7530362 共通の軽鎖を有するＦＩＸａ×ＦＸ二重特異性抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-30

(45)【発行日】2024-08-07

(54)【発明の名称】共通の軽鎖を有するＦＩＸａ×ＦＸ二重特異性抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240731BHJP

   C07K 16/36 20060101ALI20240731BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240731BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240731BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240731BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240731BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240731BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240731BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240731BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240731BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240731BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20240731BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240731BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20240731BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240731BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240731BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240731BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/36

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/13

C12P21/08

A61P7/04

A61K39/395 Y

A61K39/395 N

A61K9/08

A61K47/12

A61K47/18

A61K47/34

A61K38/02

A61K48/00

A61K31/7088

【請求項の数】 44

(21)【出願番号】P 2021535950

(86)(22)【出願日】2019-12-20

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-22

(86)【国際出願番号】 EP2019086808

(87)【国際公開番号】W WO2020128049

(87)【国際公開日】2020-06-25

【審査請求日】2022-12-19

(31)【優先権主張番号】1820977.5

(32)【優先日】2018-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1906816.2

(32)【優先日】2019-05-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1908190.0

(32)【優先日】2019-06-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】512006066

【氏名又は名称】カイマブ・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】リー，イーチャン

(72)【発明者】

【氏名】ブラックウッド，ジョン，ケニス

(72)【発明者】

【氏名】マグリオッツィ，ロベルト

【審査官】松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／０９８３６３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１２／０６７１７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０２１４５０（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ａ６１Ｐ ７／０４

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｋ ９／０８

Ａ６１Ｋ ４７／１２

Ａ６１Ｋ ４７／１８

Ａ６１Ｋ ４７／３４

Ａ６１Ｋ ３８／０２

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３１／７０８８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＦＩＸａ及びＦＸに結合し、ＦＸのＦＩＸａ媒介活性化を触媒する二重特異性抗体であって、前記抗体は２つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含み、
第１の重鎖-軽鎖対は、第１のＶＬドメインと対合した第１のＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含み、
第２の重鎖-軽鎖対は、第２のＶＬドメインと対合した第２のＶＨドメインを含むＦＸ結合性Ｆｖ領域を含み、
前記第１のＶＨドメインは、ＨＣＤＲ１が配列番号４４１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号４３６であり、ＨＣＤＲ３が配列番号４３３であると定義されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むＨＣＤＲセットを含み、アミノ酸配列レベルで配列番号４４３のＮ１２８０Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９５％同一であり、
前記第２のＶＨドメインは、ＨＣＤＲ１が配列番号５９８であり、ＨＣＤＲ２が配列番号４６７であり、ＨＣＤＲ３が配列番号５６５であると定義されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むＨＣＤＲセットを含み、アミノ酸配列レベルで配列番号６３２のＴ０９９９Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９５％同一であり、
前記第１のＶＬドメイン及び前記第２のＶＬドメインは、各々、ＬＣＤＲ１が配列番号６であり、ＬＣＤＲ２が配列番号７であり、ＬＣＤＲ３が配列番号８であると定義されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むＬＣＤＲセットを含み、アミノ酸配列レベルで配列番号１０の０１２８Ｌ ＶＬドメインと少なくとも９５％同一である、二重特異性抗体。

【請求項2】

前記第１のＶＨドメインが、配列番号４４３のＮ１２８０Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項3】

前記第１のＶＨドメインが配列番号４４３のＮ１２８０Ｈ ＶＨドメインである、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。

【請求項4】

前記第１のＶＨドメインが配列番号４５６のＮ１４４１Ｈ ＶＨドメインである、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。

【請求項5】

前記第２のＶＨドメインが配列番号６３２を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項6】

前記第１のＶＬドメイン及び前記第２のＶＬドメインが、各々、配列番号１０の０１２８Ｌと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項7】

前記第１のＶＬドメイン及び前記第２のＶＬドメインがアミノ酸配列において同一である、請求項１～６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項8】

前記第１のＶＬドメイン及び前記第２のＶＬドメインが配列番号４１６の０３２５Ｌアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の二重特異性抗体。

【請求項9】

各重鎖-軽鎖対が、ＣＨ１ドメインと対合したＣＬ定常ドメインを更に含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項10】

前記重鎖-軽鎖対が共通の軽鎖を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項11】

前記共通の軽鎖が０１２８Ｌ軽鎖の配列番号１４６のＣＬアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の二重特異性抗体。

【請求項12】

前記共通の軽鎖が配列番号４１４の０３２５Ｌ軽鎖である、請求項１１に記載の二重特異性抗体。

【請求項13】

各重鎖-軽鎖の重鎖が重鎖定常領域を含み、前記第１及び第２の重鎖-軽鎖対が会合して、前記重鎖定常領域の二量体化による四量体免疫グロブリンを形成している、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項14】

前記第１の重鎖-軽鎖対の前記重鎖定常領域が、前記第２の重鎖-軽鎖対の前記重鎖定常領域とは異なるアミノ酸配列を含み、前記互いに異なる２つのアミノ酸配列が、前記重鎖定常領域のヘテロ二量体化を促進するように操作されている、請求項１３に記載の二重特異性抗体。

【請求項15】

前記重鎖定常領域が、ノブ・イントゥ・ホール変異又は電荷対変異を含む、請求項１４に記載の二重特異性抗体。

【請求項16】

一方の重鎖-軽鎖対の前記重鎖定常領域が、置換Ｋ４３９Ｅを含むヒトＩｇＧ４定常領域であり、他方の重鎖-軽鎖対の前記重鎖定常領域が、置換Ｅ３５６Ｋを含むＩｇＧ４領域であり、定常領域の番号付けがＥＵ番号付けシステムに従うものである、請求項１４に記載の二重特異性抗体。

【請求項17】

一方又は両方の重鎖-軽鎖対の前記重鎖定常領域が、置換Ｓ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４定常領域であり、定常領域の番号付けがＥＵ番号付けシステムに従うものである、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項18】

一方の重鎖-軽鎖対の前記重鎖定常領域が配列番号４０９を含み、他方の重鎖-軽鎖対の前記重鎖定常領域が配列番号４１０を含む、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項19】

配列番号４４３又は配列番号４５６の第１のＶＨドメインアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
配列番号６３２の第２のＶＨドメインアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
配列番号４１６のＶＬドメインアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と
を含む請求項１３～１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項20】

配列番号４１９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
配列番号４２１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
配列番号４１４のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と
を含む請求項１３～１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項21】

配列番号４２６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と
配列番号４２１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
配列番号４１４のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と
を含む請求項１３～１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項22】

ヒトＩｇＧである請求項１～２１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【請求項23】

ヒトＩｇＧ４である請求項２２に記載の二重特異性抗体。

【請求項24】

請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗体をコードする単離された核酸。

【請求項25】

請求項１～２３のいずれか１項に規定される第１のＶＨドメインを含む抗体重鎖と、
請求項１～２３のいずれか１項に規定される第２のＶＨドメインを含む抗体重鎖と、
請求項１～２３のいずれか１項に規定される第１若しくは第２のＶＬドメインを含む抗体軽鎖と
をコードする組換えＤＮＡを含むインビトロの宿主細胞。

【請求項26】

配列番号４１９又は配列番号４２６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
配列番号４２１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
配列番号４１４のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と
をコードする組換えＤＮＡを含む、請求項２５に記載の宿主細胞。

【請求項27】

請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を製造するキットであって、
請求項１～２３のいずれか１項に規定される第１のＶＨドメインを含む抗体重鎖又は該重鎖をコードする核酸と、
請求項１～２３のいずれか１項に規定される第２のＶＨドメインを含む抗体重鎖又は該重鎖をコードする核酸と、
請求項１～２３のいずれか１項に規定される第１のＶＬドメインを含む抗体軽鎖又は該軽鎖をコードする核酸と、
請求項１～２３のいずれか１項に規定される第２のＶＬドメインを含む抗体軽鎖又は該軽鎖をコードする核酸と
を含むキット。

【請求項28】

配列番号４１９若しくは配列番号４２６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖又は該第１の重鎖をコードする核酸と、
配列番号４２１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖又は該第２の重鎖をコードする核酸と、
配列番号４１４のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖又は該共通の軽鎖をコードする核酸と
を含む請求項２７に記載のキット。

【請求項29】

請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を製造する方法であって、
請求項２５又は２６に記載の宿主細胞を、前記二重特異性抗体の発現のための条件下で培養すること、及び
前記宿主細胞の培養物から前記二重特異性抗体を回収すること
を含む方法。

【請求項30】

請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体又は請求項２４に記載の単離された核酸を、溶液中に、薬学的に許容される賦形剤と共に含む組成物。

【請求項31】

ヒト患者の身体の治療方法における使用のための請求項３０に記載の組成物。

【請求項32】

血友病Ａ患者の出血を制御する治療方法における使用のための請求項３０に記載の組成物。

【請求項33】

血友病Ａ患者の出血を制御する治療用の薬剤の製造のための請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の使用。

【請求項34】

前記患者が、血流中の阻害性抗体の存在に起因して、ＦＶＩＩＩを用いる治療に耐性である、請求項３１または３２に記載の組成物。

【請求項35】

前記患者が、血流中の阻害性抗体の存在に起因して、ＦＶＩＩＩを用いる治療に耐性である、請求項３３に記載の使用。

【請求項36】

前記患者が、血流中の阻害性抗体の存在に起因して、ＦＩＸａ及びＦＸに対する別の二重特異性抗体を用いる治療に耐性である、請求項３１、３２、３４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項37】

前記患者が、血流中の阻害性抗体の存在に起因して、ＦＩＸａ及びＦＸに対する別の二重特異性抗体を用いる治療に耐性である、請求項３３または３５に記載の使用。

【請求項38】

前記患者がエミシズマブを用いる治療に耐性である、請求項３６に記載の組成物。

【請求項39】

前記患者がエミシズマブを用いる治療に耐性である、請求項３７に記載の使用。

【請求項40】

阻害性抗薬物抗体の発生を低減させつつ血友病Ａ患者を治療する方法で使用するための、ＦＶＩＩＩａ活性を補充するポリペプチド薬物若しくはそのコード核酸を含む組成物、該組成物は、第１のＦＶＩＩＩａ活性を補充するポリペプチド薬剤および第２のＦＶＩＩＩａ活性を補充するポリペプチド薬剤、または、第１のＦＶＩＩＩａ活性を補充するポリペプチド薬剤、第２のＦＶＩＩＩａ活性を補充するポリペプチド薬剤、第３のＦＶＩＩＩａ活性を補充するポリペプチド薬剤のいずれかを含む、であって、
前記血友病Ａ患者を治療する方法が、
ＦＶＩＩＩａ活性を補充する第１のポリペプチド薬物を、１～１２か月の期間にわたって前記患者に投与することと、
ＦＶＩＩＩａ活性を補充する第２の異なるポリペプチド薬物に切り替えて、１～１２か月の期間にわたって前記患者に投与することと、
前記第１のポリペプチド薬物又はＦＶＩＩＩａ活性を補充する第３の異なるポリペプチド薬物のいずれかに切り替えて、１～１２か月の期間にわたって前記患者に投与することと
を含み、
前記ＦＶＩＩＩａ活性を補充する第１、第２又は第３のポリペプチド薬物は請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であり、
各場合において、前記ＦＶＩＩＩａ活性を補充するポリペプチド薬物又はそのコード核酸は、前記患者においてＦＶＩＩＩａを機能的に補充する治療有効量で投与され、前記患者が、前記ＦＶＩＩＩａ活性を補充するポリペプチド薬物のいずれかに対する阻害性抗薬物抗体を発生させるリスクが、該ＦＶＩＩＩａ活性を補充するポリペプチド薬物による治療を受け続ける患者と比較して低減される、組成物。

【請求項41】

前記ＦＶＩＩＩａ活性を補充する第１、第２及び第３のポリペプチド薬物が、任意の順序で、組換えの又は血漿由来のＦＶＩＩＩ、エミシズマブ及び請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体である、請求項４０に記載の組成物。

【請求項42】

前記治療が、前記患者への前記組成物の皮下投与を含む、請求項３１、３２、３４、３６、３８および４０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項43】

前記治療が、皮下投与を含む、請求項３３、３５、３７、３９のいずれか１項に記載の使用。

【請求項44】

血友病Ａ患者を治療するための組合せ医薬又はキットであって、少なくとも
請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体(第１の二重特異性抗体)と
組換えの若しくは血漿由来のＦＶＩＩＩ、エミシズマブ又は請求項１～２３のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、第１の二重特異性抗体とは異なる二重特異性抗体(第２の二重特異性抗体)とを含む組合せ医薬又はキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血液凝固カスケード中の第ＩＸａ因子および第Ｘ因子凝固因子に結合する二重特異性抗原結合分子（例えば、抗体）に関する。そのような二重特異性抗体は、第Ｘ因子を活性化することによって第ＶＩＩＩ因子を機能的に置換し、ＦＶＩＩＩが欠乏している患者、すなわちＡ型血友病患者に血液凝固能力を回復させる。

【背景技術】

【0002】

血友病は、多くの凝固因子のうちの１つの機能（部分的または全体）の損失により、血液の凝固能力が低下する遺伝性疾患である。血友病Ａは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の欠乏である。この疾患は、患者が残存ＦＶＩＩＩ機能を保持する程度、および血液凝固カスケード中の他の構成成分のバランスに応じて、軽度、中程度、および重度の形態を有する。治療しない場合、血友病Ａは、制御不能な出血を引き起こし、これは、特に関節血症からの関節の損傷により、重度の障害を引き起こす可能性がある。この疾患はしばしば致死的であり、生命を脅かす可能性がある。血友病Ａの世界的な発生率は、約１：１０，０００と考えられている。血友病Ｂ（異なる血液凝固因子、第ＩＸ因子の欠乏）は、あまり一般的ではなく、発生率は、約１：５０，０００である。両方の疾患は、Ｘ連鎖であるため、通常男性に見られ、男性出生における血友病Ａの発生率は、約５，０００人に１人である。

【0003】

出血エピソードの予防は、患者の生活の質を改善し、致命的な失血のリスクを減らすために不可欠である。血友病Ａの場合、失われた補因子は、ＦＶＩＩＩの投与によって置き換えられ得る。患者への投与のためのＦＶＩＩＩは、組換え発現されてもよいか、または血漿から精製されてもよい。典型的には、この治療を受けている患者は、４８時間毎または１週間当たり３回、ＦＶＩＩＩを自己注射する。

【0004】

ＦＶＩＩＩによる治療は、完璧な解決策ではない。重大な欠点は、体内で同種抗体の産生を誘発する可能性があることである。これは、同種抗体がＦＶＩＩＩに結合し、その活性を妨げ、出血が発生すると患者を危険な状況に置くため、ＦＶＩＩＩによる治療を効果のない状態にする。そのような阻害抗体は、重度の血友病のためにＦＶＩＩＩで治療された患者の約３０％において発生する。

【0005】

組換え型ではなく、血漿由来のＦＶＩＩＩによる治療は、患者において阻害抗体を誘発するリスクがより低いことが報告されている。これは、ＦＶＩＩＩに関連して自然に見られ、免疫原性エピトープをマスクし得るヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）を保持している血漿由来の形態による可能性がある。しかしながら、阻害抗体のリスクを完全に回避するＦＶＩＩＩの形態はまだ産生されていない。

【0006】

免疫原性がより高い可能性があるにもかかわらず、組換えＦＶＩＩＩは、安定性がより高く、貯蔵および輸送がより簡単かつ安価であるため、血漿由来の形態に比べていくつかの利点を提供する。寄付された血漿からの製品を介して感染を伝播するリスクは、Ｃ型肝炎およびＨＩＶなどのウイルスが感染した血液製剤がレシピエントに不注意に広がっていた１９８０年代と比較して現在大幅に減少したが、当然のことながら、厳しい安全管理の必要性が残っている。

【0007】

Ｂドメイン切断ポリペプチドであるツロクトコグアルファ（ＮｏｖｏＥｉｇｈｔ（登録商標））などのＦＶＩＩＩの新しい組換え型が開発されている。しかしながら、そのような製品は、ＦＶＩＩＩに対する中和抗体を発生させる患者には効果がない。一部の患者は、抗ＦＶＩＩＩ抗体の発生を防ぐために免疫寛容導入法をうまく受けている。しかしながら、阻害抗体を有するか、または阻害抗体を発生させるリスクがある患者に使用するためのＦＶＩＩＩの代替手段に対するかなりの需要が残っている。

【0008】

１つのそのような代替手段は、活性化されたエプタコグアルファ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））として既知の組換え第ＶＩＩａ因子である。しかしながら、それは半減期が短く、数時間毎に注射されなければならない。その使用は、長期的な保護治療の実行可能な選択肢ではなく、救援療法または阻害抗体を有する血友病患者における手術中の止血カバーの提供に主として制限されている。

【0009】

別の利用可能な製品は、活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ａＰＣＣ）であるＦＥＩＢＡ（第ＶＩＩＩ因子阻害剤迂回活性）であり、これは同様に、出血エピソードを制御し、第ＶＩＩＩ因子に対する阻害剤を有する血友病患者における外科的介入中の出血を防ぐために使用され得る。

【0010】

現在、遺伝子療法、ｓｉＲＮＡを使用した抗トロンビンの抑制、ＴＦＰＩ（組織因子経路阻害剤）、コンシズマブに対する抗体など、様々な他の代替療法が追求されている。

【0011】

１つの新しいアプローチは、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）および第Ｘ因子（ＦＸ）の両方を標的とするヒト化二重特異性ＩｇＧ抗体である。二重特異性抗体は、一方のアームでＦＩＸａに、他方のアームでＦＸに結合し、これら２つの補因子を一緒にし、それによりＦＶＩＩＩと同じ方法でＦＸのＦＩＸａ触媒活性化を促進する。したがって、抗体は、血液凝固カスケード中のＦＶＩＩＩを機能的に置き換える（図１）。その構造がＦＶＩＩＩとは完全に異なるため、抗体は、抗ＦＶＩＩＩ抗体によって中和できず、したがって投与されたＦＶＩＩＩに対する同種抗体が発生したか、または発生させるリスクがある患者に適している。

【0012】

２０１２年、Ｋｉｔａｚａｗａらは、９２匹の実験動物をヒトＦＩＸａまたはＦＸで免疫化し、抗ＦＩＸａおよび抗ＦＸ抗体遺伝子を発現のための宿主細胞に共トランスフェクトすることによって産生された、約４０，０００の抗ＦＩＸａ／Ｘ二重特異性抗体のスクリーンからの、ＦＸを活性化することが可能であったＦＩＸａ／Ｘ二重特異性抗体の単離を報告した［１］。選択した抗体を精製して、ｈＢＳ２３に指定されたヒト化抗体を生成し、これは、ＦＶＩＩＩ欠失血漿中の凝固活性および霊長類におけるインビボ止血活性を示した［１］。ｈＢＳ９１０［２］に指定されたこの抗体のより強力な型は、治験薬名ＡＣＥ９１０、ＩＮＮエミシズマブで臨床試験に参加した［３］。ＡＣＥ９１０の開発は、世界の主要な抗体グループのうちの１つで行われた。それにもかかわらず、適切なインビボ有効性、ならびに臨床規模の製造に適した生化学的および生物物理学的特性を有する分子を操作するのに７年以上かかった。

【0013】

最大１ｍｇ／ｋｇの用量でＡＣＥ９１０を皮下投与された４８名の健康な男性対象の第Ｉ相研究において、２名の対象が、抗ＡＣＥ９１０抗体の検査で陽性と出た［４］。抗体は、線形の薬物動態プロファイルおよび約４～５週間の半減期を有することが報告された［４］。その後、エミシズマブを最大３ｍｇ／ｋｇの毎週の皮下用量で、１８名の日本人の重度の血友病Ａ患者に投与し、これらの患者における出血を制御するために、凝固因子のエピソード使用を低減することが報告された［５］。２０１６年１２月、エミシズマブは、血友病Ａ患者における出血を低減するための第ＩＩＩ相臨床試験で、その一次エンドポイントを満たしたことが報告された（「ＨＡＶＥＮ １」研究）。予防的治療を受けていない患者と比較して、エミシズマブ予防法で治療された患者に関して、出血数の統計的に有意な低減が報告された。この試験は、以前にバイパス剤予防治療を受けた人々における患者内比較において、エミシズマブ予防治療による経時的な出血数の統計的に有意な低減を含む、すべての二次エンドポイントを満たしていることも報告された。したがって、エミシズマブの有効性データは有望であるが、ＨＡＶＥＮ １研究での患者の死亡によって安全性への懸念が高まった。承認された薬物は、エミシズマブと組み合わせてａＰＣＣを投与された患者における血栓性微小血管障害症および血栓塞栓症のリスクに関する枠組み警告文を伴う。上記のように、ａＰＣＣは、二重特異性抗体による治療の主要な患者群である、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体を有する患者において、出血を制御するために使用される。

【0014】

血友病の管理は、通常は乳児期にある診断の時点から始まり、患者の生涯にわたって継続的な治療が必要であり、副作用なしで許容され、かつ数十年またはさらには１００年にもわたって有効なままである療法を必要とすることに留意することが重要である。したがって、低免疫原性を含む長期の安全性は、数週間、数か月、またはさらには数年などのより短い継続期間にわたって投与されることを目的とする抗体と比較して、抗血友病抗体にとってより重要である。

【0015】

ＷＯ２０１８／０９８３６３は、ヒト抗体酵母ライブラリ（Ａｄｉｍａｂ）から単離されたＦＩＸおよびＦＸに結合する二重特異性抗体を記載した。ＷＯ２０１８／０９８３６３は、二重特異性抗体の抗ＦＩＸａアームの親和性の増加が、ＦＶＩＩＩａ活性の増加をもたらすことを開示した（アッセイにおける血液凝固時間の減少によって表される）。二重特異性抗体「ＢＳ－０２７１２５」を、最初に選択された「親」抗体の親和性成熟によって生成し、これは、ＦＩＸａ結合アームの親和性を増加させた。ＢＳ－０２７１２５は、一段階凝固アッセイにおいて約９０％のＦＶＩＩＩａ様活性を達成することが報告された。エミシズマブと比較した場合、ＢＳ－０２７１２５は、ＦＩＸチモーゲン、ＦＩＸａおよびＦＸチモーゲンに対するはるかに高い親和性結合、ならびにＦＸａへのはるかに低い結合（結合は検出されず）を呈することが報告された。ＦＩＸ結合アーム「ＢＩＩＢ－９－１３３６」は報告によると、ＦＩＸチモーゲン（タンパク質分解活性化の前の成熟ＦＩＸ）よりもＦＩＸａ（活性化ＦＩＸ）に対する選択的結合を示し、ＦＶＩＩＩａによって結合したＦＩＸａエピトープと重複するエピトープに結合することがわかった。ＦＸ結合アーム「ＢＩＩＢ－１２－９１７」は報告によると、ＦＸチモーゲンに選択的に結合し、（活性化）ＦＸａへの検出可能な結合を欠き、（ＦＸａではなくＦＸチモーゲン中に存在する）活性化ペプチド内にあるＦＸのエピトープに結合したことを示した。次いで、ＢＩＩＢ－９－１３３６を含む選択されたＦＩＸ結合抗体にさらなる変異を導入し、ＦＩＸａに対する特異性および／または親和性がさらに増加した抗体を選択するためのライブラリを生成した。

【0016】

ＷＯ２０１８／１４１８６３およびＷＯ２０１８／１４５１２５はまた、抗ＦＩＸａｘＦＸ二重特異性抗体、および出血を治療または低減するための凝固促進剤としてのそれらの使用について記載した。

【発明の概要】

【0017】

本発明は、血液凝固第ＦＩＸａ因子および第ＦＸ因子に結合する改善された二重特異性抗原結合分子に関する。本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＦＸのＦＸａへのＦＩＸａ触媒活性化を増強し、血友病Ａ患者において欠けている天然の第ＦＶＩＩＩａ補因子に効果的に取って代わって、患者の血液の凝固能力を回復させることができる。図２を参照されたい。

【0018】

本明細書で報告されるように、本発明者らは、ＦＸ活性化の増強における非常に高い効力を含む、治療製品としての開発に適した品質を有する多くの二重特異性抗原結合分子を生成することに成功した。抗ＦＩＸａおよび抗ＦＸに対する新規結合部位を有する二重特異性抗原結合分子について記載され、これは、血液凝固カスケード中でＦＶＩＩＩａに効果的に取って代わるために使用され得る。具体的には、異なる抗ＦＸ結合部位の配列と組み合わせて非常に活性であり、したがって様々な異なるＦＩＸａ－ＦＸ二重特異性抗体に組み込まれ得、製造の容易さなどのさらなる所望の特性を有する二重特異性抗体の選択に柔軟性を提供する、抗ＦＩＸａ結合部位が記載される。

【0019】

本発明者らは、強力な（ｐｏｔｅｎｔ）ＦＶＩＩＩ模倣活性（インビトロアッセイでの高性能によって示されるような）と、臨床規模の製造に適した強力な（ｒｏｂｕｓｔ）生化学的および生物物理学的特性（発現、二重特異性分子アセンブリ、精製および製剤を含む）を組み合わせた二重特異性抗体を設計した。この二重特異性抗体は、完全にヒト由来であるため、ヒトのインビボ療法における免疫原性のリスクを最小限に抑える。

【0020】

本発明の態様は、添付の特許請求の範囲に記載されており、本発明のさらなる実施形態および好ましい特徴は、以下に記載されている。

【0021】

第１の態様では、本発明は、（ｉ）ＦＩＸａ結合部位を含むＦＩＸａ結合ポリペプチドアームと、（ｉｉ）ＦＸ結合部位を含むＦＸ結合ポリペプチドアームとを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。ＦＩＸａおよび／またはＦＸ結合ポリペプチドアームは、それぞれＦＩＸａまたはＦＸ結合部位を含む抗体Ｆｖ領域を含んでもよい。抗体Ｆｖ領域は、抗体ＶＨ－ＶＬドメイン対である。ＶＨドメインは、ＶＨドメインフレームワーク内にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＶＬドメインは、ＶＬドメインフレームワーク内にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。ポリペプチドアームは、抗体重鎖（任意選択でＩｇＧ定常領域を含むもの）および／または抗体軽鎖を含んでもよい。

【0022】

したがって、本発明の抗原結合分子は、
第１および第２の抗体Ｆｖ領域であって、第１および第２の抗体Ｆｖ領域は、それぞれＦＩＸａおよびＦＸについての結合部位を含む、第１および第２の抗体Ｆｖ領域と、
インビボで分子の半減期を延長するための半減期延長領域と、を含み得る。

【0023】

半減期延長領域は、第１の抗体Ｆｖ領域に共有結合した（例えば、融合タンパク質として）第１のポリペプチドと、第２の抗体Ｆｖ領域に共有結合した（例えば、融合タンパク質として）第２のポリペプチドとを含む、ヘテロ二量体化領域であってもよく、２つのポリペプチドは、互いと共有結合的および／または非共有結合的に対になる。ヘテロ二量体化領域の第１および第２のポリペプチドは、同一または異なるアミノ酸配列を有してもよい。ヘテロ二量体化領域は、１つ以上の抗体定常ドメインを含んでもよく、例えば、それは、抗体Ｆｃ領域であってもよい。

【0024】

本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームのＦＩＸａ結合部位を通してＦＩＸａに結合し、ＦＸ結合ポリペプチドアームのＦＸ結合部位を通してＦＸに結合し、それによりＦＸのＦＸａへのＦＩＸａ触媒活性化を増強することが可能である。これは、本明細書に記載のインビトロＦＸ活性化アッセイで決定され得る。

【0025】

ＦＩＸａ結合部位は、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供されてもよく、ＣＤＲのセットは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、任意選択で、ＨＣＤＲ１は配列番号４０６であり、ＨＣＤＲ２は配列番号４０７であり、ＨＣＤＲ３は配列番号４０８である。任意選択で、ＬＣＤＲ１は配列番号６であり、ＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＬＣＤＲ３は配列番号８である。

【0026】

ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームにおけるＨＣＤＲのセットは、本明細書に示される任意の抗ＦＩＸ ＶＨドメインのＨＣＤＲのセットであってもよく、例えば、表Ｓ－９Ａに示される任意のもの、表Ｎで同定される任意のもの、または図２０で示されるＶＨドメイン、Ｎ０１２８Ｈ、Ｎ０４３６Ｈ、Ｎ０５１１Ｈ、Ｎ１０９１Ｈ、Ｎ１１７２Ｈ、Ｎ１２８０Ｈ、Ｎ１３１４Ｈ、Ｎ１３２７Ｈ、またはＮ１３３３Ｈの任意のものであり得る。ＨＣＤＲ１は、配列番号４４１であり得る。ＨＣＤＲ２は、配列番号６３４または配列番号４３６であり得る。ＨＣＤＲ３は、配列番号６３５または配列番号４３３であり得る。ＣＤＲはＮ１２８０ ＣＤＲであり得、ＨＣＤＲ１は配列番号４４１であり、ＨＣＤＲ２は配列番号４３６であり、ＨＣＤＲ３は配列番号４３３である。あるいは、ＣＤＲはＮ１３３３Ｈ ＣＤＲであり得る。

【0027】

ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームにおけるＬＣＤＲのセットは、本明細書に示される任意の抗ＦＩＸ ＶＬドメインのＬＣＤＲのセットであり得る。ＬＣＤＲは、表Ｓ－５０に示されるような０１２８ＬのＬＣＤＲであり得る。ＬＣＤＲ１は配列番号６であり得、ＬＣＤＲ２は配列番号７であり得、及び/またはＬＣＤＲ３は配列番号８であり得る。

【0028】

任意選択で、ＣＤＲのセットの１つ以上のアミノ酸は、これらの配列とは異なるように変異されてもよい。例えば、ＣＤＲのセットは、１、２、３、４、または５個のアミノ酸改変を含んでもよく、改変した残基（複数可）は、重鎖または軽鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上にある。例えば、ＣＤＲのセットは、１つまたは２つの保存的置換を含んでもよい。変異、例えば、置換の選択は、本明細書の実施例に提供される情報および分析によって情報を得ることができる。

【0029】

ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームは、ＨＣＤＲのセット、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインを含んでもよい。ＨＣＤＲ１の配列は、任意選択で１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を伴う配列番号４０６であってもよい。ＨＣＤＲ２の配列は、任意選択で１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を伴う配列番号４０７であってもよい。ＨＣＤＲ３の配列は、任意選択で１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を伴う配列番号４０８であってもよい。

【0030】

ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームは、ＬＣＤＲのセット、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインを含んでもよい。ＬＣＤＲ１の配列は、任意選択で１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を伴う配列番号６であってもよい。ＬＣＤＲ２の配列は、任意選択で１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を伴う配列番号７であってもよい。ＬＣＤＲ３の配列は、任意選択で１つまたは２つのアミノ酸改変（例えば、置換）を伴う配列番号８であってもよい。

【0031】

ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームの抗体Ｆｖ領域は、免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄおよびｊ遺伝子セグメントの組換えを通して生成されたＶＨドメインであって、ｖ遺伝子セグメントが、ＶＨ３－７（例えば、ＶＨ３－７＊０１）であり、ｊ遺伝子セグメントが、ＪＨ６（例えば、ＪＨ６＊０２）であり、任意選択で、ｄ遺伝子セグメントが、ＤＨ１－２６（例えば、ＤＨ１－２６＊０１）である、ＶＨドメインを含んでもよく、および/またはそれは、免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えを通して生成されたＶＬドメインであって、ｖ遺伝子セグメントが、ＶＬ３－２１（例えば、ＶＬ３－２１＊ｄ０１）であり、ｊ遺伝子セグメントが、ＪＬ２（例えば、ＪＬ２＊０１）である、ＶＬドメインを含んでもよい。別の実施形態では、ＶＬドメインは、免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えを通して生成されたＶＬドメインであって、ｖ遺伝子セグメントが、ＶＬ３－２１（例えば、ＶＬ３－２１＊ｄ０１）であり、ｊ遺伝子セグメントが、ＪＬ３（例えば、ＪＬ３＊０２）である、ＶＬドメインであり得る。

【0032】

ＦＩＸａポリペプチド結合アームのＶＨドメインのアミノ酸配列は、表２０に示されるＶＨドメイン、例えば、Ｎ１２８０Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９０％の配列同一性を共有してもよい。配列同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。任意選択で、ＶＨドメインは、本明細書に示される抗ＦＩＸ ＶＨドメインの１つであってもよく、例えば、表Ｓ－９Ａに示される任意のもの、表Ｎで同定される任意のもの、または図２０で示されるＶＨドメイン、Ｎ０１２８Ｈ、Ｎ０４３６Ｈ、Ｎ０５１１Ｈ、Ｎ１０９１Ｈ、Ｎ１１７２Ｈ、Ｎ１２８０Ｈ、Ｎ１３１４Ｈ、Ｎ１３２７Ｈ、またはＮ１３３３Ｈの任意のものであり得る。任意選択で、ＶＨドメインは、Ｎ１２８０Ｈ、Ｎ１３３３Ｈ、Ｎ１４４１、Ｎ１４４２、またはＮ１４５４である。任意選択で、抗ＦＩＸａ ＶＨドメインは、最大５個のアミノ酸置換、すなわち、１、２、３、４または５個の置換を有する、該ＶＨドメイン（例えば、Ｎ１２８０Ｈ）のいずれかのアミノ酸配列を含む。置換は、任意選択で１つ以上のフレームワーク領域中にあり得、例えば、ＦＲ３に、任意選択でＩＭＧＴ位置８４および／またはＩＭＧＴ位置８６に１つまたは２つの置換があり得る。

【0033】

ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を共有してもよい（０１２８Ｌ）。配列同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。任意選択で、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０である。ＶＬドメインのアミノ酸配列は、代替的には、配列番号４１６であり得る。

【0034】

ＦＸ結合部位は、ＦＸ結合ポリペプチドアーム内のＣＤＲのセットによって提供されてもよい。ＦＸ結合ポリペプチドアームは、抗体ＶＨ－ＶＬドメイン対（すなわち、抗体Ｆｖ領域）、フレームワーク内にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含むＶＨドメイン、ならびにフレームワーク内にＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含むＶＬドメインを含んでもよい。

【0035】

ＦＸ結合部位は、本明細書で同定される任意の抗ＦＸ ＶＨドメインのＨＣＤＲ（例えば、表Ｓ１０－Ｃおよび／または図１１に示されるＶＨドメインのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の任意のセット）および０１２８Ｌ ＬＣＤＲによって提供され得る。

【0036】

ＦＸ結合ポリペプチドアームは、表Ｓ－１０Ｃおよび／または図１１のいずれか、例えば、Ｔ０６８７Ｈ、Ｔ０７３６ＨまたはＴ０９９９Ｈ ＶＨドメインを含む、本明細書に開示されるＶＨドメインと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含み得る。配列同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。任意選択で、ＶＨドメインは、最大５個のアミノ酸置換、すなわち、１、２、３、４または５個の置換を有する、該ＶＨドメインのアミノ酸配列を含む。置換は、任意選択で１つ以上のフレームワーク領域中にあり得る。

【0037】

ＦＸ結合ポリペプチドアームは、Ｔ０２０１ ＶＨドメインと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含み得る（図１１に示される）。配列同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。任意選択で、ＶＨドメインは、最大５個のアミノ酸置換、すなわち、１、２、３、４または５個の置換を有する、該ＶＨドメインのアミノ酸配列を含む。置換は、任意選択で１つ以上のフレームワーク領域中にあり得る。

【0038】

ＦＸ結合ポリペプチドアームは、表Ｓ－１０Ｃに示される任意のもの、表Ｔで同定される任意のもの、または図１１からの任意のものなど、本明細書で同定される任意のＶＨドメインのアミノ酸配列を含み得る。任意選択で、ＶＨドメインは、Ｔ０２０１Ｈ、Ｔ０６８７Ｈ、Ｔ０７３６Ｈ、またはＴ０９９９Ｈである。

【0039】

ＦＸ結合ポリペプチドアームは、配列番号１０の０１２８Ｌ ＶＬドメインと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインを含み得る。配列同一性は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であってもよい。任意選択で、ＶＬドメインは、最大５個のアミノ酸置換、すなわち、１、２、３、４または５個の置換を有する、０１２８Ｌ ＶＬドメインのアミノ酸配列を含む。任意選択で、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０である。代替的には、ＶＬドメイン配列は、配列番号４１６である。

【0040】

ＦＸ結合ポリペプチドアームは、以下：
免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換えを通して生成されたＶＨドメインであって、ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＩＧＨＶ１－４６（例えば、ＶＨ１－４６＊０３）およびＩＧＨＪ１（例えば、ＪＨ１＊０１）であり、任意選択で、ｄ遺伝子セグメントが、ＩＧＨＤ６－６（例えば、ＤＨ６－６＊０１）である、ＶＨドメインと、
免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換えを通して生成されたＶＬドメインであって、ｖおよびｊ遺伝子セグメントが、ＩＧＬＶ３－２１（例えば、ＶＬ３－２１＊ｄ０１）およびＩＧＬＪ２（例えば、ＪＬ２＊０１）またはＩＧＬＪ３（例えば、ＪＬ３＊０２）である、ＶＬドメインと、を含む抗体Ｆｖ領域を含んでもよい。

【0041】

したがって、本発明の一態様は、ＦＩＸａおよびＦＸに結合し、ＦＩＸａを介したＦＸの活性化を触媒する二重特異性抗体であり、この抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対を含み、
第１の重鎖－軽鎖対は、第１のＶＬドメインと対になった第１のＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含み、
第２の重鎖－軽鎖対は、第２のＶＬドメインと対になった第２のＶＨドメインを含むＦＸ結合性Ｆｖ領域を含み、
第１のＶＨドメインは、ＨＣＤＲ１は配列番号４０６であり、ＨＣＤＲ２は配列番号４０７であり、ＨＣＤＲ３は配列番号４０８であると定義されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含むＨＣＤＲのセットを含み、および/または第１のＶＨドメインは、アミノ酸配列レベルでＮ１２８０Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９５％同一であり、
第２のＶＨドメインは、アミノ酸配列レベルでＴ０２０１Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９５％同一であり、
第１のＶＬドメインおよび第２のＶＬドメインが、各々、ＬＣＤＲ１は配列番号６であり、ＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＬＣＤＲ３は配列番号８であると定義されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含むＬＣＤＲのセットを含み、および/または第１のＶＬドメインおよび第２のＶＬドメインが、アミノ酸配列レベルで配列番号１０の０１２８Ｌ ＶＬドメインと少なくとも９５％同一である。

