特許 7530418 抗コクシジウム植物性製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-30

(45)【発行日】2024-08-07

(54)【発明の名称】抗コクシジウム植物性製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/282 20060101AFI20240731BHJP

   A61P 33/02 20060101ALI20240731BHJP

   A61K 31/216 20060101ALI20240731BHJP

   A61K 36/28 20060101ALI20240731BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20240731BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20240731BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240731BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20240731BHJP

   A23K 10/30 20160101ALI20240731BHJP

【ＦＩ】

A61K36/282

A61P33/02 173

A61K31/216

A61K36/28

A61K9/20

A61K9/48

A61K9/08

A61K9/16

A23K10/30

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2022503907

(86)(22)【出願日】2020-07-18

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-26

(86)【国際出願番号】 US2020042692

(87)【国際公開番号】W WO2021016141

(87)【国際公開日】2021-01-28

【審査請求日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】62/876,633

(32)【優先日】2019-07-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】596118493

【氏名又は名称】アカデミア シニカ

【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ

【住所又は居所原語表記】１２８ Ｓｅｃ ２，Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｎａｎｋａｎｇ，Ｔａｉｐｅｉ １１５２９ ＴＷ

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，ウェン－チン

【審査官】堂畑 厚志

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２７２９７５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１８／０３３３４４７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】YANG, Wen-Chin et al.，Anti-coccidial properties and mechanisms of an edilble herb, Bidens pilosa, and its active compounds for coccidiosis，Scientific Reports，2019年02月27日，volume 9, Article number:2896，<DOI: 10.1038/s41598-019-39194-2>

【文献】RUWALI, Pushpa et al.，In vitro immunomodulatory potential of Artemisia indica Willd. in chicken lymphocytes，Vet World，2018年，11(1):80-87，<DOI: 10.14202/vetworld.2018.80-87>

【文献】DEL CACHO, Emilio, et al.，Effect of artemisinin on oocyst wall formation and sporulation during Eimeria tenella infection，Parasitology International，vol. 59，2010年，pp. 506-511，<DOI: 10.1016/j.parint.2010.04.001>

【文献】HUANG, Wu-Yang, et al.，A Potential Antioxidant Resource: Endophytic Fungi from Medicinal Plants，Economic Botany，2007年，61(1)，pp. 14-30

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３６／

Ａ６１Ｐ ３３／

Ａ６１Ｋ ９／

Ａ２３Ｌ ３３／

Ａ２３Ｋ １０／

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

(ａ）有効量のアルテミシアインディカ抽出物と、
(ｂ）有効量のビデンスピローサ抽出物と、
(ｃ）薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤又は担体と、
を含む、抗コクシジウム組成物。

【請求項2】

経口剤形である、請求項１に記載の抗コクシジウム組成物。

【請求項3】

前記経口剤形は、錠剤、丸薬、ソフトジェルカプセル、ハードカプセル、顆粒剤、粉剤、濃縮物、液剤、モールドボール及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、請求項２に記載の抗コクシジウム組成物。

【請求項4】

動物飼料をさらに含む、請求項１に記載の抗コクシジウム組成物。

【請求項5】

前記動物飼料は、家禽飼料、魚用飼料、両生類用飼料、爬虫類用飼料、鳥用飼料及び非ヒト哺乳動物飼料からなる群から選ばれる、請求項４に記載の抗コクシジウム組成物。

【請求項6】

前記アルテミシアインディカ抽出物と前記ビデンスピローサ抽出物とは、０．０００１：１．０から１．０：１．０の比率で存在する、請求項１又は４に記載の抗コクシジウム組成物。

【請求項7】

前記アルテミシアインディカ抽出物の量は、重量で前記組成物の重量の０．０００１％から０．０１％である、請求項１又は４に記載の抗コクシジウム組成物。

【請求項8】

前記ビデンスピローサ抽出物の量は、重量で前記組成物の重量の０．０１％から０．１％である、請求項６又は７に記載の抗コクシジウム組成物。

【請求項9】

前記アルテミシアインディカ抽出物は、クロロゲン酸を含む、請求項１に記載の抗コクシジウム組成物。

【請求項10】

(ａ）有効量のアルテミシアインディカ抽出物と、
(ｂ）有効量のビデンスピローサ抽出物と、
を含む、抗コクシジウム組成物。

【請求項11】

非水性液体、水性液体、懸濁液又は粉末形態である、請求項１又は１０に記載の抗コクシジウム組成物。

【請求項12】

コクシジウムオーシストを死滅させ、及びコクシジウムオーシストの胞子形成を阻害するための、請求項１、６から８、１０から１１のいずれか１項に記載の抗コクシジウム組成物。

【請求項13】

コクシジウムオーシストを死滅させ、オーシストの胞子形成を阻止し、スポロゾイトの侵入を減少させ、及び血便を軽減するための、請求項１から１１のいずれか１項に記載の抗コクシジウム組成物。

