特許 7530638 配列類似性１９、メンバーＡ５抗体を有する抗ファミリー及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-31

(45)【発行日】2024-08-08

(54)【発明の名称】配列類似性１９、メンバーＡ５抗体を有する抗ファミリー及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240801BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240801BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20240801BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240801BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240801BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240801BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240801BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240801BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240801BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240801BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240801BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240801BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240801BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240801BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61P25/04

A61P25/28

A61P43/00 121

C07K16/18

C07K16/46

C07K19/00

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/63 Z

C12P21/08

【請求項の数】 23

(21)【出願番号】P 2020557278

(86)(22)【出願日】2019-05-10

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-08-05

(86)【国際出願番号】 IB2019053895

(87)【国際公開番号】W WO2019215702

(87)【国際公開日】2019-11-14

【審査請求日】2020-10-16

【審判番号】

【審判請求日】2022-09-30

(31)【優先権主張番号】62/669,648

(32)【優先日】2018-05-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/838,187

(32)【優先日】2019-04-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】518156428

【氏名又は名称】ニューラクル サイエンス カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ボンチョル

(72)【発明者】

【氏名】キム，ウォンキュム

(72)【発明者】

【氏名】ヨン，ジョンウォン

(72)【発明者】

【氏名】チョン，ジュンホ

(72)【発明者】

【氏名】ジン，ジュンヨン

(72)【発明者】

【氏名】ユ，エウンウォイ

【合議体】

【審判長】長井 啓子

【審判官】小金井 悟

【審判官】高堀 栄二

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１１８２３０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００８年，ｖｏｌ．８，ｐ．６２０－６２６

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

C07K 1/00-19/00

C12N 15/00-15/90

A61K 39/00-39/44

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むヒトＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に特異的に結合する単離した単クローン性抗体又はその抗原結合部分（“抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体”）であって、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｖ）軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に提示されたアミノ酸配列を含み；及び（ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に提示されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、単離した単クローン性抗体又はその抗原結合部分。

【請求項2】

重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むヒトＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に特異的に結合する単離した単クローン性抗体又はその抗原結合部分（“抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体”）であって、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｖ）軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に提示されたアミノ酸配列を含み；及び（ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に提示されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、単離した単クローン性抗体又はその抗原結合部分。

【請求項3】

重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ヒトＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に特異的に結合する単離した単クローン性抗体又はその抗原結合部分（“抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体”）であって、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２８に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｖ）軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に提示されたアミノ酸配列を含み；及び（ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に提示されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、単離した単クローン性抗体又はその抗原結合部分。

【請求項4】

重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、３０又は３１に提示されたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％同じアミノ酸配列を含み；及び／又は、ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８又は３２に提示されたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％同じアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の抗体。

【請求項5】

抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に提示されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に提示されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む基準抗体と交差競合することを特徴とする、請求項１～４のいずれかに記載の抗体。

【請求項6】

抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に提示されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に提示されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む基準抗体と交差競合することを特徴とする、請求項１～４のいずれかに記載の抗体。

【請求項7】

抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に提示されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に提示されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む基準抗体と交差競合することを特徴とする、請求項１～４のいずれかに記載の抗体。

【請求項8】

抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、その変異体及びこれらの任意の組合せからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１～７のいずれかに記載の抗体。

【請求項9】

キメラ抗体又はヒト化した抗体である、請求項１～８のいずれかに記載の抗体。

【請求項10】

Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１～９のいずれかに記載の抗体。

【請求項11】

ｓｃＦＶである、請求項１０に記載の抗体。

【請求項12】

ｓｃＦｖはＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、３０又は３１に提示されたアミノ酸配列を含み、及びＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８又は３２に提示されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の抗体。

【請求項13】

次の特性のいずれか１つ以上を表す、請求項１～１２のいずれかに記載の抗体：
（ａ）酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）によって測定される時、１０ｎＭ以下のＫ_Ｄ で、可溶性ヒトＦＡＭ１９Ａ５に結合し；
（ｂ）ＥＬＩＳＡによって測定される時、１０ｎＭ以下のＫ_Ｄ で、膜結合したヒトＦＡＭ１９Ａ５に結合し；
（ｃ）反応性神経膠症の発病を減少、逆転、遅延及び／又は予防し；
（ｄ）反応性星状細胞の過度な増殖を抑制し；
（ｅ）ニューロカン及びニューロン膠抗原２（ＮＧ２）を含むコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現を減少させ；
（ｆ）ニューロンの核でｃ－ｆｏｓ及びｐＥＲＫの発現を増加させ；
（ｇ）ニューロンの生存を促進し；
（ｈ）ニューロンでＧＡＰ４３の発現を増加させ；
（ｉ）軸索の再成長を促進し；及び
（ｊ）大食細胞又は小膠細胞の食作用を向上させる。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれか一項の抗体を暗号化する核酸。

【請求項15】

請求項１４の核酸を含むベクター。

【請求項16】

請求項１５のベクターを含む細胞。

【請求項17】

製剤に連結された請求項１～１３のいずれか一項の抗体を含む免疫接合体。

【請求項18】

請求項１～１３のいずれか一項の抗体、請求項１４の核酸、請求項１５のベクター、請求項１６の細胞又は請求項１７の免疫接合体及び担体を含む組成物。

【請求項19】

請求項１～１３のいずれか一項の抗体、請求項１４の核酸、請求項１５のベクター、請求項１６の細胞又は請求項１７の免疫接合体及び使用説明書を含むキット。

【請求項20】

適切な条件下で請求項１６の細胞を培養して抗体を単離させる段階を含む、ヒトＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に特異的に結合する抗体の製造方法。

【請求項21】

必要とする対象で疾患又は病態を治療する、請求項１～１３のいずれかに記載の抗体。

【請求項22】

追加の治療剤を投与することを特徴とする、請求項２１に記載の抗体。

【請求項23】

追加の治療剤が化学療法、免疫療法、放射線療法又はこれらの組合せを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願と共に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイル（ファイル名：３７６３＿０１１ＰＣ０２＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：３４，３０９バイト；及び生成日：２０１９年５月１０日）に電子的に提出された配列目録の内容はその全体が本明細書に参照として含まれる。

【0002】

本発明は、配列類似性１９、メンバーＡ５（ＦＡＭ１９Ａ５）を有するファミリーに特異的に結合する（例えば、脱免疫化された）抗体、該抗体を含む組成物、及び中枢神経系損傷のようなものによる障害又は疾患を予防又は治療するために対象に当該抗体を使用する方法を提供する。

【背景技術】

【0003】

ＦＡＭ１９Ａ５は５個の高度に相同性である小さなタンパク質で構成されたタンパク質のＴＡＦＡサブファミリーのメンバーである。Ｔａｎｇ Ｔ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８３（４）：７２７－３４（２００４）。これらのタンパク質は固定した位置に保存されたシステイン残基を含有し、ＣＣ－ケモカインファミリーのメンバーである大食細胞炎症性タンパク質１－アルファ（ＭＩＰ－１－アルファ）と遠い関係にある。ＴＡＦＡタンパク質は主に脳及び脊髄の特定領域で発現する。これらのタンパク質は神経発生過程で成体神経幹細胞によって生成され分泌されると考えられる。

【0004】

ＦＡＭ１９Ａ５は脊椎動物の脳で主に発現し、ＦＡＭ１９Ａ５は完全な中枢神経系の発達、分化、形成に重要であり、中枢神経系の損傷及び／又は疾病の予防又は治療に利用可能なものと考えられる。米国特許公開第２０１５／０１１８２３０号。

【0005】

ＦＡＭ１９Ａ５を抑制することは中枢神経系を治療するのに重要な役割を果たし得るが、ＦＡＭ１９Ａ５に特異的に結合してＦＡＭ１９Ａ５活性を調節できる抗体を開発する必要が依然として残っている。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、配列類似性１９、メンバーＡ５（ＦＡＭ１９Ａ５）タンパク質を有するヒトファミリーに特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分（“抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体”）を提供する。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ここで、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６及び７に提示されたアミノ酸配列を含み、これらのそれぞれは任意に１個、２個又は３個の突然変異を有し；ここで、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、９及び１０のアミノ酸配列を含み；軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のうち少なくとも１つは１個、２個又は３個の突然変異を含み；並びに、ここで、抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１として提示されたＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２として提示されたＶＬを含む基準抗体に比べてヒトにおいて免疫原性が減少している。一部の実施形態において、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に提示されたアミノ酸配列（ＧＳＡＳＹＩＴＡＡＴＩＤＡ）を含む。一部の実施形態において、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＳＹＱＭＧ）に提示されたアミノ酸配列を任意に１個、２個又は３個の突然変異と共に含む。一部の実施形態において、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に提示されたアミノ酸配列（ＶＩＮＫＳＧＳＤＴＳ）を任意に１個、２個又は３個の突然変異と共に含む。

【0007】

一部の実施形態において、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に提示されたアミノ酸配列（ＧＮＤＤＹＳＳＤＳＧＹＶＧＶ）を任意に１個、２個又は３個の突然変異と共に含む。

【0008】

一部の実施形態において、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に提示されたアミノ酸配列（ＳＧＧＧＳＳＧＹＧＹＧ）を１個、２個又は３個の突然変異と共に含む。一部の実施形態において、突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸４においてグリシンが脂肪族アミノ酸に置換されたものを含む。特定の実施形態において、脂肪族アミノ酸はアラニン、バリン、ロイシン又はイソロイシンを含む。

【0009】

一部の実施形態において、軽鎖ＣＤＲ２は１個、２個又は３個の突然変異と共にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ＷＮＤＫＲＰＳ）に提示されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸１においてトリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）が塩基性アミノ酸に置換されたものを含む。特定の実施形態において、塩基性アミノ酸はアルギニン、ヒスチジン又はリシンを含む。一部の実施形態において、突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸２においてアスパラギンが酸性アミノ酸に置換されたものを含む。一部の実施形態において、酸性アミノ酸はアスパラギン酸又はグルタミン酸を含む。一部の実施形態において、突然変異はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸４においてリシンが酸性アミノ酸に置換されたものを含む。特定の実施形態において、酸性アミノ酸はアスパラギン酸又はグルタミン酸を含む。

【0010】

一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、及び軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に提示されたアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に提示されたアミノ酸配列を含み、（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に提示されたアミノ酸配列を含み、（ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に提示されたアミノ酸配列を含み、（ｖ）軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に提示されたアミノ酸配列を含み、及び（ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に提示されたアミノ酸配列を含む。

【0011】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に提示されたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％同じアミノ酸配列を含み；及び／又は、ここで、ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に提示されたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％同じアミノ酸配列を含む。

【0012】

一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む基準抗体と交差競合し、ここで、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に提示されたアミノ酸配列を含み、及びＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に提示されたアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む基準抗体と交差競合し、ここで、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に提示されたアミノ酸配列を含み、及びＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に提示されたアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む基準抗体と交差競合し、ここで、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に提示されたアミノ酸配列を含み、及びＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に提示されたアミノ酸配列を含む。更なる実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む基準抗体と交差競合し、ここで、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に提示されたアミノ酸配列を含み、ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に提示されたアミノ酸配列を含む。

【0013】

一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、その変異体及びこれらの任意の組合せからなる群から選ばれる。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化した抗体である。

【0014】

一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又は単鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ）Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体はｓｃＦｖである。特定の実施形態において、ｓｃＦｖはＶＨ及びＶＬを含み、ここで、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に提示されたアミノ酸配列を含み、及びＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に提示されたアミノ酸配列を含む。

【0015】

一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、次の特性のいずれか１つ以上を表す：（ａ）酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）によって測定される時、１０ｎＭ以下のＫＤを有する可溶性ヒトＦＡＭ１９Ａ５に結合し；（ｂ）ＥＬＩＳＡによって測定される時、１０ｎＭ以下のＫＤを有する膜結合したヒトＦＡＭ１９Ａ５に結合し；（ｃ）反応性神経膠症（ｇｌｉｏｓｉｓ）の発病を減少、逆転、遅延及び／又は予防し；（ｄ）反応性星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）の過度な増殖を抑制し；（ｅ）ニューロカン（ｎｅｕｒｏｃａｎ）及びニューロン膠（ｎｅｕｒｏｎ－ｇｌｉａｌ）抗原２（ＮＧ２）を含むコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現を減少させ；（ｆ）ニューロンの核でｃ－ｆｏｓ及びｐＥＲＫの発現を増加させ；（ｇ）ニューロンの生存を促進し；（ｈ）ニューロンでＧＡＰ４３の発現を増加させ；（ｉ）軸索（ａｘｏｎ）の再成長を促進し；（ｊ）例えば、腫瘍で血管の正常化を誘導し；（ｋ）腫瘍の成長を抑制し；（ｌ）免疫細胞の腫瘍への浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を向上させ；（ｍ）ニューロン細胞の腫瘍への浸潤を向上させ；（ｎ）大食細胞又は小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）の食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を向上させ；（ｏ）大食細胞又は小膠細胞のミトコンドリア膜電位を増加させ；（ｐ）骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の腫瘍への補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を減少させ；（ｑ）腫瘍で壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）及び浮腫（ｅｄｅｍａ）を減少させ；（ｒ）腫瘍の組織透過性を減少させ；及び（ｓ）腫瘍で血流量を増加させる。

【0016】

本発明ではまた、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体、核酸を含むベクター、ベクターを含む細胞及び本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を含む免疫接合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を暗号化する核酸が提供される。本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体、核酸、ベクター、細胞又は免疫接合体を含む組成物及び担体も本明細書に開示される。本発明はまた、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体、核酸、ベクター、細胞又は本発明の免疫接合体を含むキット及び使用説明書を提供する。

【0017】

本発明はまた、適切な条件下で本明細書に開示された細胞を培養して抗体を単離させることを含み、ヒトＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に特異的に結合する抗体を生成する方法も提供する。

【0018】

本発明は、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体、核酸、ベクター、細胞又は免疫接合体を投与することを含む、これを必要とする対象で疾患又は病態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を治療する方法をさらに提供する。一部の実施形態において、疾患又は病態は、腫瘍、線維症、緑内障、気分障害、神経退行性疾患（例えば、アルツハイマー病）、脳卒中又は神経病性疼痛を含む。特定の実施形態において、疾患又は病態は腫瘍である。

【0019】

一部の実施形態において、腫瘍は、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）、膵癌、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）、乳癌、リンパ腫、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、線維肉腫（ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ）、結腸腺癌腫（ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝癌又は卵巣癌を含む。特定の実施形態において、神経膠腫は多形膠芽細胞腫（ＧＢＭ）である。

【0020】

一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体、核酸、ベクター、細胞又は免疫接合体は、血管の正常化を誘導する。特定の実施形態において、血管の正常化は、増加した連結性、増加した壁厚、減少した血管径、より規則的な血管方向及び分布パターン、増加した血管数、漏れ及び透過性の減少、血管での血管周囲細胞適用範囲（ｐｅｒｉｃｙｔｅ ｃｏｖｅｒａｇｅ）及び近接性の増加、酸素化増加又はこれらの組合せを含む血管の特性変化を伴う。

【0021】

一部の実施形態において、本明細書の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体、核酸、ベクター、細胞又は免疫接合体は、腫瘍の成長を抑制する。

【0022】

一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体、核酸、ベクター、細胞又は免疫接合体は、免疫細胞の腫瘍への浸潤を向上させる。特定の実施形態において、免疫細胞は大食細胞、樹状（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ）細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、自然殺害（ＮＫ）細胞又はこれらの組合せを含む。一部の実施形態において、免疫細胞は肥大（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）をさらに示す。一部の実施形態において、腫瘍への免疫細胞の強化された浸潤は、腫瘍へのニューロン細胞の浸潤増加を伴う。特定の実施形態において、ニューロン細胞は、星状細胞、神経膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）又はこれらの組合せを含む。

【0023】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体、核酸、ベクター、細胞又は免疫接合体は、大食細胞又は小膠細胞の食作用を向上させる。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体、核酸、ベクター、細胞又は免疫接合体は、大食細胞又は小膠細胞のミトコンドリア膜電位を増加させる。

【0024】

一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体、核酸、ベクター、細胞又は免疫接合体は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の腫瘍への補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）を減少させる。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体、核酸、ベクター、細胞又は免疫接合体は、腫瘍の壊死及び浮腫を減少させる。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体、核酸、ベクター、細胞又は免疫接合体は、腫瘍の組織透過性を減少させる。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体、核酸、ベクター、細胞又は免疫接合体は、腫瘍で血流速度を増加させる。

【0025】

一部の実施形態において、疾患又は障害を治療する方法は追加の治療剤を投与する段階をさらに含む。特定の実施形態において、治療方法は、化学療法、免疫療法、放射線療法又はこれらの組合せを含む。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1A】図１Ａ及び図１Ｂは、下記脱免疫化された１－６５抗体に対する１－６５抗体の重鎖可変領域（図１Ａ）及び軽鎖可変領域（図１Ｂ）の配列整列を提供する：（ｉ）ＳＳ０１－１３；（ｉｉ）ＳＳ０１－１３－ｓ５；及び（ｉｉｉ）Ｓ５－ＳＧ（本明細書においてＳ５－２．ＧＫＮＧ抗体又は１－６５－Ｓ５３Ｇ抗体とも記述される。）。重鎖及び軽鎖ＣＤＲ及びＦＲは図１Ａ及び図１Ｂに表示されている。

【図1B】図１Ａ及び図１Ｂは、下記脱免疫化された１－６５抗体に対する１－６５抗体の重鎖可変領域（図１Ａ）及び軽鎖可変領域（図１Ｂ）の配列整列を提供する：（ｉ）ＳＳ０１－１３；（ｉｉ）ＳＳ０１－１３－ｓ５；及び（ｉｉｉ）Ｓ５－ＳＧ（本明細書においてＳ５－２．ＧＫＮＧ抗体又は１－６５－Ｓ５３Ｇ抗体とも記述される。）。重鎖及び軽鎖ＣＤＲ及びＦＲは図１Ａ及び図１Ｂに表示されている。

【図2】図２は、１－６５抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）（上位３行）及び重鎖可変領域（ＶＨ）（下位３行）の潜在的免疫原性部位を確認する。ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に該当し、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に該当する。１－６５抗体のフレームワーク領域に用いられたヒトジャームライン（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）に対する配列も提示されている：ＶＬ＝免疫グロブリンラムダ可変３－２５（ＩＧＬＶ３－２５^＊０２）及び免疫グロブリンラムダ結合２（ＩＧＬＪ２^＊０１；ＶＨ＝免疫グロブリン重鎖可変３－２３（ＩＧＨＶ３－２３^＊０２）及び免疫グロブリン重鎖結合１（ＩＧＨＪ１^＊０１）。用いられたヒトジャームラインは１－６５クローンに対して最も相同的なヒトジャームライン（ＩｇＢＬＡＳＴ、ＮＣＢＩ）であった。ＩＴＯＰＥ^ＴＭ分析によって決定されたように、高い及び中間程度の免疫原性潜在力を有する無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドが提示されている。具体的に、高い免疫原性潜在力を有するＭＨＣＩＩ結合ペプチドは次の通りである：（ｉ）ペプチド＃２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の残基４６－５４（ＩＹＷＮＤＫＲＰＳ）、（ｉｉ）ペプチド＃８：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８－５６の残基：１１（ＶＧＶＩＮＫＳＧＳ）、（ｉｉｉ）ペプチド＃１０：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基７９－８７（ＶＲＬＱＬＮＮＬＲ）；及び（ｉｖ）ペプチド＃１３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基１０３－１１１（ＹＩＴＡＡＴＩＤＡ）。適当な免疫原性潜在力を有するＭＨＣＩＩ結合性ペプチドは次の通りである：（ｉ）ペプチド＃１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の残基１６－２４（ＶＫＩＴＣＳＧＧＧ）；（ｉｉ）ペプチド＃３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の残基７１－７９（ＬＴＩＴＧＶＱＡＥ）；（ｉｉｉ）ペプチド＃４：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基１８－２６（ＬＳＬＶＣＫＡＳＧ）；（ｉｖ）ペプチド＃５：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基２０－２８（ＬＶＣＫＡＳＧＦＴ）；（ｖ）ペプチド＃６：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基３２－４０（ＹＱＭＧＷＶＲＱＡ）；（ｖｉ）ペプチド＃７：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基４５－５３（ＬＥＷＶＧＶＩＮＫ）；（ｖｉｉ）ペプチド＃９：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基６４－７２（ＶＫＧＲＡＴＩＳＲ）；（ｖｉｉｉ）ペプチド＃１１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基８１－８７（ＬＱＬＮＮＬＲ）；（ｉｘ）ペプチド＃１２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基８６－９４（ＬＲＡＥＤＴＧＴＹ）。Ｔ細胞エピトープデータベースからの相同性ペプチドは次の通りである：ペプチド＃５、ペプチド＃６、ペプチド＃９及びペプチド＃１２。総１３個の結合ペプチドが確認され、これはペプチド＃１～＃１３と表示される。それぞれの結合ペプチドに対する“Ｐ１”は第１アンカー位置を示す。

【図3A】図３Ａ及び図３Ｂは、脱免疫化された１－６５抗体の結合分析を提供する。抗体を脱免疫化させるために、クローン１－６５のＭＨＣクラスＩＩ結合領域で同一でないアミノ酸残基は、ヒトジャームライン配列で相応するアミノ酸に置換された。図３Ａは、次のうち、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）の配列比較を提供する：（ｉ）正常１－６５抗体（“クローン１－６５”）、（ｉｉ）完全に脱免疫化された１－６５抗体（“完全脱免疫化されたクローン１－６５”）、及び（ｉｉｉ）２個のアミノ酸（残基２３（ＦＲ１領域）及び残基５４（ＨＣＤＲ２領域）及びＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）の残基５４（ＨＣＤＲ２領域）を除いて脱免疫化されたもの（“脱免疫化されたクローン３－２”）。“脱免疫化されたクローン３－２”抗体はまた、本明細書において“ＳＳ０１－１３－ｓ５”抗体と記述される（例えば、図１Ａ及び図１Ｂ参照）。ＩＴＯＰＥ^ＴＭ分析によって決定された通り、高い及び中間程度の免疫原性潜在力を有するアミノ酸残基はボックスで表示され、それぞれ“１”及び“２”と表示される。図３Ｂは、（ｉ）正常１－６５抗体、（ｉｉ）完全に脱免疫化された１－６５抗体、及び（ｉｉｉ）一つのアミノ酸を除いて重鎖ＣＤＲ２（“脱免疫化されたクローン－１－６５”）抗体ＥＬＩＳＡによって測定されたＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する抗体。（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡによって測定された通り、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する重鎖ＣＤＲ２抗体を有する一つのアミノ酸を除いて脱免疫化されたもの（“脱免疫化されたクローン－１－６５”）の結合比較を示す。ファージを表示するそれぞれの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をＦＡＭ１９Ａ５（黒四角）又は抗ＨＡ抗体（□）でコーティングされた微量定量（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートのウェルに添加した。ＢＳＡでコーティングされた対照ウェルで背景信号を測定した。ウェルをＨＲＰ－共役結合した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗Ｍ１３抗体で調査（ｐｒｏｂｅ）した。４０５ｎｍでの吸光度を測定した。結果は、４回行われた実験から得られた平均±ＳＤとして表示される。

【図3B】図３Ａ及び図３Ｂは、脱免疫化された１－６５抗体の結合分析を提供する。抗体を脱免疫化させるために、クローン１－６５のＭＨＣクラスＩＩ結合領域で同一でないアミノ酸残基は、ヒトジャームライン配列で相応するアミノ酸に置換された。図３Ａは、次のうち、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）の配列比較を提供する：（ｉ）正常１－６５抗体（“クローン１－６５”）、（ｉｉ）完全に脱免疫化された１－６５抗体（“完全脱免疫化されたクローン１－６５”）、及び（ｉｉｉ）２個のアミノ酸（残基２３（ＦＲ１領域）及び残基５４（ＨＣＤＲ２領域）及びＶＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）の残基５４（ＨＣＤＲ２領域）を除いて脱免疫化されたもの（“脱免疫化されたクローン３－２”）。“脱免疫化されたクローン３－２”抗体はまた、本明細書において“ＳＳ０１－１３－ｓ５”抗体と記述される（例えば、図１Ａ及び図１Ｂ参照）。ＩＴＯＰＥ^ＴＭ分析によって決定された通り、高い及び中間程度の免疫原性潜在力を有するアミノ酸残基はボックスで表示され、それぞれ“１”及び“２”と表示される。図３Ｂは、（ｉ）正常１－６５抗体、（ｉｉ）完全に脱免疫化された１－６５抗体、及び（ｉｉｉ）一つのアミノ酸を除いて重鎖ＣＤＲ２（“脱免疫化されたクローン－１－６５”）抗体ＥＬＩＳＡによって測定されたＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する抗体。（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡによって測定された通り、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する重鎖ＣＤＲ２抗体を有する一つのアミノ酸を除いて脱免疫化されたもの（“脱免疫化されたクローン－１－６５”）の結合比較を示す。ファージを表示するそれぞれの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をＦＡＭ１９Ａ５（黒四角）又は抗ＨＡ抗体（□）でコーティングされた微量定量（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートのウェルに添加した。ＢＳＡでコーティングされた対照ウェルで背景信号を測定した。ウェルをＨＲＰ－共役結合した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗Ｍ１３抗体で調査（ｐｒｏｂｅ）した。４０５ｎｍでの吸光度を測定した。結果は、４回行われた実験から得られた平均±ＳＤとして表示される。

【図4A】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、及び図４Ｄは、下記のように２個の異なる脱免疫化された１－６５抗体の分析を提供する：（ｉ）図３Ａ及び図３Ｂに示したのと同じ脱免疫化された抗体である“脱免疫化されたクローン１－６５”；及び（ｉｉ）ＨＣＤＲ２で潜在的なＮ－グリコシル化部位を除去するように変形された以外は“脱免疫化されたクローン１－６５”と同じ“脱免疫化されたクローンＳ５－ＳＧ”（“Ｓ５－ＳＧ”）（ＨＣＤＲ２のアミノ酸５においてＳ～Ｇ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基５４）、“＊”で識別される。）。図４Ａ及び図４Ｂは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて測定された抗体のサイズ及び発現レベルを示す。図４Ａで、レーン“１”及び“２”はそれぞれ、抗体ＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧに相応する。レーン“１”及び“２”内で、“Ａ”及び“Ｂ”はそれぞれ、遠心分離前及び遠心分離後に相応する。図４Ｂで、左側パネルは減少するＳＤＳ－ＰＡＧＥを示し、右側パネルは非減少ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。図４Ｃは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）の配列比較を提供する。図４Ｄは、（ｉ）正常１－６５抗体（“クローン１－６５”）、（ｉｉ）脱免疫化された１－６５抗体（本発明においてＳＳ０１－１３－Ｓ５抗体とも記述される。）及び（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡによって測定された通り、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する脱免疫化されたクローンＳ５－ＳＧ抗体の結合比較を示す。ファージを表す各単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をＦＡＭ１９Ａ５（黒四角）又は抗ＨＡ抗体（□）でコーティングされた微量定量プレートのウェルに添加した。ＢＳＡでコーティングされた対照ウェルで背景信号を測定した。ウェルはＨＲＰ－共役結合した抗Ｍ１３抗体で調査された。４０５ｎｍで吸光度を測定した。結果は、４回行われた実験から得られた平均±ＳＤとして表示される。

【図4B】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、及び図４Ｄは、下記のように２個の異なる脱免疫化された１－６５抗体の分析を提供する：（ｉ）図３Ａ及び図３Ｂに示したのと同じ脱免疫化された抗体である“脱免疫化されたクローン１－６５”；及び（ｉｉ）ＨＣＤＲ２で潜在的なＮ－グリコシル化部位を除去するように変形された以外は“脱免疫化されたクローン１－６５”と同じ“脱免疫化されたクローンＳ５－ＳＧ”（“Ｓ５－ＳＧ”）（ＨＣＤＲ２のアミノ酸５においてＳ～Ｇ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基５４）、“＊”で識別される。）。図４Ａ及び図４Ｂは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて測定された抗体のサイズ及び発現レベルを示す。図４Ａで、レーン“１”及び“２”はそれぞれ、抗体ＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧに相応する。レーン“１”及び“２”内で、“Ａ”及び“Ｂ”はそれぞれ、遠心分離前及び遠心分離後に相応する。図４Ｂで、左側パネルは減少するＳＤＳ－ＰＡＧＥを示し、右側パネルは非減少ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。図４Ｃは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）の配列比較を提供する。図４Ｄは、（ｉ）正常１－６５抗体（“クローン１－６５”）、（ｉｉ）脱免疫化された１－６５抗体（本発明においてＳＳ０１－１３－Ｓ５抗体とも記述される。）及び（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡによって測定された通り、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する脱免疫化されたクローンＳ５－ＳＧ抗体の結合比較を示す。ファージを表す各単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をＦＡＭ１９Ａ５（黒四角）又は抗ＨＡ抗体（□）でコーティングされた微量定量プレートのウェルに添加した。ＢＳＡでコーティングされた対照ウェルで背景信号を測定した。ウェルはＨＲＰ－共役結合した抗Ｍ１３抗体で調査された。４０５ｎｍで吸光度を測定した。結果は、４回行われた実験から得られた平均±ＳＤとして表示される。

【図4C】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、及び図４Ｄは、下記のように２個の異なる脱免疫化された１－６５抗体の分析を提供する：（ｉ）図３Ａ及び図３Ｂに示したのと同じ脱免疫化された抗体である“脱免疫化されたクローン１－６５”；及び（ｉｉ）ＨＣＤＲ２で潜在的なＮ－グリコシル化部位を除去するように変形された以外は“脱免疫化されたクローン１－６５”と同じ“脱免疫化されたクローンＳ５－ＳＧ”（“Ｓ５－ＳＧ”）（ＨＣＤＲ２のアミノ酸５においてＳ～Ｇ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基５４）、“＊”で識別される。）。図４Ａ及び図４Ｂは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて測定された抗体のサイズ及び発現レベルを示す。図４Ａで、レーン“１”及び“２”はそれぞれ、抗体ＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧに相応する。レーン“１”及び“２”内で、“Ａ”及び“Ｂ”はそれぞれ、遠心分離前及び遠心分離後に相応する。図４Ｂで、左側パネルは減少するＳＤＳ－ＰＡＧＥを示し、右側パネルは非減少ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。図４Ｃは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）の配列比較を提供する。図４Ｄは、（ｉ）正常１－６５抗体（“クローン１－６５”）、（ｉｉ）脱免疫化された１－６５抗体（本発明においてＳＳ０１－１３－Ｓ５抗体とも記述される。）及び（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡによって測定された通り、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する脱免疫化されたクローンＳ５－ＳＧ抗体の結合比較を示す。ファージを表す各単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をＦＡＭ１９Ａ５（黒四角）又は抗ＨＡ抗体（□）でコーティングされた微量定量プレートのウェルに添加した。ＢＳＡでコーティングされた対照ウェルで背景信号を測定した。ウェルはＨＲＰ－共役結合した抗Ｍ１３抗体で調査された。４０５ｎｍで吸光度を測定した。結果は、４回行われた実験から得られた平均±ＳＤとして表示される。

