特許 7531603 ＣＤ２８Ｈドメイン含有キメラ抗原受容体および使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-01

(45)【発行日】2024-08-09

(54)【発明の名称】ＣＤ２８Ｈドメイン含有キメラ抗原受容体および使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240802BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240802BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20240802BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240802BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240802BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240802BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240802BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240802BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240802BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240802BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240802BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240802BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240802BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240802BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C12N15/62 Z

C07K14/725 ZNA

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/867 Z

C12N5/10

C07K16/18

A61P35/00

A61K48/00

A61K31/7088

A61K35/12

A61K35/17

A61P35/02

【請求項の数】 42

(21)【出願番号】P 2022557764

(86)(22)【出願日】2020-03-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-06

(86)【国際出願番号】 US2020024985

(87)【国際公開番号】W WO2021194495

(87)【国際公開日】2021-09-30

【審査請求日】2023-03-13

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．７，ｎｏ．６，Ａｐｒｉｌ ２４，２０１９．における「ＣＤ２８ Ｈｏｍｏｌｏｇ Ｉｓ ａ Ｓｔｒｏｎｇ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂ７Ｈ７＋ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ」

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１９ Ｄｅｃ；Ｖｏｌ ４０，Ｎｏ．１２における「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＣＡＲｓ ｆｏｒ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」

(73)【特許権者】

【識別番号】514144836

【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ロング， エリック オー．

(72)【発明者】

【氏名】ジュアン， シャオシュアン

【審査官】松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】Cancer Immunol Res.，2019年，7(6)，p.939-951

【文献】Trends in Immunology，2019年，40(12)，p.1078-1081

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １４／００

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３１／７０８８

Ａ６１Ｋ ３５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

キメラ抗原受容体であって、Ｎ末端からＣ末端の順に、
（ａ）標的結合ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）ＣＤ２８ホモログ（ＣＤ２８Ｈ）由来の第１の細胞内シグナル伝達ドメインおよび２Ｂ４またはＴＣＲζ由来の第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインと、
を含むキメラ抗原受容体。

【請求項2】

前記ＣＤ２８Ｈ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号２のアミノ酸１７２～２８２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項3】

前記ＣＤ２８Ｈ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号２のアミノ酸１７２～２８２のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項4】

前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζに由来する、請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項5】

前記ＴＣＲζ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号２のアミノ酸２８３～３９５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

前記ＴＣＲζ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号２のアミノ酸２８３～３９５のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項7】

前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインが、２Ｂ４に由来する、請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項8】

前記２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１０のアミノ酸１７２～２９１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項9】

前記２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１０のアミノ酸１７２～２９１のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項10】

前記細胞内ドメインが、前記膜貫通ドメインと前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインとの間に細胞内領域をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項11】

前記膜貫通ドメインおよび細胞内領域が、ＣＤ１６、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＫＩＲ２ＤＳ４に由来する、請求項１０に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項12】

キメラ抗原受容体であって、Ｎ末端からＣ末端の順に、
（ａ）標的結合ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）ＣＤ２８ホモログ（ＣＤ２８Ｈ）由来の第１の細胞内シグナル伝達ドメインと、２Ｂ４由来の第２の細胞内シグナル伝達ドメインと、ＴＣＲζ由来の第３の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、細胞内ドメインと、
を含む、キメラ抗原受容体。

【請求項13】

前記ＣＤ２８Ｈ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号２のアミノ酸１７２～２８２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項14】

前記ＣＤ２８Ｈ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号２のアミノ酸１７２～２８２のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項15】

前記２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１０のアミノ酸１７２～２９１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項16】

前記２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１０のアミノ酸１７２～２９１のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項17】

前記標的結合ドメインが、ＣＤ１９ ｓｃＦｖまたはＣＤ２８Ｈ細胞外ドメインを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項18】

前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８Ｈ膜貫通ドメインを含む、請求項１～９または１２から１７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項19】

ヒンジドメインをさらに含み、前記ヒンジドメインが、前記標的結合ドメインに対してＣ末端であり、前記膜貫通ドメインに対してＮ末端である、請求項１～１８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項20】

前記ヒンジ領域が、ＣＤ８αヒンジ領域を含む、請求項１９に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項21】

アミノ末端シグナル配列をさらに含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項22】

前記シグナル配列が、ＣＤ８αシグナル配列である、請求項２１記載のキメラ抗原受容体。

【請求項23】

前記ＣＤ８αシグナル配列が、配列番号１６のアミノ酸１～２１を含む、請求項２２に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項24】

配列番号２、６、１２、または１６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項25】

配列番号２、６、１２、または１６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項26】

請求項１～２５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸分子。

【請求項27】

配列番号１、５、１１、または１５のうちのいずれか１つの核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２６に記載の核酸分子。

【請求項28】

配列番号１、５、１１、または１５のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、請求項２７に記載の核酸分子。

【請求項29】

請求項２６～２８のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項30】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２９に記載のベクター。

【請求項31】

前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項３０に記載のベクター。

【請求項32】

請求項１～２５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞。

【請求項33】

請求項２６～２８のいずれか一項に記載の核酸または請求項２９～３１のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。

【請求項34】

前記細胞が、ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞である、請求項３２または請求項３３に記載の細胞。

【請求項35】

請求項２６～２８のいずれか一項に記載の核酸、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のベクター、または請求項３２～３４のいずれか一項に記載の細胞および薬学的に許容され得る担体を含む組成物。

【請求項36】

がんを有する対象を処置するための、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の細胞を含む組成物または請求項３５に記載の医薬組成物。

【請求項37】

前記医薬組成物が、ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞を含む、請求項３６に記載の組成物。

【請求項38】

前記ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞が、処置されている前記対象にとって自家である、請求項３７に記載の組成物。

【請求項39】

前記がんが、血液悪性腫瘍または固形腫瘍である、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項40】

前記血液悪性腫瘍が、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、または多発性骨髄腫である、請求項３９に記載の組成物。

【請求項41】

前記固形腫瘍が、乳がん、卵巣がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、膀胱がん、前立腺がん、または肉腫である、請求項３９に記載の組成物。

【請求項42】

前記組成物が、手術、化学療法、放射線治療、またはそれらの２もしくはそれより多くの組み合わせと組み合わせて、前記対象に投与されることを特徴とする、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ＣＤ２８Ｈシグナル伝達ドメインを含有するキメラ抗原受容体、および特にがんを処置するためのそれらの使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＡＲ－Ｔ細胞による免疫療法は、血液がんの臨床処置において成功しており、固形腫瘍の標的化において実質的な進歩がなされている。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞の注入に伴う特有の有害な副作用、例えば、重篤なサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）および神経毒性などは、生命を脅かす可能性があり、慎重に管理される必要がある。ナチュラルキラー細胞は、造血幹細胞移植で観察されるように、より安全なサイトカインプロファイルおよび低い移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）活性のために、養子細胞治療におけるエフェクター細胞としての大きな潜在性を有する。ＣＡＲ－Ｔ細胞治療のコストを低減し、ＣＡＲ－Ｔ細胞産生のプロセスを単純化するために、「既製の」ＣＡＲ－Ｔ細胞戦略が提案されている。健常ドナーに由来する同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＧＶＨＤを最小限に抑え、必要なときにすぐに使用できる普遍的な凍結保存ＣＡＲ－Ｔ細胞産物を産生するために、サイレンシングされなければならない。特に、Ｔ細胞とは異なり、「既製の」ＣＡＲ－ＮＫ戦略は、ＴＣＲの遺伝子サイレンシングを必要とせずに開発することができる。ドナー由来ＮＫ細胞の安全性および持続性は、造血幹細胞移植の数十年にわたる臨床診療によって実証されている。さらに、腫瘍細胞上のリガンドに対する生殖細胞にコードされたＮＫ細胞活性化受容体によって、さらなる有益な効果を提供することができる。

【0003】

ＮＫ細胞の活性化は、活性化受容体からのシグナルの相乗的組み合わせを必要とし、そのリガンドは通常、形質転換細胞または感染細胞で上方調節される。しかしながら、活性化シグナルは、非古典的ＭＨＣ－Ｉ ＨＬＡ－Ｅに対する受容体ＣＤ９４－ＮＫＧ２Ａおよび古典的ＭＨＣ－Ｉ分子に対する阻害性キラー細胞Ｉｇ様受容体（ＫＩＲ）を含む、ＭＨＣ－Ｉに対する阻害性受容体によって打ち消される。具体的には、ＫＩＲ２ＤＬ１はＨＬＡ－Ｃ群１（Ｃ１）に対する受容体であり、ＫＩＲ２ＤＬ２／３はＨＬＡ－Ｃ群２（Ｃ２）に対する受容体であり、ＫＩＲ３ＤＬ１はＨＬＡ－Ｂの特定の対立遺伝子に対する受容体である。これらの阻害性受容体によるシグナル伝達は、典型的には、共活性化受容体によるシグナル伝達より優勢である。阻害性受容体はまた、ＮＫ細胞を高応答性の状態に維持する重要な機能を有し、これはライセンシングまたは教育と呼ばれている特性である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

ＮＫ細胞による養子細胞治療が腫瘍細胞の排除に成功するためには、阻害性受容体によるシグナル伝達を低減または無効にする必要がある。本明細書には、例えばＣＤ９４－ＮＫＧ２ＡおよびＫＩＲ２ＤＬ１による阻害を克服する能力をＣＡＲに付与するＣＤ２８ホモログ（ＣＤ２８Ｈ）活性化ドメイン（ＣＤ２８Ｈ細胞内シグナル伝達ドメインとも呼ばれる）を含むＣＡＲが開示される。

【0005】

（ａ）抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）ＣＤ２８Ｈ由来の第１の細胞内シグナル伝達ドメインおよび第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインと、を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が開示される。ドメイン（ａ）～（ｃ）はＮ末端からＣ末端の順序である。しかしながら、細胞内ドメインの第１および第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、どちらの順序であってもよい。いくつかの例では、第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、２Ｂ４、ＴＣＲζ、ＦｃεＲ１γまたはＤＡＰ１２に由来する。１つの特定の例では、第２の細胞内シグナル伝達ドメインはＴＣＲζに由来する。別の特定の例では、第２の細胞内シグナル伝達ドメインは２Ｂ４に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメインに対してＣ末端であり、膜貫通ドメインに対してＮ末端であるヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８ヒンジドメイン）をさらに含む。

【0006】

提供されるのはまた、（ａ）抗原結合ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）ＣＤ２８Ｈ由来の第１の細胞内シグナル伝達ドメイン、２Ｂ４由来の第２の細胞内シグナル伝達ドメイン、および第３の細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインと、を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）である。いくつかの例では、第３の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲζ、ＦｃεＲ１γまたはＤＡＰ１２に由来する。ドメイン（ａ）～（ｃ）はＮ末端からＣ末端の順序である。しかしながら、第１、第２および第３の細胞内シグナル伝達ドメインは、任意の順序であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメインに対してＣ末端であり、膜貫通ドメインに対してＮ末端であるヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８ヒンジドメイン）をさらに含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、配列番号２、６、１２、１６および２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の例では、ＣＡＲは、配列番号２、６、１２、１６および２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。

【0008】

本明細書で提供されるＣＡＲをコードする核酸分子も開示される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、発現ベクター（レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなど）に含まれる。実施形態では、ＣＡＲが、配列番号１、５、１１、１５および１９のうちのいずれか１つの核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含むか、または配列番号１、５、１１、１５および１９のうちのいずれか１つの核酸配列を含むかもしくはそれからなる。ＣＡＲを発現する単離された細胞（例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞）が提供され、同様にまた、それらの細胞および薬学的に許容され得る担体を含む組成物も提供される。

【0009】

がん（血液悪性腫瘍または固形腫瘍など）を有する対象を処置する方法がさらに提供される。そのような方法は、本明細書に開示される単離された細胞または組成物を対象に投与することを含む。いくつかの例では、細胞は、自家ＮＫ細胞などのＣＡＲを発現するＮＫ細胞である。

【0010】

本開示の上記および他の特徴は、添付の図面を参照して進行する以下の詳細な説明からより明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1-1】図１Ａ～図１Ｄは、ヒトＮＫ細胞上のＣＤ２８Ｈ発現を示す。図１Ａ：新たに単離されたＮＫ細胞を、フルオロフォア－コンジュゲートｍＡｂでＣＤ５６およびＣＤ２８Ｈについて染色した。ＣＤ２８Ｈのアイソタイプコントロール（ＩｇＧ）を左パネルに示す。図１Ｂ：ＣＤ２８Ｈの発現をＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ} ＮＫ細胞とＣＤ５６^ｄｉｍ ＮＫ細胞との間で比較した。各記号は独立したドナーを表す（ｎ＝４）。図１Ｃ：ＫＩＲおよびＮＫＧ２Ａ発現によって定義される異なるＣＤ５６^ｄｉｍサブセットにおけるＣＤ２８Ｈの発現。ＫＩＲファミリーの受容体を、ＰＥ－コンジュゲート抗体（ＥＢ６、ＧＬ１８３およびＤＸ９）のカクテルを使用して染色した。各記号は独立したドナー（ｎ＝４）を表す。

【図1-2】図１Ｄ：ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^－およびＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^＋ＮＫ細胞上のＣＤ２８Ｈ発現。各記号は独立したドナーを表す（ｎ＝４）。全てのデータを平均±ＳＥＭとして示す。^＊Ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．、有意でない（マン・ホイットニー検定、両側）。すべての実験を少なくとも２回繰り返した。

【0012】

【図2-1】図２Ａ：ＮＫＧ２ＡおよびＫＩＲ発現に基づく異なるＣＤ５６^ｄｉｍ ＮＫ細胞集団のゲーティング戦略。ＫＩＲ発現を、ＰＥ－コンジュゲート抗体（ＥＢ６、ＧＬ１８３およびＤＸ９）のカクテルによって決定した。

【図2-2】図２Ｂ：休止ＮＫ細胞およびＩＬ－２およびＰＨＡ中で１４日間増大させた（expanded）ＮＫ細胞におけるＣＤ２８Ｈについての免疫染色の代表的なヒストグラム。新たに単離されたかまたはＩＬ－２培養されたＮＫ細胞を、アイソタイプコントロール（網掛け）またはＣＤ２８Ｈ ｍＡｂ（実線）で染色した後、ＰＥ－コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体とインキュベートした。図２Ｃ：休止ＮＫ細胞（左）またはＩＬ－２およびＣＤ２とＮＫｐ４６との架橋によって活性化されたＮＫ細胞（右）におけるＣＤ２８Ｈについての免疫染色の代表的なヒストグラム。ＮＫ細胞を、プレートに結合したＣＤ２に対するｍＡｂおよびＮＫｐ４６プラス１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２によって７日間活性化した。図２Ｃと同様の２人のドナー由来のＮＫ細胞の活性化後の異なる時点でのＣＤ２８Ｈの発現。ＣＤ２８Ｈ^＋であるＮＫ細胞の割合を、ＣＤ５６およびＣＤ２８Ｈについて染色することによって決定した。

【図2-3】図２Ｅ：ＩＬ－２刺激後の異なる時点でのＮＫ細胞上のＣＤ２５発現。図２Ｆ：休止ＮＫ細胞をＩＬ－２中で２４時間活性化し、続いてＣＤ５６、ＣＤ２５およびＣＤ２８Ｈについて染色した。ヒストグラムに示された（右）および３人の独立したドナーからのデータとして示された（左）ＣＤ２５^－およびＣＤ２５^＋ＮＫ細胞におけるＣＤ２８Ｈの発現。平均±ＳＥＭ．ｎ．ｓ．、有意でない（マン・ホイットニー検定、両側）。

【0013】

【図3-1】図３Ａ：リダイレクトされた細胞傷害性アッセイの概略図。アッセイでは、ｍＡｂのＦ（ａｂ’）_２部分は、ＮＫ細胞受容体を特異的に認識するが、ＦｃフラグメントはマウスＰ８１５細胞上のＦｃ受容体に結合する。ＮＫ細胞は、架橋ＮＫ細胞活性化受容体によって相乗的に活性化される。

【図3-2】図３Ｂ：フルオロフォア－コンジュゲートｍＡｂを用いた免疫染色によって決定された、ＮＫＬ、ＹＴＳ、ＫＨＹＧ－１およびＮＫ－９２細胞株における２Ｂ４、ＮＫｐ４６およびＣＤ２８Ｈの表面発現。網掛けヒストグラムは、アイソタイプコントロールによる染色を表す。図３Ｃ：リダイレクトされた細胞傷害性アッセイにおけるＫＨＹＧ－１細胞によるＰ８１５細胞の溶解。ＫＨＹＧ－１細胞をＩＬ－２なしで２４時間静置した後、Ｐ８１５細胞および示されたｍＡｂと共にＥ：Ｔ比１および５で６時間インキュベートした。

【0014】

【図4-1】図４Ａ～図４Ｋは、ＣＤ２８ＨがＮＫ細胞活性化のために２Ｂ４およびＮＫｐ４６と相乗作用し、ＣＤ１６を介して活性化を増強することを示す。図４Ａ：リダイレクトされた細胞傷害性アッセイにおける、ＣＤ２８Ｈ、２Ｂ４およびＮＫｐ４６の単独または組み合わせのいずれかによって誘導されたＮＫ細胞脱顆粒の代表的な等高線図である。新たに単離されたＮＫ細胞を、Ｐ８１５細胞および５μｇ／ｍｌの示されたｍＡｂと共に３７℃で２時間インキュベートした。Ｅ：Ｔ比は１：２であった。ＮＫ細胞脱顆粒をＣＤ１０７ａについて染色することによって決定した。ＣＤ５６に対するｍＡｂは脱顆粒の陰性対照であったが、ＮＫｐ４６および２Ｂ４の共結合（co-engagement）はＮＫ活性化受容体の相乗作用の陽性対照であった。

【図4-2】図４Ｂ：いくつかのドナーからの図４Ａと同様のＮＫ脱顆粒を示す。各記号は独立したドナーを表す（ｎ＝５）。図４Ｃ～図４Ｆ：図４Ａと同様に行われたリダイレクトされた細胞傷害性アッセイにおける、ＣＤ２８Ｈと、ＣＤ２（図４Ｃ）、ＤＮＡＭ－１（図４Ｄ）、ＮＫＧ２Ｄ（図４Ｅ）およびＣＤ１６（図４Ｆ）との共結合の際のＮＫ細胞脱顆粒。各記号は独立したドナーを表し、図４Ｃではｎ＝４、図４Ｄではｎ＝３、図４Ｅではｎ＝４、図４Ｆではｎ＝５である。

【図4-3】図４Ｇ～図４Ｉ：リダイレクトされた細胞傷害性アッセイにおける図４Ａと同様のＮＫ細胞脱顆粒。２Ｂ４（図４Ｇ）、ＮＫｐ４６（図４Ｈ）およびＣＤ１６（図４Ｉ）に対する固定濃度（５μｇ／ｍｌ）のｍＡｂを使用し、漸増濃度でＣＤ２８Ｈ抗体を添加した。各記号は独立したドナーを表し、図４Ｇではｎ＝５、図４Ｈではｎ＝５、図４Ｉではｎ＝６である。図４Ｊ～図４Ｋ：Ｐ８１５細胞および示されたｍＡｂと共に様々なＥ対Ｔ比で６時間インキュベートしたＮＫ細胞。ＣＤ２８Ｈと、２Ｂ４（図４Ｊ）またはＮＫｐ４６（図４Ｋ）との共結合によって誘導されるＰ８１５細胞の溶解。各グラフは、２つの独立した実験のうちの１つを表す。全てのデータを平均±ＳＥＭとして示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．、有意でない（マン・ホイットニー検定、両側）。すべての実験を少なくとも２回繰り返した。

