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特許7532371ＴＨＲΒ受容体アゴニスト化合物、およびその製造方法および使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-02
(45)【発行日】2024-08-13
(54)【発明の名称】ＴＨＲΒ受容体アゴニスト化合物、およびその製造方法および使用
(51)【国際特許分類】
C07D 403/12 20060101AFI20240805BHJP
A61K 31/53 20060101ALI20240805BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240805BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20240805BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240805BHJP
A61P 5/14 20060101ALI20240805BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240805BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240805BHJP
【ＦＩ】
C07D403/12 CSP
A61K31/53
A61P3/04
A61P3/06
A61P3/10
A61P5/14
A61P9/10 101
A61P35/00
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021533640
(86)(22)【出願日】2019-12-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-04
(86)【国際出願番号】 US2019066013
(87)【国際公開番号】W WO2020123827
(87)【国際公開日】2020-06-18
【審査請求日】2022-12-08
(31)【優先権主張番号】201811527414.4
(32)【優先日】2018-12-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】521076605
【氏名又は名称】ターンズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＴＥＲＮＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(72)【発明者】
【氏名】ユー，シャンハイ
(72)【発明者】
【氏名】リィ，ベン
【審査官】三木 寛
(56)【参考文献】
【文献】特表２０２１－５３１３２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５０１７５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０７５６５０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開平０２－２２５４８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０２８９８３７７（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２００４－５１７８５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００３／０６４３６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Kelly, Martha J. et al，Discovery of 2-[3,5-Dichloro-4-(5-isopropyl-6-oxo-1,6-dihydropyridazin-3-yloxy)phenyl]-3,5-dioxo-2,3,4,5-tetrahydro[1,2,4]triazine-6-carbonitrile (MGL-3196), a Highly Selective Thyroid Hormone Receptor β Agonist in Clinical Trials for the Treatment of Dyslipidemia，Journal of Medicinal Chemistry，2014年，Vol.57(10)，p.3912-3923
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ ４０３／１２
Ａ６１Ｋ ３１／５３
Ａ６１Ｐ ３／０４
Ａ６１Ｐ ３／０６
Ａ６１Ｐ ３／１０
Ａ６１Ｐ ５／１４
Ａ６１Ｐ ９／１０
Ａ６１Ｐ ３５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の式（Ｉ）：【化1】
［式中、
Ｒ１は、水素、シアノ、置換または非置換のＣ１－６アルキル、または、置換または非置換のＣ３－６シクロアルキルからなる群から選択され、該置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ、およびＣ１－６アルコキシからなる群から選択され、；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、または、置換または非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択され、該置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ、および、Ｃ１－６アルコキシからなる群から選択され；
環Ａは、置換または非置換のＣ ６－１０芳香族炭素環であり、該置換基は、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、－ＯＣＦ３、－ＮＨ２、－ＮＨＣ１－４アルキル、－Ｎ（Ｃ１－４アルキル）２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＣ１－４アルキル、－ＣＯＮ（Ｃ１－４アルキル）２、－ＮＨＣＯＣ１－４アルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、または、Ｃ３－６シクロアルキルからなる群から選択される１つ以上の基であり；および、
ハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒからなる群から選択される。］
で表される化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項2】
下記の式（ＩＩＩ）：【化2】
Ｒ１からＲ３は、請求項１で定義されたとおりであり；
Ｒ４は、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、－ＯＣＦ３、－ＮＨ２、－ＮＨＣ１－４アルキル、－Ｎ（Ｃ１－４アルキル）２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＣ１－４アルキル、－ＣＯＮ（Ｃ１－４アルキル）２、－ＮＨＣＯＣ１－４アルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、またはＣ３－６シクロアルキルからなる群から選択され；
ｍは、１～４の範囲の整数であり；および、
ハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒからなる群から選択される。］
で表される構造で示される化合物である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項3】
Ｒ４が、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、－ＯＣＦ３、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、またはＣ３－６シクロアルキルからなる群から選択され；および、ｍが、１～３の範囲の整数である、
請求項２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項4】
Ｒ４が、水素、ハロゲン原子、またはＣ１－３アルキルからなる群から選択され；および、ｍが、１、または２である、請求項３に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項5】
Ｒ１が、水素、シアノ、および、置換または非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択され、該置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ、およびＣ１－６アルコキシからなる群から選択され；および、ハロゲン原子が、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒからなる群から選択される、
請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項6】
Ｒ１が、シアノ、またはＣ１－３アルキルからなる群から選択される、請求項５に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項7】
Ｒ１が、シアノである、請求項６に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項8】
Ｒ２およびＲ３が、それぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項9】
Ｒ２およびＲ３が、ともに、Ｃｌである、請求項８に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項10】
化合物またはその薬学的に許容される塩が、下記の化合物：【化3】
【請求項11】
代謝関連疾患の治療薬の製造における、請求項１～１０のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項12】
代謝関連疾患が、肥満、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病、および、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、脂肪肝、アテローム性動脈硬化症、甲状腺機能低下症、および甲状腺癌からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
代謝関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、甲状腺機能低下症、および甲状腺癌からなる群から選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
治療有効量の請求項１～１０のいずれか１項に記載の化合物または薬学的に許容される塩、および、薬学的に許容される補助剤を含む、代謝関連疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項15】
代謝関連疾患が、肥満、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病、および、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、脂肪肝、アテローム性動脈硬化症、甲状腺機能低下症、および甲状腺癌からなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
代謝関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、甲状腺機能低下症、および甲状腺癌からなる群から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１２月１３日に出願された中国特許出願第２０１８１１５２７４１４．４号の優先権を主張し、その開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０１８年１２月１３日に出願された中国特許出願第２０１８１１５２７４１４．４号の優先権を主張し、その開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
技術分野
本発明は、医薬合成の分野、特に、ＴＨＲβ受容体の新規アゴニストとして機能し得る化合物、およびその製造方法および使用に関する。
本発明は、医薬合成の分野、特に、ＴＨＲβ受容体の新規アゴニストとして機能し得る化合物、およびその製造方法および使用に関する。
【背景技術】
【0003】
甲状腺ホルモン（ＴＨ）は、下垂体によって分泌される甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に応答して甲状腺で合成される。チロキシンは、体の成長、発達、代謝、および体のバランスを調節する上でかなり重要な役割を果たす。甲状腺ホルモンは、主に、３，５，３’－トリヨード－Ｌ－チロキシン（Ｔ３）とチロキシン（Ｔ４）の２つの種類がある。ヒトの体は主にＴ４を分泌する。末梢器官では、Ｔ４はデヨージナーゼ（脱ヨウ素酵素）によってより大きな活性を持つＴ３に変換される。甲状腺によって生成されるＴ３およびＴ４は、負のフィードバック制御下にある。甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）は、正常な甲状腺機能と甲状腺ホルモン分泌に関与している。甲状腺刺激ホルモンは下垂体前葉で合成され、その分泌は視床下部で合成される甲状腺放出ホルモン（ＴＲＨ）によって制御される。
【0004】
甲状腺ホルモンは、甲状腺ホルモン受容体（ＴＨＲ）に結合することによって機能する。甲状腺ホルモン受容体は、核内受容体のファミリーに属し、標的遺伝子の発現を調節する。甲状腺ホルモン受容体には、ＴＨＲαとＴＨＲβの２つの異なるサブタイプが含まれる。ＴＨＲαは主に心臓組織に分布しており、心臓機能の調節に重要な役割を果たしている。ＴＨＲβサブタイプは主に肝臓と下垂体で発現し、コレステロール代謝と甲状腺刺激ホルモン分泌を調節する。
【0005】
正常レベルでは、甲状腺ホルモンＴＨは、体重、代謝率、体温、および感情を維持し、血清コレステロールの調節に関与している。血清コレステロールを調節するために甲状腺ホルモンを使用する試みがなされている。しかしながら、天然の甲状腺ホルモンの摂取による心臓への潜在的な副作用（頻脈や不整脈、心不全、甲状腺軸機能、筋肉代謝、骨粗鬆症など）を考慮すると、甲状腺ホルモンは、高コレステロールや肥満の治療には適していない。ＴＨＲ遺伝子の選択的ノックアウトを有する動物の研究に関する研究結果、およびいくつかの選択的ＴＨＲリガンドの研究結果は、これらの甲状腺ホルモンによって引き起こされる心臓への副作用がＴＨＲαに起因する可能性があることを示している。
【0006】
甲状腺ホルモン受容体の経路は、コレステロール、トリグリセリド、およびリポタンパク質を含む脂質の代謝を調節する。低密度コレステロールを下げると心血管疾患の発生率を下げることができることが臨床的に示されている。
【0007】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）はまた、肝臓におけるトリグリセリドの過剰な蓄積によって引き起こされる一種の代謝性障害疾患であり、これはさらに肝細胞の損傷および炎症を引き起こし、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）をもたらす可能性がある。ＮＡＳＨ患者は、通常、ＮＡＳＨとともに、２型糖尿病、高コレステロール、高脂血症、および肥満を有している。さらに、それらは、肝硬変、肝不全、そして最終的には肝臓癌を発症する可能性が高い。当該分野では、現在、ＮＡＳＨを効果的に治療する薬は限られている。脂質代謝を調節する甲状腺ホルモンの機能を考慮すると、甲状腺受容体経路は、ＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤの治療の潜在的な標的になる。甲状腺ホルモン類似体は、動物の肝臓の脂肪レベルを大幅に低下させることができることが動物の体で証明されている。
【0008】
選択的ＴＨＲβアゴニストを使用して、従来のＴＨＲ受容体アゴニストから生じる心臓への副作用を回避し、ＴＨＲβのみを選択的に活性化することにより、細胞脂質代謝を改善し、コレステロールおよび血中脂肪を低下させる機能をもたらすことができる。しかしながら、選択的ＴＨＲβアゴニストは、甲状腺軸も阻害し、うつ病、倦怠感、骨粗鬆症、およびその他の副作用を引き起こす可能性がある。したがって、甲状腺軸阻害に伴う副作用を回避するために、ＴＨＲβを活性化するとともに甲状腺軸の阻害を低減する選択的ＴＨＲβアゴニストを開発することが望まれている。
【0009】
ＷＯ０３０９４８４５、ＷＯ２００７００９９１３、ＷＯ２０１０１２２９８０、およびＷＯ２０１１０３８２０７などの特許は、いくつかのＴＨＲ受容体アゴニストを開示している。これらのアゴニストの構造は、ほとんどすべて、ＴＨＲ受容体の天然リガンドＴ３に基づいて設計および開発されている。このような背景に基づいて、甲状腺ホルモンの有益な治療効果を有するだけでなく、心臓に影響を与える副作用を回避する選択的ＴＨＲβ受容体アゴニストを開発することが依然として望まれている。
【化1】
【0010】
構造修飾は、ＴＨＲ受容体の天然リガンドＴ３に基づいて、また、本発明において実施される。本発明者らは、予想外に、ほとんどの修飾化合物がＴＨＲβ受容体に対して良好なアゴニスト活性を維持し、いくつかの化合物は、参考文献（「２－［３，５－ジクロロ－４－（５－イソプロピル－６－オキソ－１，６－ジヒドロピリダジン－３－イルオキシ）フェニル］－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ［１，２，４］トリアジン－６－カルボニトリル（ＭＧＬ－３１９６）の発見、脂質異常症の治療のための臨床試験における高選択性甲状腺ホルモン受容体βアゴニスト」、Ｍａｒｔｈａ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１４、３９１２－３９２３）の比較化合物５３と比較して、ＴＨＲαに対する選択性も向上することを発見した。同時に、本発明のいくつかの化合物はまた、非常に望ましい薬物動態特性を示す。いくつかの好ましい化合物の薬物動態特性は、比較化合物のものよりも著しく優れており、したがって、最終の薬物の特性を向上する。
比較化合物５３
【化2】
【発明の概要】
【0011】
上記の技術的課題を解決するために、本発明は、以下の技術的解決手段を用いる。
【0012】
本発明の一態様によれば、本発明は、下記の式（Ｉ）：
（Ｉ）
［式中、
Ｒ１は、水素、シアノ、置換または非置換のＣ１－６アルキル、または、置換または非置換のＣ３－６シクロアルキルからなる群から選択され、該置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ、およびＣ１－６アルコキシからなる群から選択され、；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、または、置換または非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択され、該置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ、および、Ｃ１－６アルコキシからなる群から選択され；
環Ａは、置換または非置換の飽和または不飽和のＣ５－１０脂肪族環、または、置換または非置換のＣ５－１０芳香族環であり、該置換基は、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、－ＯＣＦ３、－ＮＨ２、－ＮＨＣ１－４アルキル、－Ｎ（Ｃ１－４アルキル）２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＣ１－４アルキル、－ＣＯＮ（Ｃ１－４アルキル）２、－ＮＨＣＯＣ１－４アルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、または、Ｃ３－６シクロアルキルからなる群から選択される１つ以上の基であり、そして、２つの置換基が含まれる場合、その２つの置換基は、それらが結合する炭素と一緒になって環構造を形成してもよく；および、
ハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒからなる群から選択される。］
で表される化合物、およびその薬学的に許容される塩、を提供する。
【化3】
［式中、
