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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-31
(45)【発行日】2024-08-08
(54)【発明の名称】血中フリー体ＡＩＭ増加用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/06 20060101AFI20240801BHJP
A61K 31/7076 20060101ALI20240801BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240801BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240801BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240801BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240801BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240801BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240801BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20240801BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240801BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20240801BHJP
【ＦＩ】
A61K38/06
A61K31/7076
A61P43/00 111
A61P13/12
A61P1/16
A61P3/04
A61P25/00
A61P35/00
A61P31/10
A61P29/00
A23L33/10
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2021015422
(22)【出願日】2021-02-03
(62)【分割の表示】P 2020052617の分割
【原出願日】2020-03-24
(65)【公開番号】P2021075545
(43)【公開日】2021-05-20
【審査請求日】2023-03-17
(31)【優先権主張番号】P 2019058964
(32)【優先日】2019-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】521558592
【氏名又は名称】合同会社ＡｉＭＩＹＡ
(73)【特許権者】
【識別番号】593106918
【氏名又は名称】株式会社ファンケル
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100194803
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 理弘
(72)【発明者】
【氏名】宮崎 徹
(72)【発明者】
【氏名】渡邉 知倫
(72)【発明者】
【氏名】倉田 洋一
(72)【発明者】
【氏名】山田 昌良
【審査官】今村 明子
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１７２３９１３（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０２２３１５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／０４３６１７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国老年学雑誌，2014年，Vol.34，pp.1354-1355
【文献】肝臓，1984年，Vol.25,No.11，pp.1468-1473
【文献】J.Biomol.Res.Ther.，2017年，Vol.6,No.1，pp.1-7
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｋ ３８／００
Ａ２３Ｌ ３３／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
還元型グルタチオン、及び／又は、コエンザイムＡを有効成分として含有する血中のフリー体ＡＩＭ増加用の組成物。
【請求項2】
還元型グルタチオン、及び／又は、コエンザイムＡを有効成分として含有する血中のフリー体ＡＩＭ増加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血中フリー体ＡＩＭ増加用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＡＩＭ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ；ＣＤ５Ｌ、ａｐｉ６、Ｓｐαとも称する）は、組織マクロファージが特異的に産生する分子量約５０ｋＤａの分泌型タンパク質である（非特許文献１）。ＡＩＭは、システイン残基を多く含む特異的な配列であるｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）ドメインをタンデムに３つつなげた構造をしており、それぞれのシステイン残基は各ドメイン内で互いにジスルフィド結合することで、コンパクトな球状の立体構造をしていると考えられている。
【0003】
