知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-05
(45)【発行日】2024-08-14
(54)【発明の名称】皮膚嗅覚受容体発現促進用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 36/535 20060101AFI20240806BHJP
A61K 31/7028 20060101ALI20240806BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240806BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240806BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240806BHJP
A61K 8/9789 20170101ALI20240806BHJP
A61K 8/60 20060101ALI20240806BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240806BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20240806BHJP
【ＦＩ】
A61K36/535
A61K31/7028
A61P43/00 111
A61P17/00
A61P37/08
A61P29/00
A61P31/00
A61P35/00
A61K8/9789
A61K8/60
A61Q19/00
C12Q1/6876 Z ZNA
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2020164579
(22)【出願日】2020-09-30
(65)【公開番号】P2022056695
(43)【公開日】2022-04-11
【審査請求日】2023-04-14
(73)【特許権者】
【識別番号】593106918
【氏名又は名称】株式会社ファンケル
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100194803
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 理弘
(72)【発明者】
【氏名】禹 幸玉
(72)【発明者】
【氏名】神谷 義之
(72)【発明者】
【氏名】桜井 哲人
(72)【発明者】
【氏名】石渡 潮路
【審査官】池上 文緒
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／０７８３７０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】韓国公開特許第１０－２００９－０１１５７０５（ＫＲ，Ａ）
【文献】特開平０９－０２０６７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０６－２９３６５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】PLoS ONE，2013年，vol.8, issue 10，e77458, p.1-8
【文献】Int. J. Mol. Sci.，2020年03月，vol.21, issue 6，2007, p.1-11
【文献】Free. Radic. Biol. Med.，2012年，vol.53, issue 4，p.669-679
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３６／５３５
Ａ６１Ｋ ３１／７０２８
Ａ６１Ｋ ８／９７８９
Ａ６１Ｋ ８／６０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
シソ葉の水抽出物及び／又はＰｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ（ペリロサイド）を有効成分とする、ダニ抗原、スギ花粉抽出物、ベンゾ［ａ］ピレンのいずれかの環境因子により皮膚嗅覚受容体（ＯＲ２ＡＴ４、ＯＲ５１Ｂ５）発現が抑制されたヒト表皮角化細胞のための皮膚嗅覚受容体（ＯＲ２ＡＴ４、ＯＲ５１Ｂ５）発現促進用組成物。
【請求項2】
シソ葉の水抽出物及び／又はＰｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ（ペリロサイド）を有効成分とする、ダニ抗原、スギ花粉抽出物、ベンゾ［ａ］ピレンのいずれかの環境因子によりＮＦＥ２Ｌ２発現が抑制されたヒト表皮角化細胞のためのＮＦＥ２Ｌ２発現促進用組成物。
【請求項3】
シソ葉の水抽出物及び／又はＰｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ（ペリロサイド）を有効成分とする、ダニ抗原、ベンゾ［ａ］ピレンのいずれかの環境因子によりＩＬ－８発現が増強されたヒト表皮角化細胞のためのＩＬ－８発現抑制用組成物。
【請求項4】
Ｐｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ（ペリロサイド）がペリロサイドＢである請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
【請求項5】
外用剤である請求項４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、皮膚嗅覚受容体産生促進用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
嗅覚受容体（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）は、嗅細胞（嗅覚受容神経）にあるＧタンパク質結合受容体として見出された。脊椎動物ではこのタンパク質は嗅上皮に、昆虫では触角に位置し、嗅覚を感知する重要な受容体として知られている。
近年この嗅覚受容体が、皮膚、精子などの様々な組織細胞にも存在することが確認され、現在では、嗅覚受容体が身体全体に存在し、異なる多様な細胞型受容体（ＯＲファミリー）として発現されており、嗅覚以外の生体の生理学的細胞機能を調節すると考えられている。しかしその全体像は、いまだ解明されていない。
嗅覚受容体・ＯＲファミリーに属する受容体の一つであるＯＲ２ＡＴ４は、皮膚におけるケラチノサイトの増殖を刺激することがすでに知られている。なかでも、ヒト毛包の上皮、特に外根鞘がＯＲ２ＡＴ４を発現し、特異的ＯＲ２ＡＴ４アンタゴニストＰｈｅｎｉｒａｔ（登録商標）とＯＲ２ＡＴ４の共投与が、毛髪成長を阻害することが明らかにされている（非特許文献１）。
近年この嗅覚受容体が、皮膚、精子などの様々な組織細胞にも存在することが確認され、現在では、嗅覚受容体が身体全体に存在し、異なる多様な細胞型受容体（ＯＲファミリー）として発現されており、嗅覚以外の生体の生理学的細胞機能を調節すると考えられている。しかしその全体像は、いまだ解明されていない。
嗅覚受容体・ＯＲファミリーに属する受容体の一つであるＯＲ２ＡＴ４は、皮膚におけるケラチノサイトの増殖を刺激することがすでに知られている。なかでも、ヒト毛包の上皮、特に外根鞘がＯＲ２ＡＴ４を発現し、特異的ＯＲ２ＡＴ４アンタゴニストＰｈｅｎｉｒａｔ（登録商標）とＯＲ２ＡＴ４の共投与が、毛髪成長を阻害することが明らかにされている（非特許文献１）。
【0003】
また、全身に存在する嗅覚受容体は、免疫の活性化にも関与している。特許文献１には、公知化合物である合成物質のサンダロール（登録商標）及びブラマノール（登録商標）が、ＯＲ２ＡＴ４受容体の活性化を介して、インターロイキンＩＬ－１αの発現及び分泌を促すことにより創傷治癒を促進することが記載されている。
特許文献２には、嗅覚受容体ファミリー１、２または５１などの複数の嗅覚受容体と選択的に結合するか、または発現を選択的に変化させる化合物を癌、自己免疫疾患、感染症及び移植片対宿主病などの治療剤とする発明が開示されている。この特許文献２に開示された発明の化合物は、嗅覚受容体に結合し、あるいは嗅覚受容体の発現を制御することで、病的な細胞性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を調節し、免疫を活性化し又は正常に制御する。
特許文献２には、嗅覚受容体ファミリー１、２または５１などの複数の嗅覚受容体と選択的に結合するか、または発現を選択的に変化させる化合物を癌、自己免疫疾患、感染症及び移植片対宿主病などの治療剤とする発明が開示されている。この特許文献２に開示された発明の化合物は、嗅覚受容体に結合し、あるいは嗅覚受容体の発現を制御することで、病的な細胞性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を調節し、免疫を活性化し又は正常に制御する。
【0004】
特許文献３には、香料を有効成分とする皮膚免疫機能調節剤が記載されている。この皮膚免疫調節剤において、含有されている香料が、皮膚嗅覚受容体を刺激する作用を有していることが示されている。
このように嗅覚受容体の発現促進は、癌、自己免疫疾患、感染症、臓器移植などに使用し、治療効果を発揮する可能性があることが推測されている。しかし具体的な物質は、いまだに市場に医薬品や医薬部外品として提供されていない。
このように嗅覚受容体の発現促進は、癌、自己免疫疾患、感染症、臓器移植などに使用し、治療効果を発揮する可能性があることが推測されている。しかし具体的な物質は、いまだに市場に医薬品や医薬部外品として提供されていない。
【0005】
一方、シソ（紫蘇、学名：Perilla frutescens var. crispa）は、シソ科シソ属の植物で、芳香性の一年生草本として知られている。このシソの葉の水溶性溶媒で抽出したシソ葉抽出物（シソエキスともいう）には様々な薬効が知られており、民間療法や東洋医学において使用される。シソ葉抽出物には抗アレルギー作用を示す有効成分として知られているルテオリン、アピゲニンなどのフラボノイドの配糖体やロスマリン酸が含有されている。
シソ葉抽出物の薬理効果を利用した発明として、美白化粧料（特許文献４、５）、老化抑制化粧料（特許文献６）、アトピー性皮膚炎の皮膚セラミダーゼ調整剤（特許文献7）などが挙げられる。
シソ葉抽出物には、アントシアニジン、ペリロサイド（ｐｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ）などの多様なグルコシド物質も多く含有されている（特許文献８）。ペリロサイド類は、シソの葉から単離することができる（特許文献９参照）。
シソ葉抽出物の薬理効果を利用した発明として、美白化粧料（特許文献４、５）、老化抑制化粧料（特許文献６）、アトピー性皮膚炎の皮膚セラミダーゼ調整剤（特許文献7）などが挙げられる。
シソ葉抽出物には、アントシアニジン、ペリロサイド（ｐｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ）などの多様なグルコシド物質も多く含有されている（特許文献８）。ペリロサイド類は、シソの葉から単離することができる（特許文献９参照）。
【0006】
近年肌荒れなどの原因として考えられる肌ストレス、及びその影響に関する研究が積極的に行われている。肌へのストレスは、加齢や紫外線のほか、化粧品などに含まれる添加剤、あるいは様々な外的環境因子（化学物質、ハウスダスト、花粉）による。環境因子によるストレス、さらには炎症反応が挙げられる。加齢や紫外線、化粧料に含まれる添加剤による肌ストレスについては、従来から多くの研究がおこなわれている。一方、外的環境因子が与える肌への影響は、いまだに明らかになっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特表２０１７－５１８３２４号公報
【文献】特表２０１６－５３５０６０号公報
【文献】特開２００３－２０６２３７号公報
【文献】特開２００２－１２８６５７号公報
【文献】特開２０１４－１６９２５３号公報
【文献】特開２０１７－０１４１３２号公報
【文献】特開２０１７－１２４９８４号公報
【文献】特開２００１－２７０８３５号公報
【文献】特開平０４－３００８８９号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】NATURE COMMUNICATIONS | (2018) 9:3624 | DOI:10.1038/s41467-018-05973-0 | www.nature.com/naturecommunications
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、シソ葉抽出物及び／又はペリロサイドを有効成分とする、新たな皮膚の嗅覚受容体発現促進用組成物を提供することを課題とする。また、本発明は、シソ葉抽出物及び／又はペリロサイドを有効成分とするＮＦＥ２Ｌ２発現促進用組成物、ＩＬ－８発現抑制用組成物を提供することを課題とする。さらにまた本発明は、シソ葉抽出物及び／又はペリロサイドを有効成分とする皮膚の抗酸化能及び抗炎症能を増強する組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は以下の構成である。
（１）シソ葉抽出物及び／又はＰｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ（ペリロサイド）を有効成分とする皮膚嗅覚受容体（ＯＲ２ＡＴ４、ＯＲ５１Ｂ５）発現促進用組成物。
（２）シソ葉抽出物及び／又はＰｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ（ペリロサイド）を有効成分とするＮＦＥ２Ｌ２発現促進用組成物。
（３）シソ葉抽出物及び／又はＰｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ（ペリロサイド）を有効成分とするＩＬ－８発現抑制用組成物。
（４）Ｐｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ（ペリロサイド）がペリロサイドＢである（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）外用剤である（４）に記載の組成物。
（１）シソ葉抽出物及び／又はＰｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ（ペリロサイド）を有効成分とする皮膚嗅覚受容体（ＯＲ２ＡＴ４、ＯＲ５１Ｂ５）発現促進用組成物。
（２）シソ葉抽出物及び／又はＰｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ（ペリロサイド）を有効成分とするＮＦＥ２Ｌ２発現促進用組成物。
（３）シソ葉抽出物及び／又はＰｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ（ペリロサイド）を有効成分とするＩＬ－８発現抑制用組成物。
（４）Ｐｅｒｉｌｌｏｓｉｄｅ（ペリロサイド）がペリロサイドＢである（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）外用剤である（４）に記載の組成物。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、皮膚の嗅覚受容体発現促進用組成物、皮膚のＮＦＥ２Ｌ２発現促進用組成物、皮膚のＩＬ－８発現抑制用組成物、皮膚の抗酸化能及び抗炎症能増強用組成物が提供される。また生体内の嗅覚受容体の発現促進や活性化を介して、生体の免疫機能の調節が正常化されるため、皮膚アレルギーやアトピー症等の改善治療用医薬品や医薬部外品あるいは化粧料として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＮＨＥＫ細胞にシソ葉抽出物を添加し、２４時間後のＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図2】ＮＨＥＫ細胞にシソ葉抽出物を添加し、２４時間後のＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図3】ＮＨＥＫ細胞にシソ葉抽出物を添加し、２４時間後のＯＲ２ＡＴ４のタンパク質産生量をウエスタンブロット法で測定した結果を示すグラフである。