Ｒ１は、水素、シアノ、置換または非置換のＣ１－６アルキル、または、置換または非置換のＣ３－６シクロアルキルからなる群から選択され、該置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ、およびＣ１－６アルコキシからなる群から選択され、；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、または、置換または非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択され、該置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ、および、Ｃ１－６アルコキシからなる群から選択され；
環Ａは、置換または非置換の飽和または不飽和のＣ５－１０脂肪族環、または、置換または非置換のＣ５－１０芳香族環であり、該置換基は、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、－ＯＣＦ３、－ＮＨ２、－ＮＨＣ１－４アルキル、－Ｎ（Ｃ１－４アルキル）２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＣ１－４アルキル、－ＣＯＮ（Ｃ１－４アルキル）２、－ＮＨＣＯＣ１－４アルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、または、Ｃ３－６シクロアルキルからなる群から選択される１つ以上の基であり、そして、２つの置換基が含まれる場合、その２つの置換基は、それらが結合する炭素と一緒になって環構造を形成してもよく；および、
ハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒからなる群から選択される。］
で表される化合物、およびその薬学的に許容される塩、を提供する。
【0013】
本発明による化合物は、下記の式（ＩＩ）：
（ＩＩ）
［式中、
Ｒ１からＲ３は、上記の式（Ｉ）で定義されたとおりであり；
Ｌは、存在しないか、または、－ＣＨ２－、および－ＣＨ２ＣＨ２－からなる群から選択され；
Ｒ４は、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、－ＯＣＦ３、－ＮＨ２、－ＮＨＣ１－４アルキル、－Ｎ（Ｃ１－４アルキル）２、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、またはＣ３－６シクロアルキルからなる群から選択され；
ｎは、１～４の範囲の整数であり；
ｍは、１～４の範囲の整数であり；
Ｌが存在しない場合、該環は、２つ以上の置換基Ｒ４を有していてもよく；および、
ハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒからなる群から選択される。］
で表される構造で示される化合物である。
【化4】
［式中、
Ｒ１からＲ３は、上記の式（Ｉ）で定義されたとおりであり；
Ｌは、存在しないか、または、－ＣＨ２－、および－ＣＨ２ＣＨ２－からなる群から選択され；
Ｒ４は、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、－ＯＣＦ３、－ＮＨ２、－ＮＨＣ１－４アルキル、－Ｎ（Ｃ１－４アルキル）２、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、またはＣ３－６シクロアルキルからなる群から選択され；
ｎは、１～４の範囲の整数であり；
ｍは、１～４の範囲の整数であり；
Ｌが存在しない場合、該環は、２つ以上の置換基Ｒ４を有していてもよく；および、
ハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒからなる群から選択される。］
で表される構造で示される化合物である。
【0014】
好ましくは、式（ＩＩ）で表される構造において、Ｒ４が、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ１－３アルコキシ、またはＣ３－６シクロアルキルからなる群から選択され；
Ｌが、存在しないか、または、－ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２－からなる群から選択され；
ｎが、１、２、または３であり；および、
ｍが、１、または２である。
Ｌが、存在しないか、または、－ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２－からなる群から選択され；
ｎが、１、２、または３であり；および、
ｍが、１、または２である。
【0015】
さらに好ましくは、式（ＩＩ）で表される構造において、Ｒ４が、水素、またはＣ１－３アルキルからなる群から選択され；
Ｌが、－ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２－からなる群から選択され；
ｎが、１、２、または３であり；および、
ｍが、１、または２である。
Ｌが、－ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２－からなる群から選択され；
ｎが、１、２、または３であり；および、
ｍが、１、または２である。
【0016】
さらに好ましくは、式（ＩＩ）で表される構造において、Ｒ４が、水素、またはＣ１－３アルキルからなる群から選択され；
Ｌが、存在せず；
ｎが、１、２、または３であり；および、
ｍが、１、または２である。
Ｌが、存在せず；
ｎが、１、２、または３であり；および、
ｍが、１、または２である。
【0017】
本発明による化合物は、下記の式（ＩＩＩ）：
［式中、
Ｒ１からＲ３は、上記の式（Ｉ）で定義されたとおりであり；
Ｒ４は、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、－ＯＣＦ３、－ＮＨ２、－ＮＨＣ１－４アルキル、－Ｎ（Ｃ１－４アルキル）２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＣ１－４アルキル、－ＣＯＮ（Ｃ１－４アルキル）２、－ＮＨＣＯＣ１－４アルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、またはＣ３－６シクロアルキルからなる群から選択され；
ｍは、１～４の範囲の整数であり；および、
ハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒからなる群から選択される。］
で表される構造で示される化合物である。
【化5】
Ｒ１からＲ３は、上記の式（Ｉ）で定義されたとおりであり；
Ｒ４は、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、－ＯＣＦ３、－ＮＨ２、－ＮＨＣ１－４アルキル、－Ｎ（Ｃ１－４アルキル）２、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨＣ１－４アルキル、－ＣＯＮ（Ｃ１－４アルキル）２、－ＮＨＣＯＣ１－４アルキル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、またはＣ３－６シクロアルキルからなる群から選択され；
ｍは、１～４の範囲の整数であり；および、
ハロゲン原子は、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒからなる群から選択される。］
で表される構造で示される化合物である。
【0018】
好ましくは、式（ＩＩＩ）で表される構造において、Ｒ４が、水素、ハロゲン原子、ヒドロキシ、－ＯＣＦ３、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、またはＣ３－６シクロアルキルからなる群から選択され；および、ｍが、１～３の範囲の整数である。
【0019】
好ましくは、式（ＩＩＩ）で表される構造において、Ｒ４が、水素、ハロゲン原子、またはＣ１－３アルキルからなる群から選択され；および、ｍが、１、または２である。
【0020】
好ましくは、本発明による、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）の構造で示される前記化合物において、Ｒ１が、水素、シアノ、置換または非置換のＣ１－６アルキルからなる群から選択され、さらに好ましくは、Ｒ１が、シアノ、またはＣ１－３アルキルからなる群から選択され、よりさらに好ましくは、Ｒ１が、シアノである。
【0021】
好ましくは、本発明による、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）の構造で示される前記化合物において、Ｒ２およびＲ３が、それぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒからなる群から選択され、さらに好ましくは、Ｒ２およびＲ３が、ともに、Ｃｌである。
【0022】
好ましくは、化合物およびその薬学的に許容される塩が、下記の化合物：
のいずれかの１つである。
【化6】
【0023】
本発明の別の一態様によれば、本発明は、該化合物の製造方法を提供し、製造方法は、下記の工程：
１）分子内無水物の化合物Ｉ－ａをヒドラジン塩酸塩と反応させて、一般式Ｉ－ｂの化合物を得る；
２）得られた一般式Ｉ－ｂの化合物をオキシ塩化リン中で加熱して、一般式Ｉ－ｃの化合物を形成する；
３）得られた一般式Ｉ－ｃの化合物と化合物Ｉ－ｄを高温でカップリング反応させて、一般式Ｉ－ｅの化合物を得る（この条件において触媒はヨウ化第一銅であることが好ましい）；
４）得られた一般式Ｉ－ｅの化合物を、酸性またはアルカリ性の高温で反応させて、一般式Ｉ－ｆの化合物を得る；そして、
５）得られた一般式Ｉ－ｆの化合物を酸性水溶液中で亜硝酸ナトリウムと反応させ、次いで、化合物Ｉ－ｇを加えてさらに反応させ、高温で閉環させて、一般式Ｉの化合物を得る（この条件下では、酸は好ましくは塩酸である）；
を含む。
【化7】
２）得られた一般式Ｉ－ｂの化合物をオキシ塩化リン中で加熱して、一般式Ｉ－ｃの化合物を形成する；
３）得られた一般式Ｉ－ｃの化合物と化合物Ｉ－ｄを高温でカップリング反応させて、一般式Ｉ－ｅの化合物を得る（この条件において触媒はヨウ化第一銅であることが好ましい）；
４）得られた一般式Ｉ－ｅの化合物を、酸性またはアルカリ性の高温で反応させて、一般式Ｉ－ｆの化合物を得る；そして、
５）得られた一般式Ｉ－ｆの化合物を酸性水溶液中で亜硝酸ナトリウムと反応させ、次いで、化合物Ｉ－ｇを加えてさらに反応させ、高温で閉環させて、一般式Ｉの化合物を得る（この条件下では、酸は好ましくは塩酸である）；
を含む。
【0024】
本発明による一般式Ｉの化合物は、下記：
のようにして製造されてもよい。
一般式Ｉ－Ｂ－１の化合物を酸性水溶液中で高温加水分解して、一般式Ｉ－Ｂ－２の化合物を得る（この条件下では、酸は好ましくは塩酸である）；そして、得られた一般式Ｉ－Ｂ－２の化合物をメルカプト酢酸の存在下、高温で反応させてカルボキシを除去し、一般式Ｉの化合物を得る。
【化8】
一般式Ｉ－Ｂ－１の化合物を酸性水溶液中で高温加水分解して、一般式Ｉ－Ｂ－２の化合物を得る（この条件下では、酸は好ましくは塩酸である）；そして、得られた一般式Ｉ－Ｂ－２の化合物をメルカプト酢酸の存在下、高温で反応させてカルボキシを除去し、一般式Ｉの化合物を得る。
【0025】
本発明による一般式Ｉの化合物は、下記の方法：
により製造されてもよい。
一般式Ｉ－ｆの化合物を酸性条件下で亜硝酸ナトリウムと反応させてジアゾニウム塩化合物を形成し、次いで、ハロゲン化物アニオンを加えて、一般式Ｉ－ｇの化合物を得る；そして、遷移金属触媒下で、得られた一般式Ｉ－ｇの化合物を中間体Ｉ－ｈとカップリングさせて、一般式Ｉの化合物を得る。
【化9】
一般式Ｉ－ｆの化合物を酸性条件下で亜硝酸ナトリウムと反応させてジアゾニウム塩化合物を形成し、次いで、ハロゲン化物アニオンを加えて、一般式Ｉ－ｇの化合物を得る；そして、遷移金属触媒下で、得られた一般式Ｉ－ｇの化合物を中間体Ｉ－ｈとカップリングさせて、一般式Ｉの化合物を得る。
【0026】
本発明の別の一態様によれば、本発明は、代謝関連疾患の治療薬の製造における、該化合物の使用、を提供する。
【0027】
本発明の別の一態様によれば、本発明は、有効成分としての治療有効量の本発明の化合物および薬学的に許容される塩、および、薬学的に許容される補助剤を含む、医薬組成物、を提供する。
【0028】
好ましくは、代謝関連疾患は、肥満、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病、および、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、脂肪肝、アテローム性動脈硬化症、甲状腺機能低下症、および甲状腺癌からなる群から選択され、好ましくは、代謝関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、甲状腺機能低下症、および甲状腺癌からなる群から選択される。
【0029】
本発明の別の一態様によれば、本発明は、有効量の本発明の化合物、または該化合物およびその薬学的に許容される塩を有効成分として含む医薬組成物を、対象に投与することを含む、代謝関連疾患の治療方法、を提供する。
【0030】
好ましくは、代謝関連疾患の治療方法によれば、代謝関連疾患は、肥満、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病、および、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、脂肪肝、アテローム性動脈硬化症、甲状腺機能低下症、および甲状腺癌からなる群から選択され、好ましくは、代謝関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、甲状腺機能低下症、および甲状腺癌からなる群から選択される。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明を以下に詳細に説明する。説明に先立って、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される用語は、一般的な意味および辞書の意味に限定されると解釈されるものではなく、発明者が最良の解釈のために用語を適切に定義することが認められているという原則に基づいて本発明の技術的態様における対応する意味および概念に従って解釈されるべきであることを理解されるべきである。したがって、ここで提案する説明は、例示の目的のための好ましい例にすぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。したがって、本発明の精神および範囲から逸脱しなければ、それから他の均等物または改良物を得ることができることを理解されたい。
【0032】
本発明によれば、本明細書で引用されるすべての用語は、特に断りのない限り、当業者が本発明を理解するものと同様の意味を有する。
【0033】
本明細書において、「塩」との用語は、陽イオンおよび陰イオンを含む化合物を意味し、これは、プロトンを受け入れることができる部位のプロトン化、および／またはプロトンを供給することができる部位のプロトン引き抜きによって、形成することができる。注目することに、プロトンを受け入れることができる部位のプロトン化は、カチオン性物質の形成を導き、その電荷は、生理学的陰イオンの存在によってバランスがとられるのに対し、プロトンを供給することができる部位のプロトン引き抜きは、陰イオン物質の形成を導き、その電荷は、生理学的陽イオンの存在によってバランスがとられる。
【0034】
「薬学的に許容される塩」との用語は、その塩が薬学的に許容されることを意味する。薬学的に許容される塩としては、例えば、これに限定されるものではないが、（１）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸で形成されるか、または、有機酸、例えば、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、３－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２－エタン－ジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４－クロロベンゼンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、４－パラトルエンスルホン酸、カンファー酸、ドデシル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、サリチル酸、およびシス－ムコン酸で形成される、酸付加塩；または、（２）上記の無機酸の共役塩基で形成される、アルカリ付加塩が挙げられ、ここで、共役塩基は、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、およびＮＨｘＲ４－ｘ
＋からなる群から選択されるカチオン性成分を含み、ここで、ＮＨｘＲ４－ｘ
＋（ＲはＣ１－４アルキルであり、添字ｘは０、１、２、３または４からなる群から選択される整数である）は、第４級アンモニウム塩の陽イオンを表す。関与するすべての薬学的に許容される塩は、同じ酸付加塩について本明細書で定義される溶媒付加形態（溶媒和物）または結晶形態（多形物）を含むことが理解されるべきである。
【0035】
「Ｃ１－Ｍアルキル」との用語は、１からＭ個の炭素原子を含むアルキルを意味し、ここで、Ｍは、以下の数値を有する整数である：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０。例えば、「Ｃ１－６アルキル」とは、１～６個の炭素原子を含むアルキルを意味する。アルキルとしては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ｔ－ブチル、またはアミル、ｉ－アミル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、およびオクチルが挙げられるが、低級アルキルに限定されるものではない。
【0036】
「芳香族基」との用語は、芳香族系を意味し、これは、単環式環、または縮合または結合した環の少なくとも一部が共役芳香族系を形成するように元から一緒に縮合または結合した芳香族多環、であり得る。アリール基としては、これに限定するものではないが、フェニル、ナフチル、およびテトラリル（ｔｅｔｒａｌｙｌ）が挙げられる。アリールは、任意に置換されてもよく、例えば、１～４個のアリール基またはヘテロ環が、ハロゲン、－ＣＮ、－ＯＨ、－ＮＯ２、アミノ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリールオキシ、置換アルコキシ、アルキルカルボニル、アルキルカルボキシ、アルキルアミノ、またはアリールチオからなる群から選択される基によって置換される。
【0037】
「置換」との用語は、参照する基が、１つまたは複数の追加の基で置換され得ることを意味し、ここで、追加の基は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式炭化水素、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオール、アリールチオ、アルキルスルフィニル、アリールスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、シアノ、ハロ、カルボニル、チオカルボニル、ニトロ、ハロアルキル、フルオロアルキル、およびアミノ（一置換および二置換アミノ基およびそれらによって保護される誘導体を含む）からなる群から、個別に独立して選択される。
【0038】
本発明により提供される式（Ｉ）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩、および該化合物を含む医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル、粉末、シロップ、溶液、懸濁液、およびエアロゾルなどの様々な形態であり得、適切な固体または液体の担体または希釈剤の中で、および注射または注入に適した殺菌液の中で、存在し得る。
【0039】
本発明の医薬組成物の様々な剤形は、医薬の分野における従来の製造方法に従って製造することができる。例えば、製剤の単位用量は、０．０５～２００ｍｇの式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩を含み、好ましくは、製剤の単位用量は、０．１～１００ｍｇの式（Ｉ）の化合物を含む。
【0040】
本発明により提供される一般式（Ｉ）で表される化合物または医薬組成物は、経口、経鼻、経皮、経肺、または胃腸管経路などの投与経路を通じて、ヒトおよび動物を含む哺乳動物において臨床的に使用することができる。経口投与が最も好ましい。最も好ましい１日量は、単回投与あたり０．０１～２００ｍｇ／ｋｇ体重であり、あるいは、分割した投与あたり０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ体重である。投与方法にかかわらず、特定の治療法に基づいて、個体に最適な用量を決定すべきである。通常、投与は少量から始まり、最適な用量が見つかるまで徐々に増加させる。
【0041】
本発明において、「有効量」との用語は、期待される効果を達成するために必要とされる用量および期間のための有効量を意味し得る。この有効量は、病気の種類、治療時の病気の症状；投与される特定の標的器官の構造；患者の個々の身長および体重、または、病気または症状の重症度、などの特定の要因によってさまざまに異なるものとなり得る。当業者は、経験により、不必要な実験を行うことなく、特定の化合物の有効量を決定することができる。
