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▶ ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-02
(45)【発行日】2024-08-13
(54)【発明の名称】ＦｉｍＨ変異体、それを含む組成物、及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/245 20060101AFI20240805BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240805BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240805BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240805BHJP
A61P 13/02 20060101ALI20240805BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240805BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240805BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240805BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240805BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240805BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240805BHJP
【ＦＩ】
C07K14/245
C12N15/31 ZNA
A61K38/16
A61P43/00 105
A61P13/02 105
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2023541784
(86)(22)【出願日】2022-01-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2024-01-23
(86)【国際出願番号】 IB2022050166
(87)【国際公開番号】W WO2022153166
(87)【国際公開日】2022-07-21
【審査請求日】2023-12-06
(31)【優先権主張番号】21151126.6
(32)【優先日】2021-01-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】514010601
【氏名又は名称】ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100186897
【弁理士】
【氏名又は名称】平川 さやか
(72)【発明者】
【氏名】グリープストラ，ヤン
(72)【発明者】
【氏名】ウェールデンブルグ，エヴリン，マーリーン
(72)【発明者】
【氏名】ゲウルトセン，イェルーン
(72)【発明者】
【氏名】フェイ，ケレン，クリスティーナ
(72)【発明者】
【氏名】ファイツマ，ロウリス，ヤコブ
【審査官】松村 真里
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１８３５０１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第０２／１０２９７４（ＷＯ，Ａ２）
【文献】米国特許第６７３７０６３（ＵＳ，Ｂ２）
【文献】Proteins，2019年，Vol.88, No.4，p.593-603
【文献】Folia Microbiologica，2019年，Vol.64, No.4，p.587-600
【文献】JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，2013年，Vol.288, No.33，p.24128-24139
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＦｉｍＨレクチンドメインを含み、前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、配列番号１の７１位に対応する位置にチロシン（Ｙ）を含み、
前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、表面プラズモン共鳴を使用して測定した場合に、マンノースリガンドへの結合について少なくとも１０００ｎＭ以上のＫＤを有する、ポリペプチド。
【請求項2】
配列番号１の１４４位に対応する位置にバリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、及びアラニン（Ａ）からなる群から選択されるアミノ酸を更に含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、配列番号１の１４４位に対応する位置にバリン（Ｖ）を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
ＦｉｍＨピリンドメインを更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項5】
配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＦｉｍＨレクチンドメインを含み、前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、配列番号１の７１位に対応する位置にチロシン（Ｙ）を含む、ポリペプチド。
【請求項6】
前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、配列番号１と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項7】
配列番号１の１４４位に対応する位置にバリン（Ｖ）をさらに含む、請求項５または６に記載のポリペプチド。
【請求項8】
７１位がチロシン（Ｙ）であり、１４４位がバリン（Ｖ）である配列番号１のアミノ酸を含む、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項9】
配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する全長ＦｉｍＨである、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項10】
配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有する全長ＦｉｍＨである、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項11】
配列番号４及び５の少なくとも１つのアミノ酸２２～３００と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、US6,737,063に記載されている配列番号２３～４５及び５５のうちの少なくとも１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の７１位に対応する位置にチロシン（Ｙ）を含む、ＦｉｍＨポリペプチド。
【請求項12】
配列番号１の１４４位に対応する位置にバリン（Ｖ）を更に含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項14】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項15】
請求項１３に記載のポリヌクレオチド又は請求項１４に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項16】
請求項１～１２のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１３に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１４に記載のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項17】
腸内細菌（Enterobacteriaceae）科の細菌に対する免疫応答の誘導に使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１３に記載のポリヌクレオチド、請求項１４に記載のベクター、又は請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項18】
対象における大腸菌によって引き起こされる尿路感染症の予防又は治療において使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１３に記載のポリヌクレオチド、請求項１４に記載のベクター、又は請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項19】
ＦｉｍＨレクチンドメインを含むポリペプチドを産生するための方法であって、前記ポリペプチドを、請求項１３に記載のポリヌクレオチド及び／又は請求項１４に記載のベクターを含む組換え細胞から発現させることを含む、方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医学微生物学及びワクチンの分野に関する。具体的には、本発明は、ＦｉｍＨレクチンドメインをマンノースに対して低親和性を有する立体構造にする少なくとも１つのアミノ酸変異を含む、ＦｉｍＨレクチンドメインを含み、対象への投与時に、膀胱上皮細胞への大腸菌（E. coli）の接着の高レベルの抗体媒介性阻害を誘導する、ポリペプチドに関する。更に、本発明は、そのようなポリペプチドを含む組成物、及び免疫応答の刺激を、それを必要とする対象において免疫原性ポリペプチドの投与によって行う方法に関する。
【背景技術】
【0002】
腸外感染症の原因である大腸菌（E. coli）株は、腸外病原性大腸菌（extra-intestinal pathogenic E. coli、ＥｘＰＥＣ）と呼ばれている。ＥｘＰＥＣは、外来通院、長期治療、及び病院の環境において腸外感染症を引き起こす最も一般的な腸内グラム陰性生物である。大腸菌に起因する典型的な腸外感染症としては、尿路感染症（ＵＴＩ）、菌血症、及び敗血症が挙げられる。大腸菌は、重症敗血症の主因であり、高い罹患率及び死亡率の原因である。
【0003】
ＥｘＰＥＣは、腸内細菌（Enterobacteriaceae）科の他のメンバーと同様に、粘膜上皮表面への付着を補助するＩ型線毛を産生する。これらのＩ型線毛は、腸内細菌科のメンバーの表面から生じる毛髪様構造である。Ｉ型線毛の主要な成分は、右巻きの螺旋状に配置されるＦｉｍＡのサブユニットが繰り返されて、中心軸に孔を有する長さおよそ１μｍ及び直径７ｎｍのフィラメントを形成したものである。主サブユニットとしてのＦｉｍＡと共に、線毛フィラメントはまた、副タンパク質サブユニットとしてＦｉｍＦ、ＦｉｍＧ、及びＦｉｍＨも含む。副タンパク質サブユニットＦｉｍＨは、真核細胞表面上のマンノース含有糖タンパク質へのＩ型線毛細菌の付着を促進するマンナン結合アドヘシンであり、マンナン及びフィブロネクチンを含む様々な標的に結合するタンパク質のファミリーを表す。免疫電子顕微鏡研究により、ＦｉｍＨが、Ｉ型線毛の遠位端に戦略的に配置され、そこでＦｉｍＧと複合体を形成して柔軟な線毛構造を形成すると見られており、フィラメントに沿って様々な間隔で長手方向にも配置されることが明らかとなった。
【0004】
ＦｉｍＨアドヘシンタンパク質は、ＵＴＩに対する様々な前臨床モデルにおいてワクチンとして使用された場合に、防御を誘導することが示されている（Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：６０７－６１１、Ｌａｎｇｅｒｍａｎｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，１８１：７７４－７７８、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ＶＰ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２：１６１９６）。
【0005】
大腸菌感染中、マンノシル化受容体に結合するアドヘシンＦｉｍＨのレクチンドメインは、マンノースに対して低親和性（緊張）及びマンノースに対して高親和性（伸長／弛緩）という２つの異なる立体構造を取り得ることが示されている（Ｋａｌａｓ ｅｔ ａｌ，２０１７，Ｓｃｉ Ａｄｖ １０；３（２））。低親和性の立体構造は、細菌の運動性及び新しい組織のコロニー形成を促進する。高親和性の立体構造は、尿排泄の機械的な力の下での強固な細菌接着を確実にする。更に、低親和性バリアントに対する抗体は、尿路上皮細胞への細菌結合を遮断し、膀胱内のＣＦＵ数を減少させることが示された（Ｔｃｈｅｓｎｏｋｏｃａ，２０１１ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．７９（１０）：３８９５－９０４；Ｋｉｓｉｅｌａ，２０１３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９；１１０（４７）：１９０８９－９４）。
【0006】
国際公開第０２１０２９７４号は、多数のＦｉｍＨ変異体について記載しており、これらは全て、分子の渓谷領域（canyon region）にアミノ酸改変を含む。具体的には、国際公開第０２１０２９７４号は、結合ポケット内のマンノース相互作用残基が変異されているバリアントについて記載している。この変異の位置は、ＦｉｍＨ変異体をより開いた立体構造に保ち、それによって、野生型タンパク質ではアクセスしにくいエピトープを露出させるので、選択されている。しかしながら、現在までに、本発明者らの知る限りでは、これらの変異体のいずれも、ワクチン候補として更に追究されてはいない。臨床試験では、野生型ＦｉｍＨのみが使用されている。
【発明の概要】
【0007】
したがって、大腸菌によって引き起こされる細菌感染症に対して高度に阻害性の抗体を誘導することができるワクチンが、当該技術分野において依然として必要とされている。
【0008】
第１の態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列の７１位に対応する位置にフェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸を含むＦｉｍＨレクチンドメインを含む、ポリペプチドを提供する。
【0009】
第２の態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列の１４４位に対応する位置にフェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸を更に含む、第１の態様に記載のＦｉｍＨレクチンドメインを含むポリペプチドを提供する。
【0010】
第３の態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
【0011】
第４の態様において、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。
【0012】
第５の態様において、本発明は、本発明によるポリヌクレオチド又はベクターを含む、宿主細胞を提供する。
【0013】
第６の態様において、本発明は、本発明によるポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はベクターを含む、医薬組成物を提供する。
【0014】
第７の態様において、本発明は、腸内細菌（Enterobacteriaceae）科の細菌に対する免疫応答の誘導に使用するための、本発明によるポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、又は本発明による医薬組成物を提供する。本発明は更に、腸内細菌に関連する状態の治療又は予防を、それを必要とする対象において行うための方法であって、有効量の本発明によるポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、又は本発明による医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【0015】
