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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-31
(45)【発行日】2024-08-08
(54)【発明の名称】ＣＤ７３遮断抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240801BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240801BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240801BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240801BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240801BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240801BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240801BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
A61K39/395 P
A61K39/395 U
A61P31/00
A61P35/00
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/13
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2021562979
(86)(22)【出願日】2020-04-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-29
(86)【国際出願番号】 EP2020060955
(87)【国際公開番号】W WO2020216697
(87)【国際公開日】2020-10-29
【審査請求日】2023-04-17
(31)【優先権主張番号】62/837,214
(32)【優先日】2019-04-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】506000184
【氏名又は名称】イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＮＡＴＥ ＰＨＡＲＭＡ ＰＨＡＲＭＡ Ｓ．Ａ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】ゴーティエ，ローラン
(72)【発明者】
【氏名】パトゥレル，カリーヌ
(72)【発明者】
【氏名】ペロ，イヴァン
【審査官】山▲崎▼ 真奈
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５０２０５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０６４０４３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１９－５０３７０９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２１－５２２７８０（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＣＤ７３ポリペプチドに特異的に結合することができる抗体又は抗体断片であって、配列番号４２のアミノ酸配列（２Ｈ４＋鎖）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４３（２Ｌ１鎖）、４４（２Ｌ２鎖）、４５（２Ｌ３鎖）及び４６（２Ｌ４鎖）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗体又は抗体断片。
【請求項2】
配列番号４２のアミノ酸配列（２Ｈ４＋鎖）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号４３のアミノ酸配列（２Ｌ１鎖）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項3】
配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項4】
ＣＤ７３ポリペプチドの５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和することができる、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項5】
細胞の表面でヒトＣＤ７３ポリペプチドに特異的に結合し、且つその５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和することができ、前記ＣＤ７３ポリペプチドとその基質との間の結合を検出可能に低下させることなく、前記ヒトＣＤ７３ポリペプチドの活性を阻害する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体断片の重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸又は核酸のセット。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体断片を産生する組換え宿主細胞。
【請求項9】
患者における疾患の処置又は予防において使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項10】
前記疾患は、癌又は感染症である、請求項９に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項11】
前記癌は、白血病、膀胱癌、神経膠腫、神経膠芽腫、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、甲状腺癌、胃癌、食道癌、膵臓癌又は乳癌である、請求項１０に記載の抗体又は抗体断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、任意の図面を含む、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる２０１９年４月２３日提出の米国仮特許出願第６２／８３７，２１４号明細書の利益を主張する。
本願は、任意の図面を含む、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる２０１９年４月２３日提出の米国仮特許出願第６２／８３７，２１４号明細書の利益を主張する。
【0002】
配列表の参照
本願は、電子方式の配列リストと共に提出されている。本配列リストは、２０２０年４月１日作成の「ＣＤ７３－６＿ＳＴ２５」という名称で提供されており、サイズは、６２ｋＢである。本配列リストの電子方式の情報は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
本願は、電子方式の配列リストと共に提出されている。本配列リストは、２０２０年４月１日作成の「ＣＤ７３－６＿ＳＴ２５」という名称で提供されており、サイズは、６２ｋＢである。本配列リストの電子方式の情報は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
【0003】
本発明は、ＣＤ７３に結合し、且つそれを阻害する抗体及びその断片に関する。本発明は、そのような化合物を産生する細胞；そのような化合物並びにその抗体、断片、変異体及び誘導体を作製する方法；それを含む医薬組成物；化合物を使用して疾患、例えば癌を診断、処置又は予防する方法にも関する。
【背景技術】
【0004】
ＣＤ７３（エクト－５’－ヌクレオチダーゼ）は、７０ｋＤａのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質であり、通常、内皮細胞及び造血細胞のサブセットに発現する。ＣＤ７３は、ＣＤ３９と共にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の代謝を調節する。ＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ－１）は、ＡＴＰをＡＭＰに変換し、微量のＡＤＰのみが放出される一方、ＣＤ７３は、ＡＭＰからアデノシンへの変換を触媒する。
【0005】
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）並びにその代謝物であるＡＭＰ及びアデノシンは、細胞代謝、シグナル伝達及び免疫恒常性において重要な役割を有する。細胞死又は細胞ストレスに応答した細胞外アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の放出は、免疫応答を活性化するように作用する。しかし、その代謝物であるアデノシンは、免疫抑制作用を有する。細胞外アデノシンは、癌性組織に蓄積し、腫瘍の免疫回避の重要なメカニズムを構成する。他の効果の中でも、腫瘍由来のアデノシンは、アデニル酸シクラーゼを活性化するＡ２Ａ受容体を介して浸潤性エフェクターＴ細胞を大幅に阻害する。
【0006】
ＣＤ７３発現は、白血病、膀胱癌、神経膠腫、神経膠芽腫、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、甲状腺癌、食道癌及び乳癌を含む様々な腫瘍細胞で報告されている。ＣＤ７３発現は、黒色腫及び乳癌の転移促進性の表現型とも関連付けられている。マウスＣＤ７３に結合する抗体による治療は、マウスの乳房腫瘍の成長及び転移を阻害できることが報告されている（非特許文献１）。Ａ２Ａ受容体の遺伝子欠失は、Ｔ細胞依存性腫瘍拒絶反応を誘発できることが示されている（非特許文献２）。ｓｉＲＮＡを使用したノックダウン又は腫瘍細胞でのＣＤ７３の過剰発現は、腫瘍の成長と転移を調節することができる（非特許文献３；非特許文献１；非特許文献４）。ＣＤ７３－／－マウスは、移植及び自然発生の腫瘍から保護されている（非特許文献５）。ヒトでは、ＣＤ７３の高発現がトリプルネガティブ乳癌の予後不良であることが示されていた（非特許文献６）。しかし、ＣＤ７３は、腫瘍細胞で発現する一方、免疫系の異なる細胞、特にＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞並びにＢ細胞でも発現する。さらに、複雑な要因のさらなる１つは、文献に記載されている抗体の多くが一般にＦｃγ受容体に結合できるマウスアイソタイプであり、潜在的な遮断効果をＦｃ媒介性の効果から分離することを困難にしていることである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｓｔａｇｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４：１５４７－１５５２
【文献】Ｏｈｔａ，ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３：１３１３２－１３１３７
【文献】Ｂｅａｖｉｓ ｅｔ ａｌ（２０１３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０：１４７１１－７１６
【文献】Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０：２２４５－５５
【文献】Ｓｔａｇｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７１：２８９２－２９００
【文献】Ｌｏｉ ｅｔ ａｌ（２０１３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０：１１０９１－１１０９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
治療標的としてのＣＤ７３への長年にわたる関心にもかかわらず、ＣＤ７３の酵素活性の阻害においてより高い効力を有し、ヒトの治療における使用に適した抗体の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、腫瘍細胞を含む細胞の表面に発現されるＣＤ７３上に存在するエピトープに結合し、且つＣＤ７３酵素の酵素（エクト－５’ヌクレオチダーゼ）活性を阻害する抗体を提供する。抗体は、最小限の非ヒト（例えば、マウス）配列含有量を有するヒト由来のフレームワーク領域を有する。抗体は、二量体内モードでＣＤ７３に結合することができ、細胞の表面に発現する可溶性ＣＤ７３及び膜結合ＣＤ７３タンパク質の両方の酵素活性を阻害できる。有利には、これらの抗体は、純粋なＣＤ７３遮断抗体として使用することができ、例えばＦｃγ受容体に実質的に結合することなく、且つ／又はＡＤＣＣをＣＤ７３発現細胞に実質的に指向させることなく、細胞の表面で発現される膜結合ＣＤ７３タンパク質の酵素活性を阻害する。任意選択により、抗体は、Ｆｃドメインを保持し、ヒトＦｃＲｎへの結合を保持する。抗体は、免疫原性のリスクが低いことが有利であり、例えばヒトに投与した場合、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発する可能性が低いか又は低下している（マウス親抗体と比較して）。
【0010】
抗体は、腫瘍細胞を含むが、これに限定されない細胞の表面に発現されるヒトＣＤ７３ポリペプチド上に存在するエピトープに結合し、且つＣＤ７３酵素の酵素（エクト－５’ヌクレオチダーゼ）活性を阻害する。それらは、ＣＤ７３によって媒介されるＴ細胞増殖の抑制を阻害する特に有利な能力を有し、その結果、例えばＴ細胞増殖アッセイで観察されるように、増殖を含むが、これに限定されない、細胞傷害性ＣＤ４及び／又はＣＤ８Ｔ細胞の生物学的活性の増加を引き起こし得る。ある実施形態において、ＣＤ７３の酵素活性の阻害又は中和は、Ｔ細胞がＡＭＰ（例えば、外因的に追加されたＡＭＰ）の存在下において（例えば、ＴＣＲ共刺激を介して）インビトロで増殖するように誘導される場合、前記Ｔ細胞の増殖を増加させる抗体断片の抗体の能力を評価することによって決定される。
【0011】
ある実施形態において、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３３、３４、３５又は３６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体若しくは抗体断片又はその抗原結合ドメインが提供される。ある実施形態において、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体若しくは抗体断片又はその抗原結合ドメインが提供される。
【0012】
ある実施形態において、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４３、４４、４５又は４６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体若しくは抗体断片又はその抗原結合ドメインが提供される。ある実施形態において、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体若しくは抗体断片又はその抗原結合ドメインが提供される。
【0013】
ある実施形態において、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ＣＤ７３抗体又は抗体断片が提供される。
【0014】
ある実施形態において、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ＣＤ７３抗体又は抗体断片が提供される。
【0015】
ある実施形態において、配列番号２、３及び４に示されるそれぞれのアミノ酸配列と、ヒトＩＧＨＶ１－３遺伝子からのフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３アミノ酸配列（及び任意選択によりヒトＩＧＨＪ４遺伝子からのさらなるフレームワーク４（ＦＲ４）アミノ酸配列）とを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；並びに配列番号５、６及び７に示されるそれぞれのアミノ酸配列と、ヒトＩＧＫＶ１－３３遺伝子からのフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３アミノ酸配列（及び任意選択によりヒトＩＧＫＪ２遺伝子からのさらなるフレームワーク４（ＦＲ４）アミノ酸配列）とを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗ＣＤ７３抗原結合ドメイン又はそれを含むタンパク質（例えば、抗体又は抗体断片、多重特異性結合タンパク質、二重特異性抗体など）が提供される。任意選択により、Ｋａｂａｔ位置５９（ＨＣＤＲ２）の重鎖可変領域に存在する残基は、ロイシン又はグルタミン残基である。任意選択により、Ｋａｂａｔ位置６０（ＨＣＤＲ２）の重鎖可変領域に存在する残基は、スレオニン又はリシン残基である。任意選択により、Ｋａｂａｔ位置９７（ＨＣＤＲ３）の重鎖可変領域に存在する残基は、グリシン又はアスパラギン残基である。任意選択により、Ｋａｂａｔ位置３０（ＬＣＤＲ１）の軽鎖可変領域に存在する残基は、セリン又はスレオニン残基である。任意選択により、Ｋａｂａｔ位置５３（ＬＣＤＲ２）の軽鎖可変領域に存在する残基は、スレオニン又はアスパラギン残基である。
【0016】
ある実施形態において、配列番号２、８及び９に示されるそれぞれのアミノ酸配列と、ヒトＩＧＨＶ１－３遺伝子からのフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３アミノ酸配列（及び任意選択によりヒトＩＧＨＪ４遺伝子からのさらなるフレームワーク４（ＦＲ４）アミノ酸配列）とを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；並びに配列番号１０、１１及び７に示されるそれぞれのアミノ酸配列と、ヒトＩＧＫＶ１－３３遺伝子からのフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３アミノ酸配列（及び任意選択によりヒトＩＧＫＪ２遺伝子からのさらなるフレームワーク４（ＦＲ４）アミノ酸配列）とを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗ＣＤ７３抗原結合ドメイン又はそれを含むタンパク質（例えば、抗体又は抗体断片、多重特異性結合タンパク質、二重特異性抗体など）が提供される。ある実施形態において、ＶＨは、５９（ＨＣＤＲ２）、６０（ＨＣＤＲ２）及び９７（ＨＣＤＲ３）からなる群から選択されるＫａｂａｔ重鎖位置でのＫａｂａｔ重鎖ＣＤＲにおける１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換をさらに含む。任意選択により、５９位のロイシン残基は、グルタミン残基で置換される。任意選択により、６０位のスレオニン残基は、リシン残基で置換される。任意選択により、９７位のグリシン残基は、アスパラギン残基で置換される。ある実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ軽鎖位置３０（ＬＤＣＲ１）及び／又は５３（ＬＤＣＲ２）でのＫａｂａｔ軽鎖ＣＤＲにおけるアミノ酸置換をさらに含み、任意選択によりさらに３０位のセリン残基がスレオニン残基で置換され、任意選択によりさらに５３位のスレオニン残基がアスパラギン残基で置換される。
【0017】
ある実施形態において、配列番号２、１２及び１３に示されるそれぞれのアミノ酸配列と、ヒトＩＧＨＶ１－３遺伝子からのフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３アミノ酸配列（及び任意選択によりヒトＩＧＨＪ４遺伝子からのさらなるフレームワーク４（ＦＲ４）アミノ酸配列）とを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；並びに配列番号１４、１５及び７に示されるそれぞれのアミノ酸配列と、ヒトＩＧＫＶ１－３３遺伝子からのフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３アミノ酸配列（及び任意選択によりヒトＩＧＫＪ２遺伝子からのさらなるフレームワーク４（ＦＲ４）アミノ酸配列）とを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗ＣＤ７３抗原結合ドメイン又はそれを含むタンパク質（例えば、抗体又は抗体断片、多重特異性結合タンパク質、二重特異性抗体など）が提供される。
【0018】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、重鎖可変領域（ＶＨ）は、２、３０、４８、６９及び７３からなる群から選択されるＫａｂａｔ重鎖位置に１、２、３、４又は５つのアミノ酸置換を含むことによって特徴付けられ得、任意選択により、特定の位置でヒト配列に存在する残基は、その特定の位置でマウスドナー配列に存在する残基で置換され；軽鎖可変領域（ＶＬ）は、Ｋａｂａｔ軽鎖位置６７にアミノ酸置換を含むことによって特徴付けられ得、任意選択により、特定の位置でヒト配列に存在する残基は、その特定の位置でマウスドナー配列に存在する残基で置換される。ある実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ軽鎖位置６７での置換及び任意選択により２、６７及び８７からなる群から選択されるＫａｂａｔ軽鎖位置でのさらに１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換を含み、任意選択により、特定の位置でヒト配列に存在する残基は、その特定の位置でマウスドナー配列に存在する残基で置換される。ある実施形態において、抗体又は抗体結合ドメインは、アミノ酸置換Ｖ２Ｉ、Ｔ３０Ａ、Ｍ４８Ｉ、Ｉ６９Ｌ及びＴ７３Ｋを含む重鎖可変領域並びにアミノ酸置換Ｓ６７Ｙを含む軽鎖可変領域を含み、ここで、付番は、Ｋａｂａｔによる。
【0019】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ重鎖位置２のアミノ酸は、イソロイシンである。
【0020】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ重鎖位置３０のアミノ酸は、アラニンである。
【0021】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ重鎖位置４８のアミノ酸は、イソロイシンである。
【0022】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ重鎖位置６９のアミノ酸は、ロイシンである。
【0023】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ重鎖位置７３のアミノ酸は、リシンである。
【0024】
ある実施形態において、ＶＨは、Ｋａｂａｔ位置２にイソロイシン残基を、位置３０にアラニンを、位置４８にイソロイシンを、位置６９にロイシンを、且つ位置７３にリシンを含む。
【0025】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ軽鎖位置６７のアミノ酸は、チロシンである。
【0026】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ軽鎖位置６０のアミノ酸は、アスパラギン酸である。
【0027】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ軽鎖位置２のアミノ酸は、イソロイシンである。
【0028】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ軽鎖位置８７のアミノ酸は、フェニルアラニンである。
【0029】
ある実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置６７にチロシン残基を含み、任意選択により、ＶＬは、非ヒト残基によるＫａｂａｔフレームワーク内の他の置換を含まず、且つ／又は残基６７での置換以外には完全なヒトのＶＬ Ｋａｂａｔフレームワークを有する。
【0030】
ある実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置６７にチロシン残基を、且つ位置６０にアスパラギン酸を含む。
【0031】
ある実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置６７にチロシン残基を、位置６０にアスパラギン酸を、且つ位置２にイソロイシンを含む。
【0032】
ある実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置６７にチロシン残基を、位置６０にアスパラギン酸を、位置２にイソロイシンを、且つ位置８７にフェニルアラニンを含む。
【0033】
ある実施形態において、配列番号３７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３３、３４、３５又は３６のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む抗ＣＤ７３抗原結合ドメイン又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質（例えば、抗体又は抗体断片、多重特異性結合タンパク質、二重特異性抗体など）が提供される。ある実施形態において、ＶＨは、配列番号２、１２及び１３に示されるそれぞれのアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、及びＶＬは、配列番号１４、１５及び７に示されるそれぞれのアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。ある実施形態において、ＶＨは、Ｋａｂａｔ位置２にイソロイシン残基を、位置３０にアラニンを、位置４８にイソロイシンを、位置６９にロイシンを、且つ位置７３にリシンを含む。ある実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置６７にチロシン残基を含む。
【0034】
