特許 7532503 アルファ－サルコグリカンのアデノ随伴ウイルスベクター送達、および筋ジストロフィーの治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-02

(45)【発行日】2024-08-13

(54)【発明の名称】アルファ－サルコグリカンのアデノ随伴ウイルスベクター送達、および筋ジストロフィーの治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20240805BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240805BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240805BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240805BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240805BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240805BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240805BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240805BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240805BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240805BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61P21/00 ZNA

A61K35/76

A61K38/17

C12N15/864 100Z

C12N15/12

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【請求項の数】 41

(21)【出願番号】P 2022510976

(86)(22)【出願日】2020-08-21

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-19

(86)【国際出願番号】 US2020047339

(87)【国際公開番号】W WO2021035120

(87)【国際公開日】2021-02-25

【審査請求日】2023-08-16

(31)【優先権主張番号】62/889,749

(32)【優先日】2019-08-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/014,934

(32)【優先日】2020-04-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/022,843

(32)【優先日】2020-05-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】515289842

【氏名又は名称】リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ロディノ－カラパック， ルイーズ

(72)【発明者】

【氏名】グリフィン， ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】メンデル， ジェリー アール．

【審査官】佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１３／０７８３１６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１９－５１３３９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】Human Gene Therapy，2019年07月01日，Vol.30, No.7，pp.794-801

【文献】RODINO-KLAPAC, L. R., et al.，Demonstration of SGCA Expression and Related Outcomes in Phase I/IIa Safety Isolated Limb Perfusion Trial in LGMD2D Subjects，Molecular Therapy，2018年，Vol.26, No.5, Supplement 1，p.118，Abstract Number:250

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、前記組成物が、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で含み、前記組成物が、全身投与経路用に製剤化され、さらに、前記ｒＡＡＶが、配列番号４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、アルファ－サルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする、組成物。

【請求項2】

前記ｒＡＡＶが、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇまたは２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、前記組成物が、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量で含み、前記組成物が、全身投与経路用に製剤化され、さらに、前記ｒＡＡＶが、配列番号４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、アルファ－サルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする、組成物。

【請求項4】

前記組成物が、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量で含む、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物が、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記組成物の投与前の前記アルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記組成物の投与後に増加するか、または前記組成対象における血清ＣＫレベルが、前記組成物の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記組成物の投与後に減少するか、または前記対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記組成物の投与前の前記アルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、前記組成物の投与後に増加する、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記全身投与経路が、静脈内経路である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記組成物が、注射、注入、または移植によって投与される、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記組成物が、注入による投与用に製剤化される、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

前記組成物が、末梢四肢静脈を介する静脈内経路による投与用に製剤化される、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記筋ジストロフィーが、肢帯筋ジストロフィーである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ２Ｄ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

前記対象が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患しており、前記組成物が、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量での静脈内注入による投与用に製剤化され、前記ｒＡＡＶが、配列番号４の前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、配列番号４のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物を含む、組成物。

【請求項15】

筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための医薬の製造における組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの使用であって、前記ｒＡＡＶが、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量にあり、前記医薬が、全身投与経路用に製剤化され、さらに、前記ｒＡＡＶが、配列番号４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、アルファ－サルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする、使用。

【請求項16】

前記ｒＡＡＶが、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量にある、請求項１５に記載の使用。

【請求項17】

筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの使用であって、前記ｒＡＡＶが、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量にあり、前記医薬が、全身投与経路用に製剤化され、さらに、前記ｒＡＡＶが、配列番号４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、アルファ－サルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする、使用。

【請求項18】

ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡが、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与されるものである、請求項１７に記載の使用。

【請求項19】

前記ｒＡＡＶが、配列番号４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、アルファ－サルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項20】

前記ｒＡＡＶが、配列番号４の前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の使用。

【請求項21】

前記対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記医薬の投与前の前記アルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記医薬の投与後に増加するか、または前記対象における血清ＣＫレベルが、前記医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記医薬の投与後に減少するか、または前記対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記医薬の投与前の前記アルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、前記医薬の投与後に増加する、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の使用。

【請求項22】

前記全身投与経路が、静脈内経路である、請求項１５～２１のいずれか一項に記載の使用。

【請求項23】

前記医薬が、注射、注入、または移植による投与用に製剤化される、請求項１５～２２のいずれか一項に記載の使用。

【請求項24】

前記医薬が、注入による投与用に製剤化される、請求項１５～２３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項25】

前記医薬が、末梢四肢静脈を介する静脈内経路による投与用に製剤化される、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項26】

前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィーである、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項27】

前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ２Ｄ）である、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項28】

前記対象が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患しており、前記医薬が、静脈内注入用に製剤化され、前記ｒＡＡＶが、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量にあり、前記ｒＡＡＶが、前記配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、請求項１５～２５のいずれか一項に記載の使用。

【請求項29】

血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための医薬の製造におけるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の使用であって、前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物が、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、使用。

【請求項30】

配列番号４または配列番号８に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、アルファ－サルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする、核酸分子。

【請求項31】

前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項３０に記載の核酸分子。

【請求項32】

前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項３０に記載の核酸分子。

【請求項33】

請求項３０～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含むプラスミド。

【請求項34】

ｒＡＡＶを生成するインビトロ方法であって、請求項３３に記載のプラスミドまたは請求項３０～３２のいずれか一項に記載の核酸分子を宿主細胞に移入するステップ、前記宿主細胞を培養するステップ、及び前記培養の上清からｒＡＡＶ粒子を回収するステップを含む、方法。

【請求項35】

請求項３０～３２のいずれか一項に記載の核酸分子を含む細胞。

【請求項36】

前記細胞が、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞または微生物細胞である、請求項３５に記載の細胞。

【請求項37】

前記細胞が、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ．６細胞またはＳｆ９細胞である、請求項３６に記載の細胞。

【請求項38】

配列番号４に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターであって、前記ヌクレオチド配列が、アルファ－サルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする、組換えＡＡＶベクター。

【請求項39】

配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクター。

【請求項40】

前記ベクターが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のベクターである、請求項３８または３９に記載の組換えＡＡＶベクター。

【請求項41】

請求項３８～４０のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶを含む組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１９年８月２１日に出願された米国仮出願第６２／８８９，７４９号、２０２０年４月２４日に提出された米国仮出願第Ｎｏ．６３／０１４，９３４号、および２０２０年５月１１日に提出された米国特許出願第６３／０２２，８４３号の優先権を主張し、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本明細書に記載されているのは、アルファ－サルコグリカンを発現するＡＡＶベクターなどの治療ベクター、およびこれらのベクターを使用して、ＬＧＭＤ２Ｄなどの肢帯型筋ジストロフィーを治療する方法である。

【0003】

配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（２０２０年８月１７日に作成された、ファイル名：５４６５２＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、１８，７６８バイト、ＡＳＣＩＩテキストファイル）を含有し、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

筋ジストロフィー（ＭＤ）は遺伝性疾患のグループである。このグループは、動作を制御する骨格筋の進行性の衰弱および変性を特徴とする。ＭＤのいくつかの形態は乳児期または小児期に発症するが、他の形態は中年以降まで現れない場合がある。障害は、筋力低下の分布および程度（ＭＤのいくつかの形態は心筋にも影響を及ぼす）、発病年齢、進行速度、ならびに遺伝形式の点で異なる。

【0005】

ＭＤのうちの１つのグループは、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）である。ＬＧＭＤは、まれな状態であり、発症年齢、筋力低下の領域、心臓および呼吸器の関与、進行速度、ならびに重症度に関して、人によって症状が異なる。ＬＧＭＤは、小児期、青年期、若年成人期、またはそれ以降に始まる可能性がある。両方の性別が等しく影響を受ける。ＬＧＭＤは、肩および骨盤帯に衰弱を引き起こし、上肢および腕の近くの筋肉も時間とともに衰弱することがある。脚の脱力感は、腕の脱力感よりも前に現れることがよくある。顔の筋肉は、通常影響を受けない。状態が進行するにつれて、人々は、歩行に問題を抱えることがあり、時間の経過とともに車椅子を使用する必要があるかもしれない。肩および腕の筋肉が関与すると、腕を頭上に上げたり、物を持ち上げたりするのが困難になることがある。ＬＧＭＤの種類によっては、心臓および呼吸筋が関与し得る。

【0006】

ＬＧＭＤのための専門の検査は、診断のための全国的な計画であるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＮＣＧ）を通じて現在利用可能である。

【0007】

ＬＧＭＤサブタイプ２Ｄ（ＬＧＭＤ２Ｄ）は、しばしばα－サルコグリカノパチーと呼ばれ、アルファ－サルコグリカン遺伝子（ＳＧＣＡ；α－サルコグリカン）の変異によって引き起こされる常染色体劣性疾患であり、ジストロフィン関連タンパク質複合体の他の構造成分の喪失を伴う機能性タンパク質の完全または削減された喪失をもたらす。特に、アルファ－サルコグリカンタンパク質の喪失は、３～８歳で発症する、筋機能の低下を伴う進行性筋ジストロフィーを引き起こす。症状には、歩行の遅延、脂肪の置換および線維症によって引き起こされる近位筋の衰弱、クレアチンキナーゼの上昇、脊柱側弯症、ならびに関節拘縮が含まれる。衰弱させる病気は、しばしば車椅子依存および呼吸不全による死につながる。したがって、ＬＧＭＤ２Ｄの治療の必要性が残っている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本明細書に記載されているのは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であり、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。一態様では、本開示は、アルファ－サルコグリカン遺伝子を発現するｒＡＡＶ、かつ筋肉にアルファ－サルコグリカンを送達して、線維症を軽減および／もしくは予防する、ならびに／または筋力を増加させる、ならびに／または筋ジストロフィーに罹患している対象においてα－サルコグリカノパチーを治療する方法に関する。

【0009】

一態様では、本明細書に記載されているのは、アルファ－サルコグリカンタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一である配列を含み、アルファ－サルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％同一であるタンパク質をコードする。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。

【0010】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、ｔＭＣＫプロモーターを含むヌクレオチド配列を含む。例えば、ｔＭＣＫプロモーターは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む。加えて、ｒＡＡＶは、配列番号５の５’逆位末端反復配列および／または配列番号６の３’逆位末端反復配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号７のポリＡ配列を含む。一実施形態では、開示されたｒＡＡＶは、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のｒＡＡＶである。

【0011】

一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0012】

本開示は、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれかを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、ｒＡＡＶは、全身経路によって投与される。特に、開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡであり、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して投与される。

【0013】

開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、もしくは約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与されるか、またはｒＡＡＶは、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約４×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、もしくは約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。

【0014】

別の実施形態では、開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、ｒＡＡＶは、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。

【0015】

加えて、開示された方法のうちのいずれかにおいて、全身投与経路は、静脈内経路である。例えば、開示された方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、注射、注入、または移植によって投与される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、末梢四肢静脈を介した静脈内経路によって投与される。

【0016】

開示された方法のうちのいずれかにおいて、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィーである。例えば、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ２Ｄ）である。

【0017】

例示的な実施形態では、筋ジストロフィーを治療する方法は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している対象にｒＡＡＶを投与することを含み、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与され、ｒＡＡＶは、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。

【0018】

例示的な実施形態では、本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための方法を提供し、この方法は、対象にｒＡＡＶを投与するステップを含み、対象は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患しており、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与され、ｒＡＡＶは、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。例えば、これらの方法では、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。

【0019】

開示された方法のうちのいずれかにおいて、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加し、かつ／または対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少し、かつ／または自発運動および比力の生成は増加し、線維症は軽減し、前脛骨筋の収縮誘発性損傷に対する抵抗性は増加し、かつ／または、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加し、または線維症は、ｒＡＡＶの投与前と比較して、ｒＡＡＶの投与後の対象において軽減し、かつ／または、線維症は、ｒＡＡＶの投与前と比較して、ｒＡＡＶの投与後の対象において軽減し、かつ／または対象の筋肉における比力、線維直径サイズ、および／もしくは偏心収縮は、ｒＡＡＶの投与前と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。

【0020】

いくつかの実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子発現は、ウエスタンブロットおよび／または免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。

【0021】

別の態様では、本開示は、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかを対象に投与することを含む、細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法を提供する。例えば、本開示は、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法を提供する。加えて、方法のうちのいずれかにおいて、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。代替的に、方法のうちのいずれかにおいて、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。他の実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって、対象において測定される。

【0022】

本開示は、血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、この方法は、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかを対象に投与することを含む。例えば、本開示は、血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、この方法は、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む。

【0023】

別の態様では、本開示は、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかを対象に投与することを含む、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させる方法を提供する。例えば、本開示は、アルファ－サルコグリカン陽性線維の増加を必要とする対象の筋肉組織においてそれを行う方法を提供し、この方法は、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む。

【0024】

本開示はまた、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかを対象に投与することを含む、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行う方法を提供する。例えば、本開示は、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、この方法は、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む。加えて、開示された方法のうちのいずれかにおいて、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。代替的に、方法のうちのいずれかにおいて、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。他の実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって、対象において測定される。

【0025】

本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、組成物は、本明細書に開示されるｒＡＡＶのうちのいずれかを含み、組成物は、全身経路による投与用に製剤化される。特に、組成物のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡである。

【0026】

開示された組成物のうちのいずれかは、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量のｒＡＡＶを含む。例えば、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、もしくは約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量、またはｒＡＡＶは、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約４×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、もしくは約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量にある。

【0027】

別の実施形態では、開示された組成物のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは約７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、ｒＡＡＶは、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。

【0028】

加えて、開示された組成物のうちのいずかは、注射、注入、または移植による投与用に製剤化された組成物など、静脈内経路による投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、開示された組成物は、末梢四肢静脈を介した静脈内経路による投与用に製剤化される。

【0029】

開示された組成物のうちのいずれかは、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ２Ｄ）などの肢帯型筋ジストロフィーの治療用である。

【0030】

例示的な実施形態では、本開示は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している対象を治療するための組成物を提供し、組成物は、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇでｒＡＡＶの用量を含み、組成物は、静脈内注入による投与用に製剤化され、ｒＡＡＶは、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。

【0031】

加えて、本開示は、肢帯型筋ジストロフィーを治療すること必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、組成物は、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇでｒＡＡＶの用量を含み、組成物は、静脈内注入による投与用に製剤化され、ｒＡＡＶは、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。例えば、組成物の投与は、組成物の投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルを増加させる。

【0032】

加えて、開示された組成物のうちのいずれかの投与は、組成物の投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルを増加させ、かつ／または開示された組成物の投与は、組成物の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、対象における血清ＣＫレベルを減少させ、かつ／または自発運動および比力の生成は増加し、線維症は軽減し、前脛骨筋の収縮誘発性損傷に対する抵抗性は増加し、かつ／または、組成物の投与は、組成物の投与前のアルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数を増加させ、かつ／または組成物の投与は、ｒＡＡＶの投与前と比較して、対象における線維症を軽減し、かつ／または、組成物は、組成物の投与前と比較して、線維症を軽減し、または組成物の投与は、組成物の投与前と比較して、対象の筋肉における比力、線維直径サイズ、および／もしくは偏心収縮を増加させる。いくつかの実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子発現は、ウエスタンブロットおよび／または免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。

【0033】

別の態様では、本開示は、細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現するための組成物を提供し、組成物は、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかを含む。例えば、本開示は、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現するための組成物を提供する。加えて、組成物のうちのいずれかにおいて、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。代替的に、方法のうちのいずれかにおいて、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。他の実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって、対象において測定される。

【0034】

本開示は、血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、組成物は、開示されたｒＡＡＶのいずれかを含む。例えば、本開示は、血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、組成物は、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。

【0035】

別の態様では、本開示は、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させるための組成物を提供し、組成物は、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかを含む。例えば、本開示は、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させるための組成物を提供し、組成物は、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。

【0036】

本開示はまた、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、組成物は、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかを含む。例えば、本開示は、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行うための組成物を提供し、組成物は、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。加えて、開示された組成物のうちのいずれかの投与後、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。代替的に、開示された組成物のうちのいずれかの投与後、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。他の実施形態では、開示された組成物のうちのいずれかの投与後、アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって対象において測定される。

【0037】

本開示は、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかの使用を提供し、医薬は、全身経路による投与用に製剤化される。特に、本開示は、筋ジストロフィーを治療するための医薬の調製のためのＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡの使用を提供し、医薬は、全身投与経路による投与用に製剤化される。

【0038】

開示された使用のうちのいずれかにおいて、医薬は、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量のｒＡＡＶを含む。例えば、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、もしくは約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量、またはｒＡＡＶは、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約４×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、もしくは約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇにある。

【0039】

別の実施形態では、開示された使用のうちのいずれかにおいて、医薬は、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量のｒＡＡＶを含む。例えば、医薬は、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量のｒＡＡＶを含む。

