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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-01
(45)【発行日】2024-08-09
(54)【発明の名称】自己環状化ＲＮＡ構造体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240802BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20240802BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240802BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/55
C12N15/63 Z
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2022554679
(86)(22)【出願日】2022-03-10
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-24
(86)【国際出願番号】 KR2022003377
(87)【国際公開番号】W WO2022191642
(87)【国際公開日】2022-09-15
【審査請求日】2022-09-09
(31)【優先権主張番号】10-2021-0031225
(32)【優先日】2021-03-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】520062823
【氏名又は名称】アールズィーノミクス・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ソン－ウク・イ
(72)【発明者】
【氏名】キョン・ヒョン・イ
(72)【発明者】
【氏名】スン・リュル・ハン
(72)【発明者】
【氏名】ジ・ヒョン・キム
(72)【発明者】
【氏名】ソンチョル・キム
【審査官】平林 由利子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／１３４７９１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１０／０３０５１９７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Nucleic Acids Research，2015年，Vol.43, No.4，pp.2454-2465
【文献】Mol. Ther. ，2005年，Vol.12, No.5，pp.824-834
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
自己環状化ＲＮＡ構造体であって、前記構造体は、５’－ＩＧＳ－リボザイム－目的遺伝子－標的部位－３’の構造を有し、
前記ＩＧＳ領域は、標的部位とグアニン（Ｇ）：ウラシル（Ｕ）ゆらぎ塩基対を形成し、
前記ゆらぎ塩基対を形成するグアニンは、ＩＧＳ領域の５’末端に位置し、
前記ゆらぎ塩基対を形成するウラシルは、標的部位領域の３’末端に位置し、
前記リボザイムは、グループＩイントロンリボザイムである、自己環状化ＲＮＡ構造体。
【請求項2】
前記標的部位領域は、目的遺伝子領域と重なる、請求項１に記載の自己環状化ＲＮＡ構造体。
【請求項3】
前記ＩＧＳ領域の塩基配列は、前記グアニンを除いて標的部位の領域の塩基配列と逆相補的であることを特徴とする、請求項１に記載の自己環状化ＲＮＡ構造体。
【請求項4】
前記リボザイムは、配列番号６の塩基配列を含む、請求項１に記載の自己環状化ＲＮＡ構造体。
【請求項5】
前記構造体は、ＩＧＳ領域の５’方向に延長したヌクレオチドを含むＰ１０ヘリックスを形成する、請求項１に記載の自己環状化ＲＮＡ構造体。
【請求項6】
前記構造体は、ＩＧＳ領域の５’方向及び標的部位の３’方向に延長したヌクレオチドを含むＰ１ヘリックスを形成する、請求項１に記載の自己環状化ＲＮＡ構造体。
【請求項7】
前記構造体は、Ｐ１０ヘリックスを形成しない、請求項６に記載の自己環状化ＲＮＡ構造体。
【請求項8】
前記構造体は、ＩＧＳ領域の５’方向にＡＳ（アンチセンス配列）領域と、標的部位の３’方向に前記ＡＳ領域と相補的に結合することができるＡＢＳ（アンチセンス結合配列）領域と、
をさらに含む、請求項１又は請求項５に記載の自己環状化ＲＮＡ構造体。
【請求項9】
前記ＡＳ領域の長さは、５０～４００ｎｔである、請求項８に記載の自己環状化ＲＮＡ構造体。
【請求項10】
前記目的遺伝子領域は、５’末端にＩＲＥＳ領域を含む、請求項１に記載の自己環状化ＲＮＡ構造体。
【請求項11】
前記構造体は、リボザイム領域と目的遺伝子領域がランダムな塩基配列からなるスペーサ領域に連結された、請求項１に記載の自己環状化ＲＮＡ構造体。
【請求項12】
前記構造体は、目的遺伝子領域と標的部位領域がランダムな塩基配列からなるスペーサ領域に連結された、請求項１に記載の自己環状化ＲＮＡ構造体。
【請求項13】
自己環状化ＲＮＡ構造体を発現する、請求項１に記載の自己環状化ＲＮＡ構造体。
【請求項14】
前記自己環状化ＲＮＡ構造体は、前記自己環状化ＲＮＡ構造体を発現するために動作可能に連結されたプロモータを更に含む、請求項１３に記載の自己環状化ＲＮＡ構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、自己環状化ＲＮＡ構造体などに関する。
【背景技術】
【0002】
環状ＲＮＡ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ；ｃｉｒｃＲＮＡ）は、共有結合で連結された一本鎖の転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）であって、ＲＮＡ－ｓｅｑデータと新たに開発された生物情報学的アプローチにより、様々な生命体で数万個を越える種類のｃｉｒｃＲＮＡが確認された。真核生物において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ｍＲＮＡからバックスプライシング（ｂａｃｋ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ）を介して生成され、生体内でマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）スポンジ（ｓｐｏｎｇｅ）機能を実行して遺伝子発現を調節できることが知られている。ｃｉｒｃＲＮＡが免疫原性を引き起こすか否かは知られておらず、その構造的特性によって生体内で非常に安定して存在する。
【0003】
一方、最近メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を用いた治療薬の開発が活発である。しかし、ｍＲＮＡは生体内で容易に分解され、比較的短い半減期を有するという限界がある。このような限界を克服するために、ｍＲＮＡにポリ（Ａ）鎖（ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ）を付けて安定性を向上させるなどの研究が進められている。同様に、米国特許第１０，９５３，０３３号は、ｃｉｒｃＲＮＡの構造的特性に基づいて生体内での遺伝子発現を目的にｃｉｒｃＲＮＡを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】米国特許第１０，９５３，０３３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明が達成しようとする技術的課題は、自主的に標的化及びスプライシング反応を行って環状化されるＲＮＡ構造体を提供することにある。
【0006】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に限定されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当該技術分野の通常の技術者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記の課題を解決するために、本発明は、以下の構造を有する自己環状化ＲＮＡ構造体を提供する。
【0008】
５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）－目的遺伝子（ｇｅｎｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）－標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）－３’。
【0009】
本発明の一実施形態では、前記ＩＧＳ領域は、標的部位とグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ、Ｇ）：ウラシル（Ｕｒａｃｉｌ、Ｕ）ゆらぎ塩基対（ｗｏｂｂｌｅ ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成し、前記ゆらぎ塩基対を形成するグアニンは、ＩＧＳ領域の５’末端に位置し、前記ゆらぎ塩基対を形成するウラシルは、標的部位領域の３’末端に配置することができる。
【0010】
本発明の別の実施形態では、前記ＩＧＳ領域は、５’－ＧＮＮＮＮＮ－３’の塩基配列を含む又はそれからなり、前記標的部位領域は、５’－Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｕ－３’の塩基配列を含む又はそれからなるものであり得る。前記ＩＧＳ領域のＮと標的部位領域のＮ’は、それぞれ独立してＡ、Ｇ、Ｃ、又はＵであってもよいが、好ましくは、１つのヌクレオチド以上が、ＩＧＳ領域と標的部位領域が相補的に結合することができるヌクレオチドであり得る。
【0011】