第８の態様において、本発明は、ポリペプチドを産生するための方法であって、本発明のポリヌクレオチド及び／又は本発明のベクターを含む組換え細胞からポリペプチドを発現させることを含み、任意選択で、ポリペプチドを回収することであって、これに、任意選択で、ポリペプチドの医薬組成物への製剤化が続く、ことを更に含む、方法を更に提供する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1A】異なるＦｉｍＨバリアントによって誘導される抗体の機能性である。ウィスターラットに、非フロイントアジュバント（Ｓｐｅｅｄｙ－ラットモデル、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）と組み合わせた６０ｕｇ／用量の異なるＦｉｍＨバリアントを、０日目、７日目、１０日目、及び１８日目に、４回の筋肉内免疫付与を受容させた。血清試料を、０日目（免疫付与前）及び２８日目（免疫付与後）に得た。 Ａ）様々なＦｉｍＨバリアント（グラフの下に示される）を用いた初回実験。阻害性抗体力価（ＩＣ５０）を、１２段階希釈曲線に当てはめた４パラメーターのロジスティック回帰モデルに基づいて計算した。データは、２匹の動物／群からの二連の血清試料の平均を表す。
【図1B】異なるＦｉｍＨバリアントによって誘導される抗体の機能性である。ウィスターラットに、非フロイントアジュバント（Ｓｐｅｅｄｙ－ラットモデル、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）と組み合わせた６０ｕｇ／用量の異なるＦｉｍＨバリアントを、０日目、７日目、１０日目、及び１８日目に、４回の筋肉内免疫付与を受容させた。血清試料を、０日目（免疫付与前）及び２８日目（免疫付与後）に得た。 Ｂ）ＦｉｍＨ変異体Ｆ１４４Ｖ、Ｆ７１Ｙ、及びＦ１４４Ｖ／Ｆ７１Ｙ二重変異体を用いた別個の実験。阻害性抗体力価（ＩＣ５０）を、６段階希釈曲線に当てはめた４パラメーターのロジスティック回帰モデルに基づいて計算した。グラフは、二連に測定した血清試料の免疫付与前及び免疫付与後の個々のＩＣ５０力価、並びにＧＭＴ（幾何平均力価）±９５％ＣＩ（信頼区間）を示す。ＬＯＤ：検出限界。
【図2A】ＮＭＲスペクトル法によって決定されたマンノシドリガンドの存在下及び不在下における異なるＦｉｍＨレクチンドメインバリアントの立体構造状態である。左のパネルは、マンノシドリガンドが結合していない（例えば、アポ状態の）ときの低親和性状態（Ｌ）の一様に１５Ｎで標識したＦｉｍＨＬＤバリアントの１５Ｎ ＨＳＱＣ ＮＭＲスペクトルを示し、右のパネルは、マンノシドリガンドが結合している（例えば、リガンド状態の）ときの高親和性状態（Ｈ）のスペクトルを示す。マンノシドリガンドの結合時に化学シフトを受ける重要なアミノ酸残基が、枠内に示されている。残基は、公けに入手可能な大腸菌（E coli）Ｋ１２由来のＮＭＲスペクトルから同定されている（Ｒａｂｂａｎｉ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１８，２９３（５）：１８３５－１８４９）が、大腸菌２３－１０に特異的であった残基番号１及び２は除き、このことは、野生型ＦｉｍＨＬＤ ２３－１０タンパク質が、大腸菌Ｋ１２のＦｉｍＨＬＤと比較して、アポ状態においてわずかに異なる立体構造を有することを示す。
【図2B】ＮＭＲスペクトル法によって決定されたマンノシドリガンドの存在下及び不在下における異なるＦｉｍＨレクチンドメインバリアントの立体構造状態である。左のパネルは、マンノシドリガンドが結合していない（例えば、アポ状態の）ときの低親和性状態（Ｌ）の一様に１５Ｎで標識したＦｉｍＨＬＤバリアントの１５Ｎ ＨＳＱＣ ＮＭＲスペクトルを示し、右のパネルは、マンノシドリガンドが結合している（例えば、リガンド状態の）ときの高親和性状態（Ｈ）のスペクトルを示す。マンノシドリガンドの結合時に化学シフトを受ける重要なアミノ酸残基が、枠内に示されている。残基は、公けに入手可能な大腸菌（E coli）Ｋ１２由来のＮＭＲスペクトルから同定されている（Ｒａｂｂａｎｉ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１８，２９３（５）：１８３５－１８４９）が、大腸菌２３－１０に特異的であった残基番号１及び２は除き、このことは、野生型ＦｉｍＨＬＤ ２３－１０タンパク質が、大腸菌Ｋ１２のＦｉｍＨＬＤと比較して、アポ状態においてわずかに異なる立体構造を有することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明は、ＦｉｍＨレクチンドメインを含む新規なポリペプチドであって、ＦｉｍＨレクチンドメインが、マンノースに対して低親和性を有する立体構造（本明細書において「低親和性立体構造」とも称される）に「固定」されている、ポリペプチドを提供する。本発明は、マンノースに対して低親和性の立体構造にあるＦｉｍＨ抗原が、マンノシドを介した接着を阻害し得る抗体を誘導することができるという観察に、部分的に基づく。これらの抗体は、高度に阻害性であり、細菌感染症の予防又は治療において、増強された効果を有する。本明細書において、Ｆ７１Ｙ変異を有するＦｉｍＨレクチンドメインが、例えば、例として再発性ＵＴＩを予防又は低減するための、ＵＴＩに対するワクチンにおいて使用するのに非常に好適なものとなる、望ましい特性の驚くほど良好な組み合わせを有することが見出された。
【0018】
したがって、第１の態様において、本発明は、配列番号１の参照アミノ酸配列の７１位に対応する位置にフェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸を含むＦｉｍＨレクチンドメインを含む、ポリペプチド、好ましくは、免疫原性ポリペプチドを提供する。
【0019】
第２の態様において、本発明は更に、配列番号１の参照アミノ酸配列のそれぞれ７１位及び１４４位に対応する両方の位置にフェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸を含むＦｉｍＨレクチンドメインを含む、ポリペプチド、好ましくは、免疫原性ポリペプチドを提供する。この「二重変異体」は、低親和性立体構造に固定されたままであり、したがって、同様に、マンノシドを介した接着を阻害し得る抗体を誘導することができる。これらの阻害性抗体を誘導することに加えて、ＦｉｍＨレクチンドメインのＦ７１Ｙ及びＦ１４４Ｖ二重変異体は、高親和性立体構造に戻るように切り替えることができず、これによって二重変異体に驚くほど高い安定性がもたらされることが、本明細書において見出された。この高親和性立体構造に戻るように切り替えることができないことは、二重変異体が、例えば、例として再発性ＵＴＩを予防又は低減するための、ＵＴＩに対するワクチンにおいて使用するのに非常に好適なものとなる、非常に望ましい特性であるが、これは、とりわけ、保管中又は他の保管若しくは使用条件下において立体構造が安定であるかどうかを試験するための追加の品質又は安定性管理を必要としないことが確実であるためである。
【0020】
本明細書に使用される場合、アミノ酸７１位置及び１４４位置は、それぞれ、配列番号１のＦｉｍＨレクチンドメインの参照アミノ酸配列の７１位置及び１４４位を指す。配列番号１以外の本発明のアミノ酸配列において、好ましくは、アミノ酸７１位及び１４４位は、それぞれ、配列アライメント、好ましくは、デフォルト設定を使用したＣｌｕｓｔａｌＷ（１．８３）配列アライメントにおいて、その他のアミノ酸配列の、配列番号１の７１位及び１４４位に対応する位置に存在する。当業者であれば、上記で定義したアミノ酸配列アライメントアルゴリズムを使用して、配列番号１以外のＦｉｍＨレクチンドメインアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置を同定する方法を把握しているであろう。
【0021】
本出願全体を通じて、配列番号１のアミノ酸配列の７１位に対応する位置にフェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸を含むＦｉｍＨレクチンドメインを含む本発明のポリペプチドは、本明細書において、「ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）」と称される。同様に、配列番号１のアミノ酸配列の、それぞれ７１位及び１４４位に対応する両方の位置にフェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸を含むＦｉｍＨレクチンドメインを含む本発明のポリペプチドは、本明細書において、「ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）」と称される。
【0022】
ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）は、配列番号１の７１位に対応する位置にチロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）の群から選択されるアミノ酸を含む。
【0023】
ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）は、配列番号１の７１位に対応する位置にチロシン（Ｙ）を含む。
【0024】
ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）は、配列番号１の１４４位に対応する位置にバリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、及びアラニン（Ａ）からなる群から選択されるアミノ酸を含む。
【0025】
ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）は、配列番号１の１４４位に対応する位置にバリン（Ｖ）を含む。
【0026】
ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）及びＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）レクチンドメインのうちの少なくとも１つは、配列番号１との少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【0027】
一実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）は、ＦｉｍＨレクチンドメインをマンノース立体構造に対して低親和性にする少なくとも１つの変異を含む。一実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）は、配列番号１の７１位に対応する位置において変異されている。一実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）は、配列番号１の７１位及び１４４位に対応する位置において変異されている。
【0028】
この文脈におけるマンノースに対して低親和性を有するＦｉｍＨレクチンドメインとは、本明細書において、例えば、実施例２において指定される条件下で、表面プラズモン共鳴を使用して測定した場合に少なくとも１０００ｎＭ以上の解離定数（ＫＤ）でマンノシドリガンドに結合するＦｉｍＨレクチンドメインとして定義される。マンノースに対して高親和性を有するＦｉｍＨレクチンドメインとは、本明細書において、同じ条件下で、１００ｎＭ以下のＫＤでマンノシドリガンドに結合するＦｉｍＨレクチンドメインとして定義され、典型的には、野生型ＦｉｍＨが、このカテゴリーに入る。これらの条件下で１００ｎＭ～１０００ｎＭのＫＤを有するＦｉｍＨレクチンドメインは、本明細書において、マンノースに対して中等度の親和性を有すると称される。
【0029】
この文脈における「変異体」、「変異」、「変異された」、又は「置換」、「置換された」という用語は、対応する親分子（ここでは、７１位及び１４４位にＦを有するＦｉｍＨレクチンドメインを含むポリペプチドである）におけるものではない示された位置において、別のアミノ酸が存在することを意味する。そのような親分子は、物理的にポリペプチドとして又はそのようなポリペプチドをコードする核酸の形態で存在し得るが、アミノ酸配列又はアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列として、単にインシリコ又は理論上で存在してもよい。したがって、この文脈における変異又は置換はまた、例えば、タンパク質が、変異又は置換をコードするように合成された核酸から発現される場合、対応する親分子をコードする核酸がプロセス中に最初に実際に調製されなかった場合であっても、例えば、核酸分子が化学合成によって完全に調製されている場合であっても、存在すると考えられる。
【0030】
好ましくは、変異は、単一のアミノ酸残基の置換である。変異は、好ましくは、それぞれ、配列番号１の７１位及び１４４位のうちの少なくとも１つに対応するアミノ酸残基の置換である。好ましくは、変異は、配列番号１の７１位に対応する位置におけるフェニルアラニン（Ｆ）の別のアミノ酸による置換である。好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号１の１４４位に対応する位置におけるフェニルアラニン（Ｆ）の別のアミノ酸による置換を更に含む。ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）の場合には、配列番号１の７１位に対応する位置は、好ましくは、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択されるアミノ酸で置換される。１つの好ましい実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）は、７１位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からチロシン（Ｙ）への置換を含む。ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）は、７１位にチロシンを含む非天然のポリペプチドである。ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）は、７１位に天然に存在するフェニルアラニンの代わりにチロシンを有する（「ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ）」と称される）。ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）は、７１位にフェニルアラニン以外の天然に存在するアミノ酸の代わりにチロシンを有する（「ＦｉｍＨ（ｘ７１Ｙ）」、式中、ｘは、親分子におけるフェニルアラニン又はチロシン以外のアミノ酸である）。
【0031】
一実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）は、配列番号１の７１位及び１４４位に対応する位置に変異を含む。７１位における変異は、好ましくは、本明細書に記載の置換である。１４４位における変異は、好ましくは、配列番号１の１４４位に対応するアミノ酸残基の置換である。好ましくは、変異は、配列番号１の１４４位に対応する位置におけるフェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸残基の置換である。好ましくは、１４４位におけるアミノ酸は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、及びアラニン（Ａ）からなる群から選択されるアミノ酸によって置換される。１つの好ましい実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）は、１４４位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換を含む。
【0032】
ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）は、７１位にチロシン及び１４４位にバリンを含む、非天然のポリペプチドである。ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）は、７１位に天然に存在するフェニルアラニンの代わりにチロシンを有し、１４４位に天然に存在するフェニルアラニンの代わりにバリンを有する。ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）は、７１位にフェニルアラニン以外の天然に存在するアミノ酸の代わりにチロシン、及び１４４位にフェニルアラニン以外の天然に存在するアミノ酸の代わりにバリンを有する。
【0033】
全長ＦｉｍＨＦＬは、２つのドメイン：短いテトラペプチドループリンカーによってＣ末端ピリンドメイン（ＦｉｍＨＰＤ）に接続されたＮ末端レクチンドメイン（ＦｉｍＨＬＤ）から構成される。本発明のある特定の実施形態において、本発明によるＦｉｍＨレクチンドメインを含むポリペプチドは、ＦｉｍＨピリンドメインを含まない。本発明の別の実施形態において、本発明によるＦｉｍＨレクチンドメインを含むポリペプチドは、ＦｉｍＨピリンドメインを更に含む。一実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）は、ＦｉｍＨレクチンドメインが、それぞれ、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）及びＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）について本明細書で上記に定義されているアミノ酸配列を含む、全長ＦｉｍＨポリペプチドである。本発明のある特定の実施形態において、本発明によるＦｉｍＨレクチンドメインを含むポリペプチドは、別のポリペプチドに融合されたＦｉｍＨレクチンドメインの融合ポリペプチドであり、この他のポリペプチドは、目的の任意のポリペプチドであってもよく、これは、ＦｉｍＨに関連している必要も、天然でＦｉｍＨと会合している必要もない。ある特定の実施形態において、本発明のＦｉｍＨレクチンドメインを含むポリペプチドは、ＦｉｍＨピリンドメインを更に含み、加えて別のポリペプチドを含む、融合ポリペプチドであり、この他のポリペプチドは、目的の任意のポリペプチドであってもよく、これは、ＦｉｍＨに関連している必要も、天然でＦｉｍＨと会合している必要もない。本発明の融合ポリペプチドは、例えば、ワクチン接種の目的で、免疫原として使用することもできる。
