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特許7531250５’－ヌクレオチダーゼ変形タンパク質を暗号化するがん治療のためのポリヌクレオチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-01
(45)【発行日】2024-08-09
(54)【発明の名称】５’－ヌクレオチダーゼ変形タンパク質を暗号化するがん治療のためのポリヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7105 20060101AFI20240802BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240802BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20240802BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7105
A61P35/00
C12N15/55 ZNA
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2023517328
(86)(22)【出願日】2021-08-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-10-05
(86)【国際出願番号】 KR2021011702
(87)【国際公開番号】W WO2022065725
(87)【国際公開日】2022-03-31
【審査請求日】2023-03-13
(31)【優先権主張番号】10-2020-0122164
(32)【優先日】2020-09-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】523092759
【氏名又は名称】ビーピージーン カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イ、ヒョン チョル
(72)【発明者】
【氏名】ク、ポン ソン
(72)【発明者】
【氏名】ソ、ヒョン チョン
(72)【発明者】
【氏名】キム、チン ソク
【審査官】三谷 直也
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１０－２４６４０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５００３９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】Hyeon Cheol LEE et al.，Biotechnology Letters，2004年，Vol. 26，pp. 265-268
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ａ６１Ｋ ３１／３３－３３／４４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む抗がん剤。
【請求項2】
前記ポリヌクレオチドはｍＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の抗がん剤。
【請求項3】
前記ｍＲＮＡはがん細胞に進入して核酸代謝を阻害することを特徴とする請求項２に記載の抗がん剤。
【請求項4】
前記核酸代謝はｄＴＴＰ生合成代謝であることを特徴とする請求項３に記載の抗がん剤。
【請求項5】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号１９で表される５’－ＵＴＲと、配列番号２０で表される３’－ＵＴＲとを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の抗がん剤。
【請求項6】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号２３で表される核位置信号（ＮＬＳ）をコードする核酸配列を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の抗がん剤。
【請求項7】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号２４で表されるミトコンドリア位置信号（ＭＬＳ）をコードする核酸配列を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の抗がん剤。
【請求項8】
前記がんは大腸がんまたは乳がんであることを特徴とする請求項１に記載の抗がん剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はがん治療のためのポリヌクレオチドに関し、より詳しくは、薬物伝達物質に捕集された形態で使用されるがん治療のためのポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【0002】
がん細胞は、免疫細胞がＣＤ４７のような他の細胞を破壊することを防ぐために一般哺乳類生化学で使用される信号を濫用する。このような「私を食うな（ｄｏｎｔ’ ｅａｔ ｍｅ）」という信号を妨害することは、様々な種類のがんを標的にする効果的ながん治療法の開発に相当な利益をもたらした。
【0003】
一般に、マクロファージと呼ばれる免疫細胞はがん細胞を感知した後、それらを呑み込んで食いつくす。研究者らは、最近数年間にわたって、細胞表面のタンパク質がマクロファージに自らを食うか破壊するなという信号を送るという事実を発見した。これは免疫システムが正常な細胞を攻撃しないように保護するのに有用であるが、がん細胞をそれを利用して免疫システムを回避するためにこのような「私を食うな」という信号を使用している。研究者らは、以前、タンパク質ＰＤ－Ｌ１と主要な組織適合性１級複合体のβ２－マイクログロブリンサブユニットが、がん細胞が免疫細胞から自らを保護するのに活用しているという事実を明らかにした。ＣＤ４７を遮断する抗体は現在臨床試験中であり、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤＬ１受容体をターゲットにするがんの治療法が患者の治療に活用されている。
【0004】
この研究は、多くのがんが正常細胞と周辺組織に比べＣＤ４７を豊富に生産するということを示した。最近の研究では、研究者らは、主要に浸透するマクロファージがＳｉｒｐαという受容体を介してＣＤ４７信号を感知するという事実を明らかにした。彼らはまた、皿に患者のがん細胞とマクロファージを混ぜてＣＤ４７とＳｉｒｐαの相互作用を遮断するとマクロファージががん細胞を食いつくし始めるという事実も示した。最後に、彼らはマウスにヒト乳がん細胞を移植した。ＣＤ４７信号が遮断されたら、マウス免疫系のマクロファージががんを攻撃した。特に注目すべきことは、ＣＤ４７信号を遮断して血液がんとトリプルネガティブ乳がんに大きな影響を及ぼすという発見であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】韓国公開特許 第２００６－０１２１１５０号（２００６．１１．２８．）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明はがん治療のための新規ポリヌクレオチドであって、ＣＤ４７に結合するバインダと複合体を形成するリポソーム型ナノ粒子に捕集された形態で使用され、がん細胞の代謝脆弱性（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ）を極大化してがん細胞を死滅するメカニズムを有するがん治療のためのポリヌクレオチドを提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
前記課題を解決するために、本発明は、配列番号３で表されるアミノ酸配列を暗号化するがん治療のためのポリヌクレオチドを提供する。
【0008】
また、前記ポリヌクレオチドはｍＲＮＡであることを特徴とするがん治療のためのポリヌクレオチドを提供する。
【0009】
また、前記ｍＲＮＡはがん細胞に進入して核酸代謝を阻害することを特徴とする治療のためのポリヌクレオチドを提供する。
【0010】
また、前記核酸代謝はｄＴＴＰ生合成代謝であることを特徴とするがん治療のためのポリヌクレオチドを提供する。
【0011】
また、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１９で表される５’－ＵＴＲと、配列番号２０で表される３’－ＵＴＲとを更に含むことを特徴とするがん治療のためのポリヌクレオチドを提供する。
【0012】
また、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２３で表される核位置信号（ＮＬＳ）を暗号化する核酸配列を更に含むことを特徴とするがん治療のためのポリヌクレオチドを提供する。
【0013】
また、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２４で表されるミトコンドリア位置信号（ＭＬＳ）を暗号化する核酸配列を更に含むことを特徴とするがん治療のためのポリヌクレオチドを提供する。
【0014】
また、前記がんは大腸がんまたは乳がんであることを特徴とするがん治療のためのポリヌクレオチドを提供する。
【発明の効果】
【0015】
本発明はＣＤ４７に結合するバインダと複合体を形成するリポソーム型ナノ粒子に捕集された形態で使用され、がん細胞の代謝脆弱性を極大化してがん細胞を死滅するメカニズムを有するがん治療のためのポリヌクレオチドであって、ヒト細胞内に伝達された際に非特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＭＡ）として作用する部位を最小化し、発現を最大化するように遺伝子配列が最適化された治療のためのポリヌクレオチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】Ｓｉｒｐα、ＳＶ１、及びＳＶ４のアミノ酸配列を比較して示す図である。太字は部分的に保存されていない残基を示す。シーケンス整列はＣｌｕｓｔａｌＷで行われ、画像はＢｉｏＥｄｉｔシーケンス整列編集プログラムで生成された。
【図2】正しい方向性のためのＳＶ１の突然変異を説明する図であって、ＳＶドメイン（実線ボックス）がＣＤ４７（点線ボックス）ドメインと結合されており、図２ＡのモデルではＳＶドメイン（実線ボックス）はリシン残基が正しい方向性に影響を及ぼしていることが分かり、ＳＶ４はＣＤ４７に対する正しい結合に妨害されていない残基（下線）を選択して変位したことを示す図である。図２Ｂは正しい方向性のためのＳＶ１の突然変異を説明する図であって、ＤＳＰＥ－コンジュゲートされたＳＶ１及びＳＶ４の質量分析法（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）を利用して変位によってＤＳＰＥ－コンジュゲートが単純化された分析結果を示す図である。
【図3】Ｔ００１及びヒトＮＴ５Ｍの保存性モチーフを示す図である。Ｔ００１及びヒトＮＴ５Ｍのシーケンス整列であって、ヒトＮＴ５Ｍ及びＴ００１の配列上の類似性を確認するためにＣｌｕｓｔａｌＷを介して配列した。整列に使用されたシーケンスのＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬアクセション番号はヒトＮＴ５Ｍ及びＴ００１である。反転されたフィールドは完全に保存されたアミノ酸残基を示し、ホックすフィールドは類似した生化学的機能を有する部分的に保存されたアミノ酸残基を示す。シーケンス整列はＣｌｕｓｔａｌＷで行われ、画像はＥＳＰｒｉｐｔサーバで生成された。
【図4】Ｔ００１及びＮＴ５Ｍの構造を比較して示すモデルである。細胞質Ｔ００１（ＣＴ）とｄＴＭＰ－結合ヒトＮＴ５Ｍを重畳して示しており、殆どの鎖は構造的に非常に類似しているが、結合ループ部位はＮＴ５Ｍには存在せずＣＴにのみ存在することを示す。
