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▶ チアンスー ジェンサイエンス インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-02
(45)【発行日】2024-08-13
(54)【発明の名称】インスリン－Ｆｃ融合タンパク質及びその応用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240805BHJP
A61K 38/28 20060101ALI20240805BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20240805BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240805BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240805BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240805BHJP
C07K 14/62 20060101ALN20240805BHJP
C07K 16/18 20060101ALN20240805BHJP
C12N 9/50 20060101ALN20240805BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240805BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240805BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
A61K38/28
A61K47/65
A61P3/10
C12P21/02 E
C12P21/08
C07K14/62
C07K16/18
C12N9/50
C12N15/12
C12N15/13
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2023503514
(86)(22)【出願日】2021-07-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-09
(86)【国際出願番号】 CN2021107040
(87)【国際公開番号】W WO2022017309
(87)【国際公開日】2022-01-27
【審査請求日】2023-01-18
(31)【優先権主張番号】202010723972.9
(32)【優先日】2020-07-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】521124995
【氏名又は名称】チアンスー ジェンサイエンス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ワン、ヤーリー
(72)【発明者】
【氏名】チェン、シエン
(72)【発明者】
【氏名】チュー、ルーヤン
(72)【発明者】
【氏名】チョウ、ティンティン
(72)【発明者】
【氏名】モー、ウェイチョアン
(72)【発明者】
【氏名】リウ、チョンリャン
(72)【発明者】
【氏名】ハオ、ウェイウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ワン、シューヤー
(72)【発明者】
【氏名】チアン、チャオチュイ
(72)【発明者】
【氏名】レン、ツーチア
(72)【発明者】
【氏名】スー、ホンション
【審査官】上條 のぶよ
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５１０００３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２０－５０３８８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５０２６９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５０６６３５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５１２２５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５０４７４２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Applied Microbiology and Biotechnology，2014年，Vol.99，p.327-336
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ１２Ｐ ２１／０２
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
Ａ６１Ｋ ３８／２８
Ａ６１Ｋ ４７／６５
Ａ６１Ｐ ３／１０
Ｃ０７Ｋ １４／６２
Ｃ０７Ｋ １６／１８
Ｃ１２Ｎ ９／５０
Ｃ１２Ｎ １５／１２
Ｃ１２Ｎ １５／１３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｉｎｓ－Ｌ－Ｆｃ構造を有するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質。（ただし、Ｉｎｓは、共有結合により連結されたインスリンＡ鎖とＢ鎖とを含むインス
リン活性を提供するインスリン部分であり、Ａ鎖及びＢ鎖は異なるペプチド鎖中にあり、前記共有結合は、ジスルフィド結合であり、
Ｌは、ＩｎｓとＦｃを連結するリンカーであり、Ｌは、ポリペプチド断片であり、
Ｌは、１つまたは複数の剛性単位からなり、前記剛性単位は、以下の配列からなる群より選択され、
【表1】
Ｆｃは免疫グロブリンのＦｃ領域であり、前記Ｆｃはヒト免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来する）。
【請求項2】
前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２に由来するＦｃ領域である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記インスリンは、ヒトインスリン、ウシインスリン又はブタインスリンから選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記インスリンは、ヒトインスリンのＡ鎖及びＢ鎖からなる、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
Ｂ鎖のアミノ酸配列が配列番号８７であり、Ａ鎖、Ｌ及びＦｃのアミノ酸配列が配列番号８８であるか；
Ｂ鎖のアミノ酸配列が配列番号９３であり、Ａ鎖、Ｌ及びＦｃのアミノ酸配列が配列番号９４であるか；
Ｂ鎖のアミノ酸配列が配列番号９７であり、Ａ鎖、Ｌ及びＦｃのアミノ酸配列が配列番号９８であるか；
Ｂ鎖のアミノ酸配列が配列番号９９であり、Ａ鎖、Ｌ及びＦｃのアミノ酸配列が配列番号１００であるか；
Ｂ鎖のアミノ酸配列が配列番号１０７であり、Ａ鎖、Ｌ及びＦｃのアミノ酸配列が配列番号１０８であるか；
Ｂ鎖のアミノ酸配列が配列番号１１３であり、Ａ鎖、Ｌ及びＦｃのアミノ酸配列が配列番号１１４であるか；
Ｂ鎖のアミノ酸配列が配列番号１１５であり、Ａ鎖、Ｌ及びＦｃのアミノ酸配列が配列番号１１６であるか；又は
Ｂ鎖のアミノ酸配列が配列番号１１７であり、Ａ鎖、Ｌ及びＦｃのアミノ酸配列が配列番号１１８である、
請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、血糖を降下させるため及び／又は糖尿病を治療するための医薬組成物。
【請求項7】
前記糖尿病がＩ型又はＩＩ型糖尿病である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
式（Ｉ）の構造を有するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質と部位特異的プロテアーゼ切断部位を切断可能な部位特異的プロテアーゼとを接触させることを含む、請求項１に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生産方法：Ｘ－Ｅ１－Ｙ－Ｅ２－Ｚ－Ｌ－Ｆｃ （Ｉ）
（ただし、ＸとＺはそれぞれインスリンのＢ鎖とＡ鎖であり、かつ、ＸがＢ鎖である場合、ＺはＡ鎖であり、ＸはＡ鎖である場合、ＺはＢ鎖であり、
Ｙは、任意で存在するリンカーペプチドであり、長さは１～１００個又はそれ以上のアミノ酸であり、
Ｅ１及びＥ２は、一方又は両方が存在し、部位特異的プロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸の断片であり、
Ｅ１及びＥ２が同時に存在する場合、Ｅ１及びＥ２は、同一または異なる部位特異的プロテアーゼにより切断され、
Ｙが存在する場合は、Ｅ１及びＥ２の両方が存在し、
前記部位特異的プロテアーゼ切断部位は、Ｋｅｘ２及び／又はフリン（Ｆｕｒｉｎ）プロテアーゼの切断部位であり、
Ｌは、ＺとＦｃを連結するリンカーであり、Ｌは、ポリペプチド断片であり、
Ｌは、１つまたは複数の剛性単位からなり、前記剛性単位は、以下の群から選択され、
【表2】
Ｆｃは免疫グロブリンのＦｃ領域であり、Ｆｃはヒト免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来する）。
【請求項9】
前記インスリンは、ヒトインスリン、ウシインスリン又はブタインスリンから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記融合タンパク質が、配列番号５４、５７、５９、６０、６４、６７、６８及び６９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［相互参照］
この出願は、２０２０年７月２４日に中国特許庁に出願され、発明名称「インスリン－Ｆｃ融合タンパク質及びその応用」である中国特許出願２０２０１０７２３９７２．９の優先権を主張し、その内容は援用により全体が本明細書に組み込まれる。
この出願は、２０２０年７月２４日に中国特許庁に出願され、発明名称「インスリン－Ｆｃ融合タンパク質及びその応用」である中国特許出願２０２０１０７２３９７２．９の優先権を主張し、その内容は援用により全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、ポリペプチド系薬物の分野に関し、特に、部位特異的プロテアーゼにより切断された後の、増強されたインスリン活性及び延長された生体内半減期を有するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質、その製造方法及び応用に関する。
【0003】
近年、糖尿病の発症率は年々増加している。１型糖尿病では、主に外因性インスリンによって血糖が制御される。２型糖尿病でも、病状の悪化に伴って、インスリンが主な薬剤として血糖制御に用いられる。従って、インスリンは、糖尿病を治療するために用いられる有効な方法として知られている。
【0004】
インスリン療法は、異常なインスリン分泌（Ｉ型）又はインスリン耐性（ＩＩ型）を有する患者に必要であり、インスリンの投与により血液中のグルコースレベルを正常に調節することができる。しかし、他のタンバク質及びペプチドホルモンと同様に、インスリンは生体内半減期が非常に短いため、繰り返し投与されるという欠点がある。このような頻繁な投与は、患者に激しい痛みや不快感を引き起こす恐れがある。そのため、タンバク質の体内半減期を延長し、投与頻度を低減させることで生活の品質を改善するためには、タンバク質製剤及び化学的抱合（脂肪酸抱合体、ポリエチレンポリマー抱合体）についての研究が多く行われてきた。市販される持効型インスリンとしては、サノフィ・アベンティス社製のインスリングラルギン（ｌａｎｔｕｓ、約２０時間～２２時間持続）、ノボ ノルディスク社製のインスリンデテミル（ｌｅｖｅｍｉｒ、約１８時間～２２時間持続）及びトレシーバ（インスリンデグルデク、約４０時間持続）がある。これらの持効型インスリン製剤は、血液中のインスリン濃度のピークを生じないため、基礎インスリンとして適している。しかし、これらの製剤は十分に長い半減期を持たないため、１日１回又は２～３日ごとに注射するという欠点がまだある。従って、長期間のインスリン投与を必要とする糖尿病患者の便利性を向上させるために、週１回の投与頻度という所定の標的を達成するには限界がある。
【0005】
特許公開ＣＮ１０３５０９１１８Ｂには、抗体Ｆｃ領域に融合された単鎖インスリンが開示されている。このインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、インビトロ実験で半減期が改善されたことが示されているが、この融合インスリンは、体内血糖降下活性が低く、臨床投与に適さない。
【0006】
血糖障害をうまく制御するのは、治療される患者のコンプライアンスと高度に相関しており、必要な注射頻度を減らすことが求められている。しかし、これらの既存の修飾インスリン分子は、活性が低くて臨床使用に適さないか、或いは活性が高くて患者に投与された後に急速な血糖降下作用を示し、低血糖の副作用をもたらす恐れがる。従って、臨床投与に適した新しい持効型インスリンが当分野で緊急に求められている。
【発明の概要】
【0007】
本発明者らは、鋭意研究を重ねて、部位特異的プロテアーゼにより切断された後に増強されたインスリン活性及び延長された生体内半減期を得るインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を提供する。驚くべきことに、前記融合タンパク質によれば、体内血糖降下作用がよりフラット及び安定しており、臨床投薬の安全性と患者のコンプライアンスが改善され、それによって血糖管理をより確実に実現し、より良好な生活品質を提供することができる。
【0008】
一態様においては、本発明は、部位特異的プロテアーゼにより切断された後に増強されたインスリン活性及び延長された生体内半減期を有し、下記の式（Ｉ）の構造を有するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
【0009】
Ｘ－Ｅ１－Ｙ－Ｅ２－Ｚ－Ｌ－Ｆｃ （Ｉ）、
ここで、ＸとＺはそれぞれインスリンのＢ鎖とＡ鎖であり、かつ、ＸがＢ鎖である場合、ＺはＡ鎖であり、ＸがＡ鎖である場合、ＺはＢ鎖である。
Ｙは任意のリンカーペプチドであり、Ｙの長さは１～１００個以上のアミノ酸とすることができ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、又は上記の任意の２つの数値の間にある個数のアミノ酸とすることができ、例えば、ＹはインスリンＣペプチド又はその変異体又はその断片である。
Ｅ１及びＥ２は、一方又は両方とも存在する場合があり、部位特異的プロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸の断片であり；Ｅ１及びＥ２の長さは１～１０個以上のアミノ酸とすることができ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸とすることができ；同時に存在する場合、Ｅ１及びＥ２は、同一または異なる部位特異的プロテアーゼにより切断され得、例えば、同一の部位特異的プロテアーゼにより切断され得、Ｙが存在する場合、好ましくはＥ１及びＥ２の両方が存在することが好ましく、Ｙが存在しない場合、Ｅ１及びＥ２の一方が存在することが好ましく；前記部位特異的プロテアーゼ切断部位は、Ｋｅｘ２及び／又はフリン（Ｆｕｒｉｎ）プロテアーゼの切断部位とすることができ、例えば、Ｋｅｘ２プロテアーゼの切断部位である。
Ｌは、ＺとＦｃを連結するリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）であり；Ｌはポリペプチド断片とすることができ、例えば、Ｌは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＳｅｒから選択される１つ、２つ又はそれ以上のアミノ酸の柔軟性単位（本明細書では柔軟性ペプチドセグメントともいう）を含み、より具体的には、Ｇ及びＳからなる柔軟性単位であり、Ｌは、剛性単位（本明細書では剛性ペプチドセグメントともいう）を含むポリペプチド断片であってもよい。
ここで、ＸとＺはそれぞれインスリンのＢ鎖とＡ鎖であり、かつ、ＸがＢ鎖である場合、ＺはＡ鎖であり、ＸがＡ鎖である場合、ＺはＢ鎖である。
Ｙは任意のリンカーペプチドであり、Ｙの長さは１～１００個以上のアミノ酸とすることができ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、又は上記の任意の２つの数値の間にある個数のアミノ酸とすることができ、例えば、ＹはインスリンＣペプチド又はその変異体又はその断片である。
Ｅ１及びＥ２は、一方又は両方とも存在する場合があり、部位特異的プロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸の断片であり；Ｅ１及びＥ２の長さは１～１０個以上のアミノ酸とすることができ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸とすることができ；同時に存在する場合、Ｅ１及びＥ２は、同一または異なる部位特異的プロテアーゼにより切断され得、例えば、同一の部位特異的プロテアーゼにより切断され得、Ｙが存在する場合、好ましくはＥ１及びＥ２の両方が存在することが好ましく、Ｙが存在しない場合、Ｅ１及びＥ２の一方が存在することが好ましく；前記部位特異的プロテアーゼ切断部位は、Ｋｅｘ２及び／又はフリン（Ｆｕｒｉｎ）プロテアーゼの切断部位とすることができ、例えば、Ｋｅｘ２プロテアーゼの切断部位である。
Ｌは、ＺとＦｃを連結するリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）であり；Ｌはポリペプチド断片とすることができ、例えば、Ｌは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＳｅｒから選択される１つ、２つ又はそれ以上のアミノ酸の柔軟性単位（本明細書では柔軟性ペプチドセグメントともいう）を含み、より具体的には、Ｇ及びＳからなる柔軟性単位であり、Ｌは、剛性単位（本明細書では剛性ペプチドセグメントともいう）を含むポリペプチド断片であってもよい。
【0010】
いくつかの実施形態においては、前記剛性単位は、剛性アミノ酸を含むか又は主に剛性アミノ酸からなる。前記剛性アミノ酸には、Ｖ、Ｐ、Ｉ、Ｋ及びＬが含まれるがこれらに限定されない。
【0011】
いくつかの実施例においては、前記剛性単位は、１つまたは複数のＰＰＰＸ１ＬＰ（配列番号１２５）を含み、Ｘ１は任意のアミノ酸である。
【0012】
いくつかの別実施例においては、前記剛性単位は、１つまたは複数のＸ２ＡＰＰＰＸ１ＬＰ（配列番号１２６）を含み、Ｘ１は任意のアミノ酸、Ｘ２はＫ又はＶである。
【0013】
いくつかの別実施例においては、前記剛性単位は、以下の配列から選択されたポリペプチド断片を含む。
ＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１２７）
ＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１２８）
ＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１２９）
ＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１２７）
ＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１２８）
ＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１２９）
【0014】
いくつかの別実施例においては、前記剛性単位は、以下の配列から選択されたポリペプチド断片を含む。
ＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１３０）
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１３１）
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１３２）
ＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１３０）
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１３１）
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１３２）
【0015】
いくつかの実施形態においては、Ｌは剛性単位と柔軟性単位の両方を含み、また３つ以上の単位を含んでも良い。
【0016】
Ｆｃは免疫グロブリンのＦｃ領域である。前記Ｆｃはヒト免疫グロブリンに由来することができる。前記Ｆｃ領域はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域とすることができる。好ましくは、前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧに由来するＦｃ領域であり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＦｃ領域である。さらに好ましくは、前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２に由来するＦｃ領域である。ここで、前記Ｆｃ領域は、その由来の配列と比較して、半減期を延長する能力を保持しながら、１つまたは複数の置換、付加及び／又は欠失を有することができ、例えば、ヒトＩｇＧに由来するＦｃ領域であり、かつＦｃγＲへの結合を低減又は除去する変異及び／又はＦｃＲｎへの結合を増強する１つまたは複数の変異を有する。前記変異は、Ｎ２９７Ａ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ２５０Ｒ／Ｍ４２８Ｌから選択され得る。前記Ｆｃ領域は、グリコシル化されていてもよく、グリコシル化されていなくてもよい。
【0017】
いくつかの実施形態においては、本発明の融合タンパク質では、前記インスリンは、ヒトインスリン、ウシインスリン又はブタインスリンから選択され、好ましくはヒトインスリンである。例えば、前記インスリンのＡ鎖及びＢ鎖はヒトインスリンに由来する。
【0018】
いくつかの実施例においては、Ｙと、Ｅ１とＥ２とも存在するか、又はＹは存在せず、Ｅ１及びＥ２のうちの１つは存在する。
【0019】
いくつかの別実施例においては、前記融合タンパク質は、配列番号４７～７２から選択されたアミノ酸配列を有する。
【0020】
第２の態様においては、本発明は、Ｉｎｓ－Ｌ－Ｆｃ構造を有するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態においては、本発明の第１の態様における融合タンパク質は、特異的プロテアーゼの作用下で、Ｃ鎖が除去され、本発明の第２の態様における融合タンパク質を生成することができる。いくつかの実施形態においては、前記インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、ホモ二量体の形態で存在し、その構造概略図が図３に示される。いくつかの実施形態においては、前記インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、天然のインスリンと類似する二次構造及び三次構造を有する。
【0021】
ここで、Ｉｎｓは、インスリン活性を提供するインスリン部分であり、共有結合により連結されたインスリンＡ鎖及びＢ鎖を含む。ただし、Ａ鎖及びＢ鎖は異なるペプチド鎖中にあり、前記共有結合は、好ましくはジスルフィド結合である。
Ｌは、ＺとＦｃを連結するリンカーである。Ｌはポリペプチド断片（本明細書のいくつかの実施形態においてリンカーペプチドとも呼ばれる）とすることができる。例えば、Ｌは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＳｅｒから選択された１つ、２つ又はそれ以上のアミノ酸の柔軟性単位を含む。Ｌは、剛性単位を含むポリペプチド断片であってもよい。
Ｌは、ＺとＦｃを連結するリンカーである。Ｌはポリペプチド断片（本明細書のいくつかの実施形態においてリンカーペプチドとも呼ばれる）とすることができる。例えば、Ｌは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＳｅｒから選択された１つ、２つ又はそれ以上のアミノ酸の柔軟性単位を含む。Ｌは、剛性単位を含むポリペプチド断片であってもよい。
【0022】
いくつかの実施例においては、前記Ｌは、剛性単位を１つまたは複数含む。前記剛性単位は、剛性アミノ酸を含むか又は主に剛性アミノ酸からなる。前記剛性アミノ酸には、Ｖ、Ｐ、Ｉ、Ｋ及びＬが含まれるがこれらに限定されない。
【0023】
いくつかの別実施例においては、前記剛性単位は、ＰＰＰＸ１ＬＰ（配列番号１２５）を１つまたは複数含む。ここでは、Ｘ１は任意のアミノ酸である。
【0024】
いくつかの別実施例においては、前記剛性単位は、Ｘ２ＡＰＰＰＸ１ＬＰ（配列番号１２６）を１つまたは複数含む。ここでは、Ｘ１は任意のアミノ酸、Ｘ２はＫ又はＶである。
【0025】
いくつかの別実施例においては、前記剛性単位は、以下の配列から選択されたポリペプチド断片を含む。
ＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１２７）
ＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１２８）
ＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１２９）
ＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１２７）
ＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１２８）
ＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１２９）
【0026】
いくつかの別実施例においては、前記剛性単位は、以下の配列から選択されたポリペプチド断片を含む。
ＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１３０）
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１３１）
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１３２）
ＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１３０）
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１３１）
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１３２）
【0027】
Ｆｃは免疫グロブリンのＦｃ領域である。前記Ｆｃはヒト免疫グロブリンに由来することができる。前記Ｆｃ領域はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域とすることができる。好ましくは、前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧに由来するＦｃ領域であり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＦｃ領域である。さらに好ましくは、前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２に由来するＦｃ領域である。ここで、前記Ｆｃ領域は、その由来の配列と比較して、半減期を延長する能力を保持しながら、１つまたは複数の置換、付加及び／又は欠失を有することができ、例えば、ヒトＩｇＧに由来するＦｃ領域であり、かつＦｃγＲへの結合を低減又は除去する変異及び／又はＦｃＲｎへの結合を増強する１つまたは複数の変異を有する。前記変異は、Ｎ２９７Ａ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ２５０Ｒ／Ｍ４２８Ｌから選択され得る。前記Ｆｃ領域は、グリコシル化されていてもよく、グリコシル化されていなくてもよい。
【0028】
いくつかの実施形態においては、前記インスリンは、ヒトインスリン、ウシインスリン又はブタインスリンから選択され、ヒトインスリンであることが好ましい。例えば、前記インスリンのＡ鎖及びＢ鎖はヒトインスリンに由来する。
【0029】
いくつかの別実施形態においては、前記Ｌは、ＣＴＰを含み、例えば、１、２、３又はそれ以上のＣＴＰを含む。
【0030】
第３の態様においては、本発明は、増強されたインスリン活性及び延長された半減期を有するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生産方法を提供する。該生産方法は、本発明の第１の態様における融合タンパク質と前記部位を切断可能な特異的プロテアーゼとを接触させることを含む。前記部位特異的プロテアーゼは、Ｋｅｘ２及び／又はフリン（Ｆｕｒｉｎ）プロテアーゼであることが好ましい。
【0031】
いくつかの実施形態においては、増強されたインスリン活性及び延長された生体内半減期を有する本発明に係るインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、上記の方法により得られる。
【0032】
第４の態様においては、本発明は、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、前記融合タンパク質を発現できる発現ベクターであることが好ましい。
【0033】
第５の態様においては、本発明は、上記のポリヌクレオチドを含む、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を発現できる細胞を提供する。
【0034】
第６の態様においては、本発明は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生産方法を提供する。該生産方法は、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を発現する条件下で、本発明の第５の態様における細胞を培養する工程を含み、好ましくは、前記インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、前記部位を切断可能な特異的プロテアーゼと接触させる工程をさらに含む。ここでは、前記培養工程及び接触酵素切断工程は、同時に又は別々に行うことができる。また、前記方法は、目的融合タンパク質を得るためのタンパク質を精製する工程を含んでもよい。
【0035】
第７の態様においては、本発明は、融合タンパク質の脱グリコシル化分子量の検出及びジスルフィド結合の特徴付けを含む、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の構造を特徴付ける方法を提供する。
【0036】
第８の態様においては、本発明は、上記第１及び第３の態様における融合タンパク質、第４の態様におけるポリヌクレオチド、又は第５の態様における細胞を含む医薬組成物を提供する。
【0037】
第９の態様においては、本発明は、第１及び第２の態様における融合タンパク質、第４の態様におけるポリヌクレオチド、又は第５の態様における細胞を必要とする対象に投与することを含む、血糖の低減方法及び／又は糖尿病の治療方法を提供する。好ましくは、前記糖尿病はＩ型又はＩＩ型糖尿病である。なお、本発明の第１の態様における融合タンパク質を投与する場合、適切な部位特異的プロテアーゼの追加投与、又は体内に存在する適切な部位特異的プロテアーゼの利用を考慮してもよい。
【0038】
また、上記の血糖の低減方法及び／又は糖尿病の治療方法に対応して、本発明は、血糖の低減及び／又は糖尿病の治療のための薬剤の調製における前記融合タンパク質、ポリヌクレオチド又は細胞の使用を提供する。また、本発明は、血糖の低減及び／又は糖尿病の治療のための融合タンパク質、ポリヌクレオチド又は細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1A】図１は、インスリン前駆体融合タンパク質の発現に用いられる本発明のベクターの概略図を示す。ここでは、図１Ａは安定トランスフェクション発現ベクター、図１Ｂは一過性トランスフェクション発現ベクターである。
【図1B】同上
【図2-1】図２は、実施例３で捕捉されたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図を示す。ここでは、Ｍはマーカーを示し、それらの異なるＰはクロマトグラフィー過程で段階的に収集された目的タンパク質であり、Ｐ＋ＤＴＴはタンパク質還元後の目的バンドである。ＳＳ３０２－００２分子のＳＤＳ図のメモはマーカーのサイズであり、他のイメージでも同じのマーカーが使用される。
【図2-2】同上
【図2-3】同上
【図5A】図５は、正常なＣ５７マウスに対する異なる融合タンパク質の血糖降下の薬効の結果を示す。図５Ａは、ＳＳ３０２－０１２Ｍ、ＳＳ３０２－０１９Ｍ、ＳＳ３０２－０２９Ｍ及びＳＳ３０２－０３５Ｍの結果を示し、図５Ｂは、ＳＳ３０２－００８Ｍ、ＳＳ３０２－０１４Ｍ、ＳＳ３０２－０１５Ｍ及びＳＳ３０２－０３０Ｍの結果を示す。
【図5B】同上
【図7B】同上
【図8B】同上
【図11B】同上
【発明を実施するための形態】
【0040】
次に、実施例を参照して本発明についてより詳細に説明するが、説明された実施例は本発明の一部の実施例に過ぎず、すべての実施例ではないことは明らかである。本発明における実施例に基づいて、創造的な努力なしに当業者によって得られる他のすべての実施例は、本発明の保護範囲に入る。
【0041】
用語
インスリン
インスリンは、膵島β細胞から分泌され、グルコースの吸収を促進し、脂肪の分解を抑制するホルモンであり、血糖レベルを制御する役割を果たす。β細胞の細胞核では、１１番目の染色体の短腕にあるインスリン遺伝子領域のＤＮＡがｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡは細胞核から細胞質の小胞体に移動し、Ｎ末端に２０個の残基程度のシグナルペプチドを持つ、１０６個のアミノ酸残基からなるプレプロインスリンに翻訳される。プレプロインスリンは小胞体を通過するとき、シグナルペプチドをシグナルペプチダーゼに切断され、８６個のアミノ酸からなる長いペプチド鎖のプロインスリンが生成される。インスリンは、ゴルジ体中でタンパク質分解酵素の作用下で、３１番目及び３２番目の２つのアルギニン残基、６４番目のリジン残基及び６５番目のアルギニン残基を切断され、鎖の切断で連接部分としてのＣペプチドが生成する同時にインスリンが生成し、β細胞外に分泌され、血液循環中に入る。プロテアーゼによって加水分解されなかったプロインスリンは、その一部がインスリンとともに血液循環に入る。プロインスリンは、ほぼ生物活性を持たなく、その生物活性値がインスリンの５％～１０％しかない。
インスリン
インスリンは、膵島β細胞から分泌され、グルコースの吸収を促進し、脂肪の分解を抑制するホルモンであり、血糖レベルを制御する役割を果たす。β細胞の細胞核では、１１番目の染色体の短腕にあるインスリン遺伝子領域のＤＮＡがｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡは細胞核から細胞質の小胞体に移動し、Ｎ末端に２０個の残基程度のシグナルペプチドを持つ、１０６個のアミノ酸残基からなるプレプロインスリンに翻訳される。プレプロインスリンは小胞体を通過するとき、シグナルペプチドをシグナルペプチダーゼに切断され、８６個のアミノ酸からなる長いペプチド鎖のプロインスリンが生成される。インスリンは、ゴルジ体中でタンパク質分解酵素の作用下で、３１番目及び３２番目の２つのアルギニン残基、６４番目のリジン残基及び６５番目のアルギニン残基を切断され、鎖の切断で連接部分としてのＣペプチドが生成する同時にインスリンが生成し、β細胞外に分泌され、血液循環中に入る。プロテアーゼによって加水分解されなかったプロインスリンは、その一部がインスリンとともに血液循環に入る。プロインスリンは、ほぼ生物活性を持たなく、その生物活性値がインスリンの５％～１０％しかない。
【0042】
本発明における「インスリン」としては、天然に存在するインスリンの他に、インスリンの機能的変異体がある。前記機能的変異体とは、インスリンの天然の配列及び／又は構造に対して、１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換などの修飾を実施することで、得られたインスリン活性（生体中の血糖レベルの調節）を保有するポリペプチドを指す。アミノ酸の置換、付加又は欠失は、天然に存在する変異形態であってもよく、特定の目的として人工的修飾を行うことによって引き起こした変異形態であってもよい。当業者に周知されているように、現実にはインスリン機能的変異体がしばしばインスリンと呼ばれることがある。別の例としては、ＣＮ１０５６３６９７９Ｂ及びＣＮ２０１４８０００６９９８に開示されているインスリン類似体である。本明細書でも現実の状況と合致している。
【0043】
他の側面から言えば、インスリンの機能的変異体とは、天然インスリンと少なくとも８０％（好ましくは８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）のアミノ酸配列の相同性を有し、インスリン活性を保有するポリペプチドを指す。いくつかの機能的変異体に対しては、特定のアミノ酸残基におけるいくつかの原子・原子団で、化学置換（例えば、α－メチル化、α－ヒドロキシ化）、欠失（例えば、脱アミノ化）又は修飾（例えば、Ｎ－メチル化）を行うことができる。
【0044】
インスリン機能的変異体の製造方法及び効果検出方法は、当業者によく知られている。市販されているインスリン類似体としては、例えば、インスリンリスプロ（リリー）、インスリンアスパルト（ノボノルディスク）、インスリングルリシン（Ａｖｅｎｔｉｓ）、インスリングラルギン（サノフィ）、インスリンデテミル（ノボノルディスク）、及びインスリンデグルデク（ノボノルディスク）などが挙げられる。
【0045】
インスリンリスプロ（ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｓｐｒｏ）は、その他のアミノ酸配列及び構造が変化せずに、ヒトインスリンのＢ鎖の２８位のプロリンと２９位のリジンを位置置換したものである。２つのアミノ酸配列の順番が逆転した結果、インスリンの機能は変わっていないが、もともと二量体及び六量体を形成しやすいインスリンは、二量体及び六量体に凝集しにくくなり、単量体の形で存在してきた。このようにすると、皮下注射後に容易に吸収され、迅速に働けるようになる。
【0046】
インスリンアスパルト（ｉｎｓｕｌｉｎ ａｓｐａｒｔ）は、同様に速効型インスリンの１つで、ヒトインスリンのＢ２８位のプロリンをアスパラギン酸に置換したものである。これにより、このインスリン類似体は、六量体を形成しにくく、皮下で容易に吸収され、迅速に働くようになる。
【0047】
インスリングルリシンは、Ｂ３位のアスパラギンをリジンで置換し、Ｂ２９位のリジンをグルタミン酸で置換することにより、迅速に働けるようになる。
【0048】
インスリングラルギン（ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｌａｒｇｉｎｅ、ランタス、Ｌａｎｔｕｓ）は、１）Ａ鎖の２１位でのアスパラギン酸がグリシンに置換されていること、及び２）Ｂ鎖のＣ末端に２つのアルギニン残基が付加されていることで、ヒトインスリンとは異なる。この変更の結果、以下の変化が起こる。Ａ２１位がグリシンに置換された結果、六量体の結合がより安定し、皮下組織の中性環境下で、溶解度が低下して沈殿が発生し、それによりゆっくり吸収されるようになり、基礎インスリンのピークなしの分泌に類似し、持効型治療に適し、また、少量の亜鉛を添加すれば、その作用時間がさらに延長される。Ｂ鎖のＣ末端に２つのアルギニン残基が付加された結果、インスリンの等電点が変化し、元のｐＨ４．５からｐＨ６．７に上昇することで、皮下組織の中性環境で微小沈殿物が形成し、インスリンの分解、吸収及び作用時間が延びるようになる。
【0049】
インスリンデテミル（ｉｎｓｕｌｉｎ ｄｅｔｅｍｉｒ、Ｌｅｖｅｒｍｉｒ）は、ノボノルディスク社により開発され、構造的にＢ３０位のアミノ酸を除去し、Ｂ２９位のリジン部位に１つのＮ－１６－アルカン酸基の１４炭素数の遊離脂肪酸鎖を連結したものである。亜鉛イオンが存在する薬液においては、インスリン分子は依然として六量体の形で存在し、脂肪酸鎖で修飾されたために皮下吸収が遅くなる。血漿中においては、インスリンデテミルは、脂肪酸が存在するために血漿中のアルブミンと結合するので、遊離のインスリンデテミルだげ血糖降下作用を発揮するので、このように、インスリンの作用時間も延長される。
【0050】
インスリンデグルデクは、Ｂ３０位のスレオニンを除去し、Ｂ２９位のリジン部位でグルタミン酸リンカーを介して１６炭素数の脂肪二酸の側鎖に連結したものである。インスリンデグルデクは、フェノール及び亜鉛イオンの作用下で、製剤中で二重六量体に重合し、また、皮下注射された後、フェノールの拡散及び亜鉛イオンの徐放に伴い、ゆっくりとかつ連続的にインスリンデグルデク単量体を放出することができ、そして単量体が血中に吸収される。上記の特徴によれば、インスリンデグルデクは、糖尿病患者の体内で、その半減期が２５時間程度であるような非常に長い作用時間を持っている。
【0051】
融合タンパク質
本明細書に記載されている融合タンパク質は、アミノ酸からペプチド結合により連結されてなるタンパク質だけでなく、２本以上のペプチド鎖からジスルフィド結合により連結されてなるタンパク質も指す。
本明細書に記載されている融合タンパク質は、アミノ酸からペプチド結合により連結されてなるタンパク質だけでなく、２本以上のペプチド鎖からジスルフィド結合により連結されてなるタンパク質も指す。
【0052】
本発明に係る「インスリン－Ｆｃ融合タンパク質」とは、インスリン（その機能的変異体を含む）と免疫グロブリンのＦｃ領域により形成された融合タンパク質を指し、本明細書では「融合タンパク質」と略記することがある。また、リンカーペプチド部分を酵素切断により除去する前後のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を区別するため、酵素切断前の前記融合タンパク質は「インスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質」と呼ぶことがあり、それに応じて「インスリン－Ｆｃ融合タンパク質」は、酵素切断によりリンカーペプチド部分を除去した後の前記融合タンパク質を指す。ただし、本明細書においては、酵素切断前後の前記融合タンパク質を特に区別しないことが普通であり、この場合、前記融合タンパク質又はインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、その酵素切断前の形態と酵素切断後の形態とも包含する。なお、前記融合タンパク質がどの形態を指すのが文脈で理解できる場合は、この形態を指すために「融合タンパク質」又は「インスリン－Ｆｃ融合タンパク質」を直接使用することも多い。
【0053】
天然のヒトインスリンのＡ鎖の配列は以下の通りである。
Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ（配列番号１）
Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ（配列番号１）
【0054】
天然のヒトインスリンのＢ鎖の配列以下の通りである。
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ（配列番号２）
Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ（配列番号２）
【0055】
本明細書に記載されている融合タンパク質は、例えば、Ｆｃ、ＣＴＰ（Ｃ末端ペプチド、Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＸＴＥＮ、ＳＡＢＡ（血清アルブミンと結合するダイナクチン、ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｄｎｅｃｔｉｎ）及びＰＡＳから選択された１つまたは複数の生体内半減期を延長する追加の配列を含んでも良い。前記追加の配列は、融合タンパク質における末端、リンカー又は他の位置に位置することができる。簡略化のために、本明細書で使用される構造式Ｘ－Ｅ１－Ｙ－Ｅ２－Ｚ－Ｌ－Ｆｃ及びＩｎｓ－Ｌ－Ｆｃは、前記追加配列が他の位置する場合も含む。
【0056】
リンカーペプチド（Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ）
インスリンの体内処理中に、インスリンＡ鎖及びＢ鎖を連結するリンカーペプチドはＣペプチドである。前記Ｃペプチドには、天然に存在する配列が含まれるし、前記天然に存在する配列に基づいて１つ又はいは複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を行って形成された同じ機能を有する変異体形態も含まれる。
インスリンの体内処理中に、インスリンＡ鎖及びＢ鎖を連結するリンカーペプチドはＣペプチドである。前記Ｃペプチドには、天然に存在する配列が含まれるし、前記天然に存在する配列に基づいて１つ又はいは複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を行って形成された同じ機能を有する変異体形態も含まれる。
【0057】
ご参照の例として、ヒトインスリンの天然形態のＣペプチドの配列は以下の通りである。
Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ（配列番号３）
Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ（配列番号３）
【0058】
本発明に係るインスリン－Ｆｃ融合タンパク質においては、前記リンカーペプチドは、天然のインスリンのＣペプチド又はその変異体／その断片に限定されるものではなく、インスリンＡ鎖とＢ鎖を連結する役割を持つ他の適切なポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態においては、前記リンカーペプチドは、長さが１～１００個以上のアミノ酸とすることができ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個のアミノ酸又は上記の任意の２つの数値の間にある個数のアミノ酸である。
【0059】
いくつかの実施例においては、リンカーペプチドの配列は以下の以下の通りである。
ＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬ（配列番号４）
Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号５）
Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号６）
ＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＳＬＱＰＬＡＬ（配列番号７）
ＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬ（配列番号４）
Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号５）
Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号６）
ＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＳＬＱＰＬＡＬ（配列番号７）
【0060】
いくつかの別実施例においては、リンカーペプチドは、以下の長さが異なるポリペプチドのうちのいずれか１つの形態としてもよい。
ＥＡＥＤ（配列番号８）
ＹＰＧＤＶ（配列番号９）
ＡＡ（配列番号１０）
ＥＷ（配列番号１１）
ＥＡＥＤ（配列番号８）
ＹＰＧＤＶ（配列番号９）
ＡＡ（配列番号１０）
ＥＷ（配列番号１１）
【0061】
Ｆｃ領域／Ｆｃ断片
ヒト免疫グロブリンＩｇＧは、ジスルフィド結合により共有結合された４つのポリペプチド（軽鎖と重鎖の２つのコピー）から構成される。ＩｇＧ分子がパパインによりタンパク質加水分解されると、２つのＦａｂ断片と１つのＦｃ断片が生成する。前記Ｆｃ断片は、ジスルフィド結合により連結された２つのポリペプチドから構成される。各ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインから構成される。前記Ｆｃ断片の構造は、すべてのサブタイプのヒト免疫グロブリンでほぼ同一である。ＩｇＧは、ヒト血液中に最も豊富に存在するタンパク質の１つであり、ヒト血清中の総免疫グロブリンの７０～７５％を占めている。
ヒト免疫グロブリンＩｇＧは、ジスルフィド結合により共有結合された４つのポリペプチド（軽鎖と重鎖の２つのコピー）から構成される。ＩｇＧ分子がパパインによりタンパク質加水分解されると、２つのＦａｂ断片と１つのＦｃ断片が生成する。前記Ｆｃ断片は、ジスルフィド結合により連結された２つのポリペプチドから構成される。各ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインから構成される。前記Ｆｃ断片の構造は、すべてのサブタイプのヒト免疫グロブリンでほぼ同一である。ＩｇＧは、ヒト血液中に最も豊富に存在するタンパク質の１つであり、ヒト血清中の総免疫グロブリンの７０～７５％を占めている。
【0062】
免疫グロブリンのＦｃ領域は、体内で代謝された生分解性ポリペプチドであるため、薬物担体として安全に使用することができる。また、免疫グロブリンのＦｃ領域は、免疫グロブリン分子全体に比べて比較的低い分子量を有するため、融合タンパク質の調製、精製及び生産に有利である。免疫グロブリンのＦｃ領域には、Ｆａｂ断片（そのアミノ酸配列は抗体のサブクラスによっては高度に不均一である）が含まれていないため、免疫グロブリンのＦｃ領域は物質の均一性を大幅に増加させて低い抗原性を有することが期待される。
【0063】
