特許 7530891 アルコール生成が抑制された組換え耐酸性酵母及びこれを用いた乳酸の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-31

(45)【発行日】2024-08-08

(54)【発明の名称】アルコール生成が抑制された組換え耐酸性酵母及びこれを用いた乳酸の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/19 20060101AFI20240801BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240801BHJP

   C12N 15/60 20060101ALI20240801BHJP

   C12N 9/88 20060101ALI20240801BHJP

【ＦＩ】

C12N1/19 ZNA

C12N15/11 Z

C12N15/60

C12N9/88

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2021520201

(86)(22)【出願日】2019-09-23

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-13

(86)【国際出願番号】 KR2019012326

(87)【国際公開番号】W WO2020075986

(87)【国際公開日】2020-04-16

【審査請求日】2022-08-18

(31)【優先権主張番号】10-2018-0119721

(32)【優先日】2018-10-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC13508BP

(73)【特許権者】

【識別番号】514020459

【氏名又は名称】エスケー イノベーション カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＫ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チェ・ヨン パク

(72)【発明者】

【氏名】テ・ヨン リー

(72)【発明者】

【氏名】キ・スン リー

【審査官】松井 一泰

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／０５６５６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１８－５１８１７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－０６１００６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１０－０７５１７１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてピルベートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は弱化され、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がさらに欠失され、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する組換え菌株。

【請求項2】

前記ピルベートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、ｇ３００２遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え菌株。

【請求項3】

前記ｇ３００２遺伝子は、配列番号１又は配列番号２の塩基配列を有することを特徴とする、請求項２に記載の組換え菌株。

【請求項4】

前記アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ｇ４４２３遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え菌株。

【請求項5】

前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ｇ３００２遺伝子に代えて導入され、ｇ３００２遺伝子のプロモーターによって調節されることを特徴とする、請求項１に記載の組換え菌株。

【請求項6】

ｇ３００２遺伝子の欠失又は弱化によって、親菌株であるＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）に比べてエタノール生成能が減少することを特徴とする、請求項１に記載の組換え菌株。

【請求項7】

次の段階を含む乳酸の製造方法；
（ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の組換え菌株を培養して乳酸を生成させる段階；及び
（ｂ）前記生成された乳酸を収得する段階。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、エタノール生産が抑制された耐酸性酵母を用いた乳酸の製造方法に関し、より詳細には、乳酸生成能が与えられ、ピルベートからアセトアルデヒドへの転換が抑制され、結果的にエタノール生産経路が抑制された耐酸性酵母及びこれを用いた乳酸の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＰＬＡ（Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ）は、乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）をラクチド（ｌａｃｔｉｄｅ）に転換し、これを開環重合して作る生分解性ポリマーであり、その原料である乳酸発酵によって生産している。ＰＬＡは、使い捨て食品容器に広範囲に利用可能であり、単独或いは組成物や共重合体の形態で自動車産業を含む様々な産業的プラスチックとしても使用可能な強度を持っている。また、最近では３Ｄプリンティングにも用いられる代表的なポリマーであり、特に、３Ｄプリンタ使用時に有害ガス発生及び臭い発生が少ない、環境にやさしいポリマーである。このような生分解性ポリマーは、最近、全世界的な問題とされている廃プラスチック及び微細プラスチックにより環境破壊が加速化している現実を解決できる有望なポリマーで、先進各国が導入拡大を推進しており、ＰＬＡをより低コストで生産するために、単量体である乳酸の生産性を向上させる努力を続けている。

【0003】

伝統的な乳酸生産工程は、乳酸菌を用いて生産するが、乳酸菌によって生成される乳酸の蓄積によって酸による菌株死滅或いは成長止めが発生することを防止するために、様々な形態のＣａ塩／Ｍｇ塩又はアンモニアのような中和剤を用いて、ｐＨを中性ｐＨである６～８に合わせながら発酵を行う。発酵が終了すると微生物を分離するが、塩（ｓａｌｔ）形態では水での分離及びラクチド転換が難しいため、硫酸を添加してラクテートを乳酸に転換させながらＣａ塩はＣａＳＯ_４の形態で除去する。このような過程は、乳酸よりも多い量の副産物であるＣａＳＯ_４を発生させ、工程経済性の低下を招く。

【0004】

一方、乳酸は、Ｌ型とＤ型の光学異性質体を有する。Ｌ型を主に生産する乳酸菌でも約５～１０％のＤ型を共に生産する場合が多く、Ｄ型を主に生産する菌株の場合、Ｄ型及びＬ型を共に生産する形態と、Ｄ型及びエタノールを共に生産する形態で存在するなど、多くの多様性を有する微生物群がある（非特許文献１）。

【0005】

このような光学異性質体乳酸のうち、Ｄ型は、主に、医療用／薬物伝達用のみに用いられているが、ＰＬＡに適用時にＤ型ラクチドによる結晶化率が上がりながら熱的特性が良くなる現象が発見され、また、純粋Ｌ型ポリマーと純粋Ｄ型ポリマーを混合した加工条件によって構造的にステレオコンプレックス（Ｓｔｅｒｅｏｃｏｍｐｌｅｘ）ＰＬＡが形成される場合、耐熱性が既存のＰＬＡはもとよりＰＥ／ＰＰよりも高くなる新しいポリマーが発見されるなど、Ｄ型による結晶化度増加及びこれを用いたＰＬＡ物性強化方法に対する研究及び商業化が急速に進行されており、ＰＬＡの適用分野が拡張されつつある。

【0006】

ＰＬＡは、発酵を用いて乳酸を生産した後、精製工程を経てラクチドに転換する工程が一般的である。ラクチド転換のためには、乳酸を水素化された形（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｆｏｒｍ）に転換する工程が必要であり、通常の中性発酵へのｐＨは６～７である点から、多量の硫酸を用いて酸性ｐＨに転換する。この過程で多量の中和塩が発生し、このような中和塩を除去するための工程投資費及び中和塩の低い価値により、経済性が低下する。

【0007】

一方、自然系で乳酸を生産するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の場合、商業的レベルに乳酸生産をするためには、多量の高価栄養分（ｎｕｔｒｉｅｎｔ）を培地として使用しなければならず、このような過量の栄養成分は、後段工程の重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）工程或いはラクチドを中間体とする場合にはラクチド転換工程に大きな阻害を与え、高収率、高純度のポリマー又はその前駆体を得るためには、吸着、蒸留、イオン交換のような精製工程費用がかかり、同様に、高い生産費用の原因となる。このような問題を解決するための方法として、酵母（Ｙｅａｓｔ）を用いた研究が提示されている。酵母の場合、安価の栄養分を使用しても円滑に成長／発酵するものと知られており、酸性における耐性も高いと知られている。