本発明のまた別の実施形態では、前記ＩＧＳ領域の塩基配列は、前記グアニンを除いて標的部位の領域の塩基配列と逆相補的であり得る。
【0012】
本発明の別の実施形態では、前記リボザイムは、グループＩイントロンリボザイム（ＧｒｏｕｐＩｉｎｔｒｏｎ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）であり得、前記リボザイムは、配列番号６の塩基配列を含む又はそれからなるものであり得る。
【0013】
本発明のまた別の実施形態では、前記構造体は、ＩＧＳ領域の５’方向に延長したヌクレオチドを含むＰ１ヘリックス（ｈｅｌｉｘ）及びＰ１０ヘリックスを形成することができ、ここでＰ１ヘリックスは、標的部位の３’方向に延長したヌクレオチドと共にＩＧＳ領域と標的部位の相補的な結合がなされる領域で形成され、Ｐ１０ヘリックスは、ＩＧＳ領域の５’方向に延長したヌクレオチドがリボザイムとＧＯＩ領域との間に位置する前記延長したヌクレオチドと逆相補的な配列と相補的な結合がなされる領域で形成され得る。前記Ｐ１ヘリックスを形成する延長したヌクレオチドの長さは３－ｎｔであってもよく、Ｐ１０ヘリックスを形成する延長したヌクレオチドの長さは６－ｎｔであってもよい。
【0014】
本発明のまた別の実施形態では、前記構造体は、Ｐ１ヘリックスは形成するが、Ｐ１０ヘリックスは形成しなくてもよい。
【0015】
本発明のまた別の実施形態では、前記構造体は、５’末端及び３’末端に互いに相補的に結合することができるＡＳ（アンチセンス配列（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ））領域と、ＡＢＳ（アンチセンス結合配列（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ））領域とを含み得る。
【0016】
本発明のまた別の実施形態では、前記ＡＢＳ領域は、ＡＳ領域と逆相補的（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）な配列からなることができる。
【0017】
本発明のまた別の実施形態では、前記ＡＳ領域の長さは、ＧＯＩに応じて可変であり得るが、１０～５００ｎｔ、好ましくは５０ｎｔ超過４００ｎｔ未満、より好ましくは１５０～３５０ｎｔであり得る。
【0018】
本発明のまた別の実施形態では、前記ＧＯＩ領域は、５’末端にＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）領域を含んでもよく、開始コドン及び終結コドンを含み得る。
【0019】
本発明のまた別の実施形態では、前記構造体は、ランダムな塩基配列からなるスペーサ（Ｓｐａｃｅｒ）領域をさらに含んでもよく、前記スペーサ領域は、ＩＧＳ領域と目的遺伝子領域との間、及び／又は目的遺伝子領域と標的部位領域との間に配置され得る。
【0020】
本発明のまた別の実施形態では、前記スペーサ領域は、ポリ（Ａ）（ｐｏｌｙ（Ａ））を含む又はそれからなるものであってもよく、ポリ（Ａ）は、アデニン（Ａ）が繰り返し連結されたポリヌクレオチドであり、前記Ａは、１０から５０回繰り返して連結されたものであり得、好ましくは３０回繰り返して連結されたものであり得る。
【発明の効果】
【0021】
本発明の自己環状化ＲＮＡ構造体は、ＤＮＡベクターで発現させると同時に別のＧＴＰ処理なしに自己標的化及びスプライシング（ｓｅｌｆ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）反応により環状化（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）されてｃｉｒｃＲＮＡを形成することができ、ｃｉｒｃＲＮＡは目的遺伝子のみから構成され、目的遺伝子はＩＲＥＳ領域、開始コドン、及び終結コドンを含むペプチド又はタンパク質の迅速な発現が可能な長所がある。また、ｃｉｒｃＲＮＡは、環状の構造で５’及び３’末端が露出しないため安定的かつ高い半減期を有し、ｍｉＲＮＡ、ａｎｔｉ－ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｐｔａｍｅｒ、ｍＲＮＡワクチン、ｍＲＮＡ治療薬、抗体、ワクチン補助剤、ＣＡＲ－Ｔ ｍＲＮＡなどの機能性ＲＮＡをｃｉｒｃＲＮＡで調製し、細胞内で高い安定性を有するようにすることができる。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1A】ＩＧＳ、リボザイム、目的遺伝子、及び標的部位領域のみ含む本発明の自己環状化ＲＮＡ構造体が、自己標的化及びスプライシング（ＳＴＳ）反応によってｃｉｒｃＲＮＡに形成される過程の模式図である。
【図1B】ＩＧＳ、リボザイム、目的遺伝子、及び標的部位領域のみ含む本発明の自己環状化ＲＮＡ構造体が、自己標的化及びスプライシング（ＳＴＳ）反応によってｃｉｒｃＲＮＡに形成される過程の模式図である。
【図2A】ＡＳ、ＩＧＳ、リボザイム、目的遺伝子、標的部位、及びＡＢＳ領域を含む本発明の自己環状化ＲＮＡ構造体がＳＴＳ反応によってｃｉｒｃＲＮＡに形成される過程の模式図である。
【図2B】トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の翻訳を可能にするために目的遺伝子領域にＩＲＥＳと終結コドンを含み、Ｐ１ヘリックス及びＰ１０ヘリックスを形成できるように５’方向に延長したヌクレオチドをさらに含む、本発明の自己環状化ＲＮＡ構造体と、構造体がＳＴＳ反応によってｃｉｒｃＲＮＡに形成される過程の模式図である。
【図2C】本発明の自己環状化ＲＮＡ構造体の一態様である。
【図2D】本発明の自己環状化ＲＮＡ構造体発現ベクター調製のためのＤＮＡテンプレートの塩基配列である。
【図3】本発明の自己環状化ＲＮＡ構造体発現ベクターの試験管内転写後に直ぐ、追加のＧＴＰ処理なしでｃｉｒｃＲＮＡが発生することを確認するために、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動の結果である。転写後直ぐ（ｄｉｒｅｃｔ ＳＴＳ）に確保された試料と、追加のＧＴＰを処理して一次及び二次環状化反応を誘導する一次及び二次ＳＴＳ反応工程後の試料を利用し、各試料の一部は、ＲＮａｓｅ Ｒを処理して線状ＲＮＡ（ｌｉｎｅａｒ ＲＮＡ）を除去することによって試料中のｃｉｒｃＲＮＡを濃縮して電気泳動した。
【図4A】図３の結果からｃｉｒｃＲＮＡと推定される候補１（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ１）がｃｉｒｃＲＮＡであることを検証したものであり、図４Ａは、前記候補１バンドからＲＮＡを抽出してＲＴ－ＰＣＲを行った結果である。
【図5】図４の結果で候補１バンドのＲＮＡにモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）であることを検証したものであり、図３の結果においてｃｉｒｃＲＮＡと推定される候補１及び２バンドからＲＮＡを抽出してＭｇ２＋を処理してニック（ｎｉｃｋ）を誘導した後、電気泳動の結果である。
【図6A】本発明の自己環状化ＲＮＡ構造体発現ベクターが細胞内でｃｉｒｃＲＮＡを生成し、ｃｉｒｃＲＮＡが含むトランスジーンが発現されることを確認した結果である。具体的には、図６Ａは、前記自己環状化ＲＮＡ構造体発現ベクターの構造である。
【図6B】本発明の自己環状化ＲＮＡ構造体発現ベクターが細胞内でｃｉｒｃＲＮＡを生成し、ｃｉｒｃＲＮＡが含むトランスジーンが発現されることを確認した結果である。具体的には、図６Ｂは、ルシフェラーゼ活性分析（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ）を介したトランスジーンの発現を確認した結果である。
【図6C】本発明の自己環状化ＲＮＡ構造体発現ベクターが細胞内でｃｉｒｃＲＮＡを生成し、ｃｉｒｃＲＮＡが含むトランスジーンが発現されることを確認した結果である。具体的には、図６Ｃは、トランスジーンがｃｉｒｃＲＮＡで発現したことを検証したＲＰ－ＰＣＲ及び塩基配列分析の結果である。
【図6D】本発明の自己環状化ＲＮＡ構造体発現ベクターが細胞内でｃｉｒｃＲＮＡを生成し、ｃｉｒｃＲＮＡが含むトランスジーンが発現されることを確認した結果である。具体的には、図６Ｄは、トランスジーンがｃｉｒｃＲＮＡで発現したことを検証したＲＰ－ＰＣＲ及び塩基配列分析の結果である。
【図10】本発明の自己環状化ＲＮＡ構造体において、ＡＳ領域がＳＴＳ反応及び環状化に及ぼす影響を確認したものであり、図１０は、前記ＲＮＡを発現するベクターの試験管内転写後に確保された試料の電気泳動の結果である。
【図11】本発明の自己環状及びＲＮＡ構造体におけるスペーサ（Ｓｐａｃｅｒ）領域がＳＴＳ反応及び環状化に及ぼす影響を確認したものであり、図１１は、対照群スペーサ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｐａｃｅｒ）と様々な長さのポリ（Ａ）スペーサ（ｐｏｌｙ（Ａ）Ｓｐａｃｅｒ）を含む自己環状化ＲＮＡの構造である。
【図12】本発明の自己環状及びＲＮＡ構造体におけるスペーサ（Ｓｐａｃｅｒ）領域がＳＴＳ反応及び環状化に及ぼす影響を確認したものであり、図１２は、前記ＲＮＡを発現するベクターの試験管内転写後に確保された試料の電気泳動の結果である。
【図13】Ｐ１領域のみ含む自己環状化ＲＮＡ；Ｐ１及びＰ１０領域のみ含む自己環状化ＲＮＡ；及びＰ１領域、Ｐ１０領域、及びＡＳ領域を含む自己環状化ＲＮＡ；のリボザイムによって切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）される領域付近の塩基配列と各領域と示したものである。
【図14】Ｐ１０及びＡＳ領域がなく、Ｐ１領域のみ含む自己環状化ＲＮＡ発現ベクター調製のためのＤＮＡテンプレートの塩基配列である。
【図16A】Ｐ１０及びＡＳ領域がなく、Ｐ１領域のみ含む自己環状化ＲＮＡ発現ベクターにおいて、試験管内転写後に自己環状化ＲＮＡ構造体がｃｉｒｃＲＮＡに形成されることを電気泳動により確認した結果である。