当業者が一般的に考えられているように、「免疫グロブリンのＦｃ領域」という用語は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域を含まずに、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含むタンバク質セグメントを指す。また、Ｆｃ領域は、重鎖定常領域におけるヒンジ領域を含んでも良い。さらに、本発明における免疫グロブリンのＦｃ領域は、天然のタンバク質と実質的に類似又はより優れた生理学的機能を有する限り、重鎖及び軽鎖の可変領域以外の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域（ＣＬ）を含むＦｃ領域の一部又は全部を含んでも良い。さらに、ＣＨ２及び／又はＣＨ３のアミノ酸配列の長いほうの部分に欠失した断片であってもよい。例えば、本発明における免疫グロブリンのＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン；２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン；３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン；４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン；５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３又はＣＬドメイン；６）１つ以上の定常領域ドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はその一部）との組み合わせ；又は７）重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のそれぞれのドメインの二量体、を含むことができる。要するに、本発明における免疫グロブリンのＦｃ領域とは、１つまたは複数の重鎖／軽鎖の定常領域ドメイン又はその変異体形態を有し、生体内半減期を延長する機能を融合タンパク質に与える可能な任意の形態のＦｃ又はその変異体／誘導体を指し、例えば、単鎖Ｆｃ、単量体Ｆｃを指す。
【0064】
さらに、本発明における免疫グロブリンのＦｃ領域には、天然のアミノ酸配列及びその配列変異体（突然変異体）が含まれることができる。アミノ酸配列の誘導体は、１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより、天然のアミノ酸配列とは異なる配列を有する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃでは、２１４から２３８位、２９７から２９９位、３１８から３２２位、又は３２７から３３１位における結合に重要と知られているアミノ酸残基を、適切な標的として修飾に使用することができる。さらに、他の可能な誘導体としては、例えば、ジスルフィド結合を形成できる領域が欠失されたもの、天然のＦｃ形態のＮ末端でいくつかのアミノ酸残基が欠失されたもの、及び天然のＦｃ形態のＮ末端にメチオニン残基が付加されたものが挙げられる。さらに、エフェクター機能を除去するために、欠失は、Ｃ１ｑ結合部位やＡＤＣＣ部位などの補体結合部位で発生することがある。このような免疫グロブリンのＦｃ領域の配列誘導体を調製するための技術としては、ＷＯ９７／３４６３１及びＷＯ９６／３２４７８に開示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、当業者に周知されているように、Ｆｃ領域中の１つまたは複数のアミノ酸を変異させることによってＦｃＲｎに対するＦｃの親和性を増強して血清半減期を延長することができるので、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異（ＣＮ１７９８７６７Ｂ）のような変異体形態のＦｃ領域も本発明におけるＦｃ領域の意味範囲内にある。
【0065】
タンバク質及びペプチドにおける一般に分子の活性を変化させないアミノ酸の置換は、当技術分野で知られている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９）。最もよく発生する置換としては、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙであり、逆方向の置換も可能である。
【0066】
必要であれば、Ｆｃ領域は、リン酸化、硫酸化、アクリル酸エステル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化、アミド化などにより修飾されることができる。
【0067】
上記のＦｃ誘導体は、本発明におけるＦｃ領域と同じ生物活性又は改善された構造安定性（例えば、熱、ｐＨなどに対する構造安定性）を有する誘導体である。
【0068】
さらに、これらのＦｃ領域は、ヒトや、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット及びモルモットを含む他の動物から単離された天然の形態から得ることができ、又は形質転換された動物細胞又は微生物から得られたその組換え体若しくは誘導体であってもよい。本明細書では、それらは、ヒト又は動物の生体から無傷の免疫グロブリンを単離し、そしてタンパク質分解酵素で処理することにより、天然の免疫グロブリンから得ることができる。天然免疫グロブリンは、パパインでＦａｂ領域とＦｃ領域に消化されるが、ペプシンで処理すればｐＦｃ’及びＦ（ａｂ’）２の断片が生成する。例えば、これらの断片をサイズ排除クロマトグラフィーにかけてＦｃ又はｐＦｃ’を単離することができる。
【0069】
さらに、本発明における免疫グロブリンのＦｃ領域は、天然の糖鎖を有する形態、天然の形態と比較して糖鎖が増加した形態、又は天然の形態と比較して糖鎖が減少した形態であってもよいし、脱グリコシル化の形態であってもよい。免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増加、減少又は除去は、化学法、酵素法、遺伝子工学方法、又はＮ２９７グリコシル化部位を変異させる方法など、当技術分野で一般的に用いられる方法により行うことができる。Ｆｃ断片から糖鎖を除去することにより、補体（Ｃ１ｑ）への結合親和性が著しく低下するし、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が低下又は喪失するようになるので、所望しない体内の免疫応答が誘導される恐れがない。このように、薬物として用いられるためには、脱グリコシル化又は非グリコシル化形態の免疫グロブリンのＦｃ領域が本発明の目的により適している。
【0070】
本発明で使用される「脱グリコシル化」という用語は、Ｆｃ領域から糖部分を酵素的に除去することを意味し、「非グリコシル化」という用語は、Ｆｃ領域が、グリコシル化されていない形態として原核動物（好ましくは大腸菌）により産生されるか、又はＮ２９７グリコシル化部位をＧ、Ａ又は任意の他のアミノ酸に変異させる方法により産生されるものを意味する。
【0071】
さらに、免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭから誘導体化されたＦｃ領域であってもよいし、それらの組み合わせ又はハイブリダイゼーションにより調製されたものであってもよく、好ましくは、ＩｇＧ又はＩｇＭ（ヒト血液中に最も豊富に存在するタンバク質の１つである）から誘導体化され、最も好ましくは、ＩｇＧ（リガンド結合タンバク質の半減期を延長することが知られている）から誘導体化される。
【0072】
本発明で使用される「組み合わせ」という用語は、同じ由来の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域のポリペプチドと異なる由来の単鎖ポリペプチドとを連結して二量体又は多量体を形成することを意味する。即ち、二量体又は多量体は、ＩｇＧ Ｆｃセグメント、ＩｇＡ Ｆｃセグメント、ＩｇＭ Ｆｃセグメント、ＩｇＤ Ｆｃセグメント及びＩｇＥ Ｆｃセグメントから選択される２つ以上のセグメントから形成することができる。
【0073】
プロテアーゼ分解
プロインスリンは、活性がないか又は活性が非常に低いものであり、従来技術で組換えインスリンを作製するため、大腸菌又は酵母菌で発現させた後、トリプシン又はトリプシンとカルボキシペプチダーゼＢを使用して活性分子に処理するというプロセスが通常に用いられている。しかし、このような通常の作製プロセスは、Ｆｃがトリプシンの酵素切断部位を多く含んでプロインスリンの活性分子への処理中に切断されて失効する恐れがあるから、抗体のＦｃ領域を用いてインスリンと抱合体を形成する場合には使用できない。従来技術では上記の問題を回避するために、単鎖インスリンをＦｃ領域に直接連結させている。しかし、本発明者らの研究によると、上記インスリンは、生体内活性が非常に低いことが見られた。
プロインスリンは、活性がないか又は活性が非常に低いものであり、従来技術で組換えインスリンを作製するため、大腸菌又は酵母菌で発現させた後、トリプシン又はトリプシンとカルボキシペプチダーゼＢを使用して活性分子に処理するというプロセスが通常に用いられている。しかし、このような通常の作製プロセスは、Ｆｃがトリプシンの酵素切断部位を多く含んでプロインスリンの活性分子への処理中に切断されて失効する恐れがあるから、抗体のＦｃ領域を用いてインスリンと抱合体を形成する場合には使用できない。従来技術では上記の問題を回避するために、単鎖インスリンをＦｃ領域に直接連結させている。しかし、本発明者らの研究によると、上記インスリンは、生体内活性が非常に低いことが見られた。
【0074】
本発明者らは、体内のインスリンの成熟機構を模倣し、天然のインスリンにより近い構造を有する（成熟分子中のＡ鎖とＢ鎖がジスルフィド結合により結合されている）同時に、Ｆｃ領域が連結されていたインスリン抱合体を調製することができれば、インスリンの活性を大幅に向上させる可能性があることを予期せず発見した。出願人は、精力的なスクリーニングの結果、本発明における構造の融合ポリペプチドを調製する場合、Ｋｅｘ２プロテアーゼやフリンプロテアーゼ（Ｆｕｒｉｎ）などの酵素切断部位を導入し、前記プロテアーゼを用いて処理することにより活性及び持効型のインスリン抱合体分子が得られることを見出した。
【0075】
本発明に記載されるＫｅｘ２プロテアーゼは、カルシウムイオン依存性タンパク質分解酵素であり、Ａｒｇ－Ａｒｇ、Ｌｙｓ－Ａｒｇなどの二塩基性アミノ酸のカルボキシ末端のペプチド結合を特異的に認識・切断することができる。トリプシンとは異なり、Ｋｅｘ２は単一の塩基性アミノ酸であるアルギニン又はリジンのカルボキシ末端のペプチド結合を認識・切断することができない。Ｋｅｘ２プロテアーゼは、酵母体内でｋｉｌｌｅｒ ｔｏｘｉｎ及びα－ｆａｃｔｏｒの前駆体の処理を担っている。Ｋｅｘ２プロテアーゼの活性は、アプロチニン、ＰＭＳＦ、ＴＰＣＫなどの通常のセリンプロテアーゼ阻害剤からの阻害を受けない。
【0076】
本発明に記載されるフリンプロテアーゼ（Ｆｕｒｉｎ）は、真核生物細胞における重要なエンドプロテアーゼであり、ゴルジ体の外側の網に位置し、外分泌経路の主要なタンバク質転化酵素であり、特定のアミノ酸配列を認識することができ、小胞体－ゴルジ体で２回に自己せん断して活性化された後、分泌経路中の多くの重要なポリペプチド及びタンパク質の前駆体に対して、せん断処理を行って生物活性を有させるように働いている。フリンプロテアーゼは、そのコード遺伝子（ｆｕｒ）が癌原遺伝子ｆｅｓ／ｆｅｐｓの上流に位置することから知られている。具体的には、フリンプロテアーゼは、元のタンパク質におけるＡｒｇ－Ｘａａ－Ｙａａ－Ａｒｇカルボキシ末端のペプチド結合（ただし、Ｘａａは任意のアミノ酸、ＹａａはＡｒｇ又はＬｙｓである）を触媒して切断し、成熟のタンバク質を生成する。
【0077】
本発明に係る融合ポリペプチドは、プロテアーゼで処理された後、Ａ鎖とＢ鎖の間のリンカーペプチドが切断され、そしてＡ鎖とＢ鎖の間に天然のインスリンと類似の形態でジスルフィド結合が生じ、例えば、Ａ７（Ｃｙｓ）－Ｂ７（Ｃｙｓ）、Ａ２０（Ｃｙｓ）－Ｂ１９（Ｃｙｓ）の４つのシステインにおけるチオール基が２つのジスルフィド結合を形成して、Ａ鎖とＢ鎖の２つの鎖を連結させる。また、Ａ鎖の内部のＡ６（Ｃｙｓ）とＡ１１（Ｃｙｓ）との間にジスルフィド結合が１つ存在することが好ましい。本発明者らは、Ａ鎖又はＢ鎖とＦｃ領域との接続が存在しても、Ａ鎖とＢ鎖との間にジスルフィド結合の接続及び空間折り畳みが正確に生じ、Ｆｃ領域に融合したインスリンが形成することを驚き見出し、そして本発明を完成に至った。
【0078】
リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）
本発明の融合タンパク質においては、リンカーＬはインスリンのＡ鎖又はＢ鎖とＦｃ領域とを連接する役割を果たしており、ポリペプチドであってもよく、非ペプチド鎖の化学構造であってもよい。
本発明の融合タンパク質においては、リンカーＬはインスリンのＡ鎖又はＢ鎖とＦｃ領域とを連接する役割を果たしており、ポリペプチドであってもよく、非ペプチド鎖の化学構造であってもよい。
【0079】
いくつかの実施形態においては、リンカーはポリペプチドである。前記ポリペプチドは、主にＡ、Ｔ、Ｇ及び／又はＳからなる柔軟性単位（柔軟性ペプチドセグメント）であるか又はそれを含み、より具体的には、Ｇ及びＳからなる柔軟性単位である。前記柔軟性単位の長さは、２～５０個以上のアミノ酸とすることができ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５又は５０個のアミノ酸である。
【0080】
いくつかの別実施形態では、リンカーは、主に剛性アミノ酸からなる剛性単位（剛性ペプチドセグメント）を含むポリペプチドである。前記剛性アミノ酸には、Ｖ、Ｐ、Ｉ、Ｋ及びＬが含まれるがこれらに限定されない。
【0081】
構造特徴付け
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞により発酵・分泌され、融合タンパク質がＣＨＯ細胞中で転写及び翻訳された後、プロリンのヒドロキシ化、Ｏ糖、Ｎ糖、Ｃ末端のリジン欠失などの翻訳後の修飾を含む一連の処理を受ける。ただし、これらの修飾は、インスリンＢ鎖及びＡ鎖以外の配列に発生する。また、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、その構造を安定させるようにＣＨＯ細胞のオルガネラでジスルフィド結合を形成する。
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞により発酵・分泌され、融合タンパク質がＣＨＯ細胞中で転写及び翻訳された後、プロリンのヒドロキシ化、Ｏ糖、Ｎ糖、Ｃ末端のリジン欠失などの翻訳後の修飾を含む一連の処理を受ける。ただし、これらの修飾は、インスリンＢ鎖及びＡ鎖以外の配列に発生する。また、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、その構造を安定させるようにＣＨＯ細胞のオルガネラでジスルフィド結合を形成する。
【0082】
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のジスルフィド結合は、２つのシステイン（Ｃｙｓ）の残基間に生じる。そのジスルフィド結合は、位置によって、インスリンに存在する部分と、Ｆｃに存在する部分との２つの部分に分けられる。インスリンのジスルフィド結合は、Ｂ鎖とＡ鎖にあり、Ｎ末端からＣ末端までの順でＢ鎖とＡ鎖のアミノ酸を位置（Ｘ）として表す場合、それぞれＢＸとＡＸである。いくつかの実施例においては、ジスルフィド結合は、ＣｙｓＡ７－ＣｙｓＢ７、ＣｙｓＡ２０－ＣｙｓＢ１９、ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ１１である。Ｆｃ領域は、同じアミノ酸配列を有する２つの単鎖から構成される。いくつかの実施例においては、各単鎖において２対のジスルフィド結合があり、２つの単鎖の間に２対の鎖間ジスルフィド結合があり、Ｆｃに合計６対のジスルフィド結合がある。
【0083】
ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦは、生体高分子の構造を分析するための通常の機器であり、主な機能モジュールとしてＵＰＬＣとＱＴＯＦを含む。ＵＰＬＣにより分離された後の試料が溶液の状態でイオン源に入ってイオン化され、電荷イオンになり、加速電場の作用の下で、質量分析器ＱＴＯＦに入り、電場及び磁場の作用下で、トリプル四重極（Ｑ）及び飛行時間型質量分析（ＴＯＦ）の２つの質量分析器により様々なイオンのｍ／ｚが捕捉され、ソフトウェアの計算により正確な分子量を算出し、そして複雑な生体高分子タンパク質の構造解析を実現する。本発明では、融合タンパク質を分析するための手段として、高分解能、高感度を有する一般的に使用される装置法であるＵＰＬＣ－ＱＴＯＦを採用し、融合タンパク質の脱糖及び脱糖還元分子量、ジスルフィド結合及びジスルフィド結合ミスマッチ率を分析して特徴付けた。
【0084】
その結果、いくつかの実施例におけるインスリン－Ｆｃ融合タンパク質は、分子量及びジスルフィド結合が理論と一致しており、ミスマッチ率が低く、プロリンのヒドロキシ化、Ｏグリコシル化、Ｎグリコシル化、Ｃ末端のリジン欠失などの翻訳後の修飾が存在することが示される。
【実施例】
【0085】
実施例１：インスリン前駆体融合タンパク質の発現ベクターの構築
本実施例にはインスリン前駆体融合タンパク質の分子構築方法を説明する。本明細書では、インスリン前駆体融合タンパク質はインスリン融合タンパク質とも呼ばれることがある。このインスリン前駆体融合タンパク質は、分子形態がｐｒｏＩＮＳ－Ｌ－Ｆｃであり、酵母又は真核細胞（ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３など）で分泌及び発現されることができ、発現したタンパク質がホモ二量体の形で存在する。タンパク質の分泌及び発現を促進するために、シグナルペプチド及び／又はプロペプチドをタンパク質のＮ末端に付加することができる。シグナルペプチドには、以下の表１に示される配列が含まれるが、これらに限定されない。
本実施例にはインスリン前駆体融合タンパク質の分子構築方法を説明する。本明細書では、インスリン前駆体融合タンパク質はインスリン融合タンパク質とも呼ばれることがある。このインスリン前駆体融合タンパク質は、分子形態がｐｒｏＩＮＳ－Ｌ－Ｆｃであり、酵母又は真核細胞（ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３など）で分泌及び発現されることができ、発現したタンパク質がホモ二量体の形で存在する。タンパク質の分泌及び発現を促進するために、シグナルペプチド及び／又はプロペプチドをタンパク質のＮ末端に付加することができる。シグナルペプチドには、以下の表１に示される配列が含まれるが、これらに限定されない。
【0086】
【表1】
【0087】
ｐｒｏＩＮＳは、ヒト又は他に由来する天然のインスリン前駆体又はその類似体を指す。前記類似体には、例えば、Ａ１４Ｅ＼Ｂ１６Ｅ＼Ｂ２５Ｈ＼ｄｅｓＢ３０変異体、Ａ１４Ｅ＼Ｂ１６Ｈ＼Ｂ２５Ｈ＼ｄｅｓＢ３０変異体又はＡ１４Ｅ＼ｄｅｓＢ３０変異体などの、挿入、欠失、短縮又は変異されたインスリン前駆体が含まれる。前記類似体は、例えば、インスリンの免疫原性を低下させるか、プロテアーゼ分解を低下させてインスリンの安定性を高めるか、又はインスリンとインスリン受容体（ＩＲ）との親和性を低下させて生体内半減期を延長する目的として用いられる。
【0088】
本実施例のインスリン前駆体は、Ｋｅｘ２や、Ｆｕｒｉｎ、トリプシンなどのプロテアーゼにより成熟インスリンに処理されることができる。本実施例のインスリン前駆体は、最適化されたＣペプチドによってタンパク質の正しい折り畳みと処理を促進することもできる。本実施例で選択されるインスリン前駆体類似体には、以下の表３に示されるものが含まれるが、これらに限定されない。
【0089】
【表2】
【0090】
Ｌは、ｐｒｏＩＮＳとＦｃとの間のリンカーを表し、０から任意の長さまでのアミノ酸で構成することができ、柔軟性ポリペプチドであってもよく、剛性ポリペプチドであってもよい。Ｌは、Ｆｃのホモ二量体に結合した２つのインスリン分子がそれぞれに正しい空間構造を形成するのに寄与することができる。好ましくは、前記Ｌの配列には、表４、表５に示される配列が含まれるが、これらに限定されない。
【0091】
【表3】
【0092】
【表4】
【0093】
Ｆｃは、ヒトＩｇＧであることが好ましく、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性のないヒトＩｇＧ及びその変異体、例えばＩｇＧ２及びＩＧｇ４であることがより好ましく、変異された半減期が延長されたヒトＩｇＧであることが特に好ましい。Ｆｃは、Ｆｃの断片又はＦｃと他のタンパク質／タンパク質の断片との融合であってもよい。本発明により選択されるＦｃには、以下の配列が含まれるが、これらに限定されない。
【0094】
Ｆｃ１：ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号３６）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号３６）
【0095】
Ｆｃ２：ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、Ｔ２５０Ｑ／Ｐ３３１Ｓ／Ｍ４２８Ｌ
ＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３７）
ＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３７）
【0096】
Ｆｃ３：ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ、Ｓ２２８Ｐ
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号３８）
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号３８）
【0097】
Ｆｃ４：ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、Ｔ２５０Ｑ／ Ｎ２９７Ａ／Ｐ３３１Ｓ／Ｍ４２８Ｌ
ＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３９）
ＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３９）
【0098】
Ｆｃ５：ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｎ２９７Ａ
ＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４０）
ＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４０）
【0099】
Ｆｃ６：ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ、Ｎ２９７Ａ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ
ＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４１）
ＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４１）
【0100】
Ｆｃ７：ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号４２）
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号４２）
【0101】
Ｆｃ８：ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ、Ｓ２２８Ｐ／Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｎ２９７Ａ
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号４３）
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号４３）
【0102】
Ｆｃ９：ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ、Ｓ２２８Ｐ／Ｎ２９７Ａ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号４４）
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号４４）
【0103】
Ｆｃ１５：ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号４５）
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号４５）
【0104】
Ｆｃ１６：ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ
ＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４６）
ＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４６）
【0105】
本発明により構築された一部のインスリン前駆体融合タンパク質のアミノ酸配列の特徴を表６に示す。
【0106】
【表5】
【0107】
インスリン前駆体融合タンパク質は、Ｋｅｘ２、Ｆｕｒｉｎ、トリプシンなどのプロテアーゼにより処理してＣペプチドなどの配列を除去し、成熟インスリン融合タンパク質に変換することができる。本出願のすべての実施例においては、酵素切断処理後のタンパク質の名前は、前駆体タンパク質の名称の末端に文字Ｍ（ｍａｔｕｒｅ）を追加したものである。例えば、インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００２がプロテアーゼＫｅｘ２により処理された後、成熟タンパク質がＳＳ３０２－００２Ｍと命名される。本発明で記載されているいくつかのインスリン前駆体融合タンパク質がプロテアーゼにより処理されて得られた成熟インスリン融合タンパク質のアミノ酸配列は以下の通りである。
【0108】