【図4】ＮＨＥＫ細胞にシソ葉抽出物を添加し、２４時間後のＯＲ５１Ｂ５のタンパク質産生量をウエスタンブロット法で測定した結果を示すグラフである。
【図5】合成したペリロサイドＢのＬＣ－ＭＳチャート図である。
【図8】ＮＨＥＫ細胞にペリロサイドＢを添加し、４時間後、及び２４時間後のＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図9】ＮＨＥＫ細胞にペリロサイドＢを添加し、４時間後、及び２４時間後のＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図10】ＮＨＥＫ細胞にＭｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ又はＢｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅの添加後のＯＲ２ＡＴ４ｍＲＮＡの測定結果を示すグラフである。
【図11】ＮＨＥＫ細胞にＭｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ又はＢｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅの添加後のＯＲ５１Ｂ５ｍＲＮＡの測定結果を示すグラフである。
【図12】ＮＨＥＫ細胞にＭｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ又はＢｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅの添加後のＯＲ２ＡＴ４タンパク質を測定した結果を示すグラフである。
【図13】ＮＨＥＫ細胞にＭｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ又はＢｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅの添加後のＯＲ５１Ｂ５タンパク質を測定した結果を示すグラフである。
【図14】環境因子によって低下した皮膚嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４ｍＲＮＡの発現を、シソ葉抽出物の事前添加が予防し、改善することを確認した試験の結果を示すグラフである。
【図15】環境因子によって低下した皮膚嗅覚受容体ＯＲ５１Ｂ５ｍＲＮＡの発現を、シソ葉抽出物の事前添加が予防し、改善することを確認した試験の結果を示すグラフである。
【図16】ＮＨＥＫ細胞にノックダウン用ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、一時的な皮膚嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４遺伝子をノックダウンした時の、ＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図17】ＮＨＥＫ細胞にノックダウン用ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、一時的な皮膚嗅覚受容体ＯＲ５１Ｂ５遺伝子をノックダウンした時の、ＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示すグラフである。
【図18】一時的に皮膚嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４遺伝子をノックダウンした時のＮＦＥ２Ｌ２ｍＲＮＡの発現量を測定した試験結果を示すグラフである。
【図19】一時的に皮膚嗅覚受容体ＯＲ５１Ｂ５遺伝子をノックダウンした時のＮＦＥ２Ｌ２ｍＲＮＡの発現量を測定した試験結果を示すグラフである。
【図20】一時的に皮膚嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４遺伝子をノックダウンした時のＩＬ－８ｍＲＮＡの発現量を測定した試験結果を示すグラフである。
【図21】一時的に皮膚嗅覚受容体ＯＲ５１Ｂ５遺伝子をノックダウンした時のＩＬ－８ｍＲＮＡの発現量を測定した試験結果を示すグラフである。
【図22】環境因子によって低下するＮＦＥ２Ｌ２ｍＲＮＡの発現量がシソ葉抽出物によって低下が抑制され、さらに発現が増加することを確認した試験結果を示すグラフである。
【図23】環境因子によって増加したＩＬ－８ｍＲＮＡの発現量がシソ葉抽出物によって増加が抑制されることを確認した試験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明でいう組成物とは、シソ葉抽出物及び／又はペリロサイドを含有し、化粧料、医薬品、医薬部外品とするための添加物を含むものをいう。
本発明でいう環境因子とは、ヒトの肌に対して刺激を与え肌荒れや炎症を誘発する空気中や水などの外部環境に存在する化学物質、生物由来抗原及び花粉などをいう。
本発明で用いられるシソとは、シソ科シソ属の植物であれば使用可能である。基本品種である P. frutescens var. crispa f. crispa （チリメンジソ）や代表的な品種であるアカジソ P. frutescens var. crispa f. purpurea を例示できる。なかでも栽培種であるアカジソ、カタメジソ、チリメンジソ、アオジソが代表的なものとして例示される。これらの中でも、好ましくは、アカジソ、アオジソ及びチリメンジソが選択され、更に好ましくは、アオジソ又はアカジソが選択される。
本発明において、シソ葉抽出物とは、シソの生葉又は乾燥葉を水又はエチルアルコール等の水性溶媒で抽出後、抽出液の溶媒を凍結乾燥装置等の装置で溶媒を除去して残渣を乾燥させたものをいう。
本発明でいう環境因子とは、ヒトの肌に対して刺激を与え肌荒れや炎症を誘発する空気中や水などの外部環境に存在する化学物質、生物由来抗原及び花粉などをいう。
本発明で用いられるシソとは、シソ科シソ属の植物であれば使用可能である。基本品種である P. frutescens var. crispa f. crispa （チリメンジソ）や代表的な品種であるアカジソ P. frutescens var. crispa f. purpurea を例示できる。なかでも栽培種であるアカジソ、カタメジソ、チリメンジソ、アオジソが代表的なものとして例示される。これらの中でも、好ましくは、アカジソ、アオジソ及びチリメンジソが選択され、更に好ましくは、アオジソ又はアカジソが選択される。
本発明において、シソ葉抽出物とは、シソの生葉又は乾燥葉を水又はエチルアルコール等の水性溶媒で抽出後、抽出液の溶媒を凍結乾燥装置等の装置で溶媒を除去して残渣を乾燥させたものをいう。
【0014】
上記シソは単独で、或いは２種以上を組み合わせて用いることもできる。これらのシソは、全草を本発明に用いるシソ葉抽出物の原料として使用可能である。好ましくはシソ葉のみを採取して用いる。栽培又は自生するシソから葉のみを採取し、採取したシソ葉は、生のままあるいは、乾燥させた後、これをそのまま、あるいは細断し、抽出する。
抽出は、常法に従って浸漬法等の抽出溶媒と接触させることで行う。超臨界抽出法や水蒸気蒸留法を用いることも可能である。
抽出は、常法に従って浸漬法等の抽出溶媒と接触させることで行う。超臨界抽出法や水蒸気蒸留法を用いることも可能である。
【0015】
溶媒による抽出に際して用いる抽出溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノールなどの低級アルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチルなどのエステル類；アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類；エチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル類；ｎ－ヘキサン、トルエン、クロロホルムなどの炭化水素系溶媒などが挙げられ、それらは単独で又は二種以上混合して用いられる。
【0016】
抽出溶媒の中でも、本発明においては、水、低級アルコール類又は多価アルコール類などの親水性溶媒が好適である。この親水性溶媒を用いる場合の好ましい例としては、例えば、水、低級アルコール類（特にエタノール）、又は多価アルコール（特に、１，３－ブチレングリコール）の単独使用、或いは、水と低級アルコール類（特にエタノール）との混合溶媒、又は水と多価アルコール類（特に１，３－ブチレングリコール、グリセリン）との混合溶媒の使用等が挙げられるが、なかでも水単独、又は水とエタノール、あるいは水と１，３－ブチレングリコールの混合溶媒が特に好ましい。
【0017】
また、シソ科シソ属のシソの葉乾燥物と抽出溶媒との重量比は好ましくは１：１～１：５０の範囲であり、より好ましくは、１：５～１：２０の範囲である。
【0018】
抽出物の調製に際して、そのｐＨに特に限定はないが、一般には４～９の範囲とすることが好ましい。必要であれば、前記抽出溶媒に、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ性ｐＨ調整剤、又はクエン酸、塩酸、リン酸、硫酸などの酸性ｐＨ調整剤を配合し、所望のｐＨとなるように調整してもよい。
【0019】
抽出温度、抽出時間等の抽出条件は、用いる溶媒の種類やｐＨによっても異なる。通常、抽出温度は、好ましくは０～８０℃の範囲であり、より好ましく０～５０℃の範囲であり、特に好ましくは０～２０℃の範囲である。抽出時間は、好ましくは１～４８時間であり、より好ましくは８～２４時間であり、特に好ましくは１０～１５時間の範囲である。
【0020】
かくして抽出した抽出液は、回収後に抽出液に含有されている溶媒を、公知の濃縮手段と乾燥手段を用いて、溶媒を除去し、シソ葉抽出物とする。
シソ葉抽出物には更に、本発明の剤型に応じて各種賦形剤や安定剤、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、苦味料、酸味料、乳化剤、強化剤及び製造用剤を添加して用いることができる。使用形態も、シソ葉抽出物そのまま、或いは希釈した状態、乳化状態、更には粉末化した様々な製剤の形で用いることができる。
シソ葉抽出物には更に、本発明の剤型に応じて各種賦形剤や安定剤、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、苦味料、酸味料、乳化剤、強化剤及び製造用剤を添加して用いることができる。使用形態も、シソ葉抽出物そのまま、或いは希釈した状態、乳化状態、更には粉末化した様々な製剤の形で用いることができる。
【0021】
また、本発明は、市販のシソ葉抽出物であっても使用可能である。市販されているシソ葉抽出物としては、「シソの葉エキス」（東洋精糖株式会社）、「シソ葉エキスパウダー」（日本粉末薬品株式会社）、「ファルコレックスシソ」（一丸ファルコス株式会社）、「ファルコレックス シソ ＨＢ」（一丸ファルコス株式会社）、「ペリーラン・Ｆ－ＱＳ」（テクノーブル株式会社）、「シソ抽出液 ＢＧ－３０」（香栄興業株式会社）を例示できる。
本発明の実施に当たっては、１質量％のシソ葉抽出物を含有するペリーラン・Ｆ－ＱＳが好ましい。
当該抽出物が、本発明の目的に適しており、好結果を示すことは、実施例に示す通りである。
本発明の実施に当たっては、１質量％のシソ葉抽出物を含有するペリーラン・Ｆ－ＱＳが好ましい。
当該抽出物が、本発明の目的に適しており、好結果を示すことは、実施例に示す通りである。
【0022】
シソ葉抽出物は、ヒト又は哺乳動物の皮膚に塗布又は外用することで、皮膚の嗅覚受容体発現を促進し、皮膚のＮＦＥ２Ｌ２発現を促進し、ＩＬ－８発現を抑制する。このため、シソ葉抽出物は、皮膚の嗅覚受容体を介して皮膚における上記の機構にかかわって生じる抗酸化能を増強し、また抗炎症能を増強する。そして、この作用効果を発揮することで、皮膚におけるアレルギーの進行を予防又は改善する目的の化粧料、医薬部外品、医薬品等の外用剤としても使用可能である。
【0023】
シソ葉抽出物を化粧料、医薬部外品、医薬品等の外用剤の製剤とする場合は、シソ葉抽出物を一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体又は分散媒とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって、容易に目的の製剤を得ることができる。この場合、本発明に用いられる抽出物の他に、かかる形態に一般的に用いられる植物油、動物油等の油性基剤、鎮痛消炎剤、鎮痛剤、殺菌消毒剤、収斂剤、ホルモン剤、ビタミン類、保湿剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料等を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
本発明のシソ葉抽出物を含有する組成物又は製剤は、その含有量が特に限定されるものではない。シソ葉抽出物として、通常全組成の０．００００００１～１０質量％、好ましくは０．０００００１～10質量％、特に好ましくは０．００００１～１質量％の範囲で含有する組成物とする。
本発明のシソ葉抽出物を含有する組成物又は製剤は、その含有量が特に限定されるものではない。シソ葉抽出物として、通常全組成の０．００００００１～１０質量％、好ましくは０．０００００１～10質量％、特に好ましくは０．００００１～１質量％の範囲で含有する組成物とする。
【0024】
本発明で用いられるPerilloside（以下「ペリロサイド」）は、シソに含有される配糖体であって、シソ科シソ属の植物から抽出するか、化学的に合成した合成物を使用することが可能である。
シソ葉から抽出する場合は、上記のシソ葉抽出物を出発物質としてこれを、特許文献９の記載に従ってヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒で処理して得られる水溶性画分から、モノテルペン配糖体を分離し、精製回収することで得ることができる。特許文献９に従うと、ペリロサイドＡ、ペリロサイドＢ、ペリロサイドＣ、ペリロサイドＤの４種のペリロサイド（以下この４種のペリロサイド化合物を総称して「ペリロサイド類」という。）
シソから得る場合は、たとえば、アオジソの葉部をそのまま場合により乾燥して、水溶性の有機溶媒（たとえばメタノール、エタノールなどの低級アルコール）で、室温～加温下（たとえば３０～５０℃）で抽出処理を行う。この時、アルコールの使用量は、シソの葉１Ｋｇに対して５～２０リットル好ましくは１０～２０リットルである。抽出は、通常１～７日間、好ましくは２～３日間浸漬で行うのが好ましい。得られた抽出液は、１０分の１ないし１００分の１好ましくは５０分の１ないし１００分の１の容量まで濃縮する。濃縮は通常６０℃以下好ましくは４０から５０℃の範囲で行われる。濃縮後、析出物を濾別し、濾液に等量の水を加え、低極性溶媒で脂質類を除去する。低極性溶媒としては、ｎ－ペンタン、ｎ－ヘキサン等が好ましく、濃縮液と等量で約５回ないしは６回好ましくはほとんど着色がなくなるまで行うのがよい。次いで残った水層をやや極性の高い溶媒で抽出する。このときの溶媒としてはクロロホルムあるいは酢酸エチル等が用いられ、濃縮液と等量で約５回ないし６回行われる。得られた抽出液を減圧下で濃縮して粗目的画分が得られる。
化学的に合成する場合は、ペリリン酸（５４１ｍｇ）、ＰＰｈ３（１．３ｇ）を入れ、ＤＭＦ（５０ｍＬ）で溶解後、ＤＩＡＤ（１．０ｍＬ）、Ｄ－グルコース（３００ｍｇ）を加え、スターラーで攪拌しながら、６０℃、一晩反応させる。反応終了後、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加え、飽和塩化ナトリウム（５０ｍＬ）で、５回分液する。得られた酢酸エチル層をエバポレーターで濃縮後、シリカゲルオープンカラムクロマトグラフィーにて精製する。精製は、１００％クロロホルム、９０％：１０％＝クロロホルム：メタノール、８０％：２０％＝クロロホルム：メタノール画分に分け、８０％クロロホルム画分をＨＰＬＣにて分取を行う。
シソ葉から抽出する場合は、上記のシソ葉抽出物を出発物質としてこれを、特許文献９の記載に従ってヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒で処理して得られる水溶性画分から、モノテルペン配糖体を分離し、精製回収することで得ることができる。特許文献９に従うと、ペリロサイドＡ、ペリロサイドＢ、ペリロサイドＣ、ペリロサイドＤの４種のペリロサイド（以下この４種のペリロサイド化合物を総称して「ペリロサイド類」という。）
