特許 7530355 エンドヌクレアーゼ保護による標的化濃縮

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-30

(45)【発行日】2024-08-07

(54)【発明の名称】エンドヌクレアーゼ保護による標的化濃縮

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20240731BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240731BHJP

   C12Q 1/6855 20180101ALI20240731BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20240731BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 Z ZNA

C12N15/09 110

C12Q1/6855 Z

C12Q1/6869 Z

【請求項の数】 20

(21)【出願番号】P 2021521506

(86)(22)【出願日】2019-11-27

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-01

(86)【国際出願番号】 EP2019082791

(87)【国際公開番号】W WO2020109412

(87)【国際公開日】2020-06-04

【審査請求日】2022-11-24

(31)【優先権主張番号】18208936.7

(32)【優先日】2018-11-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】508186875

【氏名又は名称】キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ホワイト， ステファン ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ホジャーズ， ルネ コルネリス ヨセフス

【審査官】福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１８－５００９３７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸分子を含むサンプルから標的核酸断片を濃縮するための方法であって、標的核酸断片が目的の配列を含み、方法が、
ａ）少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体で目的の配列を含む核酸分子を切断し、それにより、エキソヌクレアーゼ切断から保護される目的の配列を含む標的核酸断片、及び少なくとも１つの非標的核酸断片を生成するステップと；
ｂ１）ステップａ）で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも１つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップであって、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体は、ステップｂ１）の間、標的核酸断片に結合したままであるステップと
を含む、方法。

【請求項2】

ステップｂ１）で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップｂ２）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップｂ１）におけるエキソヌクレアーゼ消化の前に、標的核酸断片、又は標的核酸断片の末端を保護するさらなるステップを含まない、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

ｉ）ステップａ）が、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体と核酸分子を一緒に１分～１８時間、１０～９０℃でインキュベートすることによって実施されること；並びに
ｉｉ）ステップｂ１）が、切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼとともに１分～１２時間、１０～９０℃でインキュベートすることによって実施されること
のうちの少なくとも１つである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体のうちの少なくとも１つがｓｇＲＮＡを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体のうちの少なくとも１つが別個の分子としてｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体のうちの少なくとも１つがＤＳＢを誘導することができる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体の両方がＤＳＢを誘導することができる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

ステップａ）において、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体のうちの少なくとも１つが核酸分子の１つの鎖をニック導入し、核酸分子が、前記第１又は第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体によってニック導入された位置の実質的に相補的位置で相補鎖をニック導入する少なくとも第３のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体と接触される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

核酸分子を含むサンプルからアダプター連結標的核酸断片を調製するための方法であって、標的核酸断片が目的の配列を含み、方法が、
ａ）少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体で目的の配列を含む核酸分子を切断し、それにより、エキソヌクレアーゼ消化から保護される目的の配列を含む標的核酸断片、及び少なくとも１つの非標的核酸断片を生成するステップと；
ｂ１）ステップａ）で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも１つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップであって、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体は、ステップｂ１）の間、標的核酸断片に結合したままであるステップと；
ｃ）アダプターを標的核酸断片に連結させるステップと
を含む、方法。

【請求項11】

ステップｃ）においてアダプターを連結させる前に、ステップｂ１）で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップｂ２）を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

アダプターが配列決定アダプターである、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項13】

核酸分子を含むサンプルから標的核酸断片を配列決定するための方法であって、標的核酸断片が目的の配列を含み、方法が、
ａ）少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体で目的の配列を含む核酸分子を切断し、それにより、エキソヌクレアーゼ消化から保護される目的の配列を含む標的核酸断片、及び少なくとも１つの非標的核酸断片を生成するステップと；
ｂ１）ステップａ）で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも１つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップであって、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体は、ステップｂ１）の間、標的核酸断片に結合したままであるステップと；
ｃ）少なくとも１つの標的核酸断片を配列決定するステップと
を含む、方法。

【請求項14】

配列決定ステップｃ）の前に、ステップｂ１）で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップｂ２)を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

配列決定ステップｃ）の前に、アダプターを標的核酸断片に連結させるステップｂ３）を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

複数の核酸サンプルに対して並行して実施される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

核酸分子がゲノムＤＮＡである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

核酸分子が植物、動物、ヒト又は微生物から得られる核酸分子である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

請求項１～１８のいずれか一項で定義した少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体を含む１つ又は複数のバイアルと、
エキソヌクレアーゼを含む１つ又は複数のバイアルと
を含む、核酸分子から標的核酸断片を濃縮するためのキット。

【請求項20】

核酸分子から少なくとも１つの標的核酸断片を濃縮するための、請求項１～１８のいずれか一項に記載の第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ９複合体、又は請求項１９に記載のキットの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、例えば、遺伝子研究におけるさらなる分析又はプロセシング用のライブラリーを調製するための、遺伝子研究の分野、より詳細には、標的化核酸単離の分野におけるものである。核酸サンプルの複雑性を低減するか、又は核酸サンプル内の標的核酸を濃縮するための新しい方法及び組成物が開示されている。

【背景技術】

【0002】

遺伝子研究の重要な要素は、規定のＤＮＡ遺伝子座の配列分析である。これは、公知のバリアントの遺伝子型を判定するか、又は配列の変化若しくはバリアントを特定するためのものであり得る。このような分析は、多くの場合、多重方式で行う必要があり、例えば、特定の遺伝子座のセットを多数のサンプルで分析する必要がある。これを行うための理想的なアッセイは、スクリーニングすることが必要とされるサンプル及び遺伝子座の数に関して柔軟であり、精度が高く、様々なシーケンスプラットフォームに適しているものである。濃縮ステップは含むが、理想的には増幅がないアッセイを提供する試みが行われてきた。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１３４６１０号には、ＩＩ型制限酵素を使用してサンプル中の核酸を断片化した後、保護アダプターを連結し、続いてエキソヌクレアーゼを使用して捕捉されていない核酸のすべてを分解することによる、複雑性の低減方法が記載されている。国際公開第２０１６／０２８８８７号では、この方法が、プログラム可能なエンドヌクレアーゼ、すなわち、サンプルの核酸を断片化するためのＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼを使用することによって改良されている。

【0003】

ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート）は、複数の短い直接配列リピートを含む遺伝子座であり、配列決定された細菌の４０％及び配列決定された古細菌の９０％で確認されている。ＣＲＩＳＰＲリピートは、遺伝的病原体、例えばバクテリオファージ及びプラスミドに対して獲得された細菌免疫のシステムを形成する。細菌が病原体により攻撃された場合、病原体のゲノムの小さな断片がＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）によってプロセシングされ、ＣＲＩＳＰＲリピート間の細菌ゲノムに組み込まれる。次いで、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は転写され、プロセシングされて、病原体ゲノムと同一の約３０ｂｐの配列を含む、いわゆるｃｒＲＮＡを形成する。これらのＲＮＡ分子は、その後、感染の際に病原体を認識するベースを形成し、病原体ゲノムの直接消化を介して病原体の遺伝要素のサイレンシングをもたらす。Ｃａｓタンパク質であるＣａｓ９は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの必須成分であり、ｃｒＲＮＡと、ｃｒＲＮＡにより規定されるゲノムの位置にＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することによって、分解のため侵入病原性ＤＮＡを標的とするトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる第２のＲＮＡと組み合わされた場合にエンドヌクレアーゼを形成する。このＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、二本鎖切断の標的化導入及びその後の内因性修復メカニズムの活性化によって、目的の部位の真核生物ゲノムに修飾を導入することができる、生化学における便利で有効なツールであることが証明されている。Ｊｉｎｅｋら（２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６～８２０）は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの必須配列を単一ＲＮＡ分子に結合させることにより生成される単鎖キメラＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ、ｓＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）が、Ｃａｓ９との組合せで機能性エンドヌクレアーゼを形成できることを証明した。多くの様々なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが異なる細菌種から同定されている（Ｚｅｔｓｃｈｅら ２０１５ Ｃｅｌｌ １６３， ７５９～７７１；Ｋｉｍら ２０１７， Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ８， １～７；Ｒａｎら ２０１５． Ｎａｔｕｒｅ ５２０， １８６～１９１）。ＲＮＡガイドを使用してエンドヌクレアーゼを核酸分子の特定の位置に向けるＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムに加えて、ＤＮＡガイド又はＲＮＡガイドを使用する他のエンドヌクレアーゼが当技術分野では公知である（Ｄｏｘｚｅｎら ２０１７， ＰＬＯＳ ＯＮＥ １２（５）：ｅ０１７７０９７； Ｋａｙａら ２０１６， ＰＮＡＳ ｖｏｌ．１１３ ｎｏ．１５， ４０５７～４０６２）。

【0004】

核酸の複雑性を低減するための柔軟で精度の高い方法が当技術分野において依然として強く求められている。当技術分野では、例えば、遺伝子研究におけるその後の分析又はプロセシングのために、１つ又は複数の標的核酸断片についてサンプルを濃縮する汎用的な方法が特に必要とされている。

【0005】

以下で詳細に説明されている本発明は、下流のプロセシング及び／又は分析のための高度に単純化されたライブラリーの調製方法を可能にする。

【発明の概要】

【0006】

第１の態様では、本発明は、核酸分子を含むサンプルから標的核酸断片を濃縮するための方法であって、標的核酸断片が目的の配列を含み、方法が
ａ）目的の配列を含む核酸分子を含むサンプルを提供するステップと；
ｂ）少なくとも第１及び第２のＲＮＡ又はＤＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ複合体で核酸分子を切断し、それにより、目的の配列を含む標的核酸断片及び少なくとも１つの非標的核酸断片を生成するステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも１つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップと；
ｄ）任意選択で、ステップｃ）で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップと
を含む、方法に関する。
好ましくは、ＲＮＡ又はＤＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ複合体は、ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体である。したがって、好ましくは、本発明は、核酸分子を含むサンプルからの標的核酸断片を濃縮するための方法であって、標的核酸断片が目的の配列を含み、方法が、
ａ）目的の配列を含む核酸分子を含むサンプルを提供するステップと；
ｂ）少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体で核酸分子を切断し、それにより、目的の配列を含む標的核酸断片及び少なくとも１つの非標的核酸断片を生成するステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも１つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップと；
ｄ）任意選択で、ステップｃ）で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップと
を含む、方法に関する。

【0007】

好ましくは、ステップｂ）は、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体と核酸分子を一緒に約１分～約１８時間、好ましくは約６０分間、約１０～９０℃、好ましくは約３７℃でインキュベートすることによって実施される。

【0008】

好ましくは、ステップｃ）は、切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと約１分～約１２時間、好ましくは３０分間、約１０～９０℃、好ましくは約３７℃でインキュベートすることによって実施される。

【0009】

好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、Ｃａｓ９タンパク質を含む。

【0010】

好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、ｓｇＲＮＡを含む。

【0011】

好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、別個の分子としてのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。

【0012】

好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、ＤＳＢを誘導することができる。

【0013】

好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の両方がＤＳＢを誘導することができる。

【0014】

好ましくは、ステップｂ）において、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは核酸分子の１つの鎖をニック導入し、その核酸分子は、前記第１又は第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体によってニック導入された位置の実質的に相補的位置で相補鎖をニック導入する少なくとも第３のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体と接触される。
第２の態様では、本発明は、核酸分子を含むサンプルからアダプター連結標的核酸断片を調製するための方法であって、標的核酸断片が目的の配列を含み、方法が、
ａ）目的の配列を含む核酸分子を含むサンプルを提供するステップと；
ｂ）少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体で核酸分子を切断し、それにより、目的の配列を含む標的核酸断片及び少なくとも１つの非標的核酸断片を生成するステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも１つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップと；
ｄ）任意選択で、ステップｃ）で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップと；
ｅ）アダプターを標的核酸断片に連結させるステップと
を含む、方法に関する。

【0015】

好ましくは、アダプターは、配列アダプターである。
第３の態様では、本発明は、核酸分子を含むサンプルから標的核酸断片を配列決定するための方法であって、標的核酸断片は目的の配列を含み、方法が、
ａ）目的の配列を含む核酸分子を含むサンプルを提供するステップと；
ｂ）少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体で核酸分子を切断し、それにより、目的の配列を含む標的核酸断片及び少なくとも１つの非標的核酸断片を生成するステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも１つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップと；
ｄ）任意選択で、ステップｃ）で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップと；
ｅ）任意選択で、アダプターを標的核酸断片に連結させるステップと；
ｆ）少なくとも１つの標的核酸断片を配列決定するステップと
を含む、方法に関する。

【0016】

好ましくは、本明細書で定義した方法は、複数の核酸サンプルに対して並行して実施される。

【0017】

好ましくは、核酸分子は、ゲノムＤＮＡである。

【0018】

好ましくは、核酸分子は、植物、動物、ヒト又は微生物から得られる核酸分子である。
第４の態様では、本発明は、
本明細書で定義した少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体と、
エキソヌクレアーゼと
を含む、核酸分子からの標的核酸断片を濃縮するためのキットオブパーツに関する。

【0019】

第５の態様では、本発明は、核酸分子から少なくとも１つの標的核酸断片を濃縮するための、本明細書で定義した第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体、又は本明細書で定義したキットオブパーツの使用に関する。

【0020】

定義
本発明の方法、組成物、使用及び他の態様に関する各種用語は、本明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって使用される。そのような用語には、特段の明示のない限り、本発明が関係する技術分野における通常の意味が付与されるものとする。他の詳細に定義された用語は、本明細書で提供された定義と一致する方法で解釈されるものとする。本明細書に記載のものと類似の又は同等の任意の方法及び材料を本発明の試験の実施において使用することができ、好ましい材料及び方法は本明細書に記載されている。

【0021】

本発明の方法において使用される従来の技術を実施する方法は、当業者には明らかである。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクス、配列決定及び関連する分野における従来の技術の実施は、当業者には周知であり、例えば、以下の文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７及び定期的更新；並びにｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏで論じられている。

【0022】

「Ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」：これらの単数形の用語は、文脈で特に明示されていない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、２つ以上の細胞の組合せなどを含む。