ＳＳ３０２－００１Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号７３）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７４）。
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号７３）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７４）。
【0109】
ＳＳ３０２－００２Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号７５）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ２：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７６）
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号７５）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ２：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７６）
【0110】
ＳＳ３０２－００３Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号７７）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ３：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号７８）
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号７７）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ３：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号７８）
【0111】
ＳＳ３０２－００４Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号７９）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ２：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８０）
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号７９）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ２：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８０）
【0112】
ＳＳ３０２－００５Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号８１）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ４：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８２）
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号８１）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ４：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８２）
【0113】
ＳＳ３０２－００６Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号８３）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１６：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＳＡＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８４）
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号８３）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１６：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＳＡＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８４）
【0114】
ＳＳ３０２－００７Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号８５）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１６：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８６）
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号８５）
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【0115】
ＳＳ３０２－００８Ｍ
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Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号８７）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１６：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＳＡＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８８）
【0116】
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Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１６：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９０）
【0117】
ＳＳ３０２－０１１Ｍ
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Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１６：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９２）
【0118】
ＳＳ３０２－０１２Ｍ
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【0119】
ＳＳ３０２－０１３Ｍ
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Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１６：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９６）。
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号９５）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１６：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９６）。
【0120】
ＳＳ３０２－０１４Ｍ
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【0121】
ＳＳ３０２－０１５Ｍ
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【0122】
ＳＳ３０２－０１６Ｍ
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【0123】
ＳＳ３０２－０１７Ｍ
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ＳＳ３０２－０１９Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号１０７）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ７：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１０８）。
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号１０７）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ７：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１０８）。
【0126】
ＳＳ３０２－０２２Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＫＲＩＫＲ（配列番号１０９）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１６：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１１０）
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＫＲＩＫＲ（配列番号１０９）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１６：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１１０）
【0127】
ＳＳ３０２－０２３Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＤＤＤＤＫ（配列番号１１１）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１６：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１１２）
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＤＤＤＤＫ（配列番号１１１）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１６：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１１２）
【0128】
ＳＳ３０２－０２９Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号１１３）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ８：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１１４）
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号１１３）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ８：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１１４）
【0129】
ＳＳ３０２－０３０Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号１１５）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ９：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１１６）
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号１１５）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ９：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１１６）
【0130】
ＳＳ３０２－０３５Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＨＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫＲ（配列番号１１７）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１５：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１１８）
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＨＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫＲ（配列番号１１７）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１５：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１１８）
【0131】
ＳＳ３０２－０３６Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫＲ（配列番号１１９）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１５：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１２０）
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫＲ（配列番号１１９）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１５：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１２０）
【0132】
ＳＳ３０２－０３７Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＲ（配列番号１２１）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１５：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１２２）
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＲ（配列番号１２１）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１５：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１２２）
【0133】
ＳＳ３０２－０３８Ｍ
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号１２３）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１５：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１２４）
Ｂ鎖：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲ（配列番号１２３）
Ａ鎖－Ｌ－Ｆｃ１５：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１２４）
【0134】
「分子クローニング実験手引き（第三版）」に記載されている方法に従って、インスリン前駆体融合タンパク質の発現ベクターを構築した。
【0135】
各インスリン前駆体融合タンパク質の配列は、ＣＨＯ細胞のコドンバイアスに従ってコドンを最適化された。
【0136】
最適化されたＤＮＡ配列の全ゲノムを合成した後、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位を介して真核発現ベクターｐＦＲＬ３．０又はｐＴＳ１にクローニングした。ｐＦＲＬ３．０ベクターは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＤＨＦＲ）の遺伝子を含み、ＤＨＦＲと目的遺伝子の共増幅によりタンパク質の高レベル発現を実現することができ、このベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクションした後、ＭＴＸ加圧スクリーニングにより安定発現細胞系を構築する。ｐＴＳ１は、一過性トランスフェクションプラスミドであり、加圧スクリーニングのマーカーを含まず、初期の分子同定のために少量のインスリン前駆体融合タンパク質を迅速に得ることができる。インスリン前駆体融合タンパク質の発現ベクターの概略図を図１Ａ及び１Ｂに示す。
【0137】
実施例２：インスリン融合タンパク質の発現
１．一過性トランスフェクションによる目的タンパク質の調製
実施例１で調製したインスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質を部分的に発現したプラスミドをヒト胎児腎細胞ＨＥＫ－２９３に導入し、目的タンパク質を一過性に発現させた。ＨＥＫ－２９３細胞を蘇生させ、細胞培養振とうフラスコに入れて継代培養し、継代播種の密度を１．０×１０６細胞／ｍＬとし、培地をＯＰＭ－２９３ ＣＤ０５ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＯＰＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）とし、培養条件を３７℃、１２０ｒｐｍ、ＣＯ２とし、２日おきに継代し、１週間培養後に一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの当日に細胞密度が４．０×１０６細胞／ｍｌ程度になるように、トランスフェクション前に細胞密度を調整した。ＦｅｃｔｏＰＲＯキット（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いてプラスミドをＨＥＫ－２９３細胞に一過性トランスフェクションした。ここでは、ＤＮＡとＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔの比率を１：１（μｇ／μＬ）とし、細胞１ミリリットルあたり１μｇのＤＮＡをトランスフェクションし、１μＬのＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔに相当した。プラスミドを一過性トランスフェクションの総体積１０％の室温Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で希釈し、振とう混合した。プラスミド希釈液をＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔの遠心管に一括的に添加し、直ちに混合し、室温で１０分間インキュベートした。調製したプラスミドとトランスフェクション試薬の混合物を、調整したＨＥＫ－２９３細胞懸濁液に一括的に添加し、混合し、細胞培養振とうフラスコをインキュベーターに入れ、温度３７℃、５％ＣＯ２、シェーカー速度１２０ｒｐｍとした培養条件下で、培養を行った。細胞を４時間トランスフェクション培養した後、Ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）Ｂｏｏｓｔｅｒを添加し、細胞１ミリリットルあたり０．５μＬを添加した。２４時間培養後、培養条件を温度３１℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ発酵培養に変更し、３～５日間培養し、細胞生存能力が９０％未満である際、遠心分離して上清（３０００ｒｐｍ）を回収し、発現量を検出し、次の精製を行い、目的タンパク質を得た。
１．一過性トランスフェクションによる目的タンパク質の調製
実施例１で調製したインスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質を部分的に発現したプラスミドをヒト胎児腎細胞ＨＥＫ－２９３に導入し、目的タンパク質を一過性に発現させた。ＨＥＫ－２９３細胞を蘇生させ、細胞培養振とうフラスコに入れて継代培養し、継代播種の密度を１．０×１０６細胞／ｍＬとし、培地をＯＰＭ－２９３ ＣＤ０５ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＯＰＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）とし、培養条件を３７℃、１２０ｒｐｍ、ＣＯ２とし、２日おきに継代し、１週間培養後に一過性トランスフェクションに使用した。トランスフェクションの当日に細胞密度が４．０×１０６細胞／ｍｌ程度になるように、トランスフェクション前に細胞密度を調整した。ＦｅｃｔｏＰＲＯキット（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いてプラスミドをＨＥＫ－２９３細胞に一過性トランスフェクションした。ここでは、ＤＮＡとＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔの比率を１：１（μｇ／μＬ）とし、細胞１ミリリットルあたり１μｇのＤＮＡをトランスフェクションし、１μＬのＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔに相当した。プラスミドを一過性トランスフェクションの総体積１０％の室温Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で希釈し、振とう混合した。プラスミド希釈液をＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔの遠心管に一括的に添加し、直ちに混合し、室温で１０分間インキュベートした。調製したプラスミドとトランスフェクション試薬の混合物を、調整したＨＥＫ－２９３細胞懸濁液に一括的に添加し、混合し、細胞培養振とうフラスコをインキュベーターに入れ、温度３７℃、５％ＣＯ２、シェーカー速度１２０ｒｐｍとした培養条件下で、培養を行った。細胞を４時間トランスフェクション培養した後、Ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ＦｅｃｔｏＰＲＯ（登録商標）Ｂｏｏｓｔｅｒを添加し、細胞１ミリリットルあたり０．５μＬを添加した。２４時間培養後、培養条件を温度３１℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ発酵培養に変更し、３～５日間培養し、細胞生存能力が９０％未満である際、遠心分離して上清（３０００ｒｐｍ）を回収し、発現量を検出し、次の精製を行い、目的タンパク質を得た。
【0138】
２．安定発現細胞株のトランスフェクション及び高発現細胞株のスクリーニング
実施例１で調製したインスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質を部分的に発現したプラスミドをチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ ＤＧ４４）（インビトロジェン ）に導入し、安定発現細胞系を構築し、そこから高収量の細胞株をスクリーニングして流加培養して目的タンパク質を調製した。
実施例１で調製したインスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質を部分的に発現したプラスミドをチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ ＤＧ４４）（インビトロジェン ）に導入し、安定発現細胞系を構築し、そこから高収量の細胞株をスクリーニングして流加培養して目的タンパク質を調製した。
【0139】
完全培地で宿主細胞ＤＧ４４を蘇生して培養した。完全培地の組成をＣＤＭ１Ｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＯＰＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）に１％ＨＴ（インビトロジェン）を加えたものとし、培養条件を３７℃、５％ＣＯ２とし、シェーカー速度を１２０ｒｐｍとした。毎日一定量の細胞懸濁液を無菌的に吸引してカウントし、細胞密度が３×１０６～４×１０６細胞／ｍＬに達した時点で継代培養を行い、継代後の細胞の初期密度を１×１０６細胞／ｍＬ程度に維持した。細胞の総量がトランスフェクション要件を満たしたら、細胞を収集してコトランスフェクション試験を行った。Ｂｉｏ－Ｒａｄエレクトロポレーション装置を用い、エレクトロポレーションに４ｍｍのエレクトロポレーションカップを選択し、電圧が２９０Ｖ、パルス長さが２０ミリ秒、エレクトロポレーションの回数が１回であった具体的なエレクトロポレーションパラメータにした電気穿孔法で、宿主細胞（ＣＨＯ ＤＧ４４）にトランスフェクションした。毎回のエレクトロポレーションで、１×１０７細胞、プラスミド４０μｇ、総体積０．８ｍＬとした。エレクトロポレーション後、細胞を１５ｍＬの回復培地（ＣＤＭ１Ｎ＋１％ＨＴ）に移し、細胞培養皿で４８時間静置培養した。４８時間後、細胞を遠心分離してスクリーニング培地（ＣＤＭ１Ｎ＋１００ｎＭ ＭＴＸ）に再懸濁し、細胞を１×１０４細胞／ｍＬ程度に希釈し、細胞希釈液を１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、細胞をインキュベーターに置いて静置培養し、培養温度３７℃、５％ＣＯ２とした。細胞を５日間培養した後、５０μＬのスクリーニング培地を追加し、クローンコンフルエンスが８０％以上に達した時点で、ドットブロッティング（Ｄｏｔ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により発現量を分析し、抗体をヤギ抗ヒトＩｇＧＨＲＰ標識抗体とし、発現量の高いクローンをスクリーニングし、発現量の高いクローンを９６ウェルプレートから２４ウェルに移して培養を継続し、１ｍＬのスクリーニング培地を追加した。同様の方法を用いて１２ウェルプレートと１０ｃｍ細胞培養皿で高収量クローンのスクリーニングと増幅を行った。
