知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-01
(45)【発行日】2024-08-09
(54)【発明の名称】がんを治療するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20240802BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20240802BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240802BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240802BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00 ZNA
A61K38/48
A61P35/00
A61P35/02
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2021529792
(86)(22)【出願日】2019-11-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 US2019063594
(87)【国際公開番号】W WO2020112991
(87)【国際公開日】2020-06-04
【審査請求日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】62/771,869
(32)【優先日】2018-11-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/796,959
(32)【優先日】2019-01-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/893,492
(32)【優先日】2019-08-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】301040958
【氏名又は名称】ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィア
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＣＨＩＬＤＲＥＮ’Ｓ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＯＦ ＰＨＩＬＡＤＥＬＰＨＩＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】ヘンリック イアン
(72)【発明者】
【氏名】シュウ マーガレット エム
【審査官】伊藤 基章
(56)【参考文献】
【文献】HENRICH, I. et al.，J Immunother Cancer，2017年，Vol. 5, Suppl. 2，pp. 223-224
【文献】ISLAM, M.A. et al.，Biomater Sci，2015年，Vol. 3，pp. 1519-1533
【文献】SAHIN, U. et al.，Nat Rev Drug Discov，2014年，Vol. 13，pp. 759-780
【文献】AVCI-ADALI, M. et al.，J Vis Exp，2014年，Vol. 93, Article No. e51943，pp. 1-11
【文献】HENRICH, I.C. et al.，Mol Cancer Res，2018年08月，Vol. 16, No. 12，pp. 1834-1843
【文献】HENRICH, I. et al.，J Immunother Cancer，2016年，Vol. 4, Suppl. 1，pp. 118-120
【文献】HENRICH, I. et al.，Clin Cancer Res，2018年01月，Vol. 24, Suppl. 2，Abstract No. PR08
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｋ ３８／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
がんを治療するための医薬組成物であって、ユビキチン特異的プロテアーゼ６（ＵＳＰ６）活性を増加させる薬剤を含み、前記薬剤がＵＳＰ６をコードする核酸分子であり、前記ＵＳＰ６をコードする核酸分子がｍＲＮＡである、医薬組成物。
【請求項2】
前記組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記ＵＳＰ６をコードする核酸分子が、in vitroで転写されたＵＳＰ６ ｍＲＮＡである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記ｍＲＮＡが５'キャップを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記５’キャップがアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記ｍＲＮＡがポリアデニル酸テールを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記ポリアデニル酸テールが１００～１５０個のアデノシンを含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つのシュードウリジンおよび／または５－メチルシチジンを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
ウリジンの少なくとも４０％がシュードウリジンで置換されており、シチジンの少なくとも４０％が５－メチルシチジンで置換されている、請求項１～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記ｍＲＮＡが、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）および１００～１５０個のアデノシンのポリアデニル酸テールを含み、ウリジンの少なくとも４０％がシュードウリジンで置換され、シチジンの少なくとも４０％が５－メチルシチジンで置換されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記ｍＲＮＡが３’ＵＴＲを欠く、請求項１～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項12】
免疫療法と組み合わせて投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
インターフェロン（ＩＦＮ）と組み合わせて投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記ＩＦＮがＩＦＮβである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記がんがユーイング肉腫である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記がんが、膵臓がん、子宮頸部がん、肺がん、卵巣がん、または膀胱がんである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記がんが急性骨髄性白血病である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項18】
前記薬剤が脂質ナノ粒子内に含まれている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項19】
前記脂質ナノ粒子が、ターゲティング部位またはナノボディを含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、2018年11月27日に出願された米国仮特許出願第62/771,869号、2019年1月25日に出願された米国仮特許出願第62/796,959号、および2019年8月29日に出願された米国仮特許出願第62/893,492号に対して、35 U.S.C. §119(e)に基づく優先権を主張するものである。 前述の出願は、参照により本明細書に援用される。
【0002】
本発明は、米国国立衛生研究所が授与する助成番号TG 32GM008076、CA178601、CA168452の政府支援を受けて行われた。政府は本発明について一定の権利を有する。
【0003】
本出願は、抗がん療法の分野に関するものである。より具体的には、本発明はがんを治療するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【0004】
本発明が関連する技術の状況を説明するために、いくつかの出版物や特許文書が本明細書中に引用されている。これらの引用文は、参照することにより、すべてが記載されているかのように、本明細書に援用される。
【0005】
免疫療法はがんの治療に革命をもたらし、これまで難治性であった悪性腫瘍の患者に希望を与えている。しかし、すべての患者が近年の免疫療法の進歩の恩恵を受けているわけではない。メラノーマ、腎細胞がん、非小細胞肺がんでは有望な結果が得られているものの、固形がんのかなりの部分はほとんどの免疫療法に適していない。膵管腺がん（ＰＤＡＣ）は、毎年～５３，０００人のアメリカ人が罹患し、従来の治療法に反応しないこともあって、５年生存率は～１５％という悲惨な状況にある(Zhang, et al. (2018) Cancers (Basel) 10(2):E39; Adamska, et al. (2018) Adv. Biol. Regul.,68:77-87)。有効な治療法がないことから、免疫療法の研究が進められてきたが、その結果は残念なものであった。ＰＤＡＣの免疫抑制微小環境は、効果的な免疫療法に対する重要な障壁と考えられている。ＰＤＡＣは一般的に「コールド」がんと呼ばれ、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞が腫瘍から排除されることが多い。さらに、なんとか侵入できたＣＴＬは、しばしば不活性化される(Johnson, et al. (2017) Clin.Cancer Res., 23(7):1656-69)。浸潤した免疫細胞は、Ｔregs、Ｍ２極性マクロファージ、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）など、不均一ではあるが、非常に腫瘍化しやすい組み合わせとなっている。従来の免疫療法を成功させるためには、新たなアプローチとして、まず抗腫瘍免疫エフェクター細胞の浸潤を増やし、高度に免疫抑制された微小環境を克服する必要がある。
【0006】
免疫原性治療薬のデリバリーは、標的病変の退縮を引き起こすだけでなく、前臨床モデルと複数のがんにおける臨床試験の両方で、遠隔転移のクリアランスにつながることが示されている(Sagiv-Barfi, et al. (2018) Sci. Transl. Med., 10:12)。腫瘍に対する免疫原性反応を誘発するために、ベクターは、CXCL10(Liu, et al. (2002) Cancer Gene Ther., 9(6):533-42)、CCL5 (Lavergne, et al. (2004) J. Immunol., 173(6):3755-62)、またはＮＹ－ＥＳＯ－１のようながん－精巣抗原 (Nishikawa, et al. (2006) J. Clin. Invest., 116(7):1946-54) などのさまざまな免疫賦活因子を過剰に発現するように設計されている。しかし、薬剤の単独療法ががんではほとんど成功しないように、単一の因子の産生が持続的な反応につながるとは考えられない。したがって、がんに対する持続的な免疫反応を促進するためには、複数の免疫誘導経路の過剰発現が必要となる。以上のことから、免疫治療法の改善が必要であることは明らかである。
【発明の概要】
【0007】
本発明によれば、対象において、がん、特に「コールド」がんまたはＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）および／または他の免疫賦活特性を欠くがんを阻害または治療する方法が提供される。特定の実施形態では、方法は、ユビキチン特異的プロテアーゼ６（ＵＳＰ６）の活性および／または発現を増加させる薬剤を対象に投与することを含む。薬剤は、薬学的に許容される担体をさらに含む組成物の一部として投与できる。特定の実施形態では、薬剤は、腫瘍内に、全身に、および／または腫瘍部位に投与される。特定の実施形態では、ＵＳＰ６活性を増加させるための薬剤は、ＵＳＰ６タンパク質またはＵＳＰ６をコードする核酸分子（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＵＳＰ６ ｍＲＮＡ）である。本発明の方法は、免疫療法の投与をさらに含み得る。特定の実施形態では、治療されるがんは、ユーイング肉腫（ＥＳ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、子宮頸部、肺、卵巣、膀胱、または膵臓のがんである。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】図１Ａ～１Ｃは、ＵＳＰ６がｉｎ ｖｉｔｒｏのＥＳ細胞および原発性腫瘍においてＩＦＮ応答を誘導することを示している。図１Ａ：原発性ユーイング肉腫のデータセット（ＧＳＥ７００７およびＧＳＥ３７３７１）のサンプルをＵＳＰ６の発現レベルでランク付けし、最高レベルの５サンプルと最低レベルの５サンプルを比較してＧＳＥＡを行った。また、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）を投与したＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳと投与しなかったＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳについてＲＮＡ配列決定を行い、続いてＧＳＥＡによるパスウェイ解析を行った。また、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ ＨＴ１２ ｖ４．０ ＢｅａｄＣｈｉｐを利用して結節性筋膜炎のデータセットについてもＧＳＥＡを行った。このプラットフォームには、ＵＳＰ６に特異的な１つのＵＳＰ６プローブが含まれている。生殖細胞腫瘍のデータセットのＧＳＥＡ（セミノーマと卵黄嚢腫瘍の比較）も提供されている。図１Ｂ：記載のＲＤ－ＥＳ細胞株をドキシサイクリンの存在下で一晩培養した後、記載の通りにブロッティングした。ＵＳＰ６株はプールされた集団を表し、ＵＳＰ６（Ｈｉｇｈ）とＵＳＰ６（Ｍｅｄ）はクローン性である。図１Ｃ：生殖細胞腫瘍のデータセットＧＳＥ１０６１５（Ｕ１３３Ａマイクロアレイ）のサンプルにおいて、ＵＳＰ６の相対的なレベルを評価した。
【0009】
【0010】
【図3】図３Ａ－３Ｆは、ＵＳＰ６がＩ型ＩＦＮによるアポトーシスに対してユーイング肉腫細胞を感受性にすることを示している。ＵＳＰ６／ＲＤ－ユーイング肉腫細胞をドキシサイクリン（ｄｏｘ）の非存在下または存在下で培養した後、示されたＩＦＮを１，０００Ｕ／ｍＬで２４時間処理した。細胞は、ブロッティング（図３Ａ）、またはトリパンブルー排除アッセイで生存率をモニターした（ｎ＝３）（図３Ｂ）。 図３Ｃ：細胞をドキシサイクリンで培養した後、１，０００Ｕ／ｍＬのＩＦＮβで１８時間または２４時間処理した。アポトーシスはアネキシンＶ染色で定量化した（ｎ＝４）。図３Ｄ：ＵＳＰ６（Ｍｅｄ）、ＵＳＰ６（Ｈｉｇｈ）、および親のＲＤ－ＥＳ細胞をドキシサイクリン（ｄｏｘ）とＩＦＮβで一晩処理した後、示した通りにブロッティングした。矢印は切断されたＰＡＲＰ産物を示す。図３Ｅ：ドキシサイクリン（ｄｏｘ）の非存在下または存在下でＵＳＰ６／ＴＣ－７１細胞を培養した後、１００Ｕ／ｍＬの示したＩＦＮで２４時間処理した。図３Ｆ：細胞をドキシサイクリン（ｄｏｘ）で培養した後、１００Ｕ／ｍＬの示したＩＦＮで２４時間処理した。アポトーシスはアネキシンＶ染色で定量化した（ｎ＝３）。ＥＲＫまたはｐ６５をローディングコントロールとして使用した。
【0011】