【0023】

本明細書で使用される場合、用語の「約」とは、わずかな変動を記載及び説明するために使用される。例えば、この用語は、±１０％以下、例えば、±５％以下、±４％以下、±３％以下、±２％以下、±１％以下、±０．５％以下、±０．１％、又は±０．０５％以下を意味し得る。さらに、量、比率、及び他の数値が本明細書において範囲形式で示されている場合がある。そのような範囲形式は、便宜的且つ簡潔にするために使用されており、範囲の制限として明示的に示した数値を含むように柔軟に理解されるべきであるが、あたかも各数値及び部分的範囲が明示的に示されているように、その範囲内に含まれるすべての個々の数値又は部分的範囲もまた含むように理解されたい。例えば、約１～約２００の範囲の比は、約１～約２００の明示的に記載された範囲を含むが、約２、約３、及び約４などの個々の比、並びに約１０～約５０、約２０～約１００などの部分的範囲も含むものと理解されたい。

【0024】

本明細書で使用される場合、用語の「アダプター」とは、好ましくは限定された長さ、例えば約１０～約２００、若しくは約１０～約１００塩基を有するか、又は約１０～約８０、若しくは約１０～約５０、若しくは約１０～約３０塩基対の長さを有する、他の核酸の末端に、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖又は両方の鎖に結合され得る、好ましくは連結され得る一本鎖、二本鎖、部分的二本鎖、Ｙ字型又はヘアピン核酸分子であり、好ましくは化学的に合成される。アダプターの二本鎖構造は、相互に塩基対を形成する２つの別個のオリゴヌクレオチド分子によって、又は単一オリゴヌクレオチド鎖のヘアピン構造によって形成され得る。明らかなように、アダプターの結合可能な末端は、制限酵素及び／又はプログラム可能なヌクレアーゼによる切断で生じるオーバーハングと互換性があるように、任意選択で連結可能であるように設計することができるか、非鋳型伸長反応の付加（例えば、３’－Ａ付加）の後に生成されたオーバーハングと互換性があるように設計することができるか、又は平滑末端を有し得る。

【0025】

「及び／又は」：用語の「及び／又は」とは、１つ又は複数の記載した事例が単独で、又は記載した事例の少なくとも１つと組み合わせて、記載したすべての事例に至るまで起こり得る状況を意味する。

【0026】

核酸又は核酸反応に関して使用される「増幅」とは、特定の核酸、例えば、標的核酸又はタグ付き核酸などのコピーを作製するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を意味する。核酸を増幅する多数の方法が当技術分野では公知であり、増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、転写介在増幅法、例えばＮＡＳＢＡ（例えば、米国特許第５，４０９，８１８号）、ループ介在増幅法（例えば、米国特許第６，４１０，２７８号に記載されているようなループ形成配列を使用する「ＬＡＭＰ」増幅）、及び等温増幅反応が含まれる。増幅される核酸は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は修飾されたＤＮＡ及び／若しくはＲＮＡを含む、ＤＮＡとＲＮＡの混合物を含むか、それらからなるか、又はそれらに由来するＤＮＡであり得る。１つ又は複数の核酸分子の増幅から生じる産物（すなわち「増幅産物」）は、出発核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその両方であるかどうかにかかわらず、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのいずれか、又はＤＮＡ及びＲＮＡのヌクレオシド若しくはヌクレオチドの両方の混合物であり得、又はそれらは修飾されたＤＮＡ若しくはＲＮＡのヌクレオシド若しくはヌクレオチドを含み得る。

【0027】

「コピー」とは、限定するものではないが、特定の配列に対して完全な配列相補性又は完全な配列同一性を有する配列であり得る。或いは、コピーは、必ずしもこの特定の配列に対して完全な配列相補性又は同一性を有するわけではなく、例えば、ある程度の配列変異は許容される。例えば、コピーは、ヌクレオチド類似体、例えば、デオキシイノシン若しくはデオキシウリジン、意図的な配列改変（例えば、特定の配列にハイブリダイズ可能であるが相補的ではない配列を含むプライマーを介して導入される配列改変）、及び／又は増幅中に生じる配列エラーを含み得る。

【0028】

用語の「相補性」とは、本明細書では、完全に相補的な鎖（例えば、第２の鎖又は逆鎖）に対する配列の配列同一性として定義される。例えば、１００％相補的（又は完全に相補的）である配列は、本明細書では、相補鎖と１００％の配列同一性を有するものと理解され、例えば、８０％相補的である配列は、本明細書では、（完全に）相補的な鎖に対して８０％の配列同一性を有するものと理解される。

【0029】

「含む」：この用語は、包括的で制限はなく、排他的ではないと解釈される。詳しくは、この用語及びその変化形は、指定した特徴、ステップ、又は構成要素が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ、又は構成要素の存在を排除するものと解釈されるべきではない。

【0030】

「構築物」又は「核酸構築物」又は「ベクター」：これは、組換えＤＮＡ技術の使用によって得られる人工核酸分子を意味し、多くの場合、構築物に含まれるＤＮＡ領域を宿主細胞で発現させる目的で、外因性ＤＮＡを宿主細胞に送達するために使用され得る。構築物のベクター骨格は、例えば、（キメラ）遺伝子が組み込まれているプラスミドであってもよく、又は適切な転写調節配列が既に存在している場合（例えば（誘導性）プロモーター）、所望のヌクレオチド配列（例えばコード配列）のみが転写調節配列の下流に組み込まれる。ベクターは、分子クローニングにおけるそれらの使用を容易にするために、さらなる遺伝要素、例えば、選択可能なマーカー、複数のクローニング部位などを含むことができる。

【0031】

本明細書で使用される場合、用語の「二本鎖」及び「二重鎖」とは、塩基対を形成する、すなわち、一緒にハイブリダイズする２つの相補ポリヌクレオチドを述べている。相補ヌクレオチド鎖は、当技術分野では逆相補としても公知である。

【0032】

用語の「有効量」とは、本明細書で使用される場合、所望の生物学的効果を誘発するのに十分である生物学的活性剤の量を意味する。例えば、いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼの有効量は、保護されていない核酸の切断を誘導するのに十分なエキソヌクレアーゼの量を意味することができる。当業者には明らかであるように、薬剤の有効量は、様々な要因、例えば使用される薬剤、薬剤が使用される条件、及び所望の生物学的効果、例えば、検出されるヌクレアーゼ切断の程度などに応じて変動し得る。

【0033】

「例示的」：この用語は「例、事例、又は実例として有用である」ことを意味し、本明細書で開示されている他の構成を排除するものと解釈されるべきではない。

【0034】

「発現」：これは、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されているＤＮＡ領域が、次にタンパク質又はペプチドに翻訳され得るＲＮＡに転写されるプロセスを意味する。

【0035】

「ガイド配列」とは、本明細書では、ＲＮＡ又はＤＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをＲＮＡ又はＤＮＡ分子中の特定の部位に向ける配列として理解されたい。ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の文脈において、「ガイド配列」は、本明細書では、ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体を二重鎖ＤＮＡ中の特定の部位に標的化するために必要とされる、ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡのセクションとしてさらに理解されたい。

【0036】

ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体は、本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼとも呼ばれ、ガイドＲＮＡと複合体化又はハイブリダイズされ、そのガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡであり得る、ＣＡＳタンパク質であると理解されたい。

【0037】

「同一性」及び「類似性」は、公知の方法により容易に算出することができる。「配列同一性」及び「配列類似性」は、グローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用し、２つの配列の長さに応じて、２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。同様の長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたり最適に整列するグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ）を使用して整列されるが、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用して整列される。配列は、（例えば、デフォルトパラメータを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列される場合に）、（下記で定義した）配列同一性の少なくとも特定のパーセンテージを共有する場合、「実質的に同一の」又は「本質的に類似の」と呼ばれ得る。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をその全長（完全長）にわたり整列し、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。グローバルアライメントは、２つの配列が類似の長さを有する場合に配列の同一性を決定するのに適切に使用される。一般的には、ＧＡＰデフォルトパラメータは、ギャップ作成ペナルティ（ｇａｐ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）とともに使用される。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合、デフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡＳ ８９、９１５～９１９）。配列アラインメント及び配列同一性パーセンテージのスコアは、コンピュータープログラム、例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．， ９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ ９２１２１－３７５２ ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３を使用し、又はオープンソースソフトウェア、例えば、上記のＧＡＰと同じパラメータを使用するか、若しくはデフォルト設定を使用するＥｍｂｏｓｓＷＩＮ バージョン２．１０．０のプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用）若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用）を使用して決定することができる（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方、並びにタンパク質アラインメント及びＤＮＡアライメントの両方において、デフォルトギャップ作成ペナルティは１０．０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティは０．５である；デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質についてはＢｌｏｓｕｍ６２であり、ＤＮＡについてはＤＮＡＦｕｌｌである）。配列が実質的に異なる全長を有する場合は、ローカルアラインメント、例えばＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するものが好ましい。

【0038】

或いは、類似性又は同一性のパーセンテージは、アルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどを使用して、公共データベースに対して検索することにより決定することができる。したがって、本発明の核酸配列及びタンパク質配列は、「クエリ配列」としてさらに使用することができ、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために、公共データベースに対して検索を実施することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３～１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施し、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施し、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップを加えたアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）： ３３８９～３４０２に記載のように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴのプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）を使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／の米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のホームページを参照されたい。

【0039】

用語の「ヌクレオチド」には、限定するものではないが、グアニン、シトシン、アデニン、及びチミン（それぞれ、Ｇ、Ｃ、Ａ及びＴ）を含む、天然に存在するヌクレオチドが含まれる。用語の「ヌクレオチド」とは、公知のプリン塩基及びピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環式塩基も含むそれらの部分を含むことをさらに意図する。そのような修飾には、メチル化されたプリン又はピリミジン、アシル化されたプリン又はピリミジン、アルキル化されたリボース又は他の複素環が含まれる。さらに、用語の「ヌクレオチド」には、ハプテン又は蛍光標識を含み、従来のリボース及びデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も同様に含み得るそれらの部分が含まれる。修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドはまた、糖部分の修飾を含み、例えば、１つ若しくは複数のヒドロキシル基がハロゲン原子若しくは脂肪族基で置き換えられているか、又はエーテル、アミンなどとして官能基化されている。

【0040】

用語の「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」とは、本明細書では互換的に使用され、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドからなる任意の長さのポリマー、例えば、約２塩基より大きく、約１０塩基より大きく、約１００塩基より大きく、約５００塩基より大きく、１０００塩基より大きく、最大約１０，０００又はそれ以上の塩基のポリマーのことを記述し、酵素的又は合成的に生成され得る（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号及び本明細書で引用されている参考文献に記載されているＰＮＡ）。核酸は、天然に存在する２つの核酸の配列に類似する配列特異的な方法で天然に存在する核酸とハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソン－クリック型塩基対形成の相互作用に関与し得る。さらに、核酸及びポリヌクレオチドは、細胞、組織、及び／又は体液から単離することができる（また任意選択で、断片化することができる）。核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ミトコンドリア、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ライブラリー由来のＤＮＡ及び／又はライブラリー由来のＲＮＡであり得る。

【0041】

本明細書で使用される場合、用語の「核酸サンプル」又は「核酸を含むサンプル」とは、核酸を含む任意のサンプルを示し、サンプルは、典型的には、必ずではないが、液体の形態中に、１つ又は複数の目的の標的ヌクレオチド配列を含む材料又は材料の混合物に関する。本発明の方法において出発物質として使用される核酸サンプルは、任意の供給源、例えば、全ゲノム、染色体のコレクション、単一の染色体、１つ又は複数の染色体又は転写された遺伝子に由来する１つ又は複数の領域からのものであってもよく、生物学的供給源又は実験的供給源、例えば、核酸ライブラリーから直接精製され得る。核酸サンプルは、ヒト若しくは他の種（例えば、植物、細菌、真菌、藻類、古細菌など）であり得る同じ個体から、又は同じ種の異なる個体から、又は異なる種の異なる個体から得ることができる。例えば、核酸サンプルは、細胞、組織、生検、体液、ゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー及び／又はＲＮＡライブラリー由来のものであり得る。

【0042】

用語の「目的の配列」、「目的の標的ヌクレオチド配列」及び「標的配列」とは、本明細書では互換的に使用され、限定するものではないが、細胞内に好ましくは存在する任意の遺伝子配列、例えば、遺伝子、遺伝子の一部、又は遺伝子内の若しくは遺伝子に隣接する非コード配列などを含む。目的の標的配列は、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム、例えば、ミトコンドリアゲノム若しくは葉緑体ゲノム、又は遺伝物質の本体とは独立して存在することができる遺伝物質、例えば、感染ウイルスゲノム、プラスミド、エピソーム、トランスポゾンなどに存在し得る。目的の配列は、遺伝子のコード配列内、転写された非コード配列内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列又はイントロン内にあり得る。前記の目的の核酸配列は、二本鎖核酸又は一本鎖核酸に存在し得る。

【0043】

目的の配列は、限定するものではないが、多型、例えばＳＮＰを有するか、又は有することが疑われる配列であり得る。

【0044】

本明細書で使用される場合、用語の「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの、好ましくは約２～２００ヌクレオチド、又は最大５００ヌクレオチドの長さの一本鎖多量体を意味する。オリゴヌクレオチドは合成であってもよく、又は酵素的に作製されてもよく、いくつかの実施形態では、約１０～５０ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド単量体（すなわち、オリゴリボヌクレオチドであり得る）又はデオキシリボヌクレオチド単量体を含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、約１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～１００、１００～１５０、１５０～２００、又は約２００～２５０ヌクレオチドの長さであり得る。

【0045】

「植物」：これは、植物細胞、植物プロトプラスト、植物が再生され得る植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、及び植物又は植物の一部、例えば胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、葯、粒などの無傷の植物細胞を含む。植物の非限定的な例としては、作物及び栽培植物、例えば、大麦、キャベツ、キャノーラ、キャッサバ、カリフラワー、チコリ、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、アブラナ、ジャガイモ、カボチャ、米、ライムギ、モロコシ、カボチャ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ピーマン、トマト、スイカ、小麦、及びズッキーニなどが挙げられる。

【0046】

「プロトスペーサー配列」は、ガイドＲＮＡ、より詳しくはｃｒＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡの場合にはガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分内のガイド配列に認識又はハイブリダイズされ得るものであり、標的配列の中に、標的配列に、又は標的配列の近くに位置する配列である。