【0008】

酸性においてよく育つ酵母（以下、耐酸性酵母）を用いて乳酸を生産する場合、発酵時に中和剤を用いて培地をｐＨ６～７に保つ必要がないので、発酵工程が単純となり、且つ後で中和剤を除去する精製工程が不要である。また、酵母は、代謝に必要な多くの成分を自ら作るため、細菌、特に、ラクトバチルスに比べて比較的栄養レベルの低い培地でも培養可能であり、多くの後段の精製工程を省くことができ、生産単価を大幅に下げることができる。

【0009】

しかしながら、酵母を用いる乳酸生産技術には前提条件があるが、それは、商業化に適用するためには菌株発酵性能指標である収率、生産性、乳酸の濃度が、乳酸菌を用いた場合と類似なレベルに高く維持される必要があるということである。

【0010】

酵母を用いた耐酸性乳酸技術の開発が試みられているが、実際には、発酵中に中和反応を利用して、ｐＨを乳酸のｐＫａ値以上である３．７以上に維持しつつ発酵をしてこそ高性能の発酵能が得られる場合が多いため、実質的に耐酸性技術とは言い難く、工程における生産費節減の効果も得難い（非特許文献２）。

【0011】

したがって、工程費用が節減できる耐酸性酵母は、中和剤を使用しないか或いは最小量で使用しながらｐＨがｐＫａ値以下の発酵液で発酵を終える必要があり、発酵の３代指標を乳酸菌と類似するレベルにしてこそ商業的適用の意味がある。

【0012】

一般の酵母は、グルコースを発酵するとエタノールを主生産物として代謝し、乳酸を生産する場合はごく稀である。また、高い耐酸性を持つ微生物から乳酸を生産する菌株を選択する確率が非常に低いため、本発明では、耐酸性に優れた酵母菌株を選別し、選別された菌株を遺伝工学的な方法で乳酸生産能を有するようにした。また、実際に選定された耐酸性菌株ライブラリーからはいずれもエタノールを生産する菌株が選定された。

【0013】

乳酸の生産代謝回路は、ピルベートで１段階反応によってなされ、この段階は、ラクテートデヒドロゲナーゼ酵素によって発生し、その後、輸送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）によって能動／拡散で細胞外に排出される。このような乳酸を主生産物として発酵するためには、乳酸生産能を導入すると同時に既存エタノール生産能を除去するための操作も伴われる必要がある。一般に、酵母では、ピルベートからエタノールに転換される２段階反応に進み、ピルベートからアセトアルデヒドに転換するＰＤＣ遺伝子を除去し、ＬＤＨを導入する方法が試みられている。

【0014】

しかしながら、サッカロミセスセレビシエのようなＣｒａｂ－ｔｒｅｅ陽性酵母では、ＰＤＣ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）を完全に遮断すると、細胞の脂質合成に必要なサイトゾルの（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）アセチル－ＣｏＡの供給が進行されないため成長が大きく阻害され、ＰＤＣを完全遮断しないと、ＬＤＨとピルベートという同一基質に対する競合のため、エタノール生産を完全に遮断できず、結果として、乳酸菌レベルの収率に上げることができないという問題がある。

【0015】

そこで、本発明者らは、耐酸性酵母において乳酸生産能を向上させるために鋭意努力した結果、前記耐酸性酵母でアルコールデヒドロゲナーゼ酵素を欠失しながらラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入して乳酸生成能を向上させた組換え菌株において、ピルベートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を欠失させ、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をさらに導入した組換え菌株を作製し、該組換え菌株を用いて乳酸を製造する場合、乳酸生成能が向上し、エタノール生成能が減少することを見出し、本発明を完成するに至った。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0016】

【文献】Ｅｌｌｅｎ Ｉ．Ｇａｒｖｉｅ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１０６－１３９，１９８０

【文献】Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２７：２２９－２５６，２０１０

【発明の概要】

【0017】

本発明の目的は、耐酸性酵母において乳酸生成能が増加しながらエタノール生成能が減少した組換え菌株を提供することにある。

【0018】

本発明の他の目的は、前記組換え耐酸性酵母を用いて乳酸を製造する方法を提供することにある。

【0019】

本発明のさらに他の目的は、前記耐酸性酵母由来のピルベートデカルボキシラーゼ活性を有する遺伝子を提供することにある。

【0020】

前記目的を達成するために、本発明は、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）において、ピルベートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は弱化され、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている、乳酸生成能を有する組換え菌株を提供する。

【0021】

本発明はまた、（ａ）前記組換え菌株を培養して乳酸を生成させる段階；及び（ｂ）前記生成された乳酸を収得する段階を含む乳酸の製造方法を提供する。

【0022】

本発明はまた、ピルベートデカルボキシラーゼ活性を有し、配列番号３又は配列番号４で表示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。

【0023】

本発明はまた、ピルベートデカルボキシラーゼ活性を有し、配列番号３又は配列番号４で表示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を提供する。

【0024】

本発明はまた、配列番号５又は配列番号６で表示される塩基配列を有するｇ３００２遺伝子のプロモーターを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】ＹＢＣ菌株から対象遺伝子を除去するためのカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）構造に対する例を示す図であり、（ａ）及び（ｂ）は、ｇ４４２３を対象に対象遺伝子のＯＲＦを除去しながらＬＤＨを導入するカセットに対して２種の選択マーカーを使用する場合を示し、（ｃ）は、対象遺伝子を除去するためのカセットの一例を示す。

【0026】

【図2】ＹＢＣ菌株においてＰＤＣ遺伝子候補がノックアウトされた組換え菌株Δｇ４６０、Δｇ３００２－１、Δｇ３００２－２及びΔｇ６００４菌株のＰＤＣ活性を確認した結果を示す図である。

【0027】

【図3】ＹＢＣ菌株においてＰＤＣ遺伝子候補がノックアウトされた組換え菌株Δｇ３００２－１、Δｇ３００２－２の成長、エタノール生産収率、糖消耗速度及びエタノール生産性を比較した図である。

【0028】

【図4】ＹＢＣ菌株においてＰＤＣ遺伝子候補がノックアウトされた組換え菌株Δｇ４６０、Δｇ３００２－２及びΔｇ６００４の成長曲線（Ａ）及びエタノール生産能（Ｂ）を示す図である。

【0029】

【図5】ｐＨ３フラスコ培養条件で組換え菌株ＹＢＣ１、ＹＢＣ２及びＹＢＣ３の乳酸生産収率（Ａ）、エタノール生産収率（Ｂ）及び乳酸生産性（Ｃ）を示す図である。

【0030】

【図6】ｐＨ４フラスコ培養条件で組換え菌株ＹＢＣ１、ＹＢＣ２及びＹＢＣ３の乳酸生産収率（Ａ）、エタノール生産収率（Ｂ）及び乳酸生産性（Ｃ）を示す図である。

【0031】

【図7】発酵器において組換え菌株ＹＢＣ１及びＹＢＣ２のグルコース消費量（Ａ）及び乳酸生産能（Ｂ）を示す図である。

【0032】

【図8】発酵器において培養条件最適化後に組換え菌株ＹＢＣ２のグルコース消費量及び乳酸生産能を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0033】