【0034】
一実施形態において、ＦｉｍＨＦＬポリペプチドは、配列番号２との少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、それによって、好ましくは、７１位又は７１位及び１４４位は、それぞれ、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）及びＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）について本明細書で上記に定義されているアミノ酸残基を含む。ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨＦＬポリペプチドは、本明細書に記載のＦ７１Ｙ及び任意選択でＦ１４４Ｖ置換を除いて、配列番号２を有する配列を含んでもよい。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号４との、又は好ましくは少なくともそのアミノ酸２２～３００との少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＦｉｍＨＦＬであり、それによって、７１位又は７１位及び１４４位は、それぞれ、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）及びＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）について本明細書で上記に定義されているアミノ酸残基を含む。ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨＦＬポリペプチドは、本明細書に記載されるＦ７１Ｙ及び／又はＦ１４４Ｖ置換を除いて、配列番号４又は少なくともそのアミノ酸２２～３００を有する配列を含み得る。
【0035】
ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨＦＬポリペプチドは、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，７３７，０６３号に記載されている配列番号２３～４５及び５５との少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、それによって、７１位又は７１位及び１４４位は、それぞれ、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）及びＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）について本明細書で上記に定義されているアミノ酸残基を含む。
【0036】
ＦｉｍＨポリペプチドは、大腸菌の様々な株の間で高度に保存されており、それらはまた、広範囲のグラム陰性菌間でも高度に保存されている。更に、株間で生じるアミノ酸変化は、概して、類似のアミノ酸位置で生じる。大腸菌株の間でのＦｉｍＨの高度な保存の結果として、１つの株に由来するＦｉｍＨポリペプチドは、ＦｉｍＨレクチンによって他の大腸菌株が細胞に結合するのを阻害若しくは防止し、並びに／又は他の大腸菌株によって引き起こされる感染症に対する保護及び／若しくは治療を提供する、抗体応答を誘導することができる。したがって、一実施形態において、ＦｉｍＨＦＬポリペプチドは、配列番号５との、又は好ましくは少なくともそのアミノ酸２２～３００との少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、それによって、７１位又は７１位及び１４４位は、それぞれ、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）及びＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）について本明細書で上記に定義されているアミノ酸残基を含む。ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨＦＬポリペプチドは、本明細書に記載されるＦ７１Ｙ置換、及び任意選択でＦ１４４Ｖ置換を除いて、配列番号５又は少なくともそのアミノ酸２２～３００を有する配列を含み得る。別の実施形態において、ＦｉｍＨＦＬポリペプチドは、配列番号６との少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、それによって、７１位又は７１位及び１４４位は、それぞれ、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）及びＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）について本明細書で上記に定義されているアミノ酸残基を含む。ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨＦＬポリペプチドは、本明細書に記載されるＦ７１Ｙ置換、及び任意選択でＦ１４４Ｖ置換を除いて、配列番号６を有する配列を含み得る。
【0037】
ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨは、好ましくは大腸菌ＦｉｍＨである。
【0038】
本明細書に使用される場合、「ペリプラズムシャペロン」という用語は、共通の結合エピトープ（複数可）の認識を介して様々なシャペロン結合タンパク質と複合体を形成することができる、細菌のペリプラズムに局在するタンパク質として定義される。シャペロンは、細菌細胞からペリプラズムに輸送されたタンパク質がそれらの天然の立体構造に折り畳まれるときに鋳型として機能する。シャペロン結合タンパク質とシャペロンとの会合はまた、ペリプラズム内に局在するプロテアーゼによる分解から結合タンパク質を保護する役割を果たし、水溶液中でのそれらの溶解度を増加させ、集合している線毛へのそれらの正しい順序での取り込みをもたらす。シャペロンタンパク質は、そのような集合を媒介することによって線毛の集合に関与するが、構造には組み込まれない、グラム陰性菌におけるタンパク質のクラスである。ＦｉｍＣは、ＦｉｍＨのペリプラズムシャペロンタンパク質である。本発明において使用するためのＦｉｍＣポリペプチドは、配列番号３との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態において、ＦｉｍＣポリペプチドは、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，７３７，０６３号に記載される配列番号２９との少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。ＦｉｍＣとＦｉｍＨとの非共有結合複合体は、ＦｉｍＣＨと命名される。
【0039】
したがって、更なる態様において、本発明は、本明細書で定義されるＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）を含み、本明細書で定義されるＦｉｍＨピリンドメイン又は全長ＦｉｍＨを更に含むポリペプチドと、本明細書で定義されるＦｉｍＣポリペプチドとを含む、複合体を提供する。
【0040】
本発明の一実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）レクチンドメインは、ＦｉｍＨピリンドメインを更に含むポリペプチドの一部であり、このポリペプチドは、ＦｉｍＣと複合体を形成して、ＦｉｍＣＨ複合体を形成する。
【0041】
本出願の発明者らは、異なるアミノ酸変化を有するいくつかのＦｉｍＨレクチンドメインバリアントを作製し、それらを、様々なアッセイにおいて、効率について試験している（実施例を参照されたい）。
【0042】
本明細書に記載されるＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）及びＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）は、いずれも、ＦｉｍＣＨ複合体を形成することができた。
【0043】
一実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）レクチンドメインは、配列番号２との少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＦｉｍＨＦＬポリペプチドの一部であり、これは、任意選択で、ＦｉｍＣポリペプチドと複合体を形成して、ＦｉｍＣＨ複合体を形成する。最終形態のＦｉｍＨＦＬポリペプチド、すなわち、成熟ＦｉｍＨＦＬポリペプチドは、典型的には、例えば配列番号４及び５のアミノ酸１～２１として示されるシグナルペプチドを含まず、すなわち、配列番号４又は配列番号５の成熟ＦｉｍＨＦＬポリペプチドは、これらの配列のアミノ酸２２～３００を含むが、典型的にはそのアミノ酸１～２１が欠如していることが理解される。ＦｉｍＨＦＬポリペプチドの組換え産生に関して、組換え宿主細胞においてシグナルペプチドを含む成熟ＦｉｍＨＦＬポリペプチドをコードし、ポリペプチドのペリプラズム位置につながる全般的な分泌経路を通じて内部（細胞質）膜を越えて輸送されること（「ペリプラズム発現」と称されることもある）が有用であるが、単離され、例えば医薬組成物において使用される最終的な成熟ＦｉｍＨＦＬポリペプチドにおいて、シグナルペプチドは、典型的には、ポリペプチドを発現している組換え細胞によるプロセシングの結果としてもはや存在しない。
【0044】
一実施形態において、ＦｉｍＣＨ複合体は、配列番号３との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有するＦｉｍＣタンパク質と、本明細書で上記に定義されているＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）レクチンドメインを含むＦｉｍＨタンパク質とを含むか、又はそれらからなる。ある特定の実施形態において、ＦｉｍＣＨ複合体は、配列番号３との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有するＦｉｍＣタンパク質と、本明細書で上記に定義されているＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）レクチンドメインを含むＦｉｍＨタンパク質又はＦｉｍＨＦＬタンパク質とを含むか、又はそれらからなり、それによって、ＦｉｍＨＦＬタンパク質は、好ましくは、（例えば、シグナルペプチドを依然として含む配列番号４又は５において）Ｆ９２置換を含む。任意選択で、ＦｉｍＣＨ複合体は、配列番号３との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有するＦｉｍＣタンパク質と、レクチンドメインにＦ７１（Ｙ）及びＦ１４４（Ｖ）置換を含むＦｉｍＨタンパク質、又は（例えば、シグナルペプチドを依然として含む配列番号４若しくは５において）Ｆ９２（Ｙ）及びＦ１６５（Ｖ）置換を含む全長ＦｉｍＨタンパク質を含むか、又はそれらからなる。
【0045】
シグナルペプチドを依然として含む全長ＦｉｍＨにおいて、アミノ酸９２位は、ＦｉｍＨレクチンドメインにおけるアミノ酸７１位に対応し、１６５位は、アミノ酸１４４位に対応する。当業者には、上記に定義されるアミノ酸配列アライメントアルゴリズムを使用して、全長ＦｉｍＨアミノ酸配列及びＦｉｍＨレクチンドメインアミノ酸配列における対応するアミノ酸位置を同定する方法が公知であろう。
【0046】
一実施形態において、大腸菌シャペロンＦｉｍＣと、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）を含むポリペプチドとを含む複合体は、組換え細胞からＦｉｍＣと共に、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）を含むポリペプチドを共発現させることによって形成することができる。
【0047】
一実施形態において、ＦｉｍＣＨ複合体は、１つの細菌株を起源とするＦｉｍＣを含むが、ＦｉｍＨは、異なる細菌株を起源とする。別の実施形態において、ＦｉｍＣＨ複合体は、いずれも同じ細菌株を起源とするＦｉｍＣ及びＦｉｍＨを含む。ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨ、又はＦｉｍＣ、又はＦｉｍＨ及びＦｉｍＣの両方は、天然に存在する実際の細菌単離物に由来しない人工配列であってもよく、例えば、それらはまた、天然の単離物のコンセンサス配列又は組み合わせに基づいてもよい。
【0048】
一実施形態において、ＦｉｍＣＨ複合体は、Ｈｉｓタグを含む少なくとも１つのポリペプチドを含む。一実施形態において、本明細書に記載の全長ＦｉｍＨが、Ｈｉｓタグを含むか、又は本明細書に記載のＦｉｍＣが、Ｈｉｓタグを含む。好ましくは、ＦｉｍＣＨ複合体において、ＦｉｍＣが、Ｈｉｓタグを含む。本明細書に使用される場合、Ｈｉｓタグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）残基のストレッチ、例えば、６個のＨｉｓ残基であり、これは、内部に付加され得るか、又は好ましくはタンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に付加され得る。そのようなタグは、精製を容易にするための使用が周知されている。
【0049】
更なる態様において、本発明は、本明細書で上記に定義されているＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）レクチンドメインを含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、それに作動可能に連結されたプロモーターによって先行され得る。ある特定の実施形態において、プロモーターは、ＦｉｍＨコード配列に対して内因性である。ある特定の実施形態において、プロモーターは、腸内細菌（Enterobacteriaceae）科の細菌においてＦｉｍＨの発現を作動させる内因性プロモーターである。他の実施形態において、プロモーターは、ＦｉｍＨコード配列に対して異種であり、例えば、組換え発現系における使用のために当業者に公知の強力なプロモーターが使用される。例えば、誘導性Ｌａｃプロモーターを含むｐＥＴ－ＤＵＥＴベクターは、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチドの発現及び／又はＦｉｍＣポリペプチドの発現のために使用することができる。Ｌａｃプロモーター又はＴａｃプロモーターなどの誘導性プロモーターの場合、ＩＰＴＧを使用して発現を誘導することができる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、その天然の環境から単離されている。ある特定の実施形態において、本発明は、本発明による単離されたポリヌクレオチドを提供する。ポリペプチドは、組換え、合成、又は人工ポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチドは、任意の形態の核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくは、ＤＮＡであり得る。ポリヌクレオチドは、天然に存在するＦｉｍＨをコードするポリヌクレオチドには存在しない１つ以上のヌクレオチドを含み得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、その５’末端及び／又は３’末端に、天然に存在するＦｉｍＨをコードするポリヌクレオチドには存在しない１つ以上のヌクレオチドを有する。コードされる成熟ＦｉｍＣ及び／又はＦｉｍＨの配列は、好ましくは、それぞれのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドにおいてシグナルペプチドが先行してもよく、シグナルペプチドは、それぞれ、ＦｉｍＣ及び／又はＦｉｍＨポリペプチドに対して内因性シグナルペプチド（すなわち、これらのタンパク質について天然に存在するシグナルペプチド）であってもよく、又はそれらは異種シグナルペプチド、すなわち、他のタンパク質由来のシグナルペプチド若しくは合成シグナルペプチドであってもよい。シグナルペプチドは、ペリプラズム発現に有用であるが、典型的には、切断され、最終的に産生及び精製されるＦｉｍＣ及び／又はＦｉｍＨそれぞれには存在しない。