【0047】

「エンドヌクレアーゼ」は、その標的部位又は認識部位に結合した際、二重鎖ＤＮＡのうちの少なくとも１つの鎖又はＲＮＡ分子の鎖を加水分解する酵素である。エンドヌクレアーゼは、本明細書では、部位特異的エンドヌクレアーゼと理解されたく、用語の「エンドヌクレアーゼ」及び「ヌクレアーゼ」は、本明細書では互換的に使用される。制限エンドヌクレアーゼは、本明細書では、二重鎖の両鎖を同時に加水分解し、ＤＮＡに二本鎖切断を導入するエンドヌクレアーゼとして理解されたい。「ニッキング」エンドヌクレアーゼは、二重鎖の１つの鎖のみを加水分解し、切断されるというよりはむしろ「切れ目が入れられた」ＤＮＡ分子を生成するエンドヌクレアーゼである。

【0048】

「エキソヌクレアーゼ」は、本明細書では、ポリヌクレオチドの末端（エキソ）から１つ又は複数のヌクレオチドを切断する任意の酵素として定義される。

【0049】

「複雑性を低減すること」又は「複雑性の低減」とは、本明細書では、複雑な核酸サンプル、例えば、ゲノムＤＮＡに由来するサンプル、リキッドバイオプシーに由来するｃｆＤＮＡ、単離されたＲＮＡサンプルなどの低減として理解するものとする。複雑性の低減は、複雑な出発物質内に含まれる１つ若しくは複数の特定の標的配列若しくは標的核酸断片（本明細書では標的断片ともいう）の濃縮、及び／又はサンプルのサブセットの生成をもたらし、そのサブセットは、複雑な出発物質内に含まれる１つ若しくは複数の特定の標的配列若しくは断片を含むか、又はそれらからなり、一方、非標的配列又は断片は、出発物質中の、すなわち複雑性の低減前の非標的配列又は断片の量と比較して、量が少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％低減する。複雑性の低減は、一般に、さらなる分析ステップ又は方法ステップ、例えば、増幅、バーコード、シーケンシング、エピジェネティック変化の決定などの前に実施される。好ましくは、複雑性の低減は、再現可能な複雑性の低減であり、これは、同じサンプルの複雑性が同じ方法を使用して低減される場合、ランダムな複雑性の低減とは対照的に、同じか又は少なくとも同等のサブセットが得られることを意味する。複雑性の低減方法の例としては、例えば、ＡＦＬＰ（登録商標）（Ｋｅｙｇｅｎｅ Ｎ．Ｖ．， ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；例えば、欧州特許第０５３４８５８号を参照されたい）、任意プライムＰＣＲ増幅、キャプチャープローブハイブリダイゼーション、Ｄｏｎｇにより記載されている方法（例えば、国際公開第０３／０１２１１８号、国際公開第００／２４９３９号を参照されたい）、及び指標付け連結（Ｕｎｒａｕ Ｐ．及びＤｅｕｇａｕ Ｋ．Ｖ．（１９９４） Ｇｅｎｅ １４５：１６３～１６９）、国際公開第２００６／１３７７３３号；国際公開第２００７／０３７６７８号；国際公開第２００７／０７３１６５号；国際公開第２００７／０７３１７１号、米国特許出願公開第２００５／２６０６２８号、国際公開第０３／０１０３２８号、米国特許出願公開第２００４／１０１５３号に記載されている方法、ゲノム分割（例えば、国際公開第２００４／０２２７５８号を参照されたい）、遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ；例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，１９９５，上記を参照、及びＭａｔｓｕｍｕｒａら，１９９９，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ｖｏｌ．２０（６）：７１９～７２６を参照されたい）及びＳＡＧＥの変法（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ．２６（１４）：３４４５～３４４６；並びにＫｅｎｚｅｌｍａｎｎ及びＭｕｈｌｅｍａｎｎ，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２７（３）：９１７～９１８を参照されたい）、ＭｉｃｒｏＳＡＧＥ（例えば、Ｄａｔｓｏｎら，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２７（５）：１３００～１３０７を参照されたい）超並列シグネチャーシーケンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｇｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ；例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒら，２０００，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８：６３０～６３４、及びＢｒｅｎｎｅｒら，２０００，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．９７（４）：１６６５～１６７０を参照されたい）、自己サブトラクト型ｃＤＮＡライブラリー（Ｌａｖｅｄｅｒら，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３０（９）：ｅ３８）、リアルタイム多重連結依存プローブ増幅（ＲＴ－ＭＬＰＡ；例えば、Ｅｌｄｅｒｉｎｇら，２００３，ｖｏｌ．３１（２３）：ｅｌ５３を参照されたい）、高カバー率発現プロファイリング（ＨｉＣＥＰ；例えば、Ｆｕｋｕｍｕｒａら，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３１（１６）：ｅ９４を参照されたい）、Ｒｏｔｈら（Ｒｏｔｈら，２００４，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２２（４）：４１８～４２６）に開示されているユニバーサルマイクロアレイシステム、トランスクリプトームサブトラクション法（例えば、Ｌｉら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３３（１６）：ｅｌ３６を参照されたい）、及び断片ディスプレイ（例えば、Ｍｅｔｓｉｓら，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．３２（１６）：ｅｌ２７を参照されたい）が挙げられる。

【0050】

「配列」又は「ヌクレオチド配列」：これは、核酸の又は核酸内のヌクレオチドの順序を意味する。言い換えると、核酸のヌクレオチドの任意の順序は、配列又は核酸配列と呼ぶことができる。例えば、標的配列は、ＤＮＡ二重鎖の一本鎖に含まれるヌクレオチドの順序である。

【0051】

用語の「配列決定」とは、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの同一性（例えば、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、又は少なくとも２００個以上の連続するヌクレオチドの同一性）が得られる方法を意味する。用語の「次世代配列決定」とは、例えば、現在Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰａｃＢｉｏ及びＲｏｃｈｅなどによって採用されているような、いわゆる並列化された合成による配列決定又はライゲーションプラットフォームによる配列決定を意味する。次世代配列決定法には、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって商品化されたようなナノポア配列決定法、又はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって商品化されたＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔテクノロジーなどの電子検出ベースの方法も含まれ得る。

【0052】

「標的核酸断片」又は「標的断片」は、好ましくはさらなる分析又は行為、例えば、限定するものではないが、コピー、増幅、配列決定及び／又は核酸調査のための他の手順などの対象である、目的の配列を含むか又はそれからなる、核酸の一本鎖又は二本鎖の小さいストレッチ若しくは長いストレッチ、又は選択された部分であり得る。複雑性を低減する前に、標的核酸断片は、より大きな核酸分子内に、例えば、分析しようとするサンプルに存在するより大きな核酸分子内に含まれるのが好ましい。

【0053】

目的の配列は、サンプル核酸内の任意の配列、例えば、遺伝子、遺伝子複合体、遺伝子座、偽遺伝子、調節領域、高度反復性領域、多型領域、又はそれらの一部であり得る。目的の配列はまた、表現型又は疾患を示す遺伝的変異又はエピジェネティック変異を含む領域であってもよい。いくつかの態様では、目的の１つ若しくは複数の配列を含むか、又はそれからなる標的核酸断片のセットは、濃縮されるように選択される。任意選択で、そのようなセットは、構造的又は機能的に関連する標的核酸断片からなる。１つ又は複数の標的断片は、限定するものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＢＮＡ（架橋核酸）、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、モルホリノ核酸、グリコール核酸、スレオス核酸、メチル化ＤＮＡなどのエピジェネティックに修飾されたヌクレオチド、並びにそれらの模倣体及び組合せを含む、天然及び非天然両方の人工又は非標準のヌクレオチドを含み得る。好ましくは、目的の配列は、二重鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡ鎖のヌクレオチド（すなわちポリヌクレオチド）の小さい連続ストレッチ又はより長い連続ストレッチであり、前記二重鎖ＤＮＡは、前記二重鎖ＤＮＡの相補鎖の標的配列に相補的な配列をさらに含む。目的の配列及びその相補鎖からなる二重鎖ＤＮＡもまた、本明細書では、標的核酸断片二重鎖ＤＮＡと呼ばれる。好ましくは、前記二重鎖ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）及び／又は無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1】ラムダＤＮＡにおけるＰｃｉＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位とＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの位置を示す図である。断片サイズは、Ｃａｓ９を使用して標的化される断片と同様に示されている。

【図2A】消化されたＤＮＡサンプルの電気泳動分析を示す図である。Ａ）Ｃａｓ９標的と保護なしのＰｃｉＩで消化されたラムダＤＮＡ。Ｂ）Ｃａｓ９標的と保護のあるＰｃｉＩで消化されたラムダＤＮＡ。

【図2B】消化されたＤＮＡサンプルの電気泳動分析を示す図である。Ａ）Ｃａｓ９標的と保護なしのＰｃｉＩで消化されたラムダＤＮＡ。Ｂ）Ｃａｓ９標的と保護のあるＰｃｉＩで消化されたラムダＤＮＡ。

【図3】それぞれが５．１～５．６ｋｂｐのサイズで、１４０６個のｓｇＲＮＡのプールを有する、４２３ゲノム遺伝子座を標的とするＣａｓ９を使用して消化されたメロンＤＮＡのＦＥＭＴＯ Ｐｕｌｓｅ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）分析を示す図である。ｓｇＲＮＡは、標的遺伝子座に隣接する配列で設計されている。実際の標的化領域の全長は約５．５ｋｂｐである。約６．４ｋｂｐのサイズの明確なピークが見られる。サイズが不正確であるため、サイズの長さにおける違いは正常である。左側の第１のレーンは消化されたメロンＤＮＡであり、第２のレーンはマーカーである。

【図4】サイズ選択されたＤＮＡのＦＥＭＴＯ Ｐｕｌｓｅ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）分析を示す図である。図３に示したサンプルから、Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＢｌｕｅＰｉｐｐｉｎを使用して、２．５ｋｂｐ～１０ｋｂｐの範囲の断片を選択する。左側の第１のレーンは消化され、サイズ選択されたメロンＤＮＡであり、第２のレーンはマーカーである。

【図5】濃縮プロトコル後に得られた読み取りがマッピングされたメロンＶｅｄｒａｎｔａｉｓゲノムの領域をＩＧＶ視覚化した図である。灰色のボックスは、２つの標的遺伝子座（上側）の相対的読み取りカバレッジを示し、マッピングされた読み取りを下に示す。標的化遺伝子座は、マッピングされた読み取りの下に黒いバーとして示されている。これらの黒いバーの下に、これらの遺伝子座に使用されたｓｇＲＮＡの位置を黒線で示している。濃縮された読み取りが選択されたｓｇＲＮＡ位置から始まり、標的化遺伝子座を完全にカバーしていることを示している。

【発明を実施するための形態】

【0055】

本発明者らは、機能性ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体が、切断された断片に対して思いがけない保護効果を有することを発見した。実際、切断後、切断された断片がエキソヌクレアーゼ切断から保護されているように思われた。理論に縛られることを望むものではないが、この保護は、エキソヌクレアーゼ処理中に切断された断片の末端に結合したままの複合体に起因し得る。したがって、本発明の方法は、意外にも、例えば、保護アダプターの連結が、本明細書に開示されている増幅不要の標的濃縮法には必要でないことを示す。

【0056】

第１の態様では、核酸分子を含むサンプルから少なくとも１つの標的核酸断片を濃縮するための方法が提供される。好ましくは、標的核酸断片は、目的の配列を含む。好ましくは、前記核酸断片は、本明細書で以下に詳述されている濃縮ステップの前にサンプルに存在する核酸分子内に含まれる。したがって、好ましくは、標的核酸断片は、サンプルの核酸分子の断片である。
好ましくは、本発明は、核酸分子を含むサンプルからの標的核酸断片を濃縮するための方法であって、標的核酸断片が目的の配列を含み、方法が、
ａ）目的の配列を含む核酸分子を含むサンプルを提供するステップと；
ｂ）少なくとも第１及び第２のＲＮＡ又はＤＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ複合体で核酸分子を切断し、それにより、目的の配列を含む標的核酸断片及び少なくとも１つの非標的核酸断片を生成するステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られた切断された核酸分子をエキソヌクレアーゼと接触させ、エキソヌクレアーゼが少なくとも１つの非標的核酸断片を消化できるようにするステップと；
ｄ）任意選択で、ステップｃ）で得られた消化物から目的の配列を含む標的核酸断片を精製するステップと
を含む、方法に関する。

【0057】

好ましくは、ステップｂ）におけるＲＮＡ又はＤＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ複合体は、ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体、ｇＲＮＡ－アルゴノート複合体、及びｇＤＮＡ－アルゴノート複合体のうちの少なくとも１つである。好ましくは、ステップｂ）におけるＲＮＡ又はＤＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ複合体は、ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体である。

【0058】

好ましくは、ステップｃ）において、少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体は、標的核酸断片に結合している。

【0059】

好ましくは、ステップｃ）において、少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体は、ステップｃ）の間、又はステップｃ）の少なくとも一部の間、標的核酸断片に結合したままである。

【0060】

好ましくは、ステップｃ）において、標的核酸断片は、エキソヌクレアーゼによって消化されず、すなわち、ステップｃ）において、標的核酸断片は、エキソヌクレアーゼ消化から保護される。

【0061】

好ましくは、ステップｃ）において、１つ又は複数の非標的核酸断片のみがエキソヌクレアーゼによって消化される。
ステップｂ）において、核酸分子は、少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体で切断される。任意選択で、ステップｂ）は、核酸分子を第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体と接触させるステップと、複合体が核酸分子を切断できるようにするステップでさらに明示され得る。したがって、一実施形態では、ステップｂ）は、以下のようにさらに明示することができる：
ｂ１）核酸分子を少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体と接触させ、第１の複合体のｇＲＮＡは、前記第１の複合体を目的の配列の上流にある配列に誘導し、第２の複合体のｇＲＮＡは、前記第２の複合体を目的の配列の下流にある配列に誘導する、
ｂ２）第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体が核酸分子を切断できるようにし、少なくとも１つの切断された核酸分子は標的核酸断片であり、少なくとも１つの、好ましくは２つの切断された核酸分子（複数可）は非標的核酸断片（複数可）である。

