特許 7530376 タンパク質の安定性を決定する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-30

(45)【発行日】2024-08-07

(54)【発明の名称】タンパク質の安定性を決定する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/15 20060101AFI20240731BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20240731BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240731BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240731BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20240731BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240731BHJP

【ＦＩ】

G01N33/15

G01N30/88 J ZNA

A61K38/02

A61K39/395 N

C07K16/18

C07K19/00

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2021547857

(86)(22)【出願日】2020-02-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-06

(86)【国際出願番号】 US2020018847

(87)【国際公開番号】W WO2020172293

(87)【国際公開日】2020-08-27

【審査請求日】2023-01-27

(31)【優先権主張番号】62/808,166

(32)【優先日】2019-02-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ウェン，ジエ

【審査官】倉持 俊輔

(56)【参考文献】

【文献】特表２００９－５３４３９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５０５５７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５３０９８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５２５４９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１０／００９３１００（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／１５

Ｇ０１Ｎ ３０／８８

Ａ６１Ｋ ３８／０２

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ｃ０７Ｋ １６／１８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

治療用タンパク質の安定性を評価する方法であって、
（ａ）前記治療用タンパク質の熱安定性を測定し、前記治療用タンパク質の熱変性温度Ｔ_ｍと、コントロールタンパク質のＴ_ｍとを比較する工程と、ここで、前記コントロールタンパク質のＴ_ｍと比較した前記治療用タンパク質のＴ_ｍの上昇は、前記治療用タンパク質の安定性の増加を示し、
（ｂ）前記治療用タンパク質のＴ_ｍ値と、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定された主要ピーク増減率との間の相関関係の統計的有意性を決定する工程と
を含み、前記治療用タンパク質のＴ_ｍは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定された主要ピーク増減率と統計的有意に相関する、方法。

【請求項2】

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した場合の治療用タンパク質の安定性を予測する方法であって、前記治療用タンパク質の熱安定性を測定する工程、及び前記治療用タンパク質の熱変性温度Ｔ_ｍと、コントロールタンパク質のＴ_ｍとを比較する工程を含み、前記治療用タンパク質のＴ_ｍは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定された主要ピーク増減率と統計的有意に相関する、方法。

【請求項3】

前記治療用タンパク質のＴ_ｍは、０．０５未満のｐ値で、ＳＥＣにより決定された主要ピーク増減率と相関する、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記治療用タンパク質のＴ_ｍは、０．０１未満のｐ値で、ＳＥＣにより決定された主要ピーク増減率と相関する、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項5】

前記治療用タンパク質のＴ_ｍは、０．００５未満のｐ値で、ＳＥＣにより決定された主要ピーク増減率と相関する、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項6】

熱安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）又は示差走査蛍光量測定（ＤＳＦ）により測定する、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項7】

統計的有意性を、線形回帰分析又は多項式回帰により決定する、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項8】

前記治療用タンパク質のＴ_ｍ値から、少なくとも６ヶ月の期間にわたる前記治療用タンパク質の安定性が予測される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項9】

前記治療用タンパク質のＴ_ｍ値から、サイズ排除クロマトグラフィーで測定した場合の治療用タンパク質の前記主要ピーク増減率が予測される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項10】

前記治療用タンパク質は、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片若しくは誘導体、多重特異性抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子、Ｆｃ融合分子、又は突然変異タンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項11】

前記モノクローナル抗体は、表Ａで表されているものからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子は、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＦＬＴ３、ＣＤ－１９、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＤＬＬ３、及びＣＤ－３の内の１つ又は複数に特異的に結合する、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記Ｆｃ融合分子又は前記突然変異タンパク質は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＣＤ１１２、ＣＤ１１２Ｒ、ＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲに特異的に結合する、請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

前記治療用タンパク質は、製剤中に存在する、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項15】

前記製剤中の前記治療用タンパク質の濃度は、７０ｍｇ／ｍＬ超である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記製剤中の前記治療用タンパク質の濃度は、７０ｍｇ／ｍｌ未満である、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記製剤中の前記治療用タンパク質の濃度は、５０ｍｇ／ｍＬ～２２０ｍｇ／ｍＬである、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０１９年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／８０８，１６６号明細書に対する優先権を主張するものであり、この明細書は、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表の参照による組み込み
本出願は、本開示の別個の一部として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５３５８３Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；２７０，０８２バイト－２０２０年２月１９日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、この配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示は、任意選択的に製剤中での治療用タンパク質の安定性を評価する方法であって、この治療用タンパク質の熱安定性を測定する工程を含み、熱安定性の値は、統計学的に有意に、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定された、この治療用タンパク質の主要ピーク増減率と相関する、方法を提供する。

【背景技術】

【0004】

タンパク質の安定性は、分子が大きい医薬品の製造可能性及び保存可能期間に重大な影響を及ぼしており、初期の分子評価での候補の選択の重要な属性の一つである。製剤緩衝液中での安定性が最適な候補分子を選択することにより、開発の後期に必要な分析が減少して時間及び資源が節約される。開発の初期に安定性の問題を特定することにより、タンパク質の安定性を改善して保存可能期間を増加させるために製剤の態様（例えば、緩衝剤、緩衝液、ｐＨ、添加剤）を変えることが可能になる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

タンパク質の安定性を測定するための現在のゴールドスタンダードは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法である。この方法は、時間と費用の両方がかかる。タンパク質の安定性を決定するための最も費用効率が高い方法が必要とされている。本開示は、熱安定性分析が、統計学的に有意に、ＳＥＣ法により決定されたタンパク質の安定性と相関することを実証する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、治療用タンパク質の安定性を評価する方法であって、この治療用タンパク質の熱安定性を測定する工程、及びこの治療用タンパク質の熱変性（融解）温度（Ｔ_ｍ）と、コントロールタンパク質のＴ_ｍとを比較する工程を含み、コントロールタンパク質のＴ_ｍと比較した治療用タンパク質のＴ_ｍの上昇は、この治療用タンパク質の安定性の増加を示し、この治療用タンパク質のＴ_ｍは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定されたタンパク質サイズでの主要ピーク増減率と統計的有意性で相関する、方法を提供する。

【0007】

本開示はまた、ＳＥＣにより測定した場合に治療用タンパク質の安定性を予測する方法であって、この治療用タンパク質の熱安定性を測定する工程、及びこの治療用タンパク質の変性（融解）温度（Ｔ_ｍ）と、コントロールタンパク質のＴ_ｍとを比較する工程を含み、この治療用タンパク質のＴ_ｍは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定されたタンパク質サイズでの主要ピーク増減率と統計的有意性で相関する、方法も提供する。

【0008】

本開示の方法のいずれかは、治療用タンパク質のＴ_ｍと、ＳＥＣにより決定された治療用タンパク質の主要ピークの変化との間の相関関係の統計的有意性を決定する工程をさらに含み得る。

【0009】

本開示の方法のいずれかにおいて、治療用タンパク質のＴ_ｍは、０．０５以下のｐ値で、又は０．０１以下のｐ値で、又は０．００５以下のｐ値で、又は０．００１以下のｐ値で、ＳＥＣにより決定されたタンパク質サイズでの主要ピーク増減率と相関する。加えて、統計的有意性を、線形回帰分析により決定するか、又はデータをフィットさせる他の方法（例えば多項式回帰）により決定する。

【0010】

例えば、治療用タンパク質のＴ_ｍ値の測定により、少なくとも１週間の期間にわたる、少なくとも２週間にわたる、少なくとも１ヶ月にわたる、少なくとも２ヶ月にわたる、少なくとも３ヶ月にわたる、少なくとも４ヶ月にわたる、少なくとも５ヶ月にわたる、少なくとも６ヶ月にわたる、少なくとも９ヶ月にわたる、少なくとも１２ヶ月にわたる、少なくとも１８ヶ月にわたる、少なくとも２年にわたる、又は少なくとも３年にわたる、製剤中でのこの治療用タンパク質の安定性が予測される。

【0011】

本開示の方法のいずれかにおいて、熱安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）又は示差走査蛍光量測定（ＤＳＦ）により測定する。これらの方法で使用されるＤＳＦは、ナノＤＳＦであり得る。