【請求項14】

コクシジウム症を緩和又は治療するための、請求項１から１１のいずれか１項に記載の抗コクシジウム組成物。

【請求項15】

コクシジウムオーシストを死滅させ、コクシジウムオーシストの胞子形成及びスポロゾイトの侵入を阻害するための抗コクシジウム製剤であって、有効量のアルテミシアインディカ抽出物及び薬学的に許容されるビヒクルを含む抗コクシジウム製剤。

【請求項16】

(ａ）有効量のアルテミシアインディカ抽出物と、
(ｂ）有効量のビデンスピローサ抽出物と、
(ｃ）非ヒト動物用飼料又は食料と、
から構成される、抗コクシジウム組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、コクシジウム症の治療に使用される植物性製剤に関し、より具体的には、アルテミシアインディカとビデンスピローサの組み合わせを含む抗コクシジウム植物性製剤に関する。

【背景技術】

【0002】

コクシジウム症は家禽の主要な寄生虫病であり、家禽産業にかなりの経済的損失を引き起こす。コクシジウムのサブクラスであるアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）属は、胞子形態であり、単細胞の原生動物の寄生生物に属し、腸内寄生虫であり、魚、爬虫類、鳥、哺乳類に感染することができる。鶏は少なくとも１１種のアイメリアに感染されやすい。そのうち、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ及びＥ．ｍａｘｉｍａは、鶏に対して毒性が比較的高い種であり、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ及びＥ．ｍｉｔｉｓは、毒性が比較的低い種である。アイメリア感染は、通常無症候性であるが、若い又は免疫力が低下した動物において下痢、血性下痢、脱水症、垂れ下がり、倦怠感、食欲不振、顔面蒼白、羽毛の波打ち及び巻き上がりなどの重篤な臨床症状を示す。

【0003】

アイメリアのライフサイクルには、細胞内、細胞外、無性、性的な段階がある。鶏がアイメリアに感染すると、寄生虫が鶏に発生し、微細な卵（オーシストと呼ばれる）を生み出し、糞便を介して広がる。適切な温度と湿度の条件下で、オーシストは１～２日以内に発生し、他の鶏に感染可能な胞子形成オーシストを形成する。 この段階では、オーシストには８つのボディ（スポロゾイトと呼ばれる）が含まれ、オーシストが食べられると、それぞれのボディは鶏の腸内の細胞に入ることができる。これらの細胞に入った後、スポロゾイトは、複数回分裂して後代（メロゾイト）を繁殖する。それぞれのメロゾイトは、さらに別の腸細胞に入ることができる。このサイクルは数回繰り返され、多数の腸細胞の破壊を招く恐れがある。最終的に、サイクルが停止し、性細胞（雌性と雄性）が産生される。雄性は雌性を受精させてオーシストを生成し、オーシストは腸の細胞から破裂し、糞便に伴って排出される。何千ものオーシストは、感染した鶏の糞便を介して広がる。したがって、混雑又は非衛生な条件下で飼育される家禽は、感染のリスクが非常に高くなる。

【0004】

植物は、人間や動物の薬の優れた供給源として考えられている。キク科のビデンスピローサは、コクシジウム症を治療するための抗コクシジウムハーブとして言われている。米国特許第９，０７２，３１２号には、コクシジウム症の予防と治療に適用されるビデンスピローサ及びポリアセチレン化合物が開示されている。しかしながら、ビデンスピローサ及びその活性化合物は、コクシジウム症を予防及び治療できるが、この予防と治療は、汚れた鶏舎では効果がない場合がある。

【発明の概要】

【0005】

一態様では、本発明は、（ａ）有効量のアルテミシアインディカ抽出物と、（ｂ）有効量のビデンスピローサ抽出物と、（ｃ）薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤又は担体とを含む抗コクシジウム組成物に関する。

【0006】

別の態様では、本発明は、（ａ）有効量のアルテミシアインディカ抽出物又は粉末と、（ｂ）有効量のビデンスピローサ抽出物又は粉末とを含む抗コクシジウム組成物に関する。

【0007】

本発明の一実施形態において、前記抗コクシジウム組成物は、（ａ）有効量のアルテミシアインディカ抽出物と、（ｂ）有効量のビデンスピローサ抽出物とを含み、又は（ａ）有効量のアルテミシアインディカ抽出物と、（ｂ）有効量のビデンスピローサ粉末とを含み、又は（ａ）有効量のアルテミシアインディカ粉末と、（ｂ）有効量のビデンスピローサ抽出物とを含み、又は（ａ）有効量のアルテミシアインディカ粉末と、（ｂ）有効量のビデンスピローサ粉末とを含む。前記抗コクシジウム組成物は、薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤又は担体をさらに含んでもよい。

【0008】

一実施形態において、前記抗コクシジウム組成物は、経口剤形である。前記経口剤形は、錠剤、丸薬、ソフトジェルカプセル、ハードカプセル、顆粒剤、粉剤、濃縮物、液剤、モールドボール及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれ得る。