ある実施形態において、配列番号２、３及び４に示されるそれぞれのアミノ酸配列と、ヒトフレームワーク（例えば、ヒト由来のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）とを有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；並びに配列番号５、６及び７に示されるそれぞれのアミノ酸配列と、ヒトフレームワーク（例えば、ヒト由来のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗ＣＤ７３抗原結合ドメイン又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質（例えば、抗体又は抗体断片、多重特異性結合タンパク質、二重特異性抗体など）が提供され、ここで、（ＶＨ）は、配列番号３７又は４２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号３３～３６又は４３～４６）のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。任意選択により、Ｋａｂａｔ位置５９（ＨＣＤＲ２）の重鎖可変領域に存在する残基は、ロイシン又はグルタミン残基である。任意選択により、Ｋａｂａｔ位置６０（ＨＣＤＲ２）の重鎖可変領域に存在する残基は、スレオニン又はリシン残基である。任意選択により、Ｋａｂａｔ位置９７（ＨＣＤＲ３）の重鎖可変領域に存在する残基は、グリシン又はアスパラギン残基である。任意選択により、Ｋａｂａｔ位置３０（ＬＣＤＲ１）の軽鎖可変領域に存在する残基は、セリン又はスレオニン残基である。任意選択により、Ｋａｂａｔ位置５３（ＬＣＤＲ２）の軽鎖可変領域に存在する残基は、スレオニン又はアスパラギン残基である。ある実施形態において、ＶＨは、Ｋａｂａｔ位置２にイソロイシン残基を、位置３０にアラニンを、位置４８にイソロイシンを、位置６９にロイシンを、且つ位置７３にリシンを含む。ある実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置６７にチロシン残基を含む。
【0035】
任意の実施形態において、ＶＨは、ヒトＶＨアクセプターフレームワークアミノ酸配列を含むものとして特徴付けられ得、ＶＬは、ヒトＶＬアクセプターフレームワークアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ＶＨヒトアクセプターフレームワークのＶＨセグメントは、ヒトＩＧＨＶ１－３遺伝子セグメントからのものであり、Ｊセグメントは、ヒトＩＧＨＪ４遺伝子セグメントからのものである。ある実施形態において、ＶＨヒトアクセプターフレームワークは、ヒトＩＧＨＶ１－３＊０１遺伝子セグメントからのものである。ある実施形態において、ＶＬドメインヒトアクセプターフレームワークは、ヒトＩＧＫＶ１－３３遺伝子セグメントからのものであり、任意選択により、ＶＬドメインヒトアクセプターフレームワークは、ヒトＩＧＫＶ１－３３＊０１遺伝子セグメントからのものである。ある実施形態において、ＶＬドメインヒトアクセプターフレームワークは、ヒトＩＧＫＪ２遺伝子セグメントからのＪセグメントを含む。
【0036】
ある実施形態において、抗体又は抗体断片は、Ｈ４＋ＶＨドメイン及びＬ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４ ＶＬドメインを含む。ある実施形態において、抗体は、抗体Ｈ４＋Ｌ１である。
【0037】
ある実施形態において、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３３、３４、３５又は３６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗ＣＤ７３抗原結合ドメイン又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質（例えば、抗体又は抗体断片、多重特異性結合タンパク質、二重特異性抗体など）が提供される。
【0038】
ある実施形態において、ヒトＣＤ７３に結合し、且つＣＤ７３のＡＴＰａｓｅ活性を中和する抗体又は抗体断片が提供され、ここで、抗体又は抗体断片は、抗体Ｈ４＋Ｌ１の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
【0039】
ある実施形態において、ヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、且つＣＤ７３のＡＴＰａｓｅ活性を中和する抗体又は抗体断片が提供され、ここで、抗体又は抗体断片は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0040】
ある実施形態において、ヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、且つＣＤ７３のＡＴＰａｓｅ活性を中和する抗体又は抗体断片が提供され、ここで、抗体又は抗体断片は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【0041】
ある実施形態において、抗体又は抗体断片は、２Ｈ４＋ＶＨドメイン及び２Ｌ１、２Ｌ２、２Ｌ３又は２Ｌ４ ＶＬドメインを含む。ある実施形態において、抗体は、抗体２Ｈ４＋２Ｌ１である。
【0042】
ある実施形態において、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４３、４４、４５又は４６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗ＣＤ７３抗原結合ドメイン又はその抗原結合ドメインを含むタンパク質（例えば、抗体又は抗体断片、多重特異性結合タンパク質、二重特異性抗体など）が提供される。
【0043】
ある実施形態において、ヒトＣＤ７３に結合し、且つＣＤ７３のＡＴＰａｓｅ活性を中和する抗体又は抗体断片が提供され、ここで、抗体又は抗体断片は、抗体２Ｈ４＋２Ｌ１の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
【0044】
ある実施形態において、ヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、且つＣＤ７３のＡＴＰａｓｅ活性を中和する抗体又は抗体断片が提供され、ここで、抗体又は抗体断片は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0045】
ある実施形態において、ヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、且つＣＤ７３のＡＴＰａｓｅ活性を中和する抗体又は抗体断片が提供され、ここで、抗体又は抗体断片は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【0046】
ある実施形態において、抗体は、非枯渇性であり、腫瘍環境におけるＣＤ７３の酵素活性を中和する。
【0047】
ある実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプ抗体である。例えば、抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む抗体又はＦｃドメインとヒトＦｃγ受容体との間の結合を低下又は欠失させるように修飾され（例えば、ＣＤ１６）、任意選択によりＦｃドメインと複数のヒトＦｃγ受容体、例えばＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ６４）との間の結合を低下させるように修飾された任意のヒトＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のＦｃドメインを含む抗体であり得る。ある実施形態において、抗体は、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ６４のそれぞれに対する結合の（野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗体と比較した）減少又は実質的に完全な喪失をもたらすアミノ酸修飾を含むヒトＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１）のＦｃドメインを含む。
【0048】
任意の実施形態において、抗体重鎖は、任意選択により、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのヒトＣＨ１定常ドメイン及び修飾ヒトＦｃドメインを含み、任意選択により配列番号１６、１７、１８又は１９のいずれか１つのアミノ酸配列をさらに含む。任意の実施形態において、抗体軽鎖は、ヒト軽鎖定常ドメインを含み、任意選択により、定常ドメインは、ヒトカッパドメインである。
【0049】
ある態様において、本開示の抗体は、細胞表面に発現されたＣＤ７３ポリペプチドの細胞内内在化又はより一般的にはダウンモジュレーションを誘導しないか又は増加させず、且つ／又はそれらのＣＤ７３阻害活性に依存しない。本開示の抗体は、ＣＤ７３の内在化を引き起こすことによってＣＤ７３を阻害する抗体よりも大きい阻害効力（ＣＤ７３酵素活性を実質的に中和する能力）を提供することができる。他のメカニズムによって可溶性ＣＤ７３を阻害する（例えば、ＣＤ７３抗体オリゴマー形成を引き起こす）抗体とは対照的に、本開示の抗体は、高（例えば、１０倍）過剰の抗体：酵素でＣＤ７３の酵素活性を阻害することができる。さらに、細胞表面ＣＤ７３で修飾されているか又は存在しない可能性のある組換えＣＤ７３上のエピトープに結合する抗体（例えば、抗体７Ｇ２）と異なり、又はＣＤ７３発現細胞での有効性に変換するには低すぎる親和性により、本抗体は、細胞表面ＣＤ７３に存在し、且つ／又は無傷のままであるエピトープに高い親和性で結合し、細胞性ＣＤ７３の酵素活性を強力に中和する能力を抗体に提供する。本抗体は、細胞内のＣＤ７３酵素活性を阻害するが、任意選択により可溶性組換えＣＤ７３のエクト－５’ヌクレオチダーゼ活性を阻害することもできる（可溶性二量体ＣＤ７３ポリペプチドを使用した無細胞アッセイで観察される）。
【0050】
ある態様において、本開示の抗体は、ＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性部位に結合することなくヒトＣＤ７３ポリペプチドの活性を阻害することができ、且つ／又はＣＤ７３の非競合的阻害剤であり、例えば、それらは、ＣＤ７３ポリペプチドとその天然基質との間の結合を検出可能に低下させることなく、ヒトＣＤ７３ポリペプチドの活性を阻害する。
【0051】
ある態様において、本開示の抗体は、残基Ｋ１３６に置換を有するＣＤ７３変異体への結合を失う。ある態様において、本開示の抗体は、残基Ｋ１３６に置換を有するＣＤ７３変異体への結合が減少しており（配列番号１の配列に関して；且つ配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ７３と比較して）；任意選択により、抗体は、残基Ａ９９、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４及びＡ１３５に置換を有するＣＤ７３変異体への結合も減少しており（配列番号１の配列に関して；且つ配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ７３と比較して；任意選択によりさらに、抗体は、残基Ｋ９７、Ｅ１２５、Ｑ１５３及びＫ３３０に置換を有するＣＤ７３変異体への結合が減少している（配列番号１の配列に関して；且つ配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ７３と比較して。
【0052】
ある実施形態において、抗体は、ＣＤ７３二量体内の各ＣＤ７３ポリペプチド鎖上のエピトープに結合し（すなわち二量体内様式でＣＤ７３に結合する）、任意選択によりさらに、エピトープは、ＣＤ７３二量体の同じ面に存在する。したがって、抗体は、とりわけ、抗体結合部位が「開いた」位置よりも空間的に離れている、より「閉じた」位置において１つのＣＤ７３二量体に二価で結合することができる。リガンド結合ＣＤ７３への結合を考慮すると、本明細書に記載の抗体は、例えば、上流のＡＤＰ及び／又はＡＭＰが処置前に有意なレベルで存在する）腫瘍環境によって特徴付けられる（例えば、それによって特徴付けられることが知られているか又は疑われる）個体又は癌を処置するために、ＡＭＰに結合したときにＣＤ７３に結合するのに有用であり得る。抗体は、高レベルのＡＤＰ（例えば、死滅する細胞によって生成され、間質及び細胞浸潤（例えば、ＴＲｅｇ細胞）上のＣＤ７３によって取り込まれて、高レベルのＡＭＰを得る）及びより一般的にはＡＭＰ、アデノシン、ＣＤ７３発現又はＣＤ７３発現細胞の存在又はレベル、高いＣＤ７３発現細胞の数又は頻度（例えば、健常組織と比較して）及び／又は細胞での高いＣＤ７３発現のレベル（例えば、免疫組織化学アッセイによって評価される）、（例えば、健常組織と比較して）高可溶性ＣＤ７３ポリペプチド（例えば、ＥＬＩＳＡ又は一般的に任意の抗体ベースの検出アッセイによって評価される）又はアデノシン受容体発現又はアデノシン受容体発現細胞の存在又はレベルによって特徴付けられる腫瘍環境を有する（例えば、それを有することが知られているか又は疑われる）個体又は癌を処置するために有用であり得る。腫瘍環境におけるＣＤ７３分子は、基質結合立体構造であり得、非基質結合ＣＤ７３に加えて、基質結合細胞ＣＤ７３（例えば、ＡＭＰなどの基質とプレインキュベートされたＣＤ７３を発現する細胞）に結合し、阻害する能力は、インビボでＣＤ７３を阻害するより大きい能力を提供し得る。任意選択により、可溶性ＣＤ７３タンパク質、ＣＤ７３発現細胞の数若しくは頻度及び／又は細胞上のＣＤ７３発現のレベルを処置前に腫瘍環境で評価することができる。抗体は、腫瘍試料において、有意なレベル（例えば、参照と比較して高レベル）の可溶性ＣＤ７３タンパク質、ＣＤ７３発現細胞の数若しくは頻度及び／又は細胞におけるＣＤ７３発現のレベルを有する個体の処置に特定の利点を有し得る。
【0053】
したがって、ある態様において、本開示は、細胞の表面で発現されるヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、且つＣＤ７３ポリペプチドの酵素（エクト－５’ヌクレオチダーゼ）活性を阻害するヒト化抗体又は抗体断片を提供し、ここで、抗体は、単一のＣＤ７３ポリペプチド二量体（可溶性ＣＤ７３ポリペプチド二量体又は細胞によって発現されるＣＤ７３ポリペプチド二量体）に二価で結合することができる。任意選択により、抗体は、第１の抗原結合ドメインで二量体内の第１のＣＤ７３ポリペプチドに、且つ第２の抗原結合ドメインで第２のＣＤ７３ポリペプチドに結合する。ある態様において、抗体は、ＣＤ７３ポリペプチドのアロステリック阻害剤である。
【0054】
抗体が結合するＣＤ７３上のエピトープは、様々な細胞（例えば、癌細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞、遺伝子導入された細胞）によって発現されるＣＤ７３ポリペプチド上に存在し、フローサイトメトリーによって決定される高い親和性で結合する。例えば、抗体は、ＣＤ７３ポリペプチドを表面に発現する細胞への結合について、５μｇ／ｍｌ以下、任意選択により２μｇ／ｍｌ以下、１μｇ／ｍｌ以下、０．５μｇ／ｍｌ以下、０．１μｇ／ｍｌ以下又は０．０５μｇ／ｍｌ以下の、フローサイトメトリーによって決定されるＥＣ５０によって特徴付けられ得る。ある実施形態において、細胞は、それらの表面でＣＤ７３を発現するように作製された細胞である。ある実施形態において、細胞は、それらの表面で内因的にＣＤ７３を発現する細胞であり、例えば癌細胞、白血病細胞、膀胱癌細胞、神経膠腫細胞、神経膠芽腫細胞、卵巣癌細胞、黒色腫細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、食道癌細胞又は乳癌細胞である。
【0055】
ある実施形態において、ＣＤ７３中和抗体は、ＣＤ７３の細胞の５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を少なくとも６０％、７５％又は８０％減少させることができることによって特徴付けられ得る。ある実施形態において、ＣＤ７３中和抗体は、１μｇ／ｍｌ以下、任意選択により０．５μｇ／ｍｌ以下、任意選択により０．２μｇ／ｍｌ以下の細胞によって発現されるＣＤ７３の５’－エクトヌクレオチダーゼ活性の阻害についてのＥＣ５０によって特徴付けられ得る。
【0056】
任意選択により、細胞によって発現されるＣＤ７３の５’－エクトヌクレオチダーゼ活性の阻害は、ＡＭＰのアデノシンへの加水分解を定量化することにより、ＣＤ７３発現細胞（例えば、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞）における５’エクトヌクレオチダーゼ活性の中和を評価することによって決定される。
【0057】
任意選択により、細胞によって発現されるＣＤ７３の５’－エクトヌクレオチダーゼ活性の阻害は、Ｔ細胞（例えば、健常ヒトドナーからのもの）がＡＭＰ（例えば、外因的に追加されたＡＭＰ）の存在下において、（例えば、ＴＣＲ共刺激、ＣＤ３及びＣＤ２８シグナル伝達の刺激を介して、例えばＴ細胞を、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストで機能化されたビーズと接触させることによって）インビトロで増殖するように誘導される場合、前記Ｔ細胞の増殖を増加させる抗体断片の抗体の能力を評価することによって決定される。任意選択により、Ｔ細胞増殖は、本明細書の実施例に記載されているアッセイを使用して評価される（実施例５及び方法を参照されたい）。
【0058】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、可溶性ＣＤ７３及び細胞表面で発現されるＣＤ７３の両方に存在する共通の抗原決定基に結合する。
【0059】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、抗原決定基がＣＤ７３二量体の共通の面に存在する、ＣＤ７３二量体内の各ＣＤ７３ポリペプチド鎖内の抗原決定基に結合する（二量体内モードにおいて）。
【0060】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、残基Ｋ１３６（配列番号１に関して）を含むＣＤ７３上のエピトープに結合する。
【0061】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ｋ９７、Ｅ１２５、Ｑ１５３及びＫ３３０（配列番号１に関して）からなる群から選択される１、２、３又は４つの残基を含むＣＤ７３上のエピトープに結合する。
【0062】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ａ９９、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４及びＡ１３５（配列番号１に関して）からなる群から選択される１、２、３、４又は５つの残基を含むＣＤ７３上のエピトープに結合する。
【0063】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＣＤ７３タンパク質（例えば、ＣＤ７３ホモ二量体タンパク質）上の、アミノ酸残基Ｋ９７、Ａ９９、Ｅ１２５、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４、Ａ１３５、Ｋ１３６、Ｑ１５３及びＫ３３０（配列番号１に関して）を含むアミノ酸残基のドメイン又はセグメント内で少なくとも部分的に結合する。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ｋ９７、Ａ９９、Ｅ１２５、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４、Ａ１３５、Ｋ１３６、Ｑ１５３及びＫ３３０（配列番号１に関して）からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４若しくは５つ又はそれを超える数の残基を含むＣＤ７３上のエピトープに結合する。
【0064】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ７３ポリペプチドと比較して、残基Ｋ１３６に突然変異を有するＣＤ７３ポリペプチドへの減少した結合を有し（配列番号１に関して）、任意選択により、突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドは、変異Ｋ１３６Ａを有する。
【0065】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ７３ポリペプチドと比較して、Ｋ９７、Ｅ１２５、Ｑ１５３及びＫ３３０からなる群から選択される残基に突然変異を有するＣＤ７３ポリペプチドへの減少した結合を有し（配列番号１に関して）、任意選択により、突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドは、変異Ｋ９７Ａ、Ｅ１２５Ａ、Ｑ１５３Ａ及び／又はＫ３３０Ａ（例えば、Ｋ９７Ａ、Ｅ１２５Ａ及びＫ３３０Ａ；Ｋ９７Ａ、Ｅ１２５Ａ及び／又はＱ１５３Ａ）を有する。
【0066】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ７３ポリペプチドと比較して、Ａ９９、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４及びＡ１３５からなる群から選択される残基に突然変異を有するＣＤ７３ポリペプチドへの減少した結合を有し（配列番号１に関して）、任意選択により、突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドは、突然変異Ａ９９Ｓ、Ｅ１２９Ａ、Ｋ１３３Ａ、Ｅ１３４Ｎ及びＡ１３５Ｓを有する。
【0067】
ある実施形態において、疾患、例えば感染症又は癌の処置又は予防において抗体を使用する方法が提供される。ある態様において、抗体は、腫瘍微小環境におけるＣＤ７３の活性を中和するのに十分な量及び頻度において、癌を有する個体に投与される。ある実施形態において、抗体は、腫瘍微小環境におけるアデノシンの生成及び／又は濃度を減少させるのに十分な量及び頻度で投与される。ある実施形態において、抗体は、腫瘍微小環境におけるＡＴＰの生成及び／又は濃度を増加させるのに十分な量及び頻度で投与される。ある実施形態において、抗体は、腫瘍細胞によって発現されるＣＤ７３の活性を中和するのに十分な量及び頻度で投与される。ある実施形態において、抗体は、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞及び／又はＢ細胞によって発現されるＣＤ７３の活性を中和するのに十分な量及び頻度で投与される。
【0068】
抗体は、ＡＭＰのアデノシンへのＣＤ７３媒介性異化を阻害する、例えば腫瘍微小環境におけるアデノシンの濃度を低下させるのに有用である。したがって、これらの抗体は、例えば、癌の処置において、アデノシン受容体を発現するＴ細胞、Ｂ細胞及び他の細胞に対するＣＤ７３及び／又はアデノシンの免疫抑制効果を逆転させるのに有用である。ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、Ｔ細胞における増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性及び／又はＮＦκＢ活性のアデノシン媒介性阻害を中和する。
【0069】
ＡＭＰのアデノシンへのＣＤ７３媒介性異化は、不可逆的であるのに対して、ＣＤ７３によるＡＴＰからＡＤＰへの異化及びＡＤＰからＡＭＰへの異化は、可逆的であるため（それぞれＮＤＫキナーゼ及びアデニル酸キナーゼによる）、不可逆的なＣＤ７３媒介性異化を遮断する抗体は、ＡＭＰのプールを増やし、それにより例えば腫瘍微小環境でＡＤＰ及びＡＴＰの濃度を上げるのに役立つ。抗体は、ＡＭＰからのＡＤＰの形成及びＡＤＰからのＡＴＰの形成を増加させるのに有用であり得る。ＡＴＰは、免疫活性化の役割を有するため、抗ＣＤ７３抗体は、Ｔ細胞の活性化、例えば癌の処置に役立ち得る。
【0070】
抗体は、腫瘍微小環境へのアデノシンの産生、量及び／又は濃度を阻害するのに有用であろう。
【0071】
可溶性ヒトＣＤ７３ポリペプチド二量体の活性を中和する抗体は、他の適切な状況（例えば、ＣＤ７３を発現するように作製されたレポーター細胞において、Ｔ細胞においてなど）でＣＤ７３をさらに中和することができる。
【0072】
個体を処置するための方法が提供され、この方法は、本明細書に記載の抗ＣＤ７３抗原結合化合物のいずれかの治療活性量を個体（例えば、疾患、腫瘍などを有する個体）に投与することを含む。ある態様において、個体を処置するための方法が提供され、この方法は、本開示の抗原結合化合物の治療活性量を個体（例えば、疾患、腫瘍などを有する個体）に投与することを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。
【0073】
ある態様において、ＣＤ７３発現細胞（例えば、個体の免疫細胞及び／又は腫瘍細胞）によって産生されるアデノシンを減少させる方法又は細胞性ＣＤ７３の酵素活性を中和する方法が提供され、方法は、ＣＤ７３発現細胞を本開示の抗原結合化合物（例えば、抗ＣＤ７３抗体若しくは抗体断片又はそれを含む組成物）と接触させることを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。ある実施形態において、ＣＤ７３発現細胞を本開示の抗原結合化合物と接触させるステップは、治療活性量の抗原結合化合物を個体に投与することを含む。ある実施形態において、個体は、癌を有する。
【0074】
ある態様において、腫瘍環境（例えば、個体）に存在するアデノシンを減少させるための方法が提供され、方法は、治療活性量の本開示の化合物（例えば、抗ＣＤ７３抗体若しくは抗体断片又はそれを含む組成物）を個体に投与することを含むか、それから本質的になるか又はそれからなる。ある実施形態において、個体は、癌を有する。任意選択により、個体は、癌を有するか又は癌になりやすいヒトである。
【0075】
抗体は、任意選択により、ＳＰＲ（例えば、実施例の方法による）によって決定される、ヒトＣＤ７３ポリペプチド（例えば、ＣＤ７３二量体として）に対する１０－９Ｍ未満（それより良好な）、好ましくは１０－１０Ｍ未満又は好ましくは１０－１１Ｍ未満の結合親和性（ＫＤ）及び／又はヒトＣＤ７３ポリペプチドを１μｇ／ｍｌ未満（それより良好な結合）のＥＣ５０で結合することによって特徴付けられる。任意選択により、結合親和性を二価として指定することができる。
【0076】
ある実施形態において、抗体は、細胞表面でヒトＣＤ７３を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞）への結合について、０．５μｇ／ｍｌ以下、任意選択により０．２μｇ／ｍｌ以下、任意選択により０．１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０を有する。
【0077】