【0042】

本発明の別の態様は、ＦＩＸａおよびＦＸに結合し、ＦＩＸａを介したＦＸの活性化を触媒する二重特異性抗体であり、この抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対を含み、
第１の重鎖－軽鎖対は、第１のＶＬドメインと対になった第１のＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含み、
第２の重鎖－軽鎖対は、第２のＶＬドメインと対になった第２のＶＨドメインを含むＦＸ結合性Ｆｖ領域を含み、
第１のＶＨドメインは、免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換え産物であり、ｖ遺伝子セグメントは、ＩＧＨＶ３－７（例えば、ＶＨ３－７＊０１）であり、ｊ遺伝子セグメントは、ＩＧＨＪ６（例えば、ＪＨ６＊０２）であり、
第２のＶＨドメインは、免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換え産物であり、ｖ遺伝子セグメントは、ＩＧＨＶ１－４６（例えば、ＶＨ１－４６＊０３）であり、ｊ遺伝子セグメントは、ＩＧＨＪ１（例えば、ＪＨ１＊０１）であり、任意選択で、ｄ遺伝子セグメントは、ＩＧＨＤ６－６（例えば、ＤＨ６－６＊０１）であり、
第１のＶＬドメインおよび第２のＶＬドメインは、共に、ヒト免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換え産物であり、ｖ遺伝子セグメントは、ＩＧＬＶ３－２１（例えば、ＶＬ３－２１＊ｄ０１）であり、ｊ遺伝子セグメントは、ＩＧＬＪ２（例えば、ＪＬ２＊０１）またはＩＧＬＪ３（例えば、ＪＬ３＊０２）である。

【0043】

本発明の別の態様は、ＦＩＸａおよびＦＸに結合し、ＦＩＸａを介したＦＸの活性化を触媒する二重特異性抗体であり、この抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対を含み、
第１の重鎖－軽鎖対は、第１のＶＬドメインと対になった第１のＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含み、
第２の重鎖－軽鎖対は、第２のＶＬドメインと対になった第２のＶＨドメインを含むＦＸ結合性Ｆｖ領域を含み、
第１のＶＨドメインは、Ｎ１２８０Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、
第２のＶＨドメインは、Ｔ０２０１Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、
第１のＶＬドメインおよび第２のＶＬドメインは各々、０１２８Ｌ ＶＬドメインと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。

【0044】

第１のＶＨドメインは、ＨＣＤＲ１は配列番号４０６であり、ＨＣＤＲ２は配列番号４０７であり、ＨＣＤＲ３は配列番号４０８であると定義されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含むＨＣＤＲのセットを含み得る。

【0045】

第１のＶＨドメインは、Ｎ１２８０Ｈと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し得る。第１のＶＨドメインは、Ｎ１２８０Ｈ ＨＣＤＲ１、Ｎ１２８０Ｈ ＨＣＤＲ２、およびＮ１２８０Ｈ ＨＣＤＲ３を含むＮ１２８０Ｈ ＨＣＤＲのセットを含み得る。例えば、それは、Ｎ１２８０Ｈ ＶＨドメインであり得る。代替的には、ＶＨドメインは、Ｎ１４４１Ｈ、Ｎ１４４２Ｈ、またはＮ１４５４Ｈ ＶＨドメインであり得る。

【0046】

例示的なＶＨドメインおよびＶＨ ＣＤＲのセットのアミノ酸配列を図２０および／または表Ｓ－９Ａに示す。二重特異性抗体の第１のＶＨドメインは、これらのＶＨドメインの任意のものであってもよく、またはこれらのＶＨドメインの任意のものと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し得る。任意選択で、それは、最大５個のアミノ酸置換、すなわち、該ＶＨドメインと比較して１、２、３、４または５個の置換を有するＶＨドメインのアミノ酸配列を含み得る。置換は、任意選択でフレームワーク領域中にある。

【0047】

第１のＶＨドメインに保持または導入され得る残基および置換の例には、以下のものが含まれる（Ｎ１２８０Ｈを参照して定義され、図１４に示すようにＩＭＧＴ番号が付けられている）：
ＦＲ３のＬｙｓ８４での別の残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＴｙｒ）の置換、例えば、Ｌｙｓ８４ＡｓｐまたはＬｙｓ８４Ｇｌｕ、および
ＦＲ３のＳｅｒ８６での別の残基、例えば、Ｇｌｕ（Ｓｅｒ８６Ｇｌｕ）などの負に帯電した残基の置換。

【0048】

その他の例には以下が含まれる：
Ｇｌｎ３、Ｖａｌ５、Ｇｌｙ９、Ｇｌｙ１１、Ｇｌｙ１６、Ｇｌｙ１７、およびＬｅｕ２１ ＦＲ１のうちの１つ以上での負に帯電した残基（例えば、ＡｓｐもしくはＧｌｕ）またはＨｉｓの置換、例えば、Ｇｌｎ３Ａｓｐ、Ｇｌｎ３Ｇｌｕ、Ｇｌｎ３Ｈｉｓ、Ｖａｌ５Ｇｌｕ、Ｇｌｙ９Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１１Ａｓｐ、Ｇｌｙ１１Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１１Ｈｉｓ、Ｇｌｙ１６Ｇｌｕ、Ｇｌｙ１７Ａｓｐ、Ｇｌｙ１７Ｇｌｕ、またはＬｅｕ２１Ａｓｐのうちのいずれか、
ＦＲ３のＶａｌ６８および／またはＶａｌ７１での負に帯電した残基の置換、例えば、Ｖａｌ６８Ａｓｐ、Ｖａｌ６８Ｇｌｕ、またはＶａｌ７１Ｇｌｕ、
ＦＲ３のＡｒｇ７５でのＨｉｓ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕの置換、
ＦＲ３のＡｒｇ８０でのＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓの置換、ならびに
ＦＲ３のＡｓｎ８２でのＡｓｐまたはＨｉｓの置換。

【0049】

上記の配列の特徴のいずれか１つまたは複数を含めることができる。

【0050】

第２のＶＨドメインは、Ｔ０２０１Ｈまたは図１１および／もしくは表Ｓ－１０Ｃで示される任意の他のＶＨドメインであってもよく、あるいはＴ０２０１Ｈまたは図１１および／もしくは表Ｓ－１０Ｃで示される任意の他のＶＨドメインと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し得る。任意選択で、それは、最大５個のアミノ酸置換、すなわち、該ＶＨドメインと比較して１、２、３、４または５個の置換を有するＶＨドメインのアミノ酸配列を含み得る。置換は、任意選択でフレームワーク領域中にある。第２のＶＨドメインは、Ｔ０２０１Ｈ ＨＣＤＲ１であるＨＣＤＲ１、Ｔ０２０１Ｈ ＨＣＤＲ１であるＨＣＤＲ２、および／またはＴ０２０１Ｈ ＨＣＤＲ３であるＨＣＤＲ３を含み得る。これらのＣＤＲのアミノ酸配列を、図１１および１２、ならびに表Ｓ－１０Ｃに示す。さらなるＣＤＲの例を、図１２および表Ｔに示す。例えば、第２のＶＨドメインは次のものを含み得る：
Ｔ０２０１ ＨＣＤＲ１もしくはＴ０７３６ ＨＣＤＲ１であるＨＣＤＲ１、
Ｔ０２０１ ＨＣＤＲ２であるＨＣＤＲ２、および／または
Ｔ０２０１ ＨＣＤＲ３、Ｔ０６８７ ＨＣＤＲ３、もしくはＴ０７３６ ＨＣＤＲ３であるＨＣＤＲ３。

【0051】

任意選択で、ＨＣＤＲ１は、配列番号６３６または配列番号５９８である。任意選択で、ＨＣＤＲ２は、配列番号４６７である。任意選択で、ＨＣＤＲ３は、配列番号６３７、配列番号６３８、配列番号６３９、または配列番号５６５である。

【0052】

第２のＶＨドメインに保持または導入され得る残基および置換の例には、以下のものが含まれる（Ｔ０２０１Ｈを参照して定義され、図１３に示すようにＩＭＧＴ番号が付けられている）：
Ｃｙｓ１１４での別のアミノ酸残基の置換、例えば、置換された残基がＩｌｅ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、ＶａｌまたはＴｒｐ（好ましくはＩｌｅ、ＶａｌまたはＬｅｕ）である、
ＦＲ１のＧｌｎ３について別の正に帯電した残基の置換、例えば、Ｇｌｎ３ＡｒｇまたはＧｌｎ３Ｌｙｓ、
フレームワーク領域の残基の生殖細胞系列、例えば、Ｉｌｅ５Ｖａｌ（ＦＲ１の残基５でのイソロイシンについてバリンの置換）、またはフレームワーク領域の非生殖細胞系列残基の、異なる非生殖細胞系列残基による置換、例えば、Ｉｌｅ５Ａｒｇ（ＦＲ１の残基５のイソロイシンについてアルギニンの置換）、
ＦＲ１のＧｌｕ１１での別のアミノ酸残基（例えば、Ｌｙｓ、ＡｌａまたはＧｌｙ）の置換、例えば、Ｇｌｕ１１Ｌｙｓ、
ＦＲ１のＧｌｙ１６についての正に帯電したアミノ酸残基の置換、例えば、Ｇｌｙ１６Ａｒｇ、
ＦＲ２の３９位にＭｅｔが存在するか、代替的には、この位置にＬｅｕが存在する、
ＣＤＲ２の６２位および／または６４位にＳｅｒが存在する、
ＦＲ３のＰｈｅ７１でのＴｙｒの置換、
ＦＲ３のＴｈｒ８２での正に帯電した残基の置換、例えば、Ｔｈｒ８２ＡｒｇまたはＴｈｒ８２Ｌｙｓ、ＦＲ３の８５位でのＳｅｒの存在、または代替的にはこの位置でのＴｈｒの存在、
ＦＲ３のＴｈｒ８６での正に帯電した残基の置換、例えば、Ｔｈｒ８６ＡｒｇまたはＴｈｒ８６Ｌｙｓ。

【0053】

上記の配列の特徴のいずれか１つまたは複数を含めることができる。

【0054】

ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームおよびＦＸ結合ポリペプチドアームは各々、抗体Ｆｖを含んでもよく、各ＦｖのＶＬドメインは、同一のアミノ酸配列を有し、すなわち、二重特異性抗原結合分子は、共通のＶＬドメインを有する。分子は、可変領域および定常領域、任意選択でヒトラムダ定常領域を含む、共通の軽鎖を有してもよい。

【0055】

二重特異性抗原結合分子は、以下
ＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含む抗体重鎖および軽鎖の第１の対（重鎖－軽鎖対）と、
ＦＸ結合性Ｆｖ領域を含む第２の重鎖－軽鎖対と、を含む、四量体免疫グロブリンであってもよく、
各重鎖は、ＶＨドメインおよび定常領域を含み、各軽鎖は、ＶＬドメインおよび定常領域を含み、第１および第２の重鎖－軽鎖対は、それらの重鎖定常領域のヘテロ二量体化を通して会合して、免疫グロブリン四量体を形成する。

【0056】

上記のように、軽鎖は、共通の軽鎖であってもよく、すなわち、第１および第２の重鎖－軽鎖対の軽鎖は、同一のアミノ酸配列を有する。各重鎖－軽鎖対は、ＣＨ１ドメインと対になった０１２８Ｌ ＣＬ定常ドメインを含み得る。軽鎖の配列は、配列番号４０５であり得る。代替的には、軽鎖の配列は、配列番号４１４であり得る。例示的な免疫グロブリンアイソタイプは、任意選択でＩｇＧ４ ＰＥなどの定常ドメインが操作されたヒトＩｇＧ、例えばＩｇＧ４を含む。

【0057】

二重特異性抗体のＦｃドメインは、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化を促進するように操作することができる。例えば、第１の重鎖－軽鎖対の重鎖定常領域は、第２の重鎖－軽鎖対の重鎖定常領域とは異なるアミノ酸配列を含み得、ここで、異なるアミノ酸配列は、重鎖定常領域のヘテロ二量体化を促進するように操作される。例としては、ノブ・イントゥ・ホール変異または電荷対変異などがある。代替的には、第１の重鎖－軽鎖対の重鎖定常領域は、第２の重鎖－軽鎖対の重鎖定常領域と同一であってもよく、その場合、ホモ二量体およびヘテロ二量体の両方がアセンブルすると予想され、これらは続いて、抗体製造プロセスにおける１つ以上の精製工程を使用して分離され、１つの抗ＦＩＸａアームおよび１つの抗ＦＸアームを含む所望のヘテロ二量体を単離する。

【0058】

本明細書で例示される二重特異性抗体の有利な特徴は、それらがＫｙｍｏｕｓｅプラットフォームを使用して、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントから生成されていることである。マウスＣＤＲをヒト抗体可変ドメインにグラフト化すること、およびこれらの変化に起因する機能の損失を軽減するために操作された可変ドメインを反復精製することなどの「ヒト化」ステップを必要とし得る、通常の実験動物の免疫化から生成される抗体とは異なり、本発明の抗体は、完全なヒト抗体可変ドメインを用いて最初から生成および選択された。完全なヒト抗体の使用は、上記のように、低免疫原性が最も重要である血友病治療の状況において特に適している。本発明の二重特異性抗体の免疫原性が低いため、それらは、ＦＶＩＩＩなどの他の治療に対する阻害抗体を伴うかまたは伴わない患者を含む、血友病Ａ患者の治療に適したものとなる。本発明の抗原結合分子を投与されている患者は、療法に対する免疫原性応答を発生させるリスクが最小限であるべきである。

【0059】

二重特異性分子の作用機序は、深部静脈血栓症および肺塞栓症などの合併症のリスクが低い良好な安全性プロファイルとも関連している。二重特異性分子の活性は、天然のＦＶＩＩＩの活性および既存の血液凝固経路に統合されている作用機構に匹敵し、天然の凝固カスケードの上流誘発の状況においてのみ活性化される。

【0060】

本発明による二重特異性抗体は、本明細書に例示されるように、第Ｘａｓｅ因子アッセイ、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイおよびトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を含む、ＦＶＩＩＩ模倣活性の多くの機能的に関連するアッセイにおいて強い活性を示した。

【0061】

他の望ましい特徴には、半減期の長さ（必要な投与頻度を低減する）、および高濃度での製剤に対する分子の適応性（家庭環境での皮下注射を促進する）が含まれる。

【0062】

患者のコンプライアンスは、特に１０代および若年成人の患者の間で、長期の自己投与療法にとって重要な問題であると認識されている。治療が現場で成功するためには、その投与スケジュールは、患者が理解し、最小限の不便さで従うことができるように単純である必要がある。投与間隔を長くすることが望ましいが、治療活性を犠牲にすることなく投与頻度を低減するには、長いインビボ半減期と、投与期間の終わりに向かう「トラフ」濃度での十分な有効性の両方を備えた製品が必要である。本発明による抗原結合分子は、望ましくは、長いインビボ半減期を有する。これは、ＦｃＲｎを介してインビボでリサイクルされるＦｃ領域を含めることで容易になる。本発明による抗原結合分子はまた、好ましくは、低濃度で高い機能的活性を維持する。本発明者らは、本発明による二重特異性抗体が、エミシズマブと同様の血栓形成活性を有するが、より低い濃度で最も顕著である血栓形成活性の増加を伴うことを見出した。本明細書に開示されるデータは、本発明による二重特異性抗体が、例えば抗体およびエミシズマブが以下の濃度で試験される場合、少なくとも１～３００ｎＭの範囲の濃度でエミシズマブと同じまたはそれを超える血栓形成活性を有することを示す：
１～３０ｎＭ、例えば、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、および／または３０ｎＭ、
１００～３００ｎＭ、例えば、１００ｎＭおよび／または３００ｎＭ。

【0063】

活性は、本明細書に記載のトロンビン生成アッセイで測定することができる。低濃度での効果的な活性は、投与期間の終わりに向かって出血に対する保護が維持されることを保証するのに役立つ可能性がある－抗体のインビボ濃度は次の投与が予定される前の最後の数日に最低となる。それはまた、血友病患者において問題を生じる出血の一般的な部位である関節を含む、血液循環によって相対的に灌流されにくい体の領域を保護する際に補助となり得る。

【0064】

本発明のさらなる態様は、添付の特許請求の範囲に記載され、かつ本開示に記載されるように、二重特異性抗原結合分子を含む医薬組成物、および血友病Ａの治療用を含む薬剤におけるそれらの使用に関する。

【0065】

単一特異性抗体もまた、本発明の態様として提供される。したがって、抗ＦＩＸａ抗体は、本明細書で定義されるような第１の重鎖－軽鎖対の２つのコピーを含み得る。抗ＦＸ抗体は、本明細書で定義されるような第２の重鎖－軽鎖対の２つのコピーを含み得る。

【0066】

さらなる態様は、本明細書に記載される抗体の配列をコードする核酸分子、そのような核酸を含有する宿主細胞、および宿主細胞を培養し、抗体を発現させ、任意選択で抗体を単離または精製することによって抗体を産生する方法を含む。これにより発現された抗体が得られる。本明細書に記載される抗体のＶＨおよびＶＬドメインも、同様に産生され得、また本発明の態様である。抗体の適切な産生方法には、連続培養またはバッチ培養（例えば、流加培養）によるバイオリアクター内の宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）からの大規模発現が含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0067】

ここで、本発明の態様および実施形態を、図面を参照してより詳細に説明する。

【0068】

【図1】血液凝固カスケードを示している［６］。

【図2】（Ａ）ＦＩＸａおよびＦＸと相互作用するＦＶＩＩＩａの補因子作用、（Ｂ）ＦＩＸａおよびＦＸと相互作用する二重特異性抗体の補因子作用、（Ｃ）血小板の表面でＦＩＸａ（９ａ）およびＦＸ（１０）と相互作用する二重特異性抗体、を示している。この実施形態における二重特異性抗体は、各々が（ＮからＣに）ＶＨ１－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む２つのジスルフィド結合した重鎖および（ＮからＣに）ＶＬ－ＣＬドメインを含む２つの同一の軽鎖（共通の軽鎖）を有する４鎖分子である。この図では、ＶＨ１－ＶＬを含む結合部位はＦＸに結合し、ＶＨ２－ＶＬを含む結合部位はＦＸａに結合する。

【図3】成熟タンパク質の残基番号付けを伴う第ＩＸ因子のアミノ酸配列（配列番号３３４）を示す。シグナルペプチド（直線下線付き）は、分泌後に開裂される。プロペプチド（波下線付き）は、成熟すると開裂される。成熟第ＩＸ因子は、軽鎖（残基１～１４５）および重鎖（残基１４６～４１５）を含む。活性化ペプチド（枠付き）は、活性化時に開裂され、Ｃｙｓ１３２とＣｙｓ２８９との間のジスルフィド架橋によって結合された軽鎖（残基１～１４５）および重鎖（残基１８１～４１５、太字）を含む、活性化第ＩＸａ因子を生成する。

【図4】残基番号付けを伴う第Ｘ因子のアミノ酸配列（配列番号３３５）を示す。残基１～３１は、シグナルペプチドである（直線下線付き）。残基３２～４０は、プロペプチドである（波下線付き）。Ｆｘ軽鎖は、残基４１～１７９である。ＦＸ重鎖は、残基１８３～４８８である。ＦＸａ重鎖は、残基２３５～４８８（太字）である。

【図5】本発明の一実施形態である共通の軽鎖を有する二重特異性ＩｇＧを示す。

【図6】抗ＦＩＸａ ＶＨドメイン配列Ｎ０４３６Ｈおよび抗ＦＸ ＶＨドメイン配列Ｔ０２００を互いに機能的に組み合わせるため、およびＮ０１２８Ｌ共通ＶＬドメインと対合するために最適化するプロセスを要約する。

【図7】（Ａ）二重特異性分子のＦＶＩＩＩ模倣活性のインビトロアッセイ（ＦＸａｓｅまたはテナーゼアッセイ）の原理、および（Ｂ）陰性対照と比較したＦＩＸａ－ＦＸ二重特異性分子についての前向きな結果を示すアッセイからの実施例データ、を示す。

【図8】ＦＸａｓｅアッセイ（標準反応条件）で様々な抗ＦＸアームを有する二重特異性抗体をスクリーニングした結果を示している。二重特異性抗体パネルは、各々がＮ０１２８Ｈ抗ＦＩＸ ＶＨドメインおよび０１２８Ｌ共通ＶＬドメインと組み合わされた一連の抗ＦＸ ＶＨ試験ドメインを含む。

【図9】抗ＦＸＴ０２００Ｈドメインの系統について同定されたＢ細胞クラスターを示している。

【図10】ＦＸａｓｅアッセイで最適化された二重特異性抗体をスクリーニングした結果を示している。（Ａ）Ｎ０１２８Ｈ、Ｎ１１７２ＨまたはＮ１２８０Ｈ抗ＦＩＸ ＶＨドメインおよび０１２８Ｌ共通軽鎖と組み合わせた名前付き抗ＦＸ ＶＨドメインを含むＩｇＧ４二重特異性抗体についてのＦＸａｓｅ活性。１０分（６００秒）で４０５ｎｍでのＯＤ。（Ｂ）Ｎ１２８０Ｈ抗ＦＩＸ ＶＨドメインおよびＮ０１２８Ｌ共通軽鎖と組み合わせた名前付き抗ＦＸ ＶＨドメインを含むＩｇＧ４二重特異性抗体についてのＦＸａｓｅ活性。

【図11】Ｔ０２００Ｈ Ｂ細胞クラスターから選択した抗ＦＸ ＶＨドメインのアミノ酸配列アライメントである。比較のために生殖細胞系列の配列（配列番号５１８）を示す。ＣＤＲは枠で囲まれている。

【図12】ＣＤＲ３の末端の４残基が個別に他のアミノ酸に変異しているＴ０２０１Ｈ ＶＨドメインの変異体を同定する。例えば、Ｔ０５９０Ｈ ＶＨドメインはＴ０２０１Ｈ ＶＨドメインのＣｙｓ１１４Ａｌａ変異体である。すなわち、ＩＭＧＴ位置１１４のシステインがアラニンに置き換えられている。

【図13】ＶＨドメインＴ０２０１Ｈのアミノ酸配列を示し、（Ａ）はＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４、（Ｂ）はＩＭＧＴ番号付けを示すために、注釈付けられている。

【図14】Ｎ１９２ＨおよびＮ１２８０Ｈに対して整合された、ＶＨドメインＮ０１２８Ｈのアミノ酸配列を示し、（Ａ）はＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４、（Ｂ）はＩＭＧＴ番号付けを示すために、注釈付けられている。

【図15】ＦＸａｓｅアッセイにおける（Ａ）ＩＸＡＸ－１２８０．０２０１．０１２８および（Ｂ）コンパレーター抗体ＡｂＥの活性の動態を示している。抗体はプロテインＡによって精製され、ホモ二量体／ヘテロ二量体混合物で構成されている。

【図16】Ｘａｓｅアッセイにおける二重特異性抗体の結果を示している。「Ｅ」は、抗体Ｅ陽性対照である。ＦＸａｓｅ活性は、１２.５μｇ／ｍＬ（１０.４ｎＭ）の最終濃度に対して正規化された試料について、１０分でＯＤ４０５ｎｍとしてプロットされる。二重特異性抗体は、活性の順にランク付けされている。

【図17】ＦＶＩＩＩ模倣活性（ＦＸａｓｅ）に対する二重特異性抗体最適化の効果を示している。各々、抗ＦＩＸａアームに名前付きＶＨドメイン、および抗ＦＸアームにＴ０６３８Ｈ ＶＨドメインを有し、そのどちらもが０１２８Ｌ共通軽鎖ＶＬドメインと対になっている、二重特異性抗体の結果が示されている。ＦＶＩＩＩ模倣活性（ＦＸａｓｅ）は、秒単位の時間（Ｘ軸）の関数として、４０５ｎｍ（Ｙ軸）でインビトロ発色第Ｘ因子活性化アッセイを使用して測定した。最適化された二重特異性抗体は個別に標識されている。ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照は、ＦＶＩＩＩ模倣活性を示さない。キーは、最大のＦＸａｓｅ活性の順に、対応するグラフの右側に抗体のＶＨドメインの名前を示す。すなわち、Ｎ１３３３Ｈ＞Ｎ１２８０Ｈ＞Ｎ１１７２Ｈ＞Ｎ１０９１Ｈ＞Ｎ０５１１Ｈ＞Ｎ０４３６Ｈ＞Ｎ０１２８Ｈ＞対照である。

【図18】Ｎ０１２８Ｈ、Ｎ１１７２ＨまたはＮ１２８０Ｈ抗ＦＩＸ ＶＨドメインおよび０１２８Ｌ共通軽鎖と組み合わせた名前付き抗ＦＸ ＶＨドメインを含むＩｇＧ４二重特異性抗体についてのａＰＴＴアッセイの結果を示す。

【図19】ＦＶＩＩＩ枯渇ヒト血漿を使用した一段階活性化ａＰＴＴ凝固アッセイにおけるＩＸＡＸ－１２８０．０２０１．０１２８二重特異性抗体（プロテインＡで精製）についての用量反応を示している。

【図20】Ｎ０１２８Ｈ、Ｎ０４３６Ｈ、Ｎ０５１１Ｈ、Ｎ１０９１Ｈ、Ｎ１１７２Ｈ、Ｎ１２８０Ｈ、Ｎ１３１４Ｈ、Ｎ１３２７Ｈ、およびＮ１３３３ＨのＶＨドメインアミノ酸配列を示し、それらのフレームワーク領域とＣＤＲを同定するために注釈が付けられている。

【図21】抗原に結合する二重特異性抗体のＳＰＲセンサーグラムであり、（Ａ）アイソタイプ対照抗体または（Ｂ）単一特異性抗体のセンサーグラムと比較して、ＦＩＸおよびＦＸへの同時結合が示されている。

【図22】Ｔ０６８１Ｈの選択されたＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列バリアントについてのＦＸａｓｅアッセイの要約結果を示している。ＡｂＥ対照で示されている場合を除き、試料はプロテインＡクロマトグラフィーにより精製され、それらの最終濃度は１２.５μｇ／ｍＬ（１０.４ｎＭ）に正規化された。ＡｂＥ陽性対照抗体の３つの試料が含まれている。（ｉ）プロテインＡ精製；１２.５μｇ／ｍＬ、（ｉｉ）プロテインＡ精製；３７.５μｇ／ｍＬ、（ｉｉｉ）プロテインＡ精製、次いで、イオン交換クロマトグラフィーによるさらなる精製；３７.５μｇ／ｍＬ。示されているすべてのデータは、１０分の時点でサンプリングされたものである。

【図23】インビトロでの二重特異性抗体ＦＸａｓｅ活性に対するＴ０２０１Ｈ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３変異誘発の効果をまとめたものである。二重特異性抗体抗ＦＸＴ０２０１ＨバリアントＶＨドメインは、ＨＥＫ細胞において、抗ＦＩＸ Ｎ０１２８０ＨアームおよびＮ１２８＿ＩｇＬ共通軽鎖で発現され、プロテインＡクロマトグラフィーで精製され、濃度０.１５ｍｇ／ｍｌ（１２５ｎＭの最終濃度）に正規化された。５μｌの精製された物質を使用して、インビトロＦＸａｓｅアッセイを実施した。示されているデータは１０分の時点のものである。点線は、Ｔ０２０１ＨのＦＸａｓｅ活性を表している。

【図24】抗ＦＸＴ０２０１Ｈ ＶＨドメインの配列変異が二重特異性抗体活性に及ぼす影響を調べたａＰＴＴ凝固アッセイの要約結果を示している。凝固時間（秒）は、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿に、名前付けされた抗ＦＸ ＶＨアーム、抗ＦＩＸ Ｎ０１２８０Ｈアーム、およびＮ１２８＿ＩｇＬ共通軽鎖を含む二重特異性抗体を添加した後に記録された。二重特異性抗体をＨＥＫ細胞で発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーで精製し、０.１ｍｇ／ｍｌ、０.３ｍｇ／ｍｌ、および０.５ｍｇ／ｍｌの３つの異なる濃度で分析した。点線は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照を添加したＦＶＩＩＩ欠乏血漿、またはＰＢＳを添加した正常なプールヒト血漿の凝固時間を示している。

【図25】変異誘発プロセスでＦＶＩＩＩ模倣活性が徐々に改善されたＶＨドメインのＣＤＲを同定している。黒の網掛けは、同じ表内にあるドメインよりも良好なＶＨドメインを同定している。

【図26】トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）のトリガーとして第ＩＸａ因子を使用した正常なプール血漿のトロンビン生成曲線を示している。トロンボグラムは、試料血漿中の経時的なトロンビンの生成を示し、経時的に（分）、凝固中に生成されたトロンビンの濃度（ｎＭ）としてプロットされる。

【図27】ＡｂＥ、アイソタイプ対照、正常血漿およびエミシズマブキャリブレーターと比較した、Ｔ０２０１ＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の単一および複合バリアントを含む最終濃度１３３ｎＭの二重特異性抗体を添加したＦＶＩＩＩ欠乏血漿のトロンビン生成について記載している。０.３ｎＭでＦＩＸａトリガー。（Ａ）８０分のトロンボグラム。（Ｂ）２５分のトロンボグラム。

【図28】ＡｂＥ、アイソタイプ対照、正常血漿、エミシズマブキャリブレーターと比較した、Ｔ０２０１ＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３単一および複合変異体を含む二重特異性抗体を添加したＦＶＩＩＩ欠乏血漿で実行したＴＧＡからのトロンビンＣｍａｘ（ｎＭ）およびＴｍａｘ（分）を示している。試験抗体はプロテインＡクロマトグラフィーによってのみ精製されたため、ヘテロ二量体とホモ二量体の混合物を表している。（Ａ）抗体濃度１３３ｎＭ。（Ｂ）抗体濃度８０ｎＭ。

【図29】（Ａ）二重特異性抗体ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０１２８および（Ｂ）エミシズマブキャリブレーターを添加したＦＶＩＩＩ欠乏血漿で実行されたＴＧＡからのＣｍａｘ（ｎＭ）およびＴｍａｘ（分）用量反応を示している。使用したアイソタイプ対照（プラス記号）はヒトＩｇＧ４であり、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿に添加した。正常なプール血漿（クロス記号）にＰＢＳを添加した。

【図30】ＴＧＡにおけるＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＡｂＥのＣｍａｘの用量反応曲線を示している。縦方向の点線は、４.５μｇ／ｍｌ（３０ｎＭ）、１０μｇ／ｍｌ（６６.６ｎＭ）、および４５μｇ／ｍｌ（３００ｎＭ）に対応する最終抗体濃度を示す。水平方向の線は、健康なボランティアから収集された正常なプール血漿のＣｍａｘを表す。

【図31】０.１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、および３００ｎＭの抗体濃度での、ヒトＦＶＩＩＩ枯渇血漿中の（Ａ）ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５「ＢｉＡｂ＿１」および（Ｂ）ＡｂＥのトロンボグラムを示している。正常なヒト血漿試料のトロンボグラムは、影付きで示されている。

【図32】ＴＧＡにおけるＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＡｂＥのＴｍａｘの用量反応曲線を示している。縦方向の点線は、４.５μｇ／ｍｌ（３０ｎＭ）、１０μｇ／ｍｌ（６６.６ｎＭ）、および４５μｇ／ｍｌ（３００ｎＭ）に対応する抗体濃度を示す。水平方向の線は、健康なボランティアから収集された正常なプール血漿のＴｍａｘを表す。

【図33】市販のヒトＦＶＩＩＩ枯渇血漿中のＴＧＡアッセイにおける、市販のエミシズマブキャリブレーターと比較した、ＢｉＡｂ＿１（ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５）、ＢｉＡｂ＿２（ＩＸＡＸ－１４５４．０９９９．０３２５）、ＢｉＡｂ＿３（ＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５）、ＢｉＡｂ＿４（ＩＸＡＸ－１４４２．０７３６．０３２５）の（Ａ）Ｃｍａｘおよび（Ｂ）Ｔｍａｘの観点からのトロンビン生成能力を示している。

【図34】ヒトＦＶＩＩＩ枯渇血漿中のＴＧＡアッセイにおける、市販のエミシズマブキャリブレーターと比較した、ＢｉＡｂ＿１（ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５）の（Ａ）Ｃｍａｘおよび（Ｂ）Ｔｍａｘの観点からのトロンビン生成能力を示している。

【図35】安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の８つの独立したミニプールから発現された二重特異性抗体ＩＸＡＸ－１１７２．０２０１．０１２８の精製収率およびヘテロ二量体の％を示している。

【図36】８つの独立したミニプールから発現した０.３ｍｇ／ｍｌに正規化された二重特異性抗体ＩＸＡＸ－１１７２．０２０１．０１２８について、ＦＸａｓｅアッセイによる二重特異性抗体活性（１０分での活性）と、ヘテロ二量体の％との相関をプロットする。ピアソンの相関係数は０.９９３９と計算された。

【図37】（Ａ）は、１ｍｌのＣａｐｔｏＳＰ ＩｍｐＲｅｓカラムでのイオン交換クロマトグラフィーと、２０ｎＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６.０中で最大５００ｎＭまでの線形ＮａＣｌグラジエントによるＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０１２８の分離を示している。吸光度、ｍＡＵ（ミリ吸光度単位）；導電率、ｍＳ／ｃｍ（ミリジーメンス／センチメートル）。ピーク１は、ＮＩＮＡ－１２８０．０１２８単一特異性抗ＦＩＸ抗体である。ピーク２は、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０１２８二重特異性抗体である。ピーク３は、ＴＩＮＡ－０９９９．０１２８単一特異性抗ＦＸ抗体である。（Ｂ）は、段階的溶出を伴うイオン交換クロマトグラフィーによるＩＸＡＸ－０４３６．０２０２．０１２８の分離を示している。ピーク１は、ＮＩＮＡ－０４３６．０１２８単一特異性抗ＦＩＸ抗体である。ピーク２は、ＩＸＡＸ－０４３６．０２０２．０１２８二重特異性抗体である。ピーク３は、ＴＩＮＡ－０２０２．０１２８単一特異性抗ＦＸ抗体である。（Ｃ）は、イオン交換クロマトグラフィーによるＩＸＡＸ－１１７２．０２０１．０１２８の分離を示している。ピーク１は、ＮＩＮＡ－１１７２．０１２８抗ＦＩＸ単一特異性抗体である。ピーク２は、ＩＸＡＸ－１１７２．０２０１．０１２８二重特異性抗体である。

【図38】二重特異性抗体（Ａ）ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５、（Ｂ）ＩＸＡＸ－１４５４．０９９９．０３２５、（Ｃ）ＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５、および（Ｄ）ＩＸＡＸ－１４４２．０７３６．０３２５の各々について、精製されたＦＩＸ／ＦＸヘテロ二量体の陽イオン交換精製を示している。

【図39】ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＡｂＥを用いたＦＸａｓｅアッセイにおける用量反応を示している。点線は、４.５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび４５μｇ／ｍｌに対応する抗体濃度を示している。

【図40】ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＡｂＥを用いた発色性ＦＶＩＩＩ模倣活性ハイフンアッセイにおける用量反応を示している。

【図41】ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＡｂＥを用いたａＰＴＴアッセイにおける用量反応を示している。縦方向の点線は、６６.６ｎＭ（１０μｇ／ｍｌ）および３００ｎＭ（４５μｇ／ｍｌ）の最終抗体濃度を表す。水平方向の線は、健康なボランティアから収集された正常なプール血漿のａＰＴＴ値を表す。

【図42】阻害剤血漿中の二重特異性抗体ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５（丸）、ＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５（ひし形）、およびＡｂＥ（クロス）の効果を調べたａＰＴＴ凝固時間アッセイの結果を示す。血友病Ａの患者から得られた血漿を使用した一段階ａＰＴＴ凝固アッセイで、これらの抗体の用量反応が示され、ＦＶＩＩＩに対して７０ＢＵの特異的阻害剤レベルが実証されている。水平方向の点線は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照を添加した阻害剤血漿の凝固時間を示している。

【図43】血友病Ａの患者から得られた血漿を用いたトロンビン生成アッセイにおける、ＩｇＧ４二重特異性抗体ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５、ＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５、およびＡｂＥ（すべてプロテインＡ、続いて陽イオン交換クロマトグラフィーで精製された）についてのトロンビンピーク高さ（Ｃｍａｘ）用量反応が示され、ＦＶＩＩＩに対して７０ＢＵの特異的阻害剤レベルを実証している。ｎＭ単位の二重特異性抗体濃度が各希釈について示されている。

【図44】血友病Ａの患者から得られた血漿を用いたトロンビン生成アッセイにおける、ＩｇＧ４二重特異性抗体（Ａ）ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５、（Ｂ）ＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５、および（Ｃ）ＡｂＥ（すべてプロテインＡ、続いて陽イオン交換クロマトグラフィーで精製された）についての用量反応が示され、ＦＶＩＩＩに対して７０ＢＵの特異的阻害剤レベルを実証している。分析された二重特異性抗体濃度は、１００、３３.３、１１.１、３.７、および１.２３ｎＭである。灰色の網掛け部分は、正常なプール血漿のトロンビン生成を示している。ＴＧＡトリガーはＦＩＸａである。

【発明を実施するための形態】

【0069】

血液凝固
血液凝固カスケードが、図１に示される。凝固（Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）または凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）は、損傷した血管からの失血を止めて、血管が修復されることを可能にする、最も重要な生物学的プロセスのうちの１つである。凝固の機構には、フィブリンの沈着および成熟とともに、血小板の活性化、接着、および凝集を伴う。凝固の誤調節は、過度の出血（血友病）または閉塞性凝固（血栓症）を引き起こす可能性がある。凝固は、すべての哺乳動物において高度に保存されている。それは、凝固因子の複雑なネットワークによって制御される。血管の内側を覆う内皮が損傷すると、凝固が開始する。内皮下組織因子（ＴＦ）の血漿第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）への曝露は、一次止血（外因性経路）をもたらし、損傷部位に緩い栓が形成される。追加の凝固因子、特に第ＩＸ因子（ＦＩＸ）および第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活性化は、二次止血（内因性経路）をもたらし、フィブリン鎖が形成されて栓を強化する。外因性および内因性経路は、最終的に共通点に集中し、カルシウムと一緒に、かつリン脂質表面上に結合した第Ｘａ／Ｖａ因子複合体の形成が、プロトロンビン（第ＩＩ因子）からトロンビン（第ＩＩａ因子）を生成する。