ＡＩＭは、尿中へ排出されず、血液中で安定的に存在する。このために、ＩｇＭとの結合が深く関与していること、またほとんどすべてのＡＩＭは血液中ではＩｇＭと複合体を形成し、非結合体で存在することがほとんどないことが報告されている（非特許文献２）。
そしてＡＩＭとＩｇＭの結合様式は、ＩｇＭ五量体のギャップの中にＡＩＭが嵌まり込むような形で結合し、ＡＩＭが持つ、システインを多く含む３つのドメインのうち、２番目のドメインに存在するフリーのシステイン残基が、ＩｇＭ五量体にあるギャップの片側に存在するフリーのシステインとジスルフィド結合により結合していること、ＡＩＭのＣ末端側の３番目のドメイン内に存在する正に荷電したアミノ酸のクラスターが、ギャップのもう片側に存在する負に荷電したアミノ酸クラスターと電荷による結合をしており、ＡＩＭにより、ギャップの両側のＩｇＭがクロスブリッジされていることが明らかになっている（非特許文献３）。
そしてＡＩＭとＩｇＭの結合様式は、ＩｇＭ五量体のギャップの中にＡＩＭが嵌まり込むような形で結合し、ＡＩＭが持つ、システインを多く含む３つのドメインのうち、２番目のドメインに存在するフリーのシステイン残基が、ＩｇＭ五量体にあるギャップの片側に存在するフリーのシステインとジスルフィド結合により結合していること、ＡＩＭのＣ末端側の３番目のドメイン内に存在する正に荷電したアミノ酸のクラスターが、ギャップのもう片側に存在する負に荷電したアミノ酸クラスターと電荷による結合をしており、ＡＩＭにより、ギャップの両側のＩｇＭがクロスブリッジされていることが明らかになっている（非特許文献３）。
【0004】
ヒトにおけるＡＩＭの作用効果の全貌は、未だ不明な点が多いが、その作用効果の一部が明らかになるにつれて、新たな医薬用途の発明がなされている。
特許文献１には、ＡＩＭを含有してなる、肝疾患の予防・治療剤の発明が記載されている。
特許文献２には、ＡＩＭもしくはその部分ペプチドを含有してなる、腎疾患の予防・治療剤の発明が記載されている。
特許文献１および２には、いずれもＡＩＭタンパク質又はペプチド断片を有効成分とする疾患治療剤や、その遺伝子を利用した新たな治療剤やＡＩＭ遺伝子の利用が開示されている。
また特許文献３は、ＡＩＭの作用を抑止する医薬発明が記載されている。すなわちＡＩＭと結合性を有し、ＡＩＭ作用を抑制する抗体やＡＩＭ遺伝子に対するアンチセンス核酸や、ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸を投与することで、ＡＩＭの作用を抑制し、メタボリックシンドロームを治療するための医薬発明が記載されている。
特許文献１には、ＡＩＭを含有してなる、肝疾患の予防・治療剤の発明が記載されている。
特許文献２には、ＡＩＭもしくはその部分ペプチドを含有してなる、腎疾患の予防・治療剤の発明が記載されている。
特許文献１および２には、いずれもＡＩＭタンパク質又はペプチド断片を有効成分とする疾患治療剤や、その遺伝子を利用した新たな治療剤やＡＩＭ遺伝子の利用が開示されている。
また特許文献３は、ＡＩＭの作用を抑止する医薬発明が記載されている。すなわちＡＩＭと結合性を有し、ＡＩＭ作用を抑制する抗体やＡＩＭ遺伝子に対するアンチセンス核酸や、ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸を投与することで、ＡＩＭの作用を抑制し、メタボリックシンドロームを治療するための医薬発明が記載されている。
【0005】
ＡＩＭは、生体中ではマクロファージによって産生されるが、血液中では、上記の通り、ＩｇＭと複合体を形成しており、不活性化されている。そして、腎疾患や肝臓疾患の進行に伴って、フリー体のＡＩＭが出現し、疾患の改善にプラスに作用する。
例えば、急性腎障害、脂肪肝、肝細胞癌、肥満、真菌性腹膜炎、多発性硬化症などさまざまな疾患症状に対し抑制的な効果を示すことが確認されている。特にネコに腎不全が多発するのは、ネコのＡＩＭが、ＡＩＭ－ＩｇＭ五量体（複合体）から解離しないためであることが明らかになっている（非特許文献４）。
また、このような疾患の指標として、血中のＡＩＭ濃度を測定する技術が、特許文献４、５、６に開示されている。
しかし、これまで血中に存在するＩｇＭの五量体とＡＩＭの複合体からＡＩＭをフリー体として生成させる手段や薬剤は提供されていない。
例えば、急性腎障害、脂肪肝、肝細胞癌、肥満、真菌性腹膜炎、多発性硬化症などさまざまな疾患症状に対し抑制的な効果を示すことが確認されている。特にネコに腎不全が多発するのは、ネコのＡＩＭが、ＡＩＭ－ＩｇＭ五量体（複合体）から解離しないためであることが明らかになっている（非特許文献４）。
また、このような疾患の指標として、血中のＡＩＭ濃度を測定する技術が、特許文献４、５、６に開示されている。
しかし、これまで血中に存在するＩｇＭの五量体とＡＩＭの複合体からＡＩＭをフリー体として生成させる手段や薬剤は提供されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】国際公開第２０１３／１６２０２１号
【文献】国際公開第２０１５／１１９２５３号
【文献】国際公開第２０１１／１４５７２３号
【文献】国際公開第２０１１／１４５７２５号
【文献】国際公開第２０１７／０２２３１５号
【文献】国際公開第２０１７／０４３６１７号
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８９：４１３－４２２，１９９９
【文献】Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３，１１８７－１１９８，Ａｐｒｉｌ ２５，２０１３
【文献】Ｈｉｒａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ａｄｖ． ２０１８； ４ ： ｅａａｕ１１９９ １０ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１８