別に断らない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家に通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で用いられる命名法は、本技術分野によく知られており、通常用いられるものである。

【0034】

耐酸性酵母は、酸性ｐＨにおいても糖を速い速度で消耗し、高い成長率を示し、発酵条件では、消耗した糖を代謝産物に転換する特徴を有する。本発明では、このような特徴を有する酵母を多くの酵母ライブラリーから選別し、選別された菌株は、乳酸濃度が４０ｇ／Ｌ～８０ｇ／Ｌである条件でも高い成長性及び糖消耗速度を示した。このような選別された菌株を対象にして、遺伝工学を用いた代謝回路調節を実施した。

【0035】

代謝回路調節方法について、前述したように、今まで、多くの研究者たちは、ピルベートから競合反応によって進行されるピルベートデカルボキシラーゼ（ｐｙｒｕｖａｔａｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）酵素を除去してエタノールを減少させる研究を行っており、それについてＣａｒｇｉｌｌ、Ｔｏｙｏｔａ、サムスンなどから多くの先行研究が発表されたことがあるが（ＵＳ７５３４５９７、ＵＳ７１４１４１０Ｂ２、ＵＳ９３５３３８８Ｂ２、ＪＰ４６９２１７３Ｂ２、ＪＰ２００１－２０４４６４Ａ、ＪＰ４０９５８８９Ｂ２、ＫＲ１６８６９００Ｂ１）、ＰＤＣの除去によるエタノール減少の効果は非常に直接的で且つ大きいが、酵母は、ＰＤＣを完全除去すると、脂肪酸生成が中断されて細胞の成長が阻害され、ＰＤＣが一部残ると、エタノール生成を完全に遮断することができない。このため、本発明者らは、ＬＤＨを強く発現させてピルベートからラクテートへの転換力を高める上に、ＡＤＨを欠失してエタノール生成能を８０％遮断した菌株を開発した（韓国特許出願第２０１８－００４４５０８号、韓国特許出願第２０１８－００４４５０９号）。ここに、中間産物であるアセトアルデヒドの蓄積を防止するために、さらにＰＤＣ遺伝子を欠失し、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をさらに導入した組換え菌株を作製することにより、中間産物毒性は最小化しながらサイトゾルのアセチル－ＣｏＡの供給には影響を与えることなく、エタノール生成能をより減少させながら乳酸生産能はより向上させた菌株を開発した。

【0036】

本発明では、ＰＤＣは、解糖過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）後にエタノール生成においてＡＤＨと共に重要な役割を担う２つの遺伝子の一つであり、ＡＤＨと同じ程度に強く発現する遺伝子であるため、ＰＤＣ遺伝子のプロモーターによって調節される前記組換え菌株においてＬＤＨが強く発現し、また、ＰＤＣ活性の減少によって、細胞内ピルベートプール（ｐｏｏｌ）が増加し、これによって乳酸生成が増加することを確認した。

【0037】

したがって、本発明は、一観点において、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてピルベートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子が欠失又は弱化され、ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されている乳酸生成能を有する組換え菌株に関する。

【0038】

本発明において、前記ピルベートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、ｇ３００２遺伝子であることを特徴とし得る。

【0039】

本発明では、ＹＢＣ菌株において存在する１２個ＰＤＣ遺伝子候補のうち、ＹＢＣ菌株から欠失した時、ＰＤＣ活性が最も多く減少する遺伝子であるｇ３００２遺伝子を主ＰＤＣ遺伝子（ｍａｉｎ ＰＤＣ遺伝子）として選別した。

【0040】

前記ｇ３００２遺伝子は、ＹＢＣ菌株のゲノムにおいて異なる２ヶ所にＯＲＦが存在する非常に独特な構造の遺伝子で、ゲノムシーケンス上で、スキャフォールド２７（Ｓｃａｆｆｏｌｄ ２７）の位置及びスキャフォールド７２（Ｓｃａｆｆｏｌｄ ７２）の位置にあり、またゲノム上で前後のＯＲＦが異なる遺伝子であって、別個の独立した遺伝子である。前記２ヶ所のｇ３００２遺伝子は、互いに９８．４６％の遺伝子レベルの相同性を有し、２ヶ所の遺伝子の前段部におけるプロモーター部分は互い異なる配列を有していることから、異なる機序で発現が調節されると推定され、前記２ヶ所の遺伝子のいずれか一方の遺伝子が主ＰＤＣ遺伝子として作動すると推定された。

【0041】

このように非常に類似する２つの遺伝子が存在する理由は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで知られたＰＤＣ１とＰＤＣ５間の相互補完機序と類似に、一方の遺伝子が消失されたり作動しないとき、これを補償（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）する遺伝子として作動するための進化の結果である可能性が非常に高い。本発明において、７２スキャフォールドに位置しているｇ３００２遺伝子を除去した場合、エタノール生産量及びグルコース消費量と成長など、全般的な表現型にも影響を及ぼすことが見られた。

【0042】

本発明の一様態では、ＹＢＣ１菌株のスキャフォールド７２に位置しているｇ３００２遺伝子（以下、ｇ３００２－１遺伝子と称する。）を除去しながらＬＤＨ遺伝子を導入した組換え菌株ＹＢＣ２と、組換え菌株ＹＢＣ２からさらに、スキャフォールド２７に位置しているｇ３００２遺伝子（以下、ｇ３００２－２遺伝子と称する。）を除去しながらＬＤＨ遺伝子を導入した組換え菌株ＹＢＣ３を作製し、これら組換え菌株を培養して、乳酸とエタノール生産能、及び乳酸生産性の向上を確認した。

【0043】

本発明において、前記ｇ３００２遺伝子は、ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）のゲノムシーケンス上で、スキャフォールド２７（ｇ３００２－２）位置及びスキャフォールド７２（ｇ３００２－１）位置にある遺伝子であることを特徴とし、前記スキャフォールド７２位置のｇ３００２－１遺伝子が欠失又は弱化していることを特徴とし得る。

【0044】

本発明において、前記組換え菌株は、前記スキャフォールド７２位置のｇ３００２－１遺伝子及び前記スキャフォールド２７位置のｇ３００２－２遺伝子の一方だけが欠失されたり、両方とも欠失されていることを特徴とし得る。

【0045】

本発明において、前記ｇ３００２－１遺伝子は、配列番号３で表示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とし、前記ｇ３００２－２遺伝子は、配列番号４で表示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とし得る。

【0046】

本発明において、前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ｇ３００２遺伝子に代えて導入され、ｇ３００２遺伝子のプロモーターによって調節されることを特徴とし得る。各ｇ３００２－１とｇ３００２－２のプロモーター領域（ｒｅｇｉｏｎ）の配列を、それぞれ配列番号５及び配列番号６に示した。

