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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-05
(45)【発行日】2024-08-14
(54)【発明の名称】サルモネラの識別方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240806BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20240806BHJP
C12Q 1/04 20060101ALN20240806BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
G01N27/62 V
G01N27/62 D
C12Q1/04
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2020096325
(22)【出願日】2020-06-02
(65)【公開番号】P2021189089
(43)【公開日】2021-12-13
【審査請求日】2022-10-31
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】000001993
【氏名又は名称】株式会社島津製作所
(74)【代理人】
【識別番号】100179969
【弁理士】
【氏名又は名称】駒井 慎二
(72)【発明者】
【氏名】福山 裕子
【審査官】海野 佳子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１６８７４０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１９－１３８８１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／０１０７８６４（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記タンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一つのタンパク質をマーカーとして用いるサルモネラの識別方法。Ｓ２２
【請求項2】
さらに下記タンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一つのタンパク質をマーカーとして用いる請求項１に記載のサルモネラの識別方法。Ｇｎｓ、ＹａｉＡ、ＹｉｂＴ、ＰＰＩａｓｅ、Ｌ２５、Ｌ２１、Ｓ８、Ｌ１７、Ｌ１５、Ｓ７、ＹｃｉＦ、ＳｏｄＡ
【請求項3】
識別対象のサルモネラを質量分析する請求項１または２に記載のサルモネラの識別方法。
【請求項4】
質量分析がＭＡＬＤＩ－ＭＳである請求項３に記載のサルモネラの識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サルモネラの識別方法に関する。より詳細には、本発明は特定のタンパク質をマーカーとして用いたサルモネラの種、亜種、血清型を識別するサルモネラの識別方法に関する。
【背景技術】
【0002】
従来、微生物の種類を識別する手法の１つとしてＤＮＡ塩基配列に基づく相同性解析が広く用いられている。こうしたＤＮＡ塩基配列を利用した手法では、被検微生物からのＤＮＡ抽出やＤＮＡ塩基配列の決定などに比較的長い時間を要する。
【0003】
しかしながら、さまざまな疾患を引き起こす細菌に罹患した場合、その細菌を迅速かつ正確に特定することは患者の治癒とともに二次感染の予防のために極めて重要である。したがって、迅速かつ正確な細菌の分析方法が求められている。
【0004】
そこで、近年では被検微生物を質量分析して得られたマススペクトルパターンに基づいて微生物同定を行う手法が用いられている。質量分析によれば、ごく微量の微生物試料を用いて短時間で分析結果を得ることができ、且つ多検体の連続分析も容易であるため、簡便且つ迅速な微生物同定が可能となる。特に、タンパク質等の生体高分子をできるだけ分解せずにイオン化するソフトイオン化法が実用化されて以来、微生物の分析に質量分析が広く応用されている。
【0005】
ソフトイオン化法のなかでも、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（以下、ＭＡＬＤＩ－ＭＳと称する場合がある）と呼ばれるイオン化法を用いた質量分析は、近年、微生物の分析手段として注目を浴びている。ＭＡＬＤＩ－ＭＳにより得られたマススペクトルパターンを、予めデータベースに多数収録された既知微生物のマススペクトルパターンと照合することにより、被検微生物の同定が行われる。こうした手法はマススペクトルパターンを各微生物に特異的な情報（すなわち指紋）として利用するため、フィンガープリント法と呼ばれている。
【0006】
ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いた微生物同定において、種までの分析は、フィンガープリント法による手法が知られており、臨床分野の一部では実用化されている。一方、亜種や血清型までの分析は、例えば、特許文献１にリボゾームタンパク質等をマーカーとして用いる手法が報告されている。特許文献１の方法では、あらかじめ実測されたマススペクトルの検出ピーク情報（ｍ／ｚ値など）を分析対象物の実測デ-タと照会し、マーカーに帰属される特定のｍ／ｚ値のピークの有無により微生物の識別が行われる。
【0007】
特許文献２には、複数のデータからなる複数のグループにおいて、各グループのデータを比較して差異解析を行い、各グループを識別するためのマーカーを探索する方法が記載されている。
さらに上記特許文献１あるいは２の方法を用いて、マーカーを特定し微生物を識別した結果も得られている。
さらに上記特許文献１あるいは２の方法を用いて、マーカーを特定し微生物を識別した結果も得られている。
【0008】
例えば、サルモネラ属のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ. ｅｎｔｅｒｉｃａについて、種までの同定をフィンガープリント法による手法で行い、血清型の識別を１２種のマーカーを用いて行う手法が報告されている（特許文献３、非特許文献1）。
非特許文献１によれば、特許文献１の方法により、ｍ／ｚ値などあらかじめ実測されたマススペクトルの検出ピーク情報を実データと照会することで、まず識別対象微生物がサルモネラ属であることを特定している。次に、血清型ごとにグループ分けされた複数の菌株のデータを比較して、各血清型を識別するためのマーカーを特定している。このような方法により、サルモネラの血清型識別マーカーとして１２種が特定され、これらのマーカーにより２２種の血清型が識別できることが報告されている。
また他の微生物のマーカーの報告例もある（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４等）。
非特許文献１によれば、特許文献１の方法により、ｍ／ｚ値などあらかじめ実測されたマススペクトルの検出ピーク情報を実データと照会することで、まず識別対象微生物がサルモネラ属であることを特定している。次に、血清型ごとにグループ分けされた複数の菌株のデータを比較して、各血清型を識別するためのマーカーを特定している。このような方法により、サルモネラの血清型識別マーカーとして１２種が特定され、これらのマーカーにより２２種の血清型が識別できることが報告されている。
また他の微生物のマーカーの報告例もある（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】特開２０１５-１８４０２０号公報
【文献】特開２０１８-５０５０６３号公報
【文献】ＷＯ２０１７／１６８７４０公報
【非特許文献】
【0010】
【文献】Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，Ｖｏｌ．１０１，No．２３－２４
【文献】ＰｌｏＳ ＯＮＥ. ２０１４；９：ｅ１１３４５８.
