ホーム > 特許ランキング > インタバイオ， エルエルシー
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-30
(45)【発行日】2024-08-07
(54)【発明の名称】試料の特性評価のための装置、方法およびキット
(51)【国際特許分類】
G01N 27/447 20060101AFI20240731BHJP
G01N 21/33 20060101ALI20240731BHJP
G01N 21/27 20060101ALI20240731BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20240731BHJP
【ＦＩ】
G01N27/447 331E
G01N27/447 315K
G01N21/33
G01N21/27 A
G01N27/62 F
G01N27/447 331K
【請求項の数】
20
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022212882
(22)【出願日】2022-12-31
(62)【分割の表示】P 2020541449の分割
【原出願日】2019-01-29
(65)【公開番号】P2023040137
(43)【公開日】2023-03-22
【審査請求日】2022-12-31
(31)【優先権主張番号】62/623,492
(32)【優先日】2018-01-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】518187374
【氏名又は名称】インタバイオ， エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】エリック ジェンタレン
(72)【発明者】
【氏名】スコット マック
【審査官】小澤 理
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０００３６７４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００９／０１９４４１９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５１６０７８（ＪＰ，Ａ）
【文献】NORDMAN, N. et al.，Interfacing microchip isoelectric focusing with on-chip electrospray ionization mass spectrometry，J. Chromatography A，2015年，Vol.1398，p.121-126
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２７／４４７
Ｇ０１Ｎ ２１／３３
Ｇ０１Ｎ ２１／２７
Ｇ０１Ｎ ２７／６２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
Ｓｃｏｐｕｓ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
システムであって、前記システムは、ｉ．マイクロ流体装置であって、前記マイクロ流体装置は、
ａ）分析物の混合物を電気泳動分離するための分離チャネルであって、前記分離チャネルは、窓を備える、分離チャネルと、
ｂ）第１の端部と前記第１の端部とは反対側の第２の端部とを有する可動化チャネルであって、前記可動化チャネルの前記第１の端部は、前記分離チャネルに流体結合されており、前記可動化チャネルは、分離された分析物の可動化のために、可動化電解質を前記分離チャネルに送達するためのものである、可動化チャネルと、
ｃ）前記分離チャネルの近位端に電気的に結合されている第１の電極と、
ｄ）前記分離チャネルの遠位端に電気的に結合されている第２の電極と、
ｅ）前記可動化チャネルの前記第２の端部に電気的に結合されている第３の電極と
を備える、マイクロ流体装置と、
ｉｉ．前記分離チャネルの前記窓を透過した光を捕捉するように配置されているイメージングユニットと
を備える、システム。
【請求項2】
前記システムは、ｉｉｉ．トリガ信号を生成するために、前記イメージングユニットから画像を受信および処理するプロセッサユニットをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記プロセッサユニットからの前記トリガ信号は、前記分析物の混合物の電気泳動分離および前記分離された分析物の可動化の間、前記第２の電極および前記第３の電極のオン状態とオフ状態とを制御する、請求項２に記載のシステム。
【請求項4】
電気泳動分離および可動化の間、前記第１の電極は、オン状態である、請求項３に記載のシステム。
【請求項5】
電気泳動分離の間、前記第２の電極は、オン状態であり、かつ、前記第３の電極は、オフ状態である、請求項３に記載のシステム。
【請求項6】
可動化の間、前記第２の電極は、オフ状態であり、かつ、前記第３の電極は、オン状態である、請求項３に記載のシステム。
【請求項7】
前記イメージングユニットは、ＵＶ吸光度または蛍光を取り込む、請求項１に記載のシステム。
【請求項8】
前記イメージングユニットは、１５秒ごとに少なくとも１つの画像の速度で複数の画像を取得する、請求項１に記載のシステム。
【請求項9】
前記プロセッサユニットは、前記分離チャネル内の分析物ピークの有無を監視するための画像処理アルゴリズムを備える、請求項３に記載のシステム。
【請求項10】
前記プロセッサユニットによって分析物ピークが検出されない場合には、前記第３の電極は、オフ状態に維持される、請求項９に記載のシステム。
【請求項11】
前記プロセッサユニットは、前記分離チャネル内の分析物ピークの位置および／または幅の経時的な変化を監視するための画像処理アルゴリズムを備える、請求項３に記載のシステム。
【請求項12】
２０秒よりも長い時間の間、前記分析物ピークの位置または幅の変化が存在しないまたは前記分析物ピークの位置または幅の変化率が減少する場合には、前記第２の電極および前記第３の電極がオン状態からオフ状態に切り替わる、請求項１１に記載のシステム。
【請求項13】
前記第２の電極および前記第３の電極は、電気泳動分離の開始後のユーザ指定時間に、オン状態とオフ状態との間で切り替わる、請求項３に記載のシステム。
【請求項14】
前記ユーザ指定時間は、少なくとも３０秒である、請求項１３に記載のシステム。
【請求項15】
前記ユーザ指定時間は、多くて２０分である、請求項１３に記載のシステム。
【請求項16】
前記マイクロ流体装置は、ｆ）前記分離チャネルの前記遠位端に流体結合されているオリフィスをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項17】
前記オリフィスは、質量分析計とのエレクトロスプレーイオン化インターフェースである、請求項１６に記載のシステム。
【請求項18】
前記第１の電極は、アノードであり、前記第２の電極および前記第３の電極は、カソードである、請求項１に記載のシステム。
【請求項19】
前記第１の電極は、カソードであり、前記第２の電極および前記第３の電極は、アノードである、請求項１に記載のシステム。
【請求項20】
前記電気泳動分離は、等電点電気泳動、キャピラリゲル電気泳動、キャピラリゾーン電気泳動、等速電気泳動、キャピラリ動電クロマトグラフィ、ミセル動電クロマトグラフィ、フローカウンタバランスキャピラリ電気泳動、電場勾配フォーカシング、または、動的場勾配フォーカシングである、請求項１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／６２３，４９２号明細書の利益を主張し、該出願全体を参照により本明細書に組み込む。
本出願は、２０１８年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／６２３，４９２号明細書の利益を主張し、該出願全体を参照により本明細書に組み込む。
【0002】
本開示は、試料の処理および特性評価のための装置および方法、ならびにそれらの様々な使用に関する。特に、本開示は、分析物の混合物中の分析物の分離および特性評価のための装置および方法に関する。
【背景技術】
【0003】
分析物の１つ以上の固有の性質に基づいて、複雑性の高い分析物混合物から分析物成分を分離し、場合により、特定の分析物成分について濃縮された試料画分のセットを提供することは、分析化学の重要な部分である。このように、複雑な混合物を単純化すると、下流の分析の複雑性が低下する。場合によっては、直交（例えば、異なるおよび／または無関係な性質に基づく）である２つ以上の濃縮工程を行うことが有利であり得る。もっとも、多くの場合、公知の方法および／または装置を使用して直交濃縮工程を行うプロセスは煩雑であるが、下流の分析装置の検出感度を超える濃度まで分析物を希釈することができる。さらに、公知の濃縮方法および／または装置と分析装置および／または技術とを接合させようとすると、複雑さが生じる可能性がある。いくつかの例では、試料の分離および／または濃縮は、上流で、または試料分析と並行して行われ得る。例えば、試料濃縮を行うための装置は、分析機器と直接結合され得る。
【0004】
例えば、タンパク質試料調製技術と質量分析計などの下流の検出システムとを接合させるために、様々な方法が使用されてきた。一般的な方法は、液体クロマトグラフィを使用して試料を調製し、質量分析のための画分を収集することである。これは、分析しなければならない多数の試料画分にタンパク質試料を分離する必要があるという欠点を有し、複雑なデータ再構成を実行後に行わなければならない。特定の形態の液体クロマトグラフィは、質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）、例えばペプチドマップ逆相クロマトグラフィに結合することができるが、これらの公知の技術は、無傷のタンパク質ではなく、ペプチド断片の使用に制限されており、それらの有用性が限定される。
【0005】
質量分析計に試料を導入する別の方法が、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）である。ＥＳＩでは、キャピラリまたはマイクロ流体装置の遠位端で試料および溶液の小滴がイオン化されて、質量分析計の荷電プレートに対して吸引力が誘導される。次いで、液滴は、この誘導された電場内で円錐形（「テイラーコーン」）に伸長し、次いで、この円錐形から、分析のために質量分析計内に小滴が放出される。典型的には、これは、ＥＳＩに便利な容積およびサイズを提供するキャピラリ内で行われる。しかし、キャピラリは、多段階処理を可能にしない直線流路を提供する。
【0006】
マイクロ流体装置を用いた他の研究が行われ続けている。マイクロ流体装置は、様々な公知の技術によって製造され、様々な流体操作を行うように設計されたチャネル網を構成することができる画定された寸法の流体チャネルを提供することができる。これらの装置は、キャピラリと比較して高度な制御と複雑性とを提供し、試料調製のための優れた選択肢となる。ただし、キャピラリベースのシステムと同様に、これらのツールは多くの場合、質量分析計に導入する前に、分離された分析物画分の限られた特性評価を提供する。
【0007】
タンパク質質量分析の１つの用途は、生物学的製剤およびバイオシミラー製剤の開発および製造中のタンパク質の特性評価である。生物学的製剤およびバイオシミラー製剤は、例えば、組換えタンパク質、抗体、生ウイルスワクチン、ヒト血漿由来タンパク質、細胞ベースの医薬品、天然由来タンパク質、抗体薬物複合体、タンパク質薬物複合体および他のタンパク質薬を含む薬物のクラスである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
規制を遵守するためには、開発および製造中に生物学的製剤の広範囲な試験を行う必要があるが、これは低分子薬物には必要とされない。これは、例えば、生物学的製剤を製造するために生体材料を使用することにより、生物学的製剤の製造がさらに複雑になり、生物分子自体がさらに複雑になり、製造プロセスがさらに複雑になるためである。定義する必要のある特性には、例えば、質量、電荷、疎水性の変化、およびグリコシル化状態、ならびに効力が含まれる。現在、これらの試験は互いに独立して行われているため、生物学的製剤を特性評価するためのプロセスを非常に時間および費用のかかるものにしている。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本開示では、分析物分離を行い、定量的分離データの精度を改善し、定量的分離データと下流の分析的特性評価データ、例えば質量分析特性評価データとの改善された相関を達成するための方法、装置およびシステムが記載される。
【0010】
本明細書では、生物医学研究、臨床診断および製薬製造の潜在的な用途を有する、分析物混合物中の分析物の分離および分析のための改善された定量的性能を可能にする方法、装置およびシステムが開示される。例えば、規制当局によって、生物学的薬物および薬物候補（例えばタンパク質）の厳密な特性評価が要求されている。本明細書に記載される方法および装置は、タンパク質および／または他の分析物を特性評価するのに好適であり得る。いくつかの例では、本明細書に記載される方法および装置は、分析物混合物を特性評価することに関し得、分析物混合物を濃縮された分析物画分に分離するために１つ以上の濃縮工程が行われる。いくつかの例では、本明細書に記載される方法および装置は、分析物混合物を特性評価することに関し、分析物混合物を濃縮された分析物画分に分離し、続いてこれをエレクトロスプレーイオン化インターフェースを介して質量分析計に導入するために、１つ以上の濃縮工程が行われる。開示される方法および装置は、分析物の分離および特性評価の利便性、再現性および／または分析性能を改善することができる。
【0011】
本明細書では、分離された複数の分析物を含む分離チャネルに可動化電解質を導入する方法が開示され、方法は、分離された分析物の画像から得られたデータを使用して、分離チャネルへの可動化電解質の導入を自動的に開始することを含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、分離チャネルは、マイクロ流体装置内のマイクロチャネルである。いくつかの実施形態では、分離チャネルはキャピラリである。いくつかの実施形態では、方法は、等電点電気泳動によって複数の分析物を分離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、質量分析計とのエレクトロスプレーイオン化インターフェースに向かって、分離された分析物を可動化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、可動化電解質は、両性イオン緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、可動化電解質は、酢酸、ギ酸、炭酸またはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、方法は、分離チャネルの全部または一部の画像を取得することをさらに含む。いくつかの実施形態では、画像は、分離チャネルを透過した光を使用して取得される。いくつかの実施形態では、画像は、ＵＶ吸光度画像または蛍光画像である。いくつかの実施形態では、画像由来データは、ピーク位置、ピーク幅およびピーク速度からなる群から選択される分離された分析物ピーク情報を含む。いくつかの実施形態では、可動化電解質の導入は、電気泳動的に行われる。いくつかの実施形態では、ａ）分離チャネル装置の第１の端部は第１の電極に電気的に結合され、分離チャネルの第２の端部は第２の電極に電気的に結合され、分離チャネルの第２の端部と交差する可動化チャネルは、第３の電極に電気的に結合され、ｂ）可動化電解質の電気泳動的導入は、第２または第３の電極とそれらのそれぞれのチャネルとの電気的結合をオン状態とオフ状態との間で切り替えることによって行われる。いくつかの実施形態では、第１の電極はアノードであり、第２および第３の電極はカソードである。いくつかの実施形態では、少なくとも２０秒の期間にわたる、１つ以上の分離された分析物ピークの画像データから得られたピーク位置またはピーク幅の変化の欠如または変化率の減少は、第２および第３の電極のオン状態とオフ状態との間の切り替えをトリガする。いくつかの実施形態では、期間は、少なくとも３０秒、４０秒、５０秒、または３０秒である。いくつかの実施形態では、可動化電解質の電気泳動的導入により、１つ以上の分離された分析物のさらに正確なｐＩ決定が可能になる。いくつかの実施形態では、可動化電解質の電気泳動的導入により、等電点電気泳動分離の完了時に達成されるものと比較して、可動化後の分離分解能が改善される。
【0013】
また、本明細書では、ａ）等電点電気泳動を行って、内部に含まれた分析物の混合物を分離させるための分離チャネル、ｂ）分離チャネルに可動化電解質を送達するために分離チャネルの遠位端と交差する可動化チャネル、およびｃ）分離チャネルの近位端に電気的に結合された第１の電極と、分離チャネルの遠位端に電気的に結合された第２の電極と、可動化チャネルに電気的に結合された第３の電極とを備える３つの電極を備えるシステムが開示され、第２または第３の電極とそれらのそれぞれのチャネルとの電気的結合は、オン状態とオフ状態との間で切り替え可能である。
【0014】
いくつかの実施形態では、第１の電極はアノードであり、第２および第３の電極はカソードである。いくつかの実施形態では、第２または第３の電極のオン状態とオフ状態との間の切り替えは、分離チャネルへの可動化電解質の電気泳動的導入を開始する。いくつかの実施形態では、可動化電解質の電気泳動的導入により、１つ以上の分離された分析物のさらに正確なｐＩ決定が可能になる。いくつかの実施形態では、可動化電解質の電気泳動的導入により、等電点電気泳動分離の完了時に達成されるものと比較して、可動化後の分離分解能が改善される。いくつかの実施形態では、システムは、等電点電気泳動分離の開始後のユーザ指定時間に、第２または第３の電極をオン状態とオフ状態との間で切り替えるように構成される。いくつかの実施形態では、ユーザ指定時間は、等電点電気泳動分離の開始から少なくとも３０秒後である。いくつかの実施形態では、ユーザ指定時間は、等電点電気泳動分離の開始から最大２０分後である。いくつかの実施形態では、システムは、等電点電気泳動分離反応中に分離チャネルを通って流れる電流を監視し、電流が、特定の電流閾値を下回ると、第２または第３の電極をオン状態とオフ状態との間で切り替えるように構成される。いくつかの実施形態では、特定の閾値電流は、約１マイクロアンペア（μＡ）から約１０マイクロアンペア（μＡ）の値の範囲である。いくつかの実施形態では、システムは、（ｉ）イメージングユニットと、（ｉｉ）プロセッサユニットとをさらに備え、分離が行われる際にイメージングユニットによって取り込まれた一連の画像は、プロセッサユニットによってさらに処理されて、第２および第３の電極のオン状態とオフ状態との間の切り替えを非対称にトリガするトリガ信号を生成する。いくつかの実施形態では、イメージングユニットは、分離チャネルの全部または一部の画像を取り込むように構成される。いくつかの実施形態では、イメージングユニットは、分離チャネル窓を透過した光を使用して画像を取り込むように構成される。いくつかの実施形態では、イメージングユニットは、ＵＶ吸光度画像または蛍光画像を取り込むように構成される。いくつかの実施形態では、一連の画像は、１５秒ごとに少なくとも１つの画像の速度で取得される。いくつかの実施形態では、プロセッサユニットは、分離チャネル内の分析物ピークの有無を監視するために使用される画像処理アルゴリズムを実行するように構成される。いくつかの実施形態では、システムは、分離チャネル内で分析物ピークが検出されない場合、第３の電極をオフ状態に維持するように構成される。いくつかの実施形態では、プロセッサユニットは、分離された分析物ピークの位置の経時的な変化または分離された分析物ピークの幅の経時的な変化を監視するために使用される画像処理アルゴリズムを実行するように構成される。いくつかの実施形態では、少なくとも２０秒の期間にわたる、１つ以上の分離された分析物ピークのピーク位置またはピーク幅の変化の欠如または変化率の減少は、第２および第３の電極のオン状態とオフ状態との間の切り替えをトリガする。いくつかの実施形態では、期間は、少なくとも３０秒、４０秒、５０秒、または３０秒である。いくつかの実施形態では、システムは、分離チャネルの遠位端と流体連通しているオリフィスをさらに備え、オリフィスは、質量分析計とのエレクトロスプレーイオン化インターフェースとして機能するように構成される。いくつかの実施形態では、システムは、等電点電気泳動によって分離された分析物のｐＩデータと質量分析計データを相関させるように構成される。
【0015】
本明細書では、図１、図４、図５、図７、図８または図９のいずれか１つに示されている装置が開示される。いくつかの実施形態では、装置は、少なくとも１つの分離チャネルまたは濃縮チャネルを備え得る。いくつかの実施形態では、装置は、少なくとも１つの分離チャネルまたは濃縮チャネル内で等電点電気泳動を行うように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、装置は、等電点電気泳動工程の完了後に分離チャネルまたは濃縮チャネルへの可動化剤の電気泳動的導入を行うように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、装置は、（ａ）等電点電気泳動を行って、内部に含まれた分析物の混合物を分離させるための分離チャネル、（ｂ）分離チャネルに可動化電解質を送達するために分離チャネルの遠位端と交差する可動化チャネル、および（ｃ）分離チャネルの近位端に電気的に結合された第１の電極と、分離チャネルの遠位端に電気的に結合された第２の電極と、可動化チャネルに電気的に結合された第３の電極とを備える３つの電極を備えてもよく、第２または第３の電極とそれらのそれぞれのチャネルとの電気的結合は、オン状態とオフ状態との間で切り替え可能である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
複数の分離された分析物を含む分離チャネルに、可動化電解質を導入する方法であって、
前記分離された分析物の画像から得られたデータを使用して、前記分離チャネルへの前記可動化電解質の導入を自動的に開始することを含む方法。
（項目２）
前記分離チャネルが、マイクロ流体装置内のマイクロチャネルである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記分離チャネルがキャピラリである、項目１に記載の方法。
（項目４）
等電点電気泳動により前記複数の分析物を分離することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
質量分析計とのエレクトロスプレーイオン化インターフェースに向かって、前記分離された分析物を可動化することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記可動化電解質が両性イオン緩衝液を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記可動化電解質が、酢酸、ギ酸、炭酸またはそれらの任意の組合せを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記分離チャネルの全部または一部の画像を取得することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記画像が、前記分離チャネルを透過した光を使用して取得される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記画像が、ＵＶ吸光度画像または蛍光画像である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記画像由来データが、ピーク位置、ピーク幅およびピーク速度からなる群から選択される分離された分析物ピーク情報を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記可動化電解質の導入が電気泳動的に行われる、項目１に記載の方法。
（項目１３）