【0040】

加えて、開示された使用のうちのいずれかにおいて、医薬は、静脈内経路による投与用に製剤化される。例えば、開示された使用のうちのいずれかにおいて、医薬は、注射、注入、または移植による投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬は、末梢四肢静脈を介した静脈内経路による投与用に製剤化される。

【0041】

開示された使用のうちのいずれかにおいて、医薬は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ２Ｄ）などの肢帯型筋ジストロフィーの治療用である。

【0042】

例示的な実施形態では、本開示は、肢帯型筋ジストロフィーを治療するための医薬の調製のためのｒＡＡＶの使用を提供し、医薬は、静脈内注入による投与用に製剤化され、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量にあり、ｒＡＡＶは、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。例えば、医薬の投与を必要とする対象への医薬の投与は、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現の増加をもたらす。

【0043】

開示される使用のうちのいずれかにおいて、医薬の投与を必要とする対象への医薬の投与は、医薬の投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルの増加をもたらし、かつ／または対象への医薬の投与は、医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、対象における血清ＣＫレベルの減少をもたらし、かつ／または自発運動および比力の生成は増加し、線維症は軽減し、前脛骨筋の収縮誘発性損傷に対する抵抗性は増加し、かつ／または対象への薬剤の投与は、医薬の投与前のアルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数の増加をもたらし、かつ／または医薬の投与を必要とする対象への医薬の投与は、医薬の投与前と比較して、対象における線維症の軽減をもたらし、かつ／または医薬の投与は、医薬の投与前と比較して、対象の筋肉における比力、線維直径サイズ、および／もしくは偏心収縮の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子発現は、ウエスタンブロットおよび／または免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。

【0044】

別の態様では、本開示は、細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現を必要する対象においてそれを行うための医薬の調製のための開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかの使用を提供する。例えば、本開示は、細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現を必要する対象においてそれを行うための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の使用を提供し、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。加えて、使用のうちのいずれかにおいて、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。代替的に、使用のうちのいずれかにおいて、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。他の実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって、対象において測定される。

【0045】

本開示は、血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかの使用を提供する。例えば、本開示は、血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の使用を提供し、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。

【0046】

別の態様では、本開示は、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させるための医薬の調製のための開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかの使用を提供する。例えば、本開示は、対象の筋肉組織においてアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させるための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の使用を提供し、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。

【0047】

本開示はまた、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかの使用を提供とする。例えば、本開示は、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の使用を提供し、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。加えて、開示された使用のうちのいずれかにおいて、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。代替的に、開示された使用のうちのいずれかにおいて、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。他の実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって、対象において測定される。

【0048】

開示された方法、組成物、または使用のうちのいずれかにおいて、対象は、４～１５歳のヒト対象、または２５～５５歳のヒト対象、または５０歳を超えるヒト対象である。

【0049】

開示された方法、組成物、または使用のうちのいずれかにおいて、対象は、小児対象、青年対象、または若年成人対象である。代替的に、対象は、中年成人または高齢対象である。

【0050】

例えば、開示された方法、組成物、または使用のうちのいずれかにおいて、対象は、４～１５歳であり、両方の対立遺伝子において確認されたアルファ－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）変異を有し、ＡＡＶｒｈ７４抗体に対して陰性であり、かつ／または４０％超もしくは通常の１００メートルの歩行試験を有した、ヒト対象である。

【0051】

別の態様では、本開示は、開示された方法、組成物、または使用のうちのいずれかの方法で投与されたｒＡＡＶを生成する方法を提供し、この方法は、ＡＡＶベクタープラスミドを宿主細胞に移入することを含み、ＡＡＶベクタープラスミドは、配列番号８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。例えば、ＡＡＶベクタープラスミドは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはベクタープラスミドは配列番号１、４、もしくは８のヌクレオチド配列を含む。

【0052】

ｒＡＡＶを生成する開示された方法のうちのいずれかにおいて、方法は、パッケージングプラスミドおよび／またはヘルパーウイルスを宿主細胞に移入することをさらに含む。加えて、ｒＡＡＶを生成する開示された方法のうちのいずれかにおいて、パッケージング細胞は、安定に組み込まれたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含み、および／またはパッケージング細胞は、安定して組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む。

【0053】

別の態様では、本開示は、配列番号１、４、または８に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む宿主細胞を提供する。例えば、宿主細胞は、配列番号１、４、または８のヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用して、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０ ^１２ ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０ ^１５ ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、方法。
（項目２）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０ ^１２ ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０ ^１５ ｖｇ／ｋｇ、約５×１０ ^１２ ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０ ^１５ ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇ、または約５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ～約２×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ～約２×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ、約１×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇ、または約２×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目５）
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記ｒＡＡＶが、全身投与経路を使用して投与され、前記定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．８５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ～約７．４１×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、方法。
（項目６）
前記対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の前記アルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加し、前記対象における血清ＣＫレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に減少し、自発運動および比力の生成が、増加し、線維症が、軽減し、前脛骨筋の収縮誘発性損傷に対する抵抗性が、増加し、かつ／または、前記対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記ｒＡＡＶの投与前の前記アルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加する、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記全身投与経路が、静脈内経路である、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ｒＡＡＶが、注射、注入または移植によって投与される、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記ｒＡＡＶが、注入によって投与される、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ｒＡＡＶが、末梢四肢静脈を介する静脈内経路によって投与される、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記ｒＡＡＶが、配列番号１に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記ｒＡＡＶが、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ｒＡＡＶが、配列番号２に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記ｒＡＡＶが、配列番号２に示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記ｒＡＡＶが、配列番号４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記ｒＡＡＶが、前記配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ｒＡＡＶが、ｔＭＣＫプロモーターを含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記ｔＭＣＫプロモーターが、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記ｒＡＡＶが、配列番号５の５’逆位末端反復配列を含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ｒＡＡＶが、配列番号６の３’逆位末端反復配列を含む、項目１～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記ｒＡＡＶが、配列番号７のポリＡ配列を含む、項目１～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のものである、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィーである、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ２Ｄ）である、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記対象が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患しており、前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ～約２×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与され、前記ｒＡＡＶが、前記配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、項目１～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記対象の細胞における前記アルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前の前記アルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加する、項目１～２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
線維症が、前記ｒＡＡＶの投与前と比較して、前記ｒＡＡＶの投与後の前記対象において軽減する、項目１～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記対象における前記線維症、中心核形成、前記ＣＫレベル、および／またはコラーゲン沈着が、前記ｒＡＡＶの投与前と比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に減少する、項目１～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記対象の前記筋肉における比力、線維直径サイズ、および／または偏心収縮が、前記ｒＡＡＶの投与前と比較して、前記ｒＡＡＶの投与後に増加する、項目１～２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記アルファ－サルコグリカン遺伝子発現が、ウエスタンブロットおよび／または免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目２６に記載の方法。
（項目３１）
配列番号４のヌクレオチド配列を含む前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物を対象に投与することを含む、細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現する、方法。
（項目３２）
前記対象の前記細胞における前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現が、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記細胞における前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現が、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現が、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって前記対象において測定される、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記方法が、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目３６）
対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させる方法であって、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目３７）
アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行う方法であって、有効量の配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を前記対象に投与することを含む、方法。
（項目３８）
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、前記組成物が、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡを、前記定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０ ^１２ ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０ ^１５ ｖｇの用量で含み、前記組成物が、全身投与経路用に製剤化される、組成物。
（項目３９）
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、前記組成物が、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡを、前記定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．８５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇまたは７．４１×１０ ^１３ ｖｇ／の用量で含み、前記組成物が、全身投与経路用に製剤化される、組成物。
（項目４０）
組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含み、前記ｒＡＡＶが、配列番号４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。
（項目４１）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ～約２×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇの用量にある、項目３８または４０に記載の組成物。
（項目４２）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ、約１×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇ、または約２×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇの用量にある、項目３８または４０に記載の組成物。
（項目４３）
前記対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記組成物の投与前の前記アルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記組成物の投与後に増加するか、または前記組成対象における血清ＣＫレベルが、前記組成物の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記組成物の投与後に減少するか、または前記対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記組成物の投与前の前記アルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、前記組成物の投与後に増加する、項目３８～４２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４４）
前記全身投与経路が、静脈内経路である、項目３８～４３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４５）
前記組成物が、注射、注入、または移植によって投与される、項目３８～４４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４６）
前記組成物が、注入による投与用に製剤化される、項目３８～４５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４７）
前記組成物が、末梢四肢静脈を介する静脈内経路による投与用に製剤化される、項目３８～４６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４８）
前記ｒＡＡＶが、配列番号１に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目３８～４７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４９）
前記ｒＡＡＶが、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目４８に記載の組成物。
（項目５０）
前記ｒＡＡＶが、配列番号２に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目３８～４９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５１）
前記ｒＡＡＶが、配列番号２に示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目３８～４９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５２）
前記ｒＡＡＶが、配列番号４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、項目３８～４９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５３）
前記ｒＡＡＶが、配列番号４の前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、項目５２に記載の組成物。
（項目５４）
前記ｒＡＡＶが、ｔＭＣＫプロモーターを含む、項目３８～５３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５５）
前記ｔＭＣＫプロモーターが、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む、項目５４に記載の組成物。
（項目５６）
前記ｒＡＡＶが、配列番号５の５’逆位末端反復配列を含む、項目３８～５５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５７）
前記ｒＡＡＶが、配列番号６の３’逆位末端反復配列を含む、項目３８～５６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５８）
前記ｒＡＡＶが、配列番号７のポリＡ配列を含む、項目３８～５７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５９）
前記ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のものである、項目３８～５８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６０）
前記筋ジストロフィーが、肢帯筋ジストロフィーである、項目３８～５９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６１）
前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ２Ｄ）である、項目３８～６０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６２）
前記対象が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患しており、前記組成物が、前記定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ～約２×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇの用量での静脈内注入による投与用に製剤化され、前記ｒＡＡＶが、配列番号４の前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、項目３８～６１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６３）
前記対象の細胞における前記アルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記組成物の投与前の前記アルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記組成物の投与後に増加する、項目３８～６２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６４）
線維症が、前記組成物の投与前と比較して、前記組成物の投与後の前記対象において軽減する、項目３８～６３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６５）
前記対象における線維症、中心核形成、前記ＣＫレベル、および／またはコラーゲン沈着が、前記組成物の投与前と比較して、前記組成物の投与後に減少する、項目３８～６３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６６）
前記対象の前記筋肉における比力、線維直径サイズ、および／または偏心収縮が、前記組成物の投与前と比較して、前記組成物の投与後に増加する、項目３８～６５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６７）
前記アルファ－サルコグリカン遺伝子発現が、ウエスタンブロットおよび／または免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目６３に記載の組成物。
（項目６８）
細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現するための組成物であって、前記組成物が、配列番号４の前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、組成物。
（項目６９）
前記対象の前記細胞における前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現が、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目６８に記載の組成物。
（項目７０）
前記細胞における前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現が、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目６８に記載の組成物。
（項目７１）
前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現が、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって前記対象において測定される、項目６８に記載の組成物。
（項目７２）
血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための組成物であって、前記配列番号４のヌクレオチド配列を含む前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物を含む、組成物。
（項目７３）
前記配列番号４のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物を含む、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させるための、組成物。
（項目７４）
配列番号４のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物を含む、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行うための、組成物。
（項目７５）
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ Ａの使用であって、前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０ ^１２ ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０ ^１５ ｖｇ／ｋｇの用量にあり、前記医薬が、全身投与経路用に製剤化される、使用。
（項目７６）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０ ^１２ ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０ ^１５ ｖｇ／ｋｇ、約５×１０ ^１２ ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０ ^１５ ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇ、または約５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ～約２×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇの用量にある、項目７５に記載の使用。
（項目７７）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ～約２×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇの用量にある、項目７５に記載の使用。
（項目７８）
前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ、約１×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇ、または約２×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇの用量にある、項目７５に記載の使用。
（項目７９）
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡ Ａの使用であって、前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．８５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇまたは７．４１×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇの用量にあり、前記医薬が、全身投与経路用に製剤化される、使用。
（項目８０）
前記対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記医薬の投与前の前記アルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記医薬の投与後に増加するか、または前記対象における血清ＣＫレベルが、前記医薬の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、前記医薬の投与後に減少するか、または前記対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数が、前記医薬の投与前の前記アルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する、項目７５～７９のいずれか一項に記載の使用。
（項目８１）
前記全身投与経路が、静脈内経路である、項目７５～８０のいずれか一項に記載の使用。
（項目８２）
前記医薬が、注射、注入、または移植による投与用に製剤化される、項目７５～８１のいずれか一項に記載の使用。
（項目８３）
前記医薬が、注入による投与用に製剤化される、項目７５～８２のいずれか一項に記載の使用。
（項目８４）
前記医薬が、末梢四肢静脈を介する静脈内経路による投与用に製剤化される、項目７５～８３のいずれか一項に記載の使用。
（項目８５）
前記ｒＡＡＶが、配列番号１に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目７５～８４のいずれか一項に記載の使用。
（項目８６）
前記ｒＡＡＶが、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目８５に記載の使用。
（項目８７）
前記ｒＡＡＶが、配列番号２に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目７５～８６のいずれか一項に記載の使用。
（項目８８）
前記ｒＡＡＶが、配列番号２に示されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目７５～８６のいずれか一項に記載の使用。
（項目８９）
前記ｒＡＡＶが、配列番号４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、項目７５～８６のいずれか一項に記載の使用。
（項目９０）
前記ｒＡＡＶが、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、項目８９に記載の使用。
（項目９１）
前記ｒＡＡＶが、ｔＭＣＫプロモーターを含む、項目７５～９０のいずれか一項に記載の使用。
（項目９２）
前記ｔＭＣＫプロモーターが、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む、項目９１に記載の使用。
（項目９３）
前記ｒＡＡＶが、配列番号５の５’逆位末端反復配列を含む、項目７５～９２のいずれか一項に記載の使用。
（項目９４）
前記ｒＡＡＶが、配列番号６の３’逆位末端反復配列を含む、項目７５～９３のいずれか一項に記載の使用。
（項目９５）
前記ｒＡＡＶが、配列番号７ポリＡ配列を含む、項目７３～９４のいずれか一項に記載の使用。
（項目９６）
前記ｒＡＡＶが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のものである、項目７３～９５のいずれか一項に記載の使用。
（項目９７）
前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィーである、項目７３～９６のいずれか一項に記載の使用。
（項目９８）
前記筋ジストロフィーが、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ２Ｄ）である、項目７３～９７のいずれか一項に記載の使用。
（項目９９）
前記対象が、肢帯型筋ジストロフィーに罹患しており、前記医薬が、静脈内注入用に製剤化され、前記ｒＡＡＶが、前記定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５×１０ ^１３ ｖｇ／ｋｇ～約２×１０ ^１４ ｖｇ／ｋｇの用量にあり、前記ｒＡＡＶが、前記配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む、項目７３～９８のいずれか一項に記載の使用。
（項目１００）
前記対象の細胞における前記アルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルが、前記医薬の投与前の前記アルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、前記医薬の投与後に増加する、項目７３～９９のいずれか一項に記載の使用。
（項目１０１）
線維症が、前記医薬の投与前と比較して、前記医薬の投与後の前記対象において軽減する、項目７３～１００のいずれか一項に記載の使用。
（項目１０２）
前記対象における線維症、中心核形成、ＣＫレベル、および／またはコラーゲン沈着が、前記医薬の投与前の前記線維症と比較して、前記医薬の投与後に減少する、項目７３～１００のいずれか一項に記載の使用。
（項目１０３）
前記対象の前記筋肉における比力、線維直径サイズ、および／または偏心収縮が、前記医薬の投与前と比較して、前記医薬の投与後に増加する、項目７２～１０２のいずれか一項に記載の使用。
（項目１０４）
前記アルファ－サルコグリカン遺伝子発現が、ウエスタンブロットおよび／または免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目１００に記載の使用。
（項目１０５）
細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現するための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の使用であって、前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物が、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、使用。
（項目１０６）
前記対象の前記細胞における前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現が、筋生検におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目１０５に記載の使用。
（項目１０７）
前記細胞における前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現が、筋生検における免疫組織化学によってアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される、項目１０５に記載の使用。
（項目１０８）
前記アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現が、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって前記対象において測定される、項目１０５に記載の使用。
（項目１０９）
血清ＣＫレベルの減少を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の使用であって、前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物が、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、使用。
（項目１１０）
対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させるための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の使用であって、前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物が、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、使用。
（項目１１１）
アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行うための医薬の調製のためのｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の使用であって、前記ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物が、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、使用。
（項目１１２）
前記対象が、４～１５歳であるヒト対象である、項目１～１１１のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。
（項目１１３）
前記対象が、小児対象、青年対象、または若年成人対象である、項目１～１１１のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。
（項目１１４）
前記対象が、４～１５歳であり、両方の対立遺伝子において確認されたアルファ－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）変異を有し、ＡＡＶｒｈ７４抗体に対して陰性であり、かつ／または４０％超もしくは通常の１００メートルの歩行試験を有した、ヒト対象である、項目１～１１１のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。
（項目１１５）
前記対象が、中年成人または高齢対象である、項目１～１１１のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。
（項目１１６）
前記対象が、２５～５５歳であるヒト対象である、項目１～１１１のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。
（項目１１７）
前記対象が、５０歳以上であるヒト対象である、項目１～１１１のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用。
（項目１１８）
ＡＡＶベクタープラスミドを宿主細胞に移入することを含む、項目１～１１７のいずれか一項に記載の方法、組成物、または使用において投与された前記ｒＡＡＶを生成する方法であって、前記ＡＡＶベクタープラスミドが、配列番号８に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、方法。
（項目１１９）
前記ＡＡＶベクタープラスミドが、配列番号８のヌクレオチド配列を含む、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
前記ベクタープラスミドが、配列番号１、４、または８に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、項目１１８または１１９に記載の方法。
（項目１２１）
前記ベクタープラスミドが、配列番号１、４、または８のヌクレオチド配列を含む、項目１１８または１１９に記載の方法。
（項目１２２）
パッケージングプラスミドおよび／またはヘルパーウイルスを前記宿主細胞に移入することをさらに含む、項目１１８～１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
パッケージング細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶｃａｐ遺伝子を含む、項目１１８～１２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２４）
前記パッケージング細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含む、項目１１８～１２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２５）
配列番号１、４、または８に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む、宿主細胞。
（項目１２６）
前記ＡＡＶベクタープラスミドが、配列番号１、４、または８のヌクレオチド配列を含む、項目１２５に記載の宿主細胞。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1】ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ遺伝子カセットを示す。