【図4D】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、及び図４Ｄは、下記のように２個の異なる脱免疫化された１－６５抗体の分析を提供する：（ｉ）図３Ａ及び図３Ｂに示したのと同じ脱免疫化された抗体である“脱免疫化されたクローン１－６５”；及び（ｉｉ）ＨＣＤＲ２で潜在的なＮ－グリコシル化部位を除去するように変形された以外は“脱免疫化されたクローン１－６５”と同じ“脱免疫化されたクローンＳ５－ＳＧ”（“Ｓ５－ＳＧ”）（ＨＣＤＲ２のアミノ酸５においてＳ～Ｇ（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基５４）、“＊”で識別される。）。図４Ａ及び図４Ｂは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて測定された抗体のサイズ及び発現レベルを示す。図４Ａで、レーン“１”及び“２”はそれぞれ、抗体ＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧに相応する。レーン“１”及び“２”内で、“Ａ”及び“Ｂ”はそれぞれ、遠心分離前及び遠心分離後に相応する。図４Ｂで、左側パネルは減少するＳＤＳ－ＰＡＧＥを示し、右側パネルは非減少ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。図４Ｃは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）の配列比較を提供する。図４Ｄは、（ｉ）正常１－６５抗体（“クローン１－６５”）、（ｉｉ）脱免疫化された１－６５抗体（本発明においてＳＳ０１－１３－Ｓ５抗体とも記述される。）及び（ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡによって測定された通り、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する脱免疫化されたクローンＳ５－ＳＧ抗体の結合比較を示す。ファージを表す各単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をＦＡＭ１９Ａ５（黒四角）又は抗ＨＡ抗体（□）でコーティングされた微量定量プレートのウェルに添加した。ＢＳＡでコーティングされた対照ウェルで背景信号を測定した。ウェルはＨＲＰ－共役結合した抗Ｍ１３抗体で調査された。４０５ｎｍで吸光度を測定した。結果は、４回行われた実験から得られた平均±ＳＤとして表示される。

【図5A】図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃは、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する抗体１－６５（図５Ａ）、ＳＳ０１－１３－Ｓ５（図５Ｂ）及びＳ５－ＳＧ（図５Ｃ）の結合に対するＳＰＲ試験結果を提供する。各図５Ａ～図５Ｃにおいて、センサグラムは上段に提供され、抗体の結合親和度の定量的値（ｋａ、ｋｄ、Ｋ_Ｄ及びＲｍａｘ）は下段の表に提供される。

【図5B】図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃは、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する抗体１－６５（図５Ａ）、ＳＳ０１－１３－Ｓ５（図５Ｂ）及びＳ５－ＳＧ（図５Ｃ）の結合に対するＳＰＲ試験結果を提供する。各図５Ａ～図５Ｃにおいて、センサグラムは上段に提供され、抗体の結合親和度の定量的値（ｋａ、ｋｄ、Ｋ_Ｄ及びＲｍａｘ）は下段の表に提供される。

【図5C】図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃは、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する抗体１－６５（図５Ａ）、ＳＳ０１－１３－Ｓ５（図５Ｂ）及びＳ５－ＳＧ（図５Ｃ）の結合に対するＳＰＲ試験結果を提供する。各図５Ａ～図５Ｃにおいて、センサグラムは上段に提供され、抗体の結合親和度の定量的値（ｋａ、ｋｄ、Ｋ_Ｄ及びＲｍａｘ）は下段の表に提供される。

【図6A】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ及び図６Ｄは、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する１－６５、ＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧ抗体の結合に対するＥＬＩＳＡ結果を提供する。図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃはそれぞれ、様々な濃度の抗体に対する棒グラフであり、抗体１－６５、ＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧに対する結果を示す。図６Ｄは、抗体に対するＥＣ５０値を含む表を提供する。

【図6B】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ及び図６Ｄは、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する１－６５、ＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧ抗体の結合に対するＥＬＩＳＡ結果を提供する。図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃはそれぞれ、様々な濃度の抗体に対する棒グラフであり、抗体１－６５、ＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧに対する結果を示す。図６Ｄは、抗体に対するＥＣ５０値を含む表を提供する。

【図6C】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ及び図６Ｄは、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する１－６５、ＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧ抗体の結合に対するＥＬＩＳＡ結果を提供する。図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃはそれぞれ、様々な濃度の抗体に対する棒グラフであり、抗体１－６５、ＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧに対する結果を示す。図６Ｄは、抗体に対するＥＣ５０値を含む表を提供する。

【図6D】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ及び図６Ｄは、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する１－６５、ＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧ抗体の結合に対するＥＬＩＳＡ結果を提供する。図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃはそれぞれ、様々な濃度の抗体に対する棒グラフであり、抗体１－６５、ＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧに対する結果を示す。図６Ｄは、抗体に対するＥＣ５０値を含む表を提供する。

【図7A】図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃは、処理後、ＢＶ２細胞によるＰＨＲＯＤＯ^ＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓの食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ）吸収の比較を提供する。ＢＶ２細胞は次のいずれか一つで処理された：（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ヒトＦＡＭ１９Ａ５－Ｆｃタンパク質単独（０μｇ／ｍＬグループ）、又は（ｉｉｉ）１－６５（図７Ａ）、ＳＳ０１－１３－Ｓ５（図７Ｂ）又はＳ５－ＳＧ（図７Ｃ）抗体の様々な濃度（３．１２５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ又は２５μｇ／ｍＬ）と組み合わせられたヒトＦＡＭ１９Ａ５－Ｆｃタンパク質。データは平均±Ｓ．Ｄとして表示される。

【図7B】図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃは、処理後、ＢＶ２細胞によるＰＨＲＯＤＯ^ＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓの食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ）吸収の比較を提供する。ＢＶ２細胞は次のいずれか一つで処理された：（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ヒトＦＡＭ１９Ａ５－Ｆｃタンパク質単独（０μｇ／ｍＬグループ）、又は（ｉｉｉ）１－６５（図７Ａ）、ＳＳ０１－１３－Ｓ５（図７Ｂ）又はＳ５－ＳＧ（図７Ｃ）抗体の様々な濃度（３．１２５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ又は２５μｇ／ｍＬ）と組み合わせられたヒトＦＡＭ１９Ａ５－Ｆｃタンパク質。データは平均±Ｓ．Ｄとして表示される。

【図7C】図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃは、処理後、ＢＶ２細胞によるＰＨＲＯＤＯ^ＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓの食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ）吸収の比較を提供する。ＢＶ２細胞は次のいずれか一つで処理された：（ｉ）ＰＢＳ、（ｉｉ）ヒトＦＡＭ１９Ａ５－Ｆｃタンパク質単独（０μｇ／ｍＬグループ）、又は（ｉｉｉ）１－６５（図７Ａ）、ＳＳ０１－１３－Ｓ５（図７Ｂ）又はＳ５－ＳＧ（図７Ｃ）抗体の様々な濃度（３．１２５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ又は２５μｇ／ｍＬ）と組み合わせられたヒトＦＡＭ１９Ａ５－Ｆｃタンパク質。データは平均±Ｓ．Ｄとして表示される。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本明細書には、配列類似性１９、メンバーＡ５（ＦＡＭ１９Ａ５）タンパク質を有するヒトファミリーに特異的に結合し、本明細書に開示の１つ以上の特性を示す単離した単クローン性抗体又はその抗原結合部分（“抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体”）が開示されている。具体的に、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体はヒト対象において免疫原性を減少させるために脱免疫化された。

【0028】

本明細書に記述された開示内容の理解を容易にするために、多数の用語及び語句が定義される。追加の定義は詳細な説明全体にわたって提示されている。

【0029】

Ｉ．定義
本明細書全体において、単数の表現は、１つ以上を意味する。例えば、“抗体”は１つ以上の抗体を表すものと理解される。このように、本明細書において単数の表現は“１つ以上の”及び“少なくとも１つの”と同じ意味で使用可能である。

【0030】

また、“及び／又は“は、明示された二つの特徴又は成分のそれぞれがもう一つと共に又は単独で具体的に開示されるものと解釈されるべきである。したがって、“Ａ及び／又はＢ”は“Ａ及びＢ”、“Ａ又はＢ”、“Ａ”（単独）、及び“Ｂ”（単独）を含むものと意図される。また、“Ａ、Ｂ及び／又はＣ”は、Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）の態様をそれぞれ含むものと意図される。

【0031】

ある態様が“含む”と述べられた場合、“構成される”及び／又は“本質的に構成される”と説明された他の類似の態様も提供されるものと理解される。

【0032】

特に言及がない限り、本明細書で用いられた全ての技術及び科学用語は、本発明の当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。例えば、文献（ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ ｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）は、本明細書で用いられた大部分の用語に対する一般の辞典的意味を当業者に提供する。

【0033】

単位、接頭辞及び記号は、Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）で承認された形態で表示される。数値範囲はその範囲を限定する数字を包括的に含む。特に言及がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ配向に左側から右側へと書かれる。開示された表題は、本発明の様々な態様の制限ではなく、これらは明細書全般を参照したものであり得る。したがって、下記定義された用語はその全体が明細書を参照してより詳細に説明される。

【0034】

本明細書において用語“約”は、概略（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）、おおよそ（ｒｏｕｇｈｌｙ）、近傍（ａｒｏｕｎｄ）、又は近傍の領域内を意味する。用語“約”が数値範囲と共に使われるとき、それは、提示された数値の上と下に境界を拡張させることによって当該範囲を変形する。一般に、用語“約”は、例えば上や下に（より高かく或いは低く）１０パーセントまで、言及された値の上と下に数値を変えることができる。

【0035】

用語“配列類似性１９、メンバーＡ５を有するファミリー”又は“ＦＡＭ１９Ａ５”は、５個の高度に相同性であるタンパク質のＴＡＦＡファミリー（“ＦＡＭ１９ファミリー”とも知られている）に属し、脳と脊髄で優勢に発現するタンパク質のことを指す。ＦＡＭ１９Ａ５はまた、ＴＡＦＡ５又はケモカイン様タンパク質ＴＡＦＡ－５（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＡＦＡ－５）とも知られている。

【0036】

ヒトにおいて、ＦＡＭ１９Ａ５を暗号化する遺伝子は染色体２２に位置する。選択的スプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）によって生成されるものと推定される多数のヒトＦＡＭ１９Ａ５（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ７Ｚ５Ａ７）アイソタイプが存在する：１３２個のアミノ酸で構成されたアイソタイプ１（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ７Ｚ５Ａ７－１）；１２５個のアミノ酸で構成されたアイソタイプ２（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ７Ｚ５Ａ７－２）；及び５３個のアミノ酸で構成されたアイソタイプ３（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ７Ｚ５Ａ７－３）。ヒトＦＡＭ１９Ａ５タンパク質は膜結合形態及び可溶性（分泌された）形態で存在すると推定される。アイソタイプ１は一つの硬膜領域を有する膜タンパク質であると推定される。アイソタイプ２は、分泌されたタンパク質（可溶性）としてＴａｎｇ Ｔ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８３（４）：７２７－３４（２００４）に報告されており、アミノ酸位置１－２５に信号ペプチドを含有する。アイソタイプ１は膜タンパク質であると推定される。次は３つの公知されたヒトＦＡＭ１９Ａ５アイソタイプのアミノ酸配列である。

【0037】

（Ｉ）アイソタイプ１（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ７Ｚ５Ａ７－１、硬膜タンパク質）：このアイソタイプは標準配列として選択された。
ＭＡＰＳＰＲＴＧＳＲ ＱＤＡＴＡＬＰＳＭＳ ＳＴＦＷＡＦＭＩＬＡ
ＳＬＬＩＡＹＣＳＱＬ ＡＡＧＴＣＥＩＶＴＬ ＤＲＤＳＳＱＰＲＲＴ
ＩＡＲＱＴＡＲＣＡＣ ＲＫＧＱＩＡＧＴＴＲ ＡＲＰＡＣＶＤＡＲＩ
ＩＫＴＫＱＷＣＤＭＬ ＰＣＬＥＧＥＧＣＤＬ ＬＩＮＲＳＧＷＴＣＴ
ＱＰＧＧＲＩＫＴＴＴ ＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
（ＩＩ）アイソタイプ２（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ７Ｚ５Ａ７－２、可溶性タンパク質）：
ＭＱＬＬＫＡＬＷＡＬ ＡＧＡＡＬＣＣＦＬＶ ＬＶＩＨＡＱＦＬＫＥ
ＧＱＬＡＡＧＴＣＥＩ ＶＴＬＤＲＤＳＳＱＰ ＲＲＴＩＡＲＱＴＡＲ
ＣＡＣＲＫＧＱＩＡＧ ＴＴＲＡＲＰＡＣＶＤ ＡＲＩＩＫＴＫＱＷＣ
ＤＭＬＰＣＬＥＧＥＧ ＣＤＬＬＩＮＲＳＧＷ ＴＣＴＱＰＧＧＲＩＫ
ＴＴＴＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
（ＩＩＩ）アイソタイプ３（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ７Ｚ５Ａ７－３）：
ＭＹＨＨＲＥＷＰＡＲ ＩＩＫＴＫＱＷＣＤＭ ＬＰＣＬＥＧＥＧＣＤ
ＬＬＩＮＲＳＧＷＴＣ ＴＱＰＧＧＲＩＫＴＴ ＴＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
用語“ＦＡＭ１９Ａ５”は、細胞によって自然的に発現するＦＡＭ１９Ａ５の任意の変異体又はアイソタイプを含む。したがって、本明細書に開示された抗体は同種の異なるアイソタイプ（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５の各アイソタイプ）と交差反応できるか、又はヒト以外の種のＦＡＭ１９Ａ５（例えば、マウスＦＡＭ１９Ａ５）と交差反応することができる。代案として、抗体はヒトＦＡＭ１９Ａ５に特異的であり得、他の種とは交差反応性を示さないことがある。ＦＡＭ１９Ａ５又はその任意の変異体及びアイソタイプは、それらを自然的に発現する細胞又は組織から単離したり又は組換え的に生成され得る。ヒトＦＡＭ１９Ａ５を暗号化するポリヌクレオチドはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０３９３９６を有し、次の配列を有する：

【0038】

【表1】

【0039】

用語“ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する拮抗剤”は、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質の発現を抑制する全ての拮抗剤のことを指す。このような拮抗剤は、ペプチド、核酸、又は化合物であり得る。より具体的に、拮抗剤は、アンチセンス－オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アプタマー、ＦＡＭ１９Ａ５標的化ＰＮＡ（ペプチド核酸）、又はこれらを含むベクターであり得る。一部の実施形態において、拮抗剤は、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に特異的に結合する抗体、又はその抗原結合部分であり得る。

【0040】

用語“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）”及び“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）”は当業界の用語であり、本明細書で同じ意味で使用可能であり、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を有する分子を指す。本明細書で使われた用語は全抗体及び任意の抗原結合断片（すなわち“抗原結合部分”）又はこれらの単鎖を含む。一部の実施形態において、“抗体”は二硫化物結合によって相互連結された少なくとも２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分を指す。他の実施形態において、“抗体”は単一可変ドメイン、例えばＶＨＨドメインを含む単鎖抗体を指す。各重鎖は重鎖可変領域（ＶＨと略称）と重鎖定常領域とからなる。特定自然発生抗体において、重鎖定常領域は３個のドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。特定自然発生抗体において、各軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬと略称）と軽鎖定常領域とからなる。軽鎖定常領域は一つのドメインＣＬからなる。

【0041】

ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称する、より保存された領域と散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する、超可変性の領域にさらに細分化され得る。それぞれのＶＨ及びＶＬは３個のＣＤＲ及び４個のＦＲからなり、これらはＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順にアミノ末端からカルボキシ末端に向かって配列される。重鎖及び軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫システムの様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び伝統補体（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）システムの第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子と免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

【0042】

用語“Ｋａｂａｔナンバリング”及び類似用語は当業界で認定され、抗体、又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域においてアミノ酸残基をナンバリングするシステムを指す。特定態様において、抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによって決定され得る（例えば、Ｋａｂａｔ ＥＡ ＆ Ｗｕ ＴＴ（１９７１）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９０：３８２－３９１ ａｎｄ Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１－３２４２参照）。Ｋａｂａｔナンバリングシステムを用いると、抗体重鎖分子内におけるＣＤＲは典型的にアミノ酸位置３１～３５（これは、選択的に３５以降に１個又は２個の追加のアミノ酸を含み得る；Ｋａｂａｔナンバリング方式において３５Ａ及び３５Ｂと言及される。）（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～６５（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸位置９５～１０２（ＣＤＲ３）に存在する。Ｋａｂａｔナンバリングシステムを用いると、抗体軽鎖分子内からＣＤＲは典型的にアミノ酸位置２４～３４（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～５６（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸位置８９～９７（ＣＤＲ３）に存在する。特定の実施形態において、本明細書に開示された抗体のＣＤＲはＫａｂａｔナンバリング方式によって決定されている。

【0043】

用語“Ｋａｂａｔでのアミノ酸位置ナンバリング”、“Ｋａｂａｔ位置”、及びこれらの変形用語は、文献（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ（１９９１））で抗体編集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに対して使われたナンバリングシステムをいう。このナンバリングシステムを用いると、実際線形アミノ酸配列はより少ない又は追加のアミノ酸を含有することができるが、これは、可変ドメインのＦＷ又はＣＤＲの短縮、又は可変ドメインのＦＷ又はＣＤＲへの挿入に該当する。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２以降の単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）及び重鎖ＦＷ残基８２以降に挿入された残基（Ｋａｂａｔによれば残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含むことができる（表１Ｂ参照）。

【0044】

【表2】

【0045】

残基のＫａｂａｔナンバリングは、“標準”Ｋａｂａｔナンバリングされた配列と抗体の配列の相同性の領域で整列によって与えられた抗体に対して決定され得る。Ｃｈｏｔｈｉａは、構造ループの位置を代わりに参照する（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの端部は、Ｋａｂａｔナンバリング慣例を用いてナンバリングされたとき、ループの長さによってＨ３２～Ｈ３４の間で変わる（これは、Ｋａｂａｔナンバリング方式がＨ３５ＡとＨ３５Ｂに挿入を位置させるためである；３５Ａも３５Ｂも存在しなければ、ループは３２で終わる；３５Ａだけ存在すれば、ループは３３で終わる；３５Ａと３５Ｂがともに存在すればループは３４で終わる）。ＡｂＭ超可変領域はＫａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループ間の折衝点を表示し、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられる。

【0046】

ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）はまた、ＣＤＲを含む免疫グロブリン可変領域に対するナンバリングシステムを提供する。例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５－７７（２００３）を参照し、これは本明細書に参照として含まれる。ＩＭＧＴナンバリングシステムは５，０００個を越える配列の整列、構造データ、及び超可変ループの特性化に基づており、全種に対して可変領域とＣＤＲ領域を容易に比較する。ＩＭＧＴナンバリングスキーマ（ｓｃｈｅｍａ）によれば、ＶＨ－ＣＤＲ１は位置２６～３５にあり、ＶＨ－ＣＤＲ２は位置５１～５７にあり、ＶＨ－ＣＤＲ３は位置９３～１０２にあり、ＶＬ－ＣＤＲ１は位置２７～３２にあり、ＶＬ－ＣＤＲ２は位置５０～５２にあり、そしてＶＬ－ＣＤＲ３は位置８９～９７にある。

【0047】

本明細書に開示された全ての重鎖定常領域アミノ酸位置に対して、ナンバリングは、配列化された最初のヒトＩｇＧ１である骨髄腫タンパク質ＥＵのアミノ酸配列を説明した文献（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３（１）：７８－８５）に最初に提示されたＥＵインデックスに従う。ＥｄｅｌｍａｎなどのＥＵインデックスはまた、文献（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）にも提示される。したがって、用語“Ｋａｂａｔに提示されたＥＵインデックス”又は“ＫａｂａｔのＥＵインデックス”及び“Ｋａｂａｔに提示されたＥＵインデックスによる位置…”及び文法的に変形された用語は、Ｋａｂａｔ １９９１に提示のＥｄｅｌｍａｎなどのヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体に基づく残基ナンバリングシステムのことをいう。

【0048】

可変ドメイン（重鎖及び軽鎖の両方）及び軽鎖定常領域アミノ酸配列に用いられたナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔ １９９１に提示されたものである。

【0049】

抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＹ）、任意の類型（例えば、ＩｇＤ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、又は任意の亜型（例えば、ヒトにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４；及びマウスにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３）を有することができる。免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１はいくつかのアロタイプで存在し、これらは最大でいくつかのアミノ酸が互いに異なる。本明細書に開示された抗体は、通常知られたアイソタイプ、類型、亜型、又はアロタイプのいずれかから由来し得る。特定の実施形態において、本明細書に開示された抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４亜型又はこれらの任意のハイブリッドである。特定の実施形態において、抗体はヒトＩｇＧ１亜型、ヒトＩｇＧ２亜型、ヒトＩｇＧ４亜型、又はヒトＩｇＧ２／ＩｇＧ４亜型のものである。

【0050】

“抗体”は、例えば、自然発生及び非自然発生抗体；単クローン性及び多クローン性抗体；キメラ及びヒト化した抗体；ヒト及び非ヒト抗体、全体合成抗体；単鎖抗体；単一特異的抗体；多重特異的抗体（二重特異的抗体を含む）；２本の重鎖と２本の軽鎖分子を含むテトラマー抗体；抗体軽鎖モノマー；抗体重鎖モノマー；抗体軽鎖ダイマ－；抗体重鎖ダイマ－；抗体軽鎖－抗体重鎖対；イントラボディー；ヘテロ共役結合抗体；１価抗体；単鎖抗体；ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体；アフィボディー（ａｆｆｙｂｏｄｉｅｓ）；抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗抗Ｉｄ抗体を含む）、及び十分に抗原結合可能な単一モノマー可変抗体ドメイン（例えば、ＶＨドメイン又はＶＬドメイン）で構成された結合分子を含む単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む（Ｈａｒｍｅｎ Ｍ．Ｍ．ａｎｄ Ｈａａｒｄ Ｈ．Ｊ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（１）：１３－２２（２００７））。

【0051】

本明細書において用語“抗体の抗原結合部分”又は“抗体の抗原結合断片”とは、抗原（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に特異的に結合する能力を保有した抗体の１つ以上の断片を指す。このような“断片”は、例えば、約８個～約１，５００個のアミノ酸長、好適には約８個～約７４５個のアミノ酸長、より好適には約８個～約３００個、約８個～約２００個のアミノ酸長、又は約１０個～約５０個、又は１００個のアミノ酸長である。抗体の抗原結合機能は全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）抗体の断片によって行われ得るということが明らかにされた。抗体、例えば本明細書に開示の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の“抗原結合部分”に含まれる結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインで構成された１価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域において二硫化物ブリッジによって連結された２個のＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成されたＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一腕のＶＬ及びＶＨドメインで構成されたＦｖ断片、及び二硫化物－連結されたＦｖｓ（ｓｄＦｖ）；（ｖ）ＶＨドメインで構成されたｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；及び（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）又は（ｖｉｉ）合成リンカーによって選択的につながり得る２以上の単離したＣＤＲの組合せを含む。また、Ｆｖ断片の２ドメインであるＶＬとＶＨは別個の遺伝子によってコードされるが、これらは合成リンカーによって、組換え方法を用いて、つながり得、これによってＶＬとＶＨ領域が対をなして１価分子を形成した単一タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）という。）になり得る（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３参照）。このような単鎖抗体もまた、抗体の“抗原結合部分”に含まれる。これらの抗体断片は当業者に公知の従来の技術によって得られ、断片は無損傷抗体と同じ方式で有用性に対してスクリーニングされる。抗原結合部分は組換えＤＮＡ技術によって、又は無損傷免疫グロブリンの酵素又は化学切断によって生成され得る。

【0052】

本明細書において用語“可変領域”又は“可変ドメイン”は当業界で通常同じ意味で使用される。可変領域は典型的に抗体の一部分、一般的に軽鎖又は重鎖の一部分、典型的に成熟した重鎖において約アミノ末端１１０～１２０個アミノ酸及び成熟した軽鎖において約９０～１１５個アミノ酸を指し、抗体のうち、配列が広範囲に互いに異なり、特定抗原に対する特定抗体の結合及び特異性と関連して用いられる。配列変動性は相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域に集中し、可変ドメインにおいてより高度に保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。

【0053】

特定メカニズムや理論に拘わらず、軽鎖及び重鎖のＣＤＲは抗原と抗体の相互作用及び特異性を主に担当するものと推定される。特定の実施形態において、可変領域はヒト可変領域である。特定の実施形態において、可変領域は、齧歯類又はマウスＣＤＲとヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。特定の実施形態において、可変領域は霊長類（例えば、非ヒト霊長類）可変領域である。特定の実施形態において、可変領域は齧歯類又はマウスＣＤＲと霊長類（例えば、非ヒト霊長類）フレームワーク領域（ＦＲ）を含む。

【0054】

本明細書において、用語“重鎖”（ＨＣ）は、抗体と関連して用いられた場合、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、任意の異なるタイプ、例えば、アルファ（α）、デルタ（δ）、エプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びミュー（μ）を指すことができ、これらはそれぞれＩｇＧの亜型、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含み、抗体のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ類型を発生させる。

【0055】

本明細書において、用語“軽鎖”（ＬＣ）は、抗体と関連して用いられた場合、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて任意の互いに異なるタイプ、例えばカッパ（κ）及びラムダ（λ）を指すことができる。軽鎖アミノ酸配列は当業界に公知されている。特定の実施形態において、軽鎖はヒト軽鎖である。

【0056】

用語“ＶＬ”及び“ＶＬドメイン”は同じ意味で使用され、抗体の軽鎖可変領域のことを指す。

【0057】

用語“ＶＨ”及び“ＶＨドメイン”は同じ意味で使用され、抗体の重鎖可変領域のことを指す。

【0058】

本明細書において、用語“定常領域”又は“定常ドメイン”は同じ意味で使用可能であり、当業界における通常の意味を有する。定常ドメインは抗体部分であり、例えば抗体と抗原の結合には直接関係しないが、Ｆｃ受容体との相互作用のような様々なエフェクター機能を示し得る軽鎖及び／又は重鎖のカルボキシ末端部分である。免疫グロブリン分子の定常領域は一般に、免疫グロブリン可変ドメインに比べてより保存されたアミノ酸配列を有する。

【0059】

“Ｆｃ領域”（断片決定化可能な領域）又は“Ｆｃドメイン”又は“Ｆｃ”は、免疫システムの様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）上に位置したＦｃ受容体又は伝統補体システムの第１成分（Ｃ１ｑ）との結合を含み、宿主組織又は因子と免疫グロブリンの結合を媒介する抗体の重鎖のＣ末端領域をいう。したがって、Ｆｃ領域は、第１定常領域免疫グロブリンドメイン（例えばＣＨ１又はＣＬ）以外の抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体イソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の両重鎖の第２（ＣＨ２）及び第３（ＣＨ３）定常ドメインから由来した２個の同じタンパク質断片を含む；ＩｇＭ及びＩｇＥ Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖に３個の重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２～４）を含む。ＩｇＧの場合、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３、並びにＣγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は一般に、位置Ｃ２２６又はＰ２３０にあるアミノ酸残基（又は、これら両アミノ酸間のアミノ酸）から重鎖のカルボキシ末端まで伸びたものに限定され、ここで、ナンバリングはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに従う。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０まで延長され、ＣＨ３ドメインはＦｃ領域においてＣｍドメインのＣ末端側に位置するが、これはＩｇＧの約アミノ酸３４１から約アミノ酸４４７まで延長される。Ｆｃ領域は、任意のアロタイプ変異体を含む自生配列Ｆｃ、又は変異体Ｆｃ（例えば、非自然発生Ｆｃ）であり得る。また、Ｆｃは単離した状態の領域を指すか、或いは“Ｆｃ融合タンパク質”（例えば、抗体又は免疫癒着（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ））とも呼ばれる、“Ｆｃ領域を含む結合タンパク質”のような含Ｆｃタンパク質ポリペプチドと関係している領域のことを指す。

【0060】

“自生配列Ｆｃ領域”又は“自生配列Ｆｃ”は自然で発見されたＦｃ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む。自生配列ヒトＦｃ領域は、自生配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域；自生配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；自生配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び自生配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域だけでなく、これらの自然発生変異体を含む。自生配列ＦｃはＦｅの様々なアロタイプを含む（例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００９）ｍＡｂｓ １：１；Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５２０（２０１４年１０月２０日オンライン公開）参照）
“Ｆｃ受容体”又は“ＦｃＲ”は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体である。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲはＦｃγＲファミリーの受容体を含み、これらの受容体の対立形質変異体及び他の方式でスプライシングされた形態を含む。ＦｃγＲファミリーは、３個の活性化受容体（マウスにおいてＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃγＲＩＶ；ヒトにおいてＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、及びＦｃγＲＩＩＩＡ）と一つの抑制受容体（ＦｃγＲＩＩＢ）で構成される。ヒトＩｇＧ１は大部分のヒトＦｃ受容体と結合し、最も強いＦｃエフェクター機能を導出する。ヒトＩｇＧ１が結合する活性化Ｆｃ受容体の種類に対してはマウスＩｇＧ２ａと同等であると見なされる。一方、ヒトＩｇＧ４は最小限のＦｃエフェクター機能を導出する（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５２０（２０１４年１０月２０日オンライン公開）参照）。

【0061】

定常領域は１つ以上のエフェクター機能を除去するために、例えば組換え技術によって操作され得る。“エフェクター機能”は、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体又はリガンドの相互作用、又はこれに起因する生化学的事例（ｅｖｅｎｔ）のことを指す。例示的な“エフェクター機能”は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、ＦｃγＲ媒介エフェクター機能、例えばＡＤＣＣ及び抗体依存性細胞媒介食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）（ＡＤＣＰ）、及び細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下向き調節を含む。このようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせられることを必要とする。したがって、用語“Ｆｃ機能のない定常領域”は、Ｆｃ領域によって媒介された１つ以上のエフェクター機能が減少した或いはない定常領域を含む。