【0140】
融合タンパク質の収量を高めるために、ＭＴＸ濃度を増加する加圧法を用いて細胞を培養した。ＭＴＸによるＤＨＦＲ遺伝子の阻害により、ＤＨＦＲ遺伝子と融合タンパク質遺伝子の共増幅を実現した。スクリーニングプロセスは、当業者に公知の方法を採用し、詳細は、１．楊薇，王迪，陳克清等．プラスミド電気穿孔法トランスフェクション条件の選択［Ｊ］．華中科技大学学報，２００９，３８（６）：８５８－８６０．；２．谷欣，黎燕．哺乳類動物細胞ＤＧ４４－ＣＨＯをコトランスフェクションする方法の検討［Ｊ］．生物技術通信，２００８，１９（１）：８７；３．Ｊｕｎ，Ｋｉｍ，Ｂａｉｋ，Ｈｗａｎｇ，Ｌｅｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，６９（２）：１６２－１６９．１０．１００７／ｓ００２５３－００５－１９７２－８に参考されたい。
【0141】
１０ｃｍの細胞培養皿中のクローンプールをスクリーニングした後、高収量のクローンを細胞培養振とうフラスコに移して、培養温度３７℃、５％ＣＯ２、シェーカー速度１２０ｒｐｍで培養した。高収量の細胞クローンが一定数に成長した後、一部の細胞を収集して凍結保存し、残りの細胞を流加培養した。バッチで基質を供給する際、播種密度を１×１０６細胞／ｍｌとし、細胞を細胞培養振とうフラスコで培養温度３７℃、５％ＣＯ２、シェーカー速度１２０ｒｐｍで培養した。播種後、毎日サンプリングしてカウントし、細胞密度と生存能力を記録した。培養３日目から補充を開始し、１日１回補充した。３～８日目、補充量がそれぞれ初期体積の２％、３％、４％、３％、３％、３％で、９日目以降の補充量が２％であり、総補充量の割合が２０％～３０％であった。１日１回グルコースを補充し、培養系内のグルコース濃度を３～４ｇ／Ｌに維持した。培養期間を１２～１４日とし、培養終了後、遠心分離（３０００ｒｐｍ）により上清を回収し、発現量を検出し、目的タンパク質を得るために次の精製を行った。
【0142】
実施例３：インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の精製
１．インスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質の捕捉
実施例２で発現された各インスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質（ＳＳ３０２－００２、ＳＳ３０２－００４、ＳＳ３０２－００５、ＳＳ３０２－００８、ＳＳ３０２－０１２、ＳＳ３０２－０１４、ＳＳ３０２－０１５、ＳＳ３０２－０１９、ＳＳ３０２－０２９、ＳＳ３０２－０３０、ＳＳ３０２－０３５）の細胞発酵ブロスを遠心分離し、０．２２μｍのフィルターを通してろ過して細胞破片を除去した後、アフィニティークロマトグラフィーにより捕捉した。ボルグロンｐｒｏｔｅｉｎＡをアフィニティ媒体として、ベースラインが安定するまで、カラム体積の３～５倍の緩衝液（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４－クエン酸、ｐＨ７．５）でｐｒｏｔｅｉｎＡクロマトカラムを平衡化し、処理された発酵ブロスの上清をロードし（ロード量３～８ｇ／Ｌ）、ロードした後、不純物タンパク質を洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１．５ＭのＮａＣｌ、２ＭのＵｒｅａ、ｐＨ７．５）でベースラインまで洗浄し、最後に２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４－クエン酸、０．４ＭのＡｒｇ、ｐＨ３．５の溶出緩衝液で溶出し、紫外線検出器の読み取りに従って段階的に収集した。収集は、ＵＶ２８０ｎｍ吸収値が０．１５ＡＵよりも高くなった時に開始し、０．２０ＡＵよりも低くなった時に停止した。収集したサンプルをすぐに２．０ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液に加え、ゆっくり攪拌し、サンプルをｐＨ６．５～７．０に調整した。サンプルを－８０℃で保存し、その後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図２）及び構造同定（実施例４を参照のこと）を行った。
１．インスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質の捕捉
実施例２で発現された各インスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質（ＳＳ３０２－００２、ＳＳ３０２－００４、ＳＳ３０２－００５、ＳＳ３０２－００８、ＳＳ３０２－０１２、ＳＳ３０２－０１４、ＳＳ３０２－０１５、ＳＳ３０２－０１９、ＳＳ３０２－０２９、ＳＳ３０２－０３０、ＳＳ３０２－０３５）の細胞発酵ブロスを遠心分離し、０．２２μｍのフィルターを通してろ過して細胞破片を除去した後、アフィニティークロマトグラフィーにより捕捉した。ボルグロンｐｒｏｔｅｉｎＡをアフィニティ媒体として、ベースラインが安定するまで、カラム体積の３～５倍の緩衝液（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４－クエン酸、ｐＨ７．５）でｐｒｏｔｅｉｎＡクロマトカラムを平衡化し、処理された発酵ブロスの上清をロードし（ロード量３～８ｇ／Ｌ）、ロードした後、不純物タンパク質を洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１．５ＭのＮａＣｌ、２ＭのＵｒｅａ、ｐＨ７．５）でベースラインまで洗浄し、最後に２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４－クエン酸、０．４ＭのＡｒｇ、ｐＨ３．５の溶出緩衝液で溶出し、紫外線検出器の読み取りに従って段階的に収集した。収集は、ＵＶ２８０ｎｍ吸収値が０．１５ＡＵよりも高くなった時に開始し、０．２０ＡＵよりも低くなった時に停止した。収集したサンプルをすぐに２．０ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液に加え、ゆっくり攪拌し、サンプルをｐＨ６．５～７．０に調整した。サンプルを－８０℃で保存し、その後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図２）及び構造同定（実施例４を参照のこと）を行った。
【0143】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図２に示す。ここでは、ロードはクロマトグラフィーにロードしたサンプルを表し、ＦＴはフロースルーサンプル（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇ時間）を表し、ｗａｓｈはリンスサンプルを表し、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３などはクロマトグラフィープロセスに段階的に収集した目的タンパク質のサンプルを表し、「Ｐ合」は段階的に収集したサンプルを収集体積の体積比に従って合併したサンプルを表し、ＮａＯＨはカラム洗浄から収集したサンプルを表し、ＤＴＴは還元後の目的タンパク質を表し、Ｍは分子量マーカー（ｍａｋｅｒ）を表し、Ａ：ＳＳ３０２－００２、Ｂ：ＳＳ３０２－００４、Ｃ：ＳＳ３０２－００５、Ｄ：ＳＳ３０２－００８、Ｅ：ＳＳ３０２－０１４、Ｆ：ＳＳ３０２－０１９、Ｇ：ＳＳ３０２－０３０、Ｈ：ＳＳ３０２－０１２、Ｉ：ＳＳ３０２－０１５、Ｊ：ＳＳ３０２－０２９、Ｋ：ＳＳ３０２－０３５。図２から分かるように、ＳＳ３０２－００２タンパク質には明らかな上部バンド（約１３０ＫＤ）と下部バンド（９５と１３０ＫＤとの間）があり、高分子量の形態（＞１７０ＫＤ）が存在する。純度が９０％を超える上部バンド（１３０ＫＤ）の収率は約６０％であった。ＳＳ３０２－００４タンパク質は明らかな上部バンド（９５～１３０ＫＤ）と下部バンド（約９５ＫＤ）を有する。その中の下部バンドＰ１～４の合併サンプルと上部バンドＰ１３～１５の合併サンプルをそれぞれ構造同定のために質量分析に供した（実施例４）。この分子は、捕捉タンパク質中の大部分が９５ＫＤの下部バンドであり、９５と１３０ＫＤとの間で純度が９０％を超える上部バンドが捕捉されたタンパク質中の収率が低かった（１５％程度）。ＳＳ３０２－００５タンパク質は７２～９５ＫＤの間で、電気泳動バンドが広く拡散状を呈している。以上の分子は、共通の特徴としてＧＳ柔軟性リンカーを含むが、ＳＳ３０２－００８、ＳＳ３０２－０１２、ＳＳ３０２－０１５などの他の分子は、基本的に単一のバンドであり、これらの分子の共通の特徴としてＣＴＰ、Ｃ１などの剛性リンカーを含む。さらに、質量分析の同定結果（実施例４を参照のこと）から示されるように、柔軟性リンカー（例えば、ＧＳ）を含むインスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質のジスルフィド結合は、一定のミスマッチ率を有し、正しいバンドの回収率が低かったが、柔軟性リンカー（例えば、ＧＳ）を含むインスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質に対する剛性リンカーを含むインスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質のジスルフィド結合は、ミスマッチが低く、得られたタンパク質中の正しく折り畳まれたインスリン前駆体タンパク質の含有量が比較的に高かった。
【0144】
２．インスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質の酵素切断
ステップ１で捕捉されたタンパク質をＧ２５、緩衝液５０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０を使用して液交換を行い、液交換後、各タンパク質に対してＫｅｘ２でＣペプチドを酵素切断してインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を得た。なお、ＳＳ３０２－００２及びＳＳ３０２－００４の酵素切断の条件は：タンパク質の最終濃度１ｍｇ／ｍＬ、フィード比（質量比）２００：１（前駆体：Ｋｅｘ２）、ＣａＣｌ２最終濃度２０ｍＭ／Ｌ、総反応体積５ｍＬ及び３ｍＬ、３７℃水浴６時間酵素切断とした。ＳＳ３０２－００８、ＳＳ３０２－０１２の３つのタンパク質の酵素切断の条件は：タンパク質最終濃度１ｍｇ／ｍＬ、フィード比（質量比）５０：１（前駆体：Ｋｅｘ２）、ＣａＣｌ２最終濃度２０ｍＭ／Ｌ、総反応体積１９０ｍＬ、３７℃水浴６時間反応とした。ＳＳ３０２－０１４、ＳＳ３０２－０１５、ＳＳ３０２－０１９、ＳＳ３０２－０２９、ＳＳ３０２－０３０、ＳＳ３０２－０３５の酵素切断の条件は、タンパク質最終濃度１ｍｇ／ｍＬ、フィード比（質量比）１：２５（Ｋｅｘ２：前駆体）、ＣａＣｌ２最終濃度２０ｍＭ／Ｌ、総反応体積６０～１８０ｍＬ（異なるタンパク質の反応体積はわずかに異なる）、３７℃水浴６時間とした。各インスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質酵素の切断後のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質はＳ３０２－００２Ｍ、ＳＳ３０２－００４Ｍ、ＳＳ３０２－００５Ｍ、ＳＳ３０２－００８Ｍ、ＳＳ３０２－０１２Ｍ、ＳＳ３０２－０１４Ｍ、ＳＳ３０２－０１５Ｍ、ＳＳ３０２－０１９Ｍ、ＳＳ３０２－０２９Ｍ、ＳＳ３０２－０３０Ｍ、及びＳＳ３０２－０３５Ｍと命名された。
ステップ１で捕捉されたタンパク質をＧ２５、緩衝液５０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０を使用して液交換を行い、液交換後、各タンパク質に対してＫｅｘ２でＣペプチドを酵素切断してインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を得た。なお、ＳＳ３０２－００２及びＳＳ３０２－００４の酵素切断の条件は：タンパク質の最終濃度１ｍｇ／ｍＬ、フィード比（質量比）２００：１（前駆体：Ｋｅｘ２）、ＣａＣｌ２最終濃度２０ｍＭ／Ｌ、総反応体積５ｍＬ及び３ｍＬ、３７℃水浴６時間酵素切断とした。ＳＳ３０２－００８、ＳＳ３０２－０１２の３つのタンパク質の酵素切断の条件は：タンパク質最終濃度１ｍｇ／ｍＬ、フィード比（質量比）５０：１（前駆体：Ｋｅｘ２）、ＣａＣｌ２最終濃度２０ｍＭ／Ｌ、総反応体積１９０ｍＬ、３７℃水浴６時間反応とした。ＳＳ３０２－０１４、ＳＳ３０２－０１５、ＳＳ３０２－０１９、ＳＳ３０２－０２９、ＳＳ３０２－０３０、ＳＳ３０２－０３５の酵素切断の条件は、タンパク質最終濃度１ｍｇ／ｍＬ、フィード比（質量比）１：２５（Ｋｅｘ２：前駆体）、ＣａＣｌ２最終濃度２０ｍＭ／Ｌ、総反応体積６０～１８０ｍＬ（異なるタンパク質の反応体積はわずかに異なる）、３７℃水浴６時間とした。各インスリン前駆体－Ｆｃ融合タンパク質酵素の切断後のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質はＳ３０２－００２Ｍ、ＳＳ３０２－００４Ｍ、ＳＳ３０２－００５Ｍ、ＳＳ３０２－００８Ｍ、ＳＳ３０２－０１２Ｍ、ＳＳ３０２－０１４Ｍ、ＳＳ３０２－０１５Ｍ、ＳＳ３０２－０１９Ｍ、ＳＳ３０２－０２９Ｍ、ＳＳ３０２－０３０Ｍ、及びＳＳ３０２－０３５Ｍと命名された。
【0145】
３．酵素切断後のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の精製
プロテアーゼ及び反応後の不純物を除去し、より純度が高く正しく折り畳まれたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を得るために、ＳＳ３０２－００４Ｍ及びＳＳ３０２－００５Ｍを酵素で切断した後に１０ＫＤ限外ろ過チューブを用いてプロテアーゼ及び他の不純物を除去し、純度の高いインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を得た。ＳＳ３０２－００８Ｍ、ＳＳ３０２－０１２Ｍ、ＳＳ３０２－０１４Ｍ、ＳＳ３０２－０１５Ｍ、ＳＳ３０２－０２９Ｍ、ＳＳ３０２－０３０Ｍを酵素で切断した後に疎水性クロマトグラフィーを用いて不純物を除去した。３～５倍のカラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ、１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．５緩衝液で疎水性クロマトグラフィー媒体Ｂｕｔｙｌ ＨＰ（ボルグロン）を平衡化し、平衡化が完成した後に試料注入を開始し（注入量３～８ｇ／Ｌ）、試料注入後、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５緩衝液で直線的に溶出し（０～１００％、２０倍のカラム体積）、紫外線検出器の読み取りに従って段階的に収集し、サンプリングして検出した。ＳＳ３０２－０１９Ｍ、ＳＳ３０２－０３５Ｍを酵素で切断した後に２段階に分けて不純物を除去し、第１ステップでは陰イオンクロマトグラフィーを採用し、３～５倍のカラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５緩衝液を用いて陰イオンクロマトグラフィー媒体Ｑ ＨＰ（ボルグロン）を平衡化し、平衡化が完成した後に試料注入を開始し（注入量５ｇ／Ｌ）、試料注入後、２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５緩衝液を用いて３ｍｌ／ｍｉｎの流速で０～６０％Ｂ １５ＣＶ直線的に溶出し、紫外線検出器の読み取りに従って段階的に収集し（上記と同じの方法）、サンプリングして検出し、純度の高いほうのサンプルを併用して次の疎水性クロマトグラフィーに供した。３～５倍のカラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０緩衝液を用いて疎水性クロマトグラフィー媒体Ｂｕｔｙｌ ＨＰ（ボルグロン）を平衡化し、平衡化が完了した後に試料注入を開始し、注入量を３～８ｇ／Ｌとし、試料注入後、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０緩衝液を用いて１ｍｌ／ｍｉｎの流速で０～１００％Ｂ １５ＣＶ直線的に溶出し、紫外線検出器の読み取りに従って段階的に収集し（上記と同じの方法）、サンプリングして構造分析し、ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦを用いてその分子量とジスルフィド結合を特徴付けた。詳細については実施例４を参照のこと。
プロテアーゼ及び反応後の不純物を除去し、より純度が高く正しく折り畳まれたインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を得るために、ＳＳ３０２－００４Ｍ及びＳＳ３０２－００５Ｍを酵素で切断した後に１０ＫＤ限外ろ過チューブを用いてプロテアーゼ及び他の不純物を除去し、純度の高いインスリン－Ｆｃ融合タンパク質を得た。ＳＳ３０２－００８Ｍ、ＳＳ３０２－０１２Ｍ、ＳＳ３０２－０１４Ｍ、ＳＳ３０２－０１５Ｍ、ＳＳ３０２－０２９Ｍ、ＳＳ３０２－０３０Ｍを酵素で切断した後に疎水性クロマトグラフィーを用いて不純物を除去した。３～５倍のカラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ、１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．５緩衝液で疎水性クロマトグラフィー媒体Ｂｕｔｙｌ ＨＰ（ボルグロン）を平衡化し、平衡化が完成した後に試料注入を開始し（注入量３～８ｇ／Ｌ）、試料注入後、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５緩衝液で直線的に溶出し（０～１００％、２０倍のカラム体積）、紫外線検出器の読み取りに従って段階的に収集し、サンプリングして検出した。ＳＳ３０２－０１９Ｍ、ＳＳ３０２－０３５Ｍを酵素で切断した後に２段階に分けて不純物を除去し、第１ステップでは陰イオンクロマトグラフィーを採用し、３～５倍のカラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５緩衝液を用いて陰イオンクロマトグラフィー媒体Ｑ ＨＰ（ボルグロン）を平衡化し、平衡化が完成した後に試料注入を開始し（注入量５ｇ／Ｌ）、試料注入後、２０ｍＭのＴｒｉｓ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５緩衝液を用いて３ｍｌ／ｍｉｎの流速で０～６０％Ｂ １５ＣＶ直線的に溶出し、紫外線検出器の読み取りに従って段階的に収集し（上記と同じの方法）、サンプリングして検出し、純度の高いほうのサンプルを併用して次の疎水性クロマトグラフィーに供した。３～５倍のカラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０緩衝液を用いて疎水性クロマトグラフィー媒体Ｂｕｔｙｌ ＨＰ（ボルグロン）を平衡化し、平衡化が完了した後に試料注入を開始し、注入量を３～８ｇ／Ｌとし、試料注入後、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０緩衝液を用いて１ｍｌ／ｍｉｎの流速で０～１００％Ｂ １５ＣＶ直線的に溶出し、紫外線検出器の読み取りに従って段階的に収集し（上記と同じの方法）、サンプリングして構造分析し、ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦを用いてその分子量とジスルフィド結合を特徴付けた。詳細については実施例４を参照のこと。
【0146】
実施例４：融合タンパク質の分子構造の解析
インスリン融合タンパク質前駆体の構造はｐｒｏＩＮＳ－Ｌ－Ｆｃであり、ｐｒｏＩＮＳはヒトインスリン前駆体（Ｂ－Ｃ－Ａを含む）、Ｌはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）であり、その概略図を図３Ａに示す。インスリン融合タンパク質前駆体は酵素加水分解されると、インスリン（Ｂ－Ａ）－Ｌ－Ｆｃ構造の成熟タンパク質を形成し、その概略図を図３Ｂに示す。インスリン融合タンパク質に用いられるリンカーには、柔軟性リンカー（例えば、ＧＳ）又は剛性リンカー（例えば、ＣＴＰ、Ｃ１）がある。ＣＨＯ細胞で発酵すると、プロペプチド、剛性リンカー（例えば、ＣＴＰ、Ｃ１）におけるＳ及びＴにはＯグリコシル化を生じる可能性があり、Ｃ１のようなリンカーにおけるＰにはプロリンのヒドロキシ化を生じる可能性があり、ＧＳのような柔軟性リンカーには翻訳後の修飾をほとんど生じない。この構造の解析では、ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦを採用してその分子量とジスルフィド結合を特徴付けた。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質分子（糖修飾を含有する）を脱糖して脱糖還元し後、分析に容易な無糖の修飾分子を得た。ＳＳ３０２－００２（約１３０ＫＤ）、ＳＳ３０２－００２（９５と１３０ＫＤとの間）、ＳＳ３０２－００８、ＳＳ３０２－００８Ｍ、ＳＳ３０２－０１２、ＳＳ３０２－０１２Ｍ、ＳＳ３０２－０１４、ＳＳ３０２－０１４Ｍ、ＳＳ３０２－０１５、ＳＳ３０２－０１５Ｍ、ＳＳ３０２－０１９、ＳＳ３０２－０１９Ｍ、ＳＳ３０２－０２９、ＳＳ３０２－０２９Ｍ、ＳＳ３０２－０３０、ＳＳ３０２－０３０Ｍ、ＳＳ３０２－０３５、ＳＳ３０２－０３５Ｍに対して、完全に脱糖し、脱糖分子と還元分子の検出を行い、ＳＳ３０２－００４（９５と１３０ＫＤとの間）、ＳＳ３０２－００４（約９５ＫＤ）、ＳＳ３０２－００５に対して完全性、還元分子の検出を行った結果、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の分子量は理論と一致した。
インスリン融合タンパク質前駆体の構造はｐｒｏＩＮＳ－Ｌ－Ｆｃであり、ｐｒｏＩＮＳはヒトインスリン前駆体（Ｂ－Ｃ－Ａを含む）、Ｌはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）であり、その概略図を図３Ａに示す。インスリン融合タンパク質前駆体は酵素加水分解されると、インスリン（Ｂ－Ａ）－Ｌ－Ｆｃ構造の成熟タンパク質を形成し、その概略図を図３Ｂに示す。インスリン融合タンパク質に用いられるリンカーには、柔軟性リンカー（例えば、ＧＳ）又は剛性リンカー（例えば、ＣＴＰ、Ｃ１）がある。ＣＨＯ細胞で発酵すると、プロペプチド、剛性リンカー（例えば、ＣＴＰ、Ｃ１）におけるＳ及びＴにはＯグリコシル化を生じる可能性があり、Ｃ１のようなリンカーにおけるＰにはプロリンのヒドロキシ化を生じる可能性があり、ＧＳのような柔軟性リンカーには翻訳後の修飾をほとんど生じない。この構造の解析では、ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦを採用してその分子量とジスルフィド結合を特徴付けた。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質分子（糖修飾を含有する）を脱糖して脱糖還元し後、分析に容易な無糖の修飾分子を得た。ＳＳ３０２－００２（約１３０ＫＤ）、ＳＳ３０２－００２（９５と１３０ＫＤとの間）、ＳＳ３０２－００８、ＳＳ３０２－００８Ｍ、ＳＳ３０２－０１２、ＳＳ３０２－０１２Ｍ、ＳＳ３０２－０１４、ＳＳ３０２－０１４Ｍ、ＳＳ３０２－０１５、ＳＳ３０２－０１５Ｍ、ＳＳ３０２－０１９、ＳＳ３０２－０１９Ｍ、ＳＳ３０２－０２９、ＳＳ３０２－０２９Ｍ、ＳＳ３０２－０３０、ＳＳ３０２－０３０Ｍ、ＳＳ３０２－０３５、ＳＳ３０２－０３５Ｍに対して、完全に脱糖し、脱糖分子と還元分子の検出を行い、ＳＳ３０２－００４（９５と１３０ＫＤとの間）、ＳＳ３０２－００４（約９５ＫＤ）、ＳＳ３０２－００５に対して完全性、還元分子の検出を行った結果、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の分子量は理論と一致した。
【0147】