【図5】Ｔ００１の最適発現のためのＵＴＲスクリーニングの候補構造を示す模式図である。
【図6】Ｔ００１の最適発現のためのＵＴＲスクリーニングにおいて、ＦＡＣＳ分析結果を示す写真及びグラフである。分析条件は以下のようである：ＧＦＰ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、ＨＣＴ－１１６、６ｗｅｌｌ（５×１０５ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）、２４ｈ ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｇｌｎ ＭＥＭ ｍｅｄｉａ。
【図8】蛍光顕微鏡で表されたｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ－ＮＬＳ及びｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ－ＭＬＳの細胞内作用位置を示す写真である。白色の矢印は核の位置を示し、黒色の矢印はミトコンドリアの位置を示す。
【図9】がん細胞におけるターゲット代謝の作用モード（ＭＯＡ）及び経路を示す図である。
【図10】ＭＣＦ７細胞株におけるｍＲＮＡトランスフェクション後の生存検査（ｌｉｖｅ ａｎｄ ｄｅａｄ ａｓｓａｙ）結果を示す写真である。蛍光顕微鏡を使用して５μｇ／ｗｅｌｌのｍＲＮＡを処理した後、ＭＣＦ７細胞の細胞生存性を観察した。トランスフェクション後２４時間で細胞生存性は効果的に減少されたが、この効果は時間依存的であるか容量依存的であった。
【図11】ＭＣＦ７細胞株におけるｍＲＮＡトランスフェクション後のＭＴＴ分析結果を示すグラフである。
【図12】ＭＣＦ７細胞株におけるｍＲＮＡトランスフェクション後のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色によるアポトーシス分析結果を示すグラフである。初期アポトーシス部分（右下の象限）はｍＲＮＡトランスフェクション後持続的に増加しており、後期アポトーシス部分（右上の象限）も増加していた。
【図13】Ｔ００１とＮＴ５Ｍトランスフェクションによる細胞毒性及び細胞成長抑制の比較結果を示すグラフである。
【図14】ＣＴ及びＮＴ５Ｍトランスフェクションで誘導されたアポトーシスの結果を示すグラフである。
【図15】Ｔ００１トランスフェクションによる細胞周期の停止を示すグラフである。
【図16】大腸がん細胞株ＨＣＴ－１１６における濃度によるアポトーシス誘発細胞の比率を示すグラフである。
【図17】Ｔ００１のｓｉＲＮＡ処理によるＴ００１相殺効果を示すグラフである。
【図18】トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）における濃度によるアポトーシス誘発細胞の比率を示すグラフである。
【図19】トリプルネガティブ乳がんに対してＣＴ処理した後のＤＮＡ損傷マーカのウェスタンブロット分析結果を示す写真である。
【図20】ＳＶ４バインダ及びＴ００１薬物を利用した抗がん剤を示す模式図である。
【図21】Ｔ００１ ｍＲＮＡの構成を概略的に示す模式図である。
【図22】ＮＬＳ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｍＲＮＡを含む免疫－リポソーム（ｉＬＰ）で複合されたカルボキシブルオレセイン－ＤＳＰＥ（ｃａｒｂｏｘｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＤＳＰＥ）に対する体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）分析結果を説明する模式図及び写真である。ＭＣＦ７細胞株において、蛍光感知によって核トランスフェクションによって各翻訳されたｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙタンパク質の位置とｍＲＮＡの位置を確認した。Ａは２．５μｇのＮＬＳ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｍＲＮＡであり、Ｂは５μｇのＮＬＳ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｍＲＮＡである。
【図23】は体外及び体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）におけるＣＤ４７マスキング分析（ｍａｓｋｉｎｇ ａｓｓａｙ）結果を示す写真である。
【図24】ＳＶ４－コンジュゲートｉＬＰ－ＮＩＲ ＲＦＰ ｍＲＮＡの静脈注射（ＩＶ）後のＭＣＦ７異種移植マウスの分布を示す写真である。Ａは異種移植マウス、Ｂは注射後１時間、Ｃは注射後３時間、Ｄは注射後６時間、Ｅは切断されたがん組織を示す。
【図25】体内におけるｉＬＰＤ静脈注射後の期間別腫瘍の体積を示すグラフ及び腫瘍の写真である。
【図26】ｉＬＰＤ処理によるマウス臓器の毒性検査の結果を示すグラフである。
【図27】本発明によるＳＶ４バインダを利用した抗がん剤のメカニズムを示す模式図である。
【図28】ＳＩＲＰα及びＳＶ１のＤＮＡ配列を比較して示す図である。
【図29】ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨＳとＳＶ４タンパク質のコンジュゲーション過程を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
以下、実施例を介して本発明を詳細に説明する。その前に、本明細書及び特許請求の範囲で使用された用語や単語は通常的であるか辞書的な意味に限って解釈されてはならず、発明者は自らの発明を最善の方法で説明するために用語の概念を適切に定義し得るとの原則に立脚して、本発明の技術的思想に符合する意味と概念で解釈されるべきである。よって、本明細書に記載された実施例の構成は、本発明の最も好ましい一実施例に過ぎず、本発明の技術的思想を全て代弁するものではないため、本出願の時点において、これらを代替し得る多様な均等物と変形例が存在し得るということを理解すべきである。
【0018】
本願に使用された用語は以下のように理解される。
【0019】
本願において、用語「ＣＤ４７」は特に制限されず、任意の動物、好ましくは哺乳類から由来したものであり、より好ましくはヒトＣＤ４７である。ヒトＣＤ４７のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は既に公知である（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２３，４８５－４９６，（１９９３），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０８，３４１９－３４２５，（１９９５），ＧｅｎＢａｎｋ：Ｚ２５５２１）。
【0020】
本願において、用語「バインダ」は受容体、特にＣＤ４７に結合するタンパク質であって、バインダは特にがん細胞でＣＤ４７と結合し、細胞－伝達物質の認識及び／または相互作用を可能にする。
【0021】
本願において、用語「コンジュゲートされた」または「コンジュゲート」は、２つまたはそれ以上の化合物が一つまたはそれ以上の化学結合またはリンカと結合して結合される化学的化合物を意味する。本発明の一具体例において、バインダとリポソームはコンジュゲートを形成する。
【0022】
本願において、用語「ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）」は対象物質にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を接合して安定性を上げるための技術であって、本発明ではＰＥＧ化されたリン脂質が使用されるが、例えば、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００などが使用される。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００は、約２０００の数平均分子量を有するＰＥＧが付着されたＤＳＰＥを意味する。
【0023】
本願において、用語「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、一般にＲＮＡまたはＤＮＡ、または変形されたＲＮＡまたはＤＮＡである、単一鎖または二重鎖形態に存在するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体を意味する。本発明の一具体例において、ポリヌクレオチドは合成された短鎖ｍＲＮＡである。
【0024】
本願において、用語「５’－ＵＴＲ（５’－Ｕｎｔｒａｎｓlａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎ）」は通常ｍＲＮＡの特定部分と理解され、ｍＲＮＡのタンパク質暗号化領域（つまり、開放解読枠（ＯＲＦ））の５’に位置する。通常、５’－ＵＴＲは転写開始領域から始まって開放解読枠の開始コドンから１ヌクレオチドの前で終結する。
【0025】
本願において、用語「３’－ＵＴＲ」は、通常ｍＲＮＡの開放解読枠（ＯＲＦ）とポリＡ配列との間に位置するｍＲＮＡの一部である。ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲはアミノ酸配列に翻訳されない。３’－ＵＴＲ配列は、通常遺伝子発現過程でそれぞれのｍＲＮＡに転写される遺伝子によって暗号化される。
【0026】
本願において、用語「ＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ、核位置信号）」及び「ＭＬＳ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｎ ｓｉｇｎａｌ、ミトコンドリア位置信号）」は、それぞれタンパク質や核酸のような特定物質を細胞核及びミトコンドリア内に運ぶ役割をするアミノ酸配列を意味する。
【0027】
本願において、用語「トランスフェクション」は、細胞外部のポリヌクレオチドが伴う物質があるまたはない状態で宿主細胞、特に、がん細胞に入る過程を意味する。「トランスフェクションされた細胞」は、例えば、細胞外部のｍＲＮＡが細胞内に導入されて細胞外部ｍＲＮＡを有している細胞を意味する。
【0028】
本発明は、配列番号３で表されるアミノ酸配列を暗号化するがん治療のためのポリヌクレオチドを開示する。
【0029】
本発明によるがん治療のためのポリヌクレオチドは、一具現例によると、ＣＤ４７に結合するバインダと複合体を形成するリポソーム型ナノ粒子に捕集された形態で使用され、がん細胞の代謝脆弱性を極大化してがん細胞を死滅するメカニズムを有するがん治療のためのポリヌクレオチドであって、ヒト細胞内に伝達された際に非特異的マイクロＲＮＡとして作用する部位を最小化し、発現を最大化するように遺伝子配列が最適化されている。
【0030】
本発明の一具現において、前記バインダは、がん細胞で過発現するＣＤ４７に結合するバインダとして、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む。
【0031】
本発明において、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むバインダは「ＳＶ１」と命名しており、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むバインダは「ＳＶ４」と命名している。
【0032】
まず、ＳＶ１（Ｓｉｒｐα－ｖａｒｉａｎｔ－ｖｅｒｓｉｏｎ１）は、本来（ｏｒｉｇｉｎａｌ）ＣＤ４７リガンドの受容性ドメインである純水Ｓｉｒｐα（アミノ酸配列（配列番号２５）参照）から由来する突然変異ライブラリから選別された。ＳＶ１突然変異の選別過程は以下のようである。