【0009】

他の実施形態において、前記抗コクシジウム組成物は、動物飼料、又は非ヒト動物用飼料若しくは食料をさらに含む。

【0010】

他の実施形態において、前記動物飼料は、家禽飼料、魚用飼料、両生類用飼料、爬虫類用飼料、鳥用飼料及び非ヒト哺乳動物飼料からなる群から選ばれる。

【0011】

他の実施形態において、前記アルテミシアインディカ抽出物と前記ビデンスピローサ抽出物は、約０．０００１：１．０から１．０：１．０の比率で存在する。

【0012】

他の実施形態において、前記アルテミシアインディカ抽出物の量は、重量で前記組成物の重量の０．０００１％から０．０１％である。前記アルテミシアインディカの重量は、約０．００００５％から約０．００５％（ｗ／ｗ）又は約０．００１％から約０．０１％（ｗ／ｗ）であってもよい。

【0013】

他の実施形態において、ビデンスピローサ抽出物の量は、重量で前記組成物の重量の０．０１％から０．１％である。前記ビデンスピローサの重量は、約０．００５％から約０．０５％であってもよい。

【0014】

他の実施形態において、前記アルテミシアインディカ抽出物は、クロロゲン酸を含む。

【0015】

本発明は、（ａ）有効量のアルテミシアインディカ抽出物又は粉末と、（ｂ）有効量のビデンスピローサ抽出物又は粉末と、（ｃ）非ヒト動物用飼料又は食料とから実質的に構成され、又はこれらから構成される抗コクシジウム組成物にも関する。

【0016】

本発明は、（ａ）有効量のアルテミシアインディカ抽出物又は粉末と、（ｂ）有効量のビデンスピローサ抽出物又は粉末から実質的に構成され、又はこれらから構成される抗コクシジウム組成物にも関する。

【0017】

本発明の一実施形態において、前記抗コクシジウム組成物は、非水性液体、水性液体、懸濁液又は粉末形態である。

【0018】

別の態様では、本発明は、コクシジウムオーシストを死滅させ、及びコクシジウムオーシストの胞子形成を阻害するための医薬品の製造における本発明の抗コクシジウム組成物の使用に関する。

【0019】

別の態様では、本発明は、必要とする被験体においてコクシジウムオーシストを死滅させ、オーシストの胞子形成を阻害し、スポロゾイトの侵入を軽減し、血便を緩和し、又はコクシジウム症を予防若しくは治療するための医薬品の製造における、本発明の抗コクシジウム組成物の使用に関する。

【0020】

さらなる態様では、本発明は、コクシジウムオーシストを死滅させ、コクシジウムオーシストの胞子形成及びスポロゾイトの侵入を阻害するための医薬品の製造における、有効量のアルテミシアインディカ抽出物と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む抗コクシジウム製剤の使用に関する。

【0021】

これら及び他の態様は、以下の図面と併せて取られる好ましい実施形態の以下の説明から明らかになるが、その中の変形及び修正は、本開示の新規の概念の精神及び範囲から逸脱することなく影響を受ける可能性がある。

【0022】

添付の図面は、本発明の１つ又は複数の実施形態を示し、書面による説明とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。可能な場合は、一実施形態の同じ又は同様の要素を参照するために、図面全体で同じ参照番号が使用される。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１Ａから１Ｃは、アイメリアテネラ（ＥＴ）オーシストの生存能力に対するＡ．インディカ（ＡＩ）、Ｂ．ピローサ（ＢＰ）又はＡ．インディカ（ＡＩ）とＢ．ピローサ（ＢＰ）の混合物を含む製剤のインビトロ効果を示す顕微鏡写真（上図）及び棒グラフ（下図）である。前記オーシストをＰＢＳ（陰性対照，ＮＣ）、沸騰（陽性対照，ＰＣ）、又はＡＩ（１Ａ）、ＢＰ（１Ｂ）若しくはＡＩとＢＰの両方（１Ｃ）を含む植物抽出物により所定の用量で３０ｍｉｎ前処理した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色後、蛍光顕微鏡（左下図）又は光学顕微鏡（左上図）を用いて前記オーシストの生存能力を観察した。明視野はオーシストの数を示した。ＰＩ陽性オーシストの百分率を平均値±ＳＥで表し、棒グラフ（スケールバー１００μｍ；右図）を作成した。

【図2】図２Ａから２Ｃは、Ｅ．テネラ（ＥＴ）オーシストの生存能力及びその胞子形成に対する、Ａ．インディカ（ＡＩ）、Ｂ．ピローサ（ＢＰ）、又はＡ．インディカ（ＡＩ）とＢ．ピローサ（ＢＰ）との混合物を含む製剤のインビトロ効果を示す顕微鏡写真（上図）及び棒グラフ（下図）である。前記オーシストを、ＰＢＳ，亜ジチオン酸ナトリウム（ＳＤ）、オーシスト胞子形成の阻害剤、又はＡＩ（２Ａ）、ＢＰ（２Ｂ）若しくはＡＩとＢＰの両方（２Ｃ）を含む植物抽出物により、所定の用量で４８時間前処理した。前記オーシストに対して二クロム酸カリウムにより胞子形成を２日間誘導した。顕微鏡（左図）を用いて胞子形成オーシストの百分率を測定し、棒グラフ（右図；スケールバー２００μｍ）を作成した。矢印↓は胞子形成オーシストを示し、矢印▼は非胞子形成オーシストを示す。