【0047】

本発明において、前記ラクテートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ由来ＬＤＨ遺伝子、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ由来ＬＤＨ遺伝子、又はＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨ遺伝子が好ましく、より好ましくは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨ遺伝子が好ましい。

【0048】

本発明において、前記組換え菌株は、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ＡＤＨ遺伝子）がさらに欠失されていることを特徴とし、前記アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、ｇ４４２３遺伝子であることを特徴とし得る。

【0049】

本発明において、前記組換え菌株は、前記ＡＤＨ遺伝子に代えてＬＤＨ遺伝子がさらに導入されていることを特徴とし得る。

【0050】

本発明において、前記ｇ３００２遺伝子の欠失又は弱化によって、親菌株であるＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）に比べてエタノール生成能が減少することを特徴とし得る。

【0051】

したがって、本発明は、他の観点において、（ａ）前記組換え菌株を培養して乳酸を生成させる段階；及び（ｂ）前記生成された乳酸を収得する段階を含む乳酸の製造方法に関する。

【0052】

本発明によって、ラクテート生産が大きく増加し、エタノール生産が大きく減少した優れた耐酸性菌株を確保することができる。

【0053】

さらに他の観点において、本発明は、ピルベートデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードし、配列番号１又は配列番号２で表示される塩基配列と９０％の相同性を有する遺伝子に関する。

【0054】

さらに他の観点において、本発明は、ピルベートデカルボキシラーゼ活性を有し、配列番号３又は配列番号４で表示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子に関する。

【0055】

本発明において、前記遺伝子は、配列番号１又は配列番号２で表示される塩基配列を有することを特徴とし得る。

【0056】

さらに他の観点において、本発明は、ピルベートデカルボキシラーゼ活性を有し、配列番号３又は配列番号４で表示されるアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。

【0057】

さらに他の観点において、本発明は、配列番号５又は配列番号６で表示される塩基配列を有するｇ３００２遺伝子のプロモーターに関する。

【0058】

本発明において、‘耐酸性酵母’とは、有機酸のｐＫａ値未満のｐＨにおいて、培地に有機酸が含まれていない場合に比べて、培地に１Ｍ以上の有機酸（特に、乳酸）が含まれている場合、少なくとも１０％のバイオマス消耗率（糖消耗率など）又は少なくとも１０％の非生長率を維持できる酵母と定義する。より具体的に、本発明において、‘耐酸性酵母’とは、ｐＨ５以上の場合に比べて、ｐＨ２～４において少なくとも１０％のバイオマス消耗率（糖消耗率など）又は少なくとも１０％の非生長率を維持できる酵母と定義する。

【0059】

本発明に係る組換え酵母は、通常の方法によって前記遺伝子を宿主酵母の染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）上に挿入させたり、或いは前記遺伝子を含むベクターを宿主酵母に導入させることによって製造できる。

【0060】

前記宿主酵母は、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主細胞が通常用いられ、本発明の一実施例では耐酸性酵母を用いているが、これに限定されず、目的ＤＮＡが十分に発現するものであればいかなる種類の酵母も構わない。

【0061】

前記組換え酵母は、任意の形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）方法によって製造できる。“形質転換”とは、ＤＮＡを宿主に導入し、ＤＮＡが染色体の因子として又は染色体統合完成によって複製可能になることであり、外部のＤＮＡを細胞内に導入して人為的に遺伝的な変化を起こす現象を意味し、通常の形質転換方法には電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、酢酸リチウム－ＰＥＧ法などがある。

【0062】

また、本発明において遺伝子を宿主微生物の染色体上に挿入する方法には、通常知られた任意の遺伝子操作方法を用いることができ、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスシンプレックスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、非ウイルス性ベクターなどを利用する方法がある。“ベクター”は、適当な宿主内でＤＮＡを発現させ得る適当な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は簡単に潜在的ゲノム挿入物であり得る。適当な宿主に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムとは関係なく複製し機能してもよく、或いは、一部の場合にはゲノム自体に統合されてもよい。現在、プラスミドがベクターの最も一般に用いられる形態であり、また、線形化ＤＮＡ（Ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ ＤＮＡ）も酵母のゲノム集積（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）のために一般に使用する形態である。

【0063】

典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たりにプラスミドベクターを含むように複製が効率的に行われるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞を選抜可能にする抗生剤耐性遺伝子又は栄養要求マーカー遺伝子（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ）、及び（ｃ）外来ＤＮＡ切片を挿入可能にする制限酵素切断部位を含む構造を有する。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を用いれば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができ（Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）、必要によっては、所望の全シーケンスを合成して使用する方法も通常用いられている。

【0064】

なお、前記遺伝子は、他の核酸配列と機能的関係で配置される時に“作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合される時に遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であり得る。例えば、前配列（ｐｒｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は分泌リーダ（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現する場合にポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合にコーディング配列に作動可能に連結されたり；又はリボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合にコーディング配列に作動可能に連結されたり；又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合にコーディング配列に作動可能に連結される。

【0065】

一般に、“作動可能に連結された”とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また分泌リーダの場合、接触しリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は、接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位においてライゲーション（連結）によって行われる。このような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を用いる。

【0066】

勿論、全てのベクターが本発明のＤＮＡ配列を発現させる上で同等に機能を発揮するわけではなく、同様に、全ての宿主が同じ発現システムに対して同一に機能を発揮するわけではない。しかし、当業者であれば、過度な実験的負担無しで本発明の範囲から逸脱しない状態で、他の様々なベクター、発現調節配列及び宿主の中から適宜選択して適用することができる。例えば、ベクターを選択するに当たっては宿主を考慮しなければならないが、これは、ベクターがその宿主内で複製されなければならないためであり、ベクターの複製数、複製数を調節できる能力、及び当該ベクターによってコードされる他のタンパク質、例えば、抗生剤マーカーの発現も考慮される必要がある。

【0067】

本発明において、炭素源は、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、フルクトース、セルロース、ガラクトース、グルコースオリゴマー及びグリセロールで構成された群から選ばれる一つ以上であることを特徴とし得るが、これに限定されない。

【0068】

本発明において、培養は、微生物、例えば大腸菌などがそれ以上働かないように（例えば、代謝体生産不可能）する条件で行われてよい。例えば、培養は、ｐＨ１．０～６．５、好ましくはｐＨ１．０～６．０、より好ましくはｐＨ２．６～４．０であることを特徴とし得るが、これに限定されない。

【実施例】

【0069】

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

【0070】

実施例１：ＹＢＣ菌株においてピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）をコードする遺伝子の発現率を確認して主発現遺伝子を確認

