▶ ドイッチェス・クレープスフォルシュングスツェントルムの特許一覧
特許7529662多発性皮膚硬化患者から単離されたプラスミドによってコードされた複製タンパク質の結晶構造
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-29
(45)【発行日】2024-08-06
(54)【発明の名称】多発性皮膚硬化患者から単離されたプラスミドによってコードされた複製タンパク質の結晶構造
(51)【国際特許分類】
C07K 14/47 20060101AFI20240730BHJP
G01N 33/53 20060101ALN20240730BHJP
【ＦＩ】
C07K14/47 ZNA
G01N33/53 D
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021526476
(86)(22)【出願日】2019-11-14
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 EP2019081364
(87)【国際公開番号】W WO2020099580
(87)【国際公開日】2020-05-22
【審査請求日】2022-07-14
(31)【優先権主張番号】18206532.6
(32)【優先日】2018-11-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】512151403
【氏名又は名称】ドイッチェス・クレープスフォルシュングスツェントルム
【氏名又は名称原語表記】ＤＥＵＴＳＣＨＥＳ ＫＲＥＢＳＦＯＲＳＣＨＵＮＧＳＺＥＮＴＲＵＭ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ブント、ティモ
(72)【発明者】
【氏名】ハンスマン、グラント エス．
(72)【発明者】
【氏名】キリック、トゥルゲイ
(72)【発明者】
【氏名】ポポフ、アレクサンデル エヌ．
(72)【発明者】
【氏名】デ ヴィリエール － ツーア ハオゼン、エテル － ミケーレ
(72)【発明者】
【氏名】ツーア ハオゼン、ハラルト
【審査官】小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／０６９２９６（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １４／００ － １４／８２５
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）Ｐ２１の空間群と、（ｂ）ａ＝３２．３８ű１～２Å、ｂ＝７７．７７ű１～２Å、及びｃ＝４７．６８ű１～２Å、α＝９０°、β＝９０．６６°、及びγ＝９０°の単位格子寸法と、を有することを特徴とする、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質ＷＨ１ドメインの結晶。
【請求項2】
配列番号１で定義された、Ｌｅｕ１１、Ｌｅｕ１８及び／又はＬｅｕ２５を含む疎水性ポケットを含む、請求項１に記載のＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質ＷＨ１ドメインの結晶。
【請求項3】
配列番号１で定義された、残基Ｌｙｓ６９、Ｌｙｓ７３、Ｌｙｓ８５、Ａｒｇ９０、Ａｒｇ７８及び／又はＡｒｇ９６を含むＤＮＡ相互作用部位を含む、請求項１に記載のＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質ＷＨ１ドメインの結晶。
【請求項4】
請求項１から３のいずれか一項に定義されたＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質ＷＨ１ドメインの結晶を生成する方法であって、（ａ）結晶化試薬中の組換え調製ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質ＷＨ１ドメインの溶液を調製する工程と、
（ｂ）蒸気拡散によって前記ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質ＷＨ１ドメインを結晶化する工程と、
を含む、方法。
【請求項5】
前記結晶化試薬が、０．２Ｍ酢酸マグネシウム及び２０％ＰＥＧ３３５０を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記蒸気拡散がハンギングドロップ蒸気拡散法である、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
配列番号１で定義されたＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の阻害剤をスクリーニングする方法であって、（ａ）前記ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質ＷＨ１ドメインの溶液を提供する工程と、
（ｂ）少なくとも１つの候補化合物を前記溶液中のＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質ＷＨ１ドメインと接触させる工程と、
（ｃ）請求項１から３のいずれかに一項に定義された前記ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質ＷＨ１ドメインの結晶を調製する工程と、
（ｄ）配列番号１で定義されたＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の候補結合化合物を同定する工程と、
を含む、方法。
【請求項8】
工程（ｄ）において、請求項３で定義されたＤＮＡ相互作用部位への候補化合物の結合が決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
原子空間関係データを得るための、請求項１から３のいずれか一項に定義されたＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質ＷＨ１ドメインの結晶の使用。
【請求項10】
ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質への薬物結合をスクリーニング、同定、設計、又は最適化するための、請求項９に記載のＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質ＷＨ１ドメインの結晶の使用。
【請求項11】
候補化合物が配列番号１で定義されたＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質に結合する能力のインシリコスクリーニングのための、請求項１から３のいずれか一項に定義されたＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質ＷＨ１ドメインの結晶の使用。
【請求項12】
候補化合物が配列番号１で定義されたＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質のＤＮＡ相互作用部位に結合する、請求項１１に記載の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、多発性硬化症患者から単離されたプラスミドによってコードされる複製タンパク質の結晶形態、それらから得られる結晶構造情報、そのような結晶形態を調製する方法、当該複製タンパク質の阻害剤の同定及び／又は設計のためのそれらの使用、並びに複製タンパク質と相互作用するか又はそれを阻害する能力を有するはずの化合物を同定、最適化及び設計する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ウシの肉及び乳の消費は、ヒトの変性疾患及び悪性疾患、例えば結腸癌及び乳癌の発症の危険因子の１つであると考えられている（１～３）。実際、疫学的データは、これらの癌と、ヨーロッパ原産のオーロックス由来ウシのウシ産生物の消費との相関関係があることを示唆している（４～７）。Ｂｏｖｉｎｅ Ｍｅａｔ ａｎｄ Ｍｉｌｋ Ｆａｃｔｏｒｓ（ＢＭＭＦ）は、ウシの肉及び乳製品において検出されている環状の一本鎖エピソームＤＮＡ（３ｋｂ未満）である。ＢＭＭＦは、ヒトの悪性疾患及び変性疾患において役割を果たすと考えられている。ＢＭＭＦは、ヒト細胞において能動的に転写及び翻訳される複製イニシエータタンパク質（Ｒｅｐ）をコードする。したがって、ＢＭＭＦは、そのような疾患の可能な病原因子を表す可能性がある（８～１０）。しかし、ＢＭＭＦも多発性硬化症の患者から単離され、研究により、これらがこの疾患の可能性のある感染因子であることが示唆された。（１０～１３）。