【図4】図４Ａ－４Ｆは、ＩＦＮβ誘導アポトーシスがＪａｋ１－ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ３を必要とし、外因性および内因性の死経路を伴うことを示している。図４Ａおよび４Ｂ:５０μｍｏｌ／Ｌの汎カスパーゼ阻害剤ＺＶＡＤ（ｐａｎ）またはカスパーゼ８阻害剤ＩＥＴＤの非存在下または存在下で、細胞をドキシサイクリン（ｄｏｘ）およびＩＦＮβで一晩処理した。ライセートを記載の通りにブロッティングした。図４Ｃおよび４Ｄ：ドキシサイクリン（ｄｏｘ）およびＩＦＮβで一晩処理した細胞を、表示したカスパーゼ阻害剤の存在下で、カスパーゼ－９（ｎ＝６）およびカスパーゼ－３／７活性を測定した（ｎ＝３）。活性は未処理のＵＳＰ６（Ｈｉｇｈ）／ＲＤ－ＥＳでの活性に対する倍数として計算した。図４Ｅ：ＵＳＰ６（Ｈｉｇｈ）／ＲＤ－ＥＳを、汎Ｊａｋ阻害剤（１μｍｏｌ／Ｌ）またはＮＦκＢ阻害剤ＰＳ－１１４５（１５μｍｏｌ／Ｌ）の存在下で、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）およびＩＦＮβで一晩処理した。図４Ｆ：ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集により、Ｊａｋ１、ＳＴＡＴ１、またはＳＴＡＴ３を削除した。細胞をドキシサイクリンとＩＦＮβで一晩処理した後、示したようにブロットした。矢印は切断されたＰＡＲＰ産物を示し、ＥＲＫはローディングコントロールとして用いた。
【0012】
【図5】図５Ａー５Ｇは、ＩＦＮβがＴＲＡＩＬを相乗的に産生することで、ＵＳＰ６陽性のユーイング肉腫細胞のアポトーシスを誘導することを示している。図５Ａおよび５Ｂ：細胞をドキシサイクリン（ｄｏｘ）および示されているようにＩＦＮ（１，０００Ｕ／ｍＬ）で２４時間処理した。ＴＲＡＩＬ ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ－ＰＣＲで定量し、未処理のＲＤ－ＥＳと比較した誘導倍率を決定した。図５Ｃ：示した細胞をドキシサイクリン（ｄｏｘ）とＩＦＮβ（１，０００Ｕ／ｍＬ）で２４時間処理し、示した通りにブロットした。図５Ｄおよび５Ｅ：示された細胞を、増加する量（１．０、１．５、または２．０ｍｇ）の抗ＴＲＡＩＬまたはコントロールＩｇＧの存在下で、ＩＦＮβ（１，０００Ｕ／ｍＬ）またはｒｅＴＲＡＩＬ（２００ｎｇ／ｍＬ）で一晩処理した。図５Ｄではサンプルをブロッティングし、図５ＥではアネキシンＶの染色を行った。図５Ｆ：ＣＲＩＳＰＲを用いてＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳ細胞からＴＲＡＩＬを枯渇させた。示されているように細胞を一晩処理し、示されているようにブロットした。図５Ｇ：示されたユーイング肉腫細胞株は、示されているようにブロットされた。ＥＲＫまたはｐ６５をローディングコントロールとして使用した。
【0013】
【図6】図６Ａー６Ｄは、Ｉ型ＩＦＮがＴＲＡＩＬおよびカスパーゼ媒介メカニズムを介してＵＳＰ６のダウンレギュレーションを誘導することを示している。図６Ａ－６Ｃ：ＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳ細胞は、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）と、示された用量のＴＲＡＩＬまたはＩＦＮα（１，０００Ｕ／ｍＬ）で示された時間処理された。図６Ｃでは、ＴＲＡＩＬを１０ｎｇ／ｍＬで使用し、示されているように汎カスパーゼ阻害剤ＺＶＡＤ（ｐａｎ）またはカスパーゼ－８阻害剤（８）を添加した。ＳＴＡＴ３またはｐ６５をローディングコントロールとして使用した。図６Ｄ：ＵＳＰ６陽性ユーイング肉腫細胞のＩＦＮ誘導アポトーシスのメカニズム：Ｊａｋ１レベルは、ＵＳＰ６を介した脱ユビキチン化によってアップレギュレートされ、細胞をＩＦＮに大きく感作させる。Ｉ型ＩＦＮ、特にＩＦＮβはＴＲＡＩＬの転写を誘導し、ＴＲＡＩＬはその受容体ＤＲ４に結合することでアポトーシスを誘導する。次に、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４は、カスパーゼの活性化を通じてＵＳＰ６のダウンレギュレーションを引き起こす。
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【図20】図２０Ａは、２９３Ｔにトランスフェクションした後の、様々なＵＳＰ６（Ｙ１６２Ｈ）ＩＶＴ ｍＲＮＡコンストラクトまたはＤＮＡコントロールの発現を示すグラフである。図２０Ｂは、２９３Ｔにトランスフェクションした後の、酵素的に付加されたｐｏｌｙＡテールまたは定義されたｐｏｌｙＡテールまたはＤＮＡコントロールのいずれかを有するＵＳＰ６（Ｙ１６２Ｈ）ＩＶＴ ｍＲＮＡコンストラクトの発現を示すグラフである。図２０Ｃは、酵素的に付加されたｐｏｌｙＡテールまたは定義されたｐｏｌｙＡテールまたはＤＮＡコントロールのいずれかを有するＵＳＰ６（Ｙ１６２Ｈ）ＩＶＴ ｍＲＮＡコンストラクトをトランスフェクションした後の２９３Ｔ細胞におけるＣＤ５４およびＣＤ１５５の表面発現を示すグラフである。
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
（発明の詳細な説明）
本明細書では、ユビキチン特異的プロテアーゼ６（ＵＳＰ６）遺伝子が、致死率の高い小児悪性腫瘍であるユーイング肉腫において、強力な抗腫瘍性を有することが示されている。ユーイング肉腫細胞のＵＳＰ６の高発現は、免疫賦活性サイトカインおよびケモカインの分泌を誘導し、腫瘍免疫の浸潤を強固にし、免疫細胞を抗腫瘍性の表現型に分化させる。ＵＳＰ６はまた、ナチュラルキラー細胞やＣＤ８＋Ｔリンパ球などの免疫エフェクター細胞による腫瘍細胞の認識と殺傷を促進する受容体の表面発現を増加させるきっかけとなる。具体的には、I型のＩＦＮはプロ・アポトーシス・リガンドであるＴＲＡＩＬの相乗的な発現を誘導し、ＵＳＰ６＋ユーイング肉腫細胞を選択的に殺傷する。ＩＦＮはまた、ＵＳＰ６＋ユーイング肉腫細胞において、ＣＸＣＬ９／１０／１１やＣＣＬ５などの多数の抗腫瘍形成性ケモカインの発現の亢進を誘発する。これらの細胞からの馴化培地は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代単球および活性型ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の遊走を促進する。さらに、ＵＳＰ６は、ＭＨＣ Ｉの表面発現を増加させる。ＵＳＰ６＋ ＥＳ細胞の異種移植を受けたマウスでは、無イベント生存期間および終末腫瘍塊までの時間が延長された。ＵＳＰ６＋の腫瘍では、免疫の浸潤も劇的に亢進していた。最後に、初代ユーイング肉腫サンプルのトランスクリプトーム解析により、ＵＳＰ６の高い発現が生体内の免疫浸潤遺伝子シグネチャーと関連していることが明らかになった。
本明細書では、ユビキチン特異的プロテアーゼ６（ＵＳＰ６）遺伝子が、致死率の高い小児悪性腫瘍であるユーイング肉腫において、強力な抗腫瘍性を有することが示されている。ユーイング肉腫細胞のＵＳＰ６の高発現は、免疫賦活性サイトカインおよびケモカインの分泌を誘導し、腫瘍免疫の浸潤を強固にし、免疫細胞を抗腫瘍性の表現型に分化させる。ＵＳＰ６はまた、ナチュラルキラー細胞やＣＤ８＋Ｔリンパ球などの免疫エフェクター細胞による腫瘍細胞の認識と殺傷を促進する受容体の表面発現を増加させるきっかけとなる。具体的には、I型のＩＦＮはプロ・アポトーシス・リガンドであるＴＲＡＩＬの相乗的な発現を誘導し、ＵＳＰ６＋ユーイング肉腫細胞を選択的に殺傷する。ＩＦＮはまた、ＵＳＰ６＋ユーイング肉腫細胞において、ＣＸＣＬ９／１０／１１やＣＣＬ５などの多数の抗腫瘍形成性ケモカインの発現の亢進を誘発する。これらの細胞からの馴化培地は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代単球および活性型ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の遊走を促進する。さらに、ＵＳＰ６は、ＭＨＣ Ｉの表面発現を増加させる。ＵＳＰ６＋ ＥＳ細胞の異種移植を受けたマウスでは、無イベント生存期間および終末腫瘍塊までの時間が延長された。ＵＳＰ６＋の腫瘍では、免疫の浸潤も劇的に亢進していた。最後に、初代ユーイング肉腫サンプルのトランスクリプトーム解析により、ＵＳＰ６の高い発現が生体内の免疫浸潤遺伝子シグネチャーと関連していることが明らかになった。
【0040】
さらに、ＵＳＰ６の高い発現は、肉腫だけでなく、膵臓管腺がん、膀胱がん、子宮頸部がん、肺腺がんなど、致死率の高いがんの肉腫においても、生存率の劇的な上昇と関連している。実際、ＵＳＰ６の発現は正常組織では非常に制限されている。しかし、ＵＳＰ６の発現上昇は、肉腫を含むいくつかの小児および成人のがんで見られる。ユーイング肉腫患者のうち、約２５％がＵＳＰ６の発現を増加させていることがわかった。驚くべきことに、ＵＳＰ６の発現が多い肉腫患者は、発現が少ない患者と比較して、無イベント生存率および全生存率が劇的に向上した。
【0041】
このように生存率が高いのは、ＵＳＰ６の強力な免疫賦活作用によるものである。例えば、ＵＳＰ６は、血管新生を減少させ、主要な抗腫瘍免疫エフェクター細胞の移動／活性化を促進することが知られている多くの抗腫瘍性サイトカインの分泌を誘導する。また、ＵＳＰ６は、腫瘍細胞の免疫認識に関わる重要なサイトカインであるインターフェロン（ＩＦＮ）の免疫調節作用を細胞に感応させる。ＩＦＮは、ＵＳＰ６を発現している腫瘍細胞を直接殺すこともできる。ＵＳＰ６を過剰に発現している腫瘍では、免疫細胞の浸潤も亢進している。最後に、ＵＳＰ６は、免疫細胞の認識や腫瘍の除去に関わるいくつかの重要な受容体の表面発現を増加させる。例えば、ＵＳＰ６を発現している腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩやナチュラルキラー細胞による細胞傷害に関与するいくつかのリガンドを増強している。
【0042】
本明細書に記載されているデータは、ＵＳＰ６の活性を調節することが、悪性腫瘍と闘うための有効な治療法であることを示している。ｉｎ ｖｉｖｏのデータは、腫瘍細胞内のＵＳＰ６発現および／または活性を人為的に増加させると、マウスの腫瘍増殖が減少し、生存率が向上することを示し、ＵＳＰ６発現の増加が抗腫瘍形成性であるという概念実証データを提供する。ＵＳＰ６の高い発現を示すがんの多くは、チェックポイント阻害剤や改変Ｔ細胞などの新しいクラスの免疫療法を含む現在の治療法に抵抗性を示している。
【0043】
具体的には、ＰＤＡＣはアグレッシブながんであり、現在利用できる治療法はほとんどない。近年、他の腫瘍では進歩しているが、ＰＤＡＣでは免疫抑制的な微小環境のため、免疫療法は広く成功していない。ＰＤＡＣにおいてＵＳＰ６を一時的に過剰発現させることで、通常は免疫学的に「コールド」な腫瘍（すなわち、ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）やその他の免疫賦活性の特徴を欠く）と考えられているものが、免疫療法の可能性を最大限に発揮できる腫瘍へと変化する。実際、上述したように、ＵＳＰ６は、ＩＦＮシグナル伝達への影響を介して、「ホット」な腫瘍微小環境と腫瘍の除去を引き起こす能力により、患者の転帰を改善する。
【0044】
注目すべきは、Ｊａｋ１がＰＤＡＣで高発現していることである。従って、ＰＤＡＣは、本明細書に記載のＵＳＰ６の作用機序に基づいて、一過性のＵＳＰ６の過剰発現による免疫賦活効果を特に受けやすいと考えられる。ＵＳＰ６の活性を高めることで、ＰＤＡＣの免疫抑制的な微小環境を逆転させ、抗腫瘍エフェクター細胞のリクルートを促進できる。
【0045】
本発明によれば、がんの阻害（例えば、減少、遅延など）、予防、および／または治療のための方法が提供される。方法は、特にがん細胞または腫瘍および／または腫瘍微小環境において、ＵＳＰ６の発現および／または活性を増加させることを含む。特定の実施形態において、本方法は、ＵＳＰ６タンパク質をがん細胞または腫瘍に、および／または腫瘍微小環境に投与することを含む。特定の実施形態において、本方法は、ＵＳＰ６をコードする核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）をがん細胞または腫瘍に、および／または腫瘍微小環境に投与することを含む。ＵＳＰ６をコードする核酸分子は、例えば、ベクター、ウイルスベクター、ナノ粒子、リポソーム、ミセルなどで投与できる。特定の実施形態では、内因性のＵＳＰ６の発現または活性を薬理学的に増強することにより、ＵＳＰ６の発現および／または活性を増加させる。特に、外因性の核酸分子および／またはタンパク質の送達は、対象の免疫活性化を有益に誘導することが知られている（例えば、送達された薬剤はアジュバントとして機能する）。本発明の薬剤は、少なくとも１つの担体（例えば、薬学的に許容される担体）を含む組成物で対象に投与してもよい。
【0046】
特定の実施形態では、ＵＳＰ６の活性／発現が一過性に増加する。一過性発現させることで、非腫瘍組織におけるＵＳＰ６の構成的なオフターゲット発現の可能性を回避できる。ＵＳＰ６の活性／発現が一時的に増加することで、患者の免疫系を「ジャンプスタート」させることができ、治療効果が期待できる。さらに、ＵＳＰ６を一過性に発現させることで、必要に応じて薬剤を腫瘍やがんの細胞に繰り返し投与できる。特定の実施形態では、対象に投与されるＵＳＰ６をコードする核酸分子は、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）であり、これにより、プラスミドまたはウイルスベクターを使用した場合に起こり得る宿主ゲノム内の統合を回避できる。
【0047】
特定の実施形態では、対象に投与されるＵＳＰ６をコードする核酸分子は、ｍＲＮＡ、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ（ＩＶＴ）ｍＲＮＡである。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは成熟したＲＮＡであり、かつ、イントロンを欠いている。修飾されていないｍＲＮＡは、一般的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの安定性、翻訳、および取り込み（uptake)が悪い (Islam, et al. (2015) Biomater. Sci., 3(12):1519-33; Sahin, et al. (2014) Nat. Rev. Drug Discov., 13(10):759-80)。しかし、最近の進歩により、有効性を高めるｍＲＮＡの改変が発見された (参照、例えば Loomis et al. (2018) Bioconjugate Chem., 29(9):3072-3083)。ｍＲＮＡは、以下の特徴のうち１つまたは複数（またはすべて）で改変されていてもよいし、Sahin, et al (Nat. Rev. Drug Discov. (2014) 13(10):759-80)に記載のように改変されていてもよい。
【0048】
最初に、ｍＲＮＡは細胞内で翻訳されるために必要な５’と３’エレメントを持っている。特定の実施形態では、ｍＲＮＡはポリＡテールを含む。ポリアデニル酸テールは、テールに存在するアデニル酸の数を変えることができる(Steinle, et al. (2017) Stem Cells 35:68-79)。特定の実施形態では、ポリＡテールは、５０～５００塩基、１００～２５０塩基、１００～２００塩基、１００～１７５塩基、１２０～１５０塩基、１００～１５０塩基、１１０～１３０塩基、または約１２０塩基を有する。
【0049】
ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲを含んでいてもよいし、３’ＵＴＲを欠いていてもよい。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは３’ＵＴＲを欠いている。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＵＳＰ６ ３’ＵＴＲを含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの安定性および／または翻訳を向上させる３’ＵＴＲを含む。例えば、ｍＲＮＡは、βグロビン３’ＵＴＲ（例えば、ヒト）を含んでいてもよい。
【0050】