【0062】

本発明者らは、驚いたことに、ステップｂの消化物にエキソヌクレアーゼを添加することにより、標的核酸断片を保護するためのさらなる手段を行うことなく、目的の前記断片が濃縮されることを見出した。言い換えると、驚いたことに、例えば不活性アダプターの連結によるさらなる保護は、エキソヌクレアーゼ分解からの標的核酸断片（複数可）の保護に必要ではない。したがって、本発明の方法は、好ましくは、エキソヌクレアーゼ処理のステップの前に、標的核酸断片、又は標的核酸断片の末端を保護するさらなるステップを含まない。好ましい実施形態では、本明細書で定義した方法は、エキソヌクレアーゼ処理の前に、保護アダプターを付加することは含まない。この文脈では、保護アダプターは、エキソヌクレアーゼ消化のため、にアダプターに捕捉される標的核酸断片を保護するように特別に設計されたアダプターと本明細書では理解するものとする。

【0063】

そのようなアダプターは、化学的部分若しくは保護基（例えばホスホロチオエート）を含むことによって、或いは末端ヌクレオチドの欠如（ヘアピン若しくはステムループアダプター、又は環化可能なアダプター）のいずれかによって、エキソヌクレアーゼによる分解から保護することが好ましい。

【0064】

本発明の方法は、例えば、核酸サンプルを濃縮するため、好ましくは、前記サンプル内の１つ又は複数の標的核酸断片の下流の処理又は分析を容易にするためのものである。この濃縮は、本発明の方法のステップａ）において出発物質として使用される核酸サンプルの複雑性の低減、及び／又は本発明の方法のステップａ）における出発物質として使用される核酸サンプルの１つ若しくは複数の標的核酸断片のサブセットの生成をもたらす。
したがって、本発明の第１の態様はまた、少なくとも、
ｉ）上記で定義したステップａ）～ｃ）及び任意選択でステップｄ）を含む、目的の配列を含む核酸サンプルの複雑性を低減するための方法；
ｉｉ）上記で定義したステップａ）～ｃ）及び任意選択でステップｄ）を含む、核酸サンプルのサブセットを提供するための方法であって、前記サブセットが１つ又は複数の標的核酸断片を含む、方法；並びに
ｉｉｉ）上記で定義したステップａ）～ｃ）及び任意選択でステップｄ）を含む、目的の配列を含む核酸分子から前記目的の配列を含む断片、すなわち標的核酸断片を単離又は取得するための方法
を提供する。

【0065】

核酸サンプルの複雑性を低減することにより、核酸配列決定用途において、とりわけ標的核酸断片が、例えば、限定するものではないがゲノムなどの複雑なサンプル内のマイナー種であるようなサンプルにおいて特定の有用性が確認される。濃縮又は複雑性の低減により、複雑なサンプルの大部分が配列決定前に除かれるので、生成される配列決定データのコストが大幅に削減され、一方、標的核酸断片は選択的に保持され、それによって目的の配列から生成される配列読み取りのパーセンテージが高くなる。

【0066】

好ましい実施形態では、本明細書の方法によって生成される濃縮された標的核酸断片は、単一分子リアルタイム配列決定反応、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．のＳＭＲＴ（登録商標）シーケンシングで使用される。他の配列決定技術、例えば、ナノポアシーケンシング（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ）、Ｓｏｌｅｘａ（登録商標）シーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ｔＳＭＳ（商標）シーケンシング（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（登録商標）シーケンシング（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、パイロシーケンシング（例えば、Ｒｏｃｈｅ／４５４製）、ＳＯＬｉＤ（登録商標）シーケンシング（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マイクロアレイシーケンシング（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製）、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングなどの使用も考えられる。好ましくは、配列決定法は、長いテンプレート分子、例えば、＞１０００～１０，０００塩基以上を配列決定することが可能である。好ましくは、配列決定法は、例えば、配列決定反応の動力学をモニターすることによって、配列決定反応中の塩基修飾を検出することが可能である。好ましくは、配列決定法は、例えばリアルタイムで、単一テンプレート分子の配列を分析することができる。本発明の複雑性を低減する方法から有利性を享受するさらなる用途には、限定するものではないが、クローニング、増幅、診断、予後診断、セラノスティックス、遺伝子スクリーニングなどが含まれ、任意選択で、多型検出を行うもの、例えば限定するものではないが、がんの診断検査が含まれる。任意選択で、本明細書の方法によって生成される濃縮された核酸は、ＤＮＡメチル化などのエピジェネティックな多様性を評価するためのアッセイにおいて使用される。ＤＮＡメチル化は、当技術分野で公知の任意の適切なアッセイ、例えば、配列決定と組み合わせたバイサルファイト変換アッセイなどを使用して評価することができる。バイサルファイト処理としても知られるバイサルファイト変換は、非メチル化シトシンを脱アミノ化してＤＮＡ中にウラシルを生成するために使用され、これがＤＮＡメチル化状態を評価するために下流の適用で使用される。メチル化されたシトシンは、ウラシルへの変換から保護されているため、直接配列決定を使用して、非メチル化シトシン及び５－メチルシトシンの位置を一塩基分解能で決定することができる。或いは、又はさらに、非増幅及び任意選択で非修飾のＤＮＡを分析する場合には、ＤＮＡ修飾を配列決定データから直接検出することができ、特定のアッセイを追加する必要がない。非増幅及び非修飾ＤＮＡにおけるＤＮＡ修飾の検出の例は、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＭＲＴシーケンシング技術の使用である。この方法は、したがって、検出された変異又は診断をヒト対象に報告するステップをさらに含んでいてもよい。この方法は、したがって、本発明の方法を使用して得られた知見を含む報告を作成するステップをさらに含んでいてもよい。

【0067】

少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体は、それぞれがガイドＲＮＡと複合体を形成しているＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＡＳ）タンパク質、又はＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼとして本明細書では理解されたい。ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインと、ガイドＲＮＡと相互作用する少なくとも１つのドメインとを含む。ガイドＲＮＡと複合体を形成する場合、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡによって特定の核酸配列に誘導される。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼと、並びに特定の標的核酸配列と相互作用することにより、ガイド配列を介して特定の核酸配列を含む部位に方向づけられると、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼは標的部位に切断を導入することができる。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの一方のドメイン又は両方のドメインがそれぞれ触媒的に活性である場合、標的部位に一本鎖切断又は二本鎖切断を導入することができる。当業者は、それがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと組み合わされた場合に、核酸分子の所定の部位に一本鎖切断又は二本鎖切断の導入を達成するようにガイドＲＮＡを設計する方法について十分に承知している。

【0068】

ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼは、一般的に６つの主要な型（Ｉ型～ＶＩ型）に分類することができ、これらはコア要素の内容及び配列に基づき、さらに亜型に分類される（Ｍａｋａｒｏｖａら，２０１１，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９：４６７～７７、及びＷｒｉｇｈｔら，２０１６，Ｃｅｌｌ １６４（１－２）：２９～４４）。一般に、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステム複合体の２つの重要な要素は、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ及びｃｒＲＮＡである。ＣｒＲＮＡは、インベーダーＤＮＡに由来するスペーサー配列が点在している短い反復配列からなる。ＣＡＳタンパク質は、様々な活性、例えばヌクレアーゼ活性を有する。したがって、ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体は、特定の配列を標的とするメカニズム、並びにその配列に対するある特定の酵素活性を提供する。

【0069】

Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムは、典型的には、ヘリカーゼ活性とＤＮａｓｅ活性を別々に有するＣａｓ３タンパク質を含む。例えば、１－Ｅ型システムでは、ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓｃａｄｅと呼ばれるマルチサブユニットエフェクター複合体（抗ウイルス防御のＣＲＩＳＰＲ関連複合体）に組み込まれ（Ｂｒｏｕｎｓら，２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０～４）、これが二重鎖ＤＮＡに特異的に結合し、Ｃａｓ３タンパク質による分解を誘発する（Ｓｉｎｋｕｎａｓら，２０１１，ＥＭＳＯ Ｊ ３０：１３３５～１３４２；Ｂｅｌｏｇｌａｚｏｖａら，２０１１，ＥＭＢＯ Ｊ ３０：６１６～６２７）。

【0070】

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムは、ｃｒＲＮＡを生成し、二重鎖ＤＮＡを特異的に切断することが可能な、単一タンパク質（約１６０ＫＤａ）であるシグネチャーＣａｓ９タンパク質を含む。Ｃａｓ９タンパク質は、典型的には２つのヌクレアーゼドメインを含んでおり、アミノ末端近くのＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインと、タンパク質の中央付近のＨＮＨ（又はＭｃｒＡ様）ヌクレアーゼドメインである。Ｃａｓ９タンパク質のそれぞれのヌクレアーゼドメインは、二重らせんの一本鎖を切断することに特化されている（Ｊｉｎｅｋら，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６～８２１）。Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／－ＣＡＳシステムのＣＡＳタンパク質の一例であり、ｃｒＲＮＡ及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる第２のＲＮＡと組み合わせた場合、エンドヌクレアーゼを形成し、これが侵入してきた病原体ＤＮＡを標的化し、ｃｒＲＮＡによって定められた病原体ゲノム上の位置にＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することにより分解する。Ｊｉｎｅｋら（２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６～８２０）は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの必須部分を融合することによって生成される一本鎖キメラガイドＲＮＡ（本明細書では「ｓｇＲＮＡ」）が、Ｃａｓ９タンパク質と組み合わせて機能的なエンドヌクレアーゼを形成することができることを示した。

【0071】

ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムは、ポリメラーゼ及びＲＡＭＰモジュールを含む。ＩＩＩ型システムは、亜型のＩＩＩ－ＡとＩＩＩ－Ｂにさらに分けることができる。ＩＩＩ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムは、プラスミドを標的とすることが明らかになっており、ＩＩＩ－Ａ型システムのポリメラーゼ様タンパク質は、ＤＮＡの特異的切断に関与している（Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ及びＳｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２：１８４３～１８４５）。ＩＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムはまた、ＲＮＡを標的とすることが明らかになっている（Ｈａｌｅら，２００９，Ｃｅｌｌ １３９：９４５～９５６）。

【0072】

ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムは、カスケード様複合体の一部を形成することが示されている特性決定されていないタンパク質であるＣｓｆ１が含まれるが、これらのシステムは、多くの場合、関連するＣＲＩＳＰＲアレイを有していない単離されたｃａｓ遺伝子として確認されている。

【0073】

Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムである、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ由来のクラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１が最近報告されている。Ｃｐｆ１遺伝子はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と関係しており、ｃｒＲＮＡを使用してＤＮＡを標的とするエンドヌクレアーゼをコードしている。Ｃｐｆ１はＣａｓ９よりも小さく単純なエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの制限のいくつかを克服し得る。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠失している単一ＲＮＡ－誘導型エンドヌクレアーゼであり、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用する。Ｃｐｆ１は、互い違いのＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する（Ｚｅｔｓｃｈｅら（２０１５） Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９～７７１）。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムは、好ましくは、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１及びＣ２ｃ３のうちの少なくとも１つを含む。

【0074】

ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムは、ＲＮａｓｅＡ活性を含むＣａｓ１３ａタンパク質を含み得る。標的核酸断片がＲＮＡである場合、本発明の方法の少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体は、Ｃａｓ１３ａ、例えば限定するものではないが、例えばＧｏｏｔｅｎｂｅｒｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１７ Ａｐｒ ２８；３５６（６３３６）：４３８～４４２に記載されているような、レプトトリキア・ワディ（Ｌｅｐｔｏｔｒｅｉｃｈｉａ ｗａｄｅｅ）由来のＣａｓ１３ａ（ＬｗＣａｓ１３ａ）又はレプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）由来のＣａｓ１３ａ（ＬｓｈＣａｓ１３ａ）を含み得る。

【0075】

本発明の方法の第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体は、本明細書で上記に定義した任意のＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼを含み得る。好ましくは、本発明の方法の第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９（例えば、配列番号２によってコードされている配列番号１のタンパク質、若しくは配列番号１９のタンパク質）、又はＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ、例えばＣｐｆ１（例えば、配列番号４によってコードされている配列番号３のタンパク質）又はＭａｄ７（例えば、配列番号２０若しくは２１のタンパク質）、又は、好ましくはその全長にわたって前記タンパク質に対して少なくとも約７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する、それらに由来するタンパク質を含む。

【0076】

好ましくは、本発明の方法の第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。

【0077】

当業者は、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムの様々な成分を調製する方法を知っている。従来技術において、その設計及び使用に関する多数の報告を利用することができる。例えば、ガイドＲＮＡの設計及びＣＡＳタンパク質（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から最初に得られた）との併用に関するＨａｅｕｓｓｌｅｒらによる最近の概説（Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．（２０１６）４３（５）：２３９～５０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｇｇ．２０１６．０４．００８．）又はＬｅｅら（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１６）１４（２）４４８～４６２）による概説を参照されたい。

【0078】

一般に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９は、２つの触媒的に活性なヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含み得る。ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインは一緒に機能し、両方とも一本鎖を切断し、ＤＮＡに二本鎖切断を行う（Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６～８２１）。デッド型ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼは、いずれのヌクレアーゼドメインも切断活性を示さないような修飾を含む。本発明の方法で使用される第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインの１つが変異したことにより、もはや機能せず（すなわち、ヌクレアーゼ活性がない）、それによりニッカーゼを生成する、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼのバリアントであり得る。例は、Ｄ１０Ａ変異又はＨ８４０Ａ変異のいずれかを有するＳｐＣａｓ９バリアントである。好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つのヌクレアーゼは、デッド型ヌクレアーゼではない。好ましくは、第１のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼは、ニッカーゼ又は（エンド）ヌクレアーゼのいずれかである。好ましくは、第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼは、ニッカーゼ又は（エンド）ヌクレアーゼのいずれかである。

【0079】

本発明の方法の少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体は、Ｃａｓ９タンパク質若しくはバリアント全体を含み得るか、又はそれからなり得るか、又はそれらの断片を含み得る。好ましくは、そのような断片は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡに結合するが、ヌクレアーゼ活性に必要とされる１つ又は複数の残基を欠失し得る。