【図2-1】ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡによる全身処置後の用量漸増試験における導入遺伝子の発現を示す。（Ａ）１×１０^１２ｖｇ、３×１０^１２ｖｇ、および６×１０^１２ｖｇ（または２０ｇのマウスに基づいて、それぞれ５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、および２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）で全身（静脈内）処置されたマウスの複数の筋肉のアルファ－サルコグリカン免疫蛍光染色（ｎ＝１群当たり６）。処置後１２週間でのアルファ－サルコグリカンを発現する筋線維は、未処置の対照と比較して７０％～９３％の範囲であった。（Ｂ）処置されたｓｇｃａ^－／－マウスからの筋肉のウエスタンブロットにより、ｈＳＧＣＡタンパク質の発現が確認される。略語：ＴＡ、前脛骨筋；ＧＡＳ、腓腹筋；ＱＤ、大腿四頭筋；ＴＲＩ、上腕三頭筋；ＧＬＵＴ、臀筋；ＰＳＯ、大腰筋；ＤＩＡ、横隔膜；ＨＲＴ、心臓；ＷＴ、野生型。

【図2-2】ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡによる全身処置後の用量漸増試験における導入遺伝子の発現を示す。（Ａ）１×１０^１２ｖｇ、３×１０^１２ｖｇ、および６×１０^１２ｖｇ（または２０ｇのマウスに基づいて、それぞれ５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、および２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）で全身（静脈内）処置されたマウスの複数の筋肉のアルファ－サルコグリカン免疫蛍光染色（ｎ＝１群当たり６）。処置後１２週間でのアルファ－サルコグリカンを発現する筋線維は、未処置の対照と比較して７０％～９３％の範囲であった。（Ｂ）処置されたｓｇｃａ^－／－マウスからの筋肉のウエスタンブロットにより、ｈＳＧＣＡタンパク質の発現が確認される。略語：ＴＡ、前脛骨筋；ＧＡＳ、腓腹筋；ＱＤ、大腿四頭筋；ＴＲＩ、上腕三頭筋；ＧＬＵＴ、臀筋；ＰＳＯ、大腰筋；ＤＩＡ、横隔膜；ＨＲＴ、心臓；ＷＴ、野生型。

【図3-1】ｓｇｃａ－／－マウスにおける用量に依存しないｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡによる筋肉形態の改善を示す。（Ａ）１×１０^１２ｖｇ、３×１０^１２ｖｇ、および６×１０^１２ｖｇ（または２０ｇのマウスに基づいて、それぞれ５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、および２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡで処置されたｓｇｃａ－／－マウスからの様々な筋肉のヘマトキシリンおよびエオシン画像。代表的な２０倍の画像は、処置用量に依存しない中心核の劇的な減少および線維サイズの全体的な正常化を示す。（Ｂ）ビヒクルで処置されたマウスおよび野生型対照と比較した、処置群における様々な筋肉の筋線維直径の正常化を確認する定量化（ｎ＝１群当たり６）。（Ｃ）未処置のマウスおよび野生型対照と比較した、処置されたマウスの筋肉の中心に位置する核の定量化（ｎ＝１群当たり６）。略語：ＴＡ、前脛骨筋；ＧＡＳ、腓腹筋；ＱＤ、大腿四頭筋；ＧＬＵＴ、臀筋；ＰＳＯ、大腰筋；ＴＲＩ、上腕三頭筋；ＤＩＡ、横隔膜；ＷＴ、野生型。

【図3-2】ｓｇｃａ－／－マウスにおける用量に依存しないｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡによる筋肉形態の改善を示す。（Ａ）１×１０^１２ｖｇ、３×１０^１２ｖｇ、および６×１０^１２ｖｇ（または２０ｇのマウスに基づいて、それぞれ５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、および２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡで処置されたｓｇｃａ－／－マウスからの様々な筋肉のヘマトキシリンおよびエオシン画像。代表的な２０倍の画像は、処置用量に依存しない中心核の劇的な減少および線維サイズの全体的な正常化を示す。（Ｂ）ビヒクルで処置されたマウスおよび野生型対照と比較した、処置群における様々な筋肉の筋線維直径の正常化を確認する定量化（ｎ＝１群当たり６）。（Ｃ）未処置のマウスおよび野生型対照と比較した、処置されたマウスの筋肉の中心に位置する核の定量化（ｎ＝１群当たり６）。略語：ＴＡ、前脛骨筋；ＧＡＳ、腓腹筋；ＱＤ、大腿四頭筋；ＧＬＵＴ、臀筋；ＰＳＯ、大腰筋；ＴＲＩ、上腕三頭筋；ＤＩＡ、横隔膜；ＷＴ、野生型。

【図4】ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡで処置されたｓｇｃａ^－／－マウスの線維症の軽減を示す。（ａ）ピクロシリウスレッド染色は、示される代表的な２０倍の画像の様々な筋肉における、ビヒクルで処置されたｓｇｃａ^－／－マウスと比較して、コラーゲン沈着の減少によって示される、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡで処置されたマウスにおける線維症の軽減を示す。（Ｂ）様々な筋肉におけるコラーゲンレベルの定量化により、未処置のマウスおよび野生型対照と比較して、３つの処置群すべてにおいてコラーゲンレベルの減少が確認される（ｎ＝１群当たり６）。略語：ＰＳＯ、大腰筋；ＤＩＡ、横隔膜；ＴＲＩ、上腕三頭筋；ＧＬＵＴ、臀筋。

【図5】ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡによる処置後の骨格筋の機能上の利点を示す。（Ａ）３ヶ月の処置後、前脛骨筋（ＴＡ）を採取して（左右両方）、比力および収縮誘発性ダメージに対する抵抗性を測定した（ＴＡ重量に対しての標準化）。比力および偏心収縮の定量化は、未処置の対照と比較して、すべての処置群（用量間の差は最小限）で増加した（ｎ＝１群当たり６）。（Ｂ）横隔膜筋条片を採取して、比力を測定した。１２週間の処置後、力は、未処置のｓｇｃａ^－／－マウスと比較して、処置されたマウスにおいて有意に増加した。（Ｃ）１２週間の処置後、未処置のｓｇｃａ^－／－対照と比較して、処置されたマウスのオープンフィールド分析により、歩行および垂直活動に改善が見られた（ｎ＝１群当たり６）。（Ｄ）血清中のクレアチンキナーゼレベルは、未処置のｓｇｃａ^－／－対照と比較して、すべての処置群で減少した。データは、一元配置分散分析とそれに続く多重比較のためのテューキーの事後分析によって分析された。特に記載がない限り、ビヒクルで処置されたｓｇｃａ^－／－マウスと比較して、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１である。略語：ＴＡ、前脛骨筋；ＤＩＡ、横隔膜；ＷＴ、野生型。

【図6】ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡによる処置後の血液化学による毒性の証拠を示さない。肝酵素（ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびＡＬＰ／Ｋ）および血糖（ＧＬＵ）レベルの毒性を分析した（ｎ＝１群当たり６）。処置されたマウスのすべての化学的値は、点線によって示されるように、マウスの正常／健康限界内であった。

【図7A】３×１０^１２ｖｇおよび^{６×１０１２}ｖｇ（または２０ｇのマウスに基づいて、それぞれ１×１０^１４ｖｇ／ｋｇおよび２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫの静脈内送達後のｓｇｃａ^－／－マウスからの様々な組織における定量的ポリメラーゼ連鎖反応に加えられた１マイクログラムのＤＮＡ当たりの転写物の平均ｖｇコピーの全身のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ送達－分布ヒストグラムの生体分布分析を示す。

【図7B】ＷＴ、およびビヒクル（ｓｇｃａ^－／－ＬＲ（乳酸リンガー））または１．０×１０^１２ｖｇ（左のウエスタンブロット）もしくは６×１０^１２ｖｇ（右のウエスタンブロット）でのｓｃＡＡｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡのいずれかで処置されたｓｇｃａ^－／－マウスの肝臓におけるアルファ－サルコグリカンタンパク質発現のウエスタンブロットを示す。各レーンは、独立したマウスを表す（Ｍ１：マウス１、Ｍ２：マウス２、Ｍ３：マウス３）。下のパネルは、装填対照として使用されたビンキュリンを表す。略語：ＤＩＡ、横隔膜；ＴＡ、前脛骨筋；ＴＲＩ、上腕三頭筋。

【図8】蛍光抗体法（図８Ａ）およびウエスタンブロット（図８Ｂ）による１２ヶ月齢のｓｇｃａ^－／－マウスの骨格筋におけるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの発現を示す。図８Ｃのグラフは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡのｓｇｃａ^－／－マウスの陽性筋線維の割合を提供する。略語：ＴＡ、前脛骨筋；ＧＡＳ、腓腹筋；ＱＤ、大腿四頭筋；ＧＬＵＴ、臀筋；ＴＲＩ、上腕三頭筋；ＰＳＯＡＳ、大腰筋、横隔膜；ＷＴ、野生型、ＬＲＳ、乳酸リンガー溶液

【図9-1】１２ヶ月齢のＳＧＣＡ^－／－マウスにおいてｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを投与した組織学的結果を示す。図９ａは、改善された筋肉の病理を示す。図９ｂは、腓腹筋（ＧＡＳ）および上腕三頭筋（ＴＲＩ）における中心核形成の減少および平均線維サイズの増加を示す。図９ｃは、未処置の対照と比較した、線維症のレベルの低下を示す。略語：ＴＡ、前脛骨筋；ＧＡＳ、腓腹筋；ＱＤ、大腿四頭筋；ＧＬＵＴ、臀筋；ＰＳＯ、大腰筋、ＴＲＩ、上腕三頭筋；横隔膜；ＷＴ、野生型。

【図9-2】１２ヶ月齢のＳＧＣＡ^－／－マウスにおいてｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを投与した組織学的結果を示す。図９ａは、改善された筋肉の病理を示す。図９ｂは、腓腹筋（ＧＡＳ）および上腕三頭筋（ＴＲＩ）における中心核形成の減少および平均線維サイズの増加を示す。図９ｃは、未処置の対照と比較した、線維症のレベルの低下を示す。略語：ＴＡ、前脛骨筋；ＧＡＳ、腓腹筋；ＱＤ、大腿四頭筋；ＧＬＵＴ、臀筋；ＰＳＯ、大腰筋、ＴＲＩ、上腕三頭筋；横隔膜；ＷＴ、野生型。

【図10】ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ投与後の老齢マウスの機能改善を示す。

【発明を実施するための形態】

【0055】

本開示は、アルファ－サルコグリカンを発現するポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶの投与が、肢帯型筋ジストロフィー動物モデルにおける筋線維症の軽減または完全な回復をもたらすという発見に基づいている。本明細書の実施例に実証されるように、本明細書に記載のｒＡＡＶの投与は、ＣＫレベルの減少、筋力の増加、歩行および垂直活動の改善、ならびに他の運動機能を含むジストロフィー機能の逆転をもたらした。

【0056】

本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の技術の範囲内で、ウイルス学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。そのような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。

【0057】

本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、上記または下記に関わらず、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0058】

定義
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上特に明記されていない限り、複数形の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「培養物」への言及は、１つ以上の培養物および当業者に周知されるその同等物への言及を含む、などである。「組換えＡＡＶ」への言及は、２つ以上のｒＡＡＶビリオンの混合物を含む、などである。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0059】

特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替案のみを指すように明示的に示されない限り、または代替案が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するように使用されるが、本開示は、代替案および「および／または」のみを指す定義を支持する。

【0060】

本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するために使用されているデバイスまたは方法に対する統計的実験誤差（誤差の標準偏差）を含むことを示すために使用される。

【0061】

「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどの、適切な制御要素と関連する場合に複製することができ、かつ細胞間で遺伝子配列を移入することができる、任意の遺伝子要素を意味する。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。発現ベクターは、様々な制御配列、構造遺伝子（例えば、目的の遺伝子）、および他の機能も果たす核酸配列を含有することができる。

【0062】

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞内でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特性評価されているＡＡＶの血清型は１３個存在する。ＡＡＶの一般的な情報および概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、およびＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で見つけることができる。しかしながら、様々な血清型が遺伝子レベルでさえも構造的および機能的の両方で非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、およびＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ２で発現されたもの等の３つの関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、および「末端逆位配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によってさらに示唆される。類似の感染性パターンは、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることも示唆する。

【0063】

「ＡＡＶベクター」という用語は、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している１つ以上の目的のポリヌクレオチド（またはトランス遺伝子）を指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物をコードおよび発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合に、感染性ウイルス粒子に複製およびパッケージングされ得る。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、限定されないが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ１０、およびＡＡＶ ｒｈ７４を含む、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターである。ＡＡＶベクターは、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子で、ＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１つ以上が全部または一部分において欠失しているが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持することができる。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製、およびパッケージングに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製およびパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスで必要とされる少なくともそれらの配列を含むように本明細書で定義される。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的レスキュー、複製、およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変更され得る。

【0064】

「ＡＡＶヘルパー機能」という用語は、生産的なＡＡＶ複製のために次にトランスで機能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現され得るＡＡＶ由来コード配列を指す。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｒｅｐ、およびｃａｐを含む。Ｒｅｐ発現産物は、とりわけ、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合、およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を所有することが示されている。Ｃａｐ発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書では、ＡＡＶベクターから失われたトランスのＡＡＶ機能を補完するために使用される。

【0065】

「組換えウイルス」とは、例えば、ウイルス粒子への異種核酸配列の付加または挿入によって遺伝的に変更されたウイルスを意味する。

【0066】

「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシドに包まれたポリヌクレオチドＡＡＶベクターから成るウイルス粒子を指す。一実施形態では、ＡＡＶビリオンは、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む。一実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子の産生には、ＡＡＶベクターの産生が含まれ、例えば、ベクターは、ＡＡＶベクター粒子内に含有される。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達されるトランス遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ｒＡＡＶベクター」または単に「ｒＡＡＶ粒子」と称される。したがってＡＡＶベクター粒子の産生には、ｒＡＡＶの産生が必然的に含まれ、ｒＡＡＶゲノムは、ｒＡＡＶベクター粒子ないに含有される。

【0067】

例えば、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶキャプシドタンパク質コートに関連する線形の一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む。ＡＡＶビリオンは、一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶまたは自己相補的（ＳＣ）ＡＡＶのいずれかであり得る。一実施形態では、相補的センス、例えば「センス」または「アンチセンス」鎖のいずれかの一本鎖ＡＡＶ核酸分子は、ＡＡＶビリオンにパッケージングされ得、両方の鎖は、等しく感染性である。

【0068】

「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ ＩＴＲが両側に隣接する目的の異種ヌクレオチド配列をカプセル化する、ＡＡＶタンパク質シェルから成る感染性の複製欠損ウイルスとして本明細書で定義される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、好適な宿主細胞で産生され、これは、その中に導入されたＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー機能、およびアクセサリー機能を有する。このようにして、宿主細胞は、その後の遺伝子送達のために、ＡＡＶベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含有する）を感染性組換えビリオン粒子にパッケージングするために必要とされるＡＡＶポリペプチドをコードすることができる。