【0033】
ＣＤ４７と結合するＳＩＲＰαの結合力が改善されたタンパク質をＷｅｉｓｋｏｐｆ Ｋ ｅｔ ａｌ．（Ｗｅｉｓｋｏｐｆ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）。「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＳＩＲＰａｌｐｈａ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｔｏ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．）３４１（６１４１）：８８－９１．）を参照して、ＳＩＲＰαの単一１４－ｋＤ結合ドメインを合成し遺伝子を確保した。Ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ＳＩＲＰαから変更されたアミノ酸はそれぞれ以下のようである。６番目に位置するバリン（ｖａｌｉｎｅ）をイソロイシン（ｉｓｏｌｕｅｃｉｎｅ）に、２７番目に位置するバリンをイソロイシンに、３１番目に位置するイソロイシンをフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）に、４７番目に位置するグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）をバリンに、５３番目に位置するリシン（ｌｙｓｉｎｅ）をアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）に、５４番目に位置するグルタミン酸をグルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）に、５６番目に位置するヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）をプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）に、６６番目に位置するセリン（ｓｅｒｉｎｅ）をトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）に、９２番目に位置するバリンをイソロイシンに置換した。タンパク質の大腸菌における発現のために、従来の核酸配列をコドン最適化によって変形してＳＶ１を製造しており、図２８にＳＩＲＰα配列（配列番号２６）及びＳＶ１のＤＮＡ配列（配列番号２７）を比較して示した。
【0034】
一方、ＳＶ１のＣ－末端にＣＲＭ１９７タンパク質を添加したタンパク質であるＳＶ１－（Ｃ）ＣＲＭ１９７、Ｎ－末端にＣＲＭ１９７タンパク質を添加したＣＲＭ１９７（Ｎ）－ＳＶ１、そしてＳＶ１端末質を製作し、ＳＶ１のＮ－末端とＣ－末端のタンパク質添加の影響をＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分析によって確認した。各資料はＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００機器を利用してＳＰＲのｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓによって分析した。この際、分析のためのＣｈｉｐとしてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＤ４７タンパク質を５００ＲＵになるようにＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ表面に接合したＣｈｉｐを使用しており、ＨＢＳ－Ｐは５μｌ／ｍｉｎの流速で分析した。各センソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）の結果は１：１バインディングモデル及びグローバルフィッティングを使用してＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析したが、その結果を下記表１に示す。
【0035】
【表1】
【0036】
表１を参照すると、ＳＰＲ分析結果において、Ｃ－末端にＣＲＭ１９７が挿入されたＳＶ１－ＣＲＭ１９７はＳＶ１に比べＫＤ値が大きく異なっていないが、Ｎ－末端にＣＲＭ１９７が挿入されたＣＲＭ１９７－ＳＶ１のような場合はａｆｆｉｎｉｔｙがＫＤ値が１９．９ｎＭまで約２倍ぐらい上昇して、親和力が減少したことを確認した。よって、ＳＶ１のＮ－末端にタンパク質を添加する場合、ＳＶがＣＤ４７に正しく結合することを妨害して発生する立体障害（ｓｔｅｒｉｃ ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）のため、ＣＤ４７に対する親和度がＳＶ１に比べ減少することを確認した。
【0037】
以下、本発明によるＳＶ４バインダ、前記バインダとコンジュゲートされるリポソームに関する具体的な実施例を詳細に説明した後、本発明によるバインダ－コンジュゲートリポソームに捕集されるＴ００１薬物と、ＳＶ４バインダ及びＴ００１薬物を利用した抗がん剤に関する具体的な実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【0038】
ＳＶ４－コンジュゲートリポソーム
脂質ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）に基づく薬物伝達システムは、相当な長所を有するため普遍的に使用されてきた。資質ナノ粒子は、高い薬容量（ｄｒｕｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）、高い安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、高い特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有しており、放出時点（ｒｅｌｅａｓｅ ｐｏｉｎｔ）を制御することができる。薬物として使用される遺伝物質のため、正イオン性リポソームは標的がんに薬物を伝達するのに使用されていた。正電荷に荷電されたリポソームは、遺伝的薬物（ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｒｕｇ）を引き寄せて薬物が標的に遇うまで保護するために薬物を覆う球状コンプレックス（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する。
脂質ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）に基づく薬物伝達システムは、相当な長所を有するため普遍的に使用されてきた。資質ナノ粒子は、高い薬容量（ｄｒｕｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）、高い安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、高い特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有しており、放出時点（ｒｅｌｅａｓｅ ｐｏｉｎｔ）を制御することができる。薬物として使用される遺伝物質のため、正イオン性リポソームは標的がんに薬物を伝達するのに使用されていた。正電荷に荷電されたリポソームは、遺伝的薬物（ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｒｕｇ）を引き寄せて薬物が標的に遇うまで保護するために薬物を覆う球状コンプレックス（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する。
【0039】
本発明において、正イオン性リポソームを形成するために、プロリポソーム（Ｐｒｏ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ）は正イオン性リン脂質、ＤＯＴＡＰ、及びコレステロールのうち一つを使用して用意された。また、血管を介してターゲットに薬物を伝達する間に血清安定性を上げようと、ＰＥＧ化リポソームを用意するためにプロリポソームにＰＥＧ１０００－ＤＳＰＥを追加に添加した。ＰＥＧ化リポソーム以外にも、ＮＨＳ活性化ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００とＳＶ４タンパク質をコンジュゲートしてＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＳＶ４を用意した。ＳＶ４コンジュゲートリポソームを用意するための最後のステップとして、ｍＲＮＡカプセルかプロリポソームとＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＳＶ４を混合した。具体的なＳＶ４－コンジュゲートリポソームの製造過程は以下のようである。
【0040】
リポソームはドライフィルム方式で用意された。ＤＯＴＡＰ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）とコレステロール（Ｓｉｇｍａ）（１：１モル比、１０ｍＭ）で構成された正イオン性リポソームとＰＥＧ－ＤＳＰＥ１０００（１ｍＭ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）が添加された。正イオン性リポソームは丸底ガラスフラスコでクロロホルムとメタノール（２：２（ｖ／ｖ））に溶解された。脂質乾燥は５０℃で回転蒸発器で真空状態で行われた。クロロホルムとメタノールを完全に除去するために、脂質膜を一晩冷凍乾燥させた。蒸発後、脂質膜は５０℃で最大１時間までヌクレアーゼフリー水（ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）で再水化（ｒｅｈｙｄｒａｔｅｄ）された。水化された脂質膜を音波処理して単一層小胞（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を形成した。最後に、１００ｎｍ空隙を有する膜を利用してミニ圧出器（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）で資質を圧出した。
【0041】
ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨＳとＳＶ４タンパク質のコンジュゲーションは以下のように用意された（図２０を参照）。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨＳはドライフィルム方式で用意した。クロロホルムに溶解されたＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨＳは丸底ガラスフラスコで蒸発された。３０℃で真空状態で１時間回転蒸発器によって脂質の乾燥を行った。蒸発後、脂質膜は３０℃で１時間までヌクレアーゼフリー水に溶解されたＳＶ４タンパク質に再水化された。コンジュゲートされていない残りのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨＳを除去するために、ｐＨ６．８のＰＢＳで透析カセット１０，０００ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を一晩行った。
【0042】
カプセル化された薬物と結合リガンドを含有したリポソームを上述したように用意した。正イオン性リポソーム３ｍｇ、プロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）２５μｇ、及びジエチルピロカボネート水（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ ｗａｔｅｒ）を混合して溶液Ａに、ｍＲＮＡ ５０μｇ及びジエチルピロカボネート水を混合して溶液Ｂにした。溶液ＡとＢはジエチルピロカボネート水で体積を同じにして３０分間培養された。次に、３０分間混合及び培養してカプセル化された薬物にリポソームを形成した。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨＳコンジュゲートＳＶ４リガンドの結合のために、カプセル化された薬物を含有したリポソーム（１：１００モル比）を５０℃で１５分間混合した。
