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特許7533918ホスホリパーゼＤ、及びエタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-05
(45)【発行日】2024-08-14
(54)【発明の名称】ホスホリパーゼＤ、及びエタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/16 20060101AFI20240806BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20240806BHJP
C12Q 1/34 20060101ALI20240806BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240806BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240806BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240806BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240806BHJP
C12R 1/465 20060101ALN20240806BHJP
【ＦＩ】
C12N9/16 Z ZNA
C12N15/55
C12Q1/34
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12R1:465
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2020036298
(22)【出願日】2020-03-03
(65)【公開番号】P2021136896
(43)【公開日】2021-09-16
【審査請求日】2023-01-05
(73)【特許権者】
【識別番号】599035339
【氏名又は名称】株式会社 レオロジー機能食品研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100120086
【弁理士】
【氏名又は名称】▲高▼津 一也
(72)【発明者】
【氏名】杉森 大助
(72)【発明者】
【氏名】川村 柚葉
(72)【発明者】
【氏名】野澤 俊貴
(72)【発明者】
【氏名】藤野 武彦
(72)【発明者】
【氏名】馬渡 志郎
(72)【発明者】
【氏名】山下 豊春
【審査官】植原 克典
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－２１０１７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】Protein J.，2010年11月，Vol.29, No.8，pp.598-608
【文献】Database UniProtKB/TrEMBL [online]， Accession No.A0A3N4ZE18，２０２３年１１月１７日検索，2019年12月11日，<https://rest.uniprot.org/unisave/A0A3N4ZE18?format=txt&versions=4>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（１－１）～（１－３）のいずれか記載のポリペプチドを含む、エタノールアミン型プラズマローゲンを基質とするホスホリパーゼＤ。（１－１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（１－２）配列番号１における２７番目～５２８番目に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有し、かつエタノールアミン型プラズマローゲンを基質とした場合のリン酸エステル結合への加水分解活性を１００とした場合に、エタノールアミン型リゾプラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が５以下、ホスファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下、及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下であるポリペプチド；
（１－３）配列番号１における２７番目～５２８番目に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであって、エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有し、かつエタノールアミン型プラズマローゲンを基質とした場合のリン酸エステル結合への加水分解活性を１００とした場合に、エタノールアミン型リゾプラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が５以下、ホスファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下、及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下であるポリペプチド；
【請求項2】
エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するホスホリパーゼＤであって、ストレプトマイセス ポリクロモゲネス（Streptomyces polychromogenes）、ストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）、又はストレプトマイセス ポリクロモゲネス（Streptomyces polychromogenes）の基準株（ＮＢＲＣ１３０７２）若しくはストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）の基準株（ＮＢＲＣ１２９０６）の１６ＳｒＤＮＡ部分配列と９９．８％以上の相同性を示すストレプトマイセスに属する微生物由来であり、以下の（２－１）～（２－４）の性質を有するホスホリパーゼＤ。
（２－１）エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有し、かつエタノールアミン型プラズマローゲンを基質とした場合のリン酸エステル結合への加水分解活性を１００とした場合に、エタノールアミン型リゾプラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が５以下、ホスファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下、及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下である；
（２－２）分子量 ５０，０００～６０，０００である；
（２－３）至適温度 ｐＨ７．０、３０分間反応の条件下で、４０～６０℃である；
（２－４）至適ｐＨ ３７℃、３０分間反応の条件下でｐＨ５．５～７．５である；
【請求項3】
試料と請求項１又は２に記載のホスホリパーゼＤとを作用させる工程を含むことを特徴とする、前記試料中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法。
【請求項4】
請求項１記載のホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項5】
請求項４記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項6】
請求項５記載の形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はホスホリパーゼＤや、エタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法や、発現ベクターや、前記発現ベクターが導入された形質転換体や、前記形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
プラズマローゲンは抗酸化作用、イオン輸送、コレステロール排出等の機能を持ったリン脂質の一種である。かかるプラズマローゲンは哺乳動物の全ての組織に存在し、人体のリン脂質の約１８％を占めているといわれており、特に脳神経細胞、心筋、リンパ球、マクロファージ等に多く含まれている。
【0003】
近年、プラズマローゲンがアルツハイマー型認知症や軽度認知障害（ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ：ＭＣＩ）の患者の脳において有意に減少していることや（非特許文献１、２参照）、アルツハイマー型認知症患者の血液中のプラズマローゲン濃度が低下していること（非特許文献３、４参照）が開示され、アルツハイマー型認知症とプラズマローゲンとの関係が注目されている。
【0004】
こうした中、プラズマローゲンの測定に関する研究も進んできた。たとえば、（Ａ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定する工程、及び（Ｂ）（ｉ）被験血液サンプルに含有される赤血球に含まれるプラズマローゲン量と、（ｉｉ）被験血液サンプルを採取した哺乳動物と同一種の健常哺乳動物由来の赤血球に含まれるプラズマローゲン量とを、比較する工程を含む、被験血液サンプルが認知症哺乳動物由来であるかを判定するための検査方法（特許文献１参照）が提案されている。
【0005】
また、エタノールアミン型プラズマローゲンを検出・定量する方法としては、サンプル中のエタノールアミン型プラズマローゲンをホスホリパーゼＡ１で加水分解処理してエタノールアミン型リゾプラズマローゲンを生成し、その後、ホスホリパーゼＤで処理する工程を含むプラズマローゲンの検出・定量方法（特許文献２－４、非特許文献５参照）も提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】国際公開第２０１２／０９０６２５号パンフレット
【文献】特開２０１６－１１１９２９号公報
【文献】特開２０１６－４５１１２号公報
【文献】国際公開第２０１４／０１３５３８号パンフレット
【非特許文献】
【0007】
【文献】Guan Ｚ, et al., J Neuropathol Exp Neurol; 58(7):740-747 (1999)
【文献】Fujino et al., J Alzheimers Dis Parkinsonism; 8(1) DOI: 10.4172/2161-0460.1000419
【文献】Goodenowe DB et al., J Lipid Res Nov;48(11): 2485-2498 (2007)
【文献】Oma et al., Dement Geriatr Cogn Disord Extra;2:298-303(2012)
【文献】Sakasegawa SI et al., Biotechnol Lett;38(1):109-16(2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
従来のプラズマローゲンの測定方法では、高速液体クロマトグラフィーを用いるなど、測定のための設備が大型かつ高額であった。また、アルツハイマー型認知症の指標としては、エタノールアミン型プラズマローゲンが用いられる。このエタノールアミン型プラズマローゲンの測定には、まずホスホリパーゼＡ１で加水分解する方法が行われていたが、反応が二段階で複雑・煩雑であると共に高コストとなるという問題や、大腸菌を用いた組換え体によるホスホリパーゼＡ１の生産が難しいという問題があった。また、これまで知られているホスホリパーゼは基質特異性、特にエタノールアミン型プラズマローゲンに対する基質特異性が低く、アルツハイマー型認知症のバイオマーカーとなるプラズマローゲン以外のリン脂質も加水分解するという問題があった。そこで本発明の課題は、エタノールアミン型プラズマローゲンに対して基質特異性が高いホスホリパーゼＤを提供すること、及び、かかるホスホリパーゼＤを用いたエタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ストレプトマイセス ポリクロモゲネス（Streptomyces polychromogenes）又はストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）に近縁のストレプトマイセス属ＡＫ４６１株由来のホスホリパーゼＤがエタノールアミン型プラズマローゲンに対して基質特異性が高いことを見いだした。さらに、かかるホスホリパーゼＤを用いれば、エタノールアミン型プラズマローゲンを検出若しくは定量でき、さらに選択的に定量でき得ることを見いだし、本発明を完成した。
【0010】
すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
〔１〕以下の（１－１）～（１－３）のいずれか記載のポリペプチドを含む、ホスホリパーゼＤ。
（１－１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（１－２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつエタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド；
（１－３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであって、エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド；
〔２〕エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するホスホリパーゼＤであって、以下の（２－１）～（２－５）の性質を有するホスホリパーゼＤ。
（２－１）エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有する；
（２－２）分子量 ５０，０００～６０，０００である；
（２－３）至適温度 ｐＨ７．０、３０分間反応の条件下で、４０～６０℃である；
（２－４）至適ｐＨ ３７℃、３０分間反応の条件下でｐＨ５．５～７．５である；
（２－５）ストレプトマイセス属に属する微生物由来である；
〔３〕ストレプトマイセス ポリクロモゲネス（Streptomyces polychromogenes）又はストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）に近縁の微生物由来であることを特徴とする、上記〔２〕記載のホスホリパーゼＤ。