【0042】
典型的な製剤は、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物と、担体、希釈剤または賦形剤とを混合することによって製造される。適切な担体、希釈剤または賦形剤は、当業者によく知られており、炭水化物、ワックス、水溶性および／または膨張性ポリマー、親水性または疎水性物質、ゼラチン、油、溶媒、および水などの物質が挙げられる。
【0043】
使用される特定の担体、希釈剤または賦形剤は、本発明の化合物の使用法および目的に従って決定されるものである。一般に、溶媒は、当業者により、哺乳動物に安全で有効に投与することができる溶媒に基づいて選択される。一般に、安全な溶媒は、水などの非毒性の水性溶媒、および水に可溶または水と混和性のある他の非毒性の溶媒である。適切な水性溶媒としては、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００、およびＰＥＧ３００）などの１つまたは複数が挙げられる。製剤はまた、緩衝剤、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、潤滑剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、抗酸化剤、光遮蔽剤、流動助剤、加工助剤、着色剤、甘味料、香料、香味剤、または他の既知の添加剤の１つまたは複数を含んでもよく、それによって、薬物を許容可能な形態で製造または使用することができる。
【0044】
本発明の式（Ｉ）の化合物を少なくとも１つの他の薬物と組み合わせて使用する場合、２つ以上の薬物を別々にまたは組み合わせて、好ましくは医薬組成物の形態で、使用することができる。本発明の式（Ｉ）の化合物または医薬組成物は、既知の経口、静脈内、直腸、膣、経皮、他の局所または全身投与形態で、対象に別々にまたは一緒に投与することができる。
【0045】
これらの医薬組成物はまた、緩衝剤、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、潤滑剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、抗酸化剤、光遮蔽剤、流動助剤、加工助剤、着色剤、甘味料、香料、香味料、または他の既知の添加物の１つまたは複数を含んでもよく、それによって、医薬組成物を許容可能な形態で製造または使用することができる。
【0046】
本発明の薬物には、経口投与経路が好ましい。経口投与用の固体剤形としては、カプセル、錠剤、粉末、または粒子製剤を挙げることができる。固体剤形において、本発明の化合物または医薬組成物は、少なくとも１つの不活性な賦形剤、希釈剤または担体と混合される。適切な賦形剤、希釈剤または担体としては、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、またはデンプン、ラクトース、スクロース、マンニトール、ケイ酸などの物質；カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、アラビアガムなどの粘着剤；グリセロールなどの湿潤剤；寒天、炭酸カルシウム、イモまたはキャッサバ澱粉、アルギン酸、特定の複合ケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；パラフィンなどの溶液ブロッキング剤；第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；カオリンおよびベントナイトなどの吸着剤；および、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、およびラウリル硫酸ナトリウムなどの潤滑剤、などが挙げられる。カプセルおよび錠剤の場合、剤形はまた、緩衝液を含んでいてもよい。同様のタイプの固体組成物は、ラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールを賦形剤として使用する、ソフトおよびハード充填ゼラチンカプセルの充填剤として使用されてもよい。
【0047】
経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、溶液、懸濁液、および、シロップおよびエリキシルが挙げられる。本発明の化合物またはその医薬組成物に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般的に使用される不活性な希釈剤、例えば、水または他の溶媒；エタノール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブタンジオール、ジメチルホルムアミドなどの可溶化剤および乳化剤；油（例えば、綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）；グリセロール；テトラヒドロフルフリルアルコール；ポリエチレングリコールとソルビタンの脂肪酸エステル；または、これらの物質のいくつかの混合物など、を含み得る。
【0048】
これらの不活性な希釈剤に加えて、組成物はまた、賦形剤、例えば、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味剤、および香料などの１つまたは複数、を含んでもよい。
【0049】
懸濁液について、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩またはそれを含む医薬組成物に加えて、懸濁液は、懸濁剤などの担体、例えば、エトキシル化イソステアロール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカントガム、またはこれらの物質のいくつかの混合物など、をさらに含み得る。
【0050】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩またはそれを含む医薬組成物は、軟膏、粉末、スプレー、および吸入剤を含む、他の局所剤形を用いて投与されてもよい。この薬物は、無菌条件下で、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体、および必要に応じて任意の保存剤、緩衝剤または高圧ガスと混合することができる。眼科用製剤、眼科用軟膏、粉末、および溶液もまた、本発明の範囲に包含されることが意図される。
【0051】
さらに、本開示は、キット（例えば、医薬品パッケージ）をさらに包含する。提供されるキットは、本明細書に記載の医薬組成物または化合物および容器（例えば、薬剤ボトル、アンプル、ボトル、シリンジおよび／またはサブパッケージ、または他の適切な容器）を含み得る。いくつかの実施形態において、提供されるキットは、任意に、本明細書に記載の医薬組成物または化合物を希釈または懸濁するための医薬賦形剤を含む第２の容器をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、第１および第２の容器において提供される本明細書に記載の医薬組成物または化合物は、組み合わされて、単位剤形を形成する。
【0052】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のキットは、キットに含まれる化合物または医薬組成物の使用説明書をさらに含む。本明細書に記載のキットには、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などの規制当局が必要とする情報が含まれていてもよい。いくつかの実施形態において、キットに含まれる情報は製剤情報である。いくつかの実施形態において、キットおよび説明書は、それを必要とする対象における増殖性疾患の治療、および／またはそれを必要とする対象における増殖性疾患の予防のために、提供される。本明細書に記載のキットは、別の組成物として１つまたは複数の追加の医薬製剤を含んでもよい。
【実施例】
【0053】
以下、本発明を特定の実施形態と組み合わせてさらに詳細に説明するが、本発明は、下記の実施形態に限定されるものではなく、これは本発明の具体的な実施形態をよく説明する目的として供するものであり、本発明の範囲を何らかの方法で限定するものとして解釈されるべきではない。実施形態に記載されていない条件は、従来の条件である。特に断りのない限り、下記の実施形態で使用される試薬および装置はすべて市販の製品である。
【0054】
下記の実施形態における化合物の構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）または／および質量分析（ＭＳ）によって測定される。ＮＭＲの変位（δ）は１０－６（ｐｐｍ）の単位で与えられる。ＮＭＲの測定には、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ－４００核磁気装置を使用する。溶媒は、重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ６）、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）、および重水素化メタノール（ＣＤ３ＯＤ）であり、内部標準は、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）である。
【0055】
ＭＳの測定には、ＦＩＮＮＩＧＡＮ ＬＣＱＡｄ（ＥＳＩ）質量分析計（製造業者：Ｔｈｅｒｍｏ、モデル：Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ ａｄｖａｎｃｅ ｍａｘ）を使用する。
【0056】
薄層クロマトグラフィー用のシリカゲルプレートとして、Ｙａｎｔａｉ Ｈｕａｎｇｈａｉ ＨＳＧＦ２５４、または、Ｑｉｎｇｄａｏ ＧＦ２５４のシリカゲルプレートを使用する。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）用シリカゲルプレートの仕様は０．１５ｍｍ～０．２ｍｍであり、生成物の分離および精製のための薄層クロマトグラフィー用のシリカゲルプレートの仕様は、０．４ｍｍ～０．５ｍｍである。
【0057】
カラムクロマトグラフィーは、一般に、Ｙａｎｔａｉ Ｈｕａｎｇｈａｉシリカゲルの２００－３００メッシュシリカゲルを担体として使用する。
【0058】
実施形態において特に説明がない場合、反応温度は、室温、すなわち２０℃～３０℃である。
【0059】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を使用して、実施形態における反応の過程を検出する。使用される展開系、および化合物を精製するために使用されるカラムクロマトグラフィーの溶離液系には、Ａ：ジクロロメタンおよびメタノール系；Ｂ：ｎ－ヘキサンおよび酢酸エチル系；Ｃ：石油エーテルおよび酢酸エチル系；Ｄ：アセトンおよび石油エーテル系が含まれ、溶媒の体積比は、化合物のさまざまな極性に応じて調整される。
【0060】
実施形態１
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリルの製造
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリルの製造
【化10】
【化11】
【0061】
工程１
２，３，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１，４－ジオン（化合物１ｂ）の製造
酢酸ナトリウム（３．６９ｇ、４５ｍｍｏｌ）、およびヒドラジン塩酸塩（３．０８ｇ、４５ｍｍｏｌ）を、化合物３，４，５，６－テトラヒドロフタル酸無水物１ａ（４．５６ｇ、３０ｍｍｏｌ）の酢酸（５０ｍｌ）および水（１００ｍｌ）の溶液に、順次、加えた。添加後、混合物を、１００℃の温度に加熱し、３時間撹拌した。反応を停止させ、室温に自然冷却した。固体を沈殿させ、濾過して、化合物１ｂ（４．２ｇ）を得て、この生成物をそのまま次の反応に使用した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 11.26 (s, 2H), 2.36 (s,4H), 1.65(s, 4H).
２，３，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１，４－ジオン（化合物１ｂ）の製造
酢酸ナトリウム（３．６９ｇ、４５ｍｍｏｌ）、およびヒドラジン塩酸塩（３．０８ｇ、４５ｍｍｏｌ）を、化合物３，４，５，６－テトラヒドロフタル酸無水物１ａ（４．５６ｇ、３０ｍｍｏｌ）の酢酸（５０ｍｌ）および水（１００ｍｌ）の溶液に、順次、加えた。添加後、混合物を、１００℃の温度に加熱し、３時間撹拌した。反応を停止させ、室温に自然冷却した。固体を沈殿させ、濾過して、化合物１ｂ（４．２ｇ）を得て、この生成物をそのまま次の反応に使用した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 11.26 (s, 2H), 2.36 (s,4H), 1.65(s, 4H).
【0062】
工程２
１，４－ジクロロ－５，６，７，８－テトラヒドロフタラジン（化合物１ｃ）の製造
化合物１ｂ（１ｇ、６．０２ｍｍｏｌ）をオキシ塩化リン（８ｍｌ）に溶解した。系内の空気を窒素ガスで３回置き換えた。系を１１０℃の温度に加熱し、３時間撹拌した。反応を停止させ、次に、自然冷却した。反応溶液を氷水にゆっくりと入れた。混合物を、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で、ｐＨ１０に調整し、酢酸エチルで３回抽出した。有機相を合わせ、有機相を飽和食塩水で洗浄し、濃縮し、乾燥して、化合物１ｃ（１．１ｇ）を得た。生成物をそのまま次の反応に使用した。
１，４－ジクロロ－５，６，７，８－テトラヒドロフタラジン（化合物１ｃ）の製造
化合物１ｂ（１ｇ、６．０２ｍｍｏｌ）をオキシ塩化リン（８ｍｌ）に溶解した。系内の空気を窒素ガスで３回置き換えた。系を１１０℃の温度に加熱し、３時間撹拌した。反応を停止させ、次に、自然冷却した。反応溶液を氷水にゆっくりと入れた。混合物を、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で、ｐＨ１０に調整し、酢酸エチルで３回抽出した。有機相を合わせ、有機相を飽和食塩水で洗浄し、濃縮し、乾燥して、化合物１ｃ（１．１ｇ）を得た。生成物をそのまま次の反応に使用した。
【0063】
工程３
３，５－ジクロロ－４－（（４－クロロ－５，６，７，８－テトラヒドロフタラジン－１－イル）オキシ）アニリン（化合物１ｄ）の製造
ジメチルスルホキシド（８ｍｌ）を、化合物１ｃ（１．０ｇ、５．０ｍｍｏｌ）、２，６－ジクロロ－４－アミノフェノール（０．９３ｇ、６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．７６ｇ、２０ｍｍｏｌ）、およびＣｕＩ（０．５７ｇ、３ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。系内の空気を窒素ガスで３回置き換えた。系を１００℃の温度に加熱し、３時間撹拌した。反応を停止させた後、冷却した。反応溶液の固体をまず濾過し、濾過残渣を酢酸エチルで繰り返し洗浄した。８０ｍｌの水を濾液に加え、その後、水相を酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水で洗浄した。濾過および溶媒濃縮後、カラムクロマトグラフィーにより、化合物１ｄ（４５０ｍｇ）を得た。
３，５－ジクロロ－４－（（４－クロロ－５，６，７，８－テトラヒドロフタラジン－１－イル）オキシ）アニリン（化合物１ｄ）の製造
ジメチルスルホキシド（８ｍｌ）を、化合物１ｃ（１．０ｇ、５．０ｍｍｏｌ）、２，６－ジクロロ－４－アミノフェノール（０．９３ｇ、６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．７６ｇ、２０ｍｍｏｌ）、およびＣｕＩ（０．５７ｇ、３ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。系内の空気を窒素ガスで３回置き換えた。系を１００℃の温度に加熱し、３時間撹拌した。反応を停止させた後、冷却した。反応溶液の固体をまず濾過し、濾過残渣を酢酸エチルで繰り返し洗浄した。８０ｍｌの水を濾液に加え、その後、水相を酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水で洗浄した。濾過および溶媒濃縮後、カラムクロマトグラフィーにより、化合物１ｄ（４５０ｍｇ）を得た。
【0064】
工程４
４－（４－アミノ－２，６－ジクロロフェノキシ）－５，６，７，８－テトラヒドロフタラジン－１（２Ｈ）－オン（化合物１ｅ）の製造
化合物１ｄ（１００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を酢酸（４ｍｌ）に溶解し、これに、酢酸ナトリウム（２００ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１２０℃の温度に加熱し、１２時間撹拌した。反応を停止させた後、溶媒を減圧下、除去した。１０ｍｌの水を加え、次いで、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ８に調整した。その後、酢酸エチル（１０ｍｌ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液および飽和食塩水でそれぞれ洗浄し、減圧下、濃縮し、灰色の固体を得た。１０ｍｌのメタノール、および１０ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を得られた固体に加え、混合物を１２０℃の温度に加熱し、１２時間撹拌した。反応を停止させた後、メタノールを減圧下、濃縮した。残った水相を酢酸エチルで３回繰り返し抽出し、有機相を合わせた。溶媒を減圧下濃縮した後、薄層クロマトグラフィーによる分離および精製により、化合物１ｅ（８０ｍｇ）を得た。
４－（４－アミノ－２，６－ジクロロフェノキシ）－５，６，７，８－テトラヒドロフタラジン－１（２Ｈ）－オン（化合物１ｅ）の製造
化合物１ｄ（１００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を酢酸（４ｍｌ）に溶解し、これに、酢酸ナトリウム（２００ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１２０℃の温度に加熱し、１２時間撹拌した。反応を停止させた後、溶媒を減圧下、除去した。１０ｍｌの水を加え、次いで、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ８に調整した。その後、酢酸エチル（１０ｍｌ×３）で抽出し、有機相を合わせた。有機相を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液および飽和食塩水でそれぞれ洗浄し、減圧下、濃縮し、灰色の固体を得た。１０ｍｌのメタノール、および１０ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を得られた固体に加え、混合物を１２０℃の温度に加熱し、１２時間撹拌した。反応を停止させた後、メタノールを減圧下、濃縮した。残った水相を酢酸エチルで３回繰り返し抽出し、有機相を合わせた。溶媒を減圧下濃縮した後、薄層クロマトグラフィーによる分離および精製により、化合物１ｅ（８０ｍｇ）を得た。
【0065】
工程５
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物１）の製造
亜硝酸ナトリウム（１６ｍｇ）を水（０．５ｍｌ）に溶解した。氷浴条件下、この溶液を、化合物１ｅ（６０ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）、水（２．５ｍｌ）、および飽和塩酸水溶液（１．２５ｍｌ）の混合物に、ゆっくりと滴下して加え、氷浴条件を維持して、溶液が透明になるまで０．５時間撹拌した。この温度で、Ｎ－シアノアセチルウレタン（３２ｍｇ）の水（４．２ｍｌ）およびピリジン（１．３ｍｌ）の混合液をさらに滴下して加え、滴下後、一晩撹拌した。反応を停止させた後、黄色の固体を濾過して、水および石油エーテルで洗浄した。酢酸（５ｍｌ）および酢酸ナトリウム（１６０ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を、得られた固体に加えた。混合物を１２０℃の温度に加熱し、６時間撹拌した後、室温に冷却した。１００ｍｌの水を加え、淡黄色の固体が沈殿した。薄層クロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝８：１）による分離および精製の後、化合物１（１２．０ｍｇ）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.03 (s, 1H), 7.75 (s,2H), 2.68-2.63 (m, 2H), 2.45-2.39 (m, 2H), 1.80-1.67 (m, 4H).