【0069】

「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指し、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されたときに「トランスフェクト」される。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野において一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。そのような技術を用いて、ヌクレオチド組込みベクターおよび他の核酸分子などの、１つ以上の外来性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入することができる。

【0070】

「形質導入」という用語は、複製欠損ウイルスベクターを介した、例えば、組換えＡＡＶビリオンを介したインビボまたはインビトロのいずれかでのレシピエント細胞へのＤＮＡ分子の送達を意味する。

【0071】

「宿主細胞」という用語は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶベクタープラスミド、アクセサリー機能ベクター、またはその他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用できるか、または使用されてきた、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を意味する。この用語には、トランスフェクトされた元の細胞の子孫が含まれる。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」は、一般に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。単一の親細胞の子孫は、自然、偶発的、または意図的な変異のために、形態またはゲノムまたは全ＤＮＡ補体において必ずしも完全に同一でない場合があることが理解される。

【0072】

「異種」という用語は、コード配列および制御配列などの核酸配列に関連するとき、通常は一緒に結合されていない、かつ／または通常は特定の細胞に関連していない配列を示す。したがって、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、自然界で他の分子と関連して見られない、別の核酸分子内または別の核酸分子に付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、自然界のコード配列に関連して見られない配列が隣接するコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が自然界で見られない（例えば、天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）構築物である。同様に、細胞内に通常は存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的のために異種であると見なされるであろう。本明細書で使用される場合、対立遺伝子変異または自然に発生する変異事象は、異種ＤＮＡを生じさせない。

【0073】

「コード配列」または特定のタンパク質を「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に配置されると、インビトロまたはインビボでポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列が含まれるが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置するであろう。

【0074】

「核酸」配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。核酸には、４－アセチルシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルアデニン、１－メチルシュードウラシル、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、シュードウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、および２，６－ジアミノプリンを含むが、これらに限定されないＤＮＡおよびＲＮＡの塩基類似体が含まれる。

【0075】

ＤＮＡ「制御配列」という用語は、集合的に、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製の起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを指し、これらは、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写、および翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞で複製、転写、および翻訳されることができる限り、これらの制御配列のすべてが常に存在する必要はない。

【0076】

「プロモーター」という用語は、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すために、その通常の意味で本明細書において使用され、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’－方向）コーディング配列の転写を開始させることができる遺伝子に由来する。転写プロモーターには、「誘導性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、「抑制性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、および「構成的プロモーター」が含まれ得る。一実施形態では、プロモーターは、筋特異的プロモーターであり、これには、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、デスミンプロモーター、骨格アルファアクチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ結合要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、短縮型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５～１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格の速筋トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋トロポニンｉ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子（ＨＩＦ）応答要素（ＨＲＥ）、ステロイド誘導性要素、およびグルココルチコイド応答要素（ｇｒｅ）が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、プロモーターは、ＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、またはＭＨＣＫ７プロモーターである。

【0077】

「動作可能にリンクされた」という用語は、そのように記述された構成要素がそれらの通常の機能を実行するように構成される要素の配置を指す。したがって、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現に影響を与えることができる。制御配列は、それらがその発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。したがって、例えば、介在する未翻訳であるが転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結されている」と見なされ得る。

【0078】

ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、コード配列をｍＲＮＡに転写し、次にコード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳されるとき、プロモーターは、細胞内のコード配列の「転写を指示」する。

【0079】

「発現カセット」または「発現構築物」は、目的の配列（複数可）または遺伝子（複数可）の発現を指示することができる集合体を指す。発現カセットは、上記のように、目的の配列（複数可）または遺伝子（複数可）に（転写を指示するように）作動可能に連結されるプロモーターなどの制御要素を含み、ポリアデニル化配列も含むことが多い。本発明のある特定の実施形態内で、本明細書に記載の発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。発現カセットの構成要素に加えて、プラスミド構築物はまた、１つ以上の選択可能なマーカー、プラスミド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル、少なくとも１つのマルチクローニング部位、および「哺乳動物」の複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの複製起点）を含み得る。

【0080】

ヌクレオチド配列を指す場合の「単離された」とは、示された分子が、他のヌクレオチド配列、クロマチン材料などの他の生物学的高分子の実質的な不在下に存在することを意味する。したがって、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」は、対象のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指すが、しかしながら、分子は、組成物の基本的な特性に悪影響を及ぼさないいくつかの追加の塩基または部分を含み得る。

【0081】

特定のヌクレオチド配列が別の配列に対して「上流」、「下流」、「３」、または「５」に位置すると記載されている場合など、本出願全体にわたって特定の核酸分子中のヌクレオチド配列の相対位置を記載する目的で、それは、当技術分野で慣習的であると称されるＤＮＡ分子の「センス」または「コーディング」鎖における配列の位置であることが理解されるべきである。

【0082】

核酸配列またはアミノ酸配列の文脈における「配列同一性」、「配列同一性の割合」、または「同一の割合」という用語は、最大限対応するようにアラインメントさせたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長であり得るか、または少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片が望ましい。しかしながら、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドなど、より小さい断片間の同一性もまた所望され得る。配列の同一性の割合は、当技術分野で知られている技術によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させ、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、およびＢＬＡＳＴなどの容易に入手可能なコンピュータープログラムを使用することにより、２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接比較することによって決定することができる。一実施形態では、ＢＬＡＳＴがアラインメントツールとして使用される場合、次のデフォルトパラメータ、遺伝暗号＝標準；ｆｉｌｔｅｒ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；マトリクッス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０個の配列；並べ替え＝高得点；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋スイスプロテイン＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。

【0083】

「対象」という用語は、動物界の任意のメンバーを指し、これには、ヒトならびにチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種などの非ヒト霊長類、牛、羊、豚、山羊、および馬などの家畜、犬および猫などの家畜哺乳類、マウス、ラット、およびモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象は、出生～２歳、１～１０歳の範囲、または４～１５歳の範囲、または１０～１９歳の範囲、または２０～４０歳、または１５～２９歳または２５～５５歳の範囲、または４０～６０歳の範囲、または５０歳以上または６０歳以上または６５歳以上または７０歳以上のヒトである。例えば、対象は、ヒトの子供（２～１２歳）、ヒトの青年（１０～１９歳）である。いくつかの実施形態では、対象は、成人（１８歳以上）である。特に、対象は、若年成人（１５～２９歳）、中年成人（２５～５５歳）、またはそれ以上の年齢の成人（５０歳以上）、または高齢のヒト対象（６５歳以上）、または老齢のヒト対象（７０歳以上）である。

【0084】

「治療効果」とは、本明細書に記載の処置によって与えられる任意の治療上の利益を意味する。例えば、そのような効果は、適切な標的組織において、目的の筋ジストロフィーで不完全であるか、または不足しているタンパク質または酵素の持続的な発現であり得る。さらに、治療効果は、目的の疾患または障害の１つ以上の臨床的または亜臨床的な兆候のいかなる軽減または排除であり得る。例えば、ＣＫレベルの減少、線維症の軽減が軽減され、前脛骨筋の収縮誘発性損傷に対する抵抗性の増加、および／筋肉内の比力の増加、および運動機能の改善は、処置されたＬＧＭＤ－２Ｄを有する対象に治療上の利益を提供する。

【0085】

別の態様では、本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、アルファ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、またはタンパク質は、アルファ－サルコグリカン活性を保持する。別の実施形態では、アルファ－サルコグリカンは、配列番号２に示されるポリペプチド配列を含む。

【0086】

別の態様では、本明細書に記載されているのは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む機能性アルファ－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列、またはその補体を含む、組換えＡＡＶベクターである。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号４に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号１または配列番号４のヌクレオチド配列を含む。

【0087】

「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、６５～６８℃の０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウムまたは０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および４２℃の５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤など）も使用できるが、ハイブリダイゼーションの速度が影響を受ける。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係する場合、追加のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、３７℃（１４塩基オリゴの場合）、４８℃（１７塩基オリゴの場合）、５５℃（２０塩基オリゴの場合）、および６０℃（２３塩基オリゴの場合）での６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸ナトリウムでの洗浄が含まれる。

【0088】

分子量、濃度、または投薬量等の物理的特性について本明細書で範囲が使用される場合、範囲およびその中の特定の実施形態の全ての組み合わせおよび部分的な組み合わせが含まれることが意図される。数値または数値範囲を指す場合の「約」という用語は、参照される数値または数値範囲が実験的変動内（または統計的実験誤差内）の近似値であることを意味し、したがって、数値または数値範囲は、例えば、記載された数値または数値範囲の１％～１５％の間で変動し得る。

【0089】

非特異的および／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減する目的で、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液に他の薬剤を含めることができる。例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル－ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ_４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランがあるが、他の適切な薬剤も使用できる。これらの添加物の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更できる。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８～７．４で行われるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度はｐＨにほとんど依存しない。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数を考慮して、異なる配列類似性のＤＮＡがハイブリッドを形成することを可能にするために、当業者によって調整され得る。

【0090】

肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ２Ｄ）は、筋力低下、呼吸異常、まれに心筋症を伴う進行性筋ジストロフィーである。ＬＧＭＤ２Ｄは、アルファ－サルコグリカン遺伝子の変異によって引き起こされ、タンパク質の喪失、およびサルコグリカンおよびジストロフィン関連糖タンパク質複合体に付随して発生する喪失をもたらす。Ｓｇｃａ－ｎｕｌｌ（ｓｇｃａ^－／－）マウスは、筋壊死および線維症、血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）の上昇、絶対筋力および自発運動の低下などのジストロフィー機能を含む、ＬＧＭＤ２Ｄ患者の臨床表現型を再現する。したがって、ｓｇｃａ^－／－マウスは、遺伝子置換の安全性および有効性を試験するための関連モデルを提供する。これにより、本開示は、筋特異的プロモーターである短縮型筋肉クレアチンキナーゼ（ｔＭＣＫ）によって駆動されるコドン最適化完全長ヒトＳＧＣＡ（ｈＳＧＣＡ）導入遺伝子を含有する自己相補的ＡＡＶｒｈ７４ベクターを提供する。ｓｇｃａ^－／－マウスにおけるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの有効性および安全性が、ビヒクルで処置されたマウスおよび野生型マウスと比較して、１×１０^１２、３×１０^１２、および６×１０^１２ｖｇの単回全身注射を評価するために、用量漸増設計を使用して試験された。ｓｇｃａ^－／－マウスにおいて、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡによる処置により、試験したすべての用量で、骨格筋の筋鞘膜においてα－ＳＧの強力なタンパク質発現がもたらされた。さらに、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡは、線維症の軽減および中心核形成の減少、ならびに筋線維サイズの正常化によって示されるように、ｓｇｃａ^－／－マウスの四肢および横隔膜筋の組織病理を改善するのに効果的であった。これらの分子変化は、横隔膜および前脛骨筋における比力の生成の有意な増加、偏心力の喪失に対する保護、および血清ＣＫの減少に付随した。自発運動は、ビヒクルで処置されたｓｇｃａ^－／－マウスと比較して、ベクターで処置されたマウスのすべての用量で改善された。最後に、ベクター関連毒性の欠如が血清化学パネルおよび肉眼的剖検によって検出された。まとめると、この研究は、ＬＧＭＤ２Ｄの治療のための臨床設定におけるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの全身送達の裏付けを提供する。

【0091】

別の態様では、本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターは、筋特異的制御要素に作動可能に連結され得る。例えば、筋特異的プロモーターは、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、デスミンプロモーター、骨格アルファア－クチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ結合要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、短縮型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５～１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋トロポニンｉ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子（ＨＩＦ）応答要素（ＨＲＥ）、ステロイド誘導性要素、およびグルココルチコイド応答要素（ｇｒｅ）のうちの１つ以上を含む。

【0092】

一実施形態では、筋特異的プロモーターは、配列番号３の配列を含むｔＭＣＫプロモーターである。本明細書に記載の例示的なｒＡＡＶは、配列番号４のヌクレオチド配列を含むＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列に対してか、または配列番号１に対して少なくとも６５％、約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。

【0093】

別の実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、アルファ－サルコグリカン活性を保持するタンパク質をコードする。

【0094】

一実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号５の５’逆位末端反復配列を含む。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号６の３’逆位末端反復配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号７のポリＡ配列を含む。

【0095】

ＡＡＶは、任意の血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ．１０、ＡＡＶ ｒｈ．７４、または変異体、およびそれらの誘導体であり得る。一実施形態では、ｒＡＡＶは、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のｒＡＡＶである。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ２００１／０８３６９２に開示され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。

【0096】

本明細書に記載のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物もまた企図される。

【0097】

提供されているのは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行う方法であり、ｒＡＡＶは、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で使用して投与される。例えば、提供される方法のうちのいずれかにおいて、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は、約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。一実施形態では、ｒＡＡＶは、静脈内経路を含む全身経路によって投与される。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される。一実施形態では、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィーである。

【0098】

加えて、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１．５×１０^１３ｖｇ～約３．５×１０^１６ｖｇ、または約３×１０^１３ｖｇ～約１．０×１０^１６ｖｇ、または約１．５×１０^１３ｖｇ～約２×１０^１５ｖｇ、または約１．５×１０^１３ｖｇ～約１×１０^１４ｖｇである。加えて、方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶの用量は、約１０ｍＬ／ｋｇの濃度で投与される。一実施形態では、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィーである。一実施形態では、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型である。本開示における用量は、ｖｇまたはｖｇ／ｋｇのいずれかで表され、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による滴定認定法に基づく。ｑＰＣＲベースの滴定法は、当技術分野で知られている。

【0099】

加えて、提供されているのは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行う方法であり、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルは、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加し、対象における血清ＣＫレベルは、ｒＡＡＶの投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少し、かつ／または自発運動および比力の生成は増加し、線維症は軽減し、前脛骨筋の収縮誘発性損傷に対する抵抗性は増加し、かつ／対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前のアルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加し、対象の筋肉組織における線維直径サイズは、ｒＡＡＶの投与前の線維直径の数と比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加し、または対象の筋肉組織における中心核形成は、ｒＡＡＶの投与前の中心核形成と比較して、ｒＡＡＶの投与後に減少する。筋肉組織には、上腕三頭筋、前脛骨筋、ヒラメ筋、腓腹筋、上腕二頭筋、僧帽筋、臀筋、大腰筋、三角筋、大腿四頭筋、および横隔膜が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、筋肉組織には、前脛骨筋、腓腹筋、臀筋、大腰筋、および上腕三頭筋が含まれる。アルファ－サルコグリカンの発現は、当業者に知られている方法によって決定される。一実施形態では、発現は、ウエスタンブロット、筋生検における免疫化学によって、および／またはゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって決定される。

【0100】

いくつかの実施形態では、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行う方法を含み、運動機能は、ｒＡＡＶの投与前の該対象の運動機能と比較して、該対象において明らかに改善される。

【0101】

提供されているのは、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を患者に投与することを含む、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行う方法である。

【0102】

提供される筋ジストロフィーを治療する方法、使用、および組成物のうちのいずれかにおいて、対象は、４～１５歳であり、両方の対立遺伝子において確認されたアルファ－サルコグリカン（ＳＧＣＡ）変異を有し、ＡＡＶｒｈ７４抗体に対して陰性であり、かつ／または４０％超もしくは通常の１００メートルの歩行試験を有した。提供される筋ジストロフィーを治療する方法、使用および組成物のうちのいずれかにおいて、対象は、小児対象である。いくつかの実施形態では、対象は、小児対象であり、例えば、１～２１歳の範囲の対象である。いくつかの実施形態では、対象は、１～１０歳、または２～１２歳、４～１５歳、または１０～１９歳である。一実施形態では、対象は、青年対象であり、例えば、１２～２１歳の範囲の対象である。加えて、対象は、一実施形態では、１５～２９歳または１８～３９歳の年齢の範囲の対象などの若年成人対象である。いくつかの実施形態では、対象は、中年成人または高齢対象であり、その結果、中年成人は、２５～５５歳の範囲であってもよく、それ以上の年齢の成人対象は、５０歳を超える範囲であってもよく、高齢対象は、６５歳を超える範囲であってもよい。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、注射、注入、または移植によって投与される。例えば、ｒＡＡＶは、およそ１～２時間にわたる注入によって投与される。加えて、ｒＡＡＶは、末梢四肢静脈を介した静脈内経路によって投与される。

【0103】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを投与するステップを含む、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行う方法では、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、ｒＡＡＶは、配列番号１に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号２に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列を含むタンパク質をコードする。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号２に示されるポリペプチド配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。加えてさらに、開示されたｒＡＡＶのうちのいずれかは、配列番号３のｔＭＣＫプロモーター配列などのプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、血清型ＡＡＶｒｈ．７４のｒＡＡＶである。加えて、ｒＡＡＶは、配列番号３のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号５の５’逆位末端反復配列を含む。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号６の３’逆位末端反復配列を含む。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号７のポリＡ配列を含む。