特定の実施形態では、ｍＲＮＡは５’キャップ、特にＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）を含む。ｍＲＮＡの強力な翻訳は、機能的な５’キャップ構造によって助けられる。例えば、ｍＲＮＡ産物は、転写され、５’キャップで改変され、確立されたプロトコルを用いて精製できる(Islam, et al.(2015)Biomater.Sci., 3(12):1519-33; Sahin, et al. (2014) Nat. Rev. Drug Discov., 13(10):759-80; Holtkamp, et al. (2006) Blood 108(13):4009-17)。ＨｉＳｃｒｉｂｅTM Ｔ７ ＡＲＣＡ （Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ） ｍＲＮＡ Ｋｉｔ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ； Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）などの市販のキットを使用して、キャップ付きおよびテール付きのｍＲＮＡを生成できる。５’キャップの例としては、７－メチルグアノシン（ｍ7Ｇおよびｍ7ＧｐｐｐＧキャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない(Wolff, et al. (1990) Science 247:1465-1468; Malone, et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci., 86:6077-6081)。任意にホスホロチオエートを含む抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ、ｍ2
7,3'-OＧｐｐｐＧ）は、様々な細胞種で優れた翻訳効率を示す (Stepinski, et al. (2001) RNA 7:1486-1495; Jemielity, et al. (2003) RNA 9:1108-1122; Mockey, et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Commun. 340:1062-1068; Rabinovich, et al. (2006) Hum. Gene Ther. 17:1027-1035; Grudzien-Nogalska, et al. (2007) RNA 13:1745-1755; Kowalska, et al. (2008) RNA 14:1119-1131; Kuhn, et al. (2010) Gene Ther. 17:961-971)。
【0051】
プロタミンを結合させたｍＲＮＡは、臨床の場で幅広く活躍しており(Weide, et al. (2009) J. Immunother., 32(5):9)、また、血清中で速やかに（２時間未満）分解されるという利点もあり、標的細胞におけるカーゴの免疫賦活効果を高めることができる (Islam, et al. (2015) Biomater. Sci., 3(12):1519-33; Sahin, et al. (2014) Nat. Rev. Drug Discov., 13(10):759-80)。第Ｉ／ＩＩ相試験において、腫瘍全体にオンコジーンを含むＩＶＴ ｍＲＮＡを注入することは、安全で効果的であることが示されている (Weide, et al. (2008) J. Immunother., 32(2):7)。他の改変されたＩＶＴ ｍＲＮＡの安定性から、改変されたＵＳＰ６ ｍＲＮＡの半減期は数日から１週間の範囲になると考えられる。
【0052】
ＵＳＰ６ ｍＲＮＡのポリＡテールを改変し、５’末端をキャッピングすることで安定性と発現が高まるが、コーディング領域、５’および３’ＵＴＲを改変すること、および／または改変ヌクレオシドを使用することも可能である(Sahin, et al. (2014) Nat. Rev. Drug Discov., 13(10):759-80; Steinle, et al. (2017) Stem Cells, 35:68-79)。 特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの改変または非天然（例えば、Ａ、Ｃ、Ｕ、またはＧではない）の塩基を含む (Limbach et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22(12):2183-2196)。 特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、改変または非天然（例えば、Ａ、Ｃ、Ｕ、またはＧではない）塩基のみを含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡはシュードウリジン（Ψ）および／または５－メチルシチジン（例えば、ウリジンおよびシトジンのそれぞれの代わりに）を含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡのウリジンのうち、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、またはそれ以上（すべて（１００％）を含む）がシュードウリジンで置換されている。特定の実施形態では、ｍＲＮＡのウリジンの約３０％～約７０％、約４０％～約６０％、約４５％～約５５％、または約５０％がシュードウリジンに置き換えられている。特定の実施形態では、ｍＲＮＡのシトジンのうち、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、またはそれ以上（すべて（１００％）を含む）が５－メチルシトジンで置換されている。特定の実施形態では、ｍＲＮＡのシトジンのうち、約３０％～約７０％、約４０％～約６０％、約４５％～約５５％、または約５０％が５－メチルシトジンで置換されている。他の改変されたヌクレオシドとしては、限定されないが、５－メトキシウリジン、５－メチルウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、５－メトキシシチジン、５－カルボキシメチルエステルウリジン、２－チオウリジン、７－メチルグアノシン、Ｎ6－メチルアデノシンなどがある。
【0053】
また、ｍＲＮＡはカプセル化されていてもよい。カプセル化されたＩＶＴ ｍＲＮＡは、いくつかの臨床試験において、安全であり、多くのタンパク質を短期間で発現させることができることが示されている。特定の実施形態では、ＩＶＴ ｍＲＮＡは、ナノ粒子、リポソーム、またはミセル（例えば、脂質ナノ粒子またはミセル）の中に含まれている。特定の実施形態では、カプセル化されたＩＶＴ ｍＲＮＡは、腫瘍抗原（例えば、他の細胞と比較して腫瘍またはがんに優先的に発現する表面タンパク質）を結合する結合薬剤を使用することによって、治療対象の腫瘍またはがんに向けられてもよい。例えば、ナノ粒子、リポソーム、またはミセルは、腫瘍抗原（例えば、CD13）に特異的な結合薬剤、特に抗体（例えば、腫瘍抗原に免疫学的に特異的なもの）またはナノボディ (Bannas, et al., Front. Immunol. (2017) 8:1603) に連結されていてもよい。 注目すべきは、上述したように、血清中および細胞内におけるＩＶＴ ｍＲＮＡの一過性の性質から、ＩＶＴ ＵＳＰ６ ｍＲＮＡは病原性を持たないと考えられることである。必要に応じて、投与量を減らしたり、安定性を低下させるためにｍＲＮＡを改変したりすることで、長期的な病原性を持つＵＳＰ６の発現を防ぐことができる。
【0054】
特定の実施形態では、ＵＳＰ６は哺乳類のものである。特定の実施形態では、ＵＳＰ６はヒト上科のものである。特定の実施形態では、ＵＳＰ６はヒトのものである。ＵＳＰ６のアミノ酸および核酸配列は、Ｇｅｎｅ ＩＤ： ９０９８およびＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ． ＮＭ_００１３０４２８４．１， ＮＰ_００１２９１２１３．１， ＮＭ_００４５０５．３， ＮＰ_００４４９６．２で提供されている。ＵＳＰ６のアミノ酸配列の例としては以下がある：
【0055】
ＵＳＰ６をコードする核酸配列の例としては、以下がある（４２２１ヌクレオチド）：
特定の実施形態では、ＵＳＰ６をコードする核酸配列は、配列番号２のＲＮＡバージョンである。
【0056】
特定の実施形態では、本発明の方法は、化学療法薬剤および／または免疫療法を対象に投与することをさらに含む。免疫療法は、ＵＳＰ６の活性／発現を高めるための薬剤の前、後、および／または同時に投与してもよい。免疫療法の例としては、チェックポイント阻害剤、インターフェロン（ＩＦＮ）、I型のＩＦＮ（例えば、ＩＦＮαおよび／またはＩＦＮβ）、ＩＦＮγ、養子縁組Ｔ細胞療法、改変Ｔ細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１Ｌまたは抗ＣＴＬＡ４）は、免疫賦活剤とのアジュバントとして使用すると、免疫応答を劇的に向上させる(Sagiv-Barfi, et al.Med., 10:12)。チェックポイント阻害剤の例としては、限定されるものではないが、ＰＤ－１阻害剤（例えば、ペムブロリズマブ（pembrolizumab ）（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））やニボルマブ（nivolumab）（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））などのＰＤ－１に免疫学的に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体）；ＰＤ－Ｌ１阻害剤（例えば、アテゾリズマブ（atezolizumab）（テセントリク（Tecentriq）（登録商標））などのＰＤ－Ｌ１に免疫学的に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体）；ＣＴＬＡ－４阻害剤（例えば、イピリムマブ（ipilimumab）（ヤーボイ（Yervoy）（登録商標）などのＣＴＬＡ－４に免疫学的に特異的な抗体、特にモノクローナル抗体）などを含む。
【0057】
本発明の組成物および方法を用いて治療され得るがんとしては、これらに限定されないが、前立腺がん、結腸直腸がん、膵臓がん、子宮頸部がん、胃がん（胃がん、stomach cancer、gastric cancer）、子宮内膜がん、脳がん、膠芽腫、肝臓がん、膀胱がん、卵巣がん、精巣がん、頭頸部がん、咽喉がん、皮膚がん、メラノーマ、基底がん、中皮腫、リンパ腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、食道がん、乳房がん、横紋筋肉腫、肉腫、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、副腎がん、甲状腺がん、腎がん、骨がん、神経内分泌がん、絨毛がんなどを含む。特定の実施形態では、がんが腫瘍を形成する。特定の実施形態では、がんは転移を伴う。特定の実施形態では、がんは子宮頚部がんである。特定の実施形態では、がんは肺がんである。特定の実施形態では、がんは膀胱がんである。特定の実施形態では、がんは卵巣がんである。特定の実施形態では、がんは、膵臓のがん（例えば、膵管腺がん）である。特定の実施形態では、がんはユーイング肉腫である。特定の実施形態では、がんは急性骨髄性白血病である。
【0058】
本発明の薬剤は、一般的に医薬製剤として患者に投与される。本明細書で使用される用語「患者」は、ヒト対象または動物対象を指す。これらの薬剤は、がんの治療のために、医師の指導のもとで治療的に使用できる。
【0059】
本発明の薬剤を含む医薬製剤は、水、緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油、洗剤、懸濁剤またはそれらの適切な混合物などの許容可能な媒体を用いて投与するために好都合に製剤化できる。選択された媒体中の薬剤の濃度を変化させてもよく、また、医薬製剤の望ましい投与経路に基づいて媒体を選択してもよい。従来の媒体や薬剤が投与される薬剤と相容れない場合を除き、医薬製剤への使用が考えられている。
【0060】
特定の患者に投与するのに適した本発明による薬剤の用量および投与レジメンは、医師が患者の年齢、性別、体重、一般的な医学的状態、薬剤を投与する特定の症状およびその重症度を考慮して決定できる。また、医師は、薬剤の投与経路、薬剤と組み合わせられる医薬品担体、および薬剤の生物学的活性を考慮できる。
【0061】
適切な医薬品の選択は、投与方法によって異なる。例えば、本発明の薬剤は、任意のがん組織（例えば、腫瘍）またはその周辺に直接注入して投与できる。この例では、医薬製剤は、がん組織に適合する媒体に分散された薬剤を含む。
【0062】
薬剤はまた、血流への静脈内注射によって、または皮下、筋肉内または腹腔内注射によって非経口的に投与され得る。非経口注射用の医薬製剤は当技術分野で知られている。薬剤を投与する方法として非経口注射を選択した場合、生物学的効果を発揮するのに十分な量の分子が標的細胞に到達することを確実にするための措置を講じる必要がある。
【0063】
本発明の薬剤を有効成分として、医薬用担体と密接に混和した医薬組成物は、通常の医薬配合技術に従って調製できる。担体は、投与したい製剤の形態に応じて、さまざまな形態をとることができる。非経口剤の場合、担体は通常、滅菌水で構成されているが、溶解性を高めるためや保存料などの他の成分が含まれることもある。また、注射用の懸濁液を調製してもよく、その場合、適切な液体担体、懸濁液薬剤などを採用できる。
【0064】
本発明の医薬製剤は、投与を容易にし、投与量を均一にするために、投与量単位の形態で製剤化できる。本明細書で使用する「投与量単位」とは、治療を受ける患者に適した、物理的に分離した医薬製剤の単位のことである。各投与量には、選択された医薬用担体との組み合わせで所望の効果をもたらすよう計算された量の活性成分が含まれている必要がある。適切な投与量単位を決定するための手順は、当業者にはよく知られている。投与量単位は、患者の体重に応じて比例的に増加または減少させることができる。特定の病状を緩和するための適切な濃度は、当技術分野で知られているように、投与濃度曲線計算によって決定できる。
【0065】
本発明に従って、本発明の薬剤を投与するための適切な投与量単位は、動物モデルにおける薬剤の毒性を評価することによって決定され得る。ヒトの腫瘍を移植したマウスに、様々な濃度の本発明の薬剤を投与し、治療の結果、腫瘍の大きさや副作用が著しく減少したという結果に基づいて、最小および最大の投与量を決定してもよい。適切な投与量単位は、他の標準的な抗がん薬との併用による薬剤の有効性を評価することによっても決定できる。薬剤の投与量単位は、腫瘍のより大きな収縮および／または増殖率の低下に応じて、個別にまたは各抗がん治療と組み合わせて決定できる。
【0066】
本発明の薬剤を含む組成物は、適切な間隔で、例えば、病理学的症状が軽減または緩和されるまで１日２回以上投与し、その後、維持レベルまで投与量を減らしてもよい。特定のケースでの適切な間隔は、通常、患者の状態によって異なる。
【0067】
定義
単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他の意味を持たない限り、複数の参照対象を含む。
単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他の意味を持たない限り、複数の参照対象を含む。
【0068】
「薬学的に許容される」とは、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されているか、米国薬局方またはその他の一般に認められた薬局方に記載されており、動物、特にヒトへの使用が認められていることを意味する。
【0069】
「担体」とは、例えば、希釈剤、アジュバント、防腐剤（例：チメロサール、ベンジルアルコール）、酸化防止剤（例：アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例：ポリソルベート８０）、乳化剤、緩衝剤（例：ＴｒｉｓＨＣｌ、酢酸、リン酸）、水、水性溶液、油、増量剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、補助剤、または本発明の活性薬剤が投与されるビヒクルを指す。担体としては、水や生理食塩水、デキストロースやグリセロールの水溶液が好ましく、特に注射剤の場合に採用される。適切な医薬用担体は、以下の文献に記載されている："Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, PA); Gennaro, A. R., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Lippincott, Williams and Wilkins); Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y.; and Kibbe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients (3rd Ed.), American Pharmaceutical Association, Washington.