MS m/z (ESI): 447.4 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物１）の製造
亜硝酸ナトリウム（１６ｍｇ）を水（０．５ｍｌ）に溶解した。氷浴条件下、この溶液を、化合物１ｅ（６０ｍｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）、水（２．５ｍｌ）、および飽和塩酸水溶液（１．２５ｍｌ）の混合物に、ゆっくりと滴下して加え、氷浴条件を維持して、溶液が透明になるまで０．５時間撹拌した。この温度で、Ｎ－シアノアセチルウレタン（３２ｍｇ）の水（４．２ｍｌ）およびピリジン（１．３ｍｌ）の混合液をさらに滴下して加え、滴下後、一晩撹拌した。反応を停止させた後、黄色の固体を濾過して、水および石油エーテルで洗浄した。酢酸（５ｍｌ）および酢酸ナトリウム（１６０ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を、得られた固体に加えた。混合物を１２０℃の温度に加熱し、６時間撹拌した後、室温に冷却した。１００ｍｌの水を加え、淡黄色の固体が沈殿した。薄層クロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝８：１）による分離および精製の後、化合物１（１２．０ｍｇ）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.03 (s, 1H), 7.75 (s,2H), 2.68-2.63 (m, 2H), 2.45-2.39 (m, 2H), 1.80-1.67 (m, 4H).
MS m/z (ESI): 447.4 [M+1].
【0066】
実施形態２
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－エタノフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物２ｂ）の製造
２
実施形態１の工程１において、原料３，４，５，６－テトラヒドロフタル酸無水物１ａを、ビシクロ［２．２．２］オクト－２－エン－２，３－ジカルボン酸無水物に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－エタノフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物２）を製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.13 (s, 1H), 7.77 (s,2H), 1.88-1.73 (m, 4H), 1.39-1.17 (m, 6H).
MS m/z (ESI): 473.2 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－エタノフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物２ｂ）の製造
【化12】
実施形態１の工程１において、原料３，４，５，６－テトラヒドロフタル酸無水物１ａを、ビシクロ［２．２．２］オクト－２－エン－２，３－ジカルボン酸無水物に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－エタノフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物２）を製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.13 (s, 1H), 7.77 (s,2H), 1.88-1.73 (m, 4H), 1.39-1.17 (m, 6H).
MS m/z (ESI): 473.2 [M+1].
【0067】
実施形態３
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－メタノフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物３）の製造
３
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－メタノフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物３）の製造
【化13】
【0068】
工程１
ジメチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２，５－ジエン－２，３－ジカルボキシレートの製造
ジメチル アセチレンジカルボキシレート（化合物３ｂ）（２．７５ｍｌ、２２．３ｍｍｏｌ）を、シクロペンタジエン（化合物３ａ）（１．４７５ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）にゆっくりと滴下し、添加後、室温で２時間、撹拌した。反応を停止させ、油性の生成物３ｃ（４．０ｇ）を得た。粗製の生成物を、精製することなく、そのまま次の反応に使用した。
ジメチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２，５－ジエン－２，３－ジカルボキシレートの製造
【化14】
【0069】
工程２
ジメチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン－２，３－ジカルボキシレートの製造
化合物３ｃ（１．０ｇ，４．８ｍｍｏｌ）、パラジウム炭素（０．０５ｇ）、および、１５ｍｌのアセトンを反応フラスコに入れ、水素バルーン下、３回置換を行った。系を室温で１時間撹拌した。濾過を行い、溶媒を濃縮し、減圧下で乾燥して、淡緑色の液体の生成物３ｄ（０．９ｇ）を得た。
ジメチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン－２，３－ジカルボキシレートの製造
【化15】
【0070】
工程３
ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン－２，３－ジアシッドの製造
テトラヒドロフラン（２０ｍｌ）および水（２０ｍｌ）を、化合物３ｄ（３．０ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）、および水酸化リチウム一水和物（１．５４ｇ、３５．８ｍｍｏｌ）の混合物に加え、室温で２時間、撹拌した。溶液を、２Ｎ希塩酸でｐＨ１に調整し、酢酸エチルで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下濃縮し、白色の固体の化合物３ｅ（２．０ｇ）を得た。
ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン－２，３－ジアシッドの製造
【化16】
【0071】
工程４
４，５，６，７－テトラヒドロ－４，７－メタノイソフェニルフラン１，３－ジオンの製造
無水酢酸（１０ｍｌ）を化合物３ｅ（２００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）に加えた。混合物を１００℃の温度に加熱し、２時間撹拌した。溶媒を、減圧下、濃縮して除去し、固体の化合物３ｆ（２００ｍｇ）の粗製の生成物を得た。
４，５，６，７－テトラヒドロ－４，７－メタノイソフェニルフラン１，３－ジオンの製造
【化17】
【0072】
工程５
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－メタノフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリルの製造
実施形態１の工程１において、原料４，５，６，７－テトラヒドロイソベンゾフラン－１，３－ジオン（化合物１ａ）を、４，５，６，７－テトラヒドロ－４，７－メタノイソフェニルフラン１，３－ジオン（化合物３ｆ）に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－メタノフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物３）を製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.08 (s, 1H), 7.77 (s,2H), 2.75-2.65 (m, 2H), 1.80-1.72 (m, 4H), 1.55-1.50 (m, 2H).
MS m/z (ESI): 459.0 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－メタノフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリルの製造
実施形態１の工程１において、原料４，５，６，７－テトラヒドロイソベンゾフラン－１，３－ジオン（化合物１ａ）を、４，５，６，７－テトラヒドロ－４，７－メタノイソフェニルフラン１，３－ジオン（化合物３ｆ）に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－メタノフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物３）を製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.08 (s, 1H), 7.77 (s,2H), 2.75-2.65 (m, 2H), 1.80-1.72 (m, 4H), 1.55-1.50 (m, 2H).
MS m/z (ESI): 459.0 [M+1].
【0073】
実施形態４
１－（３，５－ジクロロ－４－（（７，７－ジメチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタン［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキシ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物４）の製造
４
１－（３，５－ジクロロ－４－（（７，７－ジメチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタン［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキシ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物４）の製造
【化18】
【0074】
工程１
メチル ３，３－ジメチル－２－オキソシクロペンチル－１－カルボキシレートの製造
ＮＡＨ（４８０ｍｇ、１２ｍｍｏｌ）を、化合物２，２－ジメチルシクロペンタン－１－オン（１．１２ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびＭｅＯＨ（０．５ｍｌ）のＤＭＣ（１１ｍｌ）溶液に加えた。混合物を、８２℃の温度に加熱し、３時間撹拌し、冷却した。メタノール（０．５ｍｌ）、および酢酸（１ｍｌ）を順次、系に加え、系を氷水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、乾燥し、減圧下で溶媒を除去して、無色の油性の化合物４ａ（１．７ｇ）を得て、そのまま次の工程に使用した。
メチル ３，３－ジメチル－２－オキソシクロペンチル－１－カルボキシレートの製造
【化19】
【0075】
工程２
メチル ３，３－ジメチル－２－（（（トリフルオロメチル）スルホ）オキソ）シクロペント－１－エン－１－カルボキシレートの製造
－６０℃で、トリフルオロ無水酢酸（２ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）を、化合物４ａ（１．７ｇ、１０ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（８．２ｍｌ、５０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１７ｍｌ）溶液に、滴下して加えた。添加後、混合物をゆっくりと室温に昇温し、１６時間撹拌した。５０ｍｌの水をこれに加え、混合物を酢酸エチルで抽出し、減圧下で溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝５０：１）により精製して、無色の油性の化合物４ｂ（１．８ｇ）を得た。
メチル ３，３－ジメチル－２－（（（トリフルオロメチル）スルホ）オキソ）シクロペント－１－エン－１－カルボキシレートの製造
【化20】
【0076】
工程３
２－（メトキシカルボニル）－５，５－ジメチルシクロペント－１－エン－１－カルボン酸の製造
窒素ガスバルーンの雰囲気下、ＤＭＦ（２５ｍｌ）を、４ｂ（１．８ｇ、５．９６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１．９７ｍｌ、１１．９２ｍｍｏｌ）、無水酢酸（１．１３ｍｌ、１１．９２ｍｍｏｌ）、ギ酸ナトリウム（１．２２ｇ、５．９６ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（６６．９ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）、および、塩化リチウム（７５８ｍｇ、１７．８８ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。添加後、系を室温で１６時間撹拌し、系に３００ｍｌの酢酸エチルを加えた。系を水および飽和食塩水で１回ずつ洗浄した。溶媒を減圧下で除去して、無色の油４ｃ（１．２ｇ）を得た。
２－（メトキシカルボニル）－５，５－ジメチルシクロペント－１－エン－１－カルボン酸の製造
【化21】
【0077】
工程４
３，３－ジメチルシクロペント－１－エン－１，２－ジカルボン酸の製造
メタノール（６ｍｌ）、および水（６ｍｌ）を、４ｃ（１．２ｇ、６ｍｍｏｌ）、および水酸化リチウム一水和物（７５６ｍｇ、１８ｍｍｏｌ）の混合物に加え、室温で３時間撹拌した。メタノールを、減圧下で除去し、次に、溶液を濃塩酸でｐＨ１に調整し、酢酸エチルで抽出し、溶媒を減圧下で除去して、白色の固体の化合物４ｄ（１．０ｇ）を得た。
３，３－ジメチルシクロペント－１－エン－１，２－ジカルボン酸の製造
【化22】
【0078】
工程５
４，４－ジメチル－５，６－ジヒドロ－１Ｈ－シクロペンチル［ｃ］フラン－１，３（４Ｈ）－ジオンの製造
無水酢酸（１０ｍｌ）を化合物４ｄ（１．０ｇ、５．４３ｍｍｏｌ）に加えた。混合物を、１００℃の温度に加熱し、３時間撹拌し、冷却した。余分な無水酢酸を減圧下で除去して、淡褐色の液体の化合物４ｅ（８７５ｍｇ）を得て、これをそのまま次の工程に使用した。
４，４－ジメチル－５，６－ジヒドロ－１Ｈ－シクロペンチル［ｃ］フラン－１，３（４Ｈ）－ジオンの製造
【化23】
【0079】
工程６
１－（３，５－ジクロロ－４－（（７，７－ジメチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタン［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキシ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリルの製造
実施形態１の工程１において、原料３，４，５，６，－テトラヒドロフタル酸無水物（化合物１ａ）を、４，４－ジメチル－５，６－ジヒドロ－１Ｈ－シクロペンチル［ｃ］フラン－１，３（４Ｈ）－ジオン（化合物４ｅ）に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物１－（３，５－ジクロロ－４－（（７，７－ジメチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタン［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキシ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物４）を製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (s, 1H), 7.79 (s,2H), 2.97-2.93 (m, 2H), 2.01-1.98 (m, 2H), 1.34-1.20 (m, 6H).
MS m/z (ESI): 460.9 [M+1].
１－（３，５－ジクロロ－４－（（７，７－ジメチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタン［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキシ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリルの製造
実施形態１の工程１において、原料３，４，５，６，－テトラヒドロフタル酸無水物（化合物１ａ）を、４，４－ジメチル－５，６－ジヒドロ－１Ｈ－シクロペンチル［ｃ］フラン－１，３（４Ｈ）－ジオン（化合物４ｅ）に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物１－（３，５－ジクロロ－４－（（７，７－ジメチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタン［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキシ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物４）を製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (s, 1H), 7.79 (s,2H), 2.97-2.93 (m, 2H), 2.01-1.98 (m, 2H), 1.34-1.20 (m, 6H).
MS m/z (ESI): 460.9 [M+1].