【0003】
典型的には、ＢＭＭＦは、「Ｒｅｐ」と呼ばれる自律的プラスミドトランス作用性複製イニシエータタンパク質をコードする。Ｒｅｐは、ＤＮＡ上の複製起点（ｏｒｉと呼ばれる）に結合し、ほとんどの場合、大部分のＢＭＭＦ内に存在する一組の反復ＤＮＡ要素（イテロンと呼ばれる）を含む（５）。ＣｉｒｃｕｌａｒＲｅｐをコードする一本鎖（ＣＲＥＳＳ）ＤＮＡウイルスを含む様々なプラスミドの複製はまた、特定のＤＮＡ配列へのＲｅｐの結合を必要とする（１４）。原核生物内では、Ｒｅｐは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＦプラスミドについて報告されているように、プラスミドコピー数を維持するのに中心的な役割を果たす（１５）。この調節は、プラスミド由来、バクテリオファージ様又はウイルス様ＤＮＡゲノムの複製にも重要である（１６）。Ｒｅｐは、ヒトにおける多剤耐性細菌の複製に不可欠であり（１７）、研究により、Ｒｅｐが伝染性アミロイドタンパク症において役割を有することが示唆されている（１８～２０）。
【0004】
ＲｅｐｓのＸ線結晶構造は十分に文書化されており、自律複製の構造的根拠が記載されている（２４～２７）。Ｒｅｐは、本質的に、融合Ｎ末端タンパク質及びＣ末端タンパク質である２つのウィングドヘリックスドメイン（ＷＨ１及びＷＨ２と呼ばれる）から構成される。Ｒｅｐは、特定の機能及びＤＮＡへの結合に応じて、単量体型と二量体型との間で変換する（２８）。両方のドメインを含む大きな構造変化は、これらのオリゴマー形態を補完する。構造変換には、Ｒｅｐ上の特定のαヘリックス及びβ鎖がリフォールディング及び／又はシフトする必要がある（２６）。二量体型では、Ｒｅｐはリプレッサーとして機能し、ここでＷＨ２は各オペレータＤＮＡリピートに結合し、ＷＨ１は二量体形成面を形成するように機能する。単量体型では、Ｒｅｐは複製イニシエータとして機能し、ここで、ＷＨ１は大きな構造運動、すなわち二量体解離を受け、それによってＷＨ１がイテロン末端に結合することを可能にし、一方、ＷＨ２は反対のイテロン末端に結合する。
【0005】
近年、多発性硬化症患者の脳試料からエピソーム環状ＤＮＡ（単離ＭＳＢＩ１．１７６、系統ＬＫ９３１４９１．１）が単離された（１１）。ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐは、伝染性脳症関連薬剤の培養及び脳調製物から単離されたＳｐｈｉｎｘ－１．７６コード化Ｒｅｐ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＤＲ６５１２３．１及びＨＱ４４４４０４．１）と９８％のアミノ酸同一性を示す（２１）。さらに、Ｓｐｈｉｎｘ－１．７６特異的抗体に基づいて、マウスＣＮＳ、ハムスターＣＮＳ、及びヒト神経膠芽腫の神経細胞（ＧＴ１細胞株）及び脳試料において、Ｓｐｈｉｎｘ１．７６コード化Ｒｅｐを検出することが示された（２２）。ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐ抗原に基づく血清学は、健康なヒト血液ドナーに対して陽性免疫応答を示し、これらの薬剤に対する可能性のある前曝露を示した（２３）。したがって、ヒトの悪性疾患及び変性疾患におけるＢＭＭＦの機能を解読することがますます重要になってきている。
【発明の概要】
【0006】
ヒト悪性疾患及び変性疾患におけるＢＭＭＦの機能を解読するためには、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶構造を有することが非常に有用であるが、これは今まで失敗していた。そのような結晶構造はまた、当該複製タンパク質の阻害剤の同定及び／又は設計、並びに複製タンパク質と相互作用する又は複製タンパク質を阻害する能力を有するべき化合物を同定、最適化及び設計するための方法に役立つ。
【0007】
したがって、本発明の目的は、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶構造座標、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶形態を得る方法、並びに結晶構造及び結晶構造座標に基づいてＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の阻害剤として化合物を設計、同定及び最適化する方法を提供することである。
他の記載と重複するが、本発明及びその諸態様を以下に示す。ただし、本発明は以下に限定されない。
［１］
（ａ）Ｐ２ １ の空間群と、（ｂ）ａ＝３２．３８ű１～２Å、ｂ＝７７．７７ű１～２Å、及びｃ＝４７．６８ű１～２Å、α＝９０°、β＝９０．６６°、及びγ＝９０°の単位格子寸法と、を有することを特徴とする、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶構造。
［２］
Ｌｅｕ１１、Ｌｅｕ１８及び／又はＩｌｅ２５を含む疎水性ポケットを含む、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶構造。
［３］
残基Ｌｙｓ６９、Ｌｙｓ７３、Ｌｙｓ８５、Ａｒｇ９０、Ａｒｇ７８及び／又はＡｒｇ９６を含むＤＮＡ相互作用部位を含む、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶構造。
［４］
ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質又はその結晶化可能な断片の結晶を生成する方法であって、
（ａ）結晶化試薬中の組換え調製ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質、好ましくはＷＨ１ドメインの溶液を調製する工程と、
（ｂ）蒸気拡散によって前記ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ドメインを結晶化する工程と、
を含む、方法。
［５］
前記結晶化試薬が、０．２Ｍ酢酸マグネシウム及び２０％ＰＥＧ３３５０を含む、［４］に記載の方法。
［６］
前記蒸気拡散がハンギングドロップ蒸気拡散法である、［４］に記載の方法。
［７］
ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の阻害剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質又はその結晶化可能な断片の溶液を提供する工程と、
（ｂ）少なくとも１つの候補化合物を前記溶液中のＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質と接触させる工程と、
（ｃ）前記ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶を調製する工程と、
（ｄ）前記ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の候補結合化合物を同定する工程と、
を含む、方法。
［８］
工程（ｄ）において、請求項３で定義されたＤＮＡ相互作用部位への候補化合物の結合が決定される、［７］に記載の方法。
［９］
原子空間関係データを得るための、［１］から［３］のいずれかに定義された結晶構造の使用。
［１０］
ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質への薬物結合をスクリーニング、同定、設計、又は最適化するための、［９］に記載の結晶構造の使用。
［１１］
候補化合物が前記ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質に結合する、特にＤＮＡ相互作用部位に結合する能力のインシリコスクリーニングのためのＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶構造の使用。
他の記載と重複するが、本発明及びその諸態様を以下に示す。ただし、本発明は以下に限定されない。
［１］
（ａ）Ｐ２ １ の空間群と、（ｂ）ａ＝３２．３８ű１～２Å、ｂ＝７７．７７ű１～２Å、及びｃ＝４７．６８ű１～２Å、α＝９０°、β＝９０．６６°、及びγ＝９０°の単位格子寸法と、を有することを特徴とする、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶構造。