シソから得る場合は、たとえば、アオジソの葉部をそのまま場合により乾燥して、水溶性の有機溶媒（たとえばメタノール、エタノールなどの低級アルコール）で、室温～加温下（たとえば３０～５０℃）で抽出処理を行う。この時、アルコールの使用量は、シソの葉１Ｋｇに対して５～２０リットル好ましくは１０～２０リットルである。抽出は、通常１～７日間、好ましくは２～３日間浸漬で行うのが好ましい。得られた抽出液は、１０分の１ないし１００分の１好ましくは５０分の１ないし１００分の１の容量まで濃縮する。濃縮は通常６０℃以下好ましくは４０から５０℃の範囲で行われる。濃縮後、析出物を濾別し、濾液に等量の水を加え、低極性溶媒で脂質類を除去する。低極性溶媒としては、ｎ－ペンタン、ｎ－ヘキサン等が好ましく、濃縮液と等量で約５回ないしは６回好ましくはほとんど着色がなくなるまで行うのがよい。次いで残った水層をやや極性の高い溶媒で抽出する。このときの溶媒としてはクロロホルムあるいは酢酸エチル等が用いられ、濃縮液と等量で約５回ないし６回行われる。得られた抽出液を減圧下で濃縮して粗目的画分が得られる。
化学的に合成する場合は、ペリリン酸（５４１ｍｇ）、ＰＰｈ３（１．３ｇ）を入れ、ＤＭＦ（５０ｍＬ）で溶解後、ＤＩＡＤ（１．０ｍＬ）、Ｄ－グルコース（３００ｍｇ）を加え、スターラーで攪拌しながら、６０℃、一晩反応させる。反応終了後、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加え、飽和塩化ナトリウム（５０ｍＬ）で、５回分液する。得られた酢酸エチル層をエバポレーターで濃縮後、シリカゲルオープンカラムクロマトグラフィーにて精製する。精製は、１００％クロロホルム、９０％：１０％＝クロロホルム：メタノール、８０％：２０％＝クロロホルム：メタノール画分に分け、８０％クロロホルム画分をＨＰＬＣにて分取を行う。
【0025】
この粗目的画分は、常法にしたがって、分離、精製工程に付する。たとえば、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル量：粗目的画分に対し２０～５０倍好ましくは２０倍、展開溶媒：クロロホルム－メタノール、酢酸エチル－メタノール、クロロホルム－アセトンなど）に付し、得られる溶離液を高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＯＤＳ、溶離液：水－メタノール、水－アセトニトリルなど）に付すと、目的とする化合物であるペリロサイドを単離することができる。なお、化学合成によって製造することもできる。
【0026】
化学合成は、特許文献９の記載に従ってペリラ酸クロライドにピリジンの存在下、常法で糖付加化学反応させて、実施できる。糖（グルコース）の付加反応は通常有機溶媒（例えばエチルエーテル、ジオキサンなど）中、アルキル化グルコースと氷冷下で行われる。反応後、水洗により塩類を除去し、溶媒を留去する。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付して再結晶すると目的物の結晶を得ることができる。この合成の反応は、コーニッヒ－クノール法を利用するものでジヒドロペリリルアルコールに炭酸銀の存在下でアルキル化グルコースを反応させればよい。反応は通常有機溶媒（例えばエチルエーテル、ジオキサンなど）中、室温ないし若干高い温度で行うのが好ましい。反応終了後、溶媒を除去し、残渣を例えばシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、その溶離液を濃縮し、さらに濃縮物を再結晶すると目的物の結晶を得ることができる。この化学合成法により、ペリロサイドＡ、ペリロサイドＢ、ペリロサイドＣ、ペリロサイドＤを得ることができる。これらのペリロサイドは、いずれも皮膚嗅覚受容体皮膚の嗅覚受容体発現促進作用を有する。
【0027】
各ペリロサイドは、次に示す化学式１～４で特定される。
【0028】
【化1】
【0029】
【化2】
【0030】
【化3】
【0031】
【化4】
【0032】
本発明に係る化合物の代表例であるペリロサイドＢを合成する場合は、上記の特許文献９に記載された合成方法以外にも、本明細書の参考例に開示する方法でも得ることができる。すなわち、ペリリン酸と、トリフェニルホスフィンの存在下で、ジメチルホルムアミドで溶解後、アゾジカルボン酸ジイソプロピル及びＤ－グルコースを加え、撹拌しながら反応させた後、酢酸エチルと飽和塩化ナトリウム水溶液で、５回分液して酢酸エチル層を回収して、溶媒を除去することで得ることが可能である。なお溶媒除去後の残渣は、シリカゲルオープンカラムクロマトグラフィーにて精製しＨＰＬＣ分取することで、精製ペリロサイドＢを得ることができる。
【0033】
また、上記の各化合物は、対応するα－異性体、β－異性体のいずれもこの発明に含まれる。本発明に使用するペリロサイド化合物は、一般に天然物と同じ立体異性体であることが好ましいが、α－異性体であってもよい。
【0034】
シソ葉抽出物やペリロサイドを医薬部外品や医薬品、或いは化粧料等の外用剤の製剤とする場合は、一般的な製剤の製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって、容易に目的の製剤を得ることができる。この場合、本発明に用いられる抽出物の他に、かかる形態に一般的に用いられる植物油、動物油等の油性基剤、鎮痛消炎剤、鎮痛剤、殺菌消毒剤、収斂剤、ホルモン剤、ビタミン類、保湿剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料等を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
本発明のペリロサイドを含有する組成物は、ペリロサイドＢの含有量が特に限定されるものではない。ペリロサイドとして、通常全組成の０．００００００１～１０質量％、好ましくは０．０００００１～10質量％、特に好ましくは０．００００１～１質量％の範囲で含有する組成物とする。
本発明のペリロサイドを含有する組成物は、ペリロサイドＢの含有量が特に限定されるものではない。ペリロサイドとして、通常全組成の０．００００００１～１０質量％、好ましくは０．０００００１～10質量％、特に好ましくは０．００００１～１質量％の範囲で含有する組成物とする。
【実施例】
【0035】
以下に、実施例としてシソ葉抽出物による嗅覚受容体産生促進試験例、ペリロサイドによる嗅覚受容体産生促進試験、シソ葉抽出物による抗ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２ｍＲＮＡ発現促進試験、炎症因子ＩＬ－８ｍＲＮＡ発現促進試験、及び参考実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明する。
実施例１：シソ葉抽出物の皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ及び嗅覚受容体タンパク質発現促進試験
ＲＮＡi技術を用い皮膚嗅覚受容体をノックダウンしたヒト細胞にシソ葉抽出物を添加し、皮膚嗅覚受容体発現促進効果を確認した。
１．試験方法（ヒト細胞試験）
（１） 細胞培養
正常ヒト表皮角化細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（以下 「ＮＨＥＫ」）をＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標） Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ６０μＭ Ｃａｌｃｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ）溶液にＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２増殖添加剤（クラボウ）を添加し培養した。８０－９０％程度にコンフルエント状態に細胞が増殖したら０．０１７％Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．００７％ＥＤＴＡ（（０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をＰＢＳで３倍希釈））で剥がし、再混濁した後、常法により細胞数をカウントした。
実施例１：シソ葉抽出物の皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ及び嗅覚受容体タンパク質発現促進試験
ＲＮＡi技術を用い皮膚嗅覚受容体をノックダウンしたヒト細胞にシソ葉抽出物を添加し、皮膚嗅覚受容体発現促進効果を確認した。
１．試験方法（ヒト細胞試験）
（１） 細胞培養
正常ヒト表皮角化細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（以下 「ＮＨＥＫ」）をＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標） Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ６０μＭ Ｃａｌｃｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ）溶液にＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２増殖添加剤（クラボウ）を添加し培養した。８０－９０％程度にコンフルエント状態に細胞が増殖したら０．０１７％Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．００７％ＥＤＴＡ（（０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０２％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をＰＢＳで３倍希釈））で剥がし、再混濁した後、常法により細胞数をカウントした。
【0036】
（２）ＮＨＥＫ細胞への嗅覚受容体のｓｉＲＮＡ導入
ＮＨＥＫ細胞を４．０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２／ｍｌになるように１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。これを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで一日培養した後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡの調整は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）培地 （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５０μｌ当たり、Ｈｓ＿ＯＲ２ＡＴ４＿６＿ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ，ＳＩ０４２６６３８８）及びＨｓ＿ＯＲ５１Ｂ５＿１０＿ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ，ＳＩ０４３７６２３９）及びＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ，１０２７２８０）のｓｉＲＮＡを最終濃度０．２５ｎＭになるように調整し、１．５μｌのＨｉｐｅｒｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅｇｅｎｔと混合した。室温で１０分間静置したあと、５０μｌ／ｗｅｌｌずつ円を描きながら添加して細胞にトランスフェクションした。その後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで７２時間培養し、以下の試験に用いた。
ＮＨＥＫ細胞を４．０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２／ｍｌになるように１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。これを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで一日培養した後、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡの調整は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）培地 （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５０μｌ当たり、Ｈｓ＿ＯＲ２ＡＴ４＿６＿ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ，ＳＩ０４２６６３８８）及びＨｓ＿ＯＲ５１Ｂ５＿１０＿ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ，ＳＩ０４３７６２３９）及びＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ，１０２７２８０）のｓｉＲＮＡを最終濃度０．２５ｎＭになるように調整し、１．５μｌのＨｉｐｅｒｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅｇｅｎｔと混合した。室温で１０分間静置したあと、５０μｌ／ｗｅｌｌずつ円を描きながら添加して細胞にトランスフェクションした。その後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで７２時間培養し、以下の試験に用いた。
【0037】
（３）シソ葉抽出物
本試験には、シソ葉抽出物として、市販のペリーラン・Ｆ－ＱＳ（テクノーブル株式会社）を用いた。この製品は、水抽出シソ葉乾燥エキスを、当該製品の全質量当たり、１質量％を含有する。また、１，３ブチレングリコール（以下「ＢＧ」という）を３０質量％含有する。以下特段の記載のない限り、本明細書においてはペリーラン・Ｆ－ＱＳを「ペリーラン」と略記する。
ペリーランは、細胞培養培地で希釈してから、溶媒濃度（ＢＧ濃度）を、同じ濃度になるように調整して、さらに段階希釈した。
ペリーラン中に含有されているシソ葉抽出物の最終添加濃度は、予備試験に基づき皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ産生試験の場合、次の表１の濃度に希釈して調整した。また皮膚嗅覚受容体タンパク質産生試験の場合、次の表２の濃度に希釈して調整した。
本試験には、シソ葉抽出物として、市販のペリーラン・Ｆ－ＱＳ（テクノーブル株式会社）を用いた。この製品は、水抽出シソ葉乾燥エキスを、当該製品の全質量当たり、１質量％を含有する。また、１，３ブチレングリコール（以下「ＢＧ」という）を３０質量％含有する。以下特段の記載のない限り、本明細書においてはペリーラン・Ｆ－ＱＳを「ペリーラン」と略記する。
ペリーランは、細胞培養培地で希釈してから、溶媒濃度（ＢＧ濃度）を、同じ濃度になるように調整して、さらに段階希釈した。
ペリーラン中に含有されているシソ葉抽出物の最終添加濃度は、予備試験に基づき皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ産生試験の場合、次の表１の濃度に希釈して調整した。また皮膚嗅覚受容体タンパク質産生試験の場合、次の表２の濃度に希釈して調整した。
【0038】
【表1】
【0039】
【表2】
【0040】
（４）ＲＴ－ＰＣＲ法による遺伝子増幅
ｓｉＲＮＡ導入ＮＨＥＫ細胞は、ペリーランを添加後２４時間培養した後、上清を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄した。この細胞に３００μｌ／ｗｅｌｌずつＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ）を添加し、十分ピペッティングしながら破砕した。得られた細胞ホモジナイズを１．５ｍｌ Ｔｕｂｅに回収した。６０μｌのクロロホルムを加え、よく振り混ぜてから室温で５分間静置した。次いで１２，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心し、水層の上層（ＲＮＡ部分）を新しい遠心Ｔｕｂｅに移した。