【0080】

好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、Ｃａｓ９タンパク質を含む。任意選択で、本発明の方法の第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の両方がＣａｓ９タンパク質を含む。Ｃａｓ９タンパク質は、細菌のストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のもの（ＳｐＣａｓ９； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＣ＿０１７０５３．１； ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９ＺＷ２）、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来のもの（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ａ１７８ＴＥＪ９）、コリネバクテリウム・アルサラス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒｏｕｓ）由来のもの（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｓ： ＮＣ＿０１５６８３．１， ＮＣ＿０１７３１７．１）；コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）由来のもの（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｓ： ＮＣ＿０１６７８２．１， ＮＣ＿０１６７８６．１）；スピロプラズマ・シルフィディコーラ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ）由来のもの（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ： ＮＣ＿０２１２８４．１）；プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）由来のもの（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ： ＮＣ＿０１７８６１．１）；スピロプラズマ・タイワネンス（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）由来のもの（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ： ＮＣ＿０２１８４６．１）；ストレプトコッカス・イニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）由来のもの（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ： ＮＣ＿０２１３１４．１）；ベルリエラ・バルティカ（Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ）由来のもの（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ： ＮＣ＿０１８０１０．１）；シクロフレキサス・トルキスル（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓｌ）由来のもの（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ： ＮＣ＿０１８７２１．１）；ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のもの（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ： ＹＰ＿８２０８３２．１）；リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）由来のもの（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ： ＮＰ＿４７２０７３．１）；カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のもの（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ： ＹＰ＿００２３４４９００．１）；又はナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のもの（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ： ＹＰ＿００２３４２１００．１）であり得る。ＳｐＣａｓ９に相同な不活性化ＨＮＨ又はＲｕｖＣドメインを有する、これらからのＣａｓ９バリアント例えばＳｐＣａｓ９＿Ｄ１０Ａ若しくはＳｐＣａｓ９＿Ｈ８４０Ａ、又はＳｐＣａｓ９タンパク質のＤ１０若しくはＨ８４０に対応する位置に同等の置換を有し、ニッカーゼを生じさせるＣａｓ９が包含される。

【0081】

好ましい実施形態によれば、プログラム可能なヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１、例えばアシダミノコッカス属の種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｕ２ＵＭＱ６に由来し得る。バリアントは、ＲｕｖＣ又はＮＵＣドメインがもはやヌクレアーゼ活性を有していない、不活性化ＲｕｖＣ又はＮＵＣドメインを有するＣｐｆ１ニッカーゼであり得る。当業者は、当技術分野で利用可能な技術、例えば、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介突然変異誘発、及び不活性化ＲｕｖＣ又はＮＵＣドメインなどの不活性化ヌクレアーゼを可能にする全遺伝子合成などについて十分に知っている。不活性ＮＵＣドメインを有するＣｐｆ１ニッカーゼの例は、Ｃｐｆ１Ｒ１２２６Ａである（Ｇａｏら Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１６）２６：９０１～９１３、Ｙａｍａｎｏら Ｃｅｌｌ（２０１６）１６５（４）：９４９～９６２を参照されたい）。このバリアントにおいては、ＮＵＣドメインでアルギニンがアラニン（Ｒ１２２６Ａ）へ変換されており、ＮＵＣドメインが不活性化される。

【0082】

少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体は、プロトスペーサー配列とも呼ばれる核酸サンプル中の規定部位に複合体を方向づけるＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ関連ガイドＲＮＡをさらに含む。ガイドＲＮＡは、好ましくは、核酸分子内の目的の配列の近くに、その配列に、又はその配列内にあり、ｓｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの組合せ（例えば、Ｃａｓ９の場合）、又はｃｒＲＮＡのみ（例えば、Ｃｐｆ１の場合）であってもよい、ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体をプロトスペーサー配列に標的化するためのガイド配列を含む。任意選択で、１つ以上のタイプのガイドＲＮＡを同一の実験において使用することができ、例えば、２つ以上の異なる目的の配列を対象とするか、又は同じ目的の配列でさえも対象とすることできる。

【0083】

目的の配列は、少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体で切断する前に、核酸サンプル中に存在することを本明細書では理解されたい。核酸サンプルの切断は、少なくとも２つ以上の核酸断片をもたらし、少なくとも１つの核酸断片は標的核酸断片であり、少なくとも１つの核酸断片は非標的核酸断片である。標的核酸断片は、目的の配列を含むか、又はその配列からなる。したがって、核酸サンプルを切断する前に、標的核酸断片が核酸サンプル内に含まれており、標的核酸断片が切断の際に核酸サンプルから放出されることは当業者にとっては明白である。本発明者らは、ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体によって切断された核酸断片が消化、好ましくはエキソヌクレアーゼ消化から保護されることを発見した。

【0084】

本発明の方法は、第１のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のｇＲＮＡが前記第１の複合体を核酸サンプル中の配列に誘導することにより、第１のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体が目的の配列の上流で核酸サンプルを切断し、第２の複合体のｇＲＮＡが第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体を核酸サンプル中の配列に誘導することにより、第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体が目的の配列の下流で核酸サンプルを切断することを必要とする。

【0085】

好ましくは、ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体は、プロトスペーサー配列内の核酸を切断するＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼを含む。好ましいＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。

【0086】

第１のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体が結合しているプロトスペーサー配列は、標的核酸断片及び／又は非標的核酸断片中の配列であり得る。同様に、第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体が結合しているプロトスペーサー配列は、標的核酸断片及び／又は非標的核酸断片中の配列であり得る。好ましくは、プロトスペーサー配列は、標的核酸断片及び非標的核酸断片とオーバーラップする配列であり、すなわち、プロトスペーサー配列内にあるｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の切断部位である。
好ましくは、プロトスペーサー配列の位置は、本発明の方法で使用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに依存する。非限定的な例として、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼＳｐＣＡＳ９は、プロトスペーサー配列内の核酸を切断する。したがって、ＣＡＳ９が本発明の方法において使用される場合、好ましくは、プロトスペーサー配列は、標的核酸断片に部分的に位置し、また非標的断片に部分的に位置しており、すなわち、プロトスペーサー配列は、標的核酸断片と非標的核酸断片との間でオーバーラップしている。したがって、好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つのｇＲＮＡのガイド配列は、
Ａ）標的核酸断片に含まれるプロトスペーサー配列；
Ｂ）非標的核酸断片に含まれるプロトスペーサー配列：及び、
Ｃ）標的核酸断片と非標的核酸断片との間でオーバーラップするプロトスペーサー配列
からなる群から選択されるプロトスペーサー配列にハイブリダイズすることができる。

【0087】

Ａ）一実施形態では、第１のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つのｇＲＮＡのガイド配列は、標的核酸断片の配列であるか、若しくはその配列の一部である配列、又は例えば核酸断片が二本鎖の場合には、反対側の鎖にあるそれらの相補的な配列にハイブリダイズすることが可能である。言い換えると、この実施形態では、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つによって標的化されるプロトスペーサー配列は、標的核酸断片の配列であるか、又はその配列中に位置する。好ましくは、少なくとも第１のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体によって標的化されるプロトスペーサー配列は、標的核酸断片の配列又はその相補的な配列の５’末端であるか、又はそれらに隣接して位置しており、好ましくは、少なくとも第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体によって標的化されるプロトスペーサー配列は、標的核酸断片の配列又はその相補的な配列の３’末端であるか、又はそれらに隣接して位置している。隣接は、直接隣接していてもよく、好ましくは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００若しくは１０００の連続したヌクレオチド以下の距離であってもよい。ヌクレオチドの数は、本発明の方法において使用されるＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼに依存し得る。

【0088】

Ｂ）一実施形態では、第１のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つのｇＲＮＡのガイド配列は、非標的核酸断片、又は核酸サンプルが二本鎖核酸である場合には、反対側の鎖にあるそれらの相補的な配列を形成するか、又はその一部を形成する配列にハイブリダイズすることが可能である。言い換えると、この実施形態では、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つによって標的化されるプロトスペーサー配列は、切断後に標的核酸断片を形成する配列に実質的に隣接して、又は直接隣接して位置する。好ましくは、第１のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体によって標的化されるプロトスペーサー配列は、断片が核酸サンプル中に存在する場合は標的核酸断片、又はその相補的配列の５’末端に実質的に隣接し、好ましくは直接隣接する。好ましくは、第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体によって標的化とされるプロトスペーサー配列は、断片が核酸サンプル中に存在する場合には標的核酸断片、又はその相補的な配列の３’末端に隣接するか、又は直接隣接する。好ましくは、プロトスペーサー配列と、核酸サンプル中の標的核酸断片の配列のそれぞれの５’末端又は３’末端との間の距離は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００の連続したヌクレオチド以下である。ヌクレオチドの数は、本発明の方法で使用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに依存し得る。

【0089】

Ｃ）好ましい実施形態では、第１のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つのガイド配列は、非標的核酸断片と標的核酸断片との間でオーバーラップする配列にハイブリダイズすることが可能である。好ましくは、少なくとも第１又は第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のガイド配列は、非標的核酸断片の３’末端と標的核酸断片の５’末端との間でオーバーラップする配列にハイブリダイズすることが可能である。好ましくは、少なくとも第１又は第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のガイド配列は、非標的核酸断片の５’末端と標的核酸断片の３’末端との間でオーバーラップする配列にハイブリダイズすることが可能である。言い換えると、この実施形態では、好ましくは、少なくとも第１又は第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体によって標的化されるプロトスペーサー配列は、前記断片が核酸サンプル中に存在する場合、すなわち核酸サンプルの切断前、非標的核酸断片の３’末端と標的核酸断片の５’末端との間でオーバーラップする。

【0090】

非限定的な例として、ＳｐＣａｓ９は、位置３と位置４の間の２０ｎｔプロトスペーサー配列内で切断し得る。結果として、その３’末端で標的核酸断片は３ｎｔのプロトスペーサー配列を含むことができ、その５’末端で非標的核酸断片は１７ｎｔのプロトスペーサー配列を含むことができる。同様に、プロトスペーサー配列が相補鎖上にある場合、その３’末端で標的核酸断片は１７ｎｔのプロトスペーサー配列を含むことができ、その５’末端で非標的核酸断片は３ｎｔのプロトスペーサー配列を含むことができる。したがって、プロトスペーサー配列が連続する２０ヌクレオチドである例では、プロトスペーサー配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９ヌクレオチドは、非標的核酸断片の３’末端に存在することができ、プロトスペーサー配列のそれぞれ１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ヌクレオチドは、本発明の方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼの型に応じて、標的配列の５’末端に存在することができる。

【0091】

好ましくは、少なくとも第１又は第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体によって標的化されるプロトスペーサー配列は、前記断片が核酸サンプルに存在する場合、すなわち核酸サンプルの切断前、非標的核酸断片の５’末端と標的核酸断片の３’末端との間でオーバーラップする。プロトスペーサー配列が２０ヌクレオチドである非限定的な例として、プロトスペーサー配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９ヌクレオチドは、非標的核酸断片の５’末端に存在することができ、プロトスペーサー配列のそれぞれ１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１ヌクレオチドは、本発明の方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼの型に応じて、標的配列の３’末端に存在することができる。

【0092】

好ましい実施形態では、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、標的核酸断片内の配列に結合する。好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の両方が標的核酸断片内の配列に結合する。

【0093】

或いは、又はさらに、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、非標的核酸断片内の配列に結合する。好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の両方が非標的核酸断片内の配列に結合する。

【0094】

或いは、又はさらに、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、標的核酸断片と非標的核酸断片との間でオーバーラップする配列に結合する。好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の両方が標的核酸断片と非標的核酸断片との間でオーバーラップする配列に結合する。

【0095】

好ましい実施形態では、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、切断後、標的核酸断片のそれぞれ５’末端又は３’末端に結合したままである。好ましくは、少なくとも１つのｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体は、標的核酸断片の５’末端に結合したままであり、１つのｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体は、切断後、標的核酸断片の３’末端に結合したままである。別の表現をすると、好ましくは、標的核酸断片の両側に隣接するｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体である。

【0096】

ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体には、プロトスペーサー配列とは別に、認識用のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が必要であるため、使用されるｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体に応じて、標的化プロトスペーサー配列がそのようなＰＡＭ配列に隣接するようにｇＲＮＡを設計する必要がある。ＰＡＭ配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性にとって不可欠であり、比較的短く、したがって、通常、ある程度の長さの任意の所定の配列に複数回存在する。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９タンパク質のＰＡＭモチーフはＮＧＧであり、これにより確実に、任意の所定のゲノム配列について複数のＰＡＭモチーフが存在し、多くの異なるガイドＲＮＡが設計され得る。さらに、同一の二本鎖配列の反対鎖を標的とするガイドＲＮＡも設計され得る。ＰＡＭに直接隣接する配列がガイドＲＮＡに組み込まれる。これは、使用されているＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ複合体に応じて長さが異なり得る。例えば、Ｃａｓ９ｓｇＲＮＡ中の標的配列の最適な長さは２０ｎｔである。使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼに応じて、複合体はその後、ＰＡＭから様々な距離で両方のＤＮＡ鎖においてニックを誘発する。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列の３ｂｐ上流の両ＤＮＡ鎖にニックを導入し、平滑ＤＮＡ ＤＳＢを生成する。例えば使用されるｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体に応じて、核酸サンプルの切断に使用されるＰＡＭ部位は、生成された標的核酸断片又は生成された非標的核酸断片のいずれかに存在し得る。

【0097】

好ましくは、核酸サンプル中の目的の配列は、好ましくは目的の配列の末端近くに、本明細書で定義した複合体のＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼと相互作用することが公知であるＰＡＭ配列に隣接されているか、又はそのＰＡＭ配列を含む（例えば、Ｒａｎら ２０１５，Ｎａｔｕｒｅ ５２０：１８６～１９１を参照されたい）。さらに、又は或いは、ＰＡＭ配列は、好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つによって標的化されるプロトスペーサー配列に隣接する。

【0098】

例えば、前記ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼがストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である場合、ＰＡＭ配列は５’－ＮＧＧ－３’の配列を有し得る。例えば、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）Ｔ１２ Ｃａｓ９（例えば、国際公開第２０１６／１９８３６１号を参照されたい）については、ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＮＮＣＮＮＡ－３’の配列を有し得る。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼについてのさらに公知であるＰＡＭ配列は次のとおりである：ＩＩＡ型５’－ＮＧＧＮＮＮＮ－３’（ストレプトコッカス・ピオゲネス）、５’－ＮＮＧＴＮＮＮ－３’（ストレプトコッカス・パスツリアヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ））、５’－ＮＮＧＧＡＡＮ－３’（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、５’－ＮＮＧＧＧＮＮ－３’（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））、及びＩＩＣ型５’－ＮＧＧＮＮＮＮ－３’（コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｆｔｅｒｉａｅ）、５’－ＮＮＧＧＧＴＮ－３’（カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ））、５’－ＮＮＮＣＡＴＮ－３’（パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｏｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ））及び５’－ＮＮＮＮＧＴＡ－３’（ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ））。当業者は、したがって、サンプルの核酸から標的配列を断片化するためにｇＲＮＡを設計することができる。