【0050】
更なる態様において、本発明は、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクターに関する。ある特定の実施形態において、ベクターは、プラスミド又はウイルスベクター、好ましくは、プラスミドである。ベクターは、好ましくは、ＤＮＡ、例えば、ＤＮＡプラスミドの形態である。ある特定の実施形態において、ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含み、これは、ポリヌクレオチドがプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流、例えば、プラスミドの発現カセットに、位置し得る。
【0051】
なおも更なる態様において、本発明は、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は本明細書に記載のベクターを含む、宿主細胞に関する。本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、一般的な分子生物学的方法によって細胞に導入することができる。そのような核酸は、染色体外、例えば、プラスミド若しくは他のベクター上にあってもよく、又は宿主細胞のゲノムに組み込まれていてもよい。好ましくは、タンパク質をコードする核酸は、宿主細胞における核酸の発現を作動させる配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結されている。プロモーターは、構成的プロモーターであってもよく、又はその活性が調節され得る、例えば、温度変化若しくは細胞内の特定の化学物質若しくはタンパク質の存在などの特定の条件下において抑制若しくは誘導され得るプロモーターであってもよく、これらは全て、当該技術分野において周知である。
【0052】
宿主細胞は、単離された細胞であり得る。宿主細胞は、培養培地において、例えば、バイオリアクターなどの培養容器において、培養され得る。細胞は、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に好適な任意の微生物細胞、原核細胞、又は真核細胞であってよい。好ましくは、宿主細胞は、細菌宿主細胞である。好ましくは、細菌宿主細胞は、グラム陰性菌細胞である。好ましくは、宿主細胞は、大腸菌（E. coli）及びクレブシエラ（Klebsiella）から選択される。好ましくは、宿主細胞は、大腸菌である。
【0053】
必要に応じて及び／又は所望される場合には、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチド、又は本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、薬学的に許容される担体を添加することによって、薬学的に活性な混合物に組み込むことができる。
【0054】
したがって、更なる態様において、本発明はまた、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチド、又は本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、組成物、好ましくは、医薬組成物を、提供する。
【0055】
本発明の（医薬）組成物は、担体、充填剤、保存剤、可溶化剤、及び／又は希釈剤を含む、任意の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。生理食塩水並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も、特に注射溶液用の液体担体として採用され得る。好適な賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。好適な薬学的担体の例は、公知であり、例えば、教本及びマニュアルに記載されている。
【0056】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上の緩衝液、例えば、トリス緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ、又はスクロースリン酸グルタミン酸緩衝液を更に含む。
【0057】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上の塩、例えば、トリス－塩酸塩、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、及びアルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、又はそのようなアルミニウム塩の混合物）を更に含む。
【0058】
本発明の組成物は、組成物が投与される宿主において、免疫応答の誘起に使用することができ、すなわち、免疫原性である。したがって、本発明の組成物は、腸内細菌（Enterobacteriaceae）科の細菌によって引き起こされる感染症に対する、好ましくは、クレブシエラ（Klebsiella）又は大腸菌（E. coli）であり、より好ましくは、大腸菌によって引き起こされる感染症に対するワクチンとして使用することができ、したがって、任意選択で、ワクチンにおいて使用するのに好適な任意の追加の成分を含み得る。例えば、ワクチン組成物の追加の任意選択の成分は、本明細書に記載されるアジュバントである。
【0059】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、保存剤、例えば、フェノール、塩化ベンゼトニウム、２－フェノキシエタノール、又はチメロサールを更に含む。特定の実施形態において、本発明の（医薬）組成物は、０．００１％～０．０１％の保存剤を含む。他の実施形態において、本発明の（医薬）組成物は、保存剤を含まない。
【0060】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、対象への意図される投与経路に好適となるように製剤化される。例えば、本発明の組成物は、皮下、非経口、経口、皮内、経皮、結腸直腸、腹腔内、膣内、又は直腸投与に好適となるように製剤化することができる。特定の実施形態において、医薬組成物は、静脈内、経口、頬側、腹腔内、鼻腔内、気管内、皮下、筋肉内、局所、皮内、経皮、又は肺投与、好ましくは、筋肉内投与用に、製剤化することができる。
【0061】
本発明の組成物は、投与の指示書と共に、容器、パック、又はディスペンサに入れることができる。
【0062】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、使用前に保管され得、例えば、組成物は、凍結保管（例えば、約－２０℃又は約－７０℃）され得るか、冷蔵条件（例えば、約２～８℃、例えば、約４℃）で保管され得るか、又は室温で保管され得る。
【0063】
ある実施形態において、本明細書における本発明の医薬組成物は、アジュバントを更に含む。本明細書に使用される場合、「アジュバント」という用語は、本発明の組成物と共に、又はその一部として、投与された場合に、ＦｉｍＨに対する免疫応答を増大、増強、及び／又はブーストするが、アジュバント化合物が単独で投与された場合には、コンジュゲート及び／又はＦｉｍＨに対する免疫応答を生じない、化合物を指す。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞の刺激、並びに抗原提示細胞の刺激を含むいくつかの機序によって、免疫応答を増強することができる。
【0064】
ある特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、アジュバントを含むか、又はアジュバントと組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与するためのアジュバントは、免疫原性組成物の投与の前に、それと同時に、又はその後に、投与することができる。ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）及びアジュバントは、単一の組成物の形態で投与される。
【0065】
他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、アジュバントを含まず、アジュバントと組み合わせて投与されない。
【0066】
アジュバントの具体例としては、アルミニウム塩（ミョウバン）（アルミニウム水酸化物、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、及び酸化アルミニウムなど、これには、ミョウバン又はナノミョウバン製剤を含むナノ粒子が含まれる）、リン酸カルシウム（例えば、Ｍａｓｓｏｎ ＪＤ ｅｔ ａｌ，２０１７，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ １６：２８９－２９９）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、又は３－デ－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）（例えば、英国特許第２２２０２１１号、欧州特許第０９７１７３９号、欧州特許第１１９４１６６号、米国特許第６４９１９１９号を参照されたい）、ＡＳ０１、ＡＳ０２、ＡＳ０３、及びＡＳ０４（全てＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、例えば、ＡＳ０４については欧州特許第１１２６８７６号、米国特許第７３５７９３６号、ＡＳ０２については、欧州特許第０６７１９４８号、同第０７６１２３１号、米国特許第５７５０１１０号を参照されたい）、イミダゾピリジン化合物（国際公開第２００７／１０９８１２号を参照されたい）、イミダゾキノキサリン化合物（国際公開第２００７／１０９８１３号を参照されたい）、デルタ－イヌリン（例えば、Ｐｅｔｒｏｖｓｋｙ Ｎ ａｎｄ ＰＤ Ｃｏｏｐｅｒ，２０１５，Ｖａｃｃｉｎｅ ３３：５９２０－５９２６を参照されたい）、ＳＴＩＮＧ活性化合成環状ジヌクレオチド（例えば、米国特許出願公開第２０１５００５６２２４号）、レシチンとカルボマーホモポリマーとの組み合わせ（例えば、米国特許第６６７６９５８号）、並びにサポニン、例えば、Ｑｕｉｌ Ａ及びＱＳ２１（例えば、Ｚｈｕ Ｄ ａｎｄ Ｗ Ｔｕｏ，２０１６，Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ ３：ｅ１１３（ｄｏｉ：１０．４１７２／２３２９－６８３６．１０００ｅ１１３を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されず、任意選択で、ＱＳ７と組み合わされる（Ｋｅｎｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）、米国特許第５，０５７，５４０号を参照されたい）。いくつかの実施形態において、アジュバントは、フロイントアジュバント（完全又は不完全）である。ある特定の実施形態において、アジュバントは、Ｑｕｉｌ－Ａ、例えば、Ｂｒｅｎｎｔａｇ（現Ｃｒｏｄａ）又はＩｎｖｉｖｏｇｅｎから市販されているものなどを含む。ＱｕｉｌＡは、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）の木に由来するサポニンの水抽出性画分を含有する。これらのサポニンは、共通のトリテルペノイド骨格構造を有する、トリテルペノイドサポニンの群に属する。サポニンは、Ｔ依存性抗原並びにＴ非依存性抗原に対する強力なアジュバント応答、並びに強力な細胞傷害性ＣＤ８＋リンパ球応答を誘導し、粘膜抗原に対する応答を増強することが公知である。これらはまた、コレステロール及びリン脂質と組み合わされて、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）を形成し得、ＱｕｉｌＡアジュバントは、異なる起源に由来する広範な抗原に対する抗体媒介性免疫応答及び細胞媒介性免疫応答の両方を活性化し得る。ある特定の実施形態において、アジュバントは、ＡＳ０１、好ましくは、ＡＳ０１Ｂである。Ｓ０１は、ＭＰＬ（３－Ｏ－デスアシル－４’－モノホスホリルリピドＡ）、ＱＳ２１（キラヤ・サポナリア・モリナ、画分２１）、及びリポソームを含む、アジュバント系である。ある特定の実施形態において、ＡＳ０１は、市販されているか（ＧＳＫ）、又は参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９６／３３７３９号に記載されるように作製され得る。ある特定のアジュバントは、エマルジョンを含み、これは、２つの非混和性流体、例えば、油及び水の混合物であり、そのうちの一方が、他方の内側に小滴として懸濁され、界面活性剤によって安定化されている。水中油型エマルジョンは、油の小滴を取り囲む連続相を形成する水を有するが、油中水型エマルジョンは、連続相を形成する油を有する。ある特定のエマルジョンは、スクアレン（代謝可能な油）を含む。ある特定のアジュバントは、ブロックコポリマーを含み、これは、２つのモノマーが一緒にクラスター化して繰り返し単位のブロックを形成する場合に形成されるコポリマーである。ブロックコポリマー、スクアレン、及び微粒子安定剤を含む油中水型エマルジョンの例は、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）であり、これは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手することができる。任意選択で、エマルジョンは、更なる免疫刺激成分、例えば、ＴＬＲ４アゴニストと組み合わせられ得るか、又はそれを含み得る。ある特定のアジュバントは、ＭＦ５９（例えば、欧州特許第０３９９８４３号、米国特許第６２９９８８４号、米国特許第６４５１３２５号を参照されたい）及びＡＳ０３においても使用される水中油型エマルジョン（例えば、スクアレン又はラッカセイ油など）であり、任意選択で、免疫刺激剤、例えば、ＡＳ０２におけるモノホスホリルリピドＡ及び／又はＱＳ２１と組み合わされる（Ｓｔｏｕｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６，８６－９１を参照されたい）。アジュバントの更なる例は、免疫刺激剤、例えば、例えばＡＳ０１Ｅ及びＡＳ０１ＢにおけるＭＰＬ及びＱＳ２１を含有するリポソームである（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２０６７５８号）。アジュバントの他の例は、ＣｐＧ、並びにイミダゾキノリン（例えば、イミキモド及びＲ８４８）である。例えば、Ｒｅｅｄ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，１９：１５９７－１６０８を参照されたい。
【0067】
ある特定の実施形態において、アジュバントは、サポニン、好ましくは、キラヤ・サポナリアから得られるサポニンの水抽出可能な画分を含む。ある特定の実施形態において、アジュバントは、ＱＳ－２１を含む。
【0068】
ある特定の実施形態において、アジュバントは、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストを含有する。ＴＬＲ４アゴニストは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｉｒｅｔｏｎ ＧＣ ａｎｄ ＳＧ Ｒｅｅｄ，２０１３，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ １２：７９３－８０７を参照されたい。ある特定の実施形態において、アジュバントは、リピドＡ、又はそのアナログ若しくは誘導体を含む、ＴＬＲ４アゴニストである。
【0069】
例えば、ＴＬＲ４アゴニストを含むアジュバントは、様々な手法で、例えば、油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョン又は水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョン（例は、ＭＦ５９、ＡＳ０３である）などのエマルジョン、安定（ナノ）エマルジョン（ＳＥ）、脂質懸濁液、リポソーム、（ポリマー）ナノ粒子、ビロソーム、吸着ミョウバン（alum adsorbed）、水性製剤（ＡＦ）などで製剤化することができ、アジュバント中の免疫調節分子及び／又は免疫原のための様々な送達系を表す（例えば、Ｒｅｅｄ ｅｔ ａｌ．，２０１３（上記）、Ａｌｖｉｎｇ ＣＲ ｅｔ ａｌ，２０１２，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４：３１０－３１５を参照されたい）。
【0070】
免疫刺激性ＴＬＲ４アゴニストは、任意選択で、他の免疫調節成分、例えば、サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ７、ＱＳ２１、Ｍａｔｒｉｘ Ｍ、Ｉｓｃｏｍｓ、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘなど）、アルミニウム塩、他のＴＬＲのための活性化因子（例えば、イミダゾキノリン、フラジェリン、ＣｐＧ、ｄｓＲＮＡアナログなど）などと組み合わされ得る（例えば、Ｒｅｅｄ ｅｔ ａｌ，２０１３（上記）を参照されたい）。