【0070】

ＦＶＩＩＩは、トロンビンまたは第Ｘａ因子（ＦＸａ）によって開裂され、結果として生じる第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）は、Ａ１サブユニット、Ａ２サブユニット、および軽鎖からなるヘテロ三量体構造を示す。活性化すると、かつカルシウムイオンおよびリン脂質表面（血小板上）の存在下で、ＦＶＩＩＩａは、その軽鎖およびＡ２サブユニットを介してＦＩＸａに結合し、同時にそのＡ１サブユニットを介してＦＸに結合し、活性な固有の「テナーゼ」または「Ｘａｓｅ」複合体を形成し、ＦＶＩＩＩａ補因子は、ＦＩＸａおよびＦＸを近接させ、ＦＩＸａの触媒速度定数をアロステリックに増強する。図２ａを参照されたい。第Ｘ因子は、ＦＩＸａのセリンプロテアーゼ活性によって活性化され、凝固カスケードが継続し、血餅の構造ポリマーであるフィブリンの沈着に至る。

【0071】

血友病は、ＦＶＩＩＩ補因子活性の欠損（血友病Ａ）またはＦＩＸ酵素活性の欠損（血友病Ｂ）のいずれかによるＸａｓｅ複合体の欠乏によって生じる。

【0072】

第ＩＸ因子（ＦＩＸ）
第ＩＸ因子は、補因子として第ＶＩＩＩ因子を必要とするセリンプロテアーゼである。それは、不活性な前駆体として血液中を循環し、上述のように、止血チャレンジ時に内因性または外因性経路を通して活性化される。

【0073】

文脈が他の意味を必要としない限り、本明細書で言及される第ＩＸ因子は、ヒト第ＩＸ因子であり、第ＩＸａ因子は、ヒト第ＩＸａ因子である。

【0074】

ヒト第ＩＸ因子のアミノ酸配列が、図３に示される。第ＩＸ因子遺伝子の長さは、約３４ｋｂであり、８つのエクソンを含む。転写物は、短い５’非翻訳領域、オープンリーディングフレームおよび終止コドン、ならびに３’非翻訳領域を含む。ＯＲＦは、４６１アミノ酸のプレ－プロ－タンパク質をコードし、プレ配列（シグナルペプチド）は、分泌のために第ＩＸ因子を方向付け、プロペプチド配列は、ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼの結合ドメインを提供し、これは、隣接するＧＬＡドメイン中のある特定のグルタミン酸残基をカルボキシル化し、残りは、第ＩＸ因子チモーゲンを表し、これは、プレおよびプロ配列の除去後に循環に入る。成熟４１５残基ＦＩＸタンパク質は、ＮからＣ末端まで、１２個のグルタミン酸残基が翻訳後にγカルボキシル化されるＧＬＡドメイン、２つの上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン、活性化ペプチド配列、および触媒セリンプロテアーゼドメインを含む。ＦＩＸは、内因性経路を通して生成された活性化第ＸＩ因子、または外因性経路のＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体のいずれかによって活性化される。いずれにせよ、活性化は、Ｒ１４５に続くペプチド結合の開裂（α－開裂）およびＲ１８０に続くペプチド結合の開裂（β－開裂）を伴い、介在配列に対応する活性化ペプチドを放出し、それにより活性化ＦＩＸａ分子を生成し、これは、軽鎖のＣ１３２と重鎖のＣ２８９との間のジスルフィド架橋によって結合された、Ｎ末端軽鎖（ＧＬＡ－ＥＧＦ－ＥＧＦ）およびＣ末端重鎖（触媒ドメイン）を有する。残基番号付けは、成熟ＦＩＸポリペプチド配列中のアミノ酸を指す。Ｘａｓｅ複合体が形成されるリン脂質表面上では、リン脂質と結合するのはＦＩＸａのＧＬＡドメインであり、一方、触媒ドメインは、リン脂質表面よりも高く（＞７０Å）、ＦＶＩＩＩａのＡ２ドメインによって調整される［７、８］。

【0075】

ＦＩＸａ活性の欠失である血友病Ｂの分子基盤は多様であり、活性化開裂部位における様々な点変異、ナンセンス変異、ｍＲＮＡスプライス部位変異、欠失、挿入、またはミスセンス変異を含む［９］。

【0076】

活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）の触媒（プロテアーゼ）ドメインは、ＦＶＩＩＩａへの結合に関与する。このドメイン中の残基Ｅ２４５は、カルシウムイオンに結合し、この位置における変異は、ＦＶＩＩＩへの結合を低減し、血友病Ｂ、例えば、置換Ｅ２４５Ｖをもたらす可能性がある。残基３３０～３３８によって形成されたＦＩＸヘリックス内の変異は、ＦＶＩＩＩへの結合の低減、その結果として血友病Ｂとも関連している。

【0077】

一塩基多型（ＳＮＰ）および長多型を含む、第ＩＸ因子における非病原性変異もまた報告されており、［９］でレビューされている。これらには、エクソン６中のＭｎＩＩ ＳＮＰが含まれ、残基１４８におけるＴ／Ａ置換（Ｍａｌｍｏ多型）をもたらし、これは、白人および黒人のアメリカ人集団間では比較的一般的である［９］。

【0078】

第Ｘ因子（ＦＸ）
文脈が他の意味を必要としない限り、本明細書で言及される第Ｘ因子は、ヒト第Ｘ因子であり、第Ｘａ因子は、ヒト第Ｘａ因子である。ヒトＦＸのアミノ酸配列が、図４に示される。

【0079】

ＦＸは、スチュアート・プロワー因子としても既知である。それは、セリンエンドペプチダーゼである。ＦＸは、加水分解によって、第ＩＸ因子（上記のようにその補因子である第ＦＶＩＩＩ因子と一緒に）または第ＶＩＩ因子（その補因子である組織因子と一緒に）のいずれかによって第Ｘａ因子に活性化される。ＦＸは、Ａｒｇ－Ｔｈｒ結合において、次いでＡｒｇ－Ｉｌｅ結合においてプロトロンビンを２つの場所で開裂することによって作用して、活性トロンビンを得る。

【0080】

抗原結合
二重特異性抗原結合分子の望ましい特徴は、結合したＦＩＸａが結合したＦＸを活性化することを可能にする方法で、ＦＩＸａおよびＦＸを結合することである。

【0081】

ＦＩＸａおよびＦＸを一緒にし、それによりＦＩＸａによるＦＸの活性化を促進するために、二重特異性抗原結合分子は、これらの２つの補因子に同時に結合し得る。結合は連続して起こり得、例えば、初期の二元複合体が、第１の結合アームとその同種抗原との間に形成され得、第２の結合アームのその同種抗原への結合が後に続く。原則として、これら２つの結合事象は、ＦＩＸａに続いてＦＸ、またはＦＸに続いてＦＩＸａのいずれかの順序で生じ得る。分子振り付けは、２つの結合部位のそれぞれの抗原に対する相対的親和性の影響を受ける。二重特異性抗原結合分子、ＦＩＸａおよびＦＸの集団では、多くの異なる複合体が並行して存在すると予想される。したがって、プールは、遊離抗原結合分子、遊離ＦＩＸａ、遊離ＦＸ、抗原結合分子と複合体化されたＦＩＸａ、抗原結合分子と複合体化されたＦＸ、ならびにＦＩＸ、ＦＸ、および抗原結合分子の三元複合体を含み、これらの種の各々は、個々の相互作用の相対的なオンレートおよびオフレートに従って異なる割合で存在する。

【0082】

二重特異性抗原結合分子は、ＦＸよりもＦＩＸａに対して高い親和性を有することが望ましくあり得る。そのような二重特異性分子は、ＦＩＸａと初期の複合体を形成することが想定され、これがＦＸに結合し、活性化する。ＦＸに対する比較的低い親和性は、不完全な抗体－抗原複合体中で結合するＦＸの割合を低減する（すなわち、ＦＩＸａなし）。これの潜在的な利点は、より大きい割合のＦＸが患者の血液中に存在する可能性のある任意のＦＶＩＩＩと自由に関与する状態のままであることを可能にすることである。血友病Ａは、軽度の欠乏から機能的ＦＶＩＩＩの完全な欠如に及ぶ、幅広いＦＶＩＩＩの欠乏を包含する。ある程度機能的なＦＶＩＩＩを保持する患者の場合、この自然な活性を可能な限り保持することが望ましくあり得る。したがって、ＦＸ結合アームがＦＸへの結合についてＦＶＩＩＩと競合しない二重特異性抗原結合分子を提供することが望ましくあり得る。

【0083】

好ましくは、ＦＸ結合アームは、ＦＸａよりもＦＸに対して高い親和性を有する。ＦＸａに対する低い親和性は、活性化された生成物の放出を促進し、凝固カスケードにおけるＦＶＩＩＩ模倣分子の役割を完了し、ＦＸ結合部位を再利用のために自由にする。様々な実施形態では、本明細書に記載の二重特異性（例えば、抗体ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５または抗体ＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５）、そのような二重特異性のＦＸ結合アーム（例えば、Ｔ０９９９Ｈ ＶＨドメインを含む結合アーム）、またはそのような２つのアームのホモ二量体を含む抗ＦＸ単一特異性抗体は、ＦＸａよりもＦＸに対して少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも１００倍高い親和性を有し、例えば、ＦＸａよりもＦＸに対して、少なくとも１０００倍高い親和性を有し、任意選択で、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、ＦＸａに対して有意な結合を示さない。例えば、様々な実施形態では、二重特異性、ＦＸ結合アームまたは抗ＦＸ単一特異性抗体（例えば、ＴＩＮＡ－０９９９．０３２５）は、ＥＬＩＳＡにより測定され、および陰性対照ＩｇＧを参照すると、ヒトＦＸａに結合しない。ＥＬＩＳＡの代替として、親和性はＳＰＲによって測定され、ＦＸに対する親和性はＦＸａに対する親和性と比較される。

【0084】

－ＦＩＸａ結合
二重特異性抗原結合分子のＦＩＸａ結合アームは、ＦＩＸａの軽鎖および／または重鎖に結合し得る。初期の研究は、実施例に記載のＮ１２８系統のＦＩＸａ結合アームが、単独で（重鎖の非存在下で）ＦＩＸａ軽鎖に結合しないことを示した。

【0085】

したがって、本発明の二重特異性抗原結合分子（またはそのＦＩＸａ結合ポリペプチドアーム）は、重鎖および軽鎖を含むＦＩＸａ分子に結合し、かつ重鎖の非存在下でＦＩＸ軽鎖に結合しないものであってもよい。任意選択で、ＦＩＸａ結合アームは、ＦＩＸａ重鎖および軽鎖の組み合わせによって形成されるか、または安定化されるエピトープを認識する。それは例えば、ＦＩＸａ分子中の軽鎖とのみ接触し、ＦＩＸａ分子中の重鎖と組み合わせて軽鎖が存在する場合にのみ曝露または安定化されるエピトープに結合し得る。あるいは、それは、軽鎖および重鎖の両方からの１つ以上の残基を含むか、または重鎖の残基のみを含むエピトープと接触してもよい。

【0086】

本発明による抗原結合分子、またはそのＦＩＸａ結合ポリペプチドアームは、１０ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下の親和性（Ｋ_Ｄとして測定）でヒトＦＩＸａのＥＣドメインに結合し得る。例えば、Ｋ_Ｄは、１ｎＭ～３μＭであってもよい。

【0087】

ヒトＦＩＸａに結合するためのＫ_Ｄは、０.１μＭ～１μＭ、例えば、０.１５～０.３μＭであってもよい。Ｋ_Ｄは、０.６μＭ以下、０.５μＭ以下、０.４μＭ以下、０.３μＭ以下、０.２５μＭ以下、または２μＭ以下であってもよい。Ｋ_Ｄは、少なくとも０.１μＭ、例えば、少なくとも０.２μＭであってもよい。それは０.１μＭ～０.５μＭであってもよい。

【0088】

Ｋ_Ｄは、１０～１００ｎＭ、例えば、２５～７５ｎＭであってもよい。

【0089】

Ｋ_Ｄは、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下であってもよい。Ｋ_Ｄは、０.９ｎＭ以下、０.８ｎＭ以下、０.７ｎＭ以下、０.６ｎＭ以下、０.５ｎＭ以下、０.４ｎＭ以下、０.３ｎＭ以下、０.２ｎＭ以下、または０.１ｎＭ以下であってもよい。Ｋ_Ｄは、少なくとも０.００１ｎＭ、例えば、少なくとも０.０１ｎＭ、または少なくとも０.１ｎＭであってもよい。Ｋ_Ｄは、０.１～１０ｎＭであってもよい。

【0090】

本発明による抗原結合分子またはそのＦＩＸａ結合ポリペプチドのアームは、０.１μＭ～１μＭ、例えば、０.１５～０.３μＭの親和性（Ｋ_Ｄとして測定）でヒトＦＩＸに結合し得る。Ｋ_Ｄは、０.６μＭ以下、０.５μＭ以下、０.４μＭ以下、０.３μＭ以下、０.２５μＭ以下、または２μＭ以下であってもよい。Ｋ_Ｄは、少なくとも０.１μＭ、例えば、少なくとも０.２μＭであってもよい。

【0091】

ＦＩＸとの相互作用のＫ_Ｄは、ＦＩＸａとの相互作用のＫ_Ｄに匹敵し得、ＦＩＸａに対する親和性と比較して、ＦＩＸに対するＦＩＸａ結合アームの親和性において２５％未満、任意に１０％未満の差が存在し得る。ＦＩＸａと比較して、ＦＩＸとの相互作用のＫ_Ｄにおいて統計的に有意な差が存在しない場合がある。

【0092】

本明細書の他の箇所に記載されるように、親和性は、例えば、２５℃で、分析物としての溶液中の抗原を用い、任意選択で二量体として（例えば、単一特異性ＩｇＧとして）固体表面に結合した結合アームを用いた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して決定され得る。

【0093】

－ＦＸ結合
本発明による抗原結合分子、またはそのＦＸ結合ポリペプチドアームは、１０ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下のＫ_ＤでヒトＦＸのＥＣドメインに結合し得る。例えば、Ｋ_Ｄは、５μＭ～１ｎＭ、例えば、５μＭ～１０ｎＭであってもよい。

【0094】

Ｋ_Ｄは、０.１μＭ～２μＭ、例えば、０.１μＭ～１μＭ、例えば、０.１５～０.３μＭであり得る。Ｋ_Ｄは、０.６μＭ以下、０.５μＭ以下、０.４μＭ以下、０.３μＭ以下、または０.２５μＭ以下であってもよい。Ｋ_Ｄは、少なくとも０.１μＭであってもよい。

【0095】

Ｋ_Ｄは、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下であってもよい。Ｋ_Ｄは、０.９ｎＭ以下、０.８ｎＭ以下、０.７ｎＭ以下、０.６ｎＭ以下、０.５ｎＭ以下、０.４ｎＭ以下、０.３ｎＭ以下、０.２ｎＭ以下、または０.１ｎＭ以下であってもよい。Ｋ_Ｄは、少なくとも０.００１ｎＭ、例えば、少なくとも０.０１ｎＭ、または少なくとも０.１ｎＭであってもよい。例えば、Ｋ_Ｄは、１～１００ｎＭであってもよい。Ｋ_Ｄは、１～１０ｎＭであってもよい。

【0096】

本明細書の他の箇所に記載されるように、親和性は、例えば、２５℃で、分析物としての溶液中の抗原を用い、任意選択で二量体として（例えば、単一特異性ＩｇＧとして）固体表面に結合した結合アームを用いた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して決定され得る。

【0097】

－抗原結合親和性の測定
ＦＩＸ、ＦＩＸａ、ＦＸ、およびＦＸａに結合するための抗原結合分子の親和性は、平衡解離定数Ｋ_Ｄ、会合のＫａ／Ｋｄ比またはオンレート（Ｋａ）、および解離または結合相互作用のオフレート（ｋｄ）の観点から定量化され得る。Ｋ_Ｄ、抗原結合のためのＫａおよびＫｄは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して測定され得る。ＳＰＲの手順および条件の例を実施例１０に示す。

【0098】

親和性の定量化は、一価形態の抗原結合ポリペプチドアーム、例えば、抗原結合部位を含む抗体ＦａｂもしくはＦｖ、または当該の抗原に対する単一抗原結合アームを有するヘテロ二量体免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）を用いたＳＰＲを使用して実施され得る。代替的には、二価形態の抗原結合ポリペプチドアーム、例えば、ホモ二量体抗原結合アームを含むＩｇＧに対する親和性を決定することが便利であり得る。ＳＰＲは、抗原結合ポリペプチドアームの二量体をバイオセンサチップに（直接または間接的に）コーティングすること、抗原結合ポリペプチドアームを幅広い濃度の緩衝液中の抗原に曝露すること、結合を検出すること、および結合相互作用のための平衡解離定数Ｋ_Ｄを計算することを含んでもよい。ＳＰＲは、２５℃で実施されてもよい。好適な緩衝液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０.０５％界面活性剤（例えば、Ｐ２０）、および３ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.６である。２.５ｍＭ ＣａＣｌ_２を有するＨＢＳ－Ｐ １Ｘ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０５％ポリソルベート２０ ｐＨ７.６）が、例示的な緩衝液である。結合データは、使用する機器に固有であり得る標準アルゴリズムを使用して、１：１モデルに適合され得る。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標））、およびＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ）などの様々なＳＰＲ機器が既知である。

【0099】

－交差反応性
規制機関は、候補治療分子がヒトの臨床試験に進む前に実験動物における治療効果を実証していることを要求し得る。後天性血友病Ａ動物モデルの一例は、ＦＶＩＩＩ中和抗体またはＦＶＩＩＩに対する小分子阻害剤の投与を通して血液凝固が欠乏した状態にされ、それによりヒト血友病Ａ患者の表現型を再現した、カニクイザルである。動物モデルにおける二重特異性抗原結合分子の試験を可能にするために、各アームの結合部位は、１つ以上の非ヒト哺乳動物からの対応する抗原と交差反応することが望ましい。したがって、抗原結合分子のＦＩＸａ結合部位は、ネズミ科（例えば、マウスもしくはラット）、ウサギ、または非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）ＦＩＸａならびにヒトＦＩＸａに結合し得、ＦＸ結合部位は、ネズミ科（例えば、マウスもしくはラット）、ウサギ、または非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）ＦＸａおよびヒトＦＸａに結合し得る。

【0100】

抗原結合分子（またはより正確には、その抗原結合部位）の種交差反応性の程度を定量化するための一方法は、別の種の抗原と比較した抗原または１つの種に対する親和性の倍数差として、例えば、ヒト抗原対カニクイザル抗原に対する親和性の倍数差としてのものである。親和性は、Ｋ_Ｄとして定量化され得、抗原の抗原結合分子への結合の平衡解離定数を指す。Ｋ_Ｄは、本明細書の他の箇所に記載されるようにＳＰＲによって決定され得る。

【0101】

種交差反応性結合分子は、３０倍以下、２５倍以下、２０倍以下、１５倍以下、１０倍以下、または５倍以下であるヒトおよび非ヒト抗原に結合するための親和性の倍数差を有し得る。言い換えると、ヒト抗原の細胞外ドメインに結合するＫ_Ｄは、非ヒト抗原の細胞外ドメインに結合するＫ_Ｄの３０倍、２５倍、２０倍、１５倍、１０倍、または５倍以内であり得る。

【0102】

好ましくは、ヒトおよび非ヒト抗原の結合親和性は、１０倍以下の範囲内、より好ましくは５倍以内または２倍以内である。例えば、表面プラズモン共鳴によって決定されるような、非ヒトＦＩＸａに結合するためのＫ_Ｄは、ヒトＦＩＸａに結合するためのＫｄよりも最大１０倍（好ましくは、最大５倍もしくは最大２倍）大きくてもよいか、または最大１０倍（好ましくは、最大５倍もしくは最大２倍）低くてもよい。同様に、例えば、ＳＰＲによって決定されるような、非ヒトＦＸに結合するためのＫ_Ｄは、ヒトＦＸに結合するためのＫｄよりも最大１０倍（好ましくは、最大５倍もしくは最大２倍）大きくてもよいか、または最大１０倍（好ましくは、最大５倍もしくは最大２倍）低くてもよい。親和性を決定する方法は、本明細書の他の箇所に記載されている。

【0103】

結合分子はまた、両方の種の抗原に結合するためのＫ_Ｄが閾値を満たす場合、例えば、ヒト抗原に結合するＫ_Ｄおよび非ヒト抗原に結合するＫ_Ｄが両方、１０ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下である場合、種交差反応性であるとみなされ得る。Ｋ_Ｄは、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下であってもよい。Ｋ_Ｄは、０.９ｎＭ以下、０.８ｎＭ以下、０.７ｎＭ以下、０.６ｎＭ以下、０.５ｎＭ以下、０.４ｎＭ以下、０.３ｎＭ以下、０.２ｎＭ以下、または０.１ｎＭ以下であってもよい。

【0104】

異なる種の抗原に結合するための種交差反応性が有利であり得る一方で、それでもなお、望ましくない副作用を回避するために、ＦＩＸａ結合アームおよびＦＸ結合アームのそれぞれの抗原に対する選択性が望ましい。したがって、体内では、ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ／ＦＸａが、好ましくは、抗原結合分子によって結合される唯一の抗原である。

【0105】

ＦＩＸａを介したＦＸの活性化の増強
ＦＩＸａを介したＦＸからＦＸａへの活性化を増強する二重特異性抗原結合分子の能力は、インビトロまたはインビボアッセイで決定され得る。

【0106】

好適なインビトロアッセイは、実施例３および実施例７に例示され、図７に示されるＦＸ活性化アッセイである。アッセイは、
（ｉ）ＦＸａの形成に適した条件下（例えば、リン脂質の存在下、３７℃の緩衝液中）で、二重特異性抗原結合分子をＦＩＸａおよびＦＸと接触させることと、
（ｉｉ）ＦＸａによって開裂可能である基質を添加して、検出可能な生成物を生成することと、
（ｉｉｉ）検出可能な生成物の存在を検出し、任意選択で定量化することと、を含む。

【0107】

詳細なプロトコルを、実施例７に示す。

【0108】

生成物のレベルは、ＦＩＸａ－ＦＸ二重特異性抗原結合分子が反応混合物に存在しない対照アッセイと比較され得る。対照と比較した二重特異性抗体を用いたアッセイにおける生成物レベルの有意差は、二重特異性抗体がＦＩＸａを介したＦＸの活性化を増強することが可能であることを示す。ＦＶＩＩＩは、陽性対照として含まれる場合がある。

【0109】

生成物のレベルは、ＦＩＸａ－ＦＸ二重特異性抗原結合分子がエミシズマブであるアッセイと比較され得る。本発明による二重特異性抗体は、エミシズマブと同一もしくは同様の程度（例えば、１０％の差以内または５％の差以内）まで、またはより高い程度（例えば、検出可能な生成物のレベルによって測定されたエミシズマブで達成されるよりも１０％超多いＦＸからＦＸａへの活性化）まで、ＦＩＸａを介したＦＸからＦＸａへの活性化を増強し得る。好ましくは、二重特異性抗体は、ＦＩＸａを介したＦＸからＦＸａへの活性化を少なくともエミシズマブと同程度に増強する。アッセイは、典型的には、３７℃の生理学的温度で実施される。アッセイで使用するのに適した二重特異性の濃度は、本明細書の実施例に示されており、例えば、１２.５μｇ／ｍｌ（１０.４ｎＭ）または１２５ｎＭである。

【0110】

別の好適なアッセイは、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中の活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定することであり、これは、阻害剤の存在下または非存在下で実施され得、二重特異性分子の活性を組換えヒトＦＶＩＩＩと比較するために使用され得る。このアッセイは、実施例８に例示される。ａＰＴＴは、血餅形成の全体的な概要を提供し、アッセイ読み出しとして凝固時間を提供するエンドポイントアッセイである。ＦＶＩＩＩ欠乏血漿は、典型的には、ａＰＴＴアッセイにおいて約８０～９０秒の凝固時間を有する。本発明の二重特異性抗原結合分子は、ａＰＴＴアッセイにおける凝固時間を短縮するのに有効である（陰性対照と比較して）。本発明による二重特異性抗原結合分子を用いたａＰＴＴアッセイにおけるヒトＦＶＩＩＩ欠乏の凝固時間は、例えば、組換えヒトＦＶＩＩＩａを用いた凝固時間と同じか、またはそれより短い可能性がある。正常な（ＦＶＩＩＩ＋）ヒト血漿の生理学的凝固時間は、典型的には４０秒未満、例えば、３７～３４秒の範囲である。活性化ＦＶＩＩＩａを提供すると、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿でも同様の値が達成可能であり、これは、参照値に対する装置／測定の較正を通してアッセイを標準化する便利な方法を提供する。あるいは、正常な（ＦＶＩＩＩ＋）ヒト血漿の凝固時間は、参照のために使用され得、ａＰＴＴアッセイは、カルシウムの添加を通した凝固の誘発によって開始される。アッセイは、典型的には、３７℃の生理学的温度で実施される。アッセイで使用するのに適した二重特異性の濃度は、本明細書の実施例に示され、０.１ｍｇ／ｍｌ（４４ｎＭ）、０.３ｍｇ／ｍｌ（１３３ｎＭ）、および０.５ｍｇ／ｍｌ（２２２ｎＭ）を含む。

【0111】

本発明の二重特異性抗原結合分子は、ａＰＴＴアッセイにおいて、ＦＶＩＩＩａの凝固時間の１０秒以内の凝固時間を与え得る（すなわち、ＦＶＩＩＩａを用いたａＰＴＴアッセイの凝固時間よりも最大１０秒長いか、または最大１０秒短い）。好ましくは、本発明の二重特異性抗原結合分子を用いたａＰＴＴアッセイにおける凝固時間は、ＦＶＩＩＩａを用いた凝固時間よりも短い。二重特異性抗原結合分子は、凝固時間を４０秒未満、３５秒未満、または３０秒未満に短縮し得る。凝固時間は、２０～４０秒、例えば２０～３０秒であり得る。好ましくは、凝固時間は、２２～２８秒、例えば、２４～２６秒である。

【0112】

機能の別の尺度は、二重特異性抗原結合分子の存在下で、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中でトロンビンが生成される速度である。二重特異性抗体の活性は、トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）で測定できる［１０］。最近レビューされたように［１１］、多くのトロンビン生成アッセイが記載されている。本質的に、ＴＧＡは、試験分子（本明細書では、候補となる二重特異性抗体）の添加後の経時的なプロトロンビンからトロンビンへの変換（活性化）を測定することを含み、トロンビンは、検出可能な生成物を形成するための基質の切断を介して検出される。

【0113】

図１を参照すると、凝固カスケードを開始するために外因性組織因子（ＴＦ）経路が存在することが思い出される。ＴＦを発現する細胞は通常、血管系の外側に存在し、組織が損傷すると、そのようなＴＦを含む細胞は循環血小板と接触することになる。ＴＦは、第ＶＩＩａ因子による少量の第ＩＸ因子および第Ｘ因子の活性化を促進する補因子として機能する。活性化された第Ｘａ因子および第Ｖ因子は、ＴＦ含有細胞上でプロトロンビナーゼ複合体を形成し、限られた量のトロンビンを生成する。新たに生成されたトロンビンは、損傷部位に蓄積した血小板および血小板に存在する第ＸＩ因子を活性化する。ＦＩＸａをさらに確実に活性化するには、血小板に結合したＦＸＩａが必要である。ＴＧＡがエクスビボアッセイであることを考えると、ＴＦ含有細胞は存在せず、カスケードを開始するためには凝固トリガーを供給する必要がある。市販のアッセイでは通常、組換えＴＦ／リン脂質混合物を使用して凝固を開始する［１１］。本明細書で例示されるＴＧＡ法（実施例１３を参照されたい）は、ＦＸＩａなどの他の上流活性化因子を使用することができるが、第ＩＸａ因子／リン脂質混合物をトリガーとして使用する。

【0114】

ＴＧＡを実施するために、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿を、（ｉ）トリガー試薬、（ｉｉ）トロンビンによって検出可能な生成物に変換可能な基質、例えば、トロンビンによる切断時に視覚的に検出可能な生成物を産生する蛍光発生または発色基質、および（ｉｉｉ）試験分子（例えば、二重特異性抗体）と接触させて、ＦＶＩＩＩ模倣活性の存在がトロンビン生成をもたらし、したがって検出可能な生成物からのシグナルをもたらす条件を作り出す。通常、血漿には、血液凝固カスケードに必要なカルシウムなどの遊離金属イオンが不足している（図１）。Ｃａ^２＋イオンは、アッセイを開始するために供給されてもよいが（例えば、溶液中のＣａＣｌ_２として）、例えば、それは、基質溶液内に含まれてもよい。開始に続いて、検出可能な生成物の生成（トロンビンの生成を表す）が、例えば、蛍光または色を検出することによって、経時的に（好ましくは連続的に、または頻繁な間隔で、例えば、約２０秒毎に）監視される。プレートリーダーは、例えば、蛍光発生基質のフルオロフォアへの変換を監視するために使用され得る。ＴＧＡは３７℃の生理学的温度で実施される。

【0115】

血漿を制御するために添加された既知の濃度のトロンビンに対して較正することにより、蛍光をトロンビン濃度に変換することができる。次に、トロンボグラムが生成される（図２６、図２７）。

【0116】

好ましくは、二重特異性抗体（または他の試験分子）は、ＴＧＡで使用するために（例えば、プロテインＡクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーによって）、例えば、少なくとも９５％の二重特異性の組成物中で二重特異性ヘテロ二量体を提供するために（すなわち、５％以下のホモ二量体または他の抗体汚染物質が存在する必要がある）、適切に精製される。好ましくは、試験分子は、可能な限り１００％に近い純度で提供される。それは約９８、９９％または１００％純粋な二重特異性である可能性がある。

【0117】

蛍光発生ＴＧＡにおける健康な個人からの血漿のおおよその基準範囲は、Ｃｍａｘ ２００～４５０ｎＭおよびＴｍａｘ５～８分である［１１］。ＴＧＡの活性は、健康な個人、重度のＦＶＩＩＩ欠乏症の患者、およびＦＶＩＩＩ注入後の重度のＦＶＩＩＩ欠乏症の患者からの血漿についての公表された典型的なトロンビン生成曲線と比較することもできる［１２］。標準化のために、ＴＧＡの性能を、既知の濃度の陽性対照分子を表すキャリブレーターと比較することもできる。試験二重特異性の希釈系列は、一連の既知の固定濃度でキャリブレーターと比較することができる。適切なキャリブレーターは、エミシズマブキャリブレーターである。エミシズマブキャリブレーターは市販されており、１００μｇ／ｍＬのエミシズマブ（Ｈｅｍｌｉｂｒａ（登録商標））を添加したＦＶＩＩＩ免疫枯渇クエン酸ヒト血漿から調製し、緩衝液および安定剤をさらに含む。それは凍結乾燥された形で供給され、ＴＧＡで使用される前に水中で再構成される。キャリブレーター薬瓶内のエミシズマブの正確な濃度はわかっているため、アッセイでの試験二重特異性分子の活性を、濃度を正規化した後のキャリブレーターの活性と比較することができる。エミシズマブに対する二重特異性抗体を比較するための代替対照として、ＴＧＡにおける試験二重特異性抗体の性能を、エミシズマブのアミノ酸配列を有する対照二重特異性抗体の性能と比較することができ、ここで、試験二重特異性抗体と、エミシズマブのアミノ酸配列を有する二重特異性抗体とは、ＴＧＡで同一の条件下で試験される。

【0118】

ＴＧＡは、トロンビン生成の６つの側面を特徴づけるために使用できる：ラグタイム（ｌａｇ）、ピークまでの時間（Ｔｍａｘ）、最大ピーク高さ（Ｃｍａｘ）、内因性トロンビン電位（ＥＴＰ）、速度指数（ＶＩ）、および「テールスタート」またはベースラインへのリターン。ラグタイムは、トロンビンピークが生成され始める前の開始段階を表し、トリガーを追加すると、凝固カスケードが活性化される。開始されると、伝播段階で大量のトロンビンが迅速に生成される。ピークまでの時間は、最大トロンビンピーク高さ（Ｃｍａｘ）に到達するのにかかる時間（Ｔｍａｘ）を表し、ＥＴＰは生成されたトロンビンの総量を表し、速度指数は、ラグタイムとピークまでの時間の間の勾配を表す。ベースラインへのリターン（テールスタート）は、トロンビン形成の阻害（活性化プロテインＣによる）およびすでに形成されたトロンビンの不活性化（抗トロンビンによる）を反映している。Ｃｍａｘおよび／またはＴｍａｘは、通常、ＴＧＡの活動を表すために使用される重要な指標である。ＴＧＡの参照値（Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ラグタイムなど）は、固定濃度、例えば、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、または３００ｎＭで二重特異性抗体に対して決定できる。パラメーターは、一連の濃度、例えば、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、および３００ｎＭ、および／または他の濃度で測定して、完全な用量反応曲線を得て、次いで、ＥＣ５０値を決定することができる。用量反応曲線は、非線形対数（抗体）対反応可変勾配モデル（例えば、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ８．０．０を使用して実行できる可変勾配４パラメーターロジスティック回帰モデル）を使用して適合させることができる。ＥＣ５０は、最大効果の半分（ベースラインと測定パラメーターの最大値の中間）に達する試験分子（抗体など）の濃度である。ＥＣ５０は、用量反応曲線から決定できる。ＥＣ５０データを用いた実施例は、本明細書の実施例１４に示されている。

【0119】

一実施形態では、ＴＧＡは以下：
（ａ）遊離カルシウムイオンを欠くＦＶＩＩＩ欠乏血漿を
（ｉ）第ＩＸａ因子／リン脂質混合物を含むトリガー試薬、
（ｉｉ）トロンビンによる切断時に視覚的に検出可能なフルオロフォアを生成する蛍光発生基質（例えば、２ｎＭのＺＧＧＲ－ＡＭＣ蛍光発生基質）、およびカルシウムイオン（例えば、１００ｍＭのＣａＣｌ２）を含む溶液（例えば、ＳｔａｇｏからのＦｌｕＣａ試薬）、および
（ｉｉｉ）二重特異性抗体（例えば、純度９５％～１００％、例えば、９９％～１００％）と接触させること、
（ｂ）ＦＶＩＩＩ模倣活性の存在がトロンビン生成をもたらし、したがってフルオロフォアからのシグナルをもたらす条件下で、血漿を３７℃でインキュベートすること、
（ｃ）蛍光を経時的に検出して、蛍光発生基質からフルオロフォアへの変換を監視すること、
（ｄ）所定の濃度のトロンビンの溶液からの蛍光に対して検出された蛍光を較正すること、ならびに
（ｅ）トロンボグラムの１つ以上のパラメーターを決定することであって、ここで、パラメーターは、
到達する最大トロンビンピーク高さ（Ｃｍａｘ）、
最大トロンビンピーク高さ到達するのにかかる時間（Ｔｍａｘ）、および／または
トロンビンピークが生成され始める前の開始段階の長さ（ラグタイム）である、決定すること、を含む。

【0120】

１つ以上のパラメーターは、反応のベースラインおよびトッププラトー（最大値）を含む完全な用量反応曲線を得るために、二重特異性抗体の一連の濃度で決定される。用量反応曲線は、非線形対数［抗体］対反応パラメーター可変勾配モデル（４パラメーターロジスティック回帰モデル）を使用してデータポイントに適合させることができる。ＥＣ５０は、該用量反応曲線から決定される。該１つ以上のパラメーター、または該１つ以上のパラメーターについてのＥＣ５０は、試験二重特異性抗体とエミシズマブ（例えば、Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なエミシズマブキャリブレーター）との間で比較され得る。

【0121】

本発明による二重特異性抗体は、好ましくは、蛍光測定ＴＧＡにおいてエミシズマブと同等またはそれ以上の効力を示す。より高い効力は、該アッセイにおける１つ以上のパラメーター、例えば、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘまたはラグタイムについてのより低いＥＣ５０によって表され得る。本明細書の実施例に示されるように、本発明の実施形態は、より低い濃度でエミシズマブよりも高い効力を一貫して示した。例えば、図２９、図３０、図３１、図３３、および図３４に示されている結果を参照されたい。

【0122】

蛍光測定ＴＧＡの最大応答（例えば、最高のＣｍａｘ、最低のＴｍａｘ、最短のラグタイムなど）も注目に値する。最大応答は、測定されたパラメーター（例えば、Ｃｍａｘ）が抗体濃度の増加に伴ってプラトーになるレベルであり、達成可能な最大レベル（例えば、最大Ｃｍａｘ）を表す。過剰な最大反応は、凝固促進経路の異常に増加した活性化を特徴とする消費凝固障害または播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）のリスクを含む、二重特異性分子の過剰投与のリスクの増加と関連している可能性がある。凝固亢進は、動脈／静脈血栓症、塞栓症、血栓性微小血管症などの凝固障害イベントを通じて患者の安全性を損なう可能性があり、したがって治療域、すなわち、許容できない副作用または有害事象のリスクなしに有益な効果が達成される用量または血漿濃度の範囲を狭める。

【0123】

エミシズマブは、ヒトの臨床試験で許容できると考えられた安全性プロファイルに基づいて規制当局の承認を受けているため、ＴＧＡにおけるエミシズマブの最大応答は確立された安全限界を表している。任意選択で、本発明の二重特異性は、エミシズマブのそれとは２０％以下（例えば、１５％以下または１０％以下）異なる、ＴＧＡにおける最大Ｃｍａｘおよび／または最大Ｔｍａｘ応答を有する。これらの参照値は、エミシズマブキャリブレーターまたはエミシズマブの配列同一類似体を使用して決定することができる。

【0124】

本発明の二重特異性抗体は、以下のように、ＴＧＡにおいて最大応答を示し得る：
－ＴＧＡのＣｍａｘが５００ｎＭを超えないこと。任意選択で、Ｃｍａｘの最大応答は４５０ｎＭを超えない、例えば、４００ｎＭを超えない。Ｃｍａｘの最大応答は、２００～４５０ｎＭ、例えば２５０～３５０ｎＭである。および／または
－ＴＧＡのＴｍａｘは、最大応答１分以上である。任意選択で、Ｔｍａｘの最大応答は５分以上、４分以上、３分以上、または２分以上である。Ｔｍａｘの最大応答は、２～１０分、例えば２～８分、または５～８分であり得る。