抗体は、任意選択により、ＣＤ７３発現細胞（例えば、腫瘍細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞）におけるＣＤ７３の酵素活性の中和について、１μｇ／ｍｌ未満（それより良好な）、任意選択により０．５μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０によって特徴付けられる。
【0078】
ある実施形態において、抗体は、結合特異性及びＣＤ７３の酵素活性を中和する能力（例えば、Ｔ細胞がＡＭＰ（例えば、外因的に追加されたＡＭＰの存在下においてインビトロで増殖するように誘導される場合、前記Ｔ細胞の増殖を増加させる抗体又は抗体断片の能力を評価することによって決定される）を保持するモノクローナル抗体又はその断片である。ある実施形態において、抗体は、ＣＤ７３の酵素活性を中和することにおいて、配列番号４０及び４１のそれぞれのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する親抗体と実質的に同程度に強力であるか又は少なくとも同程度に強力であり、任意選択により、抗体は、ＣＤ７３の酵素活性を中和することにおいて、親抗体のＥＣ５０の１ｌｏｇ、０．５ｌｏｇ以内であるＥＣ５０を有する。ある実施形態において、抗体は、ＣＤ７３の酵素活性を中和することにおいて、配列番号４０及び４１のそれぞれのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する親抗体よりも強力であり、任意選択により、抗体は、ＣＤ７３の酵素活性を中和することにおいて、配列番号４０及び４１のそれぞれのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する親抗体よりも低いＥＣ５０を有する。
【0079】
ある実施形態において、抗体は、ＣＤ７３の酵素活性を中和することにおいて、配列番号２７及び２８のそれぞれのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する親抗体と実質的に同程度に強力であるか又は少なくとも同程度に強力であり、任意選択により、抗体は、ＣＤ７３の酵素活性を中和することにおいて、親抗体のＥＣ５０の１ｌｏｇ又は０．５ｌｏｇ以内であるＥＣ５０を有する。ある実施形態において、抗体は、ＣＤ７３の酵素活性を中和することにおいて、配列番号２７及び２８のそれぞれのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する親抗体よりも強力であり、任意選択により、抗体は、ＣＤ７３の酵素活性を中和することにおいて、配列番号２７及び２８のそれぞれのＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する親抗体よりも低いＥＣ５０を有する。
【0080】
本開示の抗体（又はその重鎖若しくは軽鎖）或いはＶＨ及び／又はＶＬドメインをコードする単離及び／又は組換え核酸（例えば、核酸のセット）、そのような核酸を含むベクター又はベクターのセット、そのようなベクターを含む細胞及び抗ＣＤ７３抗体又は抗体断片の発現に適した条件下でそのような細胞を培養することを含む、ヒト抗ＣＤ７３抗体又は抗体断片を産生する方法も提供される。本開示は、このようなタンパク質、核酸、ベクター及び／又は細胞並びに典型的には活性成分又は本組成物の処方、送達、安定性若しくは他の特徴を促進する不活性成分であり得る１つ以上のさらなる成分（例えば様々な担体）を含む組成物、例えば薬学的に許容可能な組成物及びキットにも関する。本開示は、ＣＤ７３介在性生物学的活性の調整などにおいて、例えばそれに関連する疾患、特に癌の処置において、このような抗体、核酸、ベクター、細胞、生物及び／又は組成物を作製及び使用する、様々な新規の及び有用な方法にさらに関する。
【0081】
本開示は、ＣＤ７３に結合し、且つその酵素活性を中和する抗体又は抗体断片を産生又は試験する方法も提供する。
【0082】
本開示は、リンパ球（例えば、Ｔ細胞）の活性を、それを必要とする対象において増強する方法、又はリンパ球（例えば、Ｔ細胞）の活性を回復するための方法、又はリンパ球活性（例えば、Ｔ細胞）のアデノシン媒介性阻害を軽減する方法も提供し、この方法は、対象に前述の組成物のいずれかの有効量を投与することを含む。ある実施形態において、対象は、癌に罹患している患者である。例えば、患者は、固形腫瘍、例えば結直腸癌、腎臓癌、卵巣癌、肺癌、乳癌又は悪性黒色腫の罹患者であり得る。代わりに、患者は、造血系の癌、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫又は非ホジキンリンパ腫の罹患者であり得る。
【0083】
これらの態様がより詳細に記載され、本明細書中で提供される説明からさらなる態様、特性及び長所が明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0084】
【図1A-1B】ヒト（図１Ａ）又はカニクイザル（図１Ｂ）ＣＤ７３タンパク質を発現する遺伝子導入された細胞株で試験した、Ｈ０、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４重鎖可変領域を有し、それぞれＬ０、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４軽鎖可変領域と組み合わされたヒト化変異体及び親マウス抗体ＨＰＬＰで得られた滴定曲線を示す。
【図2】可溶性組換えＣＤ７３の酵素活性の遮断を示す。左上のパネル（Ａ）は、ＡＴＰ及びＣＴＧ基質を混合すると、高レベルの発光が測定されたことを示す。ＡＭＰを反応ミックスに添加すると、ＣＴＧ反応が阻害され、発光が減少した。ＡＭＰを加水分解するｒｈＣＤ７３タンパク質の存在下で発光レベルが回復した。異なるヒト化変異体によるＣＤ７３酵素活性の遮断が示されている。
【図3A-4C】Ｔ細胞増殖のＡＭＰ媒介性阻害を逆転させる効力においてヒト化抗体を比較するための２つの一連の実験を示す。図３Ａ及び４Ａは、一連の実験ごとにＴ細胞増殖の制御及びＡＭＰによるその阻害を示す。図３Ｂ及び４Ｂは、ＣＤ４＋を回復するための抗ＣＤ７３抗体の有効性を示し、図３Ｃ及び４Ｃは、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を回復するための抗ＣＤ７３抗体の有効性を示す。細胞増殖は、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔマーカーの希釈によって決定される。データは、重複の平均＋／－標準偏差として表される。
【図5A-5C】Ｔ細胞増殖が全ての抗ＣＤ７３抗体によって回復することを示す。図５Ａは、Ｔ細胞亜集団の増殖の制御及びＡＭＰによるその阻害を示す。図５Ｂは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を回復するためのＨ４＋Ｌｘ抗体及び親抗体ＨＰＬＰの有効性を示す。図５Ｃは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を回復するための２Ｈ４＋２Ｌｘ抗体（２Ｌ１、２Ｌ２、２Ｌ３又は２Ｌ４鎖と組み合わせた２Ｈ４＋鎖）及び親抗体２ＨＰ２ＬＰの有効性を示す。データは、重複の平均＋／－標準偏差として表される。
【図6A-6B】ヒト化変異体によって回復されたＴ細胞増殖が、それぞれ２人の代表的なヒトドナーで再現可能であることを示す。ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の増殖を回復するための２Ｈ４＋２Ｌｘ抗ＣＤ７３抗体変異体の有効性が示されている。データは、重複の平均＋／－標準偏差として表される。
【発明を実施するための形態】
【0085】
定義
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。請求項で使用される場合、「含む」という語と組み合わせて使用されるとき、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は、１つ又は２つ以上を意味し得る。本明細書中で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２又はそれを超えるものを意味し得る。
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。請求項で使用される場合、「含む」という語と組み合わせて使用されるとき、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は、１つ又は２つ以上を意味し得る。本明細書中で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２又はそれを超えるものを意味し得る。
【0086】
「含む」が使用される場合、これは、任意選択により、「から基本的になる」又は「からなる」により置き換えられ得る。
【0087】
エクト－５’－ヌクレオチダーゼ及び５－プライムリボヌクレオチドホスホヒドロラーゼとしても知られるヒトＣＤ７３、ＥＣ３．１．３．５は、ＮＴ５Ｅ遺伝子によってコードされ、５’－ヌクレオチダーゼ、とりわけＡＭＰ－、ＮＡＤ－及びＮＭＮ－ヌクレオチダーゼ活性を示す。ＣＤ７３は、プリン５－プライムモノヌクレオチドの中性ｐＨでのヌクレオシドへの変換を触媒し、好ましい基質は、ＡＭＰである。酵素は、原形質膜の外面にグリコシルホスファチジルイノシトール結合によって結合された２つの同一の７０ｋＤサブユニットの二量体からなる。アミノ酸１～２６にシグナル配列を含むヒトＣＤ７３プレタンパク質（モノマー）のアミノ酸配列は、以下のようにＧｅｎｂａｎｋにおいて受託番号ＮＰ＿００２５１７で示され、この開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【化1】
【0088】
本明細書に関連して、「ＣＤ７３の酵素活性を中和する」とは、ＣＤ７３の５’－ヌクレオチダーゼ（５’－エクトヌクレオチダーゼ）活性が阻害されるプロセスを指す。これは、とりわけ、ＣＤ７３を介したアデノシンの生成の阻害、すなわちＣＤ７３を介したＡＭＰのアデノシンへの異化の阻害を含む。これは、例えば、直接又は間接的に、ＡＭＰのアデノシンへの変換を阻害する試験化合物の能力を測定する無細胞アッセイで測定することができる。ある実施形態において、抗体調製物は、例えば、本明細書に記載のアッセイを参照して、ＡＭＰからアデノシンへの変換の少なくとも５０％の減少、ＡＭＰからアデノシンへの変換の少なくとも７０％の減少又はＡＭＰからアデノシンへの変換の少なくとも８０％の減少を引き起こす。
【0089】
本明細書全体において、「癌の処置」などが抗ＣＤ７３結合物質（例えば、抗体）に関して言及される場合には常に、（ａ）癌の処置の方法であって、このような治療を必要とする個体、哺乳動物、特にヒトに、癌の処置を可能にする用量で（治療的有効量）、好ましくは本明細書中で指定されるような用量（量）で（好ましくは薬学的に許容可能な担体物質中で）抗ＣＤ７３結合物質を投与する（少なくとも１回の処置）ステップを含む方法；（ｂ）（特にヒトにおける）癌の処置のための抗ＣＤ７３結合物質の使用又はその処置における使用のための抗ＣＤ７３結合物質；（ｃ）癌の処置用の医薬品の製造のための抗ＣＤ７３結合物質の使用、抗ＣＤ７３結合物質を薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、癌の処置用の医薬品又は有効用量の癌の処置に適切な抗ＣＤ７３結合物質を含む医薬品の製造のために抗ＣＤ７３結合物質を使用する方法；又は（ｄ）本願が提出される国で特許を得ることを可能とする主題に従う、ａ）、ｂ）及びｃ）のいずれかの組み合わせを意味する。
【0090】
「抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を指す。重鎖における定常ドメインのタイプに依存して、抗体は、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの１つに割り当てられる。これらの一部は、サブクラス又はアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などにさらに分類される。代表的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０又はそれを超えるアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれ指す。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」及び「ミュー」とそれぞれ呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は、周知である。ＩｇＧは、生理学的状況において最も共通する抗体であるため及び実験室で最も容易に作製されるため、本明細書中で使用される抗体の代表的なクラスである。任意選択により、本抗体は、モノクローナル抗体である。抗体の特定の例は、ヒト化、キメラ、ヒト又はそうでなければヒトに適切な抗体である。「抗体」は、本明細書中に記載の抗体のいずれかの何らかの断片又は誘導体も含む。
【0091】
「特異的に結合する」という語は、単離標的細胞の表面上に存在するタンパク質、その中のエピトープ又はネイティブタンパク質のいずれかの組み換え形態を用いて評価した場合、抗体が好ましくは競合的結合アッセイにおいて結合パートナー、例えばＣＤ７３に結合し得ることを意味する。競合的結合アッセイ及び特異的な結合を決定するための他の方法を以下でさらに記載し、これらは、当技術分野で周知である。
【0092】
抗体が特定のモノクローナル抗体と「競合する」と言われる場合、これは、本抗体が、組み換えＣＤ７３分子又は表面発現ＣＤ７３分子のいずれかを用いた結合アッセイにおいて、モノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が結合アッセイにおいて参照抗体のＣＤ７３ポリペプチド又はＣＤ７３発現細胞への結合を減少させる場合、本抗体は、参照抗体とそれぞれ「競合する」と言われる。
【0093】
「親和性」という用語は、本明細書中で使用される場合、エピトープへの抗体の結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］（式中、［Ａｂ－Ａｇ］は、抗体－抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は、未結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は、未結合抗原のモル濃度である）として定められる解離定数Ｋｄにより与えられる。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄにより定義される。ｍＡｂの親和性を決定するための方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９－６０１（１９８３）に見出すことができ、この参考文献は、全体的に参照により本明細書中に組み込まれる。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知のある標準的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析など）の使用である。
【0094】
本明細書に関連して、「決定基」は、ポリペプチド上の相互作用又は結合の部位を指す。
【0095】
「エピトープ」という用語は、抗原性決定基を指し、抗体が結合する抗原上のエリア又は領域である。タンパク質エピトープは、直接結合に関与するアミノ酸残基並びに特異的な抗原結合抗体又はペプチドにより効果的に阻止されるアミノ酸残基、すなわち抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。これは、例えば、抗体又は受容体と組み合わせ得る複合抗原分子上の最も単純な形態又は最小構造領域である。エピトープは、直鎖状又は立体構造／構造であり得る。「直鎖状エピトープ」という用語は、アミノ酸の直鎖状配列（一次構造）上で隣接するアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。「立体構造又は構造エピトープ」という用語は、全てが隣接しておらず、したがって分子の折り畳みにより互いに対して近接するようになるアミノ酸の直鎖状配列の分離部分を表す（二次、三次及び／又は四次構造）アミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。立体構造エピトープは、三次元構造に依存する。したがって、「立体構造」という用語は、「構造」と交換可能に使用されることが多い。
【0096】
「枯渇させる」又は「枯渇させること」という用語は、ＣＤ７３発現細胞に関して、結果として、試料又は対象中に存在するこのようなＣＤ７３発現細胞の数に負の影響を与えるように死滅させるか、排除するか、溶解するか、又はこのような死滅、排除若しくは溶解の誘導を引き起こす過程、方法又は化合物を意味する。
【0097】
「内在化」という用語は、「細胞内内在化」と互換的に使用され、細胞の細胞外表面から細胞の細胞内表面に分子を移動させるプロセスに関連する分子的、生化学的及び細胞的事象を指す。分子の細胞内内在化に関与するプロセスは、周知であり、とりわけ細胞外分子（ホルモン、抗体、有機小分子など）；膜関連分子（細胞表面受容体など）；細胞外分子に結合した膜結合分子の複合体（例えば、膜貫通受容体に結合したリガンド又は膜結合分子に結合した抗体）の内在化に関与し得る。したがって、「内在化の誘導及び／又は増加」は、細胞内内在化が開始され、且つ／又は細胞内内在化の速度及び／又は程度が増加する事象を含む。
【0098】
「薬剤」という用語は、本明細書中では、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生体高分子又は生体物質から作製される抽出物を指すために使用される。「治療剤」という用語は、生物学的活性を有する薬剤を指す。
【0099】
本明細書中での目的のために、「ヒト化」又は「ヒト」抗体は、１つ以上のヒト免疫グロブリンの定常及び可変フレームワーク領域が動物免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲと融合される抗体を指す。このような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するために設計される。このような抗体は、抗原負荷に反応して特異的なヒト抗体を作製させるために「操作」されているトランスジェニックマウス又は他の動物から入手し得る（例えば、全体的な教示が参照により本明細書中に組み込まれるＧｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ７：１３；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎ ６：５７９を参照されたい）。全て当技術分野で公知である、遺伝学的又は染色体導入法並びにファージディスプレイ技術によって完全ヒト抗体も構築し得る（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５３を参照されたい）。ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞によっても作製し得る（例えば、参照によりそれらの全体において組み込まれる米国特許第５，５６７，６１０号明細書及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照されたい）。
【0100】
「超可変領域」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）及び８９～９７（Ｌ３）及び重鎖可変ドメイン中の３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１）及び／又は「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）及び９１～９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメイン中の２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ１９８７；１９６：９０１－９１７）又は抗原結合に関与する必須アミノ酸を決定するための同様の系からのアミノ酸残基を含む。一般的には、この領域中のアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、前出に記載の方法により行われる。「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔにおけるような可変ドメイン残基付番」及び「Ｋａｂａｔによる」などの句は、本明細書中では、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに対するこの付番系を指す。Ｋａｂａｔ付番系を用いて、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ若しくはＣＤＲの短縮又はそれへの挿入に対応する少数の又はさらなるアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に１つのアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、「標準的な」Ｋａｂａｔ付番配列での抗体の配列の相動性の領域でのアライメントにより、特定の抗体に対して決定され得る。
【0101】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書中で使用される場合、ＣＤＲとして定められる領域を除く抗体可変ドメインの領域を意味する。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離される近接領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）にさらに分けられ得る。
【0102】
「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」及び「Ｆｃ領域」という用語は、例えば、ヒトγ（ガンマ）重鎖の約アミノ酸（ａａ）２３０～約ａａ４５０からの、抗体重鎖のＣ末端断片又は他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体の場合、α、δ、ε及びμ）におけるその対応配列又はその天然のアロタイプを指す。別段の指定がない限り、免疫グロブリンに対する一般的に受容されるＫａｂａｔアミノ酸付番は、この開示を通して使用される（Ｋａｂａｔ ｅｔ． ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照されたい）。
【0103】
「単離」、「精製」又は「生物学的に純粋」という用語は、実質的に又は基本的に、そのネイティブ状態で見られるような通常それに付随する成分を含まない物質を指す。純度及び均一性は、一般的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析学的化学技術を用いて決定される。標品中に存在する主要な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。
【0104】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー並びに天然のアミノポリマー及び非天然のアミノポリマーに適用される。
【0105】
「組み換え」という用語は、例えば、細胞又は核酸、タンパク質又はベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが異種核酸若しくはタンパク質の導入又はネイティブ核酸若しくはタンパク質の改変により修飾されているか、又は細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞のネイティブ（非組み換え）形態内で見出されない遺伝子を発現するか、又はそうでなければ異常に発現されるか、発現が少ないか又は全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
【0106】
本明細書に関連して、ポリペプチド又はエピトープに「結合」する抗体という用語は、特異性及び／又は親和性をもって前記決定基に結合する抗体を指す。
【0107】
「同一性」又は「同一である」という用語は、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、２つ以上の一連のアミノ酸残基間の一致数により決定される場合のポリペプチド間の配列関連性の度合いを指す。「同一性」は、特定の数学的モデル又はコンピュータープログラム（すなわち「アルゴリズム」）により扱われるギャップアライメント（存在する場合）を用いた２つ以上の配列のより小さいものの間の完全な一致のパーセントを評価する。関連ポリペプチドの同一性は、公知の方法により容易に計算され得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ ＤｅｖｅｒｅｕＸ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載のものが挙げられるが、限定されない。
【0108】
同一性を決定するための方法は、試験される配列間の一致が最大となるように設計される。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータープログラム法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．），ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ ａｎｄ ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０（１９９０））を含むＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、前出）から公開されている。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用し得る。
【0109】
抗体の産生