【0015】

【図5】図５Ａおよび図５Ｂは、ショウジョウバエＳ２細胞上のＢ７Ｈ７およびＣＤ４８によって誘導されるＮＫ細胞脱顆粒およびサイトカイン産生を示す。図５Ａ：ＣＤ４８、Ｂ７Ｈ７、またはその両方でトランスフェクトされたＳ２細胞上のＣＤ４８およびＢ７Ｈ７の発現。網掛けヒストグラムは、トランスフェクトされていないＳ２細胞の染色を示す。図５Ｂ：円グラフは、示された数の応答について陽性のＮＫ細胞の頻度を表す。円弧は、ＭＩＰ－１α、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＣＤ１０７ａについて陽性のＮＫ細胞の割合を表す。値は、３人のドナーの平均を表す。

【0016】

【図6-1】図６Ａ～６Ｆは、Ｂ７Ｈ７およびＣＤ４８によって誘導されるＮＫ細胞脱顆粒およびサイトカイン産生をショウジョウバエＳ２細胞上で示す。図６Ａ：１：２のＥ：Ｔ比で２時間インキュベートした後の、Ｂ７Ｈ７、ＣＤ４８、またはその両方を発現するＳ２細胞およびＳ２細胞によって誘導されたＮＫ細胞脱顆粒の代表的な等高線図。脱顆粒を、ＣＤ５６およびＣＤ１０７ａについて染色することによって決定した。図６Ｂ：いくつかのドナーからの図６Ａと同様のＮＫ細胞脱顆粒。各記号は独立したドナーを表し、ｎ＝５である。

【図6-2】図６Ｃ～図６Ｆ：１：２のＥ：Ｔ比で、３７℃で６時間、示されたＳ２細胞と共にインキュベートした後のＮＫ細胞によるサイトカイン産生。Ｂ７Ｈ７－ＣＤ２８Ｈ相互作用をブロックするために、ＣＤ２８Ｈに対するｍＡｂ（抗ＣＤ２８Ｈ）を、１０μｇ／ｍｌで含んだ。細胞をＣＤ５６およびＣＤ１０７ａについて染色し、固定し、透過処理し、細胞内サイトカインについて染色した。複数のドナー由来のＮＫ細胞におけるＩＦＮγ（図６Ｃ）、ＴＮＦα（図６Ｄ）、ＭＩＰ－１α（図６Ｅ）およびＭＩＰ－１β（図６Ｆ）の発現。各記号は独立したドナーを表し、図６Ｃではｎ＝７、図６Ｄではｎ＝５、図６Ｅではｎ＝６、図６Ｆではｎ＝６である。全てのデータを平均±ＳＥＭとして示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定、両側）。すべての実験を少なくとも２回繰り返す。

【図6-3】図６Ｃ～図６Ｆ：１：２のＥ：Ｔ比で、３７℃で６時間、示されたＳ２細胞と共にインキュベートした後のＮＫ細胞によるサイトカイン産生。Ｂ７Ｈ７－ＣＤ２８Ｈ相互作用をブロックするために、ＣＤ２８Ｈに対するｍＡｂ（抗ＣＤ２８Ｈ）を、１０μｇ／ｍｌで含んだ。細胞をＣＤ５６およびＣＤ１０７ａについて染色し、固定し、透過処理し、細胞内サイトカインについて染色した。複数のドナー由来のＮＫ細胞におけるＩＦＮγ（図６Ｃ）、ＴＮＦα（図６Ｄ）、ＭＩＰ－１α（図６Ｅ）およびＭＩＰ－１β（図６Ｆ）の発現。各記号は独立したドナーを表し、図６Ｃではｎ＝７、図６Ｄではｎ＝５、図６Ｅではｎ＝６、図６Ｆではｎ＝６である。全てのデータを平均±ＳＥＭとして示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１（マン・ホイットニー検定、両側）。すべての実験を少なくとも２回繰り返す。

【0017】

【図7-1】図７Ａ～７Ｅは、標的細胞上のＢ７Ｈ７がＮＫ細胞によってＡＤＣＣを増強することを示す。図７Ａ：抗Ｓ２血清の存在下で２時間、示されたＳ２細胞によって誘導され、フルオロフォア－コンジュゲートＣＤ５６およびＣＤ１０７ａ ｍＡｂで染色することによって測定されたＮＫ細胞脱顆粒の代表的な等高線図。

【図7-2】図７Ｂ：複数のドナーからの図７Ａと同様のＮＫ細胞による脱顆粒。各記号は独立したドナーを表し、ｎ＝７である。図７Ｃ：２２１およびＤａｕｄｉ細胞上のＣＤ２０についての染色。網掛けヒストグラムは、アイソタイプコントロールによる染色を示す。

【図7-3】図７Ｄおよび７Ｅ：１０μｇ／ｍｌリツキシマブの存在下での５：１のエフェクター対標的細胞比でのＮＫ細胞による標的細胞の特異的溶解。各記号は独立したドナーを表し、図７Ｄおよび図７Ｅの両方においてｎ＝５である。標的細胞は、トランスフェクトされていないかまたはＢ７Ｈ７でトランスフェクトされたかのいずれかの２２１（図７Ｄ）およびＤａｕｄｉ（図７Ｅ）細胞株であった。Ｂ７Ｈ７－ＣＤ２８Ｈ相互作用をブロックするために、ＣＤ２８Ｈに対するｍＡｂ（抗ＣＤ２８Ｈ）を、１０μｇ／ｍｌで含んだ。全てのデータを平均±ＳＥＭとして示す。^＊Ｐ＜０．０５（ウィルコクソンの符号順位検定、対合、両側）。すべての実験を少なくとも２回繰り返した。

【0018】

【図8-1】図８Ａ～図８Ｃは、２２１細胞上のＢ７Ｈ７が、ＮＫ細胞によるＣＤ２８Ｈ依存性溶解を促進することを示す。図８Ａ：Ｄａｕｄｉ、Ｋ５６２および２２１細胞上のＢ７Ｈ７およびＣＤ４８についての染色。網掛けヒストグラムは、アイソタイプコントロールによる染色を表す。

【図8-2】図８Ｂ：トランスフェクトされた２２１細胞およびＤａｕｄｉ細胞におけるＢ７Ｈ７の発現。網掛けヒストグラムは、トランスフェクトされていない細胞の染色を表す。図８Ｃ：６時間後の、示されたＥ対Ｔ比での休止ＮＫ細胞による２２１および２２１．Ｂ７Ｈ７細胞の溶解。ＣＤ２８Ｈに対するｍＡｂを１０μｇ／ｍｌで添加して、ＣＤ２８Ｈ－Ｂ７Ｈ７相互作用をブロックした（四角の記号）。

【0019】

【図9-1】図９Ａ～９Ｆは、ＣＤ２８ＨのＴｙｒ１９２がＣＤ２８Ｈ媒介ＮＫ細胞活性化に必須であることを示す。図９Ａ：過バナジン酸塩処理の際のＣＤ２８Ｈ野生型および示されるＴｙｒ変異体のチロシン－リン酸化。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を過バナジン酸塩で１０分間処理した。細胞溶解物をＣＤ２８Ｈ ｍＡｂで免疫沈降させた。ホスホ－チロシン（４Ｇ１０）および全ＣＤ２８Ｈ（抗２Ａ）を免疫ブロットによって検出した。図９Ｂ：６時間後の、示されたｍＡｂの存在下での様々なＥ：Ｔ比でのＮＫＬ．ＣＤ２８Ｈ細胞によるＰ８１５細胞の溶解。

【図9-2】図９Ｃ：示されたＥ：Ｔ比で、２Ｂ４およびＣＤ２８Ｈに対するｍＡｂの存在下、ＮＫＬ細胞トランスフェクタントによるＰ８１５細胞の溶解。２Ｂ４に対するｍＡｂを伴うＮＫＬ．ＣＤ２８Ｈ－野生型を陰性対照（Ｃｔｒｌ）とした。グラフは、２つの独立した実験のうちの１つを表す。図９Ｄ：６時間後の示されたＥ：Ｔ比でのＮＫＬ細胞トランスフェクタントによる２２１．Ｂ７Ｈ７細胞の溶解。トランスフェクトされていない２２１細胞を陰性対照とした。グラフは、２つの独立した実験のうちの１つを表す。

【図9-3】図９Ｅ：ＣＤ２８Ｈ野生型またはＹ１９２Ｆ変異体を発現するＮＫＬ細胞と共にインキュベートしたＤａｕｄｉまたはＤａｕｄｉ－Ｂ７Ｈ７細胞のＣＤ２８Ｈ抗体による免疫蛍光染色。

【図9-4】図９Ｆ：図９Ｅと同様に、シナプスから離れた細胞表面領域（非ＩＳ）と比較した、免疫シナプス（ＩＳ）でのＣＤ２８Ｈの蛍光強度の倍率変化。各ドットは単一の細胞を表す。サンプルサイズ（ｎ）を図に示す。２つの独立した実験からデータを得て組み合わせ、平均±ＳＥＭとして示した。^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（マン・ホイットニー検定、両側）。すべての実験を少なくとも２回繰り返した。

【0020】

【図10】図１０は、示されたＣＤ２８Ｈ変異体でトランスフェクトされたＮＫＬ細胞上のＣＤ２８Ｈ発現を示す。網掛けヒストグラムは、トランスフェクトされていない細胞の染色を表す。

【0021】

【図11-1】図１１Ａおよび１１Ｂは、循環単球および骨髄性樹状細胞上のＢ７Ｈ７発現を示す。未処理またはＬＰＳおよびポリ（Ｉ：Ｃ）刺激ヒトＰＢＭＣのいずれかをＣＤ１４^＋集団でゲートし、フルオロフォア－コンジュゲートＢ７Ｈ７ ｍＡｂを用いてＢ７Ｈ７発現について試験した。

【図11-2】図１１Ｂ：循環骨髄性樹状細胞におけるＢ７Ｈ７の発現。図１１Ａのように処理したヒトＰＢＭＣを系列陰性（ＣＤ３^－ＣＤ１９^－ＣＤ１４^－ＮＫｐ４６^－）ＣＤ１１ｃ^＋細胞でゲートし、Ｂ７Ｈ７ ｍＡｂで染色することによってＢ７Ｈ７の発現について試験した。網掛けヒストグラムは、アイソタイプコントロールによる染色を表す。

【0022】

【図12-1】図１２Ａ～図１２Ｊは、ＣＤ２８Ｈ－ＴＣＲζキメラ抗原受容体を発現するＮＫＧ２Ａ^＋ＮＫ細胞によるＢ７Ｈ７^＋ＨＬＡ－Ｅ^＋ＨＤＬＭ－２腫瘍細胞の溶解を示す。図１２Ａ：ＮＫＬ細胞におけるＣＤ２８Ｈキメラ抗原受容体の設計および発現。完全長または細胞質ドメイン欠失（ΔＣＤ）ＣＤ２８ＨをＴＣＲζの細胞質ドメインに融合し、ＮＫＬ細胞にトランスフェクトした。細胞をフルオロフォア－コンジュゲートＣＤ２８Ｈ ｍＡｂで染色した。網掛けヒストグラムは、トランスフェクトされていないＮＫＬ細胞の染色を表す。図１２Ｂ～図１２Ｃ：５時間後の、示されたＥ：Ｔ比でトランスフェクトされたＮＫＬ細胞による２２１細胞（図１２Ｂ）および２２１．Ｂ７Ｈ７細胞（図１２Ｃ）の溶解。

【図12-2】図１２Ｄ：２２１．ＡＥＨおよび２２１．ＡＥＨ．Ｂ７Ｈ７細胞におけるＨＬＡ－ＥおよびＢ７Ｈ７についての染色。網掛けヒストグラムは、トランスフェクトされていない２２１細胞の染色を表す。免疫染色によって決定されたＮＫＬ細胞上のＮＫＧ２Ａの発現。網掛けヒストグラムは、ＩｇＧコントロールによる染色を表す。

【図12-3】図１２Ｆ～１２Ｇ：５時間後の、示されたＥ：Ｔ比でトランスフェクトされたＮＫＬ細胞による２２１．ＡＥＨ細胞（図１２Ｆ）および２２１．ＡＥＨ．Ｂ７Ｈ７細胞（図１２Ｇ）の溶解。グラフは、２つの独立した実験のうちの１つを表す。図１２Ｈ：ＨＤＬＭ－２腫瘍細胞上のＢ７Ｈ７およびＨＬＡ－Ｅの染色。網掛けヒストグラムは、アイソタイプコントロールによる染色を表す。図１２Ｉ：免疫染色によって決定されたＫＨＹＧ－１細胞上のＮＫＧ２Ａの発現（左）。ＮＫＧ２Ａに対するブロッキング抗体の存在下または非存在下での、５時間後のＫＨＹＧ－１細胞によるＨＤＬＭ－２腫瘍細胞の溶解（右）。グラフは、２つの独立した実験のうちの１つを表す。

【図12-4】図１２Ｊ：５時間後の、示されたＥ：Ｔ比でトランスフェクトされたＮＫＬ細胞によるＨＨＬＡ－２^＋ＨＬＡ－Ｅ^＋ＨＤＬＭ－２腫瘍細胞の溶解。すべての実験を少なくとも２回繰り返す。

【0023】

【図13-1】図１３Ａ～図１３Ｅは、活性化受容体、ＣＤ１９．ＣＡＲの設計および発現、ならびに設計されたＣＤ１９．ＣＡＲを発現するＮＫ細胞によるＣＤ１９^＋ＭＨＣ－Ｉ^＋腫瘍細胞の溶解の組み合わせによるＮＫ細胞脱顆粒の相乗的活性化を示す。図１３Ａ：ＮＫ細胞活性化受容体の組み合わせを架橋することによって誘導された休止ヒトＮＫ細胞の脱顆粒。示されている活性化受容体に対する抗体の存在下で、Ｐ８１５細胞を使用して、リダイレクトされた細胞傷害性アッセイにおいて架橋を行った（ｎ＝２）。図１３Ｂ：Ｎ末端ｍｙｃタグおよびＣＤ８αヒンジを細胞外ドメインとして有する抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖならびに膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの示された組み合わせを使用するＣＡＲ構築物の概略図。

【図13-2】図１３Ｃ：ＮＫＬ．２ＤＬ１細胞におけるＣＡＲ構築物の発現を示すヒストグラム。

【図13-3】図１３Ｄ：示されているＣＡＲ発現ＮＫＬ．２ＤＬ１細胞による標的細胞の溶解を比較する殺傷アッセイ。変異型ＭＨＣ－Ｉ陰性リンパ芽球様細胞株２２１またはＭＨＣ－Ｉ（ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｃ／Ｃｗ１５）トランスフェクトした２２１細胞のいずれかを標的として使用した（ｎ＝３）。図１３Ｅ：ＣＡＲ２またはＴ－ＣＡＲを発現するＮＫＬ．２ＤＬ１細胞による標的細胞溶解の比較（ｎ＝３）。図１３Ｄと同じ標的細胞を使用した。

【0024】

【図14】図１４は、ＮＫＬ．２ＤＬ１細胞上のＫＩＲ２ＤＬ１（左）およびＮＫＧ２Ａ（右）の発現を示すパネルの対である。ＮＫＬ．２ＤＬ１細胞をＩｇＧ対照（網掛け）、ならびにＫＩＲ２ＤＬ１に対するＩｇＧ抗体（左、オープンヒストグラム）およびＮＫＧ２Ａに対するＩｇＧ抗体（右、オープンヒストグラム）で染色した。

【0025】

【図15-1】図１５Ａ～図１５Ｄは、第３世代Ｔ－ＣＡＲまたはＮＫＧ２Ｄ－２Ｂ４－ＴＣＲζ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞と比較した、ＣＤ２８Ｈ－ＣＡＲを発現するＮＫ細胞によるＢ７Ｈ７^＋ＭＨＣ－Ｉ^＋腫瘍細胞の溶解を示す。図１５Ａ：ＣＤ２８Ｈの細胞外ドメインおよびシグナル伝達ドメインの示された組み合わせからなるＣＡＲ構築物の概略図。

【図15-2】図１５Ｂ：ＮＫＬ．２ＤＬ１細胞におけるＣＤ２８Ｈ．Ｔ－ＣＡＲ、ＣＤ２８Ｈ．ＣＡＲ２およびＣＤ２８Ｈ．ＣＡＲ３の発現のフローサイトメトリー決定。図１５Ｃ：ＣＡＲを形質導入されたＮＫＬ．２ＤＬ１細胞をエフェクターとして使用し、２２１．ＨＬＡ－Ｅ細胞またはＢ７Ｈ７をトランスフェクトされた２２１．ＨＬＡ－Ｅ細胞を標的として使用する殺傷アッセイ（ｎ＝２）。

【図15-3】図１５Ｄ：ＣＤ２８Ｈ．ＣＡＲを発現するＮＫＬ．２ＤＬ１細胞による２２１．ＨＬＡ－Ｃ（Ｃｗ１５）細胞またはＢ７Ｈ７をトランスフェクトされた２２１．ＨＬＡ－Ｃ（Ｃｗ１５）細胞の溶解（ｎ＝２）。

【0026】

【図16-1】図１６Ａ～１６Ｅは、ＣＤ１９．ＣＡＲ２が、ＮＫＧ２Ａ媒介阻害を克服し、Ｔ－ＣＡＲよりも持続性の活性化シグナルを伝達することを示す。図１６Ａ：ビーズ上に固定された抗体によるＣＡＲ刺激の図。ビーズによる刺激後のＣＡＲ発現ＮＫＬ細胞の溶解物における活性化シグナルのウエスタンブロット検出。示された抗体をビーズに予め結合させ、次いで、ＣＡＲ－ＮＫ細胞と共に１０分間インキュベートした。示されたシグナル伝達分子について細胞溶解物を探索した。

【図16-2】図１６Ｃ：ｐＥｒｋ／ｔｏｔａｌ－ＥｒｋおよびｐＰＬＣｇ１／ｔｏｔａｌ－ＰＬＣｇ１比のウエスタンブロット定量（ｎ＝２）。

【図16-3】図１６Ｄ：Ｔ－ＣＡＲまたはＣＡＲ２を発現するＮＫＬ細胞のビーズ刺激。示されるように、ビーズおよびＮＫ細胞の共インキュベーションを１０分間および４５分間行った。細胞溶解物を示された抗体でウエスタンブロットした。図１６Ｅ：抗体とのＣＡＲ架橋後にＴ－ＣＡＲまたはＣＡＲ２を発現するＮＫＬ細胞において誘導されたカルシウム動員。ＮＫＬ細胞をＭｙｃタグ抗体と氷上で３０分間プレインキュベートし、アッセイの前に３７℃で５分間インキュベートした。架橋のための二次ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加する前に、ベースラインカルシウムを３０秒間測定した。

【0027】

【図17】図１７は、図１３Ｂに示されるＴ－ＣＡＲおよびＣＡＲ２～ＣＡＲ６を発現するＮＫＬ細胞の刺激を示す（Ｎ：ＣＡＲなし）。示された抗体とカップリングされたビーズをＣＡＲ－ＮＫ細胞と共に３７℃で１０分間インキュベートした。細胞溶解物を、示されるように、リン酸化または全ＥｒｋおよびＰＬＣγ１に対する抗体でウエスタンブロットした。バンド強度の定量を図１６Ｃに示す。

【発明を実施するための形態】

【0028】

配列表
本明細書または添付の配列表に列挙されている任意の核酸およびアミノ酸配列は、米国特許法施行規則§１．８２２で定義されているように、ヌクレオチド塩基およびアミノ酸についての標準的な文字略語を使用して示されている。少なくともいくつかの場合、各核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示された鎖に対する任意の参照によって含まれると理解される。

【0029】

配列番号１は、ＴＣＲζの細胞質ドメインと融合した完全長ＣＤ２８Ｈの核酸配列である。ＣＤ２８Ｈ：ヌクレオチド１～８４６；ＴＣＲζ：ヌクレオチド８４７～１１８５。

【化1】

【0030】

配列番号２は、ＴＣＲζの細胞質ドメインと融合した完全長ＣＤ２８Ｈのアミノ酸配列である。ＣＤ２８Ｈ：アミノ酸１～２８２；ＴＣＲζ：アミノ酸２８３～３９５。

【化2】

【0031】

配列番号３は、ＴＣＲζの細胞質ドメインと融合したＣＤ２８Ｈの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの核酸配列である。ＣＤ２８Ｈ：ヌクレオチド１～５１３；ＴＣＲζ：ヌクレオチド５１４～８５２。