〔４〕エタノールアミン型プラズマローゲンを基質とした場合のリン酸エステル結合への加水分解活性を１００とした場合に、エタノールアミン型リゾプラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が５以下、ホスファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下、及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下であることを特徴とする上記〔２〕又は〔３〕記載のホスホリパーゼＤ。
〔５〕試料と上記〔１〕～〔４〕のいずれか記載のホスホリパーゼＤとを作用させる工程を含むことを特徴とする、前記試料中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法。
〔６〕上記〔１〕記載のホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
〔７〕上記〔６〕記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
〔８〕上記〔７〕記載の形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法。
〔１〕以下の（１－１）～（１－３）のいずれか記載のポリペプチドを含む、ホスホリパーゼＤ。
（１－１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（１－２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつエタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド；
（１－３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであって、エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド；
〔２〕エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するホスホリパーゼＤであって、以下の（２－１）～（２－５）の性質を有するホスホリパーゼＤ。
（２－１）エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有する；
（２－２）分子量 ５０，０００～６０，０００である；
（２－３）至適温度 ｐＨ７．０、３０分間反応の条件下で、４０～６０℃である；
（２－４）至適ｐＨ ３７℃、３０分間反応の条件下でｐＨ５．５～７．５である；
（２－５）ストレプトマイセス属に属する微生物由来である；
〔３〕ストレプトマイセス ポリクロモゲネス（Streptomyces polychromogenes）又はストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）に近縁の微生物由来であることを特徴とする、上記〔２〕記載のホスホリパーゼＤ。
〔４〕エタノールアミン型プラズマローゲンを基質とした場合のリン酸エステル結合への加水分解活性を１００とした場合に、エタノールアミン型リゾプラズマローゲンを基質とした場合の相対活性値が５以下、ホスファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下、及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下であることを特徴とする上記〔２〕又は〔３〕記載のホスホリパーゼＤ。
〔５〕試料と上記〔１〕～〔４〕のいずれか記載のホスホリパーゼＤとを作用させる工程を含むことを特徴とする、前記試料中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法。
〔６〕上記〔１〕記載のホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
〔７〕上記〔６〕記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
〔８〕上記〔７〕記載の形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明のホスホリパーゼＤによりエタノールアミン型プラズマローゲンを加水分解することが可能となる。したがって、本発明のホスホリパーゼＤにより、エタノールアミン型プラズマローゲンを容易かつ迅速に検出若しくは定量することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】実施例２で作成したＡＫ４６１株の１６ＳリボソームＤＮＡ遺伝子約１５００塩基対に基づく分子系統樹である。
【図2】実施例３において、精製した本発明のホスホリパーゼＤ（以下「ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ」ともいう）（ＤＥＡＥ画分）をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析した結果である。
【図3】実施例５において、精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ（ＤＥＡＥ画分）を用いてホスホリパーゼＤ活性を測定した結果を示す図である。ＰｌｓＥｔｎ ２２：６を基質とした場合のホスホリパーゼＤ活性を１００とした場合の相対活性で示してある。
【図4】実施例５において、精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの至適温度を調べた結果である。
【図5】実施例５において、精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの至適ｐＨを調べた結果である。
【図6】実施例８において、ホタテから分取したエタノールアミン型プラズマローゲンの検出結果を示す図である。
【図7】比較例において、大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の検出結果を示す図である。
【図8】実施例９において、血漿中のエタノールアミン型プラズマローゲンの検出結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
［ホスホリパーゼＤ］
本発明のホスホリパーゼＤ－（１）は、
（１－１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（１－２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつエタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド；
（１－３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであって、エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド；
の（１－１）～（１－３）のいずれか記載のポリペプチドを含むホスホリパーゼＤであり、以下、「本件ホスホリパーゼＤ－（１）」ともいう。なお、後述のように配列番号１におけるＮ末端側２６アミノ酸、つまり配列番号１における１～２６番目のアミノ酸はＳｅｃ分泌シグナルであると考えられる。そのため、配列番号１における１～２６番目のアミノ酸等のＳｅｃ分泌シグナルと考えられるアミノ酸を除いた配列、たとえば配列番号１における２７番目～５２８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドや、配列番号１における２７番目～５２８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＮ末端側に他の分泌シグナル配列を結合したポリペプチドをホスホリパーゼＤとしてもよい。
本発明のホスホリパーゼＤ－（１）は、
（１－１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（１－２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつエタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド；
（１－３）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであって、エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド；
の（１－１）～（１－３）のいずれか記載のポリペプチドを含むホスホリパーゼＤであり、以下、「本件ホスホリパーゼＤ－（１）」ともいう。なお、後述のように配列番号１におけるＮ末端側２６アミノ酸、つまり配列番号１における１～２６番目のアミノ酸はＳｅｃ分泌シグナルであると考えられる。そのため、配列番号１における１～２６番目のアミノ酸等のＳｅｃ分泌シグナルと考えられるアミノ酸を除いた配列、たとえば配列番号１における２７番目～５２８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドや、配列番号１における２７番目～５２８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＮ末端側に他の分泌シグナル配列を結合したポリペプチドをホスホリパーゼＤとしてもよい。
【0014】
また、本発明のホスホリパーゼＤ－（２）は、
（２－１）エタノールアミン型プラズマローゲンにおけるリン酸エステルの加水分解作用を有する；
（２－２）分子量 ５０，０００～６０，０００である；
（２－３）至適温度 ｐＨ７．０、３０分間反応の条件下で、４０～６０℃である；
（２－４）至適ｐＨ ３７℃、３０分間反応の条件下で５．５～７．５である；
（２－５）ストレプトマイセス属に属する微生物由来である；
の（２－１）～（２－５）の性質を有し、エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するホスホリパーゼＤであり、以下、「本件ホスホリパーゼＤ－（２）」ともいう。また、上記本件ホスホリパーゼＤ－（１）及び本件ホスホリパーゼＤ－（２）を総称して、以下、「本件ホスホリパーゼＤ」又は「本件ＰＬＤ」ともいう。
（２－１）エタノールアミン型プラズマローゲンにおけるリン酸エステルの加水分解作用を有する；
（２－２）分子量 ５０，０００～６０，０００である；
（２－３）至適温度 ｐＨ７．０、３０分間反応の条件下で、４０～６０℃である；
（２－４）至適ｐＨ ３７℃、３０分間反応の条件下で５．５～７．５である；
（２－５）ストレプトマイセス属に属する微生物由来である；
の（２－１）～（２－５）の性質を有し、エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するホスホリパーゼＤであり、以下、「本件ホスホリパーゼＤ－（２）」ともいう。また、上記本件ホスホリパーゼＤ－（１）及び本件ホスホリパーゼＤ－（２）を総称して、以下、「本件ホスホリパーゼＤ」又は「本件ＰＬＤ」ともいう。
【0015】
本明細書におけるエタノールアミン型プラズマローゲン（以下、「ＰｌｓＥｔｎ」ともいう）は、グリセロリン脂質のサブクラスの一つで、グリセロリン脂質のＣ１（ｓｎ－１）位にアルケニル（ビニル）エーテル結合した炭化水素鎖、Ｃ２（ｓｎ－２）位に脂肪酸エステル結合を持つアルケニルエーテル型グリセロリン脂質であって、塩基がエタノールアミンであるものであればよく、以下の式（I）にその構造を示す。
【0016】
【化1】
【0017】
式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、脂肪族炭化水素基である。Ｒ１は、通常、炭素数１～２０の脂肪族炭化水素基で、例えば、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、イコサニル基等が挙げられる。Ｒ２は、通常、脂肪酸残基由来の脂肪族炭化水素基で、例えば、オクタデカジエノイル基、オクタデカトリエノイル基、イコサレトラエノイル基２０:４、イコサペンタエノイル基、ドコサテトラエノイル基、ドコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基２２:６などが挙げられる。
【0018】
本件ホスホリパーゼＤは、エタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用、具体的には以下の式（II）に示すようにエタノールアミン型プラズマローゲン分子内のｓｎ－３位リン酸エステルを加水分解してプラズメニルホスファチジン酸とエタノールアミンを遊離させる作用を有する酵素である。
【0019】
【化2】
【0020】
エタノールアミン型プラズマローゲンにおいてリン酸エステルへの加水分解作用を有するか否かは、たとえばエタノールアミン型プラズマローゲンにホスホリパーゼＤを作用させて、加水分解により遊離されるエタノールアミンを定量することによって行うことができる。エタノールアミンの定量は、例えば、エタノールアミンにエタノールアミンオキシダーゼ（ＥＡＯ：特開２０１４－２３３２１９号公報）を作用させて発生した過酸化水素を定量する方法によって行うことができる。
【0021】
上記エタノールアミンオキシダーゼは、エタノールアミンを過酸化水素とアンモニアとグリコールアルデヒドに酸化する作用を触媒する酵素であればよく、モノエタノールアミンオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．８）、モノアミンオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．４）、及び一級アミンオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．２１）等を用いることができる。
【0022】
上記過酸化水素を定量する方法としては、分光光度法、過酸化水素電極を用いる方法等を挙げることができる。具体的には、例えばペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用により４－Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（４－ＡＡ）とＮ，Ｎ－ビス(４－ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ)－３－ｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ， ｄｉｓｏｄｉｕｍ （ＴＯＤＢ）とを定量的に酸化縮合させて生成した青紫色の色素であるキノン色素に基づく吸光度（５５０ｎｍ）を測定する方法を挙げることができる。なお、キノン色素量は遊離したエタノールアミン量と１：１の関係となるため、キノン色素の量を測定することでエタノールアミン量を測定することとなる。なお、本明細書中、１分間に１μmolのエタノールアミンを遊離する酵素量を１Ｕと定義した。
