262】
工程5：（11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7-メトキシ-5，11-ジオキソ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-2-イル トリフルオロメタンスルフォネート（3-6）
上記工程4にて得られた化合物（3-5）（9.74g，17.5mmol）のジクロロメタン（160mL）溶液に、2，6-ルチジン（8.17mL，70.1mmol）を-40℃にて加え、-40℃にて10分間撹拌した。反応溶液に無水トリフルオロメタンスルホン酸（8.85mL，52.6mmol）を-40℃にて加え、-40℃にて30分間撹拌した。反応溶液に10％クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝95：5→70：35］にて精製した後，NH2シリカゲルクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝95：5（v/v）～65：35（v/v）］にて精製し、目的物（3-6）（7.10g，59％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:689[81Br,(M+H)+],687[79Br,(M+H)+].
上記工程4にて得られた化合物（3-5）（9.74g，17.5mmol）のジクロロメタン（160mL）溶液に、2，6-ルチジン（8.17mL，70.1mmol）を-40℃にて加え、-40℃にて10分間撹拌した。反応溶液に無水トリフルオロメタンスルホン酸（8.85mL，52.6mmol）を-40℃にて加え、-40℃にて30分間撹拌した。反応溶液に10％クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝95：5→70：35］にて精製した後，NH2シリカゲルクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝95：5（v/v）～65：35（v/v）］にて精製し、目的物（3-6）（7.10g，59％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:689[81Br,(M+H)+],687[79Br,(M+H)+].
【0263】
工程6：（11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（3-7）
上記工程5にて得られた化合物（3-6）（2.00g，2.91mmol）、4-メトキシフェニルボロン酸（0.884g，5.82mmol）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（0.336g，0.291mmol）、炭酸ナトリウム（1.23g，11.6mmol）の混合物にトルエン（20mL）、エタノール（10mL）、水（10mL）を室温にて加えた。反応溶液を室温にて30分撹拌した後、反応溶液を酢酸エチルで抽出し、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝90：10（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（3-7）（1.71g，91％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:647[81Br,(M+H)+],645[79Br,(M+H)+].
上記工程5にて得られた化合物（3-6）（2.00g，2.91mmol）、4-メトキシフェニルボロン酸（0.884g，5.82mmol）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（0.336g，0.291mmol）、炭酸ナトリウム（1.23g，11.6mmol）の混合物にトルエン（20mL）、エタノール（10mL）、水（10mL）を室温にて加えた。反応溶液を室温にて30分撹拌した後、反応溶液を酢酸エチルで抽出し、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝90：10（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（3-7）（1.71g，91％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:647[81Br,(M+H)+],645[79Br,(M+H)+].
【0264】
工程7：（11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-1，11a-ジヒドロ-5H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5-オン（3-8）
上記工程6にて得られた化合物（3-7）（0.789g，1.22mmol）をエタノール（10mL）、テトラヒドロフラン（10mL）に溶解し、2.0Mの水素化ホウ素リチウムテトラヒドロフラン溶液（6.11mL，12.2mmol）を0℃にて加え、0℃にて3時間撹拌した。反応溶液に水を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をジクロロメタン（10mL）、エタノール（20mL）、水（10mL）に溶解し、シリカゲル（4g）を室温にて加え、室温で4日間撹拌した。シリカゲルをろ過により除き、水を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝60：40（v/v）～25：75（v/v）］にて精製し、目的物（3-8）（0.496g，81％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:501[81Br,(M+H)+],499[79Br,(M+H)+].
上記工程6にて得られた化合物（3-7）（0.789g，1.22mmol）をエタノール（10mL）、テトラヒドロフラン（10mL）に溶解し、2.0Mの水素化ホウ素リチウムテトラヒドロフラン溶液（6.11mL，12.2mmol）を0℃にて加え、0℃にて3時間撹拌した。反応溶液に水を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をジクロロメタン（10mL）、エタノール（20mL）、水（10mL）に溶解し、シリカゲル（4g）を室温にて加え、室温で4日間撹拌した。シリカゲルをろ過により除き、水を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝60：40（v/v）～25：75（v/v）］にて精製し、目的物（3-8）（0.496g，81％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:501[81Br,(M+H)+],499[79Br,(M+H)+].
【0265】
工程8：（11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-1，10，11，11a-テトラヒドロ-5H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5-オン（3-9）
上記工程7にて得られた化合物（3-8）（0.496g，0.992mmol）のジクロロメタン（20mL）溶液にナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（0.421g，1.99mmol）を0℃にて加えた。室温にて2時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝60：40（v/v）～25：75（v/v）］にて精製し、目的物（3-9）（0.426g，86％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:503[81Br,(M+H)+],501[79Br,(M+H)+].
上記工程7にて得られた化合物（3-8）（0.496g，0.992mmol）のジクロロメタン（20mL）溶液にナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（0.421g，1.99mmol）を0℃にて加えた。室温にて2時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝60：40（v/v）～25：75（v/v）］にて精製し、目的物（3-9）（0.426g，86％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:503[81Br,(M+H)+],501[79Br,(M+H)+].
【0266】
工程9：プロプ-2-エン-1-イル （11aS）-8-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-11，11a-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-10（5H）-カルボキシレート（3-10）
上記工程8にて得られた化合物（3-9）（0.426g，0.849mmol）のジクロロメタン（30mL）溶液に、ピリジン（0.102mL1.27mmol）、クロロぎ酸アリル（0.374mL，3.54mmol）を0℃にて加え、0℃にて15分間撹拌した。反応溶液に10％クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝90：10（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（3-10）（0.465g，94％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:587[81Br,(M+H)+],585[79Br,(M+H)+].
上記工程8にて得られた化合物（3-9）（0.426g，0.849mmol）のジクロロメタン（30mL）溶液に、ピリジン（0.102mL1.27mmol）、クロロぎ酸アリル（0.374mL，3.54mmol）を0℃にて加え、0℃にて15分間撹拌した。反応溶液に10％クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝90：10（v/v）～50：50（v/v）］にて精製し、目的物（3-10）（0.465g，94％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:587[81Br,(M+H)+],585[79Br,(M+H)+].
【0267】
工程10：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7’-メトキシ-8’-｛［5-（｛（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-10-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル｝オキシ）ペンチル］オキシ｝-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（3-11）
実施例2-1工程10にて得られた化合物（1-11）（0.130g，0.161mmol）と上記工程9にて得られた化合物（3-10）（0.104g，0.177mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（3mL）溶液に炭酸カリウム（0.0266g，0.193mmol）を室温にて加え、室温にて一晩撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去した後、得られた残渣をNH2-シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝70：30（v/v）～0：100（v/v）］にて精製し、目的物（3-11）（0.184g，87％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1312(M+H)+
実施例2-1工程10にて得られた化合物（1-11）（0.130g，0.161mmol）と上記工程9にて得られた化合物（3-10）（0.104g，0.177mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（3mL）溶液に炭酸カリウム（0.0266g，0.193mmol）を室温にて加え、室温にて一晩撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去した後、得られた残渣をNH2-シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝70：30（v/v）～0：100（v/v）］にて精製し、目的物（3-11）（0.184g，87％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1312(M+H)+
【0268】
工程11：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-｛［5-（｛（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-10-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル｝オキシ）ペンチル］オキシ｝-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（3-12）
上記工程10にて得られた化合物（3-11）（0.1837g，0.140mmol）と酢酸（0.048mL，0.840mmol）のテトラヒドロフラン（5.00mL）溶液に1mol/Lのテトラブチルアンモニウムフロリド テトラヒドロフラン溶液（0.700mL，0.700mmol）を室温にて加え、室温にて3時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝99.5：0.5（v/v）～95：5（v/v）］にて精製し、目的物（3-12）（0.178g、定量的）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1198(M+H)+
上記工程10にて得られた化合物（3-11）（0.1837g，0.140mmol）と酢酸（0.048mL，0.840mmol）のテトラヒドロフラン（5.00mL）溶液に1mol/Lのテトラブチルアンモニウムフロリド テトラヒドロフラン溶液（0.700mL，0.700mmol）を室温にて加え、室温にて3時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝99.5：0.5（v/v）～95：5（v/v）］にて精製し、目的物（3-12）（0.178g、定量的）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1198(M+H)+
【0269】
工程12：L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-［（5-｛［（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（3-13）
上記工程11にて得られた化合物（3-12）（0.140mmol）のジクロロメタン（2mL）溶液に、室温にてピロリジン（0.0579mL, 0.700mmol）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（0.0162g, 0.0140mmol）を加え、室温にて15分撹拌した。減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝99.5：0.5（v/v）～92.5：7.5（v/v）］にて精製し、目的物（3-13）（0.143g, 99%）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1030(M+H)+
上記工程11にて得られた化合物（3-12）（0.140mmol）のジクロロメタン（2mL）溶液に、室温にてピロリジン（0.0579mL, 0.700mmol）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（0.0162g, 0.0140mmol）を加え、室温にて15分撹拌した。減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝99.5：0.5（v/v）～92.5：7.5（v/v）］にて精製し、目的物（3-13）（0.143g, 99%）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1030(M+H)+
【0270】
工程13：N-［4-（11，12-ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン-5（6H）-イル）-4-オキソブタノイル］グリシルグリシル-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-［（5-｛［（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（3-14）
実施例2-2工程1にて得られた化合物（2-2）(0.0640g, 0.153mmol)、N‐エトキシカルボニル‐2-エトキシ‐1，2‐ジヒドロキノリン(0.0446g, 0.180mmol)の混合物にジクロロメタン（2mL）を室温にて加え、室温にて15分撹拌した。反応溶液に上記工程12にて得られた化合物（3-13）(0.143g, 0.139mmol)のジクロロメタン（2mL）溶液を加え、室温にて五時間撹拌した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィークロロホルム：メタノール＝99.5：0.5（v/v）～92.5：7.5（v/v）］で精製し、目的物（3-14）(0.103g, 52%)を得た。
1H-NMR(DMSO-D6)δ:9.93(1H,s),8.21-8.16(2H,m),8.07-8.04(1H,m),7.83-7.64(2H,m),7.60-7.55(3H,m),7.51-7.28(10H,m),7.19-7.16(2H,m),7.10-7.04(1H,m),6.92-6.90(2H,m),6.76-6.70(1H,m),6.39(1H,s),5.77-5.75(1H,m),5.21-5.18(1H,m),5.03-4.99(1H,m),4.82-4.79(1H,m),4.37-4.35(1H,m),4.21-4.20(2H,m),4.02-3.24(26H,m),3.16-3.13(1H,m),2.79-2.59(2H,m),2.39-2.28(2H,m),2.05-1.97(2H,m),1.91-1.77(4H,m),1.57-1.54(3H,m),1.28-1.23(3H,m),0.85-0.80(6H,m),0.67-0.61(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1431(M+H)+
実施例2-2工程1にて得られた化合物（2-2）(0.0640g, 0.153mmol)、N‐エトキシカルボニル‐2-エトキシ‐1，2‐ジヒドロキノリン(0.0446g, 0.180mmol)の混合物にジクロロメタン（2mL）を室温にて加え、室温にて15分撹拌した。反応溶液に上記工程12にて得られた化合物（3-13）(0.143g, 0.139mmol)のジクロロメタン（2mL）溶液を加え、室温にて五時間撹拌した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィークロロホルム：メタノール＝99.5：0.5（v/v）～92.5：7.5（v/v）］で精製し、目的物（3-14）(0.103g, 52%)を得た。
1H-NMR(DMSO-D6)δ:9.93(1H,s),8.21-8.16(2H,m),8.07-8.04(1H,m),7.83-7.64(2H,m),7.60-7.55(3H,m),7.51-7.28(10H,m),7.19-7.16(2H,m),7.10-7.04(1H,m),6.92-6.90(2H,m),6.76-6.70(1H,m),6.39(1H,s),5.77-5.75(1H,m),5.21-5.18(1H,m),5.03-4.99(1H,m),4.82-4.79(1H,m),4.37-4.35(1H,m),4.21-4.20(2H,m),4.02-3.24(26H,m),3.16-3.13(1H,m),2.79-2.59(2H,m),2.39-2.28(2H,m),2.05-1.97(2H,m),1.91-1.77(4H,m),1.57-1.54(3H,m),1.28-1.23(3H,m),0.85-0.80(6H,m),0.67-0.61(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1431(M+H)+
【0271】
［実施例2-4：薬物リンカー2］
【化65】
【0272】
工程1：（2R，11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-2-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-2，3-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（4-1）
実施例2-3工程1にて得られた化合物（3-2）（5.06g，9.67mmol）と1，3-ジブロモプロパン（4.93mL，48.4mmol）を、実施例2-3工程2と同様に反応させ、目的物（4-1）（4.85g，78％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:645[81Br,(M+H)+],643[79Br,(M+H)+].
実施例2-3工程1にて得られた化合物（3-2）（5.06g，9.67mmol）と1，3-ジブロモプロパン（4.93mL，48.4mmol）を、実施例2-3工程2と同様に反応させ、目的物（4-1）（4.85g，78％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:645[81Br,(M+H)+],643[79Br,(M+H)+].
【0273】
工程2：（2R，11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-2-ヒドロキシ-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-2，3-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（4-2）
上記工程1にて得られた化合物（4-1）（4.85g，7.54mmol）を、実施例2-3工程3と同様に反応させ、目的物（4-2）（4.05g，定量的）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:531[81Br,(M+H)+],529[79Br,(M+H)+].