項目１２に記載の方法であって、
ａ）前記分離チャネル装置の第１の端部が第１の電極に電気的に結合され、前記分離チャネルの第２の端部が第２の電極に電気的に結合され、前記分離チャネルの前記第２の端部と交差する可動化チャネルが、第３の電極に電気的に結合され、
ｂ）前記可動化電解質の前記電気泳動的導入が、前記第２または第３の電極とそれらのそれぞれのチャネルとの前記電気的結合をオン状態とオフ状態との間で切り替えることによって行われる方法。
（項目１４）
前記第１の電極がアノードであり、前記第２および第３の電極がカソードである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
少なくとも２０秒の期間にわたる、１つ以上の分離された分析物ピークの画像データから得られたピーク位置またはピーク幅の変化の欠如または変化率の減少が、前記第２および第３の電極のオン状態とオフ状態との間の前記切り替えをトリガする、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記期間が、少なくとも３０秒、４０秒、５０秒、または３０秒である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
可動化電解質の前記電気泳動的導入により、１つ以上の分離された分析物のさらに正確なｐＩ決定が可能になる、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記可動化電解質の前記電気泳動的導入により、等電点電気泳動分離の完了時に達成されるものと比較して、可動化後の分離分解能が改善される、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
ａ）等電点電気泳動を行って、内部に含まれた分析物の混合物を分離させるための分離チャネル、
ｂ）前記分離チャネルに可動化電解質を送達するために前記分離チャネルの遠位端と交差する可動化チャネル、および
ｃ）前記分離チャネルの近位端に電気的に結合された第１の電極と、前記分離チャネルの前記遠位端に電気的に結合された第２の電極と、前記可動化チャネルに電気的に結合された第３の電極とを備える３つの電極
を備えるシステムであって、
前記第２または第３の電極とそれらのそれぞれのチャネルとの前記電気的結合が、オン状態とオフ状態との間で切り替え可能であるシステム。
（項目２０）
前記第１の電極がアノードであり、前記第２および第３の電極がカソードである、項目１９に記載のシステム。
（項目２１）
前記第２または第３の電極のオン状態とオフ状態との間の前記切り替えが、前記分離チャネルへの前記可動化電解質の電気泳動的導入を開始する、項目１９に記載のシステム。
（項目２２）
可動化電解質の前記電気泳動的導入により、１つ以上の分離された分析物のさらに正確なｐＩ決定が可能になる、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記可動化電解質の前記電気泳動的導入により、等電点電気泳動分離の完了時に達成されるものと比較して、可動化後の分離分解能が改善される、項目２１に記載のシステム。
（項目２４）
前記システムが、等電点電気泳動分離の開始後のユーザ指定時間に、前記第２または第３の電極をオン状態とオフ状態との間で切り替えるように構成される、項目１９に記載のシステム。
（項目２５）
前記ユーザ指定時間が、前記等電点電気泳動分離の前記開始から少なくとも３０秒後である、項目２４に記載のシステム。
（項目２６）
前記ユーザ指定時間が、前記等電点電気泳動分離の前記開始から最大２０分後である、項目２４に記載のシステム。
（項目２７）
前記システムが、等電点電気泳動分離反応中に前記分離チャネルを通って流れる電流を監視し、前記電流が、特定の電流閾値を下回ると、前記第２または第３の電極をオン状態とオフ状態との間で切り替えるように構成される、項目１９に記載のシステム。
（項目２８）
前記特定の閾値電流が、約１マイクロアンペア（μＡ）から約１０マイクロアンペア（μＡ）の値の範囲である、項目２７に記載のシステム。
（項目２９）
（ｉ）イメージングユニットと、（ｉｉ）プロセッサユニットとをさらに備え、前記分離が行われる際に前記イメージングユニットによって取り込まれた一連の画像が、前記プロセッサユニットによってさらに処理されて、前記第２および第３の電極のオン状態とオフ状態との間の前記切り替えを非対称にトリガするトリガ信号を生成する、項目１９に記載のシステム。
（項目３０）
前記イメージングユニットが、前記分離チャネルの全部または一部の画像を取り込むように構成される、項目２９に記載のシステム。
（項目３１）
前記イメージングユニットが、分離チャネル窓を透過した光を使用して画像を取り込むように構成される、項目３０に記載のシステム。
（項目３２）
前記イメージングユニットが、ＵＶ吸光度画像または蛍光画像を取り込むように構成される、項目３１に記載のシステム。
（項目３３）
前記一連の画像が、１５秒ごとに少なくとも１つの画像の速度で取得される、項目２９に記載のシステム。
（項目３４）
前記プロセッサユニットが、前記分離チャネル内の分析物ピークの有無を監視するために使用される画像処理アルゴリズムを実行するように構成される、項目２９に記載のシステム。
（項目３５）
前記システムが、前記分離チャネル内で分析物ピークが検出されない場合、前記第３の電極をオフ状態に維持するように構成される、項目３４に記載のシステム。
（項目３６）
前記プロセッサユニットが、分離された分析物ピークの位置の経時的な変化または分離された分析物ピークの幅の経時的な変化を監視するために使用される画像処理アルゴリズムを実行するように構成される、項目２９に記載のシステム。
（項目３７）
少なくとも２０秒の期間にわたる、１つ以上の分離された分析物ピークのピーク位置またはピーク幅の変化の欠如または変化率の減少が、前記第２および第３の電極のオン状態とオフ状態との間の前記切り替えをトリガする、項目３６に記載のシステム。
（項目３８）
前記期間が、少なくとも３０秒、４０秒、５０秒、または３０秒である、項目３７に記載のシステム。
（項目３９）
前記分離チャネルの前記遠位端と流体連通しているオリフィスをさらに備え、前記オリフィスが、質量分析計とのエレクトロスプレーイオン化インターフェースとして機能するように構成される、項目１９に記載のシステム。
（項目４０）
前記システムが、等電点電気泳動によって分離された分析物のｐＩデータと質量分析計データを相関させるように構成される、項目３９に記載のシステム。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
複数の分離された分析物を含む分離チャネルに、可動化電解質を導入する方法であって、
前記分離された分析物の画像から得られたデータを使用して、前記分離チャネルへの前記可動化電解質の導入を自動的に開始することを含む方法。
（項目２）
前記分離チャネルが、マイクロ流体装置内のマイクロチャネルである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記分離チャネルがキャピラリである、項目１に記載の方法。
（項目４）
等電点電気泳動により前記複数の分析物を分離することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
質量分析計とのエレクトロスプレーイオン化インターフェースに向かって、前記分離された分析物を可動化することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記可動化電解質が両性イオン緩衝液を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記可動化電解質が、酢酸、ギ酸、炭酸またはそれらの任意の組合せを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記分離チャネルの全部または一部の画像を取得することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記画像が、前記分離チャネルを透過した光を使用して取得される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記画像が、ＵＶ吸光度画像または蛍光画像である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記画像由来データが、ピーク位置、ピーク幅およびピーク速度からなる群から選択される分離された分析物ピーク情報を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記可動化電解質の導入が電気泳動的に行われる、項目１に記載の方法。
（項目１３）
項目１２に記載の方法であって、
ａ）前記分離チャネル装置の第１の端部が第１の電極に電気的に結合され、前記分離チャネルの第２の端部が第２の電極に電気的に結合され、前記分離チャネルの前記第２の端部と交差する可動化チャネルが、第３の電極に電気的に結合され、
ｂ）前記可動化電解質の前記電気泳動的導入が、前記第２または第３の電極とそれらのそれぞれのチャネルとの前記電気的結合をオン状態とオフ状態との間で切り替えることによって行われる方法。
（項目１４）
前記第１の電極がアノードであり、前記第２および第３の電極がカソードである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
少なくとも２０秒の期間にわたる、１つ以上の分離された分析物ピークの画像データから得られたピーク位置またはピーク幅の変化の欠如または変化率の減少が、前記第２および第３の電極のオン状態とオフ状態との間の前記切り替えをトリガする、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記期間が、少なくとも３０秒、４０秒、５０秒、または３０秒である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
可動化電解質の前記電気泳動的導入により、１つ以上の分離された分析物のさらに正確なｐＩ決定が可能になる、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記可動化電解質の前記電気泳動的導入により、等電点電気泳動分離の完了時に達成されるものと比較して、可動化後の分離分解能が改善される、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
ａ）等電点電気泳動を行って、内部に含まれた分析物の混合物を分離させるための分離チャネル、
ｂ）前記分離チャネルに可動化電解質を送達するために前記分離チャネルの遠位端と交差する可動化チャネル、および
ｃ）前記分離チャネルの近位端に電気的に結合された第１の電極と、前記分離チャネルの前記遠位端に電気的に結合された第２の電極と、前記可動化チャネルに電気的に結合された第３の電極とを備える３つの電極
を備えるシステムであって、
前記第２または第３の電極とそれらのそれぞれのチャネルとの前記電気的結合が、オン状態とオフ状態との間で切り替え可能であるシステム。
（項目２０）
前記第１の電極がアノードであり、前記第２および第３の電極がカソードである、項目１９に記載のシステム。
（項目２１）
前記第２または第３の電極のオン状態とオフ状態との間の前記切り替えが、前記分離チャネルへの前記可動化電解質の電気泳動的導入を開始する、項目１９に記載のシステム。
（項目２２）
可動化電解質の前記電気泳動的導入により、１つ以上の分離された分析物のさらに正確なｐＩ決定が可能になる、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記可動化電解質の前記電気泳動的導入により、等電点電気泳動分離の完了時に達成されるものと比較して、可動化後の分離分解能が改善される、項目２１に記載のシステム。
（項目２４）
前記システムが、等電点電気泳動分離の開始後のユーザ指定時間に、前記第２または第３の電極をオン状態とオフ状態との間で切り替えるように構成される、項目１９に記載のシステム。
（項目２５）
前記ユーザ指定時間が、前記等電点電気泳動分離の前記開始から少なくとも３０秒後である、項目２４に記載のシステム。
（項目２６）
前記ユーザ指定時間が、前記等電点電気泳動分離の前記開始から最大２０分後である、項目２４に記載のシステム。
（項目２７）
前記システムが、等電点電気泳動分離反応中に前記分離チャネルを通って流れる電流を監視し、前記電流が、特定の電流閾値を下回ると、前記第２または第３の電極をオン状態とオフ状態との間で切り替えるように構成される、項目１９に記載のシステム。
（項目２８）
前記特定の閾値電流が、約１マイクロアンペア（μＡ）から約１０マイクロアンペア（μＡ）の値の範囲である、項目２７に記載のシステム。
（項目２９）
（ｉ）イメージングユニットと、（ｉｉ）プロセッサユニットとをさらに備え、前記分離が行われる際に前記イメージングユニットによって取り込まれた一連の画像が、前記プロセッサユニットによってさらに処理されて、前記第２および第３の電極のオン状態とオフ状態との間の前記切り替えを非対称にトリガするトリガ信号を生成する、項目１９に記載のシステム。
（項目３０）
前記イメージングユニットが、前記分離チャネルの全部または一部の画像を取り込むように構成される、項目２９に記載のシステム。
（項目３１）
前記イメージングユニットが、分離チャネル窓を透過した光を使用して画像を取り込むように構成される、項目３０に記載のシステム。
（項目３２）
前記イメージングユニットが、ＵＶ吸光度画像または蛍光画像を取り込むように構成される、項目３１に記載のシステム。
（項目３３）
前記一連の画像が、１５秒ごとに少なくとも１つの画像の速度で取得される、項目２９に記載のシステム。
（項目３４）
前記プロセッサユニットが、前記分離チャネル内の分析物ピークの有無を監視するために使用される画像処理アルゴリズムを実行するように構成される、項目２９に記載のシステム。
（項目３５）
前記システムが、前記分離チャネル内で分析物ピークが検出されない場合、前記第３の電極をオフ状態に維持するように構成される、項目３４に記載のシステム。
（項目３６）
前記プロセッサユニットが、分離された分析物ピークの位置の経時的な変化または分離された分析物ピークの幅の経時的な変化を監視するために使用される画像処理アルゴリズムを実行するように構成される、項目２９に記載のシステム。
（項目３７）
少なくとも２０秒の期間にわたる、１つ以上の分離された分析物ピークのピーク位置またはピーク幅の変化の欠如または変化率の減少が、前記第２および第３の電極のオン状態とオフ状態との間の前記切り替えをトリガする、項目３６に記載のシステム。
（項目３８）
前記期間が、少なくとも３０秒、４０秒、５０秒、または３０秒である、項目３７に記載のシステム。
（項目３９）
前記分離チャネルの前記遠位端と流体連通しているオリフィスをさらに備え、前記オリフィスが、質量分析計とのエレクトロスプレーイオン化インターフェースとして機能するように構成される、項目１９に記載のシステム。
（項目４０）
前記システムが、等電点電気泳動によって分離された分析物のｐＩデータと質量分析計データを相関させるように構成される、項目３９に記載のシステム。
【0016】
参照による組み込み
本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書中の用語と組み込まれた参考文献中の用語との間に矛盾がある場合、本明細書中の用語が支配する。
本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書中の用語と組み込まれた参考文献中の用語との間に矛盾がある場合、本明細書中の用語が支配する。
【0017】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点の良好な理解は、本発明の原理を利用した例示的な実施形態を説明している以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】本開示の一態様による、分析物の二次元分離と、その後の自動ロード試料のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）とを行うためのマイクロ流体装置の概略図を提供する。
【図4】本開示の一態様による、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と、その後の自動ロード試料のＥＳＩとを行うためのマイクロ流体装置の概略図を提供する。
【図5】本開示の一態様による、マイクロ流体装置の概略図を提供する。
【図6】分析物特性評価のための例示的な方法のフローチャートを提供する。
【図7】本開示の一態様による、マイクロ流体装置の概略図を提供する。
【図8】本開示の一態様による、マイクロ流体装置の概略図を提供する。
【図9】本開示の一態様による、マイクロ流体装置の概略図を提供する。
【図10】市販の機器を使用して得られた、分析物の混合物を含む試料内の分析物の分離からのデータの例を示す。
【図11】同じ設計の異なるマイクロ流体装置内で分離が行われた際の分離データの再現性の非限定的な例を提供する。
【図12】ｐＩマーカのセットに関する等電点電気泳動データの非限定的な例を提供する。
【図14】集束工程が完了した後の等電点電気泳動データの非限定的な例を提供する。
【図15A】等電点電気泳動を使用して分析物の混合物中の分析物を分離した後の試料の可動化に関するデータの非限定的な例を示す。
【図15B】等電点電気泳動を使用して分析物の混合物中の分析物を分離した後の試料の可動化に関するデータの非限定的な例を示す。
【図15C】等電点電気泳動を使用して分析物の混合物中の分析物を分離した後の試料の可動化に関するデータの非限定的な例を示す。
【図15D】等電点電気泳動を使用して分析物の混合物中の分析物を分離した後の試料の可動化に関するデータの非限定的な例を示す。
【図15E】等電点電気泳動を使用して分析物の混合物中の分析物を分離した後の試料の可動化に関するデータの非限定的な例を示す。
【図15F】等電点電気泳動を使用して分析物の混合物中の分析物を分離した後の試料の可動化に関するデータの非限定的な例を示す。
【図16A】等電点電気泳動、および可動化電解質の電気泳動的導入の使用の混合物中の分析物の分離後の試料の可動化に関するデータの非限定的な例を示す。
【図16B】等電点電気泳動、および可動化電解質の電気泳動的導入の使用の混合物中の分析物の分離後の試料の可動化に関するデータの非限定的な例を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本明細書では、試料に含まれる分析物混合物をそれらの個々の成分に分離し、その物理的特性および／または化学的特性を再現性、精度および正確性を改善して特性評価するための方法、装置およびシステムが開示される。特に、等電点電気泳動（ＩＥＦ）などの技術を使用して試料の分離および濃縮を行い、続いて質量分析などの分析機器を使用して個々の分析物成分の特性評価を行うための方法および装置が記載される。開示される方法、装置およびシステムは、分離データの再現性および定量的精度の改善を可能にするとともに、分離データと、例えば、質量分析計または他の分析機器を使用して得られる下流の分析的特性評価データとの間の相関の改善を可能にする。
【0020】
開示される方法、装置およびシステムの１つの重要な特徴は、分離反応、例えば等電点電気泳動反応の完了後の分離チャネルへの可動化緩衝液または電解質の電気泳動的導入を制御するために、オン状態とオフ状態との間で切り替え可能な電極を使用して、それによって、分離チャネルの出口または遠位端に分離チャネル内の１つ以上の分離された分析物ピークを移動させる可動化工程をトリガすることである。いくつかの例では、分離反応の完了、例えば、等電点電気泳動反応の完了に到達するのに必要な時間は既知であり、可動化工程の開始はユーザ指定時間に設定される。いくつかの例では、分離工程の完了は、例えば、等電点電気泳動が行われる際に分離チャネルを流れる電流を監視することによって検出される。いくつかの例では、分離反応の完了は、分離反応が行われる際に分離反応を監視するために分離チャネルの全部または一部の連続的または定期的なイメージングを使用して検出される。いくつかの例では、分離チャネルの処理画像から得られたデータは、分離反応がいつ完了したかを決定するためだけでなく、電極の切り替えを自動的にトリガし、それによって、可動化電解質の電気泳動的導入を開始するトリガ信号を生成するためにも使用される。いくつかの例では、分離チャネルへの可動化電解質の導入（例えば、可動化剤の電気泳動的導入のための電場および／または可動化剤を導入するための流体動圧を使用して）は、分離チャネルの出口または遠位端に向かって分析物ピークが移動する間のピークの広がりを最小限に抑える方法で、分離された分析物ピークの可動化を開始する。いくつかの例では、電気泳動圧力および／または流体動圧を使用して分離チャネル内に可動化電解質を導入すると、分離チャネルの出口または遠位端に向かって分析物ピークが移動する間の分析物ピークが狭くなる（すなわち、それによって分離分解能が改善される）。
【0021】
開示される方法、装置およびシステムの別の重要な特徴は、上記のように、分析物ピークの存在を検出するために、および／または分離反応がいつ完了したかを決定するために、分離チャネル内の分離反応を監視するためのイメージングの使用である。いくつかの例では、分離チャネルの全部または一部について画像を取得してもよい。いくつかの例では、画像を使用して、分離チャネル内の濃縮された分析物ピークの位置を検出してもよい。いくつかの例では、画像を使用して、分離チャネル内の１つ以上のマーカまたはインジケータ（例えば等電点（ｐＩ）標準物質）の存在を検出し、それにより、１つ以上の分析物のｐＩを決定してもよい。いくつかの例では、そのような画像から得られたデータを使用して、分離反応がいつ完了するか（例えば、ピーク速度、ピーク位置および／またはピーク幅を監視することによって）を決定し、続いて可動化工程をトリガしてもよい。いくつかの例では、可動化工程は、分離チャネルに可動化緩衝液または可動化電解質を導入することを含み得る。いくつかの例では、可動化緩衝液または可動化電解質は、流体動圧を使用して導入されてもよい。いくつかの例では、可動化緩衝液または可動化電解質は、電気泳動によって導入されてもよい。いくつかの例では、可動化緩衝液または可動化電解質は、電気泳動と流体動圧との組合せによって導入されてもよい。いくつかの例では、一連の１つ以上の分離された分析物バンドの可動化は、分離チャネルの出口または遠位端に向かって、分離された分析物バンドを移動させることを含み得る。いくつかの例では、一連の１つ以上の分離された分析物バンドの可動化は、下流の分析機器と流体連通している分離チャネルの出口または遠位端に向かって、分離された分析物バンドを移動させることを含み得る。いくつかの例では、分離チャネルの出口または遠位端は、移動する分析物ピークが質量分析計に注入されるように、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェースと流体連通していてもよい。いくつかの例では、分析物ピーク位置を検出し、分析物のｐＩを決定するために使用される画像データはまた、分析物分離日を質量分析データと相関させるために使用されてもよい。
【0022】
好ましい態様では、開示される方法は、マイクロ流体装置形式で行われ得、それにより、極めて少量の試料体積の処理と、２つ以上の試料処理工程および分離工程の統合とを可能にする。別の好ましい態様では、開示されるマイクロ流体装置は、下流の分析機器に結合するための統合インターフェース、例えば、分離した分析物に対して質量分析を行うためのＥＳＩインターフェースを備える。いくつかの例では、開示される方法は、比較的従来型のキャピラリ形式で行われ得る。
【0023】
本明細書に記載される開示される方法、装置およびシステムの様々な態様は、以下に記載される特定の用途のいずれかに、または任意の他のタイプの試料分析用途に適用され得る。開示される方法、装置およびシステムの様々な態様は、個別に、集合的に、または互いに組み合わせて認識することができることを理解されたい。
【0024】