さらに３００μｌのイソプロパノールを加え、よく混合し、室温で１０分間静置した。その後１２，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心しＲＮＡを沈殿させた。上清を捨て、３００μｌの７５％冷エタノールを加え、ボルテックスミキサーで撹拌し、７，５００×ｇで５分間、４℃で遠心した。上清を捨て、室温で数分間乾燥させた後、１５μｌのＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで溶解し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。
ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用し、ＲＮＡを定量してから濃度を合わせ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコールに従い逆転写を行い、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を用い調整した後ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ）を用いリアルタイムＰＣＲを行った。なお、本明細書に記載の実施例及び参考実施例で用いた各マーカー遺伝子の検出のためのプライマーは、下記表３に一括して示す。各配列のプライマーは、すべて市販の合成プライマー製品を購入して使用した。
ｓｉＲＮＡ導入ＮＨＥＫ細胞は、ペリーランを添加後２４時間培養した後、上清を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄した。この細胞に３００μｌ／ｗｅｌｌずつＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ）を添加し、十分ピペッティングしながら破砕した。得られた細胞ホモジナイズを１．５ｍｌ Ｔｕｂｅに回収した。６０μｌのクロロホルムを加え、よく振り混ぜてから室温で５分間静置した。次いで１２，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心し、水層の上層（ＲＮＡ部分）を新しい遠心Ｔｕｂｅに移した。
さらに３００μｌのイソプロパノールを加え、よく混合し、室温で１０分間静置した。その後１２，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心しＲＮＡを沈殿させた。上清を捨て、３００μｌの７５％冷エタノールを加え、ボルテックスミキサーで撹拌し、７，５００×ｇで５分間、４℃で遠心した。上清を捨て、室温で数分間乾燥させた後、１５μｌのＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで溶解し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した。
ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用し、ＲＮＡを定量してから濃度を合わせ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコールに従い逆転写を行い、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を用い調整した後ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ）を用いリアルタイムＰＣＲを行った。なお、本明細書に記載の実施例及び参考実施例で用いた各マーカー遺伝子の検出のためのプライマーは、下記表３に一括して示す。各配列のプライマーは、すべて市販の合成プライマー製品を購入して使用した。
【0041】
【表3】
【0042】
また遺伝発現量評価のため、ＲＴ－ＰＣＲで得られた各遺伝子のサイクル数（Ｃｐ）値は、ＨＰＲＴ１遺伝子のＣｐ値に対する相対値を求めて、この値で比較した。なお遺伝子発現量は、Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ遺伝子に対する相対量を算出し、１２ウエルの平均値を求めた。得られた結果を、０．０３％ＢＧを添加した場合の測定値に対して、ｔ検定を行った。
【0043】
（５）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法
嗅覚受容体遺伝子の発現によって産生された嗅覚受容体タンパク質量を測定するためＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法によって測定した。その手法は次の通りである。
回収した後、ＰＢＳ（－）で洗浄した細胞をＣｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに入れてタンパク質を抽出し、濃度に合わせ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳになるように調整した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（５－２０％ ｇｅｌ）（ディー・アール・シー株式会社）で分離し、０．２μｍ ＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋに転写した。ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れて室温、２０分、ブロッキングした。
１０００倍希釈した１次抗体に交換してから、４℃で振動させながら一晩反応させた。一次抗体にはＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ－Ｈｕｍａｎ ＯＲ２ＡＴ４ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ）、Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＯＲ５１Ｂ５ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ）、 Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ β－ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）を使用した。次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ－Ｒａｂｂｉｔ－ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＨＲＰ－Ｍｏｕｓｅ－ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１：１００００に希釈し、室温で１時間反応させた。
ＥＣＬ ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で５分間反応させ、ルミノ・イメージアナライザー ＬＡＳ－４０００ ｍｉｎｉシリーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出し、解析を行った。なお、ＯＲ２ＡＴ４及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質量は、基準タンパク質であるβ－ａｃｔｉｎに対する相対量として求め、１２ウエルの平均値を求めた。
嗅覚受容体遺伝子の発現によって産生された嗅覚受容体タンパク質量を測定するためＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法によって測定した。その手法は次の通りである。
回収した後、ＰＢＳ（－）で洗浄した細胞をＣｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに入れてタンパク質を抽出し、濃度に合わせ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳになるように調整した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（５－２０％ ｇｅｌ）（ディー・アール・シー株式会社）で分離し、０．２μｍ ＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋに転写した。ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れて室温、２０分、ブロッキングした。
１０００倍希釈した１次抗体に交換してから、４℃で振動させながら一晩反応させた。一次抗体にはＡｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ－Ｈｕｍａｎ ＯＲ２ＡＴ４ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ）、Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＯＲ５１Ｂ５ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ）、 Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ β－ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）を使用した。次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ－Ｒａｂｂｉｔ－ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＨＲＰ－Ｍｏｕｓｅ－ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１：１００００に希釈し、室温で１時間反応させた。
ＥＣＬ ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で５分間反応させ、ルミノ・イメージアナライザー ＬＡＳ－４０００ ｍｉｎｉシリーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出し、解析を行った。なお、ＯＲ２ＡＴ４及びＯＲ５１Ｂ５のタンパク質量は、基準タンパク質であるβ－ａｃｔｉｎに対する相対量として求め、１２ウエルの平均値を求めた。
【0044】
（６）データの解析
１２ｗｅｌｌの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データは希釈溶媒（１，３ブチレングリコール）添加細胞の測定値に対して有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
１２ｗｅｌｌの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データは希釈溶媒（１，３ブチレングリコール）添加細胞の測定値に対して有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0045】
２．試験結果
（１）シソ葉抽出物による皮膚嗅覚受容体のｍＲＮＡ発現促進作用
ＮＨＥＫ細胞にシソ葉抽出物を添加し、２４時間後のＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を図１、ＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を図２に示す。
図１の通り、シソ葉抽出物を添加したＮＨＥＫ細胞では、ＯＲ２ＡＴ４の遺伝子発現がシソ葉抽出物濃度に依存して増加した。また図２の通り、ＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ遺伝子発現も、シソ葉濃度に依存して有意に増加した。その効果は０．００００６２５％という極めて低濃度で有効であった。
（１）シソ葉抽出物による皮膚嗅覚受容体のｍＲＮＡ発現促進作用
ＮＨＥＫ細胞にシソ葉抽出物を添加し、２４時間後のＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を図１、ＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を図２に示す。
図１の通り、シソ葉抽出物を添加したＮＨＥＫ細胞では、ＯＲ２ＡＴ４の遺伝子発現がシソ葉抽出物濃度に依存して増加した。また図２の通り、ＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ遺伝子発現も、シソ葉濃度に依存して有意に増加した。その効果は０．００００６２５％という極めて低濃度で有効であった。
【0046】
（２）シソ葉抽出物による皮膚嗅覚受容体タンパク質の産生促進作用
ＮＨＥＫ細胞にシソ葉抽出物を添加し、２４時間後のＯＲ２ＡＴ４のタンパク質産生量をウエスタンブロット法で測定した結果を図３、ＯＲ５１Ｂ５のタンパク質産生量をウエスタンブロット法で測定した結果を図４に示す。
図３の通り、シソ葉抽出物を添加したＮＨＥＫ細胞では、ＯＲ２ＡＴ４タンパク質量は、シソ葉抽出物添加によって明らかに増加した。
また図４の通り、ＯＲ５１Ｂ５タンパク質の産生も、シソ葉抽出物添加によって有意に増加した。その効果は、０．０００２５％という低濃度で効果を発揮した。
以上の試験結果から、シソ葉抽出物は、ＯＲ２ＡＴ４及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡを増加させ、皮膚嗅覚受容体の産生を促進することが確認された。
ＮＨＥＫ細胞にシソ葉抽出物を添加し、２４時間後のＯＲ２ＡＴ４のタンパク質産生量をウエスタンブロット法で測定した結果を図３、ＯＲ５１Ｂ５のタンパク質産生量をウエスタンブロット法で測定した結果を図４に示す。
図３の通り、シソ葉抽出物を添加したＮＨＥＫ細胞では、ＯＲ２ＡＴ４タンパク質量は、シソ葉抽出物添加によって明らかに増加した。
また図４の通り、ＯＲ５１Ｂ５タンパク質の産生も、シソ葉抽出物添加によって有意に増加した。その効果は、０．０００２５％という低濃度で効果を発揮した。
以上の試験結果から、シソ葉抽出物は、ＯＲ２ＡＴ４及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡを増加させ、皮膚嗅覚受容体の産生を促進することが確認された。
【0047】
＜参考実施例１：ペリロサイドＢの化学合成＞
この参考実施例で合成したペリロサイドＢは、本発明の実施例で使用した。
（１）試薬
以下の試薬を用いた。
トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）：富士フイルム和光純薬株式会社
アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ）：富士フイルム和光純薬株式会社
Ｄ－グルコース：富士フイルム和光純薬株式会社
ペリリン酸：ｓｉｇｍａ社
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：富士フイルム和光純薬株式会社
塩化ナトリウム：富士フイルム和光純薬株式会社
シリカゲル：富士フイルム和光純薬株式会社
クロロホルム：富士フイルム和光純薬株式会社
メタノール：富士フイルム和光純薬株式会社
アセトニトリル：富士フイルム和光純薬株式会社
ギ酸：富士フイルム和光純薬株式会社
この参考実施例で合成したペリロサイドＢは、本発明の実施例で使用した。
（１）試薬
以下の試薬を用いた。
トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）：富士フイルム和光純薬株式会社
アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ）：富士フイルム和光純薬株式会社
Ｄ－グルコース：富士フイルム和光純薬株式会社
ペリリン酸：ｓｉｇｍａ社
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：富士フイルム和光純薬株式会社
塩化ナトリウム：富士フイルム和光純薬株式会社
シリカゲル：富士フイルム和光純薬株式会社
クロロホルム：富士フイルム和光純薬株式会社
メタノール：富士フイルム和光純薬株式会社