【0099】

ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体でｇＲＮＡとして使用するためのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡとして適切な分子は、当技術分野においては周知である（例えば、国際公開第２０１３１４２５７８号、及びＪｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７，８１６～８２１を参照されたい）。

【0100】

一実施形態では、ｃｒＲＮＡの少なくとも１つは、目的の配列、好ましくは本明細書で定義した目的の配列にハイブリダイズすることができる配列、又はその近くでハイブリダイズすることができる配列を含む。したがって、好ましくは、ｃｒＲＮＡの少なくとも１つは、目的の配列中の配列に完全に相補的であるヌクレオチド配列を含んでおり、すなわち、目的の配列はプロトスペーサー配列を含む。

【0101】

一実施形態では、ｃｒＲＮＡの少なくとも１つは、目的の配列、好ましくは本明細書で定義した目的の配列の相補体にハイブリダイズすることができる配列、又はその相補体の近くでハイブリダイズすることができる配列を含む。したがって、好ましくは、ｃｒＲＮＡの少なくとも１つは、目的の配列と、又は目的の配列の一部と、完全な配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0102】

好ましくは、１つ又は複数のｃｒＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡと複合体を形成することも可能である。本発明の方法で使用されるｃｒＲＮＡの少なくとも１つは、非修飾ヌクレオチド又は天然に存在するヌクレオチドを含み得るか、又はそれからなり得る。或いは、又はさらに、少なくとも１つのｃｒＲＮＡは、修飾ヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含み得るか、又はそれからなり得、好ましくは、そのような化学修飾されたヌクレオチドは、分解からｃｒＲＮＡを保護するためのものである。一実施形態では、本発明の方法で使用される少なくとも２つの、又はすべてのｃＲＮＡは、修飾ヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含み得るか、又はそれからなり得る。

【0103】

本発明の一実施形態では、少なくとも１つのｃｒＲＮＡは、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。少なくとも１つのｃｒＲＮＡは、１つ又は複数のリボヌクレオチドと１つ又は複数のデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。

【0104】

少なくとも１つのｃｒＲＮＡは、１つ又は複数の天然に存在しないヌクレオチド又はヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチド、リボース環の２’炭素と４’炭素の間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、架橋核酸（ＢＮＡ）、２’－Ｏ－メチル類似体、２’－デオキシ類似体、２’－フルオロ類似体又はそれらの組合せを含むことができる。修飾ヌクレオチドは、限定するものではないが、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、プソイドウリジン、イノシン、及び７－メチルグアノシンからなる群から選択される修飾塩基を含み得る。

【0105】

少なくとも１つのｃｒＲＮＡは、１つ又は複数の末端ヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ホスホノアセテート）（ＭＳＰ）、又はそれらの組合せを組み込むことにより化学的に修飾することができる。そのような化学的に修飾されたｃｒＲＮＡは、未修飾のｃｒＲＮＡと比較して、増加した安定性及び／又は増加した活性を含み得る。（Ｈｅｎｄｅｌら， ２０１５， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）；９８５～９８９）。特定の実施形態では、少なくとも１つのｃｒＲＮＡは、プロトスペーサー配列にハイブリダイズする領域内のリボヌクレオチドを含む。本発明の一実施形態では、デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体は、操作されたｃｒＲＮＡ構造に組み込まれ得、例えば、限定するものではないが、プロトスペーサー配列にハイブリダイズする配列、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用する配列、又はこれらの配列の間に組み込まれ得る。

【0106】

或いは、又はさらに、化学的に修飾されたヌクレオチドは、プロトスペーサー配列にハイブリダイズする配列の５’及び／又は３’に位置し得る。化学的に修飾された配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用する配列の５’及び／又は３’にさらに位置し得る。

【0107】

好ましい実施形態では、ｃｒＲＮＡのうちの少なくとも１つの長さは、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの好ましい実施形態では、ｃｒＲＮＡのうちの少なくとも１つは、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５又は約２０ヌクレオチド未満の長さである。好ましくは、本発明の方法で使用されるｃｒＲＮＡの長さは、約２０～１００、２５～８０、３０～６０、又は約３５～５０ヌクレオチドの長さである。

【0108】

プロトスペーサー配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列の部分は、プロトスペーサー配列とハイブリダイズし、複合体化されたヌクレアーゼが直接、配列特異的に結合するように、プロトスペーサー配列との十分な相補性を有するように設計されている。プロトスペーサー配列は、好ましくは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接しており、このＰＡＭ配列は、本明細書で定義したＲＮＡ－誘導型ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼ複合体のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９である場合、ＰＡＭ配列は、好ましくは５’－ＮＧＧ－３’であり、ここで、ＮはＴ、Ｇ、Ａ又はＣのいずれか１つであり得る。当業者は、任意の所望の配列にハイブリダイズするために、好ましくは、配列を任意の所望のプロトスペーサー配列に少なくとも部分的に相補的であるように操作することによって、任意の所望の配列を標的とするようにｃｒＲＮＡを操作することが可能である。好ましくは、ｃｒＲＮＡ配列の部分とその対応するプロトスペーサー配列との間の相補性は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適に整列される場合、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％である。プロトスペーサー配列に相補的であるｃｒＲＮＡ配列の部分は、少なくとも約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又はそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡ標的配列に相補的な配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０ヌクレオチド未満の長さである。好ましくは、ＤＮＡ配列に相補的な配列の長さは、少なくとも１７ヌクレオチドである。好ましくは、相補的ｃｒＲＮＡ配列は、約１０～３０ヌクレオチドの長さであるか、約１７～２５ヌクレオチドの長さであるか、又は約１５～２１ヌクレオチドの長さである。好ましくは、プロトスペーサー配列に相補的であるｃｒＲＮＡの部分は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドの長さであり、好ましくは２０又は２１ヌクレオチドであり、好ましくは２０ヌクレオチドである。

【0109】

ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用するｃｒＲＮＡの部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズし、複合体化されたヌクレアーゼをプロトスペーサー配列に方向づけるように、ｔｒａｃｒＲＮＡと十分に相補的であるように設計されている。好ましくは、ｃｒＲＮＡ配列のこの部分とｔｒａｃｒＲＮＡのその対応する部分との間の相補性は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適に整列される場合、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％である。ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用するｃｒＲＮＡの部分は、好ましくは、少なくとも約５、１０、１５、２０、２２、２５、３０、３５、４０、４５又はそれ以上のヌクレオチドの長さである。いくつかの好ましい実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用するｃｒＲＮＡの部分は、約６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０又は３５ヌクレオチド未満の長さである。好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用するｃｒＲＮＡの部分は、約５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２８ヌクレオチドの長さである。好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用する部分の長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５ヌクレオチドである。

【0110】

一実施形態では、本発明の方法で使用される少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－Ｃａｓ複合体は、それぞれ、第１及び第２のｃｒＲＮＡを含む。しかし、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体は、同じｔｒａｃｒＲＮＡを含んでいてもよい。

【0111】

好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡは、本明細書で定義した複合体のＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼと相互作用することができる１つ又は複数の構造モチーフを含む。好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡはまた、本明細書で定義したｃｒＲＮＡと相互作用することが可能である。ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの間の塩基対形成を介してハイブリダイズし得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼ及びｃｒＲＮＡと複合体を形成することが可能である。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡと複合体を形成することが可能であり、標的配列とハイブリダイズすることにより、ヌクレアーゼを標的配列に向けることができる。

【0112】

ｔｒａｃｒＲＮＡは、１つ又は複数のステムループ構造、例えば、１、２、３又はそれ以上のステムループ構造を含み得る。

【0113】

ｔｒａｃｒＲＮＡは、非修飾ヌクレオチド又は天然に存在するヌクレオチドを含み得るか、又はそれからなり得る。或いは、又はさらに、ｔｒａｃｒＲＮＡは、修飾ヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含み得るか、又はそれからなり得、好ましくは、そのような化学修飾されたヌクレオチドは、分解からｔｒａｃｒＲＮＡを保護するためのものである。

【0114】

本発明の一実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、１つ又は複数のリボヌクレオチドと１つ又は複数のデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。

【0115】

ｔｒａｃｒＲＮＡは、１つ又は複数の天然に存在しないヌクレオチド又はヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチオエート結合を有するヌクレオチド、リボース環の２’炭素と４’炭素の間にメチレン架橋を含むロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、架橋核酸（ＢＮＡ）、２’－Ｏ－メチル類似体、２’－デオキシ類似体、２’－フルオロ類似体又はそれらの組合せを含むことができる。修飾ヌクレオチドは、限定するものではないが、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、プソイドウリジン、イノシン、及び７－メチルグアノシンからなる群から選択される修飾塩基を含み得る。

【0116】

ｔｒａｃｒＲＮＡは、１つ又は複数の末端ヌクレオチドで、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル３’チオＰＡＣＥ（ホスホノアセテート）（ＭＳＰ）、又はそれらの組合せを組み込むことにより化学的に修飾することができる。そのような化学的に修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡは、未修飾のｔｒａｃｒＲＮＡと比較して、増加した安定性及び／又は増加した活性を含み得る。（Ｈｅｎｄｅｌら， ２０１５， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）；９８５～９８９）。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡと相互作用する領域内のリボヌクレオチドを含む。

【0117】

本発明の一実施形態では、デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチド類似体は、操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ構造に組み込まれ得、例えば、限定するものではないが、ｃｒＲＮＡと相互作用する配列に、ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼと相互作用する配列に、又はこれらの配列の間に組み込まれ得る。

【0118】

或いは、又はさらに、化学的に修飾されたヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡと相互作用する配列の５’及び／又は３’に位置し得る。化学的に修飾された配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼと相互作用する配列の５’及び／又は３’にさらに位置し得る。

【0119】

好ましい実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡの長さは、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７２、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０又はそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの好ましい実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、約２００、１８０、１６０、１４０、１２０、１００、９５、９０、８５、８０又は７５ヌクレオチド未満の長さである。好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡの長さは、約３０～１２０、４０～１００、５０～９０、又は約６０～８０ヌクレオチドの長さである。

【0120】

ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡ配列の部分は、複合体化されたヌクレアーゼを標的配列に向けるのに十分であるように設計されている。ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡ配列の部分は、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７２、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼと相互作用する配列は、約１２０、１００、８０、７２、７０、６０、５５、５０、４５、４０、３０又は２０ヌクレオチド未満の長さである。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡ配列の部分は、約２０～９０、３０～８５、３５～８０、４０～７５又は５０～７２ヌクレオチドの長さである。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡの部分は、約４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４又は７６ヌクレオチドの長さである。

【0121】

ｃｒＲＮＡと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡの部分は、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズし、複合体化されたヌクレアーゼを標的配列に向けるように、ｃｒＲＮＡに十分に相補的であるように設計されている。好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のこの部分とｃｒＲＮＡのその対応する部分との間の相補性は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適に整列される場合、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％である。ｃｒＲＮＡと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡの部分は、好ましくは、少なくとも約５、１０、１５、２０、２２、２５、３０、３５、４０、４５又はそれ以上のヌクレオチドの長さである。いくつかの好ましい実施形態では、ｃｒＲＮＡと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡの部分は、約６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０又は３５ヌクレオチド未満の長さである。好ましい実施形態では、ｃｒＲＮＡと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡの部分は、約５～４０、１０～３５、１５～３０、２０～２８ヌクレオチドの長さである。好ましくは、ｃｒＲＮＡと相互作用する部分の長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５ヌクレオチドである。

【0122】

好ましくは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、一緒に連結されてｓｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、当技術分野で公知の任意の従来の方法を使用して、連結させることができ、好ましくは共有結合させることができる。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの共有結合は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎｅｋら（上掲）及び国際公開第１３／１７６７７２号に記載されている。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、例えば、リンカーヌクレオチドを使用して、又はｃｒＲＮＡの３’末端及びｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の直接共有結合を介して、共有結合され得る。好ましくは、少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のｇＲＮＡは、核酸サンプルを少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体とインキュベートする際に、核酸サンプル由来の核酸内に含まれる標的核酸断片が前記核酸から切り出される用に設計される。さらに、好ましくは、第１のｇＲＮＡは、第１のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体が、核酸サンプルの切断後に標的核酸断片に結合するように設計される。さらに、好ましくは、第２のｇＲＮＡは、第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体が、核酸サンプルの切断後に標的核酸断片に結合するように設計される。好ましくは、核酸サンプル中に存在する場合の標的核酸断片は、少なくとも１つの非標的核酸断片に隣接している。好ましくは、核酸サンプル中に存在する場合の標的核酸断片は、両側に非標的核酸断片が隣接しており、すなわち、１つの非標的核酸断片は、標的核酸断片の５’に直接存在しており、１つの非標的核酸断片は、標的核酸断片の３’に直接存在している。

【0123】

好ましくは、本発明の方法の第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ９を標的核酸断片中の配列に標的化するためのｓｇＲＮＡを含む。任意選択で、本発明の方法の第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の両方は、それぞれの第１又は第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体を標的核酸断片中の配列に標的化するためのｓｇＲＮＡを含む。好ましくは、本発明の方法の第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ９を、断片が核酸サンプル内に含まれている場合に標的核酸断片に隣接する、好ましくは直接隣接する配列に標的化するためのｓｇＲＮＡを含む。任意選択で、本発明の方法の第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の両方は、それぞれの第１又は第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体を、標的配列が核酸サンプルに含まれている場合の標的核酸断片に隣接する、好ましくは直接隣接する配列に標的化するためのｓｇＲＮＡを含む。

【0124】

好ましくは、本発明の方法の第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ９を、断片が核酸サンプル内に含まれる場合に、標的核酸断片と非標的核酸断片との間でオーバーラップする配列に標的化するためのｓｇＲＮＡを含む。任意選択で、本発明の方法の第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の両方は、それぞれの第１又は第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体を、標的核酸が核酸サンプルに含まれている場合の標的核酸断片と非標的核酸断片との間でオーバーラップする配列に標的化するためのｓｇＲＮＡを含む。任意選択で、本発明の方法の第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の両方は、それぞれの第１又は第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体を、それぞれ標的核酸断片の５’末端と非標的核酸断片の３’末端との間でオーバーラップする配列に、及び標的核酸が核酸サンプルに含まれる場合、標的核酸断片の３’末端と非標的核酸断片の５’末端との間でオーバーラップする配列に標的化するためのｓｇＲＮＡを含む。