【0070】
本明細書では、「対象」という言葉は、動物、特に哺乳類、特にヒトを指す。
【0071】
本明細書では、「予防する」という用語は、状態を発症する危険性のある対象に対する予防的治療で、対象が状態を発症する確率の低下をもたらすことを意味する。
【0072】
本明細書で使用する「治療」とは、病気にかかっている患者の状態（例えば、１つ以上の症状）の改善、病気の進行の遅延など、患者に利益をもたらすあらゆる種類の治療のことを指す。
【0073】
化合物や医薬組成物の「治療上有効な量」とは、特定の障害や疾患、およびその症状を予防、抑制、または治療するのに有効な量を指す。
【0074】
化学療法薬剤は、抗がん作用を示す化合物および／または細胞に有害な化合物（例えば、毒素）である。好適な化学療法薬剤としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない： 毒素（例：サポリン、リシン、アブリン、臭化エチジウム、ジプテリア毒素、およびシュードモナス外毒素）； タキサン類；アルキル化薬剤（例えば、テモゾロミド、クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタードなど）； チオテパなどのアジリジン類；ブスルファンなどのメタンスルホン酸エステル類；カルムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシンなどのニトロソ尿素類；白金錯体（例、シスプラチン、カルボプラチン、テトラプラチン、オルマプラチン、チオプラチン、サトラプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ヘプタプラチン、イプロプラチン、トランスプラチン、ロバプラチンなど）； ミトマイシン、プロカルバジン、ダカルバジン、およびアルトレタミンなどの生物還元性アルキル化剤）；ＤＮＡ鎖切断薬剤（ブレオマイシンなど）； トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例、アムサクリン、メノガリル、アモナフィド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、Ｎ，Ｎ－ジベンジルダウノマイシン、エリプチシン、ダウノマイシン、ピラゾロアクリジン、イダルビシン、ミトキサントロン、ｍ－ＡＭＳＡ、ビサントレン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、デオキシドキソルビシン、エトポシド（ＶＰ－１６）、エトポシドリン酸塩、オキサントラゾール、ルビダゾン、エピルビシン、ブレオマイシン、およびテニポシド）； DNA副溝結合剤（例：プリカミジン）；代謝拮抗薬（例：メトトレキサート、トリメトレキサートなどの葉酸拮抗薬）；フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ＣＢ３７１７、アザシチジン、シタラビン、およびフロクスリジンなどのピリミジン系アンタゴニスト；メルカプトプリン、６－チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチンなどのプリン系アンタゴニスト；アスパルギナーゼ； およびヒドロキシウレアなどのリボヌクレオチド還元酵素阻害剤）； アントラサイクリン類；およびチューブリン相互作用剤（例：ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル（タキソール（登録商標）））。
【0075】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明するために提供される。これらは、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【0076】
（実施例１）
肉腫は、腫瘍学における重要な課題を表す多様なクラスの悪性腫瘍である。ユーイング肉腫は２番目に多い骨肉腫であり、通常、生後２０年以内に個人に発症する (Biswas, et al. (2016) World J. Orthop., 7:527-38)。限局性の患者の５年生存率は７５％であるが、転移性の患者の生存確率は約２０％と悲惨な状況である。そのため、再発や治療効果を予測できるバイオマーカーを特定し、転移性疾患に対抗する戦略を立てることが急務となっている。
肉腫は、腫瘍学における重要な課題を表す多様なクラスの悪性腫瘍である。ユーイング肉腫は２番目に多い骨肉腫であり、通常、生後２０年以内に個人に発症する (Biswas, et al. (2016) World J. Orthop., 7:527-38)。限局性の患者の５年生存率は７５％であるが、転移性の患者の生存確率は約２０％と悲惨な状況である。そのため、再発や治療効果を予測できるバイオマーカーを特定し、転移性疾患に対抗する戦略を立てることが急務となっている。
【0077】
ユーイングの肉腫では、ＥＷＳのＲＮＡ結合タンパク質とＥｔｓファミリー転写因子（最も一般的にはＦＬＩ１）を融合させた転座産物が重要な病因となる(Cidre-Aranaz, et al. (2015) Front. Oncol., 5:162)。ＥＷＳ－ＦＬＩ１の活性が持続することがトランスフォーメーションには必要であり、その重要なターゲットを特定するために多大な努力が払われてきた。病因に関与する複数のエフェクターが、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養細胞とマウスモデルの両方で同定されている。さらに、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、およびＥＷＳ－ＦＬＩ１そのものを含む、これらのエフェクターのいくつかに対する治療薬も開発されている (Gaspar, et al. (2015) J. Clin. Oncol., 33:3036-46; Toomey, et al. (2010) Oncogene 29:4504-16)。しかし、その臨床効果は限られており、ユーイング肉腫治療のための新たな標的とアプローチを特定する必要性が強調されている。
【0078】
ユビキチン特異的プロテアーゼ６（ＵＳＰ６）オンコジーンは、原発性動脈瘤性骨嚢胞（ＡＢＣ）、結節性筋膜炎などの複数の良性間葉系腫瘍で転座している (Oliveira, et al. (2004) Cancer Res., 64:1920-3; Erickson-Johnson, et al. (2011) Lab. Invest., 91:1427-33)。ＵＳＰ６の転座は、腱鞘の線維腫や巨細胞に富む肉芽腫でも確認された (Agaram, et al. (2014) Hum. Pathol., 45:1147-52; Carter, et al. (2016) Mod. Pathol., 8:865-9)。いずれの場合も、転座によってプロモーターが入れ替わり、野生型のＵＳＰ６が高レベルで発現した。ＵＳＰ６の発現は通常、成人のヒト組織では非常に限られており、精巣でのみ有意なレベルが観察される(Paulding, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., 100:2507-11)。ＵＳＰ６は１９９２年に初めてクローニングされたが(Nakamura, et al. (1992) Oncogene 7:733-41)、最近までその分子機能については、生理学的にも腫瘍形成時にもほとんど知られていなかった。ＡＢＣおよび結節性筋膜炎の起源となる候補細胞（すなわち、線維芽細胞および前骨芽細胞）にＵＳＰ６を異所性に発現させると、ヒトの腫瘍の主要な臨床的、組織学的、分子的特徴を再現した腫瘍の形成が誘導され (Pringle, et al. (2012) Oncogene 31:3525-35; Ye, et al. (2010) Oncogene 29:3619-29; Lau, et al. (2010) J. Biol. Chem., 285:37111-20)、そのためには、脱ユビキチン化酵素としての触媒活性が不可欠である(Ye, et al. (2010) Oncogene 29:3619-29)。ＵＳＰ６は、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ３、Ｗｎｔ／ｂ－ｃａｔｅｎｉｎ、ＮＦｋＢなどの複数の経路を通じて腫瘍形成を促進する (Pringle, et al. (2012) Oncogene 31:3525-35; Madan, et al. (2016) Proc. Nat. Acad. Sci., 113:E2945-54; Quick, et al. (2016) Cancer Res., 76:5337-47)。Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ３経路では、Ｊａｋ１自体がＵＳＰ６の重要なターゲットとなっている (Quick, et al. (2016) Cancer Res., 76:5337-47)。ＵＳＰ６によるＪａｋ１の脱ユビキチン化は、プロテアソームによる分解からＪａｋ１を回復させ、キナーゼレベルを大幅に上昇させ、細胞をＩＬ６などのＪａｋ１アゴニストに感応させることになる(Quick, et al. (2016) Cancer Res., 76:5337-47)。
【0079】
ＵＳＰ６の転位による過剰発現は、良性の新生物では重要な役割を果たしているが、ＵＳＰ６が発がん因子ではない悪性腫瘍では、その役割はまだ解明されていない。ＵＳＰ６ががんの細胞株に広く発現しているというのは、よく間違って引用される。しかし、この誤った結論は、ノーザンプローブが非常に関連性が高く、広く発現しているＵＳＰ３２遺伝子と交差反応した初期の研究に基づいている (Nakamura, et al. (1992) Oncogene 7:733-41)。その後、ＵＳＰ６に特異的なプライマーを用いて原発性腫瘍の逆転写定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を行ったところ、ＵＳＰ６の発現はより限定的であることがわかった(Oliveira, et al. (2005) Oncogene 24:3419-26)。しかし、これまでに悪性細胞におけるＵＳＰ６の機能を調査した論文は少なく、ほとんどがＨｅＬａ細胞での調査であった (Madan, et al. (2016) Proc. Nat. Acad. Sci., 113:E2945-54; Masuda-Robens, et al. (2003) Mol. Cell Biol., 23:2151-61; Rueckert, et al. (2012) Biol. Cell., 104: 22-33; Li, et al. (2017) Mol. Cell. Biol., 38:e00320-17; Funakoshi, et al. (2014) J. Cell. Sci., 127:4750-61)。
【0080】
ＵＳＰ６の機能は、高レベルの発現が確認された悪性腫瘍の１つであるユーイング肉腫で調べられた (Oliveira, et al. (2005) Oncogene 24:3419-26)。本明細書では、ＵＳＰ６が、免疫機能を担うＪａｋ１アゴニストであるＩＦＮに対する応答を反映した遺伝子シグネチャーを誘発することが示されている。ＵＳＰ６は、外因性ＩＦＮに対してユーイング肉腫細胞を絶妙に感応させる。ＵＳＰ６を発現する細胞では、ＩＦＮ処理によりＳＴＡＴ１を介した遺伝子発現が劇的に増強されるだけでなく、I型ＩＦＮは、ＵＳＰ６陽性のユーイング肉腫細胞には選択的に細胞毒性を示すが、ＵＳＰ６陰性のユーイング肉腫細胞には示さない。ＩＦＮによる死は、強力なプロアポトーシス・リガンドであるＴＲＡＩＬによって媒介される。本研究は、悪性細胞におけるＵＳＰ６の機能を調べた第１の研究の一つであり、ＵＳＰ６がＩＦＮ治療に対するユーイング肉腫の反応性の予後指標となる可能性を示している。
【0081】
材料と方法
細胞株とＣＲＩＳＰＲを用いたジーンターゲティング
ＲＤ－ＥＳとＴＣ－７１は、それぞれ国立がん研究所（メリーランド州ベセスダ）とロサンゼルス小児病院、ケック医学校（カリフォルニア州ロサンゼルス）から入手した。ＣＨＬＡ－１０およびＳＫ－Ｎ－ＭＣは、ペンシルベニア大学（ペンシルベニア州フィラデルフィア）のペレルマン医学部から入手した。ドキシサイクリンで誘導してＵＳＰ６を発現させた株を作成した (Ye, et al. (2010) Oncogene 29:3619-29)。 細胞は３～６ヶ月ごとにマイコプラズマの検査を行い、解凍後２週間はＭｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｒｅｍｏｖａｌ薬剤（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ ＃０９３５００４４）で予防的に維持した。すべての実験で、解凍後２０回以下の継代で維持された細胞を使用した。細胞株の同一性は、原稿提出の直前に短タンデムリピート解析で確認した。
細胞株とＣＲＩＳＰＲを用いたジーンターゲティング
ＲＤ－ＥＳとＴＣ－７１は、それぞれ国立がん研究所（メリーランド州ベセスダ）とロサンゼルス小児病院、ケック医学校（カリフォルニア州ロサンゼルス）から入手した。ＣＨＬＡ－１０およびＳＫ－Ｎ－ＭＣは、ペンシルベニア大学（ペンシルベニア州フィラデルフィア）のペレルマン医学部から入手した。ドキシサイクリンで誘導してＵＳＰ６を発現させた株を作成した (Ye, et al. (2010) Oncogene 29:3619-29)。 細胞は３～６ヶ月ごとにマイコプラズマの検査を行い、解凍後２週間はＭｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｒｅｍｏｖａｌ薬剤（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ ＃０９３５００４４）で予防的に維持した。すべての実験で、解凍後２０回以下の継代で維持された細胞を使用した。細胞株の同一性は、原稿提出の直前に短タンデムリピート解析で確認した。
【0082】
Ｊａｋ１、ＳＴＡＴ１、およびＳＴＡＴ３の検証済みＣＲＩＳＰＲターゲット配列は、公開された配列のものである (Sanjana, et al. (2014) Nat. Methods 11:783-4)。標的 gRNA [Jak1 (CACCGTCCCATACCTCATCCGGTAG; 配列番号 3), STAT1 (CACCGTCCCATTACAGGCTCAGTCG; 配列番号 4), および STAT3 (CACCGAGATTGCCCGGATTGTGGCC; 配列番号 5)] は、記載のようにLentiCRISPRv2 (Addgene #52961) にサブクローン化した (Sanjana, et al. (2014) Nat. Methods 11:783-4)。ＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳ細胞にＣＲＩＳＰＲコンストラクトをトランスフェクトし、ピューロマイシンセレクションを行った。クローンはイムノブロッティングでスクリーニングした。
【0083】
試薬
ドキシサイクリンはＣｌｏｎＴｅｃｈ社から入手した（＃８６３４－１）。Ｊａｋ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉ （ＣＡＳ ４５７０８１－０３－７； ＃４２００９９）とＰＳ－１１４５ （Ｐ６６２４）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手した。ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγは、それぞれＰＢＬ Ａｓｓａｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ社（＃１１４１０－２、＃１１２００－１）、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（＃３００－０２）から入手した。ＺＶＡＤ（ＦＭＫ００１）とＩＥＴＤ（ＦＭＫ００７）はＲａｎｄＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手した。ＴＲＡＩＬ（カタログ番号７５２９０４）および抗ＴＲＡＩＬ（カタログ番号３０８２０２）はＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社から入手した。カスパーゼ－３／７（＃Ｇ８０９０）とカスパーゼ－９（＃Ｇ８２１０）の活性化キットはＰｒｏｍｅｇａ社から購入し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社のＳｐｅｃｔｒｏＭａｘでアッセイを行った。アネキシンＶ染色キットはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から入手し（＃８８－８００７－７２）、サンプルはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＡｃｃｕｒｉ Ｃ６およびＬＳＲ ＩＩ機器で分析した。