アセトニトリル：富士フイルム和光純薬株式会社
ギ酸：富士フイルム和光純薬株式会社
【0048】
（２）使用機器
以下の分取装置及び分析装置を用いた。
分取用ＨＰＬＣ（ＬＣ－ｆｏｒｔｅ／Ｒ）：株式会社ワイエムシィ
分取用カラム（Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８）：株式会社ワイエムシィ
超高速高分離液体クロマトグラフＵＰＬＣ（Ｎｅｘｅｒａ－ＸＲ）：島津製作所株式会社
質量分析計ＴＯＦ－４６００：株式会社エービー・サイエックス
分析カラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標） ＯＤＳ Ｃ１８）：ジーエルサイエンス株式会社
以下の分取装置及び分析装置を用いた。
分取用ＨＰＬＣ（ＬＣ－ｆｏｒｔｅ／Ｒ）：株式会社ワイエムシィ
分取用カラム（Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８）：株式会社ワイエムシィ
超高速高分離液体クロマトグラフＵＰＬＣ（Ｎｅｘｅｒａ－ＸＲ）：島津製作所株式会社
質量分析計ＴＯＦ－４６００：株式会社エービー・サイエックス
分析カラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標） ＯＤＳ Ｃ１８）：ジーエルサイエンス株式会社
【0049】
（３）化学合成方法
ナスフラスコに、ペリリン酸（５４１ ｍｇ）、ＰＰｈ３（１．３ ｇ）を入れ、ＤＭＦ（５０ｍＬ）で溶解後、ＤＩＡＤ（１．０ｍＬ）、Ｄ－グルコース（３００ｍｇ）を加え、スターラーで攪拌しながら、６０℃、ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔで反応した。反応終了後、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加え、飽和塩化ナトリウム（５０ｍＬ）で、５回分液した。得られた酢酸エチル層をエバポレーターで濃縮後、シリカゲルオープンカラムクロマトグラフィーにて精製した。精製は、１００％クロロホルム、９０％：１０％＝クロロホルム：メタノール、８０％：２０％＝クロロホルム：メタノール画分に分け、８０％クロロホルム画分をＨＰＬＣにて分取を行った。
回収した８０％クロロホルム画分をロータリーエバポレーターにて濃縮後、メタノールに溶解し、下記条件で分取を実施した。
ナスフラスコに、ペリリン酸（５４１ ｍｇ）、ＰＰｈ３（１．３ ｇ）を入れ、ＤＭＦ（５０ｍＬ）で溶解後、ＤＩＡＤ（１．０ｍＬ）、Ｄ－グルコース（３００ｍｇ）を加え、スターラーで攪拌しながら、６０℃、ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔで反応した。反応終了後、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加え、飽和塩化ナトリウム（５０ｍＬ）で、５回分液した。得られた酢酸エチル層をエバポレーターで濃縮後、シリカゲルオープンカラムクロマトグラフィーにて精製した。精製は、１００％クロロホルム、９０％：１０％＝クロロホルム：メタノール、８０％：２０％＝クロロホルム：メタノール画分に分け、８０％クロロホルム画分をＨＰＬＣにて分取を行った。
回収した８０％クロロホルム画分をロータリーエバポレーターにて濃縮後、メタノールに溶解し、下記条件で分取を実施した。
【0050】
分取用ＨＰＬＣ分取条件
移動相：２５％アセトニトリル水溶液
流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
移動相：２５％アセトニトリル水溶液
流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
【0051】
単離した化合物を含む溶離液は、ロータリーエバポレーターで濃縮した。精製した化合物を２０ｍｇ得た。
この精製物を、下記条件でＵＰＬＣ－ＭＳ分析を行い、合成化合物がペリロサイドＢであることを確認した。
この精製物を、下記条件でＵＰＬＣ－ＭＳ分析を行い、合成化合物がペリロサイドＢであることを確認した。
【0052】
ＵＰＬＣ－ＭＳ分析条件
移動相：５％アセトニトリル水溶液 ＋ ０．１％ギ酸～１００％アセトニトリル＋０．１％ギ酸（０～３０ｍｉｎ：Ｇｒａｄｉｅｎｔ）
流速：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
イオン化：ＥＳＩ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ
移動相：５％アセトニトリル水溶液 ＋ ０．１％ギ酸～１００％アセトニトリル＋０．１％ギ酸（０～３０ｍｉｎ：Ｇｒａｄｉｅｎｔ）
流速：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
イオン化：ＥＳＩ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ
【0053】
ＬＣ－ＭＳチャート（図５、６）から、１０ｍｉｎ付近に本発明化合物のＭＳピークが検出された。本ピークのＭＳスペクトルから、［Ｍ＋ＦＡ－Ｈ］－＝ ３７３．１５２９、分子組成：Ｃ１６Ｈ２４Ｏ７の物性値が得られた（図７）。
以上の分析結果から、合成によって得られた化合物が、目的化合物であるペリロサイドＢであると判断した。
以上の分析結果から、合成によって得られた化合物が、目的化合物であるペリロサイドＢであると判断した。
【0054】
実施例２：ペリロサイドＢによる皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ発現促進効果試験
１．試験方法
実施例１と同様の試験を行って、ペリロサイドＢの効果を確認するため、（１）ＮＨＥＫ細胞培養、（２）ＮＨＥＫ細胞への嗅覚受容体のｓｉＲＮＡ導入、（３）ＲＴ－ＰＣＲ法による嗅覚受容体ｍＲＮＡ発現試験を行った。
また実施例２では、使用するペリロサイドＢは、参考実施例１で合成したものを用いた。
１．試験方法
実施例１と同様の試験を行って、ペリロサイドＢの効果を確認するため、（１）ＮＨＥＫ細胞培養、（２）ＮＨＥＫ細胞への嗅覚受容体のｓｉＲＮＡ導入、（３）ＲＴ－ＰＣＲ法による嗅覚受容体ｍＲＮＡ発現試験を行った。
また実施例２では、使用するペリロサイドＢは、参考実施例１で合成したものを用いた。
【0055】
皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ発現促進効果の評価を次のように行った。
１）トランスフェクションＮＨＥＫ（ｐａｓｓａｇｅ４）細胞を２×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ／ｗｅｌｌになるように１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
２）２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。新しい培地に調整したペリロサイドＢを各ｗｅｌｌに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータで培養する。
３）ペリロサイドＢ添加後、４時間経過した後、培養上清を回収し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。次いでＲＮＡｉｓｏ３００μｌを添加し、試薬に添付されたマニュアル通りＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。抽出方法は、試薬に添付のマニュアルに従って実施する。最後にＲｎｅａｓｙ ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏを３０μｌ添加し、ＲＮＡを溶解し、ＲＮＡ濃度を測定する。
４）ペリロサイド添加後２４時間経過後に、４時間後に行ったのと同じＲＮＡ回収操作で同様にＲＮＡを抽出する。
５）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、ｃＤＮＡ合成する。
６）ＳＹＢＲＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＩＩを用いＰＣＲを行う。
７）ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を１として、これに対する相対比で効果を判定する。
１）トランスフェクションＮＨＥＫ（ｐａｓｓａｇｅ４）細胞を２×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ／ｗｅｌｌになるように１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
２）２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。新しい培地に調整したペリロサイドＢを各ｗｅｌｌに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータで培養する。
３）ペリロサイドＢ添加後、４時間経過した後、培養上清を回収し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。次いでＲＮＡｉｓｏ３００μｌを添加し、試薬に添付されたマニュアル通りＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。抽出方法は、試薬に添付のマニュアルに従って実施する。最後にＲｎｅａｓｙ ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏを３０μｌ添加し、ＲＮＡを溶解し、ＲＮＡ濃度を測定する。
４）ペリロサイド添加後２４時間経過後に、４時間後に行ったのと同じＲＮＡ回収操作で同様にＲＮＡを抽出する。
５）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、ｃＤＮＡ合成する。
６）ＳＹＢＲＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＩＩを用いＰＣＲを行う。
７）ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を１として、これに対する相対比で効果を判定する。
【0056】
なおペリロサイドＢの最終添加濃度は、予備試験に基づき決定した。
添加したペリロサイドＢ濃度は、１００μＭとした。添加は、１００％エタノールで溶解し、１００ｍＭ溶液を調製した後、これを培養培地で１０００倍に希釈した。
また、比較対照として、エタノールを培養培地で１０００倍希釈したものを用いた。
添加したペリロサイドＢ濃度は、１００μＭとした。添加は、１００％エタノールで溶解し、１００ｍＭ溶液を調製した後、これを培養培地で１０００倍に希釈した。
また、比較対照として、エタノールを培養培地で１０００倍希釈したものを用いた。
【0057】
（４） データの解析
１２ｗｅｌｌの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。データは、希釈溶媒（エタノール）添加細胞の測定値（比較対照）に対して有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
１２ｗｅｌｌの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。データは、希釈溶媒（エタノール）添加細胞の測定値（比較対照）に対して有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0058】
２．試験結果
・ペリロサイドＢによる皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ発現促進作用
ＮＨＥＫ細胞にペリロサイドＢを添加し、４時間後、及び２４時間後のＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を図８に示す。また同じく、ＮＨＥＫ細胞にペリロサイドＢを添加し、４時間後、及び２４時間後のＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を図９に示す。
図８、９に示す通り、ペリロサイドＢをトランスフェクションＮＨＥＫ細胞に添加すると、４時間後から、ＯＲ２ＡＴ４及びＯＲ５１Ｂ５の遺伝子発現が有意に上昇した。この効果は、２４時間後まで持続した。またこの効果は１００μＭという低濃度で有効性を示した。
すなわち、ペリロサイドＢは、嗅覚受容体の遺伝子発現を促進しており、シソ葉抽出物には、ペリロサイドＢが含有されている。したがって、ペリロサイドＢは、シソ葉抽出物の示す嗅覚受容体産生促進効果の一部を担っているものと考えられる。
・ペリロサイドＢによる皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ発現促進作用
ＮＨＥＫ細胞にペリロサイドＢを添加し、４時間後、及び２４時間後のＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を図８に示す。また同じく、ＮＨＥＫ細胞にペリロサイドＢを添加し、４時間後、及び２４時間後のＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ発現量を測定した結果を図９に示す。
図８、９に示す通り、ペリロサイドＢをトランスフェクションＮＨＥＫ細胞に添加すると、４時間後から、ＯＲ２ＡＴ４及びＯＲ５１Ｂ５の遺伝子発現が有意に上昇した。この効果は、２４時間後まで持続した。またこの効果は１００μＭという低濃度で有効性を示した。
すなわち、ペリロサイドＢは、嗅覚受容体の遺伝子発現を促進しており、シソ葉抽出物には、ペリロサイドＢが含有されている。したがって、ペリロサイドＢは、シソ葉抽出物の示す嗅覚受容体産生促進効果の一部を担っているものと考えられる。
【0059】
＜参考実施例２：環境因子の皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ産生抑制作用確認試験＞
実施例１と同様の条件で（１）ＮＨＥＫ細胞培養、（２）ＮＨＥＫ細胞に対して環境因子を付加し、（３）ＲＴ－ＰＣＲ法により嗅覚受容体ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を評価試験した。試験方法は実施例１に準じて行った。
実施例１と同様の条件で（１）ＮＨＥＫ細胞培養、（２）ＮＨＥＫ細胞に対して環境因子を付加し、（３）ＲＴ－ＰＣＲ法により嗅覚受容体ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を評価試験した。試験方法は実施例１に準じて行った。
【0060】
１．試験に用いた環境因子
皮膚に対する環境因子の代表としてダニ抗原（Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ：株式会社エル・エス・エル）、スギ花粉抽出物（Cedar Pollen Extract：株式会社エル・エス・エル)、ベンゾ［ａ］ピレン（Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ：富士フイルム和光純薬）を選択した。各試験成分は、予備試験に基づき細胞培養培地で次の濃度になるように希釈して試験に用いた。
Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ（３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）
Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ（１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ）
Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ（１０μＭ、１００μＭ）：０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．１％に溶解後に細胞培養培地で希釈