【0071】

本発明者らは、様々な酵母菌株に対するテストを通じて耐酸性を有する菌株群を選別したことがある（大韓民国特許公開第２０１７－００２５３１５号）。前記選別された酵母菌に対して、乳酸を培養初期に培地に添加して微生物の成長及び糖消耗速度を確認しながら耐酸性に最も優れた菌株であるＹＢＣ菌株を選定し、韓国生命工学研究院生物資源センターにＫＣＴＣ１３５０８ＢＰとして寄託したことがある。

【0072】

系統分析から、ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと類似な菌株であり、２倍体の遺伝子を有しており（Ｄｉｐｌｏｉｄ）、Ｃｒａｂ－ｔｒｅｅ陽性の特性を有していることを確認した。

【0073】

ＹＢＣ菌株のゲノムにおいてＰＤＣとアノテーション（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）される遺伝子は複数個で存在し、主要遺伝子を表１に示した。

【0074】

【表1】

【0075】

ゲノムフルシーケンシングデータ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｆｕｌｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｄａｔａ）から、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びバイオインフォマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）情報を用いてＹＢＣ菌株のゲノムに存在するＰＤＣ遺伝子候補１２種を選別し、それらを下記のように検討して主ＰＤＣ候補を選別した。

【0076】

Ｇ２３３５：ＰＤＣ２：ＰＤＣの助酵素の役割

【0077】

Ｇ１５７４：ＴＨＩ３：調節タンパク質

【0078】

Ｇ４０７２：フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｐｈｅｈｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）

【0079】

Ｇ４１３６：他のＰＤＣ候補遺伝子に付着している遺伝子であって、除外する

【0080】

Ｇ４８２２、ｇ５８０９及びｇ３９１７は、追加ゲノムシーケンシングにおいてＯＲＦから除外する

【0081】

Ｇ５２３７は２５０ｂｐであり、ＰＤＣの適正サイズを作ることができず、除外する

【0082】

Ｇ４６０、ｇ２５５０、ｇ３００２及びｇ６００４：主ＰＤＣ候補として暫定決定する

【0083】

前記ｇ３００２遺伝子がアノテーションにおいてＰＤＣ１に最も近似するものと現れ、これを基準に類似性を比較した結果、表２に示すように、ｇ４６０遺伝子、ｇ３００２遺伝子及びｇ６００４遺伝子がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＤＣ１遺伝子との類似性が最も高いことがわかり、まずこれをターゲットとして選定し、該ターゲット遺伝子をＹＢＣ菌株のゲノムから欠失させる遺伝子操作を行った。

【0084】

【表2】

【0085】

【表3】

【0086】

実施例２：ＹＢＣ菌株からターゲットＰＤＣ遺伝子を除去してエタノール生成低下効果を確認

【0087】

実施例１で確認されたＹＢＣ菌株のターゲットＰＣＤ遺伝子をノックアウトさせた組換え菌株を作製し、ＰＤＣ遺伝子除去が菌株の成長に及ぼす影響を確認した。

【0088】

ｇ４６０遺伝子、ｇ３００２遺伝子及びｇ６００４遺伝子及びそれらのＵＴＲの情報に基づいて各遺伝子のＯＲＦが除去され、５’と３’ＵＴＲ及び抗生剤マーカーがある図１（ｃ）と類似の遺伝子カセットを作製してドナー（Ｄｏｎｏｒ）ＤＮＡとして用いた。

【0089】

ｇ４６０遺伝子の５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲをそれぞれ配列番号７及び配列番号８に示し、ｇ３００２遺伝子の５’－ＵＴＲを配列番号５及び配列番号６に示し、３’－ＵＴＲを配列番号９及び配列番号１０に示した。ｇ６００４遺伝子の５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲをそれぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示した。

【0090】

ドナーＤＮＡの作製には、前述したように、制限酵素を用いたクローニング方法と、ギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）、遺伝子合成を用いた方法が用いられた。作製されたドナーＤＮＡを導入し、マーカー遺伝子に対応するプレートで育ったコロニーに対して各遺伝子が除去されたことを確認するために、次のようなＯＲＦ用プライマーを用いてＰＣＲでＯＲＦが除去されたことを確認し、Δｇ４６０、Δｇ３００２及びΔｇ６００４菌株を得た。このとき、使用したプライマーにおいて、各遺伝子のＯＲＦ ｉｎｓｉｄｅは、各ＯＲＦの内部の配列を用いてＯＲＦ存在の有無を確認することができ、ＯＲＦ ｏｕｔｓｉｄｅは、各遺伝子のＵＴＲ部分を測定し、欠失（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ）以降のサイズ変化から、ＯＲＦが実際に除去されたことが確認できた。また、当該菌株がＤｉｐｌｏｉｄｉｔｙを有していることを考慮して、対立遺伝子変異（Ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）のない箇所は、２個の対立遺伝子（Ａｌｌｅｌｅ）を同時に確認することができ、場合によっては、対立遺伝子別に別個のプライマーを作製して使用した。

【0091】

ｇ４６０ ＯＲＦ ｉｎｓｉｄｅ－ｆｗｄ：ＣＣＡＧＡＣＡＡＴＴＧＧＴＴＧＡＴＡＴＣＡＣＣ（配列番号１３）

【0092】

ｇ４６０ ＯＲＦ ｉｎｓｉｄｅ（Ａ１）－ｒｅｖ：ＧＴＡＡＡＡＡＧＧＡＡＣＴＴＡＧＡＴＧＴＣＴＣＣ（配列番号１４）

【0093】

ｇ４６０ ＯＲＦ ｉｎｓｉｄｅ（Ａ２）－ｒｅｖ：ＧＴＡＡＧＡＡＴＧＡＡＣＴＴＡＧＡＴＧＴＣＴＣＣ（配列番号１５）

【0094】

ｇ４６０ ＯＲＦ ｏｕｔｓｉｄｅ－ｆｗｄ：ＴＧＡＧＧＣＡＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＡ（配列番号１６）

【0095】

ｇ４６０ ＯＲＦ ｏｕｔｓｉｄｅ－ｒｅｖ：ＴＡＡＡＡＣＡＣＣＣＧＣＡＣＡＣＧＡ（配列番号１７）

【0096】

ｇ６００４ ＯＲＦ ｉｎｓｉｄｅ－ｆｗｄ：ＣＣＡＧＧＣＡＡＴＴＡＧＴＴＧＡＴＡＴＣＡＣＴ（配列番号１８）

【0097】

ｇ６００４ ＯＲＦ ｉｎｓｉｄｅ－ｒｅｖ：ＣＡＴＡＴＣＴＴＣＧＧＡＣＡＧＣＴＴＡＣ（配列番号１９）

【0098】

ｇ６００４ ＯＲＦ ｏｕｔｓｉｄｅ－ｆｗｄ：ＧＴＧＣＣＣＡＣＡＴＴＡＡＡＧＴＣＴ（配列番号２０）

【0099】

ｇ６００４ ＯＲＦ ｏｕｔｓｉｄｅ－ｒｅｖ：ＣＣＣＧＧＴＡＣＡＣＡＴＴＴＣＣＴＣ（配列番号２１）

【0100】

ｇ３００２ ＯＲＦ ｉｎｓｉｄｅ－ｆｗｄ：ＧＡＡＧＴＣＧＡＡＧＧＴＡＴＧＡＧＡ（配列番号２２）

【0101】

ｇ３００２ ＯＲＦ ｉｎｓｉｄｅ－ｒｅｖ：ＡＴＡＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧ（配列番号２３）