上記工程1にて得られた化合物（4-1）（4.85g，7.54mmol）を、実施例2-3工程3と同様に反応させ、目的物（4-2）（4.05g，定量的）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:531[81Br,(M+H)+],529[79Br,(M+H)+].
【0274】
工程3：（11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-7-メトキシ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-2，5，11（3H，10H，11aH）-トリオン（4-3）
上記工程2にて得られた化合物（4-2）（7.54mmol）を、実施例2-3工程4と同様に反応させ、目的物（4-3）（3.73g，93％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.34(1H,s),7.29(1H,s),5.56-5.53(1H,m),4.72-4.69(1H,m),4.67-4.61(1H,m),4.23-4.17(3H,m),3.97-3.88(4H,m),3.82-3.75(1H,m),3.74-3.56(4H,m),2.82-2.77(1H,m),2.43-2.38(2H,m),1.06-0.94(2H,m),0.08-0.00(9H,m).
上記工程2にて得られた化合物（4-2）（7.54mmol）を、実施例2-3工程4と同様に反応させ、目的物（4-3）（3.73g，93％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.34(1H,s),7.29(1H,s),5.56-5.53(1H,m),4.72-4.69(1H,m),4.67-4.61(1H,m),4.23-4.17(3H,m),3.97-3.88(4H,m),3.82-3.75(1H,m),3.74-3.56(4H,m),2.82-2.77(1H,m),2.43-2.38(2H,m),1.06-0.94(2H,m),0.08-0.00(9H,m).
【0275】
工程4：（11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-7-メトキシ-5，11-ジオキソ-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-2-イル トリフルオロメタンスルフォネート（4-4）
上記工程3にて得られた化合物（4-3）（3.73g，7.08mmol）を、実施例2-3工程5と同様に反応させ、目的物（4-4）（3.27g，70％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:661[81Br,(M+H)+],659[79Br,(M+H)+].
上記工程3にて得られた化合物（4-3）（3.73g，7.08mmol）を、実施例2-3工程5と同様に反応させ、目的物（4-4）（3.27g，70％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:661[81Br,(M+H)+],659[79Br,(M+H)+].
【0276】
工程5：（11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル-10-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5，11（10H，11aH）-ジオン（4-5）
上記工程4にて得られた化合物（4-4）（3.27g，4.96mmol）を、実施例2-3工程6と同様に反応させ、目的物（4-5）（2.49g，81％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:619[81Br,(M+H)+],617[79Br,(M+H)+].
上記工程4にて得られた化合物（4-4）（3.27g，4.96mmol）を、実施例2-3工程6と同様に反応させ、目的物（4-5）（2.49g，81％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:619[81Br,(M+H)+],617[79Br,(M+H)+].
【0277】
工程6：（11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-1，11a-ジヒドロ-5H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5-オン（4-6）
上記工程5にて得られた化合物（4-5）（2.49g，4.04mmol）を、実施例2-3工程7と同様に反応させ、目的物（4-6）（1.59g，84％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：473［81Br，（M＋H）＋］，471［79Br，（M＋H）＋］.
上記工程5にて得られた化合物（4-5）（2.49g，4.04mmol）を、実施例2-3工程7と同様に反応させ、目的物（4-6）（1.59g，84％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：473［81Br，（M＋H）＋］，471［79Br，（M＋H）＋］.
【0278】
工程7：（11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-1，10，11，11a-テトラヒドロ-5H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-5-オン（4-7）
上記工程6にて得られた化合物（4-6）（1.59g，3.38mmol）を、実施例2-3工程8と同様に反応させ、目的物（4-7）（1.39g，87％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:475[81Br,(M+H)+],473[79Br,(M+H)+].
上記工程6にて得られた化合物（4-6）（1.59g，3.38mmol）を、実施例2-3工程8と同様に反応させ、目的物（4-7）（1.39g，87％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:475[81Br,(M+H)+],473[79Br,(M+H)+].
【0279】
工程8：プロプ-2-エン-1-イル （11aS）-8-（3-ブロモプロポキシ）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-11，11a-ジヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-10（5H）-カルボキシレート（4-8）
上記工程7にて得られた化合物（4-7）（1.40g，2.95mmol）を、実施例2-3工程9と同様に反応させ、目的物（4-8）（0.885g，54％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:559[81Br,(M+H)+],557[79Br,(M+H)+].
上記工程7にて得られた化合物（4-7）（1.40g，2.95mmol）を、実施例2-3工程9と同様に反応させ、目的物（4-8）（0.885g，54％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:559[81Br,(M+H)+],557[79Br,(M+H)+].
【0280】
工程9：N-｛［（プロプ-2-エン-1-イル）オキシ］カルボニル｝-L-バリル-N-［4-（｛［（11’S,11’aS）-11’-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7’-メトキシ-8’-（3-｛［（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-10-｛［（プロプ-2-エン-1-イル）オキシ］カルボニル｝-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル］オキシ｝プロポキシ）-5’-オキソ-11’，11’a-ジヒドロ-1’H，3’H‐スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］-L-アラニンアミド（4-9）
上記工程8にて得られた化合物（4-8）（0.0381g，0.0683mmol）と実施例2-1工程10で得られた化合物（1-11）（0.0552g、0.0683mmol）を、実施例2-3工程10と同様に反応させ、目的物（4-9）（0.0712g，81％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1284（M＋H）＋.
上記工程8にて得られた化合物（4-8）（0.0381g，0.0683mmol）と実施例2-1工程10で得られた化合物（1-11）（0.0552g、0.0683mmol）を、実施例2-3工程10と同様に反応させ、目的物（4-9）（0.0712g，81％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1284（M＋H）＋.
【0281】
工程10：N-｛［（プロプ-2-エン-1-イル）オキシ］カルボニル｝-L-バリル-N-［4-（｛［（11’S,11’aS）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-（3-｛［（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-10-｛［（プロプ-2-エン-1-イル）オキシ］カルボニル｝-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル］オキシ｝プロポキシ）-5’-オキソ-11’，11’a-ジヒドロ-1’H，3’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］-L-アラニンアミド（4-10）
上記工程9にて得られた化合物（4-9）（0.0712g，0.0554mmol）を、実施例2-3工程11と同様に反応させ、目的物（4-10）（0.0671g，定量的）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1170（M＋H）＋.
上記工程9にて得られた化合物（4-9）（0.0712g，0.0554mmol）を、実施例2-3工程11と同様に反応させ、目的物（4-10）（0.0671g，定量的）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1170（M＋H）＋.
【0282】
工程11：L-バリル-N-［4-（｛［（11’S,11’aS）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-（3-｛［（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル］オキシ｝プロポキシ）-5’-オキソ-11’，11’a-ジヒドロ-1’H，3’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］-L-アラニンアミド（4-11）
上記工程10にて得られた化合物（4-10）（0.0571mmol）を、実施例2-3工程12と同様に反応させ、目的物（4-11）（0.0574g，99％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:9.16(1H,s),7.93-7.91(1H,m),7.55-7.52(1H,m),7.50-7.47(3H,m),7.35-7.32(2H,m),7.21(1H,s),7.13-7.11(2H,m),6.90-6.87(2H,m),6.40(1H,s),6.08(1H,s),5.90-5.87(1H,m),5.37-5.34(1H,m),4.73-4.53(3H,m),4.23-4.08(5H,m),3.89(3H,s),3.82(3H,s),3.78-3.72(5H,m),3.57-3.51(3H,m),3.38-3.30(3H,m),2.76-2.71(1H,m),2.36-2.24(4H,m),1.78-1.42(6H,m),1.00-0.98(3H,m),0.87-0.84(3H,m),0.74-0.62(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1002(M+H)+.
上記工程10にて得られた化合物（4-10）（0.0571mmol）を、実施例2-3工程12と同様に反応させ、目的物（4-11）（0.0574g，99％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:9.16(1H,s),7.93-7.91(1H,m),7.55-7.52(1H,m),7.50-7.47(3H,m),7.35-7.32(2H,m),7.21(1H,s),7.13-7.11(2H,m),6.90-6.87(2H,m),6.40(1H,s),6.08(1H,s),5.90-5.87(1H,m),5.37-5.34(1H,m),4.73-4.53(3H,m),4.23-4.08(5H,m),3.89(3H,s),3.82(3H,s),3.78-3.72(5H,m),3.57-3.51(3H,m),3.38-3.30(3H,m),2.76-2.71(1H,m),2.36-2.24(4H,m),1.78-1.42(6H,m),1.00-0.98(3H,m),0.87-0.84(3H,m),0.74-0.62(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1002(M+H)+.
【0283】
工程12：N-［4-（11，12-ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン-5（6H）-イル）-4-オキソブタノイル］グリシルグリシル-L-バリル-N-［4-（｛［（11’S,11’aS）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-（3-｛［（11aS）-7-メトキシ-2-（4-メトキシフェニル）-5-オキソ-5，10，11，11a-テトラヒドロ-1H-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン-8-イル］オキシ｝プロポキシ）-5’-オキソ-11’，11’a-ジヒドロ-1’H，3’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］-L-アラニンアミド（4-12）
上記工程11にて得られた化合物（4-11）（0.189g，0.189mmol）と実施例2-2工程1で得られた化合物（2-2）（0.087g、0.207mmol）を、実施例2-3工程13と同様に反応させ、目的物（4-12）（0.169g，64％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1402（M＋H）＋.
上記工程11にて得られた化合物（4-11）（0.189g，0.189mmol）と実施例2-2工程1で得られた化合物（2-2）（0.087g、0.207mmol）を、実施例2-3工程13と同様に反応させ、目的物（4-12）（0.169g，64％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1402（M＋H）＋.
【0284】
［実施例2-5：薬物リンカー3］
【化66】
【0285】
工程1：ジメチル（6S，6’S）-5，5’-｛1，5-ペンタンジイルビス［オキシ（5-メトキシ-2-ニトロベンゼン-4，1-ジイル）カルボニル］｝ビス（5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-6-カルボキシレート）（5-2）
4，4’-［1，5-ペンタンジイルビス（オキシ）］ビス（5-メトキシ-2-ニトロ安息香酸）（5-1）（5.41g，10.9mmol，Journal of Medicinal Chemistry 2004，47，1161）のジクロロメタン（50mL）溶液に、0℃にて塩化オキサリル（5.63mL，65.7mmol）を加え、N，N-ジメチルホルムアミド（0.0844mL，1.09mmol）を滴下した。反応溶液を室温まで昇温し、2時間撹拌した。減圧留去して得られた残渣をジクロロメタン（100mL）に溶解し、メチル（6S）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-6-カルボキシレート塩酸塩（4.28g，24.1mmol，Tetrahedron Letters 2012. 53. 3847）とトリエチルアミン（6.07mL，43.8mmol）のジクロロメタン溶液（100mL）に窒素雰囲気下、-40℃で滴下した。反応溶液を0℃に昇温して2時間撹拌した。反応混合物に1規定塩酸（100mL）を加え、有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、目的物（5-2）（8.40g、定量的）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:769(M+H)+.
4，4’-［1，5-ペンタンジイルビス（オキシ）］ビス（5-メトキシ-2-ニトロ安息香酸）（5-1）（5.41g，10.9mmol，Journal of Medicinal Chemistry 2004，47，1161）のジクロロメタン（50mL）溶液に、0℃にて塩化オキサリル（5.63mL，65.7mmol）を加え、N，N-ジメチルホルムアミド（0.0844mL，1.09mmol）を滴下した。反応溶液を室温まで昇温し、2時間撹拌した。減圧留去して得られた残渣をジクロロメタン（100mL）に溶解し、メチル（6S）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-6-カルボキシレート塩酸塩（4.28g，24.1mmol，Tetrahedron Letters 2012. 53. 3847）とトリエチルアミン（6.07mL，43.8mmol）のジクロロメタン溶液（100mL）に窒素雰囲気下、-40℃で滴下した。反応溶液を0℃に昇温して2時間撹拌した。反応混合物に1規定塩酸（100mL）を加え、有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、目的物（5-2）（8.40g、定量的）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:769(M+H)+.
【0286】
工程2：｛1，5-ペンタンジイルビス［オキシ（5-メトキシ-2-ニトロベンゼン-4，1-ジイル）］｝ビス｛［（6S）-6-（ヒドロキシメチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル］メタノン｝（5-3）
上記工程1にて得られた化合物（5-2）（8.40g，10.9mmol）のテトラヒドロフラン（100mL）溶液に、水素化ほう素リチウム（714mg，32.8mmol）を加え、0℃にて30分撹拌し、室温に昇温して1時間撹拌した。0℃にて1規定塩酸を加えた後、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧下にて溶媒留去して、目的物（5-3）（7.70g，99％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:713(M+H)+.
上記工程1にて得られた化合物（5-2）（8.40g，10.9mmol）のテトラヒドロフラン（100mL）溶液に、水素化ほう素リチウム（714mg，32.8mmol）を加え、0℃にて30分撹拌し、室温に昇温して1時間撹拌した。0℃にて1規定塩酸を加えた後、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧下にて溶媒留去して、目的物（5-3）（7.70g，99％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:713(M+H)+.
【0287】
工程3：ペンタン-1，5-ジイルビス［オキシ（5-メトキシ-2-ニトロベンゼン-4，1-ジイル）カルボニル（6S）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-5，6-ジイルメタンジイル］ジアゼテート（5-4）
上記工程2にて得られた化合物（5-3）（7.70g、10.8mmol）をピリジン（20mL）及び無水酢酸（10mL，105.9mmol）に溶解して、室温にて撹拌した。減圧留去して、目的物（5-4）（8.38g，97％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:797(M+H)+.