【文献】Ｊ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ. ２０１５; １１９: ２３３
【文献】ＰｌｏＳ ＯＮＥ. ２０１６； １１： ｅ０１５９７３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
微生物は同一属に属していても、その種、亜種、血清型および株等に細かく分類され、それぞれの性質が異なることが知られている。例えば上述のサルモネラ属の場合、種はｅｎｔｅｒｉｃａとｂｏｎｇｏｒｉの２菌種、あるいはこれらにｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａを加えた３菌種あり、ｅｎｔｅｒｉｃａには６種の亜種がある。さらに亜種ごとに異なる血清型や株があり、例えば亜種ｅｎｔｅｒｉｃａには２０００種以上の血清型が存在するといわれている。
【0012】
さらにサルモネラ属の血清型はそれぞれ生物学的に異なる性質を有し、例えばヒトに対して病原性がある場合とない場合がある。したがって、サルモネラの種、亜種、血清型、株をできるだけ簡便かつ迅速に識別する必要がある。
【0013】
サルモネラなどのように、多数の血清型や株が存在する場合、すべてを分析することは容易ではない。またヒトに対し病原性がある微生物の分析では、できるだけ実測件数を抑えることが、検査者の安全性の観点からも重要である。さらに購入できる試料の種類も限られている。したがって上記方法のように実測データのみに基づきマーカー探索を行うには限界がある。そのため、これまで報告されているマーカー数は限られ、マーカーにより識別できる種、亜種、血清型も限られていた。
【0014】
また血清型や株の数が膨大な微生物の場合、識別に利用できる実測データも少なく、実測データのデータベース化もまだ十分に整備されていない。
【0015】
したがって、できるだけ少ない実測データに基づき、特定されたマーカーにより、迅速で簡便な方法でサルモネラを識別する方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明者らは、特定のタンパク質がサルモネラの種、亜種、血清型を識別できるマーカーとして使用できることを見出し本発明を完成するに至った。
【0017】
すなわち本発明は、
下記タンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一つのタンパク質をマーカーとして用いるサルモネラの識別方法に関する。
Ｓ２２、ＹｃａＲ、Ｌ３５、ＢｃｓＲ、ＳｓａＧ、
Ｎｕｃｌｅｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＹｉｂＪ、ＯａｄＧ、
ＣｈａＢ、ＺａｐＢ、ＨＵ－１、ＹｅｉＳ、ＨＵ－２、ＩｒａＰ、Ｓ１５、
ｒｐｏＺ、ＩＨＦｂ、ＩＨＦａ、ＹｇａＭ、ＲａｉＡ、ＹｉｆＥ、
ＹｅｅＸ、Ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ、ＲＮａｓｅＰ、ＣｈｅＹ、Ｓ５
下記タンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一つのタンパク質をマーカーとして用いるサルモネラの識別方法に関する。
Ｓ２２、ＹｃａＲ、Ｌ３５、ＢｃｓＲ、ＳｓａＧ、
Ｎｕｃｌｅｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＹｉｂＪ、ＯａｄＧ、
ＣｈａＢ、ＺａｐＢ、ＨＵ－１、ＹｅｉＳ、ＨＵ－２、ＩｒａＰ、Ｓ１５、
ｒｐｏＺ、ＩＨＦｂ、ＩＨＦａ、ＹｇａＭ、ＲａｉＡ、ＹｉｆＥ、
ＹｅｅＸ、Ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ、ＲＮａｓｅＰ、ＣｈｅＹ、Ｓ５
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、特定のタンパク質をサルモネラの識別用マーカーとして用いることで、迅速に、より簡便な方法でサルモネラを識別することができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明において、マーカーとはサルモネラのさまざま種、亜種、血清型または株を識別するために用いられる特徴的なタンパク質である。マーカーは必ずしも血清型や株まで識別する必要はなく、目的に応じて種を識別するマーカー、または亜種、血清型を識別するマーカーであってもよい。本発明のサルモネラの識別に用いるマーカーは以下の２６種のタンパク質である。
Ｓ２２、ＹｃａＲ、Ｌ３５、ＢｃｓＲ、ＳｓａＧ、
Ｎｕｃｌｅｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＹｉｂＪ、ＯａｄＧ、
ＣｈａＢ、ＺａｐＢ、ＨＵ－１、ＹｅｉＳ、ＨＵ－２、ＩｒａＰ、Ｓ１５、
ｒｐｏＺ、ＩＨＦｂ、ＩＨＦａ、ＹｇａＭ、ＲａｉＡ、ＹｉｆＥ、
ＹｅｅＸ、Ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ、ＲＮａｓｅＰ、ＣｈｅＹ、Ｓ５
Ｓ２２、ＹｃａＲ、Ｌ３５、ＢｃｓＲ、ＳｓａＧ、
Ｎｕｃｌｅｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＹｉｂＪ、ＯａｄＧ、
ＣｈａＢ、ＺａｐＢ、ＨＵ－１、ＹｅｉＳ、ＨＵ－２、ＩｒａＰ、Ｓ１５、
ｒｐｏＺ、ＩＨＦｂ、ＩＨＦａ、ＹｇａＭ、ＲａｉＡ、ＹｉｆＥ、
ＹｅｅＸ、Ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ、ＲＮａｓｅＰ、ＣｈｅＹ、Ｓ５
【0021】
上記タンパク質はサルモネラに含まれるタンパク質であり、種、亜種、血清型によらず共通に含まれるタンパク質である。さらに、これらタンパク質は、同じタンパク質であっても種、亜種または血清型が異なると、質量分析した時、プロトンが中性分子のタンパク質Ｍに付加した分子（以下、[Ｍ+Ｈ]+と称する場合がある）などのタンパク質のアミノ酸配列に基づく分子量関連イオンピークの理論ｍ／ｚ値が異なる。したがって識別対象のサルモネラを質量分析して得られる分子量関連イオンのピーク（以下、分子量関連イオンピークと称する場合がある）から、上記タンパク質に帰属される分子量関連イオンピークの理論ｍ／ｚ値を求め、求められたｍ／ｚ値を有するタンパク質がどの種、亜種または血清型に属するかを予め特定しておけば、これら識別対象のサルモネラがどの種、亜種、または血清型に属するかが判明する。このとき、タンパク質の質量電荷比ｍ／ｚの値としては、各タンパク質の塩基配列をアミノ酸配列に翻訳することにより求められた計算質量を用いることが望ましい。さらに、前記アミノ酸配列から計算質量を求める際には、翻訳後修飾としてＮ－末端メチオニン残基の切断を考慮することが望ましい。具体的には、最後から２番目のアミノ酸残基がGly、 Ala、 Ser、 Pro、 Val、 Thr、 またはCysである場合に、Ｎ－末端メチオニンが切断されるものとして理論値を算出する。