本発明は、部分的に、結果として生じる抗ＣＤ７３可変領域がヒトＣＤ７３の酵素活性の中和において高い効力を有するように、抗体ＣＤＲを組み込むことができる改変されたヒトアクセプターフレームワーク配列の発見に基づく。抗体は、ヒトにおける免疫原性が低いか又は低下しているという利点を有し、例えばヒトへの投与時、望ましくない抗ＣＤ７３抗体に向けられた免疫応答を引き起こす能力又は可能性が低い。本開示のそのような抗体の例には、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、２Ｌ１、２Ｌ２、２Ｌ３又は２Ｌ４ ＶＬドメインと組み合わされたＨ４＋又は２Ｈ４＋ ＶＨドメインを含む抗体が含まれる。本開示の抗体の例には、抗体Ｈ４＋Ｌ１、Ｈ４＋Ｌ２、Ｈ４＋Ｌ３、Ｈ４＋Ｌ４、２Ｈ４＋Ｌ１、２Ｈ４＋Ｌ２、２Ｈ４＋Ｌ３又は２Ｈ４＋Ｌ４のいずれか１つのＶＨ及びＶＬドメイン対を含む抗体が含まれる。
本発明は、部分的に、結果として生じる抗ＣＤ７３可変領域がヒトＣＤ７３の酵素活性の中和において高い効力を有するように、抗体ＣＤＲを組み込むことができる改変されたヒトアクセプターフレームワーク配列の発見に基づく。抗体は、ヒトにおける免疫原性が低いか又は低下しているという利点を有し、例えばヒトへの投与時、望ましくない抗ＣＤ７３抗体に向けられた免疫応答を引き起こす能力又は可能性が低い。本開示のそのような抗体の例には、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、２Ｌ１、２Ｌ２、２Ｌ３又は２Ｌ４ ＶＬドメインと組み合わされたＨ４＋又は２Ｈ４＋ ＶＨドメインを含む抗体が含まれる。本開示の抗体の例には、抗体Ｈ４＋Ｌ１、Ｈ４＋Ｌ２、Ｈ４＋Ｌ３、Ｈ４＋Ｌ４、２Ｈ４＋Ｌ１、２Ｈ４＋Ｌ２、２Ｈ４＋Ｌ３又は２Ｈ４＋Ｌ４のいずれか１つのＶＨ及びＶＬドメイン対を含む抗体が含まれる。
【0110】
ある態様において、ヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合する抗体又は抗体断片は、ヒト起源のＶＨ及びＶＬフレームワーク（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含む。ある態様において、抗体又は抗体断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列ＳＹＮＭＹを含むＨＣＤＲ１（重鎖ＣＤＲ１）；配列番号１２に記載のアミノ酸配列ＹＩＤＰＹＮＧＧＳＳＹＮＱＫＦＫＧを含むＨＣＤＲ２（重鎖ＣＤＲ２）であって、任意選択によりさらに、配列番号１２の１３位のグルタミン残基（Ｑ）は、ロイシン残基（Ｌ）で置換され得、配列番号１２の１４位のリシン残基（Ｋ）は、任意選択により、スレオニン残基（Ｔ）で置換され得る、配列；配列番号１３に記載のアミノ酸配列ＧＹＮＮＹＫＡＷＦＡＹを含むＨＣＤＲ３（重鎖ＣＤＲ３）であって、任意選択によりさらに、配列番号１３の３位のアスパラギン残基（Ｎ）は、グリシン残基（Ｇ）で置換され得る、配列；配列番号１４に記載のアミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＴＮＤＶＡを含むＬＣＤＲ１（軽鎖ＣＤＲ１）であって、任意選択によりさらに、配列番号１４の７位のスレオニン残基（Ｔ）は、セリン残基（Ｓ）で置換され得る、配列；配列番号１５に記載のアミノ酸配列ＹＡＳＮＲＹＴを含むＬＣＤＲ２（軽鎖ＣＤＲ２）であって、任意選択により、配列番号１５の４位のアスパラギン残基（Ｎ）は、スレオニン残基（Ｔ）で置換され得る、配列；配列番号７に記載のアミノ酸配列ＱＱＤＹＳＳＬＴを含むＬＣＤＲ３（軽鎖ＣＤＲ３）を含む。
【0111】
ある実施形態において、ＨＤＣＲ２は、式Ｉのアミノ酸配列：
Ｙ－Ｉ－Ｄ－Ｐ－Ｙ－Ｎ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｓ－Ｙ－Ｎ－Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｆ－Ｋ－Ｇ（配列番号３）又はその部分配列を含み、ここで、Ｘａａ１はＱ（Ｇｌｎ）又はＬ（Ｌｅｕ）であり、Ｘａａ２はＫ（Ｌｙｓ）又はＴ（Ｔｈｒ）である。
Ｙ－Ｉ－Ｄ－Ｐ－Ｙ－Ｎ－Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｓ－Ｙ－Ｎ－Ｘａａ１－Ｘａａ２－Ｆ－Ｋ－Ｇ（配列番号３）又はその部分配列を含み、ここで、Ｘａａ１はＱ（Ｇｌｎ）又はＬ（Ｌｅｕ）であり、Ｘａａ２はＫ（Ｌｙｓ）又はＴ（Ｔｈｒ）である。
【0112】
ある実施形態において、ＨＤＣＲ３は、式ＩＩのアミノ酸配列：Ｇ－Ｙ－Ｘａａ１－Ｎ－Ｙ－Ｋ－Ａ－Ｗ－Ｆ－Ａ－Ｙ（配列番号４）又はその部分配列を含み、ここで、Ｘａａ１は、Ｎ（Ａｓｐ）又はＧ（Ｇｌｙ）である。
【0113】
ある実施形態において、ＬＤＣＲ１は、式ＩＩＩのアミノ酸配列：Ｋ－Ａ－Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｖ－Ｘａａ１－Ｎ－Ｄ－Ｖ－Ａ（配列番号５）又はその部分配列を含み、ここで、Ｘａａ１は、Ｔ（Ｔｈｒ）又はＳ（Ｓｅｒ）である。
【0114】
ある実施形態において、ＬＤＣＲ２は、式ＩＶのアミノ酸配列：Ｙ－Ａ－Ｓ－Ｘａａ１－Ｒ－Ｙ－Ｔ（配列番号６）又はその部分配列を含み、ここで、Ｘａａ１は、Ｔ（Ｔｈｒ）又はＮ（Ａｓｎ）である。
【0115】
ある態様において、ヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合する単離抗体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列ＳＹＮＭＹを含むＨＣＤＲ１；配列番号８に記載のアミノ酸配列ＹＩＤＰＹＮＧＧＳＳＹＮＬＴＦＫＧを含むＨＣＤＲ２；配列番号９に記載のアミノ酸配列ＧＹＧＮＹＫＡＷＦＡＹを含むＨＣＤＲ３；配列番号１０に記載のアミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＡを含むＬＣＤＲ１；配列番号１１に記載のアミノ酸配列ＹＡＳＴＲＹＴを含むＬＣＤＲ２；及び配列番号７に記載のアミノ酸配列ＱＱＤＹＳＳＬＴを含むＬＣＤＲ３を含む。
【0116】
ある態様において、ヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合する単離抗体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列ＳＹＮＭＹを含むＨＣＤＲ１；配列番号１２に記載のアミノ酸配列ＹＩＤＰＹＮＧＧＳＳＹＮＱＫＦＫＧを含むＨＣＤＲ２；配列番号１３に記載のアミノ酸配列ＧＹＮＮＹＫＡＷＦＡＹを含むＨＣＤＲ３；配列番号１４に記載のアミノ酸配列ＫＡＳＱＳＶＴＮＤＶＡを含むＬＣＤＲ１；配列番号１５に記載のアミノ酸配列ＹＡＳＮＲＹＴを含むＬＣＤＲ２；及び配列番号７に記載のアミノ酸配列ＱＱＤＹＳＳＬＴを含むＬＣＤＲ３を含む。
【0117】
ある実施形態において、抗体は、ヒトサブグループＩＧＨＶ１－３からの重鎖フレームワークを含み（任意選択によりＩＧＨＪ４と共に）、任意選択により、ＩＧＨＶ１－３は、ＩＧＨＶ１－３＊０１である。ある実施形態において、ヒト化抗体は、ヒトサブグループＩＧＫＶ１－３３（任意選択によりＩＧＫＪ２と共に）、任意選択によりＩＧＫＶ１－３３＊０１からの軽鎖フレームワークを含む。
【0118】
抗体は、例えば、抗体の親和性、安定性又は他の特性を強化するために、ヒト重鎖及び／又は軽鎖フレームワーク全体にわたる１、２、３、４、５つ又はそれを超える数のアミノ酸置換をさらに含み得る。
【0119】
抗ＣＤ７３抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の例を実施例６（Ｈ４＋鎖を示し、２Ｈ４＋２Ｌｘ抗体について表５に示す）に示し、Ｌ１－Ｌ４鎖について表１に示す。
【0120】
ある態様において、本発明は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｂ）配列番号３、８又は１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）配列番号４、９又は１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；
（ｄ）配列番号５、１０又は１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｅ）配列番号６、１１又は１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；
（ｆ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３；及び
（ｇ）ヒト重鎖及び軽鎖フレームワーク配列
を含む、ヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合する抗原結合ドメイン又は抗体又は抗体断片を提供する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；
（ｂ）配列番号３、８又は１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、
（ｃ）配列番号４、９又は１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；
（ｄ）配列番号５、１０又は１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；
（ｅ）配列番号６、１１又は１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；
（ｆ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３；及び
（ｇ）ヒト重鎖及び軽鎖フレームワーク配列
を含む、ヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合する抗原結合ドメイン又は抗体又は抗体断片を提供する。
【0121】
ある実施形態において、抗体は、ＩＧＨＪ４と共に、ヒトサブグループＩＧＨＶ１－３からの重鎖フレームワークを含み、任意選択により、抗体は、ＩＧＨＪ４と共に、ＩＧＨＶ１－３＊０１を含む。ある実施形態において、ヒト化抗体は、ＩＧＫＪ２と共に、ヒトサブグループＩＧＫＶ１－３３、任意選択によりＩＧＫＶ１－３３＊０１からの軽鎖フレームワークを含む。
【0122】
任意選択により、任意の実施形態において、抗体は、ネズミ親抗体以外の抗体、例えば配列番号２７及び２８）のそれぞれのＶＨ及びＶＬを有するか、又は配列番号４０及び４１）のそれぞれのＶＨ及びＶＬを有するマウス親抗体であると特定することができる。
【0123】
任意選択により、ヒトフレームワークは、１つ以上の突然変異、例えば非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）の特定の位置に存在する残基を導入するための逆突然変異を含む。
【0124】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ重鎖位置２のアミノ酸は、イソロイシンである。
【0125】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ重鎖位置３０のアミノ酸は、アラニンである。
【0126】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ重鎖位置４８のアミノ酸は、イソロイシンである。
【0127】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ重鎖位置６９のアミノ酸は、ロイシンである。
【0128】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ重鎖位置７３のアミノ酸は、リシンである。
【0129】
ある実施形態において、ＶＨは、Ｋａｂａｔ位置２にイソロイシン残基を、位置３０にアラニンを、位置４８にイソロイシンを、位置６９にロイシンを、且つ位置７３にリシンを含む。
【0130】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ軽鎖位置６７のアミノ酸は、チロシンである。
【0131】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ軽鎖位置６０のアミノ酸は、セリン又はアスパラギン酸である。
【0132】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ軽鎖位置２のアミノ酸は、バリン又はイソロイシンである。
【0133】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ軽鎖位置８７のアミノ酸は、チロシン又はフェニルアラニンである。
【0134】
ある実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置６７にチロシン残基を、位置６０にセリンを、位置２にイソロイシンを、且つ位置８７にチロシンを含む。
【0135】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ重鎖位置２８のアミノ酸は、スレオニン（Ｔ）である。
【0136】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ重鎖位置６６のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）である。
【0137】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ重鎖位置６７のアミノ酸は、バリン（Ｖ）である。
【0138】
本明細書の任意の実施形態のある態様において、Ｋａｂａｔ重鎖位置７１のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）である。
【0139】
本明細書のＶＨ及びＶＬドメインにおける位置は、Ｋａｂａｔ付番系（Ｋａｂａｔ ｅｔ．ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用して記載される。
【0140】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、配列番号３７又は４２のＶＨドメインに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性又は１００％の同一性）を有するＶＨドメインを含む。
【0141】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体又は抗体断片は、配列番号３３～３６又は４３～４６のいずれかのＶＬドメインに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は１００％の同一性）を有するＶＬドメインを含む。
【0142】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体又は抗体断片は、配列番号４２のＶＨドメインに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性又は１００％の同一性）を有するＶＨドメイン及び配列番号４３～４６のいずれかのＶＬドメインに対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は１００％の同一性）を有するＶＬドメインを含む。
【0143】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体又は抗体断片は、Ｈ４＋Ｌ１抗体の配列番号３８の重鎖に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性又は１００％の同一性）を有する重鎖を含む。ある実施形態において、抗体又は抗体断片は、Ｈ４＋Ｌ１抗体の配列番号３９の軽鎖に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性又は１００％の同一性）を有する軽鎖を含む。
【0144】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体又は抗体断片は、２Ｈ４＋２Ｌ１抗体の配列番号４７の重鎖に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性又は１００％の同一性）を有する重鎖を含む。ある実施形態において、抗体又は抗体断片は、２Ｈ４＋２Ｌ１抗体の配列番号４８の軽鎖に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性又は１００％の同一性）を有する軽鎖を含む。
【0145】
抗体をコードするＤＮＡを調製し、適切な宿主への遺伝子移入のために適切な発現ベクターに入れることができる。次いで、抗体又はそれらの変異体、例えばそのモノクローナル抗体のヒト化バージョン、抗体の活性断片、抗体の抗原認識部分を含むキメラ抗体又は検出可能部分を含むバージョンの組み換え産生のために宿主を使用する。
【0146】
本開示のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して容易に単離し、配列決定し得る（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる）。ある態様において、本明細書の任意の実施形態の抗ＣＤ７３抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸が提供される。単離したら、ＤＮＡを発現ベクターに入れ得、次いで組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得るために、これを、そのままでは免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞などの宿主細胞に遺伝子導入する。多数の目的のいずれかのために、例えば抗体をヒト化する断片若しくは誘導体を作製するために、又は例えば抗体の結合特異性を最適化するために抗原結合部位において抗体の配列を修飾するために、このようなＤＮＡ配列を修飾し得る。ある実施形態において、抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードする単離された核酸配列並びに（例えば、そのゲノム中に）そのような核酸を含む組換え宿主細胞が提供される。抗体をコードするＤＮＡの細菌中の組換え発現は、当技術分野で周知である（例えば、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，ｐｐ．２５６（１９９３）；及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０，ｐ．１５１（１９９２）を参照されたい。
【0147】
抗体の断片及び誘導体（別段の指定がない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本願で使用される場合の１つ又は複数の「抗体」という用語に包含される）は、当技術分野で公知の技術により作製され得る。「断片」は、インタクト抗体の一部分、一般的には抗原結合部位又は可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；近接アミノ酸残基の１つの連続した配列からなる一次構造を有するポリペプチド（本明細書中で「１本鎖抗体断片」又は「１本鎖ポリペプチド」と呼ぶ）である何らかの抗体断片；及び抗体断片から形成される多特異性（例えば、二特異性）抗体が挙げられる。
【0148】
典型的には、本明細書に提供される抗ＣＤ７３抗体は、約１０４～約１０１１Ｍ－１（例えば、約１０８～約１０１０Ｍ－１）の範囲の、ＣＤ７３ポリペプチド（例えば、本明細書の実施例で産生されるＣＤ７３ポリペプチド）に対する親和性を有する。例えば、特定の態様において、本開示は、例えば、（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析などによる）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニングによって決定される、ＣＤ７３に関して１×１０－９Ｍ未満の平均解離定数（ＫＤ）を有する抗ＣＤ７３抗体を提供する。より特定の例示的な態様において、本開示は、ＣＤ７３について、約１×１０－８Ｍ～約１×１０－１０Ｍ又は約１×１０－９Ｍ～約１×１０－１１ＭのＫＤを有する抗ＣＤ７３抗体を提供する。
【0149】
抗体は、例えば、約１００、６０、１０、５又は１ナノモル濃度以下（それより良好な親和性）、好ましくはナノモル濃度以下又は任意選択により約５００、２００、１００又は１０ピコモル濃度以下の平均ＫＤによって特徴付けられ得る。ＫＤは、例えば、組換えにより産生されたヒトＣＤ７３タンパク質をチップ表面に固定化し、続いて溶液中で試験される抗体を適用することによって決定することができる。ある実施形態において、方法は、ＣＤ７３への結合について対照抗体と競合することができる（ｂ）からの抗体を選択するステップ（ｄ）をさらに含む。
【0150】
ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、それらがヒトＦｃγ受容体、例えばＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４のいずれか１つ以上に実質的な結合を有しないように調製され得る。このような抗体は、Ｆｃγ受容体に対する結合を欠くこと又は低い結合性を有することが知られている様々な重鎖の定常領域を含み得る。代替的に、Ｆｃ受容体結合を回避するために、Ｆ（ａｂ’）２断片など、定常領域を含まない（又は部分的に含む）抗体断片を使用し得る。Ｆｃ受容体結合は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイにおけるＦｃ受容体タンパク質への抗体の結合を試験することを含め、当技術分野で公知の方法に従い評価し得る。また、Ｆｃ受容体への結合を最小化又は除外するためにＦｃ部分が修飾される（例えば、１、２、３、４、５つ又はそれを超えるアミノ酸置換を導入することによって）何らかの抗体ＩｇＧアイソタイプを一般に使用し得る（例えば、その開示が参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第０３／１０１４８５号パンフレットを参照されたい）。Ｆｃ受容体結合を評価するためのそのようなアッセイは、当技術分野で周知であり、例えば国際公開第０３／１０１４８５号パンフレットに記載されている。
【0151】
ある実施形態において、抗体は、エフェクター細胞との最小限の相互作用を有する「Ｆｃサイレント」抗体を生じるＦｃ領域における１つ以上の特異的突然変異を含み得る。サイレンシングされたエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域における突然変異によって得ることができ、当技術分野において記載されてきた。Ｎ２９７Ａ突然変異、ＬＡＬＡ突然変異（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．，２００９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．２０（６）：６８５－６９１）；Ｄ２６５Ａ（Ｂａｕｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：６６６４－６９）及びＨｅｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開第２０１２／０６５９５０号パンフレットを参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、抗体は、ヒンジ領域に１、２、３つ又はそれを超えるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２であり、残基２３３～２３６、任意選択により２３３～２３８（ＥＵ付番）において１つ、２つ又は３つの置換を含む。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４であり、残基３２７、３３０及び／又は３３１（ＥＵ付番）に１つ、２つ又は３つの置換を含む。サイレントＦｃ ＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列におけるＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ突然変異を含むＬＡＬＡ突然変異体である。Ｆｃサイレント突然変異の別の例は、例えば、ＤＡＰＡ（Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ）突然変異（米国特許第６，７３７，０５６号明細書）としてＩｇＧ１抗体において用いられる、残基Ｄ２６５又はＤ２６５及びＰ３２９における突然変異である。別のサイレントＩｇＧ１抗体は、残基Ｎ２９７における突然変異（例えば、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｓ突然変異）を含み、その結果、グリコシル化／非グリコシル化抗体を生じる。他のサイレント突然変異は、残基Ｌ２３４及びＧ２３７における置換（Ｌ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ）；残基Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＲ４０９における置換（Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｒ４０９Ｋ、Ｔ、Ｍ、Ｌ）；残基Ｈ２６８、Ｖ３０９、Ａ３３０及びＡ３３１における置換（Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ）；残基Ｃ２２０、Ｃ２２６、Ｃ２２９及びＰ２３８における置換（Ｃ２２０Ｓ／Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｐ２３８Ｓ）；残基Ｃ２２６、Ｃ２２９、Ｅ２３３、Ｌ２３４及びＬ２３５における置換（Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ；残基Ｋ３２２、Ｌ２３５及びＬ２３５における置換（Ｋ３２２Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）；残基Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３３１における置換（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ）；残基２３４、２３５及び２９７における置換；残基Ｅ３１８、Ｋ３２０及びＫ３２２における置換（Ｌ２３５Ｅ／Ｅ３１８Ａ／Ｋ３２０Ａ／Ｋ３２２Ａ）；残基（Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ）における置換；残基２４３及び２６４における置換；残基２９７及び２９９における置換；ＥＵ付番系によって定義される残基２３３、２３４、２３５、２３７及び２３８がＰＡＡＡＰ、ＰＡＡＡＳ及びＳＡＡＡＳから選択される配列を含む置換（国際公開第２０１１／０６６５０１号パンフレットを参照されたい）を含む。