皮膚に対する環境因子の代表としてダニ抗原（Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ：株式会社エル・エス・エル）、スギ花粉抽出物（Cedar Pollen Extract：株式会社エル・エス・エル)、ベンゾ［ａ］ピレン（Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ：富士フイルム和光純薬）を選択した。各試験成分は、予備試験に基づき細胞培養培地で次の濃度になるように希釈して試験に用いた。
Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ（３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）
Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ（１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ）
Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ（１０μＭ、１００μＭ）：０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．１％に溶解後に細胞培養培地で希釈
【0061】
２．試験方法
１）ＮＨＥＫ（ｐａｓｓａｇｅ５）細胞を１×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ／ｗｅｌｌになるように１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
２）４８時間後、培地を除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。新しい培地で調整した上記のＭｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅを各ｗｅｌｌに添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
３）培養上清を回収し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。次いでＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ） ３００μｌを添加し、使用説明書に従ってＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。なお抽出方法は使用説明書に従う。最後にＲＮａｓｅＦｒｅｅＷａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を３０μｌ添加し、ＲＮＡを溶解し、濃度を測定する。
４）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、ｃＤＮＡを合成する。
５）ＳＹＢＲＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＩＩ（タカラバイオ）を用いＰＣＲを行う
６）ＨＰＲＴ１／ＲＰＳ１８遺伝子に対する相対量で評価する。
１）ＮＨＥＫ（ｐａｓｓａｇｅ５）細胞を１×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ／ｗｅｌｌになるように１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
２）４８時間後、培地を除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。新しい培地で調整した上記のＭｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅを各ｗｅｌｌに添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
３）培養上清を回収し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。次いでＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ） ３００μｌを添加し、使用説明書に従ってＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。なお抽出方法は使用説明書に従う。最後にＲＮａｓｅＦｒｅｅＷａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を３０μｌ添加し、ＲＮＡを溶解し、濃度を測定する。
４）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、ｃＤＮＡを合成する。
５）ＳＹＢＲＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＩＩ（タカラバイオ）を用いＰＣＲを行う
６）ＨＰＲＴ１／ＲＰＳ１８遺伝子に対する相対量で評価する。
【0062】
３．データの解析
１２ｗｅｌｌの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データは希釈培地又はＤＭＳＯ）添加細胞の測定値に対して有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
１２ｗｅｌｌの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データは希釈培地又はＤＭＳＯ）添加細胞の測定値に対して有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0063】
４．試験結果
・皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ発現量
図１０にＯＲ２ＡＴ４、図１１にＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡの測定結果を示した。Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅのいずれも添加濃度が上昇するにつれて、皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡの発現が有意に減少した。すなわち環境因子は、１μＭ～１００μＭの低濃度で皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡの発現に抑制的に作用していることが確認できた。なお図１０及び図１１のＸ軸には上段に添加した環境因子化合物の濃度、下段に添加した環境因子の物質名を示した。
・皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ発現量
図１０にＯＲ２ＡＴ４、図１１にＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡの測定結果を示した。Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅのいずれも添加濃度が上昇するにつれて、皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡの発現が有意に減少した。すなわち環境因子は、１μＭ～１００μＭの低濃度で皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡの発現に抑制的に作用していることが確認できた。なお図１０及び図１１のＸ軸には上段に添加した環境因子化合物の濃度、下段に添加した環境因子の物質名を示した。
【0064】
＜参考実施例３：環境因子の皮膚嗅覚受容体タンパク質産生抑制作用確認試験＞
実施例１と同様の条件で（１）ＮＨＥＫ細胞培養、（２）ＮＨＥＫ細胞に対して環境因子を付加し、（３）ウェスタンブロット法によって嗅覚受容体タンパク質発現に及ぼす影響を評価試験した。試験方法は実施例１に準じて行った。
実施例１と同様の条件で（１）ＮＨＥＫ細胞培養、（２）ＮＨＥＫ細胞に対して環境因子を付加し、（３）ウェスタンブロット法によって嗅覚受容体タンパク質発現に及ぼす影響を評価試験した。試験方法は実施例１に準じて行った。
【0065】
１．試験に用いる環境因子
参考実施例２と同一の条件で３種の環境因子を次の濃度に希釈して試験に用いた。
Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ（３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）
Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ（１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ）
Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ（１０μＭ、１００μＭ）：０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．１％に溶解後に細胞培養培地で希釈
参考実施例２と同一の条件で３種の環境因子を次の濃度に希釈して試験に用いた。
Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ（３μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）
Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ（１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ）
Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ（１０μＭ、１００μＭ）：０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．１％に溶解後に細胞培養培地で希釈
【0066】
２．試験方法
実施例１に準じて次の手順で試験した。
１）ＮＨＥＫ（ｐａｓｓａｇｅ５）細胞を１×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ／ｗｅｌｌになるように１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
２）４８時間後、培地を除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。新しい培地で調整した上記のＭｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ（Ｂ［ａ］Ｐ）を各ｗｅｌｌに添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
３）培養上清を回収し除去し、ＰＢＳ（－）で細胞を一回洗浄する。次いで、Ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓｉ ｂｕｆｆｅｒを１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、冷蔵庫で浸透させて、タンパク質を回収した。
４）タンパク定量及びウェスタンブロット用サンプルを調整する。
５）２μｇ／ｌａｎｅになるようにアプライし、ａｎｔｉ－ＯＲ２ＡＴ４－Ａｂ（ａｂｃａｍ）、ａｎｔｉ－ＯＲ５１Ｂ５－Ａｂ（ａｂｃａｍ）、ａｎｔｉ－β－ａｃｔｉｎ（ｓａｎｔａｃｒｕｚ）で反応させて検出した。
６）ＯＲ２ＡＴ４／ＯＲ５１Ｂ５のシグナルに対し、β－ａｃｔｉｎのシグナルで補正し、比較した。
実施例１に準じて次の手順で試験した。
１）ＮＨＥＫ（ｐａｓｓａｇｅ５）細胞を１×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ／ｗｅｌｌになるように１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
２）４８時間後、培地を除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。新しい培地で調整した上記のＭｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ（Ｂ［ａ］Ｐ）を各ｗｅｌｌに添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
３）培養上清を回収し除去し、ＰＢＳ（－）で細胞を一回洗浄する。次いで、Ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓｉ ｂｕｆｆｅｒを１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、冷蔵庫で浸透させて、タンパク質を回収した。
４）タンパク定量及びウェスタンブロット用サンプルを調整する。
５）２μｇ／ｌａｎｅになるようにアプライし、ａｎｔｉ－ＯＲ２ＡＴ４－Ａｂ（ａｂｃａｍ）、ａｎｔｉ－ＯＲ５１Ｂ５－Ａｂ（ａｂｃａｍ）、ａｎｔｉ－β－ａｃｔｉｎ（ｓａｎｔａｃｒｕｚ）で反応させて検出した。
６）ＯＲ２ＡＴ４／ＯＲ５１Ｂ５のシグナルに対し、β－ａｃｔｉｎのシグナルで補正し、比較した。
【0067】
３．データの解析
１２ｗｅｌｌの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データは、希釈培地又はＤＭＳＯ添加細胞の測定値に対する有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
１２ｗｅｌｌの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データは、希釈培地又はＤＭＳＯ添加細胞の測定値に対する有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0068】
４．試験結果
・皮膚嗅覚受容体タンパク質発現量
図１２にＯＲ２ＡＴ４、図１３にＯＲ５１Ｂ５のタンパク質測定結果を示した。Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅのいずれの環境因子も添加濃度が上昇するにつれて、皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ量と同様の変化を示した。すなわち皮膚嗅覚受容体タンパク質の発現が環境因子の添加によって有意に減少した。すなわち環境因子が皮膚嗅覚受容体タンパク質の発現に抑制的に作用していることが確認できた。なお図１２及び図１３のＸ軸には、上段に添加した環境因子化合物の濃度、下段に添加した環境因子の物質名を示した。
・皮膚嗅覚受容体タンパク質発現量
図１２にＯＲ２ＡＴ４、図１３にＯＲ５１Ｂ５のタンパク質測定結果を示した。Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅのいずれの環境因子も添加濃度が上昇するにつれて、皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ量と同様の変化を示した。すなわち皮膚嗅覚受容体タンパク質の発現が環境因子の添加によって有意に減少した。すなわち環境因子が皮膚嗅覚受容体タンパク質の発現に抑制的に作用していることが確認できた。なお図１２及び図１３のＸ軸には、上段に添加した環境因子化合物の濃度、下段に添加した環境因子の物質名を示した。
【0069】
以上の＜参考実施例２＞、＜参考実施例３＞から環境因子であるＭｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅは、皮膚嗅覚受容体を減少させていることが明らかとなった。
【0070】
実施例３：環境因子によって低下した皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ発現機能及びタンパク質発現機能のシソ葉抽出物による回復試験
上記の＜参考実施例２＞、＜参考実施例３＞で示した皮膚嗅覚受容体の減少が、シソ葉抽出物により回復することを確認するため実施した。
なお試験方法は、実施例１に準じて行った。
上記の＜参考実施例２＞、＜参考実施例３＞で示した皮膚嗅覚受容体の減少が、シソ葉抽出物により回復することを確認するため実施した。
なお試験方法は、実施例１に準じて行った。
【0071】