【0102】

ｇ３００２－１ ＯＲＦ ｏｕｔｓｉｄｅ－ｆｗｄ：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号２４）

【0103】

ｇ３００２－１ ＯＲＦ ｏｕｔｓｉｄｅ－ｒｅｖ：ＣＡＧＡＡＴＣＴＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号２５）

【0104】

ｇ３００２－２ ＯＲＦ ｏｕｔｓｉｄｅ－ｆｗｄ：ＡＴＧＴＴＡＡＧＣＧＡＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号２６）

【0105】

ｇ３００２－２ ＯＲＦ ｏｕｔｓｉｄｅ－ｒｅｖ：ＧＴＣＧＴＧＴＣＴＡＡＴＧＴＴＡＧＣ（配列番号２７）

【0106】

前記得られたΔｇ４６０、Δｇ３００２及びΔ ｇ６００４菌株を用いてＰＤＣ活性を測定した。対象菌株のＰＤＣ活性は、よく知られた文献上の方法に基づいて測定した（Ｔ．Ｃ．Ｈｏｐｐｎｅｒ，Ｈ．Ｗ．Ｄｏｅｌｌｅ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７：１５２－１５７，１９８３）。

【0107】

活性測定に必要な溶液は、次のように準備した。

【0108】

１． ２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー、２０％ ＫＯＨ溶液でｐＨ６．０に調整する。

【0109】

２． １５ｍＭ ＴＰＰ（Ｔｈｉａｍｉｎｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液を製造して１ｍｌずつ分注し、－２０℃で冷凍保管する。

【0110】

３． １００ｍＭ ＭｇＣｌ_２二水和物（ｄｉｈｙｄｒａｔｅｓ）溶液を製造して４℃で冷蔵保管する。

【0111】

４． １．０Ｍピルビン酸ナトリウム溶液を製造して１ｍｌずつ分注し、－２０℃で冷凍保管する。

【0112】

５． ４．０ｍＭ β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド二ナトリウム水和物（β－ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｈｙｄｒａｔｅ）９８％以下の溶液を製造して遮光容器に１ｍｌずつ分注し、－２０℃で冷凍保管する。

【0113】

６． ２００Ｕ／ｍｌの濃度でアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）溶液を製造して１ｍｌずつ分注し、－２０℃で冷凍保管する。

【0114】

タンパク質酵素液は、次のように準備した。

【0115】

１． ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．５溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を製造して冷蔵保管

【0116】

１ｍＭ ＰＭＳＦ（１００ｍＭ ＰＭＳＦ ｉｎ ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ ｓｔｏｃｋを使用直前に希釈して使用）投入

【0117】

２． ＹＰＤ培地で酵母菌を培養して対数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）に進入した時、遠心分離して酵母菌体を回収

【0118】

３． 回収した酵母菌体を冷溶解バッファー（ｃｏｌｄ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄し、同一溶液に再懸濁

【0119】

４． 酵母懸濁液５ｍｌに冷蔵保管された酸洗浄ガラスビーズ（Ａｃｉｄ ｗａｓｈｅｄ ｇｌａｓｓ ｂｅａｄｓ）２．０ｇを投入

【0120】

５． ３０秒間総５回ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）を行い、毎ボルテックスの間に破砕液を１分間氷に保管して低温を維持

【0121】

ガラスビーズが除去された破砕液を取って超高速遠心分離（４℃、３０分間、３０，０００ｇ）して細胞破片を除去し、上澄液を酵素液として用いた。酵素液中の総タンパク質定量は、ウシ血清アルブミン溶液を標準溶液としてＢＣＡ法で定量した。透明平底９６ウェルプレートにおいて、下表の上から下の順に試薬を投入し、総２００μｌ体積で３０℃で５分間反応し、１５秒間隔で３４０ｎｍで吸光度変化推移を観察した。

【0122】

【表4】

【0123】

溶液１（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １）は、ＰＤＣアッセイ以前に製造し、常温に維持しつつ下記の組成で混合して使用した。

【0124】

【表5】

【0125】

ＰＤＣ活性単位（ＰＤＣ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｕｎｉｔ）の定義は、次の通りである。

【0126】

１単位のＰＤＣ活性は、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを酸化させ得る酵素活性と定義する。

【0127】

－ｄＡ／ｄｔ＝［Ｒａｔｅ］ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ－［Ｒａｔｅ］ｂｌａｎｋ

【0128】

ＰＤＣ（Ｕｎｉｔ／ｍｌ ｅｎｚｙｍｅ）＝｛ｄＡ／ｄｔ×（Ｖｔｏｔａｌ，ｍｌ）｝／（６．２２×Ｖｓａｍｐｌｅ，ｍｌ）

【0129】

この分析において、光路長（Ｌｉｇｈｔ ｐａｔｈ ｌｅｎｇｔｈ）が０．６ｃｍ（９６ウェルプレート、０．２ｍｌ体積）であるので、

【0130】

ＰＤＣ（Ｕｎｉｔ／ｍｌ ｅｎｚｙｍｅ）Ａｃｔｉｖｉｔｙ＝５．３６×ｄＡ／ｄｔと計算される。

【0131】

また、比ＰＤＣ活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＤＣ ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、Ｕｎｉｔ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎと定義され、測定された総タンパク質濃度を用いて求める。

【0132】

Ｕｎｉｔ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ＝（Ｕｎｉｔ／ｍｌ ｅｎｚｙｍｅ）／（ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ ｅｎｚｙｍｅ）

【0133】

このようなＰＤＣの測定結果、図２に示すように、Δｇ３００２－１菌株においてＰＤＣ活性が最も多く減少することが見られ、Δｇ３００２－２菌株においても活性が減少することが確認された。

【0134】

前記得られたΔｇ３００２－１菌株とΔｇ３００２－２菌株を、４０ｇ／Ｌのグルコース濃度を持つＹＰ培地で１５０ｍｌ培養したが、３０℃、２００ｒｐｍで培養した。

【0135】

その結果、図３に示すように、菌株成長においてΔｇ３００２－２のノックアウト菌株と野生型ＹＢＣ菌株を対比したとき、若干の性能減少しか見られず、大差はなかったが、特異にも、Δｇ３００２－１の菌株は、成長速度、グルコース消費速度及びエタノール収率も有意に減少することが見られ、既存Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではＰＤＣ１が除去されてもＰＤＣ５による補償（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）効果によってその除去効果が表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）ではよく現れないのとは違い、補償（Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）遺伝子による補償作用が少ないと判断される。