［２］
Ｌｅｕ１１、Ｌｅｕ１８及び／又はＩｌｅ２５を含む疎水性ポケットを含む、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶構造。
［３］
残基Ｌｙｓ６９、Ｌｙｓ７３、Ｌｙｓ８５、Ａｒｇ９０、Ａｒｇ７８及び／又はＡｒｇ９６を含むＤＮＡ相互作用部位を含む、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶構造。
［４］
ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質又はその結晶化可能な断片の結晶を生成する方法であって、
（ａ）結晶化試薬中の組換え調製ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質、好ましくはＷＨ１ドメインの溶液を調製する工程と、
（ｂ）蒸気拡散によって前記ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ドメインを結晶化する工程と、
を含む、方法。
［５］
前記結晶化試薬が、０．２Ｍ酢酸マグネシウム及び２０％ＰＥＧ３３５０を含む、［４］に記載の方法。
［６］
前記蒸気拡散がハンギングドロップ蒸気拡散法である、［４］に記載の方法。
［７］
ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の阻害剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質又はその結晶化可能な断片の溶液を提供する工程と、
（ｂ）少なくとも１つの候補化合物を前記溶液中のＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質と接触させる工程と、
（ｃ）前記ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶を調製する工程と、
（ｄ）前記ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の候補結合化合物を同定する工程と、
を含む、方法。
［８］
工程（ｄ）において、請求項３で定義されたＤＮＡ相互作用部位への候補化合物の結合が決定される、［７］に記載の方法。
［９］
原子空間関係データを得るための、［１］から［３］のいずれかに定義された結晶構造の使用。
［１０］
ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質への薬物結合をスクリーニング、同定、設計、又は最適化するための、［９］に記載の結晶構造の使用。
［１１］
候補化合物が前記ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質に結合する、特にＤＮＡ相互作用部位に結合する能力のインシリコスクリーニングのためのＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶構造の使用。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明の目的は、独立請求項の教示によって解決される。本発明のさらなる有利な特徴、態様及び詳細は、本出願の従属請求項、説明、図面及び例から明らかである。
【0009】
したがって、本発明は、請求項１に特徴付けられるＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶形態に関する。好ましい実施形態は、従属請求項の主題である。
ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ元の全長複製タンパク質
ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＤＳ６３３９８．１
（複製可能なエピソームＤＮＡ ＭＳＢＩ１．１７６にコードされる）
Ｅｍｂｌ系統ＤＮＡ配列：ＬＫ９３１４９１．１
供給源：多発性硬化症に罹患したヒト脳
＞ＭＳＢＩ１．１７６推定複製イニシエータタンパク質
ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ元の全長複製タンパク質
ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＤＳ６３３９８．１
（複製可能なエピソームＤＮＡ ＭＳＢＩ１．１７６にコードされる）
Ｅｍｂｌ系統ＤＮＡ配列：ＬＫ９３１４９１．１
供給源：多発性硬化症に罹患したヒト脳
＞ＭＳＢＩ１．１７６推定複製イニシエータタンパク質
【化1】
【0010】
本発明をもたらす実験中に、ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ドメイン（残基２～１３３）のＸ線結晶構造を１．５３Å分解能で解明した（データ統計を表１に示す）。非対称単位は、１つのＷＨ１二量体、すなわち２つのプロトマー（Ａ及びＢと呼ばれる）からなっていた。電子密度は、ほとんどのタンパク質について十分に分解された（平均Ｂ因子＝２９、４３Å２）。しかし、残基３６～３９は、識別可能な電子密度の欠如のためにＢプロトマーにフィットすることができなかったが、電子密度は他のプロトマーでは異なっていた。ＷＨ１構造は、各プロトマーに５つのαヘリックス（α１～α５）及び５つのβ鎖（β１～β５）を含んでいた（図１）。Ａ及びＢプロトマーは密接に関連していた（ＲＭＳＤ＝０．３７Å）が、β２－β３ヘアピンでわずかな構造シフトが観察され、この領域のいくらかの柔軟性を示唆している。重要なことに、以前の構造（２４～２７）よりもこの改善された分解能により、水分子がこのＲｅｐ構造に効果的に付加された。
【0011】
ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１タンパク質構造のデータ収集及び精密化統計を表１に要約する。
【表1】
【0012】
密接に関連する構造及び配列についてのデータベース検索により、ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１が、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）ＲｅｐＡ ＷＨ１（ｄＲｅｐＡ、ＰＤＢ ＩＤ １ＨＫＱ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＲｅｐＥ融合ＷＨ１－２（ＲｅｐＥ５４、１ＲＥＰ）とそれぞれ２８％及び１７％のアミノ酸同一性という例外的に低いアミノ酸同一性を有することが明らかになった（２４、２５）。ｄＲｅｐＡと同様に、ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１も複製不活性二量体として折り畳まれ、ＲｅｐＥ５４（ＷＨ１－２構築物）は単量体イニシエータ形態で結晶化した。ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１及びｄＲｅｐＡ ＷＨ１の重ね合わせは、これらの２つのドメインが構造的に類似しており（ＲＭＳＤ＝１．２０Å）、両方とも典型的な５つのαヘリックス及び５つのβ鎖を有することを示した（図２）。これらの２つのＲｅｐｓの間で多くの構造的類似性及び相違が観察された。５つのβ鎖（β１－β５－β４－β３－β２）を含むＭＳＢＩ１．１７６及びｄＲｅｐＡ二量体界面は、同一の残基ではないが、同様の数の主鎖結合相互作用で保持された（図３Ａ）。この結果は、二量体界面特徴が多様なＲｅｐ分離株の間で機能的に関連している可能性が高いことを示唆した。本発明者らは、水分子がこの二量体界面で結合することを観察した（図３Ｂ）。しかし、これらの水分子が二量体界面を安定化し、及び／又はＤＮＡに結合して立体構造を変化させた後にどのように置き換えられるかはまだ知られていない。
【0013】