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の空間構造は、２つのシステイン（Ｃｙｓ）残基のチオール基間に形成されたジスルフィド結合によりサポートされて安定化された。そのジスルフィド結合は、インスリン部分のジスルフィド結合とＦｃ部分のジスルフィド結合の２つの部分に分けられた。インスリン部分のジスルフィド結合はＢ鎖とＡ鎖にあり、Ｎ末端からＣ末端の順でＢ鎖とＡ鎖のアミノ酸をそれぞれＢＸとＡＸとして命名した（ただし、Ｘはアミノ酸の配列番号、ジスルフィド結合はＣｙｓＡ７－ＣｙｓＢ７、ＣｙｓＡ２０－ＣｙｓＢ１９、ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ１１である）。Ｆｃは同じ配列を持つ２つのポリペプチド鎖で構成され、各ポリペプチド鎖には２対のジスルフィド結合が含まれ、２つのポリペプチド鎖には合計４対のジスルフィド結合が含まれ、２つのポリペプチド鎖の間には２対の鎖間ジスルフィド結合があるため、Ｆｃには６対のジスルフィド結合があった。理論的には、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のジスルフィド結合は、ｋｅｘ２酵素加水分解プロセスの影響を受けない。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質のジスルフィド結合の構造解析は、非還元変性により液交換し、制限エンドヌクレアーゼで切断処理を行い、ＵＮＩＦＩソフトウェア分析を併用することにより完成した。前処理には２つの方法がある。ＵＮＩＦＩソフトウェアで分析する際、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質前駆体の２つの鎖をそれぞれ１鎖及び２鎖と命名した。前処理方法１によりＧｌｕ－Ｃ酵素加水分解後に形成されたペプチドセグメントＵＮＩＦＩソフトウェアを１：ＶＮ、２：ＶＮとして命名した（表８～表１１を参照のこと）。前処理方法２によりＧｌｕ－Ｃ酵素及びトリプシン酵素加水分解後に形成されたペプチドセグメントＵＮＩＦＩソフトウェアを１：ＶＴＮ、２：ＶＴＮとして命名した（表１５を参照のこと）。インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の成熟タンパク質については、２つのＢ鎖をそれぞれ１鎖及び３鎖として命名し、２つのＡ＋Ｆｃ鎖をそれぞれ２鎖及び４鎖として命名し、前処理方法２によりＧｌｕ－Ｃ酵素及びトリプシン酵素加水分解後に形成されたペプチドセグメントＵＮＩＦＩソフトウェアを１：ＶＴＮ、２：ＶＴＮ、３：ＶＴＮ、４：ＶＴＮとして命名し（表１２～表１４、表１６を参照のこと）。ここでは、Ｎはタンパク質酵素分解後のペプチドセグメントのソフトウェア番号であり、番号規則としてＮ末端からＣ末端まで順次に「１、２、３、．．．」であり、また、ＵＮＩＦＩソフトウェアのジスルフィド結合を「＝」として表す。鎖間ジスルフィド結合は２つのペプチドセグメントの間に位置し、鎖内ジスルフィド結合はペプチドセグメントの右側に位置した。
【0148】
ＳＳ３０２－００２（約１３０ＫＤ）、ＳＳ３０２－００２（９５と１３０ＫＤとの間）、ＳＳ３０２－００４（９５と１３０ＫＤとの間）、ＳＳ３０２－００４（約９５ＫＤ）、ＳＳ３０２－００５では、前処理方法１を用いてジスルフィド結合解析を行った。前処理方法１の手順は以下の通りである。ＳＳ３０２タンパク質サンプルを０．５ｍＬの１０ｋＤ限外ろ過チューブに入れ、４℃、１２０００ｒｐｍの条件下で５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。このように濃縮したサンプル３０μＬに８Ｍグアニジン塩酸塩１８μＬ（ｐＨ７．５）及び１ＭのＩＡＡ（ヨードアセトアミド）０．４８μＬを加え、ボルテックス混合し、室温で暗所で４０分間インキュベートした。このように得たサンプル１．８μＬを採取し、このサンプルを希釈するために５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ２３μＬ（ｐＨ８）緩衝液を加え、タンパク質：酵素＝２５：１（μｇ：μｇ）になるように０．１ｍｇ／ｍＬのＧｌｕ－Ｃ酵素２．２５μＬを加え、３７℃で一晩水浴し、翌日１０％ＦＡ（ギ酸）３μＬを加えて反応を停止させ、ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦで検出した。前処理方法１の場合は、変性が不完全であるため、リンカー領域は酵素加水分解されにくく、インスリンにおけるジスルフィド結合とヒンジ領域のジスルフィド結合がリンカーペプチドで結合され、分子量が大きくなり、整合させるのが困難である。だから、この方法では、重要なジスルフィド結合の情報が欠けており、ＳＳ３０２－００２（約１３０ＫＤ）とＳＳ３０２－００２（９５と１３０ＫＤとの間）の２つのバンド、およびＳＳ３０２－００４（９５と１３０ＫＤとの間）とＳＳ３０２－００４（約９５ＫＤ）の２つのバンドの間のジスルフィド結合のミスマッチ状況の違いを比較するためによく使用されている。
【0149】
ＳＳ３０２－００８、ＳＳ３０２－０１２、ＳＳ３０２－０１２Ｍ、ＳＳ３０２－０１４、ＳＳ３０２－０１４Ｍ、ＳＳ３０２－０１５、ＳＳ３０２－０１５Ｍ、ＳＳ３０２－０１９Ｍ、ＳＳ３０２－０２９Ｍ、ＳＳ３０２－０３０Ｍ、ＳＳ３０２－０３５、ＳＳ３０２－０３５Ｍでは、前処理方法２を用いてジスルフィド結合解析を行った。前処理方法２の手順は次の通りである。ＳＳ３０２タンパク質サンプル４０μＬに８Ｍグアニジン塩酸塩１２０μＬを加え、６０℃で１時間水浴し、室温まで冷却した後、１ＭのＩＡＡ３．２μＬを加え、室温で暗所で４５分間インキュベートし、０．５ｍＬの１０ｋＤ限外ろ過チューブを用いて１２０００ｒｐｍ、４℃条件下で３回液交換して５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）緩衝液に交換し、液交換後のサンプル濃度が約０．６２ｍｇ／ｍＬになるようにした。このように得られたサンプル４０μＬに、タンパク質：酵素＝２５：１（μｇ：μｇ）となるように２μＬのＧｌｕ－Ｃ酵素（０．５ｍｇ／ｍＬ）及び２μＬのＴｒｙｐｓｉｎ酵素（０．５ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃で一晩水浴し、翌日５μＬの１０％ＦＡを加えて反応を停止させ、ＵＰＬＣ－ＱＴＯＦで検出した。前処理方法２ではトリプシンとＧｌｕ－Ｃ酵素を共に用いて酵素加水分解を行い、上記ＳＳ３０２分子のリンカー領域の酵素加水分解が実現され、正しいジスルフィド結合が整合され、この方法によるミスマッチジスルフィド結合の計算結果がより確実であると考えられる。
【0150】
ＵＮＩＦＩソフトウェアを併用してＵＰＬＣ－ＱＴＯＦのジスルフィド結合の検出結果を分析することにより、正しいジスルフィド結合及びミスマッチジスルフィド結合を解析し、そのジスルフィド結合のミスマッチを総ミスマッチ率及びインスリンミスマッチ率で表した。ただし、総ミスマッチ率はすべてのジスルフィド結合ペプチドセグメントの総ＸＩＣピーク面積に対するミスマッチジスルフィド結合ペプチドセグメントの総ＸＩＣピーク面積の比率であり、インスリンミスマッチ率はすべてのジスルフィド結合ペプチドセグメントの総ＸＩＣピーク面積に対するインスリン部分のミスマッチジスルフィド結合の総ＸＩＣピーク面積の比である。ＳＳ３０２－００２、ＳＳ３０２－００４、ＳＳ３０２－００５、ＳＳ３０２－００８、ＳＳ３０２－０１２、ＳＳ３０２－０１２Ｍ、ＳＳ３０２－０１４、ＳＳ３０２－０１４Ｍ、ＳＳ３０２－０１５、ＳＳ３０２－０１５Ｍ、ＳＳ３０２－０１９Ｍ、ＳＳ３０２－０２９Ｍ、ＳＳ３０２－０３０Ｍ、ＳＳ３０２－０３５、ＳＳ３０２－０３５Ｍのミスマッチ率を表７に示す。
【0151】
柔軟性リンカーを含む融合タンパク質（ＳＳ３０２－００４、ＳＳ３０２－００５）では、ＳＳ３０２－００５のミスマッチ率がすべての分子の中で最も高く、ＳＳ３０２－００４は目的バンド（９５と１３０ＫＤとの間）のミスマッチ率が比較的低いが、ミスマッチ率の高いほうの組分と単離しにくいため、その収率は高くない。リンカーに柔軟性部分と剛性部分の両方を含む融合タンパク質（ＳＳ３０２－００２）については、その目的バンドが柔軟性リンカーを含む融合タンパク質（ＳＳ３０２－００４）との総ミスマッチ率およびインスリンとのミスマッチ率に相当し、両者とも総ミスマッチ率及びインスリンミスマッチ率の高いほうの組分を含み、精製・単離されるのが困難である。一方、剛性リンカーを含む前駆体タンパク質及び成熟タンパク質（ＳＳ３０２－００８、ＳＳ３０２－０１２、ＳＳ３０２－０１２Ｍ、ＳＳ３０２－０１４、ＳＳ３０２－０１４Ｍ、ＳＳ３０２－０１５、ＳＳ３０２－０１５Ｍ、ＳＳ３０２－０１９Ｍ、ＳＳ３０２－０２９Ｍ、ＳＳ３０２－０３０Ｍ、ＳＳ３０２－０３５、ＳＳ３０２－０３５Ｍ）では、総ミスマッチ率及びインスリンミスマッチ率が８％未満であった。実施例４におけるＳＳ３０２－００２、ＳＳ３０２－００４、ＳＳ３０２－０１２Ｍ、ＳＳ３０２－０１９Ｍ、ＳＳ３０２－０３０Ｍ、ＳＳ３０２－０３５、ＳＳ３０２－０３５Ｍのジスルフィド結合結果について詳細に説明し、結果を表８～１６に示す。
【0152】
このように、剛性リンカーは、ＣＨＯ細胞におけるインスリン融合タンパク質の構造発現の精度に大きな正の効果を有し、剛性が強いほど、その分子構造発現の精度が高くなることが示された。
【0153】
【表6】
【0154】
１．ＳＳ３０２－００２
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ技術を併用し、この分子を精製して約１３０ＫＤのバンド及び９５と１３０ＫＤとの間のバンドを得た。これら２つのバンドについてそれぞれジスルフィド結合の同定を行い、ジスルフィド結合の総ミスマッチ率及びインスリンミスマッチ率を推定した。その結果、約１３０ＫＤバンドの総ミスマッチ率及びインスリンミスマッチ率は９％であり、９５と１３０ＫＤとの間のバンドの総ミスマッチ率及びインスリンミスマッチ率は２９％であった。約１３０ＫＤバンドのジスルフィド結合結果を表８に、９５と１３０ＫＤとの間のバンドのジスルフィド結合結果を表９に示す。ミスマッチジスルフィド結合は、主にインスリンＢ鎖の自己結合とインスリンの２つのＢ鎖のミスマッチに反映された。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ技術を併用し、この分子を精製して約１３０ＫＤのバンド及び９５と１３０ＫＤとの間のバンドを得た。これら２つのバンドについてそれぞれジスルフィド結合の同定を行い、ジスルフィド結合の総ミスマッチ率及びインスリンミスマッチ率を推定した。その結果、約１３０ＫＤバンドの総ミスマッチ率及びインスリンミスマッチ率は９％であり、９５と１３０ＫＤとの間のバンドの総ミスマッチ率及びインスリンミスマッチ率は２９％であった。約１３０ＫＤバンドのジスルフィド結合結果を表８に、９５と１３０ＫＤとの間のバンドのジスルフィド結合結果を表９に示す。ミスマッチジスルフィド結合は、主にインスリンＢ鎖の自己結合とインスリンの２つのＢ鎖のミスマッチに反映された。
【0155】
【表7】
【0156】
【表8】
【0157】
２．ＳＳ３０２－００４
この分子は精製して９５と１３０ＫＤとの間のバンド（Ｐ１～４合併サンプル）及び約９５ＫＤバンド（Ｐ１３～１５合併サンプル）が得られた。これらの２つのバンドについてそれぞれジスルフィド結合同定を行った結果、９５と１３０ＫＤとの間のバンドの総ミスマッチ率及びインスリンミスマッチ率はともに４％、約９５ＫＤバンドの総ミスマッチ率及びインスリンミスマッチ率はともに３７％であった。９５と１３０ＫＤとの間のバンドのジスルフィド結合結果を表１０に、約９５ＫＤバンドのジスルフィド結合結果を表１１に示し、ミスマッチジスルフィド結合は、主にインスリンＢ鎖の自己結合とインスリンの２つのＢ鎖のミスマッチに反映された。
この分子は精製して９５と１３０ＫＤとの間のバンド（Ｐ１～４合併サンプル）及び約９５ＫＤバンド（Ｐ１３～１５合併サンプル）が得られた。これらの２つのバンドについてそれぞれジスルフィド結合同定を行った結果、９５と１３０ＫＤとの間のバンドの総ミスマッチ率及びインスリンミスマッチ率はともに４％、約９５ＫＤバンドの総ミスマッチ率及びインスリンミスマッチ率はともに３７％であった。９５と１３０ＫＤとの間のバンドのジスルフィド結合結果を表１０に、約９５ＫＤバンドのジスルフィド結合結果を表１１に示し、ミスマッチジスルフィド結合は、主にインスリンＢ鎖の自己結合とインスリンの２つのＢ鎖のミスマッチに反映された。
【0158】
【表9】
【0159】
【表10】
３．ＳＳ３０２－０１２Ｍ
【0160】
この分子のジスルフィド結合は、総ミスマッチ率が２．９％であり、インスリンミスマッチ率が２．２％であり、理論と一致している。そのジスルフィド結合結果を表１２に示す。
【0161】
【表11】
【0162】
４．ＳＳ３０２－０１９Ｍ
この分子のジスルフィド結合は、総ミスマッチ率が２．８％で、インスリンミスマッチ率が１．２％であり、理論と一致している。そのジスルフィド結合結果を表１３に示す。
この分子のジスルフィド結合は、総ミスマッチ率が２．８％で、インスリンミスマッチ率が１．２％であり、理論と一致している。そのジスルフィド結合結果を表１３に示す。
【0163】
【表12】
【0164】
５．ＳＳ３０２－０３０Ｍ
この分子のジスルフィド結合は、総ミスマッチ率が１．７％であり、インスリンミスマッチ率が０％であり、理論と一致している。そのジスルフィド結合結果を表１４に示す。
この分子のジスルフィド結合は、総ミスマッチ率が１．７％であり、インスリンミスマッチ率が０％であり、理論と一致している。そのジスルフィド結合結果を表１４に示す。
【0165】
【表13】
【0166】
６．ＳＳ３０２－０３５
この分子のジスルフィド結合は、総ミスマッチ率が４．３％であり、インスリンミスマッチ率が２．２％であり、理論と一致している。そのジスルフィド結合結果を表１５に示す。
この分子のジスルフィド結合は、総ミスマッチ率が４．３％であり、インスリンミスマッチ率が２．２％であり、理論と一致している。そのジスルフィド結合結果を表１５に示す。
【0167】
【表14】
【0168】
７．ＳＳ３０２－０３５Ｍ
この分子のジスルフィド結合は、総ミスマッチ率が２．５％で、インスリンミスマッチ率が２．０％であり、理論と一致している。そのジスルフィド結合結果を表１６に示す。
この分子のジスルフィド結合は、総ミスマッチ率が２．５％で、インスリンミスマッチ率が２．０％であり、理論と一致している。そのジスルフィド結合結果を表１６に示す。
【0169】
【表15】
【0170】
実施例５：昆明マウスに対するＳＳ３０２－００２及びＳＳ３０２－００２Ｍの血糖降下作用
２４匹の健康なオスの昆明マウス（２２～２８ｇ）を６匹／群として、（１）ＳＳ３０２－００２Ｍ－２４ｎｍｏｌ／ｋｇ、（２）ＳＳ３０２－００２－２４ｎｍｏｌ／ｋｇ、（３）インスリングラルギン－４８ｎｍｏｌ／ｋｇ、（４）陰性対照群という４つの群に無作為に分けた。被検品を首の皮下に注射投与した後、それぞれ０、１、２、４、６、８、１０、１２、２４、３６、４８、６０、７２、９６時間で血糖値を検出した。実験中、マウスを絶食させず、十分な水と食物を与えた。
２４匹の健康なオスの昆明マウス（２２～２８ｇ）を６匹／群として、（１）ＳＳ３０２－００２Ｍ－２４ｎｍｏｌ／ｋｇ、（２）ＳＳ３０２－００２－２４ｎｍｏｌ／ｋｇ、（３）インスリングラルギン－４８ｎｍｏｌ／ｋｇ、（４）陰性対照群という４つの群に無作為に分けた。被検品を首の皮下に注射投与した後、それぞれ０、１、２、４、６、８、１０、１２、２４、３６、４８、６０、７２、９６時間で血糖値を検出した。実験中、マウスを絶食させず、十分な水と食物を与えた。
【0171】
図４に示すように、インスリングラルギンの薬効は４時間まで持続した。ＳＳ３０２－００２群は、投与後４時間で血糖降下作用を明らかに示し始めたが、ＳＳ３０２－００２群は、血糖降下作用及び薬効の持続時間がＳＳ３０２－００２Ｍ群より有意に弱かった。ＳＳ３０２－００２群およびＳＳ３０２－００２Ｍ群は、最大血糖降下作用がそれぞれ５．３３と２．９７ｍｍｏｌ／Ｌ）であり、薬効の持続時間がそれぞれ３６時間と７２時間であった。上記データ分析により、Ｃペプチドが切除されたインスリン融合タンパク質は力価がより高く、血糖降下作用がより優れたことが明らかになった。
【0172】
実施例６：正常なＣ５７マウスに対するＳＳ３０２－００８Ｍ、ＳＳ３０２－０１２Ｍ、ＳＳ３０２－０１４Ｍ、ＳＳ３０２－０１５Ｍ、ＳＳ３０２－０１９Ｍ、ＳＳ３０２－０２９Ｍ、ＳＳ３０２－０３０Ｍ及びＳＳ３０２－０３５Ｍの血糖降下作用
８～１０週齢、体重２２～２８ｇの５０匹の健康なオスのＣ５７マウスを、５匹／群として、ＳＳ３０２－００８Ｍ群、ＳＳ３０２－０１２Ｍ群、ＳＳ３０２－０１４Ｍ群、ＳＳ３０２－０１５Ｍ群、ＳＳ３０２－０１９Ｍ群、ＳＳ３０２－０２９Ｍ群、ＳＳ３０２－０３０Ｍ群、ＳＳ３０２－０３５Ｍ群、インスリンデグルデク群、及び対照群という１０群に無作為に分けた。被検薬を１５ｎｍｏｌ／ｋｇで首の皮下に投与し、インスリンデグルデク用量を３０ｎｍｏｌ／ｋｇとし、投与前後の異なる時点で血糖値を検出した。実験中、マウスを絶食させなかった。実験データをＧｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ７．０でプロットし、Ｍａｎｎ－ｗｈｉｔｅｎｅｙ統計により差異性を分析した。
８～１０週齢、体重２２～２８ｇの５０匹の健康なオスのＣ５７マウスを、５匹／群として、ＳＳ３０２－００８Ｍ群、ＳＳ３０２－０１２Ｍ群、ＳＳ３０２－０１４Ｍ群、ＳＳ３０２－０１５Ｍ群、ＳＳ３０２－０１９Ｍ群、ＳＳ３０２－０２９Ｍ群、ＳＳ３０２－０３０Ｍ群、ＳＳ３０２－０３５Ｍ群、インスリンデグルデク群、及び対照群という１０群に無作為に分けた。被検薬を１５ｎｍｏｌ／ｋｇで首の皮下に投与し、インスリンデグルデク用量を３０ｎｍｏｌ／ｋｇとし、投与前後の異なる時点で血糖値を検出した。実験中、マウスを絶食させなかった。実験データをＧｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ７．０でプロットし、Ｍａｎｎ－ｗｈｉｔｅｎｅｙ統計により差異性を分析した。
【0173】
図５Ａ及び５Ｂに示すように、対照群と比較して、投与群のマウスには明らかな血糖降下作用が示された。インスリンデグルデク（３０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の薬効は１２時間まで持続した。様々なインスリン融合タンパク質は、１５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、正常なＣ５７マウスに対する薬効持続時間がＳＳ３０２－０３５Ｍ／ＳＳ３０２－０３０Ｍ／ＳＳ３０２－０１９Ｍ／ＳＳ３０２－００８Ｍ（９６時間）＞ＳＳ３０２－０１２Ｍ（７２時間）＞ＳＳ３０２－０１５Ｍ（４８時間）＞ＳＳ３０２－０２９Ｍ／ＳＳ３０２－０１４Ｍ（２４時間）であった。
【0174】
実施例７：正常なＣ５７マウスにおける異なる用量のＳＳ３０２－０３５Ｍの血糖降下作用
８～１０週齢、体重２２～２８ｇの２５匹の健康なオスのＣ５７マウスを、５匹／群として、５つの群に無作為に分けた。ＳＳ３０２－０３５Ｍをそれぞれ５、７．５、１０、１２．５ｎｍｏｌ／ｋｇで首の皮下に投与した後、０、４、２４、４８、７２、９６、１２０時間で血糖値を検出した。実験中、マウスを絶食させなかった。実験結果データをＧｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ７．０でプロットし、Ｍａｎｎ－ｗｈｉｔｅｎｅｙ統計により差異性を分析した。
８～１０週齢、体重２２～２８ｇの２５匹の健康なオスのＣ５７マウスを、５匹／群として、５つの群に無作為に分けた。ＳＳ３０２－０３５Ｍをそれぞれ５、７．５、１０、１２．５ｎｍｏｌ／ｋｇで首の皮下に投与した後、０、４、２４、４８、７２、９６、１２０時間で血糖値を検出した。実験中、マウスを絶食させなかった。実験結果データをＧｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ７．０でプロットし、Ｍａｎｎ－ｗｈｉｔｅｎｅｙ統計により差異性を分析した。
【0175】
図６に示すように、正常なＣ５７マウスにおいては、ＳＳ３０２－０３５Ｍの血糖降下作用が明らかな用量依存的関係を有する。ＳＳ３０２－０３５Ｍ－５ｎｍｏｌ／ｋｇ群では、血糖値の最低値が４．３ｍｍｏｌ／Ｌで、薬効が７２時間まで持続した。ＳＳＳ３０２－０３５Ｍ－７．５ｎｍｏｌ／ｋｇ群では、血糖値の最低値が３．２ｍｍｏｌ／Ｌで、薬効が７２時間まで持続した。ＳＳＳ３０２－０３５Ｍ－１０ｎｍｏｌ／ｋｇ群では、血糖値の最低値が２．８ｍｍｏｌ／Ｌで、薬効が９６時間まで持続した。ＳＳＳ３０２－０３５Ｍ－１２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ群では、血糖値の最低値が２．５ｍｍｏｌ／Ｌで、薬効が９６時間まで持続した。
【0176】
実施例８：糖尿病モデルマウスにおけるＳＳ３０２－００４Ｍ及びＳＳ３０２－００２Ｍの血糖降下作用
１．ＳＴＺで誘導されたＩ型糖尿病のマウスモデル
Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（８週齢、体重２２～２８ｇ）にクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液で調製した０．４％ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）溶液を腹腔内注射し、４０ｍｇ／ｋｇを５日間連続投与し、１日１回、最終投与後７～１０日目に空腹時血糖値を検出した。空腹時血糖値＞１３．８ｍｍｏｌ／Ｌ（空腹時間は８：００ａ．ｍ～１４：００ｐ．ｍ）の場合はモデル構築に成功したと見なされた。
２．生体内活性及び長期有効性の検出
１．ＳＴＺで誘導されたＩ型糖尿病のマウスモデル
Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（８週齢、体重２２～２８ｇ）にクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液で調製した０．４％ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）溶液を腹腔内注射し、４０ｍｇ／ｋｇを５日間連続投与し、１日１回、最終投与後７～１０日目に空腹時血糖値を検出した。空腹時血糖値＞１３．８ｍｍｏｌ／Ｌ（空腹時間は８：００ａ．ｍ～１４：００ｐ．ｍ）の場合はモデル構築に成功したと見なされた。
２．生体内活性及び長期有効性の検出
【0177】
３５匹のＳＴＺ誘導のＩ型糖尿病マウスを、血糖値に基づいて、（１～２）ＳＳ３０２－００２Ｍの高用量群と低用量群、（３～４）ＳＳ３０２－００４Ｍの高用量群と低用量群、（５～６）インスリングラルギン（Ｇｌａｒｇｉｎｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ）の高用量群と低用量群、（７）対照群（２０ｍＭのＴｒｉｓ＋３００ｍＭのＮａＣｌ）という７つの群に無作為に分けた。ＳＳ３０２－００２Ｍ及びＳＳ３０２－００４Ｍの高用量群および低用量群では、被検薬をそれぞれ１２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ及び６．２５ｎｍｏｌ／ｋｇで首の皮下に注射投与し、インスリングラルギンの高用量群および低用量群では、被検薬をそれぞれ２５ｎｍｏｌ／ｋｇ及び１２．５ｎｍｏｌ／ｋｇで首の皮下に注射投与した。投与前後の異なる時点で血糖値の変化をそれぞれモニターした。実験中、マウスを絶食させず、十分な水と食物を与えた。
【0178】
結果を図７Ａ（ＳＳ３０２－００２Ｍ）及び７Ｂ（ＳＳ３０２－００４Ｍ）に示す。ＳＳ３０２－００２Ｍ、ＳＳ３０２－００４Ｍは、ＳＴＺで誘導されたＩ型糖尿病マウスに投与した後、明らかな血糖降下薬効を示した。その薬効は、Ｓ３０２－００２Ｍの低用量群で１２０時間まで維持され、高用量群で１９２時間まで維持された。その薬効は、Ｓ３０２－００４Ｍの低用量群で８４時間まで維持され、高用量群で１４４時間まで維持された。
【0179】
なお、ＳＳ３０２－００２Ｍ及びＳＳ３０２－００４Ｍ群に比べて、インスリングラルギン群は、同じモル数のインスリン、即ち、２５ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量の場合、血糖値がより迅速に低下及び回復し、投与後１時間前後で血糖値が最低点（約５ｍｍｏｌ／Ｌ）まで低下し、正常なＣ５７血糖値（約８ｍｍｏｌ／Ｌ）よりも低く、その後急速に上昇し、６時間で初期の血糖値に戻った。これは、ＳＳ３０２－００２Ｍ、ＳＳ３０２－００４Ｍがよりフラットで安定したＰＤスペクトルを持ち、臨床安全性がより高いことを示唆している。
【0180】
実施例９：糖尿病モデルマウスにおけるＳＳ３０２－００８Ｍ、ＳＳ３０２－０１２Ｍ及びＳＳ３０２－０３５Ｍの血糖降下作用
１．ＳＴＺで誘導されたマウスＩ型糖尿病モデル
Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（１２週齢、体重２２～２８ｇ）にクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液で調製した０．４％ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）溶液を腹腔内注射し、４０ｍｇ／ｋｇを５日間連続投与し、１日１回、最後投与後７～１０日目に空腹時血糖値＞１３．８ｍｍｏｌ／Ｌ（空腹時間は８：００ａ．ｍ～１４：００ｐ．ｍ）と検出し、モデル構築にに成功したと見なされた。
２．生体内活性及び長期有効性の検出
１．ＳＴＺで誘導されたマウスＩ型糖尿病モデル
Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（１２週齢、体重２２～２８ｇ）にクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液で調製した０．４％ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）溶液を腹腔内注射し、４０ｍｇ／ｋｇを５日間連続投与し、１日１回、最後投与後７～１０日目に空腹時血糖値＞１３．８ｍｍｏｌ／Ｌ（空腹時間は８：００ａ．ｍ～１４：００ｐ．ｍ）と検出し、モデル構築にに成功したと見なされた。
２．生体内活性及び長期有効性の検出
【0181】