【文献】Ｓｕｇｉｓａｗａ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ６： ３５２５１ （２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明者らは、天然物や化合物のＡＩＭに対する作用を研究する過程で、多数の天然物や抽出物のスクリーニングを行い、化学構造式中にチオール基を持つ化合物が特異的に、血中のＡＩＭとＩｇＭの複合体からＡＩＭを生成させることを見出し、本発明をなした。
すなわち、本発明は、血中のＡＩＭとＩｇＭの複合体からＡＩＭを生成させ、血中のフリー体のＡＩＭ濃度を上昇させる作用を有する組成物を提供することを課題とする。
すなわち、本発明は、血中のＡＩＭとＩｇＭの複合体からＡＩＭを生成させ、血中のフリー体のＡＩＭ濃度を上昇させる作用を有する組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、以下の構成からなる。
（１）化学構造式中にチオール基を持つ化合物を有効成分として含有する血中のフリー体ＡＩＭ増加用の組成物。
（２）化学構造式中にチオール基を持つ化合物が、１－プロパンチオール、２－メチル－１－プロパンチオール、シクロペンタンチオール、２－ヒドロキシベンゼンチオール、ジヒドロリポ酸、Ｌ－シスチン、還元型グルタチオン、Ｌ－システイン、コエンザイムＡ、γ－グルタミルシステインからなる群から選択される１又は２以上の化合物である（１）に記載の組成物。
（１）化学構造式中にチオール基を持つ化合物を有効成分として含有する血中のフリー体ＡＩＭ増加用の組成物。
（２）化学構造式中にチオール基を持つ化合物が、１－プロパンチオール、２－メチル－１－プロパンチオール、シクロペンタンチオール、２－ヒドロキシベンゼンチオール、ジヒドロリポ酸、Ｌ－シスチン、還元型グルタチオン、Ｌ－システイン、コエンザイムＡ、γ－グルタミルシステインからなる群から選択される１又は２以上の化合物である（１）に記載の組成物。
【発明の効果】
【0010】
本発明により血中のフリー体ＡＩＭ増加用の組成物が提供される。
本発明の組成物は、血中のＡＩＭを増加させ、血中のフリー体ＡＩＭの増加により、急性腎障害、脂肪肝、肝細胞癌、肥満、真菌性腹膜炎、多発性硬化症等のフリー体ＡＩＭの関与する疾患の予防改善剤として利用可能である。
本発明の組成物は、血中のＡＩＭを増加させ、血中のフリー体ＡＩＭの増加により、急性腎障害、脂肪肝、肝細胞癌、肥満、真菌性腹膜炎、多発性硬化症等のフリー体ＡＩＭの関与する疾患の予防改善剤として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】１－プロパンチオール：０．５Ｖ／Ｖ％、２－メチル－１－プロパンチオール：０．５Ｖ／Ｖ％、シクロペンタンチオール：０．５Ｖ／Ｖ％、２－ヒドロキシベンゼンチオール：５ｍｇ／ｍＬのフリー体ＡＩＭ増加作用の試験結果を示すウエスタンブロット画像である。
【図3】Ｌ－シスチン：１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬのフリー体ＡＩＭ増加作用試験結果を示すウエスタンブロット画像である。
【図5】Ｌ－システイン：０．５ｍＭ、５ｍＭのフリー体ＡＩＭ増加作用の試験結果を示すウエスタンブロット画像である。
【図7】ジヒドロリポ酸：０．５Ｖ／Ｖ％のフリー体ＡＩＭ増加作用の試験結果を示すウエスタンブロット画像である。
【図9】コエンザイムＡ：０．５ｍｇ／ｍＬのフリー体ＡＩＭ増加作用の試験結果を示すウエスタンブロット画像である。
【図11】還元型グルタチオン：５ｍｇ／ｍＬのフリー体ＡＩＭ増加作用の試験結果を示すウエスタンブロット画像である。
【図13】γ－グルタミルシステイン：１．２５μＭのフリー体ＡＩＭ増加作用の試験結果を示すウエスタンブロット画像である。
【図15】Ｌ－シスチンを経口投与したマウス血漿中のＡＩＭ増加を試験したウエスタンブロット画像である。
【図17】Ｌ－シスチン粉末を経口摂取したヒトの血清中のフリー体ＡＩＭ増加の試験結果を示すウエスタンブロット画像である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明について具体的に説明する。
本発明でいう「フリー体ＡＩＭ」とは、ＡＩＭがＩｇＭの五量体から生成して、単独で血中に存在している状態をいう。当該フリー体ＡＩＭは、ＩｇＭをはじめとする血中のタンパク質や糖タンパク質と非結合の状態である。
本発明においては、ＩｇＭ等と結合した状態のＡＩＭを「複合体ＡＩＭ」という。また複合体ＡＩＭとフリー体ＡＩＭの両方を合わせたＡＩＭ量を「全ＡＩＭ量」という。
なお、全ＡＩＭの検出、定量は、特許文献４～６に開示された抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイ法で測定することができる。
本発明でいう「フリー体ＡＩＭ」とは、ＡＩＭがＩｇＭの五量体から生成して、単独で血中に存在している状態をいう。当該フリー体ＡＩＭは、ＩｇＭをはじめとする血中のタンパク質や糖タンパク質と非結合の状態である。
本発明においては、ＩｇＭ等と結合した状態のＡＩＭを「複合体ＡＩＭ」という。また複合体ＡＩＭとフリー体ＡＩＭの両方を合わせたＡＩＭ量を「全ＡＩＭ量」という。
なお、全ＡＩＭの検出、定量は、特許文献４～６に開示された抗ＡＩＭモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイ法で測定することができる。
【0013】