本発明者らはまた、α１－α２－α５を含むＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１領域がｄＲｅｐＡと同様の配向であり、典型的なα１－α２湾曲を有し、それによってＶ字形構造を形成することを観察した（図３Ｃ）。ＷＨ２に対するリンカーを形成するｄＲｅｐＡのこの領域は、疎水性７アミノ酸ポケットも含み、これは典型的にはいくつかのロイシン残基（例えば、ｄＲｅｐＡ：Ｌｅｕ１２、Ｌｅｕ１９、及びＬｅｕ２６、ＲｅｐＥ：Ｌｅｕ２４、Ｌｅｕ３１、及びＬｅｕ３９）を含んでいた。ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１疎水性ポケットはまた、３つのロイシン残基、すなわちＬｅｕ１１、Ｌｅｕ１８及び／又はＩｌｅ２５を含むか又はそれらからなり、これらは同様にｄＲｅｐＡ内に配置されていた。驚くべきことではないが、水分子はＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１疎水性ポケットに存在しなかった（図３Ｂ）。
【0014】
一般に、多くのＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１構造的特徴は、他の既知の二量体Ｒｅｐ構造に保存されていた（２４～２７）。しかし、ループ運動並びに異なるαヘリックス及びβ鎖が異なる構造の間で観察されている。ＭＳＢＩ１．１７６の場合、β２－β３－ヘアピンは、ｄＲｅｐＡ β２－β３－ヘアピンと比較した場合、約２３Åシフトした（図４）。ＲｅｐＥ５４の場合、この等価なβ２－β３－ヘアピン（残基９７～１１０）は、電子密度が不足していたので（２０、２４）、構造に付加されなかった。ＲｅｐＥ５４ β２－β３－ヘアピンは柔軟であり、この柔軟性は、逆平行β２－β３－ヘアピンを不安定化し、二量体化を阻止することによって機能し得ることが示唆された（２０、２４）。しかし、ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ β２－β３－ヘアピンは、ｄＲｅｐＡ構造と同様、直接的な主鎖相互作用で明確に保持されていた（図３Ａ）。さらに、本発明者らは、この二量体界面での水媒介性相互作用もまた、このヘアピンにさらなる安定性を付加し得ることを認識した（図３Ｂ）。
【0015】
ｄＲｅｐＡドメインの以前のモデリング分析は、α２、β２、β３、及び隣接ループ上の６つの塩基性残基（ｄＲｅｐＡナンバリング：Ｌｙｓ７４、Ａｒｇ８１、Ａｒｇ９１、Ａｒｇ９３、Ｌｙｓ６２、Ａｒｇ７８）がＤＮＡ骨格の副溝に続く可能性があることを示した（２４）。ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１構造では、この領域に６つの塩基性残基も見出された。これらは、Ｌｙｓ６９、Ｌｙｓ７３（α２上に位置する）、Ｌｙｓ８５（β２）、Ａｒｇ９０（β３）、Ａｒｇ７８及び／又はＡｒｇ９６（隣接するループ上）を含むか又はそれらからなるＤＮＡ相互作用部位を表すと考えられる。ＤＮＡ相互作用部位には、好ましくは正に帯電したアミノ酸が蓄積し、ＤＮＡの負電荷と静電的に相互作用する。ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ Ｌｙｓ７３Ａ／Ｂ鎖、Ｌｙｓ８５Ａ／Ｂ鎖及びＡｒｇ９０Ａ鎖側鎖の電子密度は弱いが、これらの残基の２つ（Ａｒｇ７８及びＡｒｇ９６）は同等のｄＲｅｐＡ位置にあり、ＤＮＡ分子と相互作用することが示唆された（２４）。ＭＳＢＩ１ ＷＨ１は、シートを伸長させるβ２鎖に３つのアミノ酸挿入を有していたが、ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ β２－β３シート配向の機能は明らかではない。おそらく、この挿入は、同等のｄＲｅｐＡ残基Ａｒｇ８１及びＡｒｇ９１と比較した場合、β２－β３シート上でＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ Ｌｙｓ８５（β２）及びＡｒｇ９０（β３）を簡潔にシフトさせた。別の方法で見ると、ＭＳＢＩ１．１７６ β２－β３シートはかなり平らであったが、ｄＲｅｐＡ β２－β３ヘアピンは反対方向に引っ掛かっていた（図２）。
【0016】
ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１構造の解明は、ＢＭＭＦ ＤＮＡのこの多様な群の中でＲｅｐタンパク質の間で構造的特徴がどのように変化し得るかをよりよく理解する上で重要な前進を表す。多発性硬化症の患者から単離されたこのＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１タンパク質が原核生物Ｒｅｐ構造と密接に類似していたという知見は重要な結果を有する。全体として、この新しい構造情報は、Ｒｅｐｓのオリゴマー性を阻害することができる新しい薬物標的の開発及び設計を支援する。本発明によれば、多発性硬化症のヒト脳試料から単離されたＢＭＭＦ（ＭＳＢＩ１．１７６）上にコードされたＲｅｐ ＷＨ１ドメインは、Ｘ線結晶学を使用して１．５３Å分解能で決定された。ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１の全体構造は、アミノ酸同一性が低い（２８％）にもかかわらず、他のＲｅｐ構造と著しく類似していた。ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１は、５つのαヘリックス、５つのβ鎖、及び疎水性ポケットを含む、他のＲｅｐに共通の要素を含んでいた。興味深いことに、ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ β２－β３ヘアピンは、他のＲｅｐｓと比較した場合、約２３Åシフトした。この領域は、ＤＮＡと相互作用することが知られており、ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ヘアピンにおけるアミノ酸挿入により、正に荷電したＤＮＡ結合残基がβ２－β３シートに沿ってさらにシフトした。本発明のデータはまた、水分子がタンパク質中のαヘリックス及びβ鎖をさらに安定化することを示す。全体として、これらの新たな知見は、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐが異なる起源からの他の既知のＲｅｐと同等の役割及び機能を有し得ることを裏付けている。
【0017】
さらに、本発明は、阻害剤ＭＳＢＩ１．１７６を同定する方法、並びにＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶形態を調製する方法及びそれらの結晶構造情報を確立することを可能にする。データは、そのような構造データの使用に基づいて合理的な薬物設計を可能にする。
【0018】
本発明はまた、ＭＳＢＩ １．１７６ Ｒｅｐタンパク質の阻害剤を同定及び／又は設計する可能性を提供し、結晶形態、結晶形態から得られる結晶構造情報、そのような結晶形態を調製する方法、ＭＳＢＩ １．１７６ Ｒｅｐタンパク質活性の阻害剤を同定及び／又は設計するためのその使用、並びにこれらの方法によって同定されたＭＳＢＩ １．１７６ Ｒｅｐタンパク質の阻害剤の診断及び／又は医薬用途に関する。
【0019】
「結晶形態」又は「結晶構造」（互換的に使用される）という用語は、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質に結合した界面活性剤及び／又は核酸（特に、ＤＮＡ）を含む又は含まないＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶形態を指す。
【0020】
本明細書で使用される「単位格子」という用語は、平行移動操作のみで結晶を生成することができる最小の繰り返し単位を指す。単位格子は、結晶の構造及び対称性情報のすべてを含み、行移動によって空間のすべてにおいてパターンを再現することができる体積の最小単位である。それにより、構造情報は、パターン（原子）にすべての周囲空間を加えたものであり、対称情報は、鏡、滑り、軸、及び反転中心を意味する。平行移動は、格子端の長さの格子端に沿った動きを指す。非対称単位は、結晶学的対称性によって許容される対称性オペレータのみを使用して１つの単位格子を生成するために回転及び平行移動させることができる最小単位である。非対称単位は、多量体タンパク質の１つの分子又は１つのサブユニットであってもよいが、２つ以上であってもよい。したがって、非対称単位は、構造情報のすべてを含み、対称操作を適用することによって単位格子を再現することができる体積の最小単位である。単位格子の形状は、群を構成する対称要素の集合によって制約される。空間群には、三斜晶系、単斜晶系、斜方晶系（ｏｒｔｈｏｒｈｏｍｂｉｃ）、正方晶系、六方晶系、斜方晶系（ｒｈｏｍｂｉｃ）及び立方晶系の７つの格子型が可能である。結晶学では、空間群は結晶学群又はＦｅｄｏｒｏｖ群とも呼ばれる。単位格子の端は、単位格子の寸法をそれぞれの長さａ、ｂ、及びｃとして、単位ベクトル軸ａ、ｂ、及びｃのセットを定義する。これらのベクトルは直角である必要はなく、軸間の角度は、ｂｃ軸間のようにαで示され、ａｃ軸間のβで示され、ａｂ軸間のγで示される。異なる形状は、３つの端部の長さ（ａ、ｂ、及びｃ）及び３つの角度の値（α、β、γ）に課される制限に応じて生じる。