【0125】

本発明による二重特異性抗原結合分子は、蛍光測定ＴＧＡによって決定されるように、１００～４５０ｎＭ（例えば、２００～４５０ｎＭ）の範囲のＣｍａｘを有してもよく、例えば、二重特異性抗体は、該アッセイでは、１００ｎＭまたは３００ｎＭの濃度である。Ｃｍａｘは、好ましくは、少なくとも２００ｎＭ、より好ましくは、少なくとも２５０ｎＭ、または少なくとも３００ｎＭである。二重特異性のＣｍａｘは、エミシズマブのＣｍａｘと同じか類似している（例えば、１０％以内の差がある）場合もあれば、エミシズマブのＣｍａｘよりも大きい場合もある。二重特異性は、エミシズマブのＣｍａｘ ＥＣ５０の１０％以内であるか、またはそれよりも低い、上記アッセイにおけるＣｍａｘ ＥＣ５０を有し得る。ＥＣ５０がエミシズマブのＥＣ５０よりも低い場合、本発明の二重特異性抗体とエミシズマブとの間でＴＧＡのＣｍａｘ ＥＣ５０に少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍の差がある可能性がある。任意選択で、ＴＧＡのＣｍａｘ ＥＣ５０は、最大１０倍、最大１５倍、または最大２０倍異なる場合がある。蛍光測定ＴＧＡの二重特異性抗原結合分子のＣｍａｘのＥＣ５０は、５０ｎＭ未満、例えば、１ｎＭ～５０ｎＭ、５ｎＭ～２０ｎＭ、または５ｎＭ～１０ｎＭである場合がある。

【0126】

本発明による二重特異性抗原結合分子は、蛍光測定ＴＧＡによって決定されるように、８分以下、例えば、４～８分の範囲のＴｍａｘを有してもよく、例えば、二重特異性抗体は、該アッセイでは、１００ｎＭまたは３００ｎＭの濃度である。二重特異性のＴｍａｘは、エミシズマブのＴｍａｘと同じもしくは類似している（例えば、１０％以内の差がある）場合もあれば、エミシズマブのＴｍａｘよりも小さい場合もある。二重特異性は、エミシズマブのＴｍａｘ ＥＣ５０の１０％以内であるか、またはそれよりも低い、上記アッセイにおけるＴｍａｘ ＥＣ５０を有し得る。

【0127】

蛍光測定ＴＧＡにおける二重特異性抗原結合分子についてのＴｍａｘのＥＣ５０は、５ｎＭ未満、例えば、３ｎＭ未満または２ｎＭ未満であり得る。それは、１ｎＭ～５ｎＭ、例えば、１ｎＭ～２ｎＭであり得る。

【0128】

本発明による二重特異性抗原結合分子は、蛍光測定ＴＧＡによって決定されるように、２～６分のラグタイムを有してもよく、例えば、二重特異性抗体は、該アッセイでは、１００ｎＭまたは３００ｎＭの濃度である。二重特異性のラグタイムは、エミシズマブのラグタイムと同じもしくは類似している（例えば、１０％以内の差がある）場合もあれば、エミシズマブのラグタイムよりも短い場合もある。二重特異性は、エミシズマブのラグタイムＥＣ５０の１０％以内であるか、またはそれよりも低い、上記アッセイにおけるラグタイムＥＣ５０を有し得る。

【0129】

二重特異性抗原結合分子
二重特異性抗原結合分子は、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームおよびＦＸ結合ポリペプチドアームを含む。それは、多鎖または単鎖ポリペプチド分子であってもよい。ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームおよびＦＸ結合ポリペプチドアームは、二重特異性分子の異なる部分を表すが、１つのポリペプチドが任意選択で、ＦＩＸａ結合アームおよびＦＸ結合アームの両方の全部または一部を形成することができる。

【0130】

ポリペプチド結合アームは、抗原（ＦＩＸａまたはＦＸ）のうちの１つに対する結合部位を含む二重特異性分子の領域である。二重特異性分子の一方または両方の抗原結合部位は、ポリペプチドアームの相補性決定領域（またはペプチドループ）のセットによって提供され得、ポリペプチドアームは、抗体（例えば、抗体Ｆｖ領域）または非抗体分子のものであるかどうかにかかわらず、任意の好適な骨格ポリペプチドである。結合アームは、１つまたは２つ以上（例えば、２つ）のポリペプチドまたはその部分（例えば、ドメイン）を含んでもよい。

【0131】

本発明は、二重特異性抗体に関して本明細書に詳細に記載され、抗原結合ポリペプチドアームのうちの少なくとも１つは、抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、任意選択でＦｖ領域におけるＣＤＲのセットによって提供される。

【0132】

抗体は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンドメインを含む分子である。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥ分子、またはその抗原特異性抗体断片を含む分子であってもよい。「抗体」という用語は、抗体の抗原結合部位を含む任意のポリペプチドまたはタンパク質を含む。抗体の抗原結合部位（パラトープ）は、その標的抗原のエピトープに結合し、かつそれに相補的である抗体の一部である。「エピトープ」という用語は、抗体によって結合される抗原の領域を指す。エピトープは、構造的または機能的であると定義され得る。機能的エピトープは概して、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、立体構造的であり、すなわち、非線形アミノ酸で構成されてもよい。ある特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面グループである決定基を含んでもよく、ある特定の実施形態では、特定の三次元構造特性、および／または特定の電荷特性を有してもよい。

【0133】

抗体の抗原結合部位は、抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットによって提供され、抗原に結合することが可能である。一例において、抗体結合部位は、単一可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）、または軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）によって提供される。別の例では、結合部位は、ＶＨ／ＶＬ対（Ｆｖ）または２つ以上のそのような対によって提供される。

【0134】

抗体可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）のアミノ酸配列、ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、抗体の軽鎖および重鎖の部分である。したがって、ＶＨおよびＶＬドメインの各々の中にＣＤＲおよびＦＲがある。ＶＨドメインは、ＨＣＤＲのセットを含み、ＶＬドメインは、ＬＣＤＲのセットを含む。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを指す。各ＶＨおよびＶＬは典型的には、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される。ＣＤＲおよびＦＲに割り当てられたアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ命名法に従って定義され得る。抗体は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにフレームワークを含む抗体ＶＨドメインを含んでもよい。あるいは、またはさらに、抗体は、ＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにフレームワークを含む抗体ＶＬドメインを含んでもよい。抗体ＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの例示的な配列は、本開示の一部を形成する。ＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムに従って定義される［１３］。本明細書に開示されるすべてのＶＨおよびＶＬ配列、ＣＤＲ配列、ＣＤＲのセット、およびＨＣＤＲのセット、およびＬＣＤＲのセットは、本発明の態様および実施形態を表す。本明細書に記載されるように、「ＣＤＲのセット」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。したがって、ＨＣＤＲのセットは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を指し、ＬＣＤＲのセットは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を指す。特に明記しない限り、「ＣＤＲのセット」は、ＨＣＤＲおよびＬＣＤＲを含む。

【0135】

抗体は、抗体フレームワーク内に１つ以上のＣＤＲ、例えば、ＣＤＲのセットを含んでもよい。フレームワーク領域は、ヒト生殖細胞遺伝子セグメント配列を有してもよい。したがって、抗体は、ヒト生殖細胞フレームワーク内にＨＣＤＲのセットを含むＶＨドメインを有するヒト抗体であってもよい。通常、抗体は、例えば、ヒト生殖細胞フレームワーク内にＬＣＤＲのセットを含むＶＬドメインも有する。抗体「遺伝子セグメント」、例えば、ＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、またはＪＨ遺伝子セグメントは、抗体のその部分が由来する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを指し、例えば、ＶＨ遺伝子セグメントは、ＦＲ１からＣＤＲ３の一部までのポリペプチドＶＨドメインに対応する核酸配列を含むオリゴヌクレオチドである。ヒトｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントは、組換えられてＶＨドメインを生成し、ヒトｖおよびｊセグメントは、組換えられてＶＬドメインを生成する。Ｄドメインまたは領域は、抗体鎖の多様性ドメインまたは領域を指す。Ｊドメインまたは領域は、抗体鎖の結合ドメインまたは領域を指す。体細胞超変異は、対応する遺伝子セグメントと正確に一致または整合しないフレームワーク領域を有する抗体ＶＨまたはＶＬドメインをもたらす可能性があるが、最も近い遺伝子セグメントを同定し、したがって特定のＶＨまたはＶＬドメインが遺伝子セグメントのどの特定の組み合わせに由来するかを同定するために、配列アライメントが使用され得る。抗体配列を遺伝子セグメントと整合する場合、抗体のアミノ酸配列が、遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸配列と整合されてもよく、または抗体ヌクレオチド配列が、遺伝子セグメントのヌクレオチド配列と直接整合されてもよい。本明細書に記載の例示的な抗体のフレームワーク領域に対応する生殖細胞遺伝子セグメントが、表Ｓ－１２に示される。

【0136】

抗体は、定常領域を含む免疫グロブリン全体であってもよく、または抗体断片であってもよい。抗体断片は、無傷の抗体の一部分であり、例えば、無傷の抗体の抗原結合および／または可変領域を含む。抗体断片は、１つ以上の定常領域ドメインを含んでもよい。

【0137】

本発明の抗体は、ヒト可変領域および非ヒト（例えば、マウス）定常領域を含むヒト抗体またはキメラ抗体であってもよい。本発明の抗体は、例えば、ヒト可変領域を有し、任意選択でヒト定常領域も有する。

【0138】

したがって、抗体は任意選択で、定常領域またはその一部、例えば、ヒトＩｇＧ４定常領域などのヒト抗体定常領域またはその一部を含む。例えば、ＶＬドメインは、そのＣ末端で抗体軽鎖カッパまたはラムダ定常ドメインに付着し得る。同様に、抗体ＶＨドメインは、そのＣ末端で任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、ならびにＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのアイソタイプサブクラスのうちのいずれかに由来する、免疫グロブリン重鎖定常領域の全部または一部（例えば、ＣＨ１ドメインまたはＦｃ領域）に付着し得る。

【0139】

酵素パパインによる免疫グロブリン全体（二価）の消化は、「Ｆａｂ」断片および「Ｆｃ」断片として既知の２つの同一（一価）の抗原結合断片をもたらす。Ｆｃは、抗原結合活性を有しないが、結晶化する能力を有する。「Ｆａｂ」は、本明細書で使用される場合、重鎖および軽鎖の各々の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインを含む抗体の断片を指す。本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義し、天然配列Ｆｃ領域および可変Ｆｃ領域を含む。「Ｆｃ断片」は、ジスルフィドによってともに保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を指す。

【0140】

酵素ペプシンによる抗体の消化は、抗体分子の２つのアームが連結されたままである、二価Ｆ（ａｂ’）２断片をもたらす。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である。単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、別の断片である。ｓｃＦｖなどの２つの異なる一価の単一特異性抗体断片が一緒に連結されて、二価の二重特異性抗体を形成してもよい。

【0141】

本明細書で使用される場合の「Ｆｖ」は、抗原認識部位および抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小断片を指す。この領域は、強い非共有結合または共有結合によって会合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に、６つのＣＤＲにより、抗体に抗原結合特異性が付与される。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、通常は結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。

【0142】

好ましくは、二重特異性抗体は、二重結合抗体、すなわち、両方の抗原結合ドメインがＶＨ／ＶＬ対によって形成される二重特異性抗体である。二重結合抗体としては、ＦＩＴ－Ｉｇ（参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／１０３０７２を参照されたい）、ｍＡｂ－ｄＡｂ、ドック・アンド・ロック、Ｆａｂアーム交換、ＳＥＥＤボディ、トリオマブ、ＬＵＺ－Ｙ、Ｆｃａｂ、κλ－ボディ、直交Ｆａｂ、ｓｃダイアボディ－Ｆｃ、ダイアボディ－Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、イントラボディ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ－ＣＨ３、ダイアボディ－ＣＨ３、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣａｂ、ＩｍｍＴＡＣ、ノブ・イン・ホール、共通の軽鎖を有するノブ・イン・ホール、共通の軽鎖および電荷対を有するノブ・イン・ホール、電荷対、共通の軽鎖を有する電荷対、ＤＴ－ＩｇＧ、ＤｕｔａＭａｂ、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ（Ｈ）－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ、Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ、およびｓｃＦｖ４－Ｉｇが挙げられる。

【0143】

一実施形態では、二重特異性抗体は、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームおよびＦＸ結合ポリペプチドアームを含む二重特異性ＩｇＧであり、各ポリペプチドアームは、重鎖および軽鎖を含む。ＩｇＧは、
ＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含む抗体重鎖および軽鎖の第１の対（重鎖－軽鎖対）と、
ＦＸ結合性Ｆｖ領域を含む第２の重鎖－軽鎖対と、を含む、四量体免疫グロブリンであり、
各重鎖は、ＶＨドメインおよび定常領域を含み、各軽鎖は、ＶＬドメインおよび定常領域を含み、第１および第２の重鎖－軽鎖対は、それらの重鎖定常領域のヘテロ二量体化を通して会合して、免疫グロブリン四量体を形成する。

【0144】

任意選択で、２つのポリペプチドアームは、共通の軽鎖を含み、そのため、第１および第２の重鎖－軽鎖対の軽鎖は、同一のアミノ酸配列を有する（図５）。あるいは、２つのポリペプチドアームは、異なる軽鎖を含んでもよい。

【0145】

二重特異性抗体は、ＦＩＸａへの結合およびＦＸへの結合に対して一価であってもよい。

【0146】

抗体定常領域
上述のように、抗体は、様々なアイソタイプで、かつ異なる定常領域とともに提供され得る。抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体によって認識され、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性、および抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性を含む、細胞性エフェクター機能を仲介する抗体の能力を決定する。これらの細胞性エフェクター機能は、Ｆｃ受容体を有する細胞の標的細胞の部位への動員を伴い、抗体結合細胞の死滅をもたらす。

【0147】

本発明の文脈において、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、および／またはＣＤＣなどの細胞性エフェクター機能を回避することが望ましい。したがって、本発明による二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃエフェクター機能を欠いてもよく、例えば、それらは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、または／もしくはＣＤＣを仲介しないＦｃ領域を含んでもよいか、あるいはそれらは、Ｆｃ領域を欠くか、または抗体定常領域を完全に欠いてもよい。抗体は、エフェクターヌルである定常領域を有してもよい。

【0148】

抗体は、１つ以上の型のＦｃ受容体に結合するが、細胞性エフェクター機能を誘導しない、すなわち、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、またはＡＤＣＰ活性を仲介しない、重鎖定常領域を有してもよい。そのような定常領域は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、またはＡＤＣＰ活性を誘発する原因となる特定のＦｃ受容体（複数可）に結合できない場合がある。

【0149】

抗体は、Ｆｃγ受容体に結合しない重鎖定常領域を有してもよく、例えば、定常領域は、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ変異を含んでもよく（すなわち、野生型ロイシン残基がグルタミン酸残基に変異される）、これは、「Ｅ」変異、例えば、ＩｇＧ４－Ｅと称され得る。重鎖定常領域の別の任意の変異は、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ（「Ｐ」変異）であり、これは、Ｆａｂアーム交換を低減することによって安定性を高める。重鎖定常領域は、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ変異およびＳｅｒ２２８Ｐｒｏ変異の両方を含むＩｇＧ４であってもよい（ＥＵ番号付け）。この「ＩｇＧ４－ＰＥ」重鎖定常領域は、エフェクターヌルである。代替のエフェクターヌルヒト定常領域は、機能しないＩｇＧ１である。

【0150】

抗体定常領域は、インビボでの半減期が延長されるように操作することができる。例としては、「ＹＴＥ」変異および他の半減期延長変異（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ、Ｋｉｅｎｅｒ＆Ｗｕ、ＪＢＣ ２８１（３３）：２３５１４－２３５２４ ２００６およびＷＯ０２／０６０９１９、参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。三重変異ＹＴＥは、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインの３アミノ酸の置換であり、これらの変異は、残基２５２にチロシン、残基２５４にスレオニン、残基２５６にグルタミン酸を提供し、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号が付けられている。参考文献で記載されているように、ＹＴＥ修飾は、ヒトＣＨ２野生型ドメインを有する対応する抗体の半減期と比較して、抗体の半減期を増加させる。インビボでの有効期間の延長を提供するために、本発明の抗体は、対応する野生型ヒト定常領域（例えば、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ ＣＨ２ドメイン）と比較して抗体の半減期を増加させる１つ以上の変異を有する抗体定常領域（例えば、ＩｇＧ定常領域、例えば、ＩｇＧ ＣＨ２ドメイン）を含み得る。半減期は、ＷＯ０２／０６０９１９に記載されているような標準的な方法によって決定することができる。

【0151】

いくつかの実施形態では、ガンマ－カルボキシグルタミン酸に富む（Ｇｌａ）ドメインまたは他の膜結合ドメインは、二重特異性抗体に（例えば、ＦｃのＣ末端に）含まれ、（Ｇｌａドメインと膜の間の相互作用を介して）血小板表面のリン脂質膜への抗体の局在化を促進し、それにより、ＦＩＸおよびＦＸがインビボで天然に存在する二重特異性抗体の局所濃度を増加させる。ＷＯ２０１８／１４５１２５は、ＦＩＸ／ＦＸ二重特異性抗体および膜結合ドメイン、例えば、Ｃ１、Ｃ２ドメインなどの血小板結合ドメイン、ＰＨドメイン、ＧＬＡドメイン、または血小板の膜糖タンパク質の膜結合ドメインを含むＦＶＩＩＩ模倣タンパク質を記載した。本明細書に記載されるように、膜結合ドメインは、二重特異性抗体の重鎖定常ドメインの一方または両方のＣ末端に連結され得る。本発明の二重特異性抗原結合分子は、任意選択で、ＷＯ２０１８／１４５１２５に記載されている特徴および分子形式を含み得る。

【0152】

以下で考察されるように、異なる抗原結合アームが定常領域を介してヘテロ二量体化される二重特異性ＩｇＧ形式または他の抗体形式では、定常領域は、ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成を促進し、および/または異なる種の混合物からのヘテロ二量体の精製を促進するように操作され得る。

【0153】

抗ＦＩＸａｘＦＸ二重特異性抗体エミシズマブは、そのアセンブリ、精製および／または治療性能を促進するように設計された特徴を含む重鎖定常領域を含む。本発明による二重特異性抗体は、これらの特徴のいずれか１つ以上を含み得る。したがって、それは、以下の変化のうちの１つ以上を含むヒトＩｇＧ４（例えば、ＩｇＨＧ４＊０３）重鎖定常領域アミノ酸配列を含み得る（ＥＵ番号付け）：
ＣＨ１のＬｙｓ１９６Ｇｌｎ、
ヒンジ領域のＳｅｒ２２８Ｐｒｏ（Ｐ変異）、
ＣＨ２のＤＥターンのＰｈｅ２９６Ｔｙｒ、
ＣＨ３のＧｌｕ３５６Ｌｙｓ、
ＣＨ３のＬｙｓ４３９Ｇｌｕ、
ＣＨ３のＬｅｕ４４５Ｐｒｏ、
Ｇｌｙ４４６の欠失、
Ｌｙｓ４４７の欠失。

【0154】

変異Ｇｌｕ３５６ＬｙｓおよびＬｙｓ４３９Ｇｌｕの各々１つは、ヘテロ二量体二重特異性のＦｃ内の２つの反対向きに対になった重鎖定常領域に含まれ、すなわち、一方の重鎖定常領域はＧｌｕ３５６およびＬｙｓ４３９Ｇｌｕを含み、他方の重鎖定常領域はＧｌｕ３５６ＬｙｓおよびＬｙｓ４３９を含む（下記の電荷の対合（ｃｈａｒｇｅ ｐａｉｒｉｎｇ）に関する議論を参照されたい）。

【0155】

本発明による二重特異性抗体は、エミシズマブのＦｃ領域に存在する特徴のいずれか１つまたは複数を有するＦｃ領域を含み得る。それは、エミシズマブのＦｃ領域を含む場合がある。一実施形態では、重鎖定常領域のアミノ酸配列は、エミシズマブ重鎖定常領域のアミノ酸配列である。

【0156】

重鎖定常領域のアミノ酸配列の例を表Ｓ－１００に示す。

【0157】

ヘテロ二量体形成および／または精製を促進するための二重特異性抗体の操作
診療所で二重特異性抗体を使用することの難しさの１つは、歴史的に、大量かつ医薬品グレードの純度でそれらを産生することの難しさであった。「従来の」二重特異性ＩｇＧ形式は、重鎖および軽鎖の２つの異なる対、したがって４つの異なるポリペプチド鎖を含み、これは、一緒に発現すると、アセンブルして１０個の異なる潜在的な抗体分子になり得る。種の混合物は、ホモ二量体（ホモ二量体抗ＦＩＸａ結合アームおよびホモ二量体抗ＦＸ結合アーム）、一方または両方の軽鎖がＨ－Ｌ対間で交換される分子、ならびに「正しい」二重特異性ヘテロ二量体構造を含む。

【0158】

この潜在的な誤対合を回避する代替の分子形式が開発されており、いくつかの例が本明細書に提供される。これらには、例えば、化学結合またはロイシンジッパー（ｆｏｓ：ｊｕｎ）アセンブリ、ダイアボディ、およびｓｃＦｖヘテロ二量体によって調製されたＦ（ａｂ’）２が含まれる。それにもかかわらず、二重特異性ＩｇＧを使用して、血流中の抗体の本来の構造を反映し、かつ投与された治療用分子の免疫原性を最小限に抑えることが可能であることが依然として望ましい。加えて、完全長の二重特異性抗体は、より長い血清半減期を有し得る。

【0159】

二重特異性抗体を作製するための「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、［１４］、および参照により本明細書に組み込まれるＵＳ５，７３１，１６８に記載されている。その原理は、ヘテロ二量体重鎖の対になったＣＨ３ドメインを操作して、一方のＣＨ３ドメインが「ノブ」を含み、他方のＣＨ３ドメインが立体的に反対の位置に「ホール」を含むようにすることである。ノブはＣＨ３ドメイン間の界面で小さなアミノ酸側鎖を置き換えることによって形成され、ホールは大きな側鎖をより小さなものに置き換えることによって形成される。ノブはホールに挿入するように設計されており、ホモ二量体形成を不安定にしながら、様々なＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化に有利となる。したがって、アセンブルして二重特異性抗体を形成する抗体重鎖および軽鎖の混合物において、対になったヘテロ二量体重鎖を有するＩｇＧ分子の割合が増加し、活性分子の収量および回収率を高める。

【0160】

変異Ｙ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗは、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインに「ノブ」を形成するために含まれ得る。変異Ｅ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖは、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインに「ホール」を形成するために含まれ得る。ノブおよびホールは、任意のヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメイン、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインに導入され得る。好ましい例はＩｇＧ４である。前述のように、ＩｇＧ４は、「Ｐ」および／または「Ｅ」変異などのさらなる修飾を含み得る。例示的なＩｇＧ４－ＰＥ配列、およびノブ・イントゥ・ホール変異を含む他の例示的な定常領域が、表Ｓ－１００に示される。ＩｇＧ４型ａ（「ｒａ」）配列は置換Ｙ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗ（「ノブ」）を含み、ＩｇＧ４型ｂ（「γｂ」）配列は置換Ｅ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ（「ホール」）を含む。ｒａおよびγｂはまた、両方とも、重鎖のヒンジ領域を安定化するためにヒンジの２２８位に「Ｐ」置換を含む（Ｓ２２８Ｐ）。ｒａおよびγｂの両方はまた、ＦｃγＲへの結合を無効にするために、２３５位におけるＣＨ２領域内の「Ｅ」置換（Ｌ２３５Ｓ）も含む。したがって、ＩｇＧ４－ＰＥ重鎖の関連配列は、ｐｐｃｐＰｃｐａｐｅｆＥｇｇｐｓ（配列番号４０１）である。本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＩｇＧ４ ＰＥヒト重鎖定常領域（例えば、配列番号１４３）、任意選択で２つのそのような対になった定常領域を含んでもよく、任意選択で、１つは、「ノブ」変異を有し、１つは、「ホール」変異を有し、例えば、１つの重鎖定常領域は、配列番号１４４（ノブ）の配列を有し、１つの重鎖定常領域は、配列番号１４５（ホール）の配列を有する変異。

【0161】

二重特異性ＩｇＧ操作のさらなる進歩は、ＷＯ９８／５０４３１で説明されているように、共通の軽鎖を使用するという考えであった。２つの重鎖－軽鎖対を含む二重特異性抗体が説明されており、両方の重鎖－軽鎖対の可変軽鎖が共通の配列を有していた。ＷＯ９８／５０４３１は、共通の軽鎖アプローチを、重鎖ヘテロ二量体化界面（例えば、ノブ・イントゥ・ホール）における特定の相補的相互作用と組み合わせて、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げることを説明した。総合して、これらのアプローチは、望ましくないヘテロ二量体およびホモ二量体と比較して、所望のヘテロ二量体の形成を増強する。

【0162】

ノブ・イントゥ・ホール技術では、アミノ酸側鎖を操作して、二重特異性ヘテロ二量体の対になったＣＨ３ドメインの界面に相補的な分子形状を形成するが、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体の形成を妨げる別の方法は、アミノ酸側鎖を反対の電荷を有するように操作することである。重鎖ヘテロ二量体のＣＨ３ドメインの結合は、反対に帯電した残基の対合によって有利となるが、対になった正電荷または対になった負電荷は、ホモ二量体形成をエネルギー的に有利にしない。ＷＯ２００６／１０６９０５は、２種以上のポリペプチドで構成されるヘテロ多量体（例えば２つの異なる抗体重鎖のヘテロ二量体）であって、アミノ酸残基に置換を含み、ヘテロ多量体結合が調節されるように該ポリペプチドとの間に界面を形成するヘテロ多量体を生成するための方法を説明しており、この方法は、
（ａ）１つ以上の多量体を形成するポリペプチド間の会合が２種以上の多量体を形成し得るヘテロ多量体において阻害されるように、元の核酸からのポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を修飾することと、
（ｂ）ステップ（ａ）によって修飾された核酸配列が発現されるように、宿主細胞を培養することと、
（ｃ）宿主細胞培養物から該ヘテロ多量体を回収することと、
を含み、ステップ（ａ）の修飾は、界面を形成する変異残基を含む２つ以上のアミノ酸残基が同じ種類の正または負の電荷を保持するように、１つ以上のアミノ酸残基が置換されるように元の核酸を修飾する。

【0163】

この一例は、重鎖ホモ二量体の界面において静電反発力を導入することによって、例えば、ＣＨ３ドメインの界面において互いに接触するアミノ酸残基を修飾することによって、重鎖間の会合を抑制することであり、
位置３５６および４３９
位置３５７および３７０
位置３９９および４０９
ＥＵ番号付けシステムに従っている残基番号付け、を含む。

【0164】

これらの残基の対の１つ以上を、最初の重鎖のＣＨ３ドメインに同様の電荷（両方が正または両方が負）を有するように修飾することにより、重鎖ホモ二量体の対合が静電反発によって阻害される。第２の（異なる）重鎖のＣＨ３ドメインの同じ対または残基の対を、第１の重鎖の対応する残基と比較して反対の電荷を有するように操作することにより、静電引力による第１および第２の重鎖のヘテロ二量体対合が促進される。

【0165】

重鎖定常領域ＣＨ３界面のアミノ酸は、電荷対を導入するように修飾されたが、変異は、ＷＯ２００６／１０６９０５の表１に列挙されている。重鎖位置３５６、３５７、３７０、３９９、４０９、および４３９のアミノ酸を修飾して、ＣＨ３界面に電荷誘導分子反発を導入することは、目的の二重特異性抗体の形成効率を増加させる効果を有することが報告された。例えば、ＥＵの番号付けを使用して、一方の重鎖定常領域は変異Ｋ４３９Ｅ（正に帯電したＬｙｓが負に帯電したＧｌｕに置き換えられる）を含むＩｇＧ４定常領域であってもよく、他方の重鎖定常領域は変異Ｅ３５６Ｋ（負に帯電したＧｌｕが正に帯電したＬｙｓに置き換えられる）を含むＩｇＧ４定常領域であってもよい。「電荷の対合」は、これら２つの定常領域のヘテロ二量体化からアセンブルされたＦｃ領域の残基４３９および３５６の空間的近接性から得られる。

【0166】

２つの異なる重鎖定常領域が使用される場合、これらは、いずれかの方向で抗体の２つの異なるＶＨドメインに接続され得る。例えば、
第１の重鎖は、抗ＦＩＸ ＶＨドメインと、Ｋ４３９Ｅを含む定常領域とを含み得、第２の重鎖は、抗ＦＸ ＶＨドメインと、Ｅ３５６Ｋを含む定常領域とを含み得るか、または
第１の重鎖は、抗ＦＩＸ ＶＨドメインと、Ｅ３５６Ｋを含む定常領域とを含み得、第２の重鎖は、抗ＦＸ ＶＨドメインと、Ｋ４３９Ｅを含む定常領域とを含み得る。

【0167】

ＷＯ２００６／１０６９０５はまた、ＩｇＧ４のＣＨ３ドメインがノブ・イントゥ・ホール変異によって操作されたＦＸおよびＦＩＸａに結合する、二重特異性ＩｇＧ抗体を例示した。ａ型ａ型（ＩｇＧ４γａ）はＹ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗで置換されたＩｇＧ４であり、ｂ型（ＩｇＧ４γｂ）はＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖで置換されたＩｇＧ４であった。

【0168】

別の例では、抗体のＶＨおよびＶＬドメインへの電荷対の導入を使用して、「誤った」ＶＨ－ＶＬ対の形成（一方の抗体のＶＨと他方の抗体のＶＬの対合）が阻害された。一例では、ＶＨおよびＶＬのＱ残基がＫもしくはＲ（正）またはＥもしくはＤ（負）に変更されて、Ｑ側鎖間の水素結合が阻害され、静電反発が導入された。

【0169】

電荷対のさらなる例は、単一の細胞からヘテロ二量体のＣＨ３ドメインを含む分子を生成するための方法を説明したＷＯ２０１３／１５７９５４に開示されており、分子は、界面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを含む。この方法は、細胞中に、
（ａ）第１のＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子であって、この鎖は、ＥＵ番号付けシステムに従って３６６位にＫ残基を含む、第１の核酸分子と、
（ｂ）第２のＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖をコードする第２の核酸分子であって、この鎖は、ＥＵ番号付けシステムに従って３５１位にＤ残基を含む、第２の核酸分子とを提供することを含み、
この方法は、宿主細胞を培養し、２つの核酸分子の発現を可能にし、培養物からヘテロ二量体のＣＨ３ドメインを含む分子を採取するステップをさらに含む。

【0170】

ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成を促進するためにポリペプチド鎖における静電相互作用を操作するさらなる方法が、ＷＯ２０１１／１４３５４５で説明された。

【0171】

ＣＨ３－ＣＨ３界面での操作の別の例は、ストランド交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ヘテロ二量体である。ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＡおよびＩｇＧ ＣＨ３配列の交互のセグメントで構成され、「ＳＥＥＤ－ｂｏｄｉｅｓ」と呼ばれる相補的なＳＥＥＤヘテロ二量体の対を形成する［１５；ＷＯ２００７／１１０２０５］。

【0172】

二重特異性はまた、プロテインＡなどの精製試薬への結合に対する親和性を改変するためにＣＨ３ドメインで示差的に修飾されたヘテロ二量体化重鎖を用いて産生される。ＷＯ２０１０／１５１７９２は、以下
Ｎ末端からＣ末端まで、第１のエピトープに選択的に結合する第１のエピトープ結合領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第１のＣＨ３領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む第１のポリペプチドと、
Ｎ末端からＣ末端まで、第２のエピトープに選択的に結合する第２のエピトープ結合領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第２のＣＨ３領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む第２のポリペプチドと、を含み、ここで、第２のＣＨ３領域は、プロテインＡへの第２のＣＨ３ドメインの結合を低減または排除する修飾を含む、ヘテロ二量体二重特異性抗原結合タンパク質を記載した。

【0173】

したがって、Ｆｃ領域は、ホモ二量体種からの活性ヘテロ二量体の示差的精製を促進するための１つ以上の変異を含み得る。一方の重鎖定常領域のＣＨ３は、変異Ｈｉｓ４３５Ａｒｇおよび／またはＴｙｒ４３６Ｐｈｅ（ＥＵ番号付け）［１６］を含み得、他方の重鎖定常領域のＣＨ３は、該変異を欠いている。例えば、エミシズマブは、一方のＣＨ３がＨｉｓ４３５を含み、他方のＣＨ３がＨｉｓ４３５Ａｒｇを含むＦｃ領域を含む。

【0174】

本発明の二重特異性抗体は、必要に応じてこれらの技術および分子形式のうちのいずれかを用い得る。

【0175】

抗体の生成および修飾
抗体を同定および調製するための方法は、よく知られている。本明細書に記載の単離された（任意選択で変異された）核酸コード抗体（またはその重鎖－軽鎖対もしくはポリペプチド結合アーム）は、宿主細胞、例えば、議論されるようにＣＨＯ細胞に導入され得る。次いで、宿主細胞は、任意の所望の抗体形式を産生するために、抗体の（または抗体重鎖および／もしくは軽鎖可変ドメイン、重鎖－軽鎖対、またはポリペプチド結合アームの）発現のための条件下で培養される。いくつかの可能な抗体形式、例えば、免疫グロブリン全体、抗原結合断片、および他の設計が本明細書に記載されている。

【0176】

ＶＨおよびＶＬドメインのうちのいずれかの可変ドメインアミノ酸配列バリアント、またはその配列が本明細書に具体的に開示されているＣＤＲは、考察されるように、本発明に従って用いられ得る。

【0177】

本明細書に記載のように、抗体の重鎖および／または軽鎖可変ドメインをコードする核酸に対する改変、例えば残基の変異およびバリアントの生成を実施することができる。大規模製造のための抗体配列の最適化、精製の促進、安定性の増強、または所望の医薬品製剤への含有適合性の改善を含む、バリアントを作り出すことが望ましくあり得る理由は多く存在する。タンパク質操作の作業は、例えば、１つのアミノ酸を代替アミノ酸で置換し（任意選択で、ＣｙｓおよびＭｅｔを例外とする可能性もあるが、この位置においてすべての天然型アミノ酸を含むバリアントを生成すること）、かつ機能および発現への影響を監視して最適な置換を決定するために、抗体配列中の１つ以上の標的残基において実施され得る。場合によっては、残基をＣｙｓまたはＭｅｔで置換するか、またはこれらの残基を配列に導入することは、そうすることが、例えば、新しい分子内または分子間システイン－システイン結合の形成を通して、製造上の困難を引き起こす可能性があるため、望ましくない。リード候補が選択され、製造および臨床開発用に最適化されている場合、概して、その抗原結合特性を可能な限り変化させないか、または少なくとも親分子の親和性および効力を保持することが望ましいであろう。しかしながら、親和性、交差反応性、または中和効力などの重要な抗体特性を調節するために、バリアントを生成することもできる。

【0178】

本明細書に開示される抗体ＶＨまたはＶＬドメインのフレームワーク領域内で、１つ以上のアミノ酸変異が任意選択で行われてもよい。例えば、対応するヒト生殖細胞セグメント配列とは異なる１つ以上の残基が生殖細胞に戻され得る。本明細書の例示的な抗体のＶＨおよびＶＬドメインに対応するヒト生殖細胞遺伝子セグメント配列が、表Ｓ－１２に示される。

【0179】

二重特異性抗原結合分子において、抗原結合部位は、開示された抗ＦＩＸまたは抗ＦＸ抗体のうちのいずれかのＨおよび／またはＬ ＣＤＲのセットを含んでもよく、開示されたＨおよび／またはＬ ＣＤＲのセット内に１つ以上のアミノ酸変異を伴う。変異は、アミノ酸の置換、欠失、または挿入であってもよい。したがって、例えば、開示されたＨおよび／またはＬ ＣＤＲのセット内に１つ以上のアミノ酸置換があってもよい。例えば、Ｈおよび／またはＬ ＣＤＲのセット内に、最大１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個の変異、例えば置換があってもよい。例えば、ＨＣＤＲ３には最大６、５、４、３、または２個の変異、例えば置換、および／またはＬＣＤＲ３には最大６、５、４、３、または２個の変異、例えば置換があってもよい。

【0180】

抗体は、表に示されるように、ＶＨドメインと少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメイン、および／またはこれらの抗体のうちのいずれかのＶＬドメインと少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインを含んでもよい。２つのアミノ酸配列の同一性％を計算するために使用され得るアルゴリズムには、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、または例えば、デフォルトパラメーターを用いるスミス－ウォーターマンアルゴリズムが含まれる。特定のバリアントは、１つ以上のアミノ酸配列の改変（アミノ酸残基の付加、欠失、置換、および／または挿入）を含んでもよい。

【0181】

改変は、１つ以上のフレームワーク領域および／または１つ以上のＣＤＲで行われ得る。バリアントは任意選択で、ＣＤＲ変異誘発によって提供される。改変は通常、機能の損失をもたらさず、そのため、そのように改変されたアミノ酸配列を含む抗体は、その抗原に結合する能力を保持し得る。それは、例えば、本明細書に記載のアッセイで測定されるように、改変が行われない抗体と同じ定量的結合能力を保持し得る。そのように改変されたアミノ酸配列を含む抗体は、その抗原に結合する改善された能力を有し得る。

【0182】

改変は、１つ以上のアミノ酸残基を非天然型または非標準アミノ酸で置換すること、１つ以上のアミノ酸残基を非天然型または非標準形態に修飾すること、または１つ以上の非天然型もしくは非標準アミノ酸を配列に挿入することを含み得る。本発明の配列における改変の数および位置の例は、本明細書の他の箇所に記載されている。天然型アミノ酸には、それらの標準一文字コードによってＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅとして識別される、２０個の「標準」Ｌ－アミノ酸が含まれる。非標準アミノ酸には、ポリペプチド骨格に組み込まれるか、または既存のアミノ酸残基の修飾から生じる可能性のある任意の他の残基が含まれる。非標準アミノ酸は、天然型でも非天然型でもよい。