定義：別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【0025】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の言及を含む。本明細書における「または」への言及は、別段の記載がない限り、「および／または」を包含することが意図される。同様に、用語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、限定を意図するものではない。
【0026】
本明細書で使用される場合、「～を含むがこれらに限定されない」および「１つの非限定的な例は～」という句は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるように、所与の例の変形例および派生物を含むことを意味する。
【0027】
本明細書で使用される場合、用語「約」何らかの数とは、その数の１０％を加えたか減じたその数を指す。範囲の文脈で使用される場合、用語「約」は、その最小値の１０％を減じたその範囲およびその最大値の１０％を加えたその範囲を指す。
【0028】
本明細書で使用される場合、用語「特性評価」および「分析」は、区別なく使用され得る。「特性評価する」または「分析する」とは、一般に、試料を評価すること、例えば、試料もしくはその成分の１つ以上の特性を決定すること、または試料の同一性を決定することを意味し得る。
【0029】
本明細書で使用される場合、用語「チップ」および「装置」は、本明細書では区別なく使用され得る。
【0030】
本明細書で使用される場合、用語「分析物」および「種」は、区別なく使用され得る。分析物とは、一般に、測定可能な特性の点で、別の分子、生体分子、化学物質、巨大分子などとは異なる分子、生体分子、化学物質、巨大分子などを意味する。例えば、２つの種は、わずかに異なる質量、疎水性、電荷または正味電荷、等電点、効力を有し得るか、化学修飾、タンパク質修飾などの点で異なり得る。
【0031】
試料分析の方法
本明細書では、分離チャネルを含むマイクロ流体装置に分析物混合物を導入することを含む、試料分析の方法が開示される。いくつかの例では、分離チャネルを横切って圧力が印加されて、分析物混合物の分離に影響を及ぼしてもよい。いくつかの例では、分離チャネルを横切って電場が印加されて、分析物混合物の分離に影響を及ぼしてもよい。いくつかの例では、分析物混合物は、例えば、マイクロ流体装置の透明部分を介して、分離中にイメージングされてもよい。例えば、窓および／または光学スリットを使用して、分離チャネルへの光学アクセスを提供して、分離が起こっている間および／または分離された分析物画分が分離チャネルの出口に向かって可動化される際に分離チャネル全体またはその一部をイメージングすることができる。いくつかの例では、分析物混合物の少なくとも一部が、分離チャネルと流体連通しているオリフィスから排出されてもよい。例えば、分析物混合物の少なくとも一部（例えば、１つ以上の分離された分析物バンドまたは分析物ピーク）が、ＥＳＩを介して排出されてもよい。エレクトロスプレーイオン化を使用して分離装置と質量分析計とを接合させるいくつかの例では、オリフィスは、皿面によって画定された凹部内にテイラーコーンが形成されるように、マイクロ流体装置の皿面に配置され得る。
本明細書では、分離チャネルを含むマイクロ流体装置に分析物混合物を導入することを含む、試料分析の方法が開示される。いくつかの例では、分離チャネルを横切って圧力が印加されて、分析物混合物の分離に影響を及ぼしてもよい。いくつかの例では、分離チャネルを横切って電場が印加されて、分析物混合物の分離に影響を及ぼしてもよい。いくつかの例では、分析物混合物は、例えば、マイクロ流体装置の透明部分を介して、分離中にイメージングされてもよい。例えば、窓および／または光学スリットを使用して、分離チャネルへの光学アクセスを提供して、分離が起こっている間および／または分離された分析物画分が分離チャネルの出口に向かって可動化される際に分離チャネル全体またはその一部をイメージングすることができる。いくつかの例では、分析物混合物の少なくとも一部が、分離チャネルと流体連通しているオリフィスから排出されてもよい。例えば、分析物混合物の少なくとも一部（例えば、１つ以上の分離された分析物バンドまたは分析物ピーク）が、ＥＳＩを介して排出されてもよい。エレクトロスプレーイオン化を使用して分離装置と質量分析計とを接合させるいくつかの例では、オリフィスは、皿面によって画定された凹部内にテイラーコーンが形成されるように、マイクロ流体装置の皿面に配置され得る。
【0032】
したがって、開示される試料分析方法は、（ｉ）分析物混合物を含む試料を分離チャネルに導入すること、（ｉｉ）１つ以上の分離工程もしくは濃縮工程を行って、試料中に含有される分析物の混合物から分析物を分離すること、（ｉｉｉ）分離工程および／または可動化工程が行われている間、分離チャネルの全部もしくは一部を定期的もしくは継続的にイメージングすること、（ｉｖ）分離チャネルに可動化緩衝液もしくは可動化電解質を導入すること、ここで、導入は、ユーザ指定時間、分離チャネルを流れる電流のレベル、および／または分離チャネルの画像から得られたデータに基づいて自動的にトリガされ、（ｖ）可動化剤の電気泳動的導入および／または圧力誘起導入、およびその後の分離チャネルから分離チャネルの出口もしくは遠位端に向かう分離された分析物ピークもしくは濃縮された分析物画分の可動化、（ｖｉ）下流の分析機器への１つ以上の可動化された分析物ピークもしくは濃縮された分析物画分の移動、または（ｖｉｉ）それらの任意の組合せのうちの１つ以上を含み得る。分析物の分析は、吸光度または蛍光シグナルの測定、１つ以上の分離された分析物ピークまたは分析物バンドの存在、位置および／またはピーク幅を検出するためのイメージング、質量の決定、化学構造の分析などのような様々な方法のいずれかを含み得る。
【0033】
試料：開示される方法、装置、システムおよびソフトウェアは、様々な生物学的試料または非生物学的試料のいずれかから得られた分析物の分離および特性評価に使用することができる。例には、限定するものではないが、組織試料、細胞培養試料、全血試料（例えば、静脈血試料、動脈血試料または毛細管血試料）、血漿、血清、唾液、間質液、尿、汗、涙、工業用酵素または生物学的薬物の製造プロセスから得られたタンパク質試料、環境試料（例えば、空気試料、水試料、土壌試料、表面スワイプ試料）などが挙げられる。いくつかの実施形態では、試料は、統合された化学分離および質量分析特性評価のための開示される方法および装置を使用する分析の前に、当業者に公知の様々な技術のいずれかを使用して処理され得る。例えば、いくつかの実施形態では、試料は、タンパク質または核酸を抽出するために処理され得る。試料は、様々な供給源または対象のいずれか、例えば、細菌、ウイルス、植物、動物またはヒトから採取され得る。
【0034】
試料体積：開示される方法および装置のいくつかの例では、マイクロ流体装置を使用することにより、非常に少量の試料体積の処理が可能になり得る。いくつかの実施形態では、装置にロードされ、分析に使用される試料体積は、約０．１μｌ～約１ｍｌの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、装置にロードされ、分析に使用される試料体積は、少なくとも０．１μｌ、少なくとも１μｌ、少なくとも２．５μｌ、少なくとも５μｌ、少なくとも７．５μｌ、少なくとも１０μｌ、少なくとも２５μｌ、少なくとも５０μｌ、少なくとも７５μｌ、少なくとも１００μｌ、少なくとも２５０μｌ、少なくとも５００μｌ、少なくとも７５０μｌまたは少なくとも１ｍｌであり得る。いくつかの実施形態では、装置にロードされ、分析に使用される試料体積は、最大１ｍｌ、最大７５０μｌ、最大５００μｌ、最大２５０μｌ、最大１００μｌ、最大７５μｌ、最大５０μｌ、最大２５μｌ、最大１０μｌ、最大７．５μｌ、最大５μｌ、最大２．５μｌ、最大１μｌまたは最大０．１μｌであり得る。本項に記載される下限値および上限値のいずれかを組み合わせて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの実施形態では、装置にロードされ、分析に使用される試料体積は、約５μｌ～約５００μｌの範囲であり得る。当業者であれば、分析に使用される試料体積が、この範囲内の任意の値、例えば、約１８μｌを有し得ることを認識するであろう。
【0035】
分析物：いくつかの例では、試料は複数の分析物種を含み得る。いくつかの例では、試料中に存在する分析物種の全部または一部が、分析前または分析中に濃縮され得る。いくつかの例では、これらの分析物は、例えば、グリカン、炭水化物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、組換えタンパク質、無傷のタンパク質、タンパク質アイソフォーム、消化されたタンパク質、融合タンパク質、抗体薬物複合体、タンパク質薬物複合体、ペプチド、代謝産物または他の生物学的に関連する分子であり得る。いくつかの例では、これらの分析物は低分子薬物であり得る。いくつかの例では、これらの分析物は、タンパク質混合物中のタンパク質分子、例えば、生物学的タンパク質医薬品および／または培養物から単離されたかインビボで単離された細胞から収集された溶解物であり得る。
【0036】
分析物の分離および濃縮：いくつかの例では、開示される方法（および該方法を行うように構成された装置またはシステム）は、混合物中の複数の分析物が個々の画分に分離および／または濃縮される１つ以上の分離工程または濃縮工程を含み得る。例えば、いくつかの例では、開示される方法は、第１の濃縮工程を含み得、第１の濃縮工程では、元の試料または分析物混合物から得られた分析物分子のサブセットを含有する画分が、一度に１つの画分に溶出され、次いで、これらの濃縮された分析物画分が、別の濃縮工程に供され得る。最後の濃縮工程に続いて、濃縮された分析物画分はその後の分析のために排出される。
【0037】
いくつかの例では、開示される方法は、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上の分離工程および／または濃縮工程を含み得る。いくつかの実施形態では、分離工程または濃縮工程のうちの１つ以上は、固相分離技術、例えば、逆相ＨＰＬＣを含む。いくつかの実施形態では、分離工程または濃縮工程のうちの１つ以上は、液相分離技術、例えば、キャピラリゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を含む。いくつかの実施形態では、等電点電気泳動（ＩＥＦ）などの最終工程を使用して、濃縮された分析物画分を濃縮してから排出する。
【0038】
開示される方法（および該方法を行うように構成された装置またはシステム）は、当業者に公知の様々な分析物分離または濃縮技術のいずれかを含み得、（１または複数の）分離工程または濃縮工程は、イメージングされるように構成された少なくとも１つの第１の分離チャネル内で行われて、その結果、分離プロセスは、それが行われる際に監視され得る。例えば、いくつかの例では、イメージングされる分離は、例えば、分析物混合物から１つ以上の分離された分析物画分を生成する等電点電気泳動、キャピラリゲル電気泳動、キャピラリゾーン電気泳動、等速電気泳動、キャピラリ動電クロマトグラフィ、ミセル動電クロマトグラフィ、フローカウンタバランスキャピラリ電気泳動、電場勾配フォーカシング、動的場勾配フォーカシング（ｄｙｎａｍｉｃ ｆｉｅｌｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）などを含む電気泳動分離であり得る。
【0039】
キャピラリ等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）：いくつかの例では、分離技術は、キャピラリ等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）などの等電点電気泳動（ＩＥＦ）を含み得る。等電点電気泳動（または「等電点分離法」）は、等電点（ｐＩ）、すなわち、分子が正味のゼロ電荷を有するｐＨの差によって分子を分離する技術である。ＣＩＥＦは、アノードまたはカソードを含む試薬リザーバに両性電解質（ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）（両性電解質（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ））溶液を加えて、分離電圧が印加される分離チャネル（すなわち、電極含有ウェルを接続する流体チャネル）内にｐＨ勾配を生成することを含む。負に帯電した分子は、正極に向かって媒体中のｐＨ勾配を移動し、正に帯電した分子は負極に向かって移動する。等電点（ｐＩ）未満のｐＨ領域にあるタンパク質（または他の分子）は正に帯電するため、カソード（すなわち、負に帯電した電極）に向かって移動する。タンパク質の全体的な正味電荷は、タンパク質が正味電荷を有しないそのｐＩに対応するｐＨ領域に到達するまで、増加するｐＨ（例えば、カルボキシル基または他の負に帯電した官能基のプロトン化による）の勾配をタンパク質が移動するにつれて減少し、したがって移動は停止する。その結果、タンパク質の混合物は酸性残基と塩基性残基との相対的含有量に基づいて分離し、各タンパク質がそのｐＩに対応するｐＨ勾配のある点に位置する鋭い定常バンドに集束する。この技術により、単一の電荷によって異なるタンパク質を別個のバンドに分画することによって、極めて高い分解能を実現することができる。いくつかの実施形態では、等電点電気泳動は、電気浸透流（ＥＯＦ）を排除するために、例えば中性および親水性ポリマーコーティングによって恒久的または動的にコーティングされた分離チャネル内で行われてもよい。好適なコーティングの例には、限定するものではないが、ポリアクリルアミド、線状ポリアクリルアミド、ヒドロキシプロリセルロース（ＨＰＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはＧｕａｒａｎｔ ｃｏａｔｉｎｇ（Ａｌｃｏｒ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、分離媒体にメチルセルロースまたはグリセロールなどの添加剤を使用して（例えば、コーティングされていない分離チャネル内で）等電点電気泳動を行って、電気浸透流を大幅に減少させ、タンパク質の可溶化を向上させ、電解質の粘度を増加させることによって流体チャネルのキャピラリ内部の拡散を制限してもよい。
【0040】
上記のように、キャピラリ等電点電気泳動技術に使用されるｐＨ勾配は、両性電解質、すなわち、酸性基および塩基性基の両方を含み、特定のｐＨ範囲内で両性イオンとしてほとんどが存在する両性分子を使用することによって生成される。分離チャネルのアノード側の電解液のその部分は、「アノード液」として知られている。分離チャネルのカソード側の電解液のその部分は、「カソード液」として知られている。したがって、等電点電気泳動に使用するための両性電解質は、酸／塩基対（またはアノード液／カソード液対）の使用を含み得る。限定するものではないが、リン酸／水酸化ナトリウム、グルタミン酸／リジン、ギ酸／ジメチルアミン、市販の担体両性電解質混合物（例えば、Ｓｅｒｖａｌｙｔ ｐＨ ４－９（Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｌｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｂｅｃｋｍａｎ ｐＨ ３－１０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ３．５－９．５およびＰｈａｒｍａｌｙｔｅ ３－１０（いずれもＧｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｏｒｓａｙ，Ｆｒａｎｃｅ製）などを含め、当業者に公知の様々な両性電解質のいずれも、開示される方法および装置に使用することができる。担体両性電解質混合物は、近接したｐＩ値および良好な緩衝能を有する多数の脂肪族アミノ基およびカルボキシレート基を含む小分子（約３００～１，０００Ｄａ）の混合物である。印加電場の存在下では、担体両性電解質は、アノードからカソードへ直線的に増加する滑らかなｐＨ勾配に分配される。
【0041】
分離された分析物ピークの等電点を計算するための開示される方法および装置では、様々なｐＩ標準物質のいずれも、適切なイメージング技術を使用してそれらを視覚化することができることを条件に使用することができる。一般に、ＣＩＥＦ用途に使用されるｐＩマーカには、タンパク質ｐＩマーカおよび合成小分子ｐＩマーカの２種類がある。タンパク質ｐＩマーカは、一般的に許容されるｐＩ値を有する特定のタンパク質に基づく。それらは一般に、厳格な保管条件の採用を必要とし、低い安定性を示し得るため、ＣＩＥＦでは複数のピークを生じる可能性がある。合成小分子（酵素分離に使用され得るように、好ましくは非ペプチド分子）は保管中に一般に安定性が高く、ＣＩＥＦでは単一ピークに集中する。様々なタンパク質ｐＩマーカまたは合成小分子ｐＩマーカ、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｌｔｄ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）から入手可能な小分子ｐＩマーカが利用可能である。
【0042】
キャピラリゾーン電気泳動（ＣＺＥ）：いくつかの例では、分離技術は、印加電場内の溶液中の荷電分析物を分離するための方法であるキャピラリゾーン電気泳動を含み得る。荷電分析物分子の正味の速度は、分離システムによって示される電気浸透流（ＥＯＦ）μＥＯＦ、および個々の分析物（分子のサイズ、形状および電荷に依存する）に関する電気泳動移動度μＥＰの両方の影響を受け、その結果、異なるサイズ、形状または電荷を示す分析物分子は、異なる移動速度を示し、バンドに分離する。他のキャピラリ電気泳動法とは異なり、ＣＺＥは分離に「単純な」緩衝液を使用する。
【0043】
キャピラリゲル電気泳動（ＣＧＥ）：いくつかの例では、分離技術は、巨大分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質）、ならびにそれらのサイズおよび電荷に基づくそれらの断片の分離および分析のための方法であるキャピラリゲル電気泳動を含み得る。この方法は、ゲル充填分離チャネルの使用を含み、ゲルは、印加電場内の荷電分析物分子の電気泳動移動中、抗対流媒体（ａｎｔｉ－ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ）および／または篩媒体（ｓｉｅｖｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）として作用する。ゲルは、電場の印加によって引き起こされる熱対流を抑制するように機能するとともに、分子の通過を遅らせる篩媒体として作用し、それによって、異なるサイズまたは電荷の分子に対して異なる移動速度をもたらす。
【0044】
キャピラリ等速電気泳動（ＣＩＴＰ）：いくつかの例では、分離技術は、好適な寸法のキャピラリまたは流体チャネル内で２つの電解質（先行電解質および終末電解質として知られている）の不連続系を使用する、荷電分析物の分離方法であるキャピラリ等速電気泳動を含み得る。先行電解質は最も高い電気泳動移動度を有するイオンを含有し、終末電解質は最も低い電気泳動移動度を有するイオンを含有する。分離される分析物混合物（すなわち、試料）は、これら２つの電解質の間に挟まれ、電場を印加すると、電気泳動移動度を減少させる順序で、キャピラリまたは流体チャネル内の荷電分析物分子を近接した隣接ゾーンに分配する。ゾーンは、印加電場内で一定の速度で移動するため、検出器、例えば、導電率検出器、光検出器またはイメージング装置を利用して、分離チャネルに沿ったそれらの通過を記録してもよい。キャピラリゾーン電気泳動とは異なり、キャピラリ等速電気泳動を使用して行われる単一分析では、アニオン性分析物およびカチオン性分析物の同時決定または同時検出は実行不可能である。
【0045】
キャピラリ動電クロマトグラフィ（ＣＥＣ）：いくつかの例では、分離技術は、液体クロマトグラフィ分離法と電気泳動分離法との組合せに基づく、分析物混合物の分離方法であるキャピラリ動電クロマトグラフィを含み得る。ＣＥＣは、キャピラリ電気泳動（ＣＥ）の効率と、充填キャピラリ高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）の選択性および試料容量とをともに提供する。ＣＥＣに使用されるキャピラリにはＨＰＬＣ充填材が充填されているため、ＨＰＬＣに利用可能な多種多様な分析物選択性がＣＥＣでも利用可能である。これらの充填材の高い表面積は、ＣＥＣキャピラリが比較的大量の試料を収容することを可能にし、続いて溶出した分析物の検出をキャピラリゾーン電気泳動（ＣＺＥ）でのそれよりもやや簡単な作業にする。
【0046】
ミセル動電クロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）：いくつかの例では、分離技術は、界面活性剤ミセル（擬似固定相）と周囲の水性緩衝液（移動相）との間の差次的な分配に基づく分析物混合物の分離方法であるキャピラリ動電クロマトグラフィを含み得る。ＭＥＫＣに使用される基本的なセットアップおよび検出方法は、ＣＺＥに使用されるものと同じである。相違は、界面活性剤モノマーがミセルと平衡にあるように、緩衝液が臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）よりも高い濃度の界面活性剤を含有することである。ＭＥＫＣは、典型的には、強力な電気浸透流を生成するためにアルカリ条件を使用して、開放キャピラリまたは開放流体チャネル内で行われる。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、ＭＥＫＣ用途に一般的に使用される界面活性剤の一例である。ＳＤＳの硫酸基のアニオン特性により、界面活性剤およびミセルは、強力な電気浸透流の方向とは逆の電気泳動移動度を有する。その結果、界面活性剤モノマーおよびミセルは、それらの正味の移動が依然として電気浸透流の方向にある、すなわちカソードに向かっているにもかかわらず、非常にゆっくりと移動する。ＭＥＫＣ分離中、分析物は、ミセルの疎水性内部と親水性緩衝液との間に分散する。ミセル内部で不溶性の親水性分析物は、電気浸透流速度ｕｏで移動し、緩衝液の保持時間ｔＭで検出される。ミセル内で完全に可溶化する疎水性分析物は、ミセル速度ｕｃで移動し、最終溶出時間ｔｃで溶出する。
【0047】
フローカウンタバランスキャピラリ電気泳動（ＦＣＣＥ）：いくつかの例では、分離技術は、キャピラリを通る分析物の動電移動を積極的に遅延させるか、停止させるか、反転させるために圧力誘起カウンタフローを利用する、キャピラリ電気泳動の効率および分解能を増加させる方法であるフローカウンタバランスキャピラリ電気泳動を含み得る。検出窓を横切って分析物を遅延させるか、停止させるか、前後に移動させることによって、目的の分析物が、通常の分離条件下よりもはるかに長い時間にわたって分離チャネルに効果的に閉じ込められ、それによって、分離の効率および分解能の両方が増大する。
【0048】
クロマトグラフィ：いくつかの例では、分離技術は、試料流体中の分析物混合物（移動相）が、混合物の様々な成分を差動的に保持し、それによってそれらを異なる速度で移動させ分離させるカラムまたはチャネル充填材（固定相）を通過するクロマトグラフィ技術を含み得る。いくつかの例では、固定相に対して高い結合親和性を有する分析物を移動させるために、溶出または可動化の後続工程が必要になり得る。開示される方法に組み込まれ得るクロマトグラフィ技術の例には、限定するものではないが、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィおよび逆相クロマトグラフィが挙げられる。
【0049】