【0062】

抗体のエフェクター機能は個別の接近法によって減少又は回避され得る。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域を欠如した抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、又はモノマーＶＨ又はＶＬドメインで構成されたｓｄＡｂ）を用いて減少又は回避し得る。代案として、Ｆｃ領域の他の価値ある属性（例えば、延長された半減期及びヘテロダイマ－化）は保有しながら抗体のエフェクター機能を減少させるために、いわゆる無グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体がＦｃ領域で特定残基に連結された糖を除去することによって生成され得る。無グリコシル化抗体は、例えば、糖の付着した残基を欠失又は変更することによって、糖を酵素的に除去することによって、グリコシル化抑制剤の存在の下に培養された細胞で抗体を生成することによって、又はタンパク質をグリコシル化できない細胞（例えば、バクテリア宿主細胞）で抗体を発現することによって生成され得る（例えば、米国特許公開第２０１２０１００１４０号参照）。他の接近法は、エフェクター機能の減少したＩｇＧ亜型からのＦｃ領域を利用することであるが、例えば、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体はＩｇＧ１及びＩｇＧ３に比べてより低いレベルのＦｃエフェクター機能を有することを特徴とする。Ｆｃ部分のＣＨ２ドメインにおいてヒンジ領域に最も近接している残基が抗体のエフェクター機能を担当し、それは先天免疫システムのエフェクター細胞上でＣ１ｑ（補体）及びＩｇＧ－Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）に対して相当重なった結合部位を含有する（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５２０（２０１４年１０月２０日オンライン公開））。したがって、Ｆｃエフェクター機能が減少した又はない抗体は、例えば、ＩｇＧ４イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ２ドメインとＩｇＧ１イソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域、又はＩｇＧ２からのヒンジ領域とＩｇＧ４からのＣＨ２領域を含むキメラＦｃ領域（例えば、Ｌａｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１：４７６９－４７７７（２０１３）参照）、又は変更されたＦｃエフェクター機能、例えばＦｃ機能が減少した又はない突然変異を有するＦｃ領域を生成することによって製造され得る。突然変異を有するかかるＦｃ領域は、当業界に公知されている。例えば、米国特許公開第２０１２０１００１４０号とそこに引用された米国出願及びＰＣＴ出願、及びＡｎ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ １：６，５７２－５７９（２００９）を参照し、これらの開示はその全体が本明細書に参照として含まれる。

【0063】

“ヒンジ”、“ヒンジドメイン”又は“ヒンジ領域”又は“抗体ヒンジ領域”は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインと結合し、ヒンジの上部、中央、及び下部部分を含む重鎖定常領域のドメインのことを指す（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８ １６１：４０８３）。ヒンジは、抗体の結合領域とエフェクター領域間に可撓性のレベルを変化させ、また２本の重鎖定常領域間に分子間二硫化物結合のための部位を提供する。本明細書に開示されたヒンジは、全てのＩｇＧイソタイプに対してＧｌｕ２１６から始まってＧｌｙ２３７で終わる（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：４０８３）。野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４ヒンジの配列が当業界に公知されている（例えば、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１－３２４２；Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５２０（２０１４年１０月２０日オンライン公開）参照）。

【0064】

用語“ＣＨ１ドメイン”は、重鎖定常ドメインにおいて可変ドメインとヒンジを連結する重鎖定常領域のことを指す。本明細書に開示されたＣＨ１ドメインはＡ１１８から始まってＶ２１５で終わる。用語“ＣＨ１ドメイン”は、野生型ＣＨ１ドメインの他に、その自然的に存在する変異体（例えば、アロタイプ）も含む。（野生型及びアロタイプを含む）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＣＨ１ドメイン配列は当業界に公知されている（例えば、Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）（同上）及びＶｉｄａｒｓｓｏｎ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５２０（２０１４年１０月２０日オンライン公開）参照）。例示的なＣＨ１ドメインは、抗体の生物学的活性、例えば半減期を変形する突然変異を有するＣＨ１ドメインを含み、これらは、例えば米国特許公開第２０１２０１００１４０号及びそこに引用された米国特許及び公報とＰＣＴ公報に開示される。

【0065】

用語“ＣＨ２ドメイン”は、重鎖定常ドメインにおいてヒンジとＣＨ３ドメインを連結する重鎖定常領域のことを指す。本明細書に開示されたＣＨ２ドメインはＰ２３８から始まってＫ３４０で終わる。用語“ＣＨ２ドメイン”は、野生型ＣＨ２ドメインの他に、その自然的に存在する変異体（例えば、アロタイプ）も含む。（野生型及びアロタイプを含む）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＣＨ２ドメイン配列は当業界に公知されている（例えば、Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）（同上）及びＶｉｄａｒｓｓｏｎ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５２０（２０１４年１０月２０日オンライン公開）参照）。例示的なＣＨ２ドメインは、抗体の生物学的活性、例えば半減期及び／又は減少したＦｃエフェクター機能を変形する突然変異を有するＣＨ２ドメインを含み、これらは、例えば米国特許公開第２０１２０１００１４０号及びそこに引用された米国特許及び公報とＰＣＴ公報に開示される。

【0066】

用語“ＣＨ３ドメイン”は、重鎖定常ドメインにおいてＣＨ２ドメインに対してＣ末端である重鎖定常領域のことを指す。本明細書に開示されたＣＨ３ドメインはＧ３４１から始まってＫ４４７で終わる。用語“ＣＨ３ドメイン”は野生型ＣＨ３ドメインの他に、その自然的に存在する変異体（例えば、アロタイプ）も含む。（野生型及びアロタイプを含む）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＣＨ３ドメイン配列は当業界に公知されている（例えば、Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）（同上）及びＶｉｄａｒｓｓｏｎ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５２０（２０１４年１０月２０日オンライン公開）参照）。例示的なＣＨ３ドメインは、抗体の生物学的活性、例えば半減期を変形する突然変異を有するＣＨ３ドメインを含み、これらは、例えば米国特許公開第２０１２０１００１４０号及びそこに引用された米国特許及び公報とＰＣＴ公報に開示される。

【0067】

本明細書において用語“アイソタイプ”は、重鎖定常領域遺伝子によって暗号化される抗体類型（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥ抗体）を指す。

【0068】

用語“アロタイプ”は、いくつかのアミノ酸が異なる特定のアイソタイプグループ内で自然発生した変異体のことを指す（例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００９）ｍＡｂｓ １：１参照）。本明細書に開示された抗体は任意のアロタイプを有することができる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のアロタイプは当業界に公知されている（例えば、Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）（同上）；Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５２０（２０１４年１０月２０日オンライン公開）；及びＬｅｆｒａｎｃ ＭＰ，ｍＡｂｓ １：４，１－７（２００９）参照）。

【0069】

用語“抗原を認識する抗体”及び“抗原に特異的な抗体”は、用語“抗原に特異的に結合する抗体”と共に本明細書において同じ意味で使われる。

【0070】

本明細書において、用語“単離した抗体”は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体を指す。例えば、ＦＡＭ１９Ａ５に特異的に結合する単離した抗体は、ＦＡＭ１９Ａ５以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的に存在しない。しかし、ＦＡＭ１９Ａ５のエピトープに特異的に結合する単離した抗体は、異なる種からの他のＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対して交差反応性を有することができる。

【0071】

“結合親和性”は一般に、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）間の非共有相互作用の全体の合計強度を指す。特に言及がない限り、用語“結合親和性”は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性のことを指す。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は一般に解離定数（Ｋ_Ｄ）によって表示され得る。親和性は、制限されないが、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）、及び平衡結合定数（Ｋ_Ａ）を含む、当業界に公知の多数の方式で測定及び／又は表示され得る。Ｋ_Ｄは、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの商から計算され、モル濃度（Ｍ）で表示され、Ｋ_Ａはｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆの商から計算される。ｋ_ｏｎは、例えば抗原に対する抗体の結合速度定数を指し、ｋ_ｏｆｆは、例えば、抗原に対する抗体の解離速度定数を指す。ｋ_ｏｎ及びｋ_ｏｆｆは免疫分析（例えば、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ））、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）又は力学的排除分析（ＫｉｎＥｘＡ）のような、当業者に公知の技術によって決定され得る。

【0072】

本明細書において、用語“特異的に結合する”、“特異的に認識する”、“特異的結合”、“選択的結合”及び“選択的に結合する”とは、抗体と関連して類似の用語であり、抗原（例えば、エピトープ又は免疫複合体）に結合する分子（例えば、抗体）をいい、このような結合は当業者にとって理解される通りである。抗原に特異的に結合する分子は、例えば、免疫分析、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＫｉｎＥｘＡ ３０００機器（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）、又は当業界に公知の他の分析によって決定されたとき、通常、より低い親和性で他のペプチド又はポリペプチドに結合し得る。特定の実施形態において、抗原に特異的に結合する分子は、この分子が他の抗原に結合する時のＫ_Ａに比べて少なくとも２ログ（ｌｏｇ）、２．５ログ、３ログ、４ログ又はそれ以上のＫ_Ａでその抗原に結合する。

【0073】

抗体は典型的に１０^－５～１０^－１１Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）によって反映される、高い親和性で同族抗原に特異的に結合する。約１０^－４Ｍを超えるＫ_Ｄは、通常、非特異的結合を示すと見なされる。抗原と“特異的に結合する”抗体は、高い親和性で抗原及び実質的に同じ抗原に結合する抗体のことを指し、これは、例えば定められた抗原を用いて免疫分析（例えば、ＥＬＩＳＡ）又はＢＩＡＣＯＲＥ ２０００機器で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定された時、１０^－７Ｍ以下、好ましくは１０^－８Ｍ以下、より好ましくは１０^－９Ｍ以下、及び最も好ましくは１０^－８Ｍ～１０^－１０Ｍ以下のＫ_Ｄを有するものを意味し、これは、関連していない抗原には高い親和性で結合しない。

【0074】

本明細書において、用語“抗原”は、任意の天然又は合成免疫原性物質、例えばタンパク質、ペプチド又はハプテンのことを指す。抗原はＦＡＭ１９Ａ５又はその断片であり得る。

【0075】

本明細書において、“エピトープ”は当業界の用語であり、抗体が特異的に結合し得る抗原の局所化された領域のことを指す。エピトープは、例えばポリペプチドの連続（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）アミノ酸（線形又は連続エピトープ）であり得るか、又はエピトープは、例えばポリペプチド又はポリペプチドの２以上の非連続領域が合わせられたもの（立体形態的、非線形、不連続、又は非連続エピトープ）であり得る。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、いつもそうであるわけではないが、典型的に変性溶媒に露出時に保有され、３次フォルディングによって形成されたエピトープは典型的に変性溶媒で処理時に喪失される。エピトープは典型的に独特の空間的立体形態において少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は２０個のアミノ酸を含む。エピトープが与えられた抗体によって結合したものを決定する方法（すなわち、エピトープマッピング）が当業界に公知されており、これは、例えば免疫ブロット及び免疫沈殿分析を含み、例えばＦＡＭ１９Ａ５からの重複又は連続ペプチドが与えられた抗体（例えば、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体）との反応性に対して試験される。エピトープの空間的立体形態を決定する方法は、当業界の技術及び本明細書に開示されたものを含み、例えば、Ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴及びＨＤＸ－ＭＳを含む（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）参照）。

【0076】

特定の実施形態において、抗体が結合したエピトープは、例えばＮＭＲ分光法、Ｘ線回折結晶学研究、ＥＬＩＳＡ分析、質量分光法と結合した水素／重水素交換（例えば、液体クロマトグラフィー電子噴霧質量分光法）、アレイ基盤オリゴ－ペプチドスキャニング分析、及び／又は突然変異誘発マッピング（例えば、部位指定突然変異誘発マッピング）によって決定され得る。Ｘ線結晶学の場合、結晶化は当業界に公知の方法のいずれかを用いて達成され得る（例えば、Ｇｉｅｇｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５０（Ｐｔ４）：３３９－３５０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９９０）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８９：１－２３；Ｃｈａｙｅｎ ＮＥ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：１２６９－１２７４；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９７６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５１：６３００－６３０３）。抗体：抗原結晶は、公知のＸ線回折技術を用いて研究でき、Ｘ－ＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．によって配布；例えば、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８５）ｖｏｌｕｍｅｓ １１４ ＆ １１５，ｅｄｓ Ｗｙｃｋｏｆｆ ＨＷ ｅｔ ａｌ．，；米国特許公開第２００４／００１４１９４号参照）、及びＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９３）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４９（Ｐｔ１）：３７－６０；Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２７６Ａ：３６１－４２３，ｅｄ Ｃａｒｔｅｒ ＣＷ；Ｒｏｖｅｒｓｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５６（Ｐｔ １０）：１３１６－１３２３）のようなコンピュータソフトウェアを用いて研究できる。突然変異誘発マッピング研究は、当業者に公知の任意の方法で行うことができる。アラニンスキャニング突然変異誘発技術を含む突然変異誘発技術に関する説明は、例えばＣｈａｍｐｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１３８８－１３９４及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＢＣ ＆ Ｗｅｌｌｓ ＪＡ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５を参照する。

【0077】

用語“エピトープマッピング”は、抗体－抗原認識に対する分子決定基（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）の確認過程を指す。

【0078】

２つ以上の抗体と関連して用語“同じエピトープに結合する”とは、与えられた方法によって決定された時、抗体がアミノ酸残基の同じセグメントに結合するということを意味する。抗体が本明細書に開示の抗体と“ＦＡＭ１９Ａ５上の同じエピトープ”に結合するか否かを決定する技術は、エピトープマッピング方法、例えば、エピトープの原子分解能を提供する抗原：抗体複合体の結晶のＸ線分析及び水素／重水素交換質量分光法（ＨＤＸ－ＭＳ）を含む。他の方法は、抗体と抗原断片又は抗原の突然変異された変異体の結合をモニタリングし、ここで、抗原配列内でアミノ酸残基の変形による結合の損失が主にエピトープ成分の表示として見なされる。これに加えて、エピトープマッピング用コンピュータ組合せ方法が用いられてもよい。これらの方法は組合せファージディスプレイペプチドライブラリーから特定の短いペプチドを親和性分離できる関心抗体の能力に依存する。同じＶＨ及びＶＬ又は同じＣＤＲ１、２及び３配列を有する抗体は同じエピトープに結合すると予想される。

【0079】

“標的との結合のために他の抗体と競合する”抗体は、残り抗体と標的の結合を（部分的に又は完全に）抑制する抗体を指す。２つの抗体が標的との結合に対して互いに競合するか否か、すなわち、一つの抗体がもう一つの抗体と標的の結合を抑制するか否かと抑制する程度は、公知の競合実験によって決定され得る。特定の実施形態において、抗体は他の抗体と標的の結合に対して競合し、この結合を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％まで抑制する。抑制又は競合のレベルは、抗体が“遮断抗体”（すなわち、標的とまずインキュベーションされた低温抗体）であるか否かによって変わり得る。競合分析は、例えば、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；２００６；ｄｏｉ：１０１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ ４２７７又はＥｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅによる“Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳＡ１９９９）の第１１章に説明された通りに行われ得る。競合抗体は、同じエピトープ、重複エピトープ又は隣接エピトープ（例えば、立体障害によって証明されたとおり）に結合する。

【0080】

他の競合結合分析は、固体相直接又は間接放射性免疫分析（ＲＩＡ）、固体相直接又は間接酵素免疫分析（ＥＩＡ）、サンドウィッチ競合分析（Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２（１９８３）参照）；固体相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４（１９８６）参照）；固体相直接標識化分析、固体相直接標識化サンドウィッチ分析（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）参照）；１－１２５ラベルを使用した固体相直接標識されたＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１）：７（１９８８）参照）；固体相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６（１９９０））；及び直接標識化ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７（１９９０））を含む。

【0081】

“二重特異的”又は“二重機能性抗体”は、２つの異なる重鎖／軽鎖対と２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異的抗体はハイブリドーマの融合又はＦａｂ’断片の連結を含む様々な方法によって生成され得る（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１５４７－１５５３（１９９２）を参照）。

【0082】

本明細書において、用語“単クローン性抗体”は、特定エピトープに対して単一結合特異性及び親和性を示す抗体又は全ての抗体が特定エピトープに対して単一結合特異性及び親和性を示す抗体の組成物を指す。したがって、用語“ヒト単クローン性抗体”は、単一結合特異性を示し、ヒトジャームライン（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）免疫グロブリン配列から由来した可変及び選択的定常領域を有する抗体又は抗体組成物をいう。一部の実施形態において、ヒト単クローン性抗体は、遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）非ヒト動物、例えば不滅化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子と軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、遺伝子導入マウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成される。

【0083】

本明細書において、用語“組換えヒト抗体”は、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に対して遺伝子導入或いは染色体導入（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）された動物（例えば、マウス）から単離した抗体又はこれによって製造されたハイブリドーマ、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離した抗体、（ｃ）組換え、組合せヒト抗体ライブラリーから単離した抗体、及び（ｄ）他のＤＮＡ配列に対するヒト免疫グロブリン遺伝子配列をスプライシングを伴う任意の他の手段によって製造、発現、生成又は単離した抗体のような、組換え手段によって製造、発現、生成又は単離した全てのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体はジャームライン遺伝子によって暗号化されるが、例えば抗体成熟化の間に発生する後続再配列及び突然変異を含む特定のヒトジャームライン免疫グロブリン配列を利用する可変及び定常領域を含む。当業界に公知のとおり（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１１７－１１２５参照）、可変領域は、外来抗原に対して特異的な抗体を形成するように再配列した様々な遺伝子によって暗号化された、抗原結合ドメインを含有する。再配列に加えて、可変領域は、外来抗原に対する抗体の親和性を増加させるために多数の単一アミノ酸変化（体細胞突然変異又は超突然変異という。）によってさらに変形され得る。定常領域は抗原に対する追加の反応（すなわちアイソタイプスイッチ）で変わるだろう。したがって、抗原に反応して軽鎖及び重鎖免疫グロブリンポリペプチドを暗号化する再配列され体細胞突然変異された核酸分子は元来の核酸分子と配列同一性を有することができないが、実質的に同一又は類似であろう（すなわち、少なくとも８０％同一の性を有する）。

【0084】

用語“ヒト抗体（ＨｕＭＡｂ）”は、フレームワークとＣＤＲ領域が両方も、ヒトジャームライン免疫グロブリン配列から由来した可変領域を有する抗体を指す。また、この抗体が定常領域を含有すると、定常領域もヒトジャームライン免疫グロブリン配列から由来する。本明細書に開示された抗体はヒトジャームライン免疫グロブリン配列（例えば、試験管内無作為又は部位特定突然変異誘発によって又は生体内体細胞突然変異によって導入された突然変異）によって暗号化されないアミノ酸残基を含むことができる。しかし、本明細書に開示された“ヒト抗体”は、マウスのような他の哺乳類種のジャームラインから由来したＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に結び付けられた抗体は含まない。用語“ヒト抗体”と“完全なヒト抗体”は同じ意味で使われる。

【0085】

用語“ヒト化した抗体”は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分又は全部がヒト免疫グロブリンから由来した相応するアミノ酸に置換された抗体を指す。抗体のヒト化した形態の一部の実施形態において、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分又は全部がヒト免疫グロブリンからのアミノ酸に置換され、１以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分又は全部はそのまま残る。アミノ酸の小さな添加、欠失、挿入、置換又は変形は、抗体が特定抗原に結合する能力をなくさない限り許容される。“ヒト化した抗体”は元来の抗体と類似の抗原特異性を保有する。

【0086】

本明細書において用語“脱免疫化された”又は“脱免疫化”とは、例えばヒト対象においてその免疫原性を減少させるために抗体又はその抗原結合部分が変形される過程のことを指す。例えば、元来の抗体からの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を分析することができ、そしてヒトＴ細胞エピトープ“マップ”は相補性決定領域（ＣＤＲ）及び配列内の他の主要残基と関連してエピトープの位置を示す各Ｖ領域から生成され得る。Ｔ細胞エピトープマップから個別Ｔ細胞エピトープは、最終抗体の活性変更危険の低い代案的なアミノ酸置換を確認するために分析される。アミノ酸置換の組合せを含む様々な代案のＶＨ及びＶＬ配列が設計され、これらの配列は、本明細書に後述する診断及び治療方法に用いるための範囲のＦＡＭ１９Ａ５特異的抗体又はその抗原結合部分に導入され、次いでそれらは機能に対する試験をする。次に、変形されたＶ及びヒトＣ領域を含む完全な重鎖及び軽鎖遺伝子を発現ベクターにクローニングし、後続プラスミドを全抗体の生成のために細胞株に導入する。次に、抗体を適切な生化学的及び生物学的分析で比較し、最適の変異体を確認する。本明細書に記載された方法又は当業界に公知の任意の他の方法、例えばＷＯ９８／５２９７６又はＷＯ００／３４３１７を用いて抗体を脱免疫化させることができる。

【0087】

“キメラ抗体”は、一つの種から可変領域が由来し、他の種から定常領域が由来した抗体、例えば、マウス抗体から可変領域が由来し、ヒト抗体から定常領域が由来した抗体のことを指す。

【0088】

本明細書で用語“交差反応する”とは、異なる種からのＦＡＭ１９Ａ５に結合する本明細書に開示された抗体の能力をいう。例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５に結合する本明細書に開示された抗体はまた、他の種のＦＡＭ１９Ａ５（例えば、マウスＦＡＭ１９Ａ５）にも結合可能である。交差反応性は結合分析（例えば、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ）で精製された抗原との特異的反応性を検出することによって又はＦＡＭ１９Ａ５を生理学的に発現する細胞との結合、又は機能的相互作用を検出することによって測定され得る。交差反応性を決定する方法は、本明細書に開示の標準結合分析、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００ ＳＰＲ機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用したＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析、又は流細胞計数（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ）技術を含む。

【0089】

用語“自然発生”は、自然で発見可能であることを指す。例えば、自然の出処から分離可能であり、実験室で人間によって意図的に変形されない有機体（ウイルスを含む。）に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は自然発生的である。

【0090】

用語“ポリペプチド”は、少なくとも２つの連続連結されたアミノ酸残基を含む鎖のことを指し、鎖の長さに上限はない。タンパク質における１つ以上のアミノ酸残基は、制限されないが、グリコシル化、リン酸化又は二硫化物結合形成のような変形を含有し得る。“タンパク質”は、１つ以上のポリペプチドを含むことができる。

【0091】

本明細書において用語“核酸分子”は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含む。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であり得、ｃＤＮＡであり得る。

【0092】

本明細書において用語“ベクター”は、それが連結された他の核酸を輸送できる核酸分子のことを指す。ベクターの一種類は“プラスミド”であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）され得る円形の二本鎖ＤＮＡループのことを指す。ベクターの他の種類は、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得るウイルスベクターである。特定のベクター（例えば、バクテリア複製起源を有するバクテリアベクター及びエピゾーム哺乳類ベクター）は、それらが導入された宿主細胞で自己複製可能である。他のベクター（例えば、非エピゾーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入時に宿主細胞のゲノムに統合可能であり、これによって宿主ゲノムと共に複製される。また、特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは本明細書において“組換え発現ベクター”（又は、簡単に“発現ベクター”）と言及される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用性を有する発現ベクターは主にプラスミドの形態である。本明細書において、“プラスミド”と“ベクター”は、プラスミドがベクターの最も多く用いられる形態であることから、同じ意味で使用可能である。しかし、ウイルス（例えば、複製結合レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）ベクターのような他の形態の発現ベクターも含まれ、これらは同等の機能を果たす。

【0093】

本明細書において、用語“組換え宿主細胞”（又は、簡単に“宿主細胞”）は、細胞に自然的に存在しない核酸を含む細胞のことを指し、組換え発現ベクターが導入された細胞であり得る。かかる用語は、特定の該当細胞の他にそれら細胞の子孫も言及するものとして理解されるべきである。突然変異や環境的影響によってつながった世代では特定の変形が起こり得るので、このような子孫は実際に母細胞と同一であるとは言えなくとも、相変らず用語“宿主細胞”の範囲内に含まれる。

【0094】

本明細書において、用語“連結された”とは、２つ以上の分子のアソシエーションをいう。連結は、共有結合又は非共有結合であり得る。連結はまた、遺伝子連結（すなわち、組換え的に融合される。）であり得る。このような連結は化学的共役結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）及び組換えタンパク質生成のような当業界に公知の様々な技術を用いて達成され得る。

【0095】

本明細書において、用語“投与”は、当業者に公知の様々な方法及び伝達システム（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを用いて、治療剤又は治療剤を含む組成物を対象に物理的に注入することを指す。本明細書に開示された抗体の好ましい投与経路は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊椎又は他の非経口投与経路、例えば、注射又は注入によるものを含む。本明細書において、用語“非経口投与”とは、一般に注射による、腸（ｅｎｔｅｒａｌ）及び局部的（ｔｏｐｉｃａｌ）投与を除く他の投与方式を意味し、制限されないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、脊椎腔内、リンパ内、病巣内、嚢内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、眼窩内（ｉｎｔｒａｏｒｂｉｔａｌ）、心臓内、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、気管支経（ｔｒａｎｓｔｒａｃｈｅａｌ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、表皮下、関節内、皮膜下、脊髄腔内、硬膜外、及び胸骨内注射及び注入の他に、生体内電気穿孔も含む。代案として、本明細書に開示された抗体は、非経口的ではない経路を通じて、例えば局部的、上皮又は粘膜投与経路を通じて、例えば鼻内、経口、膣、直腸、舌下又は局部的経路を通じて投与され得る。また、投与は、例えば、１回、複数回、及び／又は１回以上の延長された期間にわたって行われ得る。

【0096】

本明細書において、用語“治療する（ｔｒｅａｔ）”、“治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）”及び“治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）”は、疾患と関連した症状、合併症、病態又は生化学的指標の進行、発生、深刻性又は再発を反転、改善、緩和、抑制又は遅延させる目的で対象に対して行われた任意の種類の介入又は過程、若しくは対象に活性剤を投与することをいう。治療は、疾患を持つ対象又は疾患を持たない対象（例えば、予防のために）に対して行われ得る。

【0097】

本明細書において、用語“対象”は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。用語“非ヒト動物”は、全ての脊椎動物、例えば哺乳類及び非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヤギ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両棲類、爬虫類などを含む。

【0098】

本明細書において用語“神経膠症の発病（ｏｎｓｅｔ）”又は“反応性神経膠症の発病”は、神経膠症の始まり又は開始を含む。神経膠症は、例えば、外傷、脳脊髓損傷、脳腫瘍、感染、虚血（ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳卒中、自己免疫反応、及び／又は神経退行性疾患による損傷又は傷害に応じた、中枢神経系における神経膠細胞の非特異性反応変化であり、星状細胞、小膠細胞、希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｔｃｙｔｅｓ）を含む様々な類型の神経膠細胞の増殖又は肥大（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）を含む。神経膠症の発病は傷跡の形成につながることがあり、これは傷ついたり損傷したＣＮＳの部分で軸索再生を抑制する。神経膠症発病の有害な影響は、ニューロンに取り返しのつかない又は永久的な損傷及び／又は周辺ニューロンの回復を防止することを含む。したがって、用語“神経膠症の発病遅延”及び“反応性神経膠症の発病遅延”は、神経膠症の始まり又は開始及びこれと関連したＣＮＳの有害効果を抑制、鈍化、阻止又は予防することを含む。

【0099】

本明細書において用語“反応性星状細胞の過度な増殖”は、例えば、ＣＮＳ傷害、外傷、損傷、脳脊髓損傷、脳腫瘍、感染、虚血、脳卒中、自己免疫反応及び／又は神経退行性疾患から近くのニューロンの破壊による星状細胞数の異常増加を含む。反応性星状細胞の過度な増殖は、傷跡の形成を含めてＣＮＳに有害な影響を与えることがあるが、これは、負傷又は損傷したＣＮＳの一部における軸索再生、炎症の悪化、反応性酸素種の神経毒性レベルの生成及び放出、潜在的な興奮毒性グルタメートの放出、発作発生（ｓｅｉｚｕｒｅ ｇｅｎｅｓｉｓ）に対する潜在的寄与、血液－脳障壁機能の損傷（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）、外傷と脳卒中の間に細胞毒性浮腫、星状細胞の慢性サイトカイン活性化が慢性疼痛に寄与する可能性、及びＣＮＳ損傷後の２次変性を抑制する。Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｖ．（２００９）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，３２（１２）：６３８－４７；ＭｃＧｒａｗ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６３（２）：１０９－１５；及びＳｏｆｒｏｎｉｅｗ，Ｍ．Ｖ．（２００５）Ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ １１（５）：４００－７。したがって、用語“反応性星状細胞の過度な増殖抑制”は、反応性星状細胞の過度又は異常増殖及びこれに関連しているＣＮＳの有害な影響を抑制、鈍化、低下、制限又は防止することを含む。

【0100】

本明細書において用語“コンドロイチン硫酸プロテオグリカン”は、タンパク質コア及びコンドロイチン硫酸で構成されたプロテオグリカンを含む。ＣＳＰＧとも知られたコンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、発達及び成体ＣＮＳにわたって広範囲に発現する細胞外マトリックス分子である。ＣＳＧＰは神経発達及び膠細胞傷跡形成に重要な役割を果たし、ＣＮＳにおいて損傷後軸索再生を抑制する。知られたＣＳＰＧは、アグレカン（ＣＳＰＧ１）、ベルシカン（ＣＳＰＧ２）、ニューロカン（ＣＳＰＧ３）、ＣＳＰＧ４（又はニューロン膠細胞抗原２（ＮＧ２））、ＣＳＰＧ５、ＳＭＣ３（ＣＳＰＧ６、染色体３の構造的維持）、ブレビカン（ＣＳＰＧ７）及びＣＤ４４（ＣＳＰＧ８、分化４４のクラスター）、ホスファカンニューロカン（ＣＳＰＧ３）を含む。Ｒｈｏｄｅｓ，Ｋ．Ｅ．及びＦａｗｃｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．（２００４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｔｏｍ．２０４（１）：３３－４８。したがって、用語“コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現減少”は、１つ以上のＣＳＧＰのレベル下落、抑制、減少、又は１つ以上のＣＳＧＰの活性減少又は不活性化を含む。特定の実施形態において、前記用語は、ニューロカン、ＮＧ２又はこれら両方のレベルを下落、抑制、減少させたり、ニューロカン、ＮＧ２又はこれら両方の活性を減少させたり不活性化させることを含む。

【0101】

本明細書において用語“ニューロン”は、電気的及び化学的信号を通じて情報を処理し伝送する電気的励起可能な細胞を含む。ニューロンはＣＮＳの脳及び脊髄及び末梢神経系（ＰＮＳ）の神経節（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ）の主要構成要素であり、互いに連結されて神経ネットワークを形成することができる。典型的なニューロンは、細胞体（ソーマ）、樹状突起（ｄｅｎｄｒｉｔｅ）及び軸索で構成される。ニューロンのソーマ（細胞体）は核を含有する。ニューロンの樹状突起は、ニューロンに対する大部分の入力が発生する多くの枝を有する細胞延長である軸索は、ソーマから延長されるより微細なケーブルのような突起であり、ソーマから神経信号を伝達し、特定類型の情報をソーマに戻す。用語“ニューロンの再成長促進”は、好ましくは損傷又は傷害後にニューロンを刺激、促進、増加又は活性化させることを含む。