【0183】

本明細書で使用する「バリアント」という用語は、１つ以上のアミノ酸または核酸の欠失、置換、または付加による親ポリペプチドまたは核酸とは異なるが、親分子の１つ以上の特定の機能または生物学的活性を保持するペプチドまたは核酸を指す。アミノ酸置換は、アミノ酸が異なる天然型アミノ酸残基で置き換えられる改変を含む。そのような置換は「保存的」として分類され得、その場合、ポリペプチドに含まれるアミノ酸残基は、極性、側鎖機能性またはサイズのいずれかに関して類似の特徴を有する別の自然に発生するアミノ酸で置き換えられる。かかる保存的置換は、当該技術分野で周知である。本発明によって包含される置換はまた、「非保存的」であってもよく、ペプチド中に存在するアミノ酸残基が、異なるグループ由来の天然型アミノ酸等の異なる特性を有するアミノ酸で置換される（例えば、電荷または疎水性アミノ酸をアラニンで置換する）か、あるいは天然型アミノ酸が、特殊な非従来型アミノ酸で置換される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、保存的である。また、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して使用される場合、バリアントという用語内に包含されて、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して、それぞれ（例えば、野生型ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して）、１次、２次、または３次構造において変化し得るポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。

【0184】

いくつかの態様では、当該技術分野で周知の方法を使用して単離または生成された「合成バリアント」、「組換えバリアント」、または「化学的に修飾された」ポリヌクレオチドバリアントもしくはポリペプチドバリアントを使用することができる。「修飾されたバリアント」は、以下に記載されるように、保存的または非保存的アミノ酸変化を含むことができる。ポリヌクレオチドの変化は、参照配列によってコードされるポリペプチド中のアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、および切断をもたらすことができる。いくつかの態様は、例えば、ヒトタンパク質中で通常生じないオルニチンの挿入であるがこれに限定されない、バリアントの基盤であるペプチド配列中で通常生じない挿入バリアント、欠失バリアント、またはアミノ酸の置換を伴う置換バリアント（アミノ酸および他の分子の挿入および置換を含む）。「保存的置換」という用語は、ポリペプチドを説明する場合、ポリペプチドの活性を実質的に変化させないポリペプチドのアミノ酸組成の変化を指す。例えば、保存的置換は、同様の化学的性質（例えば、酸性、塩基性、正または負電荷、極性または非極性など）を有する異なるアミノ酸残基を、アミノ酸残基で置換することを指す。保存的アミノ酸置換は、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる置き換え、アスパラギン酸のグルタミン酸による置き換え、またはトレオニンのセリンによる置き換えを含む。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。例えば、以下の６つの群は、互いについて保存的置換であるアミノ酸を各々含有する：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。（参照によりその全体が組み込まれるＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）も参照されたい。）いくつかの実施形態では、１個のアミノ酸またはごく一部のアミノ酸を改変、付加、または欠失する個々の置換、欠失、または付加も、その変化がペプチドの活性を低減しない場合は「保存的置換」とみなされ得る。挿入または欠失は、典型的には、約１～５アミノ酸の範囲である。保存的アミノ酸の選択は、ペプチドにおける置換されるアミノ酸の位置、例えば、アミノ酸がペプチドの外側にあり溶媒に曝露するか、または内側にあり溶媒に曝露しないかに基づいて選択してもよい。

【0185】

既存のアミノ酸の位置（溶媒へのその曝露を含む）（すなわち、溶媒に曝露されていない内部局在アミノ酸と比較して、アミノ酸が溶媒に曝露されているか、またはペプチドもしくはポリペプチドの外側表面上に存在するか）に基づき、既存のアミノ酸を置換するアミノ酸を選択することができる。そのような保存的アミノ酸置換の選択は、例えば、Ｄｏｒｄｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ Ｂｉｏｌ，１９９９，２１７，７２１－７３９、およびＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９（１９８６）；２０５－２１８、およびＳ．Ｆｒｅｎｃｈ ａｎｄ Ｂ．Ｒｏｂｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１９（１９８３）１７１に記載されているように、当該分野においてよく知られている。したがって、タンパク質またはペプチドの外側のアミノ酸（すなわち、溶媒に曝露されたアミノ酸）に適した保存的アミノ酸置換を選択することができ、例えば、次の置換：ＹのＦによる置換、ＴのＳまたはＫによる置換、ＰのＡによる置換、ＥのＤまたはＱによる置換、ＮのＤまたはＧによる置換、ＲのＫによる置換、ＧのＮまたはＡによる置換、ＴのＳまたはＫによる置換、ＤのＮまたはＥによる置換、ＩのＬまたはＶによる置換、ＦのＹによる置換、ＳのＴまたはＡによる置換、ＲのＫによる置換、ＧのＮまたはＡによる置換、ＫのＲによる置換、ＡのＳ、Ｋ、またはＰによる置換が使用され得るが、これらに限定されない。

【0186】

代替の実施形態では、タンパク質またはペプチドの内側のアミノ酸に適した、包含される保存的アミノ酸置換を選択することもでき、例えば、タンパク質またはペプチドの内側にあるアミノ酸（すなわち、アミノ酸は溶媒に曝露されていない）の好適な保存的置換を使用することができ、例えば、次の保存的置換：ＹのＦによる置換、ＴのＡまたはＳによる置換、ＩのＬまたはＶによる置換、ＷのＹによる置換、ＭのＬによる置換、ＮのＤによる置換、ＧのＡによる置換、ＴはＡまたはＳによる置換、ＤのＮによる置換、ＩのＬまたはＶによる置換、ＦのＹまたはＬによる置換、ＳのＡまたはＴによる置換、およびＡのＳ、Ｇ、Ｔ、またはＶによる置換を使用することができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、非保存的アミノ酸置換もバリアントの用語に包含される。

【0187】

本発明は、本明細書の表に示される抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメインのＶＨおよび／またはＶＬドメインバリアントを含む、ポリペプチド結合アームを産生する方法を含む。バリアントＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合ポリペプチドアームは、
（ｉ）親抗体ＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入によって、親抗体ＶＨドメインのアミノ酸配列バリアントである抗体ＶＨドメインを提供することであって、
ここで、親抗体ＶＨドメインは、図２０に示されるＶＨドメイン、例えば、Ｎ１２８０Ｈであるか、またはこれらのＶＨドメインのいずれかの重鎖相補性決定領域を含むＶＨドメインである、提供することと、
（ｉｉ）任意選択で、そのように提供されたＶＨドメインをＶＬドメインと組み合わせて、ＶＨ／ＶＬの組み合わせを提供することと、
（ｉｉｉ）ＶＨドメインまたはそのように提供されたＶＨ／ＶＬドメインの組み合わせを試験して、１つ以上の所望の特性を有する抗体を同定することと、を含む方法によって産生され得る。

【0188】

ＶＨドメインは、その配列が表Ｓ－９Ａまたは図２０に示される任意のＶＨドメイン、または表Ｓ－９Ａまたは図２０に示されるＶＨドメインのＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）のセットを含む任意のＶＨドメインであってもよい。

【0189】

ＦＩＸａ結合ポリペプチドアーム、およびそれらを含む二重特異性抗ＦＩＸａ／ＦＸ結合分子の望ましい特性は、本明細書の他の箇所に詳述されている。例えば、この方法は、ＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインの組み合わせが本明細書に記載されるようにＦＩＸａに結合することを確認することを含んでもよい。

【0190】

ＶＬドメインがこの方法に含まれる場合、ＶＬドメインは、Ｎ０１２８Ｌ ＶＬドメインであってもよいか、またはＮ０１２８Ｌ ＶＬドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入によって提供されるバリアントであってもよいか、またはＮ０１２８Ｌ ＶＬドメインの軽鎖相補性決定領域を含むＶＬドメインであってもよい。ＶＬドメインは０３２５Ｌ ＶＬドメインであり得る。

【0191】

バリアント抗体を生成する方法は、任意選択で、抗体またはＶＨ／ＶＬドメインの組み合わせのコピーを産生することを含んでもよい。方法は、例えば、コード核酸の発現によって、ＦＩＸａ結合ポリペプチドアームを含む二重特異性抗体を産生することをさらに含んでもよい。宿主細胞における組換え発現を含む発現の好適な方法は、本明細書に詳細に記載されている。

【0192】

コード核酸および発現方法
本発明に従って、二重特異性抗原結合分子、例えば、二重特異性抗体をコードする単離された核酸が提供され得る。核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡであってもよい。合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせは、抗体をコードすることができる。

【0193】

本発明は、上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写、または発現カセットの形態の構築物を提供する。例示的なヌクレオチド配列は、表に含まれる。本明細書に記載されるヌクレオチド配列への言及は、文脈が他の意味を必要としない限り、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、ＴがＵに置換される特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。

【0194】

本発明はまた、抗原結合分子をコードする１つ以上の核酸を含む組換え宿主細胞を提供する。コードされた分子を産生する方法は、例えば、核酸を含む組換え宿主細胞を培養することによる、核酸からの発現を含んでもよい。二重特異性分子は、そのように得られ得、任意の好適な技術を使用して単離および／または精製され、次いで必要に応じて使用され得る。産生方法は、薬学的に許容される賦形剤などの少なくとも１つの追加の構成成分を含む組成物に、生成物を製剤化することを含んでもよい。

【0195】

様々な異なる宿主細胞中のポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は、よく知られている。好適な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、糸状菌、酵母、およびバキュロウイルス系、ならびにトランスジェニック植物および動物が含まれる。

【0196】

原核細胞中の抗体および抗体断片の発現は、当該技術分野において十分に確立されている。一般的な細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。培養中の真核細胞中の発現は、産生のための選択肢として当業者にも利用可能である。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野において利用可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞、ヒト胎児由来網膜細胞、他多数が含まれる。

【0197】

ベクターは、必要に応じてプロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を含む、適切な調節配列を含んでもよい。抗体をコードする核酸は、宿主細胞に導入され得る。核酸は、リン酸カルシウムのトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニアまたは昆虫細胞の場合はバキュロウイルスを使用した形質導入を含む、様々な方法によって真核細胞に導入され得る。宿主細胞、特に真核細胞への核酸の導入は、ウイルスまたはプラスミド系を使用してもよい。プラスミド系は、エピソーム的に維持されてもよいか、または宿主細胞もしくは人工染色体に組み込まれてもよい。組み込みは、単一または複数の遺伝子座において１つ以上のコピーのランダム統合または標的統合のいずれかによるものであり得る。細菌細胞の場合、好適な技術には、バクテリオファージを使用した塩化カルシウムの形質転換、エレクトロポレーション、およびトランスフェクションが含まれる。導入に続いて、例えば、遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養し、次いで任意選択で、抗体を単離または精製することによって、核酸を発現させてもよい。

【0198】

本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に統合されてもよい。標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を含むことによって、統合が促進され得る。二重特異性をコードする核酸は、宿主（例えば、ＣＨＯ）細胞のゲノムＤＮＡ、例えば、染色体ＤＮＡに統合され得、得られた組換え細胞は、二重特異性を発現するために培養され得る。細胞株開発プロセスは、二重特異性をコードする核酸を複数の宿主細胞に導入し、所望の収量（例えば、少なくとも０.５ｇ／Ｌまたは少なくとも１ｇ／Ｌ）で所望のレベル（例えば、少なくとも９５％のヘテロ二量体、および５％以下のホモ二量体汚染物質）の二重特異性抗体を発現する細胞株を選択することを含み得る。好ましくは、細胞株は、細胞培養において数世代にわたって安定した発現を保持し、したがって、例えば、少なくとも６０世代にわたってこれらのレベルの産生を維持し得る。

【0199】

本発明はまた、二重特異性抗原結合分子を発現させるために、発現系において本明細書に記載の核酸を使用することを含む方法を提供する。望ましくは、抗原結合分子は、初期発酵後の細胞上清中に少なくとも０.５ｇ／Ｌの収量で、好ましくは２ｇ／Ｌを超える収量で発現される。溶解度は、分子の著しい凝集または分解を伴わずに、１０ｍｇ／ｍＬ超、好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ超でなければならない。

【0200】

グローバルな治療に適した医薬品を提供するために、抗体は、例えば、少なくとも１００リットルまたは少なくとも２００リットル、例えば１００～２５０リットルの細胞培養容量で大規模に生産することができる。バッチ培養、特に流加培養は、現在、臨床的および商業的使用のための生物療法の製造に一般的に使用されており、そのような方法は、抗体を生成するために本発明において適切に使用されてもよく、その後、本明細書に記載の精製および製剤化工程が続く。バイオリアクターは、金属（例えば、ステンレス鋼）容器であり得るか、または単回使用のバイオリアクターであり得る。

【0201】

製剤および投与
本発明による二重特異性抗原結合分子（「二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｓ）」）、およびそれらをコードする核酸分子は、通常、単離された形態で提供される。二重特異性抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメイン、ならびに核酸は、それらの自然環境または産生環境から精製されて提供されてもよい。単離された抗原結合分子および単離された核酸は、それらがインビボで見られる他のポリペプチドもしくは核酸、またはそれらが調製され（例えば、細胞培養）、そのような調製がインビトロでの組換えＤＮＡ技術によるものである環境など、それらが自然に会合される材料を含まないか、または実質的に含まない。任意選択で、単離された抗原結合分子または核酸は、（１）それが通常見られる少なくともいくつかの他のタンパク質を含まないか、（２）同じ源からの、例えば、同じ種からの他のタンパク質を本質的に含まないか、（３）異なる種の細胞によって発現されるか、（４）ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または自然界でそれが会合される他の材料の少なくとも約５０％から単離されているか、（５）それが自然界で会合されていないポリペプチドと作動可能に会合されているか（共有結合もしくは非共有結合相互作用によって）、または（６）自然界で生じない。

【0202】

二重特異性抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーによって（例えば、細胞培養上清から）精製することができる。二重特異性抗体は、
コード核酸を含む培養宿主細胞からの２つの抗体重鎖および共通の軽鎖を発現させることと、
抗体重鎖および共通の軽鎖からアセンブルされた二重特異性抗体および単一特異性抗体を含む細胞培養物を取得することと、
（例えば、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して）細胞培養物から二重特異性抗体および単一特異性抗体を単離することと、
（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して）単一特異性抗体から二重特異性抗体を精製することと、を含む方法により生成することができる。

【0203】

二重特異性抗体またはそれらをコードする核酸は、希釈剤またはアジュバントとともに製剤化され、それでもなお実際の目的のために単離され得、例えばそれらは、免疫アッセイに使用するためのマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される場合、担体と混合されてもよく、療法に使用する場合、薬学的に許容される担体または希釈剤と混合されてもよい。本明細書の他の箇所に記載されるように、他の活性成分も治療調製物に含まれ得る。抗原結合分子は、生体内で自然に、またはＣＨＯ細胞などの異種真核細胞の系によってグリコシル化されてもよく、または（例えば、原核細胞での発現によって産生された場合）非グリコシル化されてもよい。本発明は、修飾グリコシル化パターンを有する抗体を包含する。

【0204】

典型的には、単離された生成物は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成する。二重特異性抗体は、その自然環境または産生環境に見られる、その治療、診断、予防、研究、または他の使用を妨げるタンパク質またはポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない可能性がある。

【0205】

本明細書の他の場所で論じられるように、二重特異性抗体に対する抗体の重鎖および軽鎖の発現は、活性なヘテロ二量体二重特異性抗体に加えて、望ましくないホモ二量体種（抗ＦＩＸおよび抗ＦＸ抗体）を生成する可能性がある。好ましくは、二重特異性は、ヘテロ二量体二重特異性抗体が全抗体の少なくとも９５％を占め、ホモ二量体抗体汚染物質が５％以下で存在する組成物で提供される。組成物は、少なくとも９８％または少なくとも９９％のヘテロ二量体二重特異性を含み得、ホモ二量体汚染物質は、それぞれ０～２％または０～１％を表す。

【0206】

本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体を含む治療組成物を提供する。そのような二重特異性抗体をコードする核酸を含む治療組成物も提供される。コード核酸は、本明細書の他の箇所でより詳細に記載され、ＤＮＡおよびＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを含む。本明細書に記載の治療方法において、二重特異性抗体をコードする核酸の使用、および／またはそのような核酸を含む細胞の使用は、二重特異性分子自体を含む組成物の代替手段として（またはそれに加えて）使用され得る。したがって、任意選択で核酸がゲノムに安定的に統合される、二重特異性抗体をコードする核酸を含む細胞は、患者における治療的使用のための薬剤を表す。二重特異性抗体をコードする核酸は、目的の患者に由来し、かつエクスビボで修飾されたヒト細胞に導入されてもよい。コード核酸を含む細胞の患者への投与は、二重特異性抗体を発現させることが可能な細胞のリザーバを提供し、これは、単離された核酸または単離された二重特異性分子の投与と比較して、より長期間にわたって治療的利益を提供し得る。二重特異性抗体をコードする核酸は、患者の細胞で核酸が発現され、遺伝性第ＶＩＩＩ因子欠乏症を補うなどの治療効果を提供するように、インビボで患者の細胞にコード核酸を導入することを含む遺伝子療法に使用するために提供され得る。

【0207】

組成物は、好適な担体、賦形剤、ならびに改善された移動、送達、耐性などを提供するために製剤に組み込まれる他の薬剤を含んでもよい。多数の適切な製剤は、すべての製薬化学者に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａで見ることができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（陽イオン性または陰イオン性）含有小胞（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴ（商標）など）、ＤＮＡ共役体、無水吸収ペースト、水中油および油中水乳剤、カーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。組成物は、医療注射緩衝液と組み合わせて、抗体または核酸を含んでもよい。

【0208】

二重特異性抗体またはそれらをコードする核酸は、患者への所望の投与経路のために、例えば、注射用の液体（任意選択で水溶液）中で製剤化されてもよい。注射用の二重特異性を製剤化するための例示的な緩衝液は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩酸アルギニン、０.０５％ｗ／ｖのポリソルベート８０、ｐＨ５.２の水溶液である。

【0209】

様々な送達システムが既知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、任意の便利な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮内層または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管膜など）を通した吸収によって投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は、全身または局所であり得る。抗原結合分子は、好ましくは、皮下注射によって投与される。

【0210】

医薬組成物はまた、小胞、特に、リポソーム中で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３－３６５；Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３１７－３２７を参照；概して同書を参照）。

【0211】

ある特定の状況では、医薬組成物は、制御放出システムで送達され得る。一実施形態では、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ，上記、Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用され得る。Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）を参照されたい。さらに別の実施形態では、放出制御系を組成物の標的の近傍に配置することができるので、したがって全身用量の一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８，１９８４を参照されたい）。

【0212】

注射用調製物は、静脈内、皮下、皮内および筋肉内注射、点滴注入等のための剤形を含み得る。これらの注射用調製物は公知の方法によって調製され得る。例えば、注射用調製物は、例えば、注射に従来使用されている滅菌水性媒体または油性媒体に上記の抗体またはその塩を溶解、懸濁、または乳化することによって調製され得る。注射用の水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコースおよび他の補助剤を含む等張液などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用されてもよい。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあり、これらは、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用されてもよい。そのように調製された注射液は、適切なアンプルに充填され得る。本発明の医薬組成物は、標準的な針および注射器で皮下または静脈内に送達され得る。治療は、診療所での使用に限定されないことが想定される。したがって、無針デバイスを使用した皮下注射も有利である。皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の医薬組成物の送達に容易に応用が利く。そのようなペン送達デバイスは、再利用可能または使い捨てであり得る。再利用可能なペン型送達デバイスは、一般に、医薬組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内のすべての医薬組成物が投与され、カートリッジが空になったら、空のカートリッジを容易に廃棄して、医薬組成物を含む新しいカートリッジと交換することができる。その後、ペン型送達デバイスを再利用することができる。使い捨てペン型送達デバイスには、交換可能なカートリッジがない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、デバイス内のリザーバに保持された医薬組成物が事前に充填されている。いったん医薬組成物がなくなりリザーバが空になると、デバイス全体が廃棄される。多数の再利用可能なペンおよび自動注射器送達デバイスが、本発明の医薬組成物の皮下送達に応用が利く。例としては、ほんの数例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）、ＯＰＴＩＰＥＮＴ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、ならびにＯＰＴＩＣＬＩＫＴ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、もちろんこれらに限定されない。本発明の医薬組成物の皮下送達における用途を有する使い捨てペン型送達デバイスの例には、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）が含まれるが、確実にそれらに限定されない。

【0213】

有利に、上記の経口または非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合するのに適した単位用量で剤形に調製される。単位用量のそのような剤形としては、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射液（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含まれる該（ａｆｏｒｅｓａｉｄ）抗体の量は、概して、単位用量の剤形当たり約５～約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、該抗体は、約５～約１００ｍｇで、他の剤形では約１０～約２５０ｍｇで含まれてもよい。

【0214】

二重特異性抗体、核酸、またはそれを含む組成物は、薬瓶、注射器、ＩＶ容器、または注射デバイスなどの医療用容器に含まれてもよい。一例では、二重特異性抗体、核酸、または組成物は、インビトロであり、滅菌容器内にあってもよい。一例では、本明細書に記載されるような治療方法で使用するための二重特異性抗体、パッケージング、および説明書を含むキットが提供される。

【0215】

本発明の一態様は、本発明の二重特異性抗体または核酸と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物であり、その例は、上に列挙されている。「薬学的に許容される」とは、ＵＳＡ Ｆｅｄｅｒａｌもしくは州政府の規制機関によって承認されたか、または承認見込みのもの、またはＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａもしくはヒトを含む動物での使用が一般的に認められている薬局方に列挙されたものを指す。薬学的に許容される担体、賦形剤、またはアジュバントは、二重特異性薬剤、例えば、本明細書に記載の任意の抗体またはポリペプチド分子と一緒に患者に投与され得、治療量の薬剤を送達するのに十分な用量で投与された場合に、その薬理活性を破壊せず、無毒である。

【0216】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、本発明による組成物中の唯一の活性成分である。したがって、組成物は、抗体から構成されてもよいか、または１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに二重特異性抗体から構成されてもよい。しかしながら、本発明による組成物は任意選択で、１つ以上の追加の活性成分を含む。

【0217】

必要に応じて（例えば、急性出血の管理のために）、二重特異性は、組換え第ＶＩＩＩ因子（例えば、ツロクトコグアルファ）または組換え第ＶＩＩａ因子（例えば、エプタコグアルファ）を含む血友病の他の１つ以上の治療と組み合わせることができる。本明細書に記載の二重特異性抗体の機能特性および安全性プロファイルは、そのようなさらなる治療薬とのそれらの安全な組み合わせに適していると考えられている。二重特異性は、組換え因子Ｖａ（ＦＶａ）、例えば、ＵＳ１０４０７４８８に記載されているような活性化バリアントＦＶａと組み合わせることができる。

【0218】

本発明による二重特異性抗体または核酸とともに投与することが望ましくあり得る他の治療薬には、鎮痛薬が含まれる。そのような薬剤または薬剤の組み合わせは、組み合わせ調製物であるか別個の調製物であるかにかかわらず、本発明による抗体または核酸と組み合わせて投与され得るか、またはそれらとの組成物として提供され得る。本発明による二重特異性抗体または核酸は、言及されたものなどの別の治療薬（複数可）とともに、別々に、順次に、または並行して、かつ任意選択で組み合わせ調製物として投与されてもよい。

【0219】

複数の組成物が別々または同時に投与され得る。別々の投与とは、異なる時間、例えば、少なくとも１０、２０、３０、もしくは１０～６０分間隔で、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２時間間隔で投与される２つの組成物を指す。組成物を２４時間間隔で、またはさらにより長い間隔で投与することもできる。あるいは、２つ以上の組成物が、例えば１０分未満または５分未満の間隔で同時に投与され得る。同時に投与される組成物は、いくつかの態様では、構成成分の各々の同様のまたは異なる徐放機構の有無にかかわらず、混合物として投与され得る。

【0220】

二重特異性抗体およびそれらをコードする核酸は、治療薬として使用され得る。本明細書の患者は、概して哺乳動物、典型的にはヒトである。二重特異性抗体または核酸は、例えば、本明細書で言及される任意の投与経路によって哺乳動物に投与され得る。

【0221】

投与は通常、「治療的有効量」であり、これは、投与される目的の所望の効果を生じ、患者に利益を示すのに十分な量である。正確な量は、治療の目的によって決まり、既知の技術を使用して当業者によって確認可能である（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。治療の処方、例えば、投与量の決定などは、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、治療されている症状の重症度および／または疾患の進行によって決まり得る。二重特異性抗体または核酸の治療的有効量または好適な用量は、動物モデルにおけるそのインビトロ活性およびインビボ活性を比較することによって決定され得る。マウスおよび他の試験動物における有効投与量をヒトに外挿するための方法は、知られている。

【0222】

二重特異性抗体は、用量毎に以下の範囲のうちの１つの量で投与され得る：
約１０μｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、
約５０μｇ／ｋｇ体重～約５ｍｇ／ｋｇ体重、
約１００μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重、
約１００μｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、
約０.５ｍｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、または
約５ｍｇ／ｋｇ体重以下、例えば、４未満、３未満、２未満、または１ｍｇ／ｋｇ未満の抗体。

【0223】

投与される抗原結合分子の用量は、最大１ｍｇ／ｋｇであってもよい。それは、例えば３０～１５０ｍｇ／ｍＬなど、小児集団に対してはより低い強度で製剤化され得る。二重特異性分子は、小児集団に対してはより少量でパッケージ化されてもよく、例えば、２５～７５ｍｇ、例えば３０～６０ｍｇの薬瓶で提供されてもよい。

【0224】

本明細書に記載の治療方法では、１回以上の用量が投与されてもよい。場合によっては、長期的な利益を達成するために単一用量が有効である場合がある。したがって、方法は、単一用量の二重特異性抗体、それをコードする核酸、または組成物を投与することを含んでもよい。あるいは、通常は順次に、かつ数日、数週間、または数か月の期間を空けて複数回用量が投与されてもよい。任意選択で、二重特異性抗体は、月に１回、またはより少ない頻度で、例えば２か月毎または３か月毎に患者に投与されてもよい。

【0225】

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、「治療すること」、または「改善」という用語は、治療的処置を指し、その目的は、疾患または障害に関連する状態の進行または重症度を逆にする、軽減する、改善する、阻止する、遅らせる、または停止することである。「治療すること」という用語は、状態、疾患、または障害の少なくとも１つの有害効果または症状を低減または軽減することを含む。１つ以上の症状または臨床マーカーが低減された場合、治療は概して、「有効」である。あるいは、疾患の進行が低減されたか、または食い止められた場合、治療は、「有効」である。つまり、「治療」には、症状またはマーカーの改善だけではなく、治療がない場合に予想される症状と比較して、症状の停止または少なくとも進行もしくは悪化の減速も含まれる。有益なまたは所望の臨床結果としては、１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の進行の遅延もしくは減速、病的状態の改善もしくは緩和、寛解（部分的もしくは全体的にかかわらず）、および／または死亡率の減少（検出可能もしくは検出不能にかかわらず）が挙げられるが、これらに限定されない。疾患の「治療」という用語には、疾患の症状または副作用の緩和を提供すること（緩和療法を含む）も含まれる。治療が有効であるためには、完全な治癒は企図されない。方法は、ある特定の側面では治癒も含むことができる。本発明の文脈において、治療は、予防的処置であってもよい。

【0226】

長い半減期は、本発明の二重特異性抗体において望ましい特徴である。半減期の延長は、血流中の分子の治療有効濃度を維持するために必要とされる注射回数がより少なくなり、より頻度の低い投与につながる。ヒトにおける本発明の抗原結合分子のインビボ半減期は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１日、またはより長くあり得る。カニクイザルなどの非ヒト霊長類における抗原結合分子のインビボ半減期は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１日、またはより長くあり得る。

【0227】

血友病の予防的使用には、正常なＦＶＩＩＩ活性の１％を維持することが最低限であると考えられている［１］。ＡＣＥ９１０（エミシズマブ）を用いたヒトの臨床試験を報告した論文では、インシリコ集団薬物動態モデリングおよびシミュレーションにより、１ｍｇ／ｋｇの週用量が少なくとも約３００ｎＭ（４５μｇ／ｍｌ）の血漿濃度をもたらし、通常のＦＶＩＩＩ活性の少なくとも１０％の継続的な止血効果を生じることを示唆した［４］。この用量はまた、患者において十分に許容されることが報告された。

【0228】

そのデータに基づくと、約３０ｎＭ（約４.５μｇ／ｍｌ）～３００ｎＭ（約４５μｇ／ｍｌ）の血漿濃度範囲は、１～１０％の効果的なＦＶＩＩＩ活性に対応しており、抗体濃度とＦＶＩＩＩ活性および同等の抗体活性との線形の関係性が推定される。

【0229】

本発明による二重特異性は、３０ｎＭ（約４.５μｇ／ｍｌ）～３００ｎＭ（約４５μｇ／ｍｌ）の範囲の濃度で非常に高い活性を示し、比較的低用量でさえ強いトロンビン生成活性を維持する。その高い効力によって証明されるように（例えば、実施例１４を参照されたい）、本発明による二重特異性抗体は、エミシズマブよりも低い血漿濃度で治療効果を示し得る。したがって、それは、エミシズマブと比較して、同等の用量でより大きな治療効果を提供する可能性があり、より低い用量で同等の治療効果を提供する可能性がある。したがって、患者は、より少量の、および／またはより少ない頻度の注射から利益を得ることができ、医療提供者は、より低い関連費用から利益を得ることができる。

【0230】

米国ＦＤＡは現在（２０１８年１０月に発行されたガイダンスで）、エミシズマブを最初の４週間は週に１回、３ｍｇ／ｋｇの負荷用量で皮下注射し、その後、
週に１回、１.５ｍｇ／ｋｇ、または
２週間に１回、３ｍｇ／ｋｇ、または
４週間に１回、６ｍｇ／ｋｇの維持用量を続けることを推奨している。

【0231】

本発明による抗原結合分子は、１週間、２週間、３週間、４週間、または１か月の一定間隔で投与するために提供されてもよい。

【0232】

好ましい一実施形態では、二重特異性は、皮下注射によって投与される。

【0233】

治療的使用
本発明の二重特異性抗原結合分子は、療法によるヒトまたは動物の身体の治療方法で使用され得る。分子の治療指標は、以下を含む。
血友病Ａの治療に使用する、
遺伝性第ＶＩＩＩ因子欠乏症の治療に使用する、
血友病Ａ患者における出血インシデントの数の大幅な減少のために使用する、
第ＶＩＩＩ因子機能の代わりになるために使用する、
および／または
血液凝固の促進のために使用する。

【0234】

患者は典型的には、ヒト患者である。患者は、血友病Ａもしくは遺伝性第ＶＩＩＩ因子欠乏症と診断されたヒト、または野生型と比較して第ＶＩＩＩ因子の発現もしくは活性が低い（またはない）ヒトであってもよい。患者は、小児患者（例えば、２歳～１８歳未満）であっても、または成人であってもよい。患者はヒトの男性である可能性がある。患者は、第ＶＩＩＩ因子に対する阻害剤を有していても、有していなくてもよい。

【0235】

本発明の二重特異性分子、またはそのような二重特異性分子もしくはそれをコードする核酸を含む組成物は、任意のそのような方法で使用するために使用または提供され得る。任意のそのような方法で使用するための薬剤の製造のための、二重特異性分子、またはそれもしくはそれをコードする核酸を含む組成物の使用も想定される。方法は典型的には、抗体または組成物を哺乳動物、例えば、ヒト患者に投与することを含む。好適な製剤および投与方法は、本明細書の他の箇所に記載されている。

【0236】

ＦＶＩＩＩに対する阻害同種抗体を発生させる血友病Ａ患者の治療に対して、現在満たされていないニーズがある。本発明の抗原結合分子は、そのような患者での使用に適している。したがって、いくつかの態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子で治療された患者は、血流中の阻害抗体の存在により、ＦＶＩＩＩでの治療に耐性がある可能性がある。治療に対する耐性は、治療の有効性の低減に現れ得る。そのような耐性は、患者からの血漿試料を用いたインビトロアッセイ（例えば、ａＰＴＴアッセイ）において検出され得、治療分子は、対照ＦＶＩＩＩ欠乏血漿を用いたアッセイと同じレベルまで凝固時間を短縮しない（後者は、治療分子に対する阻害抗体を欠いている）。

【0237】

ＦＩＸａおよびＦＸに対する二重特異性抗体など、血友病の他の治療を受けている患者も、それらの治療抗体に対する阻害抗体を発生させる可能性がある。述べられたように、本発明のようなヒト抗体の使用は、このリスクを最小限に抑えるべきであるが、それにもかかわらず、本発明の抗原結合分子またはＦＩＸａおよびＦＸに対する他の二重特異性抗原結合分子を受けている一部の患者において、阻害抗体が生成される可能性がある。本発明による二重特異性抗原結合分子で治療された患者は、血流中の阻害抗体の存在により、ＦＩＸａおよびＦＸに対する異なる二重特異性抗原結合分子に対する治療に耐性がある可能性がある。患者は、エミシズマブによる治療に耐性がある可能性がある。

【0238】

阻害抗体が製剤の長期治療投与を通して生成される可能性があるため、患者が複数の異なる治療を交互に受け、循環して、阻害抗体を発生させるリスクを低減することが有益であり得る。したがって、本発明の二重特異性抗原結合分子は、患者が阻害抗体を（まだ）発生させていない場合でさえ、異なるＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物、例えば、ＦＩＸａおよびＦＸに対する二重特異性抗原結合分子、任意選択でエミシズマブによる治療を以前に受けた患者に投与され得る。同様に、エミシズマブもしくはＦＩＸａおよびＦＸに対する他の二重特異性抗原結合分子、または他のＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物は、概して、本発明の二重特異性抗原結合分子ですでに治療された患者に投与され得る。治療レジメンは、第１の期間（例えば、１～６か月間または６か月～１年）にわたって第１のＦＶＩＩＩ活性に取って代わるポリペプチド薬物を投与すること、続いて第２の期間（例えば、１～６か月間または６か月～１年）にわたって異なるＦＶＩＩＩ活性に取って代わるポリペプチド薬物に切り替えること、続いて第１の薬物に再び切り替えること、またはさらに別のＦＶＩＩＩ活性に取って代わるポリペプチド薬物に切り替えることを含んでもよい。異なる薬物治療の異なるアミノ酸配列は、ある薬物に対する阻害抗体を発生させるリスクのある患者が、異なる薬物（例えば、本発明の分子）に切り替えた後にもはや第１の薬物（例えば、エミシズマブ）に対する阻害抗体を発生させるリスクがないことを確実にするべきである。循環期間は、患者および医師の利便性および選好に応じて、変更または短縮されてもよい。

【0239】

コード核酸の投与が代替療法を表し、ポリペプチド薬物を直接投与する代わりに実施され得ることが認識されるであろう。

【0240】

述べられたように、本発明の二重特異性抗原結合分子は、過敏症反応、同種抗体の発生、臓器毒性、または療法の中止につながるその他の有害事象のインシデントがない（または最小限である）ことに関連する、強力な安全性プロファイルを有すると考えられる。

【0241】

項目
以下の番号付きの項は、本発明の実施形態を表し、本記載の一部である。

【0242】

１．ＦＩＸａおよびＦＸに結合し、ＦＩＸａを介したＦＸの活性化を触媒する二重特異性抗体であって、この抗体が、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対を含み、
第１の重鎖－軽鎖対は、第１のＶＬドメインと対になった第１のＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含み、
第２の重鎖－軽鎖対は、第２のＶＬドメインと対になった第２のＶＨドメインを含むＦＸ結合性Ｆｖ領域を含み、
第１のＶＨドメインが、ＨＣＤＲ１は配列番号４０６であり、ＨＣＤＲ２は配列番号４０７であり、ＨＣＤＲ３は配列番号４０８であると定義されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含むＨＣＤＲのセットを含み、および/または第１のＶＨドメインが、アミノ酸配列レベルでＮ１２８０Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９５％同一であり、
第２のＶＨドメインが、アミノ酸配列レベルでＴ０２０１Ｈ ＶＨドメイン、配列番号４７０と少なくとも９５％同一であり、
第１のＶＬドメインおよび第２のＶＬドメインが、各々、ＬＣＤＲ１は配列番号６であり、ＬＣＤＲ２は配列番号７であり、ＬＣＤＲ３は配列番号８であると定義されたアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含むＬＣＤＲのセットを含み、および/または第１のＶＬドメインおよび第２のＶＬドメインが、アミノ酸配列レベルで配列番号１０の０１２８Ｌ ＶＬドメインと少なくとも９５％同一である、二重特異性抗体。

【0243】

２．ＦＩＸａおよびＦＸに結合し、ＦＩＸａを介したＦＸの活性化を触媒する二重特異性抗体であって、この抗体が、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対を含み、
第１の重鎖－軽鎖対は、第１のＶＬドメインと対になった第１のＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含み、
第２の重鎖－軽鎖対は、第２のＶＬドメインと対になった第２のＶＨドメインを含むＦＸ結合性Ｆｖ領域を含み、
第１のＶＨドメインが、免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換え産物であり、ｖ遺伝子セグメントが、ＩＧＨＶ３－７（例えば、ＶＨ３－７＊０１）であり、ｊ遺伝子セグメントが、ＩＧＨＪ６（例えば、ＪＨ６＊０２）であり、
第２のＶＨドメインが、免疫グロブリン重鎖ｖ、ｄ、およびｊ遺伝子セグメントの組換え産物であり、ｖ遺伝子セグメントが、ＩＧＨＶ１－４６（例えば、ＶＨ１－４６＊０３）であり、ｊ遺伝子セグメントが、ＩＧＨＪ１（例えば、ＪＨ１＊０１）であり、任意選択で、ｄ遺伝子セグメントが、ＩＧＨＤ６－６（例えば、ＤＨ６－６＊０１）であり、
第１のＶＬドメインおよび第２のＶＬドメインが、共に、ヒト免疫グロブリン軽鎖ｖおよびｊ遺伝子セグメントの組換え産物であり、ｖ遺伝子セグメントが、ＩＧＬＶ３－２１（例えば、ＶＬ３－２１＊ｄ０１）であり、ｊ遺伝子セグメントが、ＩＧＬＪ２（例えば、ＪＬ２＊０１）またはＩＧＬＪ３（例えば、ＪＬ３＊０２）である、二重特異性抗体。

