特許 7534794 ｍＲＮＡ及びその製造方法並びにタンパク質の製造装置及びタンパク質の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-06

(45)【発行日】2024-08-15

(54)【発明の名称】ｍＲＮＡ及びその製造方法並びにタンパク質の製造装置及びタンパク質の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20240807BHJP

   C12P 19/34 20060101ALI20240807BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240807BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12P19/34 A

C12P21/02 C

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2021552323

(86)(22)【出願日】2020-10-05

(86)【国際出願番号】 JP2020037706

(87)【国際公開番号】W WO2021075293

(87)【国際公開日】2021-04-22

【審査請求日】2023-08-28

(31)【優先権主張番号】P 2019188411

(32)【優先日】2019-10-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(31)【優先権主張番号】P 2020121249

(32)【優先日】2020-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１９年７月１７日東京大学において開催された第２１回日本ＲＮＡ学会年会のポスターセッションにて発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１９年９月４日東北大学で開催された第１３回バイオ関連化学シンポジウム２０１９の予稿集にて発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１９年９月５日東北大学で開催された第１３回バイオ関連化学シンポジウム２０１９にて発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０２０年３月５日ウェブで発行された日本化学会第１００回春季年会の予稿集にて発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０２０年７月５日にオンライン版で公開されたＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．にて発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０２０年７月７日に国立研究開発法人科学技術振興機構のウェブサイトで公開されたプレスリリース「硫黄原子を導入した人工ｍＲＮＡで高効率たんぱく質合成」（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｐｒ／ａｎｎｏｕｎｃｅ／２０１８０１２９／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）と「プレスリリース資料」の本文にて発表

(73)【特許権者】

【識別番号】503360115

【氏名又は名称】国立研究開発法人科学技術振興機構

(74)【代理人】

【識別番号】110001612

【氏名又は名称】弁理士法人きさらぎ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】阿部 洋

(72)【発明者】

【氏名】阿部 奈保子

【審査官】西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】特開平４－１１７２８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】TOHDA, Hideki et al.，Efficient expression of E. coli dihydrofolate reductase gene by an in vitro translation system using phosphorothioate mRNA，J. Biotechnol.，1994年，Vol. 34，pp. 61-69

【文献】Database: GenBank [online], Definition: pUC18c cloning vector (beta-galactosidase mRNA on complementary strand)，1993年04月27日，[retrieved on 2020.11.12], Internet: <URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/L09136>

【文献】TaKaRa in vitro Transcription T7 Kit (for siRNA Synthesis) 説明書 ［オンライン］，2019年04月，pp. 1-14，［検索日 2020.11.12］, インターネット: <URL: https://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/6140_j.pdf>

【文献】UEDA, Takuya et al.，Phosphorothioate-containing RNAs show mRNA activity in the prokaryotic translation systems in vitro，Nucleic Acids Res.，1991年，Vol. 19，pp. 547-552

【文献】KEEDY, Hannah E. et al.，Decoding on the ribosome depends on the structure of the mRNA phosphodiester backbone，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，2018年，Vol. 115，pp. E6731-E6740

【文献】川口大輔 他，ホスホロチオエート修飾mRNAの合成と翻訳活性，第２１回 日本ＲＮＡ学会年会要旨集，2019年07月17日，p.134; P-73

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質の合成に使用されるｍＲＮＡであって、
開始コドン及び停止コドンを含む翻訳領域と、
前記開始コドンの５’末端側に位置する非翻訳領域と、を含み、
前記非翻訳領域の５’末端から前記開始コドンの３’末端側１５ｎｔまでの範囲内における一部のリン酸基のみがホスホロチオエート基に置換されていることを特徴とするｍＲＮＡ。

【請求項2】

２か所以上の前記リン酸基が前記ホスホロチオエート基に置換されていることを特徴とする請求項１に記載のｍＲＮＡ。

【請求項3】

前記非翻訳領域の少なくとも一部の前記リン酸基と、前記翻訳領域の少なくとも一部の前記リン酸基の両方が前記ホスホロチオエート基に置換されていることを特徴とする請求項２に記載のｍＲＮＡ。