【図16B】Ｐ１０及びＡＳ領域がなく、Ｐ１領域のみ含む自己環状化ＲＮＡ発現ベクターにおいて、試験管内転写後に自己環状化ＲＮＡ構造体がｃｉｒｃＲＮＡに形成されることを電気泳動により確認した結果である。
【図18】本発明の自己環状及びＲＮＡ構造体におけるＰ１領域の塩基配列がＳＴＳ反応及び環状化に及ぼす影響を確認したものである。具体的には、図１８は、図１７のＰ１領域を有する自己環状化ＲＮＡ発現ベクターの試験管内転写後に確保される試料の電気泳動の結果である。
【図19】本発明の自己環状及びＲＮＡ構造体におけるＰ１領域の塩基配列がＳＴＳ反応及び環状化に及ぼす影響を確認したものである。具体的には、図１９は、ＡＵ－ｒｉｃｈ Ｐ１領域を有する自己環状化ＲＮＡ発現ベクターと２－ｓｉｔｅ Ｐ１領域を有する自己環状化ＲＮＡ発現ベクターの試験管内転写後に確保される試料の電気泳動の結果であり、環状ＲＮＡを確認するＲＴ－ＰＣＲ電気泳動の結果である。
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明者らは、ｃｉｒｃＲＮＡの調製ためにトランススプライシングリボザイム（ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅ、Ｔ／Ｓ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）を使用して目的遺伝子を搭載したＲＮＡが自己標的化及びスプライシング反応を行って環状化されるシステム（Ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｓｅｌｆ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を考案した（図１Ａ及び図１Ｂ）。
【0024】
グループＩイントロンリボザイム（ＧｒｏｕｐＩｉｎｔｒｏｎ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）は、２回の連続的なエステル交換（ｔｒａｎｓ－ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）反応によって標的ＲＮＡを切断した後、切断された３’末端に別に存在する転写体を互いに連結してトランススプライシング（ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ）を誘導してもよい。
【0025】
ここで、本発明のシステムは、目的遺伝子（ｇｅｎｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＧＯＩ）の５’方向に内部ガイド配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＩＧＳ）を構成し、３’方向に標的部位を構成し、ＩＧＳが標的部位と相補的に結合するようにするが、グアニン（Ｇ）：ウラシル（Ｕ）ゆらぎ塩基対を形成させて、ＧＯＩとＩＧＳとの間に位置するリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）による切断及び接合を誘導してｃｉｒｃＲＮＡを調製することができる（図２Ａ及び図２Ｂ）。
【0026】
一方、本発明者らは、グループＩイントロンリボザイムのトランススプライシング効率を向上させるための以前の研究（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｎｏｖ；１２（５）：８２４－３４．）に着眼して、図２Ｃに図式化されたように自己環状化ＲＮＡ構造体の５’及び３’末端に互いに相補的に結合が可能なＡＳ（アンチセンス配列）領域とＡＢＳ（アンチセンス結合配列）が存在し、リボザイムの二次構造の前／後にＰ１及びＰ１０ヘリックスが形成されるように自己環状化ＲＮＡ構造体を設計し、Ｔ７プロモータ下でＲＮＡ構造体を発現することができるＤＮＡテンプレート（ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ）を調製した（実施例１）。
【0027】
次に、ＤＮＡテンプレートを挿入したベクターを調製し、これを試験管内で転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＩＶＴ）させた後、ｃｉｒｃＲＮＡの形成を確認した。その結果、ベクターは、自己環状化ＲＮＡ構造体を発現し、ＲＮＡ構造体は、ＧＴＰの追加がなくても、転写後に即座に自己標的化及びスプライシング（ｓｅｌｆ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ；ＳＴＳ）反応によってモノマーのｃｉｒｃＲＮＡを形成することが分かった（実施例２）。
【0028】
さらに、本発明者らは、自己環状化ＲＮＡ構造体発現ベクターが細胞内でも本発明のＲＮＡ構造体を発現し、発現したＲＮＡがｃｉｒｃＲＮＡの形態で搭載した目前遺伝子を発現できることを確認しようとした。具体的には、細胞内で遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）が可能なように目的遺伝子内にＩＲＥＳ及び終結コドンを含ませて、ガウシアルシフェラーゼ（ｇａｕｓｓｉａｎ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を目的遺伝子内にトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）として利用してプラスミドベクターを調製し、プラスミドベクターを細胞内に形質転換してｃｉｒｃＲＮＡの生成及びルシフェラーゼ活性（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を確認した。その結果、調製されたプラスミドベクターが細胞内で自己環状化ＲＮＡ構造体を発現し、構造体は、リボザイムによってｃｉｒｃＲＮＡに環状化され、ｃｉｒｃＲＮＡで目的遺伝子が発現することを分子レベルで確認することができた（実施例３）。
【0029】
次に、本発明者らは、ＩＶＴ上で即座にＳＴＳ（ｄｉｒｅｃｔ ＳＴＳ）反応によって効率的にｃｉｒｃＲＮＡを形成できるようにＲＮＡ構造体最適化を試みた。
【0030】
先ず、具体的な試験により、ＩＶＴ上のＡＳ領域の長さによるｄｉｒｅｃｔ ＳＴＳ反応率を確認した。具体的には、ＡＳ領域とＡＢＳ領域の長さが５０、１００、１５０、２００、２５０、又は３００－ｎｔとなるように自己環状化ＲＮＡ発現ベクターを調製し、ベクターをＩＶＴさせた後、ｄｉｒｅｃｔ ＳＴＳ効率を確認した。その結果、２００－ｎｔ以上の長さで自己環状化効率が顕著に減少することを確認することができた。一方、５０、１００、及び１５０－ｎｔの長さで自己環状化効率は類似していたが、５０又は１００－ｎｔの長さのＡＳ領域及びＡＢＳ領域を含む場合、試験管内転写反応自体が減少することを確認し、ｃｒｉｃＲＮＡ調製効率の観点から、ＡＳ領域とＡＢＳ領域の長さは、１５０－ｎｔが好ましいことを確認した（実施例５）。
【0031】
一方、ＡＳ領域及びＡＢＳ領域の長さにともなうｃｉｒｃＲＮＡの調製効率を確認したのと同様に、ＩＶＴ上でスペーサ領域の長さ及び塩基配列にともなうｃｉｒｃＲＮＡの調製効率を確認した結果、その長さと塩基配列がｃｉｒｃＲＮＡの調製効率に大きい影響は与えないものの、３０個のアデニン（Ａ）が連結されていることが、リボザイムとＥＭＣＶ ＩＲＥＳの場合において、リボザイムとＩＲＥＳの狭い間隔によって発生し得る構造的衝突を生じないために十分であることが分かった（実施例６）。
【0032】
本発明において、リボザイムは、連続的なエステル交換反応が可能なグループＩイントロンリボザイムを用いた。グループＩイントロンリボザイムは、標的部位切断後に切断された３’末端に別に存在する転写体を互いに連結してトランススプライシングを誘導するが、自己環状化ＲＮＡ構造体では別に存在する転写体でないＧＯＩの５’部位を切断された３’末端に連結することで、トランススプライシング効率を高めることが知られているＰ１及びＰ１０ヘリックス領域と自己環状化ＲＮＡ構造体の両末端のＡＳ領域及びＡＢＳ領域が環状化の効率にもプラスの影響を及ぼすかを確認することにした。
【0033】
具体的には、本発明者らは、Ｐ１ヘリックス領域のみ含むか、Ｐ１及びＰ１０ヘリックス領域のみ含むか、又はＰ１及びＰ１０ヘリックスとＡＳ領域を全て含む自己環状化ＲＮＡ発現ベクターを調製してベクターをＩＶＴさせた後、ｄｉｒｅｃｔ ＳＴＳ効率を確認した。その結果、驚くべきことに自己環状化ＲＮＡ構造体におけるＰ１０ヘリックス領域は、Ｐ１ヘリックス及びＰ１０ヘリックス領域の存在下でｃｉｒｃＲＮＡの調製効率を低減させることが分かった。一方、ＡＳ領域なしでＰ１ヘリックス領域のみ含む場合でも優れたｃｉｒｃＲＮＡの調製効率を示した（実施例７）。
【0034】
さらに、本発明者らは、最終産物であるｃｉｒｃＲＮＡに目的遺伝子のみを残せるように、ＩＧＳのみがＰ１ヘリックスを形成するように自己環状化ＲＮＡ構造体を設計し、様々なＩＧＳ配列でＳＴＳ反応が発生することを確認した。その結果、驚くべきことにＩＧＳ領域のみがＰ１ヘリックスを形成する場合でも、ＤＮＡで発現された自己環状化ＲＮＡ構造体のＳＴＳ反応が誘導され、さらにＩＧＳ領域と標的部位領域とが互いに相補的でないにも関わらず、ｃｉｒｃＲＮＡが形成されることを確認した。しかし、ＩＧＳ領域と標的部位領域とが互いに相補的でない場合、所望しない部位での非特異的な反応が起こり得、望ましくない産物が生成される可能性がある。５’－ＧＮＮＮＮＮ－３’のＩＧＳ領域と５’－Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｕ－３’の標的部位領域とは、互いに相補的に結合が可能な塩基配列の比率が増加するほどｃｉｒｃＲＮＡの調製効率が増加であり、特定配列でより高いｃｉｒｃＲＮＡの調製効率を示すことが分かった（実施例８）。
【0035】