【0104】

ＡＡＶ投薬量は、ＬＩＳＡ、逆転写酵素活性の評価、ＦＡＣＳ、形質導入アッセイノーザンブロッティング（例えば、半定量的ノーザン）、ドットブロット分析、またはＰＣＲ（例、ｑＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない複数の方法によって決定することができる。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）でＡＡＶベクターゲノムを測定することにより、ＡＡＶの用量を決定できることはよく知られている。そのようなｑＰＣＲ法は、従来の形質導入アッセイからの矛盾または恣意的な結果を克服する。ＰＣＲ投薬量決定の一実施形態では、プラスミドＤＮＡが較正標準として使用される。プラスミドの形態は、ｑＰＣＲ法による投薬量の結果に影響を与える可能性がある。一実施形態では、環状または超らせんＤＮＡまたはプラスミドが、定量標準として使用される。別の実施形態では、線形化されたＤＮＡまたはプラスミドが定量標準として使用される。

【0105】

「超らせんＤＮＡ」または「超らせんプラスミド」という用語は、遊離端を含まないＤＮＡまたはプラスミドを指す。「線形化されたＤＮＡ」または「線形化されたプラスミド」という用語は、互いに連結されていない遊離の５’末端および遊離の３’末端を含むＤＮＡまたはプラスミドを指す。一実施形態では、線形化されたＤＮＡまたはプラスミドは、環状ＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）の制限消化によってか、またはｄｂＤＮＡの制限消化によって得られる。別の実施形態では、制限消化は、少なくとも１つの平滑末端を生成する酵素を使用して行われる。

【0106】

例示的な実施形態では、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象においてそれを行うための方法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ７．ｈＳＧＣＡを投与するステップを含み、ｒＡＡＶは、全身投与経路を使用して、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与され、ヒト対象は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している。一実施形態では、ｒＡＡＶは、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で、約１～２時間にわたる静脈内注入によって投与され、ｒＡＡＶは、配列番号３のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ７．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列含む。別の実施形態では、用量は、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。

【0107】

本開示はまた、対象の筋肉組織におけるサルコグリカン発現を増加させる方法を提供し、この方法は、配列番号１および／または４に対して少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または９９％同一のヌクレオチド配列を含むｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物を対象に投与することを含む。

【0108】

本開示はまた、対象の筋機能を改善する方法をさらに提供し、この方法は、配列番号１および／または４に対して少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または９９％同一のヌクレオチド配列を含む構築物を対象に投与することを含む。

【0109】

いくつかの態様では、対象は、サルコグリカンタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異、または筋ジストロフィーに苦しむ。いくつかの態様では、対象は、アルファ－サルコグリカンタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異に苦しむ。

【0110】

提供された方法のうちのいずれかにおいて、対象の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前のアルファ－サルコグリカン遺伝子発現のレベルと比較して、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ７．ｈＳＧＣＡ構築物の投与後に増加する。

【0111】

加えて、提供された方法のうちのいずれかにおいて、細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前後に生検された筋肉におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学でアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。

【0112】

提供された方法のうちのいずれかにおいて、アルファ－サルコグリカンタンパク質のレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与後に増加する。例えば、アルファ－サルコグリカンタンパク質のレベルのレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前後に生検された筋肉におけるウエスタンブロットでアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出されるとき、少なくとも３３％増加するか、または、アルファ－サルコグリカンタンパク質のレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前後の筋生検における免疫組織化学および／またはゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノム数を検出することによって測定される。

【0113】

本明細書に提供される方法のうちのいずれかにおいて、対象における血清ＣＫレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前の血清ＣＫレベルと比較して、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与後に減少する。

【0114】

本明細書に提供される方法のうちのいずれかにおいて、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｏｆｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前のアルファ－サルコグリカン陽性線維の数と比較して、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与後に増加する。例えば、アルファ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前後の筋生検でのウエスタンブロットまたは免疫組織化学によりアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。例えば、対象の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与後に増加する。

【0115】

本明細書に提供された方法のうちのいずれかにおいて、対象におけるアルファ－サルコグリカンのレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前のアルファ－サルコグリカンのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後に増加する。例えば、アルファ－サルコグリカンのレベルは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前後の筋生検での免疫組織化学またはウエスタンブロットによりアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。

【0116】

別の実施形態は、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、患者の細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法を提供する。提供された、患者の細胞においてアルファ－サルコグリカン遺伝子を発現する方法のうちのいずれかにおいて、患者の細胞におけるアルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物の投与前後の筋生検におけるウエスタンブロットまたは免疫組織化学でアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。一実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子は、１つの核当たり１つを超えるｒＡＡＶベクターゲノムコピーを検出することによって、患者において測定される。別の実施形態では、アルファ－サルコグリカン遺伝子の発現は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムの数を検出することによって、対象において測定される。

【0117】

配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、血清ＣＫレベルの減少を必要とする患者においてそれを行う方法も提供される。

【0118】

配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、患者の筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維を増加させる方法が提供される。これらの方法のうちのいずれかにおいて、アルファ－サルコグリカン陽性線維の数は、ｒＡＡＶの投与前後の筋生検でのウエスタンブロットまたは免疫組織化学によりアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。

【0119】

別の実施形態は、配列番号４のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ構築物ヌクレオチド配列を対象に投与することを含む、アルファ－サルコグリカンの発現の増加を必要とする対象においてそれを行う方法を提供する。これらの方法のうちのいずれかにおいて、アルファ－サルコグリカンのレベルは、ｒＡＡＶの投与前後の筋生検でのウエスタンブロットまたは免疫組織化学によりアルファ－サルコグリカンタンパク質レベルを測定することによって検出される。

【0120】

本明細書に記載される任意の組換えＡＡＶベクターでトランスフェクトされた細胞を培養することと、トランスフェクトされた細胞の上清から組換えＡＡＶ粒子を回収することと、を含む、組換えＡＡＶベクター粒子を産生する方法も提供される。本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含むウイルス粒子もまた企図される。一実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドを宿主細胞に移すことを含む、ｒＡＡＶを生成する方法。別の実施形態では、組換えＡＡＶベクター粒子および／またはＡＡＶベクタープラスミドは、配列番号８に対して少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、または約８９％、より典型的には約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約と９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％以上同一であるヌクレオチド配列を含む。別の態様では、本開示は、配列番号８のヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、宿主細胞において安定して発現される。ＡＡＶベクタープラスミドを安定して保有する宿主細胞を使用して、ｒＡＡＶを生成することができる。一実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ．ＫＡＮプラスミド（配列番号８）である。

【0121】

それを必要とする哺乳動物の対象における線維症を軽減する方法も提供される。この点について、本方法は、治療有効量の本明細書に記載のＡＡＶベクター（または本明細書に記載のＡＡＶベクターを含む組成物）を、哺乳動物の対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物の対象は、筋ジストロフィーに罹患している。一実施形態では、筋ジストロフィーは、ＬＧＭＤ２Ｄである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶベクター（または本明細書に記載のＡＡＶベクターを含む組成物）の投与は、対象の筋肉組織おける線維症を軽減する。一実施形態では、筋肉組織は、大腰筋、横隔膜、上腕三頭筋、および／または臀筋を含む。

【0122】

本明細書で使用される「筋ジストロフィー」という用語は、強度および筋肉量が徐々に低下する障害を指す。筋ジストロフィー疾患の非限定的な例としては、ベッカー型筋ジストロフィー、脛骨筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、エメリー－ドレイフス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、サルコグリカン異常症、部分的ＬＡＭＡ２欠損による先天性筋ジストロフィーのような先天性筋ジストロフィー、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、１Ｄ型先天性筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー、肢帯型１Ａ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ａ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｂ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｃ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｄ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｅ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｆ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｇ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｈ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｉ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｉ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｊ型筋ジストロフィー、肢帯型２Ｋ型筋ジストロフィー、肢帯型ＩＣ型筋ジストロフィー、単純型表皮水疱症を伴う強直性脊椎型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー、およびウルリッヒ型スクレロアトニック筋ジストロフィーを挙げることができる。いくつかの実施形態では、対象は、肢帯型筋ジストロフィーに罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型（ＬＧＭＤ２Ｄ）に罹患している。

【0123】

本明細書で使用される「線維症」という用語は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の過剰または未制御の沈着ならびに骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、および膵臓を含む損傷後の組織における異常な修復プロセスを指す。沈着するＥＣＭ成分には、コラーゲン（例えばコラーゲン１、コラーゲン２、またはコラーゲン３）およびフィブロネクチンが含まれる。

【0124】

別の態様では、本明細書に記載されているのは、治療有効量の本明細書に記載のＡＡＶベクター（または本明細書に記載のＡＡＶベクターを含む組成物）を哺乳動物の対象に投与することを含む、哺乳動物において、筋肉組織におけるアルファ－サルコグリカン陽性線維、線維直径サイズ、筋肉における偏心収縮、筋力、および／またはアルファ－サルコグリカンの発現を増加させる方法である。また、本明細書に記載されているのは、治療有効量の本明細書に記載のＡＡＶベクター（または本明細書に記載のＡＡＶベクターを含む組成物）を対象に投与することを含む、対象において、線維症、中心核形成、ＣＫレベル、および／またはコラージュ沈着を減少させる方法である。

【0125】

本発明の方法のいずれかにおいて、対象は、肢帯型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーのような筋ジストロフィーに罹患している可能性がある。一実施形態では、筋ジストロフィーは、ＬＧＭＤ－２Ｄである。

【0126】

治療有効量の本明細書に記載のＡＡＶベクター（または本明細書に記載のＡＡＶベクターを含む組成物）を哺乳動物の対象に投与することを含む、哺乳動物の対象における筋ジストロフィーを治療する方法も提供される。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、肢帯型筋ジストロフィーである。

【0127】

本発明の方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、筋肉内注射または静脈内注射により投与される。加えて、本発明の方法のうちのいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、注射、注入、または移植による非経口投与など、全身投与される。

【0128】

本発明の組成物は、筋肉内注射または静脈内注射用に製剤化される。加えて、本発明の組成物は、注射、注入、または移植による非経口投与など、全身投与用に製剤化される。

【0129】

加えて、組成物のうちのいずれかは、筋ジストロフィー（例えば、肢帯型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィー）に罹患している対象への投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、アルファ－サルコグリカンを発現する第２の組換えＡＡＶベクター、または配列番号１もしくは配列番号４に示されるポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターをさらに含み得る。

【0130】

本発明の使用のうちのいずれかにおいて、医薬は、筋肉内注射または静脈内注射用に製剤化される。加えて、本発明の使用のうちのいずれかにおいて、医薬は、注射、注入、または移植による非経口投与など、全身投与用に製剤化される。加えて、医薬のいずれかは、筋ジストロフィー（例えば、肢帯型筋ジストロフィーまたは任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィー）に罹患している対象への投与のために調製され得る。いくつかの実施形態では、医薬は、アルファ－サルコグリカンを発現する第２の組換えＡＡＶベクター、または配列番号１もしくは配列番号４に示されるポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えＡＡＶベクターをさらに含み得る。

【0131】

前述の段落は、本発明の全ての態様を定義することを意図するものではなく、追加の態様は、詳細な説明のような他のセクションに記載される。文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせがこの文書と同じ文章、または段落、またはセクションで一緒に見られない場合でも、本明細書に記載される特徴のすべての組み合わせが考慮されることを理解されたい。本発明は、追加の態様として、上記の特定の段落で定義される変形よりもいくらか範囲が狭い本発明のすべての実施形態を含む。例えば、本発明の特定の態様が属として記載される場合、属の各メンバーが個々に本発明の態様であると理解されるべきである。

【0132】

ＡＡＶ
本発明の組換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子および核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、およびＡＡＶ ｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示される。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。

【0133】

本発明のＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組込みのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に導入される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型からのものであり得、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ１０、およびＡＡＶ ｒｈ．７４が挙げられるが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ２００１／０８３６９２に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0134】

パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順により細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。適切な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムおよび／またはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用する。

【0135】

ｒＡＡＶ生産の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、およびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）に記載されている。Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８，７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。

【0136】

したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

【0137】

本発明の組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。実施形態には、配列番号３に示されるポリヌクレオチド配列を含む、ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡと名付けられたｒＡＡＶが含まれるが、これらに限定されない。

【0138】

ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９：４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、およびＷＯ９８／０９６５７に開示される方法を含む。

【0139】

別の実施形態では、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される担体中にｒＡＡＶを含む。本組成物は、希釈剤およびアジュバント等の他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤、およびアジュバントは、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量および濃度で不活性であり、リン酸、クエン酸、もしくは他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸等の抗酸化剤；低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールもしくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ、プルロニクス、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。

【0140】

本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、処置目標、個体、および標的とされる細胞型に応じて変化し、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３～約１×１０^１４、またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ｑＰＣＲによって測定されるときのウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。

【0141】

インビボまたはインビトロで、標的細胞にｒＡＡＶを形質導入する方法が、本発明によって企図される。インビボ方法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効な複数用量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本発明の実施形態では、有効用量は、治療すべき障害／疾患の状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除もしくは軽減）する用量であり、障害／疾患の状態への進行を緩徐化もしくは予防する用量であり、疾患の範囲を縮小する用量であり、疾患の寛解（部分的もしくは完全な）をもたらす用量であり、ならびに／または生存を延長させる用量である。本発明の方法による予防または治療のために企図される疾患の例は、筋ジストロフィー、例えば肢帯型筋ジストロフィーである。したがって、提供されるのは、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡで標的細胞を形質導入する方法である。

【0142】

別の実施形態では、本開示は、ＡＡＶベクタープラスミドを宿主細胞に移入することを含む、ｒＡＡＶ ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを生成する方法を提供する。ＤＮＡを宿主細胞に移入する方法は、当該技術分野で知られており、これには、トランスフェクション、感染、形質転換、エレクトロポレーション、および形質導入が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号８に対して少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、または約８９％、より典型的には約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約と９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％以上同一であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号８に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、本開示は、配列番号８のヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、宿主細胞において安定して発現される。ＡＡＶベクタープラスミドを安定して保有する宿主細胞を使用して、ｒＡＡＶを生成することができる。一実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ．ＫＡＮプラスミドである。

【0143】

一実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号１、４、または８に対して少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、または約８９％、より典型的には約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％以上同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0144】

一実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号１、４、または８に対して少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ベクタープラスミドは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。ｒＡＡＶを生成する方法は、一実施形態では、パッケージングプラスミドおよび／またはヘルパーウイルスを宿主細胞に移入することをさらに含む。パッケージングプラスミドは、いくつかの実施形態では、プロモーターに作動可能に連結されるＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を含む。一実施形態では、プロモーターは、ＡＡＶ転写プロモーターである。一実施形態では、宿主細胞は、パッケージング細胞である。一実施形態では、パッケージング細胞は、安定に組み込まれたＡＡＶｃａｐ遺伝子を含む。別の実施形態では、パッケージング細胞は、安定に組み込まれたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含む。

【0145】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、外因性ＤＮＡ配列を発現するために使用され得る細胞を指す。宿主細胞の非限定的な例は、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および／または哺乳動物細胞を含む。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、パッケージングプラスミド、ＡＡＶベクタープラスミド、アクセサリー機能ベクター、または他のＤＮＡのレシピエントとして使用することができる。ここで使用される用語は、元の宿主細胞で外因性ＤＮＡ配列を発現した後の元の細胞の子孫を包含する。ＡＡＶ産生のための宿主細胞の非限定的な例には、Ｓｆ９昆虫細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞が含まれる。ＡＡＶベクタープラスミドは、感染（ウイルスまたはバキュロウイルス）、試薬（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム）を使用した一時的なトランスフェクション、または物理的手段（例えば、エレクトロポレーション）、または当該技術分野で知られている他の手段によって、宿主細胞（例えば、Ｓｆ９または２９３Ｔ）に導入することができる。別の実施形態では、宿主細胞株は、それらのゲノムにｒＡＡＶプラスミドとともに安定に組み込まれる。このような安定した細胞株は、選択マーカーをベクタープラスミドに組み込むことによって確立することができる。

【0146】

一実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶウイルス粒子を産生するためのパッケージング細胞である。したがって、別の態様では、本開示は、配列番号８と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクタープラスミドを含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、ＡＡＶベクタープラスミドは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１、４、または８のヌクレオチド配列を含む。