【0125】

或いは、本発明の方法の第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ９を、核酸サンプル中の配列に、すなわち、標的核酸断片に存在する又は非標的核酸断片に存在するプロトスペーサー配列に標的化するためのデュアルガイドＲＮＡを含む。デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）は、別個の、しかし好ましくはハイブリダイズした分子としてのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むか、又はそれらからなるものとして本明細書では理解されたい。任意選択で、本発明の方法の第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の両方は、それぞれの第１又は第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体をプロトスペーサー配列に標的化するためのｄｇＲＮＡを含む。

【0126】

好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することが可能である。好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の両方は、核酸サンプルで二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することが可能である。

【0127】

或いは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のうちの少なくとも１つは、本明細書では第１又は第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ－ニッカーゼ複合体として示されるニッカーゼであり、これは二重鎖ＤＮＡの一本鎖のみをニック導入することが可能である。本発明のそのような実施形態では、ステップｂ）において、第１又は第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ－ニッカーゼ複合体によってニック導入された実質的に相補的な位置で二重鎖ＤＮＡの相補鎖にニック導入することが可能な、追加の、すなわち第３のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体が加えられる。実質的に相補的な位置のニック導入により、好ましくは、二本鎖、すなわち、核酸サンプルに平滑な又は互い違いの切断が生じる。

【0128】

非限定的な例として、例えば第３のｇＲＮＡ－ＣＡＳ－ニッカーゼのプロトスペーサー配列は、好ましくは、第１のｇＲＮＡ－ＣＡＳ－ニッカーゼ複合体によって標的化されるプロトスペーサー配列に相補的な相補鎖の配列であるか、又は相補鎖の上流方向若しくは下流方向にシフトされた約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、若しくは３０ヌクレオチド内の配列である。例えば、第１のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体がｇＲＮＡ－ＣＡＳ－ニッカーゼ複合体である場合、第３のｇＲＮＡ－ＣＡＳ－ニッカーゼ複合体をステップｂで追加することができ、前記第１及び第３のｇＲＮＡ－ＣＡＳ－ニッカーゼ複合体によって目的の配列の一方の側で二本鎖切断が誘導され、これは正確に反対の位置が前記第１及び第３の複合体によってニック導入される場合には平滑末端であり得、又は前記第１及び第３の複合体によってニック導入される位置が正確に反対でない場合には互い違いであり得る。同様に、例えば前記第１及び第３のｇＲＮＡ－ＣＡＳ－ニッカーゼ複合体に加えて、第２の及びさらなる、例えば第４のｇＲＮＡ－ＣＡＳ－ニッカーゼ複合体の両方の使用は、本発明の方法のステップｂ）で得られる標的核酸断片の２つの平滑末端又は互い違いの末端をもたらし得る。いくつかの事例では、本発明の方法のステップｂによって生成される標的核酸断片の一端又は両端に互い違いの末端を生成することが、例えば、その後の方向づけられたアダプター連結の場合、望ましいこともあり得る。

【0129】

本発明の方法のステップｂ）は、少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体と核酸サンプルを一緒に、ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体が少なくとも一本鎖切断を、任意選択で二本鎖切断を誘導するのに適した条件及び時間で、例えば、限定するものではないが、本明細書で提供した実施例で詳述した条件で、インキュベートすることによって実施することができる。任意選択で、インキュベーションは、約１分～約１８時間、好ましくは約６０分、約１０～９０℃で、好ましくは約３７℃で実施される。

【0130】

本発明者らは、ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体によって切断された標的核酸断片がエキソヌクレアーゼ処理から保護されていることを見出した。したがって、核酸から標的核酸断片を切り出した直後に、エキソヌクレアーゼを加えて１つ又は複数の非標的核酸を消化することができる。標的核酸断片は分解から保護されるが、非保護断片は分解され、標的断片の濃縮又は複雑性の低減がもたらされる。したがって、本発明の方法は、目的の部分を取り出す代わりに、核酸サンプルの望ましくない（非標的）部分を除くアプローチを取っており、それにより、複雑な親和性選択スキームを回避する。

【0131】

エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、若しくは関連する酵素、又はそれらの任意の組合せであり得る。エキソヌクレアーゼＩＩＩは、ニックを認識し、ｓｓＤＮＡのピースが形成されるまでニックをギャップまで伸長する。エキソヌクレアーゼＶＩＩは、このｓｓＤＮＡを分解することができる。エキソヌクレアーゼＩもまた、ｓｓＤＮＡを分解する。ＥｘｏＩＩＩ及びＥｘｏＶＩＩは、本発明の方法のステップｃ）において使用するためのエキソヌクレアーゼの好ましい組合せである。

【0132】

エキソヌクレアーゼＶは、ｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡを３’から５’と５’から３’の両方の方向に分解することが可能である。したがって、好ましい実施形態では、本発明の方法のステップｃ）におけるエキソヌクレアーゼは、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡを３’から５’と５’から３’の両方の方向に分解することが可能なエキソヌクレアーゼであり、好ましくはエキソヌクレアーゼＶである。

【0133】

非標的配列を分解するための方法に関するさらなる情報は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０１３４６１０号で提供されている。

【0134】

さらに、エンドヌクレアーゼ、すなわち制限酵素は、本発明の方法のステップｃ）のエキソヌクレアーゼ消化と一緒に、その前に、その後に、又はそれらの任意の組合せのいずれかで、非保護断片の分解に使用することができる。本発明の方法で使用するための制限酵素は、好ましくは、本発明の方法を使用して濃縮される１つ又は複数の目的の標的配列に応じて選択され、好ましくは、１つ又は複数の制限酵素は、目的の１つ又は複数の標的配列内に存在する認識部位は有してないが、好ましくは、サンプルの核酸の残りの部分に、すなわち１つ又は複数の非標的核酸断片に１つ又は複数の位置に存在する認識部位を有するはずであることを本明細書では理解されたい。本発明の方法のステップｃ）のエキソヌクレアーゼ処理の前、又はさらにステップｂ）の切断反応の前に制限酵素消化を行う利点は、そのような消化により、ｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体によって保護されていない場合、ステップｃ）においてエキソヌクレアーゼによってより容易に消化される断片が得られることである。

【0135】

ステップｃ）、及び任意選択のエンドヌクレアーゼステップは、エキソヌクレアーゼ（及び任意選択でエンドヌクレアーゼ）が実質的にすべての非保護断片を分解するのに十分な条件及び時間で、例えば限定するものではないが、本明細書に記載した実施例に詳述されている条件で実施される。好ましくは、ステップｃ）は、エキソヌクレアーゼ（任意選択でエンドヌクレアーゼ）がすべての非保護断片を分解するのに十分な条件及び時間で実施される。ステップｃ）は、好ましくは、約１分～約１２時間、好ましくは３０分間、約１０～９０℃、好ましくは約３７℃で実施される。

【0136】

ステップｃ）の後、エキソヌクレアーゼ、及び任意選択のエンドヌクレアーゼは、例えば限定するものではないが、プロテイナーゼ、例えばプロテイナーゼＫ処理、又は熱による不活性化のうちの少なくとも１つによって不活性化することができる。そのような技術は当技術分野においては標準であり、当業者は、エキソヌクレアーゼ及び任意選択でエンドヌクレアーゼを不活性化する方法を明快に理解している。好ましい不活性化ステップは、サンプルを約５０～９０℃、好ましくは約７５℃の温度で、約１～１２０分間、好ましくは約１０分間、加熱することである。好ましくは、不活性化ステップは、本発明の方法のステップｃ）とステップｄ）の間である。

【0137】

本発明の方法のステップｃ）の後、１つ又は複数の標的核酸断片で濃縮されたサンプルは、精製ステップ、例えばＡＭＰｕｒｅビーズベースの精製プロセスにかけられ、複合体、酵素、遊離ヌクレオチド、可能性のある遊離アダプター、及び可能性のある小さな非標的核酸断片が除去され得る。標的核酸断片は、精製後に回収され、さらなるプロセシング及び／又は分析、例えば単一分子配列決定などに供することができる。

【0138】

本発明の方法は、サイズ選択ステップをさらに含み得る。任意選択で、サイズ選択ステップは、本発明の方法のステップｂ）の前、ステップｂ）とｃ）の間、又はステップｃ）の後に実施される。

【0139】

標的核酸断片の長さは変わり得るが、好ましくは、少なくとも２００、５００、１０００、３０００、５０００、７０００、１０，０００、１５，０００、又は２０，０００塩基（少なくとも１００，０００塩基以下）の長さである。長さは、主として目的の使用に応じて決まり、いくつかの任意の実施形態では、使用される特定の配列決定技術の平均の読み取りの長さに基づく。

【0140】

有効量の成分が本発明の方法において使用されることを本明細書では理解されたい。例えば、ステップｂ）で添加される少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体は、サンプル中の１つ又は複数の核酸分子の切断を誘導するのに十分な量で提供される。さらに、ステップｃ）で添加されるエキソヌクレアーゼは、サンプル又は出発物質内の非標的核酸断片の少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％を分解するのに十分な量で適用される。
本発明の方法は、好ましくは本明細書で定義したステップｃ）の後に、１つ又は複数の精製ステップを含み得る。任意選択の精製ステップは、プロテイナーゼＫ処理である。或いは、又はさらに、前記精製は、
Ｉ．ステップ（ｃ）の後に得られる消化された核酸サンプルを、１つ又は複数の標的核酸断片に特異的且つ効果的に結合する１つ又は複数の固体支持体に曝露させるステップと；任意選択で、
ＩＩ．１つ又は複数の固体支持体を洗浄し、１つ又は複数の固体支持体から標的核酸断片を溶出させるステップ
を含み得る。

【0141】

１つ又は複数の固体支持体は、限定するものではないが、Ａｍｐｕｒｅビーズであり得る。精製後、少なくとも１つの単離された標的核酸断片が得られるので、本明細書で定義した方法はまた、核酸サンプルから１つ又は複数の標的核酸断片を単離するための方法と考えることができる。

【0142】

本発明の方法は、１つ又は複数の標的核酸断片を配列決定するステップが続き得る。本明細書で定義した方法はまた、したがって、核酸サンプルから１つ又は複数の標的核酸断片を配列決定するための方法と考えることもできる。

【0143】

任意選択で、本発明の方法は、増幅ステップをさらに含む。好ましくは、この増幅は、エキソヌクレアーゼ処理後、すなわち、本明細書で定義したステップｃ）の後に実施される。増幅は、ＰＣＲによって、又は当技術分野で公知の任意の増幅方法によって実施することができる。

【0144】

本発明の方法はまた、１つ又は複数のアダプターを標的核酸断片に連結するステップを含み得る。好ましくは、そのようなアダプター連結は、本明細書で定義したステップｃ）の後に実施される。これらの１つ又は複数のアダプターは、好ましくは、制限部位ドメイン、捕捉ドメイン、配列決定プライマー結合部位、増幅プライマー結合部位、検出ドメイン、バーコード配列、転写プロモータードメイン及びＰＡＭ配列、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される機能性ドメインを含み得る。バーコードは、限定するものではないが、サンプルバーコード、又は固有分子識別子（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ、ＵＭＩ）であり得る。

【0145】

特に好ましい実施形態では、１つ又は複数のアダプターは、配列決定アダプターであり、例えば、Ｒｏｃｈｅ ４５４Ａ及び４５４Ｂシーケンシング、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標） ＳＯＬＥＸＡ（商標）シーケンシング、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬＩＤ（商標）シーケンシング、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＭＲＴ（商標）シーケンシング、Ｐｏｌｌｏｎａｔｏｒ Ｐｏｌｏｎｙシーケンシング、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ又はＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓシーケンシングを可能にする機能性ドメインを含む。

【0146】

アダプター設計に応じて、アダプターは、一本鎖、二本鎖、部分的二本鎖、Ｙ字型、ヘアピンアダプター又は環化可能なアダプターであり得る。任意選択で、１つ又は複数のアダプターを使用することができる。任意選択で、２つのアダプターの１つ又は複数のセットを使用することができ、セットの第１のアダプターは、標的核酸断片の５’末端側で連結されることを目的とし、セットの第２のアダプターは、標的核酸断片の３’末端側で連結されることを目的とする。好ましくは、セット内の第１及び第２のアダプターはそれぞれ、適合性プライマー結合配列を含むことによって、アダプター連結断片は、適合性プライマー対を使用して増幅されるか、又は配列決定される状態にある。

【0147】

好ましい実施形態では、本発明の方法は、増幅ステップ及び／又はクローニングステップを含まない。エピジェネティックな情報（例えば、５－ｍＣ、６－ｍＡなど）がアンプリコンで失われるので、増幅ステップの減少は有益である。さらなる増幅は、アンプリコンに多様性を導入することができ（例えば、増幅中のエラーを介して）、その結果、それらのヌクレオチド配列は元のサンプルを反映しない。同様に、標的領域の別の生物へのクローニングは、多くの場合、元のサンプル核酸中に存在する修飾が維持されないため、好ましい実施形態では、さらなる分析のために濃縮される標的配列は、典型的には、本明細書の方法では増幅及び／又はクローニングされない。

【0148】

ステムループアダプター又はヘアピンアダプターは一本鎖であるが、それらの末端は相補的であり、その結果、アダプターはそれ自体で折り返され、二本鎖部分と一本鎖ループが生じる。ステムループアダプターは、直鎖状の二本鎖核酸の末端に連結され得る。例えば、ステムループアダプターが二本鎖標的核酸断片の末端に結合されることにより、末端ヌクレオチドがない場合（例えば、ポリメラーゼ及びリガーゼをそれぞれ使用して、任意のギャップが埋められ、連結される）、得られた分子は、末端ヌクレオチドを欠失し、代わりに両端に一本鎖ループを有する。

【0149】

標的核酸断片は、環化可能なアダプターに連結され得る。この点において、標的配列を含む断片は、断片のいずれかの側の適合性構造の自己環化によって環化され得るか（これは、アダプター連結から、若しくは連結されたアダプターの制限酵素消化の結果として生じ得る）、又は所望の断片の末端に相補的なセレクタープローブへのハイブリダイゼーションによって環化され得る。伸長及び連結の最終ステップは、共有結合で閉じた環状の、任意選択で二本鎖のポリヌクレオチドを生成する。