上記工程2にて得られた化合物（5-3）（7.70g、10.8mmol）をピリジン（20mL）及び無水酢酸（10mL，105.9mmol）に溶解して、室温にて撹拌した。減圧留去して、目的物（5-4）（8.38g，97％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:797(M+H)+.
【0288】
工程4：1，5-ペンタンジイルビス［オキシ（2-アミノ-5-メトキシベンゼン-4，1-ジイル）カルボニル（6S）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-5，6-ジイルメタンジイル］ジアセテート（5-5）
上記工程3にて得られた化合物（5-4）（8.28g，10.4mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（100mL）溶液に、5％パラジウム炭素（54％水分、1.00g）を加えた後、反応溶液を水素雰囲気下、室温にて6時間激しく撹拌した。セライトろ過した後、ろ液を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝100：0（v/v）～90：10（v/v）］にて精製し、目的物（5-5）（5.05g，66％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:737(M+H)+.
上記工程3にて得られた化合物（5-4）（8.28g，10.4mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド（100mL）溶液に、5％パラジウム炭素（54％水分、1.00g）を加えた後、反応溶液を水素雰囲気下、室温にて6時間激しく撹拌した。セライトろ過した後、ろ液を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝100：0（v/v）～90：10（v/v）］にて精製し、目的物（5-5）（5.05g，66％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:737(M+H)+.
【0289】
工程5:{(6S)-5-[4-({5-[4-({（6S）-6-［（アセチルオキシ）メチル］-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル｝カルボニル）-5-アミノ-2-メトキシフェノキシ］ペンチル｝オキシ）-5-メトキシ-2-｛［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］アミノ｝ベンゾイル］-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-6-イル｝メチル アセテート （モノアリルオキシカルボニル体）（5-6）
上記工程4にて得られた化合物（5-5）（5.05g，6.85mmol）のジクロロメタン（100mL）溶液に、ピリジン（1.10mL，13.7mmol）を加え、窒素雰囲気下、-78℃にてクロロギ酸アリル（0.725mL，6.85mmol）を加え、2時間撹拌した。減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝70：30（v/v）～100：0（v/v）、クロロホルム：メタノール＝100：0（v/v）～90：10（v/v）］にて精製し、目的物であるモノアリルオキシカルボニル体（5-6）（2.63g，47％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:821(M+H)+.
上記工程4にて得られた化合物（5-5）（5.05g，6.85mmol）のジクロロメタン（100mL）溶液に、ピリジン（1.10mL，13.7mmol）を加え、窒素雰囲気下、-78℃にてクロロギ酸アリル（0.725mL，6.85mmol）を加え、2時間撹拌した。減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝70：30（v/v）～100：0（v/v）、クロロホルム：メタノール＝100：0（v/v）～90：10（v/v）］にて精製し、目的物であるモノアリルオキシカルボニル体（5-6）（2.63g，47％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:821(M+H)+.
【0290】
工程6：N-［（2-プロペン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［2-（｛（6S）-6-［（アセチルオキシ）メチル］-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル｝カルボニル）-5-（｛5-［4-（｛（6S）-6-［（アセチルオキシ）メチル］-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル｝カルボニル）-2-メトキシ-5-｛［（2-プロペン-1-イルオキシ）カルボニル］アミノ｝フェノキシ］ペンチル｝オキシ）-4-メトキシフェニル］カルバモイル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（5-7）
上記工程5で得られたモノアリルオキシカルボニル体（5-6）（2.00g，2.44mmol）とN-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-［4-（ヒドロキシメチル）フェニル］-L-アラニンアミド（1.10g，2.92mmol，WO2011130598）を、実施例2-1工程6と同様に反応させ、目的物（5-7）（2.64g，89％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1224(M+H)+.
上記工程5で得られたモノアリルオキシカルボニル体（5-6）（2.00g，2.44mmol）とN-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-［4-（ヒドロキシメチル）フェニル］-L-アラニンアミド（1.10g，2.92mmol，WO2011130598）を、実施例2-1工程6と同様に反応させ、目的物（5-7）（2.64g，89％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1224(M+H)+.
【0291】
工程7：N-［（2-プロペン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-［4-（｛［（2-｛［（6S）-6-（ヒドロキシメチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル］カルボニル｝-5-｛［5-（4-｛［（6S）-6-（ヒドロキシメチル）-5-アザスピロ［2.4］ヘプト-5-イル］カルボニル｝-2-メトキシ-5-｛［（2-プロペン-1-イルオキシ）カルボニル］アミノ｝フェノキシ）ペンチル］オキシ｝-4-メトキシフェニル）カルバモイル］オキシ｝メチル）フェニル］-L-アラニンアミド（5-8）
上記工程6にて得られた化合物（5-7）（2.64g，2.16mmol）のメタノール（10mL）溶液に、炭酸カリウム（1.49g，10.8mmol）を加え、室温で3時間撹拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液（100mL）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧留去して、目的物（5-8）（2.21g，90％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1140(M+H)+.
上記工程6にて得られた化合物（5-7）（2.64g，2.16mmol）のメタノール（10mL）溶液に、炭酸カリウム（1.49g，10.8mmol）を加え、室温で3時間撹拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液（100mL）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧留去して、目的物（5-8）（2.21g，90％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1140(M+H)+.
【0292】
工程8：N-［（2-プロペン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-8’-｛［5-（｛（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-5’-オキソ-10’-［（2-プロペン-1-イルオキシ）カルボニル］-5’，10’，11’，11a’-テトラヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-8’-イル｝オキシ）ペンチル］オキシ｝-7’-メトキシ-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（5-9）
上記工程7にて得られた化合物（5-8）（2.03g，1.78mmol）のジクロロメタン（50mL）溶液に、デスマーチンペルヨージナン（1.59g，3.74mmol）を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（100mL）を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝100：0（v/v）～90：10（v/v）］にて精製し、目的物（5-9）（2.05g，定量的）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1136(M+H)+.
上記工程7にて得られた化合物（5-8）（2.03g，1.78mmol）のジクロロメタン（50mL）溶液に、デスマーチンペルヨージナン（1.59g，3.74mmol）を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（100mL）を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝100：0（v/v）～90：10（v/v）］にて精製し、目的物（5-9）（2.05g，定量的）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1136(M+H)+.
【0293】
工程9：L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-［（5-｛［（11a’S）-7’-メトキシ-5’-オキソ-5’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-8’-イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（5-10）
上記工程8にて得られた化合物（5-9）（2.05g，1.80mmol）を、実施例2-3工程12と同様に反応させ、目的物（5-10）（1.02g，60％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:950(M+H)+.
上記工程8にて得られた化合物（5-9）（2.05g，1.80mmol）を、実施例2-3工程12と同様に反応させ、目的物（5-10）（1.02g，60％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:950(M+H)+.
【0294】
工程10：N-［4-（11，12-ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン-5（6H）-イル）-4-オキソブタノイル］グリシルグリシル-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-［（5-｛［（11a’S）-7’-メトキシ-5’-オキソ-5’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-8’-イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（5-11）
上記工程9にて得られた化合物（5-10）（0.710g，0.747mmol）と実施例2-2工程1にて得られた化合物（2-2）（0.313g、0.747mmol）をジクロロメタン（1.5mL）とメタノール（0.1mL）の混合溶媒に溶解した。4-（4，6-ジメトキシ-1，3，5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（0.264g，0.897mmol）を加え、室温で1時間撹拌した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝100：0（v/v）～80：20（v/v）］にて精製し目的物（5-11）（0.671g，66％）を得た。
1H-NMR(DMSO-D6)δ:9.91(1H,s),8.32(1H,s),8.23-7.91(3H,m),7.81-7.19(14H,m),7.04(1H,m),6.80-6.62(3H,m),5.77-5.75(1H,m),5.20(1H,m),5.01(1H,m),4.79(1H,m),4.46-4.35(1H,m),4.04(4H,m),3.86-3.38(18H,m),3.22-3.15(2H,m),2.67-2.63(1H,m),2.46-2.23(3H,m),2.09-1.91(2H,m),1.80-1.78(5H,m),1.57(3H,m),1.27(3H,s),1.11-1.04(1H,m),0.87-0.79(6H,m),0.63-0.55(6H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1351(M+H)+.
上記工程9にて得られた化合物（5-10）（0.710g，0.747mmol）と実施例2-2工程1にて得られた化合物（2-2）（0.313g、0.747mmol）をジクロロメタン（1.5mL）とメタノール（0.1mL）の混合溶媒に溶解した。4-（4，6-ジメトキシ-1，3，5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（0.264g，0.897mmol）を加え、室温で1時間撹拌した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝100：0（v/v）～80：20（v/v）］にて精製し目的物（5-11）（0.671g，66％）を得た。
1H-NMR(DMSO-D6)δ:9.91(1H,s),8.32(1H,s),8.23-7.91(3H,m),7.81-7.19(14H,m),7.04(1H,m),6.80-6.62(3H,m),5.77-5.75(1H,m),5.20(1H,m),5.01(1H,m),4.79(1H,m),4.46-4.35(1H,m),4.04(4H,m),3.86-3.38(18H,m),3.22-3.15(2H,m),2.67-2.63(1H,m),2.46-2.23(3H,m),2.09-1.91(2H,m),1.80-1.78(5H,m),1.57(3H,m),1.27(3H,s),1.11-1.04(1H,m),0.87-0.79(6H,m),0.63-0.55(6H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1351(M+H)+.
【0295】
［実施例2-6：薬物リンカー4］
【化67】
【0296】
工程1：メチル（6S）-5-［4-（ベンジルオキシ）-5-メトキシ-2-ニトロベンゾイル］-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-6-カルボキシレート（6-2）
4-（ベンジルオキシ）-5-メトキシ-2-ニトロ安息香酸（6-1）（6.07g，20.0mmol，Tetrahedron 1995，51，5617）、N，N-ジメチルホルムアミド（1.08mL，13.9mmol）のジクロロメタン（100mL）溶液に、氷冷下にて塩化オキサリル（3.43mL，40.0mmol）を5分間かけて滴下した。室温にて反応溶液を5時間撹拌した後、減圧留去し、得られた残渣をジクロロメタン（20mL）に溶解させ、減圧留去した。この操作を3回繰り返した後に、残渣をジクロロメタン（5mL）に懸濁させ、これに過剰のジエチルエーテルとヘキサンを加え、ろ過し、減圧下に乾燥させることにより粗酸クロリドを得た。得られた酸クロリドをジクロロメタンに溶解させ、-40℃（ドライアイス-アセトニトリル浴）に冷却し、メチル（6S）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-6-カルボキシレート塩酸塩（4.22g，22.0mmol，Tetrahedron Letters 2012.53.3847）、トリエチルアミン（3.36mL，24.2mmol）を徐々に加えた。反応混合物を一晩かけて室温にまで昇温した。反応混合物に1規定塩酸を加え、反応混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層を水，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0～50：50］にて精製し、目的物（6-2）（6.55g，80％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:441(M+H)+
4-（ベンジルオキシ）-5-メトキシ-2-ニトロ安息香酸（6-1）（6.07g，20.0mmol，Tetrahedron 1995，51，5617）、N，N-ジメチルホルムアミド（1.08mL，13.9mmol）のジクロロメタン（100mL）溶液に、氷冷下にて塩化オキサリル（3.43mL，40.0mmol）を5分間かけて滴下した。室温にて反応溶液を5時間撹拌した後、減圧留去し、得られた残渣をジクロロメタン（20mL）に溶解させ、減圧留去した。この操作を3回繰り返した後に、残渣をジクロロメタン（5mL）に懸濁させ、これに過剰のジエチルエーテルとヘキサンを加え、ろ過し、減圧下に乾燥させることにより粗酸クロリドを得た。得られた酸クロリドをジクロロメタンに溶解させ、-40℃（ドライアイス-アセトニトリル浴）に冷却し、メチル（6S）-5-アザスピロ［2.4］ヘプタン-6-カルボキシレート塩酸塩（4.22g，22.0mmol，Tetrahedron Letters 2012.53.3847）、トリエチルアミン（3.36mL，24.2mmol）を徐々に加えた。反応混合物を一晩かけて室温にまで昇温した。反応混合物に1規定塩酸を加え、反応混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層を水，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0～50：50］にて精製し、目的物（6-2）（6.55g，80％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:441(M+H)+
【0297】
工程2：（11a’S）-8’-（ベンジルオキシ）-7’-メトキシ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-5’，11’（10’H，11a’H）-ジオン（6-3）
上記工程1にて得られた化合物（6-2）（6.55g，16.0mmol）のエタノール（150mL），テトラヒドロフラン（150mL）溶液に窒素雰囲気下、ラネーニッケル（7.00g）を加えた。反応混合物にヒドラジン一水和物（7mL）を加え、50℃まで徐々に昇温した。50℃にて2時間撹拌した後にラネ-ニッケル（3.00g）、ヒドラジン一水和物（3mL）を加え、1時間撹拌した。反応混合物にTHF（100mL）を加えて、セライトろ過した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0～25：75］にて精製し、目的物（6-3）（4.42g，73％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:379(M+H)+
上記工程1にて得られた化合物（6-2）（6.55g，16.0mmol）のエタノール（150mL），テトラヒドロフラン（150mL）溶液に窒素雰囲気下、ラネーニッケル（7.00g）を加えた。反応混合物にヒドラジン一水和物（7mL）を加え、50℃まで徐々に昇温した。50℃にて2時間撹拌した後にラネ-ニッケル（3.00g）、ヒドラジン一水和物（3mL）を加え、1時間撹拌した。反応混合物にTHF（100mL）を加えて、セライトろ過した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0～25：75］にて精製し、目的物（6-3）（4.42g，73％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:379(M+H)+
【0298】
工程3：（11a’S）-8’-（ベンジルオキシ）-7’-メトキシ-10’-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-5’，11’（10’H，11a’H）-ジオン（6-4）
上記工程2にて得られた化合物（6-3）（10.0g，26.4mmol）のテトラヒドロフラン（150mL）溶液に-40℃にて、2.6mol/Lのノルマルブチルリチウムノルマルヘキサン溶液（12.0mL，31.8mmol）をゆっくりと滴下した。反応溶液を-40℃にて15分間撹拌し後、2-（クロロメトキシ）エチルトリメチルシラン（5.57mL，31.7mmol）をゆっくりと滴下した。反応溶液を室温にて3時間撹拌した後、水を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0～30：70］にて精製し、目的物（6-4）（11.8g，88％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:509(M+H)+
上記工程2にて得られた化合物（6-3）（10.0g，26.4mmol）のテトラヒドロフラン（150mL）溶液に-40℃にて、2.6mol/Lのノルマルブチルリチウムノルマルヘキサン溶液（12.0mL，31.8mmol）をゆっくりと滴下した。反応溶液を-40℃にて15分間撹拌し後、2-（クロロメトキシ）エチルトリメチルシラン（5.57mL，31.7mmol）をゆっくりと滴下した。反応溶液を室温にて3時間撹拌した後、水を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0～30：70］にて精製し、目的物（6-4）（11.8g，88％）を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:509(M+H)+
【0299】
工程4：（11a’S）-8’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-10’-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-5’，11’（10’H，11a’H）-ジオン（6-5）
上記工程3にて得られた化合物（6-4）（18.7g，36.8mmol）のテロラヒドロフラン（50mL）、エタノール（100mL）溶液に、窒素雰囲気下において5％のパラジウム炭素触媒（5.00g）を加えた。直ちに窒素風船を水素風船に付け替え、反応混合物を水素雰囲気下にて6時間撹拌した。反応混合物にクロロホルムを加えて希釈し、セライトろ過をした後、濾液を減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0～25：75］にて精製し、目的物（6-5）（15.1g，98％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：419（M＋H）＋
上記工程3にて得られた化合物（6-4）（18.7g，36.8mmol）のテロラヒドロフラン（50mL）、エタノール（100mL）溶液に、窒素雰囲気下において5％のパラジウム炭素触媒（5.00g）を加えた。直ちに窒素風船を水素風船に付け替え、反応混合物を水素雰囲気下にて6時間撹拌した。反応混合物にクロロホルムを加えて希釈し、セライトろ過をした後、濾液を減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン：酢酸エチル＝100：0～25：75］にて精製し、目的物（6-5）（15.1g，98％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：419（M＋H）＋
【0300】
工程5：（11a’S）-8’-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7’-メトキシ-10’-｛［2-（トリメチルシリル）エトキシ］メチル｝-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-5’，11’（10’H，11a’H）-ジオン（6-6）
上記工程4にて得られた化合物（6-5）（2.77g，6.62mmol）を、実施例2-3工程2と同様に反応させ、目的物（6-6）（3.31g，88％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.36(1H,s),7.25(1H,s),5.55(1H,m),4.65(1H,m),4.24-4.23(1H,m),4.11-4.03(2H,m),3.93(3H,s),3.85-3.78(1H,m),3.72-3.69(2H,m),3.46-3.39(3H,m),2.47-2.44(1H,m),2.25-2.22(1H,m),1.95-1.91(4H,m),1.67-1.59(1H,m),1.03-0.95(2H,m),0.90-0.85(1H,m),0.70-0.66(4H,m),0.05(9H,s).