【0147】

併用療法も本発明により企図される。本明細書で使用される併用療法は、同時治療または連続治療を含む。本発明の方法と標準的な医学的治療（例えば、ステロイド、コルチコステロイド、および／または限定されないがプレドニゾン、プレドニゾロン、およびデフラザコートのうちの１つ以上を含むグルココルチコイド）との組み合わせは、新規療法との組み合わせと同様に、具体的に企図される。この観点で、この組み合わせは、本発明の方法のｒＡＡＶを対象に投与する前に、ｒＡＡＶを対象に投与すると同時に、またはｒＡＡＶを対象に投与した後に、１つ以上のステロイド、コルチコステロイド、および／または限定されないがプレドニゾン、プレドニゾロン、およびデフラザコートのうちの１つ以上を含むグルココルチコイドを対象に投与することを含む。

【0148】

本発明によって企図される併用療法の関連する実施形態では、グルココルチコイドとしては、限定されないが、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、またはトリアムシノロンが挙げられる。

【0149】

抗原特異的Ｔ細胞応答は、ｒＡＡＶベクターを投与された対象で起こり得ることが認識されている。これは、遺伝子移入後２～４週間で予想される応答である。このような抗原特異的Ｔ細胞応答に対する１つの考えられる結果は、形質導入された細胞のクリアランスおよび導入遺伝子発現の喪失である。ｒＡＡＶベースの治療に対する宿主の免疫応答を弱めるために、治療前、例えば治療手順の２４時間前に、対象は、およそ１ｍｇ／ｋｇ／日の経口による予防的プレゾニゾンまたは同等のグルココルチコイドから始め、最大用量６０ｍｇ／日で投与することができる。必要に応じて、同等のグルココルチコイドをおよそ１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で静脈内投与することも可能である。治療は、およそ１ヶ月続く。プレゾニゾンまたは同等のグルココルチコイドの量を漸減させるプロトコルを、個々の対象の遺伝子移入に対する免疫応答に基づいて実施し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって、またＧＧＴによる肝機能モニタリングによって評価することができる。

【0150】

治療有効量のｒＡＡＶベクターは、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの範囲のｒＡＡＶの用量である。別の実施形態では、用量は、約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は、５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。本発明はまた、これらの範囲のｒＡＡＶベクターを含む組成物を含むように企図される。

【0151】

投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。ｒＡＡＶの力価は、超らせんＤＮＡもしくはプラスミド定量標準または線状化されたＤＮＡもしくはプラスミド定量標準によって決定されてもよい。ＡＡＶベクターの力価または投薬量は、定量標準としてのプラスミドまたはＤＮＡの物理的形態に基づいて変化する可能性がある。例えば、力価または投薬量の値は、超らせん標準ｑＰＣＲ力価測定法または線状化された標準ｑＰＣＲ力価測定法に基づいて変化し得る。一実施形態では、本開示における投薬量は、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づく。別の実施形態では、本開示における投薬量は、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づく。したがって、一実施形態では、ｒＡＡＶベクターの治療有効量は、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約２．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの範囲のｒＡＡＶの用量である。別の実施形態では、用量は、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、または２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。

【0152】

別の実施形態では、ｒＡＡＶベクターの治療有効量は、定量標準として線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約７．５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、または約１．８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの範囲のｒＡＡＶの用量である。例えば、ｒＡＡＶベクターの治療有効量は、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量である。

【0153】

一実施形態では、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づく５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量は、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づく１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇの用量と同等である。別の実施形態では、超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づく２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量は、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づく７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇと同等である。したがって、別の実施形態では、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づく約１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。

【0154】

組成物の有効用量の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬側、鼻、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶ ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路（複数可）および血清型（複数可）は、治療される感染症および／または疾患状態、ならびにα－サルコグリカンを発現する標的細胞／組織（複数可）を考慮して、当業者によって選択および／または適合され得る。

【0155】

本発明は、本発明のｒＡＡＶおよび組成物の有効用量の局所投与および全身投与を提供する。例えば、全身投与とは、全身が影響を受けるように循環系に投与することである。全身投与には、胃腸管を通した吸収のような経腸投与および注射、注入、または移植による非経口投与が含まれる。

【0156】

特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することにより達成され得る。本発明による投与としては、筋肉内への注入、血流への注入、および／または肝臓への直接注入が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体または他の成分に対する既知の制限はない（が、ＤＮＡを分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の方法で避けられるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾されてもよい。例えば、本開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。

【0157】

医薬組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射と経皮輸送の両方のための多数の製剤がこれまでに開発されており、本発明の実施において使用することができる。ｒＡＡＶは、投与および取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。したがって、別の態様では、本出願は、ＡＡＶｒｈ７４由来のカプシドを含むｒＡＡＶと、緩衝剤と、イオン強度剤と、界面活性剤と、を含む製剤に関する。一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの濃度にある。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇの濃度にある。別の実施形態では、ｒＡＡＶは、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、および／または約２×１０^１４ｖｇ／ｋｇの濃度にある。一実施形態では、投薬量は、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づく。一実施形態では、ｒＡＡＶは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡベクターである。一実施形態では、緩衝剤は、トリス、トリシン、ビス－トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳ、ＰＩＰＥＳ、およびＣＡＰＳのうちの１つ以上を含む。別の実施形態では、緩衝剤は、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度でｐＨ８．０のトリスを含む。一実施形態では、緩衝剤は、約２０ｍＭでｐＨ８．０のトリスを含む。一実施形態では、イオン強度剤は、塩化カリウム（ＫＣｌ）、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム（ＮＨ_４Ｃｌ）、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン（ＭｎＣｌ_２）、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、および酢酸リチウムのうちの１つ以上を含む。一実施形態では、イオン強度剤は、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度でＭｇＣｌ_２を含む。別の実施形態では、イオン強度剤は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。別の実施形態では、イオン強度剤は、約０．２ｍＭ～約４ｍＭの濃度でＭｇＣｌ_２を含み、約５０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。別の実施形態では、イオン強度剤は、約１ｍＭの濃度でＭｇＣｌ_２を含み、約２００ｍＭの濃度でＮａＣｌを含む。一実施形態では、界面活性剤は、スルホネート、サルフェート、ホスホネート、ホスフェート、ポロキサマー、およびカチオン性界面活性剤のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３８、およびポロキサマー４０７のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、界面活性剤は、約０．００００１％～約１％の濃度でポロキサマーを含む。別の実施形態では、界面活性剤は、約０．００１％の濃度でポロキサマー１８８を含む。筋肉内注射を目的として、ゴマ油や落花生油などのアジュバント溶液、または水性プロピレングリコール溶液、および滅菌水溶液を使用することができる。そのような水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水またはグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製することができる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。通常の保存状態および使用下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術により容易に入手可能である。

【0158】

注射用途に適した薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。あらゆる場合において、この形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジ注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。

【0159】

滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。

【0160】

ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで行うこともできる。一実施形態では、所望の標的筋肉細胞を対象から取り出し、ｒＡＡＶで形質導入し、対象に再導入する。代替的に、同系または異種の筋肉細胞は、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合に使用され得る。

【0161】

対象への形質導入および形質導入細胞の再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地でｒＡＡＶを筋肉細胞と組み合わせ、サザンブロットおよび／またはＰＣＲなどの従来の技術を使用して、または選択可能なマーカーを使用して目的のＤＮＡを持つ細胞をスクリーニングすることにより、インビトロで形質導入することができる。次に、形質導入された細胞を医薬組成物に製剤化し、組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、および腹腔内注射による、または例えばカテーテルを使用して平滑筋および心筋への注射によるなど、様々な技術により対象に導入することができる。

【0162】

本発明のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、α－サルコグリカンの持続発現をもたらす。したがって、本発明は、アルファ－サルコグリカンを発現するｒＡＡＶを哺乳動物の対象、好ましくはヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法は、本発明の１つ以上のｒＡＡＶでの形質導入組織（筋肉等の組織、肝臓および脳等の臓器、ならびに唾液腺等の腺を含むが、これらに限定されない）を含む。形質導入は、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットで行われ得る。例えば、本発明の一実施形態は、筋特異的制御要素によって指示される筋細胞および筋肉組織を形質導入する方法を提供し、これには、限定されないが、アクチンおよびミオシン遺伝子ファミリー、例えばｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するもの［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照されたい］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格筋アクチン遺伝子に由来する制御要素［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：４０８９－４０９９（１９８７）］、心筋アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列要素［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照されたい］、ならびにマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子、および遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素、低酸素誘発性核内因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５６８０－５６８４（１９９１））、グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含む、ステロイド誘発性要素およびプロモーター（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照されたい）、ならびに他の制御要素が含まれる。

【0163】

筋肉組織は生命維持に必須な臓器ではなく、アクセスしやすいため、インビボＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本発明は、形質導入筋原線維由来のｍｉＲＮＡの持続発現を企図する。

【0164】

「筋肉細胞」または「筋肉組織」とは、あらゆる種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、または心臓組織に由来する骨格筋および平滑筋）に由来する細胞または細胞群を意味する。そのような筋肉細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、および心筋芽細胞など、分化または未分化であり得る。

【0165】

「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるアルファ－サルコグリカンの発現をもたらす、記載される複製欠損ｒＡＡＶを介するインビボまたはインビトロのいずれかでのレシピエント細胞への目的のポリヌクレオチド（例えば、α－サルコグリカンをコードするポリヌクレオチド配列）の投与／送達を指すために使用される。

【0166】

したがって、本明細書では、有効用量（または本質的に同時に投与される用量もしくはある間隔で与えられる用量）の、アルファ－サルコグリカンをコードするｒＡＡＶを、それを必要とする哺乳動物の対象に投与する方法も記載される。

【0167】

本明細書で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本出願が、本明細書中のいかなる定義も含み、優先される。記載された数値範囲には、各範囲内の各整数値が含まれ、記述される最小および最大の整数が含まれる。

【0168】

本発明は、以下の実施例においてさらに説明され、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0169】

ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＣＧＡを使用した前臨床試験は、国際特許公開第ＷＯ２０１３／０７８３１６号、ならびに米国特許第９，４３４，９２８号および同第１０，１０５，４５３号に記載されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0170】

実施例１
材料および方法
動物モデル
すべての手順は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。ノックアウト（ｓｇｃａ^－／－）マウスは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌのＡｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｒｅにおいて標準条件下でホモ接合型動物として繁殖させ、維持した。マウスを、１２：１２時間の暗所：明所サイクルで、Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ（３．８％食物線維、１８．８％タンパク質、５％脂肪飼料）で維持した。すべての動物を、標準的なマウスケージに入れ、自由に摂食摂水させた。

【0171】

遺伝子型
ＤＮＡジェノタイピングを使用して、ｓｇｃａ^－／－マウスを特定した。テールクリッピングからのＤＮＡを単離し、ＯｎｅＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって分析した。一連のプライマーをＰＣＲ分析で使用して、α－ＳＧノックアウト状態を決定した。以下のプライマーおよび条件を使用した：Ｉｎｔｒｏｎ１（ＣＡＧＧＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＴＧ；配列番号９）、変異体プライマー－イントロン３（ＣＣＣＡＧＧＧＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＴ；配列番号１０）、およびＮＥＯＴＲ（ＧＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＴＡＧＣＧＴＴＧＧＣＴＡ；配列番号１１）。以下の条件下で、ゲノムＤＮＡに対して３０サイクルの反応を行った：９４℃で５分、９４℃で１分、６４℃で１分、７２℃で２．５分、７２℃で７分。

【0172】

α－ＳＧ遺伝子構築物
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ導入遺伝子カセットは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターＤＮＡプラスミドｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ａＳＧ－ｎｅｏを使用して、コドン最適化ヒトα－ＳＧｃ ＤＮＡ配列（ヒトｃＤＮＡ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ０８８９５）を駆動するｔＭＣＫ発現カセットを自己相補的ベクターバックボーンｐＨｐａ７に挿入することによって作製した。このベクターに含まれる唯一のウイルス配列は、ウイルスＤＮＡの複製とｒＡＡＶベクターゲノムのパッケージングの両方に必要なＡＡＶ２の逆位末端反復である。逆位末端反復（ＩＴＲ）のうちの１つは、このＩＴＲからの複製を制限するための末端分解部位（ＴＲＳ）の標的欠失を有し、自己相補的ベクターパッケージング用の二量体複製型の生成を促進する。ＡＡＶｒｈ７４ウイルスは、マウス、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、およびヒトにおいて、血管関門を越えて筋肉に形質導入するのに安全かつ非常に効率的であることが証明されている。

【0173】

ベクター産生
組換えＡＡＶ、（ｓｃ）ｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡは、トリプルトランスフェクションによって作製した。ｑＰＣＲベースの滴定法を使用して、Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｆａｓｔ Ｔａｑｍａｎ検出器システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用してカプセル化されたｖｇ力価を決定した。構築物は、高レベルの発現を促進するためのキメライントロンを含む。キメライントロンは、ヒトβ－グロビン遺伝子の最初のイントロンと分岐点からの５’ドナー部位、および免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のリーダーと本体との間にあるイントロンからの３’スプライスアクセプター部位から成る。ｒＡＡＶは、合成ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルも含み、効率的な転写終結に使用される。発現カセットの概略図を以下の図１に示す。ベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に隣接し、ＡＡＶｒｈ７４ビリオンにキャプシド形成されたヒトアルファ－サクログリカン（α－ＳＧ）遺伝子を使用して産生した。構築物は、ｔＭＣＫ前初期プロモーター／エンハンサー（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２１３９０）を含有し、高レベルの発現のためにβ－グロビンイントロンを使用する。

【0174】

遺伝子送達
全身送達は、ｓｇｃａ－／－マウスの尾静脈へのベクターの注射によって達成した。マウスに、３０ゲージの超微細インスリン注射器を使用して２００～２５０μＬの容量の乳酸リンガー溶液で希釈したｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの１×１０^１２ｖｇ、３×１０^１２ｖｇ、または６×１０^１２ｖｇの総投与量（１３～２０ｇの範囲のマウス、それぞれ２０ｇのマウスに基づいて、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づく投薬量、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、および２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）を注射した。すべての処置されたマウスは、４～５週齢で注射し、注射の１２週後に安楽死させた。別の実施形態では、用量は、定量標準としての線形化されたＤＮＡまたはプラスミドに基づいて、約１．８５×１０^１３ｖｇ／ｋｇまたは７．４１×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。

【0175】

血清クレアチンキナーゼ測定
クレアチンキナーゼのレベルは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６）、ビヒクル（乳酸リンガー溶液）で処置されたｓｇｃａ^－／－マウス（ｎ＝６）、およびｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡで処置されたｓｇｃａ^－／－マウス（ｎ＝１回の用量当たり６）の血清において、クレアチンキナーゼＳＬアッセイおよび対応する製造業者のプロトコル（Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｔｏｗｎ，ＰＥ，Ｃａｎａｄａ）（カタログ番号３２６－１０）を使用して測定した。簡単に説明すると、２５μＬの血清を１ｍＬの作業試薬と混合し、キュベットに加えた。分光光度計に速度論的アッセイを設定して、３４０ｎｍでの吸光度を３０秒ごとに１８０秒間測定した。クレアチンキナーゼレベルを吸光度の読み取り値および以下にリストされる式を使用して計算した。
Ｕ／Ｌ＝［ΔＡｂｓ．／分）＊１．０２５＊１０００］／［１＊６．２２＊０．０２５］＝（ΔＡｂｓ．／分）＊６５９２

【0176】

機能評価のための横隔膜強縮
マウスを安楽死させ、横隔膜（ＤＩＡ）を肋骨アタッチメントと中央腱を無傷で切開し、Ｋ－Ｈバッファーに入れた。ＤＩＡの２～４ｍｍ幅の切片を単離した。ＤＩＡ条片を腱中心で編組外科用絹糸（６／０、Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ、Ｒｅａｄｉｎｇ，ＰＡ）を用いてしっかり結び、条片の遠位端に取り付けられた肋骨の一部分を通して縫合した。各筋肉を、３７℃で維持した酸素化Ｋ－Ｈ溶液を充填した水浴に移した。筋肉を水平に整列させ、固定ピンとデュアルモード力変換器サーボモーター（３０５Ｃ、Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｕｒｏｒａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）との間で直接結んだ。２つの白金板電極を、筋肉の長さに隣接するように器官浴に位置付けた。筋肉を痙攣収縮の測定のために最適な長さに伸長させ、その後、１０分間静置させた後に、強縮プロトコルを開始した。筋肉が安定した時点で、筋肉を１ｇの最適な長さに設定し、３０秒毎に３回の１Ｈｚ攣縮、続いて、１分毎に３回の１５０Ｈｚ攣縮からなるウォームアップに供する。３分間の休止期間後、ＤＩＡを、各刺激間に２分間の休止期間を設けて、２０、５０、８０、１２０、１５０、１８０Ｈｚで各々２５０ミリ秒間刺激して、最大強縮力を決定した。筋肉の長さおよび重量を測定した。力を、筋肉の重量および長さに対して正規化した。