【0043】
コンジュゲーションターゲットとしてのＳＶ１
自然界に存在するＳｉｒｐαの配列を変形してＣＤ４７との結合力が向上されたＳＶ１を突然変異によって選定し、それに対してリポソーム剤形を製作する際に正しい方向に挿入されて反応し得るＳＶ４を突然変異によって確保した（図１を参照）。ＳＶ４突然変異の製作は以下のような方法で行われた。前記確保されたＳＶ１配列において、ＣＤ４７との正しい方向結合のために１１番目と１０４番目のリシンをロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）に置換した。置換のためにＳＶ１遺伝子をｐＥＴ２８ａベクトルに挿入したプラスミドを利用して、１１番目と１０４番目に当たる配列で点突然変異（ｐｏｉｎｔ－ｍｕｔａｔｉｏｎ）されるようにプライマ（下記表２を参照）を製作し、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ ＩＩ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）の方法に従ってそれぞれ或いは同時に置換させた突然変異遺伝子を製作した。
自然界に存在するＳｉｒｐαの配列を変形してＣＤ４７との結合力が向上されたＳＶ１を突然変異によって選定し、それに対してリポソーム剤形を製作する際に正しい方向に挿入されて反応し得るＳＶ４を突然変異によって確保した（図１を参照）。ＳＶ４突然変異の製作は以下のような方法で行われた。前記確保されたＳＶ１配列において、ＣＤ４７との正しい方向結合のために１１番目と１０４番目のリシンをロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）に置換した。置換のためにＳＶ１遺伝子をｐＥＴ２８ａベクトルに挿入したプラスミドを利用して、１１番目と１０４番目に当たる配列で点突然変異（ｐｏｉｎｔ－ｍｕｔａｔｉｏｎ）されるようにプライマ（下記表２を参照）を製作し、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ ＩＩ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）の方法に従ってそれぞれ或いは同時に置換させた突然変異遺伝子を製作した。
【0044】
【表2】
【0045】
ＳＶ１タンパク質はＮ－末端アミノ基以外に６つのリシン残基を有している（図２Ａを参照）。ＳＶ１をリポソームとコンジュゲーションすることで連結してＣＤ４７との結合によって薬物を伝達するためには、結合力の向上が必要である。ＮＨＳコンジュゲーションによってＤＳＰＥを連結する化学反応で作用する残基のうちＣＤ４７との結合を妨害しないながらも正しい方向（ｃｏｒｒｅｃｔ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）に作用する残基を選定し、これらの残基以外の残基をロイシンに置換することで、結合活性を損傷することなく変形することができる。図２に示したように、置換によってＤＳＰＥに結合する残基の場合の数を減らして、単純な結合によってＤＳＰＥ－コンジュゲートされたＳＶ４を製造した。
【0046】
一方、ＳＶ４の正しい方向のためのリシン置換効果を確認するために、ＳＶ１と比較するためにＤＳＰＥ－コンジュゲーションの形態及びリポソームに挿入された形態をそれぞれ製造し、ＣＤ４７との親和力をＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によって分析した。分析のために、ＣＭ５ Ｃｈｉｐを利用してＣＤ４７を接合した後、ＳＶ１、ＤＳＰＥ－ＳＶ１、ＬＰＤ－ＳＶ１、ＳＶ４、ＤＳＰＥ－ＳＶ４、及びＬＰＤ－ＳＶ４の会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）と解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を測定してＫＤ値を比較した。詳しくは、組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ＣＤ４７タンパク質をＥＤＣ－ＮＨＳ反応によって２５０ＲＵの標的ＳＰＲ反応でＣＭ５チップの表面に接合させて使用しており、ＨＢＳ－Ｐは３０μｌ／ｍｉｎの流速で３分会合及び１０分解離の過程によって確保したセンソグラムを１：１バインディングモデル及びグローバルフィッティングを使用してＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。分析資料の特性によって解離バッファ（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）として、ＳＶ１及びＳＶ４タンパク質に対しては１０ｍＭグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）ｐＨ２．０を、脂肪酸が付着された試料に対しては２．０Ｍ ＭｇＣｌ２を使用した。
【0047】
ＳＰＲ分析結果において、ＳＶ１はＳｉｒｐα（ｗｔ）に比べＫＤ値が２８０ｎＭから０．８７ｎＭに大きく向上された（図３を参照）。ＳＶ１の親和力（ａｆｆｉｎｉｔｙ）は大きく向上されたが、ＮＨＳコンジュゲーション反応によってＳＶ１－ＤＳＰＥを製造した場合は０．８７ｎＭから２．６７ｎＭにＫＤ値が上昇したため親和力が減少した。また、リポソームに挿入したＳＶ１－ｉＬＰの場合は更に親和力が減少し、ＫＤ値が１０．９ｎＭまで上昇した。それに対し、ＮＨＳ反応残基である２カ所のリシンをロイシンに置換したＳＶ４の場合、タンパク質自体の親和力は多少減少したが、正しい方向性のためＤＳＰＥとコンジュゲーションした場合とリポソームに挿入されたときさえ大きく減少されずに誤差範囲で結合活性が維持されることを確認した（表３を参照）。
【0048】
【表3】
【0049】
バインダ－コンジュゲートリポソーム捕集薬物
以下、上述したバインダ（ＳＶ４）－コンジュゲートリポソームに捕集される薬物の具現例について説明する。
以下、上述したバインダ（ＳＶ４）－コンジュゲートリポソームに捕集される薬物の具現例について説明する。
【0050】
ヒト５’－ヌクレオチダーゼ（Ｈｕｍａｎ ５’－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ）と類似した活性を有するが、異例的に異なる核酸に対しては特異性がないながらもｄＴＭＰ、ｄＵＭＰに対してのみ高い特異性を有するＰＢＳ２パージ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＰＢＳ２）由来のチミジル酸５’－ホスホヒドロラーゼを、がん細胞の代謝脆弱性（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ）を極大化してがん細胞を死滅するメカニズムを有する薬物候補物質として選定し、ヒト細胞内に伝達された際に非特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）として作用する部位を最小化し発現を最大化するように、遺伝子配列を最適化して「Ｔ００１」（配列番号３）と命名した。Ｔ００１の配列最適化過程は以下のようである。
【0051】
ＤＮＡ配列を哺乳類細胞発現（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）のためのコドン最適化しようと、自然コドン（ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｄｏｎ）を以下の最適コドンに代替した：ａｌａｎｉｎｅ （ＧＣＣ）、ａｒｇｉｎｉｎｅ （ＣＧＣ）、ａｓｐａｒａｇｉｎｅ （ＡＡＣ）、ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ （ＧＡＣ）、ｃｙｓｔｅｉｎｅ （ＴＧＣ）、ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ （ＧＡＧ）、ｇｌｕｔａｍｉｎｅ （ＣＡＧ）、ｇｌｙｃｉｎｅ （ＧＧＣ）、ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ （ＣＡＣ）、ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ （ＡＴＣ）、ｌｅｕｃｉｎｅ （ＣＴＧ）、ｌｙｓｉｎｅ （ＡＡＧ）、ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ （ＡＴＧ）、ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ （ＴＴＣ）、ｐｒｏｌｉｎｅ （ＣＣＣ）、ｓｅｒｉｎｅ （ＴＣＣ）、ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ （ＡＣＣ）、ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ （ＴＧＧ）、ｔｙｒｏｓｉｎｅ （ＴＡＣ）、ａｎｄ ｖａｌｉｎｅ （ＧＴＧ）。Ｒｕｎｓ ｏｆ Ｃｓ ａｎｄ Ｇｓを回避してＰＣＲ条件だけでなくオリゴヌクレオチド合成を簡略化した。
【0052】
Ｔ００１類似したヒト細胞内核酸代謝に関与する酵素は５’－ヌクレオチダーゼであって、作用位置によって３つ、つまり、ＮＴ５Ｃ（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）、ＮＴ５Ｍ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）、ＮＴ５Ｅ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ）が知られている。この３つの酵素は作用位置だけでなく、ＮＭＰまたはｄＵＭＰのリン酸基を加水分解する活性及び構造的差のたの好みの基質核酸種が異なり、殆どのＮＭＰまたはｄＵＭＰに対する広範囲の特異性を有していると知られている。このうちＮＴ５Ｍ（配列番号３２を参照）は、Ｔ００１とアミノ酸配列の低い類似性に比べ、タンパク質の構造においてはほぼ類似していると推定されている（図３を参照）。特に、配列の差にも関わらず作用部位に対する配列は保存されており、ＨＡＤスーパーファミリ（ｈａｌｏａｌｋａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属すると確認された。
【0053】
構造的相同性にもかかわらず、ＮＴ５ＭとＴ００１の構造的差は、Ｔ００１はＮＴ５Ｍに存在しない特異のバインディングループ（ｂｉｎｄｉｎｇ ｌｏｏｐ）構造を有しているということであり、この点が最も大きい特徴的差である（図４を参照）。
【0054】
前記バインディングループはＮＴ５ＭとＴ００１の基質結合部位と密接な関係があり、基質の特異性に関連すると推定される。現在まで前記バインディングループの機能に対しては殆ど知られていないが、本発明では、前記バインディングループのためＮＴ５Ｍに比べｄＴＭＰに対してより高い親和性を有し、高いｄＴＭＰ分解能を有することを一部確認した（表４を参照）。
【0055】
【表4】
【0056】
表４に示したように、現在まで知られている他の５’－デオキシリボヌクレオチダーゼのうち最もｄＴＭＰに対する親和度が高いと知られている。現在までの報告によると、他の酵素の場合、本発明で提示したＴ００１に比べｄＴＭＰに対する親和度が低いだけでなく、相対的に広範囲の基質特性を示すことが分かる。特に、構造的に類似したｈｕｍａｎ ＮＴ５Ｍに比べても基質に対するスペクトルが異なり、ｄＴＭＰに対する親和度も表４によると３０倍程度引くことが分かる。このような差はＮＴ５Ｍには存在しない結合ループがＴ００１には存在するためであると推定される。