【化3】

【0032】

配列番号４は、ＴＣＲζの細胞質ドメインと融合したＣＤ２８Ｈの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。ＣＤ２８Ｈ：アミノ酸１～１７１；ＴＣＲζ：アミノ酸１７２～２８４。

【化4】

【0033】

配列番号５は、２Ｂ４およびＴＣＲζの細胞内ドメインと融合した完全長ＣＤ２８Ｈの核酸配列である。ＣＤ２８ＨのＤＮＡ配列を、ｇＢｌｏｃｋフラグメントとして合成するためにコドン最適化した。ＣＤ２８Ｈ：ヌクレオチド１～８４６；２Ｂ４：ヌクレオチド８４７～１２０６；ＴＣＲζ：ヌクレオチド１２０７～１５４５。

【化5】

【0034】

配列番号６は、２Ｂ４およびＴＣＲζの細胞内ドメインと融合した完全長ＣＤ２８Ｈのアミノ酸配列である。ＣＤ２８Ｈ：アミノ酸１～２８２；２Ｂ４：アミノ酸２８３～４０２；ＴＣＲζ：アミノ酸４０３～５１５。

【化6】

【化7】

【0035】

配列番号７は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインならびにＣＤ２８、４１ＢＢおよびＴＣＲζの細胞内ドメインと融合したＣＤ２８Ｈの細胞外ドメインの核酸配列である。ＣＤ２８Ｈ：ヌクレオチド１～４５０；ＣＤ２８：ヌクレオチド４５１～６５４；４－１ＢＢ：ヌクレオチド６５５～７８０；ＴＣＲζ：ヌクレオチド７８１～１１１９。

【化8】

【0036】

配列番号８は、ＣＤ２８の膜貫通ドメインならびにＣＤ２８、４－１ＢＢおよびＴＣＲζの細胞内ドメインと融合したＣＤ２８Ｈの細胞外ドメインのアミノ酸配列である。ＣＤ２８Ｈ：アミノ酸１～１５０；ＣＤ２８：アミノ酸１５１～２１８；４－１ＢＢ：アミノ酸２１９～２６０；ＴＣＲζ：ヌクレオチド２６１～３７３。

【化9】

【0037】

配列番号９は、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメインならびに２Ｂ４およびＴＣＲζの細胞内ドメインと融合したＣＤ２８Ｈの細胞外ドメインの核酸配列である。ＣＤ２８Ｈ：ヌクレオチド１～４５０；ＮＫＧ２Ｄ：ヌクレオチド４５１～５１３；２Ｂ４：ヌクレオチド５１４～８７３；ＴＣＲζ：ヌクレオチド８７４～１２１２。

【化10】

【0038】

配列番号１０は、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメインならびに２Ｂ４およびＴＣＲζの細胞内ドメインと融合したＣＤ２８Ｈの細胞外ドメインのアミノ酸配列である。ＣＤ２８Ｈ：アミノ酸１～１５０；ＮＫＧ２Ｄ：アミノ酸１５１～１７１；２Ｂ４：アミノ酸１７２～２９１；ＴＣＲζ：ヌクレオチド２９２～４０４。

【化11】

【0039】

配列番号１１は、ＣＤ１９ ｓｃＦｖと、それに続く、ＣＤ２８Ｈの膜貫通ドメインならびにＣＤ２８Ｈ、２Ｂ４およびＴＣＲζのシグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ８αヒンジドメインの核酸配列である。この構築物は、Ｎ末端Ｍｙｃタグを含む。ＣＤ８α部分およびＣＤ２８Ｈ部分のＤＮＡ配列を、ｇＢｌｏｃｋフラグメントとして合成するためにコドン最適化した。シグナルペプチド：ヌクレオチド１～６３；Ｍｙｃタグ：ヌクレオチド６４～９３；ＣＤ１９ ｓｃＦｖ：ヌクレオチド９４～８１９；ＣＤ８αヒンジ：８２０－９５４；ＣＤ２８Ｈ膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメイン：ヌクレオチド９５５～１３５０；２Ｂ４：ヌクレオチド１３５１～１７１０；ＴＣＲζ：ヌクレオチド１７１１～２０４９。

【化12】

【0040】

配列番号１２は、ＣＤ１９ ｓｃＦｖと、それに続く、ＣＤ２８Ｈの膜貫通ドメインならびにＣＤ２８Ｈ、２Ｂ４およびＴＣＲζのシグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ８αヒンジドメインのアミノ酸配列である。この構築物は、Ｎ末端Ｍｙｃタグを含む。シグナルペプチド：アミノ酸１～２１；Ｍｙｃタグ：アミノ酸２２～３１；ＣＤ１９ ｓｃＦｖ：アミノ酸３２～２７３；ＣＤ８αヒンジ：２７４－３１８；ＣＤ２８Ｈ膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメイン：アミノ酸３１９～４５０；２Ｂ４：アミノ酸４５１～５７０；ＴＣＲζ：アミノ酸５７１～６８３。

【化13】

【化14】

【0041】

配列番号１３は、ＣＤ１９ ｓｃＦｖと、それに続くＣＤ２８の膜貫通ドメインならびにＣＤ２８、４－１ＢＢおよびＴＣＲζのシグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ８αヒンジドメインの核酸配列である。この構築物は、Ｎ末端Ｍｙｃタグを含む。ＣＤ８αのＤＮＡ配列を、ｇＢｌｏｃｋフラグメントとして合成するためにコドン最適化した。シグナルペプチド：ヌクレオチド１～６３；Ｍｙｃタグ：ヌクレオチド６４～９３；ＣＤ１９ ｓｃＦｖ：ヌクレオチド９４～８１９；ＣＤ８αヒンジ：ヌクレオチド８２０～９５４；ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメイン：ヌクレオチド９５５～１１５８；４－１ＢＢ：ヌクレオチド１１５９～１２８４；ＴＣＲζ：ヌクレオチド１２８５～１６２３。

【化15】

【0042】

配列番号１４は、ＣＤ１９ ｓｃＦｖと、それに続く、ＣＤ２８の膜貫通ドメインならびにＣＤ２８、４－１ＢＢおよびＴＣＲζのシグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ８αヒンジドメインのアミノ酸配列である。この構築物は、Ｎ末端Ｍｙｃタグを含む。シグナルペプチド：アミノ酸１～２１；Ｍｙｃタグ：アミノ酸２２～３１；ＣＤ１９ ｓｃＦｖ：アミノ酸３２～２７３；ＣＤ８αヒンジ：アミノ酸２７４～３１８；ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメイン：アミノ酸３１９～３８６；４－１ＢＢ：アミノ酸３８７～４２８；ＴＣＲζ：アミノ酸４２９～５４１。

【化16】

【0043】

配列番号１５は、ＣＤ１９ ｓｃＦｖと、それの続くＣＤ２８Ｈの膜貫通ドメインならびにＣＤ２８ＨおよびＴＣＲζのシグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ８αヒンジドメインの核酸配列である。この構築物は、Ｎ末端Ｍｙｃタグを含む。ＣＤ８α部分およびＣＤ２８Ｈ部分のＤＮＡ配列を、ｇＢｌｏｃｋフラグメントとして合成するためにコドン最適化した。シグナルペプチド：ヌクレオチド１～６３；Ｍｙｃタグ：ヌクレオチド６４～９３；ＣＤ１９ ｓｃＦｖ：ヌクレオチド９４～８１９；ＣＤ８αヒンジ：ヌクレオチド８２０～９５４；ＣＤ２８Ｈ膜貫通ドメイン：ヌクレオチド９５５～１０１７；ＣＤ２８Ｈシグナル伝達ドメイン：ヌクレオチド１０１８～１３５０；ＴＣＲζ：ヌクレオチド１３５１～１６８９。

【化17】

【0044】

配列番号１６は、ＣＤ１９ ｓｃＦｖと、それに続く、ＣＤ２８Ｈの膜貫通ドメインならびにＣＤ２８ＨおよびＴＣＲζのシグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ８αヒンジドメインのアミノ酸配列である。この構築物は、Ｎ末端Ｍｙｃタグを含む。シグナルペプチド：アミノ酸１～２１；Ｍｙｃタグ：アミノ酸２２～３１；ＣＤ１９ ｓｃＦｖ：アミノ酸３２～２７３；ＣＤ８αヒンジ：アミノ酸２７４～３１８；ＣＤ２８Ｈ膜貫通ドメイン：アミノ酸３１９～３３９；ＣＤ２８Ｈシグナル伝達ドメイン：アミノ酸３４０～４５０；ＴＣＲζ：アミノ酸４５１～５６３。

【化18】

【0045】

配列番号１７は、ＣＤ１９ ｓｃＦｖと、それに続くＣＤ２８の膜貫通ドメインならびにＣＤ２８およびＴＣＲζのシグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ８αヒンジドメインの核酸配列である。この構築物は、Ｎ末端Ｍｙｃタグを含む。ＣＤ８αのＤＮＡ配列を、ｇＢｌｏｃｋフラグメントとして合成するためにコドン最適化した。シグナルペプチド：ヌクレオチド１～６３；Ｍｙｃタグ：ヌクレオチド６４～９３；ＣＤ１９ ｓｃＦｖ：ヌクレオチド９４～８１９；ＣＤ８αヒンジ：ヌクレオチド８２０～９５４；ＣＤ２８膜貫通ドメイン：ヌクレオチド９５５～１０３５；ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン：ヌクレオチド１０３６～１１５８；ＴＣＲζ：ヌクレオチド１１５９～１４９７。

【化19】

【化20】

【0046】

配列番号１８は、ＣＤ１９ ｓｃＦｖと、それに続くＣＤ２８の膜貫通ドメインならびにＣＤ２８およびＴＣＲζのシグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ８αヒンジドメインのアミノ酸配列である。この構築物は、Ｎ末端Ｍｙｃタグを含む。シグナルペプチド：アミノ酸１～２１；Ｍｙｃタグ：アミノ酸２２～３１；ＣＤ１９ ｓｃＦｖ：アミノ酸３２～２７３；ＣＤ８αヒンジ：アミノ酸２７４～３１８；ＣＤ２８膜貫通ドメイン：アミノ酸３１９～３４５；ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン：アミノ酸３４６～３８６；ＴＣＲζ：アミノ酸３８７～４９９。

【化21】

【0047】

配列番号１９は、ＣＤ１９ ｓｃＦｖと、それに続くＣＤ２８Ｈの膜貫通ドメインおよびＴＣＲζのシグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ８αヒンジドメインの核酸配列である。この構築物は、Ｎ末端Ｍｙｃタグを含む。ＣＤ８αのＤＮＡ配列を、ｇＢｌｏｃｋフラグメントとして合成するためにコドン最適化した。シグナルペプチド：ヌクレオチド１～６３；Ｍｙｃタグ：ヌクレオチド６４～９３；ＣＤ１９ ｓｃＦｖ：ヌクレオチド９４～８１９；ＣＤ８αヒンジ：ヌクレオチド８２０～９５４；ＣＤ２８Ｈ膜貫通ドメイン：ヌクレオチド９５５～１０１７；ＴＣＲζ：ヌクレオチド１０１８～１３５６。

【化22】

【0048】

配列番号２０は、ＣＤ１９ ｓｃＦｖと、それに続くＣＤ２８Ｈの膜貫通ドメインおよびＴＣＲζのシグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ８αヒンジドメインのアミノ酸配列である。この構築物は、Ｎ末端Ｍｙｃタグを含む。シグナルペプチド：アミノ酸１～２１；Ｍｙｃタグ：アミノ酸２２～３１；ＣＤ１９ ｓｃＦｖ：アミノ酸３２～２７３；ＣＤ８αヒンジ：アミノ酸２７４～３１８；ＣＤ２８Ｈ膜貫通ドメイン：アミノ酸３１９～３３９；ＴＣＲζ：アミノ酸３４０～４５２。

【化23】

【0049】

配列番号２１は、ＣＤ１６（ＦＣＧＲ３Ａ）の例示的なアミノ酸配列である。

【化24】

【0050】

配列番号２２は、ＮＫｐ４６の例示的なアミノ酸配列である。

【化25】

【0051】

配列番号２３は、ＮＫｐ３０の例示的なアミノ酸配列である。

【化26】

【0052】

配列番号２４は、ＮＫｐ４４の例示的なアミノ酸配列である。

【化27】

【0053】

配列番号２５は、ＫＩＲ２ＤＳ４の例示的なアミノ酸配列である。

【化28】

【0054】

本明細書で実証されるように、ＣＤ２８Ｈ由来の細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲは、増加した抗腫瘍活性および阻害を克服する能力を提供する。特定の例では、ＣＤ２８Ｈおよび２Ｂ４由来の細胞内シグナル伝達ドメインの組み合わせを使用した。実施例に記載されるように、第３世代Ｔ細胞ＣＡＲ（ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＴＣＲζ）と比較して、共活性化受容体ＣＤ２８Ｈおよび２Ｂ４（ＣＤ２４４）由来のドメインを含むＣＡＲ（ＣＤ２８Ｈ－２Ｂ４－ＴＣＲζ）は、ＮＫ細胞によってより強い抗腫瘍細胞傷害性を誘導し、ＣＤ９４－ＮＫＧ２ＡおよびＫＩＲ２ＤＬ１による阻害を克服するその能力においてより強力であった。同様に、共活性化受容体ＣＤ２８Ｈおよび２Ｂ４を含むＣＡＲ（ＣＤ２８Ｈ－２Ｂ４－ＴＣＲζ）は、ＮＫ細胞によってより強い抗腫瘍細胞傷害性を誘導し、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメインならびに２Ｂ４およびＴＣＲζ由来の細胞内シグナル伝達ドメインで構成される別のＣＡＲ（ＮＫＧ２Ｄ－２Ｂ４－ＴＣＲζ）よりも、ＣＤ９４－ＮＫＧ２ＡおよびＫＩＲ２ＤＬ１による阻害を克服するその能力においてより強力であった。
Ｉ．用語

【0055】

特に明記しない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ Ｘ，ｅｄ．Ｋｒｅｂｓら、Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２００９（ＩＳＢＮ ０７６３７６６３２１）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（ｅｄｓ．）、Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ発行、１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．発行、１９９５（ＩＳＢＮ ０４７１１８６３４１）；およびＧｅｏｒｇｅ Ｐ．Ｒｅｄｅｉ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、３^ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００８（ＩＳＢＮ：１４０２０６７５３４）、ならびに他の同様の参考文献に見出され得る。

【0056】

別段の説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられるすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために提供されることをさらに理解されたい。

【0057】

本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれ、ＧｅｎＢａｎｋｔ番号（２０２０年３月２６日にＧｅｎＢａｎｋに存在する配列について）も同様である。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。

【0058】

本開示の様々な実施形態の精査を容易にするために、特定の用語の以下の説明が提供される。

【0059】

抗体：抗原のエピトープを認識して結合する（例えば、特異的に認識して特異的に結合する）少なくとも１つの可変領域を含むポリペプチドリガンド。哺乳動物免疫グロブリン分子は、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖から構成され、それぞれが可変重（Ｖ_Ｈ）領域および可変軽（Ｖ_Ｌ）領域とそれぞれ呼ばれる可変領域を有する。合わせて、Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は、抗体によって認識される抗原の結合を担う。哺乳動物免疫グロブリンには、抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。

【0060】

抗体可変領域は、「フレームワーク」領域および「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」として知られる超可変領域を含む。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合を担う。抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを三次元空間に配置し、整列させるのに役立つ。所与のＣＤＲのアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔらによって記載されたものを含む、いくつかの周知のナンバリングスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国保健福祉省、１９９１年；「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７、１９８９；およびＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、（ＪＭＢ ２７３、９２７－９４８、１９９７；「Ｃｈｏｔｈｉａ」のナンバリングスキーム）、ならびにＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：２０７－９、２００１を参照のこと；「ＩＭＧＴ」のナンバリングスキーム）。ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴデータベースはオンラインで維持される。

【0061】

単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、遺伝子融合された単鎖分子（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３－４２６、１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５：５８７９－５８８３、１９８８；Ａｈｍａｄら、Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２、ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／９８０２５０；Ｍａｒｂｒｙ、ＩＤｒｕｇｓ、１３：５４３－５４９、２０１０を参照されたい。）として適切なポリペプチドリンカーによって連結された１またはそれを超える抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含む遺伝子操作された分子である。ｓｃＦｖにおけるＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインの分子内配向は、典型的にはｓｃＦｖにとって決定的ではない。したがって、両方の可能な配置（Ｖ_Ｈドメイン－リンカードメイン－Ｖ_Ｌドメイン；Ｖ_Ｌドメイン－リンカードメイン－Ｖ_Ｈドメイン）を有するｓｃＦｖを使用することができる。ｄｓＦｖでは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、ジスルフィド結合を導入して鎖の会合を安定化するように変異している。ダイアボディも含まれ、これは、Ｖ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインが、単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによってドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を作り出す二価二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９０：６４４４－６４４８、１９９３；Ｐｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：１１２１－１１２３、１９９４を参照のこと）。

【0062】

抗体には、キメラ抗体（ヒト化マウス抗体など）およびヘテロコンジュゲート抗体（二重特異性抗体など）などの遺伝子操作された形態も含まれる。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４－１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）；Ｋｕｂｙ、Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３^ｒｄ Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７も参照のこと。

【0063】

２Ｂ４（ＣＤ２４４）：非ＭＨＣ拘束性殺傷を媒介するＮＫ細胞表面受容体。２Ｂ４はまた、いくつかのＴ細胞、樹状細胞および単球上に見出される。２Ｂ４のリガンドはＣＤ４８であり、これは造血細胞上に発現される。２つのヒトアイソフォームが同定されている。これらは、同一の細胞内ドメインを有し、細胞外ドメインにおける５つのアミノ酸の存在または非存在によって異なる。

【0064】

２Ｂ４配列は公的に入手可能である。例示的なヒト２Ｂ４核酸配列としては、ＮＭ＿０１６３８２およびＮＭ＿００１１６６６６４が挙げられる。例示的なヒト２Ｂ４アミノ酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７４６６およびＮＰ＿００１１６０１３６が挙げられる。当業者は、例えば、現在利用可能であるかまたは後に開発される配列検索およびデータベースツールを利用して、さらなる２Ｂ４核酸およびアミノ酸配列を同定することができる。

【0065】

ＣＤ２８ホモログ（ＣＤ２８Ｈ）：ＣＤ２８Ｈは、チェックポイント阻害物質ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４などの免疫系の調節因子を含む免疫受容体のＣＤ２８ファミリーに属する。ＣＤ２８Ｈは、最初に、細胞間相互作用、細胞遊走ならびに上皮細胞および内皮細胞の血管新生に関与する分子として記載された。ＣＤ２８Ｈは、単一の細胞外免疫グロブリンドメインと、それに続く膜貫通ドメインと、１１０アミノ酸長の細胞質領域と、を有する。ＣＤ２８Ｈは、ナイーブＴ細胞における共刺激受容体である。ＣＤ２８ＨのリガンドはＢ７ホモログ７（遺伝子ＨＨＬＡ２によってコードされるＢ７－Ｈ５としても知られるＢ７Ｈ７）であり、これはＴ細胞成長およびサイトカイン産生を共刺激する。刺激後の抗原提示細胞上での発現に加えて、Ｂ７Ｈ７は腫瘍組織でも広く発現される。ＣＤ２８Ｈ^＋ナイーブおよびメモリーＴ細胞は、エフェクター機能の低下およびナイーブ特徴の増加を示す。ＣＤ２８Ｈの発現は、ヒト末梢血中のＮＫ細胞、自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）、および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）において記述されている。