【0152】
ある実施形態において、抗体は、Ｆｃ領域に１つ以上の特異的突然変異を含むことができる。例えば、そのような抗体は、ヒトＩｇＧ１起源のＦｃドメインを含み、Ｋａｂａｔ残基２３４、２３５、２３７、３３０及び／又は３３１における突然変異を含む。そのようなＦｃドメインの一例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３３１における置換（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ又は（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ））を含む。このようなＦｃドメインの別の例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７及びＰ３３１における置換（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ３３１Ｓ）を含む。このようなＦｃドメインの別の例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０及びＰ３３１における置換（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ）を含む。ある実施形態において、抗体は、Ｆｃドメイン、任意選択によりヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含む抗体であり、Ｌ２３４Ｘ１置換、Ｌ２３５Ｘ２置換及びＰ３３１Ｘ３置換を含み、Ｘ１は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残であり基、Ｘ３は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、任意選択により、Ｘ１は、アラニン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ２は、グルタミン酸又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ３は、セリン又はその保存的置換である。別の実施形態において、抗体は、Ｆｃドメイン、任意選択によりヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含む抗体であり、Ｌ２３４Ｘ１置換、Ｌ２３５Ｘ２置換、Ｇ２３７Ｘ４置換及びＰ３３１Ｘ４置換を含み、Ｘ１は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ３は、グリシン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ４は、プロリン以外のアミノ酸残基であり、任意選択により、Ｘ１は、アラニン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ２は、グルタミン酸又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ３は、アラニン又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ４は、セリン又はその保存的置換である。別の実施形態において、抗体は、Ｆｃドメイン、任意選択によりヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含む抗体であり、Ｌ２３４Ｘ１置換、Ｌ２３５Ｘ２置換、Ｇ２３７Ｘ４置換、Ｇ３３０Ｘ４置換及びＰ３３１Ｘ５置換を含み、Ｘ１は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ３は、グリシン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ４は、アラニン以外のアミノ酸残基であり、Ｘ５は、プロリン以外のアミノ酸残基であり、任意選択により、Ｘ１は、アラニン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ２は、グルタミン酸又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ３は、アラニン又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ４は、セリン又はその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ５は、セリン又はその保存的置換である。
【0153】
本明細書で使用されている略記法では、形式は、野生型残基：ポリペプチド中の位置：突然変異体残基であり、残基位置は、ＫａｂａｔによるＥＵ付番に従って示される。
【0154】
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はそれらと少なくとも９０％、９５％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５及び３３１にアミノ酸残基を保持する（下線）。
【化2】
【0155】
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はそれらと少なくとも９０％、９５％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５及び３３１にアミノ酸残基を保持する（下線）。
【化3】
【0156】
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はそれらと少なくとも９０％、９５％若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７、３３０及び３３１にアミノ酸残基を保持する（下線）。
【化4】
【0157】
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はそれらと少なくとも９０％、９５％若しくは９９％同一の配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７及び３３１にアミノ酸残基を保持する（下線）。
【化5】
【0158】
Ｆｃサイレント抗体は、ＡＤＣＣ活性を生じないか又は低いＡＤＣＣ活性を生じ、すなわち、Ｆｃサイレント抗体は、５０％未満の特異的細胞溶解であるＡＤＣＣ活性を示す。好ましくは、抗体は、実質的にＡＤＣＣ活性を欠き、例えば、Ｆｃサイレント抗体は、５％未満又は１％未満のＡＤＣＣ活性（特異的細胞溶解）を示す。Ｆｃサイレント抗体は、ＣＤ７３発現細胞の表面でのＣＤ７３のＦｃγＲ媒介性架橋の欠如も生じ得る。
【0159】
ある実施形態において、抗体は、２２０、２２６、２２９、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２４３、２６４、２６８、２９７、２９８、２９９、３０９、３１０、３１８、３２０、３２２、３２７、３３０、３３１及び４０９（重鎖定常領域における残基の付番は、ＫａｂａｔによるＥＵ付番に従う）からなる群から選択される任意の１、２、３、４、５つ又はそれを超える残基において重鎖定常領域に置換を有する。ある実施形態において、抗体は、残基２３４、２３５及び３２２における置換を含む。ある実施形態において、抗体は、残基２３４、２３５及び３３１における置換を含む。ある実施形態において、抗体は、残基２３４、２３５、２３７及び３３１における置換を含む。ある実施形態において、抗体は、残基２３４、２３５、２３７、３３０及び３３１における置換を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１サブタイプのものである。アミノ酸残基は、ＫａｂａｔによるＥＵ付番に従って示される。
【0160】
ある実施形態において、抗体は、抗体のインビボ半減期を増加させるために、ヒトＦｃＲｎポリペプチドへの結合を増加させるアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。例示的な突然変異は、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．，２００９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．２０（６）：６８５－６９１に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗体で使用される置換の例は、Ｋａｂａｔ残基Ｍ２５２、Ｓ２５４及びＴ２５６での置換；残基Ｔ２５０及びＭ４２８での置換；残基Ｎ４３４での置換；残基Ｈ４３３及びＮ４３４での置換；残基Ｔ３０７、Ｅ３８０及びＮ４３４での置換；残基Ｔ３０７、Ｅ３８０及びＮ４３４での置換；残基Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｈ４３３、Ｎ４３４及び４３６での置換；残基Ｉ２５３での置換；残基Ｐ２５７、Ｎ４３４、Ｄ３７６及びＮ４３４での置換である。抗原結合化合物は、ＣＤ７３の酵素活性を阻害する能力、特にＣＤ７３の５’－ヌクレオチダーゼ活性を遮断し、ＣＤ７３発現細胞によるアデノシンの産生を減少させ、リンパ球のアデノシン媒介性阻害の活性を回復させ、且つ／又はそれを軽減する能力について、任意の望ましい段階で評価することができる。
【0161】
ＣＤ７３の酵素活性を阻害する抗体の能力は、組換え可溶性ヒトＣＤ７３（二量体として）及びＡＭＰを使用する無細胞アッセイで試験することができ、ＡＭＰのアデノシンへの変換（及び／又はその阻害）が直接的（例えば、基質及び生成物、すなわちＡＭＰ、アデノシン及び／又はリン酸の測定によって）又は間接的に検出される。一例では、ＡＭＰ及び／又はアデノシンは、組換えＣＤ７３との試験化合物のインキュベーションの前後にＨＰＬＣを介して検出される。
【0162】
抗体のＣＤ７３阻害活性は、他の多くの方法のいずれかで評価することもできる。例えば、間接アッセイでは、ルシフェラーゼベースの試薬（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）システム）を使用してＡＭＰの消失を検出する。アッセイにおけるルシフェラーゼ反応は、ＡＭＰによって阻害される。ＣＤ７３酵素を反応物に加えると、ＡＭＰが分解され、阻害が緩和され、検出可能なシグナルが生成される。
【0163】
可溶性ＣＤ７３を使用するアッセイは、抗体がＣＤ７３ポリペプチド二量体に対して実質的なモル過剰（例えば、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍など）で提供される条件での試験を含む。酵素に対してモル過剰で提供される場合、抗ＣＤ７３抗体は、抗体とＣＤ７３二量体の多量体複合体を形成することがもはやできなくなる。次に、ＣＤ７３の酵素活性の阻害を保持する抗体を選択することができる。
【0164】
ＣＤ７３の５’－エクトヌクレオチダーゼ酵素活性を阻害する抗体の能力は、代替的又は追加的に、細胞アッセイ（ＣＤ７３を発現する細胞を使用）で試験することもできる。有利には、抗体は、ＣＤ７３の内在化を引き起こすことによってＣＤ７３を阻害する抗体を選択する可能性を低減するために、最初に無細胞アッセイで試験又はスクリーニングして、酵素の活性を遮断する抗体を同定し、次に細胞アッセイで精製抗体として試験することができる。細胞アッセイは、本明細書の実施例に示されるように、又はその開示が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開国際公開第２０１６／０５５６０９号パンフレットに開示されるように実施することができる。例えば、ＣＤ７３発現細胞（例えば、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株）は、国際公開第２０１６／０５５６０９号パンフレットに詳述されているように、抗ＣＤ７３抗体の存在下で平底９６ウェルプレートにプレーティングされ、インキュベートされる。ＡＭＰを細胞に添加し、４℃でインキュベートする（ＣＤ７３のダウンモジュレーションを回避するため）。次に、プレートを遠心分離し、上清を平底の９６ウェル培養プレートに移す。次に、ＡＭＰのアデノシンへの加水分解によって生成された遊離リン酸塩が定量化される。抗体の存在下でのＡＭＰのアデノシンへの加水分解の減少は、抗体が細胞のＣＤ７３を阻害することを示す。
【0165】
ある実施形態において、抗体調製物は、ＣＤ７３ポリペプチドの酵素活性の少なくとも５０％の減少、好ましくはＣＤ７３ポリペプチド（例えば、可溶性ホモ二量体ＣＤ７３ポリペプチド；細胞によって発現されるＣＤ７３）の酵素活性の少なくとも６０％、７０％又は８０％の減少を引き起こす。
【0166】
抗体の活性は、例えば、リンパ球活性のアデノシン媒介性阻害を軽減するか、又はリンパ球活性の活性化を引き起こす、リンパ球の活性を調節するその能力について間接的アッセイで測定することもできる。これは、例えば、サイトカイン放出アッセイを使用して対処することができる。別の例において、抗体は、リンパ球の増殖を調節するその能力について間接アッセイで評価することができる。
【0167】
ある実施形態において、抗体は、溶液中のホモ二量体ヒトＣＤ７３ポリペプチドの５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する。ある実施形態において、抗体は、可溶性ヒトＣＤ７３ポリペプチド、とりわけＡＭＰのアデノシンへのＣＤ７３媒介性異化を中和する抗体に結合し、且つその酵素活性を阻害する。ある実施形態において、抗体は、二価の様式でＣＤ７３に結合する。ある実施形態において、抗体は、非枯渇抗体、例えばヒトＦｃγ受容体への結合を実質的に欠くＦｃサイレント抗体である。ある実施形態において、抗体は、ＣＤ７３ポリペプチド：抗ＣＤ７３抗体オリゴマーの誘導に依存することなく、溶液中のＣＤ７３を中和する。
【0168】
ある実施形態において、抗体は、細胞の表面でヒトＣＤ７３に特異的に結合し、可溶性ヒトＣＤ７３ポリペプチドの５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和することができる。ある実施形態において、抗体は、可溶性ＣＤ７３のオリゴマー化を誘導しない。
【0169】
ある実施形態において、抗体は、細胞の表面でヒトＣＤ７３に特異的に結合し、細胞性ＣＤ７３（細胞によって発現されるＣＤ７３）の５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和することができる。ある実施形態において、抗体は、細胞の表面でヒトＣＤ７３に特異的に結合し、その５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和し、ＣＤ７３に結合したときにＣＤ７３発現細胞に内在化されない。抗体は、ＣＤ７３の多量体化及びそれに続く内在化を引き起こさない。ある実施形態において、抗体は、溶液中の組換えヒトＣＤ７３ポリペプチドに結合し、その酵素活性を阻害することができ、ここで、前記抗体は、ＣＤ７３発現細胞に内在化されない。ある実施形態において、非内在化抗体は、二価の方法でＣＤ７３に結合する。ある実施形態において、抗体は、非枯渇抗体、例えばＦｃサイレント抗体である。抗体は、溶液中の二量体ヒトＣＤ７３ポリペプチドの５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和することができ、さらにＣＤ７３ポリペプチド：抗ＣＤ７３抗体オリゴマーの誘導に依存しない。
【0170】
ある実施形態において、抗体は、ヒトＣＤ７３ポリペプチドに二価で特異的に結合し、細胞性ヒトＣＤ７３（及び任意選択によりさらに組換え可溶性ヒトＣＤ７３）の酵素活性を阻害し、ここで、前記抗体は、ＣＤ７３発現細胞におけるＣＤ７３の細胞内内在化を誘導又は増加させない。好ましくは、抗体は、Ｆｃγ受容体結合（例えば、そのＦｃドメインを介して）を実質的に欠く。
【0171】
ある態様において、抗体は、ＡＭＰとプレインキュベートされた細胞の表面でヒトＣＤ７３に特異的に結合し、且つその５’－エクトヌクレオチダーゼ活性を中和することができる。任意選択により、５’－エクトヌクレオチダーゼ活性の中和は、ＡＭＰのアデノシンへの加水分解を定量化することにより、ＣＤ７３発現細胞（例えば、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞）における５’エクトヌクレオチダーゼ活性の中和を評価することによって決定される。
【0172】
ある態様において、細胞によって発現されるＣＤ７３の５’－エクトヌクレオチダーゼ活性の中和は、Ｔ細胞がＡＭＰ（例えば、外因的に追加されたＡＭＰ）の存在下において、（例えば、ＴＣＲ共刺激、ＣＤ３及びＣＤ２８シグナル伝達の刺激を介して、例えばＴ細胞を、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストで機能化されたビーズと接触させることによって）インビトロで増殖するように誘導される場合、前記Ｔ細胞の増殖を増加させる抗体の能力を評価することによって決定される。ある態様において、５’－エクトヌクレオチダーゼ活性アッセイの中和は、実施例の「方法」という名称のセクションに記載されているＴ細胞増殖アッセイを使用して評価される。
【0173】
抗体は、野生型ＣＤ７３ポリペプチド（例えば、配列番号１）に結合する抗ＣＤ７３抗体の能力と比較して、ＣＤ７３変異体で遺伝子導入された細胞に結合するそれらの能力によって特徴付けることができる。抗ＣＤ７３抗体と突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドとの間の結合の減少は、結合親和性の低下（例えば、特定の突然変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験などの公知の方法又は突然変異体ポリペプチドへの結合のＢｉａｃｏｒｅ試験によって測定される）及び／又は抗ＣＤ７３抗体の全結合能力の低下（例えば、抗ＣＤ７３抗体濃度対ポリペプチド濃度のプロットにおけるＢｍａｘの減少によって証明される）があることを意味する。結合の有意な減少は、抗ＣＤ７３抗体がＣＤ７３に結合している場合、突然変異した残基が抗ＣＤ７３抗体への結合に直接関与するか、又は結合タンパク質に近接していることを示す。
【0174】
いくつかの実施形態において、結合の有意な減少は、抗ＣＤ７３抗体と突然変異ＣＤ７３ポリペプチドとの間の結合親和性及び／又は能力が、抗体と野生型ＣＤ７３ポリペプチドとの間の結合と比較して４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超又は９５％超減少することを意味する。特定の実施形態において、結合は、検出可能限界未満に減少される。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ７３抗体の突然変異ＣＤ７３ポリペプチドへの結合が、抗ＣＤ７３抗体と野生型ＣＤ７３ポリペプチドとの間に観察される結合の５０％未満（例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％又は１０％未満）である場合、結合の有意な減少が証明される。
【0175】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、残基Ｋ１３６（配列番号１に関して）に突然変異を有するＣＤ７３ポリペプチドへの減少した結合を有し、任意選択により、突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドは、突然変異Ｋ１３６Ａを有する。
【0176】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ｋ９７、Ｅ１２５、Ｑ１５３及びＫ３３０（配列番号１に関して）からなる群から選択される残基に突然変異を有するＣＤ７３ポリペプチドへの減少した結合を有し、任意選択により、突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドは、突然変異Ｋ９７Ａ、Ｅ１２５Ａ、Ｑ１５３Ａ及び／又はＫ３３０Ａ（例えば、Ｋ９７Ａ、Ｅ１２５Ａ及びＫ３３０Ａ；Ｋ９７Ａ、Ｅ１２５Ａ及び／又はＱ１５３Ａ）を有する。
【0177】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ａ９９、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４及びＡ１３５（配列番号１に関して）からなる群から選択される残基に突然変異を有するＣＤ７３ポリペプチドへの減少した結合を有し、任意選択により、突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドは、突然変異Ａ９９Ｓ、Ｅ１２９Ａ、Ｋ１３３Ａ、Ｅ１３４Ｎ及び／又はＡ１３５Ｓを有する。
【0178】
任意選択により、ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ｑ７０、Ｒ７３、Ａ７４、Ａ１０７及びＲ１０９（配列番号１に関して）からなる群から選択される残基に突然変異を有するＣＤ７３ポリペプチドへの減少した結合を有さず、任意選択により、突然変異体ＣＤ７３ポリペプチドは、突然変異Ａ９９Ｓ、Ｑ７０Ｓ、Ｒ７３Ａ、Ａ７４Ｅ、Ａ１０７Ｉ及び／又はＲ１０９Ｇを有する。
【0179】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、残基Ｋ１３６（配列番号１に関して）を含むＣＤ７３上のエピトープに結合する。
【0180】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ｋ９７、Ｅ１２５、Ｑ１５３及びＫ３３０（配列番号１に関して）からなる群から選択される１、２、３又は４つの残基を含むＣＤ７３上のエピトープに結合する。
【0181】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ａ９９、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４及びＡ１３５（配列番号１に関して）からなる群から選択される１、２、３、４又は５つの残基を含むＣＤ７３上のエピトープに結合する。
【0182】
ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ｋ９７、Ａ９９、Ｅ１２５、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４、Ａ１３５及びＫ１３６（配列番号１に関して）からなる群から選択される１、２、３、４、５つ又はそれを超える数の残基を含むＣＤ７３上のエピトープに結合する。ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ｋ９７、Ａ９９、Ｅ１２５、Ｅ１２９、Ｋ１３３、Ｅ１３４、Ａ１３５、Ｋ１３６、Ｑ１５３及びＫ３３０（配列番号１に関して）からなる群から選択される１、２、３、４、５つ又はそれを超える数の残基を含むＣＤ７３上のエピトープに結合する。
【0183】
任意選択により、ある態様において、抗ＣＤ７３抗体は、Ｑ７０、Ｒ７３、Ａ７４、Ａ１０７及びＲ１０９（配列番号１に関して）からなる群から選択される１、２、３、４又は５つの残基を含むＣＤ７３上のエピトープに結合しない。
【0184】
１ｍｇ／ｍＬ～５００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む医薬処方物中に抗ＣＤ７３抗体が組み込まれ得、前記処方物のｐＨは、２．０～１０．０である。本処方物は、緩衝液系、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤及び界面活性剤をさらに含み得る。ある実施形態において、医薬処方物は、水性処方物、すなわち水を含む処方物である。このような処方物は、一般に溶液又は懸濁液である。さらなる実施形態において、本医薬処方物は、水性溶液である。「水性処方物」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む処方物として定義される。同様に、「水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。
【0185】
別の実施形態において、本医薬処方物は、凍結乾燥処方物であり、医師又は患者が使用前にそれに溶媒及び／又は希釈剤を添加する。
【0186】
別の実施形態において、本医薬処方物は、事前に溶解する必要がない使用準備済みの乾燥処方物（例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥）である。
【0187】
さらなる態様において、本医薬処方物は、このような抗体の水溶液及び緩衝液を含み、この抗体は、１ｍｇ／ｍＬ又はそれを超える濃度で存在し、前記処方物のｐＨは、約２．０～約１０．０である。
【0188】
別の実施形態において、本処方物のｐＨは、約２．０～約１０．０、約３．０～約９．０、約４．０～約８．５、約５．０～約８．０及び約５．５～約７．５からなる一覧から選択される範囲である。
【0189】
さらなる実施形態において、緩衝液は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム及びトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はこれらの混合物からなる群から選択される。これらの具体的な各緩衝液は、代替的な実施形態を構成する。
【0190】
さらなる実施形態において、本処方物は、薬学的に許容可能な保存剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物は、等張剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物は、キレート剤も含む。さらなる実施形態において、本処方物は、安定化剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物は、界面活性剤をさらに含む。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照する。
【0191】
ペプチド医薬処方物中に他の成分が存在し得る可能性がある。このようなさらなる成分としては、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、等張性調節剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）及び双性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシン及びヒスチジンなどのアミノ酸）が挙げられ得る。このようなさらなる成分は、当然のことながら、医薬処方物の全体的な安定性に悪影響を与えるべきではない。