【0071】
本明細書に使用される場合、「リピドＡ」という用語は、ＬＰＳ分子の疎水性脂質部分を指し、この部分は、グルコサミンを含み、ケトシド結合により、ＬＰＳ分子の内部コアにおいてケト－デオキシオクツロソン酸塩に連結されており、ＬＰＳ分子がグラム陰性菌の外膜の外葉に固定されている。ＬＰＳ及びリピドＡ構造の合成の概要については、例えば、Ｒａｅｔｚ，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５：５７４５－５７５３，Ｒａｅｔｚ ＣＲ ａｎｄ Ｃ Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ，２００２，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７１：６３５－７００、米国特許第５，５９３，９６９号及び同第５，１９１，０７２号を参照されたい。リピドＡは、本明細書に使用される場合、天然に存在するリピドＡ、その混合物、アナログ、誘導体、及び前駆体を含む。この用語は、単糖類、例えば、リピドＸと称されるリピドＡの前駆体、二糖リピドＡ、ヘプタアシルリピドＡ、ヘキサアシルリピドＡ、ペンタアシルリピドＡ、テトラアシルリピドＡ、例えば、リピドＩＶＡと称されるリピドＡのテトラアシル前駆体、脱リン酸化リピドＡ、モノホスホリルリピドＡ、ジホスホリルリピドＡ、例えば、大腸菌（Escherichia coli）及びロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）由来のリピドＡを含む。いくつかの免疫活性化リピドＡ構造は、６つのアシル鎖を含む。グルコサミン糖に直接的に結合された４つの第一級アシル鎖は、通常、１０～１６炭素長の３－ヒドロキシアシル鎖である。２つの追加のアシル鎖が、多くの場合、第一級アシル鎖の３－ヒドロキシ基に結合される。大腸菌リピドＡは、例として、典型的には、糖に結合した４つのＣ１４ ３－ヒドロキシアシル鎖、並びにそれぞれ、２’位及び３’位において第一級アシル鎖の３－ヒドロキシ基に結合した１つのＣ１２及び１つのＣ１４を有する。
【0072】
本明細書に使用される場合、「リピドＡアナログ又は誘導体」という用語は、リピドＡに構造及び免疫学的活性が類似しているが、必ずしも天然に存在するわけではない分子を指す。リピドＡアナログ又は誘導体は、例えば、短縮若しくは縮合されるように、及び／又は別のアミン糖残基、例えば、ガラクトサミン残基で置換されたグルコサミン残基を有するように、還元末端にグルコサミン－１－リン酸の代わりに２－デオキシ－２－アミノグルコン酸を含有するように、４’位にリン酸の代わりにガラクツロン酸部分を有するように、改変されていてもよい。リピドＡアナログ又は誘導体は、細菌から単離されたリピドＡから、例えば、化学的誘導によって調製されてもよく、又は例えば、最初に好ましいリピドＡの構造を決定し、そのアナログ若しくは誘導体を合成することによって化学的に合成されてもよい。リピドＡアナログ又は誘導体もまた、ＴＬＲ４アゴニストアジュバントとして有用である（例えば、Ｇｒｅｇｇ ＫＡ ｅｔ ａｌ，２０１７，ＭＢｉｏ ８，ｅＤＤ４９２－１７，ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００４９２－１７を参照されたい）。例えば、リピドＡアナログ又は誘導体は、例えば、アルカリ処理によって、野生型リピドＡ分子の脱アシル化によって、得ることができる。リピドＡアナログ又は誘導体は、例えば、細菌から単離されたリピドＡから調製することができる。そのような分子はまた、化学的に合成することもできる。リピドＡアナログ又は誘導体の別の例は、リピドＡ生合成及び／又はリピドＡ改変に関与する酵素の変異、又はその欠失若しくは挿入を有する細菌細胞から単離されたリピドＡ分子である。ＭＰＬ及び３Ｄ－ＭＰＬは、リピドＡの毒性を弱めるように改変されたリピドＡアナログ又は誘導体である。リピドＡ、ＭＰＬ、及び３Ｄ－ＭＰＬは、長鎖脂肪酸が結合した糖骨格を有し、この骨格は、グリコシド連結した２つの６炭糖、及び４位のホスホリル部分を含む。典型的には、５～８個の長鎖脂肪酸（通常、１２～１４個の炭素原子）が糖骨格に結合している。天然源の誘導に起因して、ＭＰＬ又は３Ｄ－ＭＰＬは、様々な脂肪酸長を有するいくつかの脂肪酸置換パターン、例えば、ヘプタアシル、ヘキサアシル、ペンタアシルなどの複合体又は混合物として存在し得る。これはまた、本明細書に記載される他のリピドＡアナログ又は誘導体のいくつかについても当てはまるが、合成リピドＡバリアントもまた規定され得、そして均質であり得る。ＭＰＬ及びその製造は、例えば、米国特許第４，４３６，７２７号に記載されている。３Ｄ－ＭＰＬは、例えば、米国特許第４，９１２，０９４（Ｂ１）号に記載されており、３位の還元末端グルコサミンにエステル結合している３－ヒドロキシミリスチン酸アシル残基の選択的除去によってＭＰＬとは異なる（例えば、米国特許第４，９１２，０９４（Ｂ１）号の第１欄のＭＰＬの構造と第６欄の３Ｄ－ＭＰＬとを比較されたい）。当該技術分野では、３Ｄ－ＭＰＬが使用されることが多いが、ＭＰＬと呼ばれることもある（例えば、Ｉｒｅｔｏｎ ＧＣ ａｎｄ ＳＧ Ｒｅｅｄ，２０１３（上記）の表１の最初の構造は、この構造をＭＰＬ（登録商標）と称しているが、実際には、３Ｄ－ＭＰＬの構造を示している）。本発明によるリピドＡ（アナログ、誘導体）の例としては、ＭＰＬ、３Ｄ－ＭＰＬ、ＲＣ５２９（例えば、欧州特許第１３８５５４１号）、ＰＥＴ－リピドＡ、ＧＬＡ（グリコピラノシル脂質アジュバント、合成二糖脂質、例えば、米国特許出願公開第２０１００３１０６０２号、米国特許第８７２２０６４号）、ＳＬＡ（例えば、Ｃａｒｔｅｒ Ｄ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：ｅ１０８（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１６．６３））、ＰＨＡＤ（リン酸化ヘキサアシル二糖、その構造は、ＧＬＡの構造と同じである）、３Ｄ－ＰＨＡＤ、３Ｄ－（６－アシル）－ＰＨＡＤ（３Ｄ（６Ａ）－ＰＨＡＤ）（ＰＨＡＤ、３Ｄ－ＰＨＡＤ、及び３Ｄ（６Ａ）ＰＨＡＤは、合成リピドＡバリアントであり、例えば、ａｖａｎｔｉｌｉｐｉｄｓ．ｃｏｍ／ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ／ａｄｊｕｖａｎｔｓを参照されたく、これは、これらの分子の構造も提供する）、Ｅ６０２０（ＣＡＳ番号２８７１８０－６３－６）、ＯＮＯ４００７、ＯＭ－１７４などが挙げられる。３Ｄ－ＭＰＬ、ＲＣ５２９、ＰＥＴ－リピドＡ、ＧＬＡ／ＰＨＡＤ、Ｅ６０２０、ＯＮＯ４００７、及びＯＭ－１７４の例示的な化学構造については、例えば、Ｉｒｅｔｏｎ ＧＣ ａｎｄ ＳＧ Ｒｅｅｄ，２０１３（上記）の表１を参照されたい。ＳＬＡの構造については、例えば、Ｒｅｅｄ ＳＧ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４１：８５－９０の図１を参照されたい。ある特定の好ましい実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストアジュバントは、３Ｄ－ＭＰＬ、ＧＬＡ、又はＳＬＡから選択されるリピドＡアナログ又は誘導体を含む。
【0073】
リピドＡアナログ又は誘導体を含む例示的なアジュバントとしては、ＧＬＡ－ＬＳＱ（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、ＱＳ２１、リポソームとして製剤化された脂質）、ＳＬＡ－ＬＳＱ（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、ＱＳ２１、リポソームとして製剤化された脂質）、ＧＬＡ－ＳＥ（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、スクアレン油／水エマルジョン）、ＳＬＡ－ＳＥ（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、スクアレン油／水エマルジョン）、ＳＬＡ－ナノミョウバン（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、アルミニウム塩）、ＧＬＡ－ナノミョウバン（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、アルミニウム塩）、ＳＬＡ－ＡＦ（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、水性懸濁液）、ＧＬＡ－ＡＦ（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、水性懸濁液）、ＳＬＡ－ミョウバン（合成ＭＰＬ［ＳＬＡ］、アルミニウム塩）、ＧＬＡ－ミョウバン（合成ＭＰＬ［ＧＬＡ］、アルミニウム塩）、並びにＡＳ０１（ＭＰＬ、ＱＳ２１、リポソーム）、ＡＳ０２（ＭＰＬ、ＱＳ２１、油／水エマルジョン）、ＡＳ２５（ＭＰＬ、油／水エマルジョン）、ＡＳ０４（ＭＰＬ、アルミニウム塩）、及びＡＳ１５（ＭＰＬ、ＱＳ２１、ＣｐＧ、リポソーム）を含むＧＳＫ ＡＳｘｘシリーズのアジュバントのうちのいくつかが挙げられる。例えば、国際公開第２０１３／１１９８５６号、同第２００６／１１６４２３号、米国特許第４，９８７，２３７号、同第４，４３６，７２７号、同第４，８７７，６１１号、同第４，８６６，０３４号、同第４，９１２，０９４号、同第４，９８７，２３７号、同第５１９１０７２号、同第５５９３９６９号、同第６，７５９，２４１号、同第９，０１７，６９８号、同第９，１４９，５２１号、同第９，１４９，５２２号、同第９，４１５，０９７号、同第９，４１５，１０１号、同第９，５０４，７４３号、Ｒｅｅｄ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１３（上記）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，４２：４６４０－４６４９、及びＵｌｒｉｃｈ ａｎｄ Ｍｙｅｒｓ，１９９５，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｅｄｓ．；Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，４９５－５２４を参照されたい。
【0074】
非糖脂質分子、例えば、ネオセプチン－３などの合成分子又はＬｅＩＦなどの天然分子もまた、ＴＬＲ４アゴニストアジュバントとして使用することができ、例えば、Ｒｅｅｄ ＳＧ ｅｔ ａｌ，２０１６（上記）を参照されたい。
【0075】
別の態様において、本発明は、医薬として使用するための、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチド、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は本発明の医薬組成物に関する。
【0076】
更なる態様において、本発明は、腸内細菌（Enterobacteriaceae）科のグラム陰性菌に対する免疫応答を誘導するための医薬としての、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチド、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は本明細書に記載の医薬組成物の使用に関する。
【0077】
本明細書に使用される場合、「免疫原」又は「免疫原性」又は「抗原」という用語は、単独でか、アジュバントと組み合わせてか、又はディスプレイビヒクル上に提示されるかのいずれかで、レシピエントへの投与の際に、それ自体に対する免疫学的応答を誘導することができる分子を記載して、互換可能に使用される。
【0078】
本明細書に使用される場合、抗原又は組成物に対する「免疫学的応答」又は「免疫応答」は、対象における、抗原又は組成物中に存在する抗原に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答の発生を指す。
【0079】
更なる態様において、本発明は、腸内細菌（Enterobacteriaceae）科のグラム陰性菌によって引き起こされる細菌感染症に対する免疫応答の誘導に使用するための、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチド、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は本明細書に記載の医薬組成物に関する。ある特定の実施形態において、細菌感染症は、クレブシエラ（Klebsiella）種、又は大腸菌（E. coli）によって引き起こされる。好ましい実施形態において、細菌感染症は、大腸菌（E. coli）によって引き起こされる。したがって、一実施形態において、本発明は、大腸菌（E. coli）又はクレブシエラ（Klebsiella）、好ましくは、大腸菌に対する免疫応答の誘導のための医薬としての、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチド、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチド、又は本明細書に記載の医薬組成物の使用に関する。
【0080】
好ましい実施形態において、腸内細菌（Enterobacteriaceae）科のグラム陰性菌によって引き起こされる細菌感染症は、大腸菌（E. coli）、例えば、腸管外病原性大腸菌（ＥｘＰＥＣ）による感染症であり、例えば、感染症は尿路感染症（ＵＴＩ）であり得る。一実施形態において、本発明は、対象におけるＵＴＩに関連する症状及び／又は続発症の治療、予防、又は抑制に使用するための、本明細書に記載のＦｉｍＨレクチンドメインを含むポリペプチド、本明細書に記載のポリヌクレオチド、又は本明細書に記載の医薬組成物に関する。ある特定の実施形態において、当該ＵＴＩは、ｒＵＴＩである。大腸菌は、若い女性及び高齢者における重要な健康管理問題であるＵＴＩ及びｒＵＴＩの主要な原因物質の１つである。したがって、好ましい実施形態において、細菌感染症は、大腸菌によって引き起こされるＵＴＩ又はｒＵＴＩである。
【0081】
一実施形態において、本発明は、それを必要とする対象の腸内細菌関連の状態と関連する症状及び／又は続発症を治療、予防、又は抑制する方法に関する。この方法は、有効量の本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチド、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。好ましくは、投与は、腸内細菌関連の状態を治療又は予防するのに有効な免疫応答を誘導する。好ましくは、腸内細菌関連の状態は、尿生殖路感染症、より具体的には、ＵＴＩ又はｒＵＴＩである。
【0082】
本発明はまた、腸内細菌（Enterobacteriaceae）科のグラム陰性菌によって引き起こされる細菌感染症、好ましくは、大腸菌（E. coli）によって引き起こされる細菌感染症を治療、予防、又は抑制するための薬剤の製造のための、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチド、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は本明細書に記載の医薬組成物の使用に関する。より好ましくは、細菌感染症は、大腸菌によって引き起こされるＵＴＩ又は再発性ＵＴＩ（ｒＵＴＩ）である。
【0083】
本発明は更に、本発明のポリペプチドの産生のための方法であって、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び／又は本明細書に記載されるベクターを含む、組換え細胞を培養することを含み、培養が、ポリペプチドの産生を導く条件下で行われる、方法に関する。
【0084】
ある特定の実施形態において、本方法は、ポリペプチドを回収することを更に含み、任意選択で、これには医薬組成物への製剤化が続く。
【0085】
好ましくは、大腸菌細胞、例えば、大腸菌ＢＬ２１誘導体細胞が、本発明のＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）又はＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）ポリペプチドを産生するための方法において使用される。
【0086】
ポリペプチドの回収は、好ましくは、当該技術分野において周知の従来のタンパク質精製方法を使用して実施され得る精製及び／又は単離工程を含む。そのような方法は、例えば、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン及び／若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、並びに／又はレクチンクロマトグラフィーを含み得る。