【請求項4】

ｍＲＮＡを構成するアデノシンモノリン酸、グアノシンモノリン酸、シチジンモノリン酸及びウリジンモノリン酸のいずれか２種類以上のヌクレオチドがホスホロチオエート基に置換されていることを特徴とする請求項１に記載のｍＲＮＡ。

【請求項5】

前記非翻訳領域がＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のｍＲＮＡ。

【請求項6】

少なくとも前記非翻訳領域の５’末端から前記開始コドンの３’末端側１５ｎｔまでの範囲内における１０か所以上のリン酸基がホスホロチオエート基に置換されており、
前記ホスホロチオエート基は、前記Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列及び前記翻訳領域の両方に含まれることを特徴とする請求項５に記載のｍＲＮＡ。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか１項に記載のｍＲＮＡの製造方法であって、
前記非翻訳領域と前記翻訳領域とを含む前記ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡテンプレートを調製する工程と、
前記ＤＮＡテンプレートのうち前記非翻訳領域の５’末端から前記開始コドンの３’末端側１５ｎｔまでの範囲に対応する配列内の一か所を切断して５’末端側ＤＮＡフラグメ ントと、３’末端側ＤＮＡフラグメントとを得るＤＮＡ切断工程と、
アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン三リン酸、及びウリジン三リン酸を含む未修飾ＮＴＰと、少なくとも１種類の前記未修飾ＮＴＰのリン酸基がホスホロチオエート基に置換された修飾ＮＴＰと、を準備する工程と、
５’末端側ＤＮＡフラグメントを鋳型とし、前記未修飾ＮＴＰ及び前記修飾ＮＴＰを基質として転写反応を行って５’末端側修飾ｍＲＮＡフラグメントを得る修飾ｍＲＮＡ調製工程と、
３’末端側ＤＮＡフラグメントを鋳型とし、前記未修飾ＮＴＰのみを基質として転写反応を行って３’末端側未修飾ｍＲＮＡフラグメントを得る未修飾ｍＲＮＡ調製工程と、
前記５’末端側修飾ｍＲＮＡフラグメントと前記３’末端側未修飾ｍＲＮＡフラグメントとを連結する連結工程と、を備えることを特徴とするｍＲＮＡの製造方法。

【請求項8】

タンパク質の製造装置であって、
請求項１～６のいずれか１項に記載のｍＲＮＡであって、目的タンパク質をコードする配列を前記翻訳領域に有するｍＲＮＡと、
リボソーム、ＮＴＰ、ｔＲＮＡ、アミノ酸、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を少なくとも含む翻訳系と、を備えることを特徴とするタンパク質の製造装置。

【請求項9】

前記翻訳系が再構成型大腸菌系翻訳システムであることを特徴とする請求項８に記載のタンパク質の製造装置。

【請求項10】

前記ｍＲＮＡを構成するシチジンモノリン酸及びウリジンモノリン酸のいずれか少なくとも１種類のリン酸基の一部がホスホロチオエート基に置換されていることを特徴とする請求項９に記載のタンパク質の製造装置。

【請求項11】

タンパク質の製造方法であって、
請求項１～６のいずれか１項に記載のｍＲＮＡであって、目的タンパク質をコードする配列を前記翻訳領域に有するｍＲＮＡを調製するｍＲＮＡ調製工程と、
リボソーム、ＮＴＰ、ｔＲＮＡ、アミノ酸、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を少なくとも含む翻訳系に前記ｍＲＮＡを添加して前記リボソームにより前記目的タンパク質を翻訳する翻訳工程と、を備えることを特徴とするタンパク質の製造方法。