分離チャネルのイメージング：ほとんどの場合、開示される方法（および該方法を行うように構成された装置およびシステム）は、分離および／または可動化反応が行われている間それを監視するために、少なくとも１つの分離チャネルの全部または一部をイメージングすることを含み得る。いくつかの例では、当業者に公知の様々なイメージング技術のいずれかを使用して、分離および／または可動化反応がイメージングされ得る。例には、限定するものではないが、紫外線（ＵＶ）吸光度、可視光吸光度、蛍光（例えば、天然蛍光、またはフルオロフォアにより１つ以上の分析物を標識することから生じる蛍光）、フーリエ変換赤外分光法、フーリエ変換近赤外分光法、ラマン分光法、光学分光法などが挙げられる。いくつかの例では、分離（または濃縮）チャネルの全部もしくは一部、分離チャネルの端部と下流の分析機器もしくはエレクトロスプレーオリフィスもしくは先端、エレクトロスプレーオリフィスもしくは先端自体とを接続する接合部もしくは接続チャネル、またはそれらの任意の組合せがイメージングされ得る。いくつかの例では、分離（または濃縮）チャネルは、キャピラリの内腔であってよい。いくつかの例では、分離（または濃縮）チャネルは、マイクロ流体装置内の流体チャネルであってよい。
【0050】
分離された分析物バンドの検出に使用される（１または複数の）波長範囲は、典型的には、イメージング技術の選択と、装置またはその一部が製造される（１または複数の）材料とに依存する。例えば、分離チャネル、またはマイクロ流体装置の他の部分の全部または一部をイメージングするためにＵＶ吸光度が使用される場合、約２２０ｎｍ（ペプチド結合の自然吸光度による）および／または約２８０ｎｍ（芳香族アミノ酸残基の自然吸光度による）での検出は、装置の少なくとも一部、例えば、分離チャネルまたはその一部がこれらの波長の光に対して透明であることを条件に、分離および／または可動化中にタンパク質バンドを視覚化することを可能にし得る。いくつかの例では、ＥＳＩ－ＭＳを介して分離および特性評価される分析物は、分離の前に、例えば、フルオロフォア、化学発光タグまたは他の好適な標識を用いて標識されて、蛍光イメージングまたは他の好適なイメージング技術を使用してイメージングされ得る。いくつかの例では、例えば、分析物が商業的製造プロセスによって生成されたタンパク質を含む場合、タンパク質は、蛍光を使用してイメージングされ得るように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ドメインまたはその変異体を組み込むように遺伝子操作されてもよい。タンパク質または他の分析物分子を標識する際には、標識自体が、選択された分離技術の基礎となる分析物特性を妨げたり、乱したりしないように注意しなければならない。
【0051】
いくつかの例では、イメージング（またはそこから得られたデータ）を使用して、分離チャネルから、分離チャネルの出口端と流体連通している別のチャネルへのための、１つの分離チャネルから別の分離チャネルへの分離された分析物画分またはその部分の可動化工程または他の移動をトリガしてもよい。例えば、いくつかの例では、開示される方法は、第１の分離チャネルおよび第２の分離チャネルを含むマイクロ流体装置に分析物を注入することを含み得る。第１の分離チャネルは、分析物混合物からの分析物に結合するように構成された媒体を含むことができる。したがって、分析物混合物がマイクロ流体装置に注入されると、分析物混合物の少なくとも一部が、マトリックスに結合し得、および／または第１の分離チャネルを通って流れるのを妨げられ得る。例えば、マイクロ流体装置に分析物を注入することにより、第１の分離チャネル内でクロマトグラフィ分離を行うことができる。分析物の少なくとも一部が媒体から可動化されるように、マイクロ流体装置に溶出液を注入することができる。分析物が可動化されている間に、第１の分離チャネルをイメージングすることができる。第１の分離のイメージングは、全カラム（例えば、全チャネル）イメージングおよび／またはチャネルの一部のイメージングを含むことができる。画分が第１の分離チャネルと第２の分離チャネルとの交点に配置されて、画分が第２の分離チャネルに向かって可動化されることがイメージングによって検出されると、第２の分離チャネルに電場を印加することができる。例えば、いくつかの例では、第１の分離チャネルおよび第２の分離チャネルは、Ｔ接合部を形成することができる。イメージングにより、画分の一部（例えば、目的の部分）が接合部にある時を検出することができる。電場を印加することにより、分離の第２段階ための第２の分離チャネルに向かって画分の一部（場合により、接合部に位置しない画分の他の部分ではなく）を可動化することができる。いくつかの例では、画分の少なくとも一部がマイクロ流体装置から排出されてもよい。
【0052】
分離された分析物種の可動化：開示される方法のいくつかの例、例えば、逆相クロマトグラフィなどのクロマトグラフィ分離技術を含む方法では、固定相に保持された分析物種の溶出（例えば、分離チャネルを流れる緩衝液を変更することにより）が、「可動化」工程と呼ばれ得る。ほとんどの場合、分離反応を促進するために使用される力（例えば、逆相クロマトグラフィでは圧力、または動電分離もしくは等電点電気泳動反応では電場）は、可動化工程の間オフにされ得る。いくつかの例では、分離反応を促進するために使用される力は、可動化工程の間、オンのままにされてもよい。開示される方法のいくつかの例、例えば、等電点電気泳動工程を含む方法では、分離された分析物バンドが、別の流体チャネル（第２の分離チャネルであってよい）に接続されるか、下流の分析装置、例えば、質量分析計とのエレクトロスプレーイオン化インターフェースと接合する分離チャネルの端部に向かって移動するように、分離された分析物バンドが（例えば、流体動圧および／または化学的可動化技術を使用して）可動化され得る。いくつかの実施形態では、例えば、キャピラリゲル電気泳動、キャピラリゾーン電気泳動、等速電気泳動、キャピラリ動電クロマトグラフィ、ミセル動電クロマトグラフィ、フローカウンタバランスキャピラリ電気泳動、または差速により分析物混合物の成分を分離する他の任意の分離技術が使用される例では、分離工程は可動化工程と考えられ得る。
【0053】
いくつかの例では、分析物バンドの可動化は、分離チャネルの一端に流体動圧を印加することによって実施されてもよい。いくつかの例では、分析物バンドの可動化は、重力が利用され得るように分離チャネルを垂直位置に配向することによって実施されてもよい。いくつかの例では、分析物バンドの可動化は、ＥＯＦ支援可動化を使用して実施されてもよい。いくつかの例では、分析物バンドの可動化は、例えば、等電点電気泳動に使用されるｐＨ勾配の局所ｐＨをシフトする可動化電解質を分離チャネルに導入することによる化学的可動化を使用して実施されてもよい。いくつかの例では、これらの可動化技術の任意の組合せが使用されてもよい。
【0054】
好ましい一例では、等電点電気泳動された分析物バンドの可動化工程は、化学的可動化を含む。圧力ベースの可動化と比較して、化学的可動化は、圧力の使用により誘導される流体力学的放物線流プロファイルを克服することにより、最小のバンドの広がりを示すという利点を有する。電解質（すなわち、「可動化電解質」）を分離チャネルに導入して、分離された分析物バンド（または両性イオン緩衝液成分）（または両性イオン緩衝液成分および関連する水和シェル）が印加電場内を移動するように、分離された分析物バンド（または両性イオン緩衝液成分）上の局所ｐＨおよび／または正味電荷を変化させることによって、化学的可動化を実施してもよい。いくつかの例では、分離された分析物バンドを可動化するために使用される印加電場の極性は、分析物が、分離チャネルの出口または遠位端と電気通信しているアノードに向かって移動する（アノード可動化）ような極性である。いくつかの例では、分離された分析物バンドを可動化するために使用される印加電場の極性は、分析物が、分離チャネルの出口または遠位端と電気通信しているカソードに向かって移動する（カソード可動化）ような極性である。可動化電解質は、分離チャネルまたはキャピラリへの導入のために、ヒドロキシル（カソード可動化）またはヒドロニウムイオン（アノード可動化）と競合するアニオンまたはカチオンのいずれかを含む。アノード可動化のためのカソード液として使用され得る塩基の例には、限定するものではないが、アンモニア、ジエチルアミン、ジメチルアミン、ピペリジンなどが挙げられる。カソード可動化でアノード液として使用され得る酸の例には、限定するものではないが、酢酸、ギ酸および炭酸などが挙げられる。いくつかの例では、アノードが接地され得、カソードに負電圧が印加される。いくつかの例では、カソードが接地され得、アノードに正電圧が印加される。いくつかの例では、非ゼロの負電圧がカソードに印加されてもよく、非ゼロの正電圧がアノードに印加されてもよい。
【0055】
いくつかの例では、分離された分析物バンドの可動化は、分離チャネルへの可動化緩衝液または電解質の電気泳動的導入を制御するためにオン状態とオフ状態との間で切り替え可能な電極（例えば、分離チャネルの遠位端と電気通信しているカソード、および可動化チャネル（分離チャネルの出口または遠位端の近くで分離チャネルと交差する流体チャネル）の近位端と電気通信しているカソード）をトリガするユーザ指定時間に開始され得る。
【0056】
いくつかの例では、オン状態とオフ状態との間の１つ、２つ、または３つ以上の切り替え可能な電極の遷移を独立してトリガするためのユーザ指定時間は、可動化スキームのいずれかでは、約３０秒～約３０分の範囲であり得る。いくつかの例では、ユーザ指定時間は、少なくとも３０秒、少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも２０分、少なくとも２５分または少なくとも３０分であり得る。いくつかの例では、ユーザ指定時間は、最大３０分、最大２５分、最大２０分、最大１５分、最大１０分、最大５分、最大４分、最大３分、最大２分、最大１分または最大３０秒であり得る。本項に記載される下限値および上限値のいずれかを組み合わせて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、ユーザ指定時間は約２分～約２５分の範囲であり得る。当業者であれば、ユーザ指定時間が、この範囲内の任意の値、例えば、約８．５分を有し得ることを認識するであろう。
【0057】
いくつかの例では、本明細書に開示される可動化シナリオのいずれかで可動化に影響を与える（またはそのような分離技術が行われる例では動電分離もしくは等電点電気泳動反応を行う）ために使用される電場は、約０Ｖ／ｃｍ～約１，０００Ｖ／ｃｍの範囲であり得る。いくつかの例では、電場強度は、少なくとも０Ｖ／ｃｍ、少なくとも２０Ｖ／ｃｍ、少なくとも４０Ｖ／ｃｍ、少なくとも６０Ｖ／ｃｍ、少なくとも８０Ｖ／ｃｍ、少なくとも１００Ｖ／ｃｍ、少なくとも１５０Ｖ／ｃｍ、少なくとも２００Ｖ／ｃｍ、少なくとも２５０Ｖ／ｃｍ、少なくとも３００Ｖ／ｃｍ、少なくとも３５０Ｖ／ｃｍ、少なくとも４００Ｖ／ｃｍ、少なくとも４５０Ｖ／ｃｍ、少なくとも５００Ｖ／ｃｍ、少なくとも６００Ｖ／ｃｍ、少なくとも７００Ｖ／ｃｍ、少なくとも８００Ｖ／ｃｍ、少なくとも９００Ｖ／ｃｍまたは少なくとも１，０００Ｖ／ｃｍであり得る。いくつかの例では、電場強度は、最大１，０００Ｖ／ｃｍ、最大９００Ｖ／ｃｍ、最大８００Ｖ／ｃｍ、最大７００Ｖ／ｃｍ、最大６００Ｖ／ｃｍ、最大５００Ｖ／ｃｍ、最大４５０Ｖ／ｃｍ、最大４００Ｖ／ｃｍ、最大３５０Ｖ／ｃｍ、最大３００Ｖ／ｃｍ、最大２５０Ｖ／ｃｍ、最大２００Ｖ／ｃｍ、最大１５０Ｖ／ｃｍ、最大１００Ｖ／ｃｍ、最大８０Ｖ／ｃｍ、最大６０Ｖ／ｃｍ、最大４０Ｖ／ｃｍ、最大２０Ｖ／ｃｍまたは最大０Ｖ／ｃｍであり得る。本項に記載される下限値および上限値のいずれかを組み合わせて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、電場強度時間は約４０Ｖ／ｃｍ～約６５０Ｖ／ｃｍの範囲であり得る。当業者であれば、電場強度が、この範囲内の任意の値、例えば、約５７５Ｖ／ｃｍを有し得ることを認識するであろう。
【0058】
いくつかの例では、例えば、等電点電気泳動の場合に、分離チャネルを通過する電流が最小値に達し得る、分離チャネルの電流（または導電率）を監視することから得られたデータに基づいて、分離された分析物バンドの可動化が開始され得る。いくつかの例では、最小電流値の検出、または特定の期間にわたって特定の閾値未満にとどまる電流値の検出は、等電点電気泳動反応が完了に達したかどうかを決定するために使用されてもよく、したがって、化学的可動化工程の開始をトリガするために使用されてもよい。
【0059】
いくつかの例では、最小電流値または閾値電流値は、約０μＡ～約１００μＡの範囲であり得る。いくつかの例では、最小電流値または閾値電流値は、少なくとも０μＡ、少なくとも１μＡ、少なくとも２μＡ、少なくとも３μＡ、少なくとも４μＡ、少なくとも５μＡ、少なくとも１０μＡ、少なくとも２０μＡ、少なくとも３０μＡ、少なくとも４０μＡ、少なくとも５０μＡ、少なくとも６０μＡ、少なくとも７０μＡ、少なくとも８０μＡ、少なくとも９０μＡまたは少なくとも１００μＡであり得る。いくつかの例では、最小電流値または閾値電流値は、最大１００μＡ、最大９０μＡ、最大８０μＡ、最大７０μＡ、最大６０μＡ、最大５０μＡ、最大４０μＡ、最大３０μＡ、最大２０μＡ、最大１０μＡ、最大５μＡ、最大４μＡ、最大３μＡ、最大２μＡ、最大１μＡまたは最大０μＡであり得る。本項に記載される下限値および上限値のいずれかを組み合わせて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、最小電流値または閾値電流値は、約１０μＡ～約９０μＡの範囲であり得る。当業者であれば、最小電流値または閾値電流値が、この範囲内の任意の値、例えば、約１６μＡを有し得ることを認識するであろう。
【0060】
いくつかの例では、特定の期間は、少なくとも５秒、少なくとも１０秒、少なくとも１５秒、少なくとも２０秒、少なくとも２５秒、少なくとも３０秒、少なくとも３５秒、少なくとも４０秒、少なくとも４５秒、少なくとも５０秒、少なくとも５５秒または少なくとも６０秒であり得る。
【0061】
いくつかの例では、分離工程が行われる際に分離チャネルの画像から（例えば、自動画像処理を行うことによって）得られたデータに基づいて、分離された分析物バンドの可動化が開始され得る。画像由来データは、１つ以上の分析物ピークの存在もしくは非存在、１つ以上の分析物ピークの位置、１つ以上の分析物ピークの幅、１つ以上の分析物ピークの速度、分離分解能、１つ以上の分析物ピークの存在、位置、幅もしくは速度のその変化率もしくは欠如、またはそれらの任意の組合せを監視するために使用されてもよく、分離反応が完全であるかどうかを決定するために、および／または可動化工程の開始をトリガするために使用されてもよい。場合によっては、分離工程の完了は、ある期間にわたる（例えば、１０～６０秒の期間にわたる）分離性能パラメータ（例えば、ピーク位置またはピーク幅）の変化率を監視することによって決定されてもよい。
【0062】
開示される方法の好ましい一態様では、化学的可動化工程は、装置内の電場を変化させて分離チャネルに向かって可動化電解質を電気泳動させることによって、ＣＩＥＦとＥＳＩ－ＭＳとを統合するように設計されたマイクロ流体装置内で開始され得る。いくつかの例では、可動化工程の開始は、分離チャネルの全部または一部の画像から得られたデータに基づいてトリガされてもよい。いくつかの例では、電場の変化は、１つ以上の電源に取り付けられた１つ以上の電極を接続または切断することによって実施されてもよく、１つ以上の電極は、装置上の試薬ウェルに配置されるか、装置の流体チャネルと統合される。いくつかの例では、１つ以上の電極の接続または切断は、可動化工程のタイミングおよび持続時間が、分離工程、エレクトロスプレーイオン化工程および／または質量分析データ収集と調整され得るように、コンピュータ実施方法およびプログラム可能なスイッチを使用して制御され得る。いくつかの例では、装置内の電場の変化を使用して、保持された分析物が固定相から放出されるように、固定相を含む分離チャネル内に可動化緩衝液を電気泳動的にまたは電気浸透的に流してもよい。
【0063】
いくつかの例では、３つ以上の電極が装置に接続されてもよい。例えば、第１の電極は、分離チャネルの近位端に電気的に結合されてもよい。同様に、次いで、第２の電極が分離チャネルの遠位端に結合されてもよく、第３の電極が、例えば分離チャネルの遠位端で分離チャネルと交差し、可動化緩衝液を含むリザーバに接続するかそれを含む可動化チャネルに結合されてもよい。画像ベースの方法によって決定されるように、分離工程の完了時に、第２または第３の電極とそれらのそれぞれのチャネルとの電気的結合は、「オン」状態と「オフ」状態との間で切り替え可能であり得る。そのような一例では、分離回路のアノードまたはカソードを形成する第２の電極は、「オフ」モードに切り替わってもよく、分離中にオフであってもよい第３の電極は、「オン」モードに切り替わって、チャネルへの可動化緩衝液の導入（例えば、電気泳動を介して）を開始してもよい。いくつかの例では、「オン」状態および「オフ」状態は、それぞれ電極と流体チャネルとの間の電気的結合の完全な接続または切断を含み得る。いくつかの例では、「オン」状態および「オフ」状態は、特定の電極を通過する電流をそれぞれ非ゼロまたはゼロのマイクロアンペアに固定することを含み得る。
【0064】
いくつかの例では、可動化工程のトリガまたは開始は、上記のように、１つ以上の画像由来分離パラメータについて、変化がないこと、または特定の閾値未満の変化を検出することを含み得る。例えば、いくつかの例では、１つ以上の画像由来パラメータ（例えば、ピーク位置、ピーク幅、ピーク速度など）の２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満の変化を使用して、可動化工程がトリガされてもよい。
【0065】
いくつかの例では、可動化工程のトリガまたは開始は、上記のように、１つ以上の画像由来分離パラメータについて、変化がないこと、または特定の閾値未満の変化率を検出することを含み得る。例えば、いくつかの例では、少なくとも１０秒、少なくとも１５秒、少なくとも２０秒、少なくとも２５秒、少なくとも３０秒、少なくとも３５秒、少なくとも４０秒、少なくとも４５秒、少なくとも５０秒、少なくとも５５秒または少なくとも６０秒（またはこれらの変化率と期間との任意の組合せ）の期間にわたる１つ以上の画像由来パラメータ（例えば、ピーク位置、ピーク幅、ピーク速度など）の２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満の変化を使用して、可動化工程をトリガしてもよい。
【0066】
分離時間および分離分解能：一般に、完全な分離を達成するために必要とされる分離時間は、特定の分離技術および利用される操作パラメータ（例えば、分離チャネル長、マイクロ流体装置設計、緩衝液組成、印加電圧など）によって異なる。いくつかの例では、分離時間は約０．１分～約３０分の範囲であり得る。いくつかの例では、分離時間は、少なくとも０．１分、少なくとも０．５分、少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも１５分、少なくとも２０分、少なくとも２５分または少なくとも３０分であり得る。いくつかの例では、分離時間は、最大３０分、最大２５分、最大２０分、最大１５分、最大１０分、最大５分、最大１分、最大０．５分または最大０．１分であり得る。本項に記載される下限値および上限値のいずれかを組み合わせて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、分離時間は約１分～約２０分の範囲であり得る。当業者であれば、分離時間が、この範囲内の任意の値、例えば、約１１．２分を有し得ることを認識するであろう。
【0067】
同様に、開示される方法および装置を使用して達成される分離効率および分離分解能は、利用される特定の分離技術および操作パラメータ（例えば、分離チャネル長、マイクロ流体装置設計、緩衝液組成、印加電圧など）、ならびに一次元または二次元の分離が利用されるかどうかによって異なり得る。いくつかの例では、例えば、等電点電気泳動を行う場合、分離チャネルへの可動化電解質の電気泳動的導入をトリガするために切り替え可能な電極を使用すると、分離分解能が改善され得る。例えば、いくつかの例では、開示される方法および装置を使用して行われるＩＥＦの分離分解能は、約０．１～約０．０００１ｐＨ単位の範囲でｐＩが異なる分析物バンドの分解能を提供し得る。いくつかの例では、ＩＥＦ分離分解能により、ｐＩが０．１ｐＨ単位未満、０．０５ｐＨ単位未満、０．０１ｐＨ単位未満、０．００５ｐＨ単位未満、０．００１ｐＨ単位未満、０．０００５ｐＨ単位未満または０．０００１ｐＨ単位未満異なる分析物バンドの分解能が可能になり得る。
【0068】
いくつかの例では、ピーク容量は約１０～約２０，０００の範囲であり得る。いくつかの例では、ピーク容量は、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも３，０００、少なくとも４，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１５，０００または少なくとも２０，０００であり得る。いくつかの例では、ピーク容量は、最大２０，０００、最大１５，０００、最大１０，０００、最大５，０００、最大４，０００、最大３，０００、最大２，０００、最大１，０００、最大９００、最大８００、最大７００、最大６００、最大５００、最大４００、最大３００、最大２００、最大１００または最大１０であり得る。本項に記載される下限値および上限値のいずれかを組み合わせて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、ピーク容量は約４００～約２，０００の範囲であり得る。当業者であれば、ピーク容量が、この範囲内の任意の値、例えば、約２８５を有し得ることを認識するであろう。
【0069】
いくつかの例では、分離チャネルに可動化電解質を電気泳動的に導入するように構成された開示される装置における化学的可動化の使用、等電点電気泳動中に達成される分離分解能は、可動化工程中にさらに向上することが観察された。いくつかの例では、可動化工程中の分離分解能の向上は、等電点電気泳動工程中に達成された分離分解能と比較して、約１０％～約１００％の範囲であり得る。いくつかの例では、可動化電解質を電気泳動的に導入するように構成された開示される装置に化学的可動化を使用して達成される向上は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％であり得る。いくつかの例では、可動化電解質を電気泳動的に導入するように構成された開示される装置に化学的可動化を使用して達成される向上は、最大１００％、最大９０％、最大８０％、最大７０％、最大６０％、最大５０％、最大４０％、最大３０％、最大２０％、最大１０％、最大０％であり得る。本項に記載される下限値および上限値のいずれかを組み合わせて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの例では、分離分解能の向上は約２０％～約６０％の範囲であり得る。当業者であれば、分離分解能の向上が、この範囲内の任意の値、例えば、約２３％を有し得ることを認識するであろう。
【0070】
下流の分析のための分析物の排出：いくつかの実施形態では、最終濃縮工程からの濃縮された分析物画分の実質的に全部が、連続的な流れで排出される。いくつかの実施形態では、分析物混合物の一部（例えば、目的の画分）は、分離された分析物画分の定性的、半定量的または定量的特性評価を行うように構成された分析機器、例えば、分光光度計、分光蛍光光度計、質量分析計、フローサイトメータまたは他の機器と接合するように構成された出口を介して、キャピラリまたはマイクロ流体装置から排出される。いくつかの例では、分析物混合物の他の部分（例えば、目的の画分以外の画分を含有する）は、廃棄物チャネルを介して排出されてもよい。
【0071】
いくつかの例では、１つ以上の分析物画分の排出は、圧力、電場、イオン化またはこれらの組合せを使用して行われる。
【0072】
いくつかの例では、排出は、例えば質量分析計へのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を使用して行われる。いくつかの例では、電気泳動分離用の電解質としてシース液が使用される。いくつかの例では、分析物画分を微細な噴霧に縮小するために、噴霧化ガスが提供される。いくつかの例では、誘導結合レーザイオン化（ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｌａｓｅｒ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、高速原子衝撃、ソフトレーザ脱離、大気圧化学イオン化、二次イオン質量分析、スパークイオン化、熱イオン化などのような他のイオン化方法が使用され得る。