【0012】

加えて、これらの方法のいずれかにおいて、治療用タンパク質のＴ_ｍにより、サイズ排除クロマトグラフィーで測定した場合の治療用タンパク質の主要ピーク増減率が予測される。

【0013】

本開示の方法を、任意の治療用タンパク質に対して実行し得る。治療用タンパク質として、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））分子、Ｆｃ融合分子、及びムテインが挙げられる。

【0014】

例示的なモノクローナル抗体として、表Ａで表されているものが挙げられる。

【0015】

例示的なＢｉＴＥ分子として、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、ＦＬＴ３、ＣＤ－１９、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＤＬＬ３、及びＣＤ－３の内の１つ又は複数に特異的に結合するＢｉＴＥ分子が挙げられる。

【0016】

例示的なＦｃ融合分子として、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＣＤ１１２、ＣＤ１１２Ｒ、ＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲに特異的に結合するＦＣ融合タンパク質又はムテインが挙げられる。

【0017】

本開示の方法のいずれかにおいて、治療用タンパク質は製剤化されている。例えば、この治療用タンパク質は、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍＬ、１１０ｍｇ／ｍＬ、１２０ｍｇ／ｍＬ、１３０ｍｇ／ｍＬ、１４０ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１６０ｍｇ／ｍＬ、１７０ｍｇ／ｍＬ、１８０ｍｇ／ｍＬ、１９０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２１０ｍｇ／ｍＬ、及び２２０ｍｇ／ｍＬ、並びにこれらの間の全ての増分を超える濃度で製剤化されている。

【0018】

本開示をより容易に理解し得るために、本明細書では、ある特定の用語を定義する。ある特定の用語の定義は、詳細な説明の最後に記載されている。さらなる定義は、詳細な説明の全体を通して記載されている。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】様々な統計結果の代表的なレバレッジプロット（ｌｅｖｅｒａｇｅ ｐｌｏｔ）を示す。

【図2】ｍＡｂ製剤の安定性試験のＳＥＣ及びＤＳＣのデータのレバレッジプロットを示す。

【図3】ＢｉＴＥ製剤の安定性試験のＳＥＣ及びＤＥＳのデータのレバレッジプロットを示す。

【図4】Ｆｃムテインの安定性試験のＳＥＣ及びＤＥＳのデータのレバレッジプロットを示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本開示は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）又はナノ示差走査蛍光量測定（ＤＳＦ若しくはナノＤＳＦ）等の熱安定性分析を使用してタンパク質の安定性を決定する方法を提供する。本明細書で説明されている実験から、タンパク質サンプルの熱安定性属性（ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅ）を分析することは当技術分野での現在の標準的な方法：サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用してタンパク質サンプルの安定性を分析することと統計学的に有意に相関することが実証される。タンパク質サンプルの熱安定性を決定する方法は、ＳＥＣ法と比較して、労働集約性が低く、且つこの分析を実行するのに必要な時間及び資源（製品）が少ない。従って、タンパク質の安定性を決定するか又は予測するために熱安定性を使用する方法は、ＳＥＣの実行と比べて費用が有意に低いだろう。例えば、ＳＥＣは少なくとも２つの時点を必要とするが、本熱安定性法に必要な時点は１つのみであり、結果を得るための待ち時間がない。本開示の方法を、生物製剤開発の様々な段階（例えば、分子評価、製剤開発、タンパク質キャラクタリゼーション、及び規制当局への申請に必要な実験）に適用し得る。

【0021】

治療用タンパク質は、非生理的環境下で保存されるか又は生理的ストレスに曝される場合には、構造変化を受ける。この構造変化により、タンパク質の物理的特性の変化、溶解度の変化、凝集傾向の変化、及び表面活性の変化が誘発され、最終的には、可溶性凝集体、不溶性沈殿物、タンパク質のアンフォールド又はミスフォールドの折り畳み形態、タンパク質の変性形態等の望ましくない分解が引き起こされる。治療用タンパク質の安定性を測定することにより、このタンパク質内でのこれらの構造変化が測定される。本明細書で実証されるように、熱安定性を測定することにより、温度変化に応じたこれらの構造変化が測定される。

【0022】

現在の最先端では、ゼロ時点及び少なくとも別の時点（例えば、３７℃で６ヶ月）にて、ＳＥＣを使用してタンパク質サンプルが分析される。典型的なＳＥＣ分析には、サンプル中における約１ｍｇ／ｍｌの治療用タンパク質と、約２ｍｌ以上のサンプルサイズとが必要である。しかしながら、ＤＳＣに必要なのは、分析用に１つの時点のみであり、且つ約０．４ｍｌのサンプルサイズである。ナノＤＳＦに必要なサンプルサイズは、さらに小さい（約０．０１ｍＬ）。さらに重要なことに、熱安定性アッセイには、標準的なＳＥＣ法に必要とされるような長い保存期間が必要とされない。

【0023】

熱安定性を分析する方法は、当技術分野では現在、製剤中の治療用タンパク質の安定性を評価するためには使用されていない。本開示の方法は独特であり、なぜならば、この方法は、熱安定性分析が統計学的に有意にＳＥＣ分析と相関することを実証した、本明細書に記載されているデータに基づくからである。

【0024】

本開示の方法は、薬剤開発の全ての局面での製剤中における治療用タンパク質の安定性の分析に有用である。例えば、薬剤開発の初期段階では、この方法は、特定の製剤成分をさらに分析すべきか又はある特定の成分を開発の初期に除外しなければならないかどうかを決定するための迅速な分析を提供する。この方法はまた、短時間での多くの異なる製剤の分析も可能にし、これにより、研究者が、長期使用により適している特定の製剤成分に関する調査に集中することが可能になる。本開示の方法はまた、長い保存期間を必要とすることなく、製剤に対する小さな調整の迅速な試験も可能にする。

【0025】

本明細書に記載されている実験データから、熱安定性の値とＳＥＣにより測定された場合のタンパク質の安定性の値とが統計学的に有意に相関することが実証されており、このことは、これらの値が強い直線関係を有することを統計分析が示すことを意味する。有意水準は、一般的に、所与の統計モデルに関する確率（ｐ値）として示されており、統計的有意性は、０．０５未満のｐ値（ｐ＜０．０５）で示される。

【0026】

治療用タンパク質の安定性を考察する場合には、安定性を、「タンパク質の安定性」又はこの用語の下位態様（ｓｕｂ－ａｓｐｅｃｔ）と称され得る。例えば、「タンパク質の安定性」は、天然の立体構造形態でのタンパク質の属性と、化学的因子又は環境的因子（例えば、緩衝液のｐＨ、温度、塩類、機械的撹拌等）に応じた天然の形態に対する立体構造の変化（例えば、分解、変性、凝集、又は他の非天然の立体構造形態への変化）に抵抗する能力とを指す。製剤中における治療用タンパク質の安定性を決定するための一般的な方法は、ＳＥＣである。

【0027】

タンパク質の安定性の特定の態様は、熱安定性である。「熱安定性」は、温度変化に応じたタンパク質の形態における立体構造変化（例えば、分解、変性、凝集、又は非天然の立体構造形態への他の変化）に抵抗する、このタンパク質の属性を指す。本開示の方法のいずれかにおいて、熱安定性を、熱安定性を測定する任意の方法（例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）又は示差走査蛍光量測定（ＤＳＦ若しくはナノＤＳＦ））により測定する。

【0028】

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、タンパク質の安定性を決定するための慣行の現在の標準である。典型的なＳＥＣ安定性試験では、タンパク質のアリコートを、様々な時間にわたり様々な温度で保存する。各時点の終了時に、各タンパク質サンプルの主要ピークを、ＳＥＣを使用して分析する。ＳＥＣ法では、特定のサイズ分布の孔を有する球状ビーズからなるマトリックスに通すろ過を使用して、サイズに基づいて分子が分離される。様々なサイズの分子が、このマトリックス内の孔に入るか又はこの孔から除外される場合に、分離が起こる。小分子はこの孔中に拡散し、そのサイズに従って、カラムを通る小分子の流れが遅延されるが、大分子は、この孔には入らず、カラムの空隙容量に溶出される。その結果、分子は、カラムを通過する際に、この分子のサイズに基づいて分離し、分子量（ＭＷ）の小さい順に溶出される。主要ピークは、正確なＭＷで目的のタンパク質の嵩を表す。主要ピークでのタンパク質の量の任意の増減率は、タンパク質の不安定さ（例えば、分解、変性、凝集、又は他の非天然の立体構造形態）を示す。