以上から、本発明者らは、図１Ａに図式化されたＲＮＡ構造体のみでＳＴＳ反応によりｃｉｒｃＲＮＡを取得することができ、図２０Ａに図式化された自己環状化ＲＮＡ構造体は、図２０Ｂの模式図のようにｃｉｒｃＲＮＡ前駆体において、ＧＯＩ３’末端にＵ塩基を含む目的遺伝子のみで構成されたｃｉｒｃＲＮＡを形成し得ることを確認した。
【0036】
一方、Ｐ１ヘリックスは、グループＩイントロンリボザイムの二次構造形成時にリボザイムの剪断（５’方向）方向に連結された塩基配列とリボザイムによって接合が誘導される転写体の３’方向の塩基配列が相補的な結合によって形成されるヘリックス構造を意味し、Ｐ１０ヘリックスは、リボザイムの剪断領域とリボザイムによって切断される転写体の５’方向の塩基配列が相補的な結合によって形成されるヘリックス構造を意味する。
【0037】
本発明において、Ｐ１ヘリックスは、本発明の自己環状化ＲＮＡ構造体で５’末端のＩＧＳと３’末端の標的部位の相補的な結合によって形成することができ、Ｐ１０ヘリックスは、５’末端の延長塩基配列とリボザイムの後端（３’方向）に連結された塩基配列が相補的な結合によって形成されるヘリックス構造を意味する。
【0038】
本明細書において、Ｐ１ヘリックスを形成する塩基配列をＰ１領域又はＰ１ヘリックス領域と呼び、同様にＰ１０ヘリックスを形成する塩基配列をＰ１０領域又はＰ１０ヘリックス領域と命名する。
【0039】
本発明において、ＩＧＳ領域の塩基配列は、５’－ＧＮＮＮＮＮ－３’であり、標的部位領域の塩基配列は、５’－Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｕ－３’であり、Ｐ１ヘリックスは、ＩＧＳ領域と標的部位領域が互いに相補的に結合して形成することができ、ここで、重複的な表現を排除するために、Ｐ１ヘリックス領域の技術はＩＧＳ領域の塩基配列と混用して使用してもよい。
【0040】
本発明において、Ｐ１ヘリックスは、ＩＧＳ領域の５’方向に延長塩基配列を含むように形成することができ、自然に延長塩基配列と逆相補的配列の塩基配列が標的部位の３’方向に延長されてＰ１ヘリックスを構成する。ここで、延長塩基配列が存在する場合、本明細書ではＩＧＳ領域と区分するために延長塩基配列領域をＰ１と表示する。Ｐ１０ヘリックスの場合も同様である。
【0041】
一方、本発明において、標的部位領域は、ＩＧＳ領域と相補的な結合をする塩基配列を示すものであり、ＩＧＳ領域の塩基配列の設計によって目的遺伝子（ＧＯＩ）領域と重なることができ、このときにも、ＩＧＳ領域と相補的に結合する領域を特定するために、目的遺伝子内でＩＧＳ領域と相補的な結合をする領域を標的部位に区分して命名する。言い換えれば、本発明における標的部位は、目的遺伝子領域の一部又は全部と重なる、又は目的遺伝子とは別に存在してもよい。
【0042】
本発明において、ＡＳ（アンチセンス配列）領域は、自己環状化ＲＮＡ構造体の５’末端に位置し、ＲＮＡ構造体の３’末端に位置するＡＢＳ（アンチセンス結合配列）領域の塩基配列と水素結合を目的とし、本発明において、ＡＳ領域は、ＡＢＳ領域と必須的に共存するものであり、ＡＳ領域の不存在は、ＡＢＳ領域の不存在を含む意味として理解され、同様にＡＳ領域を含むＲＮＡ構造体は、ＡＢＳ領域も含むものと理解される。
【0043】
一方、本発明者らは、自己環状化ＲＮＡ構造体のＳＴＳ反応による環状化効率において、Ｐ１領域、Ｐ１０領域、及びＡＳ領域の３種構成の存否が及ぼす影響を確認した結果、Ｐ１及びＰ１０領域とＡＳ領域を全て含む場合、Ｐ１領域のみ含む場合、Ｐ１及びＰ１０領域のみ含む場合の順序でｃｉｒｃＲＮＡの生成量が多いことを確認し、Ｐ１領域のみ含む場合の自己環状化ＲＮＡ構造体も十分な効率で環状化されてｃｉｒｃＲＮＡを生成することを確認し、本発明は、Ｐ１領域のみ含む場合の自己環状化ＲＮＡ構造体を提供する。
【0044】
従って、本明細書においてＰ１領域のみ含む自己環状化ＲＮＡ構造体とは、Ｐ１０領域とＡＳ領域が存在しないことを意味し、他の構成を排除する意味で使用されたものではない。同様に、Ｐ１領域及びＡＳ領域のみ含む自己環状化ＲＮＡ構造体は、Ｐ１０領域が存在しないことを意味するものである、Ｐ１０領域以外の他の構成を排除する意味で使用されたものではない。
【実施例】
【0045】
以下、添付の図面を参照しながら実施形態を詳細に説明する。しかし、実施形態には、様々な変更を加えることができるため、特許出願の権利範囲はこれらの実施形態によって制限又は限定されることはない。実施形態に対する全ての変更、均等物ないし代替物が権利範囲に含まれるものと理解されるべきである。
【0046】
実施形態で使用された用語は、単に説明の目的で使用されたものであり、限定することを意図するものと解釈されるべきではない。単数の表現は、文脈上明らかに異なる意味をもたない限り、複数の表現を含む。本明細書において、「含む」又は「有する」などの用語は、明細書上に記載の特徴、数字、工程、動作、構成要素、部品、又はそれらを組み合わせたものが存在すること指定するものであり、１つ又はそれ以上の他の特徴や数字、工程、動作、構成要素、部品、又はそれらを組み合わせたものの存在又は付加の可能性を予め排除しないものとして理解されるべきである。
【0047】
別の定義がない限り、技術的又は科学的な用語を含む本発明で使用される全ての用語は、実施形態が属する技術分野で通常の知識を有する者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般に使用される所定の用語は、関連技術の文脈上で有する意味と一致する意味を有するものとして解釈されるべきであって、本出願で明確に定義されない限り、理想的又は過度に形式的な意味として解釈されるべきではない。
【0048】
また、図面を参照して説明する際に、図面の符号に関係なく、同一の構成要素は同一の参照符号を付与し、これらに対する重複する説明は、省略することにする。実施形態の説明において、関連する公知技術に対する具体的な説明が実施形態の要旨を不要に曖昧にすると判断される場合には、その詳細な説明は省略する。
【0049】
実施例１．自己環状化ＲＮＡ設計及びＲＮＡ発現ベクター調製
自己環状化ＲＮＡは、図２Ｃのように設計し、これを発現するためのＤＮＡテンプレートに試験管内転写反応のためにＴ７プロモータ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）配列をさらに含めた（図２Ｄ）。ＤＮＡテンプレートは、Ｔ７ Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＧＧＧＡＴＴＣＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＣＡＴＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＧＴＣＧＡ－３’（Ｔｍ＝７７．５℃）、及びＴ７ Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＡＧＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＧＣＧＣＴＧＣＴＣＧＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴ－３’（Ｔｍ＝７９．４℃）を使用してＰＣＲで増幅し、ＤＮＡテンプレート増幅産物は、ＰｓｔＩ制限酵素を使用してｐＴＯＰ ＴＡＶ２ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）に挿入して自己環状化ＲＮＡ発現ベクターを調製した。
自己環状化ＲＮＡは、図２Ｃのように設計し、これを発現するためのＤＮＡテンプレートに試験管内転写反応のためにＴ７プロモータ（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）配列をさらに含めた（図２Ｄ）。ＤＮＡテンプレートは、Ｔ７ Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＧＧＧＡＴＴＣＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＣＡＴＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＧＴＣＧＡ－３’（Ｔｍ＝７７．５℃）、及びＴ７ Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＡＧＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＧＣＧＣＴＧＣＴＣＧＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴ－３’（Ｔｍ＝７９．４℃）を使用してＰＣＲで増幅し、ＤＮＡテンプレート増幅産物は、ＰｓｔＩ制限酵素を使用してｐＴＯＰ ＴＡＶ２ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）に挿入して自己環状化ＲＮＡ発現ベクターを調製した。
【0050】
実施例２．試験管内転写及び自己環状化の確認
２－１．試験管内転写（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＩＶＴ）
上記の実施例１で調製した自己環状化ＲＮＡ発現ベクターをＮＥＢのＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用してメーカーのプロトコルに従って試験管内転写を行った。具体的には、２０μＬ ｓｃａｌｅ（１μｇ Ｔ７ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ、１Ｘ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍＭ ｅａｃｈ ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｘ ２μＬ）で、３７℃で３時間反応後、２９μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを追加した後、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ（１０Ｕ／μＬ）を１μＬ入れて３７℃で３０分反応させ、転写後に直ぐ環状化（ｄｉｒｅｃｔ ＳＴＳ）反応を誘導した。