ドキシサイクリンはＣｌｏｎＴｅｃｈ社から入手した（＃８６３４－１）。Ｊａｋ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉ （ＣＡＳ ４５７０８１－０３－７； ＃４２００９９）とＰＳ－１１４５ （Ｐ６６２４）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手した。ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγは、それぞれＰＢＬ Ａｓｓａｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ社（＃１１４１０－２、＃１１２００－１）、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（＃３００－０２）から入手した。ＺＶＡＤ（ＦＭＫ００１）とＩＥＴＤ（ＦＭＫ００７）はＲａｎｄＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手した。ＴＲＡＩＬ（カタログ番号７５２９０４）および抗ＴＲＡＩＬ（カタログ番号３０８２０２）はＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社から入手した。カスパーゼ－３／７（＃Ｇ８０９０）とカスパーゼ－９（＃Ｇ８２１０）の活性化キットはＰｒｏｍｅｇａ社から購入し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社のＳｐｅｃｔｒｏＭａｘでアッセイを行った。アネキシンＶ染色キットはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から入手し（＃８８－８００７－７２）、サンプルはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＡｃｃｕｒｉ Ｃ６およびＬＳＲ ＩＩ機器で分析した。
【0084】
イムノブロッティングとｑＲＴ－ＰＣＲ
細胞溶解は、記載されている通りに行った (Sanjana, et al. (2014) Nat. Methods 11:783-4)。Ｊａｋ１（ｃｓ－３３３２），ｐＳＴＡＴ１（ｃｓ－９１６７），ｐＳＴＡＴ３（ｃｓ－９１４５），ＴＲＡＩＬ（ｃｓ－３２１９），ＰＡＲＰ（ｃｓ－９５４２），カスパーゼ－８（ｃｓ－９７４６），およびＢｉｄ（ｃｓ－２００２）は Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 社から入手した。ＨＡ（ｓｃ－８０５）、ＳＴＡＴ１（ｓｃ－３４６）、ＳＴＡＴ３（ｓｃ－４８２）、およびｐ６５（ｓｃ－３７２）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手した。Ｅｒｋ抗体はＷｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）から入手した。定量化はＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅを用いて行った。ＲＮＡの単離にはＴＲＩｚｏｌを用い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（カタログ番号４３６７６５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｑＰＣＲを行った。Ｅｒｋ、ＳＴＡＴ３、およびｐ６５は、説明されているように、タンパク質負荷のコントロールとして使用された (Hwang, et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:12758-65; Huang, et al. (2004) J. Biol. Chem., 279:13866-77; Banerjee, et al. (2010) Cancer Res., 70:1356-66; Chien, et al. (2011) Genes Dev., 25:2125-36)。示したように、これらのレベルはすべての条件で同程度であった。
細胞溶解は、記載されている通りに行った (Sanjana, et al. (2014) Nat. Methods 11:783-4)。Ｊａｋ１（ｃｓ－３３３２），ｐＳＴＡＴ１（ｃｓ－９１６７），ｐＳＴＡＴ３（ｃｓ－９１４５），ＴＲＡＩＬ（ｃｓ－３２１９），ＰＡＲＰ（ｃｓ－９５４２），カスパーゼ－８（ｃｓ－９７４６），およびＢｉｄ（ｃｓ－２００２）は Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 社から入手した。ＨＡ（ｓｃ－８０５）、ＳＴＡＴ１（ｓｃ－３４６）、ＳＴＡＴ３（ｓｃ－４８２）、およびｐ６５（ｓｃ－３７２）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手した。Ｅｒｋ抗体はＷｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）から入手した。定量化はＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅを用いて行った。ＲＮＡの単離にはＴＲＩｚｏｌを用い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（カタログ番号４３６７６５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｑＰＣＲを行った。Ｅｒｋ、ＳＴＡＴ３、およびｐ６５は、説明されているように、タンパク質負荷のコントロールとして使用された (Hwang, et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:12758-65; Huang, et al. (2004) J. Biol. Chem., 279:13866-77; Banerjee, et al. (2010) Cancer Res., 70:1356-66; Chien, et al. (2011) Genes Dev., 25:2125-36)。示したように、これらのレベルはすべての条件で同程度であった。
【0085】
遺伝子発現プロファイリング／経路解析、およびＤＮＡメチル化
ドキシサイクリンとＩＦＮαを２４時間処理した、または処理しなかったＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳ細胞からＲＮＡを分離した。ＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ－ｓｅｑ）、アラインメント、処理、リポジトリへの登録は、ペンシルバニア大学次世代シーケンスコア（ＧＳＥ１０７３０７）で行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３ＡおよびＵ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレイのＣＤＦファイルを編集し、ＵＳＰ３２や他の遺伝子と交差反応するプローブをＵＳＰ６プローブセット（２０６４０５_ｘ_ａｔ）から削除した。この洗練されたＵＳＰ６特異的プローブセットは、Ｐｒｏｂｅ ４、８、９、１１から構成されている。公開されているユーイング肉腫のデータセット[GSE7007 (Tirode, et al. (2007) Cancer Cell 11:421-9) and GSE37371 U133A (Martignetti, et al. (2012) PLoS One, 7:e41770)]をＵＳＰ６の発現量でソートした。ＵＳＰ６レベルが最も高い患者と最も低い患者を比較した（各グループ５名）。生殖細胞腫瘍のデータセットＧＳＥ１０６１５(Palmer, et al. (2008) Cancer Res., 68:4239-47)では、サンプルをセミノーマ（ＵＳＰ６high）と卵黄嚢腫瘍（ＵＳＰ６low）に分離した。遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）は、「Ｈａｌｌｍａｒｋｓ」分子シグネチャーデータベースを用いて、前述の方法で行った。結節性筋膜炎の遺伝子発現解析は、記述されているように、他のＵＳＰ６非発現の間葉系腫瘍と比較した (Quick, et al. (2016) Cancer Res., 76:5337-47)。
ドキシサイクリンとＩＦＮαを２４時間処理した、または処理しなかったＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳ細胞からＲＮＡを分離した。ＲＮＡシーケンス（ＲＮＡ－ｓｅｑ）、アラインメント、処理、リポジトリへの登録は、ペンシルバニア大学次世代シーケンスコア（ＧＳＥ１０７３０７）で行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３ＡおよびＵ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレイのＣＤＦファイルを編集し、ＵＳＰ３２や他の遺伝子と交差反応するプローブをＵＳＰ６プローブセット（２０６４０５_ｘ_ａｔ）から削除した。この洗練されたＵＳＰ６特異的プローブセットは、Ｐｒｏｂｅ ４、８、９、１１から構成されている。公開されているユーイング肉腫のデータセット[GSE7007 (Tirode, et al. (2007) Cancer Cell 11:421-9) and GSE37371 U133A (Martignetti, et al. (2012) PLoS One, 7:e41770)]をＵＳＰ６の発現量でソートした。ＵＳＰ６レベルが最も高い患者と最も低い患者を比較した（各グループ５名）。生殖細胞腫瘍のデータセットＧＳＥ１０６１５(Palmer, et al. (2008) Cancer Res., 68:4239-47)では、サンプルをセミノーマ（ＵＳＰ６high）と卵黄嚢腫瘍（ＵＳＰ６low）に分離した。遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）は、「Ｈａｌｌｍａｒｋｓ」分子シグネチャーデータベースを用いて、前述の方法で行った。結節性筋膜炎の遺伝子発現解析は、記述されているように、他のＵＳＰ６非発現の間葉系腫瘍と比較した (Quick, et al. (2016) Cancer Res., 76:5337-47)。
【0086】
５つの肉腫細胞株（ＣＡＤＯ－ＥＳ１，ＳＫ－ＮＭＣ， Ａ６７３，ＲＤ－ＥＳ，ＳＫ－ＥＳ－１）のＤＮＡメチル化データセットは、「Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ」から入手した (CCLE; portals.broadinstitute.org/ccle; Barretina, et al. (2012) Nature 483:603-7; Cancer Cell Line Encyclopedia Consortium (2015) Nature 528:84-7), そして、様々な遺伝子の相対的なＣｐＧメチル化をＧｒａｐｈＰａｄを使ってプロットした。ＵＳＰ６プロモーターのメチル化プローブＩＤはＭＥｘｐｒｅｓｓ社から入手し (Koch, et al. (2015) BMC Genomics 16:636) そして、ＧＳＥ８９０４１(Huertas-Martinez, et al. (2017) Cancer Lett., 386:196-207)と組み合わせて使用した。
【0087】
結果
ユーイング肉腫においてＵＳＰ６がＩＦＮ応答を誘発することを、患者サンプルおよび培養細胞を用いて明らかにした
ＵＳＰ６が発がん因子ではない悪性細胞でどのように機能するかについては、ほとんど知られておらず、主にＨｅＬａに限定した報告はわずかしかない (Madan, et al. (2016) Proc. Nat. Acad. Sci., 113:E2945-54; Masuda-Robens, et al. (2003) Mol. Cell Biol., 23:2151-61; Rueckert, et al. (2012) Biol. Cell., 104: 22-33; Li, et al. (2017) Mol. Cell. Biol., 38:e00320-17; Funakoshi, et al. (2014) J. Cell. Sci., 127:4750-61)。前述したように、新生物におけるＵＳＰ６の発現は、当初考えられていたよりもはるかに制限されている。幅広い原発性サンプルをスクリーニングしたところ、高発現は主にユーイング肉腫などの間葉系腫瘍に限られていた (Oliveira, et al. (2005) Oncogene 24:3419-26)。
ユーイング肉腫においてＵＳＰ６がＩＦＮ応答を誘発することを、患者サンプルおよび培養細胞を用いて明らかにした
ＵＳＰ６が発がん因子ではない悪性細胞でどのように機能するかについては、ほとんど知られておらず、主にＨｅＬａに限定した報告はわずかしかない (Madan, et al. (2016) Proc. Nat. Acad. Sci., 113:E2945-54; Masuda-Robens, et al. (2003) Mol. Cell Biol., 23:2151-61; Rueckert, et al. (2012) Biol. Cell., 104: 22-33; Li, et al. (2017) Mol. Cell. Biol., 38:e00320-17; Funakoshi, et al. (2014) J. Cell. Sci., 127:4750-61)。前述したように、新生物におけるＵＳＰ６の発現は、当初考えられていたよりもはるかに制限されている。幅広い原発性サンプルをスクリーニングしたところ、高発現は主にユーイング肉腫などの間葉系腫瘍に限られていた (Oliveira, et al. (2005) Oncogene 24:3419-26)。
【0088】
ユーイングの肉腫においてＵＳＰ６がどのような機能を持っているかを調べるために、原発性患者のサンプルで遺伝子の発現パターンを調べた。大規模な肉腫患者データの多くは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のマイクロアレイを使用している。このマイクロアレイは、特定の遺伝子に対する１１種類のプローブからなるプローブセットを使用している。しかし、ＵＳＰ６プローブセット（２０６４０５_ｘ_ａｔ）のほとんどのプローブは、ＵＳＰ３２や他の遺伝子と交差反応した。そこで、ＵＳＰ６に特異的なサブセットのプローブのみを使用するようにＧＳＥＡ分析を改良し、ＵＳＰ６の発現レベルが最も高い肉腫と最も低い肉腫を比較した。２つの独立した患者データセットから、ＩＦＮα（Ｉ型）およびＩＦＮγ（ＩＩ型）反応が、ＵＳＰ６の高発現と関連する上位のシグネチャーとして浮かび上がった（図１Ａ）。さらに、ＩＬ６／Ｊａｋ／ＳＴＡＴ３経路が強力に活性化された。
【0089】
ＵＳＰ６がこれらの遺伝子シグネチャーを直接誘導するかどうかを明らかにするために、不死化したユーイング肉腫細胞でメカニズムの研究を行った。しかし、一般的に使用されている肉腫株の中には、ＵＳＰ６を顕著に発現しているものはなかった。調べたすべての不死化肉腫細胞株において、ＵＳＰ６プロモーター全体に広範なＣｐＧメチル化が見られたが、原発性肉腫では比較的低いメチル化が見られた。ＣｐＧメチル化ヒートマップでは、複数の肉腫細胞株において、ＭｙｃやＥＺＨ２などの肉腫で高発現していることが知られている遺伝子と比較して、ＵＳＰ６が有意にサイレンシングされていることが明らかになった。細胞の不死化に伴ってＵＳＰ６がどのようにメチル化されるかは不明だが、いずれにしても、ＵＳＰ６を異所的に発現させる必要があった。患者由来の肉腫細胞株であるＲＤ－ＥＳを用いて、様々なレベルのＵＳＰ６をドキシサイクリンで誘導して発現させたクローンおよびプールされた安定株を作製した（図１Ｂ）。ＵＳＰ６は、ＡＢＣおよび結節性筋膜炎のモデルで観察されたのと同様に、Ｊａｋ１キナーゼ（ＵＳＰ６による直接的な脱ユビキチン化によって安定化される）の用量依存的なアップレギュレーションとＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導した（図１Ｂ）(Quick, et al. (2016) Cancer Res., 76:5337-47)。さらに、ＩＦＮシグナル伝達を媒介する主要なＳＴＡＴファミリーメンバーであるＳＴＡＴ１の強力なリン酸化が観察された（図１Ｂ）。ＲＮＡ－ｓｅｑは、プールされた細胞株であるＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳを、ドキシサイクリンの存在下と非存在下で比較して行った。原発性ユーイング肉腫サンプルと同様に、ＩＦＮαとＩＦＮγの反応がトップヒットとなり、次いでＩＬ６／Ｊａｋ／ＳＴＡＴ３の活性化が見られた（図１Ａ）。以上のことから、ＵＳＰ６はｉｎ ｖｉｖｏでのユーイング肉腫のＩＦＮ応答と関連するだけでなく、この経路を活性化するのに十分であることが示された。また、ＲＤ－ＥＳ細胞モデルは、ユーイング肉腫患者のサンプルにおけるＵＳＰ６の生理的機能を忠実に反映していることが検証された。