【0021】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＭＳＢＩ １．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶形態が疎水性ポケットを含有するか又はさらに含有し、疎水性ポケットがアミノ酸Ｌｅｕ１１、Ｌｅｕ１８及びＩｌｅ２５を含有する。
【0022】
ＭＳＢＩ １．１７６ Ｒｅｐタンパク質の潜在的な阻害剤は、Ｒｅｐタンパク質の活性を低下させるためにＤＮＡ相互作用部位に結合することができる。したがって、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質に結合する能力を有し得る化合物を設計、同定及び／又は最適化する方法は、結晶構造座標に基づくことができる。
【0023】
ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の潜在的な阻害剤は、構造に基づく機能及びタンパク質活性／局在化／安定性／修飾を調節するＲｅｐオリゴマー形成面に結合することができた。
【0024】
ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の潜在的な阻害剤は、構造に基づく機能及びタンパク質活性／局在化／安定性／修飾を調節する依然として未知のタンパク質相互作用表面に結合することができる。
【0025】
ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の潜在的な阻害剤は、構造的に関連する原核生物Ｒｅｐ（例えば、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）種由来）に結合して、ＤＮＡ結合、オリゴマー形成及び／又は付加タンパク質相互作用界面の立体障害に基づいて、異なる起源由来のそのようなＲｅｐタンパク質の活性を低下させることができた。
【0026】
本明細書に開示されるＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶形態は、以下の結晶化方法によって得ることができる。したがって、本発明は、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質を結晶化するための方法に関し、
（ａ）好ましくは少なくとも１種の無機塩及び少なくとも１種の沈殿剤を含有する結晶化試薬中で、組換え調製ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ドメインの溶液を調製する工程、
（ｂ）蒸気拡散によって当該ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ドメインを結晶化する工程、を含む。
（ａ）好ましくは少なくとも１種の無機塩及び少なくとも１種の沈殿剤を含有する結晶化試薬中で、組換え調製ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ドメインの溶液を調製する工程、
（ｂ）蒸気拡散によって当該ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ドメインを結晶化する工程、を含む。
【0027】
少なくとも１種の無機塩は、０．０１ｍＭ～２Ｍ、好ましくは０．１ｍＭ～１Ｍ、より好ましくは０．１Ｍ～０．５Ｍ、より好ましくは約０．２Ｍの量で使用される。２種以上の無機塩が使用される場合、前述の濃度は、すべての無機塩を合わせた濃度を指し、無機塩の混合物に使用される各単一塩の濃度を指すのではない。
【0028】
好ましくは、無機塩は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、フッ化アンモニウム、臭化アンモニウム、ヨウ化アンモニウム、窒化アンモニウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、ギ酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、酢酸カリウム、臭化カリウム、フッ化カリウム、塩化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、臭化ナトリウム、フッ化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸亜鉛を含むか又はそれらからなる群から選択される。好ましい無機塩は、酢酸マグネシウムである。
【0029】
理論的には、少なくとも１種の沈殿剤は、水に対してタンパク質溶質と競合し、したがってタンパク質の過飽和をもたらす。結晶は通常、過飽和状態からのみ成長することができ、したがって結晶は析出物から成長することができる。塩、ポリマー、及び有機溶媒は、緩衝沈殿剤溶液の総重量に関して沈殿剤又は沈殿剤の混合物の５重量％～５０重量％、好ましくは１０重量％～４０重量％、より好ましくは１５重量％～３５重量％、最も好ましくは２０重量％～３０重量％の量で使用される適切な沈殿剤である。
【0030】
工程（ｂ）の緩衝沈殿剤溶液に使用される沈殿剤は、好ましくは、２－メチル－２，４ペンタンジオール、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ペンタエリスリトールプロポキシラート、ペンタエリスリトールエトキシラート、ポリアクリル酸ナトリウム、ヘキサンジオール、イソプロパノール、エタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ジオキサン、エチレンイミンポリマー、エチレングリコール、プロパンジオール、ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、２－エトキシエタノール、又はそれらの混合物からなるか又はそれらを含む群から選択され得る。沈殿剤として最も好ましいのはＰＥＧであり、好ましくはＰＥＧ２００～ＰＥＧ２０，０００の範囲の分子量を有し、より好ましくはＰＥＧ１，０００～ＰＥＧ１８，０００の範囲の分子量を有し、さらにより好ましくはＰＥＧ３，０００～ＰＥＧ１５，０００の範囲の分子量を有する。ＰＥＧは非常に好ましい沈殿剤であり、緩衝沈殿剤溶液の重量の２０～３０重量％の量で使用されることが好ましい。
【0031】
最も好ましい実施形態では、結晶化緩衝液は、０．２Ｍ酢酸マグネシウム及び２０％ＰＥＧ３３５０を含む。
【0032】
好ましい実施形態では、ハンギングドロップ法又はシッティングドロップ法が結晶化のために使用される。「ハンギングドロップ蒸気拡散」技術は、巨大分子の結晶化のための最も一般的な方法である。蒸気拡散の原理は簡単である。試料と結晶化試薬との混合物からなる液滴を、試薬の液体リザーバとの蒸気平衡状態に置く。典型的には、液滴はリザーバよりも低い試薬濃度を含む。平衡を達成するために、水蒸気は液滴を離れ、最終的にリザーバ内に入る。水が液滴を離れるにつれて、試料は過飽和の方向に増加する。水がリザーバの液滴を離れるにつれて、試料と試薬の両方の濃度が上昇する。液滴内の試薬濃度がリザーバ内の試薬濃度とほぼ同じである場合、平衡に達する。
【0033】