【0023】
上記本件ホスホリパーゼＤ－（１）の（１－２）のポリペプチドにおける「配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、かつエタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチド」としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％以上、９３％以上、９５％以上、又は９８％以上の同一性を有し、かつエタノールアミン型プラズマローゲン分子内のリン酸エステル結合への加水分解作用を有するポリペプチドを挙げることができる。
【0024】
上記本件ホスホリパーゼＤ－（１）の（１－３）のポリペプチドにおける「１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチド」とは、例えば１～１０個、１～５個、１～３個、１～２個、又は１個の任意の数のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドを挙げることができる。なお、上記「１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチド」は、配列番号１における１９２番目及び４６２番目のＨ、１９４番目及び４６４番目のＫ、１９９番目及び４６９番目のＤ以外、好ましくは１９２番目～１９９番目のＨＳＫＬＶＶＶＤ、及び４６２番目～４６９番目のＨＨＫＬＶＳＶＤのＨｘＫｘｘｘｘＤモチーフ（Ｈはヒスチジン、Ｋはリジン、Ｄはアスパラギン酸、Ｓはセリン、Ｌはロイシン、Ｖはバリン、ｘは任意のアミノ酸：ＨＳＫモチーフ）以外における１又は数個のアミノ酸が付加、置換、欠失及び／又は挿入されたポリペプチドであることが好ましい。なお、上記ＨＳＫモチーフは、ホスホリパーゼＤにおいて触媒反応に寄与するアミノ酸配列である。
【0025】
上記本件ホスホリパーゼＤ－（１）の（１－２）のポリペプチド又は（１－３）のポリペプチドとしては、エタノールアミン型プラズマローゲンを基質とした場合のリン酸エステルへの加水分解活性を１００とした場合に、エタノールアミン型リゾプラズマローゲン（ＬｙＰｌｓＥｔｎ）を基質とした場合の相対活性値が５以下、好ましくは３以下、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を基質とした場合の相対活性値が５以下、好ましくは３以下、及び／又はリゾホスファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下、好ましくは３以下であるポリペプチドを好適に挙げることができる。
【0026】
上記本件ホスホリパーゼＤ－（２）は、電気泳動条件等により若干変化し得るが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける分子量が５０，０００～６０，０００（Ｄａ）、好ましくは５２，０００～５４，０００（Ｄａ）を挙げることができる。また、等電点(Genetyxによる計算値)としては６～６．５を挙げることができる。本等電点は実測値とは異なる可能性がある。
【0027】
上記本件ホスホリパーゼＤ－（２）は、ｐＨ７．０、３０分間反応の条件下において、至適温度が４０～６０℃、好ましくは４５℃～５５℃を挙げることができる。
【0028】
上記本件ホスホリパーゼＤ－（２）は、３７℃、３０分間反応の条件下において、至適ｐＨが５．５～７．５、好ましくは６．０～７．０を挙げることができる。
【0029】
上記本件ホスホリパーゼＤ－（２）は、ストレプトマイセス属に属する微生物由来であり、ストレプトマイセス属に属する微生物としては、ストレプトマイセス ポリクロモゲネス（Streptomyces polychromogenes）若しくはストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）、又はこれらに近縁の微生物のほか、ストレプトマイセス カトラエ（Streptomyces katrae）、ストレプトマイセス フラボトリチニ（Streptomyces flavotricini）、ストレプトマイセス トキシトリチニ（Streptomyces toxytricini）、ストレプトマイセス ヤングプエンシス（Streptomyces yangpuensis）、ストレプトマイセス アムリトサレンシス（Streptomyces amritsarensis）、ストレプトマイセス シンナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）、ストレプトマイセス バージニアエ（Streptomyces virginiae）、ストレプトマイセス シラツス（Streptomyces cirratus）、ストレプトマイセス ノジリエンシス（Streptomyces nojiriensis）、ストレプトマイセス コロンビエンシス（Streptomyces colombiensis）、ストレプトマイセス ナシュビレンシス（Streptomyces nashvillensis）、ストレプトマイセス セロスタティカス（Streptomyces cellostaticus）、ストレプトマイセス ベトナメンシス（Streptomyces vietnamensis）を挙げることができる。なお、近縁の微生物か否かは、例えば近隣結合法等により系統樹を推定し、分子系統解析を行うことによって判断することができる。
【0030】
さらに、上記本件ホスホリパーゼＤ－（２）は、エタノールアミン型プラズマローゲンを基質とした場合のリン酸エステルへの加水分解活性を１００とした場合に、エタノールアミン型リゾプラズマローゲン（ＬｙＰｌｓＥｔｎ）を基質とした場合の相対活性値が５以下、好ましくは３以下、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を基質とした場合の相対活性値が５以下、好ましくは３以下、及び／又はリゾホファチジルエタノールアミンを基質とした場合の相対活性値が５以下、好ましくは３以下であるホスホリパーゼＤを好適に挙げることができる。
【0031】
上記本件ホスホリパーゼＤ－（２）をストレプトマイセス属に属する微生物から調製する場合には、ストレプトマイセス属に属する微生物を培養し、培養上清を回収した後、公知の酵素精製方法、例えば、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、及び／又はアフィニティークロマトグラフィーを適宜組み合わせて行うことにより精製して調製することができる。
【0032】
［エタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法］
本発明の試料中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法は、試料と上記ホスホリパーゼＤとを作用させる工程を含む、試料中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法（以下、「本ＰｌｓＥｔｎの定量方法」ともいう）であればよく、本ホスホリパーゼＤの基質特異性からエタノールアミン型プラズマローゲンを精度よく定量することが可能となる。具体的には以下の工程（Ａ）～（Ｄ）を行う方法を挙げることができる。
１）試料を、本件ホスホリパーゼＤを用いて加水分解処理する工程（Ａ）；
２）前記工程（Ａ）で得られた処理液を、エタノールアミンオキシダーゼで処理する工程（Ｂ）；
３）前記工程（Ｂ）で得られた処理液を、ペルオキシダーゼ及び発色剤若しくは蛍光試薬で処理をする工程（Ｃ）；
４）前記工程（Ｃ）で得られた処理液を、分光光度計又は蛍光光度計による測定に付する工程（Ｄ）；
本発明の試料中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法は、試料と上記ホスホリパーゼＤとを作用させる工程を含む、試料中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法（以下、「本ＰｌｓＥｔｎの定量方法」ともいう）であればよく、本ホスホリパーゼＤの基質特異性からエタノールアミン型プラズマローゲンを精度よく定量することが可能となる。具体的には以下の工程（Ａ）～（Ｄ）を行う方法を挙げることができる。
１）試料を、本件ホスホリパーゼＤを用いて加水分解処理する工程（Ａ）；
２）前記工程（Ａ）で得られた処理液を、エタノールアミンオキシダーゼで処理する工程（Ｂ）；
３）前記工程（Ｂ）で得られた処理液を、ペルオキシダーゼ及び発色剤若しくは蛍光試薬で処理をする工程（Ｃ）；
４）前記工程（Ｃ）で得られた処理液を、分光光度計又は蛍光光度計による測定に付する工程（Ｄ）；
【0033】
上記試料としては、被験体から採取された血漿、血清、血液、唾液、髄液、尿、リンパ液、汗等の体液を挙げることができる。血清及び血漿は、被験体から通常の採血方法（例えば、シリンジ採血又は真空採血）で得られる血液を、遠心（例えば、１０００×ｇ，５分間）して、上清を回収する等の公知の方法により処理することによって得ることができる。採血をする際には、ＥＤＴＡ、フッ化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、モノヨード酢酸等の抗凝固剤や解糖阻止剤を用いることもできる。
【0034】
上記被験体としては、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等の哺乳動物の他、鳥類、魚類、両生類、ホタテ等の海洋生物、なまこ等の軟体生物、乳酸菌やカビ・酵母に至る各種微生物を挙げることができる。
【0035】
上記発色剤としては、フェノール若しくはその誘導体又はアニリン誘導体と４－アミノアンチピリンとの組み合わせや、ロイコ色素や、ジフェニルアミン誘導体や、トリアリルイミダゾール誘導体等を挙げることができ、４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）及びＮ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－トルイジン（ＴＯＯＳ）やＮ，Ｎ－ビス（４－スルホブチル）－３－メチルアニリン（ＴＯＤＢ）等のトリンダー試薬との組み合わせを好適に挙げることができる。
【0036】
上記蛍光試薬としては、アンプレックスレッドを挙げることができる。
【0037】
発色剤を用いる場合におけるエタノールアミン型プラズマローゲンの定量の原理は以下の通りである。まず、前記工程（Ａ）でエタノールアミンが産生する。工程（Ａ）で得られた処理液に対して、エタノールアミンオキシダーゼで処理すると、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が産生する。さらに、ペルオキシダーゼで処理すると、産生した過酸化水素と蛍光試薬がペルオキシダーゼによってキノン色素に変化し、分光光度計でエタノールアミンの定量が可能となる。こうして、エタノールアミン型プラズマローゲンの定量が可能となる。
【0038】
上記工程(Ａ)～工程（Ｃ）は適切な緩衝液中で行うことができ、例えば工程（Ａ）は０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０、３７℃）、工程（Ｂ）は０．２Ｍビストリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、４５℃）を挙げることができる。また、上記工程(Ａ)ではエタノールアミン型プラズマローゲンの溶解性を高めるため、上記工程（Ｃ）では発色液の濁りを抑制するために界面活性剤の存在下で行ってもよい。かかる界面活性剤としては、好ましくは非イオン系界面活性剤、より好ましくはポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、さらに好ましくはトリトンＸ－１００を挙げることができる。また、界面活性剤の使用量については、例えば、０．００１～１０質量％を挙げることができる。
【0039】
なお、工程（Ａ）で得られた処理液に対して、エタノールアミンオキシダーゼで処理することによって産生した過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を、上記の他、電極法、吸光法、発光法、ＫＭｎＯ４を利用した酸化還元法等の公知の方法を用いて定量しても良い。
【0040】
エタノールアミン型プラズマローゲンの定量方法は、試料として既知濃度のエタノールアミン型プラズマローゲンを用いて上記工程（Ａ）～（Ｄ）により検量線を作成し、測定対象の試料を用いて上記工程（Ａ）～（Ｄ）により得られた測定値を比較してエタノールアミンプラズマローゲン量を算出することが可能となる。
【0041】
［発現ベクター］
本発明の発現ベクターは、本件ホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（以下、本件発現ベクターともいう）であればよく、本件ホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、配列番号２に記載の塩基配列のうち、１～７８番目の塩基（配列番号１における１～２６番目のアミノ酸に対応）は分泌シグナルをコードする塩基配列であると考えられることから、本発明のベクターを用いて形質転換し、本件ホスホリパーゼＤを細胞外に分泌させる場合には、上記１～７８番目等の分泌シグナルと予想される塩基の全部又は一部を削除して用いてもよく、また上記１～７８番目等の分泌シグナルと予想される塩基の全部又は一部を他の分泌シグナルをコードする塩基配列に置き換えて用いてもよい。
本発明の発現ベクターは、本件ホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（以下、本件発現ベクターともいう）であればよく、本件ホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、配列番号２に記載の塩基配列のうち、１～７８番目の塩基（配列番号１における１～２６番目のアミノ酸に対応）は分泌シグナルをコードする塩基配列であると考えられることから、本発明のベクターを用いて形質転換し、本件ホスホリパーゼＤを細胞外に分泌させる場合には、上記１～７８番目等の分泌シグナルと予想される塩基の全部又は一部を削除して用いてもよく、また上記１～７８番目等の分泌シグナルと予想される塩基の全部又は一部を他の分泌シグナルをコードする塩基配列に置き換えて用いてもよい。