【0136】

これに対比する実験として、前記得られたΔｇ４６０、Δｇ３００２－２及びΔｇ６００４菌株を、４０ｇ／Ｌのグルコース濃度を有するＹＰ培地で１５０ｍｌ培養したが、３０℃、２００ｒｐｍで培養した。

【0137】

その結果、図４のＡに示すように、菌株成長において各ＰＤＣノックアウト菌株と野生型ＹＢＣ菌株間に大差がなく、エタノール生産にも有意な差異がないことが分かった。

【0138】

このように各遺伝子が欠失された菌株の培養結果及び酵素活性分析結果から、ＹＢＣ菌株においてｇ３００２遺伝子が主ＰＤＣ（ｍａｉｎ ＰＤＣ）遺伝子であることを確認し、特に、ｇ３００２－１遺伝子が主な役割を担うことが確認された。

【0139】

実施例３：ＰＤＣ遺伝子が除去されてＬＤＨが導入された組換え菌株を用いた乳酸生産

【0140】

ＹＢＣ菌株においてｇ３００２－１遺伝子が主ＰＤＣ遺伝子であることが確認されたが、乳酸生産のためにラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＬＤＨ遺伝子）を導入させる場合、ＬＤＨの発現強度は、遺伝子の前部にあるプロモーターから由来する特性であるので、ターゲット遺伝子のＯＲＦを除去しながらＬＤＨ遺伝子を導入し、ＬＤＨ発現に対する影響を確認した。

【0141】

ただし、この時はターゲット遺伝子が除去されると同時にＬＤＨが発現するので、この遺伝子の消失による影響が共に現れ、ＬＤＨだけの単独発現効果とは判断し難い。

【0142】

対象菌株は、野生型菌株ではなく、既存の野生型に主ＡＤＨ（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子を除去しながらＬＤＨ遺伝子を導入した菌株（ＹＢＣ１）を対象にした。

【0143】

ＹＢＣ菌株に導入するＬＤＨ遺伝子の候補遺伝子を文献に基づいて選別し（Ｎ．Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．，１９６４－１９７０，２００５；Ｍ．Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２７：１，２２９－２５６，２０１０）、最終的に配列番号４で表示されるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨ遺伝子を選択して導入した。前記ＹＢＣ１菌株は、ＹＢＣ菌株の主ＡＤＨ遺伝子であるｇ４４２３遺伝子を除去し、該ｇ４４２３位置にラクトバチルスプランタルム由来の配列番号２８のＬＤＨ遺伝子を導入した菌株であり、ｇ４４２３及びこれらのＵＴＲの情報に基づいて各遺伝子のＯＲＦが除去され、５’と３’ＵＴＲ及び抗生剤マーカーがある図１の（ａ）及び（ｂ）の遺伝子カセットを作製してドナーＤＮＡとして用いた。ｇ４４２３の各対立遺伝子に対して相応する５’ＵＴＲは配列番号２９及び配列番号３０に示し、３’ＵＴＲは配列番号３１及び配列番号３２に示した。ドナーＤＮＡの作製には、前述したように、制限酵素を用いたクローニング方法と、ギブソンアセンブリ、遺伝子合成を用いた方法が用いられた。ｇ４４２３のＯＲＦ座に配列番号２８のＬＤＨを合成した後に導入してドナーＤＮＡを作製し、これをＹＢＣに導入して組換え菌株ＹＢＣ１を作製した。

【0144】

なお、ｇ３００２遺伝子は、ＹＢＣ菌株のゲノムにおいて異なる２ヶ所にＯＲＦが存在する非常に独特の構造の遺伝子であり、ゲノムシーケンシング結果において、スキャフォールド２７及びスキャフォールド７２位置にある遺伝子である。前記２ヶ所のｇ３００２遺伝子は互いに９８．４６％の遺伝子レベルの相同性を有しているが、２ヶ所の遺伝子の前段部のプロモーター部分は、互いに極めて異なる配列を有しており、異なる機序で発現が調節されると推定され、前記２ヶ所の遺伝子の一方の遺伝子が主ＰＤＣ遺伝子として働くと推定された。

【0145】

このように非常に類似する２つの遺伝子が存在する理由は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで知られたＰＤＣ１とＰＤＣ５間の相互補完機序と類似に、一方の遺伝子が消失されたり作動しないとき、これを補償（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）する遺伝子として作動するための進化の結果である可能性が高いので、ＹＢＣ１菌株のｇ３００２－１遺伝子（スキャフォールド７２に位置した遺伝子）を除去しながら配列番号４のＬＤＨ遺伝子を導入した組換え菌株ＹＢＣ２と、組換え菌株ＹＢＣ２からさらにｇ３００２－２（スキャフォールド２７に位置している遺伝子）遺伝子を除去しながらＬＤＨ遺伝子を導入した組換え菌株ＹＢＣ３を作製し、これらの組換え菌株を培養し、乳酸とエタノール生産能及び乳酸生産性を確認した。

【0146】

特に、このようなｇ３００２の遺伝子の置換を確認するために、前記のＹＢＣ１のｇ４４２３遺伝子（ＡＤＨ）の座にＬＤＨを導入する方法と類似にｇ３００２－１及びｇ３００２－２のＵＴＲを用いて作製した。ただし、当該遺伝子の置換では過程の単純化のために対立遺伝子変異を考慮せず、一方の対立遺伝子を対象にしてドナーカセット（Ｄｏｎｏｒ ｃａｓｓｅｔｔｅ）を作製したが、対立遺伝子別の作製も可能である。また、遺伝子置換に使用するプライマーに対しても、前記の欠失菌株の作製に用いたプライマーの他、次のようにｇ３００２－１及びｇ３００２－２のＵＴＲとＬＤＨを共に確認できるプライマー対を個別に用いて遺伝子置換確認の正確度を上げた。

【0147】

ｇ３００２－１ ＵＴＲ－ＬＤＨ－ｆｗｄ：ＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号３３）

【0148】

ｇ３００２－１ ＵＴＲ－ＬＤＨ－ｒｅｖ：ＡＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＡＴＡＧ（配列番号３４）

【0149】

ｇ３００２－２ ＵＴＲ－ＬＤＨ－ｆｗｄ：ＡＴＧＴＴＡＡＧＣＧＡＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号３５）

【0150】

ｇ３００２－２ ＵＴＲ－ＬＤＨ－ｒｅｖ：ＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡ（配列番号３６）

【0151】

前記組換え菌株に対して接種ＯＤは０．５、培地はＹＰ培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ））にグルコース６％を用いて１００ｍｌのフラスコ培養で３０℃、１７５ｒｐｍ条件で４時間培養後に、１２５ｒｐｍ条件で培養した。