【0150】

核酸サンプルが少なくとも１つの標的核酸断片を含むことを本明細書では理解されたい。別の表現をすると、核酸サンプルは、したがって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の標的核酸断片、例えば、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００又はそれ以上の標的核酸断片を含み得るが、好ましくは、サンプル内のそれぞれの標的核酸断片は別個の配列を有する。本発明の方法は、核酸サンプルからのこれらの標的核酸断片の同時濃縮を提供することができる。したがって、任意選択で、本発明の方法のステップｂ）において、少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の複数のセットが、核酸サンプルから複数の標的核酸断片を濃縮、単離又は配列決定するために加えられる。好ましくは、第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体のこれらの複数のセットは、同じＣＲＩＳＰＲ－ヌクレアーゼを含み得るが、それらのｇＲＮＡが異なっていてもよい。例えば、それぞれの標的核酸断片について、２つの別個のｇＲＮＡ分子を使用することができ、例えば、１つのｇＲＮＡが第１のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体に組み込まれ、別のｇＲＮＡが第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体に組み込まれる。例えば、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００又はそれより多くの標的核酸断片、好ましくは、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００又はそれより多くのセットのｇＲＮＡ分子、好ましくは、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００又はそれより多くの異なるｇＲＮＡ分子が本発明の方法において使用され得る。

【0151】

任意選択で、本発明の方法は多重化され、すなわち、複数の核酸サンプルに対して、例えば、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００又はそれより多くの核酸サンプルに対して同時に適用される。この方法は、複数のサンプルに対して並行して実施することができ、「並行して」とは、実質的に同時にと本明細書では理解するものとするが、それぞれのサンプルは個別の反応チューブ又は容器で処理される。さらに、又は或いは、本発明の方法の１つ又は複数のステップは、プールされたサンプルに対して実施することができる。濃縮、単離及び／又は配列決定された断片を元のサンプルまで遡るために、サンプルをプールする前に、断片を識別子でタグ付けすることができる。そのような識別子は、任意の検出可能な実体、例えば限定するものではないが、放射性標識又は蛍光標識であり得るが、好ましくは定義された長さの、特定のヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列の組合せであるのが好ましい。さらに、又は或いは、サンプルは、独創的なプーリング戦略、例えば限定するものではないが、２Ｄ及び３Ｄプーリング戦略を使用してプールすることができ、それによって、プール後、各サンプルは、少なくとも２つ又は３つのプールにそれぞれ含まれる。特定の標的断片は、特定の濃縮、単離、及び／又は配列決定された標的断片を含むそれぞれのプールの座標を使用することによって、元のサンプルまで遡ることができる。

【0152】

本発明の方法の核酸サンプルは、任意の供給源、例えば、ヒト、動物、植物、微生物由来のものであってよく、細胞の内因性又は外因性のあらゆる種類のもの、例えば、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、人工染色体、プラスミドＤＮＡ、又はエピソームＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ミトコンドリア、又はＢＡＣ若しくはＹＡＣなどの人工ライブラリーであってもよい。ＤＮＡは、核ＤＮＡ又はオルガネラＤＮＡであり得る。好ましくは、ＤＮＡは染色体ＤＮＡであり、好ましくは細胞に内因性である。
さらなる態様では、本発明は、本明細書で上記に定義した方法のためのキットオブパーツを提供する。好ましくは、前記キットは、
本明細書で定義した少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体を含む１つ又は複数のバイアル；
ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳタンパク質と複合体を形成してｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体を形成するための少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡを含む１つ又は複数のバイアルと、前記ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳタンパク質を含むさらなるバイアル；
非標的核酸を分解するための１つ又は複数のエキソヌクレアーゼを含むさらなるバイアル；並びに、
任意選択で、非標的核酸を分解するための１つ又は複数の制限酵素を含むバイアル
のうちの少なくとも１つを含む。

【0153】

任意選択で、キットは、本明細書で定義した１つ又は複数のアダプターを、本明細書の上記で示した１つ又は複数のバイアル又は別個のバイアルのいずれかとともに、さらに含む。好ましくは、キットは、本明細書で定義した１つ又は複数のｇＲＮＡを含む少なくとも２、４、１０、２０、３０、又は５０個のバイアルを含む。好ましくは、キット内のいずれかのバイアルの容量は、１００ｍＬ、５０ｍＬ、２０ｍＬ、１０ｍＬ、５ｍＬ、４ｍＬ、３ｍＬ、２ｍＬ、又は１ｍＬを超えない。

【0154】

試薬は、凍結乾燥された形態で存在していてもよく、又は適切な緩衝液中に存在していてもよい。キットはまた、本発明を実施するのに必要な任意の他の構成要素、例えば、緩衝液、ピペット、マイクロタイタープレート、及び書面の説明書を含むことができる。本発明のキットのためのそのような他の構成要素は、当業者には公知である。

【0155】

最後に、核酸サンプルから少なくとも１つの標的核酸断片を濃縮するための、少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体、又は本明細書で定義したキットオブパーツの使用が提供される。さらに特に、エキソヌクレアーゼ分解から標的核酸断片を保護するための少なくとも第１及び第２のｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体の使用が提供される。

【実施例】

【0156】

実施例１
材料及び方法
合計３μｇのラムダＤＮＡ（配列番号５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２４５９．１）（３００ｎｇ／μｌの１０μｌ）を、制限エンドヌクレアーゼＰｃｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用し、以下の成分、２μｌの１０ｘＮＥＢ ３．１バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、３μｌのＰｃｉＩエンドヌクレアーゼ（１０Ｕ／ｍｌ）、及び５μｌのヌクレアーゼフリーの水を加えて消化した。得られた２０μｌの反応混合物を３７℃で１時間インキュベートし、その後、酵素を８０℃で２０分間のインキュベーションによって不活性化した。ラムダＤＮＡの２つのＰｃｉＩ認識部位の概要を図１に示す。

【0157】

ＰｃｉＩ制限化ラムダＤＮＡの２つの特定の部位は、Ｃａｓ９とこれらの標的化部位に対して設計された２つのｓｇＲＮＡを使用して標的化した。第１のｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ９）は配列番号１３を有し、配列番号１４を有するプロトスペーサー配列を標的とする。第２のｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１３）は配列番号１５を有し、配列番号１６を有するプロトスペーサー配列を標的とする。反応条件は以下のとおりであった：２０μｌのＰｃｉＩ制限化ラムダＤＮＡ（上記参照）、１μｌの１０ｘＮＥＢ ３．１バッファー、３μｌの０．３ｍＭ ｓｇＲＮＡ９、３μｌの０．３μＭ ｓｇＲＮＡ１３、１．８μｌのＣａｓ９タンパク質（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及び１．２μｌのヌクレアーゼフリーの水。３０μｌの反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。

【0158】

非保護断片をエキソヌクレアーゼＶとのインキュベーションによって除去した。これについては、１２．５μｌのＣａｓ９反応物に、以下の成分、１．７５μｌの１０ｘＮＥＢ ３．１バッファー、３．０μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１．０μｌの１０Ｕ／μｌ ＥｘｏＶエキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）及び１１．７５μｌのヌクレアーゼフリーの水を加えた。得られた３０μＬの反応混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。タンパク質を７５℃で１０分間インキュベーションすることにより不活性化した。
以下の対照反応を実施した：
１．ラムダＤＮＡの制限のみ。これについては、上記のＰｃｉＩ制限反応のみを実施した。

【0159】

２．ＰｃｉＩ制限化ラムダＤＮＡのエキソヌクレアーゼＶとのインキュベーション。これについては、ラムダＤＮＡのＰｃｉＩ制限後、以下の成分、１．０μｌの１０ｘＮＥＢ ３．１バッファー、３．０μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、１．０μｌの１０Ｕ／μｌ ＥｘｏＶエキソヌクレアーゼ及び５．０μｌのヌクレアーゼフリーの水を添加した。３０．０μｌの反応混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。エキソヌクレアーゼ酵素を７５℃で１０分間インキュベーションすることにより不活性化した。

【0160】

すべてのサンプルは、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ溶液（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｉｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用し、ビーズのサンプルに対する比を０．８倍にして精製した。結合後、ビーズを７０％エタノールで２回洗浄し、結合したＤＮＡを１０μｌのヌクレアーゼフリーの水で溶出した。溶出したＤＮＡを、ＦＥＭＴＯ Ｐｕｌｓｅ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して分析した。
結果
ＦＥＭＴＯ Ｐｕｌｓｅ分析の結果を図２に示す：まとめると；
ＰｃｉＩ制限酵素で消化したラムダＤＮＡは、約６００ｂｐ（配列番号６）～約９，０００ｂｐ（配列番号８）～約４０，０００ｂｐ（配列番号７）の長さを有する、予測された断片を示した。

【0161】

ＰｃｉＩ制限酵素で消化し、その後ＥｘｏＶエキソヌクレアーゼとインキュベーションしたラムダＤＮＡは断片が残っていないことを示し、このことはエキソヌクレアーゼ保護がないことを示唆している。

【0162】

ＰｃｉＩ制限酵素で消化し、Ｃａｓ９をｓｇＲＮＡ９及び１３とともに使用して標的したラムダＤＮＡは、約６００ｂｐ（配列番号６）～約９，０００ｂｐ（２ｘ）（配列番号１１及び１２）～約１０，０００ｂｐ（配列番号１０）～約２０，０００ｂｐ（配列番号９）の長さを有する、予測された断片を示した。配列番号９の最後の（３’）約５００ｂｐは配列番号１７に示し、配列番号１１の最初の（５’）約５００ｂｐは配列番号１８に示している。配列番号１０は、その５’末端に配列番号１４のプロトスペーサー部分と、その３’末端に配列番号１６のプロトスペーサー部分を含む。

【0163】

ＰｃｉＩ制限酵素で消化し、Ｃａｓ９をｓｇＲＮＡ９及び１３とともに使用して標的し、続いてＥｘｏＶエキソヌクレアーゼとインキュベートしたラムダＤＮＡは、驚いたことに、約１０，０００ｂｐの長さの断片を示した（配列番号１０）。

【0164】

結論
ＣＲＩＳＰＲ－システムヌクレアーゼ複合体は、ＤＮＡをエキソヌクレアーゼの分解から保護することができる。

【0165】

実施例２
材料、方法及び結果
作物ＤＮＡで本方法を調査するために、メロンＶｅｄｒａｎｔａｉｓのゲノムＤＮＡの４２３遺伝子座を標的とするようにｓｇＲＮＡを設計し、これらの標的はそれぞれ５．１～５．９ｋｂｐの長さを有する。それぞれの標的については、少なくとも２つのｓｇＲＮＡの組が、それぞれの標的に隣接する５００ｂｐの上流領域と下流領域の両方を標的とするように設計されており、それぞれのｓｇＲＮＡは、ゲノム内に特有の２０ｎｔの長さのガイド配列を含む。

【0166】

合計４８の反応物は、２．５μｌの１０ｘＮＥＢ ３．１バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）、０．１８μｌの１６．５８μＭ ｓｇＲＮＡミックス、０．１５μｌの２０μＭ Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９ヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）及び１３．１７μｌのヌクレアーゼフリーの水からなる総量２５μｌの中に、それぞれ９μｌの１１５．６ｎｇ／μｌ（＝約１μｇ）のメロンＶｅｄｒａｎｔａｉｓＤＮＡを含む。

【0167】

メロンＶｅｄｒａｎｔａｉｓＤＮＡ（９μｌ）を加える前に、反応混合物（１６μｌ）を１０分間、室温でプレインキュベートした。２５μｌの反応物を、３７℃で１時間インキュベートした。非保護断片を、エキソヌクレアーゼＶとのインキュベーションによって除去した。これについては、２５μｌのＣａｓ９反応物を分割し、各１２．５μｌに、以下の成分、２μｌの１０ｘＮＥＢ ３．１バッファー、２．０μｌの５０ｍＭ ＡＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）、２．５μｌの１０Ｕ／μｌエキソヌクレアーゼＶエキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）及び１μｌのヌクレアーゼフリーの水を加えた。得られた２０μｌの反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。タンパク質を、７０℃で３０分間インキュベーションすることによって不活性化した。ペプチド結合を加水分解するため、１μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ）を２０μｌの反応混合物に加え、室温で１０分間インキュベートした。

【0168】

すべてのサンプルを、Ａｍｐｕｒｅ ＰＢビーズ溶液（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、ビーズのサンプルに対する比を０．４５倍にして精製した。すべての９６反応の反応混合物をプールした。磁石に結合させた後、ビーズを７０％エタノールで２回洗浄した。ビーズを１分間乾燥させ、結合したＤＮＡを５０μｌのヌクレアーゼフリーの水で溶出させた。溶出したＤＮＡを、ＦＥＭＴＯ Ｐｕｌｓｅ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して分析した。結果を図３に示す。

【0169】

溶出したＤＮＡを、ＢｌｕｅＰｉｐｐｉｎ（Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してサイズ選択する（２．５ｋｂｐ～１０ｋｂｐ）。単離マトリックスのＢｌｕｅＰｉｐｐｉｎ Ｄｙｅ Ｆｒｅｅ ０．７５％アガロースゲルカセットを使用した。サイズ選択された生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製する。精製されたＤＮＡを１０μｌのヌクレアーゼフリーの水で溶出させた。溶出したＤＮＡを、ＦＥＭＴＯ Ｐｕｌｓｅ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して分析した。結果を図４に示す。

【0170】

溶出したＤＮＡを、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎｌＯＮシステムを使用して、配列決定用のシーケンスライブラリー調製に使用した。ライブラリー調製及び配列決定は、メーカーの仕様に従って実施した。

【0171】

得られた配列読み取りはメーカーの設定を使用して品質フィルタリングされ、それにパスした読み取りをメロンＶｅｄｒａｎｔａｉｓの全ゲノム参照配列に対してマッピングした。読み取りのマッピングについては、ｍｉｎｉｍａｐ２．１１－ｒ７９７を標準設定で使用した。マッピングした読み取りから、単一のマッピング位置を有するものだけをさらなる分析に使用した。得られたマッピングした読み取りを、ＩＧＶソフトウェア（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して視覚化した。図５に、約４７ｋｂｐ離れているゲノム内の２つの標的に関するこのようなマップを提供する。視覚化においては、標的化遺伝子座と、その遺伝子座を標的とするために使用されるｓｇＲＮＡの位置も示している。

【0172】

結論
ＣＲＩＳＰＲ－システムヌクレアーゼ複合体は、ＤＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護することができ、それによって目的の標的化領域のＤＮＡが濃縮される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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