【0087】
そのような精製及び／又は単離の典型的な例は、タンパク質に対する抗体、又はタンパク質構造の一部として発現しているＨｉｓタグ若しくは切断可能なリーダー若しくはテイルに対する抗体を利用し得る。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｈｉｓタグを含んでおり、ＩＭＡＣ親和性精製などの方法によって精製される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、Ｈｉｓタグを含まず、そのような場合、精製は、クロマトグラフィー、例えば、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、及び／又はサイズ排除クロマトグラフィーによって行うことができる。
【0088】
定義
「背景技術」において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
「背景技術」において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【0089】
別の定義がなされない限り、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で引用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用する全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によりあたかもその全体が本明細書に記載されているように組み込まれる。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
【0090】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上必要としない限り、「含む（comprise）」という用語並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形は、指定の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、任意のその他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外するものではないことを意味すると、理解されよう。本明細書に使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、「含有する（containing）」又は「含む（including）」という用語に置き換えることができ、又は場合によって本明細書に使用される場合、「有する（having）」という用語に置き換えることもできる。
【0091】
本明細書に使用される場合、「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲の要素において指定されていない任意の要素、工程、又は成分を除外する。本明細書に使用される場合、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程は除外しない。本発明の態様又は実施形態に関連して本明細書に使用される場合、本開示の範囲を変化させるために、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」、及び「有する」という上記用語のいずれかを、用語「からなる（consisting of）」又は「から本質的になる（consisting essentially of）」に置き換えることができる。
【0092】
本明細書に使用される場合、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしの第１の要素の適用性を指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書に使用される場合、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。
【0093】
本明細書に使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、本発明による組成物の有効性にも本発明による組成物の生物学的活性にも干渉しない非毒性性材料を指す。「薬学的に許容される担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体、又は医薬製剤において使用するための当該技術分野において周知である他の材料を含み得る。薬学的に許容される担体の特性は、特定の用途の投与経路によって決まる点は理解されよう。特定の実施形態によれば、本開示を考慮して、ワクチンにおける使用に好適な任意の薬学的に許容される担体を本発明で使用することができる。好適な賦形剤としては、滅菌水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組み合わせ、並びに安定剤、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又は他の好適なタンパク質及び還元糖が挙げられるが、これらに限定されない。
【0094】
本明細書に使用される場合、「有効量」という用語は、対象において所望される生物学的又は医薬的応答を誘起する活性成分又は構成成分の量を指す。有効量は、記載される目的に対して経験的及び日常的な方法で決定することができる。例えば、任意選択でインビトロアッセイを用いて、最適な用量範囲の特定に役立てることができる。
【0095】
本明細書に使用される場合、「対象」又は「患者」とは、本発明の実施形態による方法又は組成物によってワクチン接種される、又はワクチン接種された、任意の動物、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒトを意味する。本明細書に使用される場合、用語「哺乳動物」は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、最も好ましくは、ヒトが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、対象は、ヒト成人である。本明細書に使用される場合、「ヒト成人」という用語は、１８歳以上のヒトを指す。ある特定の実施形態において、対象は、１８歳未満、例えば、０～１８歳、例えば、９～１８歳、又は１２～１８歳である。ある特定の実施形態において、対象は、約１８～約５０歳のヒト対象である。ある特定の実施形態において、対象は、約５０～約１００歳、例えば、５０～８５歳、６０～８０歳、５０歳以上、５５歳以上、６０歳以上、６５歳以上、７０歳以上、７５歳以上、８０歳以上、８５歳以上のヒトである。本明細書のいくつかの実施形態において、対象は、８５歳以下、８０歳以下、７５歳以下である。ある特定の実施形態において、ヒト対象は、男性である。ある特定の実施形態において、ヒト対象は、女性である。
【0096】
本明細書に使用される場合、「ＵＴＩ」は、腎臓、膀胱、尿管、又は尿道の感染症を意味する。ＵＴＩの症状は、排尿時の灼熱感、頻繁な又は激しい尿意、不完全な排尿、異常な外観及び／又は臭いを有する尿、尿中の白血球の上昇、疲労感又は震え、見当識障害、発熱又は悪寒、倦怠感、背中、下腹部、骨盤、又は膀胱における疼痛又は圧迫のうちの１つ以上を含み得る。しかしながら、一部の患者において、症状は、存在しないか、又は非特異的であり得る。ＵＴＩの続発症は、侵襲性疾患又は敗血症などの全身性合併症を含み得る。ある特定の実施形態において、ＵＴＩは、臨床的に及び／又は微生物学的に記録され、例えば、尿の細菌培養及び／又は分子若しくは他の方法で確認される。ある特定の実施形態において、対象は、ＵＴＩを以前に有していたか、又は現在有しているヒト対象である。ある特定の実施形態において、対象は、過去２年、過去１年、又は過去６カ月以内にＵＴＩを有していた。ある特定の実施形態において、対象は、再発性ＵＴＩ（ｒＵＴＩ）を有していたか、又は現在有している。本明細書に使用される場合、「ｒＵＴＩ」は、６ヶ月間に少なくとも２回の感染又は１年間に少なくとも３回のＵＴＩを意味する。ある特定の実施形態において、ＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ）若しくはＦｉｍＨ（Ｆ７１ｍｕｔ／Ｆ１４４ｍｕｔ）、本発明のＦｉｍＣＨ複合体、本発明の融合ポリペプチド、又は本発明の組成物が投与される対象は、過去２年以内、過去１年以内、又は過去６ヶ月以内に、少なくとも２回ＵＴＩに罹患している。ある特定の実施形態において、対象は、合併型ＵＴＩに罹患している。本明細書に使用される場合、「合併型ＵＴＩ」は、尿生殖路の構造的若しくは機能的異常又は基礎疾患の存在などの状態に関連するＵＴＩを意味する。ある特定の実施形態において、ＵＴＩは、尿中の白血球数の上昇又は他の尿異常をもたらす。ある特定の実施形態において、ＵＴＩを有する対象は、尿中に多数の細菌を有し、すなわち、尿は無菌ではなく、例えば、少なくとも約１０個の細胞／ｍＬ、少なくとも約１００個の細胞／ｍＬ、少なくとも約１０３個の細胞／ｍＬ、例えば、少なくとも約１０４個の細胞／ｍＬ、例えば、少なくとも約１０５個の細胞／ｍＬの細菌細胞数を有する。
【0097】
本明細書に使用される場合、抗原又は組成物に対する「免疫学的応答」又は「免疫応答」は、対象における、抗原又は組成物中に存在する抗原に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答の発生を指す。
【0098】
別途記載のない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。
【0099】
「約」又は「およそ」という語は、数値（例えば、約１０）に関連して使用される場合、好ましくは、その値が、所与の値（１０）の１０％前後、好ましくは、その値の５％前後であり得ることを意味する。
【0100】
「相同性」、「配列同一性」などの用語は、本明細書において互換可能に使用される。配列同一性は、本明細書において、配列を比較することによって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド若しくはタンパク質）配列間又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として定義される。当該技術分野において、「同一性」はまた、場合によっては、そのような線状の配列間の一致によって決定されるような、アミノ酸又は核酸配列間の配列関連性の程度を意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存的アミノ酸置換物を、第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができる。
【0101】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じて、グローバル又はローカルアライメントアルゴリズムを使用して、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列のアライメントによって決定することができる。同様の長さの配列は、好ましくは、全長にわたって配列を最適にアライメントするグローバルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ）を使用してアライメントされ、一方で、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用してアライメントされる。次いで、配列は、それらが（例えば、デフォルトパラメーターを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適にアライメントされる場合に）少なくともある特定の最小パーセンテージの配列同一性（以下に定義される）を共有する場合、「実質的に同一」又は「本質的に類似」と称され得る。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をそれらの長さ全体（全長）にわたってアライメントし、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。グローバルアライメントは、２つの配列が類似の長さを有する場合に、配列同一性を決定するために好適に使用される。概して、ＧＡＰデフォルトパラメーターは、ギャップ生成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）で使用される。ヌクレオチドについては、使用されるデフォルトスコア付けマトリックスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質については、デフォルトスコア付けマトリックスは、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ ８９，９１５－９１９）。配列アライメント及び配列同一性パーセンテージのスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２１－３７５２ ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータプログラムを使用して、又はＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０におけるプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用）若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用）などのオープンソースソフトウェアを使用して、上記のＧＡＰと同じパラメーターを使用して、又はデフォルト設定（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方、並びにタンパク質及びＤＮＡアライメントの両方について、デフォルトギャップ開始ペナルティは１０．０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティは０．５である；デフォルトスコア付けマトリックスは、タンパク質についてはＢｌｏｓｕｍ６２であり、ＤＮＡについてはＤＮＡＦｕｌｌである）を使用して、決定され得る。配列が実質的に異なる全長を有する場合、ローカルアライメント、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するものが、好ましい。
【0102】
あるいは、類似性又は同一性パーセンテージは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して、公開データベースを検索することによって決定されてもよい。したがって、本発明の核酸配列及びタンパク質配列は、更に、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために、公開データベースに対する検索を実施するための「問い合わせ配列」として使用され得る。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３－１０）のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実行して、本発明の核酸分子に対して相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質分子に対して相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアライメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２に記載されているように利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメーターを使用してもよい。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照されたい。
【0103】
配列の説明：
【0104】
【表1】
【0105】
ＦｉｍＨポリペプチドの配列の他の例は、米国特許第６，７３７，０６３号、例えば、その中の配列番号２３～４５又は５５のいずれか１つに記載されており、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0106】
以下の本発明の実施例は、本発明の本質を更に説明するためのものである。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求項によって定められる点を理解されたい。
【0107】
ワクチン有効性におけるＦｉｍＨ立体構造変化の影響を理解するために、膀胱の細菌接着及びコロニー形成を減少させることができる機能的抗体を誘導する改善されたＦｉｍＨバリアントを同定することを目的として、タンパク質を低親和性状態に潜在的に固定することができる異なる変異を含むＦｉｍＨのいくつかのバリアントを設計した。好適なＦｉｍＨレクチンドメインバリアントを見出す機会を最適化するために、異なる予測された作用様式を有するバリアントを選択した。以前に記載されている変異体ＦｉｍＨ＿Ｑ１３３Ｋ及びＦｉｍＨ＿Ｒ６０Ｐ、並びに野生型（ＷＴ）ＦｉｍＨを、対照として用いた。