【0102】

本明細書において用語“ｃ－ｆｏｓ”は、神経伝達物質の刺激によって速く誘導される原核生物ｃ－ｆｏｓを含む。ｃ－ｆｏｓは、マウス及びヒトを含む多数の種に存在する。ｃ－ｆｏｓ遺伝子及びタンパク質は公知であり、特性化されている。Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ，Ｔｈｅ ｃ－ｆｏｓ ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｐｐ３０７－３２７（Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒｅｄｄｙ ＥＰ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）（１９８８）参照。ｃ－ｆｏｓの発現は、当業界に公知の方法、例えばノーザンブロット、定量的ＰＣＲ又は免疫組織化学によって決定され得る。用語“ｃ－ｆｏｓの発現増加”は、ｃ－ｆｏｓ ｍＲＮＡ、ｃ－ｆｏｓタンパク質又はｃ－ｆｏｓタンパク質活性レベルを増加させることを含む。

【0103】

本明細書において用語“ｐＥＲＫ”は、リン酸化された細胞外信号調節キナーゼを含む。細胞外信号調節キナーゼ又はＥＲＫは、ＥＲＫ１及びＥＲＫ２を含み、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーのメンバーである。ＥＲＫはそれの上流キナーゼによってリン酸化によって活性化されてｐＥＲＫを形成し、これは、次いで下流標的を活性化させる。ＥＲＫは、学習及び記憶と疼痛過敏に基づく神経及びシナプス塑性に関与する。Ｊｉ Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（１９９９）２：１１１４－１１１９。ＥＲＫ遺伝子、タンパク質、リン酸化及び活性化は公知されており、特性化され、ＥＲＫ及びｐＥＲＫの発現は、当業界に公知の方法（例えば、ノーザンブロット、定量的ＰＣＲ又は免疫組織化学）によって決定され得る。Ｇａｏ Ｙ．Ｊ．及びＪｉ Ｒ．Ｒ．，Ｏｐｅｎ Ｐａｉｎ Ｊ．（２００９）２：１１－１７参照。用語“ｐＥＲＫの発現増加”は、ＥＲＫ ｍＲＮＡ、ＥＲＫタンパク質又はｐＥＲＫ活性のレベルを増加させることを含む。

【0104】

本明細書において用語“ＧＡＰ４３”は、“成長関連タンパク質４３”とも知られており、神経突起の形成、再生及び塑性を促進させる神経組織特異的タンパク質である。Ｂｅｎｏｗｉｔｚ Ｌ．Ｉ．ａｎｄ Ｒｏｕｔｔｅｎｂｅｒｇ Ａ．（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０（２）：８４－９１；Ａａｒｔｓ Ｌ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４４６：８５－１０６。ヒトＧＡＰ４３は、ＧＡＰ４３遺伝子によって暗号化される。ヒトＧＡＰ４３ポリペプチド配列（ＵｎｉＰｒｏｔ：ＫＢ－Ｐ １７６７７）及びポリペプチドを暗号化するｃＤＮＡ配列は当業界に公知されている。Ｋｏｓｉｋ Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎｅｕｒｏｎ １（２）：１２７－３２；Ｎｇ Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎｅｕｒｏｎ １（２）：１３３－９。ＧＡＰ４３の発現は当業界に公知の方法（例えば、ノーザンブロット、定量的ＰＣＲ又は免疫組織化学）によって決定され得る。用語“ニューロンでＧＡＰ４３増加”は、ＧＡＰ４３ ｍＲＮＡ、ＧＡＰ４３タンパク質のレベルを向上又は増加させたり又はＧＡＰ４３タンパク質の活性を増加させることを含む。

【0105】

本明細書において、用語“治療的有効量”は、対象の疾患又は障害を“治療”したり又は疾患又は障害（例えば、中枢神経系損傷）の危険、潜在性、可能性又は発生を減少するのに効果的な薬物の、単独又は他の治療剤と組み合わせられた量のことを指す。“治療的有効量”は、疾患又は障害（例えば、外傷性脳損傷又は本明細書に開示された他の疾患のような中枢神経系損傷）を持っていたり或いは持つ危険がある対象に若干の改善又は利点を提供する薬物又は治療剤の量を含む。したがって、“治療的有効量”は、疾患の危険、潜在性、可能性又は発生を減少させたり又は一部緩和、軽減させ、及び／又は少なくとも１つの指標（例えば、反応性神経膠症の発病）を減少させ、及び／又は疾患又は障害の少なくとも１つの臨床症状を減少させる量である。

【0106】

ＩＩ．抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体
本発明では、特定の機能的特徴又は特性を特徴とする抗体、例えば単クローン性抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を開示する。例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５に特異的に結合する抗体は、ヒトにおいて免疫性が高い（すなわち、脱免疫化された）領域又は残基を除去及び／又は変形することによって突然変異（例えば、置換又は除去）された。したがって、本明細書に開示された抗体、すなわち抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、基準抗体（例えば、脱免疫化されていない相応する抗体、例えば１－６５抗体）と比較して、ヒト対象に投与される時に免疫原性を減少させた。

【0107】

また、本明細書に記載された抗体は、下記機能的特性のいずれか１つ以上を表す：
（ａ）１０ｎＭ以下のＫ_Ｄを有する可溶性ヒトＦＡＭ１９Ａ５に結合し；
（ｂ）１０ｎＭ以下のＫ_Ｄを有する膜結合したヒトＦＡＭ１９Ａ５に結合し；
（ｃ）反応性神経膠症の発病を減少、逆転、遅延及び／又は予防し；
（ｄ）反応性星状細胞の過度な増殖を抑制し；
（ｅ）ニューロカン及びニューロン膠細胞抗原２（ＮＧ２）を含むコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現を減少させ；
（ｆ）ニューロンの核でｃ－ｆｏｓ及びｐＥＲＫの発現を増加させ；
（ｇ）ニューロンの生存を促進し；
（ｈ）ニューロンでＧＡＰ４３の発現を増加させ；及び
（ｉ）軸索の再成長を促進する。

【0108】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体はヒト対象に投与される時に基準抗体（例えば、免疫化されていない相応する抗体、例えば抗体１－６５）に比べて、抗体が比較的少なく免疫原性となるように免疫化された。一部の実施形態において、抗体の免疫原性は基準抗体（例えば、免疫化されていない、相応する抗体、例えば抗体１－６５）と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％減少した。一部の実施形態において、脱免疫化過程は抗体の結合親和性を変更させない。

【0109】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、例えば、１０^－７Ｍ以下、１０^－８Ｍ以下、１０^－９Ｍ（１ｎＭ）以下、１０^－１０Ｍ（０．１ｎＭ）以下、１０^－１１Ｍ以下、又は１０^－１２Ｍ以下、例えば１０^－１２Ｍ～１０^－７Ｍ、１０^－１１Ｍ～１０^－７Ｍ、１０^－１０Ｍ～１０^－７Ｍ、又は１０^－９Ｍ～１０^－７Ｍ、例えば１０^－１２Ｍ、５×１０^－１２Ｍ、１０^－１１Ｍ、５×１０^－１１Ｍ、１０^－１０Ｍ、５×１０^－１０Ｍ、１０^－９Ｍ、５×１０^－９Ｍ、１０^－８Ｍ、５×１０^－８Ｍ、１０^－７Ｍ、又は５×１０^－７ＭのＫ_Ｄを有する高い親和性で可溶性ヒトＦＡＭ１９Ａ５又は膜結合ヒトに特異的に結合する。様々な種のヒトＦＡＭ１９Ａ５に対する抗体の結合能力を評価する標準分析は、当業界に公知であり、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、及びＲＩＡを含む。適切な分析が実施例に詳細に説明される。抗体の結合動力学（例えば、結合親和性）がまた、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析又はＫｉｎＥｘＡのような当業界に公知の標準分析によって評価され得る。ＦＡＭ１９Ａ５の機能的特性（例えば、リガンド結合）に対する抗体の効果を評価する分析が下記及び実施例にさらに詳細に説明される。

【0110】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、例えばＥＬＩＳＡによって決定された時、１０^－７Ｍ以下、１０^－８Ｍ（１０ｎＭ）以下、１０^－９Ｍ（１ｎＭ）以下、１０^－１０Ｍ以下、１０^－１２Ｍ～１０^－７Ｍ、１０^－１１Ｍ～１０^－７Ｍ、１０^－１０Ｍ～１０^－７Ｍ、１０^－９Ｍ～１０^－７Ｍ、又は１０^－８Ｍ～１０^－７ＭのＫ_Ｄを有する可溶性ヒトＦＡＭ１９Ａ５と特異的に結合する。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、１０ｎＭ以下、例えば０．１～１０ｎＭ、０．１～５ｎＭ、０．１～１ｎＭ、０．５～１０ｎＭ、０．５～５ｎＭ、０．５～１ｎＭ，１～１０ｎＭ、１～５ｎＭ、又は５～１０ｎＭのＫ_Ｄを有する可溶性ＦＡＭ１９Ａ５と特異的に結合する。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、ＥＬＩＳＡによって決定された時、約１ｐＭ、２ｐＭ、３ｐＭ、４ｐＭ、５ｐＭ、６ｐＭ、７ｐＭ、８ｐＭ、９ｐＭ、１０ｐＭ、２０ｐＭ、３０ｐＭ、４０ｐＭ、５０ｐＭ、６０ｐＭ、７０ｐＭ、８０ｐＭ、９０ｐＭ、１００ｐＭ、２００ｐＭ、３００ｐＭ、４００ｐＭ、５００ｐＭ、６００ｐＭ、７００ｐＭ、８００ｐＭ、又は９００ｐＭ、又は約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、又は９ｎＭ、又は約１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、又は９０ｎＭのＫ_Ｄを有する可溶性ヒトＦＡＭ１９Ａ５と特異的に結合する。

【0111】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、例えばＥＬＩＳＡによって決定される時、１０^－７Ｍ以下、１０^－８Ｍ（１０ｎＭ）以下、１０^－９Ｍ（１ｎＭ）以下、１０^－１０Ｍ以下、１０^－１２Ｍ～１０^－７Ｍ、１０^－１１Ｍ～１０^－７Ｍ、１０^－１０Ｍ～１０^－７Ｍ、１０^－９Ｍ～１０^－７Ｍ、又は１０^－８Ｍ～１０^－７ＭのＫ_Ｄを有する膜結合したヒトと特異的に結合する。特定の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、ＥＬＩＳＡによって決定される時、１０ｎＭ以下、例えば０．１～１０ｎＭ、０．１～５ｎＭ、０．１～１ｎＭ、０．５～１０ｎＭ、０．５～５ｎＭ、０．５～１ｎＭ、１～１０ｎＭ、１～５ｎＭ、又は５～１０ｎＭのＫ_Ｄを有する膜結合したヒトＦＡＭ１９Ａ５と特異的に結合する。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、ＥＬＩＳＡによって決定される時、約１ｐＭ、２ｐＭ、３ｐＭ、４ｐＭ、５ｐＭ、６ｐＭ、７ｐＭ、８ｐＭ、９ｐＭ、１０ｐＭ、２０ｐＭ、３０ｐＭ、４０ｐＭ、５０ｐＭ、６０ｐＭ、７０ｐＭ、８０ｐＭ、９０ｐＭ、１００ｐＭ、２００ｐＭ、３００ｐＭ、４００ｐＭ、５００ｐＭ、６００ｐＭ、７００ｐＭ、８００ｐＭ、又は９００ｐＭ、又は約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、又は９ｎＭ、又は約１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、又は９０ｎＭのＫ_Ｄを有する膜結合したヒトＦＡＭ１９Ａ５と特異的に結合する。

【0112】

本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、神経膠腫の発病を遅延又は抑制することができ、例えば外傷、脳脊髓損傷、脳腫瘍、感染、虚血、脳卒中、自己免疫反応及び／又は神経退行性疾患による損傷又は損傷に反応して中枢神経系（ＣＮＳ、例えば、脳及び／又は脊髄）で神経膠細胞の非特異的反応性変化の開始又は発病を遅延、鈍化又は制限することができる。

【0113】

本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、反応性星状細胞の過度又は異常増殖及びこれと関連したＣＮＳの有害な効果を遅延、抑制、鈍化、制限、低下又は予防することができる。例えば、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、例えばＣＮＳ損傷、外傷、負傷、脳脊髓損傷、脳腫瘍、感染、虚血、脳卒中、自己免疫反応及び／又は神経退行性疾患からニューロンの破壊による星状細胞数の異常増加を抑制又は予防でき、ＣＮＳにおいて傷跡形成を抑制又は予防でき、反応性酸素種の神経毒性レベルの放出又は潜在的に興奮毒性グルタメートの放出を抑制又は減少させることができ、ＣＮＳ損傷後発作、疼痛及び／又は２次変性を減少又は抑制させることができる。本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、好ましくはＣＮＳ損傷又は負傷後ニューロン及び／又は軸索の再成長を促進、刺激、増加又は活性化させることができる。

【0114】

本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、タンパク質コア及びコンドロイチン硫酸（ＣＳＧＰ）、例えばアグレカン（ＣＳＰＧ１）、ベルシカン（ＣＳＰＧ２）、ニューロカン（ＣＳＰＧ３）、ＣＳＰＧ４（又はニューロン膠細胞抗原２（ＮＧ２））、ＣＳＰＧ５、ＳＭＣ３（ＣＳＰＧ６、染色体３の構造的維持）、ブレビカン（ＣＳＰＧ７）、ＣＤ４４（ＣＳＰＧ８、分化クラスター４４）及びホスファカンニューロカン（ＣＳＰＧ３）で構成されたプロテオグリカンを含むコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現を抑制することができる。一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、ニューロカン及び／又はＮＧ２のレベル、又はニューロカン及び／又はＮＧ２の活性を抑制、下落又は減少させる。

【0115】

本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、ニューロンの核でｃ－ｆｏｓ及びｐＥＲＫの発現を増加させることができ、例えば、ｃ－ｆｏｓ及びｐＥＲＫのｍＲＮＡ、タンパク質及び／又はタンパク質活性を増加させることができる。本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体はまた、ＧＡＰ４３ｍＲＮＡ、ＧＡＰ４３タンパク質の発現レベルを増加又は向上させたり、或いはＧＡＰ４３タンパク質活性を増加又は向上させることができる。

【0116】

一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ここで、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、６及び７に提示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、これらのそれぞれは任意に１個、２個又は３個の突然変異を含み；ここで、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、９及び１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のうち少なくとも１つは１個、２個又は３個の突然変異を含み；並びに、ここで、抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に提示されたＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に提示されたＶＬを含む基準抗体に比べてヒト対象において減少した免疫原性を有する。

【0117】

一部の実施形態において、抗体に含まれた突然変異は、置換、欠失及び／又は挿入である。一実施形態において、突然変異は置換、例えば保存的置換である。本発明で使われた“保存的置換”（保存的代替とも呼ばれる。）は、与えられたアミノ酸を類似の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性及びサイズ）を有する異なるアミノ酸に変化させるアミノ酸置換を意味する。

【0118】

アミノ酸を分類する方法には様々なものがあるが、しはじば構造及びＲ基の一般的な化学的特性を基準に６個の主要グループに分類される。

【0119】

【表3】

【0120】

逆に、ラジカル置換又はラジカル代替は、互いに異なる物理化学的特性を有する最終アミノ酸に初期アミノ酸を交換するアミノ酸置換である。特定の実施形態において、ＦＡＭ１９Ａ５抗体におけるアミノ酸突然変異はラジカル置換である。他の実施形態において、ＦＡＭ１９Ａ５抗体におけるアミノ酸突然変異は、保存的置換及びラジカル置換の組合せである。

【0121】

一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の重鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に提示されたアミノ酸配列（ＧＳＡＳＹＩＴＡＡＴＩＤＡ）を含む。特定の実施形態において、重鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に提示されたアミノ酸配列を１個、２個又は３個の突然変異と共に含む。一部の実施形態において、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に提示されたアミノ酸配列（ＳＹＱＭＧ）を含む。特定の実施形態において、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に提示されたアミノ酸配列を１個、２個又は３個の突然変異と共に含む。一部の実施形態において、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に提示されたアミノ酸配列（ＶＩＮＫＳＧＳＤＴＳ）を含む。特定の実施形態において、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に提示されたアミノ酸配列を１個、２個又は３個の突然変異と共に含む。特定の実施形態において、突然変異はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸１においてバリンが脂肪族アミノ酸に置換されたものを含む。特定の実施形態において、脂肪族アミノ酸はアラニンを含む。一部の実施形態において、突然変異はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸５においてセリンが脂肪族アミノ酸に置換されたものを含む。特定の実施形態において、脂肪族アミノ酸はグリシンを含む。

【0122】

一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の軽鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に提示されたアミノ酸配列（ＳＧＧＧＳＳＧＹＧＹＧ）を含む。特定の実施形態において、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に提示されたアミノ酸配列を１個、２個又は３個の突然変異と共に含む。一部の実施形態において、突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸４においてグリシンが脂肪族アミノ酸に置換されたものを含む。一部の実施形態において、脂肪族アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン又はイソロイシンを含む。特定の実施形態において、脂肪族アミノ酸はアラニンである。

【0123】

一部の実施形態において、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に提示されたアミノ酸配列（ＷＮＤＫＲＰＳ）を含む。特定の実施形態において、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に提示されたアミノ酸配列を１個、２個、３個又は４個の突然変異と共に含む。一部の実施形態において、突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸１においてトリプトファンが塩基性アミノ酸に置換されたものを含む。一部の実施形態において、塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン又はリシンを含む。特定の実施形態において、塩基性アミノ酸はリシンである。一部の実施形態において、突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸２においてアスパラギンが酸性アミノ酸に置換されたものを含む。特定の実施形態において、酸性アミノ酸はアスパラギン酸又はグルタミン酸を含む。一部の実施形態において、酸性アミノ酸はアスパラギン酸である。一部の実施形態において、突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸３においてアスパラギン酸がヒドロキシル又は硫黄／セレニウム含有アミノ酸に置換されたものを含む。特定の実施形態において、ヒドロキシル又は硫黄／セレニウム含有アミノ酸は、セリンを含む。一部の実施形態において、突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸４においてリシンが酸性アミノ酸に置換されたものを含む。一部の実施形態において、酸性アミノ酸はアスパラギン酸又はグルタミン酸を含む。一部の実施形態において、酸性アミノ酸はグルタミン酸である。

【0124】

一部の実施形態において、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に提示されたアミノ酸配列（ＧＮＤＤＹＳＳＤＳＧＹＶＧＶ）を含む。特定の実施形態において、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に提示されたアミノ酸配列を１個、２個又は３個の突然変異と共に含む。

【0125】

一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体はヒト化する。他の実施形態において、ヒト化した抗ＦＡＭ１９Ａ５は、ヒト抗体のフレームワーク領域を含む。特定の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、抗体のフレームワーク領域（すなわち、ＶＨのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４及び／又はＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）内に１つ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７個以上）の突然変異を含む。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、ＶＨのＦＲ１内に突然変異を含む。特定の実施形態において、突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基２１においてアミノ酸置換（例えば、バリンが脂肪族アミノ酸、例えばセリンに）を含む。一部の実施形態において、突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基１９においてアミノ酸置換（例えば、セリンが塩基性アミノ酸、例えばアルギニンに）を含む。他の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体はＶＨのＦＲ２内に１つ以上の突然変異を含む。特定の実施形態において、突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基４９においてアミノ酸置換（例えば、グリシンがヒドロキシル又は硫黄／セレニウム含有アミノ酸、例えばセリンに）を含む。一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、ＶＨのＦＲ３内に１つ以上の突然変異（例えば１、２、３、４、５、６又は７個の突然変異）を含む。特定の実施形態において、突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の残基７９（例えば、バリンが塩基性アミノ酸、例えばリシンに）、残基８０（例えば、アルギニンが芳香族アミノ酸、例えばチロシンに）、残基８３（例えば、リシンがヒドロキシル又は硫黄／セレニウム含有アミノ酸、例えばメチオニンに）、残基８５（例えば、アスパラギンがヒドロキシル又は硫黄／セレニウム含有アミノ酸、例えばセリンに）、残基９２（例えば、グリシンが脂肪族アミノ酸、例えばアラニンに）、及び／又は残基９３（例えばトレオニンが脂肪族アミノ酸、例えばバリンに）においてアミノ酸置換を含む。

【0126】

一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、ＶＬのＦＲ１内に突然変異（例えば、１個又は２個の突然変異）を含む。特定の実施形態において、突然変異は、残基１６においてアミノ酸置換（例えば、バリンが脂肪族アミノ酸、例えばアラニンに）を含む。特定の実施形態において、突然変異はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の残基１７においてアミノ酸置換（例えば、リシンが塩基性アミノ酸、例えばアルギニンに）を含む。一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、ＶＬのＦＲ２内に１つ以上の突然変異を含む。特定の実施形態において、突然変異はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸残基３７の欠失を含む。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体はＶＬのＦＲ３内に突然変異を含む。特定の実施形態において、突然変異はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸残基６４において置換（例えば、リシンがヒドロキシル又は硫黄／セレニウム含有アミノ酸、例えばセリンに）を含む。一部の実施形態において、突然変異はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の残基７３において置換（例えば、トレオニンがヒドロキシル又は硫黄／セレニウム含有アミノ酸、例えばセリンに）を含む。

【0127】

一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｖ）軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に提示されたアミノ酸配列を含み；及び（ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に提示されたアミノ酸配列を含む。

【0128】

一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｖ）軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に提示されたアミノ酸配列を含み；及び（ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に提示されたアミノ酸配列を含む。

【0129】

一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ここで、（ｉ）重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｉｖ）軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に提示されたアミノ酸配列を含み；（ｖ）軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に提示されたアミノ酸配列を含み；及び（ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に提示されたアミノ酸配列を含む。

【0130】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に提示されたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％同じアミノ酸配列を含み、及び／又は、ここで、ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に提示されたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％同じアミノ酸配列を含み、ここで、抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に提示されたＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に提示されたＶＬを含む基準抗体に比べて減少した免疫原性を有する。

【0131】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に提示されたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同じアミノ酸配列を含み、及び／又は、ここで、ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に提示されたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％同じアミノ酸配列を含み、ここで、抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に提示されたＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に提示されたＶＬを含む基準抗体に比べて減少した免疫原性を有する。

【0132】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に提示されたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％同じアミノ酸配列を含み、及び／又は、ここで、ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に提示されたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％同じアミノ酸配列を含み、ここで、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に提示されたＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に提示されたＶＬを含む基準抗体に比べて減少した免疫原性を有する。

【0133】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に提示されたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％同じアミノ酸配列を含み、及び／又は、ここで、ＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に提示されたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％同じアミノ酸配列を含み、ここで、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に提示されたＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に提示されたＶＬを含む基準抗体に比べて減少した免疫原性を有する。

【0134】

一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む基準抗体と交差競合し、ここで、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に提示されたアミノ酸配列を含み、及びＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に提示されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、ＶＨ及びＶＬを含む基準抗体と同じヒトＦＡＭ１９Ａ５エピトープに結合し、ここで、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に提示されたアミノ酸配列を含み、及びＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に提示されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヒトＦＡＭ１９Ａ５エピトープはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に提示されたアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヒトＦＡＭ１９Ａ５エピトープはアミノ酸ＧＣＤＬＬＩＮＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）を含む。

【0135】

特定の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は基準抗体（例えば、１－６５抗体）を有するヒトＦＡＭ１９Ａ５エピトープと結合するために（又は、結合を抑制するために）交差競合する。

【0136】

特定の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は当該基準抗体（例えば、１－６５抗体）のヒトＦＡＭ１９Ａ５との結合を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％まで抑制する。競合抗体は同一エピトープ、重複エピトープ又は隣接エピトープに結合する（例えば、立体障害によって立証される。）。２個の抗体が標的に結合するために互いに競合するか否かは、ＲＩＡ及びＥＩＡのように当業界に公知の競合実験を用いて決定され得る。

【0137】

２個の抗体が同一エピトープに結合するか否かを決定する技術は、例えばエピトープマッピング方法、例えばエピトープの原子分解能を提供する抗原：抗体複合体結晶のｘ線分析、水素／重水素交換質量分析法（ＨＤＸ－ＭＳ）、及び抗原断片に対する抗体の結合又は抗原の突然変異された変異をモニタリングする方法を含み、ここで、抗原配列内のアミノ酸残基の変形による結合損失は、しばしばエピトープ成分の表示であるエピトープマッピングのための計算組合せ方法が考慮される。

【0138】

本発明の方法に有用な抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、例えば抗体をヒトＦＡＭ１９Ａ５の断片に結合させることによって、決定されたように、成熟したヒトＦＡＭ１９Ａ５の１つ以上のエピトープに結合し得る。一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、ＣＤＭＬＰＣＬＥＧＥＧＣＤＬＬＩＮＲＳＧのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸９０～１０９）、例えば、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１５の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸を有するエピトープに位置する断片に結合する。特定の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、１つ以上のアミノ酸残基９９～１０７（すなわち、ＥＧＣＤＬＬＩＮＲ）、例えばアミノ酸残基１０２、１０３、１０５及び１０７（すなわち、ＤＬ－Ｉ－Ｒ）においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に結合する。

【0139】

一部の実施形態において、少なくとも１つのエピトープは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同じアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体はその天然形態（すなわち、未変性）でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５又はその断片に結合する。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体はグリコシル化及びグリコシル化していないヒトＦＡＭ１９Ａ５の両方に結合する。

【0140】

一部の実施形態において、本発明は、例えば免疫分析（例えば、ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴又は動力学的排除分析によって測定される時、ＦＡＭ１９Ａ５ファミリーの他のタンパク質に比べて２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はより高い親和度でＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体又はその抗原結合断片は、例えば免疫分析によって測定されるように、ＦＡＭ１９Ａファミリーにおいて他のタンパク質との交差反応性無しでＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に結合する。

【0141】

一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、天然抗体でないか、自然発生抗体でない。例えば、一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、より多い、より少ない又は異なる類型の翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）後修飾を有することによって、自然的に発生する抗体のものとは異なる翻訳後修飾を有する。

【0142】

本開示内容の例示的な抗体のＶＨ及びＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列はそれぞれ表３及び表４に提供される。ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列はそれぞれ表５及び表６に提供される。

【0143】

【表4】

【0144】

【表5】

【0145】

【表6】

【0146】

【表7】

【0147】

一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は重鎖及び軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域（ＶＨ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。他の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のアミノ酸配列に提示されたＶＨを含み、及び／又はＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含む。

【0148】

一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は重鎖及び軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域（ＶＨ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。他の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列に提示されたＶＨを含み、及び／又はＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のアミノ酸配列を含む。

【0149】

一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は重鎖及び軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域（ＶＨ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。他の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のアミノ酸配列に提示されたＶＨを含み、及び／又はＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のアミノ酸配列を含む。

【0150】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、３０又は３１に提示されたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％同じアミノ酸配列を含み、及び／又は軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８又は３２に提示されたアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同じアミノ酸配列を含み、ここで、ＶＨはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、３０又は３１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、及びＶＬはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８又は３２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。

【0151】

本明細書に記述されたＶＨドメイン又はその１つ以上のＣＤＲは、重鎖、例えば全長重鎖を形成するための定常のドメインに連結され得る。類似に、本明細書に記載されたＶＬドメイン又はその１つ以上のＣＤＲは、軽鎖、例えば全長軽鎖を形成するための定常ドメインに結合され得る。全長重鎖及び全長軽鎖が結合して全長抗体を形成する。

【0152】

したがって、特定の実施形態において、本発明は、抗体軽鎖及び重鎖、例えば別途の軽鎖及び重鎖を含む抗体を提供する。軽鎖と関連して、特定の実施形態において、本明細書に記載された抗体の軽鎖はカッパ軽鎖である。他の特定の実施形態において、本明細書に記載された抗体の軽鎖はラムダ軽鎖である。さらに他の特定の実施形態において、本明細書に記載された抗体の軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖又はヒトラムダ軽鎖である。特定の実施形態において、ＦＡＭ１９Ａ５ポリペプチド（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に特異的に結合する本発明の抗体は、本明細書に記載された任意のＶＬ又はＶＬ ＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、ここで、軽鎖の定常領域はヒトカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＦＡＭ１９Ａ５ポリペプチド（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に特異的に結合する本発明の抗体は、本明細書に記載されたＶＬ又はＶＬ ＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、ここで、軽鎖の定常領域はヒトラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。ヒト定常領域配列の非制限的な例は当業界に記述されており、例えば、特許第５，６９３，７８０号及びカバット（Ｋａｂａｔ）ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）を参照する。

【0153】

重鎖と関連して、一部の実施形態において、本明細書に記載された抗体の重鎖は、アルファ（α）、デルタ（δ）、エプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びミュー（μ）重鎖であり得る。他の特定の実施形態において、本明細書に記載された抗体の重鎖は、ヒトアルファ（α）、デルタ（δ）、エプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びミュー（μ）重鎖を含むことができる。一実施形態において、ＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に特異的に結合する本明細書に記載された抗体は、本明細書に記載されたＶＨ又はＶＨ ＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖を含み、ここで、重鎖の定常領域はヒトガンマ（γ）重鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に特異的に結合する本明細書に記載された抗体は、本明細書に開示されたＶＨ又はＶＨ ＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖を含み、ここで、重鎖の定常領域は、本明細書に記述又は当業界に公知のヒト重鎖のアミノ酸を含む。ヒト定常領域配列の非制限的な例は当業界に記述されており、例えば米国特許第５，６９３，７８０号及びＫａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）を参照する。

【0154】

一部の実施形態において、ＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に特異的に結合する本明細書に記載された抗体は、ＶＨ又はＶＨ ＣＤＲ及びＶＬ及びＶＬ ＣＤＲを含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含み、ここで、定常領域はＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＹ免疫グロブリン分子又はヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＹ免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態において、ＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に特異的に結合する本発明の抗体は、本明細書に記載された任意のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン及びＶＨドメインを含み、ここで、定常領域はＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＹ免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）の定常領域のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、定常領域はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）及びアロタイプ（例えば、Ｇ１ｍ、Ｇ２ｍ、Ｇ３ｍ及びｎＧ４ｍ）及びその変異体を含んで自然発生するヒトＩｇＧの定常領域のアミノ酸配列を含む。例えば、Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５２０（２０１４年１０月２０日にオンライン掲示）及びＪｅｆｆｅｒｉｓ Ｒ．及びＬｅｆｒａｎｃ ＭＰ，ｍＡｂｓ １：４，１－７（２００９）参照。一部の実施形態において、定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の定常領域のアミノ酸配列又はその変異体を含む。