【0066】

ＣＤ２８Ｈ配列は、公的に入手可能である。例示的なヒトＣＤ２８Ｈ核酸配列としては、ＮＭ＿１４４６１５およびＮＭ＿００１３０８２３２が挙げられる。例示的なヒトＣＤ２８Ｈアミノ酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６５３２１６およびＮＰ＿００１２９５１６１が挙げられる。当業者は、例えば、現在利用可能であるかまたは後に開発される配列検索およびデータベースツールを利用して、さらなるＣＤ２８Ｈ核酸およびアミノ酸配列を同定することができる。

【0067】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：標的結合部分（単一ドメイン抗体またはｓｃＦｖなど）およびシグナル伝達ドメイン、例えばＴ細胞受容体（例えば、ＣＤ３ζ、本明細書で「ＴＣＲζ」とも呼ばれる）由来のシグナル伝達ドメインを含むキメラ分子。典型的には、ＣＡＲは、標的結合部分、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。細胞内ドメインは、典型的には、ＴＣＲζ（ＣＤ３ζまたはＦｃεＲ１γなどの１またはそれを超える免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を有するシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの例では、細胞内ドメインは、少なくとも１つのさらなる共刺激ドメインまたは細胞内シグナル伝達分子の細胞内部分も含む。

【0068】

ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯＢＰ）：活性化シグナル伝達エレメントとして作用し得る、かつＺＡＰ７０およびＳＹＫに結合し得る、細胞質ドメインにＩＴＡＭモチーフを含む膜貫通タンパク質。

【0069】

ＤＡＰ１２配列は、公的に入手可能である。例示的なヒトＤＡＰ１２核酸配列としては、ＮＭ＿１９８１２５およびＮＭ＿００１１７３５１５が挙げられる。例示的なヒトＤＡＰ１２アミノ酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９３７７５８およびＮＰ＿００１１６６９８６が挙げられる。当業者は、例えば、現在利用可能であるかまたは後に開発される配列検索およびデータベースツールを利用して、さらなるＤＡＰ１２核酸およびアミノ酸配列を同定することができる。

【0070】

単離された：「単離された」生物学的成分、例えば核酸、タンパク質（抗体を含む）または細胞小器官は、その成分が天然に生じる環境（細胞など）中の他の生物学的成分、例えば他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質および細胞小器官から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸を包含する。

【0071】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞：特定の抗原刺激の非存在下で、ＭＨＣクラスによる制限なしに標的細胞を死滅させる免疫系の細胞。標的細胞は、腫瘍細胞またはウイルスを保有する細胞であり得る。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６の存在およびＣＤ３表面マーカーの非存在を特徴とする。ＮＫ細胞は、典型的には、正常な末梢血中の単核細胞画分の約１０～１５％を構成する。歴史的に、ＮＫ細胞は、事前の免疫または活性化なしに特定の腫瘍細胞を溶解する能力によって最初に同定された。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ提示を下方調節することによってＣＴＬ応答から逃れる可能性があるウイルスおよび腫瘍に対する「バックアップ」保護機構を提供すると考えられている。ＮＫ細胞は、直接的な細胞傷害性殺傷に関与することに加えて、がんおよび感染を制御するために重要であり得るサイトカイン産生においても役割を果たす。

【0072】

いくつかの例では、「改変ＮＫ細胞」は、異種核酸（本明細書に開示される核酸またはベクターの１つまたは複数など）で形質導入または形質転換された、または１またはそれを超える異種タンパク質を発現するＮＫ細胞である。「改変ＮＫ細胞」および「形質導入ＮＫ細胞」という用語は、本明細書のいくつかの例では互換的に使用される。

【0073】

精製：精製されたという用語は、絶対純度を必要とせず、むしろ、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製されたタンパク質または核酸調製物は、タンパク質または核酸がその天然環境（例えば、細胞内）にあるよりも富化されているものである。一実施形態において、調製物は、タンパク質または核酸が調製物の全タンパク質または核酸含有量の少なくとも５０％を占めるように精製される。実質的な精製は、他のタンパク質または細胞成分からの精製を意味する。実質的に精製されたタンパク質または核酸は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％純粋である。したがって、１つの具体的な非限定的な例では、実質的に精製されたタンパク質または核酸は、他の成分を９０％含まない。

【0074】

組換え：天然に生じない配列を有するか、別の方法で分離された配列の２つのセグメント（例えば、「キメラ」配列）の人工的な組み合わせによって作製された配列を有する核酸またはタンパク質。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、または例えば遺伝子操作技術による核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって達成することができる。

【0075】

対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むヒトおよび獣医学的対象の両方を含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎動物。

【0076】

Ｔ細胞：免疫応答の重要なメディエーターである白血球（リンパ球）。Ｔ細胞には、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＣＤ４^＋Ｔリンパ球は、「分化抗原群４」（ＣＤ４）として知られるその表面にマーカーを有する免疫細胞である。ヘルパーＴ細胞としても知られるこれらの細胞は、抗体応答ならびにキラーＴ細胞応答を含む免疫応答を統合するのに役立つ。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、「分化抗原群８」（ＣＤ８）マーカーを有する。一実施形態では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。別の実施形態では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、サプレッサーＴ細胞である。

【0077】

活性化Ｔ細胞は、細胞増殖および／または１またはそれを超えるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＦＮγまたはＴＮＦα）の発現もしくは分泌の増加によって検出することができる。ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化は、抗原に応答した細胞溶解活性の増加によっても検出することができる。

【0078】

いくつかの例では、「改変Ｔ細胞」は、異種核酸（本明細書に開示される核酸またはベクターの１つまたは複数など）で形質導入または形質転換された、または１またはそれを超える異種タンパク質を発現するＴ細胞である。「改変Ｔ細胞」および「形質導入Ｔ細胞」という用語は、本明細書のいくつかの例では互換的に使用される。

【0079】

形質導入または形質転換：形質転換細胞は、分子生物学技術によって核酸分子が導入された細胞である。本明細書で使用される場合、形質導入および形質転換という用語は、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターの使用、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクションおよび粒子銃加速によるＤＮＡの導入を含む、核酸分子がそのような細胞に導入され得るすべての技術を包含する。

【0080】

疾患を処置または改善すること：「処置すること」とは、腫瘍サイズまたは腫瘍量の減少など、疾患または病的状態が発症し始めた後に疾患または病的状態の徴候または症状を減少または阻害する治療的介入を指す。「改善する」とは、がんなどの疾患の徴候または症状の数または重症度の減少を指す。

【0081】

ベクター：宿主細胞（例えば、トランスフェクションまたは形質導入によって）に導入し、それによって形質転換宿主細胞を産生することができる核酸分子。組換えＤＮＡベクターは、組換えＤＮＡを有するベクターである。ベクターは、複製起点などの宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターはまた、１またはそれを超える選択マーカー遺伝子および当技術分野で公知の他の遺伝要素を含むことができる。ウイルスベクターは、１またはそれを超えるウイルスに由来する少なくともいくつかの核酸配列を有する組換え核酸ベクターである。複製欠損ウイルスベクターは、少なくとも１つの複製必須遺伝子機能の欠損に起因して、複製に必要なウイルスゲノムの１またはそれを超える領域の補完を必要とするベクターである。
ＩＩ．キメラ抗原受容体

【0082】

本明細書では、ＣＤ２８Ｈ由来の細胞内シグナル伝達ドメインおよび少なくとも１つのさらなる細胞内シグナル伝達ドメイン（１つまたは２つのさらなる細胞内シグナル伝達ドメインなど）を含むＣＡＲが提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（Ｎ末端からＣ末端の順序で）標的結合ドメイン（抗原結合ドメインなど）と、必要に応じてヒンジ（または「ステム」）ドメインと、膜貫通ドメインと、ＣＤ２８Ｈ由来の第１の細胞内シグナル伝達ドメインおよび第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、細胞内ドメインと、を含む。第１および第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、任意の順序であり得る。特定の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ２８Ｈ由来の第１の細胞内シグナル伝達ドメインと、２Ｂ４、ＴＣＲζ、ＦｃεＲ１γまたはＤＡＰ１２由来の第２の細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む。例示的なＣＡＲとしては、図１３Ｂに概略的に示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0083】

ＣＤ２８Ｈ由来の細胞内シグナル伝達ドメインおよび少なくとも２つのさらなる細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲも提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（Ｎ末端からＣ末端の順序で）標的結合ドメイン（抗原結合ドメインなど）と、必要に応じてヒンジ（または「ステム」）ドメインと、膜貫通ドメインと、ＣＤ２８Ｈ由来の第１の細胞内シグナル伝達ドメイン、２Ｂ４由来の第２の細胞内シグナル伝達ドメイン、および第３の細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインと、を含む。第１、第２および第３の細胞内シグナル伝達ドメインは、任意の順序であり得る。いくつかの例では、第３の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲζ、ＦｃεＲ１γまたはＤＡＰ１２に由来する。例示的なＣＡＲとしては、図１５Ａに概略的に示されるものおよび表２に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0084】

いくつかの実施形態では、第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８Ｈに由来し、配列番号２のアミノ酸１７２～２８２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、またはそれらを含むか、またはそれらからなるアミノ酸配列を含む。さらなる例では、ＣＤ２８Ｈ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１のヌクレオチド５１４～８４６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、またはそれらを含むか、またはそれらからなる核酸分子によってコードされる。他の例では、ＣＤ２８Ｈ細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸は、コドン最適化されており、配列番号１５のヌクレオチド１０１８～１３５０と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、またはそれらを含むか、またはそれらからなる核酸分子を含む。

【0085】

いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、第１の細胞内シグナル伝達ドメインに対してＣ末端であり得るか、または第１の細胞内シグナル伝達ドメインに対してＮ末端であり得る。一例では、第２の細胞内シグナル伝達ドメインはＴＣＲζに由来する。いくつかの例では、第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２のアミノ酸２８３～３９５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、またはそれらを含むか、またはそれらからなるアミノ酸配列を含む。さらなる例では、ＴＣＲζ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１のヌクレオチド８４７～１１８５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、またはそれらを含むか、またはそれらからなる核酸分子によってコードされる。他の実施形態では、第２の細胞内シグナル伝達は、２Ｂ４に由来し、配列番号１０のアミノ酸１７１～２９１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、またはそれらを含むか、またはそれらからなるアミノ酸配列を含む。さらなる例では、２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号９のヌクレオチド５１４～８７３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、またはそれらを含むか、またはそれらからなる核酸分子によってコードされる。なおさらなる実施形態では、第２の細胞内シグナル伝達ドメインはＦｃεＲ１γまたはＤＡＰ１２に由来する。

【0086】

いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、２Ｂ４由来の第２の細胞内ドメイン（例えば、上述したように）および第３の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、第３の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば上記のように、ＴＣＲζ、ＦｃεＲ１γ、またはＤＡＰ１２に由来する。

【0087】

いくつかの実施形態では、標的結合ドメイン（抗原結合ドメインとも呼ばれる）は、がんもしくは腫瘍細胞上に発現されるタンパク質または腫瘍関連抗原などの目的の標的に結合する抗原結合ドメインまたはｓｃＦｖである。任意の標的結合ドメインが、本明細書中に記載されるＣＡＲに挿入され得る。いくつかの実施形態では、標的結合ドメインは、血液悪性腫瘍または固形腫瘍において発現されるタンパク質に結合する。いくつかの非限定的な例では、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９（ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖなど）に結合する。他の例では、標的結合ドメインは、Ｂ７Ｈ７（例えば、ＣＤ２８Ｈの細胞外ドメイン）に結合する。細胞外結合ドメインの例示的な標的および対応する悪性腫瘍を表１に示す。
表１：例示的な細胞外抗原結合ドメイン標的および悪性腫瘍

【表1-1】

【表1-2】

【0088】

したがって、いくつかの実施形態では、細胞外標的結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２２、Ｂ細胞成熟因子（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１７１、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、インターロイキン－１３受容体アルファ（ＩＬ－１３Ｒａ）、メソテリン、ムチン１６、ムチン１、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ－１）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＣＤ３３、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ＣＤ５、ＣＤ３８、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣａｍ）、ＣＤ１３３、およびグリピカン３（ＧＰＣ３）のうちの１またはそれを超えるものに結合する。このリストは非限定的であり、さらなる細胞外標的化ドメインも利用することができる。特定の例では、標的化ドメインは、ＣＤ１９（例えば、配列番号１２のアミノ酸３２～２７３、または配列番号１１のヌクレオチド９４～８１９によってコードされる）に結合するｓｃＦｖである。他の特定の例では、細胞外標的結合ドメインは、ＣＤ２８Ｈ細胞外ドメイン（例えば、配列番号８のアミノ酸１～１５０、または配列番号７のヌクレオチド１～４５０によってコードされる）である。

【0089】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外領域は、例えば細胞表面でのＣＡＲの発現を促進するために、シグナル配列ドメイン、例えば抗原結合ドメインのＮ末端をさらに含む。いくつかの例では、シグナル配列ドメインは、合成中および／または細胞表面上での発現の際にＣＡＲから切断され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、シグナル配列ドメインを欠く。シグナル配列ドメインは、任意の適切なシグナルペプチド配列を含み得る。１つの非限定的な例では、シグナル配列ドメインは、ＣＤ８αシグナル配列である。いくつかの例では、シグナル配列は、配列番号１６のアミノ酸１～２１を含むかもしくはそれからなるか、または配列番号１５のヌクレオチド１～６３によってコードされる。別の非限定的な例では、シグナル配列ドメインは、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）シグナル配列である。

【0090】

他の実施形態では、ＣＡＲの細胞外領域は、例えばＮＫ細胞におけるＣＡＲの発現の検出を容易にするために、検出可能な標識またはタグをさらに含む。いくつかの例では、検出可能な標識またはタグは、抗原結合ドメインに対してＮ末端である。しかしながら、当業者は、構築物の他の場所、例えば細胞内ドメインのＣ末端に検出可能な標識またはタグを配置することができる。１つの非限定的な例では、検出可能な標識またはタグはＭｙｃタグである。限定されないが、蛍光標識を含む他の検出可能な標識またはタグを選択することができる。

【0091】

いくつかの実施形態では、開示されるＣＡＲは、ヒンジ（または「ステム」）ドメインも含み、これは、いくつかの例では、細胞外標的化ドメインと膜貫通領域との間のスペーサーである。しかしながら、他の実施形態では、ＣＡＲはヒンジドメインを含まない。いくつかの実施形態では、細胞外ヒンジドメインはＣＤ８αヒンジドメインである。いくつかの例では、ヒンジドメインは、配列番号１２のアミノ酸２７４～３１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、またはそれらを含むか、またはそれらからなるＣＤ８αヒンジドメインである。さらなる例では、ＣＤ８αヒンジドメインは、配列番号１１のヌクレオチド８２０～９５４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、またはそれらを含むか、またはそれらからなる核酸分子によってコードされる。他の例では、ヒンジドメインは、本明細書に開示されるＣＡＲにおいて利用されるＣＤ２８Ｈ配列に含まれる（例えば、ＣＤ２８ＨのＩｇドメインと膜貫通ドメインとの間のヒンジドメイン）。

【0092】

開示されるＣＡＲは、存在する場合、ヒンジドメイン（例えば、ヒンジドメインに対するＣ末端）および細胞内ドメイン（例えば、細胞内ドメインのＮ末端）に連結される膜貫通ドメインを含む。他の例では、ヒンジドメインが存在しない場合、膜貫通ドメインは、細胞外標的化ドメイン（例えば、細胞外標的化ドメインに対するＣ末端）および細胞内ドメイン（例えば、細胞内ドメインのＮ末端）に連結される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ２８Ｈ膜貫通ドメインである。他の例では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＮＫｐ３０膜貫通ドメイン、ＮＫｐ４６膜貫通ドメイン、ＣＤ１６（ＦＣＧＲ３Ａ）膜貫通ドメイン、ＮＫｐ４４膜貫通ドメイン、またはＫＩＲ２ＤＳ４膜貫通ドメインである。１つの具体的な例では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８Ｈに由来する。いくつかの例では、膜貫通ドメインは、配列番号１６のアミノ酸３１９～３３９と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、またはそれらを含むか、またはそれらからなるＣＤ２８Ｈ膜貫通ドメインである。さらなる例では、ＣＤ２８Ｈ膜貫通ドメインは、配列番号１５のヌクレオチド９５５～１０１７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、またはそれらを含むか、またはそれらからなる核酸分子によってコードされる（少なくともいくつかの例では、コドン最適化されていてもよい）。他の具体的な例では、膜貫通ドメインは、配列番号２３のアミノ酸１３６～１５６（ＮＫｐ３０）、配列番号２２のアミノ酸２５６～２７９（ＮＫｐ４６）、配列番号２１のアミノ酸２０９～２２９（ＣＤ１６）、配列番号２４のアミノ酸１９３～２１３ ＮＫｐ４４）もしくは配列番号２５のアミノ酸２４６～２６５（ＫＩＲ２ＤＳ４）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、またはそれらを含むか、またはそれらからなる。

【0093】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインの細胞内領域Ｃ末端および第１の細胞内シグナル伝達ドメインに対してＮ末端（例えば、約２０～７０アミノ酸、例えば約２５～５０アミノ酸、約３５～６０アミノ酸または約４５～７０アミノ酸の細胞内領域）を含む。特定の例では、この細胞内領域は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、またはＫＩＲ２ＤＳ４に由来し、それぞれの膜貫通ドメインに対してＣ末端で連結されている（例えば、例については表２を参照のこと）。特定の例では、細胞内領域は、配列番号２１のアミノ酸２３０～２５４（ＣＤ１６）、配列番号２２のアミノ酸２８０～３０４（ＮＫｐ４６）、配列番号２３のアミノ酸１５７～２０１（ＮＫｐ３０）、配列番号２４のアミノ酸２１４～２７６（ＮＫｐ４４）、もしくは配列番号２５のアミノ酸２６６～３０４（ＫＩＲ２ＤＳ４）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるか、またはそれらを含むか、またはそれらからなる。

【0094】

本開示の例示的なＣＡＲには、図１３Ｂおよび図１５Ａに概略的に示されるもの、ならびに表２に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。

【0095】

特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２、６、１２、１６、および２０のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、ＣＡＲは、配列番号２、６、１２、１６、および２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むかまたはこれからなる。特定の例では、配列番号２、６、１２、１６および２０のうちのいずれか１つに含まれるシグナルペプチドおよび／またはＭｙｃタグは、使用前に除去される。

【0096】

本明細書に開示されるＣＡＲをコードする核酸も提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１、５、１１、１５、および１９のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を有する核酸配列によってコードされるか、または配列番号１、５、１１、１５、および１９のうちのいずれか１つの核酸配列を含むか、またはそれからなる。特定の例では、配列番号１、５、１１、１５および１９のうちのいずれか１つに含まれるシグナル配列および／またはＭｙｃタグコード配列は、使用前に除去される。
表２：例示的なＣＡＲ

【表2】

【0097】

バリアントであるＣＡＲの生物学的活性を保持するか、または特定のドメインの生物学的活性を保持する、本明細書に記載のＣＡＲまたはそのドメインの機能的バリアントも提供される。機能的バリアントは、親ＣＡＲまたはドメインとアミノ酸配列において少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％）、約９７％、約９８％、約９９％またはそれを超えて同一であり得る。置換は、例えば、細胞外標的化ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインのうちの１またはそれを超えるものにおいて行うことができる。

【0098】

いくつかの例では、機能的バリアントは、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換（例えば最大１０個の保存的アミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の保存的置換）を有する親ＣＡＲまたはドメインのアミノ酸配列を含む。他の例では、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換（例えば最大１０個の非保存的アミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の非保存的置換）を有する親ＣＡＲまたはドメインのアミノ酸配列を含む。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を妨害も阻害もしない。非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性が親ＣＡＲまたはドメインと比較して増加するように、機能的バリアントの生物学的活性を増強し得る。