上記工程4にて得られた化合物（6-5）（2.77g，6.62mmol）を、実施例2-3工程2と同様に反応させ、目的物（6-6）（3.31g，88％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.36(1H,s),7.25(1H,s),5.55(1H,m),4.65(1H,m),4.24-4.23(1H,m),4.11-4.03(2H,m),3.93(3H,s),3.85-3.78(1H,m),3.72-3.69(2H,m),3.46-3.39(3H,m),2.47-2.44(1H,m),2.25-2.22(1H,m),1.95-1.91(4H,m),1.67-1.59(1H,m),1.03-0.95(2H,m),0.90-0.85(1H,m),0.70-0.66(4H,m),0.05(9H,s).
【0301】
工程6：（11a’S）-8’-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7’-メトキシ-1’，11a’-ジヒドロ-5’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-5’-オン（6-7）
上記工程5にて得られた化合物（6-6）（3.31g，5.83mmol）を、実施例2-3工程7と同様に反応させ、目的物（6-7）（1.11g，45％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.81(1H,m),7.53(1H,s),6.82(1H,s),4.13-4.06(2H,m),3.97(3H,s),3.88-3.83(1H,m),3.69(1H,m),3.52-3.39(3H,m),2.55-2.52(1H,m),2.06-1.89(5H,m),1.67-1.63(2H,m),0.76-0.72(4H,m).
上記工程5にて得られた化合物（6-6）（3.31g，5.83mmol）を、実施例2-3工程7と同様に反応させ、目的物（6-7）（1.11g，45％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.81(1H,m),7.53(1H,s),6.82(1H,s),4.13-4.06(2H,m),3.97(3H,s),3.88-3.83(1H,m),3.69(1H,m),3.52-3.39(3H,m),2.55-2.52(1H,m),2.06-1.89(5H,m),1.67-1.63(2H,m),0.76-0.72(4H,m).
【0302】
工程7：（11a’S）-8’-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7’-メトキシ-1’，10’，11’，11a’-テトラヒドロ-5’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-5’-オン（6-8）
上記工程6にて得られた化合物（6-7）（2.56g，6.08mmol）を、実施例2-3工程8と同様に反応させ、目的物（6-8）（1.15g，45％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.60(1H,s),6.07(1H,s),4.11-4.04(1H,m),3.99(2H,m),3.87-3.84(1H,m),3.85(3H,s),3.73(1H,m),3.58-3.53(2H,m),3.47-3.42(3H,m),2.03-1.78(6H,m),1.65-1.63(2H,m),0.77-0.56(4H,m).
上記工程6にて得られた化合物（6-7）（2.56g，6.08mmol）を、実施例2-3工程8と同様に反応させ、目的物（6-8）（1.15g，45％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.60(1H,s),6.07(1H,s),4.11-4.04(1H,m),3.99(2H,m),3.87-3.84(1H,m),3.85(3H,s),3.73(1H,m),3.58-3.53(2H,m),3.47-3.42(3H,m),2.03-1.78(6H,m),1.65-1.63(2H,m),0.77-0.56(4H,m).
【0303】
工程8：プロプ-2-エン-1-イル （11a’S）-8’-［（5-ブロモペンチル）オキシ］-7’-メトキシ-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-カルボキシレート（6-9）
上記工程7にて得られた化合物（6-8）（1.15g，2.72mmol）を、実施例2-3工程9と同様に反応させ、目的物（6-9）（1.14g，82％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.23(1H,s),6.69(1H,s),5.79(1H,s),5.13-5.10(2H,m),4.68-4.66(1H,m),4.48-4.45(2H,m),4.01(2H,m),3.92(3H,s),3.76(1H,m),3.54-3.37(3H,m),2.39(1H,m),1.95-1.90(4H,m),1.68-1.61(3H,m),1.44(1H,m),0.75-0.66(4H,m).
上記工程7にて得られた化合物（6-8）（1.15g，2.72mmol）を、実施例2-3工程9と同様に反応させ、目的物（6-9）（1.14g，82％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:7.23(1H,s),6.69(1H,s),5.79(1H,s),5.13-5.10(2H,m),4.68-4.66(1H,m),4.48-4.45(2H,m),4.01(2H,m),3.92(3H,s),3.76(1H,m),3.54-3.37(3H,m),2.39(1H,m),1.95-1.90(4H,m),1.68-1.61(3H,m),1.44(1H,m),0.75-0.66(4H,m).
【0304】
工程9：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-｛［tert-ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝-7’-メトキシ-8’-｛［5-（｛（11a’S）-7’-メトキシ-5’-オキソ-10’-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-5’，10’，11’，11a’-テトラヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-8’-イル｝オキシ）ペンチル］オキシ｝-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（6-10）
上記工程8にて得られた化合物(6-9)（0.374g，0.737mmol）と実施例2-1工程10にて得られた化合物（1-11）（0.452g、0.56mmol）を、実施例2-3工程10と同様に反応させ、目的物（6-10）（0.589g，65％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1234（M＋H）＋
上記工程8にて得られた化合物(6-9)（0.374g，0.737mmol）と実施例2-1工程10にて得られた化合物（1-11）（0.452g、0.56mmol）を、実施例2-3工程10と同様に反応させ、目的物（6-10）（0.589g，65％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1234（M＋H）＋
【0305】
工程10：N-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-｛［5-（｛（11a’S）-7’-メトキシ-5’-オキソ-10’-［（プロプ-2-エン-1-イルオキシ）カルボニル］-5’，10’，11’，11a’-テトラヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-8’-イル｝オキシ）ペンチル］オキシ｝-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（6-11）
上記工程9にて得られた化合物（6-10）（0.589g，0.477mmol）を、実施例2-3工程11と同様に反応させ、目的物（6-11）（0.382g，71％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.90(1H,s),7.55(2H,m),7.25-7.21(2H,m),6.74(2H,m),6.38(1H,s),5.90-5.87(5H,m),5.33-5.09(8H,m),4.66-4.60(8H,m),3.98-3.91(10H,m),3.77-3.30(12H,m),2.42-2.36(2H,m),1.77-1.39(6H,m),0.91-0.70(14H,m).
上記工程9にて得られた化合物（6-10）（0.589g，0.477mmol）を、実施例2-3工程11と同様に反応させ、目的物（6-11）（0.382g，71％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ:8.90(1H,s),7.55(2H,m),7.25-7.21(2H,m),6.74(2H,m),6.38(1H,s),5.90-5.87(5H,m),5.33-5.09(8H,m),4.66-4.60(8H,m),3.98-3.91(10H,m),3.77-3.30(12H,m),2.42-2.36(2H,m),1.77-1.39(6H,m),0.91-0.70(14H,m).