【0029】

熱安定性を決定する方法
本開示の方法は、任意選択的に製剤中での治療用タンパク質に対して熱安定性（Ｔ_ｍ）分析を実行する工程を使用する。「熱安定性分析」は、いくつかの物理的パラメータが温度の関数として決定される及び／又は記録される技術を指す。熱安定性は、温度変化に応じたタンパク質の天然構造における立体構造変化（例えば、分解、変性、凝集、又は他の非天然の立体構造）に抵抗する、このタンパク質の属性を指す。

【0030】

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、調節された温度の上昇又は低下内でサンプル中に起こる熱エネルギーの取り込みの直接評価のための熱力学的ツールである。熱力測定は、相転移をモニタリングするために適用される。ＤＳＣでは、物質の転移と関連する温度及び熱流量を時間及び温度の関数として決定する熱分析装置を使用して、温度の関数として熱容量が測定される。用語「熱容量」は、単位物質が保持し得るエネルギーの量を指す。熱容量は、温度と共に増加する。

【0031】

温度変化中に、ＤＳＣでは、タンパク質サンプルと参照物質との間の温度差に基づいて、このサンプルにより過剰に放射されるか又は吸収される熱量が測定される。この分析では、熱量計が、タンパク質サンプルの内外の熱を測定する。ＤＳＣ分析中に、サンプルセル（タンパク質サンプル）の熱容量と、参照セル（タンパク質を欠いている）の熱容量とが比較され、同時に、両方のセルの温度が徐々に上昇する。サンプル及び参照は両方とも、この分析全体を通してほぼ同一温度で維持される。これらのセルを加熱するのに必要なエネルギー流の差違が記録され、サンプルの熱容量を算出するために使用される。温度の関数として熱容量をプロットすることにより、ＤＳＣサーモグラムが作成される。タンパク質の変性転移は、熱容量の変化として検出される。実行後のデータ分析により、熱変性温度の中間点（Ｔ_ｍ）が得られる。ＤＳＣから得られた熱変成温度を使用して、タンパク質の熱安定性を評価し得る。ＤＳＣ分析を実行するのに必要なタンパク質の量は、ミリグラムである。Ｋｏｄｒｅ ｅｔ ａｌ．ＲＲＪＡ ３：１１－２２，２０１４及びＧｉｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ ｔｅｃｈ．，２１（４）：１６７－１９３，２０１０を参照されたい。

【0032】

ＤＳＣ分析を、熱流量ＤＳＣ、熱流束ＤＳＣ、入力補償型ＤＳＣ（ｐｏｗｅｒ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ ＤＳＣ）、変調型ＤＳＣ、ハイパーＤＳＣ、又は圧力ＤＳＣを使用して実行し得る。熱流束ＤＳＣでは、パンに封入されたサンプル材料と、空の参照パンとを、炉に囲まれた熱電ディスク上に置く。この炉は、直線的な加熱速度で加熱され、この熱は、熱電ディスクを介してサンプル及び参照パンに伝達される。しかしながら、サンプルの熱容量（Ｃ_ｐ）により、サンプルパンと参照パンとの間に温度差が生じ、この温度差は、領域熱電対（ａｒｅａ ｔｈｅｒｍｏｃｏｕｐｌｅ）により測定され、結果として生じる熱流量は、オームの法則（２点間の導体を流れる電流は、この２点間の電圧に正比例する）の熱当量により決定される。熱流束ＤＳＣでは、サンプル温度が一定速度で変化しつつ、サンプル及び参照への熱流量の差違が測定される。

【0033】

入力補償型ＤＳＣでは、サンプルパン及び参照パンが、別々のヒーターで加熱される別々の炉に入れられる。サンプル及び参照が同一温度で維持され、これらを同一温度で維持するのに必要な熱出力の差違が測定され、温度又は時間の関数としてプロットされる。入力補償型ＤＳＣでは、サンプル及び参照の温度が互いに等しく保たれ、同時に両方の温度が直線的に上昇するか又は下降する。サンプル温度を参照温度に等しく維持するのに必要な電力が測定される。

【0034】

変調型ＤＳＣでは、熱流束ＤＳＣ法と同一の加熱及びセル配置が使用される。高速スキャンＤＳＣでは、古典的な入力補償型ＤＳＣと比べて早い、特に冷却による高速直線制御速度（最大５００Ｋ／分）で、有効な熱流量測定を実施し得る。標準的なＤＳＣは、１０Ｋ／分未満で動作する。圧力ＤＳＣでは、サンプルを、異なる圧力にかけ得、そのため、プロセスの圧力での物質のキャラクタリゼーション又は重複するピーク間の区別が可能になる。

【0035】

さらなるＤＳＣベースの技術として、下記が挙げられる：従来／基本のＤＳＣ、微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）－ＤＳＣ、赤外線（ＩＲ）加熱型ＤＳＣ、変調温度ＤＳＣ（ＭＴＤＳＣ）、気体流量変調型ＤＳＣ（ＧＦＭＤＳＣ）、並行ナノＤＳＣ（ＰＮＤＳＣ）、圧力摂動熱量測定（ＰＰＣ）、自己参照ＤＳＣ（ＳＲＤＳＣ）、及び高性能（ＨＰｅｒ）ＤＳＣ。ＤＳＣの用途として、構造相転移、融点、融解熱、結晶化度の割合、結晶化速度論及び相転移、酸化安定性、生体分子の熱力学分析、並びに非生体材料の硬化速度論の決定が知られている。ＤＳＣの利点は、分析の実行の容易さ、及びこの分析を使用して製品の遷移を観察し得る速度である。

【0036】

示差走査蛍光量測定（ＤＳＦ）
示差走査蛍光量測定（ＤＳＦ）は、固有の蛍光強度比（３５０：３３０ｎｍ）の変化を温度の関数として測定する。芳香族アミノ酸残基（トリプトファン、チロシン、及びフェニルアラニン）を含むタンパク質は、固有の蛍光を示す。分子が展開する場合には、この芳香族アミノ酸残基の位置が変化し、その結果、蛍光スペクトルが変化する。ＤＳＦ分析又はナノＤＳＦ分析の最中に、この固有の蛍光強度比（３５０：３３０ｎｍ）が、連続的に測定されて記録される。この固有の蛍光強度比（又はこの比の一次導関数）の温度の関数としてのプロットにより、ＤＳＦサーモグラムが作成される。実行後のデータ解析により、熱変性温度の中間点（Ｔ_ｍ）が得られる。ＤＳＦから得られた熱変性温度を使用して、タンパク質の熱安定性を評価し得る。

【0037】

相関関係
統計的アプローチを使用して、タンパク質の安定性を予測するための熱安定性属性の使用の可能性を評価する。統計学的な仮説検証では、ある試験で定義される有意水準αとは、帰無仮説が真実であると仮定すると、この試験の、この帰無仮説を拒絶する確率のことである。試験の有意水準は、典型的には５％（０．０５）に設定される。ｐ値は、帰無仮説の検証の文脈では、統計的有意性の考えを定量するために使用される。ｐ値とは、所与の統計モデルに関する算出された確率のことである。所与の統計モデルの結果（即ち予測）は、ｐ＜α（即ちｐ＜０．０５）の場合に統計的に有意と見なされる。

【0038】

本明細書で説明されている方法は、ＤＳＣ技術及びナノＤＳＦ技術を使用して熱安定性を分析する。実施例で示されているデータから、標的タンパク質のＤＳＣ及びナノＤＳＦ分析は、同一の治療用タンパク質に対してＳＥＣを使用して実行したタンパク質の安定性分析と相関することが実証される。本開示は、タンパク質の安定性の決定において現在標準であるＳＥＣ分析により決定された場合のタンパク質サイズの変化率と相関し得る熱安定性を決定する他の方法を使用することを企図する。これらの方法のいずれに関しても、熱変性温度（Ｔ_ｍ）の属性と、ＳＥＣにより決定された場合のタンパク質の安定性値（タンパク質サイズの変化率）との相関関係を評価して、この相関関係が統計的に有意であるかどうかを決定すべきである。