【0155】

特定の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、Ｆｃエフェクター機能、例えば補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）及び／又は抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）を有しない。エフェクター機能はＦｃ領域によって媒介され、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインでヒンジ領域に最も近接した残基は先天免疫系のエフェクター細胞上でＣｌｑ（補体）及びＩｇＧ－Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）に対して非常に重なった結合部位を含むので、抗体のエフェクター機能を担当する。また、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３抗体に比べてより低いレベルのＦｃエフェクター機能を有する。抗体のエフェクター機能は次のように当業界に公知の個別の接近法によって減少又は回避され得る：（１）Ｆｃ領域を欠如した抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、又はモノマーＶＨ又はＶＬドメインで構成されたｓｄＡｂ）の使用；（２）糖付着残基の欠失又は変更、酵素的に糖を除去、グリコシル化抑制剤の存在の下に培養された細胞で抗体の生成、又はタンパク質をグリコシル化できない細胞（例えば、バクテリア宿主細胞）における抗体の発現（バクテリア宿主細胞、米国特許公開第２０１２０１００１４０号参照）によって生成可能な、無グリコシル化抗体の生成；（３）エフェクター機能が減少したＩｇＧ亜型からのＦｃ領域の利用（例えば、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４抗体からのＦｃ領域又はＩｇＧ２又はＩｇＧ４抗体からのＣＨ２ドメインを含むキメラＦｃ領域、例えば、米国特許公開第２０１２０１００１４０号及びＬａｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１：４７６９－４７７７（２０１３）参照）；及び（４）Ｆｃ機能が減少又は不存在している突然変異を持つＦｃ領域の生成（米国特許公開第２０１２０１００１４０号及びそこに引用された米国出願及びＰＣＴ出願とＡｎ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ １：６，５７２－５７９（２００９）参照）。

【0156】

したがって、一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、又は単量体性ＶＨ又はＶＬドメインで構成されたｓｄＡｂである。このような抗体断片は当業界に公知されており、上記に説明されている。

【0157】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は単鎖Ｆｖである。例示的な抗ＦＡＭ１９Ａ５ ｓｃＦｖのアミノ酸配列は、下記表７に提供される。

【0158】

【表8】

【0159】

一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、Ｆｃエフェクター機能が減少又は不存在しているＦｃ領域を含む。一部の実施形態において、定常領域はヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＦｃ領域のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体はＩｇＧ２／ＩｇＧ４アイソタイプのものである。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体はＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ２ドメインとＩｇＧ１アイソタイプのＩｇＧ抗体からのＣＨ３ドメインを含むキメラＦｃ領域、又はＩｇＧ２からのヒンジ領域とＩｇＧ４からのＣＨ２領域を含むキメラＦｃ領域、又は減少又は不存在しているＦｃ機能をもたらす突然変異を持つＦｃ領域を含む。Ｆｃエフェクター機能が減少又は不存在しているＦｃ領域は当業界に公知のものを含む（例えば、Ｌａｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１：４７６９－４７７７（２０１３）；Ａｎ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ １：６，５７２－５７９（２００９）；及び米国特許公開第２０１２０１００１４０号及びそこに引用された米国特許と特許公開及びＰＣＴ公開を参照）また、Ｆｃエフェクター機能が減少又は不存在しているＦｃ領域は当業者にとって容易に製造可能である。

【0160】

ＩＩＩ．核酸分子
本発明の他の態様は、明細書で記述された抗体のいずれか一つを暗号化する１つ以上の核酸分子に関する。核酸は全体細胞に、細胞溶解物に、又は部分的に精製された形態や実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ性／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、寒天ゲル電気泳動及び当業界に公知の他の技術を含む標準技術によって、他の細胞成分又は他の汚染物、例えば他の細胞核酸（例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば自然で単離したＤＮＡに連結された染色体ＤＮＡ）又はタンパク質から精製されたとき、“単離したり”又は“実質的に純粋である”（Ｆ Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ，，ｅｄ．（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。本明細書に開示された核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含有してもよく、含有しなくてもよい。特定の実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。

【0161】

本明細書に開示された核酸は、標準分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、下記説明されるヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスから製造されたハイブリドーマ）によって発現した抗体の場合、ハイブリドーマによって製造された抗体の軽鎖及び重鎖を暗号化するｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー（例えば、ファージディスプレイ技術を利用）から得られた抗体の場合、この抗体を暗号化する核酸がライブラリーから回収され得る。

【0162】

本明細書に開示された特定核酸分子は、本発明の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体のＶＨ及びＶＬ及びＶＬ配列を暗号化するものである。このような抗体のＶＨ及びＶＬ及びＶＬ配列を暗号化する例示的なＤＮＡ配列は、それぞれ表８及び表９に提示されている。

【0163】

【表9】

【0164】

【表10】

【0165】

明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を製造する方法は、信号ペプチドと共に重鎖及び軽鎖を暗号化するヌクレオチド配列、例えば、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１及び２２を含む細胞株で重鎖及び軽鎖を発現することを含むことができる。これらのヌクレオチド配列を含む宿主細胞は本発明に含まれる。

【0166】

ＶＨ及びＶＬセグメントを暗号化するＤＮＡ断片が得られた後、これらのＤＮＡ断片は、例えば可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に転換するために、標準組換えＤＮＡ技術によってさらに操作され得る。それらの操作において、ＶＬ－又はＶＨ－暗号化ＤＮＡ断片は、抗体定常領域又は可撓性リンカーのような他のタンパク質を暗号化する他のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。本明細書において用語“作動可能に連結された”とは、２個のＤＮＡ断片によって暗号化されたアミノ酸配列がイン－フレーム（ｉｎ－ｆｒａｍｅ）を維持するように２個のＤＮＡ断片がつながることを意味する。

【0167】

ＶＨ領域を暗号化する単離したＤＮＡは、ＶＨ－暗号化ＤＮＡを重鎖定常領域（ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３）を暗号化する他のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって全長重鎖遺伝子に転換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当業界に公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１－３２４２参照）、これらの領域を含むＤＮＡ断片を標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域、例えばＩｇＧ２及び／又はＩｇＧ４定常領域であり得る。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、ＶＨ－暗号化ＤＮＡは単に重鎖ＣＨ１定常領域のみを暗号化する他のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。

【0168】

ＶＬ領域を暗号化する単離したＤＮＡは、ＶＬ－暗号化ＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬを暗号化する他のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって全長軽鎖遺伝子（のみならず、Ｆａｂ軽鎖遺伝子）に転換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当業界に公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１－３２４２参照）、これらの領域を含むＤＮＡ断片を標準ＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域はカッパ又はラムダ定常領域であり得る。

【0169】

ｓｃＦｖ遺伝子を生成するために、ＶＨ－及びＶＬ－暗号化ＤＮＡ断片は可撓性リンカーを暗号化する、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３を暗号化する他の断片に作動可能に連結され、これによってＶＬとＶＨ領域が可撓性リンカーによって結合された状態でＶＨ及びＶＬ配列は連続単鎖タンパク質として発現し得る（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４参照）。例示的な抗ＦＡＭ１９Ａ５ ｓｃＦｖのアミノ酸及びヌクレオチド配列はそれぞれ表７（上記）及び表１０に提供される。

【0170】

【表11】

【0171】

一部の実施形態において、本発明は、抗体を暗号化するヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子を含むベクターを提供する。他の実施形態において、ベクターは遺伝子治療法に用いられ得る。

【0172】

本発明に好適なベクターは、発現ベクター、ウイルスベクター、及びプラスミドベクターを含む。一実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。

【0173】

本発明で用いられたように、発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入されたとき、挿入されたコーディング配列の転写及び遺伝子暗号解読のための必須要素、又はＲＮＡウイルスベクターの場合、複製及び遺伝子暗号解読のための必須要素を含有する任意の核酸構成物のことを指す。発現ベクターはプラスミド、ファージミド、ウイルス、及びこれらの誘導体を含むことができる。

【0174】

本開示内容の発現ベクターは、本明細書に開示された抗体を暗号化するポリヌクレオチドを含むことができる。一実施形態において、抗体に対するコーディング配列は発現制御配列に作動可能に連結される。本発明に用いられた通り、２個の核酸配列は、各成分核酸配列がその機能性を維持するようにする方式で共有結合する時に作動可能に連結される。コーディング配列及び遺伝子発現制御配列は、遺伝子発現制御配列の影響又は制御の下にコーディング配列の発現又は転写及び／又は翻訳を配置する方式で共有結合する時に作動可能に連結されるという。５’遺伝子発現配列においてプロモーターの誘導がコーディング配列の転写を招く場合及び２つのＤＮＡ配列間の結合特性が（１）フレームシフト突然変異の導入を招かないか、（２）プロモーター領域がコーディング配列の転写を指示する能力を妨害しないか、（３）相応するＲＮＡ転写体がタンパク質に解読される能力を妨害しない場合、２個のＤＮＡ配列は作動可能に連結されているという。したがって、遺伝子発現配列がコーディング核酸配列の転写に影響を与えて、生成された転写物が所望の抗体に翻訳され得る場合、遺伝子発現配列はコーディング核酸配列に作動可能に連結されるだろう。

【0175】

ウイルスベクターは、非制限的であるが、次のウイルスから核酸配列を含む：レトロウイルス、例えばモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルス、ハーベイ（Ｈａｒｖｅｙ）マウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス及びラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウイルス；レンチウイルス；アデノウイルス；アデノ関連ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタインバール（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ）ウイルス；乳頭腫ウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；小児痲痺ウイルス；及びレトロウイルスのようなＲＮＡウイルス。当業界に公知の他のベクターを容易に用いることができる。特定ウイルスベクターは非必須遺伝子が関心遺伝子に代替された非細胞病原性真核ウイルスに基づく。非細胞病原性ウイルスはレトロウイルスを含み、そのライフサイクルは宿主細胞ＤＮＡへの後続するウイルス統合と共にゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を含む。レトロウイルスはヒト遺伝子治療試験のために承認された。複製が不十分な（すなわち、所望のタンパク質の合成を指示することはできるが、感染性粒子を製造できない）レトロウイルスが最も有用である。このような遺伝子変形されたレトロウイルス発現ベクターは、生体内で遺伝子の高効率形質導入に対する一般的な有用性を有する。複製欠乏レトロウイルスを生成するための標準プロトコル（外因性遺伝物質をプラスミド内に混入、プラスミドにパッケージング細胞株の形質感染、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの生成、組織培養培地からウイルス粒子の収集及びウイルス粒子に標的細胞の感染の段階を含む。）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）及びＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）に提供される。

【0176】

一実施形態において、ウイルスはアデノ関連ウイルスである二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ関連ウイルスは、複製不十分に操作可能であり、広範囲な細胞類型及び種を感染させることができる。また、熱及び脂質溶媒安定性；造血細胞を含めて様々な系統の細胞において高い形質導入頻度；及び重複感染（ｓｕｐｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）抑制の欠如による多数の形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）許容といった長所がある。報告された通り、アデノ関連ウイルスは部位特異的方式でヒト細胞ＤＮＡに統合可能であり、これによって、挿入突然変異誘発の可能性及びレトロウイルス感染の挿入された遺伝子発現特性の可変性を最小化することができる。また、野生型アデノ関連ウイルス感染は、選択的圧迫がない時、１００回以上組織で追跡され、これは、アデノ関連ウイルスゲノム統合が比較的安定した事例であることを暗示する。アデノ関連ウイルスはまた、染色体外（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）方式で機能することもできる。

【0177】

他の実施形態において、ベクターはレンチウイルスから由来する。特定の実施形態において、ベクターは非分裂細胞を感染させ得る組換えレンチウイルスのベクターである。

【0178】

レンチウイルスゲノム及びプロウイルスＤＮＡは、典型的にレトロウイルスから発見される３個の遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを有し、これらは２個の長い末端反復（ＬＴＲ）配列によって側面に位置する。ｇａｇ遺伝子は、内部構造（マトリックス、カプシド及びヌクレオカプシド）タンパク質を暗号化し；ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡ指示されたＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼ及びインテグラーゼを暗号化し；ｅｎｖ遺伝子はウイルス外皮糖タンパク質を暗号化する。５’及び３’ＬＴＲ’ｓは、ビリオンＲＮＡ’ｓの転写及びポリアデニル化を促進させる役割を担う。ＬＴＲは、ウイルス複製に必要な他の全てのシス－作用（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ）配列を含む。レンチウイルスは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆ及びｖｐｘ（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２及び／又はＳＩＶにおいて）を含む追加遺伝子を有している。

【0179】

５’ＬＴＲに隣接してゲノム（ｔＲＮＡプライマー結合部位）の逆転写及びウイルスＲＮＡの粒子内への効率的なカプセル化（Ｐｓｉ部位）に必要な配列である。カプセル化（又は、レトロウイルスＲＮＡの感染性ビリオンへのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから欠落すると、シス欠陥はゲノムＲＮＡのカプセル化を防止する。

【0180】

しかし、生成された突然変異体は、全てのビリオンタンパク質の合成を指示できる状態に残っている。本発明は、パッケージング機能、すなわちｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖだけでなく、ｒｅｖ及びｔａｔを保有する２以上のベクターに適切な宿主細胞を形質感染させる段階を含む非分裂細胞を感染させることができる組換えレンチウイルスの製造方法を提供する。以下に開示されるように、機能的ｔａｔ遺伝子を欠如したベクターは、特定適用に好ましい。したがって、例えば、第１ベクターは、ウイルスｇａｇ及びウイルスｐｏｌを暗号化する核酸を提供でき、他のベクターは、パッケージング細胞を生成するためにウイルスｅｎｖを暗号化する核酸を提供できる。本明細書において伝達ベクターとして確認された異種性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子をパッケージング細胞内に提供するベクターを導入すれば、関心のある外来遺伝子を保有する感染性ウイルス粒子を放出する生産細胞が生成される。

【0181】

前述したベクター及び外来遺伝子の構成によれば、第２ベクターはウイルス外皮（ｅｎｖ）遺伝子を暗号化する核酸を提供することができる。ｅｎｖ遺伝子はレトロウイルスを含めてほとんど全ての適切なウイルスから由来し得る。一部の実施形態において、ｅｎｖタンパク質はヒト及び他の種の細胞の形質導入を許容する両種性外皮タンパク質である。

【0182】

レトロウイルス由来したｅｎｖ遺伝子の例は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ又はＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ又はＨＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ又はＭＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ｇｉｂｂｏｎ ａｐｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＧａｌＶ又はＧＡＬＶ）、ヒト免疫欠乏ウイルス（ＨＩＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）を含むが、これに制限されない。水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＳＶ）タンパク質Ｇ（ＶＳＶ Ｇ）のような他のｅｎｖ遺伝子、肝炎ウイルス及びインフルエンザーの遺伝子も用いられ得る。

【0183】

ウイルスｅｎｖ核酸配列を提供するベクターは、本明細書の他の所に記述された調節配列と作動可能に関連される。

【0184】

特定の実施形態において、ベクターは、ベクターが非分裂細胞を形質導入させる能力を損傷させずにＨＩＶ毒性遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆが欠失されたレンチウイルスベクターを含む。

【0185】

一部の実施形態において、ベクターは３’ＬＴＲのＵ３領域の欠失を含むレンチウイルスベクターを含む。Ｕ３領域の欠失は全体削除又は部分削除であり得る。

【0186】

一部の実施形態において、本明細書に開示されたＦＶＩＩＩヌクレオチド配列を含む本発明のレンチウイルスベクターは、（ａ）ｇａｇ、ｐｏｌ又はｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を含む第１ヌクレオチド配列、及び（ｂ）異種性ｅｎｖ遺伝子を含む第２ヌクレオチド配列で細胞において形質感染され得；ここで、レンチウイルスベクターは機能性ｔａｔ遺伝子が欠如している。他の実施形態において、細胞は、ｒｅｖ遺伝子を含む第４ヌクレオチド配列でさらに形質感染される。特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ及びｎｅｆ、又はこれらの組合せから選択された機能性遺伝子が欠如している。

【0187】

特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｇａｇタンパク質、Ｒｅｖ反応要素、中心ポリプリントラック（ｃＰＰＴ）、又はこれらの任意の組合せを暗号化する１つ以上のヌクレオチド配列を含む。

【0188】

レンチウイルスベクターの例は、Ｗ０９９３１２５１、Ｗ０９７１２６２２、Ｗ０９８１７８１５、Ｗ０９８１７８１６及びＷ０９８１８９３４に開示されており、これらはその全文が本明細書に参照として含まれる。

【0189】

他のベクターはプラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは本技術分野で広範囲に記述されており、当業者に広く公知されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｌ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９参照。ここ数年間、プラスミドベクターは宿主ゲノム内で複製して宿主ゲノムに統合できないことから、生体内で細胞に遺伝子を伝達するのに特に有利なものとして明らかになった。しかし、宿主細胞と交換性であるプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内に作動可能に暗号化された遺伝子からペプチドを発現することができる。商業用供給社から入手でき、一般的に用いられる一部のプラスミドは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、様々なｐｃＤＮＡプラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ、様々なｐＣＭＶプラスミド、ｐＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを含む。特定プラスミドの追加例は、ｐｃＤＮＡ３．１、カタログ番号Ｖ７９０２０；ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ、カタログ番号Ｖ８７０２０；ｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ－Ｈｉｓ、カタログ番号Ｖ８６３２０；及びｐＢｕｄＣＥ４．１、カタログ番号Ｖ５３２２０があり、これらはいずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）社製である。他のプラスミドは当業者によく知られている。また、プラスミドはＤＮＡの特定断片を除去及び／又は追加するために標準分子生物学技術を用いてカスタマイズ設計され得る。

【0190】

ＩＶ．抗体生成
ＦＡＭ１９Ａ５に免疫特異的に結合する抗体又はその断片（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）は、抗体の合成のために当業界に公知の任意の方法、例えば化学的合成又は組換え発現技術によって生成され得る。本明細書に開示された方法は、特に言及がない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子分析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成及び変形、核酸混成化、及び当業界技術範囲内の関連分野の従来の技術を利用する。これらの技術は、例えば本明細書で引用された参考文献に詳細に説明されている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７ ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７ ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ）Ｇａｉｔ（ｅｄ．）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）（１９９１）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｒｒｅｎ Ｂ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ参照）。

【0191】

特定の実施形態において、本明細書に開示された抗体は、例えば、合成、ＤＮＡ配列の遺伝子操作を用いた生成を伴う任意の手段によって製造、発現、生成又は単離した抗体（例えば、組換え抗体）である。特定の実施形態において、このような抗体は生体内動物又は哺乳類（例えば、ヒト）の抗体ジャームライン（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）レパートリー内に自然的に存在しない配列（例えば、ＤＮＡ配列又はアミノ酸配列）を含む。一部の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は脱免疫化された。

【0192】

実施例（例えば、実施例２）に記載されるように、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、ニワトリを合成ＦＡＭ１９Ａ５ペプチドで免疫化させることによって初期に生成された。したがって、ヒト対象に投与される時に免疫原性の危険を最小化するために、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体（例えば、１－６５）はヒト抗体の免疫原性配列とより類似になるように変形された。一部の実施形態において、本明細書に開示された脱免疫化された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、脱免疫化されていない相応する対応抗体に比べてヒトＦＡＭ１９Ａ５と類似の結合親和度を有する。抗体を脱免疫化させる方法は本発明に開示されており、当業界に公知されている。

【0193】

特定の態様において、本発明は、本明細書に開示された細胞又は宿主細胞を培養することを含め、ＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する。特定の態様において、本発明は、本明細書に開示された細胞又は宿主細胞（例えば、本明細書に開示された抗体を暗号化するポリヌクレオチドを含む細胞又は宿主細胞）を用いて抗体又はその抗原結合断片を発現（例えば、組換え発現）させることによって、ＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を製造する方法を提供する。特定の実施形態において、細胞は単離した細胞である。特定の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは細胞内に導入された。特定の実施形態において、本発明の方法は、細胞又は宿主細胞から得られた抗体又はその抗原結合断片を精製する段階をさらに含む。

【0194】

多クローン性抗体を生成する方法は当業界に公知されている（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ １１，ｉｎ，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。

【0195】

単クローン性抗体は、ハイブリドーマ、組換え及びファージディスプレイ技術又はこれらの組合せを用いる当業界に公知の様々な技術を用いて製造することができる。例えば、単クローン性抗体は当業界に公知されており、例えば、Ｈａｒｌｏｗ Ｅ ＆ Ｌａｎｅ Ｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ＧＪ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３ ６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）に開示されたハイブリドーマ技術を用いて生成され得る。本明細書において用語“単クローン性抗体”は、ハイブリドーマ技術によって生成された抗体に制限されない。例えば、単クローン性抗体は、本明細書に開示された抗体又はその断片、例えば当該抗体の軽鎖及び／又は重鎖を外因的に発現させる宿主細胞から組換え的に生成され得る。

【0196】

特定の実施形態において、本明細書において“単クローン性抗体”は、単一細胞（例えば、ハイブリドーマ又は組換え抗体を生成する宿主細胞）によって生成された抗体であり、ここで、抗体は、例えばＥＬＩＳＡ又は当業界に公知されているか、本明細書の実施例に記載された他の抗原結合又は競合的結合分析によって決定されたように、ＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に免疫特異的に結合する。特定の実施形態において、単クローン性抗体はキメラ抗体又はヒト化した抗体であり得る。特定の実施形態において、単クローン性抗体は１価抗体又は多価（例えば、２価）抗体である。特定の実施形態において、単クローン性抗体は単一特異的又は多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）である。本明細書に開示された単クローン性抗体は、例えばＫｏｈｌｅｒ Ｇ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５に記載されたハイブリドーマ方法によって製造され得るか、或いは、例えば本明細書に記載のような技術を用いてファージライブラリーから単離し得る。クローン細胞株及びこれによって発現した単クローン性抗体の製造のための他の方法は当業界に公知されている（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ １１ ｉｎ：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ参照）。

【0197】

ハイブリドーマ技術を用いて特定抗体を生成しスクリーニングする方法は日常的で且つ当業界に公知である。例えば、ハイブリドーマ方法において、マウス又はヒツジ、ヤギ、ウサギ、ネズミ、ハムスター又はマカクザルのような他の適切な宿主動物は、免疫化に使用されるタンパク質（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に特異的に結合する抗体を生成したり生成し得るリンパ球を誘導するように免疫化される。代案として、リンパ球は試験管内で免疫化され得る。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールのような適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ ＪＷ（Ｅｄ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。また、ＲＩＭＭＳ（反復免疫化多重部位）技術を用いて動物を免疫化させることができる（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ＫＥ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：３８１－９、全体内容が参照として含まれる。）。

【0198】

一部の実施形態において、マウス（又は他の動物、例えばニワトリ、ネズミ、サル、ロバ、ブタ、ヒツジ、ハムスター又はイヌ）は、抗原（例えば、ＦＡＭ１９Ａ５、例えばヒトＦＡＭ１９Ａ５）で免疫化され得、免疫反応が検出され、例えば抗原に特異的な抗体がマウス血清から検出されると、マウス脾臓を取り入れて脾臓細胞を分離する。次いで、脾臓細胞を公知の技術によって任意の適切な骨髄腫細胞、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な細胞株ＳＰ２０の細胞に融合させてハイブリドーマを形成する。ハイブリドーマは、制限された希釈によって選択されクローニングされる。特定の実施形態において、免疫化されたマウスのリンパ節を取り入れ、ＮＳＯ骨髄腫細胞と融合される。

【0199】

こうして製造されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合されていない親骨髄腫細胞の成長又は生存を抑制する１つ以上の物質を含有する適切な培養培地に接種され成長される。例えば、親骨髄腫細胞に酵素ハイポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）グアニンホスホリボシル転移酵素（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠如している場合、ハイブリドーマの培養培地は典型的にハイポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含むはずであり、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠乏細胞の成長を防止する。

【0200】

特定の実施形態は効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に敏感な骨髄腫細胞を用いる。これらのうち、骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫細胞（ｍｙｅｌｏｍａ ｌｉｎｅ）、例えばＮＳＯ細胞株又はＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ－２１及びＭＰＣ１１マウス腫瘍、及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡから購入可能なＳＰ－２又はＸ６３－Ａｇ８．６５３細胞から由来したものである。ヒト骨髄腫及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株はまた、ヒト単クローン性抗体の生成に対して記述されている（Ｋｏｚｂｏｒ Ｄ（１９８４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３３：３００１－５；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。

【0201】

ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、ＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に対する単クローン性抗体の生成に対して分析される。ハイブリドーマ細胞によって生成された単クローン性抗体の結合特異性は、当業界に公知の方法、例えば免疫沈殿又は試験管内結合分析、例えば放射線免疫分析（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸収分析（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。

【0202】

所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を生成するハイブリドーマ細胞が確認された後、制限希釈手順によってクローンをサブクローニングし、標準方法（Ｇｏｄｉｎｇ ＪＷ（Ｅｄ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｓｕｐｒａ）によって成長させることができる。このような目的に適した培養培地は、例えばＤ－ＭＥＭ又はＲＰＭＩ１６４０培地を含む。また、ハイブリドーマ細胞は動物において腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）腫瘍として生体内で成長し得る。

【0203】

サブクローンによって分泌された単クローン性抗体は、例えばタンパク質Ａ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又は親和性クロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製手順によって培養培地、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）又は血清から適切に分離される。

【0204】

本明細書に記載された抗体は、特異的ＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）を認識し、当業者に公知の任意の技術によって生成され得る抗体断片を含む。例えば、本明細書に開示されたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を生成するために）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成するために）のような酵素を用いて免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって生成され得る。Ｆａｂ断片は、抗体分子の２個の同じアーム（ａｒｍ）のいずれか一方に相応し、重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと対をなす完全な軽鎖を含有する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域で二硫化物結合によって連結された抗体分子の２個の抗原結合アームを含有する。

【0205】

また、本明細書に開示された抗体又はその抗原結合断片はまた、当業界に公知の様々なファージディスプレイ方法を用いて生成され得る。ファージディスプレイ方法において、機能的抗体ドメインはそれらを暗号化するポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に表示される。特に、ＶＨ及びＶＬドメインを暗号化するＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、影響を受けた組織のマウス又はニワトリｃＤＮＡライブラリーのようなヒト又は非ヒト）から増幅される。ＶＨ及びＶＬドメインを暗号化するＤＮＡはＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーと共に組み換えられ、ファージミドベクター内にクローニングされる。大腸菌においてベクターを電気穿孔し、大腸菌をヘルパーファージに感染させる。これらの方法に用いられたファージは、典型的にｆｄ及びＭ１３を含む糸状（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）ファージであり、そしてＶＨ及びＶＬドメインは一般にファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩに組換え的に融合される。特定抗原に結合する抗原結合ドメインを発現させるファージは、例えば標識された抗原又は固体表面又はビーズに結合したり捕獲された抗原を用いて抗原によって選択又は確認され得る。本明細書に開示された抗体を製造するために利用可能なファージディスプレイ方法の例は、次の文献に記載されている：Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１－５０；Ａｍｅｓ ＲＳ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７－１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ＣＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４：９５２－９５８；Ｐｅｒｓｉｃ Ｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｅ １８７：９－１８；Ｂｕｒｔｏｎ ＤＲ ＆ Ｂａｒｂａｓ ＣＦ（１９９４）Ａｄｖａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５７：１９１－２８０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／００１１３４；国際公開番号ＷＯ９０／０２８０９号、ＷＯ９１／１０７３７号、ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９２／１８６１９号、ＷＯ９３／１１２３６号、ＷＯ９５／１５９８２号、ＷＯ９５／２０４０１号、及びＷＯ９７／１３８４４号；及び米国特許番号第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号及び第５，９６９，１０８号。

【0206】

前記参照文献に記載されたように、ファージ選択後、ファージからの抗体コーディング領域は単離して、ヒト抗体又は任意の他の所望の抗原結合断片を含む全抗体を生成し、任意の所望の宿主で発現するように用いられ得るが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及びバクテリアを含む任意の所望の宿主において、例えば下記記載のように発現する。Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片のような抗体断片を組換え的に生成する技術は、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ＲＬ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４－９；Ｓａｗａｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４：２６－３４；及びＢｅｔｔｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１－１０４３に記載されたような公知の方法によって実施され得る。

【0207】

一態様において、全抗体を生成するために、ＶＨ又はＶＬヌクレオチド配列、制限部位、及び制限部位を保護するための側面に位置する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列を含むＰＣＲプライマーを用いて、鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）からＶＨ又はＶＬ配列、例えばｓｃＦｖクローンを増幅させることができる。当業者に公知のクローニング技術を用いて、ＰＣＲ増幅されたＶＨドメインはＶＨ定常領域を発現させベクター内にクローニングされ得、そしてＰＣＲ増幅されたＶＬドメインはＶＬ定常領域、例えばヒトカッパ又はラムダ定常領域を発現させるベクター内にクローニングされ得る。ＶＨ及びＶＬドメインはまた、必要な定常領域を発現させる一つのベクター内にクローニングされ得る。重鎖転換ベクター及び軽鎖転換ベクターは続いて細胞株に共同形質感染され、当業者に公知の技術を用いて全長抗体、例えばＩｇＧを発現させる安定的な又は一時的な細胞株を生成する。

【0208】

キメラ抗体は、抗体の互いに異なる部分が互いに異なる免疫グロブリン分子から由来した分子である。例えば、キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域に融合された非ヒト動物（例えば、マウス、ネズミ又はニワトリ）単クローン性抗体の可変領域を含有し得る。キメラ抗体を生成する方法は当業界に公知されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＬ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－７；Ｏｉ ＶＴ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＬ（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４－２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２；及び米国特許番号第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、第４，８１６，３９７号及び第６，３３１，４１５号参照。

【0209】

ヒト化した抗体はあらかじめ決定された抗原に結合でき、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域及び非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲ（例えば、マウス又はニワトリ免疫グロブリン）を含む。特定の実施形態において、ヒト化した抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にヒト免疫グロブリンの一部を含む。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４領域を含むことができる。ヒト化した抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む全ての種類の免疫グロブリン、及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択され得る。ヒト化した抗体は、次のように当業界に公知の様々な技術を用いて生産され得るが、これに制限されない：ＣＤＲ－グラフティング（ヨーロッパ特許ＥＰ２３９４００；国際公開番号ＷＯ９１／０９９６７；及び米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号及び第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）又は再舗装（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ヨーロッパ特許ＥＰ５９２１０６及びＥＰ５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ ＥＡ（１９９１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８（４／５）：４８９－４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ＧＭ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｔ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５－８１４；及びＲｏｇｕｓｋａ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：９６９－９７３）、チェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、並びに、例えば米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開ＷＯ９３／１７１０５；Ｔａｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：１１１９－２５；Ｃａｌｄａｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（５）：３５３－６０；Ｍｏｒｅａ Ｖ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０（３）：２６７－７９；Ｂａｃａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２（１６）：１０６７８－８４；Ｒｏｇｕｓｋａ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９（１０）：８９５９０４；Ｃｏｕｔｏ ＪＲ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３ Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ－５９７７ｓ；Ｃｏｕｔｏ ＪＲ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（８）：１７１７－２２；Ｓａｎｄｈｕ ＪＳ（１９９４）Ｇｅｎｅ １５０（２）：４０９－１０及びＰｅｄｅｒｓｅｎ ＪＴ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）７ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３５（３）：９５９－７３に記載の技術。また、米国出願公開ＵＳ２００５／００４２６６４Ａ１（２００５年２月２４日）はその全文が本明細書に参照として含まれる。

【0210】

多重特異的（例えば、二重特異的抗体）を製造する方法は、例えば米国特許第７，９５１，９１７号；第７，１８３，０７６号；第８，２２７，５７７号；第５，８３７，２４２号；第５，９８９，８３０号；第５，８６９，６２０号；第６，１３２，９９２号及び第８，５８６，７１３号に記載されている。