＜皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ発現増強試験＞
（１）試験に用いた環境因子
ダニ抗原（Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ：株式会社エル・エス・エル）、スギ花粉抽出物（Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ：株式会社エル・エス・エル)、ベンゾ［ａ］ピレン（Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ：富士フイルム和光純薬）を細胞培養培地で次の濃度になるように希釈して試験に用いた。
Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ（３μｇ／ｍｌ）
Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ（３μｇ／ｍｌ）
Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ（１０μＭ）：０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．１％に溶解後に細胞培養培地で希釈
（１）試験に用いた環境因子
ダニ抗原（Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ：株式会社エル・エス・エル）、スギ花粉抽出物（Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ：株式会社エル・エス・エル)、ベンゾ［ａ］ピレン（Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ：富士フイルム和光純薬）を細胞培養培地で次の濃度になるように希釈して試験に用いた。
Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ（３μｇ／ｍｌ）
Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ（３μｇ／ｍｌ）
Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ（１０μＭ）：０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．１％に溶解後に細胞培養培地で希釈
【0072】
（２）試験方法
１）ＮＨＥＫ（ｐａｓｓａｇｅ４）細胞を２×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ／ｗｅｌｌになるように１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
２）２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。次いで新しい培地に、シソ葉抽出物を添加する。シソ葉抽出物の添加濃度は、０．００１％、０．０００２５％とする。
３）さらに２４時間培養した後、培地を除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。次いで新しい培地にＢ［ａ］Ｐ、Ｍｉｔｅ ＤｐＦ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔを添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
４）２４時間培養後、培養上清を回収除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。ＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ）３００μｌを添加し、使用説明書に従ってＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。最後にＲＮａｓｅＦｒｅｅＷａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を３０μｌ添加して、ＲＮＡを溶解し、濃度を測定する。
５）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＭ） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、ｃＤＮＡ合成する。
６）次いでＳＹＢＲＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＩＩ（タカラバイオ）を用いＰＣＲを行う。
７）ＨＰＲＴ１／ＲＰＳ１８遺伝子の発現量を１として、これに対する発現相対量で評価する。
１）ＮＨＥＫ（ｐａｓｓａｇｅ４）細胞を２×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ／ｗｅｌｌになるように１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
２）２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。次いで新しい培地に、シソ葉抽出物を添加する。シソ葉抽出物の添加濃度は、０．００１％、０．０００２５％とする。
３）さらに２４時間培養した後、培地を除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。次いで新しい培地にＢ［ａ］Ｐ、Ｍｉｔｅ ＤｐＦ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔを添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
４）２４時間培養後、培養上清を回収除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。ＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ）３００μｌを添加し、使用説明書に従ってＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。最後にＲＮａｓｅＦｒｅｅＷａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を３０μｌ添加して、ＲＮＡを溶解し、濃度を測定する。
５）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＭ） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、ｃＤＮＡ合成する。
６）次いでＳＹＢＲＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＩＩ（タカラバイオ）を用いＰＣＲを行う。
７）ＨＰＲＴ１／ＲＰＳ１８遺伝子の発現量を１として、これに対する発現相対量で評価する。
【0073】
（３）データの解析
１２ｗｅｌｌの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データは希釈培地又はＤＭＳＯ）添加細胞の測定値に対して有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
１２ｗｅｌｌの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データは希釈培地又はＤＭＳＯ）添加細胞の測定値に対して有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0074】
（４）試験結果
・皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ発現量
図１４にＯＲ２ＡＴ４、図１５にＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡの測定結果を示した。ＯＲ２ＡＴ４、ＯＲ５１Ｂ５は、Ｂ［ａ］Ｐ、Ｍｉｔｅ ＤｐＦ ＡＧ， Ｃｅｄａｒ ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔの添加によって減少するが、シソ葉抽出物をあらかじめ添加することで、Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅによる発現抑制が解消されることが分かった。すなわち環境因子は皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡの発現に抑制的に作用しているが、シソ葉抽出物が共存することで、このｍＲＮＡ発現の抑制を予防し、さらに改善することが確認できた。この効果は、シソ葉抽出物０．００１％という低濃度で有効であった。
・皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡ発現量
図１４にＯＲ２ＡＴ４、図１５にＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡの測定結果を示した。ＯＲ２ＡＴ４、ＯＲ５１Ｂ５は、Ｂ［ａ］Ｐ、Ｍｉｔｅ ＤｐＦ ＡＧ， Ｃｅｄａｒ ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔの添加によって減少するが、シソ葉抽出物をあらかじめ添加することで、Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅによる発現抑制が解消されることが分かった。すなわち環境因子は皮膚嗅覚受容体ｍＲＮＡの発現に抑制的に作用しているが、シソ葉抽出物が共存することで、このｍＲＮＡ発現の抑制を予防し、さらに改善することが確認できた。この効果は、シソ葉抽出物０．００１％という低濃度で有効であった。
【0075】
＜参考実施例４：皮膚嗅覚受容体遺伝子のノックダウンによる抗酸化ストレス因子及び炎症関連因子の発現抑制作用確認試験＞
ＲＮＡi技術を利用し、ＮＨＥＫ細胞にノックダウン用ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、一時的な皮膚嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ発現を抑制した細胞（以下「ノックダウン細胞」という）を調製し、その際に引き起こされる抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡ、炎症関連因子ＩＬ－８ｍＲＮＡへの影響を確認した。
ＲＮＡi技術を利用し、ＮＨＥＫ細胞にノックダウン用ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、一時的な皮膚嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡ及びＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ発現を抑制した細胞（以下「ノックダウン細胞」という）を調製し、その際に引き起こされる抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡ、炎症関連因子ＩＬ－８ｍＲＮＡへの影響を確認した。
【0076】
（１）試験方法
実施例１に準じてＮＨＥＫ細胞を培養し、さらに次の手順でノックダウン細胞を調製し試験した。
１）ＮＨＥＫ（Ｎｅｏ）細胞（ｐａｓｓａｇｅ４）を細胞密度６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種する。
２）トランスフェクション：Ｈｉｐｅｒｆｅｃｔ１．５μｌ＋ｓｉＲＮＡ（０．２５ｎＭ）を１００μｌ ＯｐｔｉＭＥＭに混合し、１００μｌ／ｗｅｌｌになるように円を書きながら添加した。そして、比較対照にネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを導入し、ｓｉＲ＿Ｃｏｎｔにした。
なおノックダウン用のトランスフェクションに用いたｓｉＲＮＡは研究用として市販されている次の製品を用いた。
ＯＲ２ＡＴ４ ｓｉＲＮＡ：ＳＩ０４２６６３８８（Ｑｉａｇｅｎ）
ＯＲ５１Ｂ５ ｓｉＲＮＡ：ＳＩ０４２６６３８８（Ｑｉａｇｅｎ）
Ａｌｌｓｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ：ＳＩ０３６５０３１８（Ｑｉａｇｅｎ）
３）培養上清を回収除去し、細胞をＰＢＳ（－）で一回洗浄する。次いでＲＮＡｉｓｏ ３００μｌを添加し、試薬に添付されたマニュアル通りＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。抽出方法は、試薬に添付のマニュアルに従って実施する。最後にＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を３０μｌ添加し、ＲＮＡを溶解し、ＲＮＡ濃度を測定する。
４）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＭ）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、ｃＤＮＡ合成する。
５）ＳＹＢＲＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴＭ）ＩＩを用いＰＣＲを行う
６）測定結果はハウスキーピング遺伝子であるＨＰＲＴ１／ＲＰＳ１８に対する相対量で評価する。
実施例１に準じてＮＨＥＫ細胞を培養し、さらに次の手順でノックダウン細胞を調製し試験した。
１）ＮＨＥＫ（Ｎｅｏ）細胞（ｐａｓｓａｇｅ４）を細胞密度６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種する。
２）トランスフェクション：Ｈｉｐｅｒｆｅｃｔ１．５μｌ＋ｓｉＲＮＡ（０．２５ｎＭ）を１００μｌ ＯｐｔｉＭＥＭに混合し、１００μｌ／ｗｅｌｌになるように円を書きながら添加した。そして、比較対照にネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを導入し、ｓｉＲ＿Ｃｏｎｔにした。
なおノックダウン用のトランスフェクションに用いたｓｉＲＮＡは研究用として市販されている次の製品を用いた。
ＯＲ２ＡＴ４ ｓｉＲＮＡ：ＳＩ０４２６６３８８（Ｑｉａｇｅｎ）
ＯＲ５１Ｂ５ ｓｉＲＮＡ：ＳＩ０４２６６３８８（Ｑｉａｇｅｎ）
Ａｌｌｓｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ：ＳＩ０３６５０３１８（Ｑｉａｇｅｎ）
３）培養上清を回収除去し、細胞をＰＢＳ（－）で一回洗浄する。次いでＲＮＡｉｓｏ ３００μｌを添加し、試薬に添付されたマニュアル通りＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。抽出方法は、試薬に添付のマニュアルに従って実施する。最後にＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を３０μｌ添加し、ＲＮＡを溶解し、ＲＮＡ濃度を測定する。
４）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＭ）ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、ｃＤＮＡ合成する。
５）ＳＹＢＲＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴＭ）ＩＩを用いＰＣＲを行う
６）測定結果はハウスキーピング遺伝子であるＨＰＲＴ１／ＲＰＳ１８に対する相対量で評価する。
【0077】
（２）データの解析
１２ｗｅｌｌの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データは、ノックダウン細胞（ｓｉＲ＿Ｃｏｎｔ）に対する有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
１２ｗｅｌｌの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データは、ノックダウン細胞（ｓｉＲ＿Ｃｏｎｔ）に対する有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0078】