【請求項12】

前記翻訳系が再構成型大腸菌系翻訳システムであることを特徴とする請求項１１に記載のタンパク質の製造方法。

【請求項13】

前記ｍＲＮＡを構成するシチジンモノリン酸及びウリジンモノリン酸のいずれか少なくとも１種類のリン酸基の一部がホスホロチオエート基に置換されていることを特徴とする請求項１２に記載のタンパク質の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ｍＲＮＡ及びその製造方法並びにタンパク質の製造装置及びタンパク質の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ホスホロチオエート基（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ基：ＰＳ）を核酸に導入することで、生物学的安定性を付与することができることが知られている。ＰＳを導入した核酸は、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡの分子構造に使われており、上市されたオリゴ核酸医薬品にも使われている。ＰＳで修飾（以下、「ＰＳ修飾」ということがある）したｍＲＮＡ（以下、「ＰＳ－ｍＲＮＡ」ということがある）は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ又は大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＳが三リン酸のα位に導入された基質ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰαＳ）を用いて酵素的に調製することができる。

【0003】

ＮＴＰαＳの合成方法はすでに開発されているものの、ＰＳ修飾はｍＲＮＡにはほとんど使用されず、３０年近く前に報告された数例のみである（例えば、非特許文献１～３参照）。これら報告は、大腸菌の無細胞翻訳系を用いたタンパク質合成に関するものである。

【0004】

非特許文献１では、ｐｏｌｙ－Ｕ配列からなるＰＳ－ｍＲＮＡを合成し天然配列の４５％の効率でポリアラニンが合成された旨が記載されている（最後から３つ目の段落）。本文献では、配列が非常に限定されており、かつ生成物は厳密にはタンパク質とは言えない。

【0005】

非特許文献２では、Ｔ７ファージＤＮＡを鋳型とし、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた試験管内転写法によりＰＳ－ｍＲＮＡを作成している。本文献では、サーマス・サーモフィルス及び大腸菌の無細胞翻訳系でＰＳ－ｍＲＮＡの翻訳活性を評価し、一塩基をＮＴＰαＳで置換したＰＳ－ｍＲＮＡがこれら無細胞系において無置換体より最大で２倍のタンパク質合成を示したことが報告されている（Ｆｉｇ．３）。

【0006】

非特許文献３では、大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼのＰＳ－ｍＲＮＡをインビトロ転写法で作成し、それを鋳型とするタンパク質合成量を測定している（Ｆｉｇ．２）。この論文では、転写時に１種類の塩基のみをＮＴＰαＳで置換したＰＳ－ｍＲＮＡと、４塩基ともＮＴＰαＳで置換したＰＳ－ｍＲＮＡを作成し、前者で未置換ｍＲＮＡ（以下、「ＰＯ－ｍＲＮＡ」ということがある）より約２～３倍のタンパク質が合成されたことが報告されている。発明者らは、この合成効率の改善がＰＳ－ｍＲＮＡの安定性によりもたらされたものと推定している。ただし、本文献には、４塩基ともＮＴＰαＳで置換したＰＳ－ｍＲＮＡでは未置換のものよりタンパク質合成量が低下した（ＰＯ－ｍＲＮＡの約３０％）ことも報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】Ｐｏｌｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ． Ｆ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｈ． Ｇｉｎｄｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３， ５５８－５６４， １９７０；

【文献】Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＲＮＡｓ ｓｈｏｗ ｍＲＮＡ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｔ． Ｕｅｄａ， Ｈ． Ｔｏｈｄａ， Ｎ． Ｃｈｉｋａｚｕｍｉ， Ｆ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｋ． Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９ （３）， ５４７－５５２， １９９１；

【文献】Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅ． ｃｏｌｉ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｂｙ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍＲＮＡ． Ｈ． Ｔｏｈｄａ， Ｎ． Ｃｈｉｋａｚｕｍｉ， Ｔ． Ｕｅｄａ， Ｋ． Ｎｉｓｈｉｋａｗａ， Ｋ． Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３４， ６１－６９， １９９４．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

従来のＰＳ－ｍＲＮＡは、ＮＴＰαＳの種類や修飾数などで翻訳効率が高くなる場合や低くなる場合があり、ｍＲＮＡにどのようなＰＳ修飾を行えば翻訳効率を高くできるか不明であった。なお、非特許文献１～３には、非翻訳領域にＰＳを導入することは記載されていない。