【0099】

ＣＡＲまたはそのドメインは、いくつかの例では、１つまたはそれを超える天然に生じるアミノ酸の代わりに１つまたはそれを超える合成アミノ酸を含み得る。そのような合成アミノ酸としては、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、ａ－アミノｎ－デカン酸、ホモセリン、Ｓ－アセチルアミノメチル－システイン、トランス－３－およびトランス－４－ヒドロキシプロリン、４－アミノフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、４－カルボキシフェニルアラニン、β－フェニルセリンβ－ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α－ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン－２－カルボン酸、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’－ベンジル－Ｎ’－メチル－リジン、Ν’，Ν’－ジベンジル－リジン、６－ヒドロキシリジン、オルニチン、α－アミノシクロペンタンカルボン酸、α－アミノシクロヘキサンカルボン酸、ＯＣ－アミノシクロヘプタンカルボン酸、ＯＣ－（２－アミノ－２－ノルボルナン）－カルボン酸、γ－ジアミノ酪酸、α、β－ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα－ｔｅｒｔ－ブチルグリシンが挙げられる。ＣＡＲは、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ－アシル化、例えば、ジスルフィド架橋を介した環化、または酸付加塩への変換、および／または必要に応じて二量体化もしくは重合もしくはコンジュゲートされ得る。他の実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、例えば、目的の細胞における発現を改善するためにコドン最適化され得る。

【0100】

いくつかの実施形態では、開示されるＣＡＲをコードする核酸分子は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの宿主細胞における発現のための発現ベクター（ウイルスベクターなど）に含まれる。いくつかの例では、発現ベクターは、ＣＡＲをコードする核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。１またはそれを超えるエンハンサー、転写および／または翻訳ターミネーター、ならびに開始配列などのさらなる発現制御配列も、発現ベクターに含めることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＣＡＲをコードする核酸は、ウイルスベクターに含まれる。適切なウイルスベクターの例としては、レトロウイルス（例えば、ガンマレトロウイルス、例えばＭｏＭＬＶまたはレンチウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび鶏痘ベクターが挙げられる。いくつかの例では、ＣＡＲをコードする核酸は、ＳＦＧレトロウイルスベクターまたはｐＨＡＧＥ－ＣＰＰＴレンチウイルスベクターなどのＭｏＭＬＶベクターに含まれる。別の例では、ＣＡＲをコードする核酸は、ｐＣＤＨ－ＥＦ１α－ＭＳＣ－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏレンチウイルス発現ベクターに含まれる。他の例では、ベクターはＤＮＡベクターであり得る。さらなる例では、ＣＡＲをコードする核酸は、ＭＳＧＶ－１などのγ－レトロウイルスベクターに含まれる。

【0101】

いくつかの例では、ベクターは、少なくとも１つのさらなるＣＡＲをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの例では、さらなるＣＡＲは、さらなる腫瘍抗原に特異的であり、例えば、標的抗原を発現または過剰発現する腫瘍細胞に対する開示されたＣＡＲの標的化の特異性を増加させる。
ＩＩＩ．キメラアダプタータンパク質を発現する細胞

【0102】

開示のＣＡＲを発現する細胞（例えば、免疫細胞）および開示のＣＡＲを発現する細胞を含む組成物も本明細書で提供される。特定の実施形態では、組成物は、開示されるＣＡＲを発現する細胞（ＮＫ細胞またはＴ細胞など）および薬学的に許容され得る担体を含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、開示されるＣＡＲをコードする核酸分子は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの宿主細胞における発現のための発現ベクター（ウイルスベクターなど）に含まれる。いくつかの例では、発現ベクターは、ＣＡＲをコードする核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。１またはそれを超えるエンハンサー、転写および／または翻訳ターミネーター、ならびに開始配列などのさらなる発現制御配列も、発現ベクターに含めることができる。

【0104】

開示される核酸は、例えばＣＡＲをコードする核酸を含む発現ベクターを使用して、細菌、植物、酵母、昆虫または哺乳動物細胞などの宿主細胞で発現させることができる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームに包んだプラスミドの挿入、ウイルスベクターなどのＤＮＡのトランスフェクションの方法を用いてもよい。真核細胞はまた、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列、および選択可能な表現型をコードする第２の核酸分子、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子と共形質転換され得る。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、レンチウイルスまたはレトロウイルスなどの真核生物ウイルスベクターを使用して、真核細胞に形質導入または形質転換し、ＣＡＲ（例えば、Ｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｄ．、２０１１）を発現させることである。いくつかの例では、そのような発現系は、２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａまたは骨髄腫細胞株などの細胞において組換えタンパク質を産生するために使用される。

【0105】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターがＣＡＲの発現に利用される。ウイルスベクターとしては、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルス、例えばガンマレトロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターは、真核細胞への遺伝子導入のための非常に効率的な方法を提供する。さらに、レトロウイルス組込みは、制御された様式で起こり、細胞あたり１コピーまたは数コピーの新しい遺伝情報の安定した組込みをもたらす。理論に拘束されるものではないが、レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコ－レトロウイルスに由来するベクターを超える利点を有する。それらはまた、低い免疫原性という追加の利点を有する。１つの非限定的な例では、ベクターは、例えばＥＦ１ａプロモーターを有するｐＥＬＮＳなどのレンチウイルスベクターである。他の例示的なベクターには、ネオマイシン欠失またはレトロウイルスベクターＭＳＧＶを有するｐＬＶ－ＥＲ１ａ－ＩＲＥＳ－Ｎｅｏが含まれる。特定の例では、ベクターは、ｐＣＤＨ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－Ｔ２Ａ Ｐｕｒｏレンチウイルス発現ベクターであり、例えばプラスミドｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２．Ｇと共にレンチウイルスを産生するために使用することができる。

【0106】

本明細書に開示されるＣＡＲを発現する免疫細胞（ＮＫ細胞またはＴ細胞など）も提供される。免疫細胞に、ＣＡＲをコードする核酸を含む発現ベクターを形質導入する。いくつかの例では、形質導入細胞は、末梢血リンパ球（例えば、対象から得られる）、末梢血単核細胞（例えば、対象から得られる）、単離されたＴ細胞（例えば、初代Ｔ細胞または対象から得られたＴ細胞）、または単離されたＮＫ細胞（例えば、初代ＮＫ細胞または対象から得られたＮＫ細胞）である。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、対象からのサンプル、例えば血液、血漿、骨髄、リンパ節または胸腺から得ることができる。いくつかの例では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞はまた、例えばＣＡＲ発現ベクターによる形質導入の前および／または後に、対象からのサンプルから富化、精製および／または増大される。
ＩＶ．免疫療法の方法

【0107】

ＣＡＲを用いてがん（血液悪性腫瘍または固形腫瘍など）を有する対象を処置する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に開示されるＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲをコードするベクターで形質導入される）および薬学的に許容され得る担体を含む組成物を対象に投与することを含む。他の例では、本方法は、開示されるＣＡＲをコードする発現ベクターおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。ＣＡＲの細胞外標的化ドメインは、例えば、表１に示されるように、処置されているがんに基づいて選択される。

【0108】

血液学的悪性腫瘍の例としては、急性白血病（例えば、１１ｑ２３陽性急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（acute myelocytic leukemia）、急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia）（ＡＭＬ）、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（chronicmyelocytic）（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia）および慢性リンパ性白血病）、リンパ芽球性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、および骨髄異形成を含む白血病が挙げられる。１つの非限定的な例では、血液悪性腫瘍は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）である。

【0109】

固形腫瘍の例としては、肉腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、およびその他の肉腫）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、結腸直腸がん、腹膜がん、食道がん、膵臓がん、乳がん（基底乳癌、乳管癌および小葉乳癌を含む）、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝臓がん（肝細胞癌を含む）、胃がん、扁平上皮癌（頭頸部扁平上皮癌を含む）、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、卵管がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱がん（腎細胞がんなど）、黒色腫、およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、神経膠芽腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫など）が挙げられる。固形腫瘍には、腫瘍転移（例えば、肺、肝臓、脳または骨への転移）も含まれる。

【0110】

細胞またはベクターを対象に導入するために、様々な薬学的に許容され得る担体、例えば緩衝食塩水などを本明細書で提供される組成物に使用することができる。これらの溶液は、無菌であり、一般に望ましくない物質を含まない。組成物は、滅菌され得る。いくつかの例では、組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、ならびに保存剤、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどの薬学的に許容され得る補助物質も含む。これらの製剤中の濃度は様々であってよく、選択された特定の投与様式および対象の必要性に従って、主に体液量、粘度、体重などに基づいて選択される。

【0111】

投与される組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、転移の程度および状態の個人差を考慮して医師が決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物は、約１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重（例えば、約１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８または１０^９細胞／ｋｇ）、例えば約１０^４～１０^６細胞／ｋｇ、約１０^５～１０^７細胞／ｋｇ、または約１０^６～１０^８細胞／ｋｇの投与量で投与される。例示的な用量は、約１０^５細胞／ｋｇ～約１０^９細胞／ｋｇ、例えば約１０^６細胞／ｋｇ、約５×１０^６細胞／ｋｇ、約１０^７細胞／ｋｇ、約５×１０^７細胞／ｋｇ、約１０^８細胞／ｋｇ、または約５×１０^８細胞／ｋｇである。改変Ｔ細胞またはＮＫ細胞の集団は、典型的には非経口的に、例えば静脈内投与される。しかし、腫瘍または腫瘍の近くへの注射もしくは注入（局所投与）または腹膜腔への投与も使用することができる。当業者は、適切な用量および投与経路を決定することができる。

【0112】

いくつかの例では、組成物（ＣＡＲを発現するＴ細胞またはＮＫ細胞を含む組成物など）は、１またはそれを超える回数、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回投与される。組成物は、静脈内注射または注入によって投与することができる。いくつかの例では、組成物は、毎日、毎週、隔月または毎月投与される。複数回用量が投与される場合、投与間の時間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間またはそれを超える時間であり得る。いくつかの非限定的な例では、組成物は静脈内投与用に製剤化され、複数回投与される。投与の量および頻度は、対象の状態ならびに対象の疾患の種類および重症度などの因子によって決定されるが、適切なレジメンは臨床試験によって決定され得る。

【0113】

いくつかの例では、ＣＡＲ改変ＮＫ細胞またはＴ細胞は、対象においてインビボで持続および／または複製することができ、持続的な腫瘍制御をもたらし得る長期持続性をもたらす。同じ例では、対象に投与されたＮＫ細胞もしくはＴ細胞、またはこれらの細胞の子孫は、対象への投与後少なくとも２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、または数年間、対象において存続する。他の実施形態では、細胞またはそれらの子孫は、対象への細胞の投与後６ヶ月未満、５ヶ月、４ヶ月、３ヶ月２ヶ月、または１ヶ月、例えば３週間、２週間、１週間の間、存在する。

【0114】

一実施形態では、ＣＡＲは、ＮＫ細胞またはＴ細胞などの細胞に導入され、対象（がんを有する対象など）は、細胞の投与を受ける。いくつかの実施形態では、方法は、対象からＮＫまたはＴ細胞を単離すること、ＣＡＲをコードする発現ベクター（レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなど）でＮＫまたはＴ細胞を形質転換すること、および処置のためにＣＡＲを発現する改変ＮＫ細胞またはＴ細胞を対象に投与すること、を含む。ＮＫ細胞またはＴ細胞は、レシピエントに対して自家であり得るか、または同種異系（例えば、単離され、形質転換されたＮＫ細胞またはＴ細胞は、処置されている対象由来ではない）であり得る。いくつかの例では、対象は、改変ＮＫ細胞またはＴ細胞を投与する前に免疫抑制レジメン（例えば、リンパ球枯渇または部分的リンパ球枯渇）を受け得る。免疫系支持療法（ＩＬ－２および／またはＧ－ＣＳＦなど）はまた、例えば、対象における改変された細胞の増大を促進するために、および／または好中球の回復を支援するために、対象に投与され得る。

【0115】

いくつかの実施形態では、リンパ球（ＰＢＭＣなど）を含む細胞の集団は、アフェレーシスを含むがこれに限定されない任意の方法によって得ることができる。細胞の集団の全部もしくは一部を直ちに利用することができ、または細胞の全部もしくは一部を将来の使用のために凍結保存することができる。使える状態にある、細胞集団の全部または一部を解凍し（予め凍結保存されている場合）、ＮＫ細胞またはＴ細胞を培養で活性化、富化および／または増大させる。ＮＫ細胞またはＴ細胞を単離、活性化および増大させる方法は、当技術分野で公知である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／００６０５４号および国際公開第２０１８／０２２６４６号）。細胞に、ＣＡＲを含むベクターを形質導入する。特定の例では、約１０^７～１０^９個の細胞が形質導入される（例えば、約１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、または１×１０^９個の細胞）。形質導入されたＴ細胞またはＮＫ細胞は、エクスビボで増大させることができ、増大後に適切な投与量（例えば、約１０^６～１０^１２個の細胞）で凍結保存することができる。形質導入されたＮＫ細胞またはＴ細胞は、対象への投与前に解凍される（予め凍結されている場合）。対象は、改変ＮＫ細胞またはＴ細胞を投与する前に免疫抑制レジメン（例えば、リンパ球枯渇）を受け得る。改変ＮＫ細胞またはＴ細胞は、例えば注射または注入によって対象に投与される。

【0116】

処置有効性は、腫瘍サイズ、病変数、腫瘍ステージ、奏効率、または他の基準などの方法によって監視される。いくつかの例では、原発腫瘍または転移のサイズの減少（例えば、標準的なＲＥＣＩＳＴまたはｉｒＲＥＣＩＳＴ基準によって定義されるような）は、対象におけるがんの阻害を示す。他の例では、無増悪生存期間および／または全生存期間（例えば、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２年、またはそれを超える、例えば１～１２ヶ月、６～１８ヶ月、１～２年、またはそれを超える期間）は、対象におけるがんの阻害を示す。他の例では、循環ＣＡＲ発現ＮＫ細胞またはＴ細胞の持続性、免疫細胞サブセットの変化、および免疫細胞の活性化状態、ならびに他の免疫学的決定因子の１またはそれを超えるものを評価し、臨床転帰をベースラインで（例えば、改変された細胞の投与前または投与のときに）、処置中の異なる時点、および／または疾患進行のときに評価する。

【0117】

いくつかの例では、対象はまた、手術、化学療法、放射線、免疫抑制剤、化学療法剤、またはそれらの２つまたはそれを超える任意の組み合わせの１またはそれを超えるもので処置される。例示的な薬剤としては、限定されないが、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメルファラン）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンおよびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、およびウラムスチン；葉酸（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセドおよびラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリンおよびチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビンなどの代謝拮抗剤；ポドフィルム（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、ビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）などの植物アルカロイド；アントラサイクリンファミリーのメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンおよびバルルビシン）、ブレオマイシン、ヒドロキシ尿素、およびマイトマイシンなどの細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質；トポイソメラーゼ阻害剤、例えばトポテカンおよびイリノテカン；モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、リツキシマブ、デュルバルマブおよびトラスツズマブ；アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、ベルテポルフィンなどの光増感剤；プロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ、イキサゾミブ、マリゾミブおよびデランゾミブ；ゲフィチニブ、イマチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、トラメチニブ、およびルキソリチニブなどのキナーゼ阻害剤；成長因子受容体阻害剤、例えば、アシチニブ、エルロチニブ、カボザンチニブおよびクリゾチニブ；ｍＴＯＲ阻害剤、例えばエベロリムス、テムシロリムス、およびテミソロチムス；ならびに他の薬剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ベキサロテン、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エンザルタミド、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、トピルタミド、アパルタミド、エストラムスチン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、タモキシフェン、クロミフェン、ラロキシフェン、アナストロゾール、フルベストラントおよびトレチノインが挙げられる。さらなる薬剤としては、チェックポイント阻害剤、例えば抗体（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、デュルバルマブ、およびアテゾリズマブ）または小分子阻害剤（例えば、ＢＭＳ－１００１、ＢＭＳ－１１６６、ＣＣＸ４５０３）が挙げられる。いくつかの例では、チェックポイント阻害剤は、対象に投与されない。当業者は、処置される対象および状態に適切な１またはそれを超える利用可能な薬剤を選択することができる。

【実施例】

【0118】

以下の実施例は、特定の特徴および／または実施形態を説明するために提供される。これらの例は、本開示を記載された特定の特徴または実施形態に限定すると解釈されるべきではない。
実施例１
ＣＤ２８ホモログは、Ｂ７Ｈ７^＋腫瘍細胞の溶解のためのナチュラルキラー細胞の強力な活性化因子である

【0119】

この実施例に含まれるデータは、２０１９年４月２４日にオンラインで公開された、Ｚｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｌｏｎｇ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．７（６）：９３９－９５１で公開されたものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
材料および方法

【0120】

プラスミド：Ｂ７Ｈ７ ｃＤＮＡを含有するプラスミドをＨａｒｖａｒｄ ＰｌａｓｍＩＤ Ｄａｔａｂａｓｅ（＃ＨｓＣＤ０００４４６６２）から得た。Ｂ７Ｈ７ ｃＤＮＡを増幅し、ショウジョウバエＳ２細胞での発現のためにｐＡｃ５．１／Ｖ５－Ｈｉｓ Ａベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩクローニング部位にクローニングし、ヒト細胞株での発現のためにｐＣＤＨ－ＥＦ１－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩクローニング部位にクローニングした。ＣＤ２８ＨのｃＤＮＡを、Ｈａｒｖａｒｄ ＰｌａｓｍＩＤ Ｄａｔａｂａｓｅ（＃ＨｓＣＤ００４１６１８４）からベクターｐＬＸ３０４において得た。ＣＤ２８Ｈ ｃＤＮＡを増幅し、ヒト細胞株の形質導入のためにｐＣＤＨ－ＥＦ１－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏレンチウイルスベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩクローニング部位にクローニングした。ＣＤ２８Ｈ変異体およびキメラを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して作製し、配列決定によって検証した。ＰＣＤＨベクターにクローニングされたｃＤＮＡはすべて、２Ａ－ペプチドとインフレームであった。発現されたタンパク質は、免疫ブロットにおいて抗２Ａ抗体によって検出することができた。全てのプラスミド構築は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して行った。

【0121】

細胞：ヒトＮＫ細胞を、陰性選択によって健康な米国ドナーの末梢血から単離した（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＮＫ細胞を、１０％ヒト血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を補充したＩｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁し、４日以内に使用した。ＩＬ２およびＰＨＡ活性化ＮＫ細胞を前記のように培養した（Ｌｉｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３６：６００～６１１、２０１２）。簡単に説明すると、新たに単離されたＮＫ細胞を、１０％精製ＩＬ２（Ｈｅｍａｇｅｎ）、１００単位／ｍｌ組換えＩＬ２（Ｒｏｃｈｅ）および５μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、Ｓｉｇｍａ）を補充したＯｐＴｉｍｉｚｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で照射した自家フィーダー細胞と共に培養し、ＰＨＡおよびフィーダー細胞を含まない同じ培地で増やした。ＣＤ２８Ｈ発現を２週間の活性化後に試験した。ＮＫｐ４６およびＣＤ２＋ＩＬ２によって活性化されたＮＫ細胞を得るために、新たに単離したＮＫ細胞を、１００単位／ｍｌの組換えＩＬ２（Ｒｏｃｈｅ）の存在下で、５μｇ／ｍｌのＣＤ２およびＮＫｐ４６ ｍＡｂでコーティングしたプレート中で培養した。ＣＤ２８Ｈ発現を３日目、５日目および７日目に試験した。ＮＫＬ細胞（インディアナ大学がん研究所（インディアナポリス、インディアナ州）のＭ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎより入手）およびＫＨＹＧ－１細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および１００単位／ｍｌ組換えＩＬ－２（Ｒｏｃｈｅ）を補充したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。７２１．２２１細胞（２２１細胞と呼ばれる）、Ｐ８１５細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナッサス、バージニア州より入手）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ マナッサス、バージニア州）およびＨＤＬＭ－２細胞（Ｊｕら、ＰＮＡＳ、１１３：１６２４～１６２９、２０１６）（Ｔ．Ｗａｌｄｍａｎｎ、ＮＣＩ、ＮＩＨから入手）を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）および２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。適切なＨＬＡ－Ｅ発現（Ｌｅｅら、ＰＮＡＳ、９５：１９９～２０４、１９９８）を達成するためのＨＬＡ－Ａシグナルペプチドを含むＨＬＡ－Ｅ（２２１．ＡＥＨ）でトランスフェクトした２２１個の細胞は、Ｄ．Ｇｅｒａｇｔｙ（シアトルのＦｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）から寄贈された。Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）および２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＮＩＨ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅによって試験されたように、細胞はマイコプラズマを含まなかった。使用した全ての細胞株は、解凍後２ヶ月以内培養で維持され、形態、成長特性、表面マーカーの発現、および機能アッセイによって認証された。