【0039】

この相関関係を、データを解析するために線形回帰を使用して評価し得る。線形回帰は、従属変数と、１つ又は複数の独立変数（又は説明変数）との間の関係をモデル化するための線形アプローチである。説明関数が１つの場合は、単純線形回帰と呼ばれる。単純線形回帰は、Ｙ＝ａ＋ｂＸという形の方程式を有し、ここで、Ｘは、説明関数であり、Ｙは、従属変数である。本発明では、従属変数は、安定性（ＭＰ％）であり、独立変数は、例えばＴ_ｍである。線形回帰では、補正を示すためにレバレッジプロットが作成される。このレバレッジプロットは、値がモデル内にあるかどうか、又はこの場合には熱安定性データがＳＥＣ分析と統計的に有意に相関するかどうかを示す。信頼曲線がレバレッジプロットのｘ軸と交差する場合には、相関関係は統計的に有意である。加えて、相関関係は、ｐ値が０．０５未満である場合には統計的に有意であるだろう。

【0040】

線形回帰、多項式回帰、又は相関関係を決定するための他の方法を決定するために使用され得るデータ解析ソフトウェアの例として、下記が挙げられる：ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｏｒｉｇｉｎ ７ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ；Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）、ＭＰ（登録商標）統計ソフトウェア（ＳＡＳ，Ｃａｒｙ ＮＣ）、ＩＢＭ（登録商標）ＳＰＳＳソフトウェア（Ａｒｍｏｎｋ，ＮＹ）、ＳＡＳ／ＳＴＡＴ（登録商標）（Ｃａｒｙ，ＮＣ）、ＳＴＡＴＡ（登録商標）（ＳｔａｔａＣｏｒｐ，Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸ）、Ｐｙｔｈｏｎ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、ＲＳｔｕｄｉｏ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、及びＰＳＰＰ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。

【0041】

治療用タンパク質
「治療用タンパク質」は、治療用の生物活性を示す任意のタンパク質分子を指す。本開示の一実施形態では、この治療用タンパク質分子は、完全長タンパク質である。他の実施形態では、この治療用タンパク質は、完全長タンパク質の活性フラグメントである。本開示の様々な実施形態では、この治療用タンパク質は、その天然の供給源から生成されて精製され得る。或いは、本開示によれば、用語「治療用組換えタンパク質」は、組換えＤＮＡ技術により得られた任意の治療用タンパク質を含む。

【0042】

タンパク質（例えば、下記の内の１つ又は複数に結合するもの）は、本開示の方法で有用であり得る。これとして、下記が挙げられる：ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、及びＣＤ３４；例えば、受容体結合を妨害するもの。ＨＥＲ受容体ファミリタンパク質、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、及びＥＧＦ受容体。細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ－Ｉ、ＭｏＩ、ｐｌ５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－Ｉ、ＶＣＡＭ、及びアルファｖ／ベータ３インテグリン。増殖因子、例えば、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、ミュラー管阻害物質、ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ－Ｉ－アルファ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、神経成長因子、例えばＮＧＦ－ベータ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子、例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、特に、ＴＧＦ－α及びＴＧＦ－β、例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、又はＴＧＦ－β５、インスリン様増殖因子Ｉ及びインスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ｄｅｓ（ｌ－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、並びに骨誘導因子。インスリン及びインスリン関連タンパク質、例えば、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、及びインスリン様増殖因子結合タンパク質。凝固及び凝固関連タンパク質、特に、第ＶＩＩＩ因子、組織因子、フォン・ヴィレブランド因子、プロテインＣ、α－１－アンチトリプシン、プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼ及び組織プラスミノーゲン活性化因子（「ｔ－ＰＡ」）、ボンバジン（ｂｏｍｂａｚｉｎｅ）、トロンビン、及びトロンボポエチン；（ｖｉｉ）他の血液タンパク質及び血清タンパク質、例えば、限定されないが、アルブミン、ＩｇＥ、及び血液型抗原。コロニー刺激因子及びその受容体、特に、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ、並びにこれらの受容体、例えばＣＳＦ－１受容体（ｃ－ｆｍｓ）。受容体及び受容体関連タンパク質、例えば、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、ＬＤＬ受容体、成長ホルモン受容体、トロンボポエチン受容体（「ＴＰＯ－Ｒ」、「ｃ－ｍｐｌ」）、グルカゴン受容体、インターロイキン受容体、インターフェロン受容体、Ｔ細胞受容体、幹細胞因子受容体、例えばｃ－Ｋｉｔ、及び他の受容体。受容体リガンド、例えば、ＯＸ４０受容体のリガンドであるＯＸ４０Ｌ。神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及びニューロトロフィン－３、－４、－５、又は－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、又はＮＴ－６）。リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、及びプロリラキシン；インターフェロン及びインターフェロン受容体、例えば、インターフェロン－α、－β、及び－γ、並びにこれらの受容体。インターロイキン及びインターロイキン受容体、例えば、ＩＬ－Ｉ～ＩＬ－３３及びＩＬ－Ｉ～ＩＬ－３３受容体、特に、ＩＬ－８受容体。ウイルス抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープウイルス抗原。リポタンパク質、カルシトニン、グルカゴン、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性物質、腫瘍壊死因子アルファ及びベータ、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ＤＮＡｓｅ、インヒビン、及びアクチビン。インテグリン、プロテインＡ又はＤ、リウマチ因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、スーパーオキシド・ジスムターゼ、表面膜タンパク質、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＡＩＤＳエンベロープ、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、イムノアドヘシン、抗体。ミオスタチン、ＴＡＬＬタンパク質、例えばＴＡＬＬ－Ｉ、アミロイドタンパク質、例えば、限定されないが、アミロイドベータタンパク質、胸腺間質性リンパ球新生因子（「ＴＳＬＰ」）、ＲＡＮＫリガンド（「ＯＰＧＬ」）、ｃ－ｋｉｔ、ＴＮＦ受容体、例えばＴＮＦ受容体１型、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、アンジオポエチン、並びに前述の何れかの生物活性フラグメント又は類似体又はバリアント。