【0022】
本発明における上記２６種のマーカータンパク質は、図１のフローチャートに示したような以下の手順で特定された。特定方法はこの方法に限定されるものではない。例えば、実データを比較し、これらのマーカータンパク質を特定してもよい。
ステップ１：全ゲノムが解読されているサルモネラの菌株を選定する。
ステップ２：上記ステップ１で選定したサルモネラの菌株の質量分析を行い、タンパク質のアミノ酸配列に基づく[Ｍ+Ｈ]+などの分子量関連イオンのピークを得る。
ステップ３：上記ステップ２で得られた分子量関連イオンピークから各ピークのｍ／ｚ値を実測された値として得る（以下、実測ｍ／ｚ値と称する場合もある）。
ステップ４：上記ステップ１で選定されたサルモネラの菌株について、遺伝子データベースより、当該サルモネラが有するタンパク質とアミノ酸配列を得、当該アミノ酸配列情報から当該タンパク質のｍ／ｚ値の理論値を算出する（以下、理論ｍ／ｚ値と称する場合がある）。
ステップ１：全ゲノムが解読されているサルモネラの菌株を選定する。
ステップ２：上記ステップ１で選定したサルモネラの菌株の質量分析を行い、タンパク質のアミノ酸配列に基づく[Ｍ+Ｈ]+などの分子量関連イオンのピークを得る。
ステップ３：上記ステップ２で得られた分子量関連イオンピークから各ピークのｍ／ｚ値を実測された値として得る（以下、実測ｍ／ｚ値と称する場合もある）。
ステップ４：上記ステップ１で選定されたサルモネラの菌株について、遺伝子データベースより、当該サルモネラが有するタンパク質とアミノ酸配列を得、当該アミノ酸配列情報から当該タンパク質のｍ／ｚ値の理論値を算出する（以下、理論ｍ／ｚ値と称する場合がある）。
【0023】
ステップ５：上記ステップ４で算出した理論ｍ／ｚ値と、上記ステップ３で得られた実測ｍ／ｚ値と比較し、実測ｍ／ｚ値に一致する理論ｍ／ｚ値を有するタンパク質とそのアミノ酸配列に、実測されたｍ／ｚ値を帰属する。
ステップ６：上記ステップ５で帰属されたタンパク質と類似のアミノ酸配列をデータベースより入手する。
ステップ７：上記ステップ６で入手した類似のアミノ酸配列を有する微生物のうちから、サルモネラを選別し、サルモネラの有するタンパク質のアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値を算出する。
ステップ８ ：ステップ７で算出したアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値をサルモネラの種、亜種、血清型、株などの識別分類ごとに比較し、種、亜種、血清型、株などの識別分類ごとに差異のある理論ｍ／ｚ値を有するタンパク質をサルモネラの識別のためのマーカーとして特定する。
ステップ６：上記ステップ５で帰属されたタンパク質と類似のアミノ酸配列をデータベースより入手する。
ステップ７：上記ステップ６で入手した類似のアミノ酸配列を有する微生物のうちから、サルモネラを選別し、サルモネラの有するタンパク質のアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値を算出する。
ステップ８ ：ステップ７で算出したアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値をサルモネラの種、亜種、血清型、株などの識別分類ごとに比較し、種、亜種、血清型、株などの識別分類ごとに差異のある理論ｍ／ｚ値を有するタンパク質をサルモネラの識別のためのマーカーとして特定する。
【0024】
上記ステップ1で選定される全ゲノムが解読されているサルモネラの菌株は遺伝子データベース等の公知のデータベース、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（登録商標 別名Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）、ＮＣＢＩや購入先情報に基づき選定すればよい。全ゲノムが解読されているサルモネラの菌株が選定されたら、当該サルモネラを入手し、ステップ２にて、質量分析を行い、タンパク質のアミノ酸配列に基づく分子量関連イオンピークを得る。質量分析方法は上述のＭＡＬＤＩ－ＭＳが好ましい。ＭＡＬＤＩ－ＭＳではタンパク質毎にアミノ酸配列に基づく分子量関連イオンピークが得られ、それぞれのピークに対して、ステップ３で、その実測ｍ／ｚ値を得る。
【0025】
一方、ステップ１で選定したサルモネラの菌株は、全ゲノム解読がなされているので、そのサルモネラの菌株に存在するタンパク質とそのアミノ酸配列は判明しており、通常、遺伝子データベースに収録されている。したがって、ステップ４では、ステップ１で選定したサルモネラが有する全タンパク質のアミノ酸配列をデータベースより入手し、それぞれの理論ｍ／ｚ値を算出することができる。用いるデータベースは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（登録商標 別名Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）、ＮＣＢＩ等が挙げられる。
【0026】
ステップ５では、ステップ３で得られた実測ｍ／ｚ値とステップ４で算出した理論ｍ／ｚ値を比較することで、ステップ２の質量分析で得られた全ての分子量関連イオンピークを既知のタンパク質およびそのアミノ酸配列に帰属することができる。
【0027】
微生物の場合、属、種、亜種、血清型、または株により、タンパク質の質量が異なる場合がある。この質量の違いは、タンパク質を構成するアミノ酸が変異したためであると考えられる。ステップ６ではアミノ酸配列の変異体を検索するため、帰属されたタンパク質と類似のアミノ酸配列を検索する。
【0028】
上記ステップ６で類似のアミノ酸配列を有するタンパク質は、例えば既存の微生物のデータベースから検索により特定することができる。検索の方法は例えば、データベースとしてＵｎｉＰｒｏｔやＮＣＢＩなどを用いたＳｉｍｉｌａｒｉｔｙ検索（相同性検索）が挙げられる。Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ検索を行う場合、例えば配列類似度５０％以上の条件で検索する。配列類似度については識別の目的等に応じて、適宜、設定すればよい。
【0029】
上記ステップ６で選定された類似のアミノ酸配列を有するタンパク質はサルモネラ以外のアミノ酸配列も含まれるため、そのなかから、ステップ７にて既存のデータベースに基づきサルモネラのアミノ酸配列のみを選別し、その理論ｍ／z値を求める。
【0030】