２－１．試験管内転写（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＩＶＴ）
上記の実施例１で調製した自己環状化ＲＮＡ発現ベクターをＮＥＢのＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用してメーカーのプロトコルに従って試験管内転写を行った。具体的には、２０μＬ ｓｃａｌｅ（１μｇ Ｔ７ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ、１Ｘ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍＭ ｅａｃｈ ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｘ ２μＬ）で、３７℃で３時間反応後、２９μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを追加した後、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ（１０Ｕ／μＬ）を１μＬ入れて３７℃で３０分反応させ、転写後に直ぐ環状化（ｄｉｒｅｃｔ ＳＴＳ）反応を誘導した。
【0051】
次に、自己環状化反応が完了する工程を確認するために、追加の環状化反応を誘導した。具体的には、最初の自己標的化及びスプライシング（１ｓｔＳＴＳ）反応を誘導するために、さらにＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ２８μＬと２０μＬの５Ｘ ＳＴＳ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、２μＬの１００ｍＭ ＧＴＰ（最終２ｍＭ）を添加して、１００μＬの容量を作り、３７℃で１時間の間自己環状化反応をさせた。そして、５５℃で１５分間加熱した後、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用してカラム精製を行った。カラム精製された５０μＬの試料に再び２０μＬの５Ｘ ＳＴＳ ｂｕｆｆｅｒ、１００ｍＭ ＧＴＰ（最終２ｍＭ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ２８μＬを入れて最終１００μＬを作り、３７℃で３時間反応させて２番目のＳＴＳ（２ｎｄＳＴＳ）反応を誘導した。反応後に５５℃で８分加熱し、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用してカラム精製を行い、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)製品）装備を使用して濃度を測定した。
【0052】
一方、反応産物で線状ＲＮＡを除去するために１番目及び２番目のＳＴＳ反応後のカラム精製された試料中の一部に対してＲＮａｓｅ Ｒを処理した。具体的には、最大１００μｇ程度のカラム精製されたＩＶＴ ＲＮＡに、１０μＬの１０Ｘ ＲＮａｓｅ Ｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１０Ｘ：０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．０、１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）、ＲＮａｓｅ Ｒ ２０ Ｕｎｉｔを添加して（水で容量を１００μＬに合わせる）３７℃で３０分反応させた後、さらにＲＮａｓｅ Ｒ １０ ｕｎｉｔを添加して３０分さらに反応させた後、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用してカラム精製を行い、Ｎａｎｏｄｒｏｐで濃度を測定した。
【0053】
各ＳＴＳ工程別に得られたＲＮＡと各工程別に得られたＲＮＡにＲＮａｓｅ Ｒを処理した試料の各２５０ｎｇは、１０Ｍ Ｕｒｅａ－ＢＰＢ（１Ｘ ＴＢＥ）ｄｙｅと１：１で混合し、７５℃で５分間加熱した後４％ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ－７Ｍ Ｕｒｅａ ｄｅｎａｔｕｒｅ ＰＡＧＥ（５０℃温度保持し、５０Ｗ条件で２時間電気泳動）を行い、ＧｅｌをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ製品（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で染色してイメージクオント８００（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ８００）（Ｃｙｔｉｖａ社製品）を使用して分析した。
【0054】
その結果、図３で確認できるように、ＲＮａｓｅ Ｒを処理するとＲＮａｓｅ Ｒにうまく切断されず、豊富になるＲＮＡバンドが現れ（候補１）、これ以外にＲＮａｓｅ Ｒ処理にもかかわらず、明確に観察可能なバンドが確認された（候補２（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ２）及びＮｉｃｋｅｄ環状ＲＮＡと推定されるバンド）。また、追加の１ｓｔ及び２ｎｄＳＴＳ反応を行わなくとも、既にｄｉｒｅｃｔ ＳＴＳ反応、即ち試験管内転写反応のみでｃｉｒｃＲＮＡと推定される物質が十分に作られることを確認できた。
【0055】
２－２．自己環状化の確認
次に、ＰＡＧＥを行った結果、ＲＮａｓｅ Ｒによって切断されないＲＮＡバンドのうち、候補１がｃｉｒｃＲＮＡであることを検証するためにＲＴ－ＰＣＲ塩基配列分析を行った。具体的には、ＰＡＧＥで候補１の位置のバンドを切断してつぶした後、３７℃で３時間から最大１６時間まで水に溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）してエタノール沈殿（Ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）で精製した環状ＲＮＡ試料とリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）部位とアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）部位が存在せず、環状化することができない線状ＲＮＡを対照群としてｃｉｒｃＲＮＡが作られた時にのみＰＣＲ増幅が可能なプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を使用してＲＴ－ＰＣＲを行った。
次に、ＰＡＧＥを行った結果、ＲＮａｓｅ Ｒによって切断されないＲＮＡバンドのうち、候補１がｃｉｒｃＲＮＡであることを検証するためにＲＴ－ＰＣＲ塩基配列分析を行った。具体的には、ＰＡＧＥで候補１の位置のバンドを切断してつぶした後、３７℃で３時間から最大１６時間まで水に溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）してエタノール沈殿（Ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）で精製した環状ＲＮＡ試料とリボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）部位とアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）部位が存在せず、環状化することができない線状ＲＮＡを対照群としてｃｉｒｃＲＮＡが作られた時にのみＰＣＲ増幅が可能なプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を使用してＲＴ－ＰＣＲを行った。
【0056】
逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）は、ＯｎｅＳｃｒｉｐｔ Ｐｌｕｓ ＲＴａｓｅ（Ａｂｍ社）を利用し、１２５ｎｇの各ＲＮＡ（対照群ＲＮＡと環状ＲＮＡと推定されるＲＮＡにＲＮａｓｅ Ｒを処理又は未処理の試料）を７０℃で５分間加熱後、氷上に置き、順に５Ｘ ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ １μＬ、２μＭ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ＳＴＳ Ｒ）１μＬ、及びＯｎｅＳｃｒｉｐｔ Ｐｌｕｓ ＲＴａｓｅ ２００Ｕを入れ、最終２０μＬの容量で５０℃において１５分間反応させ、９５℃で５分間加熱して酵素を非活性化させた後、氷に保管した。
【0057】
次に、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ Ｔａｑ ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ社）を使用してＰＣＲを行い、２μＬのＲＴ試料と２０μＭのＣｉｒｃｕｌａｒ ＳＴＳ Ｆ（５’－ＣＣＣＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧ－３’）及びＣｉｒｃｕｌａｒ ＳＴＳ Ｒ（５’－ＣＡＧＣＡＡＧＣＡＴＡＣＴＡＡＡＴＴＧＣＣＡＧ－３’）を１μＬずつ入れ、水で２０μＬの容量に合わせて、９５℃１分、［９５℃３０秒、６５℃３０秒、７２℃３０秒］３５サイクル、７２℃５分の条件でＰＣＲ増幅を行った。５μＬのＰＣＲ産物を１μＬの６Ｘ ＤＮＡローディングダイに入れて１５０Ｖで３５分電気泳動した後、ゲル撮影装置（ｇｅｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）（ＹＯＵＮＧ ＩＮ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社のＤａｖｉｎｃｈ－Ｇｅｌ製品）で画像を分析した。予想されるＳＴＳ ＰＣＲ産物の長さは、４７９ｂｐであり、１．５％のアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）（イントロンバイオ製品のＲｅｄＳａｆｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎが１Ｘ濃度で含有）でＧｅｎｅＲｕｌｅｒ ５０ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で分析した時、環状ＲＮＡと推定されるＲＮＡ試料の場合にのみＲＮａｓｅ Ｒ処理に関係なく予測されるサイズの特異的なＰＣＲ産物が観察された（図４Ａ）。