【0306】
工程11：L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-［（5-｛［（11a’S）-7’-メトキシ-5’-オキソ-5’，10’，11’，11a’-テトラヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-8’-イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（6-12）
上記工程10にて得られた化合物（6-11）（0.382g，0.341mmol）を、実施例2-3工程12と同様に反応させ、目的物（6-12）（0.200g，62％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：952（M＋H）＋
上記工程10にて得られた化合物（6-11）（0.382g，0.341mmol）を、実施例2-3工程12と同様に反応させ、目的物（6-12）（0.200g，62％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：952（M＋H）＋
【0307】
工程12：N-［4-（11，12-ジデヒドロジベンゾ［b，f］アゾシン-5（6H）-イル）-4-オキソブタノイル］グリシルグリシル-L-バリル-N-｛4-［（｛［（11’S,11a’S）-11’-ヒドロキシ-7’-メトキシ-8’-［（5-｛［（11a’S）-7’-メトキシ-5’-オキソ-5’，10’，11’，11a’-テトラヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-8’-イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］-5’-オキソ-11’，11a’-ジヒドロ-1’H-スピロ［シクロプロパン-1，2’-ピロロ［2，1-c］［1，4］ベンゾジアゼピン］-10’（5’H）-イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝-L-アラニンアミド（6-13）
上記工程11にて得られた化合物（6-12）（0.0560g，0.0588mmol）と実施例2-2工程1にて得られた化合物（2-2）（0.022g、0.053mmol）を、実施例2-3工程13と同様に反応させ、目的物（6-13）（0.0500g，63％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1354（M＋H）＋
上記工程11にて得られた化合物（6-12）（0.0560g，0.0588mmol）と実施例2-2工程1にて得られた化合物（2-2）（0.022g、0.053mmol）を、実施例2-3工程13と同様に反応させ、目的物（6-13）（0.0500g，63％）を得た。
MS（APCI、ESI）m/z：1354（M＋H）＋
【0308】
〔糖鎖ドナーの合成〕
実施例3：［N3-PEG（3）］-MSG1-Ox
実施例3：［N3-PEG（3）］-MSG1-Ox
【0309】
【化68】
【0310】
工程1：（MSG1-）Asn
市販品であるmonosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn、(株)糖鎖工学研究所製）(「(MSG-)Asn」と呼ぶ)(500mg)を以下の条件で逆相HPLC分離精製し、1st main peakとして溶出される（MSG1-）Asn（保持時間 15～19 min 付近）と2nd main peakとして溶出される（MSG2-）Asn（保持時間 21～26 min 付近）に分離した。0.1％ぎ酸水溶液を溶離液として使用し、装置にはELS-PDAトリガー分取システム（日本分光株式会社製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（10um、30Φx250mm、GLサイエンス社製）を使用し、流速を30mL/minとした。溶出中にUV検出（210nm）された最初のピ-クのピ-クを分取し、凍結乾燥して、目的物（238mg）を得た。
市販品であるmonosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn、(株)糖鎖工学研究所製）(「(MSG-)Asn」と呼ぶ)(500mg)を以下の条件で逆相HPLC分離精製し、1st main peakとして溶出される（MSG1-）Asn（保持時間 15～19 min 付近）と2nd main peakとして溶出される（MSG2-）Asn（保持時間 21～26 min 付近）に分離した。0.1％ぎ酸水溶液を溶離液として使用し、装置にはELS-PDAトリガー分取システム（日本分光株式会社製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（10um、30Φx250mm、GLサイエンス社製）を使用し、流速を30mL/minとした。溶出中にUV検出（210nm）された最初のピ-クのピ-クを分取し、凍結乾燥して、目的物（238mg）を得た。
【0311】
工程2：MSG1
上記工程1で得られた化合物（229mg）を200mMりん酸緩衝溶液（pH6.25）（1145μL）に溶解させ、EndoM（東京化成工業（株）製、1U/mL））水溶液（100μL）を加え、35℃で6日間インキュベートした。反応終了後、反応液をVIVASPIN 15R（Hydrosart膜、30K，6，000xG）を用いて限外ろ過し、得られた通過液を逆相HPLC分離精製した。0.1％トリフルオロ酢酸水溶液を溶離液として使用し、装置にはELS-PDA トリガー分取システム（日本分光株式会社製）、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス社製）を使用した。溶出中にUV検出（210nm）された目的物のピークを分取し、凍結乾燥し、目的物（117mg）を得た。
上記工程1で得られた化合物（229mg）を200mMりん酸緩衝溶液（pH6.25）（1145μL）に溶解させ、EndoM（東京化成工業（株）製、1U/mL））水溶液（100μL）を加え、35℃で6日間インキュベートした。反応終了後、反応液をVIVASPIN 15R（Hydrosart膜、30K，6，000xG）を用いて限外ろ過し、得られた通過液を逆相HPLC分離精製した。0.1％トリフルオロ酢酸水溶液を溶離液として使用し、装置にはELS-PDA トリガー分取システム（日本分光株式会社製）、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス社製）を使用した。溶出中にUV検出（210nm）された目的物のピークを分取し、凍結乾燥し、目的物（117mg）を得た。
【0312】
工程3：［N3-PEG（3）］-MSG1
5mlサンプリングチューブ（（株）イナ・オプティカ）に、11-アジド-3，6，9-トリオキサウンデカン-1-アミン（0.108mL，0.541mmol）と上記工程2で得られたMSG1（117mg，0.068mmol）の水溶液（1.2mL）を加え、1時間撹拌した後に、凍結乾燥した。凍結乾燥後の5mlサンプリングチューブに、O-（7-アザベンゾトリアゾール-1-イル）-N，N，N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（103mg，0.27mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド溶液（1.2mL）とジイソプロピルエチルアミン（0.046mL，0.27mmol）を加え、37℃で3時間撹拌した。反応終了後、あらかじめジエチルエーテル（20ml）を加えた遠沈管（50ml）に反応液を移した。小型遠心機（日立工機、CF16RX）を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。さらにジエチルエーテル（10ml）を加えて、遠心分離操作後、デカンテーションを行った。続いて、アセトニトリル（10mL）を加え、遠心分離後、デカンテーションする操作を二回繰り返した後、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。得られた固形物を上記工程2と同様の条件にて逆相HPLC精製を行い、目的物（94.2mg）を得た。
5mlサンプリングチューブ（（株）イナ・オプティカ）に、11-アジド-3，6，9-トリオキサウンデカン-1-アミン（0.108mL，0.541mmol）と上記工程2で得られたMSG1（117mg，0.068mmol）の水溶液（1.2mL）を加え、1時間撹拌した後に、凍結乾燥した。凍結乾燥後の5mlサンプリングチューブに、O-（7-アザベンゾトリアゾール-1-イル）-N，N，N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（103mg，0.27mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド溶液（1.2mL）とジイソプロピルエチルアミン（0.046mL，0.27mmol）を加え、37℃で3時間撹拌した。反応終了後、あらかじめジエチルエーテル（20ml）を加えた遠沈管（50ml）に反応液を移した。小型遠心機（日立工機、CF16RX）を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。さらにジエチルエーテル（10ml）を加えて、遠心分離操作後、デカンテーションを行った。続いて、アセトニトリル（10mL）を加え、遠心分離後、デカンテーションする操作を二回繰り返した後、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。得られた固形物を上記工程2と同様の条件にて逆相HPLC精製を行い、目的物（94.2mg）を得た。
【0313】
工程4：［N3-PEG（3）］-MSG1-Ox
5mLサンプリングチューブ（（株）イナ・オプティカ製）に、上記工程3で合成した化合物（100mg）、2-クロロ-1，3-ジメチル-1H-ベンズイミダゾール-3-イウム-クロライド（伏見製薬所製、56mg，0.257mmol）の水溶液（520μl）を加えた。氷冷後の反応液にりん酸三カリウム（165mg，0.78mmol）の水溶液（520μl）を加え、氷冷下で3時間撹拌した。得られた反応液を、アミコンウルトラ（ウルトラセル30K、Merck Millipore製）を用いて限外ろ過し、固形物を除去した。その通過液を、ゲルろ過クロマトグラフィーにて精製した。装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはHiPrep 26/10 Desalting（GEヘルスケア製）を使用し、移動相に0.03％-NH3水溶液を使用し、流速を10mL/min、分画容量を10mLとした。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、1N水酸化ナトリウム水溶液（104μl，0.104mmol）を加えて凍結乾燥し、目的物（84mg）を得た。
5mLサンプリングチューブ（（株）イナ・オプティカ製）に、上記工程3で合成した化合物（100mg）、2-クロロ-1，3-ジメチル-1H-ベンズイミダゾール-3-イウム-クロライド（伏見製薬所製、56mg，0.257mmol）の水溶液（520μl）を加えた。氷冷後の反応液にりん酸三カリウム（165mg，0.78mmol）の水溶液（520μl）を加え、氷冷下で3時間撹拌した。得られた反応液を、アミコンウルトラ（ウルトラセル30K、Merck Millipore製）を用いて限外ろ過し、固形物を除去した。その通過液を、ゲルろ過クロマトグラフィーにて精製した。装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはHiPrep 26/10 Desalting（GEヘルスケア製）を使用し、移動相に0.03％-NH3水溶液を使用し、流速を10mL/min、分画容量を10mLとした。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、1N水酸化ナトリウム水溶液（104μl，0.104mmol）を加えて凍結乾燥し、目的物（84mg）を得た。
【0314】
実施例4：［N3-PEG（3）］-MSG-Ox
【化69】
【0315】
工程1：（MSG-）Asnの調製
市販品である1S2G/1G2S-10NC-Asn-Fmoc（（株）糖鎖工学研究所製）（「Fmoc-（MSG-）Asn」と呼ぶ）（1000mg）をエタノール/水（1/1）（10mL）に溶解させ、1規定の水酸化ナトリウム水溶液（1．75mL，4当量）を加え、室温で3時間撹拌した。反応終了後、反応液をアミコンウルトラ（30K、ミリポア社製）を用いて限外ろ過し、固形物を除去し、得られた通過液に1N塩酸（832μl，1．9当量）加えた。高速濃縮装置V-10（Biotage社製）を用いて、溶媒を除去した。アセトニトリルを加えて、高速濃縮装置V-10（Biotage社製）を用いて、溶媒を除去した後に、逆相HPLC分離精製した。0.1％トリフルオロ酢酸水溶液と0．1％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。再び、純水に溶解させると、pH試験紙で酸性であることが確認されたので、18％アンモニア水（150μl）を加え、pH試験紙で塩基性になったことを確認し、再び凍結乾燥した。得られた目的物（840mg）をそのまま次の反応に用いた。
市販品である1S2G/1G2S-10NC-Asn-Fmoc（（株）糖鎖工学研究所製）（「Fmoc-（MSG-）Asn」と呼ぶ）（1000mg）をエタノール/水（1/1）（10mL）に溶解させ、1規定の水酸化ナトリウム水溶液（1．75mL，4当量）を加え、室温で3時間撹拌した。反応終了後、反応液をアミコンウルトラ（30K、ミリポア社製）を用いて限外ろ過し、固形物を除去し、得られた通過液に1N塩酸（832μl，1．9当量）加えた。高速濃縮装置V-10（Biotage社製）を用いて、溶媒を除去した。アセトニトリルを加えて、高速濃縮装置V-10（Biotage社製）を用いて、溶媒を除去した後に、逆相HPLC分離精製した。0.1％トリフルオロ酢酸水溶液と0．1％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。再び、純水に溶解させると、pH試験紙で酸性であることが確認されたので、18％アンモニア水（150μl）を加え、pH試験紙で塩基性になったことを確認し、再び凍結乾燥した。得られた目的物（840mg）をそのまま次の反応に用いた。
【0316】
工程2：MSGの合成
工程1にて得られた化合物（840mg）を200mMりん酸緩衝溶液（pH6．25）（6000μL）に溶解させ、EndoM（東京化成工業（株）製、1U/mL））水溶液（200μL）を加え、28℃で26時間インキュベートした。反応が完了していないため、EndoM（東京化成工業（株）製、1U/mL））水溶液（50μL）を加え、28℃で2時間インキュベートした後に、反応が完了するまで室温で放置した。反応終了後、反応液をアミコンウルトラ（30K、ミリポア社製）を用いて限外ろ過した。得られた通過液にトリフルオロ酢酸（80μl）加え、逆相HPLC分離精製した。0．1％トリフルオロ酢酸水溶液と0．1％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。残留トリフルオロ酢酸を除く目的で、再度純水に溶解させ、目的化合物（618mg）を無色固体として得た。
ESI-MS: Calcd for C66H110N4O49 : [M+H]+ 1743.62, Found 1743.63
工程1にて得られた化合物（840mg）を200mMりん酸緩衝溶液（pH6．25）（6000μL）に溶解させ、EndoM（東京化成工業（株）製、1U/mL））水溶液（200μL）を加え、28℃で26時間インキュベートした。反応が完了していないため、EndoM（東京化成工業（株）製、1U/mL））水溶液（50μL）を加え、28℃で2時間インキュベートした後に、反応が完了するまで室温で放置した。反応終了後、反応液をアミコンウルトラ（30K、ミリポア社製）を用いて限外ろ過した。得られた通過液にトリフルオロ酢酸（80μl）加え、逆相HPLC分離精製した。0．1％トリフルオロ酢酸水溶液と0．1％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。残留トリフルオロ酢酸を除く目的で、再度純水に溶解させ、目的化合物（618mg）を無色固体として得た。
ESI-MS: Calcd for C66H110N4O49 : [M+H]+ 1743.62, Found 1743.63
【0317】
工程3：［N3-PEG（3）］-MSGの合成
上記工程2にて得られた化合物（120mg）を用いて、実施例3工程3と同様の手法に従って、目的物（88．6mg）を得た。
ESI-MS: Calcd for C73H124N8O51 :[M+2H]2+ 965.37, Found 965.37
上記工程2にて得られた化合物（120mg）を用いて、実施例3工程3と同様の手法に従って、目的物（88．6mg）を得た。
ESI-MS: Calcd for C73H124N8O51 :[M+2H]2+ 965.37, Found 965.37
【0318】
工程4［N3-PEG（3）］-MSG-Oxの合成
上記工程3にて得られた合成した化合物（100mg）を用いて、実施例3工程4と同様の手法に従って、目的物（88mg）を得た。
上記工程3にて得られた合成した化合物（100mg）を用いて、実施例3工程4と同様の手法に従って、目的物（88mg）を得た。
【0319】
実施例5：［N3-PEG（3）］2-SG（10）-Ox
【化70】
【0320】
工程1：［N3-PEG（3）］2-SG（10）
5mlサンプリングチューブ（（株）イナ・オプティカ）に、11-アジド-3，6，9-トリオキサウンデカン-1-アミン（0.096mL，0．485mmol）、ジシアロオクタサッカリド（50mg，0．24mmol）の水溶液（0．5mL）を加え、1時間撹拌した後に、凍結乾燥した。凍結乾燥後の5mlサンプリングチューブに、O-（7-アザベンゾトリアゾール-1-イル）-N，N，N’，N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（92mg，0．24mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド溶液（0．6mL）とジイソプロピルエチルアミン（0.042mL，0．24mmol）を加え、37℃で4時間撹拌した。反応終了後、あらかじめジエチルエーテル（20ml）を加えた遠沈管（50ml）に反応液を移した。小型遠心機（日立工機、CF16RX）を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。ジエチルエーテル（20ml）を加えて、デカンテーションした。続いて、アセトニトリル（20mL）を加えて、デカンテーションした後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。得られた固形物を適量の0．2％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解させ、逆相HPLC分離精製した。0．1％トリフルオロ酢酸水溶液と0．1％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥して、目的物（42mg）を得た。
5mlサンプリングチューブ（（株）イナ・オプティカ）に、11-アジド-3，6，9-トリオキサウンデカン-1-アミン（0.096mL，0．485mmol）、ジシアロオクタサッカリド（50mg，0．24mmol）の水溶液（0．5mL）を加え、1時間撹拌した後に、凍結乾燥した。凍結乾燥後の5mlサンプリングチューブに、O-（7-アザベンゾトリアゾール-1-イル）-N，N，N’，N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（92mg，0．24mmol）のN，N-ジメチルホルムアミド溶液（0．6mL）とジイソプロピルエチルアミン（0.042mL，0．24mmol）を加え、37℃で4時間撹拌した。反応終了後、あらかじめジエチルエーテル（20ml）を加えた遠沈管（50ml）に反応液を移した。小型遠心機（日立工機、CF16RX）を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。ジエチルエーテル（20ml）を加えて、デカンテーションした。続いて、アセトニトリル（20mL）を加えて、デカンテーションした後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。得られた固形物を適量の0．2％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解させ、逆相HPLC分離精製した。0．1％トリフルオロ酢酸水溶液と0．1％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥して、目的物（42mg）を得た。