【0244】

３．ＦＩＸａおよびＦＸに結合し、ＦＩＸａを介したＦＸの活性化を触媒する二重特異性抗体であって、この抗体が、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対を含み、
第１の重鎖－軽鎖対は、第１のＶＬドメインと対になった第１のＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含み、
第２の重鎖－軽鎖対は、第２のＶＬドメインと対になった第２のＶＨドメインを含むＦＸ結合性Ｆｖ領域を含み、
第１のＶＨドメインが、配列番号４４３のＮ１２８０Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、
第２のＶＨドメインが、配列番号４７０のＴ０２０１Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、
第１のＶＬドメインおよび第２のＶＬドメインが各々、配列番号１０の０１２８Ｌ ＶＬドメインと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、二重特異性抗体。

【0245】

４．第１のＶＨドメインが、ＨＣＤＲ１は配列番号４０６であり、ＨＣＤＲ２は配列番号４０７であり、ＨＣＤＲ３は配列番号４０８であると定義されたアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含むＨＣＤＲのセットを含む、第１～３項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0246】

５．第１のＶＨドメインが、配列番号４４１のＨＣＤＲ１を含む、第４項に記載の二重特異性抗体。

【0247】

６．第１のＶＨドメインが、配列番号６３４のＨＣＤＲ２を含む、第４項または第５項に記載の二重特異性抗体。

【0248】

７．第１のＶＨドメインが、配列番号４３６のＨＣＤＲ２を含む、第４～６項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0249】

８．第１のＶＨドメインが、配列番号６３５のＨＣＤＲ３を含む、第４～７項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0250】

９．第１のＶＨドメインが、配列番号４３３のＨＣＤＲ３を含む、第４～８項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0251】

１０．第１のＶＨドメインが、Ｎ１２８０Ｈと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、第１～９項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0252】

１１．第１のＶＨドメインが、配列番号４４１のＮ１２８０Ｈ ＨＣＤＲ１、配列番号４３６のＮ１２８０Ｈ ＨＣＤＲ２、および配列番号４３３のＮ１２８０Ｈ ＨＣＤＲ３を含むＮ１２８０Ｈ ＨＣＤＲのセットを含む、第１～１０項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0253】

１２．第１のＶＨドメインが、配列番号４４３のＮ１２８０Ｈ ＶＨドメインである、第１０項または第１１項に記載の二重特異性抗体。

【0254】

１３．第１のＶＨドメインが、配列番号４５４のＮ１４５４Ｈ ＶＨドメインである、第１～１１項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0255】

１４．第１のＶＨドメインが、配列番号４５６のＮ１４４１Ｈ ＶＨドメインである、第１～１１項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0256】

１５．第１のＶＨドメインが、配列番号４５８のＮ１４４２Ｈ ＶＨドメインである、第１～１１項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0257】

１６．第１のＶＨドメインが、Ｎ１３３３Ｈと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、第１～３項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0258】

１７．第１のＶＨドメインが、Ｎ１３３３Ｈ ＣＤＲ１、Ｎ１３３３Ｈ ＣＤＲ２、およびＮ１３３３Ｈ ＣＤＲ３を含むＮ１３３３Ｈ ＣＤＲのセットを含む、第１６項に記載の二重特異性抗体。

【0259】

１８．第１のＶＨドメインが、Ｎ１３３３Ｈ ＶＨドメインである、第１６項または第１７項に記載の二重特異性抗体。

【0260】

１９．第１のＶＨドメインが、Ｎ１３２７Ｈと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、第１～３項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0261】

２０．第１のＶＨドメインが、Ｎ１３２７Ｈ ＨＣＤＲ１、Ｎ１３２７Ｈ ＨＣＤＲ２、およびＮ１３２７Ｈ ＨＣＤＲ３を含むＮ１３２７Ｈ ＨＣＤＲのセットを含む、第１９項に記載の二重特異性抗体。

【0262】

２１．第１のＶＨドメインが、Ｎ１３２７Ｈ ＶＨドメインである、第１９項または第２０項に記載の二重特異性抗体。

【0263】

２２．第１のＶＨドメインが、Ｎ１３１４Ｈと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、第１～３項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0264】

２３．第１のＶＨドメインが、Ｎ１３１４Ｈ ＨＣＤＲ１、Ｎ１３１４Ｈ ＨＣＤＲ２、およびＮ１３１４Ｈ ＨＣＤＲ３を含むＮ１３１４Ｈ ＨＣＤＲのセットを含む、第２２項に記載の二重特異性抗体。

【0265】

２４．第１のＶＨドメインが、Ｎ１３１４Ｈ ＶＨドメインである、第２２項または第２３項に記載の二重特異性抗体。

【0266】

２５．第１のＶＨドメインが、Ｎ１１７２Ｈと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、第１～３項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0267】

２６．第１のＶＨドメインが、Ｎ１１７２Ｈ ＨＣＤＲ１、Ｎ１１７２Ｈ ＨＣＤＲ２、およびＮ１１７２Ｈ ＨＣＤＲ３を含むＮ１１７２Ｈ ＨＣＤＲのセットを含む、第２５項に記載の二重特異性抗体。

【0268】

２７．第１のＶＨドメインが、Ｎ１１７２Ｈ ＶＨドメインである、第２５項または第２６項に記載の二重特異性抗体。

【0269】

２８．第１のＶＨドメインが、Ｎ１０９１Ｈと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、第１～３項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0270】

２９．第１のＶＨドメインが、Ｎ１０９１Ｈ ＨＣＤＲ１、Ｎ１０９１Ｈ ＨＣＤＲ２、およびＮ１０９１Ｈ ＨＣＤＲ３を含むＮ１０９１Ｈ ＨＣＤＲのセットを含む、第２８項に記載の二重特異性抗体。

【0271】

３０．第１のＶＨドメインが、Ｎ１０９１Ｈ ＶＨドメインである、第２８項または第２９項に記載の二重特異性抗体。

【0272】

３１．第１のＶＨドメインが、Ｎ０５１１Ｈと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、第１～３項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0273】

３２．第１のＶＨドメインが、Ｎ０５１１Ｈ ＨＣＤＲ１、Ｎ０５１１Ｈ ＨＣＤＲ２、およびＮ０５１１Ｈ ＨＣＤＲ３を含むＮ０５１１Ｈ ＨＣＤＲのセットを含む、第３１項に記載の二重特異性抗体。

【0274】

３３．第１のＶＨドメインが、Ｎ０５１１Ｈ ＶＨドメインである、第３１項または第３２項に記載の二重特異性抗体。

【0275】

３４．第１のＶＨドメインが、Ｎ０４３６Ｈと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、第１～３項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0276】

３５．第１のＶＨドメインが、Ｎ０４３６Ｈ ＨＣＤＲ１、Ｎ０４３６Ｈ ＨＣＤＲ２、およびＮ０４３６Ｈ ＨＣＤＲ３を含むＮ０４３６Ｈ ＨＣＤＲのセットを含む、第３４項に記載の二重特異性抗体。

【0277】

３６．第１のＶＨドメインが、Ｎ０４３６Ｈ ＶＨドメインである、第３４項または第３５項に記載の二重特異性抗体。

【0278】

３７．第２のＶＨドメインが、配列番号４７０のＴ０２０１Ｈ ＶＨと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、第１～３６項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0279】

３８．第２のＶＨドメインが、配列番号４６２のＴ０２０１Ｈ ＨＣＤＲ１であるＨＣＤＲ１、配列番号４６７のＴ０２０１Ｈ ＨＣＤＲ２であるＨＣＤＲ２、および／または配列番号４６８のＴ０２０１Ｈ ＨＣＤＲ３であるＨＣＤＲ３を含む、第３７項に記載の二重特異性抗体。

【0280】

３９．第２のＶＨドメインが、配列番号６３６のＨＣＤＲ１を含む、第１～３８項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0281】

４０．第２のＶＨドメインが、配列番号５９８のＨＣＤＲ１を含む、第３９項に記載の二重特異性抗体。

【0282】

４１．第２のＶＨドメインが、配列番号４６７のＨＣＤＲ２を含む、第１～４０項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0283】

４２．第２のＶＨドメインが、配列番号６３７のＨＣＤＲ３を含む、第１～４１項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0284】

４３．第２のＶＨドメインが、配列番号６３８のＨＣＤＲ３を含む、第４２項に記載の二重特異性抗体。

【0285】

４４．第２のＶＨドメインが、配列番号６３９のＨＣＤＲ３を含む、第４３項に記載の二重特異性抗体。

【0286】

４５．第２のＶＨドメインが、配列番号５６５のＨＣＤＲ３を含む、第４４項に記載の二重特異性抗体。

【0287】

４６．第２のＶＨドメインが、配列番号５８３のＨＣＤＲ３を含む、第４４項に記載の二重特異性抗体。

【0288】

４７．第２のＶＨドメインが、配列番号６３２を含む、第３７～４５項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0289】

４８．第２のＶＨドメインが、配列番号６００を含む、第３７～４５項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0290】

４９．第２のＶＨドメインが、配列番号５８５を含む、第３７～４６項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0291】

５０．第２のＶＨドメインが、Ｔ０２０１Ｈ ＨＣＤＲ１、Ｔ０２０１Ｈ ＨＣＤＲ２、およびＴ０２０１Ｈ ＨＣＤＲ３を含むＴ０２０１Ｈ ＨＣＤＲのセットを含む、第３８項に記載の二重特異性抗体。

【0292】

５１．第２のＶＨドメインが、任意選択でＣｙｓ１１４での置換を伴うＴ０２０１Ｈ ＶＨドメインである、第３７項、第３８項、または第５０項に記載の二重特異性抗体。

【0293】

５２．Ｃｙｓ１１４での置換が、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、ＶａｌまたはＴｒｐである、第５１項に記載の二重特異性抗体。

【0294】

５３．第２のＶＨドメインが、Ｔ０６３８Ｈ ＨＣＤＲ１、Ｔ０６３８Ｈ ＨＣＤＲ２、およびＴ０６３８Ｈ ＨＣＤＲ３を含むＴ０６３８Ｈ ＨＣＤＲのセットを含む、第１～３８項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0295】

５４．第２のＶＨドメインが、任意選択でＣｙｓ１１４での置換を伴うＴ０６３８ ＶＨドメインである、第５３項に記載の二重特異性抗体。

【0296】

５５．Ｃｙｓ１１４での置換が、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、ＶａｌまたはＴｒｐである、第５４項に記載の二重特異性抗体。

【0297】

５６．第１のＶＬドメインおよび第２のＶＬドメインが各々、配列番号１０の０１２８Ｌと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、第１～５５項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0298】

５７．第１のＶＬドメインおよび第２のＶＬドメインは各々、配列番号６の０１２８Ｌ ＬＣＤＲ１、配列番号７の０１２８Ｌ ＬＣＤＲ２、および配列番号８の０１２８Ｌ ＬＣＤＲ３を含む０１２８Ｌ ＣＤＲのセットを含む、第１～５６項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0299】

５８．第１のＶＬドメインおよび第２のＶＬドメインが、アミノ酸配列において同一である、第１～５７項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0300】

５９．第１のＶＬドメインおよび第２のＶＬドメインが、配列番号４１６の０３２５Ｌアミノ酸配列を含む、第５８項に記載の二重特異性抗体。

【0301】

６０．第１のＶＬドメインおよび第２のＶＬドメインが、配列番号１０の０１２８Ｌアミノ酸配列を含む、第５８項または第５９項に記載の二重特異性抗体。

【0302】

６１．各重鎖－軽鎖対が、ＣＨ１ドメインと対になったＣＬ定常ドメインをさらに含む、第１～６０項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0303】

６２．重鎖－軽鎖対が共通の軽鎖を含む、第１～６１項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0304】

６３．共通の軽鎖が０１２８Ｌ軽鎖の配列番号１４６のＣＬアミノ酸配列を含む、第６２項に記載の二重特異性抗体。

【0305】

６４．共通の軽鎖が、配列番号４１４の０３２５Ｌ軽鎖である、第６３項に記載の二重特異性抗体。

【0306】

６５．共通の軽鎖が、配列番号４０５の０１２８Ｌ軽鎖である、第６３項に記載の二重特異性抗体。

【0307】

６６．各重鎖－軽鎖の重鎖が重鎖定常領域を含み、第１および第２の重鎖－軽鎖対が会合して、重鎖定常領域の二量体化を介して四量体免疫グロブリンを形成する、第１～６５項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0308】

６７．第１の重鎖－軽鎖対の重鎖定常領域が、第２の重鎖－軽鎖対の重鎖定常領域とは異なるアミノ酸配列を含み、異なるアミノ酸配列が、重鎖定常領域のヘテロ二量体化を促進するように操作される、第６６項に記載の二重特異性抗体。

【0309】

６８．重鎖定常領域が、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）変異または電荷対変異を含む、第６７項に記載の二重特異性抗体。

【0310】

６９．一方（例えば、第１）の重鎖－軽鎖対の重鎖定常領域が、置換Ｋ４３９Ｅを含むヒトＩｇＧ４定常領域であり、他方（例えば、第２）の重鎖－軽鎖対の重鎖定常領域が、置換Ｅ３５６Ｋを含むＩｇＧ４領域であり、定常領域の番号付けが、ＥＵ番号付けシステムに従うものである、第６７項に記載の二重特異性抗体。

【0311】

７０．一方または両方の重鎖－軽鎖対の重鎖定常領域が、置換Ｓ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４定常領域であり、定常領域の番号付けが、ＥＵ番号付けシステムに従うものである、第６６～６９項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0312】

７１．一方（例えば、第１）の重鎖－軽鎖対の重鎖定常領域が、配列番号４０９を含み、他方（例えば、第２）の重鎖－軽鎖対の重鎖定常領域が、配列番号４１０を含む、第６６～７０項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0313】

７２．
第１のＶＨドメインの配列番号４４３または配列番号４５６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
第２のＶＨドメインの配列番号６３２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
ＶＬドメインの配列番号４１６のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、を含む、第６６～７１項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0314】

７３．
配列番号４１９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
配列番号４２１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
配列番号４１４のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、を含む、第６６～７２項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0315】

７４．
配列番号４２４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と
配列番号４２１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
配列番号４１４のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、を含む、第６６～７１項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0316】

７５．
配列番号４２６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と
配列番号４２１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
配列番号４１４のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、を含む、第６６～７２項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0317】

７６．
配列番号４２８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と
配列番号４３０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
配列番号４１４のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、を含む、第６６～７１項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0318】

７７．
配列番号４２８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と
配列番号４３２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
配列番号４１４のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、を含む、第６６～７１項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0319】

７８．第１の重鎖－軽鎖対の重鎖定常領域が、第２の重鎖－軽鎖対の重鎖定常領域と同一である、第６６項に記載の二重特異性抗体。

【0320】

７９．抗体が、ヒトＩｇＧである、第１～６８項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0321】

８０．抗体が、ヒトＩｇＧ４である、第７９項に記載の二重特異性抗体。

【0322】

８１．ＩｇＧが、ヘテロ二量体化を促進するために１つ以上のアミノ酸置換で任意選択で操作された、配列番号１４３のＩｇＧ４－ＰＥ重鎖定常領域を含む、第７９項または第８０項に記載の二重特異性抗体。

【0323】

８２．抗体が、エミシズマブのＦｃ領域を含む、第７９項または第８０項に記載の二重特異性抗体。

【0324】

８３．ＦＩＸａおよびＦＸに結合し、ＦＩＸａを介したＦＸの活性化を触媒する二重特異性抗体であって、この抗体が、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対を含み、
第１の重鎖－軽鎖対が、第１のＶＬドメインと対になった第１のＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含み、第１のＶＨドメインが、アミノ酸配列において、配列番号４４３のＮ１２８０Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９８％同一であり、
第２の重鎖－軽鎖対が、第２のＶＬドメインと対になった第２のＶＨドメインを含むＦＸ結合性Ｆｖ領域を含み、第２のＶＨドメインが、アミノ酸配列において、配列番号６３２のＴ０９９９Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９８％同一であり、
第１および第２の重鎖－軽鎖対が各々、配列番号４１４の０３２５Ｌ軽鎖アミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。

【0325】

８４．ＦＩＸａおよびＦＸに結合し、ＦＩＸａを介したＦＸの活性化を触媒する二重特異性抗体であって、この抗体が、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対を含み、
第１の重鎖－軽鎖対が、第１のＶＬドメインと対になった第１のＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含み、第１のＶＨドメインが、アミノ酸配列において、配列番号４５４のＮ１４５４Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９８％同一であり、
第２の重鎖－軽鎖対が、第２のＶＬドメインと対になった第２のＶＨドメインを含むＦＸ結合性Ｆｖ領域を含み、第２のＶＨドメインが、アミノ酸配列において、配列番号６３２のＴ０９９９Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９８％同一であり、
第１および第２の重鎖－軽鎖対が各々、配列番号４１４の０３２５Ｌ軽鎖アミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。

【0326】

８５．ＦＩＸａおよびＦＸに結合し、ＦＩＸａを介したＦＸの活性化を触媒する二重特異性抗体であって、この抗体が、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対を含み、
第１の重鎖－軽鎖対が、第１のＶＬドメインと対になった第１のＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含み、第１のＶＨドメインが、アミノ酸配列において、配列番号４５６のＮ１４４１Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９８％同一であり、
第２の重鎖－軽鎖対が、第２のＶＬドメインと対になった第２のＶＨドメインを含むＦＸ結合性Ｆｖ領域を含み、第２のＶＨドメインが、アミノ酸配列において、配列番号６３２のＴ０９９９Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９８％同一であり、
第１および第２の重鎖－軽鎖対が各々、配列番号４１４の０３２５Ｌ軽鎖アミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。

【0327】

８６．ＦＩＸａおよびＦＸに結合し、ＦＩＸａを介したＦＸの活性化を触媒する二重特異性抗体であって、この抗体が、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対を含み、
第１の重鎖－軽鎖対が、第１のＶＬドメインと対になった第１のＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含み、第１のＶＨドメインが、アミノ酸配列において、配列番号４５８のＮ１４４２Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９８％同一であり、
第２の重鎖－軽鎖対が、第２のＶＬドメインと対になった第２のＶＨドメインを含むＦＸ結合性Ｆｖ領域を含み、第２のＶＨドメインが、アミノ酸配列において、配列番号６００のＴ０７３６Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９８％同一であり、
第１および第２の重鎖－軽鎖対が各々、配列番号４１４の０３２５Ｌ軽鎖アミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。

【0328】

８７．ＦＩＸａおよびＦＸに結合し、ＦＩＸａを介したＦＸの活性化を触媒する二重特異性抗体であって、この抗体が、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対を含み、
第１の重鎖－軽鎖対が、第１のＶＬドメインと対になった第１のＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含み、第１のＶＨドメインが、アミノ酸配列において、配列番号４５８のＮ１４４２Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９８％同一であり、
第２の重鎖－軽鎖対が、第２のＶＬドメインと対になった第２のＶＨドメインを含むＦＸ結合性Ｆｖ領域を含み、第２のＶＨドメインが、アミノ酸配列において、配列番号５８５のＴ０６８７Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９８％同一であり、
第１および第２の重鎖－軽鎖対が各々、配列番号４１４の０３２５Ｌ軽鎖アミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。

【0329】

８８．ＦＩＸａおよびＦＸに結合し、ＦＩＸａを介したＦＸの活性化を触媒する二重特異性抗体であって、この抗体が、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対を含み、
第１の重鎖－軽鎖対が、第１のＶＬドメインと対になった第１のＶＨドメインを含むＦＩＸａ結合性Ｆｖ領域を含み、第１のＶＨドメインが、アミノ酸配列において、Ｎ１３３３Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９８％同一であり、
第２の重鎖－軽鎖対が、第２のＶＬドメインと対になった第２のＶＨドメインを含むＦＸ結合性Ｆｖ領域を含み、第２のＶＨドメインが、アミノ酸配列において、Ｔ０６３８Ｈ ＶＨドメインと少なくとも９８％同一であり、
第１および第２の重鎖－軽鎖対が各々、配列番号４０５の０１２８Ｌ軽鎖アミノ酸配列を含む共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。

【0330】

８９．ａＰＴＴアッセイにおいて、ＦＶＩＩＩ欠乏ヒト血漿の凝固時間を４０秒未満に短縮する、第１～８８項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0331】

９０．ａＰＴＴアッセイにおいて、ＦＶＩＩＩ欠乏ヒト血漿の凝固時間を３０秒未満に短縮する、第８９項に記載の二重特異性抗体。

【0332】

９１．ａＰＴＴアッセイにおいて、ＦＶＩＩＩ欠乏ヒト血漿の凝固時間を２２～２８秒に短縮する、第９０項に記載の二重特異性抗体。

【0333】

９２．ａＰＴＴアッセイにおいて、ＦＶＩＩＩ欠乏ヒト血漿の凝固時間を２４～２６秒に短縮する、第９１項に記載の二重特異性抗体。

【0334】

９３．ＦＸａｓｅアッセイにおいて、ＦＩＸａを介したＦＸからＦＸａへの活性化をエミシズマブと同じまたは同程度に増強する、第１～９２項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0335】

９４．ＦＩＸａを介したＦＸからＦＸａへの活性化を少なくともエミシズマブと同程度に増強する、第１～９３項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0336】

９５．該凝固時間またはＦＩＸａを介する活性化が、３７℃で０.１ｍｇ／ｍｌ、０.３ｍｇ／ｍｌまたは０.５ｍｇ／ｍｌの抗体濃度で決定される、第８９～９４項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0337】

９６．抗体が、蛍光測定トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）において、該アッセイにおけるエミシズマブのＣｍａｘ ＥＣ５０の１０％以内であるか、またはそれよりも低い、ＣｍａｘについてのＥＣ５０を有し、および/または抗体が、蛍光測定ＴＧＡにおいて、２００～４５０ｎＭのトロンビンのＣｍａｘの最大応答を生成する、第１～９５項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0338】

９８．抗体が、蛍光測定ＴＧＡにおけるＣｍａｘについて５０ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、第９６項に記載の二重特異性抗体。

【0339】

９９．蛍光測定ＴＧＡにおけるＣｍａｘについて１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、第９８項に記載の二重特異性抗体。

【0340】

１００．Ｃｍａｘの最大応答が、２５０ｎＭ～４００ｎＭである、第１～９９項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0341】

１０１．抗体が、蛍光測定ＴＧＡにおいて、該アッセイにおけるエミシズマブのＴｍａｘ ＥＣ５０の１０％以内であるか、またはそれよりも低い、ＴｍａｘについてのＥＣ５０を有し、および/または抗体が、１～１０分のＴｍａｘの最大応答を生成する、第１～１００項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0342】

１０２．抗体が、蛍光測定ＴＧＡにおけるＴｍａｘについて５ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、第１～１０１項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0343】

１０３．ＴｍａｘについてのＥＣ５０が、２ｎＭ未満である、第１０２項に記載の二重特異性抗体。

【0344】

１０４．抗体が、蛍光測定ＴＧＡにおいて、２～８分のＴｍａｘの最大応答を生成する、第１～１０３項のいずれかに記載の二重特異性抗体。

【0345】

１０５．第１～１０４項のいずれかに記載の第１の重鎖－軽鎖対の２つのコピーを含む抗ＦＩＸａ抗体。

【0346】

１０６．第１～１０４項のいずれかに記載の第２の重鎖－軽鎖対の２つのコピーを含む抗ＦＸ抗体。

【0347】

１０７．第１～１０６項のいずれかに記載の抗体をコードする単離された核酸。

【0348】

１０８．
第１～１０４項のいずれかに記載の第１のＶＨドメインを含む抗体重鎖、
第１～１０４項のいずれかに記載の第２のＶＨドメインを含む抗体重鎖、および／または
第１～１０４のいずれかに記載の第１または第２のＶＬドメインを含む抗体軽鎖、をコードする組換えＤＮＡを含むインビトロでの宿主細胞。

【0349】

１０９．
配列番号４１９または配列番号４２６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
配列番号４２１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
配列番号４１４のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖と、をコードする組換えＤＮＡを含む、第１０８項に記載の宿主細胞。

【0350】

１１０．各宿主細胞が、第１～１０４項のいずれかに記載の二重特異性抗体をコードする組換えＤＮＡを含む、インビトロでの宿主細胞の集団。

【0351】

１１１．第１～１０４項のいずれかに記載の二重特異性抗体を産生するためのキットであって、
第１～１０４項のいずれかに記載の第１のＶＨドメインを含む抗体重鎖、または該重鎖をコードする核酸、
第１～１０４項のいずれかに記載の第２のＶＨドメインを含む抗体重鎖、または該重鎖をコードする核酸、
第１～１０４項のいずれかに記載の第１のＶＬドメインを含む抗体軽鎖、または該軽鎖をコードする核酸、および
第１～１０４項のいずれかに記載の第２のＶＬドメインを含む抗体軽鎖、または該軽鎖をコードする核酸を含む、キット。

【0352】

１１２．
配列番号４１９または配列番号４２６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、または該第１の重鎖をコードする核酸、
配列番号４２１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、または該第２の重鎖をコードする核酸、および
配列番号４１４のアミノ酸配列を含む共通の軽鎖、または該共通の軽鎖をコードする核酸、を含む、第１１１項に記載のキット。

【0353】

１１３．該アミノ酸配列または該核酸が細胞内に提供される、第１１１項または第１１２項に記載のキット。

【0354】

１１４．該アミノ酸配列または該核酸が無細胞緩衝水性媒体中で提供される、第１１１項または第１１２項に記載のキット。

【0355】

１１５．該アミノ酸配列の各々または該核酸の各々が別個の薬瓶に提供される、第１１１～１１４項のいずれかに記載のキット。

【0356】

１１６．第１～１０４項のいずれかに記載の二重特異性抗体を産生する方法であって、二重特異性抗体の発現のための条件下で第１０８項または第１０９項に記載の宿主細胞を培養し、宿主細胞培養物から二重特異性抗体を回収することを含む、方法。

【0357】

１１７．少なくとも１００リットルの容量を含む容器内で宿主細胞を培養することを含む、第１１６項に記載の方法。

【0358】

１１８．容器が、ステンレス鋼製であるか、または単回使用のバイオリアクターである、第１１７項に記載の方法。

【0359】

１１９．薬学的に許容される賦形剤を伴う溶液中に、第１～１０４項のいずれかに記載の二重特異性抗体、または第１０７項に記載の単離された核酸を含む、組成物。

【0360】

１２０．二重特異性抗体または核酸が滅菌水溶液中にある、第１１９項に記載の組成物。

【0361】

１２１．組成物が５％以下のホモ二量体抗体汚染物質を含むように、二重特異性抗体が少なくとも９５％の純度である、第１～１０４項のいずれかに記載の二重特異性抗体を含む、第１１９項または第１２０項に記載の組成物。

【0362】

１２２．組成物が１％以下のホモ二量体抗体汚染物質を含むように、二重特異性抗体が少なくとも９９％の純度である、第１２１項に記載の組成物。

【0363】

１２３．患者における出血を制御する方法であって、第１１９～１２２項のいずれかに記載の組成物を患者に投与することを含む、方法。

【0364】

１２４．療法によるヒトの身体の治療方法における使用のための、第１１９～１２２項のいずれかに記載の組成物。

【0365】

１２５．患者の出血を制御する方法における使用のための、第１１９～１２２項のいずれかに記載の組成物。

【0366】

１２５．血友病Ａ患者の出血を制御するための薬剤の製造のための、第１～１０４項のいずれかに記載の二重特異性抗体の使用。

【0367】

１２６．患者が血友病Ａ患者である、第１２３項に記載の方法、または第１２５項に記載の使用のための組成物もしくは使用。

【0368】

１２７．患者が、血流中の阻害抗体の存在により、ＦＶＩＩＩでの治療に耐性がある、第１２６項に記載の方法または使用のための組成物。

【0369】

１２８．患者が、血流中の阻害抗体の存在により、ＦＩＸａおよびＦＸに対する別の二重特異性抗体による治療に耐性がある、第１２６項または第１２７項に記載の方法、または使用のための組成物。

【0370】

１２９．患者が、エミシズマブでの治療に耐性がある、第１２８項に記載の方法、または使用のための組成物。

【0371】

１３０．ＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチドでの治療を受けている血友病Ａ患者における、阻害抗薬物抗体の発生を低減する方法であって、
第１のＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物を、１～１２か月間の期間にわたって患者に投与することと、
患者を、１～１２か月間の期間にわたって、第２の異なるＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物に切り替えることと、
患者を、１～１２か月間の期間にわたって、第１の抗原結合分子、または第３の異なるＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物のいずれかに切り替えることと、を含み、
第１、第２または第３のＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物は、第１～１０４項のいずれかに記載の二重特異性抗体であり、
各場合において、ＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物またはそのコード核酸が、患者においてＦＶＩＩＩａに機能的に取って代わる治療有効量で投与され、患者が、ＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物のうちのいずれかに対して阻害抗薬物抗体を発生させるリスクが、そのＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物での治療を受け続けている患者と比較して低減される、方法。

【0372】

１３１．阻害抗薬物抗体の発生を低減しながら血友病Ａ患者を治療する方法で使用するための、ＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物もしくはそのコード核酸を含む組成物、または阻害抗薬物抗体の発生を低減しながら血友病Ａ患者を治療する方法で使用するための薬剤の製造のための、ＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物またはそのコード核酸の使用であって、方法が、
第１のＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物を、１～１２か月間の期間にわたって患者に投与することと、
患者を、１～１２か月間の期間にわたって、第２の異なるＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物に切り替えることと、
患者を、１～１２か月間の期間にわたって、第１の抗原結合分子、または第３の異なるＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物のいずれかに切り替えることと、を含み、
第１、第２または第３のＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物は、第１～１０４項のいずれかに記載の二重特異性抗体であり、
各場合において、ＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物またはそのコード核酸が、患者においてＦＶＩＩＩａに機能的に取って代わる治療有効量で投与され、患者が、ＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物のうちのいずれかに対して阻害抗薬物抗体を発生させるリスクが、そのＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物での治療を受け続けている患者と比較して低減される、組成物または使用。

【0373】

１３２．第１、第２および第３のＦＶＩＩＩａ活性に取って代わるポリペプチド薬物が、任意の順序で、組換えまたは血漿由来のＦＶＩＩＩ、エミシズマブ、および第１～１０４項のいずれかに記載の二重特異性抗体である、第１３０項に記載の方法、または第１３１項に記載の使用のための組成物もしくは使用。

【0374】

１３３．治療が、患者への組成物の皮下投与を含む、第１２３～１３２項のいずれかに記載の方法、使用のための組成物、または使用。

【0375】

当業者は、本明細書に記載の発明の特定の実施形態の多数の均等物を多数認識し、または日常的にすぎない研究を用いて確認することができるであろう。そのような均等物は、添付の特許請求の範囲内にあることを意図している。

【実施例】

【0376】

ヒトＦＩＸａおよびヒトＦＸのＦｖ結合部位を含む二重特異性ＩｇＧ抗体は、２０１８年６月２２日に提出された「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ Ｘ」（ＷＯ２０１８／２３４５７５）という題名のＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６６８３６に記載されているように生成された。そこに記載されているように、免疫化およびスクリーニングの広範な試みにより、抗ＦＩＸａ抗体ＮＩＮＡ－０１２８が同定されるに至り、この抗体は、ＩｇＧ形式で選択した異なる抗ＦＸ結合Ｆｖのいずれかと組み合わせると、テナーゼアッセイおよびａＰＴＴアッセイを含む機能的スクリーニングにおいて卓越した活性を示した。ＮＩＮＡ－０１２８は、ＶＨドメインＮ０１２８ＨおよびＶＬドメイン０１２８Ｌを含む。Ｎ０１２８Ｈ ＶＨドメインの多くのバリアントが生成および試験され、その結果、例えばＮ０４３６Ｈ ＶＨドメインを含む二重特異性形式での機能がさらに改善された。

【0377】

その研究に基づいて、二重特異性ＩｇＧは、共通の軽鎖としてＮＩＮＡ－０１２８のＶＬドメインを使用して設計された。抗ＦＸ抗体のパネルは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスにおいてインビボで生成された。これらは、ヒト定常領域を含む共通の軽鎖の０１２８Ｌ ＶＬドメインを使用して、抗ＦＩＸ結合アームとしてＮＩＮＡ－０１２８と共発現した。１つのＶＨドメインであるＴ０２００は、二重特異性形式で卓越した活性を示し、さらなる開発のために選択された。Ｔ０２００Ｈクローンと同じ免疫動物から得られた構造的に関連する抗体には、抗ＦＩＸ ＶＨドメインと０１２８Ｌ共通軽鎖を有する二重特異性ＩｇＧ４のＴ０２００Ｈ ＶＨドメインよりもさらに優れた性能を示すさらなる抗ＦＸ ＶＨドメインが含まれた。

【0378】

一方、さらなる抗ＦＩＸａ抗体バリアントが生成され、共通の０１２８Ｌ ＶＬドメインを保持しながらＶＨドメインに変異が導入された。抗ＦＩＸａ Ｎ０４３６Ｈ ＶＨドメイン配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の各位置ですべての可能なアミノ酸を置換し、共通の軽鎖を含む二重特異性抗体との関連で得られたＶＨドメインバリアントを発現させ、バリアント二重特異性抗体を一連の機能的アッセイにおいて評価し、機能的活性の増加に関連する変異を同定し、機能的活性の増加に関連する変異の組み合わせを含むさらなるバリアントを生成することによって最適化された。

【0379】

改善されたＴ０２００Ｈ ＶＨドメインバリアントは、改善されたＮ０４３６Ｈ ＶＨドメインバリアントと組み合わされ、各々がＮ０１２８Ｌ共通軽鎖と対にされ、最適化、スクリーニング、および選択のラウンドが繰り返された。

【0380】

図６は、スクリーニングプログラムの簡単な概要を示している。

【0381】

非常に強力なＦＶＩＩＩ模倣活性は、最適化された配列を含む共通の軽鎖二重特異性抗体で達成された。以下の二重特異性抗体は、様々な疾患関連アッセイでの機能的特性評価によって示されるように、強力なパフォーマーの例である。共通の軽鎖を有する二重特異性抗体の命名法は、ＩＸＡＸ－ｎｎｎｎ．ｔｔｔｔ．ｌｌｌｌであり、ｎｎｎｎは、抗ＦＩＸ ＶＨドメインの４桁の数値識別子であり、ｔｔｔｔは、抗ＦＸ ＶＨドメインの４桁の識別子であり、ｌｌｌｌは、共通ＶＬドメインの４桁の数値識別子である。
ＩＸＡＸ－０１２８．０２０１．０１２８（抗ＦＩＸａ ＶＨドメインＮ０１２８Ｈ；抗ＦＸ ＶＨドメインＴ０２０１Ｈ；０１２８Ｌ共通軽鎖）
ＩＸＡＸ－０４３６．０２０１．０１２８
ＩＸＡＸ－０５１１．０２０１．０１２８
ＩＸＡＸ－１０９１．０２０１．０１２８
ＩＸＡＸ－１１７２．０２０１．０１２８
ＩＸＡＸ－１２８０．０２０１．０１２８
ＩＸＡＸ－１３４１．０２０１．０１２８
ＩＸＡＸ－１３２７．０２０１．０１２８
ＩＸＡＸ－１３３３．０２０１．０１２８

【0382】

二重特異性抗体において上記および他の抗ＦＩＸ ＶＨドメインとよく結合する他の高性能抗ＦＸ ＶＨドメインは、図１１に列挙されたものおよび他の関連配列などのＴ０２０１Ｈ系統およびそのバリアントのものであった。特に良好な結果は、以下から選択される抗ＦＩＸ ＶＨドメイン、抗ＦＸ ＶＨドメイン、および共通の軽鎖を含む二重特異性抗体で得られた。

【表1】

【0383】

本明細書に記載の二重特異性抗体は、本明細書に記載の治療用途の候補医薬品分子を表す。それらは、エミシズマブなどの既存の治療に代わるものを提供することによって、特に抗薬物抗体の存在のためにそのような既存の治療がもはや効果的でない患者において、患者に不可欠な医療オプションを提供できる可能性がある。

【0384】

これらの実施例において、参照抗体ＡｂＥまたは抗体Ｅは、エミシズマブの重鎖および軽鎖アミノ酸配列を有する二重特異性抗体である［３］。

【0385】

実施例１．共通の軽鎖を有する抗ＦＸ抗体パネルの作成
０１２８Ｌ ＶＬドメインを含む共通の軽鎖を発現するトランスジェニックマウスをヒト第Ｘ因子で免疫化した。抗原特異的Ｂ細胞をフローサイトメトリーによって単一細胞選別し、ＶＨおよびＶＬ配列を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）で回収した。２００個の抗ＦＸ重鎖が、単一細胞で選別されたリンパ球のＮＧＳ分析によって同定された。同じトランスジェニック動物から採取した骨髄およびリンパ節組織について、さらにバルクＮＧＳ分析を実施した。

【0386】

実施例２．共通の軽鎖を有する抗ＦＩＸａｘＦＩＸ二重特異性抗体の作成
各抗ＦＸ重鎖は、抗ＦＩＸ Ｎ０１２８Ｈ重鎖および０１２８Ｌ共通軽鎖を含む二重特異性抗体としてＨＥＫ２９３細胞で発現された。二重特異性抗体は、参照により本明細書に組み込まれる２０１８年６月２２日に提出された「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ Ｘ」と題されたＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０６６８３６に実質的に記載されるようにプロテインＡによって精製された。

【0387】

実施例３．活性化凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）様活性アッセイ（ＦＸａｓｅまたはテナーゼアッセイ）を使用した抗ＦＸアームの初期スクリーニング
各々がＮ０１２８Ｈ抗ＦＩＸ重鎖および０１２８Ｌ共通ＶＬドメインと組み合わされた一連の異なる抗ＦＸ重鎖を含む２００個の二重特異性抗体を、第Ｘａ因子生成アッセイを使用してスクリーニングした。この機能的スクリーニングは、ＦＶＩＩＩａ模倣活性、すなわち、酵素的「ＦＸａｓｅ」アッセイによってインビトロで、ＦＩＸａを介したＦＸのＦＸａへの活性化を増強（触媒）する能力を検出する。このアッセイでは、ＦＸａの形成に適した条件下で、リン脂質の存在下において、試験二重特異性分子をＦＩＸａおよびＦＸと接触させる。ＦＸａの基質を添加し、これは、ＦＸａによって開裂されると、検出可能な生成物を生成する。試験二重特異性抗体の存在下でのこの生成物の検出を、試験抗体が存在しない（対照抗体が含まれる場合がある）陰性対照と比較する。検出されたシグナルを、４０５ｎｍでの反応溶液の吸光度を記録することによって定量化する。吸光度を、アッセイにおける広範囲の抗体濃度にわたって測定し、ＥＣ５０値を、このアッセイにおける二重特異性抗体の効力の尺度として計算する。試験抗体と対照との間のＥＣ５０の有意差は、試験抗体がＦＩＸａを介したＦＸの活性化を増強することが可能であることを示す。図７。