【図3】図３Ａから３Ｃは、Ｅ．テネラ（ＥＴ）スポロゾイトの侵入に対するＡ．インディカ（ＡＩ）、Ｂ．ピローサ（ＢＰ）又はＡ．インディカ（ＡＩ）とＢ．ピローサ（ＢＰ）の混合物を含む製剤のインビトロ効果を示す顕微鏡写真（左図）及び棒グラフ（右図）である。マディンダービーウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞をサリノマイシン（Ｓａｌ）、又はＡ．インディカ（ＡＩ）（３Ａ）、Ｂ．ピローサ（ＢＰ）（３Ｂ）若しくはＡＩとＢＰの両方（３Ｃ）を含む植物抽出物と所定の用量で０．５時間インキュベートした。前記スポロゾイトをＭＤＢＫ細胞に２時間かけて追加した。洗浄後、ＭＤＢＫ細胞をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して計数した。侵入率（％）を棒グラフに作成した。挿入図は拡大た領域を表す。１００ｘ及び４０ｘ（挿入図）の顕微鏡スケールバーは、それぞれ１０μｍ及び５０μｍ（挿入図）である。矢印は、スポロゾイトに感染したＭＤＢＫ細胞を示す。

【図4A】インビボ研究に使用される実験プロトコルを示す概略図である。未治療群の鶏に毎日標準飼料を投与し、治療群の鶏にサリノマイシン、Ａ．インディカ（ＡＩ）、Ｂ．ピローサ（ＢＰ）又はＡＩ＋ＢＰを含む飼料を投与した。７日目に、強制経口投与により鶏をＰＢＳ又はＥ．テネラ（ＥＴ）胞子形成オーシスト（１ｘ１０^４）でチャレンジした。感染後の１日目から７日目、各群に対して生存率を監視した。

【図4B】図４Ａに示される各群の生存率を示す図である。鶏を８群に分けた。群１（Ｇ１）では、未感染で標準飼料で飼育した。群２（Ｇ２）では、ＥＴに感染させ、標準飼料で飼育した。群３（Ｇ３）から群８（Ｇ８）では、ＥＴに感染させ、サリノマイシン、ＢＰ単独、ＢＰと異なる用量のＡＩとの組み合わせ、又はＡＩ単独（ＢＰなし）を含む飼料で飼育した。各群には１５匹の鶏があり、Ｐ値が示された。

【図5】Ｅ．テネラ（ＥＴ）感染後の７日目での図４Ａ、４Ｂに示される各鶏群の血便百分率を示す棒グラフである。鶏糞は感染後の１日目から７日目に分類された。

【発明を実施するための形態】

【0024】

定義
本明細書で使用される用語は、一般に、当技術分野において、本発明の文脈内で、及び各用語が使用される特定の文脈において、それらの通常の意味を有する。本発明を説明するために使用される特定の用語は、本発明の説明に関して実施者に追加のガイダンスを提供するために、以下又は本明細書の他の場所で説明される。便宜上、たとえばイタリックや引用符を使用して、特定の用語をハイライトする場合がある。ハイライトの使用は、用語の範囲と意味に影響を与えない。用語の範囲と意味は、ハイライトされているかどうかに関係なく、同じコンテキストにおいて同じである。同じことが複数の方法で言えることを理解されたい。したがって、代替の言語及び同義語を、本明細書で論じられる用語のいずれか１つ又は複数に使用することができ、用語が本明細書で詳述又は論じられるにもかかわらず特別な意味を置くこともできない。特定の用語の同義語が提供されている。１つ以上の同義語のリサイタルは、他の同義語の使用を除外しない。本明細書で論じられる任意の用語の例を含む本明細書の任意の場所での例の使用は、例示にすぎず、本発明又は任意の例示された用語の範囲及び意味を決して制限するものではない。同様に、本発明は、本明細書で与えられる様々な実施形態に限定されない。

【0025】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。

【0026】

本明細書において、「おおよそ」、「約」又は「ほぼ」は、一般に、所与の値又は範囲の２０パーセント以内、好ましくは１０パーセント以内、より好ましくは５パーセント以内を意味する。本明細書に記載の数値は概算であり、明示的に述べられていない限り、「おおよそ」、「約」又は「ほぼ」という用語を推測できることを意味する。