【0073】
いくつかの例では、濃縮された画分は、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化、表面増強レーザ脱離／イオン化、イムノブロットなどによるその後の分析のために表面に堆積される。
【0074】
いくつかの例では、開示される方法（ならびに該方法を行うように構成された開示される装置およびシステム）は、濃縮された画分の排出前および排出中に電気泳動分離で分析物を視覚化することに関する。いくつかの例では、それらは濃縮工程中に分析物を視覚化することに関する。いくつかの例では、それらは濃縮ゾーンの合間にチャネル内の分析物を視覚化することに関する。いくつかの例では、上記のように、分析物の視覚化は、紫外線吸光度、可視光吸光度、蛍光、フーリエ変換赤外分光法、フーリエ変換近赤外分光法、ラマン分光法、光学分光法などのような光学検出を介して行うことができる。
【0075】
試料分析用装置
本明細書に記載されるいくつかの例は、１つ以上の濃縮ゾーンと、濃縮された分析物画分を排出するためのオリフィスとを含むという点で、分析物混合物の分析を可能にすることができる装置に関する。いくつかの例では、これらの装置は、特定の波長の光に対して透過性でない少なくとも１つの層と、その特定の波長に対して透過性である少なくとも１つの層とを含む。光に対して透過性でない層の１つ以上の部分は、１つ以上の濃縮ゾーンを画定することができ、その結果、濃縮ゾーンは光学スリットとして機能する。
本明細書に記載されるいくつかの例は、１つ以上の濃縮ゾーンと、濃縮された分析物画分を排出するためのオリフィスとを含むという点で、分析物混合物の分析を可能にすることができる装置に関する。いくつかの例では、これらの装置は、特定の波長の光に対して透過性でない少なくとも１つの層と、その特定の波長に対して透過性である少なくとも１つの層とを含む。光に対して透過性でない層の１つ以上の部分は、１つ以上の濃縮ゾーンを画定することができ、その結果、濃縮ゾーンは光学スリットとして機能する。
【0076】
いくつかの例では、分析物混合物は、オートサンプラに装置を接続するチューブまたはキャピラリを介して装置にロードされ得る。いくつかの実施形態では、分析物混合物は、装置上のリザーバに直接ロードされ得る。
【0077】
いくつかの例では、試料の少なくとも一部を装置から排出することができるオリフィスは、皿穴である、および／または空気流から遮蔽されている。いくつかの例では、このオリフィスは導電性でない。本明細書で使用される場合、皿穴とは、凹部の側面または面取りの形状に関係なく、基板の一部が、オリフィスを含む凹部を画定することを意味すると理解されるべきである。同様に述べると、皿穴とは、座ぐり、円錐形および／または円錐台状の皿穴、半球形の穴などを含むと理解されるべきである。
【0078】
本明細書に記載されるいくつかの例は、不透明な材料（例えば、紫外線に対して不透明であるソーダ石灰ガラス）から構成された基板を含むマイクロ流体装置などの機器に関する。基板は、マイクロ流体分離チャネルを画定することができる。同様に述べると、マイクロ流体分離チャネルは、エッチングされるか、そうでなければ基板内に形成され得る。マイクロ流体分離チャネルは、基板の厚さに等しい深さを有することができる。同様に述べると、マイクロ流体分離チャネルは、基板の全深さ（例えば、最上部から最下部まで）にエッチングされ得る。このように、マイクロ流体分離チャネルは、基板を通る光学スリットを画定することができる。基板の最上面に透明層（例えば、最上層）を配置し、例えば、基板の最上面を封止することができる。マイクロ流体分離チャネルの最上部および最下部の両方が封止されるように、基板の底面に透明層（例えば、最下層）を配置することもできる。いくつかの例では、最上層および／または最下層の一部のみが透明であってよい。例えば、最上層および／または最下層は、他の点では不透明な材料で透明窓を画定することができる。窓は、例えば、マイクロ流体分離チャネルへの光学アクセスを提供することができる。
【0079】
本明細書に記載されるいくつかの例は、基板を含むマイクロ流体装置などの機器に関する。基板は、１つ以上の濃縮ゾーンまたはチャネルを画定することができる。例えば、基板は、分析物に結合するように構成された媒体を含む第１の濃縮ゾーンを画定することができる。このような第１の濃縮ゾーンは、分析物混合物をクロマトグラフィにより分離するのに好適であり得る。機器は、第２の濃縮ゾーンの両端部に電気的に結合された２つの電極をさらに含むことができる。そのような第２の濃縮ゾーンは、分析物混合物を電気泳動的に分離するのに好適であり得る。分析物の画分が第１の濃縮ゾーンで分離、濃縮（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）および／または濃縮（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）された後、第２の濃縮ゾーンでさらに分離、濃縮（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）および／または濃縮（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）され得るように、第２の濃縮ゾーンは第１の濃縮ゾーンと交差することができる。装置はまた、凹んだオリフィスを含むことができる。オリフィスは、第２の濃縮チャネルの出口とすることができ、基板の皿穴、または他の方法で凹んだ表面に配置することができる。機器は、ＥＳＩを介してオリフィスから分析物混合物の一部を排出するように構成することができる。凹部は、ＥＳＩに関連するテイラーコーンの形成のための安定した環境を提供することができ、および／または質量分析計の入口ポートを受容するように構成することができる。
【0080】
図１は、一実施形態による、自動ロード試料の二次元分離およびＥＳＩのための装置の概略図である。マイクロ流体網１００は、基板１０２によって画定される。基板は、行われる濃縮工程に適合した材料から製造される。例えば、化学的適合性、ｐＨ安定性、温度、光の様々な波長での透明度、機械的強度などが、材料の選択に関連して考慮される。
【0081】
基板１０２は、ガラス、石英、溶融シリカ、プラスチック、ポリカーボネート、ポリフルオロテトラエチレン（ＰＦＴＥ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、シリコン、ポリフッ素化ポリエチレン、ポリメタクリレート、環状オレフィンコポリマー、環状オレフィンポリマー、ポリエーテルエーテルケトンおよび／または任意の他の好適な材料から製造され得る。平面基板および／または任意の他の好適な材料の異なる層に対して異なる特性が望まれる場合、材料の混合物を利用することができる。平面基板の異なる層に対して異なる特性が望まれる場合、材料の混合物を利用することができる。
【0082】
チャネル１０６、１１０、１１４、１１６、１１８、１２４、１２２、１２６、１３２、１３６および１４０は、マイクロ流体網１００を形成し、基板１０２に加工される。同様に述べると、基板１０２は、チャネル１０６、１１０、１１４、１１６、１１８、１２４、１２２、１２６、１３２、１３６および／または１４０を画定する。
【0083】
チャネルは、例えば、フォトリソグラフィ・エッチング、成形、機械加工、積層（３Ｄ）印刷などの任意のチャネル製造方法によって基板に加工されてもよい。
【0084】
チューブ／導管１１２を通して分析物混合物および外部試薬をロードすることができ、チューブ／導管１３０を通して過剰な試薬／廃棄物を除去することができる。
【0085】
チューブ１１２および１３０は、例えば、溶融シリカ、溶融シリカキャピラリチューブ、シリコーン管および／またはＰＦＴＥ管を含め、行われるアッセイに適合する任意の材料から製造することができる。
【0086】
チャネル１１６および１２４を使用して、分析物および／または分析物の一部（例えば、画分）を分離および／または濃縮することができる。チャネル１１６および／または１２４を使用して、クロマトグラフィ分離（例えば、逆相、免疫沈降、イオン交換、サイズ排除、リガンド親和性、色素親和性、疎水性相互作用クロマトグラフィ、親水性相互作用クロマトグラフィ、ｐＨ勾配イオン交換、親和性、キャピラリ動電クロマトグラフィ、ミセル動電クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、アミノ酸分析ＨＰＬＣ、超高性能液体クロマトグラフィ、ペプチドマッピングＨＰＬＣ、フィールドフローフラクショネーション－多角度光散乱）または電気泳動分離（例えば、等電点電気泳動、キャピラリゲル電気泳動、キャピラリゾーン電気泳動、等速電気泳動、キャピラリ動電クロマトグラフィ、ミセル動電クロマトグラフィ、フローカウンタバランスキャピラリ電気泳動、電場勾配フォーカシング、動的場勾配フォーカシング）を行うことができる。例えば、チャネル１１６は、第１の濃縮工程を行うための材料により誘導体化するか、その材料を充填することができる。
【0087】
チャネル１１６および／または１２４に配置される材料は、例えば、疎水性（逆相）、免疫親和性（免疫沈降）、親和性（効力）、サイズ（サイズ排除クロマトグラフィ）、電荷（イオン交換）に基づいて、または他の形態の液体クロマトグラフィにより、分析物を捕捉するように選択することができる。
【0088】
多くの異なる方法を使用して、チャネル１１６および／または１２４内に濃縮材料を配置することができる。例えば、共有結合または吸着分子により壁を直接誘導体化することができるか、ビーズ、ガラス粒子、ゾルゲルなどを誘導体化し、これらのチャネルにロードすることができる。
【0089】
チャネル１１６に試料をロードした後、チューブ１１２およびチャネル１１４を通して洗浄溶液および溶出試薬を導入することができる。
【0090】
溶出プロセスは、チャネル１１６内で行われる濃縮方法に応じて決まる。結合した分析物の画分を溶出するために好適な溶出液を選択することができる。一部の濃縮オプションは、溶出工程を必要としないものもある（例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、電気泳動分離など）。
【0091】
次いで、溶出液またはフロースルーは、チャネル１１８を通ってチャネル１２４に流れる。チャネル１２４は、クロマトグラフィ濃縮工程または電気泳動濃縮工程のいずれかを行うために使用され得る。
【0092】
電気泳動分離は、リザーバ１０８とリザーバ１２０との間に電場を印加するために電源を使用することによって、チャネル１２４内で行うことができる。同様に述べると、装置１００は、リザーバ１０８および／またはリザーバ１２０と電気的に接触する電極を含むことができる。質量分析計の電気接地に電源の電気接地を接続して、チャネル１２４から質量分析計への電場に連続性を提供することができる。
【0093】
ＩＥＦ、等速電気泳動（ＩＴＰ）、キャピラリゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリゾーン電気泳動（ＣＺＥ）など、任意のキャピラリ電気泳動（ＣＥ）電気泳動法をチャネル１２４内で行うことができる。あるいは、非電気泳動濃縮法をチャネル１２４内で行うことができる。
【0094】
ＩＥＦまたはＩＴＰの場合、圧力、化学的手段または電気的手段によって、濃縮された精製試料バンドが合流点１２６に向かって可動化される。リザーバ１０８および１３４からのシース溶液が、シースおよびカソード液として機能し得る。
【0095】
シース／カソード液は、電気泳動分離および質量分析に適合する任意の塩基性溶液であり得る（例えば、ＭｅＯＨ／Ｎ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ）。アノード液は、任意の酸性溶液であり得る（例えば、リン酸１０ｍＭ）。
【0096】
あるいは、電場を反転させて、カソード液（ＮａＯＨ）をリザーバ１２０にロードすることができ、アノード液をリザーバ１０８および１３４内でシース溶液として使用することができる。
【0097】
合流点１２６は、濃縮された分析物画分がシース溶液と混合する場所である。チャネル１２４内の分析物画分が可動化されると、溶液が合流点１２６を通ってオリフィス１２８に押し出される。
【0098】
化学的可動化の場合、シース液は、ＩＥＦ ｐＨ勾配を乱し、それによって試料バンドを可動化することができる酸性または塩基性の可動化剤（例えば、アンモニア、酢酸、ギ酸など）を提供することができる。この可動化剤溶液をリザーバ１０８にロードすることにより、可動化剤がチャネル１２４内に電気泳動的に追い込まれる。リザーバ１０８に圧力を印加することにより、可動化剤溶液は、合流点１２６を通って流れ、オリフィス１２８から出ることができる。可動化された試料バンドは、チャネル１２４から電気泳動的に移動し、次いで、合流点１２６内の可動化剤溶液の圧力駆動流に入る。
【0099】
オリフィス１２８は、基板１０２の表面１２７によって画定される凹部内に配置することができる。例えば、表面１２７は皿穴ＥＳＩ表面であり得る。例えば、図１に示すように、ウェル１０８を通して電気的に接地されている濃縮された分析物溶液は、表面１２７によって画定された凹部内に完全に配置されるオリフィス１２８から発散するテイラーコーンを形成することができる。オリフィス１２８および／または表面１２７は、ウェル１０８に対して電位差を有することができる質量分析計入口に向けることができる。スプレーがコーン構造から質量分析計に向かって切り離されると、スプレーは、基板１０２から離れる前に、チャネル１０６および１４０を通して提供される噴霧化ガスによって側面を打たれ得る。噴霧化ガスは、任意の不活性ガスまたは非反応性ガス（例えば、アルゴン、窒素など）であり得る。
【0100】
さらに、シース液および／または噴霧化ガスを使用することにより、最後の「装置上」工程としてイオン枯渇工程を使用することが可能になる。シース液は、ＥＳＩの前のＩＥＦ電荷アッセイ濃縮工程中に失われたイオン電位の補充を可能にし、噴霧化は、オフライン分析のために試料を微細ミスト状で提供する。
【0101】
表面１２７上にテイラーコーンを生成することによって、コーンは安定したポケットまたは凹部内に生成され、乱気流から保護される。さらに、皿穴オリフィスを囲む円錐形状は、比較的広い範囲のテイラーコーン半径方向断面を収容する自然に拡大する接触表面を有し、比較的広い範囲の流量が質量分析計に向かうことを可能にする。
【0102】
オリフィス１２８は、質量分析計の入口ポートの近くに配置することができる。いくつかの例では、表面１２７は、質量分析計の入口ポートが表面１２７によって画定された凹部内に配置され得るように構成され得る。
【0103】
図２は、一実施形態による、３つの層を有する装置２１２の概略分解図である。図２Ａは、一実施形態による、装置２１２の最上層２０２を示す。図２Ｂは、一実施形態による、装置２１２の中間層２０６を示す。図２Ｃは、一実施形態による、装置２１２の最下層２１０を示す。図２Ｄは、一実施形態による、組み立てられた装置２１２を示す。３つの層２０２、２０６、２１０のそれぞれは、装置２１２が行うことを目的とするアッセイに適合する任意の材料から作製され得る。
【0104】
いくつかの実施形態では、層２０２は、光の特定の波長または波長範囲に対して透明である材料から製造される。本明細書で使用される場合、「透明」は、特定の波長または波長範囲を有する実質的な多数の光が材料を透過することを意味すると理解されるべきである。また、透明材料とは、材料の一方の側にある光の量が、他方の側にある検出器によって定量されることを可能にするように、材料が十分な透過率を有することを意味すると理解することができる。いくつかの実施形態では、目的の波長範囲は、中紫外範囲（例えば、２００ｎｍ～３００ｎｍ）を含み、例えば、ガラス、石英、溶融シリカなどの材料、およびポリカーボネート、ポリフッ素化ポリエチレン、ポリメタクリレート、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマーなどのＵＶ透過性プラスチック、ならびに他のＵＶ透過性材料を透明材料として使用することができる。いくつかの実施形態では、目的の光スペクトルは、可視スペクトル（例えば、２００～９００ｎｍ）を超えて拡大される。
【0105】
貫通孔２０４は、装置の外部から下層（例えば、層２０８）内のチャネル網への圧力および電気的インターフェースを可能にするために、層２０２に加工される。
【0106】
図２Ｂは、チャネル網２０８を含む装置２１２の内部中間層２０６を示す。チャネル網は、最上層２０２に加工された貫通孔と接合するように設計される。チャネル網２０８は、入口チューブおよび出口チューブ／導管２０９と、濃縮された分析物画分を排出するた
めのオリフィス２０５と、視認可能な濃縮ゾーン２０７とを含む。濃縮ゾーン２０７は、その深さが層２０６の全厚になるように加工される。他の実施形態では、ゾーン２０７は、層２０６の全厚よりも薄くすることができる。
めのオリフィス２０５と、視認可能な濃縮ゾーン２０７とを含む。濃縮ゾーン２０７は、その深さが層２０６の全厚になるように加工される。他の実施形態では、ゾーン２０７は、層２０６の全厚よりも薄くすることができる。
【0107】
いくつかの実施形態では、層２０６は、光の特定の波長または波長範囲に対して不透明であるおよび／または透明でない材料から製造される。本明細書で使用される場合、「不透明」は、特定の波長または波長範囲を有する実質的な多数の光が材料を透過しない（例えば、材料によって反射、吸収および／または散乱される）ことを意味すると理解されるべきである。また、透明でない材料とは、材料の一方の側にある光の量が他方の側にある検出器によって定量されることを可能にするのに材料が不十分な透過率を有し、チャネル網内のゾーンが層２０６の全厚と同じくらい深い領域を除いて、材料がこの光を効果的に遮断することを意味すると理解することができる。
【0108】
図２Ｃは、装置２１２の最下層２１０を示す。最下層２１０は、例えば、中実基板であり得る。いくつかの実施形態では、最下層２１０は、層２０２と同じ透過率を有する材料から製造することができる。
【0109】
図２Ｄは、一実施形態による、組み立てられた、最上層２０２、中間層２０６および最下層２１０を含む装置２１２を示す。入口チューブおよび出口チューブ２０９、リザーバ２０４ならびにオリフィス２０５は、装置２１０が組み立てられた後も依然として利用可能であり得る。いくつかの実施形態では、最上層２０２全体および／または最下層２１０全体が透明であり得る。他の実施形態では、最上層２０２の一部および／または最下層２１０の一部は不透明であり得、最上層２０２および／または最下層２１０の別の部分は透明である。例えば、最上層２１０および／または最下層２１０は、装置２１２が組み立てられる際に濃縮ゾーン２０７の少なくとも一部と整列する光学窓を画定することができる
。
。
【0110】
図３は、一実施形態による、マイクロ流体装置３０２を通る光路の概略図である。図３Ａは、マイクロ流体装置３０２の上面図を示す。図３Ｂは、光源３０６と検出器３０８との間に配置されたマイクロ流体装置３０２を示す。検出器３０８は、装置３０２を通過する光を測定するように配置される。図３には示されていないが、マイクロ流体装置３０２は、図１および図２に記載されているのと同様のチャネル構造を有することができるが、チャネル構造は、参照を容易にするために示されていない。いくつかの実施形態では、マイクロ流体装置３０２の最上面の一部は不透明であり、光源３０６から投射された光が検出器３０８に到達するのを完全にまたは実質的に遮る。不透明な最上面の部分は、試料特性の検出が望ましくない部分で装置を通る光の透過を実質的に防止する。例えば、いくつかの実施形態では、マイクロ流体装置３０２は、チャネル３０４が不透明層の厚さ全体を横断するため、１つ以上の（１または複数の）チャネル領域３０４上で不透明でない（例えば、いくらかの光が通過することを可能にする）。
【0111】
いくつかの実施形態では、この（１または複数の）透明チャネル領域３０４は濃縮ゾーンとすることができ、濃縮ゾーンでは、光学検出を使用して分析物を検出し、濃縮の進行を監視し、および／または（１または複数の）濃縮された分析物画分が装置から排出される際にそれらを監視することができる。いくつかの実施形態では、透明チャネル３０４を通過する光の量の変化を使用して、分析物画分がこのチャネルにある間、それらの吸光度を測定する。したがって、いくつかの実施形態では、（１または複数の）チャネル領域３０４は光学スリットを画定し、その結果、マイクロ流体装置３０２の片側に配置された光源３０６は、（１または複数の）透明チャネル領域３０４のみを通して検出器３０８を効果的に照明する。このように、検出器３０８から迷光（例えば、（１または複数の）透明チャネル領域および／または試料を通過しない光）を効果的に遮断することができ、これにより、ノイズを低減し、（１または複数の）透明チャネル領域３０４内の試料を観察する検出器３０８の能力を向上させることができる。いくつかの実施形態では、（１または複数の）透明チャネル領域３０４は、２つの濃縮ゾーンの間にあり、分析物画分が上流の濃縮ゾーンから溶出される際にそれらを検出するために使用することができる。
【0112】
図６は、本開示の一態様による分析物混合物濃縮の方法を示している。方法は、６０２では、マイクロ流体装置に分析物混合物をロードおよび／または導入することを含む。マイクロ流体装置は、図１～図３を参照して上記で説明されたマイクロ流体装置と同様であり得る。いくつかの例では、分析物混合物は、例えば、グリカン、炭水化物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、無傷のタンパク質、消化されたタンパク質、ペプチド、代謝産物、ワクチン、ウイルスおよび小分子であり得る。いくつかの例では、分析物混合物は、培養細胞の溶解物、細胞ベースの治療薬、もしくは腫瘍もしくは他の組織由来細胞などのタンパク質の混合物、生物学的製剤を含む組換えタンパク質、血液由来細胞、灌流、または任意の他の供給源由来のタンパク質混合物であってよい。分析物混合物は、装置に直接ロードされても、複数の混合物の連続分析のためにオートサンプラにロードされてもよい。
【0113】
マイクロ流体装置は、第１の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーンを含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーンは、クロマトグラフィ分離のために構成され得る。例えば、第１の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーンは、分析物混合物からの分析物に結合する、および／またはそうでなければクロマトグラフィ分離をもたらすように構成された媒体を含むことができる。６０４では、第１の濃縮を行うことができる。例えば、クロマトグラフィ分離は、第１の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーン内で行うことができる。分析物混合物がタンパク質混合物である実施形態などのいくつかの実施形態では、６０４での第１の濃縮により、タンパク質混合物を単純化することができる。６０４での第１の濃縮は、分析物の任意の識別可能な性質に基づくことができる。
【0114】
次いで、この濃縮された分析物画分は、６０６で溶出される。例えば、マイクロ流体装置に溶出液を注入して、第１の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーン内に配置された媒体から、濃縮された分析物画分を可動化することができる。いくつかの実施形態では、濃縮された分析物画分の濃縮および／または可動化をイメージングすることができる。例えば、上述のように、第１の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーンは、光学スリットを画定することができる。マイクロ流体装置に光を投射することができ、検出器が、第１の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーンを通過する光を検出することができる。試料またはその一部は、吸光度および／または蛍光イメージング技術を介して検出することができる。