【0042】
発現ベクターの種類としては環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。また、使用する宿主細胞に応じて適宜選択でき、プラスミドべクター、ウイルスベクター、ファージを挙げることができ、市販の発現ベクターを用いることができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＥＴ２４ａ、ｐＥＴ２２ｂ等のｐＥＴベクター、ｐＭＡＬ－ｐ５ｘ等のｐＭＡＬベクター、ｐＧＥＸベクター，ｐＣｏｌｄベクター、ｐＦＮ１８、ｐＰＡＬ７、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５等のｐＢＲベクター、ｐＡＣＹＣ１８４ベクター、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８等のｐＵＣベクター、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋ベクター等を挙げることができ、放線菌を宿主とする場合にはｐＵＣ７０２ベクター、ｐＩＪ６８０ベクター、ｐＩＪ７０２ベクター、ｐＴＯＮａ５ベクター、ｐＴＯＮａｓｈｏｒｔベクター、ｐＴｉｐベクター、ｐＮｉｔベクター等を挙げることができる。さらに、グラム陽性菌を宿主とする場合にはｐＢＩＣベクター、ｐＷＨ １５２０ベクター、ｐＭＭ１５２２ベクター、ｐＨＩＳ１５２２ベクター等を挙げることができる。酵母、特にサッカロマイセス・セレビジアエを宿主とする場合にはＹＲｐ７ベクター、ｐＹＣ１ベクター、ＹＥｐ１３ベクター等を挙げることができる。
【0043】
また、かかる発現ベクターには、プロモーターやターミネーター等の制御配列や、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子等の選択マーカー配列を含有していてもよい。さらに、宿主細胞外に分泌しやすくするために分泌シグナル配列を含有してもよい。分泌シグナルとしては、ＯｍｐＡシグナル（ペリプラズム移行シグナルとして機能）、ｐｅｌＢシグナル（ペリプラズム移行シグナルとして機能）、アフィニティー及び可溶性タグとしてはＭＢＰタグ（ペリプラズム移行シグナルとしても機能）、ＧＳＴタグ、ＴＦタグ、Ｈａｌｏタグ、Ｈｉｓタグ、ＳＫＩＫタグ（Kato et al., J. Biosci. Bioeng. 10.1016/j.jbiosc.2016.12.004 (2017)）、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅＸａｃｔ ｆｕｓｉｏｎタグ等を挙げることができる。
【0044】
上記ポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス属に属する微生物等の天然由来のポリヌクレオチドでも人工合成のポリヌクレオチドでもよく、本件発現ベクターを導入する微生物の種類に応じて適宜選択でき、配列情報は、公知の文献やＮＣＢＩ（www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索して適宜入手することができる。上記ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの塩基配列の情報に基づき、化学合成する方法や、ＰＣＲによって増幅する方法等の公知の技術によって作製することができる。なお、アミノ酸をコードするために選択されるコドンは、用いる宿主細胞の種類に応じて、発現を最適化してもよい。
【0045】
［形質転換体］
本発明の形質転換体は、上記本件発現ベクターを宿主に導入した形質転換体（以下、「本件形質転換体」ともいう）であればよく、宿主としては、用いる発現ベクターに応じて適宜選択でき、ＢＬ２１、ＳＨｕｆｆｌｅ等の大腸菌、ストレプトマイセス リビダンス（Streptomyces lividans）等のストレプトマイセス属に属する放線菌、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）Ｌ８８等の放線菌、バチラス・サチリス（Bacillus subtilis）、バチラス メガテリウム（Bacillus megaterium）、ブレビバチルス（Brevibacillus:Bacillus brevis）、コリネバクテリウム グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）等のグラム陽性菌，シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）等のグラム陰性菌、サッカロマイセス・セレビジアエ、ピキア・パストリス等の酵母、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）やアスペルギルス・ニガー（Aspergillus nigar）等のアスペルギルス(Aspergillus)属の糸状菌を挙げることができる。
本発明の形質転換体は、上記本件発現ベクターを宿主に導入した形質転換体（以下、「本件形質転換体」ともいう）であればよく、宿主としては、用いる発現ベクターに応じて適宜選択でき、ＢＬ２１、ＳＨｕｆｆｌｅ等の大腸菌、ストレプトマイセス リビダンス（Streptomyces lividans）等のストレプトマイセス属に属する放線菌、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）Ｌ８８等の放線菌、バチラス・サチリス（Bacillus subtilis）、バチラス メガテリウム（Bacillus megaterium）、ブレビバチルス（Brevibacillus:Bacillus brevis）、コリネバクテリウム グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）等のグラム陽性菌，シュードモナス プチダ（Pseudomonas putida）等のグラム陰性菌、サッカロマイセス・セレビジアエ、ピキア・パストリス等の酵母、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）やアスペルギルス・ニガー（Aspergillus nigar）等のアスペルギルス(Aspergillus)属の糸状菌を挙げることができる。
【0046】
本件発現ベクターを宿主に導入する方法としては、公知の方法を用いることができ、コンピテントセル法、リポフェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、リポソーム法等の化学的方法；ウイルスベクターを利用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法等の生物学的方法；エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、超音波遺伝子導入法等の物理的方法；等の公知の方法を例示することができる。
【0047】
［ホスホリパーゼＤの製造方法］
本発明のホスホリパーゼＤの製造方法は、上記本件形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法であればよく、かかる方法により、本件ホスホリパーゼＤを効率よく産生することができる。培養方法としては宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。例えば、宿主が大腸菌又は放線菌の場合は、温度条件が１０～４５℃、好ましくは２０～４２℃、より好ましくは２５～３７℃、ｐＨ条件がｐＨ５．５～８．５、好ましくはｐＨ６．２～７．５、培養時間が１０～８０時間、好ましくは１０～４８時間で、振とう培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下若しくは嫌気的条件下で培養することができる。本件ホスホリパーゼＤは培養液又は破砕した本件形質転換体から回収することができ、かかる回収する方法としては、公知のタンパク質の回収方法、例えば、遠心分離、次いで、ゲルろ過、イオン交換、アフィニティ等のクロマトグラフィーにより回収する方法を挙げることができる。
本発明のホスホリパーゼＤの製造方法は、上記本件形質転換体を培養してホスホリパーゼＤを産生する工程を含有する、ホスホリパーゼＤの製造方法であればよく、かかる方法により、本件ホスホリパーゼＤを効率よく産生することができる。培養方法としては宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。例えば、宿主が大腸菌又は放線菌の場合は、温度条件が１０～４５℃、好ましくは２０～４２℃、より好ましくは２５～３７℃、ｐＨ条件がｐＨ５．５～８．５、好ましくはｐＨ６．２～７．５、培養時間が１０～８０時間、好ましくは１０～４８時間で、振とう培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下若しくは嫌気的条件下で培養することができる。本件ホスホリパーゼＤは培養液又は破砕した本件形質転換体から回収することができ、かかる回収する方法としては、公知のタンパク質の回収方法、例えば、遠心分離、次いで、ゲルろ過、イオン交換、アフィニティ等のクロマトグラフィーにより回収する方法を挙げることができる。
【0048】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。
例示に限定されるものではない。
【実施例1】
【0049】
（エタノールアミン型プラズマローゲンに対して基質特異性が高いホスホリパーゼＤを産生する微生物の探索）
本発明者らは、エタノールアミン型プラズマローゲンに対して基質特異性が高いホスホリパーゼＤ（ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ）を産生する微生物としてこれまでの経験に基づいて放線菌に着目して以下の工程により探索を行った。
１）グリセロールストック（－８０℃保存）した放線菌株を寒天培地に白金耳で塗抹し、２８℃で培養した。
２）生育したコロニーを白金耳で取り、ＭＰＤ培地（１％（ｗ／ｖ）グルコース、０．７５％（ｗ／ｖ）モルトエキス、０．７５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．３％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：ｐＨ７．０）若しくはＩＳＰ２培地（１％（ｗ／ｖ）モルトエキス、０．４％（ｗ／ｖ）イーストエキス、０．４％（ｗ／ｖ）グルコース：ｐＨ７．２）５ｍＬに植菌した。その後、２８℃、１６０ｓｐｍ（strokes per minute）で７２時間振とう培養を行った。培養液１ｍＬをＭＰＤ培地に１００ｍＬに接種し、２８℃、１６０ｒｐｍで７２時間振とう培養を行った。
本発明者らは、エタノールアミン型プラズマローゲンに対して基質特異性が高いホスホリパーゼＤ（ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ）を産生する微生物としてこれまでの経験に基づいて放線菌に着目して以下の工程により探索を行った。
１）グリセロールストック（－８０℃保存）した放線菌株を寒天培地に白金耳で塗抹し、２８℃で培養した。
２）生育したコロニーを白金耳で取り、ＭＰＤ培地（１％（ｗ／ｖ）グルコース、０．７５％（ｗ／ｖ）モルトエキス、０．７５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．３％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：ｐＨ７．０）若しくはＩＳＰ２培地（１％（ｗ／ｖ）モルトエキス、０．４％（ｗ／ｖ）イーストエキス、０．４％（ｗ／ｖ）グルコース：ｐＨ７．２）５ｍＬに植菌した。その後、２８℃、１６０ｓｐｍ（strokes per minute）で７２時間振とう培養を行った。培養液１ｍＬをＭＰＤ培地に１００ｍＬに接種し、２８℃、１６０ｒｐｍで７２時間振とう培養を行った。
【0050】
次に、以下の方法でホスホリパーゼＤの加水分解作用（ホスホリパーゼＤ活性）を測定した。
１）培養液を遠心分離(２１，６００×ｇ、１０分、４℃)し、得られた上清を酵素サンプルとした。
２）以下の酵素反応液を３７℃で３０分保温した。基質としてはＰｌｓＥｔｎ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ：ＡＶＴ社）及びホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ（レオロジー機能食品研究所社）を用いた。
３）以下の呈色反応液を加え、４５℃で１０分保温した。
４）反応後、遠心分離(２１，６００×ｇ、５分、４℃)した。遠心上清２００μＬを９６穴マイクロウェルプレート(９６ＭＰ)に移し、マイクロプレートリーダー(Thermo Fisher社)を用いて、５５０ｎｍにおける吸光度（Ａ５５０）を測定した。
１）培養液を遠心分離(２１，６００×ｇ、１０分、４℃)し、得られた上清を酵素サンプルとした。
２）以下の酵素反応液を３７℃で３０分保温した。基質としてはＰｌｓＥｔｎ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ：ＡＶＴ社）及びホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ（レオロジー機能食品研究所社）を用いた。
３）以下の呈色反応液を加え、４５℃で１０分保温した。
４）反応後、遠心分離(２１，６００×ｇ、５分、４℃)した。遠心上清２００μＬを９６穴マイクロウェルプレート(９６ＭＰ)に移し、マイクロプレートリーダー(Thermo Fisher社)を用いて、５５０ｎｍにおける吸光度（Ａ５５０）を測定した。
【0051】
（酵素反応液）
０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０、３７℃） ２５μＬ
０．０１Ｍ ＣａＣｌ２ ５μＬ
１％基質／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ １０μＬ
酵素サンプル １０μＬ
０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０、３７℃） ２５μＬ
０．０１Ｍ ＣａＣｌ２ ５μＬ
１％基質／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ １０μＬ