【0058】
また、得られた予想されるサイズのバンドにおいて、ゲル抽出キット(ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ)（ＣＯＳＭＯ Ｇｅｎｅｔｅｃｈ社製品）を使用してメーカーのプロトコルに従ってＰＣＲ産物を分離及び精製し、ＴＯＰｃｌｏｎｅｒ ＴＡ－Ｂｌｕｎｔ ｋｉｔ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ社製品）を使用してクローニングし、ＤＨ５ａｌｐｈａ大腸菌（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ社製品）に形質転換し、ＬＢ－Ａｇａｒ（カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を含む）プレートで大腸菌コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を得て、プラスミドＤＮＡ(ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ)をＤＮＡ精製キット(ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ)（ＣＯＳＭＯ Ｇｅｎｅｔｅｃｈ社製品）を使用してメーカーのプロトコルに従って抽出及び精製して塩基配列分析を依頼した結果（ＣＯＳＭＯ Ｇｅｎｅｔｅｃｈ社のサンガー法（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）サービス、業者で提供するＭ１３Ｒ（－４０）又はＭ１３Ｆ（－２０）ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒを利用）、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の３’とＩＲＥＳの５’がＳＴＳ ｊｕｎｃｔｉｏｎ部位で正確に連結されたことを確認することができた（図４Ｂ）。
【0059】
上記の結果から、候補１が環状のＲＮＡであることが分かる。
【0060】
２－３．自己環状化再検証
ＲＴ－ＰＣＲにより、候補１がｃｉｒｃＲＮＡであることを確認したが、理論的には、候補１がダイマー（ｄｉｍｅｒ）の形態である可能性を排除することはできない。ここで、ニッキングテスト（ｎｉｃｋｉｎｇ ｔｅｓｔ）を行って候補１がｃｉｒｃＲＮＡであることを再検証することにした。
ＲＴ－ＰＣＲにより、候補１がｃｉｒｃＲＮＡであることを確認したが、理論的には、候補１がダイマー（ｄｉｍｅｒ）の形態である可能性を排除することはできない。ここで、ニッキングテスト（ｎｉｃｋｉｎｇ ｔｅｓｔ）を行って候補１がｃｉｒｃＲＮＡであることを再検証することにした。
【0061】
精製した環状ＲＮＡ ｃａｎｄｉｄａｔｅ１及び２（１００ｎｇ）にＭｇＣｌ２をそれぞれ最終０、２．５、５ｍＭで混合し、最終１０μＬの水に存在する試料を６５℃で３０分間加熱し、次に氷上でしばらく保管した後、１０μＬの１０Ｍ Ｕｒｅａ－ＢＰＢ（１Ｘ ＴＥＢ）ローディングダイ（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ）を混合した。
【0062】
７５℃で５分間加熱した後、４％ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ－７ Ｍ Ｕｒｅａ ｄｅｎａｔｕｒｅ ＰＡＧＥ（５０℃温度保持し、５０Ｗ条件で２時間電気泳動）を行い、ＧｅｌをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ製品（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で染色（ｓｔａｉｎｉｎｇ）してイメージクオント８００（Ｃｙｔｉｖａ社製品）を使用して分析した結果は、図５の通りである。
【0063】
候補１の場合、Ｍｇ２＋がない条件でわずかにｎｉｃｋｅｄ環状ＲＮＡに該当するサイズのバンドが含まれており（１０９２－ｎｔ）、２．５ｍＭ Ｍｇ２＋条件の場合、環状ＲＮＡの位置と考えられる候補１の位置のバンドが減ることを確認し、依然としてｎｉｃｋｅｄ環状ＲＮＡサイズのバンドが存在することを確認した。５ｍＭ Ｍｇ２＋条件の場合、ｎｉｃｋｅｄ環状ＲＮＡバンドまで加水分解により全て消失することを確認できた。これにより、候補１、即ち環状ＲＮＡがｎｉｃｋｉｎｇが起きたときにモノマーと予想される１０９２－ｎｔサイズを経て（２．５ｍＭ Ｍｇ２＋）、最終的に全て分解される（５ｍＭ Ｍｇ２＋）を観察したため、候補１が環状ＲＮＡでありモノマーであることを再確認することができた。
【0064】
一方、候補２は、ｉｎｔａｃｔ ＲＮＡのサイズである１８７４－ｎｔに類似のサイズ（マーカーの２０００－ｎｔ周辺）を有し、２．５ｍＭ Ｍｇ２＋条件のｍｉｌｄなｎｉｃｋｉｎｇ条件で、候補１とは異なるｎｉｃｋｅｄ環状ＲＮＡのサイズである１０９２－ｎｔバンドが生成されずに消失してしまったが、環状ＲＮＡではないことが分かった。
【0065】
実施例３．細胞内転写及び自己環状化確認
実施例２において、実施例１で調製した自己環状化ＲＮＡ発現ベクターが試験管内で転写されてｃｉｒｃＲＮＡを形成することを確認したが、ベクターが細胞内でも同様に作動するのか、さらにｃｉｒｃＲＮＡが含む目的遺伝子が細胞内で円滑に発現されることを確認しようとした。
実施例２において、実施例１で調製した自己環状化ＲＮＡ発現ベクターが試験管内で転写されてｃｉｒｃＲＮＡを形成することを確認したが、ベクターが細胞内でも同様に作動するのか、さらにｃｉｒｃＲＮＡが含む目的遺伝子が細胞内で円滑に発現されることを確認しようとした。
【0066】
細胞内で目的遺伝子の発現のために、目的遺伝子は、５’－ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ－トランスジーン－終止コドン－３’（５’－ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ－ｔｒａｎｓｇｅｎｅ－ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ－３’）の構造で設計し、発現した目的遺伝子の容易な確認のために、トランスジーンにはガウシアルシフェラーゼ（Ｇ．ｌｕｃｉ）を利用した。
【0067】
上述した目的遺伝子を含む自己環状及びＲＮＡ構造体を設計し、これを発現できるＤＮＡテンプレートをｐＣＭＶプロモータの下で発現するようにプラスミドに挿入した（図６Ａ）。プラスミドベクターを２９３Ａ細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、ｃｉｒｃＲＮＡの生成をＲＴ－ＰＣＲ及び塩基配列分析により確認し、トランスジーンの発現は、ルシフェラーゼ活性分析を行って確認した。
【0068】
具体的には、６ウェルプレート(ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ)に２ｘ１０５／ｗｅｌｌで２９３Ａ細胞をシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、２４時間後にリポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）を使用して、プラスミドベクターで形質転換した。形質転換の６時間後に培養液を交換した。そして、形質転換後の１２、２４、及び４８時間に１００μＬ培養液を回収してＧ．ｌｕｃｉ ａｃｔｉｖｉｔｙを測定した。培養液でＧ．ｌｕｃｉ活性が検出され、時間の経過とともに、活性が増加することを確認し、細胞内導入されたベクターにおいてトランスジーンであるＧ．ｌｕｃｉ遺伝子が発現されたことを確認した（図６Ｂ）。
【0069】
トランスジーンの発現がｃｉｒｃＲＮＡの形成によるものであるかをＲＴ－ＰＣＲと塩基配列分析により分子レベルで確認した。形質転換後の４８時間時間後、プラスミドベクターが導入された２９３Ａ細胞からトリゾール試薬（ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ）を使用してトータルＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を抽出した後、ＲＴ－ＰＣＲを行い、環状ＲＮＡが生成されたことを確認した。
【0070】
逆転写（ＲＴ）は、ＯｎｅＳｃｒｉｐｔ Ｐｌｕｓ ＲＴａｓｅ（Ａｂｍ社製品）を利用し、１μｇのトータルＲＮＡを７０℃で５分間加熱後、氷上に置き、順に５Ｘ ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ １μＬ、２μＭ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ＳＴＳ Ｒ）１μＬ、ＯｎｅＳｃｒｉｐｔ Ｐｌｕｓ ＲＴａｓｅ ２００Ｕを入れて、最終に２０μＬの容量で、５０℃で１５分間反応させ、９５℃で５分間加熱して酵素を非活性化させた後、氷に保管した。
【0071】