【0057】
Ｔ００１ ｍＲＮＡ薬物－ローカリゼーション（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）及びｍＲＮＡの構造
Ｔ００１の最終薬物の形態はｍＲＮＡの形態であって、発現に必要な各構成要素を最適化してＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）及びＫｏｚａｋ配列を最適化した。そのために、レポータ（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）遺伝子としてＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を使用し、図５のような候補構造を選定して発現効率を決定した。各使用したＵＴＲの配列情報は下記表５のようである。
Ｔ００１の最終薬物の形態はｍＲＮＡの形態であって、発現に必要な各構成要素を最適化してＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）及びＫｏｚａｋ配列を最適化した。そのために、レポータ（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）遺伝子としてＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を使用し、図５のような候補構造を選定して発現効率を決定した。各使用したＵＴＲの配列情報は下記表５のようである。
【0058】
【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
【表5-4】
【0059】
各ＵＴＲに対する発現効率をＧＦＰ蛍光程度によってＦＡＣＳで分析した。ＦＡＣＳ分析方法は以下のようである。
【0060】
６空洞細胞培養プレートの各空洞当たり５×１０５個の細胞を入れ、３７℃、５％ＣＯ２条件の細胞培養器で２４時間培養してプレートの底に付着した後、各ＵＴＲ構造を有する緑色蛍光を発現するＥＧＦＰ ｍＲＮＡをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ試薬を使用してトランスフェクションした。まず、微細試験管に１２５μｌのＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地と３．５μｌの試薬を混ぜて常温で１０分間培養した後、他の微細試験管で１２５μｌ培地と各ＵＴＲ構造を有するｍＲＮＡ １．２５μｇを入れて混ぜたｍＲＮＡ希釈培地を前記試薬に入れて混ぜてから５分間追加培養した後、各空洞の細胞に投与した。４時間後、各空洞の細胞をリン酸緩衝生理食塩水で軽く洗浄し、細胞培養培地に入れ替えてから２０時間追加培養した後、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリで各ＵＴＲのＥＧＦＰ ｍＲＮＡの緑色の蛍光タンパク質の発現程度を比較分析した。対照群としては、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入したＥＧＦＰ ｍＲＮＡを使用した。まず、培養が終わった細胞の緑色蛍光の強度を蛍光顕微鏡によって画像で比較分析した後、対照群を含むそれぞれのＵＴＲを有するＥＧＦＰ ｍＲＮＡを処理した細胞をトリプシン酵素でプレートの底から取り外して、微細遠沈管に集めた後、リン酸緩衝生理食塩水に希釈した。このように希釈した細胞をフローサイトメトリによって対照群に比べ緑色蛍光を発現する細胞群の分布を、強度によって強、中、弱の３段階に比較した。
【0061】
ＦＡＣＳ分析の結果、ＵＴＲの長さを減らした形態として最終発現形態を ＵＴＲ９番の形態に確定した（図６を参照）。
【0062】
ＵＴＲ９番に基づいて細胞内作用位置を多様化するために、核酸合成経路が存在する核、細胞質、及びミトコンドリアに位置させるために図７のような位置信号配列（ＮＬＳ：配列番号２３、ＭＬＳ：配列番号２４）を添加してレポータ遺伝子ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを位置信号配列によって発現させた後、蛍光でタンパク質の位置を確認した（図８を参照）。位置信号配列による蛍光位置確認試験（ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ：ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）の具体的な過程は以下のようである。
【0063】
６空洞細胞培養プレートの各空洞に共焦点顕微鏡観察用のカバーガラスを一つ入れ、５×１０５個の細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件の細胞培養器で２４時間培養して、カバーガラスの上に付着させる。それぞれの位置信号配列と赤い蛍光タンパク質を発現するｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポータ遺伝子配列が連結されたｍＲＮＡをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸを使用してトランスフェクションする。まず、微細試験管に１２５μｌのＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地と３．５μｌの試薬を混ぜて常温で１０分間培養した後、他の微細試験管で１２５μｌ培地と各位置信号配列を有するレポータ遺伝子ｍＲＮＡ １．２５μｇを入れて混ぜたｍＲＮＡ希釈培地を前記試薬に入れて混ぜてから５分間追加培養した後、各空洞の細胞に投与した。４時間後、各空洞の細胞をリン酸緩衝生理食塩水で軽く洗浄し、細胞培養培地に入れ替えた後、２０時間追加に培養して、共焦点顕微鏡観察のための試料を製作した。試料を製作するために４％パラホルムアルデヒド試薬を添加し１０分間培養して細胞を固定した後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄してから、スライドグラスの上に保存液２０μｌを入れ、その上に固定及び洗浄が終わったカバーガラスを載せて、乾かないように周辺を仕上げた後、共焦点顕微鏡の赤い蛍光で、位置信号配列がよく作動してｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙタンパク質が細胞核及びミトコンドリアに位置したのかを確認した。
【0064】
Ｔ００１ ｍＲＮＡの合成は以下のように行われた。
【0065】
鋳型ＤＮＡの用意：ＩＶＴ（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ） ｍＲＮＡを合成するためのベクトルはｐＩＲＥＳベクトルから修正された。簡略に、５’ＵＴＲ－Ｔ００１－３’ＵＴＲ ｃａｓｓｅｔｔｅはｐＩＲＥＳベクトルのＭＣＳにクローニングした。ＩＶＴテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）を生成するために、プラスミドでＳａｃＩ／ＨｐａＩ酵素で処理して線形鎖を形成し、Ｔ７プロモータとＴ７カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）が含まれた１．５ｋｂの線形鎖を純水にカラム精製して、ＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。正方向プライマ（ｇｔｇｃｔｔｃｔｇａｃａｃａａｃａｇｔｃｔｃｇａａｃｔｔａａｇｃ；配列番号３７）と逆方向プライマ（ｇａａＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧＧＣＴＴＴＡＴＴＣ；配列番号３８）をＰＣＲ反応に使用しており、全てのＰＣＲ反応はＰｆｕ重合酵素を使用して１分間９５℃で、１分間６１℃；７２℃で３分、計３０周期の間にＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はアガロースゲルで実行されており、追加処理の前にＱｉａｇｅｎクリーンアップキットを使用して抽出された。
【0066】
ＩＶＴ ｍＲＮＡの合成：ＰＣＲの後、遺伝子情報はＨｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｔ．＃．Ｅ２０６５）を使用してＤＮＡからｍＲＮＡに試験管内で転写される。反応液は、１０μｇ ＮＴＰ／キャップアナログ混合物、１μｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ、２μｌ １×Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素混合物を添加して２０μｌのＩＶＴ反応混合物を調製した。ＩＶＴ反応混合物は３０分間３７℃で培養された。鋳型ＤＮＡを除去するために１μｌ ＤＮａｓｅをＩＶＴ反応混合物に添加し、３７℃で１５分間培養した。ポリ（Ａ）テーリングのために、５μｌの１０×ポリ（Ａ）ポリメラーゼ反応緩衝液、５μｌのポリ（Ａ）ポリメラーゼ、及び２０μｌのヌクレアーゼがない水を添加し、２０μｌのＩＶＴ反応混合物を製造して４０分間３７℃で培養した。次に、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製した後、８９μｌのヌクレアーゼがない水でスピンカラム膜で溶出して合成されたｍＲＮＡを精製した。次に、南極ホスファターゼ１μｌを３０分間３７℃で処理して５’－ホスフェートを除去した後、再度ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製した後、５０μｌのヌクレアーゼがない水でスピンカラム膜で溶出して合成されたｍＲＮＡを回収した。次の実験のために、最終濃度が５００ｎｇ／μｌになるように合わせた後、分注して－８０℃で保管した。
【0067】
がん細胞におけるターゲット代謝
ＴＳ（Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）は、ＤＮＡ合成及び復旧のためのチミジレート（ｄＴＭＰ）の唯一のデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）源泉（ｓｏｕｒｃｅ）である。ＴＳタンパク質をターゲットとする薬物はがん治療の主軸をなしているが、標的外効果と毒性のため使用が制限されている。ＴＫ１（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）とＴＫ２（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）は腫瘍環境からチミジンを回復させることで代替ｄＴＭＰの生成経路に寄与し、ＴＳターゲッティング薬物に対する抵抗を調節する。ｓｉＲＮＡを有するＴＫｓの下向き調節（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）で腫瘍細胞を感知するＴＳ ｓｉＲＮＡの容量を従来のＴＳタンパク質ターゲッティング薬物（５ＦＵｄＲ及びｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）に比べ増加させたという報告があったため、本発明ではｄＴＴＰ生合成代謝に焦点を合わせた。