【0177】

機能評価のための前脛骨筋（ＴＡ）強縮
ＴＡ評価手順は、Ｈａｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ；７０９：７５－８９（２０１１）にリストされるプロトコルに従った。ケタミン／キシラジン混合物（それぞれ１００ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）を使用して腹腔内を介してマウスを麻酔した。解剖スコープの下で、後肢の皮膚を取り除き、ＴＡ筋肉および膝蓋骨を露出させた。膝蓋腱の周りに４－０の縫合糸で二重正方形を結んだ。次に、ＴＡ遠位腱を切開し、二重正方形を腱の周りに４－０縫合糸で可能な限り筋肉に近づけて結び、次に腱を切断した。露出した筋肉は常に生理食塩水で湿らせた。次いで、マウスを熱制御プラットフォームに移し、３７℃に維持した。膝は膝蓋腱縫合で金属ピンに固定し、遠位ＴＡ腱縫合で力変換器（Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｕｒｏｒａ，Ｃａｎａｄａ）のレベルアームに固定した。坐骨神経を刺激するために、電極を坐骨神経の近くに配置した。筋肉が安定したら、安静時の張力を、痙攣収縮が最大になる長さ（最適な長さ）に設定した。３分間の休止期間の後、ＴＡを、各刺激間に１分間の休止期間を設けて、５０、１００、１５０、および２００Ｈｚで刺激した。５分間の休息の後、筋肉を、１０％の伸長再延長手順により１分間隔で生じる、一連の１０回の等尺性収縮に供した。遠心性収縮後、マウスを安楽死させ、ＴＡ筋肉を切開し、秤量し、分析のために凍結させた。

【0178】

免疫蛍光
ＴＡ、腓腹筋（ＧＡＳ）、大腿四頭筋（ＱＤ）、大腰筋（ＰＳＯＡＳ）、臀筋（ＧＬＵＴ）、上腕三頭筋（ＴＲＩ）、ＤＩＡ、および心臓（ＨＲＴ）の筋肉の凍結切片（厚さ１２μｍ）をｈＳＧＣＡ導入遺伝子のために免疫蛍光染色に供した。切片を、１：１００の希釈でウサギモノクローナルα－ＳＧ一次抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ、カタログ番号ａｂ１８９２５４）とインキュベートした。Ｚｅｉｓｓ（ドイツ）ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲＣ５カメラを使用して、筋肉切片の４つの異なる象限をカバーする４つのランダムな２０倍画像を撮影した。対照と比較したα－ＳＧ染色に対する陽性線維の割合を各画像について決定し、各筋肉について平均した。陽性のα－ＳＧ線維発現は、ビヒクルで処置されたｓｇｃａ－／－対照よりも少なくとも３０％線維染色が明るいと定義された。

【0179】

ウエスタンブロット分析
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ビヒクルで処置されたｓｇｃａ－／－マウス、およびベクターを投与されたｓｇｃａ－／－マウスからの試料を、各ウエスタンブロットに使用した。ｈＳＧＣＡブロットには、ウサギモノクローナルα－ＳＧ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８９２５４）の１：１０，０００希釈液とマウスモノクローナルα－アクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ７８１１）の１：５，０００希釈液を使用した。ウサギモノクローナルマウスビンキュリン抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号７００６２）の１：１，０００希釈液も使用した。抗マウス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＡＰ３０８Ｐ）および抗ウサギ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号６５６１２０）の二次西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体を使用して、化学発光免疫検出を強化した。ウエスタンブロットの定量化は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬ １Ｄ ８．１．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したデンシトメトリーによって行った。

【0180】

形態計測分析
ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、１６～１７週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６）、ビヒクルで処置されたｓｇｃａ－／－マウス（ｎ＝６）、およびｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの１６～１７週齢の処置されたｓｇｃａ－／－マウス（ｎ＝１回の用量当たり６）からの厚さ１２μｍの筋肉の凍結切片で分析のために行った。ＴＡ、ＧＡＳ、ＱＤ、ＧＬＵＴ、ＰＳＯＡＳ、およびＴＲＩ筋において、中心核を有する筋線維の割合を決定した。さらに、ＴＡ、ＧＡＳ、ＱＤ、ＴＲＩ、およびＰＳＯＡＳ筋において、筋線維直径を測定した。各動物の筋肉当たり４つのランダム２０倍画像をＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＭＲＣ５カメラで撮影した。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ’ｓ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて中心核形成線維を定量化し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ ＬＥ４ソフトウェアを用いて線維直径を測定した。

【0181】

生体分布の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析
Ｔａｑｍａｎ定量的ＰＣＲを行って、前述のように、標的および非標的の対側筋、ならびに非標的器官に存在するベクターゲノムコピーの数を定量化した。ベクター特異的プライマープローブセットを使用して、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ導入遺伝子カセット内に位置するユニークなｔＭＣＫプロモーターのすぐ下流のイントロン領域の配列を増幅した。この研究では、以下のプライマーおよびプローブを使用した：ｔＭＣＫイントロンフォワードプライマー５’－ＡＣＣ ＣＧＡ ＧＡＴ ＧＣＣ ＴＧＧ ＴＴＡ ＴＡＡ ＴＴ－３’、ｔＭＣＫイントロンリバースプライマー５’－ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＡＣ ＡＧＡ ＧＣＣ ＴＡＡ ＧＡＣ－３’、およびｔＭＣＫイントロンプローブ５’－ＦＡＭ－ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＣＴ ＧＡＧ ＣＣＴ ＧＡＧ ＣＧＧ ＴＴＡ Ｃ－ ＩＡＢｋＦＱ－３’（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。コピー数は、ゲノムＤＮＡの１マイクログラム当たりのベクターゲノムとして報告される。

【0182】

ピクロシリウスレッド染色およびコラーゲン定量化
筋肉組織におけるコラーゲン沈着のレベルを決定するために、ピクロシリウスレッド染色を行った。染色は、１６～１７週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６（ｎ＝６）、ビヒクルで処置されたｓｇｃａ－／－（ｎ＝６）、およびｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの１６～１７週齢の処置されたｓｇｃａ－／－マウス（ｎ＝１回の用量当たり６）のＧＬＵＴ、ＰＳＯＡＳ、ＴＲＩ、およびＤＩＡ筋からの厚さ１２μｍの凍結切片で行った。各マウスの筋肉当たり４つの２０倍画像を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアプログラムを使用してコラーゲン沈着量を測定した。各筋肉の平均コラーゲンパーセントを、すべての群について計算した。

【0183】

オープンフィールドケージ活動のレーザー監視
オープンフィールド活動チャンバを使用して、実験マウスの全体的な活動を決定した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６（ｎ＝６）および未処置のｓｇｃａ^－／－（ｎ＝６）対照群からの１６～１７週齢のマウスを、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの１６～１７週齢の処置されたｓｇｃａ^－／－マウス（ｎ＝１回の用量当たり６）とともに分析に供した。すべてのマウスを、マウスが最も活動的である早朝からその夜の終わり間近のサイクルで、毎日同じ時間に試験した。全てのマウスを、毎回薄暗い光下で、かつ同じ飼育係により、隔離室で試験した。また、不安を軽減し、マウスの通常の行動、ひいてはアッセイの結果に影響を与える可能性があり得る可変的行動を最小限に抑えるために、個別に収容されていなかったマウスを試験した。マウスの行動を、Ｐｈｏｔｏｂｅａｍ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して監視した。このシステムは、動物チャンバの前後かつ左右を横断する不可視赤外光線のグリッドを使用して、ｘ－ｙ－ｚ平面内のマウスの位置および動きを監視する。活動を、５分間間隔の１時間サイクルで記録した。マウスを、データ取得開始の数日前に１時間セッションで活動試験室に順応させた。マウスを、４匹１組で、個別のチャンバ内で試験した。試験機器を使用毎に掃除して、結果を変化させ得るマウスの反動的な可変的行動を低減した。データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌワークシートに変換し、すべての計算をＥｘｃｅｌプログラム内で行った。各マウスのｘ平面およびｙ平面における動きの個々の光線中断を加算して、合計歩行を表し、ｚ平面における光線中断を加算して、１時間間隔内での垂直活動を得た。

【0184】

安全性試験
血液学
全血は、血液化学のために心臓穿刺から回収した。血液を血清分離チューブに収集し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清を収集し、凍結し、化学試験のためにＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに送った。血液学分析では、肝酵素およびブドウ糖化学を優先した。

【0185】

組織病理学
剖検では、筋肉は、液体窒素で冷却されたメチルブタンで新鮮に凍結し、他のすべての臓器は、採取し、ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。処理後、組織をＨ＆Ｅで染色し、スライドおよびすべての組織は、獣医病理学者による正式なレビューのためにＧＥＭＰａｔｈ，Ｉｎｃに送った。

【0186】

統計解析
データは、平均±ＳＥＭ（エラーバー）として表し、特に指定がない限り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を使用したテューキーの事後分析試験によって評価された群間の多重比較による一元配置分散分析を使用して分析した。

【0187】

実施例２
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの全身送達の効率
小規模パイロット研究を開始して、１×１０^１２ｖｇの用量（２０ｇのマウスに基づいて５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、ｎ＝４）でｓｇｃａ^－／－マウスの外側尾静脈への静脈内注射による遺伝子送達の有効性を観察した。免疫蛍光分析は、遺伝子移入の４週間後に採取された筋肉で行った。７つの異なる肢骨格筋におけるｈＳＧＣＡ導入遺伝子発現の量：ＴＡ、ＧＡＳ、ＧＬＵＴ、ＱＤ、ＰＳＯＡＳ、およびＴＲＩ、およびＤＩＡ。α－ＳＧを欠損したマウスは、蛍光抗体法で分析した場合、タンパク質が完全に欠如していることを示した（図２Ａ；ＴＡ、ＧＡＳ、ＴＲＩ、およびＤＩＡの代表的な画像）。１×１０^１２ｖｇの総用量の治療用量は、遺伝子送達の４週間後のＤＩＡを含むすべての骨格筋にわたる平均５４±２３．８１％のベクター伝達をもたらした。

【0188】

ｓｇｃａ^－／－マウスに全身的に送達されたｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの用量漸増試験
最も安全で最も効果的な用量を決定するために、３つの別々の用量のベクターの送達を用量漸増試験で研究し、４週齢のｓｇｃａ^－／－マウスの外側尾静脈をｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの１×１０^１２ｖｇ（５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）の総用量、３×１０^１２ｖｇの総用量（１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）、または６×１０^１２ｖｇの総用量（２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）で処置した。免疫蛍光抗体法を使用して、ＴＡ、ＧＡＳ、ＱＤ、ＧＬＵＴ、ＰＳＯＡＳ、ＴＲＩ、ＤＩＡ、およびＨＲＴ筋におけるｈＳＧＣＡ導入遺伝子の発現を評価するために、遺伝子送達の１２週間後にマウスを安楽死させた。最低用量の１×１０^１２ｖｇの総用量（５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）で処置されたマウスにおける平均ｈＳＧＣＡ発現は、ＤＩＡを含む骨格筋において７０．０７±３．７１％の全体的な発現であった。３×１０^１２ｖｇの総用量（１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）の中間用量で処置されたマウスの平均ｈＳＧＣＡ発現は、すべての骨格筋において８５．３５±２．３６％であった。最高用量の６×１０^１２ｖｇの総用量（２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）で処置されたマウスの平均ｈＳＧＣＡ発現は、すべての骨格筋において９３．８６±２．０２％であった。明確にするために、用量は、定量標準としての超らせんＤＮＡまたはプラスミドに基づいて計算した。ＨＲＴ筋におけるｈＳＧＣＡの発現は、用量に依存せず７５％のままであった。組織の代表的な画像を図２Ａに示す。強力なｈＳＧＣＡ発現は、３つの用量すべてで遺伝子送達の有効性を示す。遺伝子送達は、前肢と後肢の両方の複数の筋肉を標的とし、３つの用量すべてでマウスにおける例外的なα－ＳＧ発現を示した。最も重要なことは、横隔膜の重要な筋肉も送達後にα－ＳＧ遺伝子の発現を示したことである。図２Ｂに示されるウエスタンブロットにより、処置されたマウスの３つすべての投薬コホートのすべての筋肉におけるタンパク質発現が確認される。マウスの心筋も処置後にα－ＳＧ発現を示した。

【0189】

α－ＳＧタンパク質を欠くヒトとマウスの両方の組織病理学的特徴には、中心核形成、線維サイズ分布の不規則性、壊死、および線維症が含まれる。Ｈ＆Ｅ染色を使用して、線維サイズおよび中心核形成を含む筋肉の形態を視覚化した（図３）。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、野生型対照で観察されたものと同様の線維サイズ分布の正規化が、ビヒクルで処置されたｓｇｃａ^－／－対照と比較して、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡで処置されたｓｇｃａ^－／－マウスのＴＡ、ＱＤ、およびＴＲＩで観察された。線維の平均直径サイズは、ビヒクルで処置されたｓｇｃａ－／－対照マウスと比較して、ＴＡ、ＱＤ、およびＴＲＩ筋肉のすべての用量で有意に増加した（表１）。

【表1】

【0190】

ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡで処置されたｓｇｃａ^－／－マウスでは、中心核形成の減少も観察された。ビヒクルで処置されたｓｇｃａ^－／－マウスの骨格筋は、６８．７２±３．０１％の中心に位置する核を有する線維を有した。ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡによる処置後、すべての筋肉組織にわたる中心核形成の全体的な値は、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの最低用量で減少し、中心に位置する核を示す骨格筋線維の５５．６０±３．２５％をもたらした（表２）。

【表2】

【0191】

中間用量で処置されたマウスは、中心核を有する筋線維の６１．８５±４．００％を有したが、最高用量で処置された筋線維の核形成は、３７．９３±１２．４６％に減少した（図３Ｃ）。

【0192】

組織がコラーゲンによって克服される線維症は、ＬＧＭＤ患者の筋肉でしばしば発生し、瘢痕組織の形成につながる。線維症は、線維症のマーカーとして、コラーゲンＩおよびＩＩＩの含有量を検出するためのピクロシリウスレッド染色を使用して評価した。図４に示されるように、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡによる処置後、ｓｇｃａ－／－マウスにおいて赤色染色の強い減少が観察された。定量化により、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡで処置されたｓｇｃａ－／－マウスにおいて、ビヒクルで処置されたｓｇｃａ^－／－対照マウスと比較して、すべての筋肉にわたるコラーゲン含有量が著しく減少していることが明らかになった（図４Ｂ）。一緒に、これらのデータは、筋肉組織での強力な発現およびｓｇｃａ^－／－マウスにおけるα－ＳＧタンパク質の欠如に関連する組織病理学的特質の改善によって示されるように、ｈＳＧＣＡ導入遺伝子の全身送達の成功を実証する。

【0193】

実施例３
ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡ ｒＡＡＶは、横隔膜および前脛骨筋の機能を改善し、運動能力を高める
近位筋の衰弱および機能喪失は、ＬＧＭＤ２Ｄの主要な症状であり、呼吸不全は、ＬＧＭＤ２Ｄの主な死因であるため、ＴＡおよびＤＩＡの機能および強度を改善することは、ＬＧＭＤ２Ｄを有する対照の生活の長さおよび質を高めるために不可欠である。ＤＩＡの条片およびＴＡ筋肉の全体を使用して、ｈＳＧＣＡの発現と筋力との相関関係を確認した。図５Ａおよび５Ｂに示されるように、野生型マウスと比較して、ｓｇｃａ^－／－未処置のマウスのＴＡおよびＤＩＡ筋肉の比力において、比力および収縮誘発性損傷に対する抵抗性の欠損が認識された。

【0194】

ｓｇｃａ^－／－マウスのＴＡ筋は、野生型マウスと比較して、比力出力の減少において４４％の著しい機能障害（それぞれ１６１．６±８．２０ｍＮ／ｍｍ^２対２９１．７±６．１７ｍＮ／ｍｍ^２；ｐ＜０．０００１）、ならびに厳密な偏心収縮プロトコルに従って産生された力からのより大きな力の喪失（ｓｇｃａ^－／－マウスにおいて４４．０±６．０％の喪失、野生型マウスにおいて１８．０±１．０％の喪失；ｐ＜０．０００１）を呈した（図５Ａ）。尾静脈送達の１２週間後、出願者は、比力出力において、低、中間、高用量のｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡによる処置後の劇的な改善に気づき、これは、それぞれ２１８±１１．９４ｍＮ／ｍｍ^２、２２７±１１．７ｍＮ／ｍｍ^２、および２５５±１１．７ｍＮ／ｍｍ^２に増加した。偏心収縮プロトコル後の損傷に対する抵抗性も、ビヒクルで処置されたｓｇｃａ^－／－マウスと比較して改善し、低用量、中間用量、および高用量で処置されたマウスは、ビヒクルで処置されたｓｇｃａ^－／－マウスと比較して、それぞれ２２．０±４．０％、２２．０±３．０％、および１２．０±１．０％（ｐ＜０．０００１）のみ喪失した（図５Ａ）。