本発明でいう「組成物」とは、チオール化合物を含有し、血中フリー体ＡＩＭ増加効果を発揮するものをいう。「組成物」には食品、医薬品、健康食品、動物用飼料を包含する。
発明組成物に配合されるチオール化合物は、その分子内にＳＨ基を有する化合物である。
発明組成物に配合されるチオール化合物は、その分子内にＳＨ基を有する化合物である。
【0014】
本発明の組成物に含有されるチオール化合物は、目的に応じて、適宜選択されるが、使用性、安全性及び有効性の点から、アミノ酸系のチオール化合物や食品医薬品として使用実績のある化合物が好ましい。具体的には、１－プロパンチオール、２－メチル－１－プロパンチオール、シクロペンタンチオール、２－ヒドロキシベンゼンチオール、ジヒドロリポ酸、Ｌ－シスチン、還元型グルタチオン、Ｌ－システイン、コエンザイムＡ、γ－グルタミルシステインであり、特に、γ－グルタミルシステインが最も好ましい。
【0015】
本発明組成物には、これらのチオール化合物の１種又は２種以上を配合することができる。
【0016】
本発明組成物におけるチオール化合物の配合量は、経口投与の場合、具体的用途、剤形、他の配合成分との兼ね合い等に応じて、適宜選択され、特に限定されるものではない。通常、経口投与剤の場合、全量に対して、０．００００１～９９質量％、好ましくは０．００１～９９質量％、特に好ましくは１～９９質量％の範囲で配合される。
【0017】
本発明のチオール化合物を含む組成物は、フリー体のＡＩＭ増加の目的で各種医薬品、食品、健康食品、動物用飼料等とすることが可能である。また摂取剤形としては特に制限されず、種々の形態とすることができ、具体的には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等経口投与のための形態とすることができる。そして製剤化に有用な賦形剤を適宜配合することができる。
【実施例】
【0018】
実施例、試験例を示し、本発明についてさらに説明する。
＜実施例１：チオール化合物による血中ＡＩＭ増加試験＞
１．チオール化合物
市販されている以下のチオール化合物を試験試料とした。
１－プロパンチオール、２－メチル－１－プロパンチオール、シクロペンタンチオール、２－ヒドロキシベンゼンチオール、ジヒドロリポ酸（以上東京化成工業株式会社）、Ｌ－シスチン（味の素ヘルシーサプライ株式会社）、還元型グルタチオン、Ｌ－システイン（以上富士フイルム和光純薬株式会社）、コエンザイムＡ（ナカライテスク株式会社）、γ－グルタミルシステイン（シグマアルドリッチジャパン合同会社）。
＜実施例１：チオール化合物による血中ＡＩＭ増加試験＞
１．チオール化合物
市販されている以下のチオール化合物を試験試料とした。
１－プロパンチオール、２－メチル－１－プロパンチオール、シクロペンタンチオール、２－ヒドロキシベンゼンチオール、ジヒドロリポ酸（以上東京化成工業株式会社）、Ｌ－シスチン（味の素ヘルシーサプライ株式会社）、還元型グルタチオン、Ｌ－システイン（以上富士フイルム和光純薬株式会社）、コエンザイムＡ（ナカライテスク株式会社）、γ－グルタミルシステイン（シグマアルドリッチジャパン合同会社）。
【0019】
２．フリー体ＡＩＭ増加効果確認試験
（１）試験方法
各化合物は、次の濃度になるようＰＢＳ（－）に溶解させ試験試料を調製した。Ｌ－シスチンはＰＢＳ（－）に難溶であるため、下記濃度でＰＢＳ（－）と混合し、１５００ｇ、１５℃で３分間遠心後、上清を回収し試験に使用した。
１－プロパンチオール ：１．０Ｖ／Ｖ％
２－メチル－１－プロパンチオール：１．０Ｖ／Ｖ％
シクロペンタンチオール ：１．０Ｖ／Ｖ％
２－ヒドロキシベンゼンチオール ：１０ｍｇ／ｍＬ
Ｌ－シスチン ：２ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ
Ｌ－システイン ：１ｍＭ、１０ｍＭ
ジヒドロリポ酸 ：１．０Ｖ／Ｖ％
コエンザイムＡ ：１．０ｍｇ／ｍＬ
還元型グルタチオン ：１０ｍｇ／ｍＬ
γ－グルタミルシステイン ：２．５μＭ
（１）試験方法
各化合物は、次の濃度になるようＰＢＳ（－）に溶解させ試験試料を調製した。Ｌ－シスチンはＰＢＳ（－）に難溶であるため、下記濃度でＰＢＳ（－）と混合し、１５００ｇ、１５℃で３分間遠心後、上清を回収し試験に使用した。
１－プロパンチオール ：１．０Ｖ／Ｖ％
２－メチル－１－プロパンチオール：１．０Ｖ／Ｖ％
シクロペンタンチオール ：１．０Ｖ／Ｖ％
２－ヒドロキシベンゼンチオール ：１０ｍｇ／ｍＬ
Ｌ－シスチン ：２ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ
Ｌ－システイン ：１ｍＭ、１０ｍＭ
ジヒドロリポ酸 ：１．０Ｖ／Ｖ％
コエンザイムＡ ：１．０ｍｇ／ｍＬ
還元型グルタチオン ：１０ｍｇ／ｍＬ
γ－グルタミルシステイン ：２．５μＭ
【0020】
ヒト血清とＰＢＳ（－）とを２：３の比率で混合し、血清希釈液を調製した。
試験試料溶液と血清希釈液を等容量で混合し、３７℃１時間インキュベートした。インキュベートしたものをフリー体ＡＩＭの増加を確認するウエスタンブロッティング用の試料とした。
試験試料溶液と血清希釈液を等容量で混合し、３７℃１時間インキュベートした。インキュベートしたものをフリー体ＡＩＭの増加を確認するウエスタンブロッティング用の試料とした。
【0021】
（２）ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティング用試料に４×ＬＤＳ試料用緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え混合し、１ウェルあたり血清が１μＬ含まれるようＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ ＭＰ Ｇｅｌ（ゲル濃度：５～２０％、ディー・アール・シー）にロードし、２００Ｖの定電圧でＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により試料中のタンパク質を分離した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ ＰＶＤＦ ０．４５、ＧＥヘルスケア）に転写した。