【0027】

約０．００００５％～約０．００５％は、この範囲内の１０万分の１、１万分の１、１０００分の１、１００分の１、１０分の１、及び整数単位量が全て本発明の一部として具体的に開示されていることを意味する。したがって、０．００００５％、０．００００６％、０．００００７％・・・０．００００９％、０．０００１％、０．０００２％・・・及び０．０００９％、０．００１％、０．００１１％・・及び０．００４８、０．００４９、０．００５％の単位量が全て本発明の実施形態として含まれる。

【0028】

約０．０００１％～約０．０１％は、１万分の１、１０００分の１、１００分の１、１０分の１、及び整数単位量が全て本発明の一部として具体的に開示されていることを意味する。したがって、０．０００１％、０．０００２％、０．０００３％・・・０．０００９％、０．００１％、０．００１１％・・・及び０．００９８、０．００９９、０．０１％の単位量が全て本発明の実施形態として含まれる。

【0029】

約０．００５％～約０．０５％は、１０００分の１、１００分の１、１０分の１、及び整数単位量が全て本発明の一部として具体的に開示されていることを意味する。したがって、０．００５％、０．００６％、０．００７％・・・０．００９９、０．０１％、０．０１１％・・・及び０．０４８％、０．０４９％、０．０５％の単位量が全て本発明の実施形態として含まれる。

【0030】

約０．０１％～約０．１％は、１００分の１、１０分の１、及び整数単位量が全て本発明の一部として具体的に開示されていることを意味する。したがって、０．０１％、０．０２％、０．０３％・・・及び０．０８％、０．０９％、０．１％の単位量が全て本発明の実施形態として含まれる。

【0031】

用語「混合物」は、一般に、異なる種類の任意の組み合わせ又はブレンドを意味する。

【0032】

本発明は、ビデンスを含む植物性製剤の抗コクシジウム活性に関する。

【0033】

Ｂ．ピローサ及びアルテミシアインディカ抽出物の製造
アルテミシアインディカ抽出物
アルテミシアインディカ植物は、台湾の苗栗県のキャンパスから収集された。約１ｋｇの乾燥植物全体を１０Ｌの１００℃の水中で２時間還流した。水相を除去した後、不溶性物質を再び１０Ｌの水で２時間還流した。水溶液を合わせて凍結乾燥し、粗抽出物（０．１５ｋｇ）を得た。クロロゲン酸は、バッチの一貫性のマーカーとして使用された。クロロゲン酸を取得し、^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲにより特徴付けた。

【0034】

ビデンスピローサ抽出物
上記と同様な方法によりＢ．ピローサ植物を収集して処理した。約１ｋｇの乾燥植物全体を１０Ｌの１００℃の水中で２時間還流し、抽出を１回繰り返した。水溶液を合わせて凍結乾燥し、粗抽出物（０．１２ｋｇ）を得た。サイトピロイン（ｃｙｔｏｐｉｌｏｙｎｅ）は、バッチの一貫性のマーカーとして使用された。ポリアセチレン化合物を取得して^１Ｈ ＮＭＲ及び^１３Ｃ ＮＭＲにより特徴付けた。このようにして得られた純粋な化合物をさらに誘導体化して、他の多くのポリアセチレン化合物を提供することができる（米国特許第７，７６３，２８５号及びＫｕｓａｎｏ ｅｔ ａｌ（ＪＰ２００４０８３４６３）；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0035】

Ａ．インディカ及びＢ．ピローサの抽出物は、粉末の形態として使用される。植物抽出物粉末の百分率は、以下の通り計算する。植物粉末重量／植物粉末重量±基本的な鶏飼料＝植物粉末の％

【0036】

本発明は、抗コクシジウム特性を有するアルテミシアインディカ及びアルテミシアインディカとビデンスピローサとを含む製剤に関する。

【0037】

実施例
材料と方法
化学品
サリノマイシン、ＰＢＳ及びＨ＆Ｅ染色は、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ^ＴＭから購入された。アルテミシアインディカ及びＢ．ピローサを沸騰した水中で抽出し、後の使用するために様々な比率で混合した。

【0038】

侵入アッセイ
マディンダービーウシ腎臓（ＭＤＢＫ，ＡＴＣＣ^{（登録商標）}ＣＣＬ－２２）細胞をウシ胎児血清（１０％）及びサプリメントを含むＤＭＥＭで培養した後、２×１０^５細胞／ウェルで２４ウェルのガラスカバースリップに接種した。１日後、細胞をサリノマイシン又は所定量の植物抽出物とファイトケミカルを含むＤＭＥＭ培地中で０．５時間プレインキュベートした。新鮮なスポロゾイト（２×１０^５）を細胞に加え、さらに４時間インキュベートした。大量のＰＢＳで洗浄した後、細胞を固定してＨ＆Ｅで染色した。顕微鏡にて写真を撮影した。侵入率（％）は、算式：１００％×（スポロゾイトが侵入した細胞の数／総細胞数）により得られた。