【0080】
実施形態５
１－（３，５－ジクロロ－４－（（５－メチル－４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物５）の製造
５
１－（３，５－ジクロロ－４－（（５－メチル－４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物５）の製造
【化24】
【0081】
工程１
メチル ３－メチル－２－オキソシクロヘキサン－１－カルボキシレート ５ｂの製造
ＮａＨ（含有量６０％、１．９２ｇ、４８ｍｍｏｌ）を、２－メチルシクロヘキサノン（化合物５ａ）（４．４８ｇ、４０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍｌ）溶液に加えた。混合物を還流加熱し、３時間撹拌し、冷却した。混合物をメタノール（０．５ｍｌ）および酢酸（１ｍｌ）で大まかにクエンチした。反応系を氷浴に加え、ジクロロメタンで抽出した。溶媒を減圧下で除去し、カラムクロマトグラフィーにより精製して、油（化合物５ｂ）（５．６ｇ）を得た。
メチル ３－メチル－２－オキソシクロヘキサン－１－カルボキシレート ５ｂの製造
【化25】
【0082】
工程２
メチル ３－メチル－２－（（（トリフルオロメチル）スルホ）オキソ）シクロヘキシル－１－エン－１－カルボキシレートの製造
氷浴条件下、ＮａＨ（含有量６０％、６００ｍｇ、２５ｍｍｏｌ）を、化合物５ｂ（０．８５ｇ、５ｍｍｏｌ）のエチルエーテル（２０ｍｌ）液に加え、０．５時間撹拌した。次いで、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（２．８ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、系に滴下して加え、さらに０℃の温度で１時間撹拌した。系をＨ２Ｏ（５０ｍｌ）の添加でクエンチし、１ＮのＨＣｌを加えてｐＨ１に調整し、ジクロロメタンで抽出した。溶媒を減圧下で除去し、カラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝２０：１）により精製して、無色の油性の化合物５ｃ（１．０４ｇ）を得た。
メチル ３－メチル－２－（（（トリフルオロメチル）スルホ）オキソ）シクロヘキシル－１－エン－１－カルボキシレートの製造
【化26】
【0083】
工程３
２－（メトキシカルボニル）－６－メチルシクロヘキシル－１－エン－１－カルボン酸の製造
窒素雰囲気下、ジイソプロピルエチルアミン（０．７１４ｇ、７．００ｍｍｏｌ）、および、無水酢酸（０．９０３ｇ、７．００ｍｍｏｌ）を、化合物５ｃ（０．７１４ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）、および、ギ酸ナトリウム（０．７１４ｇ、１０．５０ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１５ｍｌ）溶液に、順次、滴下して加え、室温で１時間撹拌した。次いで、酢酸パラジウム（４０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、および塩化リチウム（４４５ｍｇ、１０．５０ｍｍｏｌ）を加え、系を室温で一晩撹拌した。これに酢酸エチル（３０ｍｌ）を加え、混合物を水で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、淡黄色の油性の化合物５ｄ（５９０ｍｇ）を得た。
２－（メトキシカルボニル）－６－メチルシクロヘキシル－１－エン－１－カルボン酸の製造
【化27】
【0084】
工程４
３－メチルシクロヘキシル－１－エン－１，２－ジアシッド ５ｅの製造
水酸化リチウム一水和物（０．３７５ｇ、８．９４ｍｍｏｌ）を、化合物５ｄ（０．５９０ｇ、２．９８ｍｍｏｌ）のメタノール（３ｍｌ）および水（３ｍｌ）の溶液に加え、室温で３時間撹拌した。次いで、メタノールを減圧下で除去した。１Ｎの塩酸水溶液を加えて系をｐＨ１に調整し、酢酸エチルで３回抽出した。有機相を合わせ、減圧下で濃縮し、溶媒除去して、油性の化合物５ｅ（０．５５０ｇ）を得た。
３－メチルシクロヘキシル－１－エン－１，２－ジアシッド ５ｅの製造
【化28】
【0085】
工程５
４－メチル－４，５，６，７－テトラヒドロイソフェニルフラン－１，３－ジオン ５ｆの製造
無水酢酸（６ｍｌ）を化合物５ｅ（０．５５０ｇ、２．９９ｍｍｏｌ）に加えた。混合物を１００℃の温度に加熱し、２時間撹拌した。系を冷却し、溶媒を減圧下で除去して、褐色の油性の化合物５ｆ（０．３４ｇ）を得て、そのまま次の工程に使用した。
４－メチル－４，５，６，７－テトラヒドロイソフェニルフラン－１，３－ジオン ５ｆの製造
【化29】
【0086】
工程６
１－（３，５－ジクロロ－４－（（５－メチル－４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物５）の製造
実施形態１の工程１において、原料３，４，５，６，－テトラヒドロフタル酸無水物（化合物１ａ）を、４－メチル－４，５，６，７－テトラヒドロイソフェニルフラン－１，３－ジオン（化合物５ｆ）に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物１－（３，５－ジクロロ－４－（（５－メチル－４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物５）を製造した。
MS m/z (ESI): 460.1 [M+1]
１－（３，５－ジクロロ－４－（（５－メチル－４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物５）の製造
実施形態１の工程１において、原料３，４，５，６，－テトラヒドロフタル酸無水物（化合物１ａ）を、４－メチル－４，５，６，７－テトラヒドロイソフェニルフラン－１，３－ジオン（化合物５ｆ）に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物１－（３，５－ジクロロ－４－（（５－メチル－４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物５）を製造した。
MS m/z (ESI): 460.1 [M+1]
【0087】
実施形態６
１－（３，５－ジクロロ－４－（（５，５－ジメチル－４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリルの製造
６
実施形態５の工程１において、原料２－メチルシクロヘキサノン（化合物５ａ）を、２，２－ジメチルシクロヘキサノンに置き換えたこと以外は、実施形態５の合成経路を実施して、表題の生成物１－（３，５－ジクロロ－４－（（５，５－ジメチル－４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物６）を製造した。
MS m/z (ESI): 474.1 [M+1]
１－（３，５－ジクロロ－４－（（５，５－ジメチル－４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリルの製造
【化30】
実施形態５の工程１において、原料２－メチルシクロヘキサノン（化合物５ａ）を、２，２－ジメチルシクロヘキサノンに置き換えたこと以外は、実施形態５の合成経路を実施して、表題の生成物１－（３，５－ジクロロ－４－（（５，５－ジメチル－４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物６）を製造した。
MS m/z (ESI): 474.1 [M+1]
【0088】
実施形態７
１－（３，５－ジクロロ－４－（（７－メチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンチル［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物７）の製造
７
実施形態５の工程１において、原料２－メチルシクロヘキサノン（化合物５ａ）を、２－メチルシクロペンタノンに置き換えたこと以外は、実施形態５の合成経路を実施して、表題の生成物１－（３，５－ジクロロ－４－（（７－メチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンチル［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物７）を製造した。
MS m/z (ESI): 446.0 [M+1]
１－（３，５－ジクロロ－４－（（７－メチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンチル［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物７）の製造
【化31】
実施形態５の工程１において、原料２－メチルシクロヘキサノン（化合物５ａ）を、２－メチルシクロペンタノンに置き換えたこと以外は、実施形態５の合成経路を実施して、表題の生成物１－（３，５－ジクロロ－４－（（７－メチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンチル［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物７）を製造した。
MS m/z (ESI): 446.0 [M+1]
【0089】
実施形態８
１－（３，５－ジクロロ－４－（（７－エチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタン［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物８）の製造
８
実施形態５の工程１において、原料２－メチルシクロヘキサノン（化合物５ａ）を、２－エチルシクロペンタノンに置き換えたこと以外は、実施形態５の合成経路を実施して、表題の生成物１－（３，５－ジクロロ－４－（（７－エチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタン［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物８）を製造した。
MS m/z (ESI): 460.1 [M+1]
１－（３，５－ジクロロ－４－（（７－エチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタン［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物８）の製造
【化32】
実施形態５の工程１において、原料２－メチルシクロヘキサノン（化合物５ａ）を、２－エチルシクロペンタノンに置き換えたこと以外は、実施形態５の合成経路を実施して、表題の生成物１－（３，５－ジクロロ－４－（（７－エチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタン［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキソ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物８）を製造した。
MS m/z (ESI): 460.1 [M+1]
【0090】
実施形態９
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物９）の製造
９
実施形態１の工程３の原料１，４－ジクロロ－５，６，７，８－テトラヒドロフタラジン（化合物１ｃ）を、１，４－ジクロロフタラジンに置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物９）を製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.00(s, 1H), 8.31(d, J=8.0Hz, 1H), 8.26 (d, J=8.0Hz, 1H), 8.09 (t, J=12.0Hz 1H), 8.03 (t, J=16.0Hz 1H), 7.81 (s, 2H).
MS m/z (ESI): 443.0 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物９）の製造
【化33】
実施形態１の工程３の原料１，４－ジクロロ－５，６，７，８－テトラヒドロフタラジン（化合物１ｃ）を、１，４－ジクロロフタラジンに置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物９）を製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.00(s, 1H), 8.31(d, J=8.0Hz, 1H), 8.26 (d, J=8.0Hz, 1H), 8.09 (t, J=12.0Hz 1H), 8.03 (t, J=16.0Hz 1H), 7.81 (s, 2H).
MS m/z (ESI): 443.0 [M+1].
【0091】
実施形態１０
２－（３，５－ジクロロ－４－（（５－クロロ－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物１０）の製造
１０
実施形態１の工程１において、原料３，４，５，６－テトラヒドロフタル酸無水物（化合物１ａ）を、３－クロロフタル酸無水物に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（５－クロロ－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物１０）を製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.00(s, 1H), 8.30 (d, J=8.0Hz, 1H), 8.15 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.95 (m, 1H), 7.80 (s, 2H).
MS m/z (ESI): 477.0 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（５－クロロ－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物１０）の製造
【化34】
実施形態１の工程１において、原料３，４，５，６－テトラヒドロフタル酸無水物（化合物１ａ）を、３－クロロフタル酸無水物に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（５－クロロ－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物１０）を製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.00(s, 1H), 8.30 (d, J=8.0Hz, 1H), 8.15 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.95 (m, 1H), 7.80 (s, 2H).
MS m/z (ESI): 477.0 [M+1].
【0092】
実施形態１１
２－（３，５－ジクロロ－４－（（５－メチル－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物１１）の製造
１１
実施形態１の工程１において、原料３，４，５，６－テトラヒドロフタル酸無水物（化合物１ａ）を、３－メチルフタル酸無水物に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（５－メチル－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物１１）を製造した。
MS m/z (ESI): 456.9 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（５－メチル－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物１１）の製造
【化35】
実施形態１の工程１において、原料３，４，５，６－テトラヒドロフタル酸無水物（化合物１ａ）を、３－メチルフタル酸無水物に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（５－メチル－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物１１）を製造した。
MS m/z (ESI): 456.9 [M+1].
【0093】
実施形態１２
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－エタノフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１２）の製造
１２
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－エタノフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１２）の製造
【化36】
【化37】
【0094】
工程１
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－エタノフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－カルボン酸の製造
酢酸（４ｍｌ）、および濃塩酸（１ｍｌ）をそれぞれ、化合物２（７７ｍｇ）に加え、１２０℃の温度に加熱し、５時間撹拌し、冷却した。反応溶液を水で希釈した。得られた固体を濾過し、水で洗浄し、石油エーテルで洗浄して、固体の化合物１２ａ（３５ｍｇ）を得て、そのまま次の反応に使用した。
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－エタノフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－カルボン酸の製造
酢酸（４ｍｌ）、および濃塩酸（１ｍｌ）をそれぞれ、化合物２（７７ｍｇ）に加え、１２０℃の温度に加熱し、５時間撹拌し、冷却した。反応溶液を水で希釈した。得られた固体を濾過し、水で洗浄し、石油エーテルで洗浄して、固体の化合物１２ａ（３５ｍｇ）を得て、そのまま次の反応に使用した。
【0095】
工程２
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－エタノフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオンの製造
メルカプト酢酸（２ｍｌ）を化合物１２ａ（３５．０ｍｇ）に加え、混合物を１７０℃の温度に加熱し、２時間撹拌した。混合物を冷却し、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８に調整し、酢酸エチルで３回抽出した。有機相を合わせた。溶媒を減圧下で除去し、薄層クロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝８：１）により分離および精製して、化合物１２（１０．０ｍｇ）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.10 (s, 1H), 7.77 (s, 2H), 7.33 (s, 1H), 2.01 (m, 2H), 1.93-1.75 (m, 4H), 1.39-1.27 (m, 4H).
MS m/z (ESI): 448.0 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－エタノフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオンの製造
メルカプト酢酸（２ｍｌ）を化合物１２ａ（３５．０ｍｇ）に加え、混合物を１７０℃の温度に加熱し、２時間撹拌した。混合物を冷却し、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８に調整し、酢酸エチルで３回抽出した。有機相を合わせた。溶媒を減圧下で除去し、薄層クロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝８：１）により分離および精製して、化合物１２（１０．０ｍｇ）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.10 (s, 1H), 7.77 (s, 2H), 7.33 (s, 1H), 2.01 (m, 2H), 1.93-1.75 (m, 4H), 1.39-1.27 (m, 4H).
MS m/z (ESI): 448.0 [M+1].
【0096】
実施形態１３
２－（３，５－ジクロロ－４－（（７，７－ジメチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンチル［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキソ）フェニル）－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１３）の製造
１３
実施形態１２の工程１において、原料２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－エタノフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物２）を、１－（３，５－ジクロロ－４－（（７，７－ジメチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタン［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキシ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物４）に置き換えたこと以外は、実施形態１２の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（７，７－ジメチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンチル［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキソ）フェニル）－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１３）を製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.02 (s, 1H), 7.77 (s, 2H), 7.35 (s, 1H), 2.94-2.90 (m, 2H), 1.99-1.95 (m, 2H), 1.32 (d, 6H).
MS m/z (ESI): 436.0 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（７，７－ジメチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンチル［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキソ）フェニル）－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１３）の製造
【化38】
実施形態１２の工程１において、原料２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－エタノフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物２）を、１－（３，５－ジクロロ－４－（（７，７－ジメチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンタン［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキシ）フェニル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－ニトリル（化合物４）に置き換えたこと以外は、実施形態１２の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（７，７－ジメチル－１－オキソ－２，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロペンチル［ｄ］ピリダジン－４－イル）オキソ）フェニル）－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１３）を製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.02 (s, 1H), 7.77 (s, 2H), 7.35 (s, 1H), 2.94-2.90 (m, 2H), 1.99-1.95 (m, 2H), 1.32 (d, 6H).
MS m/z (ESI): 436.0 [M+1].
【0097】
実施形態１４
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－１，２，４－トリアジン－３，５－（２Ｈ，４Ｈ）ジオン（化合物１４）の製造
１４
実施形態１２の工程１において、原料２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－エタノフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物２）を、２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物９）に置き換えたこと以外は、実施形態１２の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－１，２，４－トリアジン－３，５－（２Ｈ，４Ｈ）ジオン（化合物１４）を製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.00 (s, 1H), 8.30-8.23 (m, 2H), 8.09-7.99 (m, 2H), 7.18 (s, 1H).
MS m/z (ESI): 418.0 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－１，２，４－トリアジン－３，５－（２Ｈ，４Ｈ）ジオン（化合物１４）の製造
【化39】
実施形態１２の工程１において、原料２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロ－５，８－エタノフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物２）を、２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物９）に置き換えたこと以外は、実施形態１２の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－１，２，４－トリアジン－３，５－（２Ｈ，４Ｈ）ジオン（化合物１４）を製造した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.00 (s, 1H), 8.30-8.23 (m, 2H), 8.09-7.99 (m, 2H), 7.18 (s, 1H).
MS m/z (ESI): 418.0 [M+1].
【0098】
実施形態１５
２－（３，５－ジクロロ－４－（（５－フルオロ－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物１５）の製造
実施形態１の工程１において、原料３，４，５，６，－テトラヒドロフタル酸無水物（化合物１ａ）を、３－フルオロフタル酸無水物に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（５－フルオロ－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物１５）を製造した。
MS m/z (ESI): 461.0 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（５－フルオロ－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物１５）の製造
【化40】
MS m/z (ESI): 461.0 [M+1].
【0099】
実施形態１６
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－６－メチル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１６）の製造
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－６－メチル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１６）の製造
【化41】
【0100】
工程１
４－（２，６－ジクロロ－４－ヨードフェノキシ）－５，６，７，８－テトラヒドロフタラジン－１（２Ｈ）－オン（化合物１６ａ）の製造
氷浴条件下、水（４ｍｌ）および濃塩酸（２ｍｌ）を、順次、１ｅ（１００ｍｇ）に加え、次に、亜硝酸ナトリウム（３０ｍｇ）の水（２ｍｌ）の溶液を滴下して加えた。氷浴条件を維持して反応物を１時間撹拌した。ヨウ化カリウム（１０４ｍｇ）を滴下して加え、混合物を室温に昇温し、１６時間撹拌した。混合物をジクロロメタンで抽出し、溶媒を減圧下で除去して、黄色の固体１６ａ（１００ｍｇ）を得て、そのまま次の反応に使用した。
４－（２，６－ジクロロ－４－ヨードフェノキシ）－５，６，７，８－テトラヒドロフタラジン－１（２Ｈ）－オン（化合物１６ａ）の製造
【化42】
【0101】
工程２
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－６－メチル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１６）の製造
Ｎ，Ｎ－ジカルボンアミド（２．０ｍｌ）を、化合物１６ａ（２０ｍｇ）、６－アザチミン（６．６ｍｇ）、ヨウ化第一銅（８．９ｍｇ）、および炭酸カリウム（３０ｍｇ）の混合物に加え、系を１２０℃の温度に加熱し、１２時間撹拌した。系を冷却し、濾過し、酢酸エチルを添加して水から分離した。溶媒を減圧下で有機相から除去し、薄層クロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝８：１）により分離および精製して、化合物１６（５．０ｍｇ）を得た。
MS m/z (ESI): 436.1 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－６－メチル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１６）の製造
【化43】
MS m/z (ESI): 436.1 [M+1].