このようにしてステップ４から７により全ゲノムが解読されているサルモネラの菌株を質量分析することで検出されるピークが帰属されるタンパク質とそのアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値が得られる。併せて全ゲノムが解読されているサルモネラのアミノ酸配列と類似のアミノ酸配列をもつサルモネラのタンパク質の理論ｍ／ｚ値が求められる。ステップ８では、例えば同属異種のサルモネラが有するタンパク質のアミノ酸配列に基づく理論ｍ／ｚ値を比較し、種間で差異のあるｍ／ｚ値を有するタンパク質が特定できれば、該タンパク質をサルモネラの種を判別するためのマーカーとして特定できる。亜種または血清型においても同様に、亜種または血清型間で差異のある理論ｍ／ｚ値を有するタンパク質が特定できれば、該タンパク質を亜種または血清型を判別するためのマーカーとして特定できる。
【0031】
上述の方法により、サルモネラのマーカーとして、下記２６種のタンパク質をマーカーとして特定した（以下マーカータンパク質と称する場合がある）。
Ｓ２２、ＹｃａＲ、Ｌ３５、ＢｃｓＲ、ＳｓａＧ、
Ｎｕｃｌｅｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＹｉｂＪ、ＯａｄＧ、
ＣｈａＢ、ＺａｐＢ、ＨＵ－１、ＹｅｉＳ、ＨＵ－２、ＩｒａＰ、Ｓ１５、
ｒｐｏＺ、ＩＨＦｂ、ＩＨＦａ、ＹｇａＭ、ＲａｉＡ、ＹｉｆＥ、
ＹｅｅＸ、Ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ、ＲＮａｓｅＰ、ＣｈｅＹ、Ｓ５
Ｓ２２、ＹｃａＲ、Ｌ３５、ＢｃｓＲ、ＳｓａＧ、
Ｎｕｃｌｅｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＹｉｂＪ、ＯａｄＧ、
ＣｈａＢ、ＺａｐＢ、ＨＵ－１、ＹｅｉＳ、ＨＵ－２、ＩｒａＰ、Ｓ１５、
ｒｐｏＺ、ＩＨＦｂ、ＩＨＦａ、ＹｇａＭ、ＲａｉＡ、ＹｉｆＥ、
ＹｅｅＸ、Ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ、ＲＮａｓｅＰ、ＣｈｅＹ、Ｓ５
【0032】
本発明のサルモネラの識別方法は上記マーカータンパク質の少なくとも１種をマーカーとして用い、サルモネラの種、亜種、血清型を識別する方法である。これらマーカーを用いることで、サルモネラの種、亜種、血清型の判別を容易にし、サルモネラの種、亜種および血清型を簡便かつ迅速に識別することができる。
【0033】
上述の方法により特定されたマーカータンパク質のうち２種以上を組み合わせてサルモネラの識別に用いてもよい。識別の精度の観点から、２種以上を組み合わせることが好ましい。
【0034】
本発明のサルモネラの識別方法では、上記のマーカータンパク質と他のマーカーとを組み合わせて、サルモネラの識別に用いてもよい。他のマーカーとしては、公知の文献等に記載のマーカーなどが挙げられる。
【0035】
公知の文献としては非特許文献１などが挙げられる。
例えば非特許文献１には下記の１２種のタンパク質がサルモネラのマーカーとして提案されている。下記１２種のタンパク質の少なくとも１種と上記タンパク質の少なくとも１種とを組み合わせて、サルモネラの識別に用いてもよい。
Ｇｎｓ、ＹａｉＡ、ＹｉｂＴ、ＰＰＩａｓｅ、Ｌ２５、Ｌ２１、Ｓ８、
Ｌ１７、Ｌ１５、Ｓ７、ＹｃｉＦ、ＳｏｄＡ
さらに他のマーカーと組み合わせて識別に用いてもよい。
例えば非特許文献１には下記の１２種のタンパク質がサルモネラのマーカーとして提案されている。下記１２種のタンパク質の少なくとも１種と上記タンパク質の少なくとも１種とを組み合わせて、サルモネラの識別に用いてもよい。
Ｇｎｓ、ＹａｉＡ、ＹｉｂＴ、ＰＰＩａｓｅ、Ｌ２５、Ｌ２１、Ｓ８、
Ｌ１７、Ｌ１５、Ｓ７、ＹｃｉＦ、ＳｏｄＡ
さらに他のマーカーと組み合わせて識別に用いてもよい。
【0036】
上記マーカータンパク質および必要であれば他のマーカーを用いて、識別対象のサルモネラを識別する。識別方法は、例えば、識別対象のサルモネラを質量分析する方法が採用できる。特に高分子をできるだけ分解せずにイオン化するソフトイオン化法を採用したＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いることが好ましい。
【0037】
識別対象のサルモネラを質量分析し、タンパク質の分子量関連イオンピークを得る。得られた分子量関連イオンピークから上記マーカータンパク質として特定されたタンパク質に帰属される理論ｍ／ｚ値におけるピークの存在の有無を確認する。あるいは、そのマーカータンパク質のピークがどの理論ｍ／ｚ値で検出されるかを確認する。マーカータンパク質として特定されたタンパク質に帰属される理論ｍ／ｚ値におけるピークの存在が識別対象のサルモネラに確認されれば、当該タンパク質を有する種、亜種または血清型などが識別される。あるいは、そのマーカータンパク質のピークのｍ／ｚ値に基づき、サルモネラの種、亜種または血清型などが識別される。
【0038】
上述のとおり、サルモネラの識別に用いることができるマーカーを予め選定しておくことで、識別対象のサルモネラを質量分析すれば、そのサルモネラが属する種、亜種、または血清型などを識別することができる。また、想定される種、亜種、血清型を全て別途分析して識別対象のサルモネラと比較する必要はなく、識別対象のサルモネラのみを分析するだけよい。
【0039】
選定されたマーカーはサルモネラの種、亜種、血清型の判別を容易にし、サルモネラの種、亜種および血清型を簡便かつ迅速に識別することができる。また、種、亜種、血清型毎にマーカーを特定し、特定されたマーカーの少なくとも一つとその理論ｍ／ｚ値、および各種、各亜種、各血清型のいずれか少なくとも一つからなるデータベースを構築することもできる。例えば亜種を識別することができるマーカーを特定し、各亜種とそのマーカーとのデータベースを構築することができる。データベースにはマーカータンパク質以外のマーカーを有していてもよい。
【0040】
【0041】
上記図２のようなデータベースを構築しておくことで、識別対象のサルモネラを質量分析した結果得られる分子量関連イオンピークから実測ｍ／ｚ値を得、得られた実測ｍ／ｚ値とデータベースの理論ｍ／ｚ値を比較し、一致する理論ｍ／ｚ値から対応する種、亜種、または血清型を識別することができる。
識別精度を高める観点から、上記データベースに、さらに他のマーカーを同様な形式で収録してもよい。
識別精度を高める観点から、上記データベースに、さらに他のマーカーを同様な形式で収録してもよい。
【0042】
上記のようなデータベースを構築することで、識別対象のサルモネラの質量分析の結果から直ちにその種、亜種、血清型を識別することができる。
【実施例】
【0043】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらによって限定されない。
【0044】
以下の手順により、サルモネラのマーカータンパク質の特定を行い、その結果をまとめた。
【0045】
幾つかのサルモネラについて、ＭＡＬＤＩ－ＭＳで質量分析を行った。ＭＡＬＤＩ－ＭＳに用いた装置は島津製作所製ＡＸＩＭＡ（登録商標） Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅであり、測定条件は以下のとおりである。