【0108】
実施例１：阻害性抗体を誘導する能力
低親和性立体構造のＦｉｍＨに対して生成された抗体は、細菌細胞を遮断し、膀胱内でのコロニー形成を減少させることができることが示されている。したがって、第１の工程として、本発明者らは、接着阻害アッセイ（ＡＩＡ）を使用することによって、低親和性立体構造に固定されたＦｉｍＨの異なるバリアントによって誘導される抗体の機能性を評価した。
低親和性立体構造のＦｉｍＨに対して生成された抗体は、細菌細胞を遮断し、膀胱内でのコロニー形成を減少させることができることが示されている。したがって、第１の工程として、本発明者らは、接着阻害アッセイ（ＡＩＡ）を使用することによって、低親和性立体構造に固定されたＦｉｍＨの異なるバリアントによって誘導される抗体の機能性を評価した。
【0109】
材料及び方法
ＦｉｍＨの設計及び発現
ＦｉｍＣ及びＦｉｍＨを、ペリプラズムにおける発現のための異種シグナル配列、及び固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用した親和性精製のためのＦｉｍＣ上のＣ末端Ｈｉｓタグを使用して、ｐＥＴ－ＤＵＥＴ又はｐＥＴ－２２ｂベクターにおいて発現させた。ＩＰＴＧを使用して発現を誘導し、タンパク質を抽出し、ＩＭＡＣ精製（Ｔａｌｏｎ）を使用して精製した。
ＦｉｍＨの設計及び発現
ＦｉｍＣ及びＦｉｍＨを、ペリプラズムにおける発現のための異種シグナル配列、及び固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用した親和性精製のためのＦｉｍＣ上のＣ末端Ｈｉｓタグを使用して、ｐＥＴ－ＤＵＥＴ又はｐＥＴ－２２ｂベクターにおいて発現させた。ＩＰＴＧを使用して発現を誘導し、タンパク質を抽出し、ＩＭＡＣ精製（Ｔａｌｏｎ）を使用して精製した。
【0110】
免疫付与
ウィスターラットに、非フロイントアジュバント（Ｓｐｅｅｄｙラット２８日モデル、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）と組み合わせた異なるＦｉｍＨバリアント（各バリアント６０μｇ／用量）で、０日目、７日目、１０日目、及び１８日目に４回筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫付与を行った。血清抗体の機能性を、０日目（免疫付与前）及び２８日目（免疫付与後）に、以下に記載される接着阻害アッセイ（ＡＩＡ）によって調べた。
ウィスターラットに、非フロイントアジュバント（Ｓｐｅｅｄｙラット２８日モデル、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）と組み合わせた異なるＦｉｍＨバリアント（各バリアント６０μｇ／用量）で、０日目、７日目、１０日目、及び１８日目に４回筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫付与を行った。血清抗体の機能性を、０日目（免疫付与前）及び２８日目（免疫付与後）に、以下に記載される接着阻害アッセイ（ＡＩＡ）によって調べた。
【0111】
接着阻害アッセイ（ＡＩＡ）
細菌（大腸菌株Ｊ９６）を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した。標識した細菌を、膀胱尿路上皮細胞（５６３７細胞株）と共に３７℃で１時間インキュベートした。接着細菌の％を、フローサイトメトリーによって測定した。血清阻害の評価のために、細菌を予め血清試料と共に３７℃で３０分間インキュベートし、次いで５６３７細胞と混合した。
細菌（大腸菌株Ｊ９６）を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した。標識した細菌を、膀胱尿路上皮細胞（５６３７細胞株）と共に３７℃で１時間インキュベートした。接着細菌の％を、フローサイトメトリーによって測定した。血清阻害の評価のために、細菌を予め血清試料と共に３７℃で３０分間インキュベートし、次いで５６３７細胞と混合した。
【0112】
ＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレートを、１ｕｇ／ｍＬのＦｉｍＨで一晩コーティングした。洗浄後、コーティングしたウェルをブロッキング緩衝液［リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した後、血清を、プレートに添加し、次いで、これを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ラット抗体を、室温で１時間、各ウェルに添加した。最後の洗浄後、反応を、テトラメチルベンジジン基質で顕色させた。反応を、１Ｍリン酸で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで測定する。
９６ウェルプレートを、１ｕｇ／ｍＬのＦｉｍＨで一晩コーティングした。洗浄後、コーティングしたウェルをブロッキング緩衝液［リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した後、血清を、プレートに添加し、次いで、これを室温で１時間インキュベートした。洗浄後、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗ラット抗体を、室温で１時間、各ウェルに添加した。最後の洗浄後、反応を、テトラメチルベンジジン基質で顕色させた。反応を、１Ｍリン酸で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで測定する。
【0113】
結果
血清抗体阻害力価を、４パラメーターのロジスティック（４ＰＬ）回帰モデルに基づいて最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）として計算した。更に、異なるＦｉｍＨバリアントによって誘導された血清抗体（総ＩｇＧ）のレベルをＥＬＩＳＡによって評価した。最大半量有効濃度として定義されるＩＣ５０力価を、４ＰＬ非線形回帰モデルを用いて分析した二連の６ステップ滴定曲線に基づいて計算した。
血清抗体阻害力価を、４パラメーターのロジスティック（４ＰＬ）回帰モデルに基づいて最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）として計算した。更に、異なるＦｉｍＨバリアントによって誘導された血清抗体（総ＩｇＧ）のレベルをＥＬＩＳＡによって評価した。最大半量有効濃度として定義されるＩＣ５０力価を、４ＰＬ非線形回帰モデルを用いて分析した二連の６ステップ滴定曲線に基づいて計算した。
【0114】
予備実験において、いくつかの異なるＦｉｍＨバリアントを、阻害性抗体を誘導するそれらの能力について試験した。図１Ａにおいて見ることができるように、バリアントＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ）、ＦｉｍＨ（Ｆ１４４Ｖ）は、最も高いレベルの機能的抗体を誘導した。ＦｉｍＨ（Ｆ１４４Ｖ）バリアントは、２０２０年１月１６日にＪａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃの名前で出願された欧州特許出願第２０１５２２１７号に以前に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ）が同様に高レベルの阻害性抗体を誘導することは、驚くべきことであり、本発明以前には全く予測できなかった。
【0115】
予備結果を確認するために、ＡＩＡアッセイを多数の動物で繰り返し、この実験では、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ）及びＦｉｍＨ（Ｆ１４４Ｖ）の両方が高レベルの阻害性抗体を確実に誘導することができることが確認された（図１Ｂ）。
【0116】
ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ）及びＦｉｍＨ（Ｆ１４４Ｖ）バリアントは、結合ポケットの立体構造変化を誘導する異なる機序によって低親和性立体構造に固定されるとみられる。ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ）バリアントにおける置換は、残基が疎水性ポケット（弛緩状態）に折り畳まれるのを防止し、緊張状態をより好ましいものとするが、ＦｉｍＨ（Ｆ１４４Ｖ）バリアントでは、置換は、低親和性立体構造を安定化するマンノース結合ポケットの比較的近くに位置する。低親和性状態への立体構造変化は、これらの２つの異なる機序によってもたらされるため、本発明者らは、Ｆ７１Ｙ及びＦ１４４Ｖ置換の両方を含むレクチンドメインが、低親和性立体構造に更により安定して固定され得、それによってその種類のＦｉｍＨバリアントに更なる利点を提供するであろうという仮説を立てた。この仮説を試験するために、本発明者らは、そのレクチンドメインにＦ７１Ｙ及びＦ１４４Ｖ置換の両方を含むＦｉｍＨ二重変異体（ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ））を作製した。図１Ｂにおいて見ることができるように、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）は、高レベルの阻害性抗体を同様に誘導することができた。
【0117】
これらの結果に基づいて、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ）及びＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）を、リード候補として選択した。これらの特性を、以下に記載するように更に分析した。
【0118】
実施例２：新規バリアントの設計－ＳＰＲデータ
ＳＰＲ
ＦｉｍＨレクチンドメインバリアントとｎ－ヘプチル－α－Ｄ－マンノピラノシドリガンドとの相互作用の結合親和性及び動態に関する詳細な洞察を得るために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を行った。簡単に説明すると、ＦｉｍＨバリアントをマンノシドリガンド５表面に滴定し（Ｒａｂｂａｎｉ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１８，２９３（５）：１８３５－１８４９）、ここではＨＢＳ－Ｎ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）中３又は１０μＭの最高濃度を用いた。タンパク質を、０．１２～１０μＭ又は０．０３６～３．０μＭで、単一サイクル動態注入を使用して注入した。
ＳＰＲ
ＦｉｍＨレクチンドメインバリアントとｎ－ヘプチル－α－Ｄ－マンノピラノシドリガンドとの相互作用の結合親和性及び動態に関する詳細な洞察を得るために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を行った。簡単に説明すると、ＦｉｍＨバリアントをマンノシドリガンド５表面に滴定し（Ｒａｂｂａｎｉ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１８，２９３（５）：１８３５－１８４９）、ここではＨＢＳ－Ｎ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）中３又は１０μＭの最高濃度を用いた。タンパク質を、０．１２～１０μＭ又は０．０３６～３．０μＭで、単一サイクル動態注入を使用して注入した。
【0119】
結果
以前に記載された変異体ＦｉｍＨ＿Ｑ１３３Ｋ及びＦｉｍＨ＿Ｒ６０Ｐは、結合ポケット内のマンノース相互作用残基に変異を有する。これらの変異は、マンノースとの結合相互作用に直接的に影響を及ぼすと予測される。これらの変異体を、陽性対照とした。二重変異体Ｒ６０Ｐ＿Ｑ１３３Ｋも用いて、潜在的に増強された作用について調べた。更に、野生型（ＷＴ）ＦｉｍＨレクチンドメインを、陰性対照として用いた。
以前に記載された変異体ＦｉｍＨ＿Ｑ１３３Ｋ及びＦｉｍＨ＿Ｒ６０Ｐは、結合ポケット内のマンノース相互作用残基に変異を有する。これらの変異は、マンノースとの結合相互作用に直接的に影響を及ぼすと予測される。これらの変異体を、陽性対照とした。二重変異体Ｒ６０Ｐ＿Ｑ１３３Ｋも用いて、潜在的に増強された作用について調べた。更に、野生型（ＷＴ）ＦｉｍＨレクチンドメインを、陰性対照として用いた。
【0120】
マンノースへの結合に対するバリアントの親和性を、ＳＰＲを使用して評価した。結果を、表２に示す。予想した通り、ＦｉｍＨのマンノシド結合ポケットに変異を有するレクチンドメインバリアント（Ｑ１３３Ｋ及びＲ６０Ｐ＿Ｑ１３３Ｋ）は、マンノシドに全く結合しなかった。Ｒ６０Ｐ変異体は、予想した通り、マンノシドに対して低い親和性を示した。
【0121】
高レベルの阻害性抗体を誘導することができるにもかかわらず、Ｆ７１Ｙ置換を含むバリアントは、依然としてマンノシドに対していくらかの親和性を示し、この変異がマンノシドへの結合を完全には消失させなかったことを示した。Ｆ１４４Ｖ置換を含むＦｉｍＨレクチンドメインバリアントでは、マンノシドへの結合は、完全に消失した（参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年１月１６日にＪａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃの名前で出願された欧州特許出願第２０１５２２１７号において、単一のＦ１４４Ｖ変異体について以前に開示されているように）。Ｆ７１Ｙ及びＦ１４４Ｖの両方を含む変異体では、マンノシドへの結合はまた、完全に消失した。
【0122】
【表2】
【0123】
実施例３：特徴付けられた阻害性ｍＡｂ４７５及び９２６に結合する能力
ＦｉｍＨのレクチンドメインにおける変異は、強力かつ機能的な免疫応答の誘発に重要なエピトープ、例えば、ＦｉｍＨの結合ポケットに存在するエピトープの喪失を引き起こし得る。結合ポケットの完全性が本明細書に記載の変異によって損なわれないことを確実にするために、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ｍＡｂ４７５及びｍＡｂ９２６の変異体ＦｉｍＨレクチンドメインへの結合を評価した。ｍＡｂ４７５及びｍＡｂ９２６は、ＦｉｍＨのマンノース結合ポケット内のＦｉｍＨレクチンドメイン上の重複するが異なるエピトープを認識する（Ｋｉｓｉｅｌａ ｅｔ ａｌ．２０１３＆２０１５）。
ＦｉｍＨのレクチンドメインにおける変異は、強力かつ機能的な免疫応答の誘発に重要なエピトープ、例えば、ＦｉｍＨの結合ポケットに存在するエピトープの喪失を引き起こし得る。結合ポケットの完全性が本明細書に記載の変異によって損なわれないことを確実にするために、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ｍＡｂ４７５及びｍＡｂ９２６の変異体ＦｉｍＨレクチンドメインへの結合を評価した。ｍＡｂ４７５及びｍＡｂ９２６は、ＦｉｍＨのマンノース結合ポケット内のＦｉｍＨレクチンドメイン上の重複するが異なるエピトープを認識する（Ｋｉｓｉｅｌａ ｅｔ ａｌ．２０１３＆２０１５）。
【0124】
結果
変異型ＦｉｍＨレクチンドメインは、以前に国際公開第０２１０２９７４号に記載されている。国際公開第０２１０２９７４号は、ほとんどが特定されていない変異の可能な変異の広範なリストを記載している（６５個の可能な変異部位が、およそ１５９アミノ酸長であるＦｉｍＨのレクチンドメインにおいて示唆されている）。しかしながら、国際公開第０２１０２９７４号は、５４位、１３３位、又は１３５位にアミノ酸置換を有するＦｉｍＨレクチンドメインが最も有望な候補であることを示しており、ＦｉｍＨ＿Ｑ１３３Ｋが非常に好ましい選択肢として明示的に言及されている。したがって、ＦｉｍＨ－２３－１０＿Ｑ１３３Ｋが、機能性ｍＡｂ４７５によって認識されなかったことは非常に驚くべきことであり、結合ポケットの完全性の問題を示した（表３）。対照的に、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ）及びＦｉｍＨ（Ｆ１４４Ｖ）の両方が、ｍＡｂ４７５及びｍＡｂ９２６の両方によって認識され、結合ポケットが完全に無傷のままであることを示した（表３）。また、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）二重変異体は、依然として両方の抗体によって認識され、結合ポケットがまた、この二重変異体においても無傷のままであったことを示した（表３）。