転写後のＰＶＤＦ膜をＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、続いてブロッキング溶液（５％スキムミルク／ＴＢＳＴ）に浸した後、室温で１時間振盪し、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理を行ったＰＶＤＦ膜は抗体希釈用緩衝液で希釈した抗体と４℃、１６～１８時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を３回ＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキング溶液で二次抗体を希釈して室温、１時間の条件で二次抗体反応を行った。なお、使用した抗体の希釈条件は以下の通りである。
一次抗体：抗ヒト／マウスＡＩＭ抗体 ｒａｂ１（１：３０００）（宮崎研究室で生産・非特許文献２等で使用）
二次抗体：抗ウサギ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（１：５０００）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
反応終了後、再度３回、ＴＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア）を基質として用い、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ（ＢｉｏＲａｄ）にてシグナルの検出・撮影を行った。
同様の操作を血清のみの試料（ＰＢＳ添加）についても行った。
ウエスタンブロッティング用試料に４×ＬＤＳ試料用緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え混合し、１ウェルあたり血清が１μＬ含まれるようＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ ＭＰ Ｇｅｌ（ゲル濃度：５～２０％、ディー・アール・シー）にロードし、２００Ｖの定電圧でＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により試料中のタンパク質を分離した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ ＰＶＤＦ ０．４５、ＧＥヘルスケア）に転写した。
転写後のＰＶＤＦ膜をＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、続いてブロッキング溶液（５％スキムミルク／ＴＢＳＴ）に浸した後、室温で１時間振盪し、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理を行ったＰＶＤＦ膜は抗体希釈用緩衝液で希釈した抗体と４℃、１６～１８時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を３回ＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキング溶液で二次抗体を希釈して室温、１時間の条件で二次抗体反応を行った。なお、使用した抗体の希釈条件は以下の通りである。
一次抗体：抗ヒト／マウスＡＩＭ抗体 ｒａｂ１（１：３０００）（宮崎研究室で生産・非特許文献２等で使用）
二次抗体：抗ウサギ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（１：５０００）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
反応終了後、再度３回、ＴＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア）を基質として用い、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ（ＢｉｏＲａｄ）にてシグナルの検出・撮影を行った。
同様の操作を血清のみの試料（ＰＢＳ添加）についても行った。
【0022】
（３）結果
ウエスタンブロッティングの撮影画像、及び各画像からデンシトメーターにより読み取った試験試料のフリー体ＡＩＭ相対量（ＰＢＳを１とする）を図１～１４に示す。なお比較対照として、ヒト血清とＰＢＳの混合物に試料に相当する容量のＰＢＳを添加したものをＰＢＳと略記して表示した。
図１～１４に示すとおり、血清には殆ど検出されないフリー体のＡＩＭに相当するバンドが試験試料のウエスタンブロットのバンドとして出現した。このバンドがフリー体のＡＩＭであることは非特許文献２等で使用している組み換えＡＩＭを電気泳動の対照とすることで確認できた。
ウエスタンブロッティングの撮影画像、及び各画像からデンシトメーターにより読み取った試験試料のフリー体ＡＩＭ相対量（ＰＢＳを１とする）を図１～１４に示す。なお比較対照として、ヒト血清とＰＢＳの混合物に試料に相当する容量のＰＢＳを添加したものをＰＢＳと略記して表示した。
図１～１４に示すとおり、血清には殆ど検出されないフリー体のＡＩＭに相当するバンドが試験試料のウエスタンブロットのバンドとして出現した。このバンドがフリー体のＡＩＭであることは非特許文献２等で使用している組み換えＡＩＭを電気泳動の対照とすることで確認できた。
【0023】