【0122】

トランスフェクションおよびレンチウイルス産生：Ｓ２細胞トランスフェクションのために、発現プラスミドの１／１０の量の６μｇ／ｍｌピューロマイシン中で、選択のためのｐＡｃ５．１／Ｖ５－Ｈｉｓ Ａ－ｐｕｒｏプラスミドと共に、ＣＤ４８およびＢ７Ｈ７発現のためのプラスミドを一緒にまたはそれぞれ単独で細胞にトランスフェクトした。耐性細胞をクローニングし、ＣＤ４８およびＢ７Ｈ７の発現について試験した。レンチウイルスの作製のために、低継代Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をトランスフェクションの１日前にＴ７５フラスコに播種した。細胞をＰＥＩ Ｍａｘ（ポリエチレンイミン）でトランスフェクトした。簡潔には、プラスミドｐＭＤ２．Ｇ １．２μｇ、ｐｓＰＡＸ２ ２．３μｇ、ＰＣＤＨ ４．６μｇおよび２１７μｌの無血清ＤＭＥＭを１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブ中で混合した。６５μｌのＰＥＩ Ｍａｘ ４０Ｋ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）ストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、サンプルを短時間ボルテックスした。室温で１０分後、１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地８．６ｍｌをチューブに添加した。２９３Ｔ細胞の培養培地を、トランスフェクション試薬混合物を含む新鮮な培地で置き換えた。トランスフェクションの２日後、上清を回収し、０．４５μｍフィルターに通し、等分し、－８０℃で保存した。形質導入のための上清を直接またはＰＥＧ－ｉｔ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で富化した後に使用してウイルス力価を増加させた。ヒト細胞株の形質導入のために、レンチウイルスを８μｇ／ｍｌの最終濃度になるようにポリブレンと共に細胞に添加し、２日間インキュベートした。細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、予め滴定した濃度のピューロマイシンを含む完全培地に再懸濁した。ピューロマイシン耐性細胞上の形質導入遺伝子の表面発現をフローサイトメトリーによって検証した。

【0123】

フローサイトメトリーアッセイ：ほとんどのフローサイトメトリーアッセイは、細胞を予め混合したフルオロフォア－コンジュゲート抗体と４℃で３０分間インキュベートすることによって行った。ＨＬＡ－Ｅについての染色を、最初に細胞を抗ＨＬＡ－Ｅ（３Ｄ１２）または対照マウスＩｇＧ１（クローンＭＯＰＣ－２１）とインキュベートし、その後、ＰＥ－コンジュゲートポリクローナルヤギＦ（ａｂ’）_２抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートすることによって行った。ＩＬ２中で増やしたＮＫ細胞を、抗体で染色する前に、氷上で３０分間、１０％ヒト血清中でプレインキュベートしてＦｃ受容体ＣＤ１６をブロックした。休止ＮＫ細胞を、使用するまで１０％ヒト血清を含有するＩＭＤＭ中で培養したので、さらなるＦｃ受容体ブロッキングは必要とされなかった。細胞を染色後に洗浄し、ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ－２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。データをＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）で分析した。

【0124】

脱顆粒および細胞傷害性アッセイ：リダイレクトされた細胞傷害性アッセイを記載のように行った（Ｂｒｙｃｅｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、１０７：１５９～１６６、２００６）。簡単に記載すると、Ｐ８１５細胞を、５μｇ／ｍｌの、ＣＤ２８Ｈ（Ｒ＆Ｄ ＭＡＢ８３１６２）、２Ｂ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３２９５０２）、ＮＫｐ４６（ＢＤ ５５７８４７）、ＮＫＧ２Ｄ（Ｒ＆Ｄ ＭＡＢ１３９）、ＣＤ２（ＢＤ ５５５３２３）、ＤＮＡＭ－１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５９７８７）、ＣＤ１６（ＢＤ ５５５４０４）およびＣＤ５６（ＢＤ ５５５５１３）に対するｍＡｂの示された組み合わせで、室温で１５分間インキュベートした。休止ＮＫ細胞を１：２のＥ：Ｔ比で添加し、混合し、３００ｒｐｍで１分間穏やかに遠心分離した。３７℃で２時間後、細胞をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ－ＮＩＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、抗ＣＤ５６－Ｂｖ４２１（ＢＤ ５６２７５１）および抗ＣＤ１０７ａ－ＰＥ（ＢＤ ５５５８０１）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。標的細胞溶解アッセイを、ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ非破壊細胞傷害性バイオアッセイキット（Ｌｏｎｚａ）を製造者の指示に従って使用して、またはフローベースアッセイによって行った。簡潔には、ＮＫ細胞を、示されたＥ：Ｔ比で１０％ ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地中で６時間、ＰＫＨ６７標識標的細胞と共にインキュベートした。細胞をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ＮＩＲで染色し、標的細胞の溶解をフローサイトメトリーによって決定した。ＣＤ２８Ｈブロッキングのために、ＮＫ細胞を１０μｇ／ｍｌ ＣＤ２８Ｈ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と１５分間プレインキュベートした後、２２１．Ｂ７Ｈ７細胞と混合した。ＫＨＹＧ－１およびＮＫＬ細胞を、細胞傷害性アッセイに使用する前に、ＩＬ－２を含まない完全ＩＭＤＭ培地に１日間静置した。

【0125】

Ｓ２細胞混合および複数の機能アッセイ：休止ＮＫ細胞をトランスフェクトしたＳ２細胞と１：２のＥ：Ｔ比で混合した。細胞を１０％ ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地中で２時間インキュベートし、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ－ＮＩＲ、抗ＣＤ５６－Ｂｖ４２１および抗ＣＤ１０７ａ－ＰＥで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。細胞内サイトカインおよびケモカインを染色するために、ＮＫ細胞およびＳ２細胞を１時間、３μＭ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で５時間インキュベートした。ＣＤ２８Ｈブロッキングのために、１０μｇ／ｍｌ ＣＤ２８Ｈ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＮＫ細胞と１５分間プレインキュベートした後、Ｓ２細胞と混合した。細胞を抗ＣＤ１０７ａ－ＰＥ（ＢＤ ５５５８０１）および抗ＣＤ５６－Ｂｖ４２１（ＢＤ ５６２７５１）で染色し、４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、細胞内染色透過処理洗浄緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で透過処理した。細胞を、抗ＩＦＮ－γ－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ５０６５１０）、抗ＴＮＦ－α－ＢＶ６５０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ５０２９３７）、抗ＭＩＰ－１α－ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＭＡ５２３５６４）および抗ＭＩＰ－１β－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＢＤ ５６０６８８）で染色した。ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ－２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）で分析した。

【0126】

ＡＤＣＣアッセイ：Ｓ２細胞を、１：１０，０００に希釈したウサギ抗Ｓ２血清と室温で１５分間プレインキュベートした。休止ＮＫ細胞をＥ：Ｔ比１：２で添加し、混合し、３００ｒｐｍで１分間遠心分離した。１０％ ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地中、３７℃で２時間後、細胞をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ－ＮＩＲ、抗ＣＤ５６－Ｂｖ４２１および抗ＣＤ１０７ａ－ＰＥで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。リツキシマブを使用するＡＤＣＣアッセイのために、２２１細胞およびＤａｕｄｉ細胞を１０μｇ／ｍｌのリツキシマブと共に室温で１５分間プレインキュベートした。休止ＮＫ細胞を５：１のＥ：Ｔ比で添加し、５時間インキュベートした。標的細胞の溶解を、ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ非破壊細胞傷害性バイオアッセイキット（Ｌｏｎｚａ）を製造者の指示に従って使用して決定した。

【0127】

統計分析：統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ Ｖ７を用いて行った。データを平均±ＳＥＭとして提示し、両側マン・ホイットニー検定またはウィルコクソンの符号順位検定によって比較する。

【0128】

ヒトドナー：健康な米国成人由来の末梢血サンプルを、ＮＩＨ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄが承認したプロトコル（９９－ＣＣ－０１６８）の下で、書面によるインフォームドコンセントを得て、Ｂｅｌｍｏｎｔ Ｒｅｐｏｒｔに従ってＮＩＨ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅから得た。
結果

【0129】

ＣＤ２８Ｈは、初代休止ヒトＮＫ細胞上に発現される：新たに単離されたヒトＮＫ細胞の大部分は、細胞表面でＣＤ２８Ｈを発現した（図１Ａ）。ヒトＮＫ細胞は、ＣＤ５６の発現に基づいてＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}およびＣＤ５６^ｄｉｍ ＮＫサブセットに分けることができる。２つのサブセットは、異なる表現型および特性（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：６３３－６４０、２００１）を有する。本発明者らは、２つのＮＫサブセットにおけるＣＤ２８Ｈ発現を調べ、より大きな割合のＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}サブセットがＣＤ２８Ｈを発現した（図１Ｂ）。ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ} ＮＫ細胞のほとんどは、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＤ１６^－ＫＩＲ^－ＮＫＧ２Ａ^＋ＣＤ５７^－として表現型分類され、成熟度の低いＮＫ細胞集団を表す（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：６３３－６４０、２００１）。ＫＩＲおよびＮＫＧ２Ａの発現は、ＣＤ５６^ｄｉｍ ＮＫ細胞をいくつかのサブセット（図２Ａ）に分割することができる。しかしながら、ＮＫＧ２Ａ^＋ＫＩＲ^＋、ＮＫＧ２Ａ^＋ＫＩＲ^－、ＮＫＧ２Ａ^－ＫＩＲ^＋およびＮＫＧ２Ａ^－ＫＩＲ^－ＮＫであるＣＤ５６^ｄｉｍ ＮＫ細胞の間では、ＣＤ２８Ｈ発現の有意差は見られなかった（図１Ｃ）。ＣＤ５７発現を使用して、ＣＤ５６^ｄｉｍ ＮＫ細胞をさらに分離することもできる（Ｌｏｐｅｚ－Ｖｅｒｇｅｓら、Ｂｌｏｏｄ、１１６：３８６５～３８７４、２０１０）。ＣＤ５７^＋ＮＫ細胞は成熟しており、最終分化しており、増殖のための能力が低下している（Ｌｏｐｅｚ－Ｖｅｒｇｅｓら、Ｂｌｏｏｄ、１１６：３８６５～３８７４、２０１０）。ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ５７^－ＮＫサブセットと比較して、ＣＤ５７^＋細胞のより低い割合がＣＤ２８Ｈを発現した（図１Ｄ）。エクスビボで増大および活性化されたＮＫ細胞は非常に細胞傷害性であり、数十年にわたって臨床および基礎研究で使用されてきた（Ｂａｃｈａｎｏｖａら、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｇ．１９：１３３－１４１、２０１４；Ｇｒａｎｚｉｎら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：４５８、２０１７）。培養中のＮＫ細胞増大のための十分に確立された戦略は、フィーダー細胞として放射線照射された自家ＰＢＭＣの存在下でのＩＬ２とＰＨＡの組み合わせである（Ｌｉｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３６：６００～６１１、２００１２；Ｇｒａｎｚｉｎら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：４５８、２０１７）。ＮＫ細胞上のＣＤ２８Ｈ発現は、ＩＬ２およびＰＨＡにおいて２週間後に失われ（図２Ｂ）、この結果は、ＮＫ細胞をＣＤ２およびＮＫｐ４６に対するＩＬ２およびプレートにコーティングしたｍＡｂで刺激した免疫細胞の定量的プロテオミクス分析と一致する（Ｒｉｅｃｋｍａｎｎら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：５８３－５９３、２０１７）。同じ刺激条件を使用して、免疫染色によってＣＤ２８Ｈ発現の減少を確認した（図２Ｃ）。ＣＤ２８Ｈを発現するＮＫ細胞の割合の減少が活性化の３日後に観察され、活性化の７日後にＮＫ細胞の約２０％に徐々に低下した（図２Ｄ）。本発明者らはまた、ＩＬ２中でより短時間活性化されたＮＫ細胞上のＣＤ２８Ｈの発現を試験した。ＣＤ２５発現を活性化のためのマーカーとして使用した（図２Ｅ）。ＩＬ２で２４時間活性化した後、ＣＤ２５^＋およびＣＤ２５^－ＮＫ細胞上のＣＤ２８Ｈ発現に有意差は観察されなかった（図２Ｆ）。結果は、ＣＤ２８Ｈの発現が長期刺激および増大後にのみ減少したが、ＩＬ２による短期活性化によっては減少しなかったことを示した。

【0130】

ＣＤ２８Ｈは、２Ｂ４およびＮＫｐ４６と相乗作用し、ＣＤ１６によるＮＫ細胞活性化を増強する：ＣＤ２８Ｈ単独および他の受容体と共結合したＣＤ２８Ｈによって誘導されるＮＫ細胞脱顆粒を、リダイレクトされた細胞傷害性アッセイ（逆ＡＤＣＣとしても知られる）を用いて試験した（Ｂｒｙｃｅｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、１０７：１５９～１６６、２００６；Ｖｉｔａｌｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２０６５－２０７２、１９９８）。ＦｃＲ^＋マウス細胞株Ｐ８１５を、ＣＤ２８Ｈおよび他の受容体に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と混合し、ＮＫ細胞と共にインキュベートした。ｍＡｂのＦ（ａｂ’）_２部分は、それぞれのＮＫ細胞受容体に結合したが、Ｆｃフラグメントは、マウスＰ８１５細胞上のＦｃＲに結合した。ＮＫ細胞の活性化およびＰ８１５細胞の溶解を、ＮＫ活性化受容体（図３Ａ）の共結合によって誘導した。ＣＤ５６およびＣＤ１０７ａについて染色することによって決定される強いＮＫ細胞脱顆粒は、ＣＤ２８Ｈと、２Ｂ４またはＮＫｐ４６のいずれかとの共結合後にのみ生じたが（図４Ａおよび図４Ｂ）、ＣＤ２、ＮＫＧ２ＤまたはＤＮＡＭ－１との共結合後には生じなかった（図４Ｃ～図４Ｅ）。末梢血中のＣＤ５６^ｄｉｍ ＮＫ細胞は細胞傷害性およびサイトカイン産生の両方において適格であるが、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ} ＮＫ細胞は細胞傷害性が低く、サイトカイン産生細胞と見なされている（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：６３３－６４０、２００１；Ｆａｕｒｉａｔら、Ｂｌｏｏｄ、１１５：２１６７～２１７６、２０１０）。したがって、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ} ＮＫ細胞のわずかにより多くの画分がＣＤ２８Ｈを発現したが（図１Ｂ）、ＮＫ細胞の脱顆粒はＣＤ５６^ｄｉｍ ＮＫ細胞でのみ観察され（図４Ａ）、以前の研究と一致した（Ｂｒｙｃｅｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、１０７：１５９～１６６、２００６；Ｂｒｙｃｅｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、１１４：２６５７～２６６６、２００９）。ＣＤ２８Ｈはまた、ＣＤ１６によって誘導されたＮＫ細胞脱顆粒を増強した（図４Ｆ）。ＣＤ２８Ｈを介した刺激に対するＮＫ細胞の応答を滴定するために、２Ｂ４、ＮＫｐ４６およびＣＤ１６に対するｍＡｂを、漸増濃度のＣＤ２８Ｈ抗体の存在下で、リダイレクトされた細胞傷害性アッセイにおいて一定濃度で使用した（図４Ｇ～図４Ｉ）。１００ｎｇ／ｍｌという低いＣＤ２８Ｈ抗体で脱顆粒の増強が観察され、刺激は約５μｇ／ｍｌでプラトーに達した（図４Ｇ～図４Ｉ）。このリダイレクトされた細胞傷害性アッセイにおけるＰ８１５細胞の溶解もまた、異なるエフェクター対標的比で調査した（図４Ｊ～図４Ｋ）。ＮＫ細胞は、ＣＤ２８Ｈと、２Ｂ４およびＮＫｐ４６との共結合の際にＰ８１５標的細胞を効率的に溶解し、３つの受容体のいずれもが、単独でＮＫ細胞細胞傷害性を誘発しなかった（図４Ｊ～図４Ｋ）。

【0131】

４つの一般的に使用されるＮＫ細胞株、すなわちＮＫＬ、ＹＴＳ、ＫＨＹＧ－１およびＮＫ－９２の中で、ＫＨＹＧ－１のみがＣＤ２８Ｈを発現したが、４つすべてが２Ｂ４およびＮＫｐ４６を発現した（図３Ｂ）。ＫＨＹＧ－１細胞は、ＣＤ２８Ｈおよび２Ｂ４に対する、またはＣＤ２８ＨおよびＮＫｐ４６に対する抗体の存在下でＰ８１５標的細胞を溶解した（図３Ｃ）。したがって、休止ＮＫ細胞で観察されたＣＤ２８Ｈと、２Ｂ４およびＮＫｐ４６との相乗作用は、ＫＨＹＧ－１細胞で再現された。

【0132】

Ｂ７Ｈ７およびＣＤ４８の共発現は、ＮＫ細胞の脱顆粒およびサイトカイン産生を誘因する：受容体－リガンド相互作用に関連してＣＤ２８Ｈおよび２Ｂ４によるＮＫ細胞の相乗的活性化を研究するために、本発明者らは、Ｂ７Ｈ７およびＣＤ４８を単独または組み合わせのいずれかでショウジョウバエＳ２細胞において発現させた（図５Ａ）。ほとんどの造血細胞で発現されるＣＤ４８は、２Ｂ４のリガンドである。Ｂ７Ｈ７（Ｓ２．Ｂ７Ｈ７）またはＣＤ４８（Ｓ２．ＣＤ４８）を発現するＳ２細胞と２時間インキュベートしたＮＫ細胞は、脱顆粒しなかった（図６Ａ）。対照的に、Ｂ７Ｈ７およびＣＤ４８の両方を発現するＳ２細胞は、ＮＫ細胞脱顆粒を誘導した（図６Ａ～図６Ｂ）。結果は、それぞれのリガンドによるＣＤ２８Ｈおよび２Ｂ４の両方の結合がＮＫ細胞の相乗的活性化をもたらすことを示した。Ｓ２細胞上のＢ７Ｈ７およびＣＤ４８の共発現は、初代ＮＫ細胞におけるＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＭＩＰ－１αおよびＭＩＰ－１βの産生を誘導した（図６Ｃ～図６Ｆ）。ＮＫ細胞脱顆粒で観察されたように、サイトカインおよびケモカインの産生は、ＣＤ２８Ｈおよび２Ｂ４の相乗作用によってのみ誘発されたが、いずれかの受容体単独では誘発されなかった。さらに、ＩＦＮγ、ＴＮＦ－α、ＭＩＰ－１αおよびＭＩＰ－１βの発現は、ＣＤ２８Ｈブロッキング抗体の存在下で減少し（図６Ｃ～図６Ｆ）、ＣＤ２８Ｈを介した刺激が確認された。ＣＤ４８およびＢ７Ｈ７は、単独ではごく一部のＮＫ細胞を刺激してＭＩＰ－１αを発現させたが、Ｂ７Ｈ７およびＣＤ４８は、一緒に強いＮＫ細胞応答を誘導した－ＮＫ細胞の約７０％がＭＩＰ－１αを発現し、ＮＫ細胞の約１０％が少なくとも３つの異なる応答を有した（図５Ｂ）。脱顆粒ＮＫ細胞およびＩＦＮγ産生ＮＫ細胞が部分的にのみ重複していたことは、注目に値する。さらに、ＣＤ２８Ｈに対するブロッキング抗体は、すべてのＮＫ応答を減弱させた。