変異型ＦｉｍＨレクチンドメインは、以前に国際公開第０２１０２９７４号に記載されている。国際公開第０２１０２９７４号は、ほとんどが特定されていない変異の可能な変異の広範なリストを記載している（６５個の可能な変異部位が、およそ１５９アミノ酸長であるＦｉｍＨのレクチンドメインにおいて示唆されている）。しかしながら、国際公開第０２１０２９７４号は、５４位、１３３位、又は１３５位にアミノ酸置換を有するＦｉｍＨレクチンドメインが最も有望な候補であることを示しており、ＦｉｍＨ＿Ｑ１３３Ｋが非常に好ましい選択肢として明示的に言及されている。したがって、ＦｉｍＨ－２３－１０＿Ｑ１３３Ｋが、機能性ｍＡｂ４７５によって認識されなかったことは非常に驚くべきことであり、結合ポケットの完全性の問題を示した（表３）。対照的に、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ）及びＦｉｍＨ（Ｆ１４４Ｖ）の両方が、ｍＡｂ４７５及びｍＡｂ９２６の両方によって認識され、結合ポケットが完全に無傷のままであることを示した（表３）。また、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）二重変異体は、依然として両方の抗体によって認識され、結合ポケットがまた、この二重変異体においても無傷のままであったことを示した（表３）。
【0125】
【表3】
【0126】
実施例４：ＮＭＲによるＦｉｍＨレクチンドメインバリアントの立体構造状態分析
１５Ｎを成長培地に添加することにより方法の節に記載されるように生成した１５Ｎで均一に標識したＦｉｍＨＬＤバリアントの１Ｈ，１５Ｎ異核単一量子コヒーレンス核磁気共鳴（ＨＳＱＣ ＮＭＲ）スペクトルを、ｎ－ヘプチル－α－Ｄ－マンノピラノシドリガンドの不在下及び存在下で測定して、残基に基づくレベルでの構造的差異を評価した。タンパク質を、１５０μＭに濃縮し、７％～１０％のＤ２Ｏを含む２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中で測定した。ｎ－ヘプチル－α－Ｄ－マンノピラノシドリガンドを、Ｄ２Ｏに溶解し、１０倍モル過剰までタンパク質に段階的に添加した。それぞれの試料のスペクトルを、公けに入手可能な参照スペクトルと比較した（Ｒａｂｂａｎｉ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１８，２９３（５）：１８３５－１８４９）。
１５Ｎを成長培地に添加することにより方法の節に記載されるように生成した１５Ｎで均一に標識したＦｉｍＨＬＤバリアントの１Ｈ，１５Ｎ異核単一量子コヒーレンス核磁気共鳴（ＨＳＱＣ ＮＭＲ）スペクトルを、ｎ－ヘプチル－α－Ｄ－マンノピラノシドリガンドの不在下及び存在下で測定して、残基に基づくレベルでの構造的差異を評価した。タンパク質を、１５０μＭに濃縮し、７％～１０％のＤ２Ｏを含む２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中で測定した。ｎ－ヘプチル－α－Ｄ－マンノピラノシドリガンドを、Ｄ２Ｏに溶解し、１０倍モル過剰までタンパク質に段階的に添加した。それぞれの試料のスペクトルを、公けに入手可能な参照スペクトルと比較した（Ｒａｂｂａｎｉ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１８，２９３（５）：１８３５－１８４９）。
【0127】
結果
ＦｉｍＨバリアントＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ）、ＦｉｍＨ（Ｆ１４４Ｖ）、及びＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）を、マンノシドリガンドの存在下で低親和性立体構造のままとなるそれらの能力について分析した。リガンドの不在下では、３つ全てのバリアントは、高親和性状態を示すことが知られている残基の化学シフトを比較すると、低親和性立体構造にある（Ｒａｂｂａｎｉ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１８，２９３（５）：１８３５－１８４９）。対照的に、ＦｉｍＨＬＤ ２３－１０野生型は、マンノシドリガンドの不在下において、高親和性立体構造に固定される。しかしながら、リガンドの存在下では、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ）及びＦｉｍＨ（Ｆ１４４Ｖ）は、高親和性立体構造に切り替わって戻るが、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）は低親和性立体構造のままであり、例えば、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）へのリガンドの添加後に化学シフトは観察されない（図２及び表４）。
ＦｉｍＨバリアントＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ）、ＦｉｍＨ（Ｆ１４４Ｖ）、及びＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）を、マンノシドリガンドの存在下で低親和性立体構造のままとなるそれらの能力について分析した。リガンドの不在下では、３つ全てのバリアントは、高親和性状態を示すことが知られている残基の化学シフトを比較すると、低親和性立体構造にある（Ｒａｂｂａｎｉ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１８，２９３（５）：１８３５－１８４９）。対照的に、ＦｉｍＨＬＤ ２３－１０野生型は、マンノシドリガンドの不在下において、高親和性立体構造に固定される。しかしながら、リガンドの存在下では、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ）及びＦｉｍＨ（Ｆ１４４Ｖ）は、高親和性立体構造に切り替わって戻るが、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）は低親和性立体構造のままであり、例えば、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）へのリガンドの添加後に化学シフトは観察されない（図２及び表４）。
【0128】
【表4】
【0129】
Ｋ１２野生型とは異なる２つの未知の残基は別として、ＦｉｍＨＬＤ ２３－１０野生型は、リガンドなしで既に高親和性（Ｈ）立体構造にあると考えられる。単一変異体バリアントＦ７１Ｙ及びＦ１４４Ｖは、リガンドなしでは低親和性（Ｌ）立体構造にあるが、リガンドの存在下ではＨ立体構造に切り替わり、一方で、二重変異体バリアントＦ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖは、リガンドの存在下であってもＬ立体構造のままであった。この高親和性立体構造に戻るように切り替えることができないことにより、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）は、ワクチンの医薬組成物において使用するのに特に有望なものとなり、これは、例えば、保管中及び他の保管条件下において立体構造が安定であるかどうかを試験するための追加の品質又は安定性管理を必要としないことが確実であるためである。更に、高親和性立体構造に戻るように切り替えることができないことにより、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）を研究ツールとして使用して、作用機序を研究すること、又は立体構造に関する知識を得ることが可能となり、これにより、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）を使用して、有用な研究、診断、及び場合により薬学的用途を有する特異的抗体を生成することが可能になる。
【0130】
したがって、結論として、試験した全てのＦｉｍＨバリアントのうち、ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ）、ＦｉｍＨ（Ｆ１４４Ｖ）、及びＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）は、ＦｉｍＨの結合ポケットを無傷に保ちながら、最高レベルの機能的阻害性抗体を誘導することができる。ＦｉｍＨ（Ｆ７１Ｙ／Ｆ１４４Ｖ）は、マンノシドへの結合を完全に消失させ、リガンドの存在下であっても低親和性立体構造に固定されたままとなるという更なる利点を有する。
本発明によれば、以下の態様を提供し得る。
[１]
配列番号１の７１位に対応する位置にチロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）を含むＦｉｍＨレクチンドメインを含む、ポリペプチド。
[２]
前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、配列番号１の７１位に対応する位置にチロシン（Ｙ）を含む、上記[１]に記載のポリペプチド。
[３]
配列番号１のアミノ酸配列の１４４位に対応する位置にフェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸を更に含む、上記[１]又は[２]に記載のポリペプチド。
[４]
前記ポリペプチドが、配列番号１の１４４位に対応する位置にバリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、及びアラニン（Ａ）からなる群から選択されるアミノ酸を含む、上記[３]に記載のポリペプチド。
[５]
前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、配列番号１の１４４位に対応する位置にバリン（Ｖ）を含む、上記[３]又は[４]に記載のポリペプチド。
[６]
前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは、前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、７１位のフェニルアラニン残基がチロシンによって置換されている配列番号１を含む、上記[１]～[５]のいずれかに記載のポリペプチド。
[７]
前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、７１位のフェニルアラニン残基がチロシンによって置換され、１４４位のフェニルアラニン残基がバリンによって置換されている配列番号１を含む、上記[６]に記載のポリペプチド。
[８]
前記ポリペプチドが、ＦｉｍＨピリンドメインを更に含む、上記[１]～[７]のいずれかに記載のポリペプチド。
[９]
前記ポリペプチドが、配列番号２との少なくとも９０％の配列同一性を有する全長ＦｉｍＨであり、好ましくは、前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、７１位のフェニルアラニン残基がチロシンによって置換されている配列番号２を含み、より好ましくは、前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、７１位のフェニルアラニン残基がチロシンによって置換され、１４４位のフェニルアラニン残基がバリンによって置換されている配列番号２を含む、上記[１]～[８]のいずれかに記載のポリペプチド。
[１０]
上記[１]～[９]のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
[１１]
上記[１０]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[１２]
上記[１０]に記載のポリヌクレオチド又は上記[１１]に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
[１３]
上記[１]～[９]のいずれかに記載のポリペプチド、上記[１０]に記載のポリヌクレオチド、又は上記[１１]に記載のベクターを含む、医薬組成物。
[１４]
好ましくは、大腸菌（E. coli）又はクレブシエラ（Klebsiella）であり、好ましくは大腸菌である腸内細菌（Enterobacteriaceae）科の細菌に対する免疫応答の誘導に使用するための、上記[１]～[９]に記載のポリペプチド、上記[１０]に記載のポリヌクレオチド、上記[１１]に記載のベクター、又は上記[１２]に記載の医薬組成物。
[１５]
対象における大腸菌によって引き起こされる尿路感染症の予防又は治療において使用するための、上記[１]～[９]に記載のポリペプチド、上記[１０]に記載のポリヌクレオチド、上記[１１]に記載のベクター、又は上記[１２]に記載の医薬組成物。
[１６]
ＦｉｍＨレクチンドメインを含むポリペプチドを産生するための方法であって、前記ポリペプチドを、上記[１０]に記載のポリヌクレオチド及び／又は上記[１１]に記載のベクターを含む組換え細胞から発現させることを含み、任意選択で、前記ポリペプチドを回収及び精製することであって、これに、任意選択で前記ポリペプチドの医薬組成物への製剤化が続く、ことを更に含む、方法。
本発明によれば、以下の態様を提供し得る。
[１]
配列番号１の７１位に対応する位置にチロシン（Ｙ）又はトリプトファン（Ｗ）を含むＦｉｍＨレクチンドメインを含む、ポリペプチド。
[２]
前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、配列番号１の７１位に対応する位置にチロシン（Ｙ）を含む、上記[１]に記載のポリペプチド。
[３]
配列番号１のアミノ酸配列の１４４位に対応する位置にフェニルアラニン（Ｆ）以外のアミノ酸を更に含む、上記[１]又は[２]に記載のポリペプチド。
[４]
前記ポリペプチドが、配列番号１の１４４位に対応する位置にバリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、及びアラニン（Ａ）からなる群から選択されるアミノ酸を含む、上記[３]に記載のポリペプチド。
[５]
前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、配列番号１の１４４位に対応する位置にバリン（Ｖ）を含む、上記[３]又は[４]に記載のポリペプチド。
[６]
前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは、前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、７１位のフェニルアラニン残基がチロシンによって置換されている配列番号１を含む、上記[１]～[５]のいずれかに記載のポリペプチド。
[７]
前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、７１位のフェニルアラニン残基がチロシンによって置換され、１４４位のフェニルアラニン残基がバリンによって置換されている配列番号１を含む、上記[６]に記載のポリペプチド。
[８]
前記ポリペプチドが、ＦｉｍＨピリンドメインを更に含む、上記[１]～[７]のいずれかに記載のポリペプチド。
[９]
前記ポリペプチドが、配列番号２との少なくとも９０％の配列同一性を有する全長ＦｉｍＨであり、好ましくは、前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、７１位のフェニルアラニン残基がチロシンによって置換されている配列番号２を含み、より好ましくは、前記ＦｉｍＨレクチンドメインが、７１位のフェニルアラニン残基がチロシンによって置換され、１４４位のフェニルアラニン残基がバリンによって置換されている配列番号２を含む、上記[１]～[８]のいずれかに記載のポリペプチド。
[１０]
上記[１]～[９]のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
[１１]
上記[１０]に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[１２]
上記[１０]に記載のポリヌクレオチド又は上記[１１]に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
[１３]
上記[１]～[９]のいずれかに記載のポリペプチド、上記[１０]に記載のポリヌクレオチド、又は上記[１１]に記載のベクターを含む、医薬組成物。
[１４]
好ましくは、大腸菌（E. coli）又はクレブシエラ（Klebsiella）であり、好ましくは大腸菌である腸内細菌（Enterobacteriaceae）科の細菌に対する免疫応答の誘導に使用するための、上記[１]～[９]に記載のポリペプチド、上記[１０]に記載のポリヌクレオチド、上記[１１]に記載のベクター、又は上記[１２]に記載の医薬組成物。
[１５]
対象における大腸菌によって引き起こされる尿路感染症の予防又は治療において使用するための、上記[１]～[９]に記載のポリペプチド、上記[１０]に記載のポリヌクレオチド、上記[１１]に記載のベクター、又は上記[１２]に記載の医薬組成物。
[１６]
ＦｉｍＨレクチンドメインを含むポリペプチドを産生するための方法であって、前記ポリペプチドを、上記[１０]に記載のポリヌクレオチド及び／又は上記[１１]に記載のベクターを含む組換え細胞から発現させることを含み、任意選択で、前記ポリペプチドを回収及び精製することであって、これに、任意選択で前記ポリペプチドの医薬組成物への製剤化が続く、ことを更に含む、方法。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