【0388】

結果
アッセイされたすべての二重特異性抗体の中で、単一の抗体が卓越したＦＸａｓｅ活性を示した。０１２８Ｌ共通ＶＬドメインと対になったＮ０１２８Ｈ抗ＦＩＸ重鎖およびＴ０２００Ｈ抗ＦＸ重鎖は、パネル内の他のすべての抗体よりも著しく高いＦＸａｓｅ活性を示した。図８。

【0389】

材料および方法－標準的なＦＸａｓｅ反応条件
７.５μＬのＦＩＸ（３.７５μｇ／ｍＬ）、および組換え抗体を産生するＥｘｐｉ２９３細胞（実施例８）からの５μＬの上清をアッセイプレートの各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。２.５μＬのＦＸＩａ（１０ｎｇ／ｍＬ）、５μＬのＦＸ（５０ｎｇ／ｍＬ）、０.０５μＬのリン脂質（１０ｍｇ／ｍＬ）、および５μＬのＴＢＳＢ－Ｓ緩衝液の混合物を各ウェルに添加して、酵素反応（ＦＸａを生成するためのＦＸのＦＩＸａ開裂）を開始し、３７℃で１時間インキュベートした。６０分後、５μＬの０.５Ｍ ＥＤＴＡを添加することによって反応を終了した。１０μＬのＳ２７６５基質溶液を各ウェルに添加した後、４０５ｎｍ（参照波長６５５ｎｍ）での吸光度を３０分間測定した（１０分毎に１回読み取り）。特に明記しない限り、すべての反応を３７℃で実施した。
ＴＢＳＢ：
０.１％ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩水
７.５ｍＬのＴＢＳＢを作製するには：
０.１ｍＬの７.５％ ＢＳＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）
７.４ｍＬの１Ｘ ＴＢＳ溶液（２０Ｘ ＴＢＳ溶液ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから希釈）
ＴＢＳＢ－Ｓ：
５ｍＭのＣａＣｌ２および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＴＢＳＢ
１００ｍＬのＴＢＳＢ－Ｓを作製するには：
９９.４ｍＬのＴＢＳＢ
０.５ｍＬの１Ｍ ＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）
０.１ｍＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）
ＦＸＩａ原液（１０μｇ／ｍＬ）：
１０ｍＬのＴＢＳＢ－Ｓを０.１ｍｇのＦＸＩａ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加して、１０μｇ／ｍＬの原液を作製する。
使用前に１０ｎｇ／ｍＬ（１：１，０００）の希釈標準溶液に希釈する。
Ｆ．ＩＸａ原液（５μｇ／ｍＬ）
１００ｍＬのＴＢＳＢ－Ｓを０.５ｍｇ ＦＩＸａ（ＨＦＩＸａ １０８０）（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加して、５μｇ／ｍＬの原液を作製する。
使用前に１.０μｇ／ｍＬ（１：５）の希釈標準溶液に希釈する。
ＦＩＸ原液（３７.５μｇ／ｍＬ）：
１３.３ｍＬのＴＢＳＢ－Ｓを０.５ｍｇのＦＩＸ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加して、３７.５μｇ／ｍＬの原液を作製する。
使用前に３.７５μｇ／ｍＬ（１：１０）の希釈標準溶液に希釈する。
ＦＸ希釈標準溶液（５０μｇ／ｍＬ）：
１６ｍＬのＴＢＳＢ－Ｓを０.８ｍｇのＦＸ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加して、５０μｇ／ｍＬの希釈標準溶液を作製する。
使用前にさらなる希釈は必要ない。
Ｓ２７６５原液：
２５ｍｇのＳ２７６５（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）発色基質（０.０３５ｍｍｏｌ）
２ｍＭの原液を作製するには：
１７.４９３ｍＬの水をバイアルに添加し、振盪しながら溶解する。
ポリブレン溶液：
０.６ｇ／Ｌの臭化ヘキサジメトリン原液を作製するには：
０.１５ｇの臭化ヘキサジメトリン（Ｓｉｇｍａ）を２５０ｍＬの水に添加する。
使用前に０.６ｍｇ／Ｌ（１：１，０００）の希釈標準溶液に希釈する。
Ｓ２７６５基質希釈標準溶液
２ｍＭのＳ－２７６５原液および０.６ｍｇ／Ｌのポリブレン溶液の１：１混合物。

【0390】

実施例４．抗ＦＸＴ０２００Ｈ ＶＨドメインの同定
Ｎ０１２８Ｈ抗ＦＩＸ ＶＨドメイン、Ｔ０２００Ｈ抗ＦＸ ＶＨドメイン、および０１２８Ｌ共通軽鎖を含むＩＸＡＸ．０１２８．０２００．０１２８と指定された二重特異性抗体は、他の二重特異性抗体と比較して高いＦＸａｓｅ活性を示した。Ｔ０２００Ｈ ＶＨドメインは、なおさらに改善された二重特異性抗体の産生を試みるためのさらなる開発のために選択された。

【0391】

実施例５．抗ＦＸＴ０２００Ｈ ＶＨドメインの最適化
系統発生分析
バルクＮＧＳ（実施例１）および系統発生分析から、１１３個の抗ＦＸ重鎖が、抗ＦＸ重鎖Ｔ０２００Ｈと同じリンパ球クラスターに属するものとして同定された。このクラスターは、共通の進化系統を共有しているように見えるＢ細胞を表している。クラスター内の抗ＦＸ重鎖は、アミノ酸レベルでＴ０２００Ｈと約９５％の配列同一性を共有していた。図９。

【0392】

１１３個の抗ＦＸ重鎖は、異なる抗ＦＩＸ重鎖および０１２８Ｌ共通軽鎖のパネルを用いた二重特異性抗体で発現され、ＦＸａｓｅアッセイによってスクリーニングされた。

【0393】

本発明者らは、二重特異性抗体としてアッセイした場合、Ｔ０２００Ｈ ＶＨドメインと比較してＦＸａｓｅ活性の増加を示したいくつかの抗ＦＸ重鎖を同定した。図１０は、Ｘａｓｅアッセイからの実施例データを示している。

【0394】

最も活性のあるＦＸアーム配列の選択を図１１に示す。これらのＶＨドメインは、それぞれＴ０２０１ＨからＴ０２１７Ｈと指定された。二重特異性形式で最も強い活性を示したのは、Ｔ０２０４、Ｔ０２０７、Ｔ０２０５、およびＴ０２０１だった（図１０ｂ）。

【0395】

アミノ酸配列の比較を使用し、機能データによって支持されているため、本発明者らは、最も活性のあるＶＨドメインが異なり、Ｔ０２００Ｈと比較して生物活性の増強に寄与し得る抗ＦＸ重鎖のフレームワークおよびＣＤＲ領域のいくつかのアミノ酸残基を同定した。例えば、ＶＨドメインの以下のアミノ酸の特徴のうちの１つ以上は、ＶＨドメインを含む二重特異性抗体のＦＶＩＩＩ模倣活性を増加させる可能性がある（ＩＭＧＴ残基の番号付け）。
ＦＲ１の５位でのバリン（Ｖ）のイソロイシン（Ｉ）による置換。
ＦＲ１の１３位でのリジン（Ｋ）のグルタミン（Ｑ）による置換。
ＦＲ２の３９位でのロイシン（Ｌ）のメチオニン（Ｍ）による置換。
ＣＤＲ２の６２位でのスレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換。
ＣＤＲ２の６４位でのアスパラギン酸（Ｄ）のセリン（Ｓ）による置換。
ＦＲ３の８５位でのスレオニン（Ｔ）のセリン（Ｓ）による置換。
ＣＤＲ３の１１２位でのアラニン（Ａ）のセリン（Ｓ）による置換。

【0396】

それにもかかわらず、Ｔ０２００Ｈ自体が二重特異性抗体で強い活性を示し、これらの置換のいずれもが、すべての上位ＶＨドメインに一貫して存在しなかったため、これらのアミノ酸置換がなくても活性が高いことは明らかである（図１１）。

【0397】

機能最適化のための標的変異誘発
ＶＨドメインＴ０２０１ＨのＣＤＲ３を体系的に変異させて、各位置の残基が個別に別のアミノ酸に置き換えられたＶＨドメインのライブラリを提供した。得られたＶＨドメインはＴ０ＸＸＸＨと名付けられ、ここで、ＩＭＧＴ位置１１４（Ｃｙｓ）、１１５（Ｌｅｕ）、１１６（Ｇｌｎ）、および１１７（Ｌｅｕ）の変異体のＸＸＸ番号が図１２に示されている。ＩＭＧＴの番号付けについては、図１３を参照されたい。

【0398】

潜在的な開発責任の除去
ＣＤＲ３に存在する対になっていないシステイン（Ｃ）残基は、高リスクの配列モチーフとして同定された。Ｔ０２００ＨのＣＤＲ３の１１４位に存在するこの対になっていないシステインと、バルクＮＧＳ分析から同定された１１３個のさらなる抗ＦＸ ＶＨドメインすべてが、二重特異性抗体の開発について開発責任を負っている。本発明者らは、Ｔ０２０１Ｈのこの位置にあるシステインを他のすべてのアミノ酸で置換したＶＨドメインをスクリーニングした。これらの新しいバリアントは、ＩｇＧ４二重特異性抗体としてＮ１２８０Ｈ（実施例６を参照されたい）および０１２８Ｌ共通軽鎖で発現され、プロテインＡによって精製され、ＦＸａｓｅアッセイによってＦＶＩＩＩ模倣活性についてスクリーニングされた。１１４位のシステインをイソロイシン（Ｉ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）、またはトリプトファン（Ｗ）で置き換えると、Ｔ０２０１ＨまたはＴ０２０２Ｈ ＶＨドメインを有する二重特異性抗体と同様のＦＶＩＩＩ模倣活性を有する二重特異性抗体が得られた。本発明者らは、Ｃ１１４は他の様々なアミノ酸に置き換えることができ、引き続きＦＶＩＩＩ模倣活性を維持できると結論付けている。

【0399】

実施例６．抗ＦＩＸ ＶＨの体系的な配列最適化
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の各アミノ酸残基を個別に変異させて、抗ＦＩＸ Ｎ０１２８Ｈ重鎖の単一位置変異体を生成した。このように生成された抗ＦＩＸ重鎖バリアントは、ＨＥＫ２９３の抗ＦＸ重鎖Ｔ０２０１ＨおよびＮ０１２８Ｌ共通ＶＬドメインと対になって二重特異性形式で発現された。

【0400】

プロテインＡ精製二重特異性抗体を、ＦＸａｓｅ（実施例７）およびａＰＴＴによって生物学的活性についてアッセイし、二重特異性抗体のＦＶＩＩＩ模倣活性を改善するアミノ酸変化を探した。次に、改善されたバリアントを組み合わせて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域に二重または三重変異体を生成した。

【0401】

表Ｎは、ＣＤＲの１つ以上の残基が他のアミノ酸に変異しているＮ０１２８Ｈ ＶＨドメインの変異体を同定している。例えば、Ｎ０４３６Ｈ ＶＨドメインは、ＣＤＲ３のＩＭＧＴ位置１１１Ａのセリンがイソロイシンに置き換えられている、Ｎ０１２８Ｈ ＶＨドメインのＳｅｒ－＞Ｉｌｅ変異体である。最初の単一点変異に加えて、さらなる残基変異が導入された。例えば、Ｎ０５１１Ｈ ＶＨドメインは、ＣＤＲ３のＩＭＧＴ位置１１２Ａのセリンがイソロイシンに置き換えられている、Ｎ０４３６Ｈ ＶＨドメインのＳｅｒ１１２ＡＬｙｓ変異体である。例えば、Ｎ１１７２Ｈは、ＣＤＲ２のＩＭＧＴ位置６４のグルタメートがアルギニンに置き換えられている、Ｎ０５１１Ｈ ＶＨドメインのＧｌｕ６４Ａｒｇ変異体である。例えば、Ｎ１２８０Ｈは、ＣＤＲ１のＩＭＧＴ位置２９のＴｈｒがアルギニンに置き換えられている、Ｎ１１７２Ｈ ＶＨドメインのＴｈｒ２９Ａｒｇ変異体である。他の名前付きＶＨドメインは、同じ方法で表Ｎから同定できる。

【0402】

ＩＭＧＴの番号付けについては、図１４を参照されたい。

【0403】

実施例７．ＦＸａｓｅアッセイにおける改善された二重特異性抗体のスクリーニング
各々が０１２８Ｌ共通ＶＬドメインと対になった、実施例５に記載のように生成されたＶＨドメインバリアントを含む抗ＦＸアームを、実施例６に記載のように生成されたＶＨドメインバリアントを含む抗ＦＩＸアームと組み合わせ、ＦＩＸＡｘＦＸ二重特異性抗体を生成し、テナーゼアッセイにおける機能的活性についてスクリーニングした。

【0404】

結果
実施例データを示す。
図１０。
図１５。
図１６。

【0405】

各々が０１２８Ｌ共通ＶＬドメインと対になった、抗ＦＩＸ ＶＨドメインと抗ＦＸ ＶＨドメインのいくつかの組み合わせについて、高活性の二重特異性抗体が同定された。抗ＦＩＸ ＶＨおよび抗ＦＸ ＶＨドメインの組み合わせの例を図１６に示す。

【0406】

抗ＦＸ ＶＨドメインの同一性は、これらの二重特異性アームの組み合わせについて、抗ＦＩＸ ＶＨドメインの同一性よりも強い影響力を有しているようであり、Ｔ０６３８Ｈ、Ｔ０６１６Ｈ、Ｔ０５９６Ｈ、およびＴ０６６３Ｈは最高性能の抗ＦＸ ＶＨドメインの１つである。これらの抗ＦＸドメインは、図１６に示すようなＮ１２８０Ｈのバリアントを含む、様々な抗ＦＩＸアームとの組み合わせで良好に機能した。抗ＦＩＸ ＶＨドメイン配列は、添付の表Ｎを参照することによって同定される。抗ＦＸ ＶＨドメイン配列は、図１２を参照することによって同定される。

【0407】

Ｎ１２８二重特異性抗体のＦＶＩＩＩ模倣活性は、３つのＣＤＲのいずれかのアミノ酸残基を修飾することによって順次最適化された。ＣＤＲ全体でＦＶＩＩＩ模倣活性を高めるためにいくつかのアミノ酸残基が同定され、これらの変異を組み合わせて活性を最大化した。Ｎ０１２８Ｈ ＶＨドメインを有する抗体のＦＶＩＩＩ模倣活性は、次の順序：Ｎ０１２８Ｈ－＞Ｎ０４３６Ｈ－＞Ｎ０５１１Ｈ－＞Ｎ１０９１Ｈ－＞Ｎ０１１７２Ｈ－＞Ｎ１２８０Ｈ－＞Ｎ１３３３Ｈ、でさらにＶＨドメインを用いて徐々に改善された。図１７。

【0408】

材料および方法－修飾されたＦＸａｓｅ反応条件。
二重特異性抗体ＦＶＩＩＩ模倣活性の初期スクリーニングは、上記の実施例３に記載された標準ＦＸａｓｅ反応条件を使用して評価された。二重特異性抗体のＦＶＩＩＩ模倣活性が増加するにつれて、標準ＦＸａｓｅ反応条件はＦＸａｓｅ活性の改善を検出するのにもはや十分ではなかった。したがって、より感度の高い修飾されたＦＸａｓｅ反応条件が確立された。

【0409】

この修飾されたアッセイは、次の点で標準ＦＸａｓｅ反応条件と異なる：ＦＸＩａが使用されていない、第ＩＸ因子の活性化型（ＦＩＸａ）が使用されている、インキュベーション工程がない。すべてのＦＸａｓｅ試薬は二重特異性抗体と混合され、ＦＸａの生成は、３７℃に設定されたＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して、４０５ｎｍで３０秒毎に４０～５０回、反応溶液の吸光度を記録することによって検出される。

【0410】

１８.４５μｌのＴＢＳＢ－Ｓ緩衝液を０.０５μｌのリン脂質（１０ｍｇ／ｍｌ）と混合し、ピペッティングにより激しく混合してリン脂質を分散させた。この混合物に、すべて３７℃まで予熱した、１.５μｌのＦＩＸａ（１μｇ／ｍｌ）および５μｌのＦＸ（５０μｇ／ｍｌ）を、５μｌのポリブレン（０.６ｍｇ／Ｌ）および５μｌのＳ２７６５（４ｍＭ）と組み合わせた。最後に、ＦＸａｓｅ活性について調査中の５ｕｌの二重特異性抗体を追加した。４０５ｎｍ（参照波長６５５ｎｍ）での吸光度は、３０秒毎に４０～５０回記録された。

【0411】

実施例８．血漿凝固アッセイにおける改善された二重特異性抗体のスクリーニング
各々が０１２８Ｌ共通ＶＬドメインと対になった、実施例５に記載のように生成されたＶＨドメインバリアントを含む抗ＦＸアームを、実施例６に記載のように生成されたＶＨドメインバリアントを含む抗ＦＩＸアームと組み合わせ、ＦＩＸａｘＦＸ二重特異性抗体を生成した。血友病Ａ患者の血液の凝固能力を修正する本発明の二重特異性抗体の能力を決定するために、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿を使用した活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に対するこれらの抗体の効果を検査した。

【0412】

様々な濃度を有する５μＬの二重特異性抗体溶液、２０μＬのＦＶＩＩＩ欠乏ヒト血漿（Ｈｅｌｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および２５μＬのａＰＴＴ試薬（ＡＰＴＴ Ｓｉ Ｌ Ｍｉｎｕｓ、Ｈｅｌｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の混合物を、３７℃で３分間加温した。２５μＬの２５ｍＭ ＣａＣｌ_２（Ｈｅｌｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を混合物に添加することによって、凝固反応を開始した。凝固までの期間を測定した。これに使用された装置は、Ｃ－４ ４チャネル凝固分析装置（Ｈｅｌｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）だった。

【0413】

結果の試料を図１８に示す。

【0414】

続いて、最高の凝固時間短縮効果を示した二重特異性抗体に対する濃度依存性を決定した。

【0415】

例えば、ＩＸＡＸ－１２８０．０２０１．０１２８ ＩｇＧ４抗体は、参照抗体ＡｂＥ（陽性対照）に匹敵する、ａＰＴＴの用量依存的な減少を示した。図１９。アイソタイプ対照抗体では、ａＰＴＴの短縮は観察されなかった。このアッセイに使用した抗体調製物は、プロテインＡでの一工程精製の結果であり、それらは、所望の二重特異性画分に加えて、残留抗ＦＩＸ単一特異性抗体および残留抗ＦＸ単一特異性抗体が含まれていることに注意されたい。

【0416】

実施例９．二重特異性抗体における抗ＦＩＸ ＶＨドメインの分析
実施例７および実施例８に記載されたものを含む様々な機能アッセイからのデータを考慮すると、抗ＦＸ ＶＨドメインＴ０２０１およびその配列バリアントは、共通の軽鎖を有する二重特異性抗体において様々な抗ＦＩＸ ＶＨドメインと組み合わせて良好に機能することが注目された。例えば、抗ＦＩＸ ＶＨドメインＮ０１２８Ｈ、Ｎ０４３６Ｈ、Ｎ０５１１Ｈ、Ｎ１０９１Ｈ、Ｎ１１７２Ｈ、Ｎ１２８０Ｈ、Ｎ１３１４Ｈ、Ｎ１３２７Ｈ、およびＮ１３３３Ｈはすべて、二重特異性抗体で良好な機能的活性を示した。これらの抗ＦＩＸ ＶＨドメインは、密接な構造的関係を共有している。図２０。それらの性能は、置換による残基の微調整（表Ｎ）および改善された活性に関連する置換の組み合わせによってさらに増強する可能性がある。

【0417】

実施例１０．抗原結合に対する親和性
結合親和性および抗体－抗原相互作用の動力学は、ＳＰＲを使用して決定された。精製された試験抗体（すべてＩｇＧ４ＰＥ）の親和性および動態を、陽性対照としてのコンパレーター抗ＦＩＸ抗体ＡｂＮまたはコンパレーター抗ＦＸ抗体ＡｂＴ、および陰性対照としてのアイソタイプ対照（ＩＳＴＣ）と比較した。

【0418】

ＦＩＸに対する結合親和性
分析した抗ＦＩＸ抗体は、約０.１８μＭ～０.３μＭの親和性範囲でのＦＩＸへの結合、ならびにＦＩＸの高速会合（ｋ_オン）および解離（ｋ_オフ）速度を示した。分析された抗ＦＩＸ抗体は、コンパレーター抗体ＡｂＮと比較して、ＦＩＸへのわずかに高い結合親和性およびより高い会合速度を示した。ＩＳＴＣではＦＩＸへの結合は観察されなかった。表Ｅ－１０－１。

【表2】

【0419】

ＦＸに対する結合親和性
分析した抗ＦＸ抗体は、約０.１μＭ～１.４μＭの親和性範囲でのＦＸへの結合、ならびにＦＸの高速会合（ｋ_オン）および解離（_ｋオフ）速度を示した。ＩＳＴＣではＦＸへの結合は観察されなかった。

【0420】

分析した抗ＦＸ抗体は、ベンチマーク抗体ＡｂＴと比較してＦＸへの同様の結合親和性を示した。

【表3】

【0421】

材料および方法
ＳＰＲを使用して、ＦＩＸまたはＦＸそれぞれに対する結合親和性（Ｋ_Ｄ）、反応速度定数オンレート（ｋ_オン）およびオフレート（ｋ_オフ）を決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システムを使用して分析を実施した。

【0422】

製造業者の説明書に従って、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体をＣＭ４チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定した。チップ表面はアミンカップリングによって活性化され、続いて１Ｍのエタノールアミンでブロックされた。固定化ランは、固定化ランニング緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰを使用して２５℃で実施された。

【0423】

プロテインＡで精製された単一特異性抗体（リガンドと呼ばれる）は、約２μｇ／ｍｌで抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＣＭ４表面に捕捉された。リガンドを、８つすべての流動チャネルのすべての活性チャネルに１０μＬ／分で６０秒間注入した。ランは、中性ｐＨ ＨＢＳ－Ｐ １Ｘ＋ＣａＣｌ_２ ２.５ｍＭをランニング緩衝液として使用して２５℃で実施した。

【0424】

ヒトＦＩＸ（ＭＷ約５５ＫＤａ）またはヒトＦＸ（ＭＷ約５８ＫＤａ）をランニング緩衝液中１ｍｇ／ｍｌで再構成し、分析物として使用した。分析物を、複数サイクル反応速度（ＭＣＫ）モードで、３つの濃度（１.５μＭ、５００ｎＭ、および１６６.７ｎＭ）において、１２０秒の会合相および２００秒（ＦＩＸについて）または３００秒（ＦＸについて）の解離相を用いて、活性チャネルおよび参照チャネルの両方において流速３０μＬ／秒で注入した。１０μＬ／分で６０秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ１.５の３回の注入を再生相に使用した。

【0425】

抗ＦＩＸ分析のために、ＩＳＴＣ抗体ｈＩｇＧ４ＰＥを、参照チャネルにおいて１０μＬ／分で６０秒間、１μｇ／ｍＬで捕捉した。ｈＩｇＧ４ＰＥ ＩＳＴＣおよびｈＩｇＧ１ ＩＳＴＣを、陰性対照として活性チャネルに捕捉した。単一特異性抗体ＡｂＮを陽性対照として使用した。

【0426】

抗ＦＸ分析のために、ｈＩｇＧ４ＰＥ ＩＳＴＣも陰性対照として活性チャネルに捕捉した。単一特異性抗体ＡｂＴを陽性対照として使用した。

【0427】

会合速度定数（ｋオン）、解離速度定数（ｋオフ）、および解離定数（ＫＤ）の値を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアによって結合データから計算した。データを参照し、緩衝液を差し引いて、一工程生体分子反応（Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１）モデルに適合した。モデルにおいて、解離の最初の３０秒を評価した。

【0428】

実施例１１．ＦＸおよびＦＩＸへの二重特異性抗体の同時結合
ＦＩＸｘＦＸ二重特異性抗体ＩＸＡＸ－０４３６．０２０２．０１２８がＦＩＸおよびＦＸに同時に結合する能力は、ＳＰＲを使用して実証された。精製された二重特異性抗体の結合動態をアイソタイプ対照（ＩＳＴＣ）と比較した。結合のセンサーグラムは、二重特異性抗体がＦＩＸおよびＦＸに同時に結合する一方で、ＩＳＴＣではＦＩＸおよびＦＸへの結合が観察されなかったことを示した。図２１Ａ。

【0429】

ＦＩＸは、二重特異性抗体で捕捉された表面上を飛び超えて、第１の分析物との結合を可能にした。二重特異性抗体間の相互作用は、センサーグラム図２１に示されているように、ベースライン応答を生成した。次の２番目の分析物であるＦＸの注入により、シグナルがさらに増加し、ＦＸがすでにＦＩＸと複合体を形成している二重特異性抗体に結合することを示している。

【0430】

逆に、ＦＩＸおよびＦＸがアイソタイプ対照が捕捉された表面上を飛び超えた場合、ＦＩＸまたはＦＸへの結合は観察されず、二重特異性抗体に対するＦＩとＦＸとの間の相互作用の特異性を示している。図２１Ａ。

【0431】

二重特異性抗体のセンサーグラムは、単一特異性抗体のセンサーグラムと比較することもできる。捕捉された抗体が抗ＦＸ単一特異性である場合、同じ一連の注入は、ＦＩＸを飛び超える場合に有意な反応をいずれも示さず、代わりに、第２の注入（１：１混合）を実施すると、約５０応答単位（ＲＵ）が観察され、一方で、二重特異性では、その応答は２５ＲＵ高くなる。図２１Ｂ。

【0432】

ＦＶＩＩ模倣二重特異性抗体の主要な特徴は、ＦＩＸとＦＸに同時に結合し、ＦＩＸａによるＦＸからＦＸａへの変換を促進する能力である。観察された結合は、本明細書に記載の二重特異性抗体が第ＩＸ因子および第ＩＸ因子と同時に相互作用できるという生物物理学的確認を表し、これは添付の実施例に記載の機能データと一致する。

【0433】

材料および方法
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システムを使用してＳＰＲ分析を実施した。

【0434】

製造業者の説明書に従って、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体をＣＭ４チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定した。チップ表面はアミンカップリングによって活性化され、続いて１Ｍのエタノールアミンでブロックされた。固定化ランは、固定化ランニング緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰを使用して２５℃で実施された。

【0435】

プロテインＡ捕捉、次いで、イオン交換クロマトグラフィーによって精製された二重特異性抗体（リガンド）は、約２μｇ／ｍｌで抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＣＭ４表面に捕捉された。リガンドは、１つの活性チャネルに、１０μｌ／分で６０秒間１０μｇ／ｍｌで注入された。ランは、中性ｐＨ ＨＢＳ－Ｐ １Ｘ＋ＣａＣｌ_２ ２.５ｍＭをランニング緩衝液として使用して２５℃で実施した。

【0436】

ヒトＦＩＸまたはヒトＦＸ（分析物）をランニング緩衝液中１.１５ｍｇ／ｍｌで再構成し、分析物として使用した。分析物は、１０μＭ単独で注入するか、１：１（１０μＭ １０μＭ）で１０μｌ／分で１８０秒間混合した。

【0437】

アイソタイプ対照ｈＩｇＧ４ＰＥ抗体を、陰性対照として、参照チャネルにおいて１０μＬ／分で６０秒間、１０μｇ／ｍＬで捕捉した。二重参照プロセスで使用されるすべての試料に対して、緩衝液のブランク注入が実施された。３０μＬ／分で３０秒間、１０ｍＭのグリシンｐＨ１.５の３回の注入を再生相に使用した。データを参照し、緩衝液を差し引いて、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルに適合した。

【0438】

実施例１２．抗ＦＸ ＶＨのさらなる最適化
二重特異性抗体の抗ＦＩＸ結合アームは、Ｎ１２８０ＨのＣＤＲを含むＶＨドメインおよび０１２８ＬのＣＤＲを含むＶＬドメインとして「固定」され、性能を改善させるために抗ＦＸ ＶＨドメインがさらに改良された。０１２８Ｌは共通の軽鎖として使用された。

【0439】

表Ｔは、ＣＤＲの１つ以上の残基が他のアミノ酸に変異しているＴ０２０１Ｈ ＶＨドメインの変異体を同定している。この表は、同定された変異を有する各バリアントＶＨドメインに付けられた名前を示している。いずれの場合も、示されたもの以外の残基は変更されない。例えば、Ｔ０６１６Ｈ ＶＨドメインは、ＣＤＲ３のＩＭＧＴ位置１１５のロイシン（Ｌ）がイソロイシン（Ｉ）に置き換えられている、Ｔ０２０１Ｈ ＶＨドメインのＬｅｕ１１５Ｉｌｅ変異体である。Ｔ０２０１Ｈ ＶＨドメインに単一の変異を含むバリアントにさらなる残基の変化が導入され、Ｔ０２０１Ｈ ＶＨドメインに異なる変異の組み合わせを表すさらなるバリアントが生じた。例えば、Ｔ０６８７Ｈ ＶＨドメインは、Ｔ０２０１Ｈ ＶＨドメインのＳｅｒ１１１ＡＰｈｅ、Ｃｙｓ１１４Ｖａｌ、Ｌｅｕ１１５Ｉｌｅ変異体である。すなわち、ＣＤＲ３のＩＭＧＴ位置１１１Ａのセリンがフェニルアラニンに置き換えられており（Ｔ０５３７Ｈ変異）、ＣＤＲ３のＩＭＧＴ位置１１４のシステインがバリンに置き換えられており（Ｔ０６０６Ｈ変異）、ＩＭＧＴ位置１１５のロイシンがイソロイシンに置き換えられている（Ｔ０６１６Ｈ変異）。他の名前付き抗ＦＸ ＶＨドメインの配列は、同じ方法で表Ｔから同定される。ＩＭＧＴの番号付けについては、図１３を参照されたい。

【0440】

プロテインＡクロマトグラフィーによって精製された二重特異性抗体は、Ｔ０２０１Ｈ ＶＨドメインを含む親二重特異性に対する改善を探索するために機能的活性について試験された。

【0441】

改善された抗体は、ＦＸａｓｅアッセイ（実施例７に詳述されている修飾されたＦＸａｓｅ反応条件を使用する）およびａＰＴＴアッセイ（実施例８に詳述されている方法）で同定された。

【0442】

ＨＣＤＲ３の変異誘発により、ＦＶＩＩＩ模倣活性が改善された。改善された活性を示すＶＨドメインのＨＣＤＲを図２５に示す。例えば、Ｔ０２０１Ｈ ＶＨドメインＣＤＲ３における以下の置換および置換の組み合わせの各々は、ＦＶＩＩＩ模倣活性（括弧内に示される結果のＶＨドメインの名前）を改善することが見出された（非網羅的リスト）：
ＣＤＲ３（Ｔ０６３８Ｈ ＶＨ）のＧｌｎ１１６Ｍｅｔ；
ＣＤＲ３（Ｔ０６１６Ｈ ＶＨ）のＬｅｕ１１５Ｉｌｅ；
ＣＤＲ３（Ｔ０５３７Ｈ ＶＨ）のＳｅｒ１１１ＡＰｈｅ；
Ｃｙｓ１１４Ｉｌｅ Ｌｅｕ１１５Ｉｌｅ（Ｔ０６６６Ｈ ＶＨ）；
Ｓｅｒ１１１ＡＰｈｅ Ｃｙｓ１１４Ｉｌｅ Ｌｅｕ１１５Ｉｌｅ（Ｔ０６７８Ｈ ＶＨ）；
Ｓｅｒ１１１ＡＰｈｅ Ｃｙｓ１１４Ｌｅｕ Ｌｅｕ１１５Ｉｌｅ（Ｔ０６８１Ｈ ＶＨ）；
Ｓｅｒ１１１ＡＰｈｅ Ｃｙｓ１１４Ｖａｌ Ｌｅｕ１１５Ｉｌｅ（Ｔ０６８７Ｈ）。

【0443】

Ｔ０２０１ＨのＨＣＤＲ３変異誘発を結論付けると、ＶＨドメインＴ０６８７Ｈ、Ｔ０６７８Ｈ、およびＴ０６８１Ｈは、二重特異性抗体で最も強い活性を示した。

【0444】

二重特異性抗体の機能的活性は、抗ＦＸアームにおけるＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２の変異誘発によってなおさらに改善された。Ｔ０６８１Ｈ以降、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の各アミノ酸残基は、他のすべての可能なアミノ酸によって体系的に置き換えられ、表Ｔに示されているＴ０６９０Ｈ～Ｔ０９９３Ｈの番号が付けられたＶＨドメインが生成された。

【0445】

ＨＣＤＲ１バリアントの機能評価を支持するために、ａＰＴＴおよびＴＧＡ分析も実行された。ＶＨドメインＴ０７３６（Ｓ２９Ｋ変異）、Ｔ０７１３、Ｔ０７３４、Ｔ０７４２、Ｔ０７７４、およびＴ０７８５は、Ｔ０６８１Ｈと比較して改善された活性を示した。Ｔ０６８１ＨのＨＣＤＲ１バリアントの機能分析に基づいて、ＶＨドメインＴ０７３６Ｈがトップパフォーマーとして選択された。Ｔ０２０１Ｈと比較すると、Ｔ０７３６Ｈは、ＣＤＲ１のＳｅｒ２９Ｌｙｓ置換と、ＣＤＲ３のＳｅｒ１１１ＡＰｈｅ Ｃｙｓ１１４ＶａｌおよびＬｅｕ１１５Ｉｌｅ置換を組み合わせたものである。

【0446】

ＨＣＤＲ２バリアントの機能評価を支持するために、ＦＸａｓｅ、ａＰＴＴおよびＴＧＡ分析も実行された。Ｔ０６８１ＨのＨＣＤＲ２バリアントの機能分析に基づいて、以下のＶＨドメインがＴ０６８１Ｈ：Ｔ０９２６Ｈ（Ｓ６２Ｋ）、Ｔ８５０Ｈ（Ｉ５６Ｌ）、Ｔ０９２５Ｈ（Ｓ６２Ｌ）、Ｔ０９５１Ｈ（Ｇ６３Ｓ）、Ｔ０９５８Ｈ（Ｓ６４Ｄ）、Ｔ０９８９（Ｔ６５Ｒ）およびＴ０９９０Ｈ（Ｔ６５Ｓ）と比較して改善された活性を有することが同定された。

【0447】

次に、選択したＣＤＲ１およびＣＤＲ２バリアントを選択したＣＤＲ３と組み合わせて、さらにＶＨドメインバリアントを生成し、活動のさらなる改善の可能性を調査した。

【0448】

高性能抗体のＦＸａｓｅアッセイデータを図２２および図２３に要約されている。ａＰＴＴアッセイデータは図２４に要約されている。

【0449】

図２２および２３に示すＶＨドメインを含む二重特異性抗体は、Ｔ０２０１Ｈを含む二重特異性抗体と比較して、改善した、または類似の凝固時間を示し、Ｔ０９９９ＨはａＰＴＴアッセイで最短の凝固時間を示した。

【0450】

ＦＸａｓｅ活性および凝固時間は、コンパレーター二重特異性抗体ＡｂＥと同等だった。

【0451】

図２５は、変異誘発プロセスでＦＶＩＩＩ模倣活性が徐々に改善されたＶＨドメインのＣＤＲを同定している。

【0452】

実施例１３．トロンビン生成アッセイにおける二重特異性抗体の強力な活性
トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）は、血漿中のトロンビンへのプロトロンビンの活性化を検出する。トロンビンが生成されると、蛍光発生基質がフルオロフォアに変換され、それが、プレートリーダーによって継続的に監視される。ＴＧＡは、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿の凝固カスケードでＦＶＩＩＩを置換する二重特異性抗体の能力の強力な尺度を提供し、ＴＧＡでのトロンビン生成の動態は、ＦＶＩＩＩ模倣薬のインビボ治療性能の指標として非常に信頼できると考えられている。

【0453】

結果
ＴＧＡトリガーとしての第ＩＸａ因子の適切な濃度を確立するために、本発明者らは、トリガー試薬に存在するＦＩＸａの濃度を変化させながら、最初に固定濃度の二重特異性抗体を使用してＴＧＡを実施した。本発明者らは、２２２ｎＭのＦＩＸａを含む１ｍｌのＭＰ試薬の原液は、Ｃｍａｘが４１８.１１ｎＭのトロンビン、Ｔｍａｘが７.６７分、ラグタイムが５.８３分の正常なプールされたヒト血漿（最終濃度、０.３３ｎＭのＦＩＸａ）のトロンビン生成を誘発するのに十分であると判断した。図２６。これらの値は、健康な成人の基準範囲と同等であり（例えば、参考文献［１１］の表３を参照）、ＴＧＡトリガーとしてのＦＩＸａの使用を確証するものである。

【0454】

二重特異性抗体ＶＨドメインＴ０２０１Ｈ、ならびにＴ０２０１ＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３コンビナトリアルバリアントを、ＨＥＫ細胞でＦＩＸ Ｎ１２８０ＨアームおよびＮ０１２８共通軽鎖で発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーで精製し、最終濃度１３３ｎＭおよび８０ｎＭで分析した。ＶＨドメインバリアントは、Ｔ０２０１Ｈと比較して、ラグタイムの短縮、Ｃｍａｘの増加、ピークまでの時間の短縮を示し、Ｔ０９９９は、分析した両方の濃度で最大のトロンビンピーク高さおよび最短のピーク時間を示した。少なくともＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０１２８の性能は、ＡｂＥおよびエミシズマブキャリブレーターの性能と同等だった。ＡｂＥは、ラグタイム、ピーク高さ、およびピークまでの時間がそれぞれ２.５分、２９１.８ｎＭ、および６.０分を示し、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０１２８は、ラグタイム、ピーク高さ、およびピークまでの時間が２.０分、３１７.２ｎＭ、および５分を示した。図２７。図２８。図２７に示すように、Ｔｍａｘの昇順で、本発明者らは、Ｔ０９９９、Ｔ０６８７、Ｔ０７３６、Ｔ０６７８、Ｔ０６８１、Ｔ０６６６、Ｔ０２０１、およびＴ０５９６をそれぞれ含む二重特異性抗体のＴｍａｘが５、６.８３、６.８３、７、７.６７、１３.１７、１５、１５.６７分であることを観察した。