ＴＳ（Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）は、ＤＮＡ合成及び復旧のためのチミジレート（ｄＴＭＰ）の唯一のデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）源泉（ｓｏｕｒｃｅ）である。ＴＳタンパク質をターゲットとする薬物はがん治療の主軸をなしているが、標的外効果と毒性のため使用が制限されている。ＴＫ１（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）とＴＫ２（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）は腫瘍環境からチミジンを回復させることで代替ｄＴＭＰの生成経路に寄与し、ＴＳターゲッティング薬物に対する抵抗を調節する。ｓｉＲＮＡを有するＴＫｓの下向き調節（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）で腫瘍細胞を感知するＴＳ ｓｉＲＮＡの容量を従来のＴＳタンパク質ターゲッティング薬物（５ＦＵｄＲ及びｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）に比べ増加させたという報告があったため、本発明ではｄＴＴＰ生合成代謝に焦点を合わせた。
【0068】
このような酵素の複合下向き調節は、ＴＳターゲット抗がん治療を強化するためには魅力的な戦略であるが、正常細胞毒性とがん薬物に対する耐性が問題になる恐れがある。このような欠陥を避ける代案は高いｄＴＭＰ特異的加水分解酵素を得ることであるが、すなわちＴ００１である。Ｔ００１は他のｄＮＭＰ（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｏｎｏ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を加水分解せず、ｄＴＭＰをチミジンに加水分解する。細胞の不均衡なヌクレオチドプールはｄＴＴＰの欠乏によって引き起こされ、細胞の成長と増殖に深刻な損傷をもたらす恐れがある。基質選択性とＴ００１の活性を考慮して、以下のような仮説を立てた：（１）不均衡なヌクレオチドプールはヒト腫瘍細胞を誘導して損傷を累積させ、（２）Ｔ００１の過発現は不均衡なヌクレオチドプールを引き起こし、（３）不均衡なヌクレオチドプールは過度な復旧周期（ｒｅｐａｉｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）によるアポトーシスを引き起こす 可能性がある。
【0069】
がん細胞にＴ００１ ｍＲＮＡｓトランスフェクションによる生存細胞数の減少
まず、各Ｔ００１ ｍＲＮＡをトランスフェクションした後、腫瘍細胞の成長を評価するために各グループの細胞数を推定し、生存検査で培養細胞の成長を分析した（図１０を参照）。生存検査は以下のように行われた。
まず、各Ｔ００１ ｍＲＮＡをトランスフェクションした後、腫瘍細胞の成長を評価するために各グループの細胞数を推定し、生存検査で培養細胞の成長を分析した（図１０を参照）。生存検査は以下のように行われた。
【0070】
６空洞細胞培養プレートの一空洞当たりに５×１０５個の細胞を入れ、３７℃、５％ＣＯ２条件の細胞培養器で２４時間培養して底に付着した。２４時間後、それぞれのｍＲＮＡバージョン別にリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を使用してトランスフェクションし、更に２４時間培養した。実験群それぞれの細胞を回収し、生存検査分析試薬である２μＭ ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ、４μＭ ＥｔｈＤ－１を回収した細胞に処理して３０分間反応した後、細胞を蛍光顕微鏡を介して確認した。ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭは細胞内に入って生きている細胞の酵素によって分解された後、緑色蛍光を示し、ＥｔｈＤ－１は死んでいる細胞の細胞内に入った後、核を染色して赤色蛍光を示す。
【0071】
図１０に示したように、トランスフェクション後２４時間における生存細胞は対照群に比べ著しく減少しており、ｍＲＮＡバージョン（ＮＴ、ＭＴ、及びＣＴ）の間には差がなかった。
【0072】
がん細胞にＴ００１ ｍＲＮＡｓトランスフェクションによる生存細胞の増殖抑制
細胞生存能を定量化するためにＭＴＴ分析を行った。ＭＴＴ分析方法は以下のようである。
細胞生存能を定量化するためにＭＴＴ分析を行った。ＭＴＴ分析方法は以下のようである。
【0073】
９６空洞細胞培養プレートに一空洞当たりに１０，０００個の細胞を入れ、３７℃、５％ＣＯ２条件の細胞培養器で２４時間培養して底に付着した。２４時間後、各ｍＲＮＡバージョン別、濃度別にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｒｅａｇｅｎｔを作ってトランスフェクションし、更に２４時間、４８時間、７２時間培養した後、それぞれ時間別に細胞活性分析実験を行った。各時間別サンプルに細胞活性分析試薬であるＥＺ－Ｃｙｔｏｘを細胞培養した各空洞当たり１０μｌ投与して２４時間反応した後、プレートリーダを利用して４５０ｎｍ波長の吸光値を測定する。対照群に比べ各バージョン別ｍＲＮＡ処理群の値を比較して、処理時間と濃度別の細胞生存能を分析した。
【0074】
ＭＴＴ分析結果、対照群に比べＴ００１ ｍＲＮＡにトランスフェクションした細胞の増殖はトランスフェクション後２４時間で著しく抑制されており、抑制効果は最大７２時間まで維持されて、各細胞の生存性が持続的に減少されると示された。細胞生存性は容量によって異なるように示された（図１１を参照）。
【0075】
がん細胞にＴ００１ ｍＲＮＡｓトランスフェクションによるアポトーシスの誘導
前記実験結果によって、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色後フローサイトメトリ分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行って、Ｔ００１がアポトーシスを誘導して細胞数の減少または細胞増殖の抑制を誘発するのかを調べた。具体的な分析方法は以下のようである。
前記実験結果によって、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色後フローサイトメトリ分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行って、Ｔ００１がアポトーシスを誘導して細胞数の減少または細胞増殖の抑制を誘発するのかを調べた。具体的な分析方法は以下のようである。
【0076】
６空洞細胞培養プレートの各空洞当たり５×１０５個の細胞を入れ、３７℃、５％ＣＯ２条件の細胞培養器で２４時間培養してプレートの底に付着した後、各バージョン別ｍＲＮＡをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ試薬を使用してトランスフェクションした。まず、微細試験管に１２５μｌのＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地と３．５μｌの試薬を混ぜて常温で１０分間培養した後、他の微細試験管で１２５μｌ培地と各ＵＴＲ構造を有するｍＲＮＡ １．２５μｇを入れて混ぜたｍＲＮＡ希釈培地を前記試薬に入れて混ぜてから５分間追加培養した後、各空洞の細胞に投与した。４時間後、各空洞の細胞をリン酸緩衝生理食塩水で軽く洗浄し、細胞培養培地に入れ替えた後、２０時間追加培養してから、トリプシン酵素でプレートの底から取り外して微細遠沈管に集めた後、リン酸緩衝生理食塩水に希釈した。各微細遠沈管ごとに３μｌのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色試薬とＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ染色試薬を入れ、１５分間常温で反応した後、フローサイトメトリ分析器によってＴ００１のバージョン別アポトーシスが誘導された細胞群の程度を比較した。対照群としては、ｍＲＮＡがないｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ試薬を使用した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ試薬はアポトーシスが進行される細胞の細胞膜を染色し、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅは死んだ細胞の細胞内核を染色する。よって、フローサイトメトリグラフ上でアポトーシスが行われない細胞は第３象限に分布し、アポトーシスの進行程度によって細胞群の位置は第４象限から第１象限に移動する。
【0077】
分析結果、全てのバージョンでアポトーシスは互いに類似していた。対照群のアポトーシス率は３．７５％であり、ＮＴ、ＭＴ、及びＣＴでトランスフェクションした細胞の初期アポトーシス率はそれぞれ２１．５９％、２５．１１％、及び２４．６５％と示された。ＮＴ、ＭＴ、及びＣＴと共に転移された細胞のアポトーシス率はそれぞれ９．８５％、８．４２％、１１．４７％に示された（図１２を参照）。アポトーシス率は容量依存的に増加しており、それぞれのＴ００１バージョンの間で若干の差を示した。
【0078】
大腸がん細胞（ＨＣＴ－１１６）に対するＴ００１とＮＴ５Ｍの細胞毒性の比較
Ｔ００１はＭＴ５Ｍとは異なる構造的差のため核酸Ｔにより特異的である。よって、全般的な核酸の損失よりｄＴＴＰの損失による核酸の不均衡はがん細胞の代謝に大きな影響を及ぼし、そのためがん細胞の成長を阻害することができる。それを照明するために、ヒトＮＴ５Ｍの成熟型（ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）とイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）が含まれた非成熟型（ｎｏｎ－ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）を細胞質Ｔ００１（ＣＴ）と細胞生存能及び細胞成長抑制効果を比較し、各酵素間の基質特異性によって細胞にいかなる影響を及ぼすのかを調べた。各ｍＲＮＡを大腸がん細胞株ＨＣＴ－１１６にトランスフェクションし、２４時間後にトリパンブルー分析（Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ａｓｓａｙ）を行ってＨＣＴ－１１６細胞生存能と細胞成長抑制結果を図１３に示した。具体的な実験方法は以下のようである。
Ｔ００１はＭＴ５Ｍとは異なる構造的差のため核酸Ｔにより特異的である。よって、全般的な核酸の損失よりｄＴＴＰの損失による核酸の不均衡はがん細胞の代謝に大きな影響を及ぼし、そのためがん細胞の成長を阻害することができる。それを照明するために、ヒトＮＴ５Ｍの成熟型（ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）とイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）が含まれた非成熟型（ｎｏｎ－ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）を細胞質Ｔ００１（ＣＴ）と細胞生存能及び細胞成長抑制効果を比較し、各酵素間の基質特異性によって細胞にいかなる影響を及ぼすのかを調べた。各ｍＲＮＡを大腸がん細胞株ＨＣＴ－１１６にトランスフェクションし、２４時間後にトリパンブルー分析（Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ａｓｓａｙ）を行ってＨＣＴ－１１６細胞生存能と細胞成長抑制結果を図１３に示した。具体的な実験方法は以下のようである。
【0079】