次に、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ Ｔａｑ ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ社製品）を使用してＰＣＲを行い、２μＬのＲＴ試料と２０μＭのＣｉｒｃｕｌａｒ ＳＴＳ ｐｒｉｍｅｒ Ｆ（５－ｃａａｇｇａｃｔｔｇｇａｇｃｃｃａｔｇｇａｇｃａｇ－３）と、ｐｒｉｍｅｒ Ｒ（５－ｔｇｔｇｃｃｇｃｃｔｔｔｇｃａｇｇｔｇｔａｔｃ－３）とを１μＬずつ入れ、水で２０μＬの容量に合わせて９５℃１分、［９５℃３０秒、６５℃３０秒、７２℃３０秒］３５サイクル、７２℃５分の条件でＰＣＲ増幅を行った。予想されるＳＴＳ ＰＣＲ産物の長さは、４７９ｂｐであり、１．５％のアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）（イントロンバイオ製品のＲｅｄＳａｆｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎが１Ｘ濃度で含有）でＧｅｎｅＲｕｌｅｒ ５０ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社の製品）で分析したとき、環状ＲＮＡが存在する場合にのみ予測されるサイズの特異的なＰＣＲ産物を確認することができた。ここで、５μＬのＰＣＲ産物は、１μＬの６Ｘ ＤＮＡローディングダイに入れて１５０Ｖで３５分電気泳動した後、ゲル撮影装置（ｇｅｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）（ＹＯＵＮＧ ＩＮ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社のＤａｖｉｎｃｈ－Ｇｅｌ製品）で画像を分析した（図６Ｃ）。
【0072】
また、得られた予想されるサイズのバンドは、ゲル抽出キット（ＣＯＳＭＯ Ｇｅｎｅｔｅｃｈ社製品）を使用してメーカーのプロトコルに従ってＰＣＲ産物を分離及び精製とＴＯＰｃｌｏｎｅｒ ＴＡ－Ｂｌｕｎｔ ｋｉｔ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ社製品）を使用してクローニングし、ＤＨ５ａｌｐｈａ大腸菌（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ社製品）に形質転換し、ＬＢ－Ａｇａｒ（カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を含む）プレートで大腸菌コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を得て、プラスミドＤＮＡをＤＮＡ精製キット（ＣＯＳＭＯ Ｇｅｎｅｔｅｃｈ社製品）とマニュアルを使用して抽出及び精製して塩基配列分析を依頼した結果（ＣＯＳＭＯ Ｇｅｎｅｔｅｃｈ社のサンガー法（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）サービス、業者で提供するＭ１３Ｒ（－４０）又はＭ１３Ｆ（－２０）ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒを利用）、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の３’とＩＲＥＳの５’がＳＴＳ ｊｕｎｃｔｉｏｎ部位で正確に連結された塩基配列を確認することができた（図６Ｄ）。
【0073】
上記から、調製されたプラスミドベクターが細胞内で自己環状化ＲＮＡ構造体を発現し、構造体は、リボザイムによってｃｉｒｃＲＮＡに環状化され、ｃｉｒｃＲＮＡで目的遺伝子が発現することを分子レベルで確認することができた。
【0074】
実施例４．ｃｉｒｃＲＮＡ精製
４－１．ＨＰＬＣ実行によるｃｉｒｃＲＮＡ精製の可能性の確認
人体注入のためのｃｉｒｃＲＮＡの調製における免疫原性の発生を最小にするために、ＨＰＬＣを用いた分析及び精製を行った。具体的には、ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ Ｂｉｏ ＵＨＰＬＣシステムを利用し、分析条件は図７Ａの通りである。分析には、［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ］のグラジェント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）条件を使用し、試料の分取は、［Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ］の条件を使用した。
４－１．ＨＰＬＣ実行によるｃｉｒｃＲＮＡ精製の可能性の確認
人体注入のためのｃｉｒｃＲＮＡの調製における免疫原性の発生を最小にするために、ＨＰＬＣを用いた分析及び精製を行った。具体的には、ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ Ｂｉｏ ＵＨＰＬＣシステムを利用し、分析条件は図７Ａの通りである。分析には、［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ］のグラジェント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）条件を使用し、試料の分取は、［Ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ］の条件を使用した。
【0075】
ＩＶＴを行った後、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用してカラム精製のみ行ったＲＮＡ（図７Ｂ）とＲＮａｓｅ Ｒを処理したＲＮＡ（図７Ｃ）を分析してみると、ＲＮａｓｅ Ｒを処理した試料で増加するピークが存在し、これから、ＲＮａｓｅ Ｒ処理なしでｃｉｒｃＲＮＡをＨＰＬＣで分離できることが分かった。
【0076】
４－２．ＨＰＬＣ実行によるｃｉｒｃＲＮＡ精製
ＨＰＬＣを介してフラクションコレクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の条件に示されたグラジェント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）を使用して分取し、図８Ａのように各フラクションを確保した。ピークが明確な７番及び１０番～１３番のフラクションを４％ ｄｅｎａｔｕｒｅ ＰＡＧＥで各２００ｎｇずつかけ、先の方法と同様に電気泳動を行った。
ＨＰＬＣを介してフラクションコレクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の条件に示されたグラジェント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）を使用して分取し、図８Ａのように各フラクションを確保した。ピークが明確な７番及び１０番～１３番のフラクションを４％ ｄｅｎａｔｕｒｅ ＰＡＧＥで各２００ｎｇずつかけ、先の方法と同様に電気泳動を行った。
【0077】
その結果、図８Ｂに確認されるように、フラクション１２できれいな環状ＲＮＡが分離精製された。
【0078】
実施例５．ＡＳ（アンチセンス配列）領域の最適化
試験管内転写過程中における即座の環状化反応にＡＳ（アンチセンス配列）領域とその逆相補的なＡＢＳ（アンチセンス結合配列）領域の長さが及ぼす影響の確認を試みた。ここで、ＡＳ領域とＡＢＳ領域の長さを５０、１００、１５０、２００、２５０、又は３００－ｎｔと異なるＤＮＡテンプレートを調製し（図９）、実施例１と同様に各ＲＮＡ構造体を発現できるベクターを調製し、実施例２と同様に３７℃で３時間試験管内転写を行い、即座にＳＴＳ反応程度を４％ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ－７ Ｍ Ｕｒｅａ ｇｅｌ（２０×２０ｃｍ、１ｍｍ）でＰＡＧＥを実施し、相対バンド強度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）で比較確認した。
試験管内転写過程中における即座の環状化反応にＡＳ（アンチセンス配列）領域とその逆相補的なＡＢＳ（アンチセンス結合配列）領域の長さが及ぼす影響の確認を試みた。ここで、ＡＳ領域とＡＢＳ領域の長さを５０、１００、１５０、２００、２５０、又は３００－ｎｔと異なるＤＮＡテンプレートを調製し（図９）、実施例１と同様に各ＲＮＡ構造体を発現できるベクターを調製し、実施例２と同様に３７℃で３時間試験管内転写を行い、即座にＳＴＳ反応程度を４％ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ－７ Ｍ Ｕｒｅａ ｇｅｌ（２０×２０ｃｍ、１ｍｍ）でＰＡＧＥを実施し、相対バンド強度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）で比較確認した。
【0079】
各ＡＳ領域の塩基配列は、以下の表１に示した。
【0080】
【表1】
【0081】
その結果、図１０及び下の表２で確認できるように、ＡＳ５０、ＡＳ１００、ＡＳ１５０の場合、自己環状化効率がＡＳ２００以上の長さに比べて相対的に優れていた。一方、ＡＳ５０とＡＳ１００は、試験管内転写反応以後に生産された全体のＲＮＡが顕著に少なかった。従って、自己環状化ＲＮＡ構造体の発現及び環状のＲＮＡ調製において、ＡＳ１５０が最適な長さであることが分かった。
【0082】
【表2】
【0083】
実施例６．スペーサ領域の最適化