【0046】
［質量分析条件］
装置：島津製作所製ＡＸＩＭＡ（登録商標） Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
条件: ｐｏｓｉｔｉｖｅモード。Ｌｉｎモード。ラスター分析。
装置：島津製作所製ＡＸＩＭＡ（登録商標） Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
条件: ｐｏｓｉｔｉｖｅモード。Ｌｉｎモード。ラスター分析。
【0047】
［手順］
１.サルモネラの全ゲノム解読株としてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ. ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ａｂａｅｔｅｔｕｂａ（以下、Ｓ.Ａｂａｅｔｅｔｕｂａと称する）の菌株: ＡＴＣＣ ３５６４０を選定し、ＬＢ寒天培地で、温度３７℃で２０時間培養した。同様に、サルモネラ属の血清型２種の各株: Ｓ. Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（菌株：ＧＴＣ００１３１、ＧＴＣ０９４９１、ＨｙｏｇｏＳＥ１１００２、ＨｙｏｇｏＳＥ１２００１）とＳ. Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（菌株：ＮＢＲＣ１４２１０、ＮＢＲＣ１５１８１、ＮＢＲＣ１２５２９、ＮＢＲＣ１３２４５）を、ＬＢ寒天培地で、温度３７℃で２０時間培養した。
１.サルモネラの全ゲノム解読株としてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ. ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ａｂａｅｔｅｔｕｂａ（以下、Ｓ.Ａｂａｅｔｅｔｕｂａと称する）の菌株: ＡＴＣＣ ３５６４０を選定し、ＬＢ寒天培地で、温度３７℃で２０時間培養した。同様に、サルモネラ属の血清型２種の各株: Ｓ. Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（菌株：ＧＴＣ００１３１、ＧＴＣ０９４９１、ＨｙｏｇｏＳＥ１１００２、ＨｙｏｇｏＳＥ１２００１）とＳ. Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（菌株：ＮＢＲＣ１４２１０、ＮＢＲＣ１５１８１、ＮＢＲＣ１２５２９、ＮＢＲＣ１３２４５）を、ＬＢ寒天培地で、温度３７℃で２０時間培養した。
【0048】
２.マトリックス溶液として、以下のｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｗａｋｏ社製、以下、ＳＡ）溶液を調製して以下の手順に用いた。
ＳＡ－１:ＳＡ２５ｍｇ／ｍＬのエタノール（以下、ＥｔＯＨ）溶液
ＳＡ－２: ＳＡ２５ ｍｇ／ｍＬのメチレンジホスホン酸（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、以下、ＭＤＰＮＡ）１重量％ 、ｎ－ｄｅｃｙｌ－β－Ｄ－ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、以下、ＤＭＰ）１ｍＭ、トリフルオロ酢酸（Ｗａｋｏ社製、ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、以下、ＴＦＡ）０．６重量％、およびアセトニトリル（Ｗａｋｏ社製、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、以下、ＡＣＮ）５０重量％からなる水溶液。
ＳＡ－１:ＳＡ２５ｍｇ／ｍＬのエタノール（以下、ＥｔＯＨ）溶液
ＳＡ－２: ＳＡ２５ ｍｇ／ｍＬのメチレンジホスホン酸（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、以下、ＭＤＰＮＡ）１重量％ 、ｎ－ｄｅｃｙｌ－β－Ｄ－ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、以下、ＤＭＰ）１ｍＭ、トリフルオロ酢酸（Ｗａｋｏ社製、ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、以下、ＴＦＡ）０．６重量％、およびアセトニトリル（Ｗａｋｏ社製、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、以下、ＡＣＮ）５０重量％からなる水溶液。
【0049】
３.上記手順１のサルモネラ約１ｍｇを微量天秤で秤量し、上記手順２で調整したＳＡ－２溶液を加え、サルモネラの濃度が１ｍｇ／０．０７５ ｍＬ（１×１０7個／μＬ）となるよう、ニードルで懸濁後、超音波に１ｍｉｎかけ、得られた懸濁液に対し、遠心分離を１２０００ｒｐｍ、５ｍｉｎの条件で行った。
【0050】
４.上記手順２で調整したＳＡ－１溶液を、ＭＡＬＤＩプレートに、０．５μＬずつ滴下し、プリコートした。その後、上記３.の遠心分離後の上清液を、プリコートされたウェル上に、１μＬずつ滴下した。自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ－ＭＳにプレートを挿入し、ｐｏｓｉｔｉｖｅ、Ｌｉｎモードで、ラスター分析で測定した。ｎ数は４とした。測定後、サルモネラの自己キャリブレーションを適用し、得られたマススペクトルを評価し、検出されたタンパク質のピークのｍ/ｚ値を確認した。
【0051】
５.全ゲノム解読株であるＳ. Ａｂａｅｔｅｔｕｂａの公開遺伝子情報から、全てのアミノ酸配列とタンパク質名を入手した。このアミノ酸配列情報から、各タンパク質のアミノ酸配列に基づく理論ｍ／ｚ値を算出した。
【0052】
６.上記手順５で入手したタンパク質に対し、上記４.で得られたマススペクトルのピークのうち、ｍ／ｚ値が３０００～２００００範囲、ピークのシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が３以上、質量精度５００ｐｐｍ以内で、ｎ数４のうち３回以上検出され、また手順5から入手したタンパク質のｍ／ｚ値の理論値の近似値がひとつのピークに対し２つ以上存在しないピークに帰属されるタンパク質を選択した。
【0053】
７.上記手順６の各タンパク質に対し、公開遺伝子情報のSimilarity検索（配列類似度５０％以上）により類似のアミノ酸配列情報を検索し、サルモネラ属菌の各株における理論ｍ／ｚ値を、種、亜種、血清型情報とともに入手した。
【0054】
８.上記手順７で得られた理論ｍ／ｚ値をサルモネラ属の種、亜種、血清型ごとに比較し、種、亜種、血清型ごとに異なるｍ／ｚ値を示すタンパク質をマーカータンパク質として以下の２６種を特定した。
【0055】
Ｓ２２、ＹｃａＲ、Ｌ３５、ＢｃｓＲ、ＳｓａＧ、
Ｎｕｃｌｅｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＹｉｂＪ、ＯａｄＧ、
ＣｈａＢ、ＺａｐＢ、ＨＵ－１、ＹｅｉＳ、ＨＵ－２、ＩｒａＰ、Ｓ１５、
ｒｐｏＺ、ＩＨＦｂ、ＩＨＦａ、ＹｇａＭ、ＲａｉＡ、ＹｉｆＥ、
ＹｅｅＸ、Ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ、ＲＮａｓｅＰ、ＣｈｅＹ、Ｓ５
Ｎｕｃｌｅｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＹｉｂＪ、ＯａｄＧ、
ＣｈａＢ、ＺａｐＢ、ＨＵ－１、ＹｅｉＳ、ＨＵ－２、ＩｒａＰ、Ｓ１５、
ｒｐｏＺ、ＩＨＦｂ、ＩＨＦａ、ＹｇａＭ、ＲａｉＡ、ＹｉｆＥ、
ＹｅｅＸ、Ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ、ＲＮａｓｅＰ、ＣｈｅＹ、Ｓ５
【0056】
９. 上記２６種のマーカータンパク質、および非特許文献1で報告されている１２マーカータンパク質を用いた場合の、種、亜種、血清型、および株の理論値情報をまとめた。併せて、サルモネラ属の血清型2種の各株: Ｓ. Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（菌株：ＧＴＣ００１３１、ＧＴＣ０９４９１、ＨｙｏｇｏＳＥ１１００２、ＨｙｏｇｏＳＥ１２００１）とＳ. Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（菌株：ＮＢＲＣ１４２１０、ＮＢＲＣ１５１８１、ＮＢＲＣ１２５２９、ＮＢＲＣ１３２４５）について、上記手順8.で特定されたマーカー候補が正しいかどうか確認するため、実測したマススペクトルからピーク検出状況を確認した。
【0057】
［結果］
Ｓ. Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（菌株：ＧＴＣ００１３１、ＧＴＣ０９４９１、ＨｙｏｇｏＳＥ１１００２、ＨｙｏｇｏＳＥ１２００１）とＳ. Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（菌株：ＮＢＲＣ１４２１０、ＮＢＲＣ１５１８１、ＮＢＲＣ１２５２９、ＮＢＲＣ１３２４５）のマススペクトルにおいて、上記手順６と同様にして選択した主なタンパク質のうちの代表ピークの検出状況を表１にまとめた。実測データは、遺伝子情報から算出したタンパク質のｍ／ｚ値情報をほぼ反映していた。
Ｓ. Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（菌株：ＧＴＣ００１３１、ＧＴＣ０９４９１、ＨｙｏｇｏＳＥ１１００２、ＨｙｏｇｏＳＥ１２００１）とＳ. Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（菌株：ＮＢＲＣ１４２１０、ＮＢＲＣ１５１８１、ＮＢＲＣ１２５２９、ＮＢＲＣ１３２４５）のマススペクトルにおいて、上記手順６と同様にして選択した主なタンパク質のうちの代表ピークの検出状況を表１にまとめた。実測データは、遺伝子情報から算出したタンパク質のｍ／ｚ値情報をほぼ反映していた。
【0058】
【表1】
【0059】
検出率は以下のようにして求めた。
血清型毎に上記各株について４回測定し、Ｓ／Ｎ＞３、質量精度500 ppm以内で、タンパク質が３回以上検出された場合を、そのタンパク質が検出された株と判定した。検出された株の数を測定した株の総数で割って検出率とした。例えば、タンパク質が検出された株が４株中、４株であれば検出率１００％、４株中３株であれば検出率は７５％である。
血清型毎に上記各株について４回測定し、Ｓ／Ｎ＞３、質量精度500 ppm以内で、タンパク質が３回以上検出された場合を、そのタンパク質が検出された株と判定した。検出された株の数を測定した株の総数で割って検出率とした。例えば、タンパク質が検出された株が４株中、４株であれば検出率１００％、４株中３株であれば検出率は７５％である。
【0060】
表１から分かるように一部を除き、ほぼ理論値通りにピークが検出されている。タンパク質によって検出率の低い場合がある理由としては、タンパク質のピークが低感度であるためだった。この結果から、遺伝子情報から検出ピークのｍ／ｚ値を予測することが可能であることが確かめられた。これにより、遺伝子情報に基づきマーカータンパク質を予測できると考えられる。併せて、上記方法により特定されたマーカータンパク質はサルモネラを識別するのに有効であると考えられた。
【0061】
上記でマーカーとして特定したタンパク質２６種の種、亜種、血清型の理論ｍ／ｚ値の例を表２、４、６に示す。併せて、非特許文献1で報告されているサルモネラ血清型識別用１２マーカータンパク質の理論ｍ/z値をまとめた結果を表３、５、７に示す。
【0062】
【表2】
【0063】
表２は、サルモネラ属の２種（S. bongori、S. enterica）に対する、上記でマーカーとして特定したタンパク質２６種のうち代表１７種（S15、S22、YeiS、YcaR、YgaM、RaiA、IraP、HU2、BcsR、IHFa、CheY、rpoZ、YifE、IHFb、YeeX、HU1、Endolysin）の理論ｍ／ｚ値を示している。表中の下線の数値は、その種のみで確認された理論ｍ／ｚ値を示している。ただし種間に５００ppm以内のｍ／ｚ値がある場合は下線をつけていない。複数のｍ／ｚ値がある場合は、代表値以外を”etc.”として示している。その場合、代表値としては、種間で差異のある代表的なｍ／ｚ値とともに、種間に近似するｍ／ｚ値がある場合はそのｍ／ｚ値を優先して例示している。
下線の数値のｍ／ｚ値でピークが確認された場合は、そのピークのみで種の識別ができる可能性があることを示している。また、ひとつのタンパク質で識別困難な場合も、複数のタンパク質のｍ／ｚ値を確認することで識別できる可能性があることがわかる。併せて、後述の表３のような既知マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難な識別もできる可能性がある。
下線の数値のｍ／ｚ値でピークが確認された場合は、そのピークのみで種の識別ができる可能性があることを示している。また、ひとつのタンパク質で識別困難な場合も、複数のタンパク質のｍ／ｚ値を確認することで識別できる可能性があることがわかる。併せて、後述の表３のような既知マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難な識別もできる可能性がある。
【0064】
【表3】
【0065】
表３は、サルモネラ属の２種（S. bongori、S. enterica）に対する、非特許文献１で報告された血清型識別用として既知のマーカータンパク質１２種のうち代表６種の理論ｍ／ｚ値を示している。下線の数値は、その種のみで確認された理論ｍ／ｚ値を示している。ただし種間で５００ppm以内のｍ／ｚ値がある場合は下線をつけていない。複数のｍ／ｚ値がある場合は、代表値以外を”etc.”として示している。その場合、代表値としては、種間で差異のある代表的なｍ／ｚ値とともに、種間に近似するｍ／ｚ値がある場合はそのｍ／ｚ値を優先して例示している。