【0102】
実施形態１７
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－６－イソプロピル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１７）の製造
実施形態１６の工程２において、原料６－アザチミンを、６－イソプロピル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ、２０１２、９（３）５３６－５５６」の既知の方法を実施して製造）に置き換えたこと以外は、実施形態１６の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－６－イソプロピル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１７）を製造した。
MS m/z (ESI): 464.1 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－６－イソプロピル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１７）の製造
【化44】
MS m/z (ESI): 464.1 [M+1].
【0103】
実施形態１８
６－シクロプロピル－２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１８）の製造
実施形態１６の工程２において、原料６－アザチミンを、６－シクロプロピル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（「Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１９７５、４０、１０３８－１０４１」の既知の方法を実施して製造）に置き換えたこと以外は、実施形態１６の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－６－シクロプロピル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１８）を製造した。
MS m/z (ESI): 462.1 [M+1].
６－シクロプロピル－２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４，５，６，７，８－ヘキサヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１８）の製造
【化45】
MS m/z (ESI): 462.1 [M+1].
【0104】
実施形態１９
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－６－メチル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１９）の製造
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－６－メチル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１９）の製造
【化46】
【0105】
工程１
３，５－ジクロロ－４－（（４－クロロフタラジン－１－イル）オキソ）アニリン（化合物１９ａ）の製造
実施形態１における１，４－ジクロロ－５，６，７，８－テトラヒドロフタラジン（化合物１ｃ）を、１，４－ジクロロフタラジンに置き換えたこと以外は、実施形態１の工程３の中間体１ｄの合成経路を実施して、表題の生成物３，５－ジクロロ－４－（（４－クロロフタラジン－１－イル）オキソ）アニリン（化合物１９ａ）を製造した。
３，５－ジクロロ－４－（（４－クロロフタラジン－１－イル）オキソ）アニリン（化合物１９ａ）の製造
【化47】
【0106】
工程２
４－（４－アミノ－２，６－ジクロロフェノキシ）フタラジン－１（２Ｈ）－オン（化合物１９ｂ）の製造
実施形態１における３，５－ジクロロ－４－（（４－クロロ－５，６，７，８－テトラヒドロフタラジン－１－イル）オキシ）アニリン（化合物１ｄ）を、３，５－ジクロロ－４－（（４－クロロフタラジン－１－イル）オキソ）アニリン（化合物１９ａ）に置き換えたこと以外は、実施形態１の工程４の中間体１ｅの合成経路を実施して、表題の生成物４－（４－アミノ－２，６－ジクロロフェノキシ）フタラジン－１（２Ｈ）－オン（化合物１９ｂ）を製造した。
４－（４－アミノ－２，６－ジクロロフェノキシ）フタラジン－１（２Ｈ）－オン（化合物１９ｂ）の製造
【化48】
【0107】
工程３
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－６－メチル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１９）の製造
実施形態１６の工程１において、４－（２，６－ジクロロ－４－ヨードフェノキシ）－５，６，７，８－テトラヒドロフタラジン－１（２Ｈ）－オン（化合物１６ａ）を、化合物４－（４－アミノ－２，６－ジクロロフェノキシ）フタラジン－１（２Ｈ）－オン（化合物１９ｂ）に置き換えたこと以外は、実施形態１６の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－６－メチル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１９）を製造した。
MS m/z (ESI): 432.0 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－６－メチル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１９）の製造
実施形態１６の工程１において、４－（２，６－ジクロロ－４－ヨードフェノキシ）－５，６，７，８－テトラヒドロフタラジン－１（２Ｈ）－オン（化合物１６ａ）を、化合物４－（４－アミノ－２，６－ジクロロフェノキシ）フタラジン－１（２Ｈ）－オン（化合物１９ｂ）に置き換えたこと以外は、実施形態１６の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキソ）フェニル）－６－メチル－１，２，４－トリアジン－３，５（２Ｈ，４Ｈ）－ジオン（化合物１９）を製造した。
MS m/z (ESI): 432.0 [M+1].
【0108】
実施形態２０
２－（３，５－ジクロロ－４－（（６－メチル－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物２０）の製造
実施形態１の工程１において、原料テトラヒドロフタル酸無水物（１ａ）を、４－メチルフタル酸無水物に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（６－メチル－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物２０）を製造した。
MS m/z (ESI): 457.0 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（６－メチル－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物２０）の製造
【化49】
MS m/z (ESI): 457.0 [M+1].
【0109】
実施形態２１
２－（３，５－ジクロロ－４－（（６－クロロ－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物２１）の製造
実施形態１の工程１において、原料テトラヒドロフタル酸無水物（１ａ）を、４－クロロフタル酸無水物に置き換えたこと以外は、実施形態１の合成経路を実施して、表題の生成物２－（３，５－ジクロロ－４－（（６－クロロ－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物２１）を製造した。
MS m/z (ESI): 477.0 [M+1].
２－（３，５－ジクロロ－４－（（６－クロロ－４－オキソ－３，４－ジヒドロフタラジン－１－イル）オキシ）フェニル）－３，５－ジオキソ－２，３，４，５－テトラヒドロ－１，２，４－トリアジン－６－ニトリル（化合物２１）の製造
【化50】
MS m/z (ESI): 477.0 [M+1].
【0110】
試験１：ＴＲαに対する化合物の結合力の試験
１．主な実験材料と装置
Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダー；
ビオチン－ＳＲＣ２－２コアクチベーターペプチド（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から市販）；
ＴＲαＬＢＤ、ＧＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．ＰＶ４７６２）；
ユウロピウム結合抗グルタチオン抗体（Ｃｉｓｂｉｏから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．６１ＧＳＴＫＬＢ）；および、
ストレプトアビジン－Ｄ２（Ｃｉｓｂｉｏから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．６１０ＳＡＤＡＢ）
１．主な実験材料と装置
Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダー；
ビオチン－ＳＲＣ２－２コアクチベーターペプチド（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から市販）；
ＴＲαＬＢＤ、ＧＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．ＰＶ４７６２）；
ユウロピウム結合抗グルタチオン抗体（Ｃｉｓｂｉｏから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．６１ＧＳＴＫＬＢ）；および、
ストレプトアビジン－Ｄ２（Ｃｉｓｂｉｏから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．６１０ＳＡＤＡＢ）
【0111】
２．化合物の調製と処理
２．１ 化合物のジメチルスルホキシドストック溶液の調製
すべての化合物をジメチルスルホキシドに溶解して、１０ｍｍｏｌのストック溶液を調製した。
２．２ 化合物の保管
化合物をジメチルスルホキシドに溶解した後、溶液をデシケーター内で室温で３ヶ月間保管することができる。長期保管の場合、化合物を－２０℃の冷凍庫に入れる。
２．１ 化合物のジメチルスルホキシドストック溶液の調製
すべての化合物をジメチルスルホキシドに溶解して、１０ｍｍｏｌのストック溶液を調製した。
２．２ 化合物の保管
化合物をジメチルスルホキシドに溶解した後、溶液をデシケーター内で室温で３ヶ月間保管することができる。長期保管の場合、化合物を－２０℃の冷凍庫に入れる。
【0112】
３．実験ステップ
３．１ １ｘ反応バッファーの調製
３．２ 化合物のスクリーニング
ａ）１００％ジメチルスルホキシドを使用して、ポジティブ薬物のトリヨードサイロニン（Ｔ３）を１０ｍｍｏｌ（１００ｘ）から、または試験する化合物を１ｍｍｏｌ（１００ｘ）から、１：３の等しい比率で、合計１０個の濃度に希釈した。
ｂ）４ｘ濃度勾配希釈化合物を１ｘ反応バッファーで調製した。
ｃ）５μｌの４ｘ濃度勾配希釈化合物を３８４ウェル試験プレートに添加した。
ｄ）４ｘＴＲαＬＢＤおよび４ｘＲＸＲαを１ｘ反応バッファーで調製した。
ｅ）５μｌの４ｘＴＲαＬＢＤおよび４ｘＲＸＲαを３８４ウェル試験プレートに添加した。
ｆ）２ｘビオチン－ＳＲＣ２－２、２ｘユーロピウム結合抗グルタチオン抗体、および２ｘストレプトアビジン－ｄ２を、１ｘ反応バッファーで調製した。
ｇ）１０μｌの２ｘ混合溶液（ステップｆ参照）を３８４ウェル試験プレートに添加した。
ｈ）３８４ウェル試験プレートを遠心分離機で１分間に１０００回転で遠心分離した。
ｉ）光から保護しながら、室温で１時間、インキュベーションを行った。
ｊ）波長６６５ｎｍおよび６１５ｎｍにおける３８４ウェル試験プレートの各ウェルの蛍光シグナル値をＥｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダーで記録し、６６５ｎｍ／６１５ｎｍの蛍光比を計算した。
３．１ １ｘ反応バッファーの調製
３．２ 化合物のスクリーニング
ａ）１００％ジメチルスルホキシドを使用して、ポジティブ薬物のトリヨードサイロニン（Ｔ３）を１０ｍｍｏｌ（１００ｘ）から、または試験する化合物を１ｍｍｏｌ（１００ｘ）から、１：３の等しい比率で、合計１０個の濃度に希釈した。
ｂ）４ｘ濃度勾配希釈化合物を１ｘ反応バッファーで調製した。
ｃ）５μｌの４ｘ濃度勾配希釈化合物を３８４ウェル試験プレートに添加した。
ｄ）４ｘＴＲαＬＢＤおよび４ｘＲＸＲαを１ｘ反応バッファーで調製した。
ｅ）５μｌの４ｘＴＲαＬＢＤおよび４ｘＲＸＲαを３８４ウェル試験プレートに添加した。
ｆ）２ｘビオチン－ＳＲＣ２－２、２ｘユーロピウム結合抗グルタチオン抗体、および２ｘストレプトアビジン－ｄ２を、１ｘ反応バッファーで調製した。
ｇ）１０μｌの２ｘ混合溶液（ステップｆ参照）を３８４ウェル試験プレートに添加した。
ｈ）３８４ウェル試験プレートを遠心分離機で１分間に１０００回転で遠心分離した。
ｉ）光から保護しながら、室温で１時間、インキュベーションを行った。
ｊ）波長６６５ｎｍおよび６１５ｎｍにおける３８４ウェル試験プレートの各ウェルの蛍光シグナル値をＥｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダーで記録し、６６５ｎｍ／６１５ｎｍの蛍光比を計算した。
【0113】
４．データ分析
４．１ 各ウェルの相対比（比665nm/615nm－比ブランク）の計算
４．２ 活性率は、下記のように計算した。
４．３ 曲線プロットとＥＣ５０の計算
ＥＣ５０は、Ｇｒａｐｈｐａｄ５．０を使用して非線形回帰法で計算し、化合物の活性（％）と対数濃度の関係に適合させた。
Ｙ＝最小＋（最大－最小）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０－Ｘ）×傾き））
Ｘ：化合物の対数濃度、Ｙ：活性（パーセント）
４．１ 各ウェルの相対比（比665nm/615nm－比ブランク）の計算
４．２ 活性率は、下記のように計算した。
【数1】
ＥＣ５０は、Ｇｒａｐｈｐａｄ５．０を使用して非線形回帰法で計算し、化合物の活性（％）と対数濃度の関係に適合させた。
Ｙ＝最小＋（最大－最小）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０－Ｘ）×傾き））
Ｘ：化合物の対数濃度、Ｙ：活性（パーセント）
【0114】
下記の表１に特定の試験データを示す。
【0115】
試験２：ＴＲαに対する化合物のアゴニスト活性の評価
１．主な実験材料と装置
Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダー
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＡＴＣＣから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．：ＣＲＬ－３２１６）
ｐＧＬ４．３５［ｌｕｃ２Ｐ／９ＸＧＡＬ４ ＵＡＳ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．：Ｅ１３７０）
ｐＢＩＮＤ－ＴＲαプラスミド（Ｐｈａｒｍａｒｏｎから）
ｐＢＩＮＤ－ＲＸＲαプラスミド（Ｐｈａｒｍａｒｏｎから）
ＬｉｐｏＬＴＸトランスフェクション剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．：１５３３８－１００）
１．主な実験材料と装置
Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダー
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＡＴＣＣから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．：ＣＲＬ－３２１６）
ｐＧＬ４．３５［ｌｕｃ２Ｐ／９ＸＧＡＬ４ ＵＡＳ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．：Ｅ１３７０）
ｐＢＩＮＤ－ＴＲαプラスミド（Ｐｈａｒｍａｒｏｎから）
ｐＢＩＮＤ－ＲＸＲαプラスミド（Ｐｈａｒｍａｒｏｎから）
ＬｉｐｏＬＴＸトランスフェクション剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．：１５３３８－１００）
【0116】
２．化合物の調製
２．１ 化合物の溶解
化合物粉末は、標準的なスキームに従って、１０ｍｍｏｌのジメチルスルホキシドストック溶液に調製した。
２．２ 化合物保管
ジメチルスルホキシドに溶解したすべての化合物は、デシケーター内で室温で短期間保管するか、－２０℃で長期間保管した。
２．３ 実験化合物の調製
２．３．１ 試験するすべての化合物を、１０μｍｏｌの初期濃度から開始して、ジメチルスルホキシドにより３倍勾配で１０個の希釈勾配に希釈した。
２．３．２ ポジティブコントロールのトリヨードサイロニン（Ｔ３）を、１６．６７μｍｏｌの初期濃度から開始して、ジメチルスルホキシドにより３倍勾配で１０個の希釈勾配に希釈した。
２．３．３ １６６．７倍のポジティブコントロール（１６．６７μｍｏｌ、トリヨードサイロニン（Ｔ３））および１６６．７倍のネガティブコントロール（１００％ジメチルスルホキシド）を調製した。
２．４ 化合物のプレートを閉じて、５分間振とうした。
２．１ 化合物の溶解