【0115】
マイクロ流体装置は、第２の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーンを含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーンは、電気泳動分離のために構成され得る。６０８では、例えば、溶離液に対して第２の濃縮を行うことができる。例えば、電場および／または電位が、第２の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーンにわたって適用され得る。
【0116】
いくつかの例では、分析物混合物の画分が第１の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーンと第２の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーンとの交点に配置された際に、６０８で第２の濃縮を開始することができる。例えば、第１の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーンは監視（例えば、イメージング）され得、目的の画分が交点に到達した際に電位および／または電場が印加され得る。
【0117】
いくつかの例では、第２の濃縮は、６０８で、電荷特性（電荷アイソフォーム）に基づいて濃縮された画分を提供することができる。そのような濃縮には、例えば、ゲル等電点電気泳動、可動化による等電点電気泳動、全カラムイメージングによる等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィ、ｐＨ勾配交換クロマトグラフィ、等速電気泳動、キャピラリゾーン電気泳動、キャピラリゲル電気泳動、または例えば電荷に基づく他の濃縮技術が含まれ得る。
【0118】
６０４での第１の濃縮はクロマトグラフィ濃縮として記載されており、６０８での第２の濃縮は電気泳動濃縮として記載されているが、任意の好適な濃縮を任意の好適な順序で行うことができることを理解されたい。例えば、６０４での第１の濃縮および６０８での第２の濃縮は、ともにクロマトグラフィ濃縮であり得るか、ともに電気泳動濃縮であり得る。別の例として、６０４での第１の濃縮は電気泳動濃縮であり得、６０８での第２の濃縮はクロマトグラフィ濃縮であり得る。
【0119】
いくつかの例では、１つ以上の濃縮は、酸化などの疎水性変化に基づいて濃縮された画分を提供することができる。そのような濃縮には、例えば、逆相クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、親水性相互作用クロマトグラフィ、または例えば疎水性に基づく他の濃縮技術が含まれ得る。
【0120】
いくつかの例では、１つ以上の濃縮は、翻訳後修飾、ガラクトシル化、フコシル化、シアリル化、マンノース誘導体およびその他のグリコシル化を含むグリコフォーム、ならびにグリケーション、酸化、還元、リン酸化、スルファネーション（ｓｕｌｐｈａｎａｔｉｏｎ）、ジスルフィド結合形成、脱アミド、アシル化、ペグ化、切断、抗体薬物コンジュゲーション（ＡＤＣ）、タンパク質薬物コンジュゲーション、Ｃ末端リジンプロセシング、他の天然および非天然の翻訳後修飾、およびタンパク質の翻訳後に導入される他の化学的および構造的修飾などに基づいて濃縮された画分を提供することができる。そのような濃縮には、例えば、結合アッセイなどが含まれ得る。
【0121】
いくつかの例では、１つ以上の濃縮は、酸化などの疎水性変化に基づいて濃縮された画分を提供することができる。そのような濃縮には、例えば、逆相クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、親水性相互作用クロマトグラフィ、または疎水性に基づく他の濃縮技術が含まれ得る。
【0122】
いくつかの例では、１つ以上の濃縮は、変異、製造中のアミノ酸置換などによって引き起こされるような一次アミノ酸配列に基づいて濃縮された画分を提供することができる。そのような濃縮には、例えば、電荷アイソフォームによる分離、疎水性変化、または一次アミノ酸配列の差を区別することができる他の濃縮技術が含まれ得る。
【0123】
いくつかの例では、１つ以上の濃縮は、効力に基づいて濃縮された画分を提供することができる。そのような濃縮には、例えば、バイオアッセイ、酵素阻害アッセイ、酵素活性化アッセイ、競合アッセイ、蛍光偏光アッセイ、シンチレーション近接アッセイ、または効力に基づく他の濃縮技術などが含まれ得る。
【0124】
いくつかの例では、１つ以上の濃縮は、親和性に基づいて濃縮された画分を提供することができる。そのような濃縮には、例えば、標的に対する溶液相結合、ビーズベースの標的に対する結合、表面結合標的、免疫沈降、プロテインＡ結合、プロテインＧ結合などが含まれ得る。
【0125】
いくつかの例では、１つ以上の濃縮は、質量またはサイズに基づいて濃縮された画分を提供することができる。そのような濃縮には、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィ、ゲル浸透クロマトグラフィ、または質量に基づく他の濃縮技術が含まれ得る。
【0126】
いくつかの例では、分析物混合物は、装置から排出される前に２つを超える濃縮を経る。
【0127】
６１０では、濃縮された分析物画分を装置から排出することができる。いくつかの実施形態では、濃縮された分析物画分は、エレクトロスプレーイオン化を介して排出することができる。６０８では、分析物画分を濃縮することにより、マイクロ流体装置から排出される前に分析物画分を濃縮することができる。
【0128】
いくつかの例では、分析物画分は、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化などのイオン化技術を使用して、６１０で排出される。
【0129】
いくつかの例では、分析物画分は、動電学的な力または流体力を使用して、６１０で排出される。
【0130】
いくつかの例では、濃縮されたタンパク質画分は、６１０で、質量分析計に結合された方法で装置から排出される。
【0131】
マイクロ流体装置から排出される（例えば、生物学的またはバイオシミラー）分析物の質量は、例えば、飛行時間質量分析、四重極質量分析、イオントラップまたはオービトラップ質量分析、飛行距離質量分析、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴、共鳴質量測定およびナノメカニカル質量分析（ｎａｎｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）によって測定することができる。
【0132】
いくつかの例では、ｐＩマーカを使用して、視覚化されたＩＥＦチャネル（例えば、第１の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーンおよび／または第２の分離チャネルおよび／または濃縮ゾーン）のｐＩ範囲をマッピングする。いくつかの実施形態では、ｐＩマーカまたは両性電解質を使用して、下流の質量分析データ中のそれらの存在によって分析物のｐＩを決定することができる。
【0133】
いくつかの例では、可動化およびＥＳＩ中にＩＥＦを監視することができる。このように、質量分析データをＩＥＦのピークと相関させることができ、これにより、ピーク分解能を維持および／または改善することができる。
【0134】
いくつかの例では、分析物混合物および／またはその一部は、圧力源を使用してマイクロ流体装置内で可動化することができる。いくつかの例では、可動化は静水圧を用いて行われる。いくつかの例では、可動化は化学的可動化である。いくつかの例では、可動化は動電学的可動化である。
【0135】
図８は、本開示の一態様による、マイクロ流体装置の概略図である。マイクロ流体網８００が、基板８０２内に配置され、および／または基板８０２によって画定される。基板は、行われる濃縮工程に適合した材料から製造される。例えば、化学的適合性、ｐＨ安定性、温度、光の様々な波長での透明度、機械的強度などが、材料を選択する際に懸念され得る 基板８０２は、ガラス、石英、溶融シリカ、プラスチック、ポリカーボネート、ＰＦＴＥ、ＰＤＭＳ、シリコン、ポリフッ素化ポリエチレン、ポリメタクリレート、環状オレフィンコポリマー、環状オレフィンポリマー、ポリエーテルエーテルケトンおよび／または任意の他の好適な材料から製造され得る。平面基板の異なる層に対して異なる特性が望まれる場合、材料の混合物を利用することができる。
【0136】
チャネル８０６、８０８、８１０、８１１、８１７、８１４、８１２は、チャネル網を形成し、基板８０２に加工される（例えば、基板８０２によって画定される）。
【0137】
チャネルは、フォトリソグラフィ・エッチング、成形、機械加工、積層（３Ｄ）印刷などの任意のチャネル製造方法によって基板に加工されてもよい。
【0138】
チューブ８０４を通して分析物混合物および外部試薬をロードすることができ、チューブ８１０および８１８を通して過剰な試薬／廃棄物を除去することができる。
【0139】
チューブ８０４および８１０ ８１８は、溶融シリカ、溶融シリカキャピラリチューブ、シリコーン管、ＰＦＴＥ管などを含め、行われるアッセイに適合する任意の材料から製造することができる。
【0140】
チャネル８０６および８１４は、分離／濃縮ゾーンとして指定することができる。チャネル８０６および／または８１４のいずれかを使用して、クロマトグラフィ分離（逆相、免疫沈降、イオン交換、サイズ排除、リガンド親和性、色素親和性、疎水性相互作用、親和性、キャピラリ動電クロマトグラフィ、ミセル動電クロマトグラフィなど）または電気泳動分離（等電点電気泳動、キャピラリゲル電気泳動、キャピラリゾーン電気泳動、等速電気泳動、キャピラリ動電クロマトグラフィ、ミセル動電クロマトグラフィ、フローカウンタバランスキャピラリ電気泳動、電場勾配フォーカシング、動的場勾配フォーカシングなど）を行うことができる。例えば、チャネル８０６は、チャネル８０６内の暗色の円によって表される、第１の濃縮工程を行うための材料により誘導体化するか、その材料を充填することができる。
【0141】
チャネル８０６に配置される材料は、疎水性（逆相）、親和性（効力）、サイズ（サイズ排除クロマトグラフィ）、電荷（イオン交換）、免疫親和性（免疫沈降）、タンパク質間相互作用、ＤＮＡ－タンパク質相互作用、アプタマーに基づく捕捉、小分子に基づく捕捉に基づいて、または他の形態の液体クロマトグラフィなどにより、分析物を捕捉するように選択することができる。
【0142】
多くの異なる方法を使用して、チャネル８０６および／または８１４内に濃縮材料を配置することができる。共有結合または吸着分子により壁を直接誘導体化することができるか、ビーズ、ガラス粒子、ゾルゲルなどを誘導体化し、これらのチャネルにロードすることができるか、線状ポリマー溶液、例えば、線状ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、デキストランなど、架橋ポリマー溶液、例えば、ポリアクリルアミドなど、液体クロマトグラフィ用のマトリックス、または他の材料などの篩材料（ｓｉｅｖｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）をチャネルに充填することができる。
【0143】
行われる特定のアッセイに応じて、化学反応性溶液を加えてもよい。場合によっては、材料の誘導体化は、材料がチャネル８０６（またはチャネル８１４）にロードされた後、ロードされた材料に吸着するか共有結合する分子、または材料に反応性要素を化学的に架橋し得る分子を加えることによって行ってもよい。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、エポキシなどのような抗体結合分子によってコーティングされた材料をチャネル８０６内に配置することができる。抗体溶液を用いたその後のリンスは、抗体によってコーティングされた材料を残し、免疫親和性捕捉に関与することができる。場合によっては、抗体が材料上にコーティングされる前に遊離溶液中でその標的に結合することができるように、抗体と標的分析物または溶解物とを混合してもよい。
【0144】
濃縮材料が装置にロードされた後、チューブ８０４を介してチャネル８０６に試料がロードされる。その後、洗浄溶液および溶出試薬が、チューブ８０４を通してチャネル８０６に導入され得る。
【0145】
場合によっては、捕捉された材料に結合するように検出試薬が加えられる。リジン、システインおよび他のアミノ酸部分などのアミノ酸側鎖に対する結合によって、ポリペプチドの末端の標的タンパク質にフルオロフォア、発色団または他の検出分子などの検出部分を共有結合させることができる多数の標識試薬が利用可能である。共有結合された検出部分により、蛍光励起、発色団アッセイまたは他の間接的な手段を通じてタンパク質を検出することが可能になる。場合によっては、標的タンパク質は標識されないままであり、２２０ｎｍ、２８０ｎｍ、もしくはタンパク質が光を吸収する他の任意の波長の自然吸光度、または自然蛍光によって検出され得る。場合によっては、非共有結合の蛍光発生標識、発色性標識、蛍光標識または発色団標識、例えば、ＳＹＰＲＯ（登録商標）ルビー、クマシーブルーなどを使用してタンパク質が検出される。
【0146】
場合によっては、チャネル８１４に検出試薬を直接加えて検出を支援する。
【0147】
溶出プロセスは、チャネル８０６内で行われる濃縮方法に応じて決まる。溶出プロセスは、結合した分析物の少なくとも一部を溶出するように選択される。場合によっては、これは、熱と、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、もしくは他の界面活性剤、グリシン、尿素、または捕捉された分析物の放出を誘導する任意の他の方法との組合せによって達成することができる。一部の濃縮オプションは、直接溶出工程を必要としないものもある（例えば、サイズ排除クロマトグラフィ）。場合によっては、溶出の後に変性が続く。
【0148】
次いで、溶出液は、チャネル８０８を通って次の分離／濃縮ゾーンであるチャネル８１４に流れる。チャネル８１４は、クロマトグラフィ濃縮工程または電気泳動濃縮工程のいずれかを行うために使用され得る。
【0149】
電気泳動分離は、リザーバ８１２とリザーバ８１６との間に電場を印加するために電源を使用することによって、チャネル８１４内で行うことができる。チャネル８０６からの溶離液がチャネル８０８と８１４との交点を通過すると、電場が有効になり、分析物がチャネル８１４にロードされる。場合によっては、タンパク質分析物がＳＤＳのような負に帯電した界面活性剤によって飽和される標準的なゲル電気泳動モードのように、分析物は負に帯電される。ただし、例えば、タンパク質分析物が臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などの正に帯電した界面活性剤によって飽和される系に対応するために、チャネル８１４の極性は容易に反転させることができる。他の場合には、タンパク質分析物は、中性界面活性剤によってコーティングされてもよいか、例えば、天然ゲル電気泳動では界面活性剤を用いずコーティングされてもよい。この場合、選択された緩衝系でのタンパク質標的の予測電荷に基づいて極性が選択されて、タンパク質分析物はチャネル８１４内に移動する。
【0150】
チャネル８１４では、ＩＥＦ、ＩＴＰ、ＣＧＥ、ＣＺＥなどの任意のＣＥ電気泳動法を行うことができる。あるいは、非電気泳動濃縮法をチャネル内で行うことができる。
【0151】
全カラムイメージング、部分的なカラムのイメージングによって、および／または単一点検出によって、チャネル８１４内の分析物を視認することができる。
【0152】
場合によっては、別の分析物試料に対して装置を使用することができるように、チャネル８０６、８１４または両方の濃縮材料を除去し、新鮮な材料を補充してもよい。場合によっては、図８などのチャネル設計が、装置に対して複数回繰り返されてもよく、その結果、複数の分析物試料が並行して分析され得る。
【0153】
マイクロ流体装置の設計および製造：開示される方法、装置およびシステムのいくつかの例では、混合物からの分析物の分離、および場合により、ＥＳＩ－ＭＳまたは他の分析機器を使用したそれらのその後の分析は、１つ以上の試料調製工程（例えば、濾過工程、予備濃縮工程または抽出工程など）および／または分離工程（例えば、上述のように）をエレクトロスプレーイオン化工程と統合するように設計されたマイクロ流体装置を使用して行われてもよい。
【0154】
いくつかの例では、開示されるマイクロ流体装置は、１つ以上の試料ポートまたは試薬ポート（入口ポート、試料ウェルまたは試薬ウェルとも呼ばれる）、１つ以上の廃棄物ポート（出口ポートとも呼ばれる）、該入口ポートおよび出口ポートを互いに、もしくは中間流体チャネル（例えば、分離チャネル）と接続する１つ以上の流体チャネル、またはそれらの任意の組合せを備え得る。いくつかの実施形態では、開示されるマイクロ流体装置は、１つ以上の反応チャンバもしくは混合チャンバ、１つ以上の微細加工弁、１つ以上の微細加工ポンプ、１つ以上のベント構造、１つ以上の膜（例えば、濾過膜）、１つ以上のマイクロカラム構造（例えば、クロマトグラフィ分離媒体が充填された流体チャネルまたは改変された流体チャネル）、またはそれらの任意の組合せをさらに備え得る。
【0155】
当業者に公知の様々な流体作動機構のいずれかを使用して、装置を通る試料および試薬の流体の流れを制御してもよい。開示される方法、装置およびシステムに使用するのに適した流体作動機構の例には、限定するものではないが、１つ以上の入口ポートもしくは出口ポートに対する正圧もしくは負圧の印加、重力もしくは遠心力、動電学的な力、エレクトロウェッティング力またはそれらの任意の組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、正圧または負圧は、例えば、流体チャネルを通る試料または試薬の流れを作動させるために入口ポートおよび／または出口ポートに結合される機械的アクチュエータまたはピストンを使用することによって直接印加されてもよい。いくつかの実施形態では、機械的アクチュエータまたはピストンは、入口ポートおよび／または出口ポートを封止するために使用される可撓性膜または隔壁に対して力を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、正圧または負圧は、例えば、１つ以上の入口ポートおよび／または出口ポートに接続された加圧ガスラインまたは真空ラインを使用することによって間接的に印加されてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の入口ポートおよび／または出口ポートに接続されたポンプ、例えば、プログラム可能なシリンジポンプ、ＨＰＬＣポンプ、または蠕動ポンプを使用して、流体の流れを駆動してもよい。いくつかの実施形態では、動電学的な力および／またはエレクトロウェッティング力は、電場を使用して、および装置内の表面特性の制御を通じて印加されてもよい。電場は、１つ以上の入口ポートおよび／または出口ポートに挿入された電極によって、または装置内の１つ以上の流体チャネルに組み込まれた電極によって印加されてもよい。電極は、装置内の電圧および／または電流を制御するために、１つ以上のＤＣ電源またはＡＣ電源と接続されてもよい。
【0156】
一般に、装置の本体を含め、開示されるマイクロ流体装置の入口ポート、出口ポート、流体チャネルまたは他の構成要素は、限定するものではないが、ガラス、溶融シリカ、シリコン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）もしくは環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）または他のエラストマー材料を含む様々な材料のいずれかを使用して製造され得る。好適な製造技術は、一般に、材料の選択に応じて決まり、逆もまた同様である。例には、限定するものではないが、ＣＮＣ機械加工、フォトリソグラフィおよび化学エッチング、レーザフォトアブレーション、射出成形、熱エンボス加工、ダイカット、３Ｄ印刷などが挙げられる。いくつかの実施形態では、マイクロ流体装置は、例えば、流体チャネルを備えるフルイディクス層が上層および／または下層の間に挟まれてチャネルを封止する層状構造を備えてもよい。上層および／または下層は、フルイディクス層の流体チャネルと整列して、入口ポートおよび／または出口ポートなどを作成する開口部を備えてもよい。２つ以上の装置層を一緒に締結して、分解され得るか、恒久的に結合され得る装置を形成してもよい。好適な結合技術は、一般に、層を製造するために使用される材料の選択に応じて決まる。例には、限定するものではないが、陽極接合、熱接合、レーザ溶接、またはＵＶ硬化性接着剤の使用が挙げられる。
【0157】
いくつかの実施形態では、マイクロ流体装置内の入口ポート、出口ポートまたは流体チャネルの全部または一部は、入口ポート、出口ポートまたは流体チャネル壁の電気浸透流特性（例えば、ＨＰＣまたはＰＶＡコーティング）および／または疎水性／親水性特性（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティング）を改変するために使用される表面コーティングを含み得る。
【0158】
開示される装置の入口ポートおよび／または出口ポートは、様々な形状およびサイズで製造することができる。適切な入口ポートおよび／または出口ポートの形状には、限定するものではないが、円筒形、楕円形、立方体、円錐形、半球形、長方形もしくは多面体（例えば、いくつかの平面、例えば、長方形直方体、六角柱、八角柱、逆三角錐、逆四角錐、逆五角錐、逆六角錐または逆切頭角錐から構成される三次元形状）またはそれらの任意の組合せが含まれる。
【0159】
入口ポートおよび／または出口ポートの寸法は、平均直径および深さに関して特徴付けられ得る。本明細書で使用される場合、入口ポートまたは出口ポートの平均直径とは、入口ポートおよび／または出口ポートの形状の平面断面内に内接し得る最大の円を指す。本開示のいくつかの実施形態では、入口ポートおよび／または出口ポートの平均直径は、約０．５ｍｍ～約１０ｍｍの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、入口ポートおよび／または出口ポートの平均直径は、少なくとも０．５ｍｍ、少なくとも１ｍｍ、少なくとも２ｍｍ、少なくとも４ｍｍ、少なくとも８ｍｍまたは少なくとも１０ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、平均直径は、最大１０ｍｍ、最大８ｍｍ、最大６ｍｍ、最大４ｍｍ、最大２ｍｍ、最大１ｍｍまたは最大０．５ｍｍであり得る。本項に記載される下限値および上限値のいずれかを組み合わせて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの実施形態では、平均直径は約２ｍｍ～約８ｍｍの範囲であり得る。当業者であれば、入口ポートおよび／または出口ポートの平均直径が、この範囲内の任意の値、例えば、約５．５ｍｍを有することを認識するであろう。
【0160】
いくつかの実施形態では、入口ポートおよび／または出口ポート（例えば、試料ウェルまたは試薬ウェル）の深さは、約５μｍ～約５００μｍの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、深さは、少なくとも５μｍ、少なくとも１０μｍ、少なくとも２５μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも７５μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍまたは少なくとも５００μｍであり得る。いくつかの実施形態では、深さは、最大５００μｍ、最大４００μｍ、最大３００μｍ、最大２００μｍ、最大１００μｍ、最大５０μｍ、最大２５μｍ、最大１０μｍまたは最大５μｍであり得る。本項に記載される下限値および上限値のいずれかを組み合わせて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの実施形態では、入口ポートおよび／または出口ポートの深さは約５０μｍ～約２００μｍの範囲であり得る。当業者であれば、深さが、この範囲内の任意の値、例えば、約１３０μｍを有し得ることを認識するであろう。