【0192】
抗体を含有する医薬組成物は、いくつかの部位、例えば局所部位、例えば皮膚及び粘膜部位、吸収を迂回する部位、例えば動脈における、静脈における、心臓における投与及び吸収を含む部位、例えば皮膚、皮下における、筋肉における又は腹部における投与において、このような処置を必要とする患者に投与され得る。医薬組成物の投与は、このような処置を必要とする患者への、いくつかの投与経路を通した、例えば皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、舌、舌下、頬側、口腔における投与、経口、胃腸における投与、鼻腔、肺、例えば細気管支及び肺胞又はそれらの組み合わせを通した投与、上皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼、例えば結膜を通した投与、ウレタル及び非経口投与であり得る。
【0193】
悪性腫瘍の診断及び処置
本明細書中に記載のような抗ＣＤ７３抗体又は抗体断片を使用して、個体、とりわけヒト患者を処置する方法も提供される。ある実施形態において、本開示は、ヒト患者への投与のための医薬組成物の調製における、本明細書に記載されるような抗体又は抗体断片の使用を提供する。典型的には、患者は、癌又は感染性疾患（例えばウイルス性又は細菌性の感染症）に罹患しているか又はそのリスクがある。
本明細書中に記載のような抗ＣＤ７３抗体又は抗体断片を使用して、個体、とりわけヒト患者を処置する方法も提供される。ある実施形態において、本開示は、ヒト患者への投与のための医薬組成物の調製における、本明細書に記載されるような抗体又は抗体断片の使用を提供する。典型的には、患者は、癌又は感染性疾患（例えばウイルス性又は細菌性の感染症）に罹患しているか又はそのリスクがある。
【0194】
例えば、ある態様において、それを必要とする患者の免疫細胞（例えば、リンパ球）の活性を回復又は増強する方法が提供され、この方法は、前記患者に本開示の中和抗ＣＤ７３抗体を投与するステップを含む。ある実施形態において、方法は、免疫細胞活性の増加及び／又は疾患部位（例えば、腫瘍環境又は感染部位）への浸潤が有益であるか、又は免疫抑制、免疫抑制細胞又は例えばＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞）によって生成されるアデノシンによって引き起こされるか又はそれによって特徴付けられる、癌又は感染症などの疾患を有する患者の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性を増加させることを目的とする。
【0195】
方法は、腫瘍微小環境（及びその中のＣＤ７３媒介性アデノシン産生）が免疫系による認識の欠如（免疫回避）に寄与し得ると疑われる腫瘍を有する個体を処置するために特に有用であろう。腫瘍環境は、例えば、ＣＤ７３発現免疫細胞、例えば、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞及び／又はＣＤ７３発現腫瘍細胞によって特徴付けられ得る。
【0196】
方法及び抗ＣＤ７３抗体は、様々な癌及び他の増殖性疾患の処置及び／又は予防に利用することができる。これらの方法は、リンパ球の抗腫瘍活性を阻害するアデノシンを減少させることにより、且つさらにおそらくリンパ球の抗腫瘍活性を増加させることができるＡＴＰを増加させることにより機能するため、特に腫瘍微小環境中のアデノシンが抗腫瘍免疫応答の抑制に強力な役割を果たし得る固形腫瘍を含む広範囲の癌に適用可能である。ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体で処置されるヒト患者は、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部の癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）、メラノーマ、子宮癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍の血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストにより誘導されるものを含む環境誘導性の癌、例えば多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫／縦隔原発性Ｂ細胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞型リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫及び前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫を含む血液系悪性腫瘍及び前記癌のいずれかの組み合わせを有する。本開示は、転移性癌の処置にも適用可能である。患者は、処置前、処置中又は処置後に上記臨床特性の１つ以上に対して試験又は選択され得る。
【0197】
方法及び抗ＣＤ７３抗体は、免疫細胞（例えば、リンパ球）の活性及び／又は浸潤を阻害するアデノシンを減少させることにより、且つさらにおそらくリンパ球の活性を増加させることができるＡＴＰを増加させることにより機能するため、好ましくはウイルス、細菌、原生動物、カビ又は真菌による感染によって引き起こされる任意の感染症を含む広範囲の感染症に適用可能である。
【0198】
ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、個体において（例えば、１、２、３、４週間及び／又はその後の抗原結合化合物の投与まで）、ＣＤ７３の酵素活性を中和することについて、少なくともＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００の血中濃度を達成及び／又は維持するのに有効な量で投与される。ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体の活性量は、個体の血管外組織において、ＣＤ７３の酵素活性を中和することについて、ＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００を達成するのに有効な量である。ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体の活性量は、個体において、ＣＤ７３の酵素活性の中和の阻害について、ＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００を達成（又は維持）するのに有効な量である。
【0199】
ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、個体において、ＡＭＰのアデノシンへのＣＤ７３媒介性異化の阻害（例えば、ＡＭＰのアデノシンへの加水分解を定量化することにより、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における５’エクトヌクレオチダーゼ活性の中和を評価することによる）について、少なくともＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００の血中濃度を達成及び／又は維持する（例えば、１、２、３、４週間及び／又はその後の抗ＣＤ７３抗体の投与まで）のに有効な量で投与される。ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体の量は、個体の血管外組織におけるＡＭＰのアデノシンへのＣＤ７３媒介性異化の阻害について、ＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０、任意選択により実質的にＥＣ１００を達成（又は維持）するのに有効な量である。
【0200】
ある実施形態において、個体の癌を処置又は予防するための方法であって、疾患を有する個体に、循環中の５０％、７０％の又は完全な（例えば、９０％）受容体飽和ＣＤ７３発現細胞に必要な濃度よりも高い（例えば、ＰＢＭＣで評価される）循環中の濃度を特定の期間、任意選択により目的の血管外組織（例えば、腫瘍又は腫瘍環境）において、達成又は維持する量の抗ＣＤ７３抗体を投与することを含む方法が提供される。任意選択により、達成される濃度は、特定された受容体飽和に必要な濃度よりも少なくとも２０％、５０％又は１００％高い。
【0201】
ある実施形態において、個体の癌を処置又は予防するための方法であって、個体に、ＣＤ７３発現細胞への結合について、ＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０又は任意選択によりＥＣ１００より高い（例えば、ＣＤ７３発現細胞、例えばＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で、抗ＣＤ７３抗体を滴定することによって評価される）循環中の濃度を特定の期間、任意選択により目的の血管外組織（例えば、腫瘍又は腫瘍環境）において、達成又は維持する量の抗ＣＤ７３抗体を投与することを含む方法が提供される。任意選択により、達成される濃度は、ＣＤ７３発現細胞に結合するために、ＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０又は任意選択によりＥＣ１００よりも、少なくとも２０％、５０％又は１００％高い。
【0202】
任意の実施形態において、抗体は、例えば、ヒトＰＢＭＣにおけるＣＤ７３発現細胞への結合について、０．５～１００ｎｇ／ｍｌ、任意選択により１～１００ｎｇ／ｍｌ、任意選択により３０～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約３０～９０ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０、任意選択によりＥＣ７０又は任意選択によりＥＣ１００を有し得る（例えば、ＣＤ７３発現細胞、例えばＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で抗ＣＤ７３抗体を滴定することによって評価される）。
【0203】
抗ＣＤ７３抗体によるＣＤ７３の酵素活性の中和のためのＥＣ５０は、例えば、約０．０１μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌ、任意選択により０．１μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、任意選択により０．１μｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌであり得る。例えば、ＥＣ５０は、約０．１μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ又は約０．３μｇ／ｍｌであり得る。したがって、この抗ＣＤ７３抗体の量は、例えば、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、任意選択により少なくとも０．２μｇ／ｍｌ、任意選択により少なくとも１μｇ／ｍｌ又は任意選択により少なくとも２μｇ／ｍｌの血中濃度を達成及び／又は維持するように投与される。
【0204】
血管系の外側の組織が標的とされる場合（腫瘍環境、例えば固形腫瘍の処置において）、循環中の対応する濃度を提供する用量と比較して典型的にはおよそ１０倍高い用量が必要であると考えられる。約１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌの循環（血液）濃度を達成（及び／又は維持）するために投与される抗ＣＤ７３抗体の量は、それぞれ約０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌの血管外組織（例えば、腫瘍組織）濃度を達成（及び／又は維持）することが予想される。
【0205】
ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、任意選択により少なくとも０．２μｇ／ｍｌ、任意選択により少なくとも１μｇ／ｍｌ又は任意選択により少なくとも２μｇ／ｍｌの組織（例えば、腫瘍環境）濃度を達成及び／又は維持する量で投与される。抗体は、例えば、少なくとも１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌ、例えば、１～１００μｇ／ｍｌ、１０～１００μｇ／ｍｌ、１～５０μｇ／ｍｌ、１～２０μｇ／ｍｌ又は１～１０μｇ／ｍｌの血中濃度を達成及び／又は維持する量で投与することができる。投与量は、投与後の特定の期間（例えば、１、２、３、４週間など）にわたり、所望の濃度の維持を提供するように調整することができる。
【0206】
いくつかの実施形態において、ある量の抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３の酵素活性の中和について、少なくともＥＣ７０又はＥＣ１００に対応する血液（血清）又は血管外組織（例えば、腫瘍環境）中の濃度を得るように投与される。抗体は、例えば、少なくとも約１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌの血中濃度又は血管外組織（例えば、腫瘍環境）を達成及び／又は維持する量で投与することができる。
【0207】
ＥＣ５０、ＥＣ７０又はＥＣ１００は、例えばＣＤ７３の酵素活性の中和に関する細胞アッセイで評価できる（例えば、ＡＭＰのアデノシンへの加水分解を定量化することによるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の５’エクトヌクレオチダーゼ活性の中和）。ＣＤ７３の酵素活性の中和に関する「ＥＣ５０」は、酵素活性の中和に関し、その最大反応又は、効果の５０％を生じる抗ＣＤ７３抗体の有効濃度を指す）。ＣＤ７３の酵素活性の中和に関する「ＥＣ７０」は、その最大反応又は効果の７０％を生じる抗ＣＤ７３抗体の有効濃度を指す。ＣＤ７３の酵素活性の中和に関する「ＥＣ１００」は、酵素活性のそのような中和に関し、その実質的に最大の反応又は効果を生じる抗ＣＤ７３抗体の有効濃度を指す。
【0208】
いくつかの実施形態において、特に固形腫瘍の処置について、達成される濃度は、酵素活性の中和について、少なくともＥＣ５０、任意選択により、約又は少なくとも約、ＥＣ１００に対応する組織（血管系の外側、例えば、腫瘍又は腫瘍環境）における濃度をもたらすように設計される。
【0209】
ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体の量は、１～２０ｍｇ／ｋｇ体重である。ある実施形態において、その量は、毎週、２週間ごと、毎月又は２ヶ月ごとに個体に投与される。
【0210】
ある実施形態において、少なくとも１つの投与サイクル（任意選択で少なくとも２、３、４又はそれを超える投与サイクル）にわたり、有効量の本開示の抗ＣＤ７３抗体を個体に投与することを含む、ヒト個体を処置する方法が提供され、ここで、サイクルは、８週間以下の期間であり、少なくとも１つのサイクルのそれぞれについて、１回、２回、３回又は４回の用量の抗ＣＤ７３抗体が１～２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、静脈内注入によって投与される。
【0211】
ヒトを処置するための適切な処置プロトコルは、例えば、本明細書に開示される量の抗ＣＤ７３抗体を患者に投与することを含み、ここで、方法は、少なくとも１用量の抗ＣＤ７３抗体が投与される少なくとも１つの投与サイクルを含む。任意選択により、少なくとも２、３、４、５、６、７又は８用量の抗ＣＤ７３抗体が投与される。ある実施形態において、投与サイクルは、２週間～８週間である。
【0212】
癌を有する患者は、腫瘍微小環境内の細胞（例えば、腫瘍細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞）でのＣＤ７３の発現を評価するための事前の検出ステップを伴って又は伴わずに抗ＣＤ７３抗体で処置することができる。任意選択により、処置方法は、個体の腫瘍からの生物学的試料（例えば、癌組織又は癌の近位又は周辺の組織、癌隣接組織、隣接非腫瘍組織又は正常な隣接組織）中のＣＤ７３核酸又はポリペプチドを検出するステップを含むことができる。生物学的試料がＣＤ７３を発現する細胞を含むという決定（例えば、参照、例えば健常組織と比較して、抗ＣＤ７３抗体による高レベルの高強度の染色でＣＤ７３を発現する）は、患者が、抗ＣＤ７３抗体による処置から大きい利益を有し得る癌を有することを示す。ある実施形態において、方法は、生物学的試料中のＣＤ７３核酸又はポリペプチドの発現のレベルを決定すること及びそのレベルを健常個体に対応する参照レベルと比較することを含む。生物学的試料が、参照レベル（例えば、健常組織）と比較して増加したレベルでＣＤ７３核酸又はポリペプチドを発現する細胞を含むという決定は、本開示の抗ＣＤ７３抗体で有利に処置することができる癌を患者が有することを示す。任意選択により、生物学的試料中のＣＤ７３ポリペプチドを検出することは、悪性細胞又はＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞又はＢ細胞の表面に発現されるＣＤ７３ポリペプチドを検出することを含む。
【0213】
個体が、ＣＤ７３ポリペプチドを発現する細胞によって特徴付けられる癌を有するかを決定することは、例えば、癌環境（例えば、腫瘍又は腫瘍隣接組織）からの細胞を含む個体から生物学的試料を（例えば、生検を実施することによって）取得すること、前記細胞をＣＤ７３ポリペプチドに結合する抗体と接触させること及び細胞がその表面にＣＤ７３を発現するかを検出することを含み得る。任意選択により、個体がＣＤ７３を発現する細胞を有するかどうかを決定することは、免疫組織化学アッセイを実施することを含む。
【0214】
本抗体組成物は、その抗体が投与されている特定の治療目的のために通常利用される薬剤を含む１つ以上の他の治療剤と組み合わせて有利に使用され得る。さらなる治療剤は、通常、処置されている特定の疾患又は状態に対する単剤療法においてその薬剤に対して一般的に使用される量及び治療計画で投与される。このような治療剤としては、抗癌剤及び化学療法剤が挙げられるが、限定されない。
【0215】
ある実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、ヒトＰＤ－１の阻害活性（例えばＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を阻害する）を中和する薬剤の有効性を増強する。したがって、ある実施形態において、第２の又はさらなる第２の治療剤は、ヒトＰＤ－１の阻害活性を中和する抗体又は他の薬剤である。
【0216】
プログラム死１（ＰＤ－１）（「プログラム細胞死１」とも呼ばれる）は、ＣＤ２８ファミリーの受容体の阻害性メンバーである。完全なヒトＰＤ－１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ６４８６３に見出すことができる。ＰＤ－１の阻害活性の阻害又は中和は、ＰＤ－Ｌ１誘導ＰＤ－１シグナル伝達を妨げるポリペプチド剤（例えば、抗体、Ｆｃドメインに融合したポリペプチド、イムノアドヘシンなど）の使用を含み得る。現在、市販又は臨床評価中のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を阻止する少なくとも６つの薬剤が存在する。１つの薬剤は、ＢＭＳ－９３６５５８（ニボルマブ／ＯＮＯ－４５３８、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、以前にはＭＤＸ－１１０６）である。ニボルマブ（商品名Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））は、ＰＤ－１及びＣＤ８０の両方へのＰＤ－Ｌ１リガンドの結合を阻害するＦＤＡ認可完全ヒトＩｇＧ４抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂであり、国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットにおいて抗体５Ｃ４として記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。メラノーマ患者では、３ｍｇ／ｋｇの用量で最も有意なＯＲが観察されたが、他の癌のタイプでは１０ｍｇ／ｋｇであった。ニボルマブは、一般に癌の進行まで３週間ごとに１０ｍｇ／ｋｇで投与される。「ヒトＰＤ－１の阻害活性を低下させる」、「ＰＤ－１を中和する」又は「ヒトＰＤ－１の阻害活性を中和する」という用語と、ＰＤ－１が、ＰＤ－１と、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２などの１つ以上のその結合パートナーとの間の相互作用から生じるシグナル伝達能力において阻害される過程を指す。ＰＤ－１の阻害活性を中和する薬剤は、ＰＤ－１と、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２などのその結合パートナーの１つ以上との間の相互作用に起因するシグナル伝達を減少、阻止、阻害又は抑制する。したがって、このような薬剤は、増殖、サイトカイン産生及び／又は細胞傷害性などのＴ細胞エフェクター機能を増強するように、Ｔリンパ球上に発現される細胞表面タンパク質によって媒介されるか又はそれを介した負の共刺激シグナルを減少させることができる。
【0217】
ランブロリズマブ又はペンブロリズマブ（商品名Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））とも呼ばれるＭＫ－３４７５（Ｍｅｒｃｋ社製ヒトＩｇＧ４抗ＰＤ１ｍＡｂ）は、メラノーマの治療のためにＦＤＡによって承認され、他の癌において試験されている。ペンブロリズマブは、疾患の進行まで２週間又は３週間ごとに２ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇで試験した。Ｍｅｒｃｋ３７４５又はＳＣＨ－９００４７５としても知られているＭＫ－３４７５は、国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットにも記載されている。
【0218】
ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ７４４６（アテゾリズマブ、商品名Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（商標）、Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社製の抗ＰＤ－Ｌ１）は、ＦｃγＲ結合及びその結果としての抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を最小限に抑えることによって効力及び安全性を最適化するように設計された、操作されたＦｃドメインを含むヒト抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂである。１、１０、１５及び２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量のＭＰＤＬ３２８０Ａを３週間ごとに最高１年間投与した。第３相試験では、ＭＰＤＬ３２８０ＡをＮＳＣＬＣにおいて３週間ごとに静脈内注入により１２００ｍｇで投与する。
【0219】
ＡＭＰ－２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ及びＧＳＫ）は、Ｆｃドメインに融合したＰＤ－Ｌ２細胞外ドメインを含むイムノアドヘシンである。ＰＤ－１を中和する薬剤の他の例は、ＰＤ－Ｌ２に結合する抗体（抗ＰＤ－Ｌ２抗体）を含み得、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を阻止する。
【0220】
ピディリズマブ（ＣＴ－０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）（ＣｕｒｅＴｅｃｈ／Ｔｅｖａ社製ヒト化ＩｇＧ１抗ＰＤ１ｍＡｂ）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１； ＣｕｒｅＴｅｃｈ）（例えば、国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレットを参照されたい）は、別の例である。薬剤は、リツキシマブ感受性再発性ＦＬを有する３０人の患者において試験され、患者は、４週間ごとの３ｍｇ／ｋｇでの静脈内ＣＴ－０１１の４回にわたる注入に、ＣＴ－０１１の最初の注入の２週間後に始まって毎週３７５ｍｇ／ｍ２で４週間にわたり投与されるリツキシマブを組み合わせて処置された。
【0221】
さらなる公知のＰＤ－１抗体及び他のＰＤ－１阻害剤としては、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫにライセンスされたＢ７－ＤＣ／ＩｇＧ１融合タンパク質）、国際公開第２０１２／１４５４９３号パンフレットに記載のＡＭＰ－５１４、国際公開第２０１１／０６６３８９号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１３／０３４５５９号明細書に記載の抗体ＭＥＤＩ－４７３６（デュルバルマブ、商品名Ｉｍｆｉｎｚｉ（商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅにより開発された抗ＰＤ－Ｌ１）、国際公開第２０１０／０７７６３４号パンフレットに記載の抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（抗ＰＤ－Ｌ１）、ＢＭＳ－９３６５５９としても知られているＭＤＸ－１１０５は、国際公開第２００７／００５８７４号パンフレットに記載のＢｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂにより開発された抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレット、国際公開第２００９／０１４７０８号パンフレット、国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレット及び国際公開第２０１３／０１９９０６号パンフレットに記載の抗体及び阻害剤が挙げられ、これらの開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。抗ＰＤ１抗体のさらなる例は、国際公開第２０１５／０８５８４７号パンフレット（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）に開示されており、例えばそれぞれ配列番号６、配列番号７及び／又は配列番号８の軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、２及び３並びにそれぞれ配列番号３、配列番号４又は配列番号５の抗体重鎖可変ドメインＣＤＲ１、２及び３を有する抗体であり、配列番号は、国際公開第２０１５／０８５８４７号パンフレットに従った付番であり、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１への結合についてこれらの抗体のいずれかと競合する抗体も使用することができる。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１中和剤は、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害する抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１中和剤は、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を阻害する抗ＰＤ１抗体である。代表的な抗ＰＤ－１抗体は、ペンブロリズマブである（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標）としてＭｅｒｃｋ＆Ｃｏから市販、参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットも参照されたい）。例示的な抗ＰＤ－Ｌ１は、抗体ＭＥＤＩ－４７３６（デュルバルマブ、商品名Ｉｍｆｉｎｚｉ（商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅによって開発された抗ＰＤ－Ｌ１）である。