【0152】

その結果、図５に示すように、ＹＢＣ１菌株に比べてｇ３００２遺伝子が欠失され、ＬＤＨ遺伝子がさらに挿入されたＹＢＣ２及びＹＢＣ３菌株において乳酸生成量が増加することを確認し、エタノール生成量は、ＹＢＣ２及びＹＢＣ３菌株においてＹＢＣ１菌株に比べて減少したことを確認した。乳酸の生産性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）は、ＹＢＣ２菌株において最も高いが、菌株間において大差はないことが確認された。

【0153】

なお、部分中和によってｐＨを調整した時の性能比較のために、既存の乳酸発酵で用いるＣａＣＯ_３を少量添加した。添加量は、ＣａＣＯ_３をグルコース投入量の３０％レベルに添加して最終ｐＨが４のレベルとなるように調節したが、詳細な培養条件は、次の通りである。前記組換え菌株は、接種ＯＤ値は２、培地はＹＰ培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス）にグルコース９％、ＣａＣＯ_３ ３％を使用し、１００ｍｌのフラスコ培養で３０℃、１５０ｒｐｍで培養した。

【0154】

その結果、図６に示すように、ＹＢＣ１菌株に比べてｇ３００２遺伝子が欠失され、ＬＤＨ遺伝子がさらに挿入されたＹＢＣ２及びＹＢＣ３菌株は、ｐＨ４条件でも乳酸生成量が増加することを確認し、エタノール生成量も、ＹＢＣ２及びＹＢＣ３菌株においてＹＢＣ１菌株に比べて顕著に減少したことを確認した。また、接種ＯＤ及び部分中和の効果によって生産性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）が図５の結果に比べて図６で増加したことが確認できた。

【0155】

ＰＤＣの場合、解糖過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）後にエタノール生成においてＡＤＨと共に重要な役割を果たす２つの遺伝子の一つで、ＡＤＨだけが強く発現する遺伝子であるため、ＰＤＣ遺伝子のプロモーターによって調節されるＹＢＣ２菌株及びＹＢＣ３菌株においてＬＤＨが強く発現すると判断され、また、ＰＤＣ活性の減少によって、細胞内ピルベートプールが増加し、これによって乳酸生成が増加すると判断される。

【0156】

本実施例において注目すべき事実は、エタノール収率の減少対比乳酸収率の増加に関する点である。図５のＹＢＣ１とＹＢＣ２を基準にすれば、エタノール収率は０．０９３ｇ／ｇから０．０７５ｇ／ｇへと０．０１８ｇ／ｇ減少した。エタノールと乳酸の分子量を考慮すれば、これは０．０１８＊９０／４６＝０．０３５の乳酸収率の増加につながると予想され、０．６２ｇ／ｇの収率増加が予想されたが、実際には０．６７ｇ／ｇの収率増加があり、これは、グリセロール及びアセテートのような他の副産物の収率減少が乳酸収率の増加に反映されたものであり、エタノール生成遮断の他、乳酸の追加発現によるＮＡＤＨバランス回復とこれによるグリセロールの生産量減少及び乳酸生産フラックス（Ｆｌｕｘ）の強化による収率増加によるものと判断され、ｇ３００２のプロモーターがＬＤＨ遺伝子をよく発現させ、このことからＬＤＨ酵素が強化されたことが分かる。

【0157】

これに基づいて図５の培養結果を判断すれば、ｇ３００２は乳酸生成能において大きな収率増加（ｐＨ調節無しで０．５９ｇ／Ｌ－＞０．６７ｇ／Ｌ）を確認し、ＰＤＣ活性の減少とともにＬＤＨの発現による収率増加及び性能増加があったことが分かる。

【0158】

実施例４：ｐＨ４で組換え菌株の乳酸生成能確認

【0159】

酸性条件での乳酸生成能を確認するために、培養液をｐＨ４に調節した後、ＹＢＣ１菌株及びＹＢＣ２菌株の発酵による乳酸生成能向上を確認した。

【0160】

ＹＢＣ１菌株は、ＳＨ（Ｈｅｓｔｒｉｎ ａｎｄ Ｓｃｈｒａｍｍｅ）培地（グルコース１２０ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、クエン酸１．１５ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ２．７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４、７Ｈ_２Ｏ １ｇ／Ｌ）を使用し、１Ｌ体積で発酵器で１２０ｇ／Ｌの糖濃度で培養した。培養温度は３０℃であり、０．２ｖｖｍで空気を供給しながらＮａＯＨでｐＨ４に調節し、３５０～４５０ｒｐｍレベルを維持した。

【0161】

ＹＢＣ２菌株は、ＨＳ培地を用いて１Ｌ体積で発酵器で１２０ｇ／Ｌの糖濃度で培養し、培養温度は３０℃であり、０．１ｖｖｍで空気を供給しながら、ＣａＣＯ_３を３．６％投入してｐＨ４に調節し、４００ｒｐｍレベルを維持した。

【0162】

その結果、図７に示すように、同一条件でＹＢＣ１菌株と比較したとき、ＹＢＣ２菌株の乳酸生成能が大きく向上することが確認できた。

【0163】

実施例５：ＹＢＣ２菌株の発酵性能最適化

【0164】

ＹＢＣ２菌株の乳酸発酵性能を向上させるために、培養条件最適化を行った。

【0165】

培養最適化は、主に、初期ＯＤ及び酸素供給速度に対する条件変化を中心に行い、その中でも最も良好な性能の２つの結果を図８に示した。

【0166】

図８のＡ条件は、ＹＢＣ２菌株に対して、培地はＹＰ培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス）であり、１Ｌ体積で発酵器で１２０ｇ／Ｌの糖濃度で培養した。培養温度は３０℃であり、０．０２５～０．０５ｖｖｍで空気を供給しながらＣａＣＯ_３を３．６％を３回に分けて発酵時間５時間、１３時間及び２３時間に投入して、ｐＨ４に調節し、３００～４００ｒｐｍレベルを維持した。

【0167】

図８のＢ条件は、ＹＢＣ２菌株に対して、培地はＹＰ培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス）であり、１Ｌ体積で発酵器で１２０ｇ／Ｌの糖濃度で培養した。培養温度は３０℃であり、０．０５ｖｖｍで空気を供給しながらＣａＣＯ_３を３．６％投入してｐＨ４に調節し、４００ｒｐｍを維持した。

【0168】

その結果、図８及び表４に示すように、図８のＡの条件で培養した時に収率が最も高いことを確認したが、生産性及び乳酸濃度は、図８のＢの条件が最もよいことが確認された。

【0169】

【表6】

【0170】

以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好ましい実施態様であり、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されると言えよう。

【産業上の利用可能性】

【0171】

本発明に係る組換え耐酸性酵母は、エタノール生成を抑制して細胞内ピルベートプールが増加し、ＬＤＨ酵素を強く発現して乳酸を高収率で生産することができる。

【0172】

以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好ましい実施態様であり、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されると言えよう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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