酵素サンプル １０μＬ
【0052】
（呈色反応液）
０．２Ｍ ＢｉｓＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５、４５℃） １００μＬ
５０Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） ２０μＬ
０．２％（ｗ／ｖ）ＴＯＤＢ ２０μＬ
０．３％（ｗ／ｖ）４－ＡＡ ２０μＬ
２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ １０μＬ
０．０６Ｕ／ｍＬ エタノールアミンオキシダーゼ ２０μＬ
超純水（ＵＰＷ） １０μＬ
０．２Ｍ ＢｉｓＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５、４５℃） １００μＬ
５０Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） ２０μＬ
０．２％（ｗ／ｖ）ＴＯＤＢ ２０μＬ
０．３％（ｗ／ｖ）４－ＡＡ ２０μＬ
２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ １０μＬ
０．０６Ｕ／ｍＬ エタノールアミンオキシダーゼ ２０μＬ
超純水（ＵＰＷ） １０μＬ
【0053】
上記によりＰｌｓＥｔｎに対するホスホリパーゼＤ活性が確認された菌株のうち、活性が高い菌株を対象に基質特異性試験を行った。基質特異性試験では、ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ（レオロジー機能食品研究所社）、ＰｌｓＥｔｎ２２：６（ＡＶＴ社）、ＰｌｓＥｔｎ２０：４（ＡＶＴ社）、ＰｌｓＥｔｎ１８：１（ＡＶＴ社）、ＰＥ（1-Hexadecanoyl-2-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）（ＡＶＴ社）、ＬＰＥ（L-α-Lysophosphatidylethanolamine）（ＳＲＬ社）、ＬｙＰｌｓＥｔｎ（1-O-1'-(Z)-Octadecenyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）（ＡＶＴ社）の７種類の脂質へのホスホリパーゼＤ活性を測定した。ホスホリパーゼＤ活性の活性測定は上記と同様に行った。そのなかで、ＰｌｓＥｔｎに対して最も高いホスホリパーゼＤ活性を示す株としてＡＫ４６１株をＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ産生菌として選抜した。
【実施例2】
【0054】
（ＡＫ４６１株の分類学上の同定）
実施例１で選抜したＡＫ４６１株の分類学上の同定をした。まず、ＡＫ４６１株をＩＳＰ２培地（日本製薬社）で３０℃、７２時間培養した。培養後、アクロモペプチダーゼ（和光純薬工業社）を用いてＤＮＡを抽出した。かかる抽出したＤＮＡをＰＣＲ法の鋳型として用い、文献（中川恭好、川崎浩子 日本放線菌学会編 東京：日本学会事務センター ８８－１１７（２００１））に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行い、１６ＳｒＤＮＡを約１５００ｂｐ増幅した。
実施例１で選抜したＡＫ４６１株の分類学上の同定をした。まず、ＡＫ４６１株をＩＳＰ２培地（日本製薬社）で３０℃、７２時間培養した。培養後、アクロモペプチダーゼ（和光純薬工業社）を用いてＤＮＡを抽出した。かかる抽出したＤＮＡをＰＣＲ法の鋳型として用い、文献（中川恭好、川崎浩子 日本放線菌学会編 東京：日本学会事務センター ８８－１１７（２００１））に記載のプライマーを用いてＰＣＲを行い、１６ＳｒＤＮＡを約１５００ｂｐ増幅した。
【0055】
増幅した１６ＳｒＤＮＡの塩基配列をＣｈｒｏｍａｓＰｒｏ ２．１（Ｔｅｃｈｎｅｌｙｓｉｕｍ社）により決定した。増幅した前記１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を、ＢＬＡＳＴ相同検索を用い、国際塩基配列データベースＤＤＢＪ、ＥＮＡ（ＥＭＢＬ）、ＧｅｎＢａｎｋからから得た既知の微生物のｒＤＮＡ塩基配列と比較して、既知の微生物とのＤＮＡ相同性の一致の程度を比較した。近隣結合法として知られている文献（Saitou&Nei，1987；Mol．Biol．Evol．4406-425）に記載のＣｌｕｓｔａｌ Ｗ プログラムを用いて、系統樹を作成した。その系統樹を図１に示す。左上の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、株名の末尾のＴはその種の基準株(Ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ)をそれぞれ示す。
【0056】
ＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、ＡＫ４６１株の１６ＳｒＤＮＡ部分配列は、ストレプトマイセス ポリクロモゲネス（Streptomyces polychromogenes）の基準株（ＮＢＲＣ１３０７２）又はストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）の基準株（ＮＢＲＣ１２９０６）に対して相同率９９．８％の相同性を示した。
【0057】
さらに、簡易形態観察を行ったところ、しわ状のコロニーを示し、色調は表面・裏面共に淡黄色を呈した。また、微視的観察の結果からは、気菌糸及び連鎖胞子の形成が見られた。
【0058】
図１の系統樹及び簡易形態観察結果から、ＡＫ４６１株はストレプトマイセス（Streptomyces）に属し、もっとも近縁の微生物はストレプトマイセス ポリクロモゲネス（Streptomyces polychromogenes）又はストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）であることが確認された。
【実施例3】
【0059】
（ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの精製）
ＡＫ４６１株が生成するＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを、以下の方法で精製した。
（１）ＭＰＤプレート上のコロニー生育したＡＫ４６１株のコロニーを白金耳で取り、ＭＰＤ試験管培地５ｍＬに植菌した。２８℃、１６０ｓｐｍで２～３日間振とう培養を行った（前培養）。前培養液１ｍＬを、ＭＰＤフラスコ培地 １００ｍＬに植菌した。２８℃、１６０ｒｐｍで３～４日間振とう培養を行った(本培養)。なお、特に記載しない限り、以下のＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの精製の工程はすべて氷中又は４℃で行った。
（２）上記で得られたＡＫ４６１株の培養液を遠心分離機（１８，８００×ｇ、３０分）を用いて、この培養液から培養上清（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐ．）を回収した。
（３）回収した培養上清に１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を終濃度２０ｍＭになるように加えた後、氷上で６０％（ｗ／ｖ）飽和となるように粉末硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１８，８００×ｇ、３０分）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し粗酵素液(６０％ＡＳ)を得た。
（４）（３）で得られた粗酵素液に終濃度１Ｍになるよう粉末硫酸アンモニウムを氷中で加え、スタ－ラーで撹拌しながら、完全に溶解させて以下の条件でカラムクロマトグラフィーを行った。
ＡＫ４６１株が生成するＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを、以下の方法で精製した。
（１）ＭＰＤプレート上のコロニー生育したＡＫ４６１株のコロニーを白金耳で取り、ＭＰＤ試験管培地５ｍＬに植菌した。２８℃、１６０ｓｐｍで２～３日間振とう培養を行った（前培養）。前培養液１ｍＬを、ＭＰＤフラスコ培地 １００ｍＬに植菌した。２８℃、１６０ｒｐｍで３～４日間振とう培養を行った(本培養)。なお、特に記載しない限り、以下のＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの精製の工程はすべて氷中又は４℃で行った。
（２）上記で得られたＡＫ４６１株の培養液を遠心分離機（１８，８００×ｇ、３０分）を用いて、この培養液から培養上清（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐ．）を回収した。
（３）回収した培養上清に１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を終濃度２０ｍＭになるように加えた後、氷上で６０％（ｗ／ｖ）飽和となるように粉末硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１８，８００×ｇ、３０分）により回収した。この沈殿を２０ｍＭ トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し粗酵素液(６０％ＡＳ)を得た。
（４）（３）で得られた粗酵素液に終濃度１Ｍになるよう粉末硫酸アンモニウムを氷中で加え、スタ－ラーで撹拌しながら、完全に溶解させて以下の条件でカラムクロマトグラフィーを行った。
【0060】
（５）（４）で得られた粗酵素液を、１Ｍ 硫酸アンモニウム／２０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）－Ｐｈｅｎｙｌ－６５０Ｍカラム（東ソー社）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、２０ｍＭＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ５．５）に緩衝液を変更し、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより溶出させ、活性画分（Ｐｈｅｎｙｌ）を得た。
【0061】
（６）（５）で得られた活性画分（Ｐｈｅｎｙｌ）を、２０ｍＭ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ５．５）で予め平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ－ＭＸ－Ｔｒｐ－６５０Ｍカラム（東ソー社）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に緩衝液を変更し、塩化ナトリウム（０Ｍから０．５Ｍまで）のリニアグラジェントにより溶出させ、活性画分（Ｍｘ－Ｔｒｐ）を得た。
（７）（６）で得られた活性画分（ＭＸ－Ｔｒｐ）を、２０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ－６５０Ｍカラム（東ソー社）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから２Ｍまで）のリニアグラジェントにより溶出させ、活性画分（ＤＥＡＥ）を得た。
（７）（６）で得られた活性画分（ＭＸ－Ｔｒｐ）を、２０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ－６５０Ｍカラム（東ソー社）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから２Ｍまで）のリニアグラジェントにより溶出させ、活性画分（ＤＥＡＥ）を得た。
【0062】
各精製工程における収量、収率、ホスホリパーゼＤ活性等を表１に示す。ホスホリパーゼＤ活性は実施例１と同様の方法で測定した。上記工程により、精製度（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｌｄ）及び比活性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）が９２５倍向上した精製ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを得た。また、精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ（ＤＥＡＥ画分）をＳＤＳ-ＰＡＧＥ（１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により解析した結果を図２に示す。左レーン（Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ）は分子量マーカーであり、右レーンは、活性化区分（ＤＥＡＥ）のバンドを示す。その結果、約６６ｋＤａ、約５３ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約３２ｋＤａの４つのバンドが観察された。
【0063】
【表1】
【実施例4】
【0064】
（精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの内部アミノ酸配列の解析）
図２に示すＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける４つの矢印で示すバンドのゲルを切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化を行った。そして、得られたペプチドサンプルについて液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により内部アミノ酸配列の解析を行った。その結果、５３ｋＤａのバンドのＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる内部アミノ酸配列解析で表２に示す７つのペプチド配列がデータベース中のタンパク質のアミノ酸配列の一部と相同性があった。一方、６６ｋＤａ、４５ｋＤａ、３２ｋＤａのバンドはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析で相同性があるタンパク質が見出されなかった。