【0043】

例示的なポリペプチド及び抗体として、下記が挙げられる：Ａｃｔｉｖａｓｅ（登録商標）（アルテプラーゼ）；アリロクマブ、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダルベポエチン－アルファ）、Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標）（エポエチンアルファ、又はエリスロポエチン）；Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）（インターフェロンβ－Ｉａ）；Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（トシツモマブ）；Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）（インターフェロン－β）；ボコシズマブ（Ｌ１Ｌ３と呼ばれる抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体、米国特許第８，０８０，２４３号明細書を参照されたい）；Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）（アレムツズマブ）；Ｄｙｎｅｐｏ（登録商標）（エポエチンデルタ）；Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（ボルテゾミブ）；ＭＬＮ０００２（抗α４β７ Ａｂ）；ＭＬＮ１２０２（抗ＣＣＲ２ケモカイン受容体Ａｂ）；Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）；Ｅｐｒｅｘ（登録商標）（エポエチンアルファ）；Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）；エボロクマブ；Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（登録商標）（ソマトロピン）；Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）；Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（登録商標）（ソマトロピン［ｒＤＮＡ起源］注射用）；Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）（アダリムマブ）；Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）（インターフェロンアルファコン－１）；Ｎａｔｒｅｃｏｒ（登録商標）（ネシリチド）；Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標）（アナキンラ）；Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（サルグラモスチム）；ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（登録商標）（エプラツズマブ）；Ｂｅｎｌｙｓｔａ（商標）（ベリムマブ）；Ｍｅｔａｌｙｓｅ（登録商標）（テネクテプラーゼ）；Ｍｉｒｃｅｒａ（登録商標）（メトキシポリエチレングリコール－エポエチンベータ）；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン）；Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）（エファリズマブ）；Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）（セルトリズマブペゴル）；Ｓｏｌｉｒｉｓ（商標）（エクリズマブ）；パキセリズマブ（抗Ｃ５補体）；ＭＥＤＩ－５２４（Ｎｕｍａｘ（登録商標））；Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ）；エドレコロマブ（Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標））；Ｔｒａｂｉｏ（登録商標）（レルデリムマブ）；ＴｈｅｒａＣｉｍ ｈＲ３（ニモツズマブ）；Ｏｍｎｉｔａｒｇ（ペルツズマブ、２Ｃ４）；Ｏｓｉｄｅｍ（登録商標）（ＩＤＭ－Ｉ）；ＯｖａＲｅｘ（登録商標）（Ｂ４３．１３）；Ｎｕｖｉｏｎ（登録商標）（ビシリズマブ）；カンツズマブメルタンシン（ｈｕＣ２４２－ＤＭｌ）；ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）（エポエチンベータ）；Ｎｅｕｍｅｇａ（登録商標）（オプレルベキン）；Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）（ペグ化フィルグラスチム、ペグ化Ｇ－ＣＳＦ、ペグ化ｈｕ－Ｍｅｔ－Ｇ－ＣＳＦ）；Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（フィルグラスチム）；Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３（登録商標）（ムロモナブ－ＣＤ３）、Ｐｒｏｃｒｉｔ（登録商標）（エポエチンアルファ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（インフリキシマブ）、Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標）（アブシキマブ）、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）（抗ＩＬ６受容体Ａｂ）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、ＨｕＭａｘ－ＣＤ４（ザノリムマブ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）、Ｒｏｆｅｒｏｎ－Ａ（登録商標）－（インターフェロンアルファ－２ａ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）（バシリキシマブ）、Ｓｔｅｌａｒａ（商標）（ウステキヌマブ）、Ｐｒｅｘｉｇｅ（登録商標）（ルミラコキシブ）、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）；１４６Ｂ７－ＣＨＯ（抗ＩＬ１５抗体、米国特許第７，１５３，５０７号明細書を参照されたい）、Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）（ナタリズマブ）；Ｖａｌｏｒｔｉｍ（登録商標）（ＭＤＸ－１３０３、抗炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）防御抗原Ａｂ）；ＡＢｔｈｒａｘ（商標）；Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）；Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）（オマリズマブ）、ＥＴＩ２１１（抗ＭＲＳＡ Ａｂ）、ＩＬ－Ｉ Ｔｒａｐ（ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分及びＩＬ－Ｉ受容体成分の両方の細胞外ドメイン（Ｉ型受容体及び受容体アクセサリータンパク質））、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ（ＩｇＧ１ Ｆｃに融合したＶＥＧＦＲｌのＩｇドメイン）、Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）（ダクリズマブ）；Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）（ダクリズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン）、Ｚｅｔｉａ（エゼチミブ）、Ａｔａｃｉｃｅｐｔ（ＴＡＣＩ－Ｉｇ）、抗α４β７ Ａｂ（ベドリズマブ）；ガリキシマブ（抗ＣＤ８０モノクローナル抗体）、抗ＣＤ２３ Ａｂ（ルミリキシマブ）；ＢＲ２－Ｆｃ（ｈｕＢＲ３／ｈｕＦｃ融合タンパク質、可溶性ＢＡＦＦアンタゴニスト）；Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標）（ゴリムマブ）；マパツズマブ（ヒト抗ＴＲＡＩＬ受容体－１ Ａｂ）；オクレリズマブ（抗ＣＤ２０ヒトＡｂ）；ＨｕＭａｘ－ＥＧＦＲ（ザルツムマブ）；Ｍ２００（ボロシキシマブ、抗α５β１インテグリンＡｂ）；ＭＤＸ－０１０（イピリムマブ、抗ＣＴＬＡ－４ Ａｂ及びＶＥＧＦＲ－Ｉ（ＩＭＣ－１８Ｆ１）；抗ＢＲ３ Ａｂ；抗Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ及び毒素Ｂ Ｃ Ａｂｓ ＭＤＸ－０６６（ＣＤＡ－Ｉ）及びＭＤＸ－１３８８）；抗ＣＤ２２ ｄｓＦｖ－ＰＥ３８コンジュゲート（ＣＡＴ－３８８８及びＣＡＴ－８０１５）；抗ＣＤ２５ Ａｂ（ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ）；抗ＴＳＬＰ抗体；抗ＴＳＬＰ受容体抗体（米国特許第８，１０１，１８２号明細書を参照されたい）；Ａ５と呼ばれる抗ＴＳＬＰ抗体（米国特許第７，９８２，０１６号明細書を参照されたい）；（抗ＣＤ３ Ａｂ（ＮＩ－０４０１）を参照されたい；アデカツムマブ（ＭＴ２０１、抗ＥｐＣＡＭ－ＣＤ３２６ Ａｂ）；ＭＤＸ－０６０、ＳＧＮ－３０、ＳＧＮ－３５（抗ＣＤ３０ Ａｂ）；ＭＤＸ－１３３３（抗ＩＦＮＡＲ）；ＨｕＭａｘ ＣＤ３８（抗ＣＤ３８ Ａｂ）；抗ＣＤ４０Ｌ Ａｂ；抗Ｃｒｉｐｔｏ Ａｂ；抗ＣＴＧＦ特発性肺線維症Ｉ期フィブロジェン（ＦＧ－３０１９）；抗ＣＴＬＡ４ Ａｂ；抗ｅｏｔａｘｉｎｌ Ａｂ（ＣＡＴ－２１３）；抗ＦＧＦ８ Ａｂ；抗ガングリオシドＧＤ２ Ａｂ；抗スクレロスチン抗体（米国特許第８，７１５，６６３号明細書又は米国特許第７，５９２，４２９号明細書を参照されたい）、Ａｂ－５と呼ばれる抗スクレロスチン抗体（米国特許第８，７１５，６６３号明細書又は米国特許第７，５９２，４２９号明細書を参照されたい）；抗ガングリオシドＧＭ２ Ａｂ；抗ＧＤＦ－８ヒトＡｂ（ＭＹＯ－０２９）；抗ＧＭ－ＣＳＦ受容体Ａｂ（ＣＡＭ－３００１）；抗ＨｅｐＣ Ａｂ（ＨｕＭａｘ ＨｅｐＣ）；ＭＥＤＩ－５４５、ＭＤＸ－１１０３（抗ＩＦＮα Ａｂ）；抗ＩＧＦＩＲ Ａｂ；抗ＩＧＦ－ＩＲ Ａｂ（ＨｕＭａｘ－Ｉｎｆｌａｍ）；抗ＩＬ１２／ＩＬ２３ｐ４０ Ａｂ（ブリアキヌマブ）；抗ＩＬ－２３ｐ１９ Ａｂ（ＬＹ２５２５６２３）；抗ＩＬ１３ Ａｂ（ＣＡＴ－３５４）；抗ＩＬ－１７ Ａｂ（ＡＩＮ４５７）；抗ＩＬ２Ｒａ Ａｂ（ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ）；抗ＩＬ５ 受容体Ａｂ；抗インテグリン受容体Ａｂ（ＭＤＸ－Ｏｌ８、ＣＮＴＯ ９５）；抗ＩＰＩＯ潰瘍性大腸炎Ａｂ（ＭＤＸ－１１００）；抗ＬＬＹ抗体；ＢＭＳ－６６５１３；抗マンノース受容体／ｈＣＧβ Ａｂ（ＭＤＸ－１３０７）；抗メソセリンｄｓＦｖ－ＰＥ３８コンジュゲート（ＣＡＴ－５００１）；抗ＰＤｌＡｂ（ＭＤＸ－１ １０６（ＯＮＯ－４５３８））；抗ＰＤＧＦＲα抗体（ＩＭＣ－３Ｇ３）；抗ＴＧＦβ Ａｂ（ＧＣ－１００８）；抗ＴＲＡＩＬ受容体－２ヒトＡｂ（ＨＧＳ－ＥＴＲ２）；抗ＴＷＥＡＫ Ａｂ；抗ＶＥＧＦＲ／Ｆｌｔ－１ Ａｂ；抗ＺＰ３ Ａｂ（ＨｕＭａｘ－ＺＰ３）；ＮＶＳ抗体＃１；ＮＶＳ抗体＃２；並びに配列（配列番号８及び配列番号６）を含むアミロイド－ベータモノクローナル抗体（米国特許第７，９０６，６２５号明細書を参照されたい）。