化合物粉末は、標準的なスキームに従って、１０ｍｍｏｌのジメチルスルホキシドストック溶液に調製した。
２．２ 化合物保管
ジメチルスルホキシドに溶解したすべての化合物は、デシケーター内で室温で短期間保管するか、－２０℃で長期間保管した。
２．３ 実験化合物の調製
２．３．１ 試験するすべての化合物を、１０μｍｏｌの初期濃度から開始して、ジメチルスルホキシドにより３倍勾配で１０個の希釈勾配に希釈した。
２．３．２ ポジティブコントロールのトリヨードサイロニン（Ｔ３）を、１６．６７μｍｏｌの初期濃度から開始して、ジメチルスルホキシドにより３倍勾配で１０個の希釈勾配に希釈した。
２．３．３ １６６．７倍のポジティブコントロール（１６．６７μｍｏｌ、トリヨードサイロニン（Ｔ３））および１６６．７倍のネガティブコントロール（１００％ジメチルスルホキシド）を調製した。
２．４ 化合物のプレートを閉じて、５分間振とうした。
【0117】
３ 実験プロセス
３．１ 細胞懸濁液の調製およびプレート播種
ａ）すべての細胞をＡＴＣＣ標準操作に従って培養し、ＨＥＫ２９３Ｔを指数増殖期に試験した。
ｂ）培地を廃棄した。
ｃ）細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄した。
ｄ）トリプシン処理溶液を加えて細胞を処理し、完全培地で処理を停止した。
ｅ）細胞を収集してカウントし、細胞の生存率が９０％を超えた場合にのみ実験を実施できた。
ｆ）２．５×１０６個のＨＥＫ２９３－ＬＵＣ細胞を６０ｍｍの細胞培養皿に播種した。
ｇ）細胞を播種した培養皿を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れ、一晩培養した。
３．２ 細胞トランスフェクション
ａ）ＬｉｐｏＬＴＸトランスフェクション剤を平衡化のために室温に置いた。
ｂ）６μｌのＰｌｕｓ剤および６μｇのＤＮＡを、２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地にチューブ壁に接触させずに加え、ピペッティングガンによるブローとピペッティングにより均一に混合した。そして、
プラスミド：２．５μｇのｐＢＩＮＤ－ＴＲα、２．５μｇのｐＢＩＮＤ－ＲＸＲα、および１μｇのｐＧＬ４．３５プラスミドがそれぞれ添加された。
ｃ）１２μｌのＬｉｐｏＬＴＸおよび２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地をチューブの壁に接触させずに加え、ピペッティングガンによるブローとピペッティングにより均一に混合した。
ｄ）ＤＮＡ Ｐｌｕｓ（ステップ３．２．ｂ参照）と混合した薬剤を、希釈したＬｉｐｏＬＴＸ（ステップ３．２．ｃ参照）トランスフェクション剤に添加し、室温で１５分間静置した。
ｅ）ＤＮＡと混合したトランスフェクション剤を６０ｍｍの細胞培養皿（ステップ３．１参照）に加えた。
ｆ）培養皿を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れ、５時間培養した。
３．３ 化合物の処理
ａ）１５０ｎｌの希釈化合物（ステップ２．３参照）をＥｃｈｏ５５０によって細胞培養プレート（６００７６８０－５０、ＰＥ）に移した。
ｂ）細胞（ステップ３．２参照）を３８４細胞培養プレート（６００７６８０－５０、ＰＥ）に、１ウェルあたり１５，０００個の細胞および２５μｌの培地（５％ウシ胎児血清を含む）となるように、播種した。
ｃ）細胞を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで一晩培養した。
３．４ 化合物の検出
ａ）Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）検出剤を室温に置いた。
ｂ）３８４細胞プレート（ステップ３．３参照）を室温に置いた。
ｃ）１ウェルあたり２５μｌのＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）検出剤を細胞培養プレート（ステップ３．４ｂ参照）に添加した。
ｄ）プレートを振とう機に置き、光から保護しながら５分間振とうした。
ｅ）化学発光値をＥｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダーで検出した。
３．１ 細胞懸濁液の調製およびプレート播種
ａ）すべての細胞をＡＴＣＣ標準操作に従って培養し、ＨＥＫ２９３Ｔを指数増殖期に試験した。
ｂ）培地を廃棄した。
ｃ）細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄した。
ｄ）トリプシン処理溶液を加えて細胞を処理し、完全培地で処理を停止した。
ｅ）細胞を収集してカウントし、細胞の生存率が９０％を超えた場合にのみ実験を実施できた。
ｆ）２．５×１０６個のＨＥＫ２９３－ＬＵＣ細胞を６０ｍｍの細胞培養皿に播種した。
ｇ）細胞を播種した培養皿を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れ、一晩培養した。
３．２ 細胞トランスフェクション
ａ）ＬｉｐｏＬＴＸトランスフェクション剤を平衡化のために室温に置いた。
ｂ）６μｌのＰｌｕｓ剤および６μｇのＤＮＡを、２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地にチューブ壁に接触させずに加え、ピペッティングガンによるブローとピペッティングにより均一に混合した。そして、
プラスミド：２．５μｇのｐＢＩＮＤ－ＴＲα、２．５μｇのｐＢＩＮＤ－ＲＸＲα、および１μｇのｐＧＬ４．３５プラスミドがそれぞれ添加された。
ｃ）１２μｌのＬｉｐｏＬＴＸおよび２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地をチューブの壁に接触させずに加え、ピペッティングガンによるブローとピペッティングにより均一に混合した。
ｄ）ＤＮＡ Ｐｌｕｓ（ステップ３．２．ｂ参照）と混合した薬剤を、希釈したＬｉｐｏＬＴＸ（ステップ３．２．ｃ参照）トランスフェクション剤に添加し、室温で１５分間静置した。
ｅ）ＤＮＡと混合したトランスフェクション剤を６０ｍｍの細胞培養皿（ステップ３．１参照）に加えた。
ｆ）培養皿を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れ、５時間培養した。
３．３ 化合物の処理
ａ）１５０ｎｌの希釈化合物（ステップ２．３参照）をＥｃｈｏ５５０によって細胞培養プレート（６００７６８０－５０、ＰＥ）に移した。
ｂ）細胞（ステップ３．２参照）を３８４細胞培養プレート（６００７６８０－５０、ＰＥ）に、１ウェルあたり１５，０００個の細胞および２５μｌの培地（５％ウシ胎児血清を含む）となるように、播種した。
ｃ）細胞を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで一晩培養した。
３．４ 化合物の検出
ａ）Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）検出剤を室温に置いた。
ｂ）３８４細胞プレート（ステップ３．３参照）を室温に置いた。
ｃ）１ウェルあたり２５μｌのＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）検出剤を細胞培養プレート（ステップ３．４ｂ参照）に添加した。
ｄ）プレートを振とう機に置き、光から保護しながら５分間振とうした。
ｅ）化学発光値をＥｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダーで検出した。
【0118】
４．データ分析
４．１ 活性（％）の計算
４．２ ＥＣ５０の計算、および化合物の用量－効果の曲線のプロット
化合物のＥＣ５０は、Ｇｒａｐｈｐａｄ５．０を使用して計算し、化合物の活性（％）および対数濃度に適合させた。
Ｙ＝最小＋（最大－最小）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０－Ｘ）×傾き））
Ｘ：化合物の対数濃度、Ｙ：阻害率（パーセント）
４．１ 活性（％）の計算
【数2】
化合物のＥＣ５０は、Ｇｒａｐｈｐａｄ５．０を使用して計算し、化合物の活性（％）および対数濃度に適合させた。
Ｙ＝最小＋（最大－最小）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０－Ｘ）×傾き））
Ｘ：化合物の対数濃度、Ｙ：阻害率（パーセント）
【0119】
下記の表１に特定の試験データを示す。
【0120】
試験３：ＴＲβに対する化合物の結合力の試験
１．主な実験材料と装置
Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダー；
ビオチン－ＳＲＣ２－２コアクチベーターペプチド（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．、Ｌｔｄ．から市販）
ＴＲβＬＢＤ、ＧＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．ＰＶ４７６２）
ユウロピウム結合抗グルタチオン抗体（Ｃｉｓｂｉｏから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．６１ＧＳＴＫＬＢ）
ストレプトアビジン－Ｄ２（Ｃｉｓｂｉｏから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．６１０ＳＡＤＡＢ）
１．主な実験材料と装置
Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダー；
ビオチン－ＳＲＣ２－２コアクチベーターペプチド（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．、Ｌｔｄ．から市販）
ＴＲβＬＢＤ、ＧＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．ＰＶ４７６２）
ユウロピウム結合抗グルタチオン抗体（Ｃｉｓｂｉｏから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．６１ＧＳＴＫＬＢ）
ストレプトアビジン－Ｄ２（Ｃｉｓｂｉｏから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．６１０ＳＡＤＡＢ）
【0121】
２．化合物の調製と処理
２．１ 化合物のジメチルスルホキシドストック溶液の調製
すべての化合物をジメチルスルホキシドに溶解して、１０ｍｍｏｌのストック溶液を調製した。
２．２ 化合物の保管
化合物をジメチルスルホキシドに溶解した後、溶液をデシケーター内で室温で３ヶ月間保管することができる。長期保管の場合、化合物を－２０℃の冷凍庫に入れる。
２．１ 化合物のジメチルスルホキシドストック溶液の調製
すべての化合物をジメチルスルホキシドに溶解して、１０ｍｍｏｌのストック溶液を調製した。
２．２ 化合物の保管
化合物をジメチルスルホキシドに溶解した後、溶液をデシケーター内で室温で３ヶ月間保管することができる。長期保管の場合、化合物を－２０℃の冷凍庫に入れる。
【0122】
３．実験ステップ
３．１ １ｘ反応バッファーの調製
３．２ 化合物スクリーニング
ａ）１００％ジメチルスルホキシドを使用して、ポジティブ薬物のトリヨードサイロニン（Ｔ３）を１０μｍｏｌ（１００ｘ）から、または試験する化合物を１ｍｍｏｌ（１００ｘ）から、１：３の等しい比率で、合計１０個の濃度に希釈した。
ｂ）４ｘ濃度勾配希釈化合物を１ｘ反応バッファーで調製した。
ｃ）５μｌの４ｘ濃度勾配希釈化合物を３８４ウェル試験プレートに添加した。
ｄ）４ｘＴＲβＬＢＤおよび４ｘＲＸＲβを１ｘ反応バッファーで調製した。
ｅ）５μｌの４ｘＴＲβＬＢＤおよび４ｘＲＸＲβを３８４ウェル試験プレートに添加した。
ｆ）２ｘビオチン－ＳＲＣ２－２、２ｘユーロピウム結合抗グルタチオン抗体、および２ｘストレプトアビジン－ｄ２を、１ｘ反応バッファーで調製した。
ｇ）１０μｌの２ｘ混合溶液（ステップｆ参照）を３８４ウェル試験プレートに添加した。
ｈ）３８４ウェル試験プレートを遠心分離機で１分間に１０００回転で遠心分離した。
ｉ）光から保護しながら、室温で１時間、インキュベーションを行った。
ｊ）波長６６５ｎｍおよび６１５ｎｍにおける３８４ウェル試験プレートの各ウェルの蛍光シグナル値をＥｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダーで記録し、６６５ｎｍ／６１５ｎｍの蛍光比を計算した。
３．１ １ｘ反応バッファーの調製
３．２ 化合物スクリーニング
ａ）１００％ジメチルスルホキシドを使用して、ポジティブ薬物のトリヨードサイロニン（Ｔ３）を１０μｍｏｌ（１００ｘ）から、または試験する化合物を１ｍｍｏｌ（１００ｘ）から、１：３の等しい比率で、合計１０個の濃度に希釈した。
ｂ）４ｘ濃度勾配希釈化合物を１ｘ反応バッファーで調製した。
ｃ）５μｌの４ｘ濃度勾配希釈化合物を３８４ウェル試験プレートに添加した。
ｄ）４ｘＴＲβＬＢＤおよび４ｘＲＸＲβを１ｘ反応バッファーで調製した。
ｅ）５μｌの４ｘＴＲβＬＢＤおよび４ｘＲＸＲβを３８４ウェル試験プレートに添加した。
ｆ）２ｘビオチン－ＳＲＣ２－２、２ｘユーロピウム結合抗グルタチオン抗体、および２ｘストレプトアビジン－ｄ２を、１ｘ反応バッファーで調製した。
ｇ）１０μｌの２ｘ混合溶液（ステップｆ参照）を３８４ウェル試験プレートに添加した。
ｈ）３８４ウェル試験プレートを遠心分離機で１分間に１０００回転で遠心分離した。
ｉ）光から保護しながら、室温で１時間、インキュベーションを行った。
ｊ）波長６６５ｎｍおよび６１５ｎｍにおける３８４ウェル試験プレートの各ウェルの蛍光シグナル値をＥｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダーで記録し、６６５ｎｍ／６１５ｎｍの蛍光比を計算した。
【0123】
４．データ分析
４．１ 各ウェルの相対比（比665nm/615nm－比ブランク）の計算
４．２ 活性率は、下記のように計算した。
４．３ 曲線プロットとＥＣ５０の計算
ＥＣ５０は、Ｇｒａｐｈｐａｄ５．０を使用して非線形回帰法で計算し、化合物の活性（％）と対数濃度の関係を適合させた。
Ｙ＝最小＋（最大－最小）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０－Ｘ）×傾き））
Ｘ：化合物の対数濃度、Ｙ：活性（パーセント）
４．１ 各ウェルの相対比（比665nm/615nm－比ブランク）の計算
４．２ 活性率は、下記のように計算した。
【数3】
ＥＣ５０は、Ｇｒａｐｈｐａｄ５．０を使用して非線形回帰法で計算し、化合物の活性（％）と対数濃度の関係を適合させた。
Ｙ＝最小＋（最大－最小）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０－Ｘ）×傾き））
Ｘ：化合物の対数濃度、Ｙ：活性（パーセント）
【0124】
下記の表１に特定の試験データを示す。
【0125】
表１ サイロキシン受容体βに対する化合物の結合活性を以下に示す。
【表1】
【0126】
結論
開示の比較化合物５３と比較して、本発明によるいくつかの化合物は、予想以上に高いＴＨＲβ活性（＜０．２μＭ）を示し、いくつかの化合物は、比較化合物５３よりもＴＨＲαに対して高い選択性を示した。
開示の比較化合物５３と比較して、本発明によるいくつかの化合物は、予想以上に高いＴＨＲβ活性（＜０．２μＭ）を示し、いくつかの化合物は、比較化合物５３よりもＴＨＲαに対して高い選択性を示した。
【0127】
試験４：ＴＲβ受容体に対する化合物のアゴニスト活性の評価
実験の要約
ＴＲβ－ＬＢＤおよびＲＸＲα－ＬＢＤコード配列を、それぞれ、ｐＢＩＮＤプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１５８１）に挿入した。発現ベクターおよびレポーターベクター（安定した統合ＧＡＬ４プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を保有するｐＧＬ４．３５）を、宿主細胞で共発現させた。アゴニストが対応するキメラ受容体に結合すると、キメラ受容体は、レポーター遺伝子ベクターのＧＡＬ４結合部位に結合し、レポーター遺伝子の発現を刺激する。化学発光シグナルの強度に従って、ＴＲβ受容体に対する化合物のアゴニスト活性を求めた。
実験の要約
ＴＲβ－ＬＢＤおよびＲＸＲα－ＬＢＤコード配列を、それぞれ、ｐＢＩＮＤプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１５８１）に挿入した。発現ベクターおよびレポーターベクター（安定した統合ＧＡＬ４プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を保有するｐＧＬ４．３５）を、宿主細胞で共発現させた。アゴニストが対応するキメラ受容体に結合すると、キメラ受容体は、レポーター遺伝子ベクターのＧＡＬ４結合部位に結合し、レポーター遺伝子の発現を刺激する。化学発光シグナルの強度に従って、ＴＲβ受容体に対する化合物のアゴニスト活性を求めた。
【0128】
実験材料および装置
Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダー
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＡＴＣＣから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．：ＣＲＬ－３２１６）
ｐＧＬ４．３５［ｌｕｃ２Ｐ／９ＸＧＡＬ４ ＵＡＳ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａから市販（Ａｒｔ．Ｎｏ．：Ｅ１３７０）
ｐＢＩＮＤ－ＴＲβプラスミド（Ｐｈａｒｍａｒｏｎから）