【0039】

生存能力試験
Ｅ．テネラスポロゾイトを植物抽出物又はサリノマイシンと４．５時間インキュベートした。顕微鏡を用いてスポロゾイトでの生細胞及び死細胞を区分した（図３）。生存率（％）は、死細胞の数を総細胞数で割って１００％をかけることで得られた。

【0040】

胞子形成アッセイ
Ｅ．テネラオーシストをＰＢＳで前処理し、沸騰処理（１００℃、３０ｍｉｎ）し、又は所定量の植物抽出物で４８時間前処理した。胞子形成の前にオーシストを２％二クロム酸カリウムと２日間インキュベートした。胞子形成オーシストの百分率（％）を計算した。

【0041】

Ｅ．テネラスポロゾイトのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色
ＥＴオーシストをＰＢＳで１時間処理し、沸騰処理（１００℃、３０ｍｉｎ）し、又は所定用量の植物抽出物と１時間インキュベートした。オーシストをＰＩで染色した。ＰＢＳで洗浄した後、顕微鏡を用いてオーシストを観察した。

【0042】

鶏、飼料及び実験設計
１日齢のローマンブロイラーの雛は、台中孵化場（台湾）から購入し、到着後、羽を結い、体重を測り、スＰｅｔｅｒｓｉｍｅターターブローダーユニット（Ｐｅｔｅｒｓｉｍｅ ｓｔａｒｔｅｒ ｂｒｏｏｄｅｒ ｕｎｉｔ）にランダムに入れた。孵化後の１日から２日に鶏に水と餌を自由に摂取させた。飼料は、標準飼料と担体単独（対照飼料）又は所定用量の植物性製剤（アルテミシアインディカ（ＡＩ）、Ｂ．ピローサ（ＢＰ）又はＡＩとＢＰの両方を含む）とを混合したものである。群分け後、鶏にアイメリアオーシストを強制経口投与して感染させた。成長状況（体重及び飼料要求率）、病理学（血便及び消化管形態計測）及び生存率を測定して検査した（図４Ａ）。全ての鶏は、施設内の動物施設で飼育され、施設内のガイドラインに従って取り扱われた。

【0043】

免疫組織化学的染色
対照飼料、及びアルテミシアインディカ（ＡＩ）、Ｂ．ピローサ（ＢＰ）、又は両者を含む飼料で１４日間飼育した鶏から盲腸を摘出し、急速凍結して複数の平行切片を切り出した。切片をＨ＆Ｅ又は抗インスリン抗体で染色し、ジアミノベンジジン四塩酸塩で現像した後、画像分析を行った（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５）９８：７４－８１）。

【0044】

統計分析
３つ以上の独立した実験の結果を平均値±Ｓ．Ｅ．で表した。データをＡＮＯＶＡで分析した。Ｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意差があると見なされた。

【0045】

結果
Ｅ．テネラオーシストの生存、オーシストの胞子形成及びスポロゾイトの侵入に対する植物抽出物の影響
Ａ．インディカ（ＡＩ）抽出物、Ｂ．ピローサ（ＢＰ）抽出物、及びＡＩ抽出物とＢＰ抽出物との混合物の影響を調べるために、Ｅ．テネラ（ＥＴ）オーシストに対するＡＩ、ＢＰ及びＡＩとＢＰの組み合わせの直接死滅活性をそれぞれ調べた。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色（沸騰処理，図１Ａ）により、陽性対照とする沸騰処理が３０％のＥＴオーシストを効果的に死滅させたことが実証された。ＡＩは、ＥＴオーシストを用量依存的に死滅させた（図１Ａ，右図）。ＢＰは、オーシストを死滅できなかった（図１Ｂ）。ＡＩとＢＰの組み合わせは、ＥＴオーシストを直接死滅させた（図１Ｃ）。

【0046】

Ｅ．ＥＴオーシストの胞子形成に対する植物抽出物の影響を試験した。７０％のＥＴオーシストは、インビトロ培養において胞子を形成できた（ＰＢＳ，図２Ａ）。陽性対照として亜ジチオン酸ナトリウム（ＳＤ）で処理することにより、ＰＢＳ治療群に比べてＥ．ＥＴオーシストの胞子形成が４０％減少した（ＳＤ，図２Ａ，右図）。Ａ．インディカ（ＡＩ）は、Ｅ．ＥＴオーシストの胞子形成を用量依存的に減少させた（図２Ａ）。Ｂ．ピローサ（ＢＰ）もＥＴオーシストの胞子形成を用量依存的に阻害した（図２Ｂ）。ＡＩとＢＰの組み合わせは、ＥＴオーシストの胞子形成を相乗的に阻害した（図２Ｃ）。