ＨＣＴ－１１６細胞に非成熟型ＮＴ５Ｍと成熟型ＮＴ５Ｍ、ＣＴ ｍＲＮＡをそれぞれ１．２５μｇずつトランスフェクションする。２４時間後トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）を処理し、遠心分離機を利用して細胞を収集（ｈａｒｖｅｓｔ）した。収集した細胞を１×ＤＰＢＳで再浮遊（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した後、一定量の細胞をトリパンブルー試薬と１：１に混ぜた。室温（ＲＴ）で２分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後、血球計算盤（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を利用して細胞数を計数した。トリパンブルー試薬に染色された細胞と染色されていない細胞の数を求めて、生存細胞（ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ）と非生存細胞（ｎｏｎ－ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ）の数を求めた後、総細胞数で割って生存度（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を求めた。各実験は３回以上繰り返して有意性を評価した。
【0080】
図１３のように、ｄＴＭＰに対する親和度と活性が高いＴ００１の場合、類似した活性を有するヒトＮＴ５Ｍに比べ細胞に及ぼす影響が大きく示された。
【0081】
特に、細胞に示された毒性は主にアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）誘導によって示されることを確認した（図１４を参照）。ＨＣＴ－１１６細胞に非成熟型ＮＴ５Ｍ、成熟型ＮＴ５Ｍ、及びＣＴ ｍＲＮＡをそれぞれ１．２５μｇずつトランスフェクションした細胞を２４時間培養した後、アポトーシスの程度を測定して分析した結果、２種類のＮＴ５Ｍ ｍＲＮＡは対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べＳｕｂ Ｇ１基が約１２％増加したのに対し、ＣＴ ｍＲＮＡは対照群に比べ約２５％が増加したことを確認した。Ｔ００１発現によって引き起こされるアポトーシスは、細胞内核酸欠乏による細胞周期の変化から由来すると判断され、基質のうち特定核酸及びｄＴＴＰの選択的欠乏が細胞周期の停止（ａｒｒｅｓｔ）を引き起こし、この過程が深化したら、結局アポトーシスが誘発されると推定される（図１５を参照）。
【0082】
前記結果で示されたアポトーシス誘発効果は、大腸がん細胞株でＣＴの処理濃度によって濃度依存的な傾向が示されたことからすると、ＣＴの活性が直接アポトーシスに関与したという事実を示す（図１６を参照）。
【0083】
このようながん細胞のアポトーシスがＴ００１の効果であるのかを確認するために、ＣＴに対するｓｉＲＮＡを使用してＴ００１をノックダウン（ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ）させた後、アポトーシスの程度の変化を確認した。Ｔ００１をターゲットにする２種類のｓｉＲＮＡを製作してＨＣＴ－１１６細胞にトランスフェクションした後、ＣＴ ｍＲＮＡをトランスフェクションし、２４時間後にＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ染色によってアポトーシスの程度を確認した。具体的な実験方法は以下のようである。
【0084】
Ｔ００１をターゲットにするｓｉＲＮＡを２種類に製作して、ＲＮＡｉＭＡＸ ｒｅａｇｅｎｔを使用してトランスフェクションし、１時間後ＣＴ ｍＲＮＡをトランスフェクションした。２４時間後、細胞を収集し、ＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉを使用して染色した。２０分間室温でインキュベーションした後、フローサイトメトリを使用して蛍光の程度を分析した。各サンプル当たり１０，０００個の細胞を分析した。使用されたｓｉＲＮＡの配列は以下のようである。
【0085】
［ｓｉＴ００１－１］
ｓｅｎｓｅ（配列番号３３）：ＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＵＣＡＧＡＵＵＡＣＡＵＣＡＡＧ
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ（配列番号３４）：ＣＵＵＧＡＵＧＵＡＡＵＣＵＧＡＣＵＵＣＵＵＣＵＣＧ
ｓｅｎｓｅ（配列番号３３）：ＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＵＣＡＧＡＵＵＡＣＡＵＣＡＡＧ
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ（配列番号３４）：ＣＵＵＧＡＵＧＵＡＡＵＣＵＧＡＣＵＵＣＵＵＣＵＣＧ
【0086】
［ｓｉＴ００１－２］
ｓｅｎｓｅ（配列番号３５）：ＣＧＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＣＣＵＵＣＣＵＧＡ
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ（配列番号３６）：ＵＣＡＧＧＡＡＧＧＵＵＵＣＡＡＵＧＡＡＵＵＵＧＣＧ
ｓｅｎｓｅ（配列番号３５）：ＣＧＣＡＡＡＵＵＣＡＵＵＧＡＡＡＣＣＵＵＣＣＵＧＡ
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ（配列番号３６）：ＵＣＡＧＧＡＡＧＧＵＵＵＣＡＡＵＧＡＡＵＵＵＧＣＧ
【0087】
分析の結果、ＣＴ ｍＲＮＡ単独でトランスフェクションしたグループに比べ、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしてからＣＴ ｍＲＮＡをトランスフェクションしたグループでアポトーシスが減少することを確認した（図１７を参照）。
【0088】
トリプルネガティブ誘発のがん種におけるＴ００１の濃度依存的阻害効果
Ｔ００１の作用メカニズム上、大腸がん以外のがん種でもがん細胞のアポトーシスを誘発することができると考えられ、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）に対して同じ試験を行ってアポトーシス誘発能を確認した。具体的な試験方法は以下のようである。
Ｔ００１の作用メカニズム上、大腸がん以外のがん種でもがん細胞のアポトーシスを誘発することができると考えられ、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）に対して同じ試験を行ってアポトーシス誘発能を確認した。具体的な試験方法は以下のようである。
【0089】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８ｃｅｌｌをそれぞれ５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、ＣＴ ｍＲＮＡをそれぞれ０、０．６２５、１．２５、２．５μｇずつトランスフェクションした。２４時間後、細胞を収集し、ＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉを使用して染色した。２０分間室温でインキュベーションした後、フローサイトメトリを使用して蛍光の程度を分析した。各サンプル当たり１０，０００個の細胞を分析した。３回繰り返し実験し、有意性を評価した。
【0090】
細胞質Ｔ００１（ＣＴ） ｍＲＮＡを濃度別にトリプルネガティブ乳がんの２種に対して処理した後、２４時間培養細胞をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ染色によってＦＡＣＳ分析を行った結果、ＣＴ ｍＲＮＡの濃度に比例して試験したがん種でも同じくアポトーシス細胞の割合が増加することを確認した（図１８を参照）。
【0091】
アポトーシスの源信に対するタンパク質レベルの分析のために、ＣＴ ｍＲＮＡをＴＮＢＣ細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６に１．２５μｇをトランスフェクションした後、１８時間後ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を行った。具体的な分析方法は以下のようである。
【0092】
ＣＴ ｍＲＮＡをトランスフェクションし、１８時間後に細胞を収集した。ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（＋ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を使用して氷で細胞を３０分間溶菌（ｌｙｓｉｓ）した後、４℃遠心分離機を１５分間利用してタンパク質を分離した。分離されたタンパク質を定量し、アクリルアミドゲル（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）に１０乃至２０μｇのタンパク質をローディングした。ゲルをＰＶＤＦ膜に転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）した後、５％脱脂粉乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）でＲＴで１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。各１’抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を入れ、４℃で一晩保管した。０．１％ ＴＢＳＴで洗浄（ｗａｓｈ）した後、２’抗体を入れてＲＴで１時間インキュベーションした。０．１％ ＴＢＳＴで洗浄した後、ＥＣＬ溶液を利用してタンパク質を検出した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋を利用してタンパク質の発現を分析した。
【0093】
分析結果、図１９に示したように、アポトーシスマーカであるＰＡＲＰの切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）とＤＮＡ損傷（ｄａｍａｇｅ）マーカであるｇａｍｍａ－Ｈ２ＡＸの発現増加を確認した。ＣＴ ｍＲＮＡの処理の際、ｄＴＴＰの欠乏のためＤＮＡ損傷が発生することを確認したが、それによってアポトーシスが誘発されるという事実を確認した。
【0094】
ＳＶ４バインダ及びＴ００１薬物を利用した抗がん剤
以下、ＳＶ４バインダ及びＴ００１薬物を利用した抗がん剤の具現例について説明する。
以下、ＳＶ４バインダ及びＴ００１薬物を利用した抗がん剤の具現例について説明する。
【0095】
ＳＶ４バインダ及びＴ００１薬物を利用した抗がん剤は、がん細胞の表面で過発現するＣＤ４７を１次的に探知して結合し、２次的にがん細胞に進入したｍＲＮＡ型核酸代謝阻害薬物ががん細胞の過度な核酸合成代謝を感知し阻害することで、がん細胞の免疫回避及び代謝脆弱性を標的にして正常細胞の副作用を革新的に減らした４世代ターゲット型代謝抗がん剤である。一般に、がん細胞特異的表面タンパク質の場合は正常細胞にも分布することが多く、特異的表面タンパク質を認識する標的タンパク質と毒性物質を結合する場合、正常細胞の被害は避けられない。しかし、認識だけでは毒性を与えず、過度に核酸の合成を試みるがん細胞の代謝を標的にする場合、がん細胞に対する認識率が高いため正常細胞の被害を減らすことができる。つまり、ＣＤ４７を認識してＴ００１ ｍＲＮＡが細胞内に流入されても、成長のために核酸を増幅しない大部分の正常細胞は核酸に対する要求が少ないため被害が殆どないが、過度な核酸を合成しなければ成長できないがん細胞の場合、ｄＴＭＰの欠乏による核酸の不均衡のため大きな被害を受ける。よって、がん細胞の高発現ＣＤ４７を認識する過程で一部の正常細胞のうち比較的高いＣＤ４７レベルを有する細胞を標的にしても、内部に流入された核酸代謝の標的によってがん細胞に更に大きな被害を与えることで、がん細胞の認識率を上げて正常細胞の被害を減らすことができる。
【0096】