（３）試験結果
１）ＯＲ２ＡＴ４及びＯＲ５１Ｂ５の変化
ＯＲ２ＡＴ４ｍＲＮＡの測定結果を図１６、ＯＲ５１Ｂ５ｍＲＮＡを図１７に示す。図１６ではｓｉＲ＿Ｃｏｎｔに対してｓｉＲ＿ＯＲ２ＡＴ４及びｓｉＲ－ＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡが顕著に低下している結果となった。すなわち、それぞれの遺伝子に対するｓｉＲＮＡによって該当する遺伝子がノックダウンされ、ＯＲ２ＡＴ４及びＯＲ５１Ｂ５ｍＲＮＡの発現が顕著に抑制された。
１）ＯＲ２ＡＴ４及びＯＲ５１Ｂ５の変化
ＯＲ２ＡＴ４ｍＲＮＡの測定結果を図１６、ＯＲ５１Ｂ５ｍＲＮＡを図１７に示す。図１６ではｓｉＲ＿Ｃｏｎｔに対してｓｉＲ＿ＯＲ２ＡＴ４及びｓｉＲ－ＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡが顕著に低下している結果となった。すなわち、それぞれの遺伝子に対するｓｉＲＮＡによって該当する遺伝子がノックダウンされ、ＯＲ２ＡＴ４及びＯＲ５１Ｂ５ｍＲＮＡの発現が顕著に抑制された。
【0079】
２）抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡの変化
ＯＲ２ＡＴ４ｍＲＮＡを抑制したときの抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡの発現量の変化を図１８に、同じくＯＲ５１Ｂ５ｍＲＮＡを抑制したときの抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡの発現量の変化を図１９示す。図１８では、ＯＲ２ＡＴ４ｍＲＮＡを抑制した細胞において、ＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡの発現量の低下が顕著となることが確認された。また図１９では、ＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ発現を抑制した細胞において、同じくＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡの発現量の低下が顕著となることが確認された。
すなわち皮膚嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４又はＯＲ５１Ｂ５の抑制によって抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２が選択的に抑制されることが明らかとなった。
ＯＲ２ＡＴ４ｍＲＮＡを抑制したときの抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡの発現量の変化を図１８に、同じくＯＲ５１Ｂ５ｍＲＮＡを抑制したときの抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡの発現量の変化を図１９示す。図１８では、ＯＲ２ＡＴ４ｍＲＮＡを抑制した細胞において、ＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡの発現量の低下が顕著となることが確認された。また図１９では、ＯＲ５１Ｂ５のｍＲＮＡ発現を抑制した細胞において、同じくＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡの発現量の低下が顕著となることが確認された。
すなわち皮膚嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４又はＯＲ５１Ｂ５の抑制によって抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２が選択的に抑制されることが明らかとなった。
【0080】
３）炎症関連因子ＩＬ－８ｍＲＮＡの変化
ＯＲ２ＡＴ４ｍＲＮＡを抑制したときの炎症関連因子ＩＬ－８のｍＲＮＡの発現量の変化を図２０に、同じくＯＲ５１Ｂ５ｍＲＮＡを抑制したときの炎症関連因子ＩＬ－８のｍＲＮＡの発現量の変化を図２１示す。
図２０では、ＯＲ２ＡＴ４ｍＲＮＡを抑制した細胞において、炎症関連因子ＩＬ－８ｍＲＮＡの発現量の上昇が顕著となることが確認された。
また図２１では、ＯＲ２ＢＴ４のｍＲＮＡ発現を抑制した細胞において、同じく炎症関連因子ＩＬ－８のｍＲＮＡの発現量の上昇が顕著となることが確認された。
すなわち皮膚嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４又はＯＲ２ＢＴ４の抑制によって炎症関連因子ＩＬ－８が選択的に上昇することが明らかとなった。
ＯＲ２ＡＴ４ｍＲＮＡを抑制したときの炎症関連因子ＩＬ－８のｍＲＮＡの発現量の変化を図２０に、同じくＯＲ５１Ｂ５ｍＲＮＡを抑制したときの炎症関連因子ＩＬ－８のｍＲＮＡの発現量の変化を図２１示す。
図２０では、ＯＲ２ＡＴ４ｍＲＮＡを抑制した細胞において、炎症関連因子ＩＬ－８ｍＲＮＡの発現量の上昇が顕著となることが確認された。
また図２１では、ＯＲ２ＢＴ４のｍＲＮＡ発現を抑制した細胞において、同じく炎症関連因子ＩＬ－８のｍＲＮＡの発現量の上昇が顕著となることが確認された。
すなわち皮膚嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４又はＯＲ２ＢＴ４の抑制によって炎症関連因子ＩＬ－８が選択的に上昇することが明らかとなった。
【0081】
以上の参考実施例４の試験結果から、皮膚嗅覚受容体の発現の抑制は、抗酸化ストレス因子を抑制し、炎症関連因子を増強させることが明らかとなった。
【0082】
実施例４：シソ葉抽出物が皮膚細胞の抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２と炎症関連因子ＩＬ－８に及ぼす作用
実施例３おいて、シソ葉抽出物が環境因子による皮膚嗅覚受容体の産生抑制を防御し回復させる作用を有することを示した。本実施例４においては、シソ葉抽出物が、参考実施例４で示した環境因子による抗酸化ストレス因子の抑制を同様に防御し回復させ、また炎症関連因子の増加を抑制する効果を有することを確認した。この作用について次に説明する。
実施例３おいて、シソ葉抽出物が環境因子による皮膚嗅覚受容体の産生抑制を防御し回復させる作用を有することを示した。本実施例４においては、シソ葉抽出物が、参考実施例４で示した環境因子による抗酸化ストレス因子の抑制を同様に防御し回復させ、また炎症関連因子の増加を抑制する効果を有することを確認した。この作用について次に説明する。
【0083】
＜シソ葉抽出物による環境因子に対する影響試験＞
（１）試験に用いた環境因子
ダニ抗原（Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ：株式会社エル・エス・エル）、スギ花粉抽出物（Cedar Pollen Extract：株式会社エル・エス・エル)、ベンゾ［ａ］ピレン（Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ：富士フイルム和光純薬）を細胞培養培地で次の濃度になるように希釈して試験に用いた。
Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ（３μｇ／ｍｌ）
Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ（３μｇ／ｍｌ）
Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ（１０μＭ）：０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．１％に溶解後に細胞培養培地で希釈
（１）試験に用いた環境因子
ダニ抗原（Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ：株式会社エル・エス・エル）、スギ花粉抽出物（Cedar Pollen Extract：株式会社エル・エス・エル)、ベンゾ［ａ］ピレン（Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ：富士フイルム和光純薬）を細胞培養培地で次の濃度になるように希釈して試験に用いた。
Ｍｉｔｅ－Ｄｐ Ｆｅｃｅｓ ＡＧ（３μｇ／ｍｌ）
Ｃｅｄａｒ Ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔ（３μｇ／ｍｌ）
Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ（１０μＭ）：０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．１％に溶解後に細胞培養培地で希釈
【0084】
（２）試験方法
１）トランスフェクションＮＨＥＫ（ｐａｓｓａｇｅ４）細胞を２×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ／ｗｅｌｌになるように１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
２）２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。次いで新しい培地に、シソ葉抽出物０．００１％と上記の環境因子を添加する。
３）さらに２４時間培養した後、培地を除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。次いで新しい培地にＢ［ａ］Ｐ、Ｍｉｔｅ ＤｐＦ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔを添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
４）２４時間培養後、培養上清を回収除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。ＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ）３００μｌを添加し、使用説明書に従ってＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。最後にＲＮａｓｅＦｒｅｅＷａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を３０μｌ添加して、ＲＮＡを溶解し、濃度を測定する。
５）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＭ） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、ｃＤＮＡ合成する。
６）次いでＳＹＢＲＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴＭ）ＩＩ（タカラバイオ）を用いＰＣＲを行う。
７）ＨＰＲＴ１／ＲＰＳ１８遺伝子の発現量を１として、これに対する発現相対量で評価する。
１）トランスフェクションＮＨＥＫ（ｐａｓｓａｇｅ４）細胞を２×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ／ｗｅｌｌになるように１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
２）２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。次いで新しい培地に、シソ葉抽出物０．００１％と上記の環境因子を添加する。
３）さらに２４時間培養した後、培地を除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。次いで新しい培地にＢ［ａ］Ｐ、Ｍｉｔｅ ＤｐＦ ＡＧ、Ｃｅｄａｒ ｐｏｌｌｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔを添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。
４）２４時間培養後、培養上清を回収除去し、ＰＢＳ（－）で一回洗浄する。ＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ）３００μｌを添加し、使用説明書に従ってＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出する。最後にＲＮａｓｅＦｒｅｅＷａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を３０μｌ添加して、ＲＮＡを溶解し、濃度を測定する。
５）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＭ） ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用い、ｃＤＮＡ合成する。
６）次いでＳＹＢＲＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴＭ）ＩＩ（タカラバイオ）を用いＰＣＲを行う。
７）ＨＰＲＴ１／ＲＰＳ１８遺伝子の発現量を１として、これに対する発現相対量で評価する。
【0085】
（３）データの解析
１２ｗｅｌｌの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データは希釈培地又はＤＭＳＯ）添加細胞の測定値に対して有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
１２ｗｅｌｌの測定結果から、平均値及び標準偏差値を得た。全データは希釈培地又はＤＭＳＯ）添加細胞の測定値に対して有意差検定を行った（ｔ－検定、有意水準：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0086】
（４）試験結果
【0087】
１）抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡの変化
抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡの発現量の変化を図２２に示す。図２２では、環境因子によって低下する抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡ発現が回復又は増強されていることが確認された。
すなわち皮膚に対して環境因子が、抗酸化ストレス因子の発現を抑制するのに対して、シソ葉抽出物は、環境因子による抑制作用に対して抗酸化ストレス因子の低下抑制又は回復、あるいは抗酸化ストレス因子の発現を増強していることが明らかとなった。
抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡの発現量の変化を図２２に示す。図２２では、環境因子によって低下する抗酸化ストレス因子ＮＦＥ２Ｌ２のｍＲＮＡ発現が回復又は増強されていることが確認された。
すなわち皮膚に対して環境因子が、抗酸化ストレス因子の発現を抑制するのに対して、シソ葉抽出物は、環境因子による抑制作用に対して抗酸化ストレス因子の低下抑制又は回復、あるいは抗酸化ストレス因子の発現を増強していることが明らかとなった。
【0088】
２）炎症関連因子ＩＬ－８ｍＲＮＡの変化
ＯＲ２ＡＴ４ｍＲＮＡを抑制したときの炎症関連因子ＩＬ－８ｍＲＮＡの発現量の変化を図２３に示す。図２３では、環境因子によってＩＬ－８の発現が増加するが、シソ葉抽出物は、このＩＬ－８の増加を抑制し、正常化する作用を有していることが確認された。
すなわち皮膚に対して環境因子が、皮膚の炎症を誘発又は促進する方向に作用する炎症関連因子ＩＬ－８の発現を増強するが、シソ葉抽出物は、このＩＬ－８の発現を抑制する方向に作用することが分かった。
ＯＲ２ＡＴ４ｍＲＮＡを抑制したときの炎症関連因子ＩＬ－８ｍＲＮＡの発現量の変化を図２３に示す。図２３では、環境因子によってＩＬ－８の発現が増加するが、シソ葉抽出物は、このＩＬ－８の増加を抑制し、正常化する作用を有していることが確認された。
すなわち皮膚に対して環境因子が、皮膚の炎症を誘発又は促進する方向に作用する炎症関連因子ＩＬ－８の発現を増強するが、シソ葉抽出物は、このＩＬ－８の発現を抑制する方向に作用することが分かった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】