【0047】

ＭＤＢＫ細胞へのＥＴスポロゾイトの侵入に対するＢ．ピローサｓの影響を調べた。Ｙａｎｇらの報告（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１９）９：２８９６）によると、ＥＴスポロゾイトは２０％の細胞に侵入することができる（図３Ａ，右図）。５０μｇ／ｍｌの抗コクシジウム薬であるサリノマイシンは、ＥＴスポロゾイトの侵入を１０％に減少させた。Ａ．インディカ（ＡＩ）は、ＥＴスポロゾイトの侵入を用量依存的に減少させた（図３Ａ，右図）。Ｂ．ピローサ（ＢＰ）もＭＤＢＫ細胞へのＥＴスポロゾイトの侵入を用量依存的に減少させた（図３Ｂ，右図）。ＡＩとＢＰの組み合わせは、ＥＴスポロゾイトの侵入を相乗的に減少させた（図３Ｃ，右図）。これらのデータにより、ＡＩとＢＰの組み合わせは、オーシスト、オーシストの胞子形成、及びスポロゾイトの侵入の段階でＥＴのライフサイクルに干渉できることが実証された。ＡＩ又はＢＰの単独に比べて、ＡＩとＢＰの組み合わせは、ＥＴオーシストの胞子形成及びＥＴスポロゾイトの侵入をより効果的に阻害することができる。これらのデータは、ＡＩとＢＰは、抗コクシジウムのメカニズムが異なることを示している。

【0048】

Ｅ．テネラチャレンジ鶏の生存率、体重増加及び飼料要求率に対する植物抽出物の影響
Ａ．インディカ（ＡＩ）抽出物、Ｂ．ピローサ（ＢＰ）抽出物、及び両者の組み合わせの抗コクシジウム効果をインビボで調べた。鶏をランダムに８群に分け、毎日（１日目から１４日目）標準鶏飼料（群１、２）、サリノマイシンを含む飼料（群３）、又は所定用量の植物抽出物を含む飼料（群４から８）で飼育した（図４Ａ）。

【0049】

図４Ｂに示されるように、標準飼料で飼育された鶏は、ＥＴに感染した後に、生存率が１００％（ＣＴＲ，群１）から６０％（Ｅｔ，群２）に減少した。サリノマイシンを含む飼料で飼育された感染鶏（群３）の生存率１００％であった。同様に、の生存率は、ＡＩ、ＢＰ又はＡＩとＢＰの組み合わせを含む飼料で飼育された感染鶏（群４から８）の生存率はいずれも１００％であった。

【0050】

表１は、ＥＴチャレンジ鶏の体重増加に対する植物抽出物の影響を示す。図４Ｂに示されるように、鶏の体重（ＢＷ）を１、７及び１４日目に測定し、体重（ＢＷ）増加を７、１４日目に計算した。７日目（ＥＴ感染前）に、異なる群の鶏は、体重増加（７日目のＢＷマイナス１日目のＢＷ）は大体同じであった。群２から８（Ｇ２からＧ８）の鶏をＥＴオーシスト（１ｘ１０^４）に感染させ、対照群（Ｇ１）の鶏をＰＢＳで処理した。１４日目（ＥＴ感染後）に、非感染非投薬鶏（群１）、感染非投薬鶏（群２）、サリノマイシン投与感染鶏（群３）、０．０１％ＢＰ（群４）、０．０００１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ（群５）、０．００１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ（群６）、０．０１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ（群７）、及び０．０１％ＡＩ（群８）の平均体重増加（１４日目のＢＷマイナス１日目のＢＷ）は、それぞれ８８．８４ｇ、５０．８０ｇ、５６．３３ｇ、６１．９８ｇ、６２．９１ｇ、６４．６５ｇ、６７．６６ｇ、及び５９．７８ｇであった。これらのデータは、ＡＩとＢＰの組み合わせの体重増加の効果がそれぞれの単独よりも高いことを示している。

【0051】

【表1】

【0052】

表２は、ＥＴチャレンジ鶏の飼料要求率（ＦＣＲ）に対する植物抽出物の影響を示す。１４日目（ＥＴ感染後）に、対照鶏（群１）、感染鶏（群２）、サリノマイシン投与感染鶏（群３）、０．０１％ＢＰ（群４）、０．０００１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ（群５）、０．００１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ（群６）、０．０１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ（群７）、及び０．０１％ＡＩ（群８）の平均ＦＣＲは、それぞれ２．２４、３．３８、３．０５、２．６０、３．０１、３．０４、２．８８及び２．９６であった。これらの結果から分かるように、ＡＩ、ＢＰ、及びＡＩとＢＰとの組み合わせは、サリノマイシン又は対照飼料単独に比べて、ＥＴ感染による体重減少及びＦＣＲ増加を大幅に改善することができる。改善の一部は、植物抽出物の体重増加効果によるものである。