図２に示すＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける４つの矢印で示すバンドのゲルを切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化を行った。そして、得られたペプチドサンプルについて液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により内部アミノ酸配列の解析を行った。その結果、５３ｋＤａのバンドのＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる内部アミノ酸配列解析で表２に示す７つのペプチド配列がデータベース中のタンパク質のアミノ酸配列の一部と相同性があった。一方、６６ｋＤａ、４５ｋＤａ、３２ｋＤａのバンドはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析で相同性があるタンパク質が見出されなかった。
【0065】
【表2】
【0066】
５３ｋＤａのバンドのＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる内部アミノ酸配列解析でヒットした７つのペプチド配列をプロテオミクス支援システム "ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ サーバー（ＰＬＧＳ）"によって解析した。その結果、表３に示すようにＰＬＧＳ Ｓｃｏｒｅにおいてストレプトマイセス ラセモクロモゲネス（Streptomyces racemochromogenes）のホスホリパーゼＤ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ｅｎｔｒｙ Ｎｏ． Ｅ０Ｄ７Ｉ２：配列番号３）が６８８と最も高いことが明らかとなった。したがって、５３ｋＤａのバンドのタンパク質がＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの可能性が高いと考えられた。
【0067】
【表3】
【実施例5】
【0068】
（精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの性質）
精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの基質特異性、至適温度、至適ｐＨを調べた。
◆ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの基質特異性
上記で精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを用いて実施例１と同様の方法でホスホリパーゼＤ活性を測定し、基質特異性を調べた。基質としてはＰｌｓＥｔｎ２２：６、ＰｌｓＥｔｎ２０：４、ＰｌｓＥｔｎ１８：１、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、及びエタノールアミン型リゾプラズマローゲン（ＬｙＰｌｓＥｔｎ）を用いた。ＰｌｓＥｔｎ２２：６、ＰｌｓＥｔｎ２０：４、ＰｌｓＥｔｎ１８：１を式（III）～式(V）に示す。
精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの基質特異性、至適温度、至適ｐＨを調べた。
◆ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの基質特異性
上記で精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを用いて実施例１と同様の方法でホスホリパーゼＤ活性を測定し、基質特異性を調べた。基質としてはＰｌｓＥｔｎ２２：６、ＰｌｓＥｔｎ２０：４、ＰｌｓＥｔｎ１８：１、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、及びエタノールアミン型リゾプラズマローゲン（ＬｙＰｌｓＥｔｎ）を用いた。ＰｌｓＥｔｎ２２：６、ＰｌｓＥｔｎ２０：４、ＰｌｓＥｔｎ１８：１を式（III）～式(V）に示す。
【0069】
（１）PlsEtn22:6
1-(1Z-octadecenyl)-2-docosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
CAS Number:206059-98-5
1-(1Z-octadecenyl)-2-docosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
CAS Number:206059-98-5
【0070】
【化3】
【0071】
（２）PlsEtn20:4
1-(1Z-octadecenyl)-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
CAS Number:144371-69-7
1-(1Z-octadecenyl)-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
CAS Number:144371-69-7
【0072】
【化4】
【0073】
（３）PlsEtn18:1
1-(1Z-octadecenyl)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
CAS Number:144371-68-6
1-(1Z-octadecenyl)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
CAS Number:144371-68-6
【0074】
【化5】
【0075】
ＰｌｓＥｔｎ ２２：６を基質とした場合のホスホリパーゼＤ活性を１００とした場合の相対活性を図３に示す。図３から明らかなように、ＰｌｓＥｔｎ ２０：４を基質とした場合の相対活性は約１５、ＰｌｓＥｔｎ １８：１を基質とした場合の相対活性は約８であった。一方、基質としてホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、及びエタノールアミン型リゾプラズマローゲン（ＬｙＰｌｓＥｔｎ）を用いて実施例１と同様の方法でホスホリパーゼＤ活性を測定したところ、ホスホリパーゼＤ活性を１００とした場合の相対活性はいずれもほぼ０であった。このように、精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤは、エタノールアミン型プラズマローゲンに対する基質特異性が極めて高いことが明らかとなった。
【0076】
◆ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの至適温度
基質となる０．２％ ＰｌｓＥｔｎ ２２：６と、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０、各温度）５０ｍＭとの溶液に精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを１０あるいは２０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を３７℃にて３０分間反応させた。その後、加水分解作用を測定した。結果を図４に示す。図４中、横軸が温度、縦軸がΔＡ５５０（試料の５５０ｎｍの吸光度と盲検液の吸光度の差、以下同じ）である。図４から明らかなように、精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤは、３０℃～７０℃で加水分解作用を有し、特に４０℃～６０℃で加水分解作用が高いことが明らかとなった。
基質となる０．２％ ＰｌｓＥｔｎ ２２：６と、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０、各温度）５０ｍＭとの溶液に精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを１０あるいは２０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を３７℃にて３０分間反応させた。その後、加水分解作用を測定した。結果を図４に示す。図４中、横軸が温度、縦軸がΔＡ５５０（試料の５５０ｎｍの吸光度と盲検液の吸光度の差、以下同じ）である。図４から明らかなように、精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤは、３０℃～７０℃で加水分解作用を有し、特に４０℃～６０℃で加水分解作用が高いことが明らかとなった。
【0077】
◆ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの至適ｐＨ
基質となる０．２％ ＰｌｓＥｔｎ ２２：６と、酢酸－酢酸Ｎａ（グラフ中酢酸Ｎａ：ｐＨ４．５～６）、ＢｉｓＴｒｉｓ－ＨＣｌ（グラフ中Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ：ｐＨ６～７）、又は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（グラフ中Ｔｒｉｓ ＨＣｌ：ｐＨ７～９）から選ばれる緩衝液（ｐＨ４．５、５、６、６．５、７、７．５、８、又は９、温度３７℃）５０ｍＭとの溶液に、精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを１０あるいは２０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を各ｐＨ条件にて３０分間、酵素反応させた。その後の呈色反応は実施例１と同様の方法で行い、酵素活性を測定した。結果を図５に示す。図５中、横軸がｐＨ、縦軸がΔＡ５５０である。図５に基づき、精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤは、ｐＨ５～８．５、特にｐＨ６～７で処理しても加水分解作用を有していた。
基質となる０．２％ ＰｌｓＥｔｎ ２２：６と、酢酸－酢酸Ｎａ（グラフ中酢酸Ｎａ：ｐＨ４．５～６）、ＢｉｓＴｒｉｓ－ＨＣｌ（グラフ中Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ：ｐＨ６～７）、又は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（グラフ中Ｔｒｉｓ ＨＣｌ：ｐＨ７～９）から選ばれる緩衝液（ｐＨ４．５、５、６、６．５、７、７．５、８、又は９、温度３７℃）５０ｍＭとの溶液に、精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを１０あるいは２０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を各ｐＨ条件にて３０分間、酵素反応させた。その後の呈色反応は実施例１と同様の方法で行い、酵素活性を測定した。結果を図５に示す。図５中、横軸がｐＨ、縦軸がΔＡ５５０である。図５に基づき、精製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤは、ｐＨ５～８．５、特にｐＨ６～７で処理しても加水分解作用を有していた。
【実施例6】
【0078】
（ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤのクローニング）
ＡＫ４６１株由来ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤのクローニングを以下の方法により行った。
ＡＫ４６１株由来ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤのクローニングを以下の方法により行った。
【0079】
（ゲノムＤＮＡの調製）
ＡＫ４６１株を、実施例１と同様の方法でＭＰＤ培地を用いて２８℃で２日間培養し、集菌した。次いで、この菌体を、ＳＥＴ ｂｕｆｆｅｒ５ｍＬとリゾチーム１０ｍｇ(終濃度２ｍｇ／ｍＬ)を加えて転倒混和し、３７℃で２時間保温した。次に、これに１０％ＳＤＳ溶液（０．２Ｎ ＮａＯＨ）６７０μＬ（終濃度１％）、３ｍｇ／ｍＬのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ １ｍＬ（終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、ハイブリダイザ－でゆっくりと回しながら５５℃で２時間保温した。この溶液に５Ｍ Ｎａｃｌ ４ｍＬ及びクロロホルム１０ｍＬを加えて攪拌し、遠心分離後に上清を別チューブに回収し、上清体積の０．６倍量の２－プロパノールを加え、遠心分離(４，０００×ｇ、５分、４℃)した。沈殿したゲノムＤＮＡを回収し、１０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。これに、ＲＮａｓｅ Ａを終濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で２０分処理した後、０．８ＭのＮａＣｌを含む１３％ＰＥＧ溶液を５００μＬ加え攪拌し、遠心分離した。上清を除去し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）５００μＬに沈殿を溶解した後、フェノール／クロロホルム(１：１、ｖ／ｖ)混合液５００μＬを加えて攪拌し、遠心分離により、水相を分取した。この水相に体積の０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２倍量のエタノールを添加混合し、ＡＫ４６１株のゲノムＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノールに浸漬した後、１０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）からなる溶液に溶解してゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）溶液を調製した。