【0321】
工程2：［N3-PEG（3）］2-SG（10）-Ox
5mLサンプリングチューブ（（株）イナ・オプティカ製）に、上記工程1で合成した化合物（40mg）、2-クロロ-1，3-ジメチル-1H-ベンズイミダゾール-3-イウム-クロライド（伏見製薬所製、17．9mg，0．083mmol）の水溶液（200μl）を加えた。氷冷後の反応液にりん酸三カリウム（52．6mg，0．25mmol）の水溶液（200μl）を加え、氷冷下で2時間撹拌した。得られた反応液を、アミコンウルトラ（ウルトラセル30K、 Merck Millipore製）を用いて限外ろ過し、固形物を除去した。その通過液を、ゲルろ過クロマトグラフィーにて精製した。装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはHiPrep 26/10 Desalting（GEヘルスケア製）を使用し、移動相に0．03％－NH3水溶液を使用し、流速を10mL/min、分画容量を10mLとした。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、1N水酸化ナトリウム水溶液（33μl，0．033mmol）を加えて凍結乾燥し、目的物（34mg）を得た。
5mLサンプリングチューブ（（株）イナ・オプティカ製）に、上記工程1で合成した化合物（40mg）、2-クロロ-1，3-ジメチル-1H-ベンズイミダゾール-3-イウム-クロライド（伏見製薬所製、17．9mg，0．083mmol）の水溶液（200μl）を加えた。氷冷後の反応液にりん酸三カリウム（52．6mg，0．25mmol）の水溶液（200μl）を加え、氷冷下で2時間撹拌した。得られた反応液を、アミコンウルトラ（ウルトラセル30K、 Merck Millipore製）を用いて限外ろ過し、固形物を除去した。その通過液を、ゲルろ過クロマトグラフィーにて精製した。装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはHiPrep 26/10 Desalting（GEヘルスケア製）を使用し、移動相に0．03％－NH3水溶液を使用し、流速を10mL/min、分画容量を10mLとした。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、1N水酸化ナトリウム水溶液（33μl，0．033mmol）を加えて凍結乾燥し、目的物（34mg）を得た。
【0322】
〔糖鎖リモデリング抗体の調製〕
実施例6：Trastuzumab A1又はA2抗体- [MSG1-N3]2
実施例6：Trastuzumab A1又はA2抗体- [MSG1-N3]2
【0323】
【化71】
【0324】
工程1：（Fucα1，6）GlcNAc－Trastuzumab A1抗体の調製
実施例1-3で調製したTrastuzumab A1抗体溶液ca.22.3mg／mL（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（2.69mL）に、7.7mg／mL野生型EndoS溶液（PBS）を0.156mL加え、37℃で4時間インキュベートした。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション（BIO－RAD製）を用いて確認した。反応終了後、以下の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトカラムによる精製を行った。
（1）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA avant（GEヘルスケア製）
カラム：HiTrap rProtein A FF（5mL）（GEヘルスケア製）
流速：5mL／min（チャージ時は1.25mL／min）
上記で得た反応液を複数回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー（20mMりん酸緩衝液（pH6.0））を1.25mL／minで4CV（Column Volume）流し、更に5mL／minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液（20mMりん酸緩衝液（pH7.0）、0.5M塩化ナトリウム溶液）を15CV流した。溶出時は、溶出バッファー（ImmunoPure IgG Eution buffer、PIERCE製）を6CV流した。溶出液を1Mトリス緩衝液（pH9.0）で直ちに中和した。目的物を含むフラクションを共通操作Cを用いて、5mMりん酸緩衝液50mM－モルホリノエタンスルホン酸（MES）溶液（pH6.8）への緩衝液交換を行った。
（2）ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA avant（GE ヘルスケア製）
カラム：Bio-Scale Mini CHT Type Iカートリッジ（5mL）（BIO－RAD製）
流速：5mL／min（チャージ時は1．25mL／min）
上記（1）で得られた溶液をカラムの上部へ添加し、A液（5mMりん酸緩衝液50mM－モルホリノエタンスルホン酸（MES）溶液（pH6.8））を1．25mL／minで4CV流し、更に5mL／minで3CV流した。その後、A液とB液（5mMりん酸緩衝液50mM－モルホリノエタンスルホン酸（MES）溶液（pH6.8）、2M塩化ナトリウム溶液）を用いて、溶出した。溶出条件は、A液：B液＝100：0～0：100（15CV）である。さらに、洗浄溶液（500mMりん酸緩衝液（pH6.5））を5CV流した。
目的物を含むフラクションを共通操作Cを用いて緩衝液交換を行い、6.08mg／mLの（Fucα1，6）GlcNAc－TrastuzumabA1抗体溶液（50mMリン酸緩衝液（pH6．0））（6.10mL）を得た。
実施例1-3で調製したTrastuzumab A1抗体溶液ca.22.3mg／mL（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（2.69mL）に、7.7mg／mL野生型EndoS溶液（PBS）を0.156mL加え、37℃で4時間インキュベートした。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション（BIO－RAD製）を用いて確認した。反応終了後、以下の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトカラムによる精製を行った。
（1）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA avant（GEヘルスケア製）
カラム：HiTrap rProtein A FF（5mL）（GEヘルスケア製）
流速：5mL／min（チャージ時は1.25mL／min）
上記で得た反応液を複数回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー（20mMりん酸緩衝液（pH6.0））を1.25mL／minで4CV（Column Volume）流し、更に5mL／minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液（20mMりん酸緩衝液（pH7.0）、0.5M塩化ナトリウム溶液）を15CV流した。溶出時は、溶出バッファー（ImmunoPure IgG Eution buffer、PIERCE製）を6CV流した。溶出液を1Mトリス緩衝液（pH9.0）で直ちに中和した。目的物を含むフラクションを共通操作Cを用いて、5mMりん酸緩衝液50mM－モルホリノエタンスルホン酸（MES）溶液（pH6.8）への緩衝液交換を行った。
（2）ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA avant（GE ヘルスケア製）
カラム：Bio-Scale Mini CHT Type Iカートリッジ（5mL）（BIO－RAD製）
流速：5mL／min（チャージ時は1．25mL／min）
上記（1）で得られた溶液をカラムの上部へ添加し、A液（5mMりん酸緩衝液50mM－モルホリノエタンスルホン酸（MES）溶液（pH6.8））を1．25mL／minで4CV流し、更に5mL／minで3CV流した。その後、A液とB液（5mMりん酸緩衝液50mM－モルホリノエタンスルホン酸（MES）溶液（pH6.8）、2M塩化ナトリウム溶液）を用いて、溶出した。溶出条件は、A液：B液＝100：0～0：100（15CV）である。さらに、洗浄溶液（500mMりん酸緩衝液（pH6.5））を5CV流した。
目的物を含むフラクションを共通操作Cを用いて緩衝液交換を行い、6.08mg／mLの（Fucα1，6）GlcNAc－TrastuzumabA1抗体溶液（50mMリン酸緩衝液（pH6．0））（6.10mL）を得た。
【0325】
工程2：Trasutuzumab A1抗体- [MSG1-N3]2の調製
上記工程1にて得られた6.08mg／mL（Fucα1，6）GlcNAc－Trasutuzumab A1抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（6.10mL）に、実施例3工程4で合成した糖鎖（9.78mg）の50mMりん酸緩衝液（pH6.0）溶液（0.200mL）、5.80mg／mLのEndoS D233Q／Q303L溶液（PBS）（0.128mL）を加えて、30℃で3時間インキュベートした。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション（BIO－RAD製）を用いて確認した。反応終了後、上記工程1と同様にアフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製を行った後、目的物を含むフラクションを共通操作Cを用いてりん酸緩衝生理食塩水（pH6．0）へ緩衝液交換を行い、10.2mg／mLのTrasutuzumab A1抗体［MSG１－N3］2溶液（りん酸緩衝生理食塩水（pH6.0））（3.65mL）を得た。
Trastuzumab A2抗体（実施例1）を用いて、実施例6の工程1及び2と同様の操作を行うことによってTrasutuzumab A2抗体- [MSG1-N3]2を得た。
上記工程1にて得られた6.08mg／mL（Fucα1，6）GlcNAc－Trasutuzumab A1抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（6.10mL）に、実施例3工程4で合成した糖鎖（9.78mg）の50mMりん酸緩衝液（pH6.0）溶液（0.200mL）、5.80mg／mLのEndoS D233Q／Q303L溶液（PBS）（0.128mL）を加えて、30℃で3時間インキュベートした。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション（BIO－RAD製）を用いて確認した。反応終了後、上記工程1と同様にアフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製を行った後、目的物を含むフラクションを共通操作Cを用いてりん酸緩衝生理食塩水（pH6．0）へ緩衝液交換を行い、10.2mg／mLのTrasutuzumab A1抗体［MSG１－N3］2溶液（りん酸緩衝生理食塩水（pH6.0））（3.65mL）を得た。
Trastuzumab A2抗体（実施例1）を用いて、実施例6の工程1及び2と同様の操作を行うことによってTrasutuzumab A2抗体- [MSG1-N3]2を得た。
【0326】
実施例7： H01L02-抗体-[MSG1-N3]2
【化72】
【0327】
工程1：（Fucα1，6）GlcNAc－H01L02抗体の調製
実施例1-3で調製したH01L02抗体溶液ca．24.3mg／mL（50mリン酸緩衝溶液（pH6．0））（1.65mL）を用いて、上記実施例6工程1と同様の操作を行い、20.0mg／mLの（Fucα1，6）GlcNAc－H01L02抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（1.48mL）を得た。
実施例1-3で調製したH01L02抗体溶液ca．24.3mg／mL（50mリン酸緩衝溶液（pH6．0））（1.65mL）を用いて、上記実施例6工程1と同様の操作を行い、20.0mg／mLの（Fucα1，6）GlcNAc－H01L02抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（1.48mL）を得た。
【0328】
工程2： H01L02抗体-[MSG1-N3]2の調製
上記工程1で得られた20.0mg／mL（Fucα1，6）GlcNAc－H01L02抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（1.48mL）を用いて、実施例6工程2と同様の操作を行うことによって、10.0mg／mL H01L02抗体-[MSG1-N3]2溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6.0））（１.5mL）を得た。
上記工程1で得られた20.0mg／mL（Fucα1，6）GlcNAc－H01L02抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（1.48mL）を用いて、実施例6工程2と同様の操作を行うことによって、10.0mg／mL H01L02抗体-[MSG1-N3]2溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6.0））（１.5mL）を得た。
【0329】
実施例8：HwtL05抗体-[MSG1-N3]2
【化73】
【0330】
工程1：（Fucα1，6）GlcNAc－HwtL05抗体の調製
実施例1-3で調製した抗HwtL05抗体溶液ca．24.5mg／mL（50mリン酸緩衝溶液（pH6．0））（3.00mL）を用いて、上記実施例6工程1と同様の操作を行い、20.39mg／mLの（Fucα1，6）GlcNAc－HwtL05抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（2.8mL）を得た。
実施例1-3で調製した抗HwtL05抗体溶液ca．24.5mg／mL（50mリン酸緩衝溶液（pH6．0））（3.00mL）を用いて、上記実施例6工程1と同様の操作を行い、20.39mg／mLの（Fucα1，6）GlcNAc－HwtL05抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（2.8mL）を得た。
【0331】
工程2：HwtL05抗体-[MSG1-N3]2の調製
上記工程1で得られた20.39mg／mL（Fucα1，6）GlcNAc－HwtL05抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（2.1mL）を用いて、実施例6工程2と同様の操作を行うことによって、10.04mg／mL HwtL05抗体-[MSG1-N3]2溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6.0））（4.0mL）を得た。
上記工程1で得られた20.39mg／mL（Fucα1，6）GlcNAc－HwtL05抗体溶液（50mMりん酸緩衝液（pH6.0））（2.1mL）を用いて、実施例6工程2と同様の操作を行うことによって、10.04mg／mL HwtL05抗体-[MSG1-N3]2溶液（リン酸緩衝生理食塩水（pH6.0））（4.0mL）を得た。
【0332】
〔ADCの合成〕
実施例9：ADC1
ADC1は、下記の反応式に示すように実施例6工程2で得られた抗体と実施例2-3で得られた薬物リンカー1(3-14)をコンジュゲーションすることによって合成した。式中、Rは実施例で用いられた薬物リンカーを示す。
実施例9：ADC1
ADC1は、下記の反応式に示すように実施例6工程2で得られた抗体と実施例2-3で得られた薬物リンカー1(3-14)をコンジュゲーションすることによって合成した。式中、Rは実施例で用いられた薬物リンカーを示す。
【0333】
【化74】
【0334】
【化75】
【0335】
（実施例9工程1で得られる化合物はトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
【0336】
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例6工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）溶液（10.0mg／mL，0.40mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0.767mL）、実施例2-3工程13にて得られた化合物(3-14)の10mMジメチルスルホキシド溶液（0.033mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作：上記溶液を後述の共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を7.00mL得た。
特性評価：共通操作E,Fを用いて下記の特性値を得た。
抗体濃度：0.48mg／mL，抗体収量：3.39mg（85％），抗体一分子あたりの平均薬物結合数（n）：1.7
実施例6工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）溶液（10.0mg／mL，0.40mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0.767mL）、実施例2-3工程13にて得られた化合物(3-14)の10mMジメチルスルホキシド溶液（0.033mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作：上記溶液を後述の共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を7.00mL得た。
特性評価：共通操作E,Fを用いて下記の特性値を得た。
抗体濃度：0.48mg／mL，抗体収量：3.39mg（85％），抗体一分子あたりの平均薬物結合数（n）：1.7
【0337】
実施例10：ADC2
ADC2は、下記の反応式に示すように実施例7工程2で得られた抗体と実施例2-3工程13で得られた薬物リンカー1(3-14)をコンジュゲーションすることによって合成した。式中、Rは実施例で用いられた薬物リンカーを示す。
ADC2は、下記の反応式に示すように実施例7工程2で得られた抗体と実施例2-3工程13で得られた薬物リンカー1(3-14)をコンジュゲーションすることによって合成した。式中、Rは実施例で用いられた薬物リンカーを示す。
【0338】
【化76】
【0339】
【化77】
【0340】
（実施例10工程1で得られる化合物はトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
【0341】
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例7工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）溶液（10.0mg／mL，400μL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（200μL）、実施例2-3工程13にて得られた化合物(3-14)の10mM N，N－ジメチルホルムアミド溶液（33.1μL；抗体1分子に対して12当量）と1，2－プロパンジオール（167μL）の混合溶液を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を2.5mL得た。