本発明のさらに重要な態様は、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の阻害剤の同定、最適化及び／又は設計のためのインシリコ予測モデルのためのＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の結晶形態の使用に関する。ＤＮＡ相互作用部位におけるアミノ酸の原子の正確な位置を知ることは、適切な阻害剤を設計する、例えば化合物ライブラリから適切な阻害剤を同定する、又は阻害能を高めることによって既知の適切な阻害剤を最適化する可能性を提供する。適切な阻害剤の設計、同定及び最適化は、当技術分野で周知の標準的なコンピュータベースの方法及びソフトウェアプログラムを用いて行うことができる。コンピュータベースのシステムにおけるデータの分析及び比較を行うために、様々な市販のソフトウェアプログラムが利用可能である。当業者は、コンピュータ分析を行うための利用可能なアルゴリズム又は実装ソフトウェアパッケージのうちのどれが、コンピュータベースのシステムにおける使用のために利用又は適合され得るかを容易に認識するであろう。標的構造モチーフ又は標的モチーフは、任意の合理的に選択された配列又は配列の組み合わせを指し、ここで、配列は、標的モチーフ折り畳み時に形成される三次元配置又は電子密度マップに基づいて配列が選択される。当技術分野で公知の様々な標的モチーフが存在する。入力及び出力手段のための様々な構造フォーマットを使用して、本発明のコンピュータベースのシステムにおいて情報を入力及び出力することができる。様々な比較手段を使用して、標的配列又は標的モチーフをデータ記憶手段と比較して、構造モチーフを同定するか、又は原子座標／Ｘ線回折データから部分的に導出された電子密度マップを解釈することができる。当業者は、使用することができる公的に入手可能なコンピュータモデリングプログラムのいずれか１つを容易に認識することができる。タンパク質を観察、分析、設計及び／又はモデル化するために使用することができる適切なソフトウェアは、Ａｌｃｈｅｍｙ（商標）、ＬａｂＶｉｓｉｏｎ（商標）、Ｓｙｂｙｌ（商標）、Ｍｏｌｃａｄｄ（商標）、Ｌｅａｐｆｒｏｇ（商標）、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ２０（商標）、Ｇｅｎｅｆｏｌｄ（商標）及びＳｉｔｅｌ（商標）（ミズーリ州セントルイスのＴｒｉｐｏｓ社から入手可能）、Ｑｕａｎｔａ（商標）、ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ（商標）及びＧＲＡＳＰ（商標）、Ｕｎｉｖｉｓｉｏｎ（商標）、Ｃｈｅｍ３Ｄ（商標）及びＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｅｒｔ（商標）を含む。
【0034】
したがって、さらなる態様では、本発明は、コンピュータベースの方法又はソフトウェアプログラムによって阻害剤を設計、同定又は最適化するために、結晶形態及び結晶形態の関連する構造座標又はＤＮＡ相互作用部位の少なくとも１つを適用することによってＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質の阻害剤を設計、同定及び最適化する方法に関する。
【0035】
原子座標／Ｘ線回折データを使用して、物理モデルを作成することができ、次いで、物理モデルを使用して、決定されたＤＮＡ相互作用部位、あるいは疎水性ポケット及び／又はＤＮＡ相互作用部位に隣接するポケットなどの他の構造的又は機能的ドメイン又はサブドメインを阻害及び／又は相互作用する能力又は特性を有するべき化合物の分子モデルを設計することができる。あるいは、複合体の原子座標／Ｘ線回折データは、決定された部位、あるいは他の構造的又は機能的ドメイン又はサブドメインを阻害及び／又は相互作用すると予想される異なる分子を計算するためにコンピュータモデリングシステムで使用することができるコンピュータ可読媒体上の原子モデル出力データとして表すことができる。例えば、データのコンピュータ分析により、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質と化合物との三次元相互作用を計算して、化合物が特定のドメイン又はサブドメインに結合するか、又はその立体配座を変化させることを確認することができる。次いで、物理モデル又はコンピュータモデルの分析から同定された化合物を合成し、適切なアッセイで生物学的活性について試験することができる。
【0036】
阻害剤が化合物ライブラリから同定される場合、又は既知の阻害剤が理論的化学修飾によって最適化される場合、阻害効果を検証し、最適化プロセスを継続するために、実際の化合物を試験することが望ましい。したがって、好ましくは、化合物を同定及び／又は最適化するための上記の方法は、
（ａ）同定又は最適化された化合物を得る工程、
（ｂ）ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質に対する阻害効果を決定するために、同定又は最適化された化合物をＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質と接触させる工程、を含む。
（ａ）同定又は最適化された化合物を得る工程、
（ｂ）ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質に対する阻害効果を決定するために、同定又は最適化された化合物をＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐタンパク質と接触させる工程、を含む。
【0037】
表１に列挙されたすべての構造座標を使用する必要はない。したがって、疎水性ポケット及び／又はＤＮＡ相互作用部位の構造座標のみを使用することができる。
【0038】
本出願では、多発性硬化症のヒト脳試料から単離されたＢＭＭＦ（ＭＳＢＩ１．１７６）上にコードされたＲｅｐ ＷＨ１ドメインは、Ｘ線結晶学を使用して１．５３Å分解能で決定された。ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１の全体構造は、アミノ酸同一性が低い（２８％）にもかかわらず、他のＲｅｐ構造と著しく類似していた。ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１は、５つのαヘリックス、５つのβ鎖、及び疎水性ポケットを含む、他のＲｅｐに共通の要素を含んでいた。これらの新たな知見は、ＭＳＢＩ１．１７６ Ｒｅｐが異なる起源からの他の既知のＲｅｐと同等の役割及び機能を有し得ることを示唆している。Ｒｅｐは、異なる宿主におけるプラスミド又は自己エピソーム核酸の複製に重要である。したがって、そのようなタンパク質及びＲｅｐをコードするＤＮＡは、疾患と関連している可能性があると考えられている。したがって、Ｒｅｐの慎重な構造的及び機能的特徴付けが必要である。本研究に記載されたＲｅｐは、多発性硬化症の患者から単離されたヒト生物活性ｂｏｖｉｎｅ ｍｅａｔ ａｎｄ ｍｉｌｋ ｆａｃｔｏｒ ＭＳＢＩ １．１７６によってコードされている。特定の血清抗体は、そのような薬剤に対する一般的なヒト曝露を指す健康なヒト血液バンクドナーのセットにおいて見出された。このＭＳＢＩ１．１７６にコードされたＲｅｐ ＷＨ１タンパク質が原核生物Ｒｅｐ構造と密接に類似しているという発見は、重要な結果を有する可能性があり、ヒトに対するこれらの薬剤の疾患に相関する適応の可能性を指摘する。この新しい構造情報は、多様な起源のこれらのＲｅｐを阻害することができる治療薬／予防薬の開発及び設計を支援し得る。
【0039】
以下の略語は、本明細書で言及される一般的なアミノ酸及び修飾アミノ酸に使用される。
アミノ酸
Ａｌａ アラニン
Ａｒｇ アルギニン
Ａｓｎ アスパラギン
Ａｓｐ アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）（アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔａｔｅ））
Ｃｙｓ システイン
Ｇｌｎ グルタミン
Ｇｌｕ グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）（グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ））
Ｇｌｙ グリシン
Ｈｉｓ ヒスチジン
ｌｌｅ イソロイシン
Ｌｅｕ ロイシン
Ｌｙｓ リジン
Ｍｅｔ メチオニン
Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｐｒｏ プロリン
Ｓｅｒ セリン
Ｔｈｒ スレオニン
Ｔｒｐ トリプトファン
Ｔｙｒ チロシン
Ｖａｌ バリン
アミノ酸
Ａｌａ アラニン
Ａｒｇ アルギニン
Ａｓｎ アスパラギン
Ａｓｐ アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）（アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔａｔｅ））
Ｃｙｓ システイン
Ｇｌｎ グルタミン