【0053】

【表2】

【0054】

Ｅ．テネラチャレンジ鶏の糞便オーシスト排出量に対する植物抽出物の影響
表３は、各群の糞便オーシスト排出量を示す。ＥＴ感染鶏の糞便中のアイメリアオーシストの排出量は、アイメリア増殖の指標である。図４Ｂのニワトリの糞便１ｇあたりのオーシスト（ＯＰＧ）は、ＥＴ感染後３日目から７日目までカウントされた。非感染非投薬対照群では、糞便からオーシストが検出されなかった（群１，表３）。全てのＥＴ感染群では、感染後の４日目に初めて糞便オーシストの排出が検出され、感染後の７日目にピークになった（群２）。サリノマイシンが投与された感染鶏（群３）は、感染非投薬鶏（群２）に比べて、糞便１ｇあたりのオーシストがわずかに少なかった。０．０１％ＢＰ、０．０００１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ、０．００１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ、０．０１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ、及び０．０１％ＡＩ（群４から８）が投与された鶏は、それぞれ感染非投薬鶏（群２）に比べて糞便１ｇあたりのオーシストが顕著に少なった。このデータは、ＡＩとＢＰとの組み合わせがそれぞれの単独よりも多くのＯＰＧを減少できることを示している。

【0055】

【表3】

【0056】

Ｅ．テネラチャレンジ鶏の腸病変に対する植物抽出物の影響
表４は、ＥＴ感染後の７日目の肉眼的盲腸病変スコアを示す。図４Ｂに示される鶏の盲腸における肉眼的病変を観察して採点した。非感染非投薬対照鶏（群１，表４）は、盲腸に病変がなかった（スコア＝０）。非投薬鶏は、感染後の７日目の平均病変スコアが４点（群２）であり、ＥＴ感染が腸においてより多くの肉眼的盲腸病変を引き起こしたことを示している。サリノマイシンが投与された感染鶏は、平均病変スコアが３．８６点（群３）であった。０．０１％ＢＰ、０．０００１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ、０．００１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ、０．０１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ、及び０．０１％ＡＩが投与された感染鶏（群４から８）は、それぞれ感染非投薬鶏（群２）に比べて病変スコアが顕著に少なかった。このデータは、ＡＩとＢＰの組み合わせがそれぞれの単独よりも鶏の腸における肉眼的病変を減少できることを示している。

【0057】

【表4】

【0058】

表５は、図４ＢにおけるＥＴ感染後の７日目での鶏の盲腸の顕微鏡的病変スコアを示す。顕微鏡を用いてコクシジウムによる粘膜損傷を観察し、鶏盲腸の粘膜損傷の分布と重症度に基づいて顕微鏡的盲腸病変に対して採点した。

【0059】

非感染非投薬対照群（群１）では、顕微鏡的盲腸病変が観察されなかった（スコア＝０）。感染非投薬鶏（群２）では、ＥＴ感染後の７日目に盲腸に重篤な顕微鏡的病変が観察された（スコア＝７．２）。盲腸には重篤な潰瘍形成、出血及び絨毛減少も観察された（データ示せず）。オーシスト、生殖母細胞及びシゾントが盲腸上皮内に現れた（データ示せず）。感染サリノマイシン投与鶏（群３）は、感染非投薬鶏（群２）に比べて、盲腸の顕微鏡的病変（スコア＝６．２９）に軽度の改善を示した。しかし、Ｂ．ピローサ、Ｂ．ピローサとＡＩの組み合わせ、又はＡＩ単独が投与された感染鶏（群４から８，表５）は、盲腸における顕微鏡的病変が顕著に減少した（スコア：４．７８から５．８０）。一貫して、Ｂ．ピローサは潰瘍と出血を減少させ、対照飼料よりも多くの粘膜と絨毛が鶏盲腸に保存された（データ示せず）。Ｂ．ピローサはまた、サリノマイシン及び対照飼料に比べて、盲腸上皮内のオーシスト、生殖母細胞及びシゾントの数を大幅に減少させた（データ示せず）。よって、Ｂ．ピローサ、Ｂ．ピローサとＡＩの組み合わせ、又はＡＩ単独は、ＥＴ感染後の鶏の腸の病理を顕著に軽減した。このデータは、ＡＩとＢＰの組み合わせがそれぞれの単独よりも鶏の腸における顕微鏡的病変をさらに減少できることを示している。

【0060】

【表5】

【0061】

Ｅ．テネラチャレンジ鶏の血便に対する植物抽出物の影響
図５は、Ｅ．テネラ（ＥＴ）感染後の７日目の各鶏群の血便百分率を示す。非感染対照鶏（群１）では、血便が観察された。ＥＴ感染は、１００％の血便（群２）を引き起こした。サリノマイシンが投与された鶏（群３）は、血便の百分率が顕著に減少した。０．０１％ＢＰ、０．０００１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ、０．００１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ、０．０１％ＡＩ＋０．０１％ＢＰ、及び０．０１％ＡＩが投与された感染鶏（群４から８）は、それぞれ感染非投薬鶏（群２）に比べて血便の百分率が顕著に減少した。このデータは、ＡＩとＢＰの組み合わせがそれぞれの単独よりも血便をさらに減少できることを示している。

【0062】

本明細書で引用及び論じられている全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、各参考文献が参照により個別に組み込まれた場合と同程度である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】