【0044】

本開示の方法に適した抗体の例として、表Ａで示される抗体が挙げられる。好適な抗体のその他の例として、下記が挙げられる：インフリキシマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、セツキシマブ、パリビズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アラシズマブペゴル、ａｌｄ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトクス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アルチヌマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、トシリズマブ、バピヌズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビバツズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ｃｃ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、クレネズマブ、ｃｒ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デミシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュピルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴル、エノキズマブ、エノキズマブ、エノチクマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エクスビビルマブ、エクスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ｆｂｔａ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ｇｓ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツズマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモナブ－ｃｄ３、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトクス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パジバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ １４０、クイリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレデュマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトクス、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、トレメリムマブ、チシリムマブ、チルドラキズマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ－６５０、トシリズマブ、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマフォドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ、及びゾリモマブアリトクス。

【0045】

本開示の製剤及び方法での使用に最も好ましい抗体は、アダリムマブ、ベバシズマブ、ブリナツモマブ、セツキシマブ、コナツムマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エレヌマブ、エボロクマブ、インフリキシマブ、ナタリズマブ、パニツムマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロモソズマブ、及びトラスツズマブ、並びに表Ａから選択される抗体である。

【0046】

【表1】

【0047】

【表2】

【0048】

ムテイン
ムテインは、核酸配列の変異（例えば、置換、欠失、又は挿入）に起因するアミノ酸変化を少なくとも有するタンパク質である。例示的なムテインは、野生型アミノ酸配列に対して少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は約９０％超（例えば、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。加えて、ムテインは、上記で説明されている融合タンパク質であり得る。

【0049】

例示的な実施形態では、ムテインは、野生型のアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、このアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸の、同様の特性（例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性、及び／又は芳香性）を有する別のアミノ酸による置換を指し、下記の５つの群の内の１つ内での交換が挙げられる：
Ｉ．小さい脂肪族の非極性か又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負に帯電した残基、並びにそのアミド及びエステル：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、システイン酸、及びホモシステイン酸；
ＩＩＩ．極性の正に耐電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大きい脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。

【0050】

例示的な実施形態では、ムテインは、野生型のアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、このアミノ酸置換は、非保存的アミノ酸置換である。本明細書で使用される場合、用語「非保存的アミノ酸置換」は、本明細書では、あるアミノ酸の、異なる特性（例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性、及び／又は芳香性）を有する別のアミノ酸による置換と定義され、上記５つの群以外の交換が挙げられる。

【0051】

例示的な態様では、ムテインは、野生型のアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、この置換アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。「天然に存在するアミノ酸」、又は「標準アミノ酸」、又は「正規アミノ酸」は、ユニバーサル遺伝子コードのコドンにより直接コードされる、真核生物中で見出される２０種のアルファアミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の内の１つを意味する。例示的な態様では、ムテインは、野生型のアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、この置換アミノ酸は、非標準アミノ酸であるか、又は翻訳中にタンパク質に組み込まれないアミノ酸である。非標準アミノ酸として下記が挙げられるが、これらに限定されない：セレノシステイン、ピロールリシン、オルニチン、ノルロイシン、β－アミノ酸（例えば、β－アラニン、β－アミノイソ酪酸、β－フェニルアラニン、β－ホモフェニルアラニン、β－グルタミン酸、β－グルタミン、β－ホモトリプトファン、β－ロイシン、β－リシン）、ホモ－アミノ酸（例えば、ホモフェニルアラニン、ホモセリン、ホモアルギニン、モノシステイン、ホモシステイン）、Ｎ－メチルアミノ酸（例えば、Ｌ－アブリン、Ｎ－メチル－アラニン、Ｎ－メチル－イソロイシン、Ｎ－メチル－ロイシン）、２－アミノカプリル酸、７－アミノセファロスポラニン酸、４－アミノ桂皮酸、アルファ－アミノシクロヘキサンプロピオン酸、アミノ－（４－ヒドロキシフェニル）酢酸、４－アミノ－ニコチン酸、３－アミノフェニル酢酸、及び同類のもの。

【0052】

ＢｉＴＥ分子
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子は、互いに連結された２つの抗体結合ドメイン（又はターゲティング領域）を含む二重特異性抗体コンストラクト又は二重特異性融合タンパク質である。この分子の一方のアームは、細胞傷害性Ｔ細胞の表面上で見出されるタンパク質と結合するように操作されており、他方のアームは、主に腫瘍細胞上で見出される特定のタンパク質に結合するように設計されている。両方の標的が関与している場合には、ＢｉＴＥ分子は、細胞傷害性Ｔ細胞と腫瘍細胞との間に架橋を形成し、この架橋により、Ｔ細胞は、腫瘍細胞を認識して毒性分子の注入により腫瘍細胞と戦い得る。例えば、この分子の腫瘍結合アームを、異なるタイプの癌を標的とする異なるＢｉＴＥ抗体コンストラクトが作られるように変更し得る。

【0053】

ＢｉＴＥ分子に関する用語「結合ドメイン」は、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープ又は所与の標的部位と（特異的に）結合する／これらと相互作用する／これらを認識するドメインを指す。第１の結合ドメインの構造及び機能（腫瘍細胞抗原の認識）、並びに好ましくは、同様に第２の結合ドメイン（細胞傷害性Ｔ細胞抗原）の構造及び／又は機能は、抗体（例えば、完全長免疫グロブリン分子又は全免疫グロブリン分子）の構造及び／又は機能に基づく。

【0054】

「エピトープ」は、結合ドメイン（例えば、抗体若しくは免疫グロブリン、又は抗体若しくは免疫グロブリンの誘導体若しくはフラグメント）が特異的に結合する抗原上の部位を指す。「エピトープ」は抗原性であり、そのため、用語エピトープは、本明細書では「抗原性構造」又は「抗原決定基」と称される場合もある。そのため、結合ドメインは、「抗原相互作用部位」である。前記結合／相互作用は、「特異的認識」を定義するとも理解される。

【0055】

例えば、ＢｉＴＥ分子は、３つの軽鎖ＣＤＲ（即ち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに３つの重鎖ＣＤＲ（即ち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）の存在を特徴とする第１の結合ドメインを含む。第２の結合ドメインは、好ましくは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件も含む。より好ましくは、第２の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（即ち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（即ち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む。第１及び／又は第２の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体由来のＣＤＲ配列の足場への移植ではなく、ファージディスプレイ法又はライブラリスクリーニング法により作製されるか又は得られることが想定される。

【0056】

結合ドメインは、典型的には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得るが、両方を含む必要はない。Ｆｄフラグメントは、例えば、２つのＶＨ領域を有し、多くの場合には、インタクトな抗原結合ドメインの一部の抗原結合機能を保持する。（改変された）抗原結合抗体フラグメントの例として、（１）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインを有する一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（２）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを有する二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（３）２つのＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント；（４）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインを有するＦｖフラグメント、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに（７）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられ、後者が好ましい（例えば、ｓｃＦＶライブラリ由来）。

【0057】

ＢｉＴＥ分子に関する用語「に（特異的に）結合する」、「（特異的に）認識する」、「（特異的に）向けられる」、及び「と（特異的に）反応する」は、標的のタンパク質又は抗原上に位置するエピトープの１つ又は複数の、好ましくは少なくとも２つの、より好ましくは少なくとも３つの、最も好ましくは少なくとも４つのアミノ酸と相互作用するか又は特異的に相互作用する結合ドメインを指す。

【0058】

用語「可変」は、配列内で可変性を示し且つ特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する、抗体又は免疫グロブリンドメインの部分（即ち「可変ドメイン」）を指す。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）との対形成により、単一の抗原結合部位が形成される。ＶＨに最も近接するＣＨドメインは、ＣＨ１と称される。各軽（Ｌ）鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合により重（Ｈ）鎖に連結されるが、２本のＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ又は複数のジスルフィド結合により互いに連結される。

【0059】

可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく；重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の各々のサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存的な（即ち非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭ）と呼ばれ、抗原結合表面を形成するために、三次元空間内において６つのＣＤＲのための足場を提供する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がβシート配置をとる４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含み、ループ接続を形成し、場合によりβシート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって接続される。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭにより近接して一体に保持されており、他の鎖の超可変領域と共に、抗原結合部位の形成に寄与する（前掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。定常ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能（例えば、抗体依存性、細胞介在性の細胞傷害性、及び補体活性化）を示す。