ＳＴＺによるモデル構築した４０匹のＩ型糖尿病マウスを、血糖値に基づいて、（１）ＳＳ３０２－００８Ｍ－７．５ｎｍｏｌ／ｋｇ群、（２）ＳＳ３０２－０１２Ｍ－７．５ｎｍｏｌ／ｋｇ群、（３）ＳＳ３０２－０３５Ｍ－７．５ｎｍｏｌ／ｋｇ群、（４）ＳＳ３０２－００８Ｍ－１５ｎｍｏｌ／ｋｇ群、（５）ＳＳ３０２－０１２Ｍ－１５ｎｍｏｌ／ｋｇ群、（６）ＳＳ３０２－０３５Ｍ－１５ｎｍｏｌ／ｋｇ群、（７）インスリンデグルデク－３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、（８）緩衝液対照群（２０ｍＭのＴｒｉｓ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ）という８つの群に無作為に分けた。投与前後の異なる時点で血糖値を検出した。実験中、マウスを絶食させなかった。実験結果をＧｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ７．０でプロットし、Ｍａｎｎ－ｗｈｉｔｅｎｅｙ統計により差異性を分析した。
【0182】
図８Ａ及び８Ｂに示すように、同じ用量の場合、ＳＳ３０２－０３５Ｍは、ＳＳ３０２－００８Ｍ及びＳ３０２－０１２Ｍより薬効維持時間に有意に優れており、特に、低用量７．５ｎｍｏｌ／ｋｇ群（１４４時間ｖｓ．７２時間）でより顕著であった。図８Ｂに示すように、インスリンデグルデクを３０ｎｍｏｌ／ｋｇ投与した後、糖尿病マウスの血糖値は迅速に低下して回復し、１時間前後で最低点に低下し、２４時間で初期血糖値に戻った。これは、ＳＳ３０２－００８Ｍ、ＳＳ３０２－０１２Ｍ、ＳＳ３０２－０３５Ｍのほうがより長いＰＤスペクトルを持ち、インスリンデグルデクより薬効維持時間に優れたことを示唆している。
【0183】
実施例１０：ＳＤラットにおけるＳＳ３０２－００８Ｍ及びＳＳ３０２－０１２Ｍの薬力学（ＰＤ）及び薬物動態学（ＰＫ）実験
１０匹のＳＤラット（８～１０週齢、体重２５０～３５０ｇ）を無作為に２つの群に分け、各群３♂／２♀とし、ＳＳ３０２－００８Ｍ、ＳＳ３０２－０１２Ｍをそれぞれ２０ｎｍｏｌ／ｋｇで首の皮下に投与した。投与前後の異なる時点で血糖値を検出し、全血を採取し、ＰＫ検出のために血清を単離した。実験中、ラットを絶食せず、十分な水と食物を与えた。データをＧｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ７．０でプロットし、Ｍａｎｎ－ｗｈｉｔｅｎｅｙ統計により差異性を分析した。
１０匹のＳＤラット（８～１０週齢、体重２５０～３５０ｇ）を無作為に２つの群に分け、各群３♂／２♀とし、ＳＳ３０２－００８Ｍ、ＳＳ３０２－０１２Ｍをそれぞれ２０ｎｍｏｌ／ｋｇで首の皮下に投与した。投与前後の異なる時点で血糖値を検出し、全血を採取し、ＰＫ検出のために血清を単離した。実験中、ラットを絶食せず、十分な水と食物を与えた。データをＧｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ７．０でプロットし、Ｍａｎｎ－ｗｈｉｔｅｎｅｙ統計により差異性を分析した。
【0184】
２．ＥＬＩＳＡ検出
マウス抗インスリンモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ、ａｂ８３０２）をＰＢＳで１ｕｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃で一晩放置して被覆した。被覆液を除去し、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した後、４％ＢＳＡを加え、２５０μｌ／ウェル、３７℃で２時間ブロッキングし、ブロッキング液を除去した後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。ＳＳ３０２－００８Ｍ／ＳＳ３０２－０１２Ｍの標準品を２％ＢＳＡで希釈し、２００ｎｇ／ｍｌから合計８つの倍加希釈勾配を使用して標準曲線を確立した。ラット血清を２％ＢＳＡで様々な倍数に希釈した。陰性対照として正常ラット血清を使用した。上記サンプルを１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートし、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、２％ＢＳＡで希釈した第２の抗体（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ２ Ｆｃ（ＨＲＰ）、１：３０００）（ａｂｃａｍ、ａｂ９９７７９）を加え、１００μＬ／ウェル、３７℃で１時間インキュベートし、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した後、ＴＭＢ発色液を加え、１００μｌ／ウェル、３７℃で暗所で１０分間発色させた。２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェルで加えて反応を終了させ、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０／６３０値を検出した。
マウス抗インスリンモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ、ａｂ８３０２）をＰＢＳで１ｕｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃で一晩放置して被覆した。被覆液を除去し、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した後、４％ＢＳＡを加え、２５０μｌ／ウェル、３７℃で２時間ブロッキングし、ブロッキング液を除去した後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。ＳＳ３０２－００８Ｍ／ＳＳ３０２－０１２Ｍの標準品を２％ＢＳＡで希釈し、２００ｎｇ／ｍｌから合計８つの倍加希釈勾配を使用して標準曲線を確立した。ラット血清を２％ＢＳＡで様々な倍数に希釈した。陰性対照として正常ラット血清を使用した。上記サンプルを１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートし、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、２％ＢＳＡで希釈した第２の抗体（Ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ２ Ｆｃ（ＨＲＰ）、１：３０００）（ａｂｃａｍ、ａｂ９９７７９）を加え、１００μＬ／ウェル、３７℃で１時間インキュベートし、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した後、ＴＭＢ発色液を加え、１００μｌ／ウェル、３７℃で暗所で１０分間発色させた。２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェルで加えて反応を終了させ、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０／６３０値を検出した。
【0185】
３．薬力学実験の結果
図９に示すように、ＳＳ３０２－００８Ｍ及びＳＳ３０２－０１２Ｍは、ＳＤラットに投与した後、明らかな血糖降下作用を示した。ＳＳ３０２－００８Ｍの薬効は９６時間まで維持されるが、ＳＳ３０２－０１２Ｍの薬効は７２時間まで維持された。
図９に示すように、ＳＳ３０２－００８Ｍ及びＳＳ３０２－０１２Ｍは、ＳＤラットに投与した後、明らかな血糖降下作用を示した。ＳＳ３０２－００８Ｍの薬効は９６時間まで維持されるが、ＳＳ３０２－０１２Ｍの薬効は７２時間まで維持された。
【0186】
４．薬物動態学の結果と分析
ＳＤラットにおけるＳＳ３０２－００８Ｍ及びＳＳ３０２－０１２Ｍの薬物動態学の結果を図１０に示す。ＳＤラットにおけるＳＳ３０２－００８Ｍ及びＳＳ３０２－０１２Ｍの半減期（Ｔ１／２）は、それぞれ１６．３２±０．７７時間及び１３．３９±０．４３時間であった。具体的なＰＫパラメータを表１７に示す。
ＳＤラットにおけるＳＳ３０２－００８Ｍ及びＳＳ３０２－０１２Ｍの薬物動態学の結果を図１０に示す。ＳＤラットにおけるＳＳ３０２－００８Ｍ及びＳＳ３０２－０１２Ｍの半減期（Ｔ１／２）は、それぞれ１６．３２±０．７７時間及び１３．３９±０．４３時間であった。具体的なＰＫパラメータを表１７に示す。
【0187】
【表16】
【0188】
実施例１１：ビーグル犬におけるＳＳ３０２－０３５Ｍの薬力学（ＰＤ）及び薬物動態学（ＰＫ）実験
２．５ｎｍｏｌ／ｋｇのＳＳ３０２－０３５Ｍを８～１２ｋｇのオスの健康な一般グレードのビーグル犬（４匹）に単回皮下投与した後、薬力学及び薬物動態パラメータを評価した。投与前後の異なる時点で、四肢の末梢静脈から血液サンプルを採取した。各時点で約１ｍＬの全血を採取し、ＥＤＴＡ－Ｋ２を含む抗凝固チューブに入れ、その後、４℃条件下で３０００ｇ／ｍｉｎで１０分間遠心分離して血漿を収集した。投与前０時間及び投与後１、２、３、４、６、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４及び１６８時間で全血を１滴採取し、迅速血糖測定器（Ｒｏｃｈｅ ＡＣＣＵ－ＣＨＥＫ Ｐｅｒｆｏｒｍａ）及び血糖試験紙（Ｒｏｃｈｅ ＡＣＣＵ－ＣＨＥＫ Ｐｅｒｆｏｒｍａ）で動物の血糖値を測定した。薬力学（ＰＤ）の結果を図１０Ａに示し、薬物動態学（ＰＫ）の結果を図１０Ｂに示す。実験中、動物を０～６時間以内に絶食させ、その後、食物と水を自由に摂取させた。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ８．２ソフトウェアを使用して薬物動態パラメータ（非コンパートメントモデル）を算出し、関連するＰＫパラメータを表１８に示す。ＰＤ結果によると、ＳＳ３０２－０３５Ｍは２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ用量でビーグル犬のランダム血糖値を有意に下げることができ、血糖降下の効果が１２０時間まで持続し、明らかな低血糖の症状が見られなかった。ＰＫ結果によると、ＳＳ３０２－０３５Ｍは、２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ用量で、正常なビーグル犬における生体内半減期が３７．６５±７．３６時間であった。
２．５ｎｍｏｌ／ｋｇのＳＳ３０２－０３５Ｍを８～１２ｋｇのオスの健康な一般グレードのビーグル犬（４匹）に単回皮下投与した後、薬力学及び薬物動態パラメータを評価した。投与前後の異なる時点で、四肢の末梢静脈から血液サンプルを採取した。各時点で約１ｍＬの全血を採取し、ＥＤＴＡ－Ｋ２を含む抗凝固チューブに入れ、その後、４℃条件下で３０００ｇ／ｍｉｎで１０分間遠心分離して血漿を収集した。投与前０時間及び投与後１、２、３、４、６、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４及び１６８時間で全血を１滴採取し、迅速血糖測定器（Ｒｏｃｈｅ ＡＣＣＵ－ＣＨＥＫ Ｐｅｒｆｏｒｍａ）及び血糖試験紙（Ｒｏｃｈｅ ＡＣＣＵ－ＣＨＥＫ Ｐｅｒｆｏｒｍａ）で動物の血糖値を測定した。薬力学（ＰＤ）の結果を図１０Ａに示し、薬物動態学（ＰＫ）の結果を図１０Ｂに示す。実験中、動物を０～６時間以内に絶食させ、その後、食物と水を自由に摂取させた。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ８．２ソフトウェアを使用して薬物動態パラメータ（非コンパートメントモデル）を算出し、関連するＰＫパラメータを表１８に示す。ＰＤ結果によると、ＳＳ３０２－０３５Ｍは２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ用量でビーグル犬のランダム血糖値を有意に下げることができ、血糖降下の効果が１２０時間まで持続し、明らかな低血糖の症状が見られなかった。ＰＫ結果によると、ＳＳ３０２－０３５Ｍは、２．５ｎｍｏｌ／ｋｇ用量で、正常なビーグル犬における生体内半減期が３７．６５±７．３６時間であった。
【0189】
【表17】
【0190】
本発明の実施例において構築された融合タンパク質前駆体の全長配列は以下の通りである。
１） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００１ 配列番号４７
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
２） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００２ 配列番号４８
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
３） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００３ 配列番号４９
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
４） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００４ 配列番号５０
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
５） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００５ 配列番号５１
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
１） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００１ 配列番号４７
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
２） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００２ 配列番号４８
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＱＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
３） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００３ 配列番号４９
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４） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００４ 配列番号５０
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５） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００５ 配列番号５１
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【0191】
６） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００６ 配列番号５２
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７） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００７ 配列番号５３
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８） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００８ 配列番号５４
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９） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００９ 配列番号５５
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１０） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１１ 配列番号５６
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７） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００７ 配列番号５３
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８） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００８ 配列番号５４
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９） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－００９ 配列番号５５
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１０） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１１ 配列番号５６
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【0192】
１１） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１２ 配列番号５７
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１２） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１３ 配列番号５８
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１３） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１４ 配列番号５９
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１４） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１５ 配列番号６０
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１５） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１６ 配列番号６１
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１２） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１３ 配列番号５８
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１３） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１４ 配列番号５９
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１４） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１５ 配列番号６０
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１５） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１６ 配列番号６１
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【0193】
１６） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１７ 配列番号６２
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１７） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１８ 配列番号６３
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１８） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１９ 配列番号６４
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１９） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０２２ 配列番号６５
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２０） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０２３ 配列番号６６
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１７） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１８ 配列番号６３
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１８） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０１９ 配列番号６４
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１９） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０２２ 配列番号６５
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２０） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０２３ 配列番号６６
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【0194】
２１） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０２９ 配列番号６７
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２２） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０３０ 配列番号６８
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２３） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０３５ 配列番号６９
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２４） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０３６ 配列番号７０
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２５） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０３７ 配列番号７１
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２２） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０３０ 配列番号６８
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＳＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
２３） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０３５ 配列番号６９
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＨＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
２４） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０３６ 配列番号７０
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＴＰＫＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
２５） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０３７ 配列番号７１
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＥＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
【0195】
２６） インスリン前駆体融合タンパク質ＳＳ３０２－０３８ 配列番号７２
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
本願発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