【0211】

単一ドメイン抗体、例えば軽鎖を欠如している抗体は、当業界に公知の方法によって生成され得る。Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ ＆ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３１：２５－３８；Ｎｕｔｔａｌｌ ＳＤ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １（３）：２５３－２６３；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ，（２００１）Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７４（４）：２７７－３０２；米国特許第６，００５，０７９号；及び国際公開番号ＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９４／２５５９１及びＷＯ０１／４４３０１参照。

【0212】

また、ＦＡＭ１９Ａ５抗原に免疫特異的に結合する抗体は結局、当業者に公知の技術を用いて抗原を“摸倣”する抗イディオタイプ抗体を生成するのに用いられ得る（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ＮＳ ＆ Ｂｏｎａ ＣＡ（１９８９）ＦＡＳＥＢ Ｊ７（５）：４３７－４４４；及びＮｉｓｓｉｎｏｆｆ Ａ（１９９１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７（８）：２４２９－２４３８参照）。

【0213】

特定の実施形態において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体と同じＦＡＭ１９Ａ５のエピトープ（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に結合する本明細書に開示された抗体は、ヒト抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施形態において、本明細書に開示の抗体がＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に結合することを競合的に遮断する（例えば、容量依存的方式で）抗体（例えば、１－６５）はヒト抗体又はその抗原結合断片である。

【0214】

ヒト抗体は当業界に公知の任意の方法を用いて生成され得る。例えば、機能性内因性免疫グロブリンを発現させることはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させ得る遺伝子導入マウスが用いられ得る。特に、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は無作為に又は相同組換えによってマウス胚性幹細胞内に導入され得る。代案として、ヒト可変領域、定常領域及び多様性領域は、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子以外にマウス胚性幹細胞内に導入され得る。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は相同組換えによってヒト免疫グロブリン遺伝子坐の導入と共に個別的に又は同時に非機能的になり得る。特に、ＪＨ領域の同型接合性（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）欠失は、内因性抗体生成を防止する。変形された胚性幹細胞を拡張させ、胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ）内に微細注射してキメラマウスを生産する。次いで、キメラマウスを育ててヒト抗体を発現させる同型子孫を生産する。遺伝子導入マウスは、選択された抗原、例えば抗原（例えば、ＦＡＭ１９Ａ５）の全部又は一部によって正常な方式で免疫化される。抗原に対して指示された単クローン性抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて免疫化された遺伝子導入マウスから得られる。形質転換マウスによって取り入れられたヒト免疫グロブリン転移遺伝子はＢ細胞分化の間に再配列され、続いてクラス転換及び体細胞突然変異を行う。したがって、このような技術を用いて治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体を生成することができる。ヒト抗体を生成するためのこの技術に対する概要は、Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ ＆ Ｈｕｓｚａｒ Ｄ（１９９５）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５－９３を参照する。ヒト抗体及びヒト単クローン性抗体を生成するための当該技術及びこのような抗体を生成するためのプロトコルに対する詳細な議論は、例えば、国際公開ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９６／３４０９６及びＷＯ９６／３３７３５；及び米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号及び第５，９３９，５９８号を参照する。ヒト抗体を生成できるマウスの例は、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^ＴＭ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．；米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，１８４号）、ＨＵＡＢ－ＭＯＵＳＥ^ＴＭ（Ｍｅｄｅｒｅｘ，Ｉｎｃ．／Ｇｅｎ Ｐｈａｒｍ；米国特許第５，５４５，８０６号及び第５，５６９，８２５号）、ＴＲＡＮＳ ＣＨＲＯＭＯ ＭＯＵＳＥ^ＴＭ（Ｋｉｒｉｎ）及びＫＭ ＭＯＵＳＥ^ＴＭ（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｋｉｒｉｎ）を含む。

【0215】

ＦＡＭ１９Ａ５に特異的に結合するヒト抗体（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）は、ヒト免疫グロブリン配列から由来した抗体ライブラリーを用いて、上述したファージディスプレイ方法を含めて当業界に公知の様々な方法によって製造され得る。また、米国特許第４，４４４，８８７号、第４，７１６，１１１号及び第５，８８５，７９３号；及び国際公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９１／１０７４１参照。

【0216】

一部の実施形態において、ヒト抗体はマウス－ヒトハイブリドーマを用いて生成され得る。例えば、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）で形質転換されたヒト末梢血液リンパ球は、マウス骨髄腫細胞と融合してヒト単クローン性抗体を分泌するマウス－ヒトハイブリドーマを生成することができ、そしてこれらのマウス－ヒトハイブリドーマは、標的抗原に免疫特異的に結合するヒト単クローン性抗体を分泌するもの（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５のようなＦＡＭ１９Ａ５）を決定するためにスクリーニングされ得る。かかる方法は当業界に公知及び記述されている。例えば、Ｓｈｉｎｍｏｔｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４６：１９－２３；Ｎａｇａｎａｗａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １４：２７－３１参照。

【0217】

Ｖ．抗体の操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）方法
上記論議された通り、本明細書に開示されたＶＨ及びＶＬ配列を有する抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、ＶＨ及び／又はＶＬ配列、又はこれに付着された定常領域を変形させることによって新しい抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を生成するために利用可能である。したがって、本明細書に開示された他の態様において、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の構造的特徴は、本明細書に開示された抗体の少なくとも１つの機能的特性、例えばヒトＦＡＭ１９Ａ５への結合を保有する構造的に関連した抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を生成するために用いられる。例えば、操作方法の出発物質は、本明細書に提供のＶＨ及び／又はＶＬ配列、又はその１つ以上のＣＤＲ領域である。操作された抗体を生成するために、本明細書に提供された１つ以上のＶＨ及び／又はＶＬ配列又はその１つ以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に製造（すなわち、タンパク質として発現）する必要はない。むしろ、配列に含まれた情報は出発物質として用いられて、元来の配列から由来した“第２世代”配列を生成した後、“第２世代”配列を製造し、タンパク質として発現する。

【0218】

したがって、本発明は次の段階を含む抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の製造方法を提供する：
（ａ）（ｉ）表３に提示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列、又は表５に提示された重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含む重鎖可変領域配列；及び（ｉｉ）表４に提示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列、又は表６に提示された重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域配列を提供する段階；
（ｂ）少なくとも１つの変更された抗体配列を生成するために重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列内に少なくとも１つのアミノ酸残基を変更させる段階；及び
（ｃ）変更された抗体配列をタンパク質として発現させる段階。

【0219】

標準分子生物学技術を用いて変更された抗体配列を製造し発現させることができる。

【0220】

一部の実施形態において、変更された抗体配列によって暗号化された抗体は、本明細書に記載された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の機能的特性の一つ、一部又は全部を保有する抗体であり、これは次のを含む：
（１）ヒト対象で減少した免疫原性；
（２）例えば、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される時、１０ｎＭ以下（例えば、０．０１ｎＭ～１０ｎＭ）のＫ_Ｄを有する可溶性ヒトＦＡＭ１９Ａ５への結合；
（３）例えば、ＥＬＩＳＡによって測定される時、１０ｎＭ以下（例えば、０．０１ｎＭ～１ｎＭ）のＫ_Ｄを有する膜結合したヒトＦＡＭ１９Ａ５への結合；
（４）例えば、ＥＬＩＳＡによって測定される時、１ｎＭ以下（例えば、０．０１ｎＭ～１ｎＭ）のＥＣ５０を有する膜結合したヒトＦＡＭ１９Ａ５への結合；
（５）反応性神経膠症の発病減少、逆転、遅延及び／又は予防；
（６）反応性星状細胞の過度な増殖抑制；
（７）ニューロカン及びニューロン－神経膠抗原２（ＮＧ２）を含むコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現減少；
（８）ニューロンの核でｃ－ｆｏｓ及びｐＥＲＫの発現増加；
（９）ニューロンの生存促進；
（１０）ニューロンでＧＡＰ４３の発現増加；
（１１）軸索の再成長促進；及び
（１２）本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を有するヒトＦＡＭ１９Ａ５に結合するためのいずれか一方向又は両方向競合。

【0221】

変更された抗体は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１、又は前記（１）～（１２）に提示された全ての機能的特性を示すことができる。変形された抗体の機能的特性は当業界で利用可能であり及び／又は本明細書に記載の標準分析、例えば実施例（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ）に記載されたような標準分析を用いて評価され得る。

【0222】

本明細書に提示された抗体操作方法の特定の実施形態において、突然変異は抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体コーディング配列の全部又は一部に沿って無作為に又は選択的に導入され得、その結果として生成されて変形された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、結合活性及び／又は本明細書に提示された他の機能的特性のためにスクリーニングされ得る。突然変異方法は当業界の技術分野に記述されている。例えば、ＳｈｏｒｔのＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９２７８０は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー又はこれらの組合せを用いて抗体突然変異を生成及びスクリーニングする方法を記述する。代案として、Ｌａｚａｒ等のＰＣＴ公開ＷＯ０３／０７４６７９では、抗体の物理化学的特性を最適化するために電算スクリーニング方法を用いる方法を記述する。

【0223】

ＶＩ．細胞及びベクター
特定の態様において、本発明は、ＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）及び関連ポリヌクレオチド及び発現ベクターに特異的に結合する本明細書に記述された抗体（又はその抗原結合断片）を発現させる（例えば、組換え的に）細胞（例えば、宿主細胞）（又はその抗原結合断片）を提供する。本発明は抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を暗号化するヌクレオチド配列又は宿主細胞、例えば哺乳動物細胞における組換え発現のための断片を含むポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。本発明はまた、本明細書に記述された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体（例えば、ヒト又はヒト化した抗体）を組換え的に発現させるための当該ベクターを含む宿主細胞を提供する。特定の態様において、本発明は、宿主細胞からこのような抗体を発現させる、本明細書に記載された抗体の製造方法を提供する。

【0224】

ＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に特異的に結合する本明細書に記述された抗体（例えば、全長抗体、抗体の重鎖及び／又は軽鎖、又は単鎖抗体）の組換え発現は、抗体を暗号化するポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構成を含む。本明細書に記載された抗体分子、重鎖及び／又は軽鎖、又はその断片（例えば、重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン）を暗号化するポリヌクレオチドが得られると、抗体分子を生成するためのベクターは当業界に公知の技術を利用する組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。したがって、ヌクレオチド配列を暗号化する抗体又は抗体断片（例えば、軽鎖又は重鎖）を含有するポリヌクレオチドを発現させてタンパク質を製造する方法が本明細書に記載されている。当業者に公知の方法を用いて抗体又は抗体断片（例えば、軽鎖又は重鎖）コーディング配列及び適切な転写及び翻訳制御信号を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、試験管内組換えＤＮＡ技術、合成技術及び生体内遺伝子組換えを含む。本発明はまた、本明細書に記載された抗体分子、抗体の重鎖又は軽鎖、抗体又はその断片の重鎖又は軽鎖可変ドメイン、又は作動可能にプロモーターに連結された重鎖又は軽鎖ＣＤＲを暗号化するヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。当該ベクターは、例えば抗体分子の定常領域を暗号化するヌクレオチド配列を含み（例えば、国際公開番号ＷＯ８６／０５８０７及びＷＯ８９／０１０３６；及び米国特許番号第５，１２２，４６４号参照）、そして、抗体の可変ドメインは、全体重鎖、全体軽鎖、又は全体重鎖及び軽鎖の両方の発現のために当該ベクターにクローニングされ得る。

【0225】

発現ベクターは通常の技術によって細胞（例えば、宿主細胞）に伝達され得、次いで、生成された細胞は通常の技術によって培養されて本明細書に記載の抗体（例えば、本発明の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体のＶＨ及び／又はＶＬ、又はＶＨ及び／又はＶＬ ＣＤＲのいずれか１つ以上を含む抗体）又はその断片を生成することができる。したがって、本発明は、本明細書に記載された抗体又はその断片、又はその重鎖又は軽鎖、又はその断片、又は宿主細胞において当該配列の発現のためのプロモーターに作動可能に連結された本発明の単鎖抗体を暗号化するポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、二本鎖連結された抗体の発現のために、重鎖及び軽鎖の両方を個別的に暗号化するベクターは、下記に詳述されるように、全体免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞で共同発現し得る。特定の実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記載された抗体の重鎖及び軽鎖の両方を暗号化するポリヌクレオチド又はその断片を含むベクターを含有する。特定の実施形態において、宿主細胞は２個の異なるベクターを含有するが、第１ベクターは、本明細書に記載された抗体の重鎖又は重鎖可変領域を暗号化するポリヌクレオチド又はその断片を含み、及び第２ベクターは、本明細書に記載された抗体の軽鎖又は軽鎖可変領域をコーディングするポリヌクレオチド又はその断片を含む。他の実施形態において、第１宿主細胞は、本明細書に記載された抗体の重鎖又は重鎖可変領域を暗号化するポリヌクレオチドを含む第１ベクター又はその断片を含み、及び第２宿主細胞は、本明細書に記載された抗体の軽鎖又は軽鎖可変領域を暗号化するポリヌクレオチドを含む第２ベクターを含む。特定の実施形態において、重鎖／重鎖可変領域は、本明細書に記載された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体又はその抗原結合断片を形成するために第２細胞の軽鎖／軽鎖可変領域と関連した第１細胞によって発現する。特定の実施形態において、本発明は、当該第１宿主細胞及び第２宿主細胞を含む宿主細胞の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を提供する。

【0226】

特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の軽鎖／軽鎖可変領域を暗号化するポリヌクレオチドを含む第１ベクター、及び本明細書に記載された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の重鎖／重鎖可変領域を暗号化するポリヌクレオチドを含む第２ベクターを含むベクターの集団を提供する。

【0227】

様々な宿主発現ベクターシステムを用いて本明細書に記載の抗体分子を発現させることができる。当該宿主発現システムは、関心のあるコーディング配列が生成され、後続的に精製され得るビークルを表し、さらに、適切なヌクレオチドコーディング配列で形質転換又は形質感染される時、本明細書に記載の抗体分子を現場で発現させ得る細胞を表す。これらは次を含むが、これらに制限されない：組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又は抗体コーディング配列を含有するコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたバクテリア（例えば、大腸菌及びＢ．サブチリス）のような微生物；抗体コーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセスピキア）；抗体コーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞システム；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）；タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染されたり抗体コーディング配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞システム（例えば、クラミドモナスレインハーディのような緑藻類）；又は哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタルロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）から由来したプロモーターを含有する組換え発現構成物を収得する哺乳動物細胞システム（例えばＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１又はＣＯＳ）、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＳＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７０３０、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅＬａ及びＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０及びＢＭＴ１０細胞）。特定の実施形態において、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合断片を発現させるための細胞は、ＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ ＧＳ ＳＹＳＴＥＭ^ＴＭ（Ｌｏｎｚａ）のＣＨＯ細胞である。特定の実施形態において、本明細書に記載された抗体を発現させるための細胞は、ヒト細胞、例えばヒト細胞株である。特定の実施形態において、哺乳動物発現ベクターは、ＰＯＰＴＩＶＥＣ^ＴＭ又はｐｃＤＮＡ３．３である。特定の実施形態において、特に全体組換え抗体分子の発現のために大腸菌のようなバクテリア細胞又は真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）が組換え抗体分子の発現に用いられる。例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中間初期遺伝子プロモーター要素のようなベクターと共に中国ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞は、抗体に対する効果的な発現システムである（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ＭＫ ＆ Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ Ｈ（１９８６）Ｇｅｎｅ ４５：１０１－５；及びＣｏｃｋｅｔｔ ＭＩ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８（７）：６６２－７）。特定の実施形態において、本明細書に記載された抗体は、ＣＨＯ細胞又はＮＳＯ細胞によって生成される。特定の実施形態において、ＦＡＭ１９Ａ５（例えば、ヒトＦＡＭ１９Ａ５）に免疫特異的に結合する本発明の抗体を暗号化するヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターによって調節される。

【0228】

バクテリアシステムにおいて、発現する抗体分子に意図された用途によって多数の発現ベクターが有利に選択され得る。例えば、大量の当該抗体が生成される時、抗体分子の薬学組成物の生成のために、容易に精製された高いレベルの融合タンパク質生成物の発現を指示するベクターが好ましいだろう。このようなベクターは、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｅｔｈｅｒ Ｕ ＆ Ｍｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｌｌ Ｂ（１９８３）ＥＭＢＯ Ｊ２：１７９１－１７９４）を含むが、これに制限されず、ここで、抗体コーディング配列は、融合タンパク質が生成されるようにｌａｃ Ｚコーディング領域のフレーム内ベクター；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ Ｓ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ Ｍ（１９８５）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １３：３１０１－３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ Ｇ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ＳＭ（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４：５５０３－５５０９）；などに個別的にライゲーションされ得る。例えば、ｐＧＥＸベクターは、グルタチオン５－転移酵素（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために用いられ得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）ビーズに吸着及び結合した後、ガラスグルタチオンの存在の下に溶離させることによって、溶菌（ｌｙｓｅｄ）された細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子生成物がＧＳＴモイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）から放出され得るようにトロンビン又は因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計される。

【0229】

昆虫システムにおいて、オートグラファカルフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核ポリヘドリンウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、例えば外来遺伝子を発現させるベクターとして用いられ得る。ウイルスは、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞で成長する。抗体コーディング配列はウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別的にクローニングされ得、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれ得る。

【0230】

哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルス基盤発現システムが用いられ得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、関心のある抗体コーディング配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び３重リーダー配列に連結され得る。続いて、このキメラ遺伝子は試験管内又は生体内組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）における挿入は、感染された宿主で抗体分子を発現可能であり且つ生存可能な組換えウイルスを招くだろう（例えば、Ｌｏｇａｎ Ｊ ＆ Ｓｈｅｎｋ Ｔ（１９８４）ＰＮＡＳ ８１（１２）：３６５５－９参照）。挿入された抗体コーディング配列の効率的な翻訳のために特定開始信号が必要であることもある。これらの信号は、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。また、開始コドンは全体挿入物の翻訳を保障するために所望のコーディング配列の判読フレームと同じ位相でなければならない。これらの外因性翻訳制御信号及び開始コドンは天然及び合成両方の様々な起源であり得る。適切な転写増進因子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）要素、転写終結因子（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）などを含めることによって発現効率を向上させることができる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６－５４４参照）。

【0231】

また、挿入された配列の発現を調節したり、所望の特定方式で遺伝子生成物を変形及び加工する宿主細胞菌株を選択することができる。タンパク質生成物の当該変形（例えば、グリコシル化）及び加工（例えば、切断）はタンパク質の機能に重要であり得る。個別の宿主細胞はタンパク質及び遺伝子生成物の翻訳後加工及び変形のための特徴的で且つ特異的なメカニズムを有する。発現した外来タンパク質の正確な変形及び加工を保障するために適切な細胞株又は宿主システムが選択され得る。そのために、遺伝子生成物の一次転写、グリコシル化及びリン酸化の適切な処理のための細胞機構（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を保有する真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ）宿主細胞が用いられ得る。このような哺乳動物宿主細胞は次のようなものを含むが、これらに制限されない：ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢHＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０及びＴ４７Ｄ、ＮＳＯ（任意の免疫グロブリン鎖を内生的に生成しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７０３０、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１又はＣＯＳ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞。特定の実施形態において、本明細書に記載の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞で生成される。

【0232】

特定の実施形態において、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合部分はフコース含有量が減少したり或いはフコース含有量がない。このような抗体は当業者に公知の技術を用いて生成され得る。例えば、抗体はフコシル化能力がないか不足する細胞で発現し得る。特定例において、１，６－フコシル転移酵素の両側対立遺伝子のノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）を有する細胞株は、フコース含有量が減少した抗体又はその抗原結合部分を生成するのに用いられ得る。ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）システム（Ｌｏｎｚａ）は、フコース含有量が減少した抗体又はその抗原結合部分を生成するのに用いられ得る当該システムの例である。

【0233】

組換えタンパク質の長期間、高収率生産のために、安定した発現細胞が生成され得る。例えば、本明細書に記載の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を安定的に発現する細胞株は、その抗原結合部分を操作することができる。特定の実施形態において、本明細書に提供された細胞は、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合部分を形成するようにアソシエートされた軽鎖／軽鎖可変ドメイン及び重鎖／重鎖可変ドメインを安定的に発現する。

【0234】

特定の態様において、ウイルス複製起源を含有する発現ベクターを使用する代わりに、宿主細胞は適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、増進因子、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位など）及び選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。外来ＤＮＡ／ポリヌクレオチドの導入後、操作された細胞は濃縮培地で１～２日間成長した後、選択培地に転換され得る。組換えプラスミドで選別可能なマーカーは選別に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定的に統合し成長して病巣（ｆｏｃｉ）を形成し、結果として細胞株にクローニングされ拡張され得るようにする。この方法は、本明細書に記載の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体又はその抗体結合部分を発現する細胞株を操作するのに有利に用いられ得る。このような操作された細胞株は、特に抗体分子と直接又は間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価に有用であり得る。

【0235】

ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｃｅｌｌ １１（１）：２２３－３２）、ハイポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＥＨ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ Ｗ（１９６２）ＰＮＡＳ ４８（１２）：２０２６－２０３４）及びアデニンホスホリボシル転移酵素（Ｌｏｗｙ Ｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２（３）：８１７－２３）遺伝子を非制限的に含む数多くの選択システムがそれぞれ、ｔｋ－、ｈｇｐｒｔ－又はａｐｒｔ－細胞に用いられ得る。また、抗代謝物質耐性は次の遺伝子に対する選択の基礎として用いられ得る：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｉｒ（Ｗｉｇｌｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）ＰＮＡＳ ７７（６）：３５６７－７０；Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）ＰＮＡＳ ７８：１５２７－３１）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＲＣ ＆ Ｂｅｒｇ Ｐ（１９８１）ＰＮＡＳ ７８（４）：２０７２－６）；アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｗｕ ＧＹ ＆ Ｗｕ ＣＨ（１９９１）Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ Ｐ（１９９３）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ３２：５７３－５９６；マリガンＲＣ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２；及びＭｏｒｇａｎ ＲＡ ＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＷＦ（１９９３）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６２：１９１－２１７；Ｎａｂｅｌ ＧＪ ＆ Ｆｅｉｇｎｅｒ ＰＬ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１（５）：２１１－５）；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ＲＦ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｇｅｎｅ ３０（１－３）：１４７－５６）。組換えＤＮＡ技術分野で通常の公知された方法は所望の組換えクローンを選択するために日常的に適用可能であり、当該方法は、例えば次の文献に記述され、それらはその全文が本明細書に参照として含まれる：Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ Ｍ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；及びＣｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ＮＣ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ Ｆ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １５０：１－１４。

【0236】

抗体分子の発現レベルはベクター増幅によって増加され得る（検討のためにＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ＣＲ ＆ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ ＣＣＧ参照、ＤＮＡクローニングにおいて哺乳動物細胞でクローニングされた遺伝子の発現のための遺伝子増幅に基づくベクターの使用、Ｖｏｌ ３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）。抗体を発現するベクターシステムでマーカーが増幅され得る場合、宿主細胞培養に存在する抑制剤レベルの増加はマーカー遺伝子の複製数を増加させるだろう。増幅された領域は抗体遺伝子と関連しているので、抗体の生成も増加するだろう（Ｃｒｏｕｓｅ ＧＦ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：２５７－６６）。

【0237】

宿主細胞は、本明細書に記述の２個以上の発現ベクター、すなわち重鎖由来ポリペプチドを暗号化する第１ベクター及び軽鎖由来ポリペプチドを暗号化する第２ベクターで共同形質感染され得る。２個のベクターは重鎖及び軽鎖ポリペプチドの同一発現を可能にする、同一で且つ選択可能なマーカーを含有し得る。宿主細胞は異なる量の２個以上の発現ベクターで共同形質感染され得る。例えば、宿主細胞は第１発現ベクター及び第２発現ベクターのうち、次のいずれかの比率で形質感染され得る：１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５又は１：５０。

【0238】

代案として、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方を暗号化し発現できる単一ベクターが用いられ得る。このような状況で、過量の無毒性重鎖を避けるために軽鎖を重鎖の前に位置させなければならない（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ ＮＪ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５６２－５６５；及びＫｏｈｌｅｒ Ｇ（１９８０）ＰＮＡＳ ７７：２１９７－２１９９）。重鎖及び軽鎖に対するコーディング配列はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含むことができる。発現ベクターはモノシストロン性又はマルチシストロン性であり得る。マルチシストロン性核酸構成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上、又は２～５、５～１０又は１０～２０遺伝子／ヌクレオチド配列の範囲を暗号化できる。例えば、バイシストロン性核酸構成物は次の順序にプロモーター、第１遺伝子（例えば、本明細書に記述された抗体の重鎖）、及び第２遺伝子（例えば、本明細書に記述された抗体の軽鎖）を含むことができる。このような発現ベクターにおいて、両遺伝子の転写はプロモーターによって駆動され得るが、第１遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳はキャップ依存的スキャニングメカニズムによって行われ得、第２遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、例えば、ＩＲＥＳによるキャップ独立的メカニズムによって行われ得る。

【0239】

本明細書に記載された抗体分子が組換え発現によって生成されると、抗体分子は免疫グロブリン分子の精製のために当業界に公知の任意の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和度、特にタンパク質Ａ後の特定抗原に対する親和度、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差等溶解度、又はタンパク質精製のための任意の他の標準技術によって精製され得る。また、本明細書に記載された抗体は、精製を容易にするために、本明細書に記載又は当業界に公知の異種ポリペプチド配列に融合され得る。

【0240】

特定の実施形態において、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合部分は単離又は精製される。一般に、単離した抗体は、単離した抗体と異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体である。例えば、特定の実施形態において、本明細書に記載された抗体の製剤は、実質的に細胞物質及び／又は化学前駆体がない。“細胞物質が実質的にない”という語句は、抗体が単離したり組換え的に生成される細胞の細胞成分から抗体が分離される抗体の製剤を含むという意味である。したがって、実質的に細胞物質がない抗体は、異種性タンパク質（本明細書において“汚染タンパク質”とも呼ばれる。）が約３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％又は０．１％未満（乾燥重量基準）である抗体の製剤及び／又は抗体の変異体、例えば、異なる翻訳後修飾形態の抗体又は異なるバージョンの抗体（又は抗体結合部分）を有する抗体の製剤を含む。抗体が組換え的に生成される時、また一般的に培養培地が実質的になく、すなわち、培養培地はタンパク質製剤の体積の約２０％未満、１０％未満、２％、１％、０．５％又は０．１％を示す。抗体が化学的合成によって生成される場合、一般的に化学的前駆体又は他の化学物質が実質的になく、すなわち、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質から分離される。したがって、このような抗体の製剤は関心抗体以外の化学的前駆体又は化合物の約３０％、２０％、１０％又は５％未満（乾燥重量基準）を有する。特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体は単離又は精製される。

【0241】

ＶＩＩ．分析
本明細書に記載された抗体は、例えば標準ＥＬＩＳＡによってＦＡＭ１９Ａ５への結合に対して試験できる。簡単にいうと、微量定量（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートをＰＢＳ中の１～２μｇ／ｍｌ精製ＦＡＭ１９Ａ５でコーティングした後、ＰＢＳ中の５％ウシ血清アルブミンで遮断した。抗体の希釈液（例えば、ＦＡＭ１９Ａ５－免疫化されたマウスからの血漿の希釈液）を各ウェルに添加して３７℃で１～２時間培養する。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、３７℃で１時間ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に共役結合した２次試薬（例えば、ヒト抗体の場合、ヤギ－抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的多クローン性試薬）と共に培養する。洗浄後、プレートにＡＢＴＳ基質（Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ．、製品：ＡＢＴＳ－１０００）を展開し、ＯＤ ４１５～４９５で分光光度計で分析した。免疫化されたマウスからの血清は次に、ヒトＦＡＭ１９Ａ５を発現する細胞株に結合するために流動細胞測定法によってさらにスクリーニングされるが、ＦＡＭ１９Ａ５を発現しない対照群細胞株には結合しない。簡単にいうと、１：２０希釈でＦＡＭ１９Ａ５発現ＣＨＯ細胞を抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体と共に培養することによって抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の結合を評価する。細胞を洗浄し、ＰＥ標識された抗ヒトＩｇＧ Ａｂで結合を検出した。流細胞（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ）分析はＦＡＣＳｃａｎ流細胞分析（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて行われる。好ましくは、最高の力価を発生させるマウスが融合に用いられるだろう。

【0242】

上述したようなＥＬＩＳＡ分析法は、ＦＡＭ１９Ａ５免疫源と陽性反応性を表す抗体を生成する抗体及びハイブリドーマをスクリーニングするために用いることができる。好ましくは、ＦＡＭ１９Ａ５に高い親和力で結合する抗体を生成するハイブリドーマをサブクローニングし、さらに特性化することができる。（ＥＬＩＳＡによって）親細胞の反応性を維持する各ハイブリドーマから一つのクローンが細胞バンクを作り、抗体精製のために選択され得る。

【0243】

抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマは単クローン性抗体精製のために２リットルスピンナーフラスコで成長することができる。タンパク質Ａセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）への親和性クロマトグラフィー前に上澄液を濾過し濃縮させることができる。溶離されたＩｇＧはゲル電気泳動及び高性能液体クロマトグラフィーで確認して純度を保障することができる。緩衝溶液はＰＢＳに交換され、濃度は１．４３消滅係数を用いてＯＤ ２８０によって決定され得る。単クローン性抗体は分取され、－８０℃で保存され得る。

【0244】

選択された抗ＦＡＭ１９Ａ５単クローン性抗体が独特のエピトープに結合するかどうかを決定するために、各抗体は市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，ＩＬ）を用いてビオチン化され得る。ビオチン化されたＭＡｂ結合はストレプトアビジン標識されたプローブ（ｐｒｏｂｅ）で検出され得る。非標識された単クローン性抗体及びビオチン化された単クローン性抗体を使用した競合研究は、前記記載されたＦＡＭ１９Ａ５コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを用いて行うことができる。

【0245】

精製された抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡは、特定アイソタイプの抗体に特異的な試薬を用いて行うことができる。例えば、ヒト単クローン性抗体のアイソタイプを決定するために、微量定量プレートのウェルを４℃で一晩中１μｇ／ｍｌの抗ヒト免疫グロブリンでコーティングすることができる。１％ ＢＳＡで遮断した後、プレートを周囲温度で１～２時間１μｇ／ｍｌ以下の試験単クローン性抗体又は精製されたアイソタイプ対照群と反応させる。続いて、ウェルをヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＭ特異的アルカリ性ホスファターゼ共役結合したプローブと反応させることができる。プレートには前述の通りに展開され分析される。