【0009】

本発明の目的は、タンパク質の合成に使用され、リボソームによる翻訳効率の高いｍＲＮＡ及びその製造方法を提供することにある。また、本発明の他の目的は、このｍＲＮＡを用いて翻訳効率を高くしたタンパク質の製造装置及びタンパク質の製造方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意研究を重ねた。その結果、５’末端から開始コドン付近まで部分的にＰＳを導入したｍＲＮＡは、タンパク質の合成量が２２倍増加し、一方、開始コドン付近から３’末端までの２５０塩基にＰＳを導入したｍＲＮＡはその合成量が２０％低下したことがわかった。このことから、ｍＲＮＡの５’末端から開始コドン付近までにＰＳを導入することで翻訳効率を格段に高めることができることを見出し、本発明を完成させた。

【0011】

すなわち、本発明は、タンパク質の合成に使用されるｍＲＮＡであって、開始コドン及び停止コドンを含む翻訳領域と、前記開始コドンの５’末端側に位置する非翻訳領域と、を含み、少なくとも前記非翻訳領域の５’末端から前記開始コドンの３’末端側１５ｎｔまでの範囲内における一部のリン酸基がホスホロチオエート基に置換されていることを特徴とするｍＲＮＡである。

【0012】

この場合において、２か所以上の前記リン酸基が前記ホスホロチオエート基であることが好ましい。

【0013】

さらにこの場合、前記非翻訳領域の少なくとも一部の前記リン酸基と、前記翻訳領域の少なくとも一部の前記リン酸基とが前記ホスホロチオエート基であることが好ましい。

【0014】

あるいはまた、ｍＲＮＡを構成するアデノシンモノリン酸、グアノシンモノリン酸、シチジンモノリン酸及びウリジンモノリン酸のいずれか２種類以上のヌクレオチドがホスホロチオエート基であることが好ましい。

【0015】

上記のいずれかの場合において、前記非翻訳領域がＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含むことが好ましい。

【0016】

この場合において、少なくとも前記非翻訳領域の５’末端から前記開始コドンの３’末端側１５ｎｔまでの範囲内における１０か所以上のリン酸基がホスホロチオエート基に置換されており、前記ホスホロチオエート基は、前記Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列及び前記翻訳領域の両方に含まれることが好ましい。

【0017】

本発明は、上記のいずれかに記載のｍＲＮＡの製造方法であって、前記非翻訳領域と前記翻訳領域とを含む前記ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡテンプレートを調製する工程と、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン三リン酸及びウリジン三リン酸を含む未修飾ＮＴＰと、前記未修飾ＮＴＰの少なくとも１種類のリン酸基がホスホロチオエート基に置換された修飾ＮＴＰと、を準備する工程と、前記ＤＮＡテンプレートを鋳型とし、前記未修飾ＮＴＰ及び前記修飾ＮＴＰを基質としてＲＮＡポリメラーゼにより転写反応を行う工程と、を備えることを特徴とするｍＲＮＡの製造方法である。

【0018】

この場合において、前記ＤＮＡテンプレートのうち前記非翻訳領域の５’末端から前記開始コドンの３’末端側１５ｎｔまでの範囲に対応する配列内の一か所を切断して５’末端側ＤＮＡフラグメントと、３’末端側ＤＮＡフラグメントとを得るＤＮＡ切断工程と、５’末端側ＤＮＡフラグメントを鋳型とし、前記未修飾ＮＴＰ及び前記修飾ＮＴＰを基質として転写反応を行って５’末端側修飾ｍＲＮＡフラグメントを得る修飾ｍＲＮＡ調製工程と、３’末端側ＤＮＡフラグメントを鋳型とし、前記未修飾ＮＴＰのみを基質として転写反応を行って３’末端側未修飾ｍＲＮＡフラグメントを得る未修飾ｍＲＮＡ調製工程と、前記５’末端側修飾ｍＲＮＡフラグメントと前記３’末端側未修飾ｍＲＮＡフラグメントとを連結する連結工程と、を備えることが好ましい。

【0019】

さらに、本発明は、タンパク質の製造装置であって、上記のいずれかに記載のｍＲＮＡであって、目的タンパク質をコードする配列を前記翻訳領域に有するｍＲＮＡと、リボソーム、ＮＴＰ、ｔＲＮＡ、アミノ酸、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を少なくとも含む