【0060】

軽鎖のＣＤＲ３、及び特に重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖の可変領域内での抗原結合において最も重要な決定因子を構成する場合がある。いくつかの抗体コンストラクトでは、重鎖ＣＤＲ３が抗原と抗体との間の主要な接触領域を構成すると思われる。ＣＤＲ３のみを変化させるインビトロ選択スキームを使用して、抗体の結合特性を変化させ得るか又はどの残基が抗原の結合に寄与するかを決定し得る。従って、ＣＤＲ３は、典型的には、抗体結合部位内における分子多様性の最大の供給源である。例えば、Ｈ３は、２つのアミノ酸残基ほど短いものであり得るか、又は２６個超のアミノ酸であり得る。

【0061】

構築及び体細胞変異の後の抗体遺伝子の配列は、極めて多様であり、これらの多様化した遺伝子は、１０１０種の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。従って、免疫系は、免疫グロブリンのレパートリーを提供する。用語「レパートリー」は、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列に全体又は一部が由来する少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。この配列は、重鎖のＶセグメント、Ｄセグメント、及びＪセグメント、並びに軽鎖のＶセグメント及びＪセグメントのインビボでの再編成により生成され得る。或いは、この配列は、再編成を生じさせる、例えばインビトロでの刺激に応答して、細胞から生成され得る。或いは、この配列の一部又は全てを、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、変異誘発、及び他の方法により得ることができる（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照されたい）。レパートリーは、１つの配列のみを含み得るか、又は遺伝的に多様なコレクション内のものを含む複数の配列を含み得る。

【0062】

用語「二重特異性」は、本明細書で使用される場合、「少なくとも二重特異性」である抗体コンストラクトを指し、即ち、この抗体コンストラクトは、少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインは、ある抗原又は標的に結合し、第２の結合ドメインは、別の抗原又は標的に結合する。従って、ＢｉＴＥ分子内の抗体コンストラクトは、少なくとも２種の異なる抗原又は標的に対する特異性を含む。本発明の用語「二重特異性抗体コンストラクト」は、多重特異性抗体コンストラクト、例えば３つの結合ドメインを含む三重特異性抗体コンストラクト又は３つ超（例えば、４つ、５つ．．．）の特異性を有するコンストラクトも包含する。

【0063】

ＢｉＴＥ分子内の抗体コンストラクトの少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメインは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでもよいし含まなくてもよい。用語「ペプチドリンカー」は、本発明によれば、本発明の抗体コンストラクトの一方の（可変及び／又は結合）ドメイン及び他方の（可変及び／又は結合）ドメインのアミノ酸配列を互いに連結するアミノ酸配列を定義する。そのようなペプチドリンカーの必須の技術的特徴は、前記ペプチドリンカーがいかなる重合活性も含まないことである。好適なペプチドリンカーの内の１つは、米国特許第４，７５１，１８０号明細書及び同第４，９３５，２３３号明細書又は国際公開第８８／０９３４４号パンフレットで説明されているものである。

【0064】

リンカーが使用される場合、このリンカーは、好ましくは、第１及び第２のドメインのそれぞれが互いに独立してこれらの異なる結合特異性を確実に保持し得るのに十分な長さ及び配列からなる。ＢｉＴＥ分子内の抗体コンストラクト中の少なくとも２つの結合ドメイン（又は２つの可変ドメイン）を接続するペプチドリンカーの場合、これらのペプチドリンカーは、好ましくは、数個のアミノ酸残基（例えば１２個以下のアミノ酸残基）のみを含むものである。そのため、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、又は５個のアミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５個未満のアミノ酸を含む想定されるペプチドリンカーは、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸を含み、ここで、Ｇｌｙリッチリンカーが好ましい。前記「ペプチドリンカー」に関連して特に好ましい「単一」のアミノ酸は、Ｇｌｙである。従って、前記ペプチドリンカーは、単一のアミノ酸Ｇｌｙからなり得る。ペプチドリンカーの別の好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（即ちＧｌｙ４Ｓｅｒ）又はそのポリマー（即ち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘ）を特徴とし、ここで、ｘは、１以上の整数である。二次構造を促進しないことを含む前記ペプチドリンカーの特徴は、当技術分野で既知であり、例えばＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６－９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１－３０）、並びにＲａａｇ及びＷｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３－８０）で説明されている。いかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。前記ドメインの相互の連結を、例えば、実施例で説明されている遺伝子操作により生じさせ得る。融合し且つ作動可能に連結された二重特異性一本鎖コンストラクトを調製し、それを哺乳動物細胞又は細菌において発現させる方法は、当技術分野で公知である（例えば、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット、又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１）。

【0065】

本開示のＢｉＴＥ分子は、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－単一ドメインｍＡｂ、上述のフォーマットの内のいずれかのダイアボディ及びオリゴマーからなる群から選択されるフォーマットで、抗体コンストラクトを含み得る。

【0066】

特に好ましい実施形態によれば、且つ添付の実施例で記述されているように、ＢｉＴＥ分子内の抗体コンストラクトは、「二重特異性一本鎖抗体コンストラクト」であり、より好ましくは二重特異性「一本鎖Ｆｖ」（ｓｃＦｖ）である。Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、これらを、ＶＬ領域及びＶＨ領域が一価分子を形成するように対をなす単一のタンパク質鎖としてこれらが作製されることを可能にする合成リンカーにより、組換え法を使用して結合させ得る；例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい。これらの抗体フラグメントは、当業者に既知の従来技術を用いて得られ、且つこれらのフラグメントは、全抗体又は完全長抗体と同じ様式で機能について評価される。従って、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、約１０～約２５個のアミノ酸の、好ましくは約１５～２０個のアミノ酸の短いリンカーペプチドにより通常は接続される、免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可動性のためにグリシンに富み、且つ溶解性のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。

【0067】

二重特異性一本鎖分子は、当技術分野で既知であり、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５－３９７０、Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１－７０２５、Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３－１９７、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８－２１０３、Ｂｒｕｅｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０－２４２６、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１－５６で説明されている。一本鎖抗体の作製に関して説明された技術（とりわけ米国特許第４，９４６，７７８号明細書、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｅｂｅｌ（２０１０），前掲、並びにＬｉｔｔｌｅ（２００９），前掲を参照されたい）を、選出された標的を特異的に認識する一本鎖抗体コンストラクトを作製するために適合させ得る。

【0068】

二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）（二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）又は二重特異性の一本鎖可変フラグメント（形式（ｓｃＦｖ）２を有するｂｉ－ｓｃＦｖ又はｄｉ－ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖ分子を連結することにより操作され得る。これら２つのｓｃＦｖ分子が同じ結合特異性を有する場合には、得られる（ｓｃＦｖ）_２分子を二価と呼ぶことが好ましい（即ち、これは、同じ標的エピトープに対して２の価数を有する）。これら２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合には、得られる（ｓｃＦｖ）_２分子を二重特異性と呼ぶことが好ましい。連結は、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を作製して、タンデムｓｃＦｖを生成することによりなされ得る（例えば、Ｋｕｆｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８－２４４を参照されたい）。別の可能性は、２つの可変領域を一緒に折り畳むには短すぎる（例えば約５個のアミノ酸の）リンカーペプチドを用いてｓｃＦｖ分子を作製し、このｓｃＦｖを二量体化させることである。この型は、ダイアボディとして知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｌｙ １９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９０（１４）：６４４４－８を参照されたい）。

【0069】

単一ドメイン抗体は、他のＶ領域又はＶドメインに非依存的に、特異抗原に選択的に結合可能である１つのみの（単量体の）抗体可変ドメインを含む。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダにおいて見出される重鎖抗体から操作されており、これは、ＶＨＨフラグメントと呼ばれる。軟骨魚類も重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有し、これから、ＶＮＡＲフラグメントと呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。代替的なアプローチは、例えば、ヒト又はげっ歯類由来の一般的な免疫グロブリン由来の二量体可変ドメインを単量体に分割し、それによって単一ドメインＡｂとしてＶＨ又はＶＬを得ることである。単一ドメイン抗体に関する大部分の研究は、現時点で重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖由来のナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが示されている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディ、又は単一可変ドメイン抗体と呼ばれる。

【0070】

従って、（単一ドメインｍＡｂ）_２は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ及びＶＮＡＲを含む群から個別に選択される（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体から構成されるモノクローナル抗体コンストラクトである。リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態である。同様に、「ｓｃＦｖ単一ドメインｍＡｂ」は、上述した少なくとも１つの単一ドメイン抗体と、上述した１つのｓｃＦｖ分子とで構成されたモノクローナル抗体コンストラクトである。この場合もやはり、リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態である。