【0222】
処置方法において、ＣＤ７３結合化合物及び第２の治療剤は、個別に、一緒に若しくは連続して又はカクテルにして投与し得る。いくつかの実施形態において、本抗原結合化合物は、第２の治療剤の投与前に投与される。例えば、ＣＤ７３結合化合物は、第２の治療剤の投与のおよそ０～３０日前に投与され得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ７３結合化合物は、第２の治療剤の投与の約３０分～約２週間、約３０分～約１週間、約１時間～約２時間、約２時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間、約８時間～１日又は約１～５日前に投与する。いくつかの実施形態において、ＣＤ７３結合化合物は、治療剤の投与と同時に投与する。いくつかの実施形態において、ＣＤ７３結合化合物は、第２の治療剤の投与後に投与する。例えば、ＣＤ７３結合化合物は、第２の治療剤の投与からおよそ０～３０日後に投与し得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ７３結合化合物は、第２の治療剤の投与から、約３０分～約２週間、約３０分～約１週間、約１時間～約２時間、約２時間～約４時間、約４時間～約６時間、約６時間～約８時間，約８時間～１日又は約１～５日後に投与する。
【実施例】
【0223】
方法
組換えｈｕＣＤ７３のクローニング、産生及び精製
分子生物学
ｈｕＣＤ７３タンパク質は、以下のプライマーＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＣＧ（配列番号２０）（フォワード）及びＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡｔｃａＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧｃｔｔｇａｔｃｃｇａｃｃｔｔｃａａｃｔｇ配列番号２１）（リバース）を使用して、ＭＩＡＰＡＣＡ－２ｃＤＮＡからクローン化された。次に、精製されたＰＣＲ産物を、ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングシステムを使用して発現ベクターにクローニングした。精製ステップのために、タンパク質のＣ末端部分に６ｘＨｉｓタグを加えた。
組換えｈｕＣＤ７３のクローニング、産生及び精製
分子生物学
ｈｕＣＤ７３タンパク質は、以下のプライマーＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＣＧ（配列番号２０）（フォワード）及びＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡｔｃａＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧｃｔｔｇａｔｃｃｇａｃｃｔｔｃａａｃｔｇ配列番号２１）（リバース）を使用して、ＭＩＡＰＡＣＡ－２ｃＤＮＡからクローン化された。次に、精製されたＰＣＲ産物を、ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングシステムを使用して発現ベクターにクローニングした。精製ステップのために、タンパク質のＣ末端部分に６ｘＨｉｓタグを加えた。
【0224】
クローン化ｈｕＣＤ７３のアミノ酸配列：
【化6】
【0225】
ｈｕＣＤ７３タンパク質の発現及び精製
クローン化された配列の検証後、細胞をヌクレオフェクトし、次に産生プールをサブクローニングして、ｈｕＣＤ７３タンパク質を産生する細胞クローンを得た。ローラーで増殖させたｈｕＣＤ７３クローンからの上清を回収し、Ｎｉ－ＮＴＡカラムを使用して精製し、２５０ｍＭイミダゾールを使用して溶出した。次に、精製したタンパク質をＳ２００サイズ排除クロマトグラフィーカラムに充填した。二量体に対応する精製タンパク質は、酵素活性アッセイのためにＴｒｉｓ ２０ｍＭ ｐＨ７．５、ＮａＣｌ １２０ｍＭ及びＣａＣｌ２ ４ｍＭ緩衝液で製剤化される一方、製剤緩衝液には２０％グリセロールが補充される。
クローン化された配列の検証後、細胞をヌクレオフェクトし、次に産生プールをサブクローニングして、ｈｕＣＤ７３タンパク質を産生する細胞クローンを得た。ローラーで増殖させたｈｕＣＤ７３クローンからの上清を回収し、Ｎｉ－ＮＴＡカラムを使用して精製し、２５０ｍＭイミダゾールを使用して溶出した。次に、精製したタンパク質をＳ２００サイズ排除クロマトグラフィーカラムに充填した。二量体に対応する精製タンパク質は、酵素活性アッセイのためにＴｒｉｓ ２０ｍＭ ｐＨ７．５、ＮａＣｌ １２０ｍＭ及びＣａＣｌ２ ４ｍＭ緩衝液で製剤化される一方、製剤緩衝液には２０％グリセロールが補充される。
【0226】
組換えＣＤ７３タンパク質のＡｂ ＫＤを評価するためのＳＰＲ分析
ＳＰＲ測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置で２５℃において行った。プロテイン－Ａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化された。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で活性化した。プロテイン－Ａを結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．６）中で１０μｇ／ｍＬに希釈し、適切な固定化レベルに達するまで（すなわち２０００ＲＵ）注入した。残りの活性化された基の失活は、１００ｍＭエタノールアミンｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。親和性研究は、製造業者（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｗｉｚａｒｄ）によって推奨される標準的なＣａｐｔｕｒｅ－Ｋｉｎｅｔｉｃプロトコルに従って実施した。１．２３～３００ｎＭの範囲のヒト組換え可溶性ＣＤ７３タンパク質の段階希釈液を、捕捉した抗ＣＤ７３抗体に順次注入し、再分化前に１０分間分離させた。センサーグラムセット全体を、１：１動態結合モデルを用いてフィッティングした。二価の親和性並びに動態結合速度定数及び解離速度定数が計算される。
ＳＰＲ測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置で２５℃において行った。プロテイン－Ａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化された。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で活性化した。プロテイン－Ａを結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．６）中で１０μｇ／ｍＬに希釈し、適切な固定化レベルに達するまで（すなわち２０００ＲＵ）注入した。残りの活性化された基の失活は、１００ｍＭエタノールアミンｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。親和性研究は、製造業者（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｗｉｚａｒｄ）によって推奨される標準的なＣａｐｔｕｒｅ－Ｋｉｎｅｔｉｃプロトコルに従って実施した。１．２３～３００ｎＭの範囲のヒト組換え可溶性ＣＤ７３タンパク質の段階希釈液を、捕捉した抗ＣＤ７３抗体に順次注入し、再分化前に１０分間分離させた。センサーグラムセット全体を、１：１動態結合モデルを用いてフィッティングした。二価の親和性並びに動態結合速度定数及び解離速度定数が計算される。
【0227】
抗体による抗ＣＤ７３認識を評価するためのフローサイトメトリー分析
ＦＣＳＢに再懸濁した１０５個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を丸底９６Ｗマイクロプレート（ウェルあたり５０μＬ）に分配した。抗ＣＤ７３ ｍＡｂの用量範囲をプレートに加え、細胞を＋５±３℃で１時間インキュベートした。プレートを４００ｇ、４℃で３分間回転させることにより、細胞をＦＣＳＢで３回洗浄した。ＦＣＳＢで希釈したＰＥ複合化ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次Ａｂを細胞に添加し、プレートを＋５±３℃でさらに３０分間インキュベートした。上記のように細胞を３回洗浄し、フローサイトメーターで分析した。
ＦＣＳＢに再懸濁した１０５個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を丸底９６Ｗマイクロプレート（ウェルあたり５０μＬ）に分配した。抗ＣＤ７３ ｍＡｂの用量範囲をプレートに加え、細胞を＋５±３℃で１時間インキュベートした。プレートを４００ｇ、４℃で３分間回転させることにより、細胞をＦＣＳＢで３回洗浄した。ＦＣＳＢで希釈したＰＥ複合化ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次Ａｂを細胞に添加し、プレートを＋５±３℃でさらに３０分間インキュベートした。上記のように細胞を３回洗浄し、フローサイトメーターで分析した。
【0228】
蛍光強度の中央値対ｍＡｂ濃度をグラフにプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）プログラムを使用してＥＣ５０を計算した。
【0229】
組換えヒト又はカニクイザルＣＤ７３を用いたインビトロ酵素アッセイ
簡潔には、組換えヒト又はカニクイザルＣＤ７３を、ある用量範囲の抗ＣＤ７３又はアイソタイプ対照ｍＡｂの存在下において白色の９６Ｗ平底マイクロプレートでインキュベートした。プレートを＋３７±１℃で１時間インキュベートした。ＡＴＰ（１２．５μＭ）及びＡＭＰ（１２５μＭ）を各ウェルに添加し、プレートを＋３７±１℃でさらに３０分間インキュベートした。ルシフェラーゼ／ルシフェリン含有ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに加え、プレートを暗所で室温において５分間インキュベートし、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して放出光を測定した。
・条件：
・ＡＴＰ＋ＡＭＰ：最大ルシフェラーゼ阻害（１００％）
・ＣＤ７３＋ＡＴＰ＋ＡＭＰ：ルシフェラーゼ阻害なし（０％）
簡潔には、組換えヒト又はカニクイザルＣＤ７３を、ある用量範囲の抗ＣＤ７３又はアイソタイプ対照ｍＡｂの存在下において白色の９６Ｗ平底マイクロプレートでインキュベートした。プレートを＋３７±１℃で１時間インキュベートした。ＡＴＰ（１２．５μＭ）及びＡＭＰ（１２５μＭ）を各ウェルに添加し、プレートを＋３７±１℃でさらに３０分間インキュベートした。ルシフェラーゼ／ルシフェリン含有ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに加え、プレートを暗所で室温において５分間インキュベートし、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して放出光を測定した。
・条件：
・ＡＴＰ＋ＡＭＰ：最大ルシフェラーゼ阻害（１００％）
・ＣＤ７３＋ＡＴＰ＋ＡＭＰ：ルシフェラーゼ阻害なし（０％）
【0230】
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７（商標）ソフトウェアを使用して、残留酵素活性と抗ＣＤ７３ Ａｂ濃度をグラフにプロットした。
【0231】
Ｔ細胞増殖アッセイ
健常ドナーから末梢血を採取し、フィコール勾配で単核細胞を単離した。リンパ球は、５２％Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配（細胞ペレット）でさらに濃縮され、２μＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色された。５×１０４～１×１０５の染色細胞を９６ｗ丸底プレートに分配し、抗ＣＤ７３ Ａｂと共に３７℃で１時間インキュベートし、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングビーズを添加して３～５日間活性化した。Ｔ細胞増殖の阻害は、２００μＭのＡＭＰを添加することで達成された。Ｔ細胞増殖及びＡＭＰの免疫抑制効果を遮断するＡｂの能力は、増殖するＴ細胞の色素希釈を定量化することによりフローサイトメトリーによって評価された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して、抗ＣＤ７３Ａｂ濃度に対する増殖Ｔ細胞のパーセンテージをグラフにプロットした。一部の実験は、健常ドナー又は癌患者からのＰＢＭＣ全体で行われた。プロトコルは、Ｔ細胞抑制が０．５～１ｍＭのＡＴＰの添加によって達成されたことを除いて上記のとおりであった。
健常ドナーから末梢血を採取し、フィコール勾配で単核細胞を単離した。リンパ球は、５２％Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配（細胞ペレット）でさらに濃縮され、２μＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色された。５×１０４～１×１０５の染色細胞を９６ｗ丸底プレートに分配し、抗ＣＤ７３ Ａｂと共に３７℃で１時間インキュベートし、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングビーズを添加して３～５日間活性化した。Ｔ細胞増殖の阻害は、２００μＭのＡＭＰを添加することで達成された。Ｔ細胞増殖及びＡＭＰの免疫抑制効果を遮断するＡｂの能力は、増殖するＴ細胞の色素希釈を定量化することによりフローサイトメトリーによって評価された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用して、抗ＣＤ７３Ａｂ濃度に対する増殖Ｔ細胞のパーセンテージをグラフにプロットした。一部の実験は、健常ドナー又は癌患者からのＰＢＭＣ全体で行われた。プロトコルは、Ｔ細胞抑制が０．５～１ｍＭのＡＴＰの添加によって達成されたことを除いて上記のとおりであった。
【0232】
ドナー又は患者を比較するために、Ｔ細胞増殖は、以下の式を使用して正規化された。
【数1】
【0233】
同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ
健常ドナーからの単核細胞をフィコール勾配で単離し、単球をＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用した免疫磁気選択によって精製した。単球は、ＧＭ－ＣＳＦ（４００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で５～７日間培養することにより、樹状細胞（ＭｏＤＣ）に分化した。ＤＣ回復の日、同種異系ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、非ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の免疫磁気枯渇によって精製され、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔで染色された。ＤＣ（１０４細胞／ウェル）及びＴ細胞（５×１０４細胞／ウェル）を９６Ｗ丸底マイクロプレートである用量範囲の抗ｈｕＣＤ７３抗体及び固定用量のＡＴＰの存在下において混合した。Ｔ細胞増殖及びＡＴＰ媒介性抑制を逆転させるＡｂの能力は、Ｔ細胞増殖アッセイについて記載されているように評価された。
健常ドナーからの単核細胞をフィコール勾配で単離し、単球をＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用した免疫磁気選択によって精製した。単球は、ＧＭ－ＣＳＦ（４００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で５～７日間培養することにより、樹状細胞（ＭｏＤＣ）に分化した。ＤＣ回復の日、同種異系ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、非ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の免疫磁気枯渇によって精製され、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔで染色された。ＤＣ（１０４細胞／ウェル）及びＴ細胞（５×１０４細胞／ウェル）を９６Ｗ丸底マイクロプレートである用量範囲の抗ｈｕＣＤ７３抗体及び固定用量のＡＴＰの存在下において混合した。Ｔ細胞増殖及びＡＴＰ媒介性抑制を逆転させるＡｂの能力は、Ｔ細胞増殖アッセイについて記載されているように評価された。
【0234】
実施例１：ヒトフレームワーク配列を用いた抗ｈｕＣＤ７３抗体のモデリング及び生成
それぞれ配列番号２７及び２８のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する、ＰＣＴ公開国際公開第２０１６／０５５６０９号パンフレットに記載されている親抗体３Ｃ１２は、ＩＧＨＪ４＊０１（ＦＲ４）と共に、ヒトサブグループＩＧＨＶ１－３＊０１からの重鎖フレームワーク（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３）のＶＨへの導入及びＩＧＫＪ２＊０１（ＦＲ４）と共に、ヒトサブグループＩＧＫＶ１－３３＊０１からの軽鎖フレームワーク（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３）のＶＬへの導入によって改変された。
それぞれ配列番号２７及び２８のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する、ＰＣＴ公開国際公開第２０１６／０５５６０９号パンフレットに記載されている親抗体３Ｃ１２は、ＩＧＨＪ４＊０１（ＦＲ４）と共に、ヒトサブグループＩＧＨＶ１－３＊０１からの重鎖フレームワーク（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３）のＶＨへの導入及びＩＧＫＪ２＊０１（ＦＲ４）と共に、ヒトサブグループＩＧＫＶ１－３３＊０１からの軽鎖フレームワーク（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３）のＶＬへの導入によって改変された。
【0235】
異なるヒトＶＨ及びＶＬ遺伝子セグメントに基づく３次元モデルを重ね合わせ、全てのアミノ酸の差異を１つずつ精査した。インシリコでの分子設計は、親キメラ（ＨＰＬＰ）抗体及びヒト化（Ｈ０Ｌ０）抗体の両方の３Ｄモデルを使用して検証された。あらゆる重要な低エネルギー結合を特定し、その破壊を回避するために、残基間の鎖内及び鎖外結合も評価された。
【0236】
設計された各ドメインのＶＨ及びＶＬ配列は、それぞれＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換を有するｈｕＩｇＧ１由来の定常ドメイン及びｈｕＣｋ定常ドメインを含むベクターにクローニングされた。得られた２つのベクターをＣＨＯ細胞株に同時導入した。確立された細胞プールを使用して、ＣＨＯ培地で抗体を産生した。次に、プロテインＡを使用して抗体を精製した。Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換（Ｎ２９７結合型グリコシル化を保持）を含むＦｃドメインを含む、ヒトＩｇＧ１定常領域を有する３Ｃ１２のキメラＦａｂバージョンのモデリングに使用された重鎖及び軽鎖配列は、以下のとおりである。
【0237】
ＨＰ Ｆａｂ重鎖（可変ドメインに下線）
【化7】
【0238】
ＬＰ Ｆａｂ軽鎖（可変ドメインに下線）
【化8】
【0239】
Ｈ０ Ｆａｂ重鎖（可変ドメインに下線）
【化9】
【0240】
Ｌ０ Ｆａｂ軽鎖（可変ドメインに下線）
【化10】
【0241】
ＨＰＬＰ親抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を以下に示す。
【0242】
ＨＰ ＶＨ
【化11】
【0243】
ＬＰ ＶＬ
【化12】
【0244】
重鎖設計
残基Ｉ２（Ｋａｂａｔ付番によると位置２）がＣＤＲ＿Ｈ３－Ｙ１０９と疎水性結合を形成し、ＣＤＲ＿Ｈ３の配置又は柔軟性に役割を果たすかを調べるために、位置２のバリン残基をイソロイシンに置換した。Ｖ２及びＩ２の側鎖は、２つのモデルで一致していない。Ｖ２もＨ０－Ｙ１０９（Ｋａｂａｔ Ｙ１０８）と疎水性結合を形成するが、Ｙ１０９の位置は、わずかに変わり、Ｈ０－Ｙ１０９は、ＬＣ－Ｙ５５（Ｋａｂａｔ Ｙ５４）と水素結合を形成する。Ｙ５５は、ＣＤＲ＿Ｌ２残基である。Ｖ２置換は、ＣＤＲ＿Ｈ３とＣＤＲ＿Ｌ２との両方の位置に影響し得る。
残基Ｉ２（Ｋａｂａｔ付番によると位置２）がＣＤＲ＿Ｈ３－Ｙ１０９と疎水性結合を形成し、ＣＤＲ＿Ｈ３の配置又は柔軟性に役割を果たすかを調べるために、位置２のバリン残基をイソロイシンに置換した。Ｖ２及びＩ２の側鎖は、２つのモデルで一致していない。Ｖ２もＨ０－Ｙ１０９（Ｋａｂａｔ Ｙ１０８）と疎水性結合を形成するが、Ｙ１０９の位置は、わずかに変わり、Ｈ０－Ｙ１０９は、ＬＣ－Ｙ５５（Ｋａｂａｔ Ｙ５４）と水素結合を形成する。Ｙ５５は、ＣＤＲ＿Ｌ２残基である。Ｖ２置換は、ＣＤＲ＿Ｈ３とＣＤＲ＿Ｌ２との両方の位置に影響し得る。
【0245】
２８位及び３０位の残基（フレームワーク１、Ｋａｂａｔによると２８位及び３０位）が抗原への結合に影響を与えるかどうかを調べるために、これらの位置をアラニンで置換した。親抗体は、Ｈ０Ｌ０抗体のＹＴＦＴと比較して配列ＹＡＦＡを有する。残基Ａ２８及びＡ３０は、パラトープに近い分子表面に露出している。２８位のスレオニンは、抗原への結合に悪影響を与える可能性が高いようである。一方、Ａ３０は、重要ではないようであった。
【0246】
４４位（Ｋａｂａｔ ４４ともいう）の残基がＶＨ／ＶＬ境界部で役割を果たすかどうかを調べるために、この残基を逆変異させ、それにより親抗体に存在するセリンを保存した。親抗体は、Ｈ０Ｌ０抗体のＧＱＲと比較して配列ＧＫＳを有する。Ｒ４４は、ＶＨ／ＶＬ境界部にあり、Ｌ４５側鎖に非常に近い位置にある。
【0247】
４８位（Ｋａｂａｔ ４８ともいう）の残基が重要であるかどうかを調べるために、この残基を逆変異させ、それにより親抗体に存在する残基を保存した。親抗体は、Ｈ０Ｌ０抗体のＷＭＧと比較して配列ＷＩＧを有する。Ｉ４８及びＭ４８は、ＣＤＲ＿Ｈ２の直下の重要な位置を占めているようであり、複雑な疎水性ネットワークに関与している。
【0248】
６７位（Ｋａｂａｔ位置６６）及び６８位（Ｋａｂａｔ位置６７）の残基の重要性を調べるために、これらの残基を逆変異させ、それにより親抗体に存在する残基を保存した。親抗体は、Ｈ０Ｌ０抗体のＲＶＴと比較して配列ＫＡＴを有する。Ｆ６４（Ｋａｂａｔ Ｆ６３）とＫ６７／Ｒ６７（Ｋａｂａｔ Ｋ６６／Ｒ６６）との間のループは、２つのモデルで非常に異なる立体構造を示す。Ａ６８（Ｋａｂａｔ ６７）は、バーニア残基である。
【0249】
Ａｂｎｕｍ位置７０（Ｋａｂａｔ位置６９）の残基の役割を調べるために、この残基を逆変異させ、それにより親抗体に存在するロイシンを保存した。親抗体は、Ｈ０Ｌ０抗体のＴＩＴと比較して配列ＴＬＴを有する。Ｌ７０及びＩ７０（Ｋａｂａｔ Ｌ６９及びＩ６９）は、複雑な疎水性ネットワークに関与している。
【0250】
７２位（Ｋａｂａｔ ７１）の残基の役割を調べるために、この残基を逆変異させ、それにより親抗体に存在するセリンを保存した。親抗体は、Ｈ０Ｌ０抗体のＴＲＤと比較して配列ＴＶＤを有する。Ｖ７２及びＲ７２（Ｋａｂａｔ Ｖ７１及びＲ７１）は、ＣＤＲ＿Ｈ２の直下の重要な位置を占める。残基Ｖ７２の遠位親水性側鎖は、分子表面に突出し、Ｎ５５（Ｋａｂａｔ Ｎ５４）と水素結合を形成する。Ｎ５５は、両方のモデルで同じ位置を占める。しかし、Ｒ７２（Ｋａｂａｔ Ｒ７１）との水素結合は、対応するループの柔軟性を低下させ得る。したがって、Ｈ０Ｌ０で親バリンをアルギニンに置換することによる抗原結合への影響は、予測できない。
【0251】
７４位（Ｋａｂａｔ ７３）の残基が抗原への結合に影響を与えるかどうかを調べるために、この残基を逆変異させ、それにより親抗体に存在するセリンを保存した。親抗体は、Ｈ０Ｌ０抗体のＤＴＳと比較して配列ＤＫＳを有する。Ｋ７４及びＴ７４（Ｋａｂａｔ Ｋ７３及びＴ７３）は、パラトープに近い分子表面に露出しており、抗原結合に関与している可能性がある。
【0252】