【0090】
そこで、ＵＳＰ６が他の腫瘍タイプのＩＦＮ応答と関連しているかどうかが検討された。結節性筋膜炎でもＩＦＮシグネチャーが誘導されており、これはＵＳＰ６の転座による過剰発現によって引き起こされている（図１Ａ）。また、生殖細胞腫瘍では、ＵＳＰ６の発現がＩＦＮ反応と関連していた。卵黄嚢腫瘍（通常は卵巣や精巣になる運命にある卵黄嚢を覆う細胞から発生した胚細胞腫瘍）は一様にＵＳＰ６の発現量が低いのに対し、セミノーマ（精巣の胚葉上皮から発生した胚細胞腫瘍）は高い発現量を示している（図１Ｃ）。セミノーマと卵黄嚢腫瘍を比較したＧＳＥＡでは、ＵＳＰ６の高い発現がＩＦＮやＪａｋ－ＳＴＡＴ３のシグネチャーと再び相関していることが明らかになった（図１Ａ）。これらの結果を総合すると、ＵＳＰ６はヒトの腫瘍におけるＩＦＮ応答とより広範に関連していることがわかる。
【0091】
ＵＳＰ６は外因性ＩＦＮ処理に対してユーイング肉腫細胞を感作する
ＵＳＰ６は、それ自体でＩＦＮ応答を引き起こすだけでなく、Ｊａｋ１レベルの上昇により、ＲＤ－ＥＳを外因性ＩＦＮに対して過敏にさせることができる。実際、ＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳ細胞におけるＳＴＡＴ１／３活性化の劇的な増強と延長は、Ｉ型およびＩＩ型のＩＦＮ（それぞれＩＦＮα／ＩＦＮβとＩＦＮγ、図２）で観察された。親のＲＤ－ＥＳ細胞をＩＦＮαまたはＩＦＮγで処理すると、ＳＴＡＴ１とＳＴＡＴ３のリン酸化が誘導され、３０分以内にピークに達し、８時間後までに徐々に減少した。一方、ＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳでは、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３のリン酸化が増強され、８時間後には顕著な活性化が持続した（図２ＡおよびＢ）。興味深いことに、Ｉ型ＩＦＮはＵＳＰ６のダウンレギュレーションを誘導した（図２Ａ）。
ＵＳＰ６は、それ自体でＩＦＮ応答を引き起こすだけでなく、Ｊａｋ１レベルの上昇により、ＲＤ－ＥＳを外因性ＩＦＮに対して過敏にさせることができる。実際、ＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳ細胞におけるＳＴＡＴ１／３活性化の劇的な増強と延長は、Ｉ型およびＩＩ型のＩＦＮ（それぞれＩＦＮα／ＩＦＮβとＩＦＮγ、図２）で観察された。親のＲＤ－ＥＳ細胞をＩＦＮαまたはＩＦＮγで処理すると、ＳＴＡＴ１とＳＴＡＴ３のリン酸化が誘導され、３０分以内にピークに達し、８時間後までに徐々に減少した。一方、ＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳでは、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３のリン酸化が増強され、８時間後には顕著な活性化が持続した（図２ＡおよびＢ）。興味深いことに、Ｉ型ＩＦＮはＵＳＰ６のダウンレギュレーションを誘導した（図２Ａ）。
【0092】
ＵＳＰ６は、ＳＴＡＴ１／３の活性化を延長することに加え、低用量ＩＦＮに対する感受性を高めた（図２Ｂ）。１０から１，０００Ｕ／ｍＬの用量で、ＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳ細胞は、親のＲＤ－ＥＳと比較してＳＴＡＴ１／３リン酸化の上昇を示した。ＵＳＰ６がＳＴＡＴの活性化を促進・延長する能力は、ＴＣ－７１、ＣＨＬＡ－１０、およびＳＫＮ－ＭＣという３つの患者由来のユーイング肉腫株でも確認されたことから、ＵＳＰ６の作用はユーイング肉腫株で広く認められ、ＲＤ－ＥＳ株の特異性ではないことが示された。
【0093】
驚くべきことに、長時間の処理により、I型ＩＦＮは親のＲＤＥＳ細胞ではなく、ＵＳＰ６を発現した細胞に対して選択的に細胞傷害性を示した。ＰＡＲＰ切断とトリパンブルー排除でモニターすると、ＩＦＮβが最も大きな細胞傷害性を示し、次いでＩＦＮα、ＩＦＮγの順であった（図３ＡおよびＢ）。アネキシンＶ染色により、ＩＦＮβによる死がアポトーシスによって起こることが確認された（図３Ｃ）。ＩＦＮβは、２，５００Ｕ／ｍＬまでの投与量でＩＦＮαよりも効果的にアポトーシスを誘導したが、これはＩＦＮβの方がI型ＩＦＮ受容体に対する親和性が高いためと考えられる。さらに、ＵＳＰ６は用量依存的にＩＦＮβに対する感受性をもたらし、死滅の程度はＵＳＰ６の発現レベルと相関していた（図３Ｄ）。ＵＳＰ６はまた、ＩＦＮβによるアポトーシスに対してＴＣ－７１細胞を感作した（図３ＥおよびＦ）。しかし、ＵＳＰ６はＣＨＬＡ－１０細胞とＳＫ－Ｎ－ＭＣ細胞の死を最小限に抑えた。しかし、これらの結果は、ＵＳＰ６がＩＦＮに対する反応の大きさを決定し、ＩＦＮのアポトーシスの可能性に対してＥＳ細胞を大きく感応させることができることを示している。
【0094】
ＩＦＮによるアポトーシスは、外因性と内因性の経路があり、Ｊａｋ１－ＳＴＡＴ１／３が必要である。
ＩＦＮは、細胞の種類によって、細胞表面の受容体にリガンドが結合することで起こる外因性アポトーシスや、ミトコンドリアの制御異常によって起こる内因性アポトーシスを引き起こすことができる。これらの経路は、異なるカスパーゼプロテアーゼを必要とすることで区別される。外因性アポトーシスでは、カスパーゼ－８が切断・活性化され、続いてカスパーゼ－３／７が活性化される。内因性アポトーシスでは、ミトコンドリアのタンパク質であるＢｉｄが切断され、カスパーゼ－９が活性化され、さらにカスパーゼ－３／７が活性化される。しかし、ＩＦＮによって誘導された外因性アポトーシスがミトコンドリアルートに流れ込み、Ｂｉｄやカスパーゼ－９の切断・活性化を引き起こす状況もある。
ＩＦＮは、細胞の種類によって、細胞表面の受容体にリガンドが結合することで起こる外因性アポトーシスや、ミトコンドリアの制御異常によって起こる内因性アポトーシスを引き起こすことができる。これらの経路は、異なるカスパーゼプロテアーゼを必要とすることで区別される。外因性アポトーシスでは、カスパーゼ－８が切断・活性化され、続いてカスパーゼ－３／７が活性化される。内因性アポトーシスでは、ミトコンドリアのタンパク質であるＢｉｄが切断され、カスパーゼ－９が活性化され、さらにカスパーゼ－３／７が活性化される。しかし、ＩＦＮによって誘導された外因性アポトーシスがミトコンドリアルートに流れ込み、Ｂｉｄやカスパーゼ－９の切断・活性化を引き起こす状況もある。
【0095】
ＩＦＮによって誘導されたＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳの死は、カスパーゼ－８特異的阻害剤であるＩＥＴＤによって阻止され（図４Ａ）、カスパーゼ－８の切断を伴っていた（図４Ｂ）ことから、外因性経路が関与していると考えられる。しかし、ＩＦＮβは、Ｂｉｄの切断（図４Ｂ）とカスパーゼ－９の活性化（図４Ｃ）も誘導し、ミトコンドリアルートの関与を示した。カスパーゼ－３／７の活性化も観察され、カスパーゼ－８阻害剤で阻止できた（図４Ｄ）。以上のことから、ＩＦＮβによるＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳ細胞の死は、ミトコンドリアの制御異常を伴う細胞表面を介した外因性の経路で起こることが示された。
【0096】
アポトーシスのシグナル伝達機構をさらに解明するために、ＩＦＮによる死に関与することが明らかになっているＪａｋ１－ＳＴＡＴとＮＦｋＢの役割を調べた (Hwang, et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:12758-65; Huang, et al. (2004) J. Biol. Chem., 279:13866-77)。汎Ｊａｋファミリー阻害剤は、ＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳのアポトーシスを完全に阻害したが、ＮＦｋＢ阻害剤は効果がなかった（図４Ｅ）。レポーターアッセイでは、ＮＦｋＢ阻害剤が機能していることが確認された。Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ経路の必要性を確認するために、ＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳ細胞でＪａｋ１、ＳＴＡＴ１、およびＳＴＡＴ３のＣＲＩＳＰＲによるノックアウトを行った（図４Ｆ）。図４Ｆは、Ｊａｋ１を欠失させると、死滅が著しく低下することを示している。このことは、ＳＴＡＴ１とＳＴＡＴ３がアポトーシス反応において異なる役割を果たしていることを示しており、ＩＦＮに応答してホモまたはヘテロダイマーとして機能することと一致している。これらの遺伝学的、薬理学的アプローチにより、Ｊａｋ１、ＳＴＡＴ１、およびＳＴＡＴ３がＩＦＮβを介したＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳのアポトーシスに必要であることが示された。
【0097】
ＩＦＮβによるＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳ細胞のアポトーシスは、ＴＲＡＩＬ経路を介して行われる
ＩＦＮはプロアポトーシスのリガンドであるＦａｓＬとＴＲＡＩＬの発現を誘導する。ＲＮＡ－ｓｅｑデータによると、ＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳでは、親細胞と比較して、ＦａｓではなくＴＲＡＩＬがＩＦＮによって相乗的に誘導されることが示された。ＲＴ－ｑＰＣＲにより、ＩＦＮがＲＤ－ＥＳのＴＲＡＩＬ発現にほとんど影響を及ぼさないことが確認された（図５Ａ）。しかし、ＩＦＮβで処理したＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳでは、ＴＲＡＩＬ ｍＲＮＡレベルが劇的に上昇していた。また、ＩＦＮαおよびＩＦＮγでも、より程度は低いものの誘導が見られ（図５Ａ）、それぞれで誘導された死の程度と相関していた（図３）。一方、ＦａｓＬの発現はＵＳＰ６の影響を大きく受けなかった。５つのＴＲＡＩＬ受容体の発現も調べ、活性型（ＤＲ４／ＤＲ５）と不活性型デコイ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ／ＤおよびＯＰＧ）の両方で、そのバランスがＴＲＡＩＬ誘発性アポトーシスに対するがん細胞の感作に重要な役割を果たすことが示されている (von Karstedt, et al. (2017) Nat. Rev. Cancer 17:352-66)。ＵＳＰ６は、死への感応と一致する方法で受容体の発現を変化させなかった。
ＩＦＮはプロアポトーシスのリガンドであるＦａｓＬとＴＲＡＩＬの発現を誘導する。ＲＮＡ－ｓｅｑデータによると、ＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳでは、親細胞と比較して、ＦａｓではなくＴＲＡＩＬがＩＦＮによって相乗的に誘導されることが示された。ＲＴ－ｑＰＣＲにより、ＩＦＮがＲＤ－ＥＳのＴＲＡＩＬ発現にほとんど影響を及ぼさないことが確認された（図５Ａ）。しかし、ＩＦＮβで処理したＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳでは、ＴＲＡＩＬ ｍＲＮＡレベルが劇的に上昇していた。また、ＩＦＮαおよびＩＦＮγでも、より程度は低いものの誘導が見られ（図５Ａ）、それぞれで誘導された死の程度と相関していた（図３）。一方、ＦａｓＬの発現はＵＳＰ６の影響を大きく受けなかった。５つのＴＲＡＩＬ受容体の発現も調べ、活性型（ＤＲ４／ＤＲ５）と不活性型デコイ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ／ＤおよびＯＰＧ）の両方で、そのバランスがＴＲＡＩＬ誘発性アポトーシスに対するがん細胞の感作に重要な役割を果たすことが示されている (von Karstedt, et al. (2017) Nat. Rev. Cancer 17:352-66)。ＵＳＰ６は、死への感応と一致する方法で受容体の発現を変化させなかった。
【0098】
図５Ｃは、ＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳにＩＦＮβを投与すると、ドキシサイクリン依存的にＴＲＡＩＬタンパク質が強く誘導されることを確認している。ＴＲＡＩＬの転写およびタンパク質の誘導は、ＵＳＰ６／ＴＣ－７１ユーイング肉腫の細胞株でも確認された（図５ＢおよびＣ）。抗ＴＲＡＩＬ中和抗体は、ＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳおよびＵＳＰ６／ＴＣ－７１細胞のＩＦＮβによるアポトーシスを阻害した（ＰＡＲＰ切断およびアネキシンＶ染色で測定）（図５ＤおよびＥ）。さらに、ＣＲＩＳＰＲを介してＴＲＡＩＬを欠失させると、ＩＦＮβによるＵＳＰ６／ＲＤ－ＥＳの死を完全に阻止できた（図５Ｆ）。これらのデータは、ＴＲＡＩＬがＩＦＮβによるＵＳＰ６陽性細胞のアポトーシスを媒介する上で支配的な役割を果たしていることを確認している。
【0099】
前述のように、ＵＳＰ６存在下でのＩＦＮβによるアポトーシスに対して、様々なユーイング肉腫株は異なる感受性を示した：ＲＤ－ＥＳとＴＣ－７１は非常に感受性が高く、ＣＨＬＡ－１０とＳＫ－Ｎ－ＭＣはほとんど反応しなかった（図３）。これが、これらの株でＴＲＡＩＬの誘導が異なることによるものかどうかを調べるために、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。しかし、ＴＲＡＩＬの転写は、感受性の低いユーイング肉腫株でも相乗的に誘導された（図５Ｂ）。次に、この反応性の違いが、ＴＲＡＩＬ受容体の発現の違いに起因するのかどうかを検討した。驚くべきことに、ＵＳＰ６存在下でのＩＦＮβに対する感受性は、ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４の発現と正確に相関していることがわかった。ＤＲ４レベルは、ＲＤ－ＥＳとＴＣ－７１で最も高く、感受性のないユーイング肉腫株ではほとんど検出されなかった（図５Ｇ）。
【0100】
ＩＦＮは、ＴＲＡＩＬ依存性のカスパーゼ活性化を介してＵＳＰ６のダウンレギュレーションを誘発する
上記のように、Ｉ型ＩＦＮはＵＳＰ６タンパク質のダウンレギュレーションを誘導する（図２、３、４）。ＴＲＡＩＬはまた、時間および用量依存的にＵＳＰ６のダウンレギュレーションを引き起こした（図６ＡおよびＢ）。ＴＲＡＩＬはより迅速に作用し、ＵＳＰ６のダウンレギュレーションが４時間以内に観察されたが、ＩＦＮβは１２～１８時間を必要とした（図２Ａおよび６Ｂ）。カスパーゼはＴＲＡＩＬシグナル伝達において重要な役割を果たすため、ＵＳＰ６のダウンレギュレーションを媒介するかどうかをテストした。汎カスパーゼ阻害剤ＺＶＡＤとカスパーゼ８阻害剤ＩＥＴＤの両方が、ＩＦＮβおよびＴＲＡＩＬによって誘導されるＵＳＰ６のダウンレギュレーションを完全にブロックした（それぞれ図４Ａおよび６Ｃ）。総合すると、これらの結果は、ＵＳＰ６がＴＲＡＩＬ転写を誘導し、それがＤＲ４を介してシグナルを送り、ＵＳＰ６のカスパーゼ依存性ダウンレギュレーションを引き起こすという負のフィードバックメカニズムを明らかにしている（モデルを参照、図６Ｄ）。注目すべきは、Ｉ型ＩＦＮとＴＲＡＩＬがＵＳＰ６を制御する第１の生理的なアゴニストであることである。
上記のように、Ｉ型ＩＦＮはＵＳＰ６タンパク質のダウンレギュレーションを誘導する（図２、３、４）。ＴＲＡＩＬはまた、時間および用量依存的にＵＳＰ６のダウンレギュレーションを引き起こした（図６ＡおよびＢ）。ＴＲＡＩＬはより迅速に作用し、ＵＳＰ６のダウンレギュレーションが４時間以内に観察されたが、ＩＦＮβは１２～１８時間を必要とした（図２Ａおよび６Ｂ）。カスパーゼはＴＲＡＩＬシグナル伝達において重要な役割を果たすため、ＵＳＰ６のダウンレギュレーションを媒介するかどうかをテストした。汎カスパーゼ阻害剤ＺＶＡＤとカスパーゼ８阻害剤ＩＥＴＤの両方が、ＩＦＮβおよびＴＲＡＩＬによって誘導されるＵＳＰ６のダウンレギュレーションを完全にブロックした（それぞれ図４Ａおよび６Ｃ）。総合すると、これらの結果は、ＵＳＰ６がＴＲＡＩＬ転写を誘導し、それがＤＲ４を介してシグナルを送り、ＵＳＰ６のカスパーゼ依存性ダウンレギュレーションを引き起こすという負のフィードバックメカニズムを明らかにしている（モデルを参照、図６Ｄ）。注目すべきは、Ｉ型ＩＦＮとＴＲＡＩＬがＵＳＰ６を制御する第１の生理的なアゴニストであることである。
【0101】