【0133】

ＣＤ２８Ｈは、ＣＤ１６媒介ＡＤＣＣを増強する：ＣＤ２８ＨによるＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣの可能な増強を調べるために、Ｓ２細胞に対するウサギ抗血清を用いてアッセイを行った（Ｂｒｙｃｅｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、１０７：１５９～１６６、２００６）。Ｓ２細胞を抗Ｓ２血清でプレコートした後、初代ヒトＮＫ細胞とインキュベートした。Ｓ２細胞におけるＢ７Ｈ７の発現は、ＡＤＣＣアッセイにおいてＮＫ活性化を増強したが、Ｂ７Ｈ７およびＣＤ４８の両方を発現すると、ＮＫ脱顆粒をさらに増加させた（図７Ａおよび図７Ｂ）。ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣは、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）およびセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）などの治療用抗体の作用機序において中心的な役割を果たす（Ｓｃｏｔｔら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ、１２：２７８～２８７、２０１２）。ＮＫ細胞の標的として一般的に使用される３つのＭＨＣクラスＩ欠損細胞株を、Ｂ７Ｈ７の発現について調べた（図８Ａ）。Ｂ７Ｈ７は、Ｋ５６２細胞によって発現されたが、Ｄａｕｄｉ細胞や２２１細胞では、発現されなかった（図８Ａ）。これらの３つの細胞株のうち、２２１のみがＣＤ４８を発現した（図８Ａ）。本発明者らは、Ｂ７Ｈ７の発現のために２２１およびＤａｕｄｉ細胞にレンチウイルスを形質導入し、Ｂ７Ｈ７の明るく均一な発現を得た（図８Ｂ）。新たに単離されたヒトＮＫ細胞は、Ｂ７Ｈ７を発現する２２１細胞（２２１．Ｂ７Ｈ７）を、トランスフェクトされていない２２１細胞（図８Ｃ）よりも効率的に溶解した。２２１．Ｂ７Ｈ７の向上した溶解は、ＣＤ２８Ｈ特異的ｍＡｂによってブロックされた（図８Ｃ）。Ｄａｕｄｉ細胞および２２１細胞は、両方ともＣＤ２０^＋リンパ芽球様Ｂ細胞株（図７Ｃ）であるので、本発明者らはリツキシマブを使用してＡＤＣＣを誘導した。リツキシマブ誘導性ＡＤＣＣにおける標的細胞の特異的溶解は、Ｂ７Ｈ７の発現によって増加し、殺傷の増強は、ＣＤ２８Ｈ抗体によって特異的にブロックされた（図７Ｄおよび図７Ｅ）。本発明者らは、ＣＤ２８Ｈ－Ｂ７Ｈ７相互作用が、初代ＮＫ細胞による２２１およびＤａｕｄｉ細胞の自然殺傷、ならびにＡＤＣＣによる２２１およびＤａｕｄｉ細胞の溶解を増強すると結論付けた。

【0134】

Ｔｙｒ１９２は、ＣＤ２８Ｈ媒介ＮＫ細胞活性化に必須である：ＣＤ２８Ｈ細胞質尾部は、３つのチロシンを含み、これらは潜在的に活性化シグナルの形質導入に寄与し得る。全ての可能な組み合わせにおいて、各チロシンをフェニルアラニンで置き換えた。ＣＤ２８Ｈ野生型および各変異体を、チロシンホスファターゼ阻害剤の過バナジン酸塩で処理した後、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から免疫沈降させた。チロシンリン酸化は、Ｙ１９２またはＹ２２２のいずれかの変異によって大きく減少した（図９Ａ）。変異体をＮＫ細胞株で発現させることにより、各変異体の機能を試験した。ＣＤ２８Ｈ^－２Ｂ４^＋細胞株ＮＫＬにおける野生型ＣＤ２８Ｈの外因性発現は、Ｐ８１５細胞を用いたリダイレクトされたＡＤＣＣアッセイで示されるように、ＣＤ２８Ｈおよび２Ｂ４の相乗作用を再現した（図９Ｂ）。ＮＫ細胞のＣＤ２８Ｈ依存性活性化に対する各チロシンの寄与を試験するために、ＣＤ２８Ｈ変異体をＮＫＬ細胞で発現させた（図１０）。Ｙ１９２（Ｙ１９２Ｆ）の単一部位変異は、ＣＤ２８Ｈおよび２Ｂ４による相乗的活性化を無効にした（図９Ｃ）。野生型ＣＤ２８ＨおよびＣＤ２８Ｈ変異体を発現するＮＫＬ細胞による２２１．Ｂ７Ｈ７細胞の溶解も調べた。リダイレクトされた細胞傷害性アッセイと一致して、Ｂ７Ｈ７発現による２２１細胞の殺傷の増強も変異Ｙ１９２Ｆで失われ（図９Ｄ）、Ｙ１９２のリン酸化がＮＫ細胞活性化に必須であり得ることを示した。Ｙ１９２Ｆ変異は免疫シナプスでのＣＤ２８Ｈの蓄積を変化させず（図９Ｅおよび図９Ｆ）、ＣＤ２８Ｈの蓄積と細胞傷害性をシグナル伝達するその能力が脱共役であることを示唆した。ＮＫ細胞免疫学的シナプスの形成には複数の段階がある（Ｏｒａｎｇｅ Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７１３－７２５、２００８）。シナプスにおける変異体Ｙ１９２Ｆの蓄積は、Ｙ１９２によって特異的に引き起こされるシグナルがシナプス形成のその段階に必要でないことを示した。細胞質尾部の３つのチロシン残基に加えて、ＣＤ２８Ｈは、プロリンリッチドメインも含み、これはシグナル伝達に関与し得る。

【0135】

ＣＤ２８Ｈ－ＣＡＲを有するＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ａによる阻害を無効にすることによってＢ７Ｈ７^＋腫瘍細胞を死滅させる：ＣＤ２８ＨリガンドＢ７Ｈ７の発現は、活性化骨髄性細胞（Ｚｈｕら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．４；２０４３、２０１３；Ｚｈａｏら、ＰＮＡＳ １１０：９８７９－９８８４、２０１３）および腫瘍細胞（Ｊａｎａｋｉｒａｍら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２３５９－２３６６、２０１５）に限定される。本発明者らは、ＬＰＳまたはポリ（Ｉ：Ｃ）によって活性化された単球およびＤＣ上のＢ７Ｈ７の限界発現（marginal expression）を検出した（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。腫瘍組織におけるＢ７Ｈ７のより広範な発現は、本発明者らに、がん免疫療法において腫瘍を標的とするＣＤ２８Ｈ－Ｂ７Ｈ７相互作用を利用する可能性を探求する動機を与えた。本発明者らは、完全長または細胞質ドメイン切断型（ΔＣＤ）ＣＤ２８ＨをＴＣＲ ζ鎖のシグナル伝達ドメイン（図１２Ａおよび配列番号１～４）と融合することによって、２つのＣＤ２８Ｈ ＣＡＲを構築した。ＮＫＬ細胞におけるＣＤ２８Ｈ－ＣＡＲの発現（図１２Ａ）は、トランスフェクトされていない２２１細胞に対する細胞傷害活性を有意に変化させず（図１２Ｂ）、２２１．Ｂ７Ｈ７細胞の殺傷を増強した（図１２Ｃ）。非古典的ＭＨＣ－Ｉ抗原ＨＬＡ－Ｅは、ＮＫ細胞上の阻害性受容体ＮＫＧ２Ａに結合し、ＮＫ細胞活性化を抑制する（Ｌｏｎｇら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｎｕｏｌ．３１：２２７－２５８、２０１３）。ＣＤ２８ＨまたはＣＤ２８Ｈ－ＣＡＲがＮＫＧ２Ａ媒介阻害を克服することができるかどうかを試験するために、細胞表面にＨＬＡ－Ｅを発現する２２１．ＡＥＨ細胞をＢ７Ｈ７でトランスフェクトした（図１２Ｄ）。ＮＫＬ細胞は、ＮＫＧ２Ａを発現する（図１２Ｅ）。ＮＫＬ．ＣＤ２８ＨおよびＮＫＬ．ＣＤ２８Ｈ－ＣＡＲ細胞の２２１．ＡＥＨ細胞に対する細胞傷害性は、おそらくＮＫＧ２Ａによる阻害に起因して低かった（図１２Ｆ）。注目すべきことに、ＮＫＬ．ＣＤ２８Ｈ－ＴＣＲζ細胞は２２１．ＡＥＨ．Ｂ７Ｈ７細胞を死滅させ、ＮＫＧ２Ａ媒介阻害がＣＤ２８Ｈ－Ｂ７Ｈ７相互作用によって克服されたことを示した（図１２Ｇ）。ＮＫＬにおける野生型ＣＤ２８Ｈ単独またはＣＤ２８ＨΔＣＤ－ＴＣＲζキメラ受容体の発現は、ＮＫＧ２Ａ阻害を克服せず、ＣＤ２８Ｈ－ＴＣＲζキメラにおけるＣＤ２８Ｈの必須の共刺激機能を示した（図１２Ｇ）。Ｂ７Ｈ７^＋ホジキンリンパ腫細胞株ＨＤＬＭ－２を使用して、ＣＤ２８Ｈ－ＣＡＲの抗腫瘍活性をさらに試験した（図１２Ｈ）。ＨＬＡ－Ｅ（図１２Ｈ）を発現するＨＤＬＭ－２細胞を、ＮＫＧ２Ａに対するｍＡｂとのＮＫＧ２Ａ－ＨＬＡ－Ｅ相互作用をブロックした後にのみ、ＣＤ２８Ｈ^＋ＮＫＧ２Ａ^＋ＫＨＹＧ－１ ＮＫ細胞株によって溶解した（図１２Ｉ）。しかしながら、完全長ＣＤ２８Ｈを有するＣＡＲを発現するＮＫＬ細胞は、Ｂ７Ｈ７^＋ＨＬＡ－Ｅ^＋ＨＤＬＭ－２腫瘍細胞の効率的な殺傷を達成し（図１２Ｊ）、ＣＤ２８Ｈ－ＣＡＲが、抗腫瘍活性および治療潜在性を有することを示した。
考察

【0136】

本発明者らは、循環血液中のほとんどのＮＫ細胞が、Ｔ細胞に記載されているＣＤ２８受容体ファミリーのメンバーであるＣＤ２８Ｈを発現することを示した。ＣＤ２８Ｈと２Ｂ４との共結合は、脱顆粒、標的細胞溶解、ならびにサイトカインおよびケモカインの発現のための新たに単離されたＮＫ細胞の相乗的活性化をもたらした。ＣＤ２８Ｈは、ＮＫ細胞共活性化受容体のファミリーへの付加であり、２Ｂ４およびＮＫｐ４６と相乗作用するが、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２、またはＤＮＡＭ－１とは相乗作用しない。ＣＤ２８Ｈ発現は、ＩＬ２による長期活性化中にオフになる。ＣＤ２８Ｈの下方調節もまた、抗原刺激後のヒトＴ細胞において観察されている。それにもかかわらず、一般に「休止」と呼ばれる末梢血から新たに単離されたＮＫ細胞は、ＩＬ２およびＩＬ１５の非存在下でさえ完全に機能的である。ＣＤ２８Ｈとの共結合はまた、ＣＤ１６媒介ＮＫ細胞脱顆粒および細胞傷害性を増強した。相乗作用を必要とする共活性化受容体とは異なり、ＮＫ細胞におけるＣＤ１６シグナル伝達は細胞傷害性を活性化するのに十分である。２Ｂ４、ＣＤ２、ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ－１などの他の活性化受容体もＡＤＣＣを増強することが報告されている。

【0137】

本発明者らは、Ｂ７Ｈ７が活性化骨髄性細胞上で発現することを示した。ＣＤ４８が造血細胞上で広く発現されるという事実を考慮すると、活性化骨髄性細胞上のＢ７Ｈ７の発現は、ＮＫ細胞とＡＰＣとの間の相互作用に寄与し得る。ＣＤ２８Ｈと他の活性化受容体との間の他の潜在的相乗作用の関与は、ＮＫ－ＡＰＣ相互作用および免疫ホメオスタシスの調節に別の複雑さを重ねるかもしれない。実際、ＮＫｐ３０およびＮＫＧ２Ｄなどの活性化受容体は、ＮＫ－ＤＣ相互作用の調節因子として報告されている。Ｂ７Ｈ７は、その共刺激機能に加えて、Ｔ細胞に対する共阻害効果も有し得、免疫チェックポイント阻害剤として提案されている。この実施例に関連して、脱顆粒、標的細胞溶解およびサイトカイン発現を含む、ここで実施された機能的アッセイにおいて、ＮＫ細胞株および初代ＮＫ細胞に対するＢ７Ｈ７の阻害効果はなかった。しかしながら、ＰＤ－１およびＬＡＧ－３などのチェックポイント共阻害受容体の発現は、通常、活性化後にＮＫ細胞上で誘導または上方調節される。Ｂ７Ｈ７の共阻害受容体の発現は、活性化または他の刺激によってＮＫ細胞上で誘導される可能性がある。

【0138】

本発明者らは、ＣＤ２８Ｈを介したＮＫ細胞の活性化に対する細胞株上に発現されるＢ７Ｈ７の寄与を試験した。変異体細胞株２２１は、ＮＫ細胞阻害性受容体に対するいくつかのＭＨＣ－Ｉリガンドの喪失のためにＮＫ細胞の細胞傷害性に感受性がある。２２１細胞におけるＢ７Ｈ７の発現は、それらをＮＫ細胞に対してさらにより感受性にした。これは、ＣＤ２８Ｈと２Ｂ４との相乗作用によって説明することができ、２Ｂ４のリガンドであるＣＤ４８が２２１で発現される。しかしながら、ＨＬＡ－Ｅも発現した２２１細胞上のＢ７Ｈ７の発現は、ＮＫ細胞株上に発現したＮＫＧ２Ａによる阻害を克服するのに十分ではなく、これはＮＫ細胞上のＭＨＣ－Ｉ特異的受容体の優勢な阻害機能と一致する。

【0139】

ＣＤ２８Ｈと、２Ｂ４およびＮＫｐ４６との相乗作用のシグナル伝達の根拠は不明である。本発明者らは、ＣＤ２８Ｈの細胞質尾部の３つのチロシン残基のうちのただ１つ（チロシン１９２）が、ＮＫ細胞の細胞傷害性を共活性化するのに必要かつ十分であることを示した。フェニルアラニンによる他の２つのチロシンの置換は、ＣＤ２８Ｈ媒介ＮＫ細胞活性化を損なわなかった。チロシン１９２および隣接アミノ酸は、アダプターＧｒｂ２のＳＨ２ドメインおよび関連タンパク質の結合を予測する配列モチーフ（ＹｘＮ）を形成する。

【0140】

本発明者らは、ＣＤ２８ＨをＴＣＲζの細胞内ドメインに融合することによって、ＣＤ２８Ｈ自体をＣＡＲとして使用する可能性を試験した。ＮＫＬ細胞におけるＣＤ２８Ｈ－ＴＣＲζ ＣＡＲの発現は、ＣＤ２８Ｈを発現するＮＫＬ細胞による溶解に対して既に非常に感受性がある２２１．Ｂ７Ｈ７細胞のより高い感受性をもたらさなかった。しかしながら、ＮＫＬ細胞におけるＣＤ２８Ｈ－ＴＣＲζ ＣＡＲは、Ｂ７Ｈ７およびＨＬＡ－Ｅを共発現する２２１細胞で示されるように、ＮＫＧ２Ａによる阻害に対する完全な耐性をもたらした。Ｂ７Ｈ７とＨＬＡ－Ｅの両方を天然に発現するホジキンリンパ腫腫瘍細胞ＨＤＬＭ－２を用いても、阻害に対する耐性が観察された。予想通り、ＣＤ２８Ｈ^－ＮＫＧ２Ａ^＋ＮＫＬ細胞はＨＤＭＬ－２細胞を死滅させなかった。注目すべきことに、ＮＫＬ細胞におけるＣＤ２８Ｈ－ＴＣＲζ ＣＡＲの発現は、ＨＤＭＬ－２細胞の非常に効率的な溶解をもたらしたが、ＣＤ２８Ｈ細胞質尾部もＴＣＲζ鎖も、それら自身では阻害を克服することができなかった。ここで、ＣＤ２８Ｈの天然の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を、ＮＫ細胞において使用するためのＣＡＲ成分のリストに加えることができる。

【0141】

ＮＫ細胞上のＭＨＣ－Ｉ特異的阻害性受容体によるシグナル伝達を克服するために提案された解決策には、ＮＫ細胞におけるＣＡＲ発現に付随する阻害性受容体のサイレンシング、またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞と抗体による阻害性受容体ＫＩＲおよびＮＫＧ２Ａの遮断とを組み合わせることが含まれ、その一部は既に臨床で使用されている。より単純でより低コストのアプローチは、ＨＬＡ－ＣおよびＨＬＡ－Ｅを発現する腫瘍細胞の状況においてＫＩＲおよびＮＫＧ２Ａによる阻害を克服するＮＫ仕様のＣＡＲを設計することである。一例として、ＣＤ２８Ｈ－ＴＣＲζ ＣＡＲは、ＨＬＡ－Ｅ^＋腫瘍細胞との接触中にＮＫＧ２Ａによる阻害に対して完全に耐性があった。要約すると、本発明者らは、ＣＤ２８ＨがＮＫ細胞の活性化受容体であることを示し、本発明者らは、阻害性受容体によるシグナル伝達を克服し、Ｂ７Ｈ７を発現する腫瘍を標的とするために、ＮＫ－ＣＡＲの設計のためにＣＤ２８Ｈを利用する可能性を高めた。
実施例２
ＮＫ細胞における阻害抵抗性キメラ抗原受容体は強力かつ持続的な活性化シグナルをもたらす
材料および方法

【0142】

細胞：ヒトＮＫ細胞の単離を前記のように行った。ＮＫＬ細胞株は、Ｍ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、インディアナポリス、インディアナ州）から得て、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ）を含むＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。Ｐ８１５細胞（ＡＴＣＣ）、７２１．２２１細胞（２２１細胞と呼ばれる）、およびＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｃ（Ｃｗ１５）トランスフェクトした２２１細胞を、１０％熱不活性化ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。

【0143】

プラスミド、レンチウイルス産生：ＣＡＲ構築物をｇＢｌｏｃｋｓ（ＩＤＴ）として直接合成するか、または既存の鋳型からＰＣＲによって増幅し、次いでｐＣＤＨ－ＥＦ１－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位にクローニングした。全てのプラスミド構築は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して行った。レンチウイルスの作製のために、低継代Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に、以前に記載されたようにＰＥＩ Ｍａｘ（ポリエチレンイミン）をトランスフェクトした（Ｚｈｕａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．７：９３９－９５１、２０１９）。Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞からの培養培地をトランスフェクションの２日後に回収し、０．４５μＭフィルターに通した。培養培地を形質導入に直接使用するか、またはＰＥＧ－ｉｔ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して濃縮した。

【0144】

細胞傷害性アッセイ：カルセイン－ＡＭ放出アッセイを使用して、ＮＫ細胞による標的細胞の溶解を決定した。簡潔には、完全培地中の最終濃度１０^６／ｍｌの標的細胞を、１５μＭカルセイン－ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。完全培地で２回洗浄した後、標識された標的細胞を９６－ウェル－プレートに１０^４／ウェルで添加した。エフェクターＮＫ細胞を異なるＥ：Ｔ比で添加し、４時間インキュベートした。標的細胞溶解を、プレートリーダー（Ｅｎｓｐｉｒｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ ａｎｄ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｐｌｕｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州）によって測定した上清中の放出されたカルセイン－ＡＭの蛍光によって決定した。