配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有する第１の重鎖変異体（Ｈ１）は、Ｖ２Ｉ及びＴ７３Ｋ置換を有していた。配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する第２の重鎖（Ｈ２）変異体は、置換Ｖ２Ｉ、Ｔ２８Ａ、Ｒ７１Ｖ及びＴ７３Ｋを有していた。配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有する第３の重鎖変異体（Ｈ３）は、置換Ｖ２Ｉ、Ｔ２８Ａ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６６Ｋ、Ｖ６７Ａ、Ｒ７１Ｖ及びＴ７３Ｋを有していた。配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有する第４の重鎖変異体（Ｈ４）は、置換Ｖ２Ｉ、Ｔ２８Ａ、Ｔ３０Ａ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６６Ｋ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９Ｌ、Ｒ７１Ｖ及びＴ７３Ｋを有していた。置換の付番は、Ｋａｂａｔによる。
【0253】
軽鎖設計
親抗体は、Ｈ０Ｌ０抗体のＤＩＱＭと比較して配列ＤＶＶＭを有する。残基Ｖ２は、Ａ２５と疎水性結合を形成する。残基Ｉ２は、パラトープ表面に露出している可能性があるが、パラトープの構成への影響は、予測できない。Ｉ２は、Ａ２５と疎水性結合を形成せず、これによりＣＤＲ－Ｌ１の位置がわずかに変わり得る。したがって、残基２のイソロイシンは、バリンで置換された。
親抗体は、Ｈ０Ｌ０抗体のＤＩＱＭと比較して配列ＤＶＶＭを有する。残基Ｖ２は、Ａ２５と疎水性結合を形成する。残基Ｉ２は、パラトープ表面に露出している可能性があるが、パラトープの構成への影響は、予測できない。Ｉ２は、Ａ２５と疎水性結合を形成せず、これによりＣＤＲ－Ｌ１の位置がわずかに変わり得る。したがって、残基２のイソロイシンは、バリンで置換された。
【0254】
親抗体は、Ｈ０Ｌ０抗体のＰＳＲと比較して配列ＰＤＲを有する。残基Ｒ６１は、回転異性体の位置を占める。ループは、同じ方向を向いているように見えるが、重なり合っていない（ドメイン全体のグローバル翻訳に対応する横方向翻訳）。親抗体では、Ｄ６０は、ＣＤＲ－Ｌ２－Ｒ５４と塩橋及び水素結合を形成する。Ｈ０Ｌ０抗体では、残基Ｓ６０は、Ｒ５４と接触しない。Ｒ５４は、回転異性体の位置を占める。Ｄ６０との接触は、ＣＤＲ－Ｌ２残基に特定の適切な位置を課すために重要であり得る。したがって、Ｈ０Ｌ０抗体の６０位のアスパラギン酸残基は、セリンで置換された。
【0255】
親抗体は、Ｈ０Ｌ０抗体のＧＳＧと比較して配列ＧＹＧを有する。残基Ｙ６７がパラトープに寄与するかどうかを調べるために、Ｈ０Ｌ０抗体のセリンをチロシンに置換した。
【0256】
親抗体は、Ｈ０Ｌ０抗体のＹＹＣと比較して配列ＹＦＣを有する。Ｙ８７は、隣接する残基と水素結合を形成するように見えないが、この残基の役割を調べ、Ｈ０Ｌ０の８７位のチロシンをフェニルアラニンで置換した。
【0257】
配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有する第１の軽鎖変異体（Ｌ１）は、置換Ｓ６７Ｙを有していた。配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する第２の軽鎖（Ｌ２）変異体は、置換Ｓ６０Ｄ及びＳ６７Ｙを有していた。配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する第３の軽鎖変異体（Ｌ３）は、置換Ｉ２Ｖ、Ｓ６０Ｄ及びＳ６７Ｙを有していた。配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有する第４の軽鎖変異体（Ｌ４）は、置換Ｉ２Ｖ、Ｓ６０Ｄ、Ｓ６７Ｙ及びＹ８７Ｆを有していた。
【0258】
それぞれの重鎖（表１の「Ｈ」鎖）及び軽鎖（表１の「Ｌ」鎖）可変領域のアミノ酸配列を以下の表１に示す。
【0259】
【表1】
【0260】
以下の表２に示す重鎖及び軽鎖の組み合わせを有する抗体が産生された。
【0261】
【表2】
【0262】
実施例２：ＳＰＲによる可溶性ＣＤ７３タンパク質への結合
実施例１の表２の抗体の結合は、ヒト可溶性二量体ＣＤ７３タンパク質への結合について試験され、クローン化され、産生され、精製された。ヒト化変異体の親和性並びに結合定数及び解離定数は、ＳＰＲ分析によって評価された。表３は、計算された全ての定数をまとめたものである。
実施例１の表２の抗体の結合は、ヒト可溶性二量体ＣＤ７３タンパク質への結合について試験され、クローン化され、産生され、精製された。ヒト化変異体の親和性並びに結合定数及び解離定数は、ＳＰＲ分析によって評価された。表３は、計算された全ての定数をまとめたものである。
【0263】
完全ヒトＩＧＨＶ１－３＊０１及びＩＧＨＪ４＊０１重鎖フレームワーク並びに完全ヒトＩＧＫＶ１－３３＊０１及びＩＧＫＪ２＊０１軽鎖フレームワークを有するＨ０Ｌ０抗体は、６５ｎＭのＫＤをもたらした。表３に示すように、ヒト化変異体ＨｘＬ０（Ｈ１Ｌ０、Ｈ２Ｌ０、Ｈ３Ｌ０及びＨ４Ｌ０）は、他の変異体と同等の結合定数を示したが、より速い解離プロファイルを有する。したがって、ＨｘＬ０変異体のＫＤは、他の全ての変異体で観察されたものよりも高かった（表３）。したがって、ヒト化変異体への完全ヒトＩＧＫＶ１－３３＊０１及びＩＧＫＪ２＊０１軽鎖アミノ酸配列の導入は、ＣＤ７３に対するヒト化Ａｂに対する親和性に有害であるように思われる。
【0264】
しかし、他の全てのヒト化変異体は、キメラ親３Ｃ１２抗体（０．６８ｎＭ）と同様のＣＤ７３に対する親和性を有していた。とりわけ、完全ヒト未修飾ＩＧＨＶ１－３＊０１及びＩＧＨＪ４＊０１重鎖フレームワークを含む全ての重鎖は、ＣＤ７３への高親和性結合を提供した。
【0265】
【表3】
【0266】
実施例３：フローサイトメトリーによるヒトＣＤ７３を発現する細胞への結合
表２のヒト化抗体の結合は、フローサイトメトリーによってＣＤ７３発現細胞への結合について試験された。図１に示すように、試験した全てのＡｂは、ヒトＣＤ７３タンパク質を認識した。ｈｕＣＤ７３に対する結合の有効性は、親抗体よりも効率が低いＨ０Ｌ０、Ｈ２Ｌ０及びＨ３Ｌ０を除き、ヒト化変異体とキメラ形式との間で類似していた。これらの観察結果は、ＨｘＬ０変異体（Ｈ１Ｌ０、Ｈ２Ｌ０、Ｈ３Ｌ０及びＨ４Ｌ０）に対する親和性がより低いことを示したＳＰＲデータと一致している。その結果、未修飾の完全ヒトＩＧＨＶ１－３＊０１及びＩＧＨＪ４＊０１重鎖フレームワークを含む全ての重鎖は、親抗体と同等のＣＤ７３発現細胞への優れた結合を提供した。
表２のヒト化抗体の結合は、フローサイトメトリーによってＣＤ７３発現細胞への結合について試験された。図１に示すように、試験した全てのＡｂは、ヒトＣＤ７３タンパク質を認識した。ｈｕＣＤ７３に対する結合の有効性は、親抗体よりも効率が低いＨ０Ｌ０、Ｈ２Ｌ０及びＨ３Ｌ０を除き、ヒト化変異体とキメラ形式との間で類似していた。これらの観察結果は、ＨｘＬ０変異体（Ｈ１Ｌ０、Ｈ２Ｌ０、Ｈ３Ｌ０及びＨ４Ｌ０）に対する親和性がより低いことを示したＳＰＲデータと一致している。その結果、未修飾の完全ヒトＩＧＨＶ１－３＊０１及びＩＧＨＪ４＊０１重鎖フレームワークを含む全ての重鎖は、親抗体と同等のＣＤ７３発現細胞への優れた結合を提供した。
【0267】
実施例４：組換え可溶性ヒトＣＤ７３タンパク質を用いたインビトロ酵素アッセイ
組換えＣＤ７３タンパク質の酵素活性を阻害するヒト化変異体の有効性を親抗体と比較した（図２）。
組換えＣＤ７３タンパク質の酵素活性を阻害するヒト化変異体の有効性を親抗体と比較した（図２）。
【0268】
図２（パネルＡ）に示すように、ＡＴＰ及びＣＴＧ基質を混合すると、高レベルの発光が測定された。ＡＭＰを反応ミックスに添加すると、ＣＴＧ反応が阻害され、発光が減少した。ＡＭＰを加水分解するｒｈＣＤ７３タンパク質の存在下で発光レベルが回復した。ヒト化変異体によるＣＤ７３酵素活性の遮断を図２に示す。
【0269】
結果は、親抗体と比較して活性が低下したＬ０変異体（Ｈ０Ｌ０、Ｈ１Ｌ０、Ｈ２Ｌ０、Ｈ３Ｌ０及びＨ４Ｌ０）を除いて、全てのヒト化変異体が可溶性ＣＤ７３タンパク質の酵素活性の強力な阻害を示すことを示した。しかし、驚くべきことに、ほとんどの抗体では、効力は親抗体の効力よりも幾分低かった。Ｈ１Ｌ４及び全てのＨ４変異体のみが親抗体と同様の効力で酵素活性を遮断した。
【0270】
これらの実験は、ＩＧＫＶ１－３３＊０１及びＩＧＫＪ２＊０１配列をアクセプターフレームワークとして使用した場合、重鎖の逆突然変異の数とは無関係に、軽鎖に突然変異が存在しないことにより、可溶性ＣＤ７３タンパク質の活性を阻害する能力が有意に減少することを示した。
【0271】
ＣＤ７３タンパク質活性遮断の最高の有効性は、Ｈ１Ｌ４変異体及びＨ４Ｌ０以外のＨ４Ｌｘ変異体（すなわちＨ４Ｌ１、Ｈ４Ｌ２、Ｈ４Ｌ３及びＨ４Ｌ４）で達成された。
【0272】
実施例５：Ｔ細胞増殖アッセイ
高い抑制効果を誘導し、親３Ｃ１２抗体の存在下で増殖の回復を可能にするＡＭＰの濃度を確立するために、Ｔ細胞増殖を阻害できるＡＭＰの濃度を２つの一連の実験で試験した。濃縮されたリンパ球画分は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ及びある用量範囲のＡＭＰ（５０μＭ～１．６ｍＭ～５０μＭ）の存在下で３日間インキュベートされた。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の回復の最高の割合は、２つの一連の実験において、それぞれ０．２～０．８ｍＭ及び０．２～１ｍＭのＡＭＰで観察された。
高い抑制効果を誘導し、親３Ｃ１２抗体の存在下で増殖の回復を可能にするＡＭＰの濃度を確立するために、Ｔ細胞増殖を阻害できるＡＭＰの濃度を２つの一連の実験で試験した。濃縮されたリンパ球画分は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ及びある用量範囲のＡＭＰ（５０μＭ～１．６ｍＭ～５０μＭ）の存在下で３日間インキュベートされた。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の回復の最高の割合は、２つの一連の実験において、それぞれ０．２～０．８ｍＭ及び０．２～１ｍＭのＡＭＰで観察された。
【0273】
ヒト化変異体及び親抗体の能力を２つの一連の実験で評価し、０．８ｍＭのＡＭＰによって阻害されたＴ細胞増殖を回復する能力を比較した。
【0274】
図３に示すように、ＨｘＬ０変異体を除いて、キメラ及びヒト化抗体は、Ｔ細胞増殖を回復することができた（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋亜集団の両方について）。増殖を回復するそれらの能力にもかかわらず、ヒト化変異体の大部分の効力は、親抗体と比較して低かった。Ｈ０Ｌ４、Ｈ１Ｌ４及びＨ４Ｌ４変異体は、親抗体の完全な効力を達成しなかったものの、親抗体と同様のレベルの効力を示した。
【0275】
第２の実験は、Ｌ０変異体がアイソタイプ対照に置き換えられたことを除いて、同じ実験条件で実施された。結果を図４に示す。
【0276】
図３に示したものと同様に、ＨｘＬ０変異体を除いて、キメラ及びヒト化抗体は、Ｔ細胞増殖を回復することができた（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋亜集団の両方について）。しかし、増殖を回復するそれらの能力にもかかわらず、ヒト化変異体の大部分の効力は、この場合にも親抗体と比較して幾分低かった。Ｈ０Ｌ４、Ｈ１Ｌ４及びＨ４Ｌ４変異体は、親抗体の効率に最も近づいた。
【0277】
実施例６：新しいフレームワーク及びＣＤＲ変異体の設計
驚くべきことに、前述の例は、フローサイトメトリー滴定とＣＤ７３の酵素活性の阻害における効力との間に直接的な相関関係がないことを示した。興味深いことに、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４変異体は、ＳＰＲアッセイ及びＣＤ７３発現細胞のフローサイトメトリーにおけるＣＤ７３組換えタンパク質への結合親和性に基づいて本質的に区別できなかったが、Ｈ２及びＨ３変異体は、実施例５のＴ細胞増殖を回復する能力において、Ｈ４変異体よりも機能アッセイにおいて効力が低かった。１つの可能性は、ＣＤ７３を阻害する効力に有害であった（しかし、ＣＤ７３に対する結合親和性には有害でなかった）Ｈ２及びＨ３フレームワークに導入された突然変異が、Ｈ４変異体フレームワークに導入された突然変異によって代償されたことである。その結果、重鎖フレームワーク及び／又はＣＤＲ残基に置換を有する新しい変異体が設計された。これらの観察に基づいて、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４鎖で行われた置換は、機能に重要であると考えられる残基、機能に影響を与えない可能性が高い残基、機能に負の影響を与える残基及び機能を回復させる残基のいずれかに分類された。
驚くべきことに、前述の例は、フローサイトメトリー滴定とＣＤ７３の酵素活性の阻害における効力との間に直接的な相関関係がないことを示した。興味深いことに、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４変異体は、ＳＰＲアッセイ及びＣＤ７３発現細胞のフローサイトメトリーにおけるＣＤ７３組換えタンパク質への結合親和性に基づいて本質的に区別できなかったが、Ｈ２及びＨ３変異体は、実施例５のＴ細胞増殖を回復する能力において、Ｈ４変異体よりも機能アッセイにおいて効力が低かった。１つの可能性は、ＣＤ７３を阻害する効力に有害であった（しかし、ＣＤ７３に対する結合親和性には有害でなかった）Ｈ２及びＨ３フレームワークに導入された突然変異が、Ｈ４変異体フレームワークに導入された突然変異によって代償されたことである。その結果、重鎖フレームワーク及び／又はＣＤＲ残基に置換を有する新しい変異体が設計された。これらの観察に基づいて、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４鎖で行われた置換は、機能に重要であると考えられる残基、機能に影響を与えない可能性が高い残基、機能に負の影響を与える残基及び機能を回復させる残基のいずれかに分類された。
【0278】
以下に示すアミノ酸配列（配列番号３７；アミノ酸置換は太字、Ｋａｂａｔ ＣＤＲは下線）を有する「Ｈ４＋」と呼ばれる新しい重鎖変異体が設計され、これは、（それぞれ配列番号３３、３４、３５及び３６の）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４軽鎖と組み合わされて、４つの新しい抗体、Ｈ４＋Ｌ１、Ｈ４＋Ｌ２、Ｈ４＋Ｌ３及びＨ４＋Ｌ４を生成した。
【0279】
Ｈ４＋ＶＨ：
【化13】
【0280】
Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む完全なＨ４＋重鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
【化14】
【0281】
Ｈ４＋Ｌ１抗体には、ヒトＣｋａｐｐａドメインを含むＬ１軽鎖が含まれており、その完全な配列を以下に示す。
【化15】
【0282】
同じフレームワーク置換が、重鎖と軽鎖のＣＤＲが異なる抗体にどのように影響するかを調べるために、共通の重鎖及び４つの異なる軽鎖の１つを有する４つの抗体のシリーズをさらに産生した。「２Ｈ４＋」と呼ぶ共通の重鎖は、ＨＣＤＲ２のＫａｂａｔ位置５９（Ｑ５９）のグルタミン（すなわちＨ４＋鎖と比較したＬ５９Ｑ置換）、ＨＣＤＲ２のＫａｂａｔ残基６０（Ｋ６０）のリシン（すなわちＨ４＋鎖と比較したＴ６０Ｋ置換）及びＨＣＤＲ３のＫａｂａｔ位置９７（Ｎ９７）のアスパラギン（すなわちＨ４＋鎖と比較したＧ９７Ｎ置換）を有していた。２Ｌ１、２Ｌ２、２Ｌ３及び２Ｌ４と呼ぶ４つの軽鎖は、それぞれＬ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４鎖と同じフレームワーク残基を有し、ＬＣＤＲ１のＫａｂａｔ位置３０（Ｔ３０）のスレオニン（すなわちＬ１～Ｌ４鎖と比較したＳ３０Ｔ置換）及びＬＣＤＲ２のＫａｂａｔ残基５３（Ｎ５３）のアスパラギン（すなわちＬ１－Ｌ４鎖と比較したＴ５３Ｎ置換）の存在でＬ１～Ｌ４鎖からのそのＣＤＲと異なっていた。得られた４つの新しい抗体は、以下で２Ｈ４＋２Ｌ１、２Ｈ４＋２Ｌ２、２Ｈ４＋２Ｌ３及び２Ｈ４＋２Ｌ４と呼ぶ（表４を参照されたい）。マウスフレームワークでＣＤＲを共有する親抗体は、２ＨＰ及び２ＬＰと呼ばれる重鎖及び軽鎖の可変領域（以下の表５に示すアミノ酸配列）で産生された。
【0283】
実施例１のように、全ての抗体は、Ｆｃ受容体結合を減少させるためにＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプとして産生された。
【0284】
【表4】
【0285】
【表5】
【0286】
Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む完全な２Ｈ４＋重鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
【化16】
【0287】
ヒトＣｋａｐｐａドメインを含む抗体の完全な２Ｌ１軽鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
【化17】
【0288】
実施例７：組換えＣＤ７３タンパク質を用いたインビトロ酵素アッセイの新しい変異体の研究
実施例４に記載の方法を使用して、組換えＣＤ７３タンパク質の酵素活性を阻害するヒト化変異体の有効性を親抗体と比較した。実施例６で産生された全ての新しいヒト化変異体は、ＣＤ７３タンパク質の活性を強力に阻害した。
実施例４に記載の方法を使用して、組換えＣＤ７３タンパク質の酵素活性を阻害するヒト化変異体の有効性を親抗体と比較した。実施例６で産生された全ての新しいヒト化変異体は、ＣＤ７３タンパク質の活性を強力に阻害した。
【0289】
Ｈ４＋Ｌｘ抗体は、その親抗体と同程度に効率的でであった。さらに、全ての２Ｈ４＋２Ｌｘ（２Ｈ４＋Ｌ１、２Ｈ４＋Ｌ２、２Ｈ４＋Ｌ３及び２Ｈ４＋Ｌ４）変異体は、Ｈ４＋Ｌｘ変異体と比較してＣＤ７３阻害の効力の増加を示した。２Ｈ４＋２Ｌｘ変異体は、親２ＨＰ２ＬＰ抗体と同様の効果でＣＤ７３の活性を阻害した。
【0290】
異なる濃度のＣＤ７３タンパク質（５０、１００、２００、４００ｎｇ／ｍＬ）を使用してさらなる実験を実施した。この実験の目的は、大量のＣＤ７３タンパク質の活性を遮断するヒト化抗体の能力を研究することであった。この場合にも、２Ｈ４＋２Ｌｘ変異体は、親２ＨＰ２ＬＰ抗体と同程度に強力であった。
【0291】
実施例８：カニクイザルＣＤ７３タンパク質に対する有効性に関する新しい変異体の研究
組換えｒｅｃ ｃｙＣＤ７３タンパク質に対する実験は、２Ｈ１Ｌｘ及び２Ｈ４＋２Ｌｘ変異体を使用して実施された。実験条件は、使用したｃｙＣＤ７３タンパク質の濃度（４００ｎｇ／ｍＬ）を除いて、ヒトタンパク質での実験と同じであった。
組換えｒｅｃ ｃｙＣＤ７３タンパク質に対する実験は、２Ｈ１Ｌｘ及び２Ｈ４＋２Ｌｘ変異体を使用して実施された。実験条件は、使用したｃｙＣＤ７３タンパク質の濃度（４００ｎｇ／ｍＬ）を除いて、ヒトタンパク質での実験と同じであった。
【0292】
ｃｙＣＤ７３タンパク質の酵素活性を遮断するヒト化変異体の有効性は、親（キメラ）抗体の有効性と同じであった。
【0293】
実施例９：Ｔ細胞増殖アッセイにおける新しい変異体の研究
異なる抗体のヒト化変異体は、ＡＭＰによって阻害されたＴ細胞増殖を回復する能力について試験された。
異なる抗体のヒト化変異体は、ＡＭＰによって阻害されたＴ細胞増殖を回復する能力について試験された。
【0294】
図５Ａは、Ｔ細胞増殖に対するＡＭＰの阻害効果を示す。全てのヒト化変異体は、Ｔ細胞増殖に対するＡＭＰの阻害効果を強力に遮断した（図５Ｂ及びＣ）。大半のヒト化変異体は、一般に、ＡＭＰ媒介性Ｔ細胞抑制を逆転させるうえでキメラ親対応物と同程度に効率的であるようであるが、２Ｈ４＋２Ｌｘ変異体は、全ての変異体の中で最も強力であり、驚くべきことに、ＡＭＰの抑制効果を遮断することにおいて親２ＨＰ２ＬＰ抗体よりもさらに強力であった。
【0295】
実施例１０：２人のヒトドナーでのＴ細胞増殖アッセイにおける新しい変異体の比較研究
以前に得られた結果によると、２Ｈ４＋２Ｌｘヒト化変異体は、さらなる一連のＴ細胞増殖実験でさらに特徴付けられた。
以前に得られた結果によると、２Ｈ４＋２Ｌｘヒト化変異体は、さらなる一連のＴ細胞増殖実験でさらに特徴付けられた。
【0296】
図６Ａ及び６Ｂは、それぞれ２人の健常ドナーからの細胞を使用したＴ細胞増殖アッセイで得られた結果を示す。以前に観察されたように、２Ｈ４＋２Ｌｘ変異体は、それぞれ親２ＨＰ２ＬＰよりも強力にＴ細胞増殖を回復した（図６Ａ及びＢ、右パネル）。異なる２Ｈ４＋２Ｌｘ変異体間で明確な違いは観察されなかった。したがって、この場合にも、２Ｈ４＋２Ｌｘ変異体は、ＡＭＰの抑制効果を遮断することにおいて親の２ＨＰ２ＬＰ抗体よりもさらに強力であった。
【0297】
総合すると、Ｔ細胞増殖アッセイで得られた結果は、Ｈ４＋及びＨ４＋鎖のフレームワークを有するヒト化変異体が最も強力な抗体変異体であり、２Ｈ４＋２Ｌｘ変異体が全体として全ての抗体の中で最大の効力を有することを示す。
【0298】
実施例１１：同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおける新しい変異体の研究
２Ｈ４＋２Ｌｘ抗体変異体は、Ｔ細胞増殖アッセイで以前に得られた結果を確認するために同種ＭＬＲで試験された。Ｔ細胞増殖は、２つのヒトドナー試料について図７に示すように、１００μＭのＡＴＰ（ＣＤ３９によってＡＤＰ及びＡＭＰに分解される）を添加することによって阻害された。
２Ｈ４＋２Ｌｘ抗体変異体は、Ｔ細胞増殖アッセイで以前に得られた結果を確認するために同種ＭＬＲで試験された。Ｔ細胞増殖は、２つのヒトドナー試料について図７に示すように、１００μＭのＡＴＰ（ＣＤ３９によってＡＤＰ及びＡＭＰに分解される）を添加することによって阻害された。
【0299】
図７の左パネルに示すように、ＡＴＰの添加によりＴ細胞の増殖が阻害された。Ｔ細胞の増殖は、抗ＣＤ７３抗体の存在下で回復した（中央及び右側のパネル）。全ての２Ｈ４＋２Ｌｘヒト化変異体は、親２ＨＰ２ＬＰ抗体と同等の又はそれより優れた有効性でＴ細胞増殖を回復させることができた。全ての２Ｈ４＋２Ｌｘ変異体は、これらの設定でＴ細胞増殖を回復するために親２ＨＰ２ＬＰよりも強力であった。これらの結果は、ＡＭＰを阻害剤として使用したＴ細胞増殖アッセイで得られた結果と一致していた。
【0300】
要約すると、Ｈ４＋及び２Ｈ４＋可変領域に導入された置換は、Ｌ１及び２Ｌ１鎖（及びＬ２、Ｌ３、Ｌ４、２Ｌ２、２Ｌ３、２Ｌ４鎖）に導入された置換と共に、それらの親マウス抗体の重要な機能的特性を回復し（及びさらに改善し）、さらにヒトフレームワーク領域を有するようであるため、ヒトにおける免疫原性のリスクがより低い。２Ｈ４＋２Ｌｘ抗体は、全ての中で最も強力である。
【0301】
ＣＤ７３に対する結合親和性がＣＤ７３活性の機能的阻害の効力と直接相関しなかったという驚くべき発見に関して、１つの考えられる説明は、これらの抗体がＣＤ７３に結合してアロステリック阻害剤として作用するという事実に関連している可能性がある。抗体は、インタクトな全長抗体とＣＤ７３二量体との間で１：１の化学量論で二量体内結合モードにおいてＣＤ７３に結合する。ＣＤ７３の以前の構造研究は、その酵素活性が酵素の開放（非活性）及び閉鎖（活性、基質結合）状態を定義する広範なＮ末端ドメイン回転を必要とすることを示した（Ｋｎａｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０（１２）：２１６１－７３）。ＣＤ７３の外部ドメインと複合体を形成した親抗ＣＤ７３Ｆ（ａｂ）の結晶構造に基づき、無傷の抗体とＣＤ７３二量体との１：１化学量論を考慮すると、立体障害により、無傷の抗体がＣＤ７３開放配座異性体に結合する可能性が低くなること予想される。代わりに、無傷の抗体は、ＡＭＰが加水分解されない中間状態でＣＤ７３を拘束する。したがって、ＣＤ７３は、エネルギー的に不安定な立体構造にあるときに抗体に結合するため、ここでの抗体構造の剛性を変更する小さい変化は、ＣＤ７３二量体の立体構造の変化に適応する抗体の能力に影響を与える可能性がある。結果として、これらの変化は、基質の存在下でＣＤ７３の活性を阻害する抗体の能力に影響を与え得る。しかし、抗体構造のこれらの小さい変化は、ＳＰＲ又は基質の非存在下でさらに実行される他の結合アッセイで観察されないであろう。本明細書に記載の重鎖及び軽鎖可変領域は、ヒトフレームワークを組み込んでいる間、親抗体の完全なＣＤ７３相互作用動態を捕捉することができる（さらにはそれを改善することができる）ようである。
【0302】
本明細書中で引用される、刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、本明細書中の他の箇所でなされる特定の文献のいずれかの個別に提供される組み込みにかかわらず、（法律によって許される最大の限度で）各参考文献が個々に及び具体的に参照により組み込まれることが示され、本明細書中でその全体において記載されているかのように、同定度に参照により全体的に本明細書に組み込まれる。
【0303】
「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」並びに「その」という語及び同様の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り又は文脈に明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈すべきである。
【0304】
別段の指定がない限り、本明細書中で提供される全ての厳密値は、対応する近似値の代表である（例えば、特定の要因に関して提供される全ての代表的厳密値又は測定値は、必要に応じて、「約」により修飾される対応する近似測定値も提供するとみなされ得る）。
【0305】
１つ又は複数の要素に関する「含む」、「有する」、「包含する」又は「含有する」などの語を使用した本明細書における何らかの態様又は実施形態の本明細書中の記述は、別段の指定がない限り又は内容に明らかに矛盾しない限り、その特定の１つ又は複数の要素「からなる」、「から基本的になる」又はそれを「実質的に含む」、本明細書における同様の態様又は実施形態に対する支持を提供するものとする（例えば、特定の要素を含む場合の本明細書中に記載の組成物は、別段の指定がない限り又は内容に明らかに矛盾しない限り、その要素からなる組成物も記載するものとしても理解されるべきである）。
【0306】
本明細書中で提供されるあらゆる実施例又は代表的な語（例えば、「など」）の使用は、本発明を単により良好に明らかにするものとして意図され、別段の主張がない限り、本発明の範囲において限定を提起しない。本明細書中のいかなる語も、何らかの請求項に記載されていない要素を本発明の実施に必須であるものとして示すものと解釈すべきではない。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【配列表】