Ｇｌｕ グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）（グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ））
Ｇｌｙ グリシン
Ｈｉｓ ヒスチジン
ｌｌｅ イソロイシン
Ｌｅｕ ロイシン
Ｌｙｓ リジン
Ｍｅｔ メチオニン
Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｐｒｏ プロリン
Ｓｅｒ セリン
Ｔｈｒ スレオニン
Ｔｒｐ トリプトファン
Ｔｙｒ チロシン
Ｖａｌ バリン
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１二量体のＸ線結晶構造。 ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１プロトマーは、鎖Ａではシアン、鎖Ｂではオレンジ色に着色されている。１つのプロトマーは、５つのαヘリックス（α１～α５）及び５つのβ鎖（β１～β５）を含む。二量体界面は、２本の鎖（β４～β３）を含む。
【図2】密接に一致する原核生物ＲｅｐＡ ＷＨ１との構造比較。 ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１及びＲｅｐＡ ＷＨ１のアミノ酸同一性は２８％である。ＲｅｐＡ（灰色）と重ね合わせると、これらの２つのＷＨ１二量体が非常に類似しており、ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．が１．２０Åであることを示した。伸長したループにおける構造的差異が観察され、注目すべきことに、α２及びβ１並びにβ２及びβ３を接続するループが観察された。
【図3】ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１のＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１構造類似性。 （Ａ）５つのβシート（β１－β５－β４－β３－β２）は、ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１（シアン及びオレンジ色）及びＲｅｐＡＷＨ１（灰色）における主鎖相互作用を示す。β鎖は、二量体界面（β４－β３）を含む、ＲｅｐＡと同様の多数の主鎖水素結合（破線）によって保持された。 （Ｂ）α１－α２－α５を含む領域の配向は、ＲｅｐＡと同様であった。この領域はＶ字型構造を生成し、α５はＷＨ２ドメインに対するリンカー領域である。疎水性ポケットはまた、３つのロイシン残基、すなわちＬｅｕ１１、Ｌｅｕ１８及びＩｌｅ２５を含み、これらは同様にＲｅｐＡに位置していた（データは示さず）。
【0041】
以下の例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するために本発明者によって発見された技術を表し、したがってその実施のための好ましい形態を構成すると考えることができることを当業者は理解されたい。本発明の様々な態様の変更及び代替実施形態は、この説明を考慮すれば当業者には明らかであろう。
【0042】
したがって、この説明は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実施する一般的な方法を当業者に教示する目的のためのものである。本明細書に示され説明される本発明の形態は、実施形態の例として解釈されるべきであることを理解されたい。本発明のこの説明の利益を得た後に当業者にはすべて明らかであるように、要素及び材料は、本明細書に図示及び記載されたものに置き換えられてもよく、部品及びプロセスは逆にされてもよく、本発明の特定の特徴は独立して利用されてもよい。
【実施例】
【0043】
例１：ＭＳＢＩ１ ＷＨ１の結晶を得る方法
多発性硬化症患者の脳試料からＭＳＢＩ１．１７６ ＤＮＡ（ＬＫ９３１４９１．１）を単離した（１１）。ＭＳＢＩ１ ＷＨ１ドメイン（残基１～１３５）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、ヒトノロウイルス突出ドメインについて以前に記載されたように精製した（２９）。簡潔には、コドン最適化ＷＨ１を改変発現ベクターｐＭａｌ－ｃ２Ｘ（Ｇｅｎｅａｒｔ）にクローニングし、タンパク質発現のためにＢＬ２１細胞に形質転換した。形質転換細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したＬＢ培地中で３７℃で４時間増殖させた。発現を、ＩＰＴＧ（０．７５ｍＭ）を用いて、０．７のＯＤ６００で、２２℃で１８時間誘導した。細胞を６０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって回収し、氷上での超音波処理によって破壊した。Ｈｉｓタグ付き融合ＭＢＳＩ１タンパク質を最初にＮｉカラム（Ｑｉａｇｅｎ）から精製し、１０ｍＭイミダゾールを含むゲル濾過緩衝液（ＧＦＢ：２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及び３００ｍＭ ＮａＣｌ）で透析し、ＨＲＶ－３Ｃプロテアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で４℃で一晩消化した。次いで、切断されたＭＳＢＩ１ ＷＨ１を再びＮｉカラムに適用して、切断されたタンパク質を分離及び回収し、４℃で一晩ＧＦＢ中で透析した。ＭＳＢＩ１ ＷＨ１タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィによってさらに精製し、５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、４℃でＧＦＢに保存した。ＭＳＢＩ１ ＷＨ１の結晶を、タンパク質試料と母液（０．２Ｍ酢酸マグネシウム及び２０％ＰＥＧ３３５０）との１：１混合物中、１８℃で約６～１０日間、ハンギングドロップ蒸気拡散法を使用して成長させた。データ収集の前に、ＭＳＢＩ１ ＷＨ１結晶を、４０％ＰＥＧ３３５０を含む母液を含む凍結保護剤に移し、続いて液体窒素中で急速凍結した。
多発性硬化症患者の脳試料からＭＳＢＩ１．１７６ ＤＮＡ（ＬＫ９３１４９１．１）を単離した（１１）。ＭＳＢＩ１ ＷＨ１ドメイン（残基１～１３５）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、ヒトノロウイルス突出ドメインについて以前に記載されたように精製した（２９）。簡潔には、コドン最適化ＷＨ１を改変発現ベクターｐＭａｌ－ｃ２Ｘ（Ｇｅｎｅａｒｔ）にクローニングし、タンパク質発現のためにＢＬ２１細胞に形質転換した。形質転換細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したＬＢ培地中で３７℃で４時間増殖させた。発現を、ＩＰＴＧ（０．７５ｍＭ）を用いて、０．７のＯＤ６００で、２２℃で１８時間誘導した。細胞を６０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって回収し、氷上での超音波処理によって破壊した。Ｈｉｓタグ付き融合ＭＢＳＩ１タンパク質を最初にＮｉカラム（Ｑｉａｇｅｎ）から精製し、１０ｍＭイミダゾールを含むゲル濾過緩衝液（ＧＦＢ：２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及び３００ｍＭ ＮａＣｌ）で透析し、ＨＲＶ－３Ｃプロテアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で４℃で一晩消化した。次いで、切断されたＭＳＢＩ１ ＷＨ１を再びＮｉカラムに適用して、切断されたタンパク質を分離及び回収し、４℃で一晩ＧＦＢ中で透析した。ＭＳＢＩ１ ＷＨ１タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィによってさらに精製し、５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、４℃でＧＦＢに保存した。ＭＳＢＩ１ ＷＨ１の結晶を、タンパク質試料と母液（０．２Ｍ酢酸マグネシウム及び２０％ＰＥＧ３３５０）との１：１混合物中、１８℃で約６～１０日間、ハンギングドロップ蒸気拡散法を使用して成長させた。データ収集の前に、ＭＳＢＩ１ ＷＨ１結晶を、４０％ＰＥＧ３３５０を含む母液を含む凍結保護剤に移し、続いて液体窒素中で急速凍結した。
【0044】
例２：Ｘ線回折