【0195】

ビヒクルで処置されたｓｇｃａ^－／－マウスのＤＩＡでは、生成された比力は、野生型マウスと比較して、強度において４１％の減少を示した（１３１．５±１２．０７ｍＮ／ｍｍ^２対２２３．８±１５．８５ｍＮ／ｍｍ^２）。３回の投与すべてで、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡによる処置後に力の改善が観察され、低用量のマウスにおけるＤＩＡの比力は、１７９．２±２１．０３ｍＮ／ｍｍ^２に増加し、中間用量のマウスでは２０１．２±２２．９４ｍＮ／ｍｍ^２に増加し、高用量のマウスでは、２６１．４６±９．７３ｍＮ／ｍｍ^２に増加した（図６５Ｂ）。これらのデータは、ｓｇｃａ^－／－マウスのＴＡおよびＤＩＡ筋は、力の欠損を有し、野生型マウスよりも消耗が速いことを示す。しかしながら、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの送達後、機能回復が達成された。

【0196】

ＬＧＭＤ２Ｄの追加の症状には、おそらく筋肉の損傷による運動不耐性ならびに活動および歩行の低下があり、痛みおよび筋肉の疲労を引き起こす。身体活動のレベルを評価するために、ｓｇｃａ^－／－および野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、以前の報告で使用されたものと同様のオープンフィールド活動プロトコルに供した。マウスの歩行関連活動を監視して、ｓｇｃａ^－／－マウスにおけるα－ＳＧの欠如が、野生型マウスと比較して、歩行の減少をもたらすかどうかを決定した。図５Ｃのグラフは、野生型対照と比較したｓｇｃａ^－／－マウスモデルにおける歩行および垂直立ちの減少を示す。ｓｇｃａ^－／－マウスで記録された平均水平歩行光線中断は、２０００±１５９光線中断／時間であり、野生型対照の８９１１±１１９３光線中断／時間と比較して、歩行が７７．５％減少した。ｓｇｃａ^－／－マウスで記録された平均垂直立ち光線中断は、２４．７５±１１．４７光線中断／時間であり、野生型マウスの８０３．３±５５．０３光線中断／時間と比較して、垂直立ちが９７％減少した。ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡによる処置後、マウスの歩行および垂直立ち活動は、遺伝子送達の１２週間後に増加した。平均水平歩行は、１×１０^１２の総用量で処置されたマウスで３５９５±５５．０３光線中断／時間、３×１０^１２ｖｇの総用量で処置されたマウスで５２３８±８６１．９光線中断／時間、６×１０^１２ｖｇの総投与量で処置されたマウスで６４８７±４６７．９光線中断／時間に増加した。平均垂直立ち活動は、１×１０^１２の総用量で処置されたマウスで３７７±１４６．１光線中断／時間、３×１０^１２ｖｇの総用量で処置されたマウスで３２１±１２６．１光線中断／時間、６×１０^１２ｖｇの総用量で処置されたマウスで４４８．８±５３．４３光線中断／時間に増加した（図５Ｃ）。処置されたマウスの身体活動は、ビヒクルで処置されたｓｇｃａ^－／－マウスと比較して、歩行において４４％～６９％および垂直立ちにおいて９２％～９４％の改善を示した。さらに、血清クレアチンキナーゼレベルは、未処置のマウスと比較して、すべての処置群で有意に減少した（図５Ｄ）。一緒に、これらのデータは、α－ＳＧの送達が身体活動を回復させ、ｓｇｃａ^－／－マウスの筋肉の破壊から保護することを示す。

【0197】

ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの安全性および生体分布分析
安全対策として、血液化学および血液学の研究を、ベクターを投与されたｓｇｃａ^－／－および野生型マウスで行った。すべての値は、マウスの通常の基準範囲内であった（図６）。さらに、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを投与されたｓｇｃａ^－／－および野生型マウスからのＨ＆Ｅで染色されたすべての筋肉および臓器の組織切片を正式なレビューのために獣医病理学者に送った。ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを投与されたｓｇｃａ^－／－および野生型マウスのうちのいずれからの試料にも有害作用は認められなかった。有効性に加えて、これらのデータは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの３つの用量すべての全身送達が、忍容性が高く、安全で、ｓｇｃａ^－／－および野生型マウスに対して無毒であることを実証した。

【0198】

ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの送達による潜在的な毒性または安全性に対する懸念を試験するために、ベクター生体分布定量ＰＣＲを行って、ベクターゲノムの存在を定量化した（図７Ａ）。ベクター特異的ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡプライマープローブセットを使用して、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ／ｈＳＧＣＡを投与されたｓｇｃａ^－／－マウスから試験されたすべての筋肉および臓器のベクターゲノムを検出した。予想通り、ベクターゲノムは、試験した組織に存在し、肝臓で最も高いコピー数を示し、次に筋肉であった。ビヒクル（ｓｇｃａ^－／－ＬＲ）またはｓｃＡＡｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡのいずれかで処置されたＷＴおよびｓｇｃａ－／－マウスの肝臓におけるアルファ－サルコグリカンタンパク質のウエスタンブロットを図７Ｂに示す。

【0199】

α－ＳＧ発現の効率を改善するために、一実施形態では、ｈＳＧＣＡ ｃＤＮＡ配列を自己相補的ベクターにパッケージ化する。自己相補的ＡＡＶベクターには、ｄｓＤＮＡの形成を促進する逆位反復ゲノムが含有されるため、これらのプロセスを促進するために複数のベクターゲノムを必要とせずに複製および転写を可能にする。このように、自己相補的ベクターの使用は、導入遺伝子のより迅速な発現を可能にする律速段階を排除する。出願者は、ＬＧＭＤ２Ｄ患者におけるｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの血管内送達が、１×１０^１２および３×１０^１２の用量での遺伝子移入の１８０日後のα－ＳＧ発現の増加と関連していることを示している。

【0200】

ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの静脈内送達は、ビヒクルで処置された対照と比較して、３つのベクターで処置されたコホートすべてにおいて、強度、ならびに前脛骨筋および横隔膜筋の収縮誘発性損傷に対すると抵抗性の増加を筋肉に提供する。加えて、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡによる処置は、ＣＫの有意な減少をもたらした。さらに、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡで処置した後、マウスは、ビヒクルで処置されたマウスよりも頻繁に歩行し、後肢で立つことができた。

【0201】

中心に位置する核、線維サイズの広い変動、炎症、壊死、および線維症を含む顕著な組織病理学は、典型的には、ＬＧＭＤ２Ｄ患者の筋生検を通して観察される。ｈＳＧＣＡ送達後、マウスは、ＣＮの減少、筋線維サイズのより均一な分布、およびコラーゲン含有量の減少を有し、筋肉は、ビヒクルで処置されたマウスと比較して、全体的に健康な外観を有した。組織病理学および瘢痕組織の全体的な減少は、ベクターで処置されたマウスの筋肉の全体的な正常な機能および生理学の改善と付随して関連していた。

【0202】

最後に、定量ＰＣＲ、血清化学分析、および組織病理学を通じて実施された安全性研究では、毒性の兆候は確認されなかった。ｔＭＣＫプロモーターは、標的組織（すべて筋肉）でのみ検出され、肝臓を除く他の（非筋肉）臓器には存在しなかった。肝臓でのｔＭＣＫの検出は、それが、クリアランス器官であるため、珍しいことでも懸念事項でもない。認定獣医病理学者によるすべての組織（肝臓を含む）の組織病理学的レビューは、ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの全身送達がすべての組織で安全であるということだけでなく、遺伝子送達がビヒクルで処置されたｓｇｃａ^－／－マウスの骨格筋に見られるジストロフィー病理の量を劇的に減少させると結論付けた。ベクターで処置されたマウスの血液試料で行った化学も、毒性の欠如を裏付ける。

【0203】

本開示のように、用量漸増試験は、ここで全身的に試験された最低用量、すなわち合計１×１０^１２ｖｇ（５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）が、α－ＳＧタンパク質の喪失に関連する徴候および症状を減少させるのに十分であることを裏付ける前臨床データを提供する。試験された最低用量で、強度および運動行動（歩行および後ろ脚で立つこと）の増加によって実証されるように、すべての筋肉の機能的改善が、ベクターで処置されたマウスで観察された。安全性試験では、合計６×１０^１２ｖｇ（２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）の最高送達用量でも、毒性の兆候は見られない。

【0204】

実施例４
高齢患者および持続性
ｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを介する遺伝子置換は、ＬＧＭＤ－２Ｄおよび他の関連疾患の治療において肯定的な結果を示している。この研究は、ｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡが、より重大な影響を受けた古い筋肉を治療する能力を試験し、ＡＡＶウイルスベクターの長期間持続性を決定するように設計された。

【0205】

すべての手順は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる承認に従って実施した。マウスを標準化された条件下で１２：１２時間の明暗サイクルで維持し、餌および水を自由に与えた。最初に、ｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを、３回の用量（１．０×１０^１２、３．０×１０^１２、および６．０×１０^１２ｖｇ）で重度の筋肉組織病理を呈する１２ヶ月齢のｓｇｃａ^－／－マウス（ｎ＝５）に尾静脈注射によって全身投与した。対照には、乳酸リンガー溶液（ＬＲＳ）を注射されたｓｇｃａ^－／－マウス（ｎ＝５）およびＬＲＳを注射されたＢＬ６野生型マウス（ｎ＝４）が含まれた。処置後６ヶ月のエンドポイントで、処置されたマウスからの筋肉を、ＳＣＧＡタンパク質発現、組織学的救済、および機能改善について評価した。３つの用量すべてで、対照と比較して、筋鞘でのα－ＳＧの強力なタンパク質発現、組織病理の改善、自発運動および比力の生成の増加、偏心力の喪失に対する保護、ならびに血清ＣＫの減少が示された。ベクター毒性は、検出されなかった。老齢のマウスでは、処置により、分析された筋肉での広範囲にわたる高レベルのタンパク質発現、線維症の軽減、および前脛骨筋の収縮誘発性損傷に対する抵抗性の増加がもたらされた。

【0206】

特に、１２ヶ月齢のｓｇｃａ^－／－マウスにｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡをＩＶ投与すると、横隔膜および心臓を含む、下肢、上肢、および胴体近位部の筋肉全体に高レベルのタンパク質発現が広まった（図８）。

【0207】

ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの投与後、筋病変の全体的な改善（図９ａ）および中心核形成の減少が観察された。加えて、平均線維サイズは、投与後、腓腹筋（ＧＡＳ）および上腕三頭筋（ＴＲＩ）におけるＷＴの線維のレベルと同様のレベルに増加した（図９ｂ）。

【0208】

コラーゲン沈着のレベルは、線維症の尺度として定量化した。ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの投与は、未処置の対照と比較して、線維症のレベルの減少をもたらした（図９ｃ）。ｓｃＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡの投与後の機能改善は、前脛骨筋（ＴＡ）および横隔膜（ＤＩＡ）筋の力出力（比力）の改善、およびＴＡ筋における収縮誘発性損傷に対する抵抗性の増加によって証明された（図１０）。

【0209】

遺伝子治療の長期的な持続性をさらに調査するために、４週齢のｓｇｃａ^－／－マウスにｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＳＧＣＡを全身投与する。処置後２４ヶ月以上、ベクターゲノムのコピー数を、試験されたすべての形質導入された筋肉（ＴＡ、ＴＲＩ、ＤＩＡ、ＧＬＵＴ、ＰＳＯＡＳ、ＧＡＳ、およびＱＵＡＤ）にわたってｑＰＣＲにより検出する。タンパク質の発現および局在を、処置された筋肉の免疫蛍光染色によって研究する。

【0210】

本開示は特定の実施形態といった点で記載された一方、その変更および修正が生じることが当業者に理解されるだろう。したがって、特許請求の範囲内に見られるようなこのような制限のみが本開示に課せられるべきである。

【0211】

本出願で参照されるすべての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
配列番号１
ＳＧＣＡ ｃＤＮＡコドン最適化配列：
ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＡＣＡＣＴＧＴＴＣＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＧＡＧＡＴＡＣＣＧＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＣＡＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＧＧＴＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＡＴＧＡＧＡＣＡＴＴＴＣＴＧＡＧＴＣＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＧＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＴＡＴＣＡＣＴＴＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＧＡＴＣＡＣＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＴＴＣＣＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＣＧＣＴＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＣＧＡＡＧＴＧＡＣＡＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＧＣＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴＡＣＴＡＣＣＡＧＧＣＡＧＣＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＴＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＡＴＣＡＧＧＣＣＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＴＧＣＧＧＴＣＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＣＣＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＴＣＴＧＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＴＧＴＧＧＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＴＧＴＧＡＣＴＡＧＣＧＣＴＣＴＧＧＡＴＡＧＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＣＣＡＡＴＣＧＡＧＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＧＴＧＴＡＣＡＴＴＡＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧＣＧＣＴＴＣＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＡＧＴＣＡＣＧＣＴＡＧＧＴＧＣＧＣＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＡＴＴＴＴＣＧＣＧＴＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＴＡＡＡＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＡＣＧＡＡＧＴＧＣＣＡＡＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＡＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＴＧＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＧＣＴＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴＡＴＧＴＧＡＴＧＴＧＣＴＧＴＣＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＧＡＣＣＴＧＧＣＣＡＣＡＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＴＡＣＴＡＴＴＣＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＴＣＴＡＧＧＧＡＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＴＧＡＧＴＡＣＡＣＴＧＣＣＴＡＴＧＴＴＴＡＡＴＧＴＧＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＡＴＴＧＡ
配列番号２
ヒトＳＧＣＡタンパク質配列：
ＭＡＥＴＬＦＷＴＰＬＬＶＶＬＬＡＧＬＧＤＴＥＡＱＱＴＴＬＨＰＬＶＧＲＶＦＶＨＴＬＤＨＥＴＦＬＳＬＰＥＨＶＡＶＰＰＡＶＨＩＴＹＨＡＨＬＱＧＨＰＤＬＰＲＷＬＲＹＴＱＲＳＰＨＨＰＧＦＬＹＧＳＡＴＰＥＤＲＧＬＱＶＩＥＶＴＡＹＮＲＤＳＦＤＴＴＲＱＲＬＶＬＥＩＧＤＰＥＧＰＬＬＰＹＱＡＥＦＬＶＲＳＨＤＡＥＥＶＬＰＳＴＰＡＳＲＦＬＳＡＬＧＧＬＷＥＰＧＥＬＱＬＬＮＶＴＳＡＬＤＲＧＧＲＶＰＬＰＩＥＧＲＫＥＧＶＹＩＫＶＧＳＡＳＰＦＳＴＣＬＫＭＶＡＳＰＤＳＨＡＲＣＡＱＧＱＰＰＬＬＳＣＹＤＴＬＡＰＨＦＲＶＤＷＣＮＶＴＬＶＤＫＳＶＰＥＰＡＤＥＶＰＴＰＧＤＧＩＬＥＨＤＰＦＦＣＰＰＴＥＡＰＤＲＤＦＬＶＤＡＬＶＴＬＬＶＰＬＬＶＡＬＬＬＴＬＬＬＡＹＶＭＣＣＲＲＥＧＲＬＫＲＤＬＡＴＳＤＩＱＭＶＨＨＣＴＩＨＧＮＴＥＥＬＲＱＭＡＡＳＲＥＶＰＲＰＬＳＴＬＰＭＦＮＶＨＴＧＥＲＬＰＰＲＶＤＳＡＱＶＰＬＩＬＤＱＨ＊
配列番号３
ｔＭＣＫプロモーター配列：
ＣＣＡＣＴＡＣＧＧＧＴＣＴＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＧＴＴＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＧＧＧＴＣＴＴＡＧＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＧＧＧＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＧＴＴＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＧＧＧＴＣＴＴＡＧＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＡＣＴＡＣＧＧＧＴＣＴＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＧＴＴＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＧＧＧＴＣＴＴＡＧＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＡＧＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＧＧＣＴＣＣＴＣＴＡＴＡＴＡＡＣＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＧＧＧＴＣＡＣ
配列番号４
ＡＡＶｒｈ７４－ｔＭＣＫ－ＳＧＣＡ：

【化1-1】

【化1-2】

【化1-3】

配列番号５
５’ＩＴＲ

【化2】

配列番号６
３’ＩＴＲ

【化3】

配列番号７
ポリＡ
ＧＧＣＣＧＣＡＡＴ ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴ ＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴ ＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴ ＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴ ＴＧＴＧ
配列番号８

【化4-1】

【化4-2】

【化4-3】

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【配列表】

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