【表4】

【表5】

【表6】

【0455】

用量反応ＴＧＡの場合、二重特異性抗体ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０１２８をＨＥＫ細胞で発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーで精製し、イオン交換クロマトグラフィーで二重特異性ヘテロ二量体を精製した。０.３ｎＭのＦＩＸａトリガーを使用して、ＴＧＡにおけるＣｍａｘ（ｎＭ）およびＴｍａｘ（分）の用量反応を、二重特異性抗体ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０１２８を添加したＦＶＩＩＩ欠乏血漿で実行し、エミシズマブキャリブレーターと比較した。両方の二重特異性抗体は、抗体濃度の増加とともにＣｍａｘの直線的な減少を示した。ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０１２８は、キャリブレーター抗体よりも大きなＣｍａｘを達成した。この増加は、二重特異性抗体の濃度が低いほど顕著になる。図２９を参照されたい。

【表7】

【表8】

【0456】

材料および方法
ＴＧＡトリガーとして第ＩＸａ因子の適切な濃度を確立するための最初の実験作業では、健康な個人から採取した８０μｌの正常なプール血漿（Ｈｅｌｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ透明Ｕ底９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃３６６５）にて、２０μｌのトリガー試薬（様々な量のＦＩＸａのみを含有するリン脂質から構成される微粒子（ＭＰ）試薬）と混合した。すべての試薬は製造元の指示に従って使用し、水浴で３７℃に予熱した。

【0457】

０.３３ｎＭのＦＩＸａの最終濃度が正常血漿のトロンビン生成を誘発するのに十分であると決定されたら、０.３ｎＭのＦＩＸａを含む同じアッセイ条件を、較正された自動トロンボグラムアッセイにおいてＦＶＩＩＩ枯渇血漿に適用した。

【0458】

ＦＶＩＩＩ免疫枯渇血漿（Ｈｅｌｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ透明Ｕ底９６ウェルプレートにて、２０μｌのトリガー試薬（２２２ｎＭのＦＩＸａのみを含有するリン脂質から構成される微粒子（ＭＰ）試薬、最終濃度０.３３ｎＭ）と混合した。すべての試薬は製造元の指示に従って使用し、水浴で３７℃に予熱した。ＴＧＡ用量反応は、３００ｎＭの試験二重特異性抗体またはエミシズマブキャリブレーター（（ＦＶＩＩＩ欠乏血漿（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に添加したエミシズマブ）で開始し、５ポイントにわたって３分の１の希釈系列で実行した。ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用し、ＰＢＳを添加した正常（ＦＶＩＩＩ＋ｖｅ）プール血漿を陽性対照として使用した。

【0459】

試料は、同じ血漿中にトロンビンキャリブレーター（所定量のトロンビンを含有する）を含有する２つ組キャリブレーターウェルを伴って、２つ組で測定された。９６ウェルプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ）で１０分間３７℃に温めた。２０μｌのＦｌｕＣａ試薬（１００ｍＭのＣａＣｌ_２を含む緩衝液中の蛍光基質、ＺＧＧＲ－ＡＭＣ（２.５ｍＭ））を添加すると、トロンビンの生成が始まった。ＴＧＡ試薬はＳｔａｇｏから入手した。経時にわたる蛍光の増加は、プレートリーダーによって監視された。

【0460】

トロンビンキャリブレーター曲線は、調査対象の各試料と一緒に実行された。既知の濃度のトロンビンを含むキャリブレーターを使用すると、ソフトウェアＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅＢＶを使用して取得した蛍光シグナルから、調査中の試料で生成されたトロンビンの量を計算できる。試験ウェルからの蛍光を、トロンビンキャリブレーターウェルからの蛍光に対して較正して、試験ウェルで生成された同等のトロンビンを決定した。

【0461】

実行データは、Ｓｔａｇｏ分析ソフトウェアを使用して分析された。生成されたトロンビンの量は、既知の活性を有するトロンビンキャリブレーター曲線を使用して決定された。トロンボグラムの以下の態様が決定された：ラグタイム（分）、内因性トロンビン電位（ＥＴＰ；トロンビン下の面積、ｎＭのトロンビン／分）、ピーク高さ（Ｃｍａｘ；ｎＭのトロンビン）、ピークまでの時間（Ｔｍａｘ／分）、速度指数（ＶＩ；ｎＭ／分、ラグタイムとピークまでの時間との間の勾配）、およびテールスタート（分；トロンビン生成が終了した時間）。

【0462】

実施例１４．トロンビン生成アッセイにおける用量反応および効力
二重特異性抗体ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５の最大トロンビンピーク高さ（Ｃｍａｘ、ｎＭのトロンビン）およびピークまでの時間（Ｔｍａｘ、分）を評価するために、本発明者らは、実施例１３に記載された方法に従って、完全な抗体濃度用量を使用して、ヒトＦＶＩＩＩ枯渇血漿でトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を実施した。用量反応曲線から生成したデータは、非線形対数［抗体］対反応パラメーター可変勾配モデル（４パラメーターロジスティック回帰モデル）を使用して適合させた。比較のためにＡｂＥを含めた。このアッセイで使用されたＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＡｂＥは、質量分析によって１００％のヘテロ二量体に近く、ホモ二量体汚染物質は検出されなかったと判断された。

【0463】

４５～４.５μｇ／ｍｌに相当する３００～３０ｎＭに及ぶ前向き治療域にわたって、本発明者らは、分析したすべての濃度でＡｂＥと比較してＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５と同等（１０％以内）またはそれ以上のＣｍａｘ（ｎＭのトロンビン）値を観察した（図３０）。ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５のＣｍａｘは、二重特異性抗体の濃度が１００～３００ｎＭの場合、通常の血漿対照のＣｍａｘに近かった（図３０および図３１）。対照的に、ＡｂＥのＣｍａｘは、ＩｇＧ濃度が３００ｎＭの場合にのみ正常レベルに達した。この研究では、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５（８.０ｎＭ）のＥＣ５０は、ＡｂＥ（５４.４ｎＭ）のＥＣ５０の約１５％だった。

【0464】

Ｃｍａｘ曲線を使用すると、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５は、その濃度が８μｇ／ｍＬ以上の場合に４５μｇ／ｍＬのエミシズマブと同じ活性を達成できると予測できる。これは、エミシズマブと比較して、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５の潜在的な有効性の利点を示唆している。

【0465】

同じ用量反応の分析であるが、Ｔｍａｘに関しては、本発明者らは、分析したすべての濃度でＡｂＥと比較してＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５のＴｍａｘ値が同等（１０％以内）またはそれ以下（もしくは低減した）であることを観察した（図３２）。得られたＴｍａｘ値に基づいて計算されたＥＣ５０値は、ＡｂＥ（四角）では２.８ｎＭであるのに対して、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５（丸）では１.６５ｎＭである。

【0466】

図３０および３２に示されている治療範囲に関して、本発明者らは、ＡｂＥと比較してそれぞれ大きいおよび小さいＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５ＣｍａｘおよびＴｍａｘ用量反応曲線を観察する。

【表9】

【表10】

【0467】

さらに３つの二重特異性抗体（ＢｉＡｂ ２、３、および４）の活性も、ＴＧＡで評価され、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５（ＢｉＡｂ １）、および市販のヒトＦＶＩＩＩ枯渇血漿（Ｈｅｌｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の市販のエミシズマブキャリブレーター（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の性能と比較された。ＢｉＡｂは以下の通りであり、各々２つの重鎖にそれぞれ配列番号４０９および配列番号４１０の重鎖定常領域を含み、共通の軽鎖に配列番号１４６のラムダ軽鎖定常領域を含む：
１．ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５．配列番号４１９の抗ＦＩＸ重鎖、配列番号４２１の抗ＦＸ重鎖、配列番号４１４の共通の軽鎖。
２．ＩＸＡＸ－１４５４．０９９９．０３２５．配列番号４２４の抗ＦＩＸ重鎖、配列番号４２１の抗ＦＸ重鎖、配列番号４１４の共通の軽鎖。
３．ＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５．配列番号４２６の抗ＦＩＸ重鎖、配列番号４２１の抗ＦＸ重鎖、配列番号４１４の共通の軽鎖。
４．ＩＸＡＸ－１４４２．０７３６．０３２５．配列番号４２８の抗ＦＩＸ重鎖、配列番号４３０の抗ＦＸ重鎖、配列番号４１４の共通の軽鎖。

【0468】

ＢｉＡｂ＿１、２、３、および４は、エミシズマブと同じように、トロンビンのピーク高さ（Ｃｍａｘ）を用量依存的に増加させ、ピークまでの時間（Ｔｍａｘ）を用量依存的に減少させた。ＢｉＡｂ＿１のＣｍａｘ曲線の上部は、エミシズマブ（３３４.８ｎＭ）よりも高い約３６８ｎＭで測定された。ＢｉＡｂ＿１、２、３、および４のＥＣ５０（Ｃｍａｘ）は互いに類似しており、それぞれ６.４５ｎＭ、５.８７ｎＭ、５.２ｎＭ、および４.８１ｎＭのＥＣ５０を計算した。これは、エミシズマブのＥＣ５０（１８.３３ｎＭ）の２６％～３５％のＥＣ５０を表す。図３３Ａ。ＢｉＡｂ＿１～ＢｉＡｂ＿４の計算されたＥＣ５０（Ｔｍａｘ）値は、エミシズマブの２.５３ｎＭと比較して、それぞれ０.５６ｎＭ、０.６５ｎＭ、１.０８ｎＭ、０.９３ｎＭだった。図３３Ｂ。

【0469】

第３の研究では、ＢｉＡｂ＿１（ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５）を、ヒトＦＶＩＩＩ枯渇血漿でＴＧＡアッセイを使用して、市販のエミシズマブキャリブレーターと再度比較した。ＢｉＡｂ＿１は、トロンビンのピーク高さ（Ｃｍａｘ）を用量依存的に増加させ、ピークまでの時間（Ｔｍａｘ）を用量依存的に減少させた。図３４。ＢｉＡｂ＿１についてのＣｍａｘ曲線の上部は、エミシズマブ（２８６.３ｎＭ）よりも高い約３９６.５ｎＭだった。ＢｉＡｂ＿１のＥＣ５０は７.７ｎＭであり、エミシズマブのＥＣ５０（２５.９ｎＭ）の約３０％だった。

【0470】

ＢｉＡｂ＿１がそれぞれ約４００ｎＭ、３７５ｎＭ、および３７５ｎＭのＣｍａｘを示し、エミシズマブが２７５ｎＭ、３００ｎＭ、および３５０ｎＭのＣｍａｘを示した図３４、図３３、および図３０で示されるように、ＴＧＡ間では、アッセイ間の変動が観察された。絶対値の変動にもかかわらず、観察された傾向は、ＴＧＡの各事象で同じだった。

【0471】

要約すると、市販のエミシズマブキャリブレーターまたは生成された参照抗体ＡｂＥのいずれかを使用したＴＧＡデータは、エミシズマブと比較してＢｉＡｂ＿１（ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５）の有効性の利点を一貫して示した。試験した他の抗体（ＢｉＡｂ＿２、ＢｉＡｂ＿３、およびＢｉＡｂ＿４）でも利点が観察された。

【0472】

エミシズマブに関するＦＤＡの学際的レビューによると、エミシズマブの定常状態のトラフ血漿濃度が４５μｇ／ｍＬ以上の場合、年間出血率（ＡＢＲ）の中央値は０となる［１７］。上記のＴＧＡのＣｍａｘ曲線を使用すると、ＢｉＡｂ＿１は、その濃度が約２～４μｇ／ｍＬ以上の場合、４５μｇ／ｍＬのエミシズマブと同じ活性を達成できると予測される。この観察は、エミシズマブに関して潜在的な有効性および／または投薬上の利点を示唆している。活性の違いは、二重特異性抗体がエミシズマブよりも低用量および／または低頻度で投与された場合に同じ治療効果を達成できることを潜在的に意味し、臨床的利点を表す。より高いＣｍａｘは、より強力な凝固促進能力の可能性を示しているが、この増加の規模が安全上の懸念に関連している可能性は低い。

【0473】

実施例１５．最適化された抗体アームの親和性
それぞれの抗原に結合するための精製された抗ＦＩＸおよび抗ＦＸ抗体の親和性および動態は、上記の実施例１０に記載されるようにＳＰＲによって決定された。

【0474】

抗ＦＩＸ抗体は、親和性が増加する一般的な傾向（より低いＫ_Ｄ）と、二重特異性抗体のより大きな活性と相関するより速いオフレートとを伴って、約０.０５μＭ～０.３μＭ（５０～３００ｎＭ）の親和性範囲でＦＩＸへの結合を示した。表Ｅ１５－１。

【表11】

【0475】

抗ＦＸ抗体は、約０.３～３μＭの親和性範囲でＦＸへの結合を示した。表Ｅ１５－２。抗ＦＸ抗体ＭＯＮＡは、単一細胞選別から得られたＩｇＭクローンからのＶＨおよびＶＬドメインを有する対照低親和性抗体として含まれていた（実施例１）。

【表12】

【0476】

実施例１６．初期の生物物理学的評価
二重特異性抗体の発現を評価するために、ＩＸＡＸ－１１７２．０２０１．０１２８をミニプール分析の代表的な抗体として選択した。ミニプール分析は、大量（少なくとも１ｇ／ｌ）のヘテロ二量体二重特異性抗体を発現するＣＨＯ安定トランスフェクト細胞のスクリーニングを可能にし、安定した二重特異性抗体発現を評価する手段を表す。

【0477】

安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１細胞のための標準的なロンザ流加培養増殖プロトコルを使用して、二重特異性抗体が発現された。トランスフェクション後、ウェル当たり５０００個の生細胞を分注して、複数のミニプールを生成した。オクテットによって測定された抗体価に基づいて、８つが進められた。

【0478】

細胞を採取し、濾過し、プロテインＡクロマトグラフィーで精製して、上清から抗体を単離した。抗体濃度（ｍｇ）はＯＤ２８０で定量し、抗体の総量（ｍｇ）は、試料の量と、細胞培養量に応じて割り当てられた精製収率（ｍｇ／Ｌ）とに基づいて計算した。８つのミニプール試料の各々におけるヘテロ二量体とホモ二量体の相対的なパーセンテージは、画像化されたキャピラリー等電点フォーカシング（ｉｃＩＥＦ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ、Ｍａｕｒｉｃｅ）を使用して決定された。ホモ二量体およびヘテロ二量体のピークは、ＦＩＸおよびＦＸの一時的に発現した参照ホモ二量体アームを使用して割り当てられた。

【0479】

本発明者らは、最大約９５％のヘテロ二量体を伴う約１ｇ／Ｌの二重特異性抗体を発現する安定的にトランスフェクトされた細胞を分離することができた（例えば、図３５のＭＰ＿１およびＭＰ＿７で示されているように）。

【0480】

ＦＸａｓｅアッセイにおける二重特異性抗体活性は、ピアソンの相関係数が０.９９のヘテロ二量体％と相関していた（図３６）。

【0481】

実施例１７．二重特異性抗体の精製
二重特異性抗体の２つの重鎖および１つの共通の軽鎖の共発現は、二重特異性抗体および単一特異性抗体副産物を含む組成物を生成する。これらは、単一特異性ホモ二量体と比較した二重特異性ヘテロ二量体の等電点の違いを利用して、イオン交換クロマトグラフィーによって分離することができる。

【0482】

二重特異性抗体ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０１２８は、配列番号４１９の抗ＦＩＸ重鎖、配列番号４２１の抗ＦＸ重鎖、および配列番号４０５の共通の軽鎖を含む。二重特異性抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して細胞上清から抗体を単離し、続いてイオン交換クロマトグラフィーを使用してヘテロ二量体を単離することにより、ＨＥＫ細胞におけるこれらのポリペプチドの共発現後に精製された。

【0483】

二重特異性抗体ＩＸＡＸ－０４３６．０２０１．０１２８は、配列番号３２４のＶＨドメインならびにＰ（ヒンジ）変異およびＫ４３９Ｅを有するＩｇＧ４ヒト重鎖定常領域を含む抗ＦＩＸ重鎖と、配列番号４７０のＶＨドメインならびにＰ（ヒンジ）変異およびＥ３５６Ｋを有するＩｇＧ４ヒト重鎖定常領域を含む抗ＦＸ重鎖と、配列番号４０５の共通の軽鎖とを含む。

【0484】

二重特異性抗体ＩＸＡＸ－０４３６．０２０２．０１２８は、配列番号３２４のＶＨドメインならびにＰ（ヒンジ）変異およびＫ４３９Ｅを有するＩｇＧ４ヒト重鎖定常領域を含む抗ＦＩＸ重鎖と、配列番号４７２のＶＨドメインならびにＰ（ヒンジ）変異およびＥ３５６Ｋを有するＩｇＧ４ヒト重鎖定常領域を含む抗ＦＸ重鎖と、配列番号４０５の共通の軽鎖とを含む。

【0485】

二重特異性抗体ＩＸＡＸ－１１７２．０２０１．０１２８は、配列番号４４０のＶＨドメインならびにＰ（ヒンジ）変異およびＫ４３９Ｅを有するＩｇＧ４ヒト重鎖定常領域を含む抗ＦＩＸ重鎖と、配列番号４７０のＶＨドメインならびにＰ（ヒンジ）変異およびＥ３５６Ｋを有するＩｇＧ４ヒト重鎖定常領域を含む抗ＦＸ重鎖と、配列番号４０５の共通の軽鎖とを含む。

【0486】

イオン交換クロマトグラフィーは、各抗体組成物をその構成要素にきれいに分離した。ベースラインの分離が観察された。抗ＦＩＸｘＦＸヘテロ二量体二重特異性抗体は、ホモ二量体汚染物質抗ＦＩＸおよび／または抗ＦＸ単一特異性抗体から分離される。

【0487】

図３７ａは、抗ＦＩＸホモ二量体ＮＩＮＡ－１２８０．０１２８および抗ＦＸホモ二量体ＴＩＮＡ－０９９９．０１２８と混合された二重特異性抗体を含む組成物からのＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０１２８の精製の成功を示している。

【0488】

図３７ｂは、抗ＦＩＸホモ二量体ＮＩＮＡ－０４３６．０１２８および抗ＦＸホモ二量体ＴＩＮＡ－０２０２．０１２８と混合された二重特異性抗体を含む組成物からのＩＸＡＸ－０４３６．０２０２．０１２８の精製の成功を示している。クロマトグラムは、酢酸ナトリウムｐＨ５中で最大５００ｎＭにＮａＣｌ濃度を増加させた一連の段階的溶出を使用した、ホモ二量体汚染物質からのＮ４３６二重特異性抗体の陽イオンイオン交換精製を表している。ピーク１は抗ＦＩＸホモ二量体抗体を表す。ピーク２は抗ＦＩＸ／ＦＸ二重特異性抗体であり、ピーク３は抗ＦＸホモ二量体抗体を表す。ピーク１、２、および３は、それぞれ合計ピーク面積の１８％、７９％、および３％を構成する。

【0489】

図３７ｃは、二重特異性抗体および抗ＦＩＸホモ二量体ＮＩＮＡ－１１７２．０１２８を含む組成物からのＩＸＡＸ－１１７２．０２０１．０１２８の精製の成功を示している。ここでのカラム精製により、３１.５％の抗ＦＩＸホモ二量体および６８.５％の二重特異性ヘテロ二量体が得られた。クロマトグラムは、弱く結合したピーク１（抗ＦＩＸホモ二量体）を除去するための最初の段階的溶出と、それに続く抗ＦＩＸ／ＦＸ二重特異性を溶出するためのＮａＣｌ濃度の増加を使用したグラジエント溶出を使用した、抗ＦＩＸホモ二量体汚染物質からのＮ１１７２二重特異性抗体の陽イオンイオン交換精製を表している。抗ＦＸホモ二量体の存在は検出されなかった。

【0490】

材料および方法
ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０１２８精製では、二重特異性抗体はＥｘｐｉ２９３Ｆ ＨＥＫ細胞で一過性に発現した。細胞培養上清を回収し、濾過し、１ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化した５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＭＳＳ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。カラムを５カラム容量のＰＢＳで洗浄し、結合した抗体をＩｇＧ溶出液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して溶出した。溶出した二重特異性抗体を４℃で一晩１ｘＰＢＳに透析し、分子量１０ｋＤａのカットオフを有する遠心フィルターユニットを使用して濃縮した。

【0491】

クロマトグラフィーは室温で実施した。１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｃａｐｔｏ ＳＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６.０で平衡化し、平衡化緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６.０）中で１：２０に希釈した０.５ｍｇのプロテインＡ精製物質をカラムにロードした。続いて、カラムを１０カラム容量の平衡化緩衝液で洗浄した後、直線グラジエント（９０カラム容量にわたる１００％Ｂ～５００ｍＭのＮａＣｌ）を使用して、二重特異性抗体と単一特異性汚染物質を溶出した。このプロセスでは、緩衝液をＡ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６.０、塩なし）からＢ（５００ｍＭのＮａＣｌを添加した緩衝液Ａ）に、１ｍｌのカラムについて１ｍｌ／分の流速で９０ｃｖで徐々に変化させる。

【0492】

ＩＸＡＸ－０４３６．０２０２．０１２８精製では、緩衝液Ａ（５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５）と緩衝液Ｂ（５０ｎＭの酢酸ナトリウムおよび５００ｍＭの塩化ナトリウム）の比率を変えて、３つの異なるイオン強度での洗浄を含む段階的なグラジエントを適用した。

【0493】

ＩＸＡＸ－１１７２．０２０１．０１２８精製では。最初の段階的溶出を使用して、弱く結合したピーク１（抗ＦＩＸホモ二量体）を除去し、続いて濃度を増加させたＮａＣｌを使用してグラジエント溶出を行い、抗ＦＩＸ／ＦＸ二重特異性を溶出した。

【0494】

続いて、以下の二重特異性抗体がＣＨＯ細胞で発現された。
５．ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５．配列番号４１９の抗ＦＩＸ重鎖、配列番号４２１の抗ＦＸ重鎖、配列番号４１４の共通の軽鎖。
６．ＩＸＡＸ－１４５４．０９９９．０３２５．配列番号４２４の抗ＦＩＸ重鎖、配列番号４２１の抗ＦＸ重鎖、配列番号４１４の共通の軽鎖。
７．ＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５．配列番号４２６の抗ＦＩＸ重鎖、配列番号４２１の抗ＦＸ重鎖、配列番号４１４の共通の軽鎖。
８．ＩＸＡＸ－１４４２．０７３６．０３２５．配列番号４２８の抗ＦＩＸ重鎖、配列番号４３０の抗ＦＸ重鎖、配列番号４１４の共通の軽鎖。
９．ＩＸＡＸ－１４４２．０６８７．０３２５．配列番号４２８の抗ＦＩＸ重鎖、配列番号４２１の抗ＦＸ重鎖、配列番号４１４の共通の軽鎖。

【0495】

これらの二重特異性抗体の各々は、２つの重鎖についてそれぞれ配列番号４０９および配列番号４１０の重鎖定常領域、ならびに共通の軽鎖に配列番号１４６のラムダ軽鎖定常領域を含む。

【0496】

ＣＨＯ細胞における上記の抗体１～５の各々の一過性発現から観察された力価は、単一特異性アイソタイプ対照抗体の力価と同等だった。安定したプールおよびミニプール（トランスフェクション後に最大４，０００個の細胞を播種）も生成された。安定したプールは低いパーセンテージ（１１～１９％）のヘテロ二量体抗体を生成したが、力価が最大４.９ｇ／ｌ、ヘテロ二量体のパーセンテージが最大８２％のミニプールは、限られた数のスクリーニングされたミニプールから確立された。

【0497】

プロテインＡ精製後、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、ホモ二量体副産物を除去し、機能アッセイおよび開発性スクリーニングでの使用に適した高純度の材料を生成した。

【0498】

グラジエント陽イオン交換法を使用して、抗体１～４をホモ二量体副産物から分離し、溶出した物質中９１～９６％のヘテロ二量体を提供した。したがって、この予備精製法を使用しても、本発明者らは、９１～９６％の純粋なヘテロ二量体を得ることができた。図３８。この技法を使用した抗体５では、同等のホモ二量体／ヘテロ二量体の分離は観察されなかった。

【0499】

実施例１８．質量分析による品質評価
治療用モノクローナル抗体の構造的完全性は、製品の不均一性をもたらす複数のタイプの翻訳後修飾によって損なわれる可能性がある。質量分析（ＭＳ）を使用して、陽イオン交換精製後の二重特異性抗体の品質を特徴付け、評価した。

【0500】

実施例１７に記載の陽イオン交換分離後、ＢｉＡｂ＿１ ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５の溶出組成物中の３つの異なる種（それぞれ、抗ＦＩＸ／抗ＦＸヘテロ二量体、抗ＦＩＸホモ二量体、および抗ＦＸホモ二量体）をＭＳによって分析した。ＭＳによって決定された３つの分子の分子量（ＭＷ）は、ＢｉＡｂ＿１のアミノ酸配列によって予測された理論上のＭＷと一致した。したがって、ＭＳの結果により、陽イオン交換精製後のＦＩＸ／ＦＸヘテロ二量体の同一性および純度が確認された。

【0501】

実施例１９．安定性評価
実施例１７に記載の精製の後、ＢｉＡｂ＿１、２、３および４をそれぞれ、緩衝液１（酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５）または緩衝液２（クエン酸／リン酸、ｐＨ６.０）のいずれかに緩衝液交換し、４℃で２週間保存するか、２５℃で４週間保存するか、または１回の凍結／解凍サイクルに付した。処理による抗体の損失を計算するために、処理の前後にＩｇＧの濃度を測定した。ＳＥＣ－ＨＰＬＣも、二重特異性抗体の分解および凝集を監視するために、処理の前後に実施された。ＢｉＡｂ＿１、２、３、または４の明らかな損失または分解は観察されなかった。したがって、これらの４つの二重特異性抗体は、緩衝液１および緩衝液２の両方ですべて安定だった。

【0502】

実施例２０．ＦＸａｓｅアッセイにおける用量反応および効力
ＦＸａｓｅ動態アッセイを実行して、用量反応におけるＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＡｂＥの第ＶＩＩＩ因子模倣活性を測定し、実施例７に従ってそれらのＥＣ５０値を決定した。用量反応曲線から生成したデータは、非線形対数［抗体］対反応パラメーター可変勾配モデル（４パラメーターロジスティック回帰モデル）を使用して適合させた。図３９。ｙ軸は、６００秒のアッセイ時点でのＯＤ４０５ｎｍ値をプロットしている。ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＡｂＥの両方のＥＣ５０値は、データの非線形回帰曲線から計算され、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５のＥＣ５０は３.９９ｎＭ、ＡｂＥのＥＣ５０は２６１.２ｎＭだった。用量反応曲線が不完全だったため、これらは概算である。これにもかかわらず、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５のＥＣ５０はＡｂＥよりも有意に低いことは明らかである。ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＡｂＥの活性は用量依存的である。ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５は、ＡｂＥと比較して、特に低濃度で、より高いＦＶＩＩＩ模倣活性を示した。

【表13】

【0503】

実施例２１．ハイフンアッセイの用量反応
ヒト血漿中の第Ｘａ因子産生を分析する発色アッセイ（ＨＹＰＨＥＮ ＢｉｏＭｅｄ）を使用して、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＡｂＥの第ＶＩＩＩ因子模倣活性を測定した。このアッセイでは、ＦＸａの生成は、発色基質の添加後に測定されたＯＤ４０５に比例する。抗体濃度用量反応曲線を生成し、非線形対数［抗体］対反応パラメーター可変勾配モデル（４パラメーターロジスティック回帰モデル）を使用して適合させた。用量反応に基づくＥＣ５０値を計算した。ＡｂＥの１５.４３ｎＭと比較して、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５のＥＣ５０値は５.９２ｎＭと計算された。

【0504】

ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５は、ほぼすべての濃度で、ＡｂＥよりも優れたＦＶＩＩＩ模倣能力を一貫して達成した。６０ｎＭでは、Ａ４０５ｎｍは両方の分子で４.９８８で飽和した。ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５は２０ｎＭでこの飽和を維持したが、ＡｂＥは３.４５７の減少したＡ４０５ｎｍを示した。０.０２８ｎＭの最低濃度では、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５はＡｂＥよりも４倍以上高い吸光度を示した。計算されたＥＣ５０値は、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５が用量反応アッセイ全体でＡｂＥと比較した場合に優れた効力を示すことを確証している。図４０。

【表14】

【0505】

材料および方法
ＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩＩ：Ｃ（Ｒｅｆ．２２１４０２）キットは、製造元のアッセイプロトコルに従って使用された。簡単に説明すると、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿（Ｈｅｌｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ）をトリス－ＢＳＡ緩衝液（Ｒ４）を使用して１：４０に希釈し、透明な底の９６ウェルプレートに４５μｌを加えた。５μｌの二重特異性抗体を希釈した血漿に加えた。３７℃にプレインキュベートした試薬Ｒ１（ＦＸ）およびＲ２（ＦＩＸａ）を各々５０μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で５分間インキュベートした。続いて、５０μｌの試薬Ｒ３（ＳＸａ－１１、発色試薬）を添加し、混合し、さらに５分間正確にインキュベートした。５０μｌの２０％酢酸の添加により反応を停止させた。第Ｘａ因子の生成は、特定の第Ｘａ因子基質（ＳＸａ－１１）を切断する第Ｘａ因子の能力によって監視された。この基質が切断されると、着色生成物ｐＮＡが放出される。これは、分光光度計を使用して４０５ｎＭで監視され、ブランク試料と比較することができる。

【0506】

このアッセイで使用されたＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＡｂＥは、質量分析によって１００％のヘテロ二量体に近く、ホモ二量体汚染物質は検出されなかった（または低いレベルのみ検出された）と判断された。

【0507】

ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＡｂＥ試料は、希釈剤としてＰＢＳを使用した１：３希釈系列を使用して希釈した。５μＬの容量を４５μＬの第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿に加えた。希釈系列の各試料の最終濃度（ｎＭ）（アッセイ時）は、６０.０、２０.０、６.６７、２.２２、０.７４１、０.２４７、０.０８２、および０.０２８だった。濃度をｌｏｇ（Ｍ）に変換し、プロットした。ＥＣ５０計算を可能にするために、非線形回帰がグラフにプロットされた。

【0508】

実施例２２．血漿凝固アッセイにおける用量反応および効力
本発明者らは、完全抗体濃度用量反応（実施例８による方法）を使用して、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５に対する二重特異性抗体ＡｂＥの活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を評価した。用量反応曲線から生成したデータは、非線形対数［抗体］対反応パラメーター可変勾配モデル（４パラメーターロジスティック回帰モデル）を使用して適合させた。

【0509】

分析された濃度値にわたって、本発明者らは、分析されたすべての濃度でＡｂＥと比較してＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５の同等のａＰＴＴ値（１０％以内）を観察した（図４１）。用量反応曲線を、止血効果を示さなかったヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体アイソタイプ対照と比較した。得られたａＰＴＴ値に基づいて計算されたＥＣ５０値は、ＡｂＥ（四角）では２.０ｎＭであるのに対して、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５（丸）では２.１ｎＭであった。

【0510】

３０～３００ｎＭの将来的な治療範囲に関して、本発明者らは、ＡｂＥと同等のａＰＴＴ用量反応曲線をＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５で観察する。

【0511】

このアッセイで使用されたＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＡｂＥは、質量分析によって１００％のヘテロ二量体であり、ホモ二量体汚染物質は検出されなかったと判断された。

【0512】

実施例２３．抗ＦＶＩＩＩ阻害抗体の存在下での活性
患者が外因的に投与されたＦＶＩＩＩに対して同種抗体を産生した場合、第ＶＩＩＩ因子補充療法は、血友病Ａの患者の治療に効果がなくなる可能性がある。阻害性抗ＦＶＩＩＩ同種抗体は、ＦＩＸ、リン脂質、およびヴォン・ヴィレブランド因子のＦＶＩＩＩへの結合を遮断し、ＦＶＩＩＩを不活性にし得る。

【0513】

有利なことに、治療用二重特異性抗体は、同種抗体がＦＶＩＩＩに特異性を有するため、患者の血液中のＦＶＩＩＩ同種抗体の存在に対して非感受性である。これは、阻害性患者から採取した血漿中の止血を機能的に回復する二重特異性抗体の能力によって確認される。この実施例では、本発明者らは、２つの止血アッセイ：阻害性同種抗体を有する血友病Ａを有する患者からの血漿（「阻害剤血漿」と呼ばれる）を使用する、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）およびトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）、を使用してこれを実証する。凝固時間の回復は、分析された二重特異性抗体がＦＶＩＩＩ阻害性同種抗体の存在下で機能的であることを示した。したがって、本明細書で提示されたデータは、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５が、ＦＶＩＩＩに対する阻害性同種抗体を有する患者の凝固時間を機能的に救済できることを示している。

【0514】

ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）アッセイまたはナイメゲン（Ｎｉｊｍｅｇｅｎ）改変ベセスダアッセイを使用して、ＦＶＩＩＩに対する同種抗体の力価を測定する。これらのアッセイでは、患者の血漿の様々な希釈液を等量の「正常な」血漿と混合し、一定期間インキュベートし、ＦＶＩＩＩのレベルを測定する。残留ＦＶＩＩＩの減少が観察された場合、阻害剤の存在が示される。これらのアッセイの測定単位は、ベセスダ単位（ＢＵ）として知られている。ＢＵが高いほど、阻害が大きく、残留ＦＶＩＩＩ活性が低いことを示す。本明細書に記載される実験では、７０ＢＵの特定の阻害剤レベルを有する患者の血漿を使用した。

【0515】

ａＰＴＴ
ＩｇＧ４二重特異性抗体ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５、ＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５、およびＡｂＥをＣＨＯ細胞で発現させた後、プロテインＡクロマトグラフィー、続いて陽イオン交換クロマトグラフィーで精製し、活性ヘテロ二量体を汚染ホモ二量体から分離し、ａＰＴＴにより、６つの異なる濃度、３００、１００、３３.３、１１.１、３.７および１.２３ｎＭで分析した。ａＰＴＴは、実施例８に従って実行された。用量反応曲線から生成したデータは、非線形対数［抗体］対反応パラメーター可変勾配モデル（４パラメーターロジスティック回帰モデル）を使用して適合させた。ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５とＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５ＩｇＧ４抗体はどちらも、ＡｂＥと同様の方法で、阻害性患者試料の凝固障害を救済することができた。図４２。

【0516】

トロンビン生成アッセイ
阻害性血漿（７０ＢＵ）でのトロンビン生成は、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５、ＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５、ＡｂＥ ＩｇＧ４二重特異性抗体について、以下のプロテインＡ、その後の陽イオン交換クロマトグラフィーでの精製を用いて、決定された。実施例１３に従って、トロンビン生成アッセイを使用した。トロンビンピークがすべての二重特異性抗体で観察され、これは、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５の両方が、ＡｂＥと同様に、ＦＶＩＩＩに対する阻害性同種抗体を含有する血漿中の止血を機能的に回復できることを示している。

【0517】

各二重特異性抗体の用量反応を実行し、ピークトロンビン高さ（Ｃｍａｘ）を決定した。図４３。分析した濃度範囲では、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５のＣｍａｘ用量反応は、ＡｂＥのＣｍａｘよりも大きく、トロンビンバーストが大きいことを示し、ＩＸＡＸ－１２８０．０９９９．０３２５およびＩＸＡＸ－１４４１．０９９９．０３２５のＴｍａｘ用量反応は、ＡｂＥのＴｍａｘよりも低く、トロンビンバーストが速いことを示している。図４４。
＿＿＿＿＿＿＿＿

【0518】

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【0519】

ＦＩＸａ結合アームＶＨドメインポリペプチド配列

【表15-1】

【表15-2】

【表15-3】

【表15-4】

【表15-5】

【表15-6】

【表15-7】

【表15-8】

【表15-9】

【表15-10】

【表15-11】

【表15-12】

【表15-13】

【表15-14】

【表15-15】

【表15-16】

【表15-17】

【表15-18】

【表15-19】

【表15-20】

【表15-21】

【表15-22】

【表15-23】

【表15-24】

【表15-25】

【表15-26】

【表15-27】

【表15-28】

【表15-29】

【0520】

【表16-1】

【表16-2】

【0521】

ＦＸ結合アームＶＨドメインポリペプチド配列

【表17-1】

【表17-2】

【表17-3】

【0522】

【表18-1】

【表18-2】

【0523】

【表19-1】

【表19-2】

【表19-3】

【表19-4】

【表19-5】

【表19-6】

【表19-7】

【表19-8】

【表19-9】

【表19-10】

【表19-11】

【表19-12】

【表19-13】

【表19-14】

【表19-15】

【0524】

【表20-1】

【表20-2】

【表20-3】

【表20-4】

【表20-5】

【表20-6】

【表20-7】

【0525】

ヒト生殖細胞遺伝子セグメント

【表21】

【0526】

共通の軽鎖配列

【表22】

【0527】

【表23】

【0528】

【表24】

【0529】

共通の軽鎖Ｎ０１２８ＬとそのネイティブヒトＩｇλリーダー配列（ｖ３－２１リーダーペプチドＭＡＷＴＡＬＬＬＧＬＬＳＨＣＴＧＳＶＴ、配列番号５１９）を使用した二重特異性抗体の組換え発現により、Ｎ末端Ｓｅｒがクリッピングされ、ＶＬドメインがＮ０３２５ＶＬドメインについて本明細書に示される配列と同等な抗体を生じた。成熟軽鎖ポリペプチドがＳｅｒ後の切断によって生じる代替リーダー配列で使用するために、同じ成熟生成物を達成するために軽鎖０３２５が生成された。０３２５は、０１２８ＬのＮ末端Ｓｅｒ残基を省略している。

【0530】

定常領域

【表25-1】

【表25-2】

【表25-3】

【0531】

【表26-1】

【表26-2】

【0532】

【表27-1】

【表27-2】

【表27-3】

【表27-4】

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20-1】

【図20-2】

【図20-3】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33-1】

【図33-2】

【図34-1】

【図34-2】

【図35】

【図36】

【図37-1】

【図37-2】

【図38-1】

【図38-2】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【配列表】

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