なお、例示した6種のタンパク質は、非特許文献１で報告された血清型識別用の１２マーカーのうちの６つであり、表３に例示した種の識別用マーカーとしては知られていない。
表３の下線の数値のｍ／ｚ値でピークが確認された場合は、そのピークのみで種の識別ができる可能性があることを示している。また、ひとつのタンパク質で識別困難な場合も、複数のタンパク質のｍ／ｚ値を確認することで、識別できる可能があることがわかる。併せて、前記の表２のような新規マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難だった識別もできる可能性がある。
なお、例示した6種のタンパク質は、非特許文献１で報告された血清型識別用の１２マーカーのうちの６つであり、表３に例示した種の識別用マーカーとしては知られていない。
表３の下線の数値のｍ／ｚ値でピークが確認された場合は、そのピークのみで種の識別ができる可能性があることを示している。また、ひとつのタンパク質で識別困難な場合も、複数のタンパク質のｍ／ｚ値を確認することで、識別できる可能があることがわかる。併せて、前記の表２のような新規マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難だった識別もできる可能性がある。
【0066】
【表4】
【0067】
表４は、Salmonella entericaの６亜種（houtenae、salamae、indica、diarizonae、arizonae、enterica）に対する新規マーカータンパク質２６種のうち代表６種（ChaB、YeiS、SsaG、IraP、BcsR、Endolysin）の理論ｍ／ｚ値を示している。表中のハイフンはデータべースに記載のないことを示している。下線の数値は、その亜種のみで確認された理論ｍ／ｚ値を示している。ただし種間に５００ppm以内のｍ／ｚ値がある場合は下線をつけていない。複数のｍ／ｚ値がある場合は代表値以外を”etc.”として示している。その場合、代表値としては、種間で差異のある代表的なｍ／ｚ値とともに、種間に近似するｍ／ｚ値がある場合はそのｍ／ｚ値を優先して例示している。
下線の数値のｍ／ｚ値でピークが確認された場合は、そのピークのみで種の識別ができる可能性があることを示している。また、ひとつのタンパク質で識別困難な場合も、複数のタンパク質のｍ／ｚ値を確認することで、識別できる可能があることがわかる。併せて、後述の表５のような既知マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難だった識別もできる可能性がある。
下線の数値のｍ／ｚ値でピークが確認された場合は、そのピークのみで種の識別ができる可能性があることを示している。また、ひとつのタンパク質で識別困難な場合も、複数のタンパク質のｍ／ｚ値を確認することで、識別できる可能があることがわかる。併せて、後述の表５のような既知マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難だった識別もできる可能性がある。
【0068】
【表5】
【0069】
表５は、Salmonella entericaの６亜種（houtenae、salamae、indica、diarizonae、arizonae、enterica）に対する、非特許文献１で報告された血清型識別用として既知のマーカータンパク質１２種のうち代表４種（YibT、L15、YaiA、Gns）の理論ｍ／ｚ値を示している。表中のハイフンはデータべースに記載のないことを示している。下線の数値は、その亜種のみで確認された理論ｍ／ｚ値を示している。ただし種間に５００ppm以内のｍ／ｚ値がある場合は下線を示していない。複数のｍ／ｚ値がある場合は代表値以外を”etc.”として示している。その場合、代表値としては、種間で差異のある代表的なｍ／ｚ値とともに、種間に近似するｍ／ｚ値がある場合はそのｍ／ｚ値を優先して例示している。
なお、例示した４種のタンパク質は、非特許文献１で報告された血清型識別用の１２マーカーのうちの４つで、表５に例示した亜種の識別用マーカーとしては知られていない。
下線の数値のｍ／z値でピークが確認された場合は、そのピークのみで種の識別ができる可能性があることを示している。また、ひとつのタンパク質で識別困難な場合も、複数のタンパク質のｍ／ｚ値を確認することで、識別できる可能があることがわかる。
併せて、前記の表４のような新規マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難だった識別もできる可能性がある。
なお、例示した４種のタンパク質は、非特許文献１で報告された血清型識別用の１２マーカーのうちの４つで、表５に例示した亜種の識別用マーカーとしては知られていない。
下線の数値のｍ／z値でピークが確認された場合は、そのピークのみで種の識別ができる可能性があることを示している。また、ひとつのタンパク質で識別困難な場合も、複数のタンパク質のｍ／ｚ値を確認することで、識別できる可能があることがわかる。
併せて、前記の表４のような新規マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難だった識別もできる可能性がある。
【0070】
【表6】
【0071】
表６は、Salmonella enterica subsp. entericaの血清型１４種（Adelaide、Agama、Agona、Alachua、Albany、Altona、Anatum、Barreilly、Berta、Bovismorbificans、Braenderup、Brancaster、Bredeney、Cerro）に対する新規マーカータンパク質２６種のうち代表７種（YjbJ、ChaB、YeiS、SsaG、YgaM、RaiA、Endolysin）の理論ｍ／ｚ値を示している。表中のハイフンはデータべースのないことを示している。複数のタンパク質のｍ／ｚ値を組み合わせることで識別できる可能性があることがわかる。併せて、後述の表７のような既知マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難だった識別もできる可能性がある。
【0072】
【表7】
【0073】
表７は、Salmonella enterica subsp. entericaの血清型１４種（Adelaide、Agama、Agona、Alachua、Albany、Altona、Anatum、Barreilly、Berta、Bovismorbificans、Braenderup、Brancaster、Bredeney、Cerro）に対する新規マーカータンパク質の代表6種（SodA、YibT、L15、PPlase、L25、Gns）の理論ｍ／ｚ値を示している。表中のハイフンはデータべースのないことを示している。複数のタンパク質のｍ／ｚ値を組み合わせることで識別できる可能があることがわかる。なお、SodAは高質量タンパク質のため、他のタンパク質と比べ低感度であること、高質量域で確認されるピーク形状が変異しやすいことなどから、ｍ／ｚ値の精度が低下しやすいことが知られている。