ＡＫ４６１株を、実施例１と同様の方法でＭＰＤ培地を用いて２８℃で２日間培養し、集菌した。次いで、この菌体を、ＳＥＴ ｂｕｆｆｅｒ５ｍＬとリゾチーム１０ｍｇ(終濃度２ｍｇ／ｍＬ)を加えて転倒混和し、３７℃で２時間保温した。次に、これに１０％ＳＤＳ溶液（０．２Ｎ ＮａＯＨ）６７０μＬ（終濃度１％）、３ｍｇ／ｍＬのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ １ｍＬ（終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、ハイブリダイザ－でゆっくりと回しながら５５℃で２時間保温した。この溶液に５Ｍ Ｎａｃｌ ４ｍＬ及びクロロホルム１０ｍＬを加えて攪拌し、遠心分離後に上清を別チューブに回収し、上清体積の０．６倍量の２－プロパノールを加え、遠心分離(４，０００×ｇ、５分、４℃)した。沈殿したゲノムＤＮＡを回収し、１０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。これに、ＲＮａｓｅ Ａを終濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加え、３７℃で２０分処理した後、０．８ＭのＮａＣｌを含む１３％ＰＥＧ溶液を５００μＬ加え攪拌し、遠心分離した。上清を除去し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）５００μＬに沈殿を溶解した後、フェノール／クロロホルム(１：１、ｖ／ｖ)混合液５００μＬを加えて攪拌し、遠心分離により、水相を分取した。この水相に体積の０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２倍量のエタノールを添加混合し、ＡＫ４６１株のゲノムＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノールに浸漬した後、１０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）からなる溶液に溶解してゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）溶液を調製した。
【0080】
（ＡＫ４６１株由来ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの部分塩基配列のクローニング）
１．ＰＣＲ増幅
上記で調製したＡＫ４６１株ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。その後ＰＣＲ増幅産物のサブクローニングとシークエンスを行い、ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ遺伝子の部分塩基配列を解析した。
１．ＰＣＲ増幅
上記で調製したＡＫ４６１株ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。その後ＰＣＲ増幅産物のサブクローニングとシークエンスを行い、ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ遺伝子の部分塩基配列を解析した。
【0081】
まず、実施例４で明らかになった内部アミノ酸配列に対応するコドンのうち、Streptomyces属においてコドン使用頻度が１０％以上であるコドンを選び、配列番号４に記載のフォワードプライマー(ＰｌｓＥｔｎ－ＦＷ１)及び配列番号５に記載のリバースプライマー（ＰｌｓＥｔｎ－ＲＶ１）を設計した。
【0082】
上記ＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。
【0083】
２×Ｇｆｌｅｘ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １２．５μＬ
１０μＭ ＰｌｓＥｔｎ－ＦＷ１ ０．７５μＬ
１０μＭ ＰｌｓＥｔｎ－ＲＶ１ ０．７５μＬ
３３．２７ｎｇ／μＬ ＡＫ４６１ ｇＤＮＡ ２μＬ
１．２５Ｕ／μＬ Ｇｆｌｅｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μＬ
超純水（ＵＰＷ） ８．５μＬ
１０μＭ ＰｌｓＥｔｎ－ＦＷ１ ０．７５μＬ
１０μＭ ＰｌｓＥｔｎ－ＲＶ１ ０．７５μＬ
３３．２７ｎｇ／μＬ ＡＫ４６１ ｇＤＮＡ ２μＬ
１．２５Ｕ／μＬ Ｇｆｌｅｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μＬ
超純水（ＵＰＷ） ８．５μＬ
【0084】
ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
ステップ１；９４℃、２分；
ステップ２；９８℃、１０秒；
ステップ３；６５℃、３０秒；
ステップ４；６８℃、２分；
ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返す；
ステップ５；６８℃、２分；
ステップ１；９４℃、２分；
ステップ２；９８℃、１０秒；
ステップ３；６５℃、３０秒；
ステップ４；６８℃、２分；
ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返す；
ステップ５；６８℃、２分；
【0085】
２．ＰＣＲ増幅産物のサブクローニング及びシークエンス
上記で得られた１４００ｂｐのＰＣＲ増幅産物をＤＮＡシークエンスするため、以下の方法によりＭｉｇｈｔｙ ＴＡ－ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＥＴ ｆｏｒ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）を用いて、ｐＭＤ２０－Ｔベクターにサブクローニングを行った。次に、大腸菌（ＨＳＴ０８）に形質転換して培養し、ブルー・ホワイトコロニーセレクションにより白色コロニーを選択し、コロニーＰＣＲにより目的サイズのバンドが確認できたコロニーを培養し、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドを配列番号６に記載のフォワードプライマー（Ｍ１３Ｒ－ｐＵＣ）及び配列番号７に記載のリバースプライマー（Ｍ１３Ｍ４）を用いてシークエンスを行った。
上記で得られた１４００ｂｐのＰＣＲ増幅産物をＤＮＡシークエンスするため、以下の方法によりＭｉｇｈｔｙ ＴＡ－ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＥＴ ｆｏｒ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）を用いて、ｐＭＤ２０－Ｔベクターにサブクローニングを行った。次に、大腸菌（ＨＳＴ０８）に形質転換して培養し、ブルー・ホワイトコロニーセレクションにより白色コロニーを選択し、コロニーＰＣＲにより目的サイズのバンドが確認できたコロニーを培養し、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドを配列番号６に記載のフォワードプライマー（Ｍ１３Ｒ－ｐＵＣ）及び配列番号７に記載のリバースプライマー（Ｍ１３Ｍ４）を用いてシークエンスを行った。
【0086】
（ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの未知領域の解析）
ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの未知領域を解析するために、制限酵素消化したＡＫ４６１株のゲノムＤＮＡを鋳型にＩｎｖｅｒｓ ＰＣＲを行い、クローニングとシークエンスを行った。
ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの未知領域を解析するために、制限酵素消化したＡＫ４６１株のゲノムＤＮＡを鋳型にＩｎｖｅｒｓ ＰＣＲを行い、クローニングとシークエンスを行った。
【0087】
まず、上記「２．ＰＣＲ増幅産物のサブクローニング及びシークエンス」で得られた部分塩基配列を参考に、Ｉｎｖｅｒｓ ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号８に記載のフォワードプライマー（ＰｌｓＥｔｎ－ＦＷ２）及び配列番号９に記載のリバースプライマー（ＰｌｓＥｔｎ－ＲＶ２）を設計した。次に、ＡＫ４６１株のゲノムＤＮＡを６種類の制限酵素(ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＮｄｅＩ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ)で消化した。その後、アガロース電気泳動で消化を確認し、フェノール・クロロフォルム抽出とエタノール沈殿を行い、制限酵素とＡＫ４６１株のゲノムＤＮＡを除去した。その後セルフライゲーション、フェノール・クロロフォルム抽出とエタノール沈殿を行い、Ｉｎｖｅｒｓ ＰＣＲの鋳型ＤＮＡを作製した。
【0088】
上記で得られたＩｎｖｅｒｓ ＰＣＲの鋳型ＤＮＡ、及びＩｎｖｅｒｓ ＰＣＲ用のプライマーを用いてＩｎｖｅｒｓ ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。
【0089】
２×Ｇｆｌｅｘ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １２．５μＬ
１０μＭ ＰｌｓＥｔｎ－ＦＷ２ ０．７５μＬ
１０μＭ ＰｌｓＥｔｎ－ＲＶ２ ０．７５μＬ
ライゲーション反応液 ２μＬ
１．２５Ｕ／μＬ Ｇｌｅｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μＬ
超純水（ＵＰＷ） ８．５μＬ
１０μＭ ＰｌｓＥｔｎ－ＦＷ２ ０．７５μＬ
１０μＭ ＰｌｓＥｔｎ－ＲＶ２ ０．７５μＬ
ライゲーション反応液 ２μＬ
１．２５Ｕ／μＬ Ｇｌｅｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μＬ
超純水（ＵＰＷ） ８．５μＬ
【0090】
ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
ステップ１；９４℃、２分；
ステップ２；９８℃、１０秒；
ステップ３；６５℃、３０秒；
ステップ４；６８℃、２分；
ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返す；
ステップ５；６８℃、２分；
ステップ１；９４℃、２分；
ステップ２；９８℃、１０秒；
ステップ３；６５℃、３０秒；
ステップ４；６８℃、２分；
ステップ２からステップ４を３０サイクル繰り返す；
ステップ５；６８℃、２分；
【0091】
その後、上記「ＡＫ４６１株由来ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの部分塩基配列のクローニング」と同様の方法でＰＣＲ増幅産物をクローニングし、シークエンスを行った。
【0092】
上記シークエンス解析により、ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤのアミノ酸配列は、配列番号１に記載された５２８アミノ酸からなる配列であり、Ｓｉｇｎａｌ Ｐプログラムによる予測によりＮ末端側２６アミノ酸はＳｅｃ分泌シグナルであると考えられる。また、ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤのアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号２に記載された塩基配列であることが確認された。なお、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣプログラムによる推定分子量は５２，９６３Ｄａ、推定の等電点は６．１６であった。この等電点は推定値であり、実測値とは異なる可能性がある。さらに、ＨＫＤモチーフを２カ所（配列番号１における１９２番目～１９９番目、４６２番目～４６９番目）有していた。
【実施例7】
【0093】
（大腸菌によるＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤの発現及び調製）
配列番号１０に記載のフォワードプライマー（ＰｌｓＥｔｎ－ＦＷ３）及び配列番号１１に記載のリバースプライマー（ＰｌｓＥｔｎ－ＲＶ３）を用いてＰＣＲを行い、配列番号２に記載の塩基配列からなるＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ遺伝子のＳｅｃシグナル配列と考えられる配列を除いた配列（配列番号１２に示す塩基配列）において、５’末端にＮｄｅＩサイトを、３’末端側にＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加するように増幅した。ＰＣＲ副産物をＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで消化し、発現ベクターであるｐＥＴ２４ａ（＋）のＮｄｅＩ－ＨｉｎｄIII部位に挿入して、組換えプラスミドを得た。次に、得られた組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、組換え大腸菌を得た。得られた組換え大腸菌を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１００ｍＬのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＴＢ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ社）で、３０℃又は３７℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を回収した。菌体は２０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁した後、超音波破砕し、遠心上清を生酵素とした（約０．０４Ｕ／ｍＬ）。
配列番号１０に記載のフォワードプライマー（ＰｌｓＥｔｎ－ＦＷ３）及び配列番号１１に記載のリバースプライマー（ＰｌｓＥｔｎ－ＲＶ３）を用いてＰＣＲを行い、配列番号２に記載の塩基配列からなるＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ遺伝子のＳｅｃシグナル配列と考えられる配列を除いた配列（配列番号１２に示す塩基配列）において、５’末端にＮｄｅＩサイトを、３’末端側にＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加するように増幅した。ＰＣＲ副産物をＮｄｅＩとＨｉｎｄIIIで消化し、発現ベクターであるｐＥＴ２４ａ（＋）のＮｄｅＩ－ＨｉｎｄIII部位に挿入して、組換えプラスミドを得た。次に、得られた組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、組換え大腸菌を得た。得られた組換え大腸菌を、３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１００ｍＬのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＴＢ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ社）で、３０℃又は３７℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を回収した。菌体は２０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁した後、超音波破砕し、遠心上清を生酵素とした（約０．０４Ｕ／ｍＬ）。