第１の部分と第２の部分とを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質であって、前記第１の部分がインスリン活性を提供するインスリン部分であり、前記第２の部分が前記第１の部分の生体内半減期を延長する作用を有するＦｃ部分であり、前記第１の部分と前記第２の部分が共有結合により連結され、前記インスリン－Ｆｃ融合タンパク質が切断された後にインスリン活性を有する、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質。
＜２＞
下記の式（Ｉ）の構造を有する、＜１＞に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質。
Ｘ－Ｅ１－Ｙ－Ｅ２－Ｚ－Ｌ－Ｆｃ （Ｉ）
（ただし、ＸとＺはそれぞれインスリンのＢ鎖とＡ鎖であり、かつ、ＸがＢ鎖である場合、ＺはＡ鎖であり、ＸはＡ鎖である場合、ＺはＢ鎖であり、
Ｙは、任意のリンカーペプチドであり、Ｙの長さは１～１００個以上のアミノ酸であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、又は上記の任意の２つの数値の間にある個数のアミノ酸であり、例えば、ＹはインスリンＣペプチド又はその変異体又はその断片であり、
Ｅ１及びＥ２は、一方又は両方とも存在する場合があり、部位特異的プロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸の断片であり、Ｅ１及びＥ２の長さは１～１０個以上のアミノ酸であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸であり、
同時に存在する場合、Ｅ１及びＥ２は、同一または異なる部位特異的プロテアーゼにより切断され、例えば、同一の部位特異的プロテアーゼにより切断され、
Ｙが存在する場合は、Ｅ１及びＥ２の両方が存在することが好ましく、Ｙが存在しない場合は、Ｅ１及びＥ２の一方が存在することが好ましく、
前記部位特異的プロテアーゼ切断部位は、Ｋｅｘ２及び／又はフリン（Ｆｕｒｉｎ）プロテアーゼの切断部位であり、例えば、Ｋｅｘ２プロテアーゼの切断部位であり、
Ｌは、ＺとＦｃを連結するリンカーであり、アミノ酸断片又は非ペプチド鎖の化学構造であり、
Ｆｃは免疫グロブリンのＦｃ領域であり、前記Ｆｃはヒト免疫グロブリンに由来し、前記Ｆｃ領域はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域であり、ＩｇＧに由来するＦｃ領域であることが好ましく、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＦｃ領域であり、ＩｇＧ２に由来するＦｃ領域であることがさらに好ましく、
前記Ｆｃ領域は、その由来の配列と比較して、半減期を延長する能力を保持しながら１つまたは複数の置換、付加及び／又は欠失を有し、例えば、ヒトＩｇＧに由来するＦｃ領域でありながらＦｃγＲへの結合を低減又は除去する変異及び／又はＦｃＲｎへの結合を増強する１つまたは複数の変異を有し、
前記変異は、Ｎ２９７Ａ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ２５０Ｒ／Ｍ４２８Ｌから選択され、
前記Ｆｃ領域は、グリコシル化されているか又は非グリコシル化されている。）
＜３＞
前記Ｌがポリペプチド断片であり、
好ましくは、前記Ｌは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＳｅｒから選択された１つ又は２つ以上のアミノ酸の柔軟性ペプチドセグメントを含み、例えば、ＧとＳからなる柔軟性ペプチドセグメントを含み、
前記柔軟性ペプチドセグメントの長さは、２～５０個以上のアミノ酸であり、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５又は５０個のアミノ酸であり、
好ましくは、前記Ｌは、剛性単位を１つまたは複数含み、前記剛性単位は剛性アミノ酸を含むか又は本質的に剛性アミノ酸からなり、前記剛性アミノ酸にはＶ、Ｐ、Ｉ、Ｋ及びＬが含まれるがこれらに限定されなく、
より好ましくは、前記剛性単位は、ＰＰＰＸ １ ＬＰ（配列番号１２５）を１つまたは複数含み、Ｘ １ は任意のアミノ酸であり、
より好ましくは、前記剛性単位は、Ｘ ２ ＡＰＰＰＸ １ ＬＰ（配列番号１２６）を１つまたは複数含み、Ｘ １ は任意のアミノ酸で、Ｘ ２ はＫ又はＶである、＜１＞又は＜２＞に記載の融合タンパク質。
＜４＞
前記剛性単位が以下の配列：
ＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１２７）、
ＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１２８）、および
ＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１２９）から選択されたポリペプチド断片を含み、
好ましくは、前記剛性単位が以下の配列：
ＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１３０）、
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１３１）、及び
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１３２）から選択されたポリペプチド断片を含む、＜３＞に記載の融合タンパク質。
＜５＞
前記Ｌが以下の配列：
から選択されたポリペプチド断片を含む、＜１＞～＜４＞に記載の融合タンパク質。
＜６＞
前記インスリンは、ヒトインスリン、ウシインスリン又はブタインスリンから選択され、好ましくはヒトインスリンであり、例えば、前記インスリンのＡ鎖及びＢ鎖がヒトインスリンに由来する、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
＜７＞
Ｙ、Ｅ１及びＥ２がすべて存在するか、又はＹが存在せず、Ｅ１及びＥ２のうちの１つが存在する、＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
＜８＞
配列番号４７～７２から選択されたアミノ酸配列を有する、＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
＜９＞
＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質と前記部位特異的プロテアーゼ切断部位を切断可能な部位特異的プロテアーゼとを接触させることを含み、好ましくは前記部位特異的プロテアーゼがＫｅｘ２及び／又はＦｕｒｉｎプロテアーゼである、増強されたインスリン活性及び延長された半減期を有するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生産方法。
＜１０＞
＜９＞に記載の方法より得られる、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質。
＜１１＞
Ｉｎｓ－Ｌ－Ｆｃ構造を有するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質。
（ただし、Ｉｎｓは、共有結合により連結されたインスリンＡ鎖とＢ鎖とを含むインスリン活性を提供するインスリン部分であり、Ａ鎖及びＢ鎖は異なるペプチド鎖中にあり、前記共有結合は、好ましくはジスルフィド結合であり、
Ｌは、ＺとＦｃを連結するリンカーであり、アミノ酸断片であるか又は非ペプチド鎖の化学構造であり、
Ｆｃは免疫グロブリンのＦｃ領域であり、前記Ｆｃはヒト免疫グロブリンに由来し、前記Ｆｃ領域はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域であり、ＩｇＧに由来するＦｃ領域であることが好ましく、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＦｃ領域であり、ＩｇＧ２に由来するＦｃ領域であることがさらに好ましく、
前記Ｆｃ領域は、その由来の配列と比較して、半減期を延長する能力を保持しながら１つまたは複数の置換、付加及び／又は欠失を有し、例えば、ヒトＩｇＧに由来するＦｃ領域でありながらＦｃγＲへの結合を低減又は除去する変異及び／又はＦｃＲｎへの結合を増強する１つまたは複数の変異を有し、
前記変異は、Ｎ２９７Ａ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ２５０Ｒ／Ｍ４２８Ｌから選択され、
前記Ｆｃ領域は、グリコシル化されているか又は非グリコシル化されている。）
＜１２＞
前記インスリンは、ヒトインスリン、ウシインスリン又はブタインスリンから選択され、好ましくはヒトインスリンであり、例えば、前記インスリンのＡ鎖及びＢ鎖がヒトインスリンに由来する、＜１１＞に記載の融合タンパク質。
＜１３＞
前記Ｌがポリペプチド断片であり、
好ましくは、前記Ｌは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＳｅｒから選択された１つ又は２つ以上のアミノ酸の柔軟性ペプチドセグメントを含み、例えば、ＧとＳからなる柔軟性ペプチドセグメントを含み、前記柔軟性ペプチドセグメントの長さは、２～５０個以上のアミノ酸であり、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５又は５０個のアミノ酸であり、
好ましくは、前記Ｌは、剛性単位を１つまたは複数含み、前記剛性単位は剛性アミノ酸を含むか又は本質的に剛性アミノ酸からなり、前記剛性アミノ酸にはＶ、Ｐ、Ｉ、Ｋ及びＬが含まれるがこれらに限定されなく、
より好ましくは、前記剛性単位は、ＰＰＰＸ １ ＬＰ（配列番号１２５）を１つまたは複数含み、Ｘ １ は任意のアミノ酸であり、
より好ましくは、前記剛性単位は、Ｘ ２ ＡＰＰＰＸ １ ＬＰ（配列番号１２６）を１つまたは複数含み、Ｘ １ は任意のアミノ酸で、Ｘ ２ はＫ又はＶである、＜１１＞又は＜１２＞に記載の融合タンパク質。
＜１４＞
前記剛性単位が以下の配列：
ＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１２７）、
ＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１２８）、及び
ＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１２９）から選択されたポリペプチド断片を含み、
好ましくは、前記剛性単位が以下の配列：
ＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１３０）、
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１３１）、及び
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１３２）から選択されたポリペプチド断片を含む、＜１３＞に記載の融合タンパク質。
＜１５＞
前記Ｌが以下の配列：
から選択されたポリペプチド断片を含む、＜１１＞～＜１４＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
＜１６＞
＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
＜１７＞
＜１６＞に記載のポリヌクレオチドを含み、好ましくは、ＣＨＯ細胞である、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を発現する細胞。
＜１８＞
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を発現する条件下で、＜１７＞に記載の細胞を培養する工程を含み、
好ましくは、前記インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、前記部位特異的プロテアーゼ切断部位を切断可能な部位特異的プロテアーゼと接触させる工程をさらに含み、
前記培養工程及び接触工程が同時に又は別々に行われる、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生産方法。
＜１９＞
＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は＜１０＞～＜１５＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
＜２０＞
＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は＜１０＞～＜１５＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質を必要とする対象に投与することを含み、好ましくは、前記糖尿病がＩ型又はＩＩ型糖尿病である、血糖の低減方法及び／又は糖尿病の治療方法。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮＧＧＡＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
本願発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
第１の部分と第２の部分とを含むインスリン－Ｆｃ融合タンパク質であって、前記第１の部分がインスリン活性を提供するインスリン部分であり、前記第２の部分が前記第１の部分の生体内半減期を延長する作用を有するＦｃ部分であり、前記第１の部分と前記第２の部分が共有結合により連結され、前記インスリン－Ｆｃ融合タンパク質が切断された後にインスリン活性を有する、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質。
＜２＞
下記の式（Ｉ）の構造を有する、＜１＞に記載のインスリン－Ｆｃ融合タンパク質。
Ｘ－Ｅ１－Ｙ－Ｅ２－Ｚ－Ｌ－Ｆｃ （Ｉ）
（ただし、ＸとＺはそれぞれインスリンのＢ鎖とＡ鎖であり、かつ、ＸがＢ鎖である場合、ＺはＡ鎖であり、ＸはＡ鎖である場合、ＺはＢ鎖であり、
Ｙは、任意のリンカーペプチドであり、Ｙの長さは１～１００個以上のアミノ酸であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個、又は上記の任意の２つの数値の間にある個数のアミノ酸であり、例えば、ＹはインスリンＣペプチド又はその変異体又はその断片であり、
Ｅ１及びＥ２は、一方又は両方とも存在する場合があり、部位特異的プロテアーゼ切断部位を含むアミノ酸の断片であり、Ｅ１及びＥ２の長さは１～１０個以上のアミノ酸であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸であり、
同時に存在する場合、Ｅ１及びＥ２は、同一または異なる部位特異的プロテアーゼにより切断され、例えば、同一の部位特異的プロテアーゼにより切断され、
Ｙが存在する場合は、Ｅ１及びＥ２の両方が存在することが好ましく、Ｙが存在しない場合は、Ｅ１及びＥ２の一方が存在することが好ましく、
前記部位特異的プロテアーゼ切断部位は、Ｋｅｘ２及び／又はフリン（Ｆｕｒｉｎ）プロテアーゼの切断部位であり、例えば、Ｋｅｘ２プロテアーゼの切断部位であり、
Ｌは、ＺとＦｃを連結するリンカーであり、アミノ酸断片又は非ペプチド鎖の化学構造であり、
Ｆｃは免疫グロブリンのＦｃ領域であり、前記Ｆｃはヒト免疫グロブリンに由来し、前記Ｆｃ領域はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域であり、ＩｇＧに由来するＦｃ領域であることが好ましく、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＦｃ領域であり、ＩｇＧ２に由来するＦｃ領域であることがさらに好ましく、
前記Ｆｃ領域は、その由来の配列と比較して、半減期を延長する能力を保持しながら１つまたは複数の置換、付加及び／又は欠失を有し、例えば、ヒトＩｇＧに由来するＦｃ領域でありながらＦｃγＲへの結合を低減又は除去する変異及び／又はＦｃＲｎへの結合を増強する１つまたは複数の変異を有し、
前記変異は、Ｎ２９７Ａ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ２５０Ｒ／Ｍ４２８Ｌから選択され、
前記Ｆｃ領域は、グリコシル化されているか又は非グリコシル化されている。）
＜３＞
前記Ｌがポリペプチド断片であり、
好ましくは、前記Ｌは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＳｅｒから選択された１つ又は２つ以上のアミノ酸の柔軟性ペプチドセグメントを含み、例えば、ＧとＳからなる柔軟性ペプチドセグメントを含み、
前記柔軟性ペプチドセグメントの長さは、２～５０個以上のアミノ酸であり、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５又は５０個のアミノ酸であり、
好ましくは、前記Ｌは、剛性単位を１つまたは複数含み、前記剛性単位は剛性アミノ酸を含むか又は本質的に剛性アミノ酸からなり、前記剛性アミノ酸にはＶ、Ｐ、Ｉ、Ｋ及びＬが含まれるがこれらに限定されなく、
より好ましくは、前記剛性単位は、ＰＰＰＸ １ ＬＰ（配列番号１２５）を１つまたは複数含み、Ｘ １ は任意のアミノ酸であり、
より好ましくは、前記剛性単位は、Ｘ ２ ＡＰＰＰＸ １ ＬＰ（配列番号１２６）を１つまたは複数含み、Ｘ １ は任意のアミノ酸で、Ｘ ２ はＫ又はＶである、＜１＞又は＜２＞に記載の融合タンパク質。
＜４＞
前記剛性単位が以下の配列：
ＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１２７）、
ＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１２８）、および
ＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１２９）から選択されたポリペプチド断片を含み、
好ましくは、前記剛性単位が以下の配列：
ＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１３０）、
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１３１）、及び
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１３２）から選択されたポリペプチド断片を含む、＜３＞に記載の融合タンパク質。
＜５＞
前記Ｌが以下の配列：
から選択されたポリペプチド断片を含む、＜１＞～＜４＞に記載の融合タンパク質。
＜６＞
前記インスリンは、ヒトインスリン、ウシインスリン又はブタインスリンから選択され、好ましくはヒトインスリンであり、例えば、前記インスリンのＡ鎖及びＢ鎖がヒトインスリンに由来する、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
＜７＞
Ｙ、Ｅ１及びＥ２がすべて存在するか、又はＹが存在せず、Ｅ１及びＥ２のうちの１つが存在する、＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
＜８＞
配列番号４７～７２から選択されたアミノ酸配列を有する、＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
＜９＞
＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質と前記部位特異的プロテアーゼ切断部位を切断可能な部位特異的プロテアーゼとを接触させることを含み、好ましくは前記部位特異的プロテアーゼがＫｅｘ２及び／又はＦｕｒｉｎプロテアーゼである、増強されたインスリン活性及び延長された半減期を有するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生産方法。
＜１０＞
＜９＞に記載の方法より得られる、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質。
＜１１＞
Ｉｎｓ－Ｌ－Ｆｃ構造を有するインスリン－Ｆｃ融合タンパク質。
（ただし、Ｉｎｓは、共有結合により連結されたインスリンＡ鎖とＢ鎖とを含むインスリン活性を提供するインスリン部分であり、Ａ鎖及びＢ鎖は異なるペプチド鎖中にあり、前記共有結合は、好ましくはジスルフィド結合であり、
Ｌは、ＺとＦｃを連結するリンカーであり、アミノ酸断片であるか又は非ペプチド鎖の化学構造であり、
Ｆｃは免疫グロブリンのＦｃ領域であり、前記Ｆｃはヒト免疫グロブリンに由来し、前記Ｆｃ領域はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域であり、ＩｇＧに由来するＦｃ領域であることが好ましく、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＦｃ領域であり、ＩｇＧ２に由来するＦｃ領域であることがさらに好ましく、
前記Ｆｃ領域は、その由来の配列と比較して、半減期を延長する能力を保持しながら１つまたは複数の置換、付加及び／又は欠失を有し、例えば、ヒトＩｇＧに由来するＦｃ領域でありながらＦｃγＲへの結合を低減又は除去する変異及び／又はＦｃＲｎへの結合を増強する１つまたは複数の変異を有し、
前記変異は、Ｎ２９７Ａ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ２５０Ｒ／Ｍ４２８Ｌから選択され、
前記Ｆｃ領域は、グリコシル化されているか又は非グリコシル化されている。）
＜１２＞
前記インスリンは、ヒトインスリン、ウシインスリン又はブタインスリンから選択され、好ましくはヒトインスリンであり、例えば、前記インスリンのＡ鎖及びＢ鎖がヒトインスリンに由来する、＜１１＞に記載の融合タンパク質。
＜１３＞
前記Ｌがポリペプチド断片であり、
好ましくは、前記Ｌは、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ及びＳｅｒから選択された１つ又は２つ以上のアミノ酸の柔軟性ペプチドセグメントを含み、例えば、ＧとＳからなる柔軟性ペプチドセグメントを含み、前記柔軟性ペプチドセグメントの長さは、２～５０個以上のアミノ酸であり、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５又は５０個のアミノ酸であり、
好ましくは、前記Ｌは、剛性単位を１つまたは複数含み、前記剛性単位は剛性アミノ酸を含むか又は本質的に剛性アミノ酸からなり、前記剛性アミノ酸にはＶ、Ｐ、Ｉ、Ｋ及びＬが含まれるがこれらに限定されなく、
より好ましくは、前記剛性単位は、ＰＰＰＸ １ ＬＰ（配列番号１２５）を１つまたは複数含み、Ｘ １ は任意のアミノ酸であり、
より好ましくは、前記剛性単位は、Ｘ ２ ＡＰＰＰＸ １ ＬＰ（配列番号１２６）を１つまたは複数含み、Ｘ １ は任意のアミノ酸で、Ｘ ２ はＫ又はＶである、＜１１＞又は＜１２＞に記載の融合タンパク質。
＜１４＞
前記剛性単位が以下の配列：
ＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１２７）、
ＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１２８）、及び
ＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１２９）から選択されたポリペプチド断片を含み、
好ましくは、前記剛性単位が以下の配列：
ＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１３０）、
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰ（配列番号１３１）、及び
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰ（配列番号１３２）から選択されたポリペプチド断片を含む、＜１３＞に記載の融合タンパク質。
＜１５＞
前記Ｌが以下の配列：
から選択されたポリペプチド断片を含む、＜１１＞～＜１４＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
＜１６＞
＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
＜１７＞
＜１６＞に記載のポリヌクレオチドを含み、好ましくは、ＣＨＯ細胞である、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を発現する細胞。
＜１８＞
インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を発現する条件下で、＜１７＞に記載の細胞を培養する工程を含み、
好ましくは、前記インスリン－Ｆｃ融合タンパク質を、前記部位特異的プロテアーゼ切断部位を切断可能な部位特異的プロテアーゼと接触させる工程をさらに含み、
前記培養工程及び接触工程が同時に又は別々に行われる、インスリン－Ｆｃ融合タンパク質の生産方法。
＜１９＞
＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は＜１０＞～＜１５＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
＜２０＞
＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は＜１０＞～＜１５＞のいずれか１項に記載の融合タンパク質を必要とする対象に投与することを含み、好ましくは、前記糖尿病がＩ型又はＩＩ型糖尿病である、血糖の低減方法及び／又は糖尿病の治療方法。
【図1A】
【図1B】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【配列表】