＜実施例２：Ｌ－シスチンの単回経口投与によるフリー体ＡＩＭ増加作用試験＞
（１）被検体
Ｌ－シスチン（純度９８％以上 味の素ヘルシーサプライ株式会社製）
（１）被検体
Ｌ－シスチン（純度９８％以上 味の素ヘルシーサプライ株式会社製）
【0024】
（２）試験方法
８週齢ＩＣＲマウス雄（日本クレア株式会社）を１週間飼育部屋で馴化飼育した後本試験に供した。なお本試験では、１群８匹のマウスを使用した。
Ｌ－シスチンは、０．５質量％のカルボキシメチルセルロースを溶解した水に２００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように分散懸濁させた。
試験当日、マウスの体重を測定し、その体重測定結果に基づいて、Ｌ－シスチン２０００ｍｇ／ｋｇ体重（１０ｍＬ）を、ゾンデを用いて単回経口投与した。またコントロール群は、０．５％カルボキシメチルセルロース含有水溶液を１０ｍL／ｋｇ・体重を同様に単回経口投与した。
投与０．５時間後にイソフルラン吸入麻酔下において、ＥＤＴＡ処理済みのシリンジで心採血を行った。得られた血液から遠心分離により血漿を単離した。
８週齢ＩＣＲマウス雄（日本クレア株式会社）を１週間飼育部屋で馴化飼育した後本試験に供した。なお本試験では、１群８匹のマウスを使用した。
Ｌ－シスチンは、０．５質量％のカルボキシメチルセルロースを溶解した水に２００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように分散懸濁させた。
試験当日、マウスの体重を測定し、その体重測定結果に基づいて、Ｌ－シスチン２０００ｍｇ／ｋｇ体重（１０ｍＬ）を、ゾンデを用いて単回経口投与した。またコントロール群は、０．５％カルボキシメチルセルロース含有水溶液を１０ｍL／ｋｇ・体重を同様に単回経口投与した。
投与０．５時間後にイソフルラン吸入麻酔下において、ＥＤＴＡ処理済みのシリンジで心採血を行った。得られた血液から遠心分離により血漿を単離した。
【0025】
（３）ウエスタンブロッティング
採取したマウス血漿とＰＢＳ（－）とを１：４の比率で混合し、血漿希釈液を調製した。この希釈液を、フリー体ＡＩＭの増加を確認するウエスタンブロッティング用の試料とした。
ウエスタンブロッティング用希釈血漿試料に４倍希釈したＬＤＳ試料用緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え混合した。次いで、１ウェルあたり血漿が１μＬ含まれるようＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ ＭＰ Ｇｅｌ（ゲル濃度：５～２０％、ディー・アール・シー）にロードし、２００Ｖの定電圧でＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により試料中のタンパク質を分離した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ ＰＶＤＦ ０．４５、ＧＥヘルスケア）に転写した。
転写後のＰＶＤＦ膜をＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、続いてブロッキング溶液（５％スキムミルク／ＴＢＳＴ）に浸した後、室温で１時間振盪し、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理を行ったＰＶＤＦ膜は、抗体希釈用緩衝液で希釈した抗体と４℃、１６～１８時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を３回ＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキング溶液で二次抗体を希釈して室温、１時間の条件で二次抗体反応を行った。
なお、使用した抗体の希釈倍率は以下の通りである。
一次抗体：抗ヒト／マウスＡＩＭ抗体 ｒａｂ１（宮崎研究室で生産・非特許文献２等で使用）１：３０００に希釈
二次抗体：抗ウサギ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）抗体ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）１：５０００に希釈
反応終了後、再度３回、ＴＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア）を基質として用い、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ （ＢｉｏＲａｄ） にてシグナルの検出・撮影を行った。
採取したマウス血漿とＰＢＳ（－）とを１：４の比率で混合し、血漿希釈液を調製した。この希釈液を、フリー体ＡＩＭの増加を確認するウエスタンブロッティング用の試料とした。
ウエスタンブロッティング用希釈血漿試料に４倍希釈したＬＤＳ試料用緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え混合した。次いで、１ウェルあたり血漿が１μＬ含まれるようＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ ＭＰ Ｇｅｌ（ゲル濃度：５～２０％、ディー・アール・シー）にロードし、２００Ｖの定電圧でＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により試料中のタンパク質を分離した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ ＰＶＤＦ ０．４５、ＧＥヘルスケア）に転写した。