【0094】
次に、基質としてＰｌｓＥｔｎ、ＬｙＰｌｓＥｔｎ、ＰＯＰＥ、及びＬＰＥを用い、上記生酵素又は熱失活Ｃｔｒｌを１０μＬ加えてホスホリパーゼＤ活性を測定した。同時に、酵素なしのコントロール（酵素なし（Ｃｔｒｌ））も行った。ホスホリパーゼＤ活性の測定は実施例１と同様の方法で行った。表４に示すように、ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤはＰｌｓＥｔｎに対して高い特異性を有することが確認された。
ＰＯＰＥ：１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）（Avanti Polar Lipids社）
ＬＰＥ：リゾホスファチジルエタノールアミン（L-α-Lysophosphatidylethanolamine、Egg）（DOOSAN Serdary Research Laboratories 社）
ＰＯＰＥ：１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）（Avanti Polar Lipids社）
ＬＰＥ：リゾホスファチジルエタノールアミン（L-α-Lysophosphatidylethanolamine、Egg）（DOOSAN Serdary Research Laboratories 社）
【0095】
【表4】
【実施例8】
【0096】
（ホタテ分取エタノールアミン型プラズマローゲンの検量線の作成）
実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを用いて、ホタテから分取したエタノールアミン型プラズマローゲン（ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ）の検出を行った。なお、ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎの定量は、実施例１に記載のようにＰｌｓＥｔｎが加水分解されて得られるエタノールアミンを定量することで行った。
実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを用いて、ホタテから分取したエタノールアミン型プラズマローゲン（ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ）の検出を行った。なお、ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎの定量は、実施例１に記載のようにＰｌｓＥｔｎが加水分解されて得られるエタノールアミンを定量することで行った。
【0097】
１．ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎの調製
ホタテ類の食用部位から分取したホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ １ｍｇ（レオロジー機能食品研究所社）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬに加えて超音波でエマルションにして調製した。
２．ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ溶液の調製
実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ １５ｍＬを凍結乾燥後、１．５ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒに溶解した(１０倍に濃縮)。
３．ホスホリパーゼＤ活性の測定
以下の方法で蛍光強度を測定することでホスホリパーゼＤ活性を測定した。
１）ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ（０．０４２Ｕ／ｍＬ）を１０倍に濃縮したものを０．４２Ｕ／ｍＬ酵素サンプルとした。
２）ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ（レオロジー機能食品研究所社）及び大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（シグマアルドリッチ社）、血漿を９６穴ウェルプレートに分注した。
３）以下の蛍光法酵素反応液と酵素サンプルを加え、１分間振とうした。
［蛍光法酵素反応液］
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．７５ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００
２．５Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
１Ｕ／ｍＬ チラミンオキシダーゼ
５０μＭ Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ
上記総量 １００μＬ
０．４２Ｕ／ｍＬ 酵素サンプル １０μＬ
４）３７℃で１０分間保温した。
５）反応後、プレートリーダー (BECKMAN COULTER社)を用いて、蛍光光度（ＥＸ５３５ｎｍ、ＥＭ５９５ｎｍ）を測定した。
ホタテ類の食用部位から分取したホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ １ｍｇ（レオロジー機能食品研究所社）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬに加えて超音波でエマルションにして調製した。
２．ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ溶液の調製
実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ １５ｍＬを凍結乾燥後、１．５ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒに溶解した(１０倍に濃縮)。
３．ホスホリパーゼＤ活性の測定
以下の方法で蛍光強度を測定することでホスホリパーゼＤ活性を測定した。
１）ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤ（０．０４２Ｕ／ｍＬ）を１０倍に濃縮したものを０．４２Ｕ／ｍＬ酵素サンプルとした。
２）ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ（レオロジー機能食品研究所社）及び大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（シグマアルドリッチ社）、血漿を９６穴ウェルプレートに分注した。
３）以下の蛍光法酵素反応液と酵素サンプルを加え、１分間振とうした。
［蛍光法酵素反応液］
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．７５ｍＭ ＣａＣｌ２
０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００
２．５Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
１Ｕ／ｍＬ チラミンオキシダーゼ
５０μＭ Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ
上記総量 １００μＬ
０．４２Ｕ／ｍＬ 酵素サンプル １０μＬ
４）３７℃で１０分間保温した。
５）反応後、プレートリーダー (BECKMAN COULTER社)を用いて、蛍光光度（ＥＸ５３５ｎｍ、ＥＭ５９５ｎｍ）を測定した。
【0098】
なお、基質としては、ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎ １０、１５、２０、２５、又は５０μｇを用いた。結果を図６に示す。
【0099】
図６に示すように、実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを用いればホタテ由来ｐｌｓＥｔｎの検出ができること、及びホタテ由来ＰｌｓＥｔｎの濃度依存的に蛍光強度が増加していることが確認された。
【0100】
［比較例］
大豆にはプラズマローゲンが含まれていないことが知られている。そこで、比較例として大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を用いて測定を行った。
大豆にはプラズマローゲンが含まれていないことが知られている。そこで、比較例として大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を用いて測定を行った。
【0101】
１．大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の調製
大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）１ｍｇを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）１ｍＬに加えて超音波でエマルションにして調製した。
２．蛍光光度計による分析
ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎの代わりに大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を１０、１５、２０、２５又は５０μｇ用いた以外は上記実施例８と同様の方法で反応させた。結果を図７に示す。
大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）１ｍｇを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）１ｍＬに加えて超音波でエマルションにして調製した。
２．蛍光光度計による分析
ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎの代わりに大豆由来のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を１０、１５、２０、２５又は５０μｇ用いた以外は上記実施例８と同様の方法で反応させた。結果を図７に示す。
【0102】
図７に示すように、大豆由来のＰＥ量が増加しても蛍光強度はほとんど増加しておらず、蛍光強度はほぼ一定であった。したがって、ＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤはホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）には活性を示さないことが明らかとなった。
【0103】
以上のとおり、実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを用いれば、ＰｌｓＥｔｎを特異的に定量できることが確認された。
【実施例9】
【0104】
（血漿中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量）
１．血漿の調製
血清及び血漿は細胞膜ではないため、赤血球や白血球と比べて、これらに含まれるプラズマローゲンは極めて少ない。したがって、血清や血漿中のプラズマローゲン量を測定することはこれまでの技術では困難であった。一方、近年、プラズマローゲンはアルツハイマー型認知症のバイオマーカーとなると考えられており、血清又は血漿中のプラズマローゲンを定量することはアルツハイマー型認知症等の疾患の発症リスクの判定に重要である。そこで、実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを用いて血漿中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量が可能かどうかを調べた。
１．血漿の調製
血清及び血漿は細胞膜ではないため、赤血球や白血球と比べて、これらに含まれるプラズマローゲンは極めて少ない。したがって、血清や血漿中のプラズマローゲン量を測定することはこれまでの技術では困難であった。一方、近年、プラズマローゲンはアルツハイマー型認知症のバイオマーカーとなると考えられており、血清又は血漿中のプラズマローゲンを定量することはアルツハイマー型認知症等の疾患の発症リスクの判定に重要である。そこで、実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを用いて血漿中のエタノールアミン型プラズマローゲンの定量が可能かどうかを調べた。
【0105】
血漿の準備は、特開２０１６－１１１９２９号公報に記載の方法に準じて行った。簡潔に説明すると、ヘパリン入り採血管（テルモ社）を用いて静脈血を採取し、１０００×ｇ，５分間遠心して、上清（すなわち血漿）を回収した。
２．血漿サンプルの調製
上記で回収した血漿を冷凍保存し、測定前に解凍し５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒで調整した。
３．蛍光光度計による分析
ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎの代わりに上記血漿サンプルを２０、３０、４０又は５０μＬ用いた以外は実施例８と同様の方法で反応させた。結果を図８に示す。
２．血漿サンプルの調製
上記で回収した血漿を冷凍保存し、測定前に解凍し５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒで調整した。
３．蛍光光度計による分析
ホタテ由来ＰｌｓＥｔｎの代わりに上記血漿サンプルを２０、３０、４０又は５０μＬ用いた以外は実施例８と同様の方法で反応させた。結果を図８に示す。
【0106】
図８に示すように血漿サンプルの量に比例して蛍光強度が増加していることが確認された。実施例８の結果と合わせると、実施例７で調製したＰｌｓＥｔｎ－ＰＬＤを用いれば血漿中のエタノールアミン型プラズマローゲンを定量できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0107】
本発明のホスホリパーゼＤを用いれば、血漿等に含まれるエタノールアミン型プラズマローゲンを安価で検出又は定量可能とするものであり、産業上の有用性は高い。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】