次に、試験管内転写過程中に即座の環状化反応にスペーサ領域の長さ又は種類が及ぼす影響を確認するために、互いに異なる長さ及び塩基配列のスペーサ領域を含むＤＮＡテンプレートを調製し（図１１）、実施例１と同様に各ＲＮＡ構造体を発現できるベクターを調製し、実施例２と同様に３７℃で３時間試験管内転写を行い、即座にＳＴＳ反応程度を４％ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ－７ Ｍ Ｕｒｅａ ｇｅｌ（２０×２０ｃｍ、１ｍｍ）でＰＡＧＥを実施し、相対バンド強度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）で比較確認した。各スペーサ領域の塩基配列は、下の表３と同様に、本試験でＡ１０、Ａ３０、及びＡ３０のスペーサは、スペーサ領域の直後にＩＲＥＳ挿入のために３’末端に制限認識部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を付加して利用した。本試験ではスペーサの３’末端にＡａｔＩＩｓｉｔｅ（ＧＡＣＧＴＣ）を付加して利用した。
次に、試験管内転写過程中に即座の環状化反応にスペーサ領域の長さ又は種類が及ぼす影響を確認するために、互いに異なる長さ及び塩基配列のスペーサ領域を含むＤＮＡテンプレートを調製し（図１１）、実施例１と同様に各ＲＮＡ構造体を発現できるベクターを調製し、実施例２と同様に３７℃で３時間試験管内転写を行い、即座にＳＴＳ反応程度を４％ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ－７ Ｍ Ｕｒｅａ ｇｅｌ（２０×２０ｃｍ、１ｍｍ）でＰＡＧＥを実施し、相対バンド強度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）で比較確認した。各スペーサ領域の塩基配列は、下の表３と同様に、本試験でＡ１０、Ａ３０、及びＡ３０のスペーサは、スペーサ領域の直後にＩＲＥＳ挿入のために３’末端に制限認識部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を付加して利用した。本試験ではスペーサの３’末端にＡａｔＩＩｓｉｔｅ（ＧＡＣＧＴＣ）を付加して利用した。
【0084】
【表3】
【0085】
その結果、図１２及び下の表４で確認できるように、スペーサの長さとシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の違いにもかかわらず、試験管内転写過程で即座の環状化効率に大きな差は示されなかったが、自己環状化ＲＮＡ構造体の発現及び環状のＲＮＡ調製において、Ａ３０が最適なスペーサ（Ｓｐａｃｅｒ）として動作することが分かった。
【0086】
【表4】
【0087】
実施例７．自己環状化ＲＮＡ構造体最適化
７－１．ＡＳ領域、Ｐ１ヘリックス、及びＰ１０ヘリックス領域
実施例１で設計した自己環状化ＲＮＡ構造体は、ＡＳ領域、Ｐ１ヘリックス、及びＰ１０ヘリックス領域を含む。以下、各構成が試験管内転写過程中に即座の環状化反応に及ぼす影響を確認するために、図１３に図式化したように、Ｐ１ヘリックス領域のみ含むか、Ｐ１及びＰ１０ヘリックス領域のみ含むか、Ｐ１及びＰ１０ヘリックスとＡＳ領域を全て含むＤＮＡテンプレートとを調製し、実施例１と同様に各ＲＮＡ構造体を発現できるベクターを調製し、実施例２と同様に３７℃で３時間試験管内転写を行い、即座にＳＴＳ反応程度を４％ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ－７ Ｍ Ｕｒｅａ ｇｅｌ（２０×２０ｃｍ、１ｍｍ）でＰＡＧＥを行って相対バンド強度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）で比較確認した。
７－１．ＡＳ領域、Ｐ１ヘリックス、及びＰ１０ヘリックス領域
実施例１で設計した自己環状化ＲＮＡ構造体は、ＡＳ領域、Ｐ１ヘリックス、及びＰ１０ヘリックス領域を含む。以下、各構成が試験管内転写過程中に即座の環状化反応に及ぼす影響を確認するために、図１３に図式化したように、Ｐ１ヘリックス領域のみ含むか、Ｐ１及びＰ１０ヘリックス領域のみ含むか、Ｐ１及びＰ１０ヘリックスとＡＳ領域を全て含むＤＮＡテンプレートとを調製し、実施例１と同様に各ＲＮＡ構造体を発現できるベクターを調製し、実施例２と同様に３７℃で３時間試験管内転写を行い、即座にＳＴＳ反応程度を４％ Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ－７ Ｍ Ｕｒｅａ ｇｅｌ（２０×２０ｃｍ、１ｍｍ）でＰＡＧＥを行って相対バンド強度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）で比較確認した。
【0088】
Ｐ１ヘリックス領域のみ含むＴ７ ＤＮＡテンプレートの塩基配列は、図１４の通りである。
【0089】
その結果、図１５及び下の表５で確認できるように、各ベクターが試験管内転写生成された総ＲＮＡには、大きな差はなかったが、Ｐ１及びＰ１０ヘリックスとＡＳ領域を全て含む場合、Ｐ１ヘリックス領域のみ含む場合、Ｐ１及びＰ１０領域のみ含む場合の順序で環状ＲＮＡ生成量が多いことが分かった。
【0090】
【表5】
【0091】
７－２．Ｐ１０及びＡＳ領域を含まない自己環状化ＲＮＡ構造体の環状化検証
実施例７－１の結果から、Ｐ１０及びＡＳ領域を含まないＤＮＡテンプレート（Ｐ１構造体）で試験管内転写過程中に追加的な環状化工程なしで十分なｃｉｒｃＲＮＡを調製できることが分かる。これを検証するために、実施例７－１のＳＴＳ反応後産物にＲＮａｓｅ Ｒを処理して線状ＲＮＡを除去し、先の試験と同様にＰＡＧＥを行い、実施例２－２と同様にＲＴ－ＰＣＲ及び塩基配列分析を行った。
実施例７－１の結果から、Ｐ１０及びＡＳ領域を含まないＤＮＡテンプレート（Ｐ１構造体）で試験管内転写過程中に追加的な環状化工程なしで十分なｃｉｒｃＲＮＡを調製できることが分かる。これを検証するために、実施例７－１のＳＴＳ反応後産物にＲＮａｓｅ Ｒを処理して線状ＲＮＡを除去し、先の試験と同様にＰＡＧＥを行い、実施例２－２と同様にＲＴ－ＰＣＲ及び塩基配列分析を行った。
【0092】
その結果、図１６Ａ及び図１６Ｂで確認できるように、Ｐ１構造体を使用して自己環状化を行った場合にも、ＲＮａｓｅ Ｒを処理するとＲＮａｓｅ Ｒにうまく切断されず、豊富になるＲＮＡバンドが観察され、バンドにＳＴＳ反応産物をＲＴ－ＰＣＲと塩基配列分析を行った結果、ｃｉｒｃＲＮＡであることを確認した。
【0093】
実施例８．Ｐ１ヘリックス領域最適化
実施例７の結果によって、Ｐ１０とＡＳ及びＡＢＳがない自己環状化構造体も十分にｃｉｒｃＲＮＡを作ることができることを確認した。ここで、Ｐ１ヘリックスを構成する５’末端に存在する内部ガイド配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＩＧＳ）と３’末端に存在する標的部位の塩基配列のみを互いに相補的に結合させれば（ＵとＧはゆらぎ塩基対）、環状ＲＮＡが生成されるものと仮定し、それを検証することにした。
実施例７の結果によって、Ｐ１０とＡＳ及びＡＢＳがない自己環状化構造体も十分にｃｉｒｃＲＮＡを作ることができることを確認した。ここで、Ｐ１ヘリックスを構成する５’末端に存在する内部ガイド配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＩＧＳ）と３’末端に存在する標的部位の塩基配列のみを互いに相補的に結合させれば（ＵとＧはゆらぎ塩基対）、環状ＲＮＡが生成されるものと仮定し、それを検証することにした。
【0094】
ＩＧＳ領域は、ＧＮＮＮＮＮであり、標的部位塩基配列は、Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’Ｕであるため、ＧＯＩにＵ１つのヌクレオチドのみ追加すると、最終的に生成されるｃｉｒｃＲＮＡは、１つのＵ塩基とＧＯＩ領のみから構成される。（図１Ａ及び図１Ｂ）。また、ＧＯＩの３’末端がＵ塩基で終わる場合、ＩＧＳ領域の塩基配列をＧＯＩと逆相補的で設計することにより最終的に生成されるｃｉｒｃＲＮＡがＧＯＩ領域のみで構成されるように調製することができる（図２０Ａ及び図２０Ｂ）。
【0095】
図１７に示すようにＩＧＳと標的部位の配列を多様に設計し、実施例１の方法でベクターを調製した後、実施例２－１の試験管内転写を行った。
【0096】
その結果、図１８～図１９及び下の表６で確認できるように、両末端が相補的（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）なシーケンスを有する場合、試験管内転写後に、即座にＳＴＳ反応によって生成されたｃｉｒｃＲＮＡ増加を確認することができ、Ｎｏ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ＩＧＳ領域を含むベクターは、非常に低いレベルのｃｉｒｃＲＮＡを生成することが分かった。上記から、ＩＧＳと標的部位は、互いに相補的であれば、いずれも効率的に自己環状化反応を誘導できることが分かる。
【0097】
【表6】
【0098】
以上、本発明の実施形態について図面を参照しながら詳細に説明したが、当技術分野で通常の知識を有する者であれば、上記に基づいて様々な技術的修正及び変形を適用することができる。例えば、説明された技術は、説明された方法と異なる順序で実行されるか、及び／又は説明されたシステム、構造、装置、回路などの構成要素が説明された方法と異なる形態で結合又は組み合わせられ、他の構成要素又は均等物によって代替又は置換されても適切な結果が達成され得る。
【0099】
従って、他の具現、他の実施形態、及び特許請求の範囲と均等なものなども、後述する特許請求の範囲の範囲に属する。
【産業上の利用可能性】
【0100】
本発明は、試験管内、細胞内、及び生体内におけるタンパク質発現のためのｃｉｒｃＲＮＡの調製に用いることができ、ｍｉＲＮＡ、ａｎｔｉ－ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｐｔａｍｅｒ、ｍＲＮＡワクチン、ｍＲＮＡ治療薬、抗体、ワクチン補助剤、ＣＡＲ－Ｔ ｍＲＮＡなどの機能性ＲＮＡをｃｉｒｃＲＮＡで調製するために使用することができる。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【配列表】