転写後のＰＶＤＦ膜をＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、続いてブロッキング溶液（５％スキムミルク／ＴＢＳＴ）に浸した後、室温で１時間振盪し、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理を行ったＰＶＤＦ膜は、抗体希釈用緩衝液で希釈した抗体と４℃、１６～１８時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を３回ＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキング溶液で二次抗体を希釈して室温、１時間の条件で二次抗体反応を行った。
なお、使用した抗体の希釈倍率は以下の通りである。
一次抗体：抗ヒト／マウスＡＩＭ抗体 ｒａｂ１（宮崎研究室で生産・非特許文献２等で使用）１：３０００に希釈
二次抗体：抗ウサギ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）抗体ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）１：５０００に希釈
反応終了後、再度３回、ＴＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア）を基質として用い、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ （ＢｉｏＲａｄ） にてシグナルの検出・撮影を行った。
【0026】
（４）結果
ウエスタンブロッティングの撮影画像を図１５に示す。
図１５に示すとおり、コントロールでは僅かに検出されるフリー体ＡＩＭに相当するバンドがシスチンを経口投与した試験動物の血漿試料において増加した。
この画像からデンシトメーターにより読み取った試験試料のフリー体ＡＩＭ相対量（０．５％ＣＭＣ溶液投与の値を１とする）の平均値を図１６に示す。
ウエスタンブロッティングの撮影画像を図１５に示す。
図１５に示すとおり、コントロールでは僅かに検出されるフリー体ＡＩＭに相当するバンドがシスチンを経口投与した試験動物の血漿試料において増加した。
この画像からデンシトメーターにより読み取った試験試料のフリー体ＡＩＭ相対量（０．５％ＣＭＣ溶液投与の値を１とする）の平均値を図１６に示す。
【0027】
動物を用いた経口投与試験からチオール基を有する化合物であるＬ－シスチンは、経口投与することで血中のフリー体ＡＩＭを増加させることが確認できた。
【0028】
＜実施例３：Ｌ－シスチン単回経口投与によるフリー体ＡＩＭ増加作用（ヒト臨床試験）＞
（１）試験食品
精製Ｌ－シスチン（純度９８％以上 味の素ヘルシーサプライ株式会社製）を２．１ｇ含有する粉末
（１）試験食品
精製Ｌ－シスチン（純度９８％以上 味の素ヘルシーサプライ株式会社製）を２．１ｇ含有する粉末
【0029】
（２）試験方法
１）被験者
２０歳以上６５歳未満の健常成人男女１０人を被験者とした。
２）試験食品の摂取
各被験者に対し、１２時間以上の絶食後に、試験食品（Ｌ－シスチン粉末）を摂取直前に水１５０ｍｌに懸濁して全量摂取させた。なお、摂取前および摂取３０分後、１２０分後に採血を行った。また検査中は水以外の飲食を禁止とした。
３）採血
採血は、プレーン採血管（テルモ株式会社）を用いて行った。得られた血液を遠心分離により血清を単離した。
１）被験者
２０歳以上６５歳未満の健常成人男女１０人を被験者とした。
２）試験食品の摂取
各被験者に対し、１２時間以上の絶食後に、試験食品（Ｌ－シスチン粉末）を摂取直前に水１５０ｍｌに懸濁して全量摂取させた。なお、摂取前および摂取３０分後、１２０分後に採血を行った。また検査中は水以外の飲食を禁止とした。
３）採血
採血は、プレーン採血管（テルモ株式会社）を用いて行った。得られた血液を遠心分離により血清を単離した。
【0030】
（３）ウエスタンブロッティング
採取したヒト血清とＰＢＳ（－）とを１：４の比率で混合し、血清希釈液を調製した。
この希釈液を、フリー体ＡＩＭの増加を確認するウエスタンブロッティング用の試料とした。
ウエスタンブロッティング用に希釈した血清試料に４倍希釈したＬＤＳ試料用緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え混合した。次いで、１ウェルあたり血清が１μＬ含まれるようＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ ＭＰ Ｇｅｌ（ゲル濃度：５～２０％、ディー・アール・シー）にロードし、２００Ｖの定電圧でＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により試料中のタンパク質を分離した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ ＰＶＤＦ ０．４５、ＧＥヘルスケア）に転写した。
転写後のＰＶＤＦ膜をＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、続いてブロッキング溶液（５％スキムミルク／ＴＢＳＴ）に浸した後、室温で１時間振盪し、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理を行ったＰＶＤＦ膜は、抗体希釈用緩衝液で希釈した抗体と４℃、１６～１８時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を３回ＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキング溶液で二次抗体を希釈して室温、１時間の条件で二次抗体反応を行った。
なお、使用した抗体の希釈倍率は以下の通りである。