特性評価：共通操作E,Fを用いて下記の特性値を得た。
抗体濃度：1.08mg／mL，抗体収量：2.71mg（68％），抗体一分子あたりの平均薬物結合数（n）：1.9
実施例7工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）溶液（10.0mg／mL，400μL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（200μL）、実施例2-3工程13にて得られた化合物(3-14)の10mM N，N－ジメチルホルムアミド溶液（33.1μL；抗体1分子に対して12当量）と1，2－プロパンジオール（167μL）の混合溶液を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を2.5mL得た。
特性評価：共通操作E,Fを用いて下記の特性値を得た。
抗体濃度：1.08mg／mL，抗体収量：2.71mg（68％），抗体一分子あたりの平均薬物結合数（n）：1.9
【0342】
実施例11：ADC3
ADC3は、下記の反応式に示すように実施例8工程2で得られた抗体と実施例3工程13で得られた薬物リンカー1(3-14)をコンジュゲーションすることによって合成した。式中、Rは実施例で用いられた薬物リンカーを示す。
ADC3は、下記の反応式に示すように実施例8工程2で得られた抗体と実施例3工程13で得られた薬物リンカー1(3-14)をコンジュゲーションすることによって合成した。式中、Rは実施例で用いられた薬物リンカーを示す。
【0343】
【化78】
【0344】
【化79】
【0345】
（実施例11工程1で得られる化合物はトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例8工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）溶液（10．04mg／mL，0.400mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0.367mL）、実施例2-3工程13にて得られた化合物(3-14)の10mMジメチルスルホキシド溶液（0.033mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を2.50mL得た。
特性評価：共通操作E，Fを用いて下記の特性値を得た。
抗体濃度：0.89mg／mL，抗体収量：2.22mg（55％），抗体一分子あたりの平均薬物結合数（n）：1.8
工程1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例8工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）溶液（10．04mg／mL，0.400mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0.367mL）、実施例2-3工程13にて得られた化合物(3-14)の10mMジメチルスルホキシド溶液（0.033mL；抗体1分子に対して12当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作：上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を2.50mL得た。
特性評価：共通操作E，Fを用いて下記の特性値を得た。
抗体濃度：0.89mg／mL，抗体収量：2.22mg（55％），抗体一分子あたりの平均薬物結合数（n）：1.8
【0346】
実施例12：ADC4 及びADC5
ADC4は、実施例6工程2で得られたTrasutuzumab A2抗体- [MSG1-N3]2と実施例2-3で得られた薬物リンカー1(3-14)をコンジュゲーションすることによって合成した。式中、Rは実施例で用いられた薬物リンカーを示す。
ADC4は、実施例6工程2で得られたTrasutuzumab A2抗体- [MSG1-N3]2と実施例2-3で得られた薬物リンカー1(3-14)をコンジュゲーションすることによって合成した。式中、Rは実施例で用いられた薬物リンカーを示す。
【0347】
【化80】
【0348】
【化81】
【0349】
（実施例12工程1で得られる化合物はトリアゾール環の幾何異性体を有し、上記Rとして示した2種類の構造からなる薬物リンカーを混合して保持する。）
【0350】
工程1-1：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション(ADC4)
実施例6工程2にて得られたTrastuzumab A2抗体- [MSG1-N3]2（重鎖アミノ酸配列：配列番号31、軽鎖アミノ酸配列：配列番号32）のリン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）溶液（10.0mg／mL，0.50mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0.486mL）、実施例2-3工程13にて得られた化合物(3-14)の10mMジメチルスルホキシド溶液（0.014mL；抗体1分子に対して4当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて40時間反応させた。
精製操作：上記溶液を後述の共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を2.50mL得た。
特性評価：共通操作E,Fを用いて下記の特性値を得た。
抗体濃度：1.12mg／mL，抗体収量：2.80mg（56％），抗体一分子あたりの平均薬物結合数（n）：1.8
実施例6工程2にて得られたTrastuzumab A2抗体- [MSG1-N3]2（重鎖アミノ酸配列：配列番号31、軽鎖アミノ酸配列：配列番号32）のリン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）溶液（10.0mg／mL，0.50mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0.486mL）、実施例2-3工程13にて得られた化合物(3-14)の10mMジメチルスルホキシド溶液（0.014mL；抗体1分子に対して4当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて40時間反応させた。
精製操作：上記溶液を後述の共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を2.50mL得た。
特性評価：共通操作E,Fを用いて下記の特性値を得た。
抗体濃度：1.12mg／mL，抗体収量：2.80mg（56％），抗体一分子あたりの平均薬物結合数（n）：1.8
【0351】
工程1-2：抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション(ADC5)
実施例6工程2にて得られたTrastuzumab A2抗体- [MSG1-N3]2（重鎖アミノ酸配列：配列番号31、軽鎖アミノ酸配列：配列番号32）のリン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）溶液（10.0mg／mL，0.50mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0.486mL）、実施例2-3工程13にて得られた化合物(3-14)の10mMジメチルスルホキシド溶液（0.014mL；抗体1分子に対して１２当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて40時間反応させた。
精製操作：上記溶液を後述の共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を2.50mL得た。
特性評価：共通操作E,Fを用いて下記の特性値を得た。
抗体濃度：1.13mg／mL，抗体収量：2.82mg（56％），抗体一分子あたりの平均薬物結合数（n）：1.8
実施例6工程2にて得られたTrastuzumab A2抗体- [MSG1-N3]2（重鎖アミノ酸配列：配列番号31、軽鎖アミノ酸配列：配列番号32）のリン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）溶液（10.0mg／mL，0.50mL）に、室温にて1，2－プロパンジオール（0.486mL）、実施例2-3工程13にて得られた化合物(3-14)の10mMジメチルスルホキシド溶液（0.014mL；抗体1分子に対して１２当量）を加え、チューブローテーター（MTR－103、アズワン株式会社）を用いて、室温にて40時間反応させた。
精製操作：上記溶液を後述の共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を2.50mL得た。
特性評価：共通操作E,Fを用いて下記の特性値を得た。
抗体濃度：1.13mg／mL，抗体収量：2.82mg（56％），抗体一分子あたりの平均薬物結合数（n）：1.8
【0352】
実施例13：抗体‐薬物コンジュゲートの細胞増殖阻害試験（1）
HER2抗原陽性細胞のヒト乳癌株であるKPL－4細胞（川崎医科大学・紅林淳一、British Journal of Cancer，(1999)79(5／6).707－717）を、10％のウシ胎児血清（Hyclone）を含むRPMI1640 Medium(Thermo Fisher Scientific；以下、RPMI培地）で6.25×103Cells／mLになるように調製し、96穴細胞培養用マイクロプレートに80μLずつ添加した。細胞添加後、37℃、5％CO2下で一晩培養した。
翌日、RPMI培地で100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM、6.4pM、1.3pM、0．26pMに希釈した抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1, ADC2, ADC3をマイクロプレートに20μLずつ添加した。抗体‐薬物コンジュゲート非添加ウェルにはRPMI培地を20μLずつ添加した。KPL－4は37℃、5％CO2下で6日間培養した。培養後、マイクロプレートをインキュベーターから取り出して室温で30分間静置した。培養液と等量のCellTiter－Glo Luminescent Cell Viability Assay（Promega）を添加してプレートミキサーで攪拌した。室温で10分間静置後にプレートリーダー（PerkinElmer）で発光量を計測した。
生細胞率は次式で算出した。
生細胞率（％）＝a÷b×100
a：被験物質添加ウェルの発光量の平均値
b：培地添加ウェルの発光量の平均値
IC50値は次式で算出した。
IC50（nM）＝antilog（（50－d）×（LOG10（b）－LOG10（a））÷（d－c）＋LOG10（b））
a：被験物質の濃度a
b：被験物質の濃度b
c：濃度aの被験物質を添加した時の生細胞率
d：濃度bの被験物質を添加した時の生細胞率
a、bは生細胞率50％を挟む2点でa＞b。
KPL－4細胞に対して抗体‐薬物コンジュゲートADC1， ADC2は0.001＜IC50＜0.01（nM）の抗細胞効果、ADC3は0.01＜IC50＜0.1（nM）の抗細胞効果を示した。
HER2抗原陽性細胞のヒト乳癌株であるKPL－4細胞（川崎医科大学・紅林淳一、British Journal of Cancer，(1999)79(5／6).707－717）を、10％のウシ胎児血清（Hyclone）を含むRPMI1640 Medium(Thermo Fisher Scientific；以下、RPMI培地）で6.25×103Cells／mLになるように調製し、96穴細胞培養用マイクロプレートに80μLずつ添加した。細胞添加後、37℃、5％CO2下で一晩培養した。
翌日、RPMI培地で100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM、6.4pM、1.3pM、0．26pMに希釈した抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1, ADC2, ADC3をマイクロプレートに20μLずつ添加した。抗体‐薬物コンジュゲート非添加ウェルにはRPMI培地を20μLずつ添加した。KPL－4は37℃、5％CO2下で6日間培養した。培養後、マイクロプレートをインキュベーターから取り出して室温で30分間静置した。培養液と等量のCellTiter－Glo Luminescent Cell Viability Assay（Promega）を添加してプレートミキサーで攪拌した。室温で10分間静置後にプレートリーダー（PerkinElmer）で発光量を計測した。
生細胞率は次式で算出した。
生細胞率（％）＝a÷b×100
a：被験物質添加ウェルの発光量の平均値
b：培地添加ウェルの発光量の平均値
IC50値は次式で算出した。
IC50（nM）＝antilog（（50－d）×（LOG10（b）－LOG10（a））÷（d－c）＋LOG10（b））
a：被験物質の濃度a
b：被験物質の濃度b
c：濃度aの被験物質を添加した時の生細胞率
d：濃度bの被験物質を添加した時の生細胞率
a、bは生細胞率50％を挟む2点でa＞b。
KPL－4細胞に対して抗体‐薬物コンジュゲートADC1， ADC2は0.001＜IC50＜0.01（nM）の抗細胞効果、ADC3は0.01＜IC50＜0.1（nM）の抗細胞効果を示した。
【0353】
実施例14：抗体‐薬物コンジュゲートの細胞増殖阻害試験（２）
HER2抗原陽性細胞のヒト乳癌株であるJIMT-1細胞(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ ACC 589))を、10%のウシ胎児血清(Hyclone)を含むDMEM Medium (Thermo Fisher Scientific；以下、DMEM培地）で1.3×104 Cells/mLになるように調製し、96穴細胞培養用マイクロプレートに80μLずつ添加した。細胞添加後、37℃、5％CO2下で一晩培養した。
翌日、DMEM培地で100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM、6.4pM、1.3pM、0.26pMに希釈した抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1, ADC2, ADC3をマイクロプレートに20μLずつ添加した。抗体‐薬物コンジュゲート非添加ウェルにはDMEM培地を20μLずつ添加した。JIMT-1は37℃、5%CO2下で6日間培養した。培養後、マイクロプレートをインキュベーターから取り出して室温で30分間静置した。培養液と等量のCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega)を添加してプレートミキサーで攪拌した。室温で10分間静置後にプレートリーダー(PerkinElmer)で発光量を計測した。実施例13と同じ式を用いて、生細胞率を算出した。
JIMT-1細胞に対して抗体‐薬物コンジュゲートADC1、ADC2は0.1<IC50<1(nM）の抗細胞効果、ADC3は1<IC50<10(nM)の抗細胞効果を示した。
HER2抗原陽性細胞のヒト乳癌株であるJIMT-1細胞(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ ACC 589))を、10%のウシ胎児血清(Hyclone)を含むDMEM Medium (Thermo Fisher Scientific；以下、DMEM培地）で1.3×104 Cells/mLになるように調製し、96穴細胞培養用マイクロプレートに80μLずつ添加した。細胞添加後、37℃、5％CO2下で一晩培養した。
翌日、DMEM培地で100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM、6.4pM、1.3pM、0.26pMに希釈した抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1, ADC2, ADC3をマイクロプレートに20μLずつ添加した。抗体‐薬物コンジュゲート非添加ウェルにはDMEM培地を20μLずつ添加した。JIMT-1は37℃、5%CO2下で6日間培養した。培養後、マイクロプレートをインキュベーターから取り出して室温で30分間静置した。培養液と等量のCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega)を添加してプレートミキサーで攪拌した。室温で10分間静置後にプレートリーダー(PerkinElmer)で発光量を計測した。実施例13と同じ式を用いて、生細胞率を算出した。
JIMT-1細胞に対して抗体‐薬物コンジュゲートADC1、ADC2は0.1<IC50<1(nM）の抗細胞効果、ADC3は1<IC50<10(nM)の抗細胞効果を示した。
【0354】
実施例15：抗体‐薬物コンジュゲートの細胞増殖阻害試験（3）
ＨＥＲ２抗原陽性細胞のヒト乳癌株である ＫＰＬ－４細胞（川崎医科大学・紅林淳一、British Journal of Cancer, (1999)79(5/6). 707-717）を、10％のウシ胎児血清（Hyclone）を含むRPMI1640 Medium (Thermo Fisher Scientific；以下、RPMI培地）で6.25×103 Cells/mLになるように調製し、96穴細胞培養用マイクロプレートに80μＬずつ添加した。細胞添加後、37℃、5％CO2下で一晩培養した。
翌日、ＲＰＭＩ培地で100ｎＭ、20ｎＭ、4ｎＭ、0.8ｎＭ、0.16ｎＭ、0.032ｎＭ、6.4ｐＭ、1.3ｐＭ、0.26ｐＭに希釈した抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC4をマイクロプレートに20μＬずつ添加した。抗体‐薬物コンジュゲート非添加ウェルにはRPMI培地を20μＬずつ添加した。KPL-4は37℃、5％CO2下で6日間培養した。培養後、マイクロプレートをインキュベーターから取り出して室温で30分間静置した。培養液と等量のCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega)を添加してプレートミキサーで攪拌した。室温で10分間静置後にプレートリーダー(PerkinElmer)で発光量を計測した。実施例13と同じ式を用いて、生細胞率を算出した。
KPL-4細胞に対して抗体‐薬物コンジュゲートADC4は0.001＜IC50＜0.01 (nM)の抗細胞効果を示した。
ＨＥＲ２抗原陽性細胞のヒト乳癌株である ＫＰＬ－４細胞（川崎医科大学・紅林淳一、British Journal of Cancer, (1999)79(5/6). 707-717）を、10％のウシ胎児血清（Hyclone）を含むRPMI1640 Medium (Thermo Fisher Scientific；以下、RPMI培地）で6.25×103 Cells/mLになるように調製し、96穴細胞培養用マイクロプレートに80μＬずつ添加した。細胞添加後、37℃、5％CO2下で一晩培養した。
翌日、ＲＰＭＩ培地で100ｎＭ、20ｎＭ、4ｎＭ、0.8ｎＭ、0.16ｎＭ、0.032ｎＭ、6.4ｐＭ、1.3ｐＭ、0.26ｐＭに希釈した抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC4をマイクロプレートに20μＬずつ添加した。抗体‐薬物コンジュゲート非添加ウェルにはRPMI培地を20μＬずつ添加した。KPL-4は37℃、5％CO2下で6日間培養した。培養後、マイクロプレートをインキュベーターから取り出して室温で30分間静置した。培養液と等量のCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega)を添加してプレートミキサーで攪拌した。室温で10分間静置後にプレートリーダー(PerkinElmer)で発光量を計測した。実施例13と同じ式を用いて、生細胞率を算出した。
KPL-4細胞に対して抗体‐薬物コンジュゲートADC4は0.001＜IC50＜0.01 (nM)の抗細胞効果を示した。