【0145】

ビーズ刺激：１細胞あたり４ビーズの比で、抗体被覆ヤギ抗マウスＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を刺激した。ビーズコーティングに使用される抗体には、Ｍｙｃタグ抗体（９Ｂ１１、マウスＩｇＧ２ａ、細胞シグナル伝達）、ＮＫＧ２Ａ抗体（Ｚ１９９、マウスＩｇＧ２ｂ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、対照マウスＩｇＧ２ｂ（ＭＯＰＣ－１４１、Ｓｉｇｍａ）および対照マウスＩｇＧ２ａ（ＵＰＣ－１０、Ｓｉｇｍａ）が含まれた。１０^７個のビーズを、異なる組み合わせ：１μｇのｍＩｇＧ２ａ＋１μｇのｍＩｇＧ２ｂ、１μｇのｍＩｇＧ２ａ＋１μｇの抗ＮＫＧ２Ａ、１μｇの抗Ｍｙｃタグ＋１μｇのｍＩｇＧ２ｂ、または１μｇの抗Ｍｙｃタグ＋１μｇの抗ＮＫＧ２Ａの２μｇの全ＩｇＧで、３７℃で３０分間コーティングした。。ビーズを１％ ＦＣＳハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、コーニング）で洗浄して過剰な抗体を除去し、同じ緩衝液に再懸濁した。予冷したビーズおよび細胞を氷上で混合し、３７℃の水浴中で１０分間または４５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、溶解した後、ウエスタンブロットによって分析した。
結果および考察

【0146】

本発明者らは、ＣＤ２８Ｈが強力なＮＫ細胞共活性化受容体であり、ＣＤ２８ＨおよびＴＣＲζの両方のシグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体がＮＫＧ２Ａ媒介阻害に耐性であることを実証した（Ｚｈｕａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．７：９３９－９５１、２０１９）。休止ヒトＮＫ細胞は、ＮＫ活性化受容体の相乗的組み合わせによって活性化される（Ｂｒｙｃｅｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、１０７：１５９～１６６、２００６；Ｌｏｎｇら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：２２７－２５８、２０１３）。組み合わせの１つとして、ＣＤ２８Ｈと２Ｂ４との間の相乗作用は、堅牢なＮＫ細胞活性化および脱顆粒を誘導することができる（図１３Ａ）。本発明者らは、ＣＤ２８Ｈおよび２Ｂ４のシグナル伝達ドメインをＴＣＲζ細胞質ドメインと組み合わせてＣＡＲ構築物にすると、強力なＮＫ細胞活性化を誘導することができ、これは阻害性シグナルに対するより強い耐性を達成し得ると仮定した。本発明者らは、ＣＤ１９^＋がん細胞を標的化するための細胞外ドメインとして、Ｎ末端ＭｙｃタグおよびＣＤ８αヒンジを有する抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを使用してＣＡＲ構築物を設計した。膜貫通ドメインは、Ｔ－ＣＡＲについてはＣＤ２８由来であり、ＮＫ仕様のＣＡＲについてはＣＤ２８Ｈ由来であった。細胞内ドメインは、ＮＫ受容体ＣＤ２８Ｈおよび２Ｂ４、Ｔ細胞受容体ＣＤ２８および４－１ＢＢ由来の１～３個のシグナル伝達ドメインの組み合わせ、ならびにＴ細胞受容体（ＴＣＲζ）のζ鎖から作製された（図１３Ｂ）。ＣＡＲ構築物を、ＮＫＧ２Ａの内因性発現およびＫＩＲ２ＤＬ１のトランスジェニック発現を有するＮＫＬ．２ＤＬ１細胞にトランスフェクトした（図１４）。ＮＫＬ細胞上の異なるＣＡＲ構築物間で同様の発現が達成された（図１３Ｃ）。ＭＨＣ－Ｉ陰性ＣＤ１９^＋７２１．２２１リンパ芽球細胞株（ここでは２２１と呼ぶ）を標的細胞として使用する殺傷アッセイにより、ＣＤ２８Ｈ、２Ｂ４およびＴＣＲζシグナル伝達ドメインの組み合わせを含有するＣＤ１９．ＣＡＲ２が、２２１リンパ芽球に対する堅牢ななＮＫ細胞細胞傷害性を誘導し、ＣＤ２８Ｈおよび２Ｂ４の両方のシグナル伝達ドメインがこの強い活性に寄与することが実証された（図１３Ｄ）。第三世代Ｔ細胞ＣＡＲ（Ｔ－ＣＡＲとして示される）と比較して、ＣＤ１９．ＣＡＲ２（例えば、配列番号１２）は、２２１標的細胞に対してより高い腫瘍溶解有効性を示した（図１３Ｅ）。

【0147】

ＭＨＣ－Ｉに対する受容体によって媒介される阻害に対するＣＡＲ構築物の耐性を試験するために、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｃでトランスフェクトした２２１細胞を細胞傷害性アッセイに使用した。ＣＤ１９．ＣＡＲ２は、ＮＫＧ２ＡまたはＫＩＲ２ＤＬ１によって媒介される阻害および誘導されるＭＨＣ－Ｉ^＋リンパ芽球標的細胞の溶解を克服することができ、両方の共刺激ドメインがこの阻害耐性応答に必要であった（図１３Ｄ）。ＣＤ１９．ＣＡＲ２と比較して、ＮＫＬ．２ＤＬ１細胞で発現される第３世代ＣＤ１９．Ｔ－ＣＡＲ（ＣＤ２８－４１ＢＢ－ζ）は、ＮＫＧ２ＡおよびＫＩＲ２ＤＬ１による阻害を克服するその能力は、はるかに弱かった（図１３Ｅ）。細胞外抗原標的化ドメインとしてＣＤ１９ ｓｃＦｖを使用するＣＡＲ構築物に加えて、本発明者らはまた、Ｂ７Ｈ７^＋腫瘍細胞を標的化するための細胞外ドメインとしてＣＤ２８Ｈ受容体自体を使用してＣＡＲを試験した（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。殺傷アッセイを、Ｂ７Ｈ７およびＭＨＣ－Ｉ（ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｃ）トランスフェクトした２２１リンパ芽球（Ｚｈｕａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．７：９３９－９５１、２０１９）を使用して行った。ＣＤ２８Ｈ．Ｔ－ＣＡＲと比較して、ＣＤ２８Ｈ．ＣＡＲ２（例えば、配列番号２）は、ＮＫＧ２ＡまたはＫＩＲ２ＤＬ１のいずれかによる阻害に対してはるかに耐性であるＮＫ細胞活性化を誘導した（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）。さらに、ＣＤ２８Ｈ．ＣＡＲ２は、２Ｂ４およびＴＣＲζの細胞質ドメインに融合されたシグナル伝達分子ＤＡＰ１０の動員について、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメインから構成される別のＮＫ仕様のＣＡＲ（ＣＡＲ３）よりも優れた阻害耐性活性を示した（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）。このＮＫＧ２Ｄ－２Ｂ４－ζ膜貫通およびシグナル伝達ドメイン組成物（ＣＡＲ３）は、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞におけるメソテリン標的化ＣＡＲの一部として以前に試験された（Ｌｉら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、２３：１８１～１９２ ｅ５、２０１８）。

【0148】

ＣＡＲを介して伝達される活性化シグナル形質導入を調べるために、ＣＤ１９．ＣＡＲを発現するＮＫＬ細胞を、Ｎ末端ｍｙｃタグを架橋することによってＣＡＲを介して活性化シグナルを誘導するビーズ結合ｍｙｃタグ抗体（Ｍｙｃビーズ）によって刺激した（図１６Ａ）。本発明者らは、ＣＤ１９．ＣＡＲを発現するＮＫＬ細胞の溶解物におけるホスホリパーゼＣγ１（ＰＬＣ－γ１）Ｔｙｒ７８３およびマイトジェン関連タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ／Ｅｒｋ）のリン酸化を評価した。ＴＣＲζのみの細胞質シグナル伝達ドメインを担持するＣＡＲ６を除いて、各ＣＡＲを介した刺激後に、ＰＬＣ－γ１およびＥＲＫのリン酸化が検出可能であった（図１６Ｂおよび図１３Ｂ）。試験したすべてのＣＡＲの中で、ＣＡＲ２は、ＰＬＣ－γ１およびＥｒｋの両方の最も強いリン酸化を誘導した（図１６Ｂ、図１６Ｃおよび図１５Ａ）。ＮＫＧ２ＡもしくはＭｙｃタグのいずれかまたは両方に対する抗体とカップリングされたビーズによる刺激を使用して、異なるＣＡＲの阻害に対する耐性を試験した（図１６Ａ）。阻害に対する最も強い耐性は、ＮＫＧ２ＡとＣＡＲ２とを共架橋した後に検出された。実質的なＰＬＣ－γ１およびＥｒｋリン酸化も保持されたが、ＮＫＧ２ＡおよびＣＡＲ４は架橋された（図１６Ｂおよび図１６Ｃ）。Ｔ－ＣＡＲと比較して、ＣＡＲ２およびＣＡＲ４の両方が、阻害に対してより抵抗性であるＮＫ細胞活性化シグナルを誘導した（図１６Ｂおよび図１６Ｃ）。さらに、持続的なＥｒｋリン酸化が、Ｔ－ＣＡＲの活性化と比較してＣＡＲ２媒介ＮＫ細胞活性化において検出され、より持続的な活性化シグナルがＣＡＲ２によって産生されたことを示した（図１６Ｄ）。この結論は、Ｔ－ＣＡＲよりもＣＡＲ２の架橋後により持続的なカルシウム動員を示したカルシウム動員アッセイによってさらに裏付けられた（図１６Ｅ）。

【0149】

ここで、本発明者らは、ＣＤ２８Ｈ－２Ｂ４－ＴＣＲζの融合シグナル伝達ドメインを含有するＮＫ仕様のＣＡＲ２が、ＮＫ細胞における発現のための第３世代Ｔ－ＣＡＲよりも効果的なＣＡＲ構築物であることを実証した。ＣＡＲ２は、Ｔ－ＣＡＲよりも強い細胞傷害性および活性化シグナルを誘導した。重要なことに、ＣＡＲ－２は、ＮＫ細胞がＭＨＣクラスＩの受容体によって媒介される阻害を克服し、ＭＨＣクラスＩ^＋がん細胞を死滅させるのを促進する阻害耐性活性化シグナルを誘発した。いくつかの形質転換がん細胞は、ＭＨＣクラスＩを下方調節してＴ細胞媒介監視を回避するが、多くの腫瘍細胞は、依然としてＭＨＣクラスＩの実質的な発現を保持しており、これはＮＫＧ２Ａまたは阻害性ＫＩＲに関与し、ＮＫ細胞の抗がん応答を制限し得る。これらの結果は、Ｔ細胞による細胞治療とは異なり、ＮＫ細胞における発現のためのＣＡＲ構築物の阻害耐性特性の評価が重要であることを裏付けている。ＣＡＲ２シグナル伝達ドメインの設計は、活性化受容体２Ｂ４とＣＤ２８Ｈとの間の強い相乗作用に基づいていた。
実施例３
ＣＡＲ有効性のインビボ評価

【0150】

この実施例は、マウス異種移植モデルにおいてインビボで１またはそれを超える開示されたＣＡＲの有効性を評価するために使用され得る方法を記載する。しかしながら、当業者は、これらの特定の方法から逸脱する方法を使用してＣＡＲの有効性をインビボで試験することもできることを理解する。

【0151】

ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒγ^ｎｕｌｌマウス（ＮＳＧマウスとしても知られている）に、１０^５個～１０^６個のルシフェラーゼ発現ＮＡＬＭ－６ Ｂ－ＡＬＬ細胞を注射する。ＮＫ細胞は、免疫磁気法を用いた陽性および／または陰性選択によって健康なドナーのＰＢＭＣから単離される。増やしたＮＫ細胞に、ＣＤ１９－ＣＡＲを含むレトロウイルスベクター、例えば本明細書に記載のもの（例えば、配列番号１、５、１１および１５）を形質導入する。１０^６個～１０^７個の形質導入および増やしたＮＫ細胞を含む組成物を、腫瘍担持マウスに静脈内投与する。ＣＡＲ発現ＮＫ細胞のインビボ増殖および持続性は、ヒトＩＬ－２またはＩＬ－１５の投与によって支持される。腫瘍量を生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって追跡する。ＣＡＲのインビボ有効性を、腫瘍担持ＮＳＧマウスの腫瘍量および全生存期間（ＯＳ）の両方によって評価する。
実施例４
ＣＤ１９－ＣＡＲ発現ＮＫ細胞によるＢ細胞リンパ腫の処置

【0152】

この実施例は、ＣＤ１９－ＣＡＲが形質導入されたＮＫ細胞で、Ｂ細胞リンパ腫を有する対象を処置するために使用することができる方法を記載する。しかしながら、当業者は、これらの特定の方法から逸脱する方法もまた、Ｂ細胞リンパ腫を有する対象を首尾よく処置するために使用され得ることを理解する。さらに、同様の方法を使用して、他のがんを有する対象を他のＣＡＲ発現ＮＫ細胞で処置することができる。

【0153】

Ｂ細胞リンパ腫を有する対象は、末梢血単核細胞を採取するためにアフェレーシスを受ける。ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ５６陽性／ＣＤ３陰性細胞）は、免疫磁気法を用いた陽性および／または陰性選択によってＰＢＭＣから単離され、本明細書に記載のもの（例えば、配列番号１、５、１１、１５および１９）などのＣＤ１９－ＣＡＲを含むレトロウイルスベクターで形質導入される。形質導入されたＮＫ細胞は、後の使用のために凍結保存することができ、または対象への投与のために製剤化することができる（例えば、薬学的に許容され得る担体中）。１０^６個～１０^１２個の増やしたＮＫ細胞を含む組成物を対象に静脈内投与する。

【0154】

本開示の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮して、例示された実施形態は単なる例であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを認識されたい。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの請求項の範囲および精神の範囲内に入るすべてを本発明者らの発明として主張する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
キメラ抗原受容体であって、
（ａ）標的結合ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）ＣＤ２８ホモログ（ＣＤ２８Ｈ）由来の第１の細胞内シグナル伝達ドメインおよび第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインであって、前記第１および第２の細胞内シグナル伝達ドメインがどちらの順序であってもよい、細胞内ドメインと、を含むキメラ抗原受容体。
(項目２)
前記ＣＤ２８Ｈ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号２のアミノ酸１７２～２８２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のキメラ抗原受容体。
(項目３)
前記ＣＤ２８Ｈ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号２のアミノ酸１７２～２８２のアミノ酸配列を含む、項目２に記載のキメラ抗原受容体。
(項目４)
前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインが、２Ｂ４、ＴＣＲζ、ＦｃεＲ１γまたはＤＡＰ１２に由来する、項目１～３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
(項目５)
前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζに由来する、項目４に記載のキメラ抗原受容体。
(項目６)
前記ＴＣＲζ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号２のアミノ酸２８３～３９５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目５に記載のキメラ抗原受容体。
(項目７)
前記ＴＣＲζ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号２のアミノ酸２８３～３９５のアミノ酸配列を含む、項目６に記載のキメラ抗原受容体。
(項目８)
前記第２の細胞内シグナル伝達ドメインが、２Ｂ４に由来する、項目４に記載のキメラ抗原受容体。
(項目９)
前記２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１０のアミノ酸１７２～２９１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目８に記載のキメラ抗原受容体。
(項目１０)
前記２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１０のアミノ酸１７２～２９１のアミノ酸配列を含む、項目９に記載のキメラ抗原受容体。
(項目１１)
前記細胞内ドメインが、前記膜貫通ドメインと前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインとの間に細胞内領域をさらに含む、項目１～１０のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
(項目１２)
前記膜貫通ドメインおよび細胞内領域が、ＣＤ１６、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４またはＫＩＲ２ＤＳ４に由来する、項目１１記載のキメラ抗原受容体。
(項目１３)
キメラ抗原受容体であって、
（ａ）標的結合ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）ＣＤ２８ホモログ（ＣＤ２８Ｈ）由来の第１の細胞内シグナル伝達ドメインと、２Ｂ４由来の第２の細胞内シグナル伝達ドメインと、第３の細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、前記第１、第２、および第３の細胞内シグナル伝達ドメインが、任意の順序であり得る、細胞内ドメインと、を含む、キメラ抗原受容体。
(項目１４)
前記ＣＤ２８Ｈ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号２のアミノ酸１７２～２８２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１３に記載のキメラ抗原受容体。
(項目１５)
前記ＣＤ２８Ｈ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号２のアミノ酸１７２～２８２のアミノ酸配列を含む、項目１４に記載のキメラ抗原受容体。
(項目１６)
前記２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１０のアミノ酸１７２～２９１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１３～１５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
(項目１７)
前記２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号１０のアミノ酸１７２～２９１のアミノ酸配列を含む、項目１６に記載のキメラ抗原受容体。
(項目１８)
前記第３の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζ、ＦｃεＲ１γまたはＤＡＰ１２に由来する、項目１３～１７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
(項目１９)
前記第３の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲζに由来する、項目１８に記載のキメラ抗原受容体。
(項目２０)
前記標的結合ドメインが、ＣＤ１９ ｓｃＦｖまたはＣＤ２８Ｈ細胞外ドメインを含む、項目１～１９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
(項目２１)
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８Ｈ膜貫通ドメインを含む、項目１～１０または１３から２０のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
(項目２２)
ヒンジドメインをさらに含み、前記ヒンジドメインが、前記標的結合ドメインに対してＣ末端であり、前記膜貫通ドメインに対してＮ末端である、項目１～２１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
(項目２３)
前記ヒンジ領域が、ＣＤ８αヒンジ領域を含む、項目２２に記載のキメラ抗原受容体。
(項目２４)
アミノ末端シグナル配列をさらに含む、項目１～２３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
(項目２５)
前記シグナル配列が、ＣＤ８αシグナル配列である、項目２４記載のキメラ抗原受容体。
(項目２６)
前記ＣＤ８αシグナル配列が、配列番号１６のアミノ酸１～２１を含む、項目２５に記載のキメラ抗原受容体。
(項目２７)
配列番号２、６、１２、１６および２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１～２６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
(項目２８)
配列番号２、６、１２、１６および２０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、項目２７に記載のキメラ抗原受容体。
(項目２９)
項目１～２８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸分子。
(項目３０)
配列番号１、５、１１、１５、および１９のうちのいずれか１つの核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む、項目２９に記載の核酸分子。
(項目３１)
配列番号１、５、１１、１５および１９のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、項目３０に記載の核酸分子。
(項目３２)
項目２９～３１のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
(項目３３)
前記ベクターが、ウイルスベクターである、項目３２に記載のベクター。
(項目３４)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、項目３３に記載のベクター。
(項目３５)
項目１～２８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する細胞。
(項目３６)
項目２９～３１のいずれか一項に記載の核酸または項目３２～３４のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
(項目３７)
前記細胞が、ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞である、項目３５または項目３６に記載の細胞。
(項目３８)
項目２９～３１のいずれか一項に記載の核酸、項目３２～３４のいずれか一項に記載のベクター、または項目３５～３７のいずれか一項に記載の細胞および薬学的に許容され得る担体を含む組成物。
(項目３９)
がんを有する対象を処置する方法であって、有効量の項目３５～３７のいずれか一項に記載の細胞または項目３８に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
(項目４０)
前記医薬組成物が、ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞を含む、項目３９に記載の方法。
(項目４１)
前記ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞が、処置されている前記対象にとって自家である、項目４０に記載の方法。
(項目４２)
前記がんが、血液悪性腫瘍または固形腫瘍である、項目３９～４１のいずれか一項に記載の方法。
(項目４３)
前記血液悪性腫瘍が、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、または多発性骨髄腫である、項目４２に記載の方法。
(項目４４)
前記固形腫瘍が、乳がん、卵巣がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、膀胱がん、前立腺がん、または肉腫である、項目４２に記載の方法。
(項目４５)
手術、化学療法、放射線治療、またはそれらの２もしくはそれより多くの組み合わせで前記対象を処置することをさらに含む、項目３９～４４のいずれか一項に記載の方法。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図12-4】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図16-1】

【図16-2】

【図16-3】

【図17】

【配列表】

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