一次抗体：抗ヒト／マウスＡＩＭ抗体 ｒａｂ１（宮崎研究室で生産・非特許文献２等で使用）１：３０００に希釈
二次抗体：抗ウサギ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）抗体ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）１：５０００に希釈
反応終了後、再度３回、ＴＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア）を基質として用い、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ （ＢｉｏＲａｄ）にてシグナルの検出・撮影を行った。シグナル値を基に、試験食品の摂取前後のフリー体ＡＩＭ量の変化を対応のあるｔ検定（１標本ｔ検定）を用いて評価した。統計解析ソフトはＪＭＰ（登録商標）１４．０（ＳＡＳ社製）及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を使用した。
採取したヒト血清とＰＢＳ（－）とを１：４の比率で混合し、血清希釈液を調製した。
この希釈液を、フリー体ＡＩＭの増加を確認するウエスタンブロッティング用の試料とした。
ウエスタンブロッティング用に希釈した血清試料に４倍希釈したＬＤＳ試料用緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え混合した。次いで、１ウェルあたり血清が１μＬ含まれるようＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡ ＭＰ Ｇｅｌ（ゲル濃度：５～２０％、ディー・アール・シー）にロードし、２００Ｖの定電圧でＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により試料中のタンパク質を分離した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ ＰＶＤＦ ０．４５、ＧＥヘルスケア）に転写した。
転写後のＰＶＤＦ膜をＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、続いてブロッキング溶液（５％スキムミルク／ＴＢＳＴ）に浸した後、室温で１時間振盪し、ブロッキング処理を行った。
ブロッキング処理を行ったＰＶＤＦ膜は、抗体希釈用緩衝液で希釈した抗体と４℃、１６～１８時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦ膜を３回ＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキング溶液で二次抗体を希釈して室温、１時間の条件で二次抗体反応を行った。
なお、使用した抗体の希釈倍率は以下の通りである。
一次抗体：抗ヒト／マウスＡＩＭ抗体 ｒａｂ１（宮崎研究室で生産・非特許文献２等で使用）１：３０００に希釈
二次抗体：抗ウサギ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）抗体ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）１：５０００に希釈
反応終了後、再度３回、ＴＢＳＴで洗浄し、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥヘルスケア）を基質として用い、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ （ＢｉｏＲａｄ）にてシグナルの検出・撮影を行った。シグナル値を基に、試験食品の摂取前後のフリー体ＡＩＭ量の変化を対応のあるｔ検定（１標本ｔ検定）を用いて評価した。統計解析ソフトはＪＭＰ（登録商標）１４．０（ＳＡＳ社製）及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社製）を使用した。
【0031】
（４）結果
試験食摂取１２０分後の血清を用いたウエスタンブロッティングの撮影画像を図１７に示す。
図１７に示すとおり、シスチンを摂取していないヒトの血清には殆ど検出されないフリー体のＡＩＭに相当するバンドが、シスチンを経口投与した被験者の血清試料のウエスタンブロットには出現した。
この画像からデンシトメーターにより読み取った試験試料のフリー体ＡＩＭ相対量摂取前を１とした相対値の平均値を図１８に示す。
試験食摂取１２０分後の血清を用いたウエスタンブロッティングの撮影画像を図１７に示す。
図１７に示すとおり、シスチンを摂取していないヒトの血清には殆ど検出されないフリー体のＡＩＭに相当するバンドが、シスチンを経口投与した被験者の血清試料のウエスタンブロットには出現した。
この画像からデンシトメーターにより読み取った試験試料のフリー体ＡＩＭ相対量摂取前を１とした相対値の平均値を図１８に示す。
【0032】
図１８に示す通りシステインのチオール基がジスルフィド結合した化合物であるＬ－シスチンは、経口投与することでヒト血中ＡＩＭを有意に増加させることが確認できた。
【0033】
以上のインビトロ、インビボ試験及び人臨床試験の結果から、チオール基を有する化合物には、通常血中に存在しないフリー体のＡＩＭを増加させる作用があることがわかった。また、γ－グルタミルシステインは低濃度で強い活性を持つことが確認された。したがってチオール化合物による血中のフリー体ＡＩＭの増加により、急性腎障害、脂肪肝、肝細胞癌、肥満、真菌性腹膜炎、多発性硬化症等のフリー体ＡＩＭが関与する疾患の予防改善剤として期待される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