【0071】

例示的なＢｉＴＥ分子として、下記が挙げられる：抗ＣＤ３３及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ分子、抗ＢＣＭＡ及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ分子、抗ＦＬＴ３及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ分子、抗ＤＬＬ３及び抗ＣＤ３ ＢｉＴＥ、ＢＬＩＮＣＹＴＯ（ブリナツモマブ）、並びにソリトマブ。

【実施例】

【0072】

実施例１：
方法
サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）実験を、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム、ＴＳＫ－ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷｘｌ、５μｍ粒径、７．８ｍｍ ＩＤ×３００ｍｍ 長さのカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｅｐ）、波長が２８０ｎｍに設定されたＡｇｉｌｅｎｔ ＵＶ検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ；Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用して実施した。ＳＥＣ－ＬＳの行程を、移動相として使用される１００ｍＭのリン酸カリウム、２５０ｍＭの塩化カリウム、ｐＨ６．８±０．１の緩衝液により室温で実施し、流速は０．５ｍＬ／分であった。

【0073】

示差走査熱量測定
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）実験を、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣシステム（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．；Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）で実施した。このＤＳＣ実験で使用するサンプル濃度は、対応する製剤緩衝液を使用して元のサンプルを希釈することにより、約１ｍｇ／ｍＬであった。このサンプルを、６０℃／時間の速度で１０℃から１００℃へと加熱した。プレスキャンは１５分であり、フィルタリング期間は１０秒であり、フィードバックモードはなしとした。サンプルセル中における吸熱性の熱転移により、シグナルの正の偏向が生じる。データ解析を、ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｏｒｉｇｉｎ ７ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ；Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用して実施した。

【0074】

ナノ示差走査蛍光量測定
ナノ示差走査蛍光量測定（ｎａｎｏＤＳＦ）実験を、ｎａｎｏＴｅｍｐｅｒ ｎａｎｏＤＳＦシステム（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ；Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）で実施した。このＤＳＣ実験で使用するサンプル濃度は、対応する製剤緩衝液を使用して元のサンプルを希釈することにより、約１ｍｇ／ｍＬであった。このサンプルを、６０℃／時間の速度で２０℃から９５℃へと加熱した。データ解析を、ＰＲ．ＴｈｅｒｍＣｏｎｔｒｏｌソフトウェア（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を使用して実施した。

【0075】

統計解析
統計解析を、統計ソフトウェアＪＭＰ（登録商標）（Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）を使用して行なった。ｐ値及びレバレッジプロットを、ＪＭＰデータ解析から得た。様々な統計結果のレバレッジプロットの典型的な結果を、図１に示す。

【0076】

実施例２
熱安定性データから、モノクローナル抗体の安定性が予測される
モノクローナル抗体（ｍＡｂ－１）を含む製剤を、実施例１で説明されているＳＥＣ及びＤＳＣ法を使用して分析した。サンプルの情報、並びにＳＥＣ及びＤＳＣのデータを、表１に示す。主要ピークは、天然形態のｍＡｂ－１からなった。

【0077】

データを、ＪＭＰ統計ソフトウェアで解析した。このＪＭＰ統計解析から得られたＰ値は、Ｐ＝０．０１５９であり、０．０５未満であった。このことは、６ヶ月間のＳＥＣ安定性データとＴ_ｍデータ（Ｔ＝０）との間に統計的に有意な相関関係が存在したことを示唆する。ＪＭＰ統計解析から得られたレバレッジプロットを、図２に示す。図２における信頼曲線は、灰色の実線の水平線と交差する。これからも、６ヶ月間のＳＥＣ安定性データとＴ_ｍデータ（Ｔ＝０）との間に統計的に有意な相関関係が存在することが裏付けられた。このｍＡｂ－１データの統計解析結果は、熱安定性属性値を使用してｍＡｂ－１のＳＥＣ安定性データを予測し得ることを示す。

【0078】

【表3】

【0079】

実施例３
熱安定性データから、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子の安定性が予測される
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ－１）分子の様々な構築物を含む製剤を、実施例１で説明されているＳＥＣ及びＤＳＣ法を使用して分析した。サンプルの情報を表２に示し、ＳＥＣ及びＤＳＣのデータを表３に示す。

【0080】

データを、ＪＭＰ統計ソフトウェアで解析した。このＪＭＰ統計解析から得られたＰ値は、Ｐ＝０．００１４であり、０．０５未満であった。このことは、２週間のＳＥＣ安定性データとＴ_ｍデータとの間に統計的に有意な相関関係が存在したことを示唆する。ＪＭＰから得られたレバレッジプロットを、図３に示す。図３における信頼曲線は、灰色の実線の水平線と交差する。これからも、６週間のＳＥＣ安定性データとＴ_ｍデータとの間に統計的に有意な相関関係が存在することが裏付けられた。このＢｉＴＥ－１データの統計解析結果は、熱安定性属性値を使用してＢｉＴＥ－１ ＳＥＣ安定性データを予測し得ることを示す。

【0081】

【表4】

【0082】

【表5】

【0083】

実施例４
熱安定性データから、Ｆｃ融合タンパク質の安定性が予測される
ムテインＦｃ融合タンパク質（ムテイン－１）を含む製剤を、実施例１で説明されているＳＥＣ及びＤＳＣ法を使用して分析した。サンプルの情報を表４に示し、ＳＥＣ及びＤＳＣのデータを表５に示す。

【0084】

データを、ＪＭＰ統計ソフトウェアで解析した。このＪＭＰ統計解析から得られたＰ値は、Ｐ＜０．０００１であり、０．０５未満であった。このことは、２週間のＳＥＣ安定性データとＴ_ｍデータとの間に統計的に有意な相関関係が存在したことを示唆する。ＪＭＰから得られたレバレッジプロットを、図４に示す。図４における信頼曲線は、灰色の実線の水平線と交差する。これから、２週間のＳＥＣ安定性データとＴ_ｍデータとの間に統計的に有意な相関関係が存在したことが裏付けられる。このムテインデータの統計解析結果は、熱安定性属性値を使用してＦｃ融合タンパク質の安定性データ及びｍＡｂ等の他の構造ファミリのムテインの安定性データを予測し得ることを示す。

【0085】

【表6】

【0086】

【表7】

【0087】

結論
統計的アプローチを使用することにより、ＳＥＣ法により測定されたタンパク質の安定性を、熱安定性属性（Ｔ_ｍ）を使用して統計的に有意に予測し得ることが実証された。ＳＥＣにより測定されたタンパク質の安定性を予測するために熱安定性属性（Ｔ_ｍ）を測定する方法により、医薬品開発での分析中に時間及び資源が大幅に節約される。

【0088】

本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という用語は、別途文脈が明確に示さない限り、複数の参照物を含む。「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）という用語、並びに「１つ又は複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」及び「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。さらに、「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、２つの特定の特徴又は構成要素のそれぞれの特定の開示として（他の特徴又は構成要素の有無にかかわらず）解釈されるべきである。そのため、「及び／又は」という用語は、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」等の語句で使用される場合、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、並びに「Ｂ」（単独）を包含することが意図される。同様に、「及び／又は」という用語は、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」等の語句で使用される場合、下記の態様のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。

【0089】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、一般には包括的な意味で使用され、即ち、１つ又は複数の特徴又は構成要素の存在を許容するために使用される。

【0090】

「約」という用語は、本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して数値に関連して使用される場合、当業者によく知られており且つ受け入れられる精度の間隔を示す。一般に、そのような精度の間隔は、±１０％である。

【0091】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の内の多くの一般辞書を当業者に提供する。下記の手順及び手法を、当技術分野において公知の従来の方法に従って、並びに本明細書全体を通して引用されており且つ論じられている様々な一般的で且つより具体的な参考文献で説明されているように、概して実施し得る。

【0092】

単位、接頭辞、及び記号は、国際単位系（ＳＩ）で認められた形式で示される。数値範囲は、この範囲を規定する数値を含む。別途指示されない限り、アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシへの向きで記述されている。本明細書で示される見出しは、本開示の様々な態様を限定するものではなく、この限定を、本明細書全体を参照することにより得ることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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