ｐＢＩＮＤ－ＲＸＲαプラスミド（Ｐｈａｒｍａｒｏｎから）
ＬｉｐｏＬＴＸトランスフェクション剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．：１５３３８－１００）
Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．：Ｅ２５２０）
Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダー
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＡＴＣＣから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．：ＣＲＬ－３２１６）
ｐＧＬ４．３５［ｌｕｃ２Ｐ／９ＸＧＡＬ４ ＵＡＳ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａから市販（Ａｒｔ．Ｎｏ．：Ｅ１３７０）
ｐＢＩＮＤ－ＴＲβプラスミド（Ｐｈａｒｍａｒｏｎから）
ｐＢＩＮＤ－ＲＸＲαプラスミド（Ｐｈａｒｍａｒｏｎから）
ＬｉｐｏＬＴＸトランスフェクション剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．：１５３３８－１００）
Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａから市販）（Ａｒｔ．Ｎｏ．：Ｅ２５２０）
【0129】
２．３ 実験化合物の調製
試験するすべての化合物を、１０ｍｍｏｌの初期濃度から開始して、ジメチルスルホキシドにより３倍勾配で１０個の希釈勾配に希釈した。
ポジティブコントロールのトリヨードサイロニン（Ｔ３）を、１６．６７μｍｏｌの初期濃度から開始して、ジメチルスルホキシドにより３倍勾配で１０個の希釈勾配に希釈した。
１６６．７倍のポジティブコントロール（１６．６７μｍｏｌ、トリヨードサイロニン（Ｔ３））および１６６．７倍のネガティブコントロール（１００％ジメチルスルホキシド）を調製した。
化合物のプレートを閉じて、５分間振とうした。
試験するすべての化合物を、１０ｍｍｏｌの初期濃度から開始して、ジメチルスルホキシドにより３倍勾配で１０個の希釈勾配に希釈した。
ポジティブコントロールのトリヨードサイロニン（Ｔ３）を、１６．６７μｍｏｌの初期濃度から開始して、ジメチルスルホキシドにより３倍勾配で１０個の希釈勾配に希釈した。
１６６．７倍のポジティブコントロール（１６．６７μｍｏｌ、トリヨードサイロニン（Ｔ３））および１６６．７倍のネガティブコントロール（１００％ジメチルスルホキシド）を調製した。
化合物のプレートを閉じて、５分間振とうした。
【0130】
実験プロセス
３．１ 細胞懸濁液の調製およびプレート播種
ａ）すべての細胞をＡＴＣＣ標準操作に従って培養し、ＨＥＫ２９３Ｔを指数増殖期に試験した。
ｂ）培地を廃棄した。
ｃ）細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄した。
ｄ）トリプシン処理溶液を加えて細胞を処理し、完全培地で処理を停止した。
ｅ）細胞を収集してカウントし、細胞の生存率が９０％を超えた場合にのみ実験を実施できた。
ｆ）２．５×１０６個のＨＥＫ２９３－ＬＵＣ細胞を６０ｍｍの細胞培養皿に播種した。
ｇ）細胞を播種した培養皿を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れ、一晩培養した。
３．２ 細胞トランスフェクション
ａ）ＬｉｐｏＬＴＸトランスフェクション剤を平衡化のために室温に置いた。
ｂ）６μｌのＰｌｕｓ剤および６μｇのＤＮＡを、２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地にチューブ壁に接触させずに加え、ピペッティングガンによるブローとピペッティングにより均一に混合した。プラスミド：２．５μｇのｐＢＩＮＤ－ＴＲβ、２．５μｇのｐＢＩＮＤ－ＲＸＲα、および１μｇのｐＧＬ４．３５プラスミド
ｃ）１２μｌのＬｉｐｏＬＴＸおよび２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地をチューブの壁に接触させずに加え、ピペッティングガンによるブローとピペッティングにより均一に混合した。
ｄ）ＤＮＡ ｐｌｕｓ（ステップ３．２．ｂ参照）と混合した薬剤を、希釈したＬｉｐｏＬＴＸ（ステップ３．２．ｃ参照）トランスフェクション剤に添加し、室温で１５分間静置した。
ｅ）ＤＮＡと混合したトランスフェクション剤を６０ｍｍの細胞培養皿（ステップ３．１参照）に加えた。
ｆ）培養皿を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れ、５時間培養した。
３．３ 化合物の処理
ａ）１５０ｎｌの希釈化合物（ステップ２．３参照）をＥｃｈｏ５５０によって細胞培養プレート（６００７６８０－５０、ＰＥ）に移した。
ｂ）細胞（ステップ３．２参照）を３８４細胞培養プレート（６００７６８０－５０、ＰＥ）に、１ウェルあたり１５，０００個の細胞および２５μｌの培地となるように、播種した。
ｃ）細胞を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで一晩培養した。
３．４ 化合物の検出
ａ）Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）検出剤を室温に置いた。
ｂ）３８４細胞プレート（ステップ３．３参照）を室温に置いた。
ｃ）１ウェルあたり２５μｌのＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）検出剤を細胞培養プレート（ステップ３．４ｂ参照）に添加した。
ｄ）プレートを振とう機に置き、光から保護しながら５分間振とうした。
ｅ）化学発光値をＥｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダーで検出した。
３．１ 細胞懸濁液の調製およびプレート播種
ａ）すべての細胞をＡＴＣＣ標準操作に従って培養し、ＨＥＫ２９３Ｔを指数増殖期に試験した。
ｂ）培地を廃棄した。
ｃ）細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄した。
ｄ）トリプシン処理溶液を加えて細胞を処理し、完全培地で処理を停止した。
ｅ）細胞を収集してカウントし、細胞の生存率が９０％を超えた場合にのみ実験を実施できた。
ｆ）２．５×１０６個のＨＥＫ２９３－ＬＵＣ細胞を６０ｍｍの細胞培養皿に播種した。
ｇ）細胞を播種した培養皿を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れ、一晩培養した。
３．２ 細胞トランスフェクション
ａ）ＬｉｐｏＬＴＸトランスフェクション剤を平衡化のために室温に置いた。
ｂ）６μｌのＰｌｕｓ剤および６μｇのＤＮＡを、２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地にチューブ壁に接触させずに加え、ピペッティングガンによるブローとピペッティングにより均一に混合した。プラスミド：２．５μｇのｐＢＩＮＤ－ＴＲβ、２．５μｇのｐＢＩＮＤ－ＲＸＲα、および１μｇのｐＧＬ４．３５プラスミド
ｃ）１２μｌのＬｉｐｏＬＴＸおよび２５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地をチューブの壁に接触させずに加え、ピペッティングガンによるブローとピペッティングにより均一に混合した。
ｄ）ＤＮＡ ｐｌｕｓ（ステップ３．２．ｂ参照）と混合した薬剤を、希釈したＬｉｐｏＬＴＸ（ステップ３．２．ｃ参照）トランスフェクション剤に添加し、室温で１５分間静置した。
ｅ）ＤＮＡと混合したトランスフェクション剤を６０ｍｍの細胞培養皿（ステップ３．１参照）に加えた。
ｆ）培養皿を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れ、５時間培養した。
３．３ 化合物の処理
ａ）１５０ｎｌの希釈化合物（ステップ２．３参照）をＥｃｈｏ５５０によって細胞培養プレート（６００７６８０－５０、ＰＥ）に移した。
ｂ）細胞（ステップ３．２参照）を３８４細胞培養プレート（６００７６８０－５０、ＰＥ）に、１ウェルあたり１５，０００個の細胞および２５μｌの培地となるように、播種した。
ｃ）細胞を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで一晩培養した。
３．４ 化合物の検出
ａ）Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）検出剤を室温に置いた。
ｂ）３８４細胞プレート（ステップ３．３参照）を室温に置いた。
ｃ）１ウェルあたり２５μｌのＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（商標）検出剤を細胞培養プレート（ステップ３．４ｂ参照）に添加した。
ｄ）プレートを振とう機に置き、光から保護しながら５分間振とうした。
ｅ）化学発光値をＥｎｖｉｓｉｏｎ２１０４マイクロプレートリーダーで検出した。
【0131】
データ分析
４．１ 活性（％）の計算
４．２ ＥＣ５０計算、および化合物の用量－効果の曲線のプロット
化合物のＥＣ５０は、Ｇｒａｐｈｐａｄ５．０を使用して計算し、化合物の活性（％）および対数濃度に適合させた。
Ｙ＝最小＋（最大－最小）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０－Ｘ）×傾き））
Ｘ：化合物の対数濃度、Ｙ：阻害率（パーセント）
４．１ 活性（％）の計算
【数4】
化合物のＥＣ５０は、Ｇｒａｐｈｐａｄ５．０を使用して計算し、化合物の活性（％）および対数濃度に適合させた。
Ｙ＝最小＋（最大－最小）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＩＣ５０－Ｘ）×傾き））
Ｘ：化合物の対数濃度、Ｙ：阻害率（パーセント）
【0132】
表２：サイロキシン受容体ベータに対する本発明の化合物のアゴニスト活性を、下記に示す。
【表2】
【0133】
結論
本発明の化合物は、甲状腺ホルモン受容体ベータの下流シグナルを活性化し得る。
本発明の化合物は、甲状腺ホルモン受容体ベータの下流シグナルを活性化し得る。
【0134】
試験５：薬物動態学的評価
ラットを試験動物として使用した。実施形態４および実施形態９の化合物を胃内注入した後、異なる時間でのラットの血漿中の薬物濃度を調べた。ラットにおける本発明の化合物の薬物動態学的挙動を試験し、その薬物代謝特性を評価した。実施形態の各群において、同様の体重を有する３匹の雄ＳＤラットを選択し、経口用量は、単回用量で２ｍｇ／ｋｇとした。動物に該用量を投与してから、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、１０時間、および２４時間の時点で採血した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析法を用いて、血漿中の化合物の含有量を検出したが、この方法の定量の下限は２０ｎｇ／ｍｌであった。メタキネティックデータ分析ソフトウェアＷｉｎＮｏｎｌｉｎ７．０を使用して、ＶＴ０８８および血漿の濃度データに関する統計を作成した。特に下記の表２に示すように、ノンコンパートメントモデル法（ＮＣＡ）を用いて、薬物動態パラメーターを計算した。
ラットを試験動物として使用した。実施形態４および実施形態９の化合物を胃内注入した後、異なる時間でのラットの血漿中の薬物濃度を調べた。ラットにおける本発明の化合物の薬物動態学的挙動を試験し、その薬物代謝特性を評価した。実施形態の各群において、同様の体重を有する３匹の雄ＳＤラットを選択し、経口用量は、単回用量で２ｍｇ／ｋｇとした。動物に該用量を投与してから、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、１０時間、および２４時間の時点で採血した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析法を用いて、血漿中の化合物の含有量を検出したが、この方法の定量の下限は２０ｎｇ／ｍｌであった。メタキネティックデータ分析ソフトウェアＷｉｎＮｏｎｌｉｎ７．０を使用して、ＶＴ０８８および血漿の濃度データに関する統計を作成した。特に下記の表２に示すように、ノンコンパートメントモデル法（ＮＣＡ）を用いて、薬物動態パラメーターを計算した。
【0135】
実験スキーム
実験薬物：実施形態４および実施形態９の化合物。
実験動物
Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｉｐｐｒ－Ｂｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から、動物生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２００８－００１６で市販されている、６匹の健康な雄ＳＤラットを、各群３匹で、２つの群に分けた。
薬物調製
一定量の薬物を採取し、２％Ｋｌｕｃｅｌ ＬＦ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液に添加して、透明な溶液または均一な懸濁液を調製した。
投薬
ＳＤラットを一晩絶食させ、そして、それぞれ、２ｍｇ／ｋｇの投与用量および１０ｍＬ／ｋｇの投与体積で胃内注入によって薬物を与えた。
手法
実施形態４および実施形態９の化合物を胃内注入によりラットに投与した。少なくとも０．２ｍＬの血液を、投与の前後の１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、１０時間、および２４時間で、尾静脈から収集し、次いで、血液をヘパリン処理したサンプルチューブに入れ、４℃、３５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して、血漿を分離した。次に、ヘパリン処理したサンプルチューブを－２０℃で保存し、投与の２時間後にラットに餌を摂取させた。
種々の濃度の薬物の胃内注入後のラットの血漿中で試験された化合物含有量の測定
血漿サンプルを室温で解凍し、それぞれ５０μＬを採取し、１３０μＬの内部標準溶液（１０００ｎｇ／ｍＬ、アセトニトリル、トルブタミド）に加え、混合物を約１分間撹拌し、次に、４℃、１３０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上澄み液５０μＬを採取し、１００μＬの５０％アセトニトリル水と混合した後、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。
実験薬物：実施形態４および実施形態９の化合物。
実験動物
Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｉｐｐｒ－Ｂｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から、動物生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２００８－００１６で市販されている、６匹の健康な雄ＳＤラットを、各群３匹で、２つの群に分けた。
薬物調製
一定量の薬物を採取し、２％Ｋｌｕｃｅｌ ＬＦ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液に添加して、透明な溶液または均一な懸濁液を調製した。
投薬
ＳＤラットを一晩絶食させ、そして、それぞれ、２ｍｇ／ｋｇの投与用量および１０ｍＬ／ｋｇの投与体積で胃内注入によって薬物を与えた。
手法
実施形態４および実施形態９の化合物を胃内注入によりラットに投与した。少なくとも０．２ｍＬの血液を、投与の前後の１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、１０時間、および２４時間で、尾静脈から収集し、次いで、血液をヘパリン処理したサンプルチューブに入れ、４℃、３５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して、血漿を分離した。次に、ヘパリン処理したサンプルチューブを－２０℃で保存し、投与の２時間後にラットに餌を摂取させた。
種々の濃度の薬物の胃内注入後のラットの血漿中で試験された化合物含有量の測定
血漿サンプルを室温で解凍し、それぞれ５０μＬを採取し、１３０μＬの内部標準溶液（１０００ｎｇ／ｍＬ、アセトニトリル、トルブタミド）に加え、混合物を約１分間撹拌し、次に、４℃、１３０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上澄み液５０μＬを採取し、１００μＬの５０％アセトニトリル水と混合した後、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。
【0136】
表３に、薬物動態パラメーターの結果を示す。
表３：ラットの医薬代謝データ
表３：ラットの医薬代謝データ
【表3】
【0137】
結論
本発明の化合物は、良好な薬物動態学的吸収および有意な薬物動態学的利点を有する。報告された比較化合物５３と比較して、本発明の化合物のいくつかは、同じ用量および製剤で予想以上に高いＣｍａｘ値および曝露量を示す。上記のＰＫの結果はすべて、本発明で提供される化合物が良好なＰＫ特性を有し、代謝関連疾患の治療薬として使用できることを示している。
本発明の化合物は、良好な薬物動態学的吸収および有意な薬物動態学的利点を有する。報告された比較化合物５３と比較して、本発明の化合物のいくつかは、同じ用量および製剤で予想以上に高いＣｍａｘ値および曝露量を示す。上記のＰＫの結果はすべて、本発明で提供される化合物が良好なＰＫ特性を有し、代謝関連疾患の治療薬として使用できることを示している。