【0161】
いくつかの実施形態では、開示される装置の流体チャネルは、正方形、長方形、円形などの様々な断面形状のいずれかを有し得る。一般に、流体チャネルの断面形状は、流体チャネルを作成するために使用される製造技術に応じて決まり、逆もまた同様である。いくつかの実施形態では、流体チャネルの断面寸法（例えば、非長方形断面の流体チャネルの高さ、幅または平均直径。ここで、平均直径とは、流体チャネルの断面形状内に内接し得る最大の円の直径として定義される）は、約５μｍ～約５００μｍの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、流体チャネルの寸法は、少なくとも５μｍ、少なくとも１０μｍ、少なくとも２５μｍ、少なくとも５０μｍ、少なくとも７５μｍ、少なくとも１００μｍ、少なくとも２００μｍ、少なくとも３００μｍ、少なくとも４００μｍまたは少なくとも５００μｍであり得る。いくつかの実施形態では、流体チャネルの寸法は、最大５００μｍ、最大４００μｍ、最大３００μｍ、最大２００μｍ、最大１００μｍ、最大５０μｍ、最大２５μｍ、最大１０μｍまたは最大５μｍであり得る。本項に記載される下限値および上限値のいずれかを組み合わせて、本開示内に含まれる範囲を形成してもよく、例えば、いくつかの実施形態では、流体チャネルの寸法は約７５μｍ～約３００μｍの範囲であり得る。当業者であれば、寸法が、この範囲内の任意の値、例えば、約９５μｍを有し得ることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、流体チャネルの深さは、装置の入口ポートおよび／または出口ポートの深さと等しくてもよい。
【0162】
開示される装置のいくつかの例では、可動化チャネルと分離チャネルとの間の交点は、約１０度～約９０度の範囲の角度を含み得る。いくつかの例では、可動化チャネルと分離チャネルとの間の角度は、少なくとも１０度、少なくとも２０度、少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度または少なくとも９０度であり得る。
【0163】
試料分析のためのシステム
本開示の試料分析システムは、（ｉ）開示される装置に試料を注入するための１つ以上のオートローダもしくは他の流体操作機器、（ｉｉ）分析物の分離を行うための開示される装置のうちの１つ以上、（ｉｉｉ）１つ以上の流体ポンプ（またはフルイディクスコントローラ）、（ｉｖ）１つ以上の高電圧電源（または電場／電流コントローラ）、（ｖ）１つ以上のイメージングシステム（または「モジュール」、「ユニット」など）、（ｖｉ）１つ以上の質量分析計もしくは他の分析機器、および（ｖｉｉ）１つ以上のプロセッサ、コントローラもしくはコンピュータ、またはそれらの任意の組合せを備え得る。いくつかの例では、１つ以上のプロセッサ、コントローラまたはコンピュータは、試料のロードプロセスを自動化し、印加された圧力および／または電場により装置内の流体の流速を制御し（分離および／または可動化反応を行うことを含む）、画像取得プロセスを制御し、半自動化または完全自動化された画像処理を行い、マイクロ流体装置の動作と質量分析計または他の下流の分析機器との間の同期を制御し、質量分析計または他の下流の分析機器によるデータ取得、ならびに日付処理、保管および表示、またはそれらの任意の組合せを制御するためのコード化された命令を含むソフトウェアを実行するように構成されてもよい。
本開示の試料分析システムは、（ｉ）開示される装置に試料を注入するための１つ以上のオートローダもしくは他の流体操作機器、（ｉｉ）分析物の分離を行うための開示される装置のうちの１つ以上、（ｉｉｉ）１つ以上の流体ポンプ（またはフルイディクスコントローラ）、（ｉｖ）１つ以上の高電圧電源（または電場／電流コントローラ）、（ｖ）１つ以上のイメージングシステム（または「モジュール」、「ユニット」など）、（ｖｉ）１つ以上の質量分析計もしくは他の分析機器、および（ｖｉｉ）１つ以上のプロセッサ、コントローラもしくはコンピュータ、またはそれらの任意の組合せを備え得る。いくつかの例では、１つ以上のプロセッサ、コントローラまたはコンピュータは、試料のロードプロセスを自動化し、印加された圧力および／または電場により装置内の流体の流速を制御し（分離および／または可動化反応を行うことを含む）、画像取得プロセスを制御し、半自動化または完全自動化された画像処理を行い、マイクロ流体装置の動作と質量分析計または他の下流の分析機器との間の同期を制御し、質量分析計または他の下流の分析機器によるデータ取得、ならびに日付処理、保管および表示、またはそれらの任意の組合せを制御するためのコード化された命令を含むソフトウェアを実行するように構成されてもよい。
【0164】
イメージングハードウェア：開示される方法、装置およびシステムを実装するために、様々なイメージングシステムまたはシステムコンポーネントのいずれかを利用してもよい。例には、限定するものではないが、１つ以上の光源（例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）、ダイオードレーザ、ファイバレーザ、ガスレーザ、ハロゲンランプ、アークランプなど）、コンデンサレンズ、対物レンズ、ミラー、フィルタ、ビームスプリッタ、プリズム、画像センサ（例えば、ＣＣＤ画像センサまたはカメラ、ＣＭＯＳ画像センサまたはカメラ）など、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。光源および画像センサは、利用されるイメージングモードに応じて、例えば、吸光度ベースの画像が取得され得るように、マイクロ流体装置の対辺に配置され得る。いくつかの例では、光源および画像センサは、例えば、エピ蛍光画像が取得され得るように、マイクロ流体装置の同じ側に配置され得る
。
。
【0165】
画像は、分離および／または可動化工程中に連続的に取得されてもよいし、ランダムに、または指定された時間間隔で取得されてもよい。いくつかの例では、一連の１つ以上の画像が連続的に、またはランダムに、または指定された時間間隔で取得される。いくつかの例では、一連の短い露光画像（例えば、１０～２０枚の画像）が高速（例えば、ミリ秒のタイムスケール）で取得され、次いで平均化されて、改善された信号対雑音比を有する「単一画像」を提供する。いくつかの例では、「単一画像」は、１秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒ごとに、またはさらに長い時間間隔で取得される。いくつかの例では、いくつかの例では、一連の１つ以上の画像は、ビデオ画像を含み得る。
【0166】
画像処理ソフトウェア：いくつかの例では、上記のように、システムは、分析物ピークの存在を検出し、ｐＩマーカまたは分離された分析物バンドの位置を決定し、ピーク形状、またはこれらのパラメータのいずれかの経時的な変化を決定するための画像処理ソフトウェアを実行するように構成されたプロセッサ、コントローラまたはコンピュータを備え得る。開示される方法およびシステムを実装する際の画像前処理または画像処理に、当業者に公知の様々な画像処理アルゴリズムのいずれかが利用されてもよい。例には、限定するものではないが、キャニーエッジ検出法、キャニー・デリチェエッジ検出法、１次勾配エッジ検出法（例えば、ソーベル演算子）、２次微分エッジ検出法、位相適合（位相コヒーレンス）エッジ検出法、他の画像セグメンテーションアルゴリズム（例えば、強度閾値処理、強度クラスタリング法、強度ヒストグラムベースの方法など）、機能およびパターン認識アルゴリズム（例えば、任意の形状を検出するための一般化ハフ変換、円形ハフ変換など）、ならびに数学的分析アルゴリズム（例えば、フーリエ変換、高速フーリエ変換、ウェーブレット分析、自己相関など）、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【0167】
プロセッサおよびコンピュータシステム：１つ以上のプロセッサまたはコンピュータを使用して、本明細書に開示される方法を実装してもよい。１つ以上のプロセッサは、中央処理装置（ＣＰＵ）、グラフィック処理装置（ＧＰＵ）、汎用処理装置またはコンピューティングプラットフォームなどのハードウェアプロセッサを備え得る。１つ以上のプロセッサは、様々な好適な集積回路（例えば、ディープラーニングネットワークアーキテクチャを実装するために特別に設計された特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、計算時間などを加速するため、および／または配備を容易にするためのフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ））、マイクロプロセッサ、新興の次世代マイクロプロセッサ設計（例えば、メモリスタベースのプロセッサ）、論理デバイスなどのいずれかから構成され得る。本開示はプロセッサを参照して説明されているが、他のタイプの集積回路および論理デバイスも適用可能であり得る。プロセッサは、任意の好適なデータ運用能力を有し得る。例えば、プロセッサは、５１２ビット、２５６ビット、１２８ビット、６４ビット、３２ビットまたは１６ビットのデータ運用を実行し得る。１つ以上のプロセッサは、シングルコアプロセッサもしくはマルチコアプロセッサ、または並列処理用に構成された複数のプロセッサであり得る。
【0168】
用途
開示される方法、装置およびシステムは、限定するものではないが、プロテオミクス研究、細胞研究、創薬および臨床診断を含む様々な分野で潜在的な用途を有する。例えば、開示される方法を使用して分析物試料の分離ベースのＥＳＩ－ＭＳ分析のために達成され得る改善された再現性および定量は、開発および／または製造中の生物学的製剤およびバイオシミラー製剤の特性評価のために非常に有益であり得る。
開示される方法、装置およびシステムは、限定するものではないが、プロテオミクス研究、細胞研究、創薬および臨床診断を含む様々な分野で潜在的な用途を有する。例えば、開示される方法を使用して分析物試料の分離ベースのＥＳＩ－ＭＳ分析のために達成され得る改善された再現性および定量は、開発および／または製造中の生物学的製剤およびバイオシミラー製剤の特性評価のために非常に有益であり得る。
【0169】
生物学的製剤およびバイオシミラー製剤は、例えば、組換えタンパク質、抗体、生ウイルスワクチン、ヒト血漿由来タンパク質、細胞ベースの医薬品、天然由来タンパク質、抗体薬物複合体、タンパク質薬物複合体および他のタンパク質薬を含む薬物のクラスである。ＦＤＡおよび他の規制当局は、バイオシミラリティを実証するための段階的アプローチの使用を要求しており、これには、構造、機能、動物毒性、ヒトでの薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）、臨床での免疫原性、ならびに臨床での安全性および有効性に関して、提案された製品と参照製品との比較が含まれ得る（“Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ Ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｔｏ ａ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ：Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ”，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ａｐｒｉｌ ２０１５を参照）。タンパク質製品に必要になり得る構造特性評価データの例には、一次構造（すなわち、アミノ酸配列）、二次構造（すなわち、αヘリックス構造またはβシート構造を形成するためのフォールディングの程度）、三次構造（すなわち、ポリペプチド骨格および二次構造ドメインにより生成されたタンパク質の三次元形状）および四次構造（例えば、活性タンパク質複合体を形成するのに必要なサブユニットの数、またはタンパク質の凝集状態））が挙げられる。多くの場合、この情報は、Ｘ線結晶解析法など、困難で時間および費用のかかる技術を使用しなければ利用できない可能性がある。したがって、候補生物学的薬物と参照薬物との間のバイオシミラリティを確立するために、タンパク質構造の便利で、リアルタイムで、比較的ハイスループットな特性評価を可能にする実験技術が必要である。
【0170】
いくつかの例では、開示される方法、装置およびシステムは、バイオシミラリティを確立するために、生物学的薬物候補（例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ））および参照生物学的薬物の構造比較データを提供するために使用され得る。例えば、いくつかの例では、薬物候補および参照薬物の等電点データおよび／または質量分析データは、バイオシミラリティの実証を裏付ける重要な証拠を提供し得る。いくつかの実施形態では、同一の反応条件下でともに部位特異的プロテアーゼにより処理された薬物候補および参照薬物の等電点データおよび／または質量分析データは、バイオシミラリティの実証を裏付ける重要な証拠を提供し得る。いくつかの実施形態では、開示される方法、装置およびシステムを使用して、生物学的薬物製造プロセスを監視して（例えば、リアルタイムでバイオリアクタプロセスを監視して）、製造プロセスの異なる時点で採取された試料、または異なる製造工程から採取された試料を分析することによって、製品の品質および一貫性を保証してもよい。
【0171】
［実施例］
これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
【0172】
［実施例１］－質量分析（ＭＳ）の前にチップ上のタンパク質電荷を特性評価する
この実施例では、図４に示すチャネル網は、ソーダ石灰ガラスのプレートから製造され、このソーダ石灰ガラスは、標準的なフォトリソグラフィ・エッチング技術を使用して、２８０ｎｍの光の非常に低い透過率を有する。濃縮チャネル４１８の深さは、ガラス層４０２の厚さと同じである、すなわち、濃縮チャネル４１８は、このガラスプレート４０２の最上部から最下部まで通っている。装置４００は、装置４００の片側に配置された光源によって照明され、装置４００の反対側に配置された検出器によってイメージングされ得る。基板４０２は不透明であるが、濃縮チャネル４１８は光学スリットを画定するため、基板４０２は濃縮チャネル４１８を通過しない光を遮断し、迷光を遮断し、イメージングプロセスの解像度を向上させることができる。
この実施例では、図４に示すチャネル網は、ソーダ石灰ガラスのプレートから製造され、このソーダ石灰ガラスは、標準的なフォトリソグラフィ・エッチング技術を使用して、２８０ｎｍの光の非常に低い透過率を有する。濃縮チャネル４１８の深さは、ガラス層４０２の厚さと同じである、すなわち、濃縮チャネル４１８は、このガラスプレート４０２の最上部から最下部まで通っている。装置４００は、装置４００の片側に配置された光源によって照明され、装置４００の反対側に配置された検出器によってイメージングされ得る。基板４０２は不透明であるが、濃縮チャネル４１８は光学スリットを画定するため、基板４０２は濃縮チャネル４１８を通過しない光を遮断し、迷光を遮断し、イメージングプロセスの解像度を向上させることができる。
【0173】
ガラス層４０２は、２８０ｎｍの光に対して透過性（例えば、透明）である２つの溶融シリカプレートの間に挟まれている。図２のように、最上部プレートは、機器およびユーザがチャネル網と接合するための貫通孔を含むのに対して、最下部プレートは中実である。３つのプレートを５２０℃で３０分間接着する。入口管および出口管を開裂キャピラリ（１００μｍ ＩＤ、ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ）から製造し、チャネル網に接着する。
【0174】
装置は、窒素ガス源、ヒータ、正圧ポンプ（例えば、Ｐａｒｋｅｒ、Ｔ５－１ＩＣ－０３－１ＥＥＰ）、２つの白金イリジウム電極（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、３５７３８３）で終端する電気泳動電源（Ｇａｍｍ Ｈｉｇｈ Ｖｏｌｔａｇｅ、ＭＣ３０）、ＵＶ光源（例えば、ＬＥＤ、ｑｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、ＵＶＴＯＰ２８０）、ＣＣＤカメラ（例えば、ＴｈｏｒＬａｂｓ、３４０ＵＶ－ＧＥ）、および装置に試料をロードするためのオートサンプラを含む機器に取り付けられる。電源は質量分析計と共通の接地を共有している。機器はソフトウェア（例えば、ｌａｂＶｉｅｗ）を介して制御される。
【0175】
タンパク質試料を両性電解質ｐＨ勾配およびｐＩマーカと予め混合してからバイアルに入れ、オートサンプラにロードする。それらは、オートサンプラから入口４１２を介して、濃縮チャネル４１８を通してマイクロ流体装置４００に連続的にロードされ、装置から出て、出口４３４を通して廃棄物４３０に送られる。
【0176】
シース／カソード液（５０％ＭｅＯＨ、Ｎ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ）を２つのカソード液ウェル４０４、４３６にロードし、アノード液（１０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４）をアノード液ウェル４２６にロードし、加熱された窒素ガスの供給源を２つのガスウェル４０８、４４０に取り付ける。
【0177】
すべての試薬をロードした後、アノード液ウェル４２６およびカソード液ウェル４０４、４３６に電極を接続することによりアノード液ウェル４２６からカソード液ウェル４０４、４３６に＋６００Ｖ／ｃｍの電場を印加して、等電点電気泳動を開始する。濃縮チャネル４１８の下にＵＶ光源を整列させ、濃縮チャネル４１８の上にカメラを配置して、濃縮チャネル４１８を通過する光を測定し、それにより、それらの吸光度によって集束タンパク質を検出する。ソーダ石灰ガラスから構成されるガラスプレート４０２は、カメラからの迷光を遮断するように機能するため、濃縮チャネル４１８を通過しない光がカメラに到達するのが妨げられ、測定の感度が向上する。
【0178】
集束タンパク質の画像は、ＩＥＦ中に継続的および／または定期的に取り込むことができる。集束が完了すると、入口４１２から低圧を印加し、オリフィス４２４に向かってｐＨ勾配を可動化する。この時点で電場を維持して、高分解能ＩＥＦ分離を維持することができる。ＥＳＩプロセス中に濃縮チャネル４１８をイメージングし続けることを使用して、各タンパク質がオリフィス４２４から排出される際にそれらのｐＩを決定することができる。
【0179】
濃縮されたタンパク質画分が濃縮チャネル４１８から合流点４２０に移動すると、それがシース流体と混合し、これにより、タンパク質画分が質量分析適合溶液に入れられ、集束されたタンパク質に対する電荷が回復され（ＩＥＦはタンパク質を非荷電状態にする）、イオン化が改善される。
【0180】
次いで、濃縮されたタンパク質画分は、ガラスプレート４０２の皿面４２２によって画定され得るオリフィス４２４に向かって進み続ける。濃縮されたタンパク質画分は、シース流体ウェル接地と質量分析計負極との間の電場に捕捉された後、テイラーコーンを生成することができる。
【0181】
溶液が濃縮チャネル４１８からテイラーコーンを押し続けると、流体の小滴がテイラーコーンから排出され、質量分析計入口に向かって飛翔する。窒素ガス（例えば、１５０℃）が、ガスウェル４０８、４４０から流れ、ガスチャネル４１０、４３２を下って、テイラーコーンの側面を打つ窒素ガスジェットを形成し、これにより、マイクロ流体装置を離れる前に、テイラーコーンから発散する液滴を微細ミストに変換することができ、質量分析計内での検出を支援することができる。入口４１２からの圧力を調整することにより、必要に応じてテイラーコーンのサイズを調整して、質量分析計内での検出を改善することができる。
【0182】
［実施例２］－逆相－＞ＩＥＦ－＞ＭＳ
実施例２は、実施例１と同様であり得るが、図１を参照して説明される。チャネル１１６は、Ｃ１８により誘導体化されたゾルゲルがロードされた第１の濃縮ゾーンであり得る。タンパク質をロードした後、一定体積の溶出液（ＩＥＦ両性電解質および標準物質を含むＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）をチャネル１１６にロードして、ゾルゲルに捕捉された最も疎水性の低いタンパク質を溶出することができる。溶離液はチャネル１２４に向けられ、チャネル１２４は、ＩＥＦ、ＵＶ吸光度モニタリング、および実施例１で説明したように最終的にＥＳＩが行われる第２の濃縮ゾーンであり得る。第１の溶離液のＥＳＩが完了すると、一定体積のさらに高いＭｅＣＮ濃度を使用して、次に低い疎水性タンパク質画分を溶出する。
実施例２は、実施例１と同様であり得るが、図１を参照して説明される。チャネル１１６は、Ｃ１８により誘導体化されたゾルゲルがロードされた第１の濃縮ゾーンであり得る。タンパク質をロードした後、一定体積の溶出液（ＩＥＦ両性電解質および標準物質を含むＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）をチャネル１１６にロードして、ゾルゲルに捕捉された最も疎水性の低いタンパク質を溶出することができる。溶離液はチャネル１２４に向けられ、チャネル１２４は、ＩＥＦ、ＵＶ吸光度モニタリング、および実施例１で説明したように最終的にＥＳＩが行われる第２の濃縮ゾーンであり得る。第１の溶離液のＥＳＩが完了すると、一定体積のさらに高いＭｅＣＮ濃度を使用して、次に低い疎水性タンパク質画分を溶出する。
【0183】
［実施例３］－効力－＞ＩＥＦ－＞ＭＳ
実施例３は、実施例２と同様であり得るが、生物学的薬物標的誘導体化ビーズがチャネル１１６にロードされ、タンパク質を捕捉するために使用され得る。溶液相標的（競合）、塩、ｐＨなどによる溶出によって、反応の親和性を特性評価する。
実施例３は、実施例２と同様であり得るが、生物学的薬物標的誘導体化ビーズがチャネル１１６にロードされ、タンパク質を捕捉するために使用され得る。溶液相標的（競合）、塩、ｐＨなどによる溶出によって、反応の親和性を特性評価する。
【0184】
［実施例４］－逆相－＞キャピラリゾーン電気泳動－＞ＭＳ
実施例４は実施例２と同様であり得るが、図５を参照して説明される。タンパク質混合物が、入口５２１を通してロードされ、逆相クロマトグラフィ用にＣ１８により誘導体化されたビーズを含み得る濃縮ゾーン５１０まで通過し得る。ロード中、流体はゾーン５１０を通過し、視認領域５１１を通過し、出口５２２から出て廃棄される。視認領域５１０は、２８０ｎｍのＵＶ光に対して不透明であるソーダ石灰ガラスから作製された内部層を横断し、最上層および最下層は、２８０ｎｍの光に対して透明である溶融シリカから作製される。
実施例４は実施例２と同様であり得るが、図５を参照して説明される。タンパク質混合物が、入口５２１を通してロードされ、逆相クロマトグラフィ用にＣ１８により誘導体化されたビーズを含み得る濃縮ゾーン５１０まで通過し得る。ロード中、流体はゾーン５１０を通過し、視認領域５１１を通過し、出口５２２から出て廃棄される。視認領域５１０は、２８０ｎｍのＵＶ光に対して不透明であるソーダ石灰ガラスから作製された内部層を横断し、最上層および最下層は、２８０ｎｍの光に対して透明である溶融シリカから作製される。
【0185】
２８０ｎｍの光源が視認領域５１１の下に配置され、ＣＣＤ検出器が視認領域５１１の上に配置される。
【0186】
２０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの溶液が、入口５２１および濃縮ゾーン５１０を通してロードされる。この溶液は、混合物中の最も疎水性の低いタンパク質が濃縮された画分を溶出する。濃縮ゾーン５１０から出口５２２に移動する際の濃縮されたタンパク質画分の２８０ｎｍでの吸光度について、視認領域５１１が監視される。画分が濃縮ゾーン５１０と濃縮ゾーン５１５との交点に配置されると、電源がオンになり、リザーバ５１４の正極とリザーバ５０４の接地との間に電場が生成される。この極性は、電源の極性を切り替えることにより容易に反転させることができる。電場が存在すると、濃縮されたタンパク質画分は、キャピラリゾーン電気泳動によってタンパク質を分離する濃縮ゾーン５１５に移動する。分離されたタンパク質は、合流点５１６でシース、電解液と混合し、表面５１８にテイラーコーンを形成する。噴霧化窒素ガスラインが、ポート５０８および５２８で装置に接続され、チャネル５１２および５３０を通って移動し、エレクトロスプレーからの材料がオリフィス５２０を介して装置から出る際に、それらの側面を打つ。