ＵＳＰ６がいくつかの良性新生物において重要な役割を果たしていることは以前から認識されていたが、悪性新生物の生物学におけるＵＳＰ６の機能はあまり理解されていない。原発性腫瘍サンプルを分析したところ、ヒトの悪性腫瘍の中で、ＵＳＰ６の発現が最も高いのは、ユーイング肉腫を含む間葉系がんであることが明らかになった。本研究は、ユーイング肉腫におけるＵＳＰ６の機能を探る初めての試みである。ＵＳＰ６の発現は、原発ユーイング肉腫腫瘍のＩＦＮシグネチャーと関連している。さらに、培養したユーイング肉腫細胞にＵＳＰ６を誘導的に発現させると、この反応を引き起こすのに十分である。ＵＳＰ６はまた、外因性ＩＦＮに対するユーイング肉腫細胞の絶妙な感受性をもたらす。驚くべきことに、Ｉ型ＩＦＮ（特にＩＦＮβ）は、ＤＲ４依存的に、ＵＳＰ６陰性ではなく、ＵＳＰ６陽性のユーイング肉腫細胞のＴＲＡＩＬを介したアポトーシスを誘導する（結果の概要は図６Ｄ参照）。
【0102】
これまでＵＳＰ６に関する研究はほとんど行われておらず、そのため、ＵＳＰ６の発現がどのように制御されているのか、その活性がどのように調節されているのか、また、ＵＳＰ６がどのような正常な生理過程に関与しているのかについては何もわかっていない。本願では、ＵＳＰ６の翻訳後修飾を引き起こす第１の生理的なアゴニストとして、Ｉ型ＩＦＮとＴＲＡＩＬが同定された。ＴＲＡＩＬはカスパーゼに依存したＵＳＰ６のプロセッシングとダウンレギュレーションを誘発するが、Ｉ型ＩＦＮはＴＲＡＩＬシグナルの誘導によってもこのダウンレギュレーションを誘発できる。この負のフィードバック・ループ（ＵＳＰ６がＩＦＮを介したＴＲＡＩＬの誘導を増幅させ、次にＵＳＰ６のダウンレギュレーションを引き起こす）は、正常な生理機能において、アポトーシスだけでなく炎症を含むＴＲＡＩＬ誘導機能を制限するために重要な役割を果たしていると考えられる (Zoller, et al. (2017) Sci. Rep., 7:5691; Azijli, et al. (2013) Cell Death Differ., 20:858-68)。
【0103】
今後の課題としては、ＵＳＰ６を介したＩＦＮシグナルがユーイング肉腫の病因にどのように影響するかを明らかにすることである。数多くの研究により、ＩＦＮは幅広い種類の腫瘍において、腫瘍の進行を促進したり、弱めたりすることが示されている (Bekisz, ET AL. (2013) J. Interferon Cytokine Res., 33:154-61; Wang, ET AL. (2013) J. Interferon Cytokine Res., 33:181-8; Zaidi, et al. (2011) Clin. Cancer Res., 17:6118-24)。この複雑さは、腫瘍細胞だけでなく、免疫細胞や腫瘍の微小環境にある他の細胞にも作用する能力があるからだと考えられる。いくつかのシナリオでは、ＩＦＮは、腫瘍細胞の増殖と転移を促進する炎症性微小環境を促進できる (Zaidi, et al. (2011) Clin. Cancer Res., 17:6118-24). また、ＩＦＮは免疫の浸潤を刺激し、それによって腫瘍細胞の殺傷を促進することもある。注目すべきは、ＩＦＮとＴＲＡＩＬは、ｉｎ ｖｉｔｒｏマウス異種移植でも、ユーイング肉腫の抗腫瘍性に大きく機能していることである(Kontny, et al. (2001) Cell Death Differ., 8:506-14; Wietzerbin, et al. (2003) Ann. NY Acad. Sci., 1010:117-120; Picarda, et al. (2010) Clin. Cancer Res., 16:2363-74)。
【0104】
ユーイング肉腫の患者に対する標準的な治療は、過去２０年間でほとんど進歩していない。一般的な細胞障害性化学療法は、播種性疾患や再発性疾患の患者には有効ではない。そのため、再発性／播種性疾患を予防・治療するための新しい治療法の開発や、治療に対する反応を予測するバイオマーカーの同定が重要な目標となっている。Ｉ型ＩＦＮはいくつかのがんの治療薬として検討されているが、現在のところ、その使用は進行したメラノーマの症例に限られている (Wang, et al. (2011) J. Interferon Cytokine Res., 31:545-52)。しかし、その強力な免疫賦活作用に起因する重篤な全身性の副作用のために、その広範な使用は制限されている(Wang, et al. (2011) J. Interferon Cytokine Res., 31:545-52)。今回の結果では、ＵＳＰ６が低用量ＩＦＮに対して細胞を大きく感作するため、この問題は緩和される。したがって、全身性の副作用を最小限に抑えつつ、殺腫瘍活性を維持できるＩＦＮの低用量投与が可能となる。さらに、ＵＳＰ６は他のがんでもＩＦＮ反応と関連することがあるため、今回の知見はＵＳＰ６が過剰に発現している他の悪性腫瘍にも適用可能である。
【0105】
（実施例２）
ユビキチン特異的ペプチダーゼ６（ＵＳＰ６）は、多くの免疫賦活因子の産生を促進する。ＵＳＰ６はヒトに特異的な遺伝子で、ほとんどの組織や器官で発現が制限されており、精巣でのみかなりの発現が検出されている。悪性腫瘍の中では、ユーイング肉腫を含むいくつかの肉腫で最も高発現しているが、他のがんでは高発現することはまれである (Oliveira, et al. (2014) Hum. Pathol., 45(1):1-11; Oliveira, et al. (2005) Oncogene 24(21):3419-26)。ＵＳＰ６は、動脈瘤性骨嚢胞（ＡＢＣ）および結節性筋膜炎（ＮＦ）として知られる２つの良性骨軟部腫瘍の主要な病因となっている。ＮＦとＡＢＣでは、ＵＳＰ６がプロモーターを交換する転座を起こし、その結果、野生型タンパク質が持続的に高発現する。ＮＦの臨床経過は独特であり、急速な増殖とそれに続く数週間または数ヶ月の自然退縮が見られる(Erickson-Johnson, et al. (2011) Lab Invest., 91(10):1427-33)。ＮＦ病変は、ＣＤ１６３マクロファージ、ＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞を含む免疫細胞の豊富な浸潤を示すが、Ｔregは示さない。ＡＢＣおよびＮＦにおけるＵＳＰ６の役割が調査され、ＵＳＰ６がＪａｋ１キナーゼを直接脱ユビキチン化および安定化する適応性および自然免疫応答を仲介する重要なエフェクターであるという発見につながった(Quick et al. (2016) Cancer Res., 76(18):5337-47)。
ユビキチン特異的ペプチダーゼ６（ＵＳＰ６）は、多くの免疫賦活因子の産生を促進する。ＵＳＰ６はヒトに特異的な遺伝子で、ほとんどの組織や器官で発現が制限されており、精巣でのみかなりの発現が検出されている。悪性腫瘍の中では、ユーイング肉腫を含むいくつかの肉腫で最も高発現しているが、他のがんでは高発現することはまれである (Oliveira, et al. (2014) Hum. Pathol., 45(1):1-11; Oliveira, et al. (2005) Oncogene 24(21):3419-26)。ＵＳＰ６は、動脈瘤性骨嚢胞（ＡＢＣ）および結節性筋膜炎（ＮＦ）として知られる２つの良性骨軟部腫瘍の主要な病因となっている。ＮＦとＡＢＣでは、ＵＳＰ６がプロモーターを交換する転座を起こし、その結果、野生型タンパク質が持続的に高発現する。ＮＦの臨床経過は独特であり、急速な増殖とそれに続く数週間または数ヶ月の自然退縮が見られる(Erickson-Johnson, et al. (2011) Lab Invest., 91(10):1427-33)。ＮＦ病変は、ＣＤ１６３マクロファージ、ＣＤ８+およびＣＤ４+Ｔ細胞を含む免疫細胞の豊富な浸潤を示すが、Ｔregは示さない。ＡＢＣおよびＮＦにおけるＵＳＰ６の役割が調査され、ＵＳＰ６がＪａｋ１キナーゼを直接脱ユビキチン化および安定化する適応性および自然免疫応答を仲介する重要なエフェクターであるという発見につながった(Quick et al. (2016) Cancer Res., 76(18):5337-47)。
【0106】
ＵＳＰ６のレベルが上昇している数少ないがんの１つであるユーイング肉腫におけるＵＳＰ６の役割も調査された。ＵＳＰ６は、患者由来の肉腫細胞株Ａ６７３およびＲＤ－ＥＳでドキシサイクリン誘導性の方法で発現した。ＵＳＰ６の発現レベルは、原発性患者の腫瘍サンプルの発現レベルに近いことが確認された。ＵＳＰ６の高発現は、インターフェロン応答シグネチャーを誘発し、表面のＭＨＣクラスＩ発現を増強し(Funakoshi, et al. (2014) J. Cell Sci., 127(Pt 21):4750-61)、これらに限定されないがＣＣＬ５、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＴＲＡＩＬなどの多数の免疫賦活因子の産生につながる。ユーイング肉腫でＵＳＰ６を発現させると、腫瘍の増殖が弱まり（図７Ａ）、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫細胞の浸潤が促進される（図７Ｂ、７Ｃ）。ｄｏｘによって誘導されたＵＳＰ６の発現は、ヌードマウスに異種移植されたユーイング肉腫細胞（ＴＣ７１）の増殖を阻害し、生存率を高めた（図７Ｄ）。図７Ｅに見られるように、ＵＳＰ６を発現させると、腫瘍体積が最大になるまでの時間が長くなり、腫瘍の増殖が遅くなる。さらに、ＵＳＰ６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化を促進する因子の分泌を誘導し、腫瘍微小環境において、成熟樹状細胞の存在を増加させる一方で、Ｍ２マクロファージの存在を減少させる。また、ＵＳＰ６発現が高い患者は、発現が低い患者に比べて、全生存期間および無イベント生存期間が良好であることが、マウスのユーイング肉腫異種移植モデルと一致している。注目すべきは、ＵＳＰ６の高い発現が、他の多くのがんにおける生存率の向上と関連していることである（図７Ｆ）。
【0107】
（実施例３）
図８Ａに示すように、ＵＳＰ６発現が高い急性骨髄性白血病患者は、予後が有意に改善している。同様に、図８Ｂは、ＵＳＰ６の発現量が高いユーイング肉腫患者の予後が有意に改善していることを示している。
図８Ａに示すように、ＵＳＰ６発現が高い急性骨髄性白血病患者は、予後が有意に改善している。同様に、図８Ｂは、ＵＳＰ６の発現量が高いユーイング肉腫患者の予後が有意に改善していることを示している。
【0108】
ユーイング肉腫細胞株ＴＣ－７１、ＲＤ－ＥＳ、およびＣＨＬＡ１０を追加実験で使用した。注目すべきは、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）の添加により、ＵＳＰ６の発現が起こることである。図９に示すように、ＵＳＰ６は、プロアポトーシスのリガンドであり、腫瘍の増殖をコントロールするのに有用なＴＲＡＩＬの受容体であるＴＲＡＩＬ－Ｒ１とＴＲＡＩＬ－Ｒ２の発現をアップレギュレートする。図１０に示すように、ＵＳＰ６はＣＤ５４（細胞傷害性免疫細胞が標的腫瘍細胞に結合することを可能にする）およびＨＬＡ－ＡＢＣ／ＭＨＣクラスＩ（細胞傷害性Ｔ細胞が腫瘍細胞を認識して殺すために使用）の発現もアップレギュレートする。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、腫瘍細胞を殺すことができる細胞毒性免疫細胞である。特に、ＵＳＰ６の誘導は、腫瘍細胞をＮＫ細胞株ＮＫ－９２に感作させる（図１１）。
【0109】
（実施例４）
図１２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡのＵＳＰ６プラスミドマップの概略図を示している。ＨｉＳｃｒｉｂｅTM Ｔ７ ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ）ｍＲＮＡキット（ニューイングランドバイオラボ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）などの市販のキットを使用して、キャップ付きおよびテール付きのｍＲＮＡを生成できる。In vitroで転写されたＲＮＡは、細胞に投与できる（例えば、ナノ粒子、リポソーム、またはミセルを介して）。ここでは、市販の脂質キャリアであるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘTM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いてｍＲＮＡをカプセル化し、細胞に送達した。カプセル化とトランスフェクションは、メーカーの推奨する方法で行った。
図１２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡのＵＳＰ６プラスミドマップの概略図を示している。ＨｉＳｃｒｉｂｅTM Ｔ７ ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ）ｍＲＮＡキット（ニューイングランドバイオラボ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）などの市販のキットを使用して、キャップ付きおよびテール付きのｍＲＮＡを生成できる。In vitroで転写されたＲＮＡは、細胞に投与できる（例えば、ナノ粒子、リポソーム、またはミセルを介して）。ここでは、市販の脂質キャリアであるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘTM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いてｍＲＮＡをカプセル化し、細胞に送達した。カプセル化とトランスフェクションは、メーカーの推奨する方法で行った。
【0110】
ＵＳＰ６は、ＴＢＣ（Ｔｒｅ－２／Ｂｕｂ２／Ｃｄｃ１６）ドメインとユビキチン特異的プロテアーゼドメイン（ＵＳＰ）を含む。ＵＳＰ６のＡ６変異体は、ＴＢＣドメインの３重の点変異体で、ＵＳＰ６がＡｒｆ６を活性化し、表面の受容体を輸送する能力を失っている(Lau et al. (2010) J. Biol. Chem., 285(47): 37111-37120)。ＵＳＰ６のＣＳ変異体は、重要な触媒残基（Ｃｙｓ５４１→Ｓｅｒ）に点変異があり、タンパク質のレスキュー活性が失われている (Madan et al. (2016) PNAS 113(21):E2945-E2954)。
【0111】
図１３に見られるように、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により、ユーイング肉腫とＡＭＬでＵＳＰ６ ｍＲＮＡの発現に成功したことが示された。ＵＳＰ６またはＵＳＰ６（ＣＳ／Ａ６）を投与した細胞では、未処理の細胞やコントロール（ｃＬｕｃ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ））で処理した細胞と比較して、ＵＳＰ６の発現が大きくなっていた。
【0112】
図１４に見られるように、ＵＳＰ６ ｍＲＮＡは、ＡＭＬおよびユーイング肉腫において抗腫瘍性サイトカインを誘導する。実際、ＣＸＣＬ９とＴＲＡＩＬのｍＲＮＡの発現は、ＵＳＰ６で処理した細胞では、未処理の細胞、コントロール（ｃＬｕｃ）で処理した細胞、不活性変異体ＵＳＰ６（ＣＳ／Ａ６）で処理した細胞と比較して、有意に増加した。
【0113】
図１５に見られるように、ＵＳＰ６のｍＲＮＡは機能的なタンパク質に翻訳される。ＨＡタグ付きのＵＳＰ６タンパク質は、ＵＳＰ６のｍＲＮＡを増量して導入したＨｅＬａ細胞で測定した（図１５）。２９３Ｔ細胞を用いた実験では、ＨＡタグ付きＵＳＰ６タンパク質の増加は一過性であり、ＵＳＰ６ ｍＲＮＡの導入により、ＣＤ５４、ＭＨＣクラスＩ、ＤＲ５の表面発現が増加することが示された。ＵＳＰ６ ｍＲＮＡはまた、いくつかのＡＭＬ細胞株（ＮＢ４、Ｕ９３７）において、免疫認識マーカーの表面発現を増加させる（図１６Ａ）。実際、ＵＳＰ６のｍＲＮＡが存在すると、未処理の細胞や、変異体ＵＳＰ６（ＣＳ）とＵＳＰ６（Ａ６）、あるいは二重変異体ＵＳＰ６（ＣＳ／Ａ６）で処理した細胞と比較して、ＣＤ５４とＭＨＣクラスＩの発現が増加したのである。図１６Ｂは、ＵＳＰ６ ｍＲＮＡを導入したＴＨＰ－１またはＵ９３７ ＡＭＬ細胞において、ＤＲ５およびＭＨＣ クラスＩの発現がコントロールと比較して増加したことを示している。
【0114】
図１７に見られるように、ＵＳＰ６ ｍＲＮＡはいくつかの細胞株で選択的に死を誘導した。ＨｅＬａ、ユーイング肉腫（Ａ６７３）およびＡＭＬ （ＴＨＰ－１）細胞をＵＳＰ６ ｍＲＮＡで処理すると、アポトーシスが誘導されたが、未処理の細胞や、コントロールのｃＬｕｃまたは不活性二重変異体ＵＳＰ６（ＣＳ／Ａ６）で処理した細胞では誘導されなかった。
【0115】
また、ユーイング肉腫の細胞株Ａ６７３は、１μｇのコントロールｍＲＮＡ（ｃＬｕｃ）またはＵＳＰ６ ｍＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘTMでトランスフェクションした。その後、細胞を１０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮβまたは０．５ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγで処理した。ＵＳＰ６ ｍＲＮＡは、コントロール群と比較して、抗腫瘍性サイトカインであるＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、ＴＲＡＩＬの発現を選択的に強力に誘導する（図１８）。