図２０に示したように、ＳＶ４バインダを利用した抗がん剤の構成は、外部にＣＤ４７認識タンパク質を有し、内部にｍＲＮＡ型核酸代謝阻害薬物にがん種によって位置信号（核内、細胞質内、またはミトコンドリア内）を異なるようにして組み合わせたｍＲＮＡを捕集したリポソーム型ナノ粒子の形態になっている。図２７は、本発明によるＳＶ４バインダを利用した抗がん剤のメカニズムを示す模式的に示している。
【0097】
抗がん剤の構成要素
（１）ＣＤ４７バインダ（ＳＶ４）
Ｓｉｒｐα由来のタンパク質をを変形した高親和性ＣＤ４７結合体とそれにＤＳＰＥとのコンジュゲーションの際に正しい方向にリポソームの外部に位置するように変形したＳＶ４をＣＤ４７バインダ（ｂｉｎｄｅｒ）として使用したが、ＳＶ４の推定構造を図１Ａに示した。ＤＳＰＥと結合した資料、それをリポソームに挿入した資料それぞれのＫＤ値を比較した結果、配列変位によってリポソーム形態から改善されたことが分かった（前記表１を参照）。
（１）ＣＤ４７バインダ（ＳＶ４）
Ｓｉｒｐα由来のタンパク質をを変形した高親和性ＣＤ４７結合体とそれにＤＳＰＥとのコンジュゲーションの際に正しい方向にリポソームの外部に位置するように変形したＳＶ４をＣＤ４７バインダ（ｂｉｎｄｅｒ）として使用したが、ＳＶ４の推定構造を図１Ａに示した。ＤＳＰＥと結合した資料、それをリポソームに挿入した資料それぞれのＫＤ値を比較した結果、配列変位によってリポソーム形態から改善されたことが分かった（前記表１を参照）。
【0098】
（２）リポソーム基盤の薬物伝達体構成物質
リポソームは正電荷に荷電して標的まで円滑な薬物伝達を行うために使用された物質として、正イオン性リン脂質（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ１０００）、ＤＯＴＡＰ、及びコレステロールの構造をそれぞれ下記化学式１乃至３に示した。
リポソームは正電荷に荷電して標的まで円滑な薬物伝達を行うために使用された物質として、正イオン性リン脂質（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ１０００）、ＤＯＴＡＰ、及びコレステロールの構造をそれぞれ下記化学式１乃至３に示した。
【0099】
【化1】
【0100】
【化2】
【0101】
【化3】
【0102】
（３）薬物
上述したように、核内、細胞質内、及びミトコンドリア内で発現可能なｍＲＮＡとして、図２１にＴ００１ ｍＲＮＡの構成を概略的に示した。
上述したように、核内、細胞質内、及びミトコンドリア内で発現可能なｍＲＮＡとして、図２１にＴ００１ ｍＲＮＡの構成を概略的に示した。
【0103】
位置信号で融合されたｍＳｔｒｒａｗｂｅｒｒｙ ｍＲＮＡによって翻訳されたタンパク質のポジショニング
位置信号がよく作動したのかを確認するために、ｍＲＮＡを核及びミトコンドリア位置信号でＭＣＦ７にトランスフェクションした。ｍＳｔｒｒａｗｂｅｒｒｙ蛍光を検出し、各ｍＲＮＡの成功的なトランスフェクションと位置を確認した（図２２を参照）。具体的な実験方法は以下のようである。
位置信号がよく作動したのかを確認するために、ｍＲＮＡを核及びミトコンドリア位置信号でＭＣＦ７にトランスフェクションした。ｍＳｔｒｒａｗｂｅｒｒｙ蛍光を検出し、各ｍＲＮＡの成功的なトランスフェクションと位置を確認した（図２２を参照）。具体的な実験方法は以下のようである。
【0104】
６空洞細胞培養プレートの各空洞当たりに５×１０５個の細胞を入れ、３７℃、５％ＣＯ２条件の細胞培養器で２４時間培養してプレートの底に付着した。カルボキシフルオレセインコンジュゲート（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ＤＳＰＥを使用して構築したリポソームに実験室で合成した細胞内細胞質位置信号が連結された赤色の蛍光タンパク質を生成するｍＳｔｒｒａｗｂｅｒｒｙ ｍＲＮＡを捕集し、２４時間培養が終わったＭＣＦ－７細胞に処理してトランスフェクションした。２４時間更に培養した後、共焦点レーザ蛍光顕微鏡の緑色波長でリポソームのカルボキシフルオレセインが発生する緑色蛍光の細胞上での位置を確認し、赤色波長でトランスフェクションされたｍＲＮＡがｍＳｔｒｒａｗｂｅｒｒｙタンパク質を生成し細胞質に位置することを確認した。
【0105】
ＣＤ４７媒介の薬物伝達の確認
薬物の伝達がＣＤ４７を媒介に引き起こされるのかを確認するために、ＭＣＦ－７細胞にエピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）薬物が捕集されたＳＶ４が結合されたｉＬＰを処理した。この際、ＣＤ４７の媒介可否を確認するために、ＣＤ４７抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）を処理した実験群と処理していない実験群を比較した。具体的なＣＤ４７ ｍａｓｋｉｎｇ ａｓｓａｙ方法は以下のようである。
薬物の伝達がＣＤ４７を媒介に引き起こされるのかを確認するために、ＭＣＦ－７細胞にエピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）薬物が捕集されたＳＶ４が結合されたｉＬＰを処理した。この際、ＣＤ４７の媒介可否を確認するために、ＣＤ４７抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）を処理した実験群と処理していない実験群を比較した。具体的なＣＤ４７ ｍａｓｋｉｎｇ ａｓｓａｙ方法は以下のようである。
【0106】
６空洞細胞培養プレートの各空洞当たりに５×１０５個の細胞を入れ、３７℃、５％ＣＯ２条件の細胞培養器で２４時間培養してプレートの底に付着した後、一つの細胞サンプルにのみ最終濃度５μｇ／ｍｌのＣＤ４７抗体を入れて４時間反応し、細胞表面のＣＤ４７を遮断する。ここにエピルビシンを捕集しＳＶ４が結合されたリポソーム（ｉＬＰ）を各細胞ごとにエピルビシンの最終濃度が１０μＭになるようにｉＬＰ処理して２４時間培養した。２４時間後、蛍光顕微鏡を介して細胞内に導入されて細胞核で赤色蛍光を示すエピルビシンの蛍光程度を比較分析した。この際、対照群としてはエピルビシンを直接処理した細胞サンプルを使用した（図２３Ａを参照）。ＭＣＦ－７異種移植マウスの１００μｇのＳＶ４タンパク質を先に投与し飽和させてマウス体内のがん細胞のＣＤ４７を遮断した状態と同じ体積のリン酸緩衝生理食塩水を投与して、がん細胞のＣＤ４７を遮断していない状態にする。ここにＳＶ４－ＤＳＰＥと近赤外線領域の赤い蛍光を示すＣｙａｎｉｎｅ ５．５－ＤＳＰＥが同時に挿入されているＴ００１ ｍＲＮＡを捕集させたリポソームを血管注射によってマウス体内に１００μｌ（ｍＲＮＡ ５μｇ／Ｌｉｐｏｓｏｍｅ ０．５ｍｇ）を投与して、ＣＤ４７を媒介にしたターゲットに対する接近性を確認した。
【0107】
実験結果、図２３Ａに示したように、ＣＤ４７を遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した処理群ではエピルビシンの蛍光が示されなかったが、遮断していない実験群ではエピルビシンの蛍光が示された。
【0108】
また、体内でのＣＤ４７媒介の薬物伝達能を確認するためのＭＣＦ－７異種移植マウスモデル実験において、血液細胞に存在するＣＤ４７によって全般的なノイズが観察されたが、ＳＶ４で遮断したマウスでより遮断していないマウスのがん細胞でより強い薬物の伝達が確認された（図２３Ｂを参照）。
【0109】
ＭＣＦ７異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）マウスモデルにおいて、近赤外線蛍光タンパク質（Ｎｅａｒ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＮＩＲ ＲＦＰ）ｍＲＮＡを含むＳＶ４－コンジュゲートｉＬＰを静脈注射によって注入した後、時間別に蛍光画像を分析したが、その結果を図２４に示した。具体的な実験方法は以下のようである。
【0110】
ヒト乳がん細胞株であるＭＣＦ７をは移用してヌードマウスに異種移植した。ＮＩＲ－ＲＦＰ（Ｎｅａｒ Ｉｎｆｒａｒｅｄ－Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ） ｍＲＮＡが捕集されたＳＶ４－ｉＬＰを静脈注射によって２５ｇマウス当たり５μｇ ｍＲＮＡが投与されるように調節して投与した後、ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを使用して注射した試料の蛍光程度を追跡した。
【0111】
図２４を参照すると、ｍＲＮＡの伝達が一部血液細胞のＣＤ４７を介して引き起こされるが、比較的高いレベルでがん細胞に発現が蓄積される現象を観察した。
【0112】
ＭＣＦ７異種移植マウスＩＶがん成長制御効能試験（２８日）を行ったが、詳しくは、ＭＣＦ７を培養してヌードマウスに皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。腫瘍（ｔｕｍｏｒ）が成長したヌードマウスをランダムに分類した後、静脈（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ、ＩＶ）にそれぞれＰＢＳ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ＮＴ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ＭＴ（Ｌｉｐｓｏｍｅ ２０ ｍｐｋ、１０μｇ ｍＲＮＡ／ｍｇ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）を処理した。各ｍＲＮＡは５μｇを処理しており、３日間隔に２８日間、計５回処理した。３日間隔に腫瘍の体積（ｖｏｌｕｍｅ）を調査してグラフで示した。２８日目にヌードマウスを犠牲し、腫瘍を分離して体積を測定して、その結果を図２５に示した。
【0113】
図２５を参照すると、ｉＬＰＤ－ＮＴ及びｉＬＰＤ－ＭＴグループにおける腫瘍の成長率が２つの対照群グループ（Ｐ＝０．０３）に比べ著しく減少していた。また、ＰＢＳとＶｏｉｄ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ注入試料との間には若干の差があった。
【0114】
体内でのｍＲＮＡの毒性効果を評価するために、実験期間の間マウスの体重を測定したが、全てのグループでマウスの体重は全体実験期間にわたって若干増加しており、対照群に比べ試料注入後の体重の変化は大きくないと示された。図２５のように、実験完了後に犠牲されたマウスから採取した腫瘍組織の最終大きさを比較して示した。
【0115】
実験完了後に犠牲されたマウスから採取した血液と組織で血液学的及び組織学的検査を実施し、その結果を図２６に示した。図２６を参照すると、対照群に比べ試料を処理したマウスの血液と肝臓でＷＢＣの数を除外したら有意味な毒性効果は殆ど見られなかった。
【0116】
これまで説明した本発明の好ましい実施例は技術的課題を解決するために開示されたものであって、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者であれば本発明の思想及び範囲内で多様な修正、変更、付加などが可能なはずであり、このような修正変更などは以下の特許請求の範囲に属するとみなすべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図6-5】
【図6-6】
【図6-7】
【図6-8】
【図6-9】
【図6-10】
【図6-11】
【図6-12】
【図6-13】
【図6-14】
【図6-15】
【図6-16】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図12-4】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図15-1】
【図15-2】
【図15-3】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【配列表】