【0246】

ＦＡＭ１９Ａ５を発現する生きている細胞に対する単クローン性抗体の結合を試験するために、実施例に記載されるように流細胞分析法を用いることができる。簡単にいうと、膜結合ＦＡＭ１９Ａ５（標準成長条件下で成長）を発現する細胞株は４℃で１時間０．１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳで様々な濃度の単クローン性抗体と混合される。洗浄後、細胞を１次抗体染色と同じ条件下でフルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）標識された抗ＩｇＧ抗体と反応させる。サンプルは、単一細胞上にゲートするために光及び側面散乱特性を用いてＦＡＣＳｃａｎ機器によって分析することができ、標識された抗体の結合が決定される。蛍光顕微鏡法を用いる他の分析法が流細胞分析法に加えて又は代案として用いられ得る。細胞は、前記記述された通りに正確に染色され、蛍光顕微鏡によって検査され得る。この方法を用いると個別の細胞を視角化できるが、抗原の密度によって感度が減少し得る。

【0247】

ウェスタンブロットによってＦＡＭ１９Ａ５抗原との反応性に対して抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体をさらに試験することができる。簡単にいうと、ＦＡＭ１９Ａ５を発現する細胞からの細胞抽出物を製造し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリラミドゲル電気泳動することができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に移し、２０％マウス血清で遮断し、試験する単クローン性抗体で調査する。ＩｇＧ結合は抗ＩｇＧアルカリ性ホスファターゼを用いて検出され、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で現像され得る。

【0248】

様々な抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の結合親和度、交差反応性及び結合動力学を分析する方法は、当業界に公知の標準分析法、例えばＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭ２０００ＳＰＲ機構（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を含む。

【0249】

一実施形態において、抗体は、可溶性形態のヒトＦＡＭ１９Ａ５に特異的に結合する。一実施形態において、抗体は膜結合形態のヒトＦＡＭ１９Ａ５に特異的に結合する。抗体はＦＡＭ１９Ａ５の特定エピトープに特異的に結合できる（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５内の断片）。特定の実施形態において、抗体は好ましくは高い親和度でヒトＦＡＭ１９Ａ５に結合し、タンパク質のＦＡＭ１９サブファミリーの他のメンバーと交差反応しない。

【0250】

ＶＩＩＩ．二重特異的分子
本明細書に記載された抗体は、二重特異的分子を形成するのに用いられ得る。抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体又はその抗原結合部分は、他の機能性分子、例えば他のペプチド又はタンパク質（例えば、受容体に対する他の抗体又はリガンド）に誘導されたり連結されて少なくとも２個の互いに異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成することができる。ＩＬ－６、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＥＧＦ及びＴＧＦａのようなサイトカインはタンパク質信号トランスデューサー（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）及び転写３の活性化剤（ＳＴＡＴ３）を活性化させることによって神経膠症及び／又は反応性星状膠細胞症（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）の発病のトリガーとして関与してきており（Ｂａｌａｓｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．ｌ４（２）：８４６－５６（１９９４）；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ２０；９２（１３）：５８６５－９（１９９５））、これは、ＣＮＳ損傷後反応性星状膠細胞症の多い様相を調節する。Ｈｅｒｒｍａｎｎ Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８（２８）：７２３１－７２４３（２００８）。例えば、ＳＴＡＴ３の不在又は減少は膠細胞繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の弱化した上向き調節、星状細胞肥大の失敗、及び炎症の拡散増加、病変体積増加及びＣＮＳ損傷後部分的に弱化した運動回復を招く。Ｈｅｒｒｍａｎｎ Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８（２８）：７２３１－７２４３（２００８）。したがって、例えば、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、組合せ治療のための神経膠症の発病及び／又は反応性星状膠細胞症の過度な増殖に関与する任意のタンパク質に特異的に結合する抗体又はｓｃＦｖ、例えばＩＬ－６、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、ＥＧＦ又はＴＧＦａに対する抗体に連結され得る。

【0251】

また、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、対象の中枢神経系損傷（例えば、外傷性脳損傷、脳脊髓損傷、脳卒中又は脳腫瘍）、脳脊髓系損傷、退行性脳障害（例えば、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、ＡＬＳ）、退行性脳脊髓又は神経障害又は神経病性疼痛を含む疾患又は障害を治療する抗体又はｓｃＦｖに連結され得る（セクションＸＩＩの疾患又は障害参照）。例えば、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、多発性硬化症を治療する抗体又はｓｃＦｖ、例えばＮａｔａｌｉｚｕｍａｂ（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標））、Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ（ＬＥＭＴＲＡＤＡ（登録商標））に連結され得る。

【0252】

本明細書に記述された抗体は、実際に２個以上の互いに異なる結合部位及び／又は標的分子に結合する多重特異的分子を生成するために、１つ以上の他の機能性分子に誘導されたり連結され得；このような多重特異的分子はまた、本明細書に用いられた用語“二重特異的分子”によって含まれるように意図される。本明細書に記載の二重特異的分子を生成するために、本明細書に記載された抗体は、１つ以上の他の結合分子、例えばさらに他の抗体、その抗体結合部分、ペプチド又は摸倣結合体（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｉｍｅｔｉｃ）に機能的に連結され得る（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合又はその他の方式によって）。一実施形態において、二重特異的分子はＦＡＭ１９Ａ５及びＶＥＧＦに結合する。他の実施形態において、二重特異的分子はＦＡＭ１９Ａ５及びＥＧＦに結合する。

【0253】

したがって、本発明は、ＦＡＭ１９Ａ５に対する少なくとも１つの第１結合特異性及び第２標的エピトープに対する第２結合特異性を含む二重特異的分子を提供する。二重特異的分子が多重特異的である本発明の実施形態において、分子は第３結合特異性をさらに含むことができる。

【0254】

一実施形態において、本明細書に記載された二重特異的分子は、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む１つ以上の抗体又はその抗体結合部分を結合特異性として含む。抗体はまた、軽鎖又は重鎖二量体、又はその任意の最小断片、例えばＬａｄｎｅｒ等の米国特許第４，９４６，７７８号に記述されたようなＦｖ又は単鎖構成物であり得、前記特許の内容は参照として含まれる。

【0255】

ヒト単クローン性抗体が好ましいが、本明細書に記載の二重特異的分子に用いられ得る他の抗体は、マウス、キメラ及びヒト化した単クローン性抗体である。

【0256】

本明細書に記載の二重特異的分子は、当業界に公知の方法を用いて構成成分結合特異性を共役結合することによって製造され得る。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は個別的に生成された後に互いに共役結合し得る。結合特異性がタンパク質又はペプチドである場合、共有共役結合のために様々なカップリング剤又は架橋剤が用いられ得る。架橋剤の例には、タンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロベンゾ酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）がある（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６０：１６８６；Ｌｉｕ，ＭＡ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８６４８参照）。他の方法は、Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．７８，１１８－１３２；Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１－８３）及びＧｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７－２３７５参照）。好ましい共役結合剤（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手可能なＳＡＴＡ及びスルホ－ＳＭＣＣである。

【0257】

結合特異性が抗体である場合、これらは２個の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によって共役結合し得る。特に好ましい実施形態において、ヒンジ領域は、共役結合前に奇数、好ましくは一つのスルフヒドリル残基を含有するように変形される。

【0258】

代案として、両結合特異性は同一ベクターで暗号化され、同一宿主細胞で発現及び集合され得る。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ ｘ ｍＡｂ、ｍＡｂ ｘ Ｆａｂ、ｍＡｂ ｘ（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ ｘ Ｆ（ａｂ’）２又はリガンド ｘ Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。二重特異的抗体は、各重鎖のＣ末端にｓｃＦｖを有する抗体を含むことができる。本明細書に記載された二重特異的分子は、一つの単鎖抗体及び結合決定因子を含む単鎖分子、又は２個の結合決定因子を含む単鎖二重特異的分子であり得る。二重特異的分子は少なくとも２個の単鎖分子を含むことができる。二重特異的分子の製造方法は、例えば米国特許番号５，２６０，２０３；米国特許番号５，４５５，０３０；米国特許番号４，８８１，１７５；米国特許番号５，１３２，４０５；米国特許番号５，０９１，５１３；米国特許番号５，４７６，７８６；米国特許番号５，０１３，６５３；米国特許番号５，２５８，４９８；及び米国特許番号５，４８２，８５８に記述されている。

【0259】

二重特異的分子のそれらの特異的標的に対する結合は、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫分析（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、生体分析（例えば、成長抑制）又はウェスタンブロット分析のような当業界に公知の方法を用いて確認され得る。これらの各分析は、一般に、関心のある複合体に特異的な標識された試薬（例えば、抗体）を使用することによって、特に関心のあるタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。

【0260】

ＩＸ．診断
一実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体に付着されたモイエティは、結合モイエティ、標識モイエティ及び生物学的活性モイエティからなる群から選ばれる。

【0261】

本明細書に記載された抗体は、サンプル試験及び生体内映像化を含めて診断目的に用いることができ、そのために、抗体（又はその結合部分）を適切な検出試薬（ａｇｅｎｔ）に共役結合させて免疫接合体を形成することができる。診断目的のために、適切な試薬は、全身映像化のための放射性同位元素、及び放射性同位元素、酵素、蛍光ラベル及びサンプル試験に適した他の抗体タグを含む検出可能なラベルである。

【0262】

検出可能なラベルは、試験管内診断分野で現在用いられる様々な類型のいずれであってもよく、その例には、コロイド性金のような金属ゾル、Ｎ２Ｓ２、Ｎ３Ｓ又はＮ４タイプのペプチドキレート剤と共に提供されたＩ^１２５又はＴｃ^９９のような同位元素を含む微粒子ラベル、蛍光マーカー、発光マーカー、燐光マーカーなどを含む発色団、与えられた物質を検出可能なマーカーに転換させる酵素ラベル、及び増幅後に例えばポリメラーゼ連鎖反応によって現れるポリヌクレオチドタグがある。適切な酵素ラベルは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどを含む。例えば、ラベルは、アダマンチルメトキシホスホリルオキシフェニルジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、ジナトリウム３－（４－（メトキシスピロ｛１，２－ジオキセタン－３，２’－（５’－クロロ）トリシクロ｛３．３．１，１３，７｝デカン｝－４－イル）フェニルホスフェート（ＣＳＰＤ）のような１，２－ジオキセタン物質の転換後に化学発光の存在又は形成を測定することによって検出される酵素アルカリ性ホスファターゼの他にも、ＣＤＰ及びＣＤＰ－ｓｔａｒ（登録商標）又は当業界に公知のその他発光性物質、例えばテルビウム（ＩＩＩ）及びユウロピウム（ＩＩＩ）のような適切なランタニドのキレートであり得る。検出手段は選択されたラベルによって決定される。ラベル又はその反応生成物の外観は、ラベルが微粒子であり且つ適切なレベルに蓄積された場合、肉眼で識別したり、又は標準慣行にしたがって分光光度計、発光計、蛍光計などのような機構を用いて識別することができる。

【0263】

本明細書に記載の抗体はまた、抗体－薬物接合体（ＡＤＣ）のような免疫接合体を形成するために治療剤に共役結合され得る。適切な治療剤は、神経膠症及び／又は反応性星状膠細胞症の発病調節剤及び／又は退行性脳障害、中枢神経系損傷又は神経病性疼痛治療剤を含む。退行性脳障害を治療するための治療剤は、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するための薬物を含む。これは、退行性脳障害を治療するために通常用いられる薬物、例えばセクションＸＩＩに説明された薬物を含む。

【0264】

免疫接合体は当業界に公知の方法によって製造され得る。好ましくは、共役結合方法は実質的に（又はほぼ）非免疫原性連結、例えばペプチド－（すなわち、アミド－）、スルフィド－、（立体的に妨げられる）、ジスルフィド－、ヒドラゾン－及びエーテル連結を招く。これらの連結はほぼ非免疫原性であり、血清内で適切な安定性を示す（例えば、Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３（２００９）２３５－２４４；ＷＯ２００９／０５９２７８；ＷＯ９５／１７８８６参照）。

【0265】

モイエティ及び抗体の生化学的性質によって、異なる共役結合戦略が用いられ得る。モイエティが５０～５００個アミノ酸の自然発生又は組換えである場合、タンパク質共役結合体の合成のための化学を記述する教科書に標準手順があり、当業者はこれに容易に従うことができる（例えば、Ｈａｃｋｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．Ｐ．Ｒ．，ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ，Ｄ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４７（２００８）１００３０－１００７４参照）。一実施形態において、マレイニミドモイエティと抗体又はモイエティ内のシステイン残基との反応が用いられる。これは、例えば、抗体のＦａｂ又はＦａｂ’－断片が用いられる場合に特に適切な結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）化学である。代案として、一実施形態において、抗体又はモイエティのＣ末端に結合することが行われる。タンパク質、例えばＦａｂ－断片のＣ末端変形は記載の通りに実施され得る（Ｓｕｎｂｕｌ，Ｍ．ａｎｄ Ｙｉｎ，Ｊ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．７（２００９）３３６１－３３７１）。

【0266】

一般に、部位特異的反応及び共有結合は、存在する他の官能基の反応性と直交する（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）反応性を有する天然アミノ酸をアミノ酸に変換させることに基づく。例えば、希少な配列コンテクスト内の特異的なシステインはアルデヒドにおいて酵素的に転換され得る（Ｆｒｅｓｅ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｄｉｅｒｋｓ，Ｔ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．１０（２００９）４２５－４２７参照）。与えられた配列コンテクストにおいて天然アミノ酸と特定酵素の特異的酵素反応性を用いて所望のアミノ酸変形を得ることも可能である（例えば、Ｔａｋｉ，Ｍ．ｅｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７（２００４）１１９－１２６；Ｇａｕｔｉｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１５（２００８）１２８－１３６参照）。プロテアーゼ－触媒化されたＣ－Ｎ結合形成は、Ｂｏｒｄｕｓａ，Ｆ．，Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）３８９－４０３）によって用いられる。

【0267】

部位特異的反応及び共有結合はまた、末端アミノ酸と適切な変形試薬の選択的反応によって達成され得る。ベンゾニトリルとＮ末端システインの反応性（Ｒｅｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４８（２００９）９６５８－９６６２参照）は部位特異的共有結合を達成するために用いられ得る。天然化学的ライゲーションはまた、Ｃ末端システイン残基に依存し得る（Ｔａｙｌｏｒ，Ｅ．Ｖｏｇｅｌ；Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，Ｂ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００９）、２２（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、６５－９６）。

【0268】

ＥＰ１０７４５６３は正に荷電されたアミノ酸のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）に位置したシステインと負に荷電されたアミノ酸のストレッチ内でシステインの早い反応に基づく共役結合方法を記述する。

【0269】

モイエティはまた、合成ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。ポリペプチドが化学的に合成される場合、直交化学的反応性を有するアミノ酸は当該合成中に混入し得る（例えば、Ｄｅ Ｇｒａａｆ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０（２００９）１２８１－１２９５参照）。非常に様々な直交官能基が危うくなっており、合成ペプチドに導入され得るためにこのようなペプチドがリンカーに共役結合することは標準化学である。

【0270】

単一標識されたポリペプチドを得るために、１：１化学量論を有する共役結合は、他の共役結合副産物からクロマトグラフィーによって分離され得る。この手順は、染料標識された結合対メンバー及び荷電されたリンカーを使用することによって促進され得る。かかる種類の標識され且つ正に荷電された結合対メンバーを使用することによって、単一共役結合したポリペプチドは、荷電及び分子量の差が分離に用いられ得るので、非標識されたポリペプチド及び１つ以上のリンカーを有するポリペプチドから容易に分離される。蛍光染料は、標識された１価結合剤のような非結合成分から複合体を精製するのに有用であり得る。

【0271】

Ｘ．製薬学的組成物
生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）のうち、所望する程度の純度を有する本明細書に開示された方法に有用な抗体又はその抗原結合部分を含む組成物が開示される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いられた投薬量及び濃度において受領者に非毒性であり、緩衝剤、例えばホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート化剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン（ｓａｌｔ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｏｕｎｔｅｒ－ｉｏｎｓ）、例えばナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／又は非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。

【0272】

特定の実施形態において、製薬学的組成物は、製薬学的に許容される担体中に、本明細書に開示の抗体又はその抗原結合部分、二重特異的分子、又は免疫接合体、及び選択的に１つ以上の追加の予防又は治療剤を含む。特定の実施形態において、製薬学的組成物は、製薬学的に許容される担体中に、本明細書に開示された抗体又はその抗原結合部分の有効量、及び選択的に１つ以上の追加の予防又は治療剤を含む。一部の実施形態において、抗体は製薬学的組成物に含まれた唯一の活性成分である。本明細書に開示された製薬学的組成物はＦＡＭ１９Ａ５活性を増進、誘発又は活性化し、且つ中枢神経系損傷、退行性脳障害又は神経病性疼痛のような病態を治療するのに有用である。

【0273】

非経口製剤に用いられた製薬学的に許容される担体は、水性ビークル、非水性ビークル、抗菌剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所痲酔剤、懸濁及び分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤又はキレート化剤及び他の製薬学的に許容される物質を含む。水性ビークルの例は、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロース及び乳酸加リンゲル液を含む。非水性非経口ビークルは、植物起源の固定油、綿実油、トウモロコシ油、胡麻油及ラッカセイ油を含む。静菌（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ）又は静真菌（ｆｕｎｇｉｓｔａｔｉｃ）濃度の抗菌剤が多回投与容器に包装された非経口製剤に添加されてもよく、これらはフェノール又はクレゾール、水銀含有物質、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチル及びプロピルｐ－ヒドロキシベンゾ酸エステル、チメロサール、ベンザルコニウムクロリド及びベンゼトニウムクロリドを含む。等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔ）は塩化ナトリウム及びデキストロースを含む。緩衝剤は、ホスフェート及びシトレートを含む。抗酸化剤は重硫酸ナトリウムを含む。局所痲酔剤はプロカイン塩酸塩を含む。懸濁剤及び分散剤は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリドンを含む。乳化剤はポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）を含む。金属イオンの封鎖剤又はキレート化剤はＥＤＴＡを含む。製薬学的担体はまた、水混和性ビークル用エチルアルコール、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコールを含み、ｐＨ調整用水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸又は乳酸を含む。

【0274】

製薬学的組成物は対象に対する任意の投与経路に合うように製剤化され得る。投与経路の具体的な例は、鼻内、経口、非経口、脊椎腔内、脳室内、肺、皮下、又は心室内経路を含む。皮下、筋肉内又は静脈内注射を特徴とする非経口投与がまた考慮される。注射可能物質が従来の形態で、液体溶液又は懸濁液、注射前に液体中で溶液又は懸濁液になるに適した固体形態、又はエマルジョンとして製造され得る。注射可能物質、溶液及びエマルジョンはまた、１つ以上の賦形剤を含有する。好適な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール又はエタノールである。また、所望時には、投与される製薬学的組成物は少量の非毒性補助物質、例えば湿潤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解性増進剤、及び他のそのような製剤、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン及びシクロデキストリンを含有し得る。

【0275】

抗体の非経口投与用製剤は、直に注射可能な滅菌溶液、使用直前に溶媒と直に調合可能な凍結乾燥した粉末のような滅菌乾燥可溶性製品、皮下注射用錠剤、直に注射可能な滅菌懸濁液、使用直前にビークルと直に調合可能な滅菌乾燥不溶性製品及び滅菌エマルジョンを含む。溶液は水性又は非水性であり得る。

【0276】

静脈内投与される場合、好適な担体は、生理学的食塩水又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、及び増粘及び溶解剤を含有する溶液、例えばグルコース、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコール及びこれらの混合物を含む。

【0277】

抗体を含む局部用混合物は、局所及び全身投与について説明されたとおりに製造される。得られた混合物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどであり得、クリーム、ゲル、軟膏、エマルジョン、溶液、エリキシル、ローション、懸濁液、チンキ剤、ペースト、フォーム、エアゾール、灌注剤、スプレー、坐薬、包帯、皮膚パッチ又は局部的投与に適した任意の他の製剤として製剤化できる。

【0278】

本明細書に開示された抗体又はその抗原結合部分は、例えば吸入による、局部的投与用エアゾールとして製剤化できる（例えば、米国特許第４，０４４，１２６号、第４，４１４，２０９号、及び第４，３６４，９２３号を参照、これらの特許は炎症性疾患、特に喘息の治療に有用なステロイドの分配のためのエアゾールを開示する。）。経気道投与用のこれらの製剤は、噴霧器用のエアゾール又は溶液の形態であるか、又は吸込剤用の超微細粉末であり得、単独で用いられたり又はラクトースのような非活性担体と組み合わせて使用される。この場合、製剤の粒子は、一部の実施形態において、５０ミクロン未満、一部の実施形態において、１０ミクロン未満の直径を有する。

【0279】

本明細書に開示された抗体又はその抗原結合部分は、局所又は局部的適用、例えば皮膚及び粘膜に局部的適用、例えば目に局所適用のために、ゲル、クリーム及びローションとして製剤化でき、目に適用又は胸骨内又は髄腔内適用のために製剤化できる。局部的投与は経皮伝達のために考慮され、また目や粘膜投与、又は吸入療法用に考慮される。他の製薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて又は単独で抗体の鼻液も投与され得る。

【0280】

イオン泳動及び電気泳動装置を含む経皮パッチが当業者にとって公知であり、抗体投与用に使用され得る。例えば、このようなパッチは、米国特許第６，２６７，９８３号、第６，２６１，５９５号、第６，２５６，５３３号、第６，１６７，３０１号、第６，０２４，９７５号、第６，０．１０７１５号、第５，９８５，３１７号、第５，９８３，１３４号、第５，９４８，４３３号、及び第５，８６０，９５７号に開示されている。

【0281】

特定の実施形態において、本明細書に開示された抗体又はその抗原結合部分を含む製薬学的組成物は凍結乾燥した粉末であり、これは、溶液、エマルジョン及び他の混合物として投与用に再構成され得る。凍結乾燥した粉末はまた、固形物又はゲルとして再構成及び製剤化されてもよい。凍結乾燥した粉末は、本明細書に開示された抗体又はその抗原結合部分、又はその製薬学的に許容される誘導体を適切な溶媒に溶解することによって製造される。一部の実施形態において、凍結乾燥した粉末は滅菌状態である。溶媒は粉末又は粉末から製造された再構成溶液の安定性又は他の薬物学的成分を改善する賦形剤を含有できる。使用可能な賦形剤は、制限ではないが、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース又は他の好適な製剤を含む。また、溶媒は、一部の実施形態において、ｐＨが弱中性である緩衝剤、例えばシトレート、ナトリウム又はカリウムホスフェート又は当業者に公知の他の緩衝剤を含有し得る。溶液を後続滅菌濾過した後、当業者に公知の標準条件下で凍結乾燥することによって所望の製剤を提供する。一部の実施形態において、得られた溶液は凍結乾燥用バイアルに配分される。各バイアルは、化合物の単一投薬量又は多回投薬量を含有し得る。凍結乾燥した粉末は適切な条件の下に、例えば約４℃～室温で保管され得る。

【0282】

注射用水によるこの凍結乾燥した粉末の再構成は、非経口投与に使用するための製剤を提供する。再構成のために凍結乾燥した粉末が滅菌水又は他の適切な担体に添加される。正確な量は選択された化合物に依存する。このような量は経験的に決定され得る。

【0283】

本明細書に開示された抗体又はその抗原結合部分、二重特異的分子、又は免疫接合体及び本明細書に開示された他の組成物はまた、治療対象の特定組織、受容体、又は他の身体領域に標的化するように製剤化され得る。多くの標的化方法が当業者に公知されている。全てのこのような標的化方法を本組成物に使用することが考慮される。標的化方法の非制限的な例は、例えば、米国特許第６，３１６，６５２号、第６，２７４，５５２号、第６，２７１，３５９号、第６，２５３，８７２号、第６，１３９，８６５号、第６，１３１，５７０号、第６，１２０，７５１号、第６，０７１，４９５号、第６，０６０，０８２号、第６，０４８，７３６号、第６，０３９，９７５号、第６，００４，５３４号、第５，９８５，３０７号、第５，９７２，３６６号、第５，９００，２５２号、第５，８４０，６７４号、第５，７５９，５４２号及び第５，７０９，８７４号を参照する。特定の実施形態において、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合部分は、中枢神経系損傷、退行性脳障害又は神経病性疼痛を治療するために標的化される。

【0284】

生体内投与に用いられる組成物は滅菌され得る。例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に滅菌され得る。

【0285】

ＸＩ．キット
本明細書に記載の１つ以上の抗体、又はその抗原結合部分、二重特異的分子、又はその免疫接合体を含むキットが提供される。特定の実施形態において、本明細書に開示された１つ以上の抗体又はその抗原結合部分のような、製薬学的組成物の成分のうち１つ以上で満たされた１つ以上の容器、選択的な使用説明書を含む製薬学的パック又はキットが提供される。一部の実施形態において、キットは、本明細書に開示された製薬学的組成物及び任意の予防又は治療剤を含有する。

【0286】

ＸＩＩ．治療的用途及び方法
本発明は、本明細書に記載された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体、二重特異的分子又は免疫接合体、又はそれらの組成物をそれを必要とする対象（例えば、ヒト）に投与することを含む、対象でＣＮＳの損傷又は傷害を緩和させる方法を提供する。

【0287】

他の態様において、本明細書に開示の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を対象に投与することを含み、対象で神経膠症の始まり又は開始及びＣＮＳの関連した有害な影響を抑制、鈍化、低下、制限、減少、逆転又は予防する方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、対象に本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を投与することを含み、対象で反応性星状細胞の過度又は異常な増殖及びそれと関連したＣＮＳの有害な影響を抑制、鈍化、低下、制限、減少、逆転、又は予防する方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を対象に投与することを含み、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現を縮小、抑制又は減少したり（ニューロカン、ＮＧ２又は全てのレベルを含む。）、又は不活性ニューロン、ＮＧ２又は全ての活性を減少したり付与する方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本願に記載された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を対象に投与することを含み、好ましくは、対象において損傷又は障害後に二ューロンの成長を刺激、促進、増加又は活性化させる方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を対象に投与してｃ－ｆｏｓ ｍＲＮＡ、ｃ－ｆｏｓタンパク質又はｃ－ｆｏｓタンパク質活性のレベルを増加させ、好ましくは、ニューロンの核でＥＲＫ ｍＲＮＡ、ＥＲＫタンパク質又はｐＥＲＫ活性のレベルを増加させる方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載された抗ＦＡＭ１９Ａ５を対象に投与して、好ましくはニューロンでＧＡＰ４３ｍＲＮＡ、ＧＡＰ４３タンパク質のレベルを向上又は増加させたり、又はＧＡＰ４３タンパク質の活性を増加させる方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を対象に投与し、必要とする対象でニューロンの生存を増進又は促進させ及び／又は軸索の再成長を促進させる方法を提供する。一部の実施形態において、対象は、ヒト、好ましくはＣＮＳ損傷、外傷、負傷、脳脊髓損傷、脳腫瘍、感染、虚血、脳卒中、自己免疫反応及び／又は神経退行性疾患からのニューロン損傷又は傷害を持つヒトである。

【0288】

一部の態様において、本発明はまた、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を対象に投与して疾患、障害又は病態を治療する方法を提供する。一部の実施形態において、疾患、障害又は病態は、中枢神経系損傷、脳脊髓系損傷、退行性脳障害、退行性脳脊髓液又は神経障害、又は神経病性疼痛を含む。一部の実施形態において、中枢神経系損傷は、外傷性脳損傷、脳脊髓損傷、脳卒中、脳腫瘍又はこれらの組合せである。一部の実施形態において、退行性脳障害は、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）又はこれらの組合せである。したがって、特定の実施形態において、本発明は本明細書に開示の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体又はその組成物を対象に投与して、必要とする対象で外傷性脳損傷、脳脊髓損傷、脳卒中、脳腫瘍又はこれらの組合せを治療する方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体又はその組成物を対象に投与して、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、ＡＬＳを治療する方法を提供する。一部の実施形態において、対象はヒトである。

【0289】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、中枢神経系損傷（例えば、外傷性脳損傷、脳脊髓損傷、脳卒中又は脳腫瘍）、脳脊髓液系損傷、退行性脳障害（例えば、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、ＡＬＳ）、退行性脳脊髓液又は神経障害又は神経病性疼痛を治療するための１つ以上の追加製剤との組合せで投与され得る。

【0290】

一部の実施形態において、疾患、障害又は病態は腫瘍、線維症、緑内障又は気分障害を含む。特定の実施形態において、疾患、障害又は病態は腫瘍を含む。一部の実施形態において、腫瘍は黒色腫、膵癌、神経膠腫（例えば、多形膠芽細胞腫（ＧＢＭ））、乳癌、リンパ腫、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、線維肉腫、結腸腺癌腫、肝癌又は卵巣癌を含む。

【0291】

一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、例えば腫瘍内の血管正常化を誘導する。一部の実施形態において、血管の正常化は、増加した連結性、増加した壁厚、減少した血管径、より規則的な血管方向及び分布パターン、増加した血管数、漏れ及び透過性減少、血管における増加した血管周囲細胞適用範囲及び近接性、増加した酸素化、又はこれらの組合せを含む血管の特性変化を伴う。

【0292】

一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、腫瘍の成長を抑制する。一部の実施形態において、腫瘍の成長は、基準（例えば、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を投与していない対象で腫瘍の成長）と比較して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％抑制される。

【0293】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、免疫細胞の腫瘍への浸潤を向上させる。一部の実施形態において、腫瘍への免疫細胞の浸潤は、基準（例えば、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を投与していない癌対象）と比較して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％促進／増加する。特定の実施形態において、免疫細胞は、大食細胞、樹状細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、自然殺害（ＮＫ）細胞又はこれらの組合せを含む。一部の実施形態において、免疫細胞は肥大を示す。一部の実施形態において、免疫細胞の腫瘍への浸潤は神経細胞の腫瘍への浸潤増加を伴う。特定の実施形態において、ニューロン細胞は、星状細胞、神経膠細胞又はこれらの組合せを含む。

【0294】

一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、大食細胞又は小膠細胞の食作用を向上させる。一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、大食細胞又は小膠細胞のミトコンドリア膜電位を増加させる。特定の実施形態において、食作用又はミトコンドリア膜電位は基準（例えば、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を投与していない癌対象）と比較して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％促進又は増加する。

【0295】

一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は、腫瘍の壊死及び浮腫を減少させる。他の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は腫瘍の組織透過性を減少させる。一部の実施形態において、腫瘍の壊死及び浮腫又は組織透過性は基準（例えば、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を投与していない癌対象）と比較して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少する。

【0296】

一部の実施形態において、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体は腫瘍において血流速度を増加させる。特定の実施形態において、血流速度は基準（例えば、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を投与していない癌対象）と比較して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％増加する。