【0355】
実施例16：抗体‐薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（1）
マウス：4－5週齢の雌BALB／c ヌードマウス（日本チャールズ・リバー）を実験使用前にSPF条件下で4－7日間馴化した。マウスには滅菌した固形飼料（FR－2，Funabashi Farms Co．，Ltd）を給餌し、滅菌した水道水（5－15 ppm次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加して調製）を与えた。
測定・計算式：全ての研究において、腫瘍の長径及び短径を電子式デジタルキャリパー（CD－15CX，Mitutoyo Corp．）で一週間に2－3回測定し、腫瘍体積（mm3）を計算した。計算式は以下に示すとおり。
腫瘍体積（mm3）＝長径（mm） × [短径（mm）]2 × 1／2
抗体‐薬物コンジュゲート及び抗体は全て10mM－Acetate Buffer，5％ Sorbitol，pH5.5 （ナカライテスク株式会社；ABS緩衝液）で希釈し、10mL／kgの液量を尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
KPL－4細胞（川崎医科大学・紅林淳一、British Journal of Cancer，(1999）79（5/6）．707－717）をDulbecco’s phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich)に懸濁し、1.5×107cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day14に無作為に群分けを実施した。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、又はADC2をDay14に0.33mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
結果を図18に示す。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、ADC2はいずれも0.33mg／kg投与で腫瘍増殖抑制効果を示した。また、腫瘍増殖抑制効果の強さはADC2、ADC1の順であった。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、ADC2はいずれも0.33mg／kg投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
マウス：4－5週齢の雌BALB／c ヌードマウス（日本チャールズ・リバー）を実験使用前にSPF条件下で4－7日間馴化した。マウスには滅菌した固形飼料（FR－2，Funabashi Farms Co．，Ltd）を給餌し、滅菌した水道水（5－15 ppm次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加して調製）を与えた。
測定・計算式：全ての研究において、腫瘍の長径及び短径を電子式デジタルキャリパー（CD－15CX，Mitutoyo Corp．）で一週間に2－3回測定し、腫瘍体積（mm3）を計算した。計算式は以下に示すとおり。
腫瘍体積（mm3）＝長径（mm） × [短径（mm）]2 × 1／2
抗体‐薬物コンジュゲート及び抗体は全て10mM－Acetate Buffer，5％ Sorbitol，pH5.5 （ナカライテスク株式会社；ABS緩衝液）で希釈し、10mL／kgの液量を尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
KPL－4細胞（川崎医科大学・紅林淳一、British Journal of Cancer，(1999）79（5/6）．707－717）をDulbecco’s phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich)に懸濁し、1.5×107cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day14に無作為に群分けを実施した。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、又はADC2をDay14に0.33mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
結果を図18に示す。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、ADC2はいずれも0.33mg／kg投与で腫瘍増殖抑制効果を示した。また、腫瘍増殖抑制効果の強さはADC2、ADC1の順であった。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、ADC2はいずれも0.33mg／kg投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
【0356】
実施例17：抗体‐薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（2）
JIMT－1細胞（DSMZ ACC 589）を生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、5×106cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day11に無作為に群分けを実施した。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、又はADC2をDay11に0.4mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
結果を図19に示す。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、又はADC2は0.4mg／kg投与時に腫瘍の退縮を伴う強い抗腫瘍効果を認めた。また、いずれの投与用量においても抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、又はADC2投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
JIMT－1細胞（DSMZ ACC 589）を生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、5×106cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day11に無作為に群分けを実施した。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、又はADC2をDay11に0.4mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
結果を図19に示す。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、又はADC2は0.4mg／kg投与時に腫瘍の退縮を伴う強い抗腫瘍効果を認めた。また、いずれの投与用量においても抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、又はADC2投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
【0357】
実施例18：抗体‐薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（3）
CFPAC－1細胞（American Type Culture Collection；ATCC CRL-1918）を生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、5×106cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day10に無作為に群分けを実施した。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、又はADC2をDay10に0.4mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
結果を図20に示す。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1を投与したマウスにおいて、腫瘍の退縮を伴う強い抗腫瘍効果が認められた。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC2を投与したマウスにおいては腫瘍増殖抑制効果を認めた。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、又はADC2投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
実施例19：抗体‐薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（4）
KPL－4細胞（川崎医科大学・紅林淳一、British Journal of Cancer，(1999）79（5/6）．707－717）を生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、1.5×107cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day14に無作為に群分けを実施した。抗体‐薬物コンジュゲートADC5をDay14に0.4mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
結果を図23に示す。抗体‐薬物コンジュゲートADC5は0.4mg／kg投与で腫瘍退縮を伴う強い抗腫瘍効果を認めた。抗体‐薬物コンジュゲートADC5は0.4mg／kg投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
CFPAC－1細胞（American Type Culture Collection；ATCC CRL-1918）を生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、5×106cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day10に無作為に群分けを実施した。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、又はADC2をDay10に0.4mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
結果を図20に示す。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1を投与したマウスにおいて、腫瘍の退縮を伴う強い抗腫瘍効果が認められた。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC2を投与したマウスにおいては腫瘍増殖抑制効果を認めた。抗HER2抗体‐薬物コンジュゲートADC1、又はADC2投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
実施例19：抗体‐薬物コンジュゲートの抗腫瘍試験（4）
KPL－4細胞（川崎医科大学・紅林淳一、British Journal of Cancer，(1999）79（5/6）．707－717）を生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）に懸濁し、1.5×107cellsを雌ヌードマウスの右体側部に皮下移植し（Day0）、Day14に無作為に群分けを実施した。抗体‐薬物コンジュゲートADC5をDay14に0.4mg／kgの用量で尾静脈内投与した。また、コントロール群（Vehicle群）としてABS緩衝液を同様に投与した。
結果を図23に示す。抗体‐薬物コンジュゲートADC5は0.4mg／kg投与で腫瘍退縮を伴う強い抗腫瘍効果を認めた。抗体‐薬物コンジュゲートADC5は0.4mg／kg投与によるマウスの体重減少は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【0358】
本発明の抗HER2抗体－薬物コンジュゲート、抗HER2抗体及び／又はPBD誘導体等を用いることにより、各種がんの治療又は予防が可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【0359】
配列番号1：Trastuzumab A1及びA2の重鎖及びHwtL05抗体重鎖のCDRH1のアミノ酸配列
配列番号2：Trastuzumab A1及びA2の重鎖及びHwtL05抗体重鎖のCDRH2のアミノ酸配列
配列番号3：Trastuzumab A1及びA2の重鎖及びHwtL05抗体重鎖のCDRH3のアミノ酸配列
配列番号4：H01L02抗体重鎖のCDRH3のアミノ酸配列
配列番号5：Trastuzumab A1及びA2の軽鎖のCDRL1のアミノ酸配列
配列番号6：Trastuzumab A1及びA2の軽鎖のCDRL2を含むアミノ酸配列
配列番号7：Trastuzumab A1及びA2の軽鎖のCDRL3のアミノ酸配列
配列番号8：H01L02抗体及びHwtL05抗体軽鎖のCDRL3のアミノ酸配列
配列番号9：ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号10：ヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG1LALA定常領域のアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号11：Trastuzumab A1の重鎖アミノ酸配列
配列番号12：Trastuzumab A1の重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号13：Trastuzumab A1、A2及びHwtの重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号14：Trastuzumab A1、A2及びHwtの重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号15：H01のアミノ酸配列
配列番号16：H01をコードするヌクレオチド配列
配列番号17：H01の重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号18：H01の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号19：Trastuzumab A1の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号20：Trastuzumab A1の軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号21：Trastuzumab A1及びA2の軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号22：Trastuzumab A1及びA2の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号23：L02のアミノ酸配列
配列番号24：L02をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号25：L02の可変領域アミノ酸配列
配列番号26：L02の可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号27：L05のアミノ酸配列
配列番号28：L05をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号29：L05の可変領域アミノ酸配列
配列番号30：L05の可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号31：Trastuzumab A2の重鎖アミノ酸配列
配列番号32：Trastuzumab A2の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号33：Trastuzumabの重鎖アミノ酸配列
配列番号34：Trastuzumabの軽鎖のアミノ酸配列
配列番号2：Trastuzumab A1及びA2の重鎖及びHwtL05抗体重鎖のCDRH2のアミノ酸配列
配列番号3：Trastuzumab A1及びA2の重鎖及びHwtL05抗体重鎖のCDRH3のアミノ酸配列
配列番号4：H01L02抗体重鎖のCDRH3のアミノ酸配列
配列番号5：Trastuzumab A1及びA2の軽鎖のCDRL1のアミノ酸配列
配列番号6：Trastuzumab A1及びA2の軽鎖のCDRL2を含むアミノ酸配列
配列番号7：Trastuzumab A1及びA2の軽鎖のCDRL3のアミノ酸配列
配列番号8：H01L02抗体及びHwtL05抗体軽鎖のCDRL3のアミノ酸配列
配列番号9：ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号10：ヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG1LALA定常領域のアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号11：Trastuzumab A1の重鎖アミノ酸配列
配列番号12：Trastuzumab A1の重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号13：Trastuzumab A1、A2及びHwtの重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号14：Trastuzumab A1、A2及びHwtの重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号15：H01のアミノ酸配列
配列番号16：H01をコードするヌクレオチド配列
配列番号17：H01の重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号18：H01の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号19：Trastuzumab A1の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号20：Trastuzumab A1の軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号21：Trastuzumab A1及びA2の軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号22：Trastuzumab A1及びA2の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号23：L02のアミノ酸配列
配列番号24：L02をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号25：L02の可変領域アミノ酸配列
配列番号26：L02の可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号27：L05のアミノ酸配列
配列番号28：L05をコードするポリヌクレオチド配列
配列番号29：L05の可変領域アミノ酸配列
配列番号30：L05の可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号31：Trastuzumab A2の重鎖アミノ酸配列
配列番号32：Trastuzumab A2の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号33：Trastuzumabの重鎖アミノ酸配列
配列番号34：Trastuzumabの軽鎖のアミノ酸配列
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】