例示した６種のタンパク質は、非特許文献１で報告された２２種の血清型識別用の１２マーカーのうちの6つで、２２種以外の血清型の識別マーカーとして有効なことは厳密には知られていない。表７では、S. Altona、S. Braenderup以外は２２種以外の血清型にあたる。
また、表６のような新規マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難だった識別もできる可能性がある。
例示した６種のタンパク質は、非特許文献１で報告された２２種の血清型識別用の１２マーカーのうちの6つで、２２種以外の血清型の識別マーカーとして有効なことは厳密には知られていない。表７では、S. Altona、S. Braenderup以外は２２種以外の血清型にあたる。
また、表６のような新規マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難だった識別もできる可能性がある。
【0074】
表２から７の結果から、今回のプロトコルにより確認された新規マーカータンパク質２６種が、サルモネラの種、亜種、血清型の識別に有効であることが判明した。併せて、これらのマーカータンパク質により、既知のマーカータンパク質だけでは困難な識別もできる可能性が示唆された。
【0075】
［態様］
上述した例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
上述した例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
【0076】
［１］下記タンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一つのタンパク質をマーカーとして用いるサルモネラの識別方法。
Ｓ２２、ＹｃａＲ、Ｌ３５、ＢｃｓＲ、ＳｓａＧ、
Ｎｕｃｌｅｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＹｉｂＪ、ＯａｄＧ、
ＣｈａＢ、ＺａｐＢ、ＨＵ－１、ＹｅｉＳ、ＨＵ－２、ＩｒａＰ、Ｓ１５、
ｒｐｏＺ、ＩＨＦｂ、ＩＨＦａ、ＹｇａＭ、ＲａｉＡ、ＹｉｆＥ、
ＹｅｅＸ、Ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ、ＲＮａｓｅＰ、ＣｈｅＹ、Ｓ５
Ｓ２２、ＹｃａＲ、Ｌ３５、ＢｃｓＲ、ＳｓａＧ、
Ｎｕｃｌｅｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＹｉｂＪ、ＯａｄＧ、
ＣｈａＢ、ＺａｐＢ、ＨＵ－１、ＹｅｉＳ、ＨＵ－２、ＩｒａＰ、Ｓ１５、
ｒｐｏＺ、ＩＨＦｂ、ＩＨＦａ、ＹｇａＭ、ＲａｉＡ、ＹｉｆＥ、
ＹｅｅＸ、Ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ、ＲＮａｓｅＰ、ＣｈｅＹ、Ｓ５
【0077】
上記［１］の発明によれば、特定のタンパク質をサルモネラの識別用マーカーとして用いることで、より迅速かつ簡便にサルモネラの種、亜種、血清型を識別することができる。また、他のマーカーであるタンパク質と組み合わせることにより、さらに効率的にサルモネラの種、亜種、血清型を識別することができる。
【0078】
［２］さらに下記タンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一つのタンパク質をマーカーとして用いる上記［１］に記載のサルモネラの識別方法。
Ｇｎｓ、ＹａｉＡ、ＹｉｂＴ、ＰＰＩａｓｅ、Ｌ２５、Ｌ２１、Ｓ８、Ｌ１７、
Ｌ１５、Ｓ７、ＹｃｉＦ、ＳｏｄＡ
Ｇｎｓ、ＹａｉＡ、ＹｉｂＴ、ＰＰＩａｓｅ、Ｌ２５、Ｌ２１、Ｓ８、Ｌ１７、
Ｌ１５、Ｓ７、ＹｃｉＦ、ＳｏｄＡ
【0079】
上記［２］の発明によれば、上記［１］に記載の識別用マーカーに[２]に記載の他の血清型識別マーカーであるタンパク質と組み合わせることにより、より効果的にサルモネラの種、亜種、血清型を識別することができる。加えて、[２]に記載の他のマーカータンパク質のみでは困難な識別も、[１]と組み合わせることで可能になることもある。
【0080】
［３］識別対象のサルモネラを質量分析する上記［１］または［２］に記載のサルモネラの識別方法。
［４］質量分析がＭＡＬＤＩ－ＭＳである上記［３］に記載のサルモネラの識別方法。
［４］質量分析がＭＡＬＤＩ－ＭＳである上記［３］に記載のサルモネラの識別方法。
【0081】
上記［３］および［４］の発明によれば、ごく微量の試料を用いて短時間で分析結果を得ることができ、且つ多検体の連続分析も容易である。
【0082】
［５］下記タンパク質のｍ／ｚ値とサルモネラの種、亜種および血清型の少なくとも一つからなるデータベース。
Ｓ２２、ＹｃａＲ、Ｌ３５、ＢｃｓＲ、ＳｓａＧ、
Ｎｕｃｌｅｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＹｉｂＪ、ＯａｄＧ、
ＣｈａＢ、ＺａｐＢ、ＨＵ－１、ＹｅｉＳ、ＨＵ－２、ＩｒａＰ、Ｓ１５、
ｒｐｏＺ、ＩＨＦｂ、ＩＨＦａ、ＹｇａＭ、ＲａｉＡ、ＹｉｆＥ、
ＹｅｅＸ、Ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ、ＲＮａｓｅＰ、ＣｈｅＹ、Ｓ５
［６］さらに下記タンパク質のｍ／ｚ値を含む上記［５］に記載のデータベース。
Ｇｎｓ、ＹａｉＡ、ＹｉｂＴ、ＰＰＩａｓｅ、Ｌ２５、Ｌ２１、Ｓ８、Ｌ１７、
Ｌ１５、Ｓ７、ＹｃｉＦ、ＳｏｄＡ
［７］サルモネラの種、亜種および血清型を含む上記［５］または［６］に記載のデータベース。
Ｓ２２、ＹｃａＲ、Ｌ３５、ＢｃｓＲ、ＳｓａＧ、
Ｎｕｃｌｅｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＹｉｂＪ、ＯａｄＧ、
ＣｈａＢ、ＺａｐＢ、ＨＵ－１、ＹｅｉＳ、ＨＵ－２、ＩｒａＰ、Ｓ１５、
ｒｐｏＺ、ＩＨＦｂ、ＩＨＦａ、ＹｇａＭ、ＲａｉＡ、ＹｉｆＥ、
ＹｅｅＸ、Ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ、ＲＮａｓｅＰ、ＣｈｅＹ、Ｓ５
［６］さらに下記タンパク質のｍ／ｚ値を含む上記［５］に記載のデータベース。
Ｇｎｓ、ＹａｉＡ、ＹｉｂＴ、ＰＰＩａｓｅ、Ｌ２５、Ｌ２１、Ｓ８、Ｌ１７、
Ｌ１５、Ｓ７、ＹｃｉＦ、ＳｏｄＡ
［７］サルモネラの種、亜種および血清型を含む上記［５］または［６］に記載のデータベース。
【0083】
上記［５］、［６］および［７］の発明によれば、識別対象サルモネラの質量分析の結果から直ちにその種、亜種、血清型を識別することができる。
【図1】
【図2】