【0116】
未処理またはＵＳＰ６ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたユーイング肉腫細胞株Ａ６７３を、ＵＳＰ６－またはＵＳＰ６＋の集団に選別した。そして、抗腫瘍性表面受容体の表面発現を分析した。図１９に見られるように、ＵＳＰ６を発現した細胞は、抗腫瘍性の受容体であるＣＤ５４、ＤＲ５、ＣＤ１５５を高レベルで発現している。
【0117】
（実施例５）
ＵＳＰ６の３’ＵＴＲがタンパク質の発現に必要かどうかを、３種類のコンストラクトを用いて調べた。ＩＶＴのｍＲＮＡを合成するためには、まず、３’と５’の末端に対するプライマーを使って、作業可能な断片を作ることが必要である。ここでは、ＩＶＴのｍＲＮＡを合成するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの結合部位となるＴ７プロモーターを使用した。また、このコンストラクトは、ＵＳＰ６タンパク質の発現を検出するために、ＵＳＰ６コード領域の５’末端にＨＡタグを含んでいる。第１のコンストラクトは、ＵＳＰ６のコーディング領域（ＣＤＳと呼ぶ）の３’エンドで終了する。第２のコンストラクトは、さらにＵＳＰ６ ３’ＵＴＲを含む。第３のコンストラクトは、ＵＳＰ６ ３’ＵＴＲ（ＵＴＲと呼ばれる）と、ＵＳＰ６ ３’ＵＴＲのすぐ下流にあるＳＰ６サイトをさらに含む。
ＵＳＰ６の３’ＵＴＲがタンパク質の発現に必要かどうかを、３種類のコンストラクトを用いて調べた。ＩＶＴのｍＲＮＡを合成するためには、まず、３’と５’の末端に対するプライマーを使って、作業可能な断片を作ることが必要である。ここでは、ＩＶＴのｍＲＮＡを合成するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの結合部位となるＴ７プロモーターを使用した。また、このコンストラクトは、ＵＳＰ６タンパク質の発現を検出するために、ＵＳＰ６コード領域の５’末端にＨＡタグを含んでいる。第１のコンストラクトは、ＵＳＰ６のコーディング領域（ＣＤＳと呼ぶ）の３’エンドで終了する。第２のコンストラクトは、さらにＵＳＰ６ ３’ＵＴＲを含む。第３のコンストラクトは、ＵＳＰ６ ３’ＵＴＲ（ＵＴＲと呼ばれる）と、ＵＳＰ６ ３’ＵＴＲのすぐ下流にあるＳＰ６サイトをさらに含む。
【0118】
ＩＶＴ ｍＲＮＡはＮＥＢのキットで合成された (www.neb.com/products/ e2060-hiscribe-t7-arca-mrna-kit-with-tailing#Product%20Information)。発現を改善するために、ｍＲＮＡをＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ）でキャップした。ウリジンとシトシンの５０％を合成５－メチルシトシンとシュードウリジンに置き換えて、発現を改善し、細胞死を減らした。なお、今回の実験で使用したＵＳＰ６には点変異（Ｙ１６２Ｈ）があり、ＵＳＰ６の機能や発現には影響していないようである。適切なｍＲＮＡの翻訳と安定性のためのポリＡテールの付加には、酵素プロセスが採用された。酵素法では、様々な長さのテールを有する産物（通常１００～２００塩基）のプールを作成する。
【0119】
ＵＳＰ６（Ｙ１６２Ｈ） ＩＶＴのｍＲＮＡまたはＤＮＡコントロールを、市販の脂質キャリアー(Lipofectamine（登録商標） MessengerMaxTM for mRNA and Lipofectamine（登録商標） 2000 for DNA)を用いて２９３Ｔにトランスフェクションした。１サンプルあたり１．６μｇのＤＮＡまたはｍＲＮＡを使用した。ＵＳＰ６を発現している細胞の割合は、抗ＨＡ抗体を用いた細胞内フローサイトメトリーにより決定した。図２０Ａに見られるように、すべてのコンストラクトがＵＳＰ６を発現していた。ただし、ＣＤＳおよびＵＴＲバージョンはＳＰ６バージョンよりも優れていた。ＵＳＰ６の３’ＵＴＲは、その発現を負に制御する複数のｍｉＲＮＡの標的になっていると考えられることから、ＣＤＳコンストラクトを選択し、さらなる実験を行った。
【0120】
前述のように、ポリＡテールは最初、酵素法を用いて付加された。この手法により、様々な長さのテールを有する産物のプールが得られる。より明確な産物を提供するために、１２０個のチミンを含むリバースＣＤＳプライマーを介してポリＡテールを直接追加した。そのため、ＩＶＴのｍＲＮＡは、１２０個のアデノシンからなる一定のポリＡテールを含む。
【0121】
酵素法やＰＣＲ法でポリＡテールを付加したＵＳＰ６（Ｙ１６２Ｈ） ＩＶＴ ｍＲＮＡやＤＮＡコントロールを、市販の脂質キャリア(Lipofectamine（登録商標） MessengerMaxTM for mRNA and Lipofectamine（登録商標） 2000 for DNA) を用いて２９３Ｔに様々な量でトランスフェクションした。ＵＳＰ６を発現している細胞の割合を、抗ＨＡ抗体を用いた細胞内フローサイトメトリーで測定した。ＵＳＰ６は、腫瘍に対する免疫細胞の認識に重要な２つの受容体であるＣＤ１５５とＣＤ５４の表面発現を増加させることができる。したがって、フローサイトメトリーでＣＤ１５５とＣＤ５４の表面発現を見ることで、ＵＳＰ６（Ｙ１６２Ｈ）ＩＶＴのｍＲＮＡが機能しているかどうかも判断した。
【0122】
図２０Ｂに見られるように、酵素によるポリ（Ａ）テーリングは、ＵＳＰ６ ｍＲＮＡの発現をわずかに増加させる。しかし、１２０塩基の一定のポリ（Ａ）テールを追加しても、ＵＳＰ６や主要な抗腫瘍表面マーカー（ＣＤ１５５およびＣＤ５４）のＵＳＰ６による発現に悪影響を与えることはない（図２０Ｃ）。そこで、１２０塩基のポリ（Ａ）テールを持つＵＳＰ６のｍＲＮＡ産物を選択し、研究を進めた。
【0123】
ＵＳＰ６（Ｙ１６２Ｈ）に対する野生型ＵＳＰ６の発現を、２９３Ｔ（胚性腎臓）、Ａ６７３（ユーイング肉腫）、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）を含むいくつかの細胞株で試験した。ＵＳＰ６（Ｙ１６２Ｈ）または１２０塩基の一定のポリ（Ａ）テールを有するＵＳＰ６ ＩＶＴ ｍＲＮＡまたはＤＮＡコントロールを、市販の脂質キャリアー (Lipofectamine（登録商標） MessengerMaxTM for mRNA and Lipofectamine（登録商標） 2000 for DNA)を用いて２９３Ｔにトランスフェクションした。ｍＲＮＡは０．５μｇ、ＤＮＡは１．６μｇで使用した。ＵＳＰ６を発現している細胞の割合を、抗ＨＡ抗体を用いた細胞内フローサイトメトリーで測定した。
【0124】
図２１Ａに見られるように、すべての細胞株でＩＶＴ ＵＳＰ６またはＵＳＰ６（Ｙ１６２Ｈ）が高レベルで発現しており、Ａ６７３株およびＫ５６２株ではＤＮＡコントロールの発現をも上回っていた。ＷＴ ＵＳＰ６のｍＲＮＡの発現は、ＵＳＰ６（Ｙ１６２Ｈ）のｍＲＮＡと同一であった。
【0125】
ＵＳＰ６ ＩＶＴ ｍＲＮＡの機能性は、ＣＤ５４とＣＤ１５５の表面のアップレギュレーションを見ることで、上記の細胞株で確認された。ＤＮＡサンプルのＨＡ＋集団は、Ｋ５６２システムには存在しなかったため、解析から除外した。図２１Ｂに見られるように、ＷＴ ＵＳＰ６ ｍＲＮＡは、主要な抗腫瘍性表面マーカーのアップレギュレーションをもたらし、ＵＳＰ６（Ｙ１６２Ｈ）ｍＲＮＡと同様の働きをする。
【0126】
外因性のＩＶＴ ｍＲＮＡは、ウイルスを模倣して標的細胞を死滅させることができる。このような非特異的な細胞死は、細胞がＩＶＴのｍＲＮＡを異物として認識するのを防ぐために、改変ヌクレオチドを組み込むことで回避できる。ウリジンとシトシンをそれぞれシュードウリジンと５－メチルシトシンに置換（例えば５０％）することで、非特異的な細胞死を防ぐことができる。これを検証するために、改変ヌクレオチドを有するまたは有しないＵＳＰ６やシプリディナルシフェラーゼ（ｃＬｕｃ）のｍＲＮＡを、細胞内でテストした。ｃＬｕｃ ｍＲＮＡはコントロールｍＲＮＡとして使用した。細胞死はＰＡＲＰの切断によってモニターされた。細胞が死ぬと、ＰＡＲＰタンパク質が切断され、低分子量のバンドが現れる。蛋白質ｐ６５はローディングコントロールとした。図２２にあるように、改変ヌクレオチドは非特異的な細胞死を防ぐ。ＵＳＰ６ ｍＲＮＡや、改変ヌクレオチドを含まないコントロールのｃＬｕｃ ｍＲＮＡは、著しい非特異的な細胞死をもたらす。
【0127】
ＵＳＰ６は、強力な抗腫瘍サイトカインであるインターフェロン（ＩＦＮ）に対する腫瘍細胞の反応を劇的に高める。ＵＳＰ６は、抗腫瘍性サイトカインであるＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ５、ＴＲＡＩＬの産生を誘導し、ＩＦＮを投与すると、これらのケモカインの発現が相乗的に増加する。また、変異型のＵＳＰ６ ｍＲＮＡ（ＵＳＰ６（ＣＳ／Ａ６－）と命名）も作成した。ＵＳＰ６（ＣＳ／Ａ６－）は、ＴＢＣドメインとＵＳＰドメインの両方に不活性化の変異があり、機能的に不活性となっていること以外は、ＷＴ ＵＳＰ６のｍＲＮＡと同一である。ここでは、Ａ６７３細胞にＵＳＰ６ ｍＲＮＡ（ＡＲＣＡキャップ、改変ヌクレオチド、３’ＵＴＲなし、一定のｐｏｌｙＡ）またはコントロールとしてｃＬｕｃ／ＵＳＰ６（ＣＳ／Ａ６－）をトランスフェクトした。トランスフェクション後、これらの細胞を１０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮβまたは０．５ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγで２４時間処理した。ＵＳＰ６と抗腫瘍性サイトカインの発現をＲＴ－ｑＰＣＲで測定した。図２３に見られるように、ＵＳＰ６ ｍＲＮＡおよび変異型ＵＳＰ６ ｍＲＮＡが標的細胞で発現している。しかし、ＵＳＰ６のｍＲＮＡのみが強力なサイトカインの発現を誘導し、ＩＦＮ処理により相乗的に増強されることがわかった。
【0128】
ユーイング肉腫の細胞株Ａ６７３では、強い相乗効果のある抗腫瘍性サイトカインの産生が観察されたため、別のユーイング肉腫の細胞（ＴＣ－７１）も試験した。ここでは、ＴＣ－７１細胞にＵＳＰ６のｍＲＮＡまたはコントロールとしてｃＬｕｃをトランスフェクトした。トランスフェクション後、これらの細胞を５ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγで２４時間処理した。ＵＳＰ６と抗腫瘍性サイトカインの発現をＲＴ－ｑＰＣＲで測定した。図２４に見られるように、ＵＳＰ６ ｍＲＮＡはＴＣ－７１細胞に発現し、単独で強力な抗腫瘍性サイトカインの発現を誘導し、ＩＦＮγとの相乗効果を発揮した。この結果は、Ａ６７３細胞で見られた結果を再現している。
【0129】
ＵＳＰ６ ｍＲＮＡの効果がユーイング肉腫だけに限定されないことを確認するために、ＡＭＬ細胞株ＴＨＰ－１にＵＳＰ６ ｍＲＮＡまたはコントロールとしてｃＬｕｃをトランスフェクトした。トランスフェクション後、これらの細胞を１０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮβまたは５ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγで２４時間処理した。ＵＳＰ６と抗腫瘍性サイトカインの発現をＲＴ－ｑＰＣＲで測定した。図２５に見られるように、ＵＳＰ６ ｍＲＮＡはＡＭＬ細胞株ＴＨＰ－１に発現し、単独で強力な抗腫瘍性サイトカインの発現を誘導し、ＩＦＮβ／γと相乗効果を発揮した。この結果は、ユーイング肉腫の細胞株で見られた結果を再現している。
【0130】
さらに、ＡＭＬ細胞株Ｕ９３７に、ＵＳＰ６のｍＲＮＡまたはコントロールとしてｃＬｕｃをトランスフェクトした。トランスフェクション後、これらの細胞を１０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮβまたは５ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγで２４時間処理した。ＵＳＰ６と抗腫瘍性サイトカインの発現をＲＴ－ｑＰＣＲで測定した。図２６に見られるように、ＵＳＰ６ ｍＲＮＡはＡＭＬ細胞株Ｕ９３７で発現し、単独で強力な抗腫瘍性サイトカインの発現を誘導し、ＩＦＮβ／γとの相乗効果を発揮した。この結果は、ユーイング肉腫の細胞株で見られた結果を再現している。
【0131】
炎症性物質の強力で長期的な発現は、患者にとって有害である。従って、ＵＳＰ６の発現は一過性であることが望ましい。ここでは、ＴＨＰ－１細胞株にＵＳＰ６のｍＲＮＡまたはコントロールとしてｃＬｕｃをトランスフェクトした。トランスフェクション後、１日、２日、３日後に細胞を採取した。図２７に示すように、ＵＳＰ６ ｍＲＮＡは、１日後に強力な抗腫瘍性サイトカインの産生を引き起こし、３日目には急速に減少した。
【0132】
以上のように、ＵＳＰ６のｍＲＮＡの発現がｑＰＣＲによって確認された。ここでは、機能的なタンパク質レベルを調べた。このｍＲＮＡはＨＡでタグ付けされたＵＳＰ６をコードしているので、細胞内フローサイトメトリー（ＩＣフロー）を用いて、数日間にわたってＵＳＰ６を発現した細胞の割合を観察した。さらに、この細胞をＵＳＰ６＋とＵＳＰ６－の集団（ＨＡ＋とＨＡ－）に分けて、ＵＳＰ６の影響を受けることが知られている抗腫瘍性受容体の発現を観察することもできた。図１５に示すように、２９３Ｔ細胞におけるＵＳＰ６の発現は、１日目にピークに達した後、３日目までに急速に減少してベースラインに戻り、これはＴＨＰ－１における前回のｑＰＣＲタイムコースと同様である。ＵＳＰ６を発現している細胞の割合が減少しても、ＵＳＰ６を発現している細胞（すなわち、ＨＡ＋）は、抗腫瘍性表面受容体を高発現している。
【0133】
さらに実験では、ＨｅＬａ（子宮頸部がん）に、何もしないか、（ＮＴ）、ｃＬｕｃ、ＵＳＰ６のｍＲＮＡをトランスフェクトした。その後、ＵＳＰ６タンパク質の発現をＩＣフロー（ＨＡ抗体による染色）で検出し、抗腫瘍性表面受容体ＤＲ５とＣＤ５４のアップレギュレーションを検出した。サンプルは処理後６時間および２４時間後に採取した。ＵＳＰ６の発現は、ｍＲＮＡを処理した６時間後に検出され、２４時間後には急速に増加した。また、処理後６時間という早い段階で、主要な抗腫瘍性表面マーカーのアップレギュレーションが観察された。
【0134】
また、ＵＳＰ６のｍＲＮＡは、ＡＭＬ細胞の抗腫瘍性表面マーカーをアップレギュレートすることも判明した。ＡＭＬ細胞（Ｕ９３７およびＴＨＰ－１）にｃＬｕｃまたはＵＳＰ６のｍＲＮＡをトランスフェクトし、ＤＲ５、ＣＤ１５５、ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ５４などの抗腫瘍性表面マーカーの表面発現をフローサイトメトリーで分析し、サンプルをＨＡー集団とＨＡ＋集団（ＵＳＰ６－およびＵＳＰ６＋）に分けて解析した。図２８に見られるように、主要な抗腫瘍表面受容体の強い、特異的なアップレギュレーションは、ＵＳＰ６細胞でのみ観察された。
【0135】
さらに、ＡＭＬ細胞に、コントロールとしてＵＳＰ６ ｍＲＮＡまたは不活性なＵＳＰ６（ＣＳ／Ａ６－）変異体をトランスフェクトした。ＵＳＰ６－／＋の集団では、上記と同様に抗腫瘍性表面受容体を分析した。図２９に見られるように、不活性化したＵＳＰ６（ＣＳ／Ａ６－）変異体ではなく、ＵＳＰ６＋細胞では、主要な抗腫瘍表面受容体の強い特異的なアップレギュレーションが観察されたが、ＮＢ４細胞ではＤＲ５は例外であった。
【0136】
さらに、細胞株ＨｅＬａとＡ６７３にリードＵＳＰ６のｍＲＮＡをトランスフェクトした。ＵＳＰ６－／＋の集団では、上記と同様に抗腫瘍性表面受容体を分析した。図３０に見られるように、主要な抗腫瘍表面受容体の強力で特異的なアップレギュレーションは、ＵＳＰ６＋細胞のみならず、両細胞株でも観察された。
【0137】
ＵＳＰ６は、インターフェロン（ＩＦＮ）の細胞毒性や強力なアポトーシス促進リガンドであるＴＲＡＩＬに対して、がんの細胞を感作できる。ＵＳＰ６が主要な死の受容体をアップレギュレートすることから、ＵＳＰ６のｍＲＮＡががんの細胞株に選択的に死を誘導できるかどうかが検証された。ＨｅＬａ、Ａ６７３、ＴＨＰ－１の各細胞株に、ＵＳＰ６またはコントロールのｍＲＮＡをトランスフェクトした後（ｃＬｕｃまたはＵＳＰ６（ＣＳ／Ａ６－））、アネキシン染色により細胞の死をモニターした。図３１に示すように、ＵＳＰ６ ｍＲＮＡは、いくつかの異なるがん細胞株において選択的に死を誘導した。これらの結果は、図１７に示したデータをさらに発展させたものである。
【0138】
以上、本発明の好ましい実施形態の一部を説明し、具体的に例示してきたが、本発明がこのような実施形態に限定されることを意図しているわけではない。以下の特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲と精神から逸脱することなく、これに様々な変更を加えることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21-1】
【図21-2】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【配列表】