【0297】

一部の実施形態において、腫瘍を治療する方法は、追加の治療剤を投与することを含む。特定の実施形態において、追加の治療剤は、化学療法、免疫療法、放射線療法又はこれらの組合せを含む。一部の実施形態において、免疫療法は単クローン性抗体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法、Ｔ－細胞療法、ＮＫ－細胞療法、樹状細胞（ＤＣ）療法、養子細胞移入（ＡＣＴ）、免疫チェックポイント調節剤、サイトカイン、癌ワクチン、補助剤、腫瘍溶解性ウイルス又はこれらの組合せを含む。一部の実施形態において、化学療法は、テモゾロミド、ゲムシタビン、パクリタクセル、カルボプラチン、シスプラチン、エロツクスマブ（ｅｌｏｔｕｘｕｍａｂ）、レナリドマイド、デキサメタゾン、オキサリプラチン又はこれらの組合せを含む。

【0298】

一部の実施形態において、治療有効量の本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体又はその組成物が投与される。対象（例えば、ヒト）を治療するとき、本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の治療的有効量は、疾患の年齢、性別、重症度のような因子に依存する。

【0299】

一部の実施形態において、本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体又はその組成物は、静脈内、経口、非経口、硬膜内、髄腔内、脳室内、肺、皮下、皮膚、筋肉内、又は心室内に投与される。

【0300】

次の実施例は例示的に提供されるもので、制限的なものではない。

【0301】

実施例
実施例１：ヒトＦＡＭ１９Ａ５タンパク質の発現及び精製
組換えヒトＦＡＭ１９Ａ５タンパク質を下に説明されたとおりに生成して精製し、この精製されたタンパク質を結合親和性分析に基づく抗体スクリーニング分析に使用した。まず、ＦＡＭ１９Ａ５遺伝子を発現するＬＰＳ－ｈＴプラスミドをバクテリアに形質転換し、タンパク質過発現を誘導した。生成されたＦＡＭ１９Ａ５タンパク質をＮｉ－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて精製した。イミダゾールを漸次高い濃度で使用してＮｉ－カラムからＨｉｓ－タグされたＦＡＭ１９Ａ５タンパク質を除去した。溶液中タンパク質発現をクマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）Ｒ－２５０染料を用いて測定した。ＦＡＭ１９Ａ５イミダゾール含有溶液だけを取り、ＰＢＳを用いてＦＡＭ１９Ａ５タンパク質を濃縮した。濃縮が完了した時、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質の純度と濃度をウェスタンブロット分析を用いて測定した。次いで、濃縮されたタンパク質を用いてＦＡＭ１９Ａ５－特異的抗体に対してスクリーニングした。

【0302】

実施例２：抗体ライブラリーＦＡＭ１９Ａ５の生成
１．免疫化
ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質をニワトリの免疫化のための抗原として使用した。合成ペプチドＫＬＨ共役結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）５０μｇを７５０μＬリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に混合し、３７℃で３０分間インキュベーションした。その後、２％スクアレン内毒素ＭＰＬ（モノホスホリレート脂質Ａ種）から毒素を除去し、油中水（ｗａｔｅｒ ｉｎ ｏｉｌ）エマルジョン補助剤（ＲＩＢＩ＋ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ補助剤、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）を含有するＴＤＷ及びＣＷＳの細胞壁成分のミコバクテリアをエマルジョン化し、その後、３匹のニワトリ及び４匹のウサギに皮下注射した。ニワトリ及びウサギは免疫化中に略２～３週間隔で総３回及び４回免疫化した。ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質を過発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶離液を用いて、免疫化された動物から得られた抗体の力価（ｔｉｔｅｒ）を免疫ブロッティングを用いて測定した。

【0303】

２．免疫化されたニワトリ及びウサギからの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ライブラリーの製造
ＴＲＩ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、前記説明された免疫化されたニワトリの脾臓、骨髄及び滑液嚢（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｓａｃ）からＲＮＡを抽出した。Ｏｌｉｇｏ－ｄＴプライマーとＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ^ＴＭＩＩＩ第１鎖合成システム（Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。動物の免疫システムから得られたｃＤＮＡに対して、拡張型高忠実度ＰＣＲシステム（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を用いて単鎖可変領域ライブラリーを生成した。各反応においてｃＤＮＡ １μＬ、各プライマー６０ｐｍｏｌ、１０倍反応緩衝溶液１０μＬ、８μＬの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、及びＴａｑ ＤＮＡ重合酵素０．５μＬを水と混合した。最終体積は１００μＬであった。ＰＣＲ反応を次の条件を用いて行った：３０サイクル（ｉ）９４℃で１５秒、（ｉｉ）５６℃で３０秒、及び（ｉｉｉ）７２℃で９０秒、その後７２℃で１０分間最終延長。約３５０ｂｐの長さを有する断片を含むＰＣＲ生成物を１．５％寒天ゲル上にローディングし、電気泳動後にＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｌ ＩＩ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてヌクレオチド断片を精製した。精製されたＰＣＲ生成物をＯＤ ２６０ｎｍで読み取って定量した（１ユニットＯＤ＝５０μＬ／ｍＬ）。

【0304】

第２ＰＣＲからの２個のＶＨ及びＶＬ第１生成物を重複延長ＰＣＲ（Ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）によって無作為に連結した。各ＰＣＲ反応物を１００ｎｇの精製されたＶＬ及びＶＨ生成物、各プライマー６０ｐｍｏｌ、１０倍反応緩衝液１０μＬ、８μＬの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素０．５μＬ及び水と１００μＬの最終体積として混合した。ＰＣＲを次の条件下で行った：２５サイクル（ｉ）９４℃で１５秒、（ｉｉ）５６℃で３０秒、及び（ｉｉｉ）７２℃で２分、その後７２℃で１０分間最終延長。約７００ｂｐの長さを有する単鎖可変領域断片を含むＰＣＲ生成物を１．５％寒天ゲル上にローディングし、電気泳動後にＱＩＡＧＥＮ ＩＩゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてヌクレオチド断片を精製した。精製されたＰＣＲ生成物をＯＤ ２６０ｎｍで読み取って定量した（１ユニットＯＤ＝５０μＬ／ｍＬ）。

【0305】

３．ライブラリー、ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）及び形質転換
ＰＣＲ生成物のｓｃＦｖ断片とベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ－ＳＳ（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＣＡ，ＵＳＡ）をＳｆｉＩ制限酵素で切断（ｄｉｇｅｓｔ）した。精製された重複ＰＣＴ生成物１０μｇをＳｆｉＩ ３６０ユニット（１６ユニット当たりμｇ ＤＮＡ，Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）、１０倍反応緩衝液２０μＬ及び水と混合して最終体積２００μＬにした。ｐＣｏｍｂ３Ｘ－ＳＳベクター２０μｇをＳｆｉＩ １２０ユニット（６ユニット当たりμｇ ＤＮＡ）、１０倍反応緩衝液２０μＬ及び水と混合して最終体積２００μＬにした。混合物を５０℃で８時間切断した。その後、ｓｃＦｖ断片（約７００ｂｐ）及びベクター（約３，４００ｂｐ）を含む切断された生成物を１％寒天ゲル上にローディングし、ゲル抽出キットＩＩ ＱＩＡＧＥＮ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて精製した。ＳｆｉＩ－制限されたｐＣｏｍｂ３Ｘベクター１，４００ｎｇと切断されたｓｃＦｖ断片７００ｎｇを５倍リガーゼ緩衝液、１０μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）及び水と混合して最終体積２００μＬにした。混合物を１６℃で１６時間インキュベーションしてライゲーションを行った。

【0306】

エタノールで沈殿後、ＤＮＡペレットを水１５μＬに溶解した。ライブラリーを生成するために、ライゲーションサンプルを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＥＲ２７３８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ，Ｈｉｔｃｈｉｎ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｎｅ，ＳＧ４ ＯＴＹ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ）にバイブレーター遺伝子（遺伝子パルサー：Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて電気穿孔によって形質転換した。細胞をスーパーブロス（ＳＢ）培地５ｍＬと混合し、３７℃で１時間２５０ｒｐｍで撹拌しながらインキュベーションした。その後、１００ｍｇ／ｍＬカナマイシン３μＬをＳＢ培地１０ｍＬに添加した。ライブラリーサイズを決定するために、培養物サンプル０．１μＬ、１μＬ及び１０μＬを５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するルリアブロス（ＬＢ）寒天板上に擦り塗った。１時間撹拌後、１００ｍｇ／ｍＬカナマイシン４．５μＬをＬＢ培養物に添加し、さらに１時間追加撹拌した。その後、水中のＶＣＭ１３ヘルパーファージ２ｍＬ（＞１０^１１ｃｆｕ／ｍＬ）を１００ｍｇ／ｍＬカナマイシン９２．５μＬを含有する予熱されたＬＢ（１８３ｍＬ）と共にＬＢ培地に添加した。この混合物を２時間３７℃で２５０ｒｐｍでさらに撹拌した。その後、カナマイシン２８０μＬ（５０ｍｇ／ｍＬ）を培養物に添加し、３７℃で一晩撹拌した。翌日、バクテリアペレットを高速遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＪＡ－１０ローター）を用いて４℃、３，０００ｇで遠心分離した。その後、バクテリアペレットを用いてファージミドＤＮＡを抽出し、上澄液は滅菌遠心分離瓶に移した。その後、ポリエチレングリコール－８０００（ＰＥＧ－８０００，Ｓｉｇｍａ）８ｇと塩化ナトリウム（ＮａＣｌ，Ｍｅｒｃｋ）６ｇを上澄液に添加した後、氷に３０分間維持した。その後、上澄液を４℃、１５，０００ｇで１５分間遠心分離した。その後、上澄液を捨て、１％ ＢＳＡ－再生を含有するファージペレットＴｒｉｓを緩衝食塩水（ＴＢＳ）に懸濁した。

【0307】

実施例３：免疫化された抗原に対するライブラリーパンニング（バイオパンニング）（ｂｉｏ－ｐａｎｎｉｎｇ）
磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２７０ Ｅｐｏｘｙ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてバイオパンニングを行った。室温で約１×１０^７ビーズを組換えＦＡＭ１９Ａ５タンパク質５μｇで室温で２０時間ビーズとタンパク質を共に回転撹拌してコーティングした。コーティングが完了するとビーズをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で４回洗浄し、室温で３％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で１時間遮断した。その後、コーティングされたビーズを前記説明されたファージディスプレイされたｓｃＦｖと共に室温で２時間培養した。抗原コーティングされたビーズに結合しないファージを除去するために、ビーズを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳで洗浄した。その後、結合したファージを５０μＬの０．１Ｍグリシン／塩化水素（０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．２）で溶出し、塩化水素と共に２Ｍ Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．１）３μＬで中和した。このファージ含有上澄液を用いて大腸菌ＥＲ２７３８細胞を感染させ、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを用いて一晩増幅し救済（ｒｅｓｃｕｅ）した。また、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ寒天板上にファージ－感染された培養物をブロット（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）することによって、ファージ－感染された培養物からのファージ力価によって投入（インプット）及び生成（アウトプット）を決定した。翌日、ＰＥＧ－８０００及びＮａＣｌを用いてファージを沈殿させ、次いでこれをバイオパンニングに使用した。バイオパンニングは、前記過程を反復することによって最大で総５回行った。各増幅においてファージをスクリーニングし、ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する高い親和性のために選択した。

【0308】

実施例４：ファージＥＬＩＳＡによるクローンの選択
バイオパンニングから選択されたクローンを分析するために、ファージディスプレイされたｓｃＦｖから個別クローンを無作為に選択し、ＥＬＩＳＡを用いてクローンがＦＡＭ１９Ａ５組換えタンパク質に結合することを確認した。ＦＡＭ１９Ａ５組換えタンパク質を０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３緩衝剤に希釈し、タンパク質をウェル当たり１００ｎｇを用いて１６時間４℃で９６ウェル微量定量プレートをコーティングした。翌日、プレートを１時間３７℃で３％ ＢＳＡ／ＰＢＳで遮断した。その後、ファージ上澄液を６％ ＢＳＡ／ＰＢＳと混合し、３７℃で２時間培養した。その後、上澄液を含有するプレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０／ＰＢＳで洗浄した。ＨＲＰ－共役結合したＭ１３抗体（ａ－Ｍ１３－ＨＲＰ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を１／５，０００に希釈した。希釈された抗体５０μＬをプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション及び洗浄後、色展開（ｃｏｌｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）のためにプレートに０．０５Ｍクエン酸緩衝溶液、１μｇ／ｍＬの２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ，Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ，ＵＳＡ）、及び０．１％ Ｈ_２Ｏ_２を添加した。各ウェルに対する吸光度を４０５ｎｍで測定した。

【0309】

ＦＡＭ１９Ａ５組換えタンパク質に結合し、高い吸光度を示した他免疫化されたニワトリから生成された２４個クローンを分析した。２４個クローンから独特の配列を持つ１３個のｓｃＦｖクローンを得た。免疫化されたウサギ（データ不図示）から生成されたクローンの場合、１６４個のクローンが配列化され、１７４個のクローンが初期に確認された。これらのクローンから２２個の最終独特のＳｃＦｖ配列を得た。

【0310】

実施例５：脱免疫化された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の生成
１．抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体（クローン１－６５）の脱免疫化
ヒト対象に投与される時、免疫原性の危険を減少させるために、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体（例えば、１－６５）内で高い免疫原性の特定領域を確認するためにシリコ（ｓｉｌｉｃｏ）分析（ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｔｄ．，ＵＫ）を行った。無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを確認するために、ｉＴｏｐｅ^ＴＭ（Ａｂｚｅｎａ ｐｌｃ．，ＵＫ）を全配列にわたって重なった９－ｍｅｒペプチドに対して行った。潜在的なＴ細胞エピトープは、３４個の異なるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に対する相互作用の分析によって予測された。クローン１－６５は総１３個の非ジャームライン無差別ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを含有した（図２）。１－６５抗体及びＳＳ０１－１３（すなわち、脱免疫化後１－６５抗体）の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列整列が図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ提供されている。

【0311】

また、無差別ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、１０，０００個以上のペプチドに対するＴ細胞刺激分析によって構築されたＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープデータベースであるＴＣＥＤ^ＴＭ（Ａｂｚｅｎａ ｐｌｃ．，ＵＫ）によって分析された。クローン１－６５は４個の無差別ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドが公知のＴ細胞エピトープに対して高い相同性を有することを示した（図２）。

【0312】

２．複合抗体ライブラリーの構築
複合抗体ライブラリーは、免疫原性と関連したＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを回避するように設計されている。ライブラリー構築のために最も相同性であるヒトジャームラインを選択するために、クローン１－６５のフレームワークをＩｇＢＬＡＳＴデータベース（ＮＣＢＩ）で分析した。ヒトジャームラインＩＧＬＶ３－２５^＊０２、ＩＧＬＪ２^＊０１、ＩＧＨＶ３－２３^＊０２及びＩＧＨＪ１^＊０１遺伝子は、クローン１－６５に対して選択された（図１）。最も相同性であるヒトジャームライン配列においてクローン１－６５の同一でない特定アミノ酸残基ＭＨＣクラスＩＩ結合領域を相応するアミノ酸に置き換えるようにライブラリーを構築した。特に、ペプチド中のｐ１、ｐ４、ｐ６、ｐ７及びｐ９残基は、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子の結合グルーブ（ｇｒｏｏｖｅ）との相互作用に重要である（Ｊａｍｅｓ ＥＡ，Ｍｏｕｓｔａｋａｓ ＡＫ，Ｂｕｉ Ｊ，Ｎｏｕｖ Ｒ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ＧＫ，Ｋｗｏｋ ＷＷ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８３（５）：３２４９－５８）。

【0313】

ヒト及びニワトリアミノ酸をともにカバーするために縮退性コドン（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｃｏｄｏｎｓ）を暗号化するオリゴヌクレオチドの連続重複延長重合酵素鎖反応（ＰＣＲ）を行って、前述したように部位指向突然変異誘発ライブラリーを生成した（Ｂａｅｋ ＤＳ，Ｋｉｍ ＹＳ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５；４６３（３）：４１４－２０）。ＰＣＲ生成物をファージミドベクター内にサブクローニングし、前述したようにファージ製造のために大腸菌菌株ＥＲ２７３８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）に形質転換させた（Ｈａｎ Ｊ，Ｌｅｅ ＪＨ，Ｐａｒｋ Ｓ，Ｙｏｏｎ Ｓ，Ｙｏｏｎ Ａ，Ｈｗａｎｇ ＤＢ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１６；４８（１１）：ｅ２７１）。

【0314】

３．バイオパンニング及びクローン選択
陽性クローンを単離させるために、バイオパンニング及びファージ酵素免疫分析を前述のように行った（Ｂａｒｂａｓ ＣＦ．Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：実験室説明書。Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：２００１）。ＦＡＭ１９Ａ５に対する反応性を有するファージクローンを選択し、そのヌクレオチド配列をサンガー（ｓａｎｇｅｒ）配列化によって決定した。ＦＡＭ１９Ａ５に対する親和性が維持される最も少ない数の無差別ＭＨＣクラスＩＩ結合エピトープを有するｓｃＦｖクローンが最終的に選択された。

【0315】

クローン１－６５における総６個の無差別ＭＨＣクラスＩＩ結合エピトープが、脱免疫化されたクローン１－６５（すなわち、ＳＳ０１－１３－Ｓ５抗体）から除去された（図３Ａ）。ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３の無差別ＭＨＣクラスＩＩ結合エピトープは除去不可能だった（すなわち、図３Ａの結合ペプチド＃６、＃７、＃８及び＃１３）。また、ＨＦＲ１に位置した結合ペプチド＃４のｐ６残基及び結合ペプチド＃５のｐ４残基が結合活性において決定的な役割を担うので、ＨＦＲ１における無差別ＭＨＣクラスＩＩ結合エピトープは除去不可能だった。脱免疫化されたクローン１－６５抗体とＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する野生型１－６５抗体の結合の比較は、図３Ｂに提供される。

【0316】

実施例６：脱免疫化された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体（クローン１－６５）のＣＤＲ－Ｈ２で潜在的Ｎ－グリコシル化部位の部位指向除去
部位指向された突然変異誘発ライブラリーを構築するために、クローン１－６５ｓｃＦｖを暗号化する遺伝子をＰＣＲの鋳型として用いた。ＣＤＲ－Ｈ２のＳ５３は、前述したようにＮＮＫ変性コドン（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ、Ｋ＝Ｇ又はＴ）を暗号化するオリゴヌクレオチドで無作為化された（Ｌｅｅ ＨＫ，Ｊｉｎ Ｊ，Ｋｉｍ ＳＩ，Ｋａｎｇ ＭＪ，Ｙｉ ＥＣ，Ｋｉｍ ＪＥ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７；４９３（１）：３２５－３１）。重複延長ＰＣＲによって増幅されたｓｃＦｖ断片を前記ファージミドベクター内にサブクローニングし、上述したようにファージ製造のためにＥＲ２７３８（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）内に形質転換させた。

【0317】

形質転換後、力価プレートから、ファージを表示する無作為に選択された突然変異体ｓｃＦｖを救済し、前述したようにファージ酵素免疫分析を実施した（Ｂａｒｂａｓ ＣＦ．Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：実験室説明書。Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；２００１）。ＦＡＭ１９Ａ５に対して類似の反応性を示すファージクローンを選択し、そのヌクレオチド配列をサンガー配列化によって決定した。Ｓ５３は、トレオニン、グリシン及びロイシンに置換され得る。これらの結果は、クローン１－６５のＣＤＲ－Ｈ２で潜在的なＮ－グリコシル化部位がセリンをロイシン又はグリシンに置き換えることによって除去され得ることを明らかにした。

【0318】

セリン（Ｓ５３Ｇ）（すなわち、Ｓ５－ＳＧ抗体）からグリシンに置換された脱免疫化されたクローン１－６５（すなわち、ＳＳ０１－１３－Ｓ５抗体）は、オリゴヌクレオチドを使用する重複延長ＰＣＲによって構築された（図４Ｃ）。ファージミドベクター内にサブクローニングした後、ファージを表示するＳ５－ＳＧ抗体を救済し、上述したようにファージ酵素免疫分析を行った。抗体の発現レベル及びサイズは、図４Ａ及び図４Ｂに提供されている。Ｓ５－ＳＧ抗体（“脱免疫化されたクローン１－６５－Ｓ５３Ｇ”）は、脱免疫化されたクローン１－６５（すなわち、ＳＳ０１－１３－Ｓ５抗体）に比べてＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する親和性がより低かった（図４Ｄ）。

【0319】

実施例７：結合親和度分析
本明細書に開示された個別のる抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体のＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に対する結合親和度をさらに評価するために、ＳＰＲ及びＥＬＩＳＡ分析をともに用いた。

【0320】

ＳＰＲ分析のために、次のプロトコルが用いられた。ＦＡＭ１９Ａ５タンパク質を固定化緩衝液（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）中に希釈させた（２μｇ／ｍＬ）。ＣＭ５センサーチップをエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（４００ｍＭ）及びＮＨＳ（１００ｍＭ）の混合物で４２０秒間活性化させた。次いで、２μｇ／ｍＬのＦＡＭ１９Ａ５タンパク質（固定化緩衝液中、ｐＨ４．５）を１０μＬ／分の流速で４２０秒間Ｆｃ２サンプルチャネルに注入して約５０ＲＵレベルに到達した。その後、チップを４２０秒間流量１０μＬ／分で１Ｍエタノールアミン塩化水素によって不活性化させた。基準表面Ｆｃｌチャネルも製造され、類似に活性化及び不活性化された。抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体をランニング緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（ＨＢＳ－ＥＰ；０．００５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を有する１ｘ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）で個別の濃度（９０ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３．３ｎＭ、１．１ｎＭ、０ｎＭ）に希釈した。希釈された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を６０秒のアソシエーション段階（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）の間に３０μＬ／分の流速でＦｃ１－Ｆｃ２チャネルに注射した。次に、単一サイクル動力学モードによる３００秒解離段階（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）が続いた。各分析サイクル後、センサーチップ表面を６０秒間３０μＬ／分の流速で１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．５で再生させた。データはＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて１：１フィッティングに対して分析された。

【0321】

ＥＬＩＳＡ分析のために、次のプロトコルが用いられた。抗ウサギＦｃ抗体（５０ｍＭ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６で１μｇ／ｍＬの濃度に希釈される。）を用いて４℃で一晩９６－ウェルプレート（１００μＬ／ウェル）をコーティングした。次に、プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ：０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／ＰＢＳ）で総５回洗浄した。その後、プレートを遮断緩衝液（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳＴ）（１５０μＬ／ウェル）で３７℃で１時間遮断し、洗浄緩衝液でさらに洗浄した。次いで、遮断緩衝液に希釈された５０ｎｇ／ｍＬのＦＡＭ１９Ａ５－ウサギＦｃ（ＦＡＭ１９Ａ５－ｒＦｃともいう。）抗原を各ウェルに添加した。プレートを３７℃でさらに１時間インキュベーションした。インキュベーション後、洗浄緩衝液でプレートをさらに総５回洗浄した。異なる濃度（２，０５５ｐＭ、６８５ｐＭ、２２８．３ｐＭ、７６．１ｐＭ、２５．４ｐＭ、８．５ｐＭ、２．８ｐＭ、０ｐＭ）で遮断緩衝液中の希釈された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーション後にプレートを洗浄し（洗浄緩衝液中で総５回洗浄）、次いで、希釈された抗ヒトカッパ軽鎖－ＨＲＰ（遮断緩衝液中１：１０，０００）をウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。プレートを３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、プレートをさらに洗浄し、ＴＭＢ溶液（１００μＬ／ウェル）で処理した。この反応を１００μＬの硫酸（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を用いて中断し、９６ウェルマイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて４５０ｎｍにおける吸収によって色変化の程度を検出した。

【0322】

分析結果は、図５Ａ～図５Ｃ及び図６Ａ～図６Ｄに示されている。図５Ａ～図５Ｃに示すように、ＳＰＲの結果は、試験された３個の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体のうち１－６５抗体が最大の結合親和度でＦＡＭ１９Ａ５タンパク質に結合することを示唆した。１－６５抗体は、０．３４５ｎＭのＫ_Ｄを有するのに対し、ＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧ抗体はそれぞれ２．２０１ｎＭ及び１．７９７ｎＭのＫ_Ｄを有する。図６に示すように、ＥＬＩＳＡ分析で類似の結果が観察された。

【0323】

実施例８：免疫細胞の食細胞能（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ａｂｉｌｉｔｙ）に対する抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の効果評価
本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体が特定免疫細胞の食細胞能に影響を及ぼすか否かを評価するために、ＢＶ細胞（固定化したネズミ小膠細胞株）を使用した。簡単にいうと、ＢＶ２細胞を９６－ウェルプレート（５×１０^３／１００μＬ／ウェル）上にプレーティングし、６時間３７℃の５％ ＣＯ_２でインキュベーションした。次いで、細胞をヒトＦＡＭ１９Ａ５－Ｆｃタンパク質（０．２５μＭ、ロット番号１７０８１５）単独で又は抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体１－６５、ＳＳ０１－１３－Ｓ５又はＳ５－ＳＧの様々な濃度（３．１２５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ又は２５μｇ／ｍＬ）に組み合わせて処理した。対照群の細胞をＰＢＳ単独で処理した。処理された細胞をさらに１６時間３７℃の５％ ＣＯ_２でインキュベーションした。インキュベーション後、ＰＨＲＯＤＯ^ＴＭＧｒｅｅｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｐ３５３６６）を細胞に添加した（１５μｇ／１００μＬ／ウェル）。その後、ＩＮＣＵＣＹＴＥ（登録商標）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて１時間ごとに緑色蛍光強度を測定し、ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓの食細胞吸収を観察した。

【0324】

図７Ａ～図７Ｃに示すように、ヒトＦＡＭ１９Ａ５－Ｆｃタンパク質でＢＶ２細胞を処理した場合、ＢＶ２細胞の食細胞能を抑制した。しかし、ヒトＦＡＭ１９Ａ５－Ｆｃタンパク質及び任意の試験された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の組合物でＢＶ２細胞を処理した場合、濃度依存的方式で食作用を回復させた。ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓで処理して約１０時間後、対照群（すなわち、ＰＢＳ単独）と比較して、抗体１－６５、ＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧで観察された食作用の量はそれぞれ、次の通りであった：８６％、９６％及び８９％。これらの結果は、１－６５抗体のように脱免疫化されたＳＳ０１－１３－Ｓ５及びＳ５－ＳＧがＢＶ２細胞においてＦＡＭ１９Ａ５－Ｆｃタンパク質媒介された抑制を効果的に遮断できることを立証する。

【0325】

実施例９：脳損傷動物モデルにおいて抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の用途
本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の生体内機能を評価するために、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）マウスモデルが用いられ得る。簡単にいうと、マウスに個別の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体が投与されるだろう。ＴＢＩ誘導（ＴＢＩ５Ｄ）後に動物を犠牲させることができる。抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の効果、例えば、外傷性脳損傷後ペナンブラ（ｐｅｎｕｍｂｒａ）部位の反応性神経膠症の発病が測定されるだろう。

【0326】

実施例１０：誘導性黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）モデルにおいて抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の抗癌効果
本開示内容の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の抗癌効果を評価するために、誘導性マウス黒色腫モデルが用いられ得る。簡単にいうと、黒色腫は、雄Ｔｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；Ｂｒａｆ＋／＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ／ｌｏｘマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ，ＵＳＡ）を雌Ｔｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；ＢｒａｆＣＡ／ＣＡ；Ｐｔｅｎｌｏｘ／ｌｏｘと交配することによってＴｙｒ：：ＣｒｅＥＲ；ＢｒａｆＣＡ／＋；Ｐｔｅｎｌｏｘ／ｌｏｘマウスを生産することができる。Ｄａｎｋｏｒｔ Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４１（５）：５４４－５２（２００９）参照。黒色腫は出生後約７週目に自発的に誘導されるだろう。マウスは、腫瘍体積及び黒色腫の数によって分類され得る。

【0327】

分離後、動物には、抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体又はヒトＩｇＧ対照群抗体を投与することができる。次いで、投与して様々な時点に動物で黒色腫の体積分析を行うことができる。

【0328】

実施例１１：神経病性疼痛動物モデルにおいて抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の使用
本明細書に開示された抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体の生体内機能を評価するために、慢性収縮損傷（ＣＣＩ）のマウスモデルが用いられ得る。簡単にいうと、マウスには個別の抗ＦＡＭ１９Ａ５抗体が投与され得る。次いで、投与して約１週後に陰嚢神経ライゲーションによって末梢神経損傷が動物で誘導され得る。損傷後に様々な時点で、機械的異痛（ａｌｌｏｄｙｎｉａ）（物理的外部刺激に対する反応）及び熱痛覚過敏（ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）（温度上昇に対する反応）がともに動物で評価され得る。機械的異痛はボンフレイ（Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ）モノフィラメント（０．１６ｇ）を損傷した足に複数回適用し、動物が疼痛に反応する頻度を観察して評価される。熱痛覚過敏はハーグリーブス（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ）試験を用いて評価され、ここで、放射形熱刺激（強度：３０）が損傷した足に適用され、足引っ込め遅延時間が決定される。

【0329】

概要及び要約部分以外の詳細な説明部分が、請求項の解釈のためた用いられるものとして理解すべきである。概要及び要約部分は、本発明者らによって考察された通り、本発明の全部ではないが、１つ以上の例示的な実施形態を提示でき、したがって、本発明と添付の請求項をいかなる方法でも制限しようと意図しない。

【0330】

本発明は、明示された機能とこれらの関係の実施形態を例示する機能的構成要素の補助下に以上開示された。それらの機能的構成要素の境界は、説明の便宜のために本明細書で恣意的に限定された。明示された機能とそれらの関係が適切に行われる限り、代案の境界も限定され得る。

【0331】

特定の実施形態に関する前述した説明は、本発明の通常の性質を十分に表すことができ、第三者は当業界の知識を適用することによって本発明の一般概念から逸脱することなく過度な実験無しでこのような特定の実施形態を様々な用途に合わせて容易に変形及び／又は改造することができる。したがって、このような改造及び変形は、本明細書に提示された教示及び指針に基づいて開示された実施形態の等価物の意味と範囲内にあるように意図される。本明細書で用いられた語句又は用語は制限ではなく説明のためのものであることが理解されるべきであり、本明細書の用語又は語句は教示及び指針に照らして当業者によって解釈されるべきである。

【0332】

本発明の範囲及び領域は、前記説明された例示の実施形態のいずれによっても制限されず、請求項及びその等価物によってのみ限定されるべきである。

【0333】

本明細書で引用された全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト及び受託番号／データベース配列（ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の両方を含む）は、各個別刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト又は受託番号／データベース配列が参照として含まれるように具体的にそして個別的に簡潔に適示されたのと同じ範囲で全ての目的のためにその全体が参照として本明細書に含まれる。

【0334】

本ＰＣＴ出願は、２０１８年５月１０日付に提出された米国仮出願第６２／６６９，６４８号及び２０１９年４月２４日付に提出された米国仮出願第６２／８３８，１８７号の優先権を主張し、これはその全体が本明細書に参照として含まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【配列表】

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