ＭＳＢＩ１ ＷＨ１ドメインのＸ線回折データを、ビームラインＩＤ２３－１及びＩＤ３０Ｂで欧州シンクロトロン放射施設（ＥＳＲＦ）で収集した。天然硫黄を使用した単波長異常回折（Ｓ－ＳＡＤ）実験では、７つの結晶からの回折データを、Ｄｅｃｔｒｉｓピクセルアレイ検出器ＰＩＬＡＴＵＳ－６Ｍを備えたビームラインＩＤ２３－１上でλ＝１．８５０Åで収集した。試料位置でのＸ線ビームサイズは５０μｍであり、結晶のサイズは約７０×７０×２００μｍ３であった。放射線損傷の影響を減少させるために、螺旋データ収集戦略を適用した。１つのネイティブデータセットは、初期位相拡張のためにλ＝０．９７２ÅでＩＤ２３－１において収集され、第２のネイティブデータセットは、構造精密化のためにλ＝０．９７９ÅでＩＤ３０Ｂにおいて収集された。データ収集のための最適な実験パラメータは、ＥＳＲＦのＭｘＣｕｂｅソフトウェア（３１）に組み込まれたＢＥＳＴ（３０）を使用して設計された。単一のネイティブデータセットはＸＤＳで処理されたが、Ｓ－ＳＡＤの複数のデータセットはＸＤＳで処理され、次いでＸＳＣＡＬＥ（３２）を使用してマージされた。
ＭＳＢＩ１ ＷＨ１ドメインのＸ線回折データを、ビームラインＩＤ２３－１及びＩＤ３０Ｂで欧州シンクロトロン放射施設（ＥＳＲＦ）で収集した。天然硫黄を使用した単波長異常回折（Ｓ－ＳＡＤ）実験では、７つの結晶からの回折データを、Ｄｅｃｔｒｉｓピクセルアレイ検出器ＰＩＬＡＴＵＳ－６Ｍを備えたビームラインＩＤ２３－１上でλ＝１．８５０Åで収集した。試料位置でのＸ線ビームサイズは５０μｍであり、結晶のサイズは約７０×７０×２００μｍ３であった。放射線損傷の影響を減少させるために、螺旋データ収集戦略を適用した。１つのネイティブデータセットは、初期位相拡張のためにλ＝０．９７２ÅでＩＤ２３－１において収集され、第２のネイティブデータセットは、構造精密化のためにλ＝０．９７９ÅでＩＤ３０Ｂにおいて収集された。データ収集のための最適な実験パラメータは、ＥＳＲＦのＭｘＣｕｂｅソフトウェア（３１）に組み込まれたＢＥＳＴ（３０）を使用して設計された。単一のネイティブデータセットはＸＤＳで処理されたが、Ｓ－ＳＡＤの複数のデータセットはＸＤＳで処理され、次いでＸＳＣＡＬＥ（３２）を使用してマージされた。
【0045】
さらなる処理のためにＳ－ＳＡＤを使用していくつかのデータセットを収集した（３３）。Ｓ－ＳＡＤ整相プロトコルは、ＨＫＬ２ＭＡＰ（３４）に実装されているＳＨＥＬＸＣ／Ｄ／Ｅパイプラインを使用して実行した。ＳＨＥＬＸＣでの下部構造決定のために１０００回の試行を行った。２．３Åの分解能及び３．１Åに短縮された異常シグナルを使用して、ＳＨＥＬＸＤは２４個すべての硫黄部位を正しく同定した。４１５残基をＳＨＥＬＸＥによって自動的に構築し、さらなる処理のための解釈可能なマップを得た。最後に、収集された最初のＳ－ＳＡＤネイティブデータセットに基づいて自動モデル構築にＡＲＰ－ｗＡＲＰを使用した（３５）。構造は、ＣＯＯＴ（３６）及びＰＨＥＮＩＸ（３７）における複数回の手動モデル構築で第２の高解像度ネイティブデータセットを使用して改良された。Ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ及びＰｒｏｃｈｅｃｋを使用して構造を検証した。Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（バージョン４．１）を使用して、２．４～３．５Åの間の水素結合距離で相互作用を分析した。ＰｙＭＯＬを使用して、図及びタンパク質接触電位を作成した。原子座標及び構造因子は、６Ｈ２４のアクセションコードでタンパク質データバンク（ＰＤＢ）に寄託されている。
【0046】
例３：ＤＮＡ結合のモデリング
ＲｅｐＡドメインの以前のモデリング分析は、α２、β２、β３、及び隣接するループ上の６つの塩基性残基（ＲｅｐＡナンバリング：Ｌｙｓ７４、Ａｒｇ８１、Ａｒｇ９１、Ａｒｇ９３、Ｌｙｓ６２、及びＡｒｇ７８）がＤＮＡ骨格の副溝に続く可能性があることを示した（２４）。ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１構造では、この領域に６つの塩基性残基、すなわちＬｙｓ６９、Ｌｙｓ７３（両方ともα４上に位置する）、Ｌｙｓ８５（β２）、Ａｒｇ９０（β３）、Ａｒｇ７８及びＡｒｇ９６（両方とも隣接ループ上にある）も見出された。ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ Ｌｙｓ７３Ａ／Ｂ鎖、Ｌｙｓ８５Ａ／Ｂ鎖及びＡｒｇ９０Ａ鎖側鎖の電子密度は弱いが、これらの残基の２つ（Ａｒｇ７８及びＡｒｇ９６）は同等のＲｅｐＡ位置にあり、ＤＮＡ分子と相互作用することが示唆された（２４）。ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１は、シートを伸長させるβ２鎖に３つのアミノ酸挿入を有していたが、ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ β２－β３シート配向の機能は明らかではない。おそらく、この挿入は、同等のＲｅｐＡ残基Ａｒｇ８１及びＡｒｇ９１と比較した場合、β２－β３シート上でＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ Ｌｙｓ８５（β２）及びＡｒｇ９０（β３）を簡潔にシフトさせた。別の方法で見ると、ＭＳＢＩ１．１７６ β２－β３シートはかなり平らであったが、ＲｅｐＡ β２－β３ヘアピンは反対方向に引っ掛かっていた。
ＲｅｐＡドメインの以前のモデリング分析は、α２、β２、β３、及び隣接するループ上の６つの塩基性残基（ＲｅｐＡナンバリング：Ｌｙｓ７４、Ａｒｇ８１、Ａｒｇ９１、Ａｒｇ９３、Ｌｙｓ６２、及びＡｒｇ７８）がＤＮＡ骨格の副溝に続く可能性があることを示した（２４）。ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１構造では、この領域に６つの塩基性残基、すなわちＬｙｓ６９、Ｌｙｓ７３（両方ともα４上に位置する）、Ｌｙｓ８５（β２）、Ａｒｇ９０（β３）、Ａｒｇ７８及びＡｒｇ９６（両方とも隣接ループ上にある）も見出された。ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ Ｌｙｓ７３Ａ／Ｂ鎖、Ｌｙｓ８５Ａ／Ｂ鎖及びＡｒｇ９０Ａ鎖側鎖の電子密度は弱いが、これらの残基の２つ（Ａｒｇ７８及びＡｒｇ９６）は同等のＲｅｐＡ位置にあり、ＤＮＡ分子と相互作用することが示唆された（２４）。ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１は、シートを伸長させるβ２鎖に３つのアミノ酸挿入を有していたが、ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ β２－β３シート配向の機能は明らかではない。おそらく、この挿入は、同等のＲｅｐＡ残基Ａｒｇ８１及びＡｒｇ９１と比較した場合、β２－β３シート上でＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１ Ｌｙｓ８５（β２）及びＡｒｇ９０（β３）を簡潔にシフトさせた。別の方法で見ると、ＭＳＢＩ１．１７６ β２－β３シートはかなり平らであったが、ＲｅｐＡ β２－β３ヘアピンは反対方向に引っ掛かっていた。
【化2】
【0047】
ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｇｅｎｅｔｙｘ）を使用して、ＭＳＢＩ１．１７６（ＬＫ９３１４９１．１）及びＲｅｐＡ（ＰＤＢ ＩＤ １ＨＫＱ）の上記アミノ酸配列アラインメントを生成した。結晶構造を用いて二次構造要素を示し、確認した。同一の残基及び相同な残基は、それぞれ塗りつぶした背景又はボックスで強調表示される。おそらく、ＤＮＡ分子は二量体界面に沿って相互作用し、この領域の６つの塩基性残基、すなわちＬｙｓ６９（α４）、Ｌｙｓ７３（α４）、Ａｒｇ７８、Ｌｙｓ８５（β２）、Ａｒｇ９０（β３）及びＡｒｇ９６と相互作用する可能性がある。ＤＮＡ相互作用に関与することが示唆されたＲｅｐＡの塩基性アミノ酸残基を逆三角形（▼）でマークし、ＭＳＢＩ１．１７６ ＷＨ１の等価物を三角形（▲）でマークした。
【0048】
参考文献
【配列表フリーテキスト】
【0049】
配列表１ ＜２２３＞ＭＳＢＩ１．７６タンパク質
配列表２ ＜２２３＞ＲｅｐＡドメイン
配列表２ ＜２２３＞ＲｅｐＡドメイン
【図1】
【図2】
【図3(a)】
【図3(b)】
【図4】
【配列表】