【0187】
あるいは、流体動圧を使用して、濃縮されたタンパク質画分を濃縮ゾーン５１５にロードすることができる。
【0188】
［実施例５］－免疫沈降－＞タンパク質溶解物のキャピラリゲル電気泳動
この実施例では、図８のレイアウトによって表されるマイクロ流体チャネル層が、環状オレフィンコポリマーから製造されている。同様に述べると、マイクロ流体装置８００の基板８０２は、チャネル網を画定する。多くの用途では、例えば、蛍光検出が使用される場合、マイクロ流体装置８００は、材料が分析物を検出するのに必要な光の波長範囲を透過させることを条件に、単一の材料を使用して製造され得る。
この実施例では、図８のレイアウトによって表されるマイクロ流体チャネル層が、環状オレフィンコポリマーから製造されている。同様に述べると、マイクロ流体装置８００の基板８０２は、チャネル網を画定する。多くの用途では、例えば、蛍光検出が使用される場合、マイクロ流体装置８００は、材料が分析物を検出するのに必要な光の波長範囲を透過させることを条件に、単一の材料を使用して製造され得る。
【0189】
プロテインＡコーティングされたビーズがチャネル８０６にロードされる。これらのビーズは、プロテインＡビーズに結合する、目的の標的に対して生じた抗体の溶液によりリンスされる。次いで、分析物の検出を妨げる抗体の脱落を減少させるために、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）などの市販の架橋試薬を使用して、この抗体をビーズに対する抗体に共有結合的に架橋する。免疫沈降ビーズを調製し、チャネル８０６にロードした後、チューブ８０４を介して溶解物分析物試料をロードすることができる。分析物が固定化抗体によって捕捉されるのに十分な時間を与えた後、未結合タンパク質を洗浄し、チューブ８２２を介して廃棄物に排出する。
【0190】
次に、タンパク質が抗体ビーズから溶出し、これを分析することができる。溶出は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の溶液をロードし、５０℃で１０分間加熱することによって達成される。溶出した分析物は、放出されると、チャネル８０８を通ってチャネル８０８と８１４との交点に向かって流れる。分析物プラグがチャネル８０８と８１４との交点に達すると、リザーバ８１２の負極とリザーバ８１６の正極との間で電場がオンになり、負に帯電したタンパク質が、蛍光発生タンパク質色素ＳＹＰＲＯ（登録商標）ルビーがロードされたチャネル８１４内のデキストラン線状ポリマー溶液を通って移動する。
【0191】
蛍光標識された標的タンパク質は、全カラムイメージングを使用してＣＧＥ中にチャネル８１４で視覚化することができる。同様に述べると、ＳＹＰＲＯ（登録商標）ルビー色素が２８０ｎｍの光により励起され、６１８ｎｍの放出光が検出器により測定されている間に、チャネル８１４全体をイメージングすることができる。
【0192】
［実施例６］－質量分析計インターフェースを用いないマイクロ流体設計の変形例
場合によっては、質量分析計インターフェースの有無によって異なる２つの設計のマイクロ流体層を有することが有利であろう。分析物を特性評価した後、質量分析データがなくても確認特性評価を行うことができる。ほぼ同じマイクロ流体設計で確認特性評価を行うことにより、異常が同定された場合、質量同定のための質量分析計インターフェースを有するチップにアッセイを戻すことは簡単であろう。これにより、確認データの異常が、質量分析データに対して分析されていることを示すために必要な作業を省略することができる。
場合によっては、質量分析計インターフェースの有無によって異なる２つの設計のマイクロ流体層を有することが有利であろう。分析物を特性評価した後、質量分析データがなくても確認特性評価を行うことができる。ほぼ同じマイクロ流体設計で確認特性評価を行うことにより、異常が同定された場合、質量同定のための質量分析計インターフェースを有するチップにアッセイを戻すことは簡単であろう。これにより、確認データの異常が、質量分析データに対して分析されていることを示すために必要な作業を省略することができる。
【0193】
一例として、図９は、オリフィス４２４および皿面４２２を有しない、図４に示されるマイクロ流体装置４００と同様のマイクロ流体設計を示す。分析物は、依然として入口９０４およびチャネル９０６を通して濃縮チャネル９０８までチップに導入されるが、分析後、試料は、オリフィスでエレクトロスプレーイオン化を行うのではなく、出口チャネル９１０を通してフラッシングされる。この設計は、一般的な操作のために実行することができ、次いで、質量同定が必要とされる時に、図４に示されるマイクロ流体装置４００上で同じ濃縮を行うことができ、これにより、図８のマイクロ流体装置９００上に見られる分析物変異体の同定を確実にする。
【0194】
［実施例７］－化学的可動化を使用して質量分析（ＭＳ）の前にチップ上のタンパク質電荷を特性評価する
この実施例では、図４に示すチャネル網は、ソーダ石灰ガラスのプレートから製造され、このソーダ石灰ガラスは、標準的なフォトリソグラフィ・エッチング技術を使用して、２８０ｎｍの光の非常に低い透過率を有する。濃縮チャネル４１８の深さは、ガラス層４０２の厚さと同じである、すなわち、濃縮チャネル４１８は、このガラスプレート４０２の最上部から最下部まで通っている。装置４００は、装置４００の片側に配置された光源によって照明され、装置４００の反対側に配置された検出器によってイメージングされ得る。基板４０２は不透明であるが、濃縮チャネル４１８は光学スリットを画定するため、基板４０２は濃縮チャネル４１８を通過しない光を遮断し、迷光を遮断し、イメージングプロセスの解像度を向上させることができる。
この実施例では、図４に示すチャネル網は、ソーダ石灰ガラスのプレートから製造され、このソーダ石灰ガラスは、標準的なフォトリソグラフィ・エッチング技術を使用して、２８０ｎｍの光の非常に低い透過率を有する。濃縮チャネル４１８の深さは、ガラス層４０２の厚さと同じである、すなわち、濃縮チャネル４１８は、このガラスプレート４０２の最上部から最下部まで通っている。装置４００は、装置４００の片側に配置された光源によって照明され、装置４００の反対側に配置された検出器によってイメージングされ得る。基板４０２は不透明であるが、濃縮チャネル４１８は光学スリットを画定するため、基板４０２は濃縮チャネル４１８を通過しない光を遮断し、迷光を遮断し、イメージングプロセスの解像度を向上させることができる。
【0195】
ガラス層４０２は、２８０ｎｍの光に対して透過性（例えば、透明）である２つの溶融シリカプレートの間に挟まれている。図２のように、最上部プレートは、機器およびユーザがチャネル網と接合するための貫通孔を含むのに対して、最下部プレートは中実である。３つのプレートを５２０℃で３０分間接着する。入口管および出口管を開裂キャピラリ（１００μｍ ＩＤ、ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ）から製造し、チャネル網に接着する。
【0196】
装置は、窒素ガス源、ヒータ、正圧ポンプ（例えば、Ｐａｒｋｅｒ、Ｔ５－１ＩＣ－０３－１ＥＥＰ）、２つの白金イリジウム電極（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、３５７３８３）で終端する電気泳動電源（Ｇａｍｍ Ｈｉｇｈ Ｖｏｌｔａｇｅ、ＭＣ３０）、ＵＶ光源（例えば、ＬＥＤ、ｑｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、ＵＶＴＯＰ２８０）、ＣＣＤカメラ（例えば、ＴｈｏｒＬａｂｓ、３４０ＵＶ－ＧＥ）、および装置に試料をロードするためのオートサンプラを含む機器に取り付けられる。電源は質量分析計と共通の接地を共有している。機器はソフトウェア（例えば、ｌａｂＶｉｅｗ）を介して制御される。
【0197】
タンパク質試料を両性電解質ｐＨ勾配およびｐＩマーカと予め混合してからバイアルに入れ、オートサンプラにロードする。それらは、オートサンプラから入口４１２を介して、濃縮チャネル４１８を通してマイクロ流体装置４００に連続的にロードされ、装置から出て、出口４３４を通して廃棄物４３０に送られる。
【0198】
カソード液（Ｈ２Ｏ中の１％Ｎ４ＯＨ）をカソード液ウェル４３６にロードし、アノード液（１０ｍＭ Ｈ３ＰＯ４）をアノード液ウェル４２６にロードし、可動化剤溶液（４９％ＭｅＯＨ、４９％Ｈ２Ｏ、１％酢酸）をウェル４０４に加え、加熱された窒素ガスの供給源を２つのガスウェル４０８、４４０に取り付ける。
【0199】
すべての試薬をロードした後、アノード液ウェル４２６およびカソード液ウェル４３６に電極を接続することによって、アノード液ウェル４２６からカソード液ウェル４３６に＋６００Ｖ／ｃｍの電場を印加して、等電点電気泳動を開始する。濃縮チャネル４１８の下にＵＶ光源を整列させ、濃縮チャネル４１８の上にカメラを配置して、濃縮チャネル４１８を通過する光を測定し、それにより、それらの吸光度によって集束タンパク質を検出する。ソーダ石灰ガラスから構成されるガラスプレート４０２は、カメラからの迷光を遮断するように機能するため、濃縮チャネル４１８を通過しない光がカメラに到達するのが妨げられ、測定の感度が向上する。
【0200】
集束タンパク質の画像は、ＩＥＦ中に継続的および／または定期的に取り込むことができる。集束が完了すると、カソード液ウェル４３６を接続する電極を切断し、可動化剤ウェル４０４の電極を使用して、アノード液ウェル４２６から可動化剤ウェル４０４に６００Ｖ／ｃｍの電場を印加する。さらに、ウェル４０４に圧力を印加して、４０４から４２４のオリフィスへ約１００ｎＬ／分の流量を開始する。
【0201】
可動化剤溶液中の酢酸は、電場によって濃縮チャネル４１８に引き込まれ、そこでタンパク質および両性電解質をイオン化し、ｐＨ勾配を乱す。濃縮されたタンパク質画分をイオン化すると、それらはチャネル４１８から合流点４２０に移動する。次いで、濃縮されたタンパク質画分は、合流点４２０を通して可動化剤溶液とともに流れ、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によってチップオリフィス４２４を介して排出される。ＥＳＩプロセス中に濃縮チャネル４１８をイメージングし続けることを使用して、各タンパク質がオリフィス４２４から排出される際にそれらのｐＩを決定することができる。
【0202】
濃縮されたタンパク質画分が濃縮チャネル４１８から合流点４２０に移動すると、それが可動化剤溶液と混合し、これにより、タンパク質分画が質量分析適合溶液に入れられ、タンパク質のイオン化が維持される。
【0203】
次いで、濃縮されたタンパク質画分は、ガラスプレート４０２の皿面４２２によって画定され得るオリフィス４２４に向かって進み続ける。濃縮されたタンパク質画分は、シース流体ウェル接地と質量分析計負極との間の電場に捕捉された後、テイラーコーンを生成することができる。
【0204】
溶液が濃縮チャネル４１８からテイラーコーンを押し続けると、流体の小滴がテイラーコーンから排出され、質量分析計入口に向かって飛翔する。窒素ガス（例えば、１５０℃）が、ガスウェル４０８、４４０から流れ、ガスチャネル４１０、４３２を下って、テイラーコーンの側面を打つ窒素ガスジェットを形成し、これにより、マイクロ流体装置を離れる前に、テイラーコーンから発散する液滴を微細ミストに変換することができ、質量分析計内での検出を支援することができる。入口４１２からの圧力を調整することにより、必要に応じてテイラーコーンのサイズを調整して、質量分析計内での検出を改善することができる。
【0205】
［実施例８］－市販の機器を用いて行われたＩＥＦ分離と、開示される装置を用いて行われた分離との比較
図１０は、２つの異なるＣ末端リジン変異体を含むＮＩＳＴモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を集束させるために市販の等電点電気泳動機器（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して得られた分析物分離データの例を提供する（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ ２．Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ ＮＩＳＴｍＡｂ ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，２０１５）。タンパク質分析物ピークの吸光度を測定し、分離軸に沿った（画像センサピクセル内の）ピーク位置の関数としてプロットした。ＩＥＦを使用してモノクローナル抗体アイソフォームを分離し、それぞれのｐＩに基づいて分離する。ＩＥＦ電気泳動図では、モノクローナル抗体の２つのＣ末端リジン変異体（１００６）に対応する２つの異なる塩基性アイソフォームを観察することができる。
図１０は、２つの異なるＣ末端リジン変異体を含むＮＩＳＴモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を集束させるために市販の等電点電気泳動機器（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して得られた分析物分離データの例を提供する（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ ２．Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ ＮＩＳＴｍＡｂ ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，２０１５）。タンパク質分析物ピークの吸光度を測定し、分離軸に沿った（画像センサピクセル内の）ピーク位置の関数としてプロットした。ＩＥＦを使用してモノクローナル抗体アイソフォームを分離し、それぞれのｐＩに基づいて分離する。ＩＥＦ電気泳動図では、モノクローナル抗体の２つのＣ末端リジン変異体（１００６）に対応する２つの異なる塩基性アイソフォームを観察することができる。
【0206】
図１１は、図１０に示されるデータに使用されるのと同じＮＩＳＴモノクローナル抗体の分離のための等電点電気泳動データの例を提供する。図７に示す装置（図４に示され、上述されたものと同様であるが、ウェル４０８および４４０、チャネル４１０および４３２、ならびに凹部４２２を欠き、幅２５０μｍ×深さ１００μｍの断面を有する長さ５ｃｍの分離／濃縮チャネル７１８を備える。Ｇｕａｒａｎｔコーティング（Ａｌｃｏｒ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により分離チャネルをコーティングした）で等電点電気泳動を行った。装置７００は、分離チャネル７１８の厚さを画定するガラスまたはポリマー層７０２と、チャネル７０６を介して合流点領域７２４と流体連通している可動化剤ウェル７０４と、チャネル７１４を介して分離／濃縮チャネル７１８の近位端と流体連通している入口７１２と、チャネル７２８を介して分離／濃縮チャネル７１８の近位端と流体連通しているアノード液ウェル７２６と、流体チャネル７３０を介して分離／濃縮チャネル７１８の遠位端と流体連通している出口７３４と、チャネル７３８を介して合流点領域７２４と流体連通しているカソード液ウェル７３６と、装置の動作中にテイラーコーン７２０を生成するエレクトロスプレーオリフィス７２２とを備える。等電点電気泳動と可動化剤の電気泳動的導入とを行うためのアノード、カソードおよび可動化電極の間の電場の印加は、上記のように、図４に示す装置の対応する特徴について述べた通りである。
【0207】
１．５％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ３－１０、１．５％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ８－１０．５（水中）中の２５０μｇ／ｍＬのＮＩＳＴ ｍＡｂの試料を分離チャネルにロードし（１％ギ酸をアノード液として使用、１％ジエチルアミンをカソード液として使用（いずれも水中））、３００Ｖ／ｃｍの分離電場を１分間印加し（ジュール熱を最小限に抑えるため）、続いて６００Ｖ／ｃｍの電場を６分間印加した（試料の最初の集束に続いて、分離チャネルの導電率は低下し、電場が増加されてＩＥＦ分離が加速され得る）。分離チャネルの全チャネルイメージングによりＵＶ吸光度トレースを取得した。ＮＩＳＴ ｍＡｂの２つのＣ末端リジン変異体は明確に分離されている。開示されるマイクロ流体装置および方法を使用して行われるＩＥＦ分離の再現性は、３つの異なるチップ（２８１１、２８０８および２８０５）を使用して取得されたトレースの比較によって示される。
【0208】
［実施例９］－ｐＨ勾配の線形性
図１２は、図７に示され、上述されたマイクロ流体装置で行われる分離反応の等電点電気泳動データの例を提供する。３％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ３－１０（水中）にｐＨ３．３８、４．０５、７．００、８．４０、９．９９および１０．１７のｐＩマーカを含む試料を分離チャネルにロードし（１％ギ酸をアノード液として使用、１％ジエチルアミンをカソード液として使用（いずれも水中））、３００Ｖ／ｃｍの分離電場を１分間印加した後、６００Ｖ／ｃｍの電場を６分間印加した。分離チャネルの全チャネルイメージングにより、図１２に示すＵＶ吸光度トレースを取得した。ｐＨ１０．０および１０．２マーカを含むｐＩマーカは、十分に分離されている。
図１２は、図７に示され、上述されたマイクロ流体装置で行われる分離反応の等電点電気泳動データの例を提供する。３％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ３－１０（水中）にｐＨ３．３８、４．０５、７．００、８．４０、９．９９および１０．１７のｐＩマーカを含む試料を分離チャネルにロードし（１％ギ酸をアノード液として使用、１％ジエチルアミンをカソード液として使用（いずれも水中））、３００Ｖ／ｃｍの分離電場を１分間印加した後、６００Ｖ／ｃｍの電場を６分間印加した。分離チャネルの全チャネルイメージングにより、図１２に示すＵＶ吸光度トレースを取得した。ｐＨ１０．０および１０．２マーカを含むｐＩマーカは、十分に分離されている。
【0209】
図１３は、図１２に示されるデータに関する、（画像センサピクセルに関する）ピーク位置対ｐＨのプロットを提供する。破線は、直線に対する実験データの最良の適合を示し、開示される装置および方法を使用して達成され得るｐＨ勾配の極めて高い精度を示している。
【0210】
［実施例１０］－可動化剤の電気泳動的導入および分離分解能の向上
図１４は、図７に示され、上述されたものなどのマイクロ流体装置における一連のｐＩ標準物質の等電点電気泳動のデータの例を示す。３％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ３－１０（水中）にｐＨ３．３８、４．０５、７．００、８．４０、９．９９および１０．１７（各２５０μｇ／ｍＬ）のｐＩマーカを含む試料を分離チャネルにロードし（１％ギ酸をアノード液として使用、１％ジエチルアミンをカソード液として使用、１％ギ酸、５０％イソプロピルアルコールを可動化剤として使用（いずれも水中））、３００Ｖ／ｃｍの分離電場を１分間印加した後、６００Ｖ／ｃｍの電場を６分間印加した。分離チャネルの全チャネルイメージングにより、図１４に示すＵＶ吸光度トレースを取得した。
図１４は、図７に示され、上述されたものなどのマイクロ流体装置における一連のｐＩ標準物質の等電点電気泳動のデータの例を示す。３％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ３－１０（水中）にｐＨ３．３８、４．０５、７．００、８．４０、９．９９および１０．１７（各２５０μｇ／ｍＬ）のｐＩマーカを含む試料を分離チャネルにロードし（１％ギ酸をアノード液として使用、１％ジエチルアミンをカソード液として使用、１％ギ酸、５０％イソプロピルアルコールを可動化剤として使用（いずれも水中））、３００Ｖ／ｃｍの分離電場を１分間印加した後、６００Ｖ／ｃｍの電場を６分間印加した。分離チャネルの全チャネルイメージングにより、図１４に示すＵＶ吸光度トレースを取得した。
【0211】
等電点電気泳動分離の完了後、分離電場を提供するために使用したカソードをオフにし、可動化チャネルと電気通信しているカソードをオンにして、分離チャネルへの可動化剤の電気泳動的導入による可動化を開始した。カソードとアノードとの間に電場（４００Ｖ／ｃｍ）を印加して、可動化剤の電気泳動を５分間駆動した。図１５Ａ～Ｆは、可動化場をオンにした後、１分（図１５Ａ）、２分（図１５Ｂ）、３分（図１５Ｃ）、４分（図１５Ｄ）、５分（図１５Ｅ）、および６分（図１５Ｆ）の時点で取得されたＵＶ吸光度トレースの例を示す。図から分かるように、この一連のトレースではバンドの広がりの拡大はほとんどまたは全く観察されず、電極のオンチップスイッチングと、可動化剤の電気泳動的導入の使用とは、それらが分離チャネルから移動される際であっても、ＩＥＦによって達成される分離分解能を維持することを示す。
【0212】
図１６Ａは、図７に示され、上述されたものなどのマイクロ流体装置における、２つのｐＩ標準物質（７．００および９．９９）およびモノクローナル抗体を含む試料の等電点電気泳動のデータの例を示す。１．５％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ３－１０、１．５％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ８－１０．５（水中）にｐＨ７．００および９．９９のｐＩマーカ（各２５０μｇ／ｍＬ）ならびに２５０μｇ／ｍＬのトラスツズマブを含む試料を分離チャネルにロードし（１％ギ酸をアノード液として使用、１％ジエチルアミンをカソード液として使用、１％ギ酸、５０％イソプロピルアルコールを可動化剤として使用（いずれも水中））、３００Ｖ／ｃｍの分離電場を１分間印加した後、６００Ｖ／ｃｍの電場を６分間印加した。分離チャネルの全チャネルイメージングにより、図１６Ａに示すＵＶ吸光度トレースを取得した。
【0213】
等電点電気泳動分離の完了後、分離電場を提供するために使用したカソードをオフにし、可動化チャネルと電気通信しているカソードをオンにして、分離チャネルへの可動化剤の電気泳動的導入による可動化を開始した。カソードとアノードとの間に電場（４００Ｖ／ｃｍ）を印加して、可動化剤の電気泳動を５分間駆動した。図１６Ｂは、電気泳動可動化工程の開始後５分に取得されたＵＶ吸光度トレースの例を示す。
【0214】
異なるピーク対の分離分解能は、図１６Ａ～図１６Ｂに示すＵＶ吸光度トレースから計算し、推定分離分解能は、２つのピーク（ピクセル単位）に関する移動時間の差を全ベースラインピーク幅（ピクセル単位）で割って計算した。この計算は、かろうじてベースライン分解されたガウスピークに対して０．５の値を生じる。図１６Ａ～Ｂに示すＵＶトレースから計算された分解能データを表１に要約し、開示される電気泳動可動化法の使用が、可動化が行われる際にピーク分解能の測定可能な改善をもたらすことを示す。
【表1】
【0215】
開示される方法、装置およびシステムの好ましい実施形態を本明細書に示し、説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。ここで、本発明から逸脱することなく、多数の変形例、変更および置換が当業者に思い浮かぶであろう。本明細書に記載される方法、装置およびシステムの実施形態に対する様々な代替案が、本発明を実施する際に任意の組合せで使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図15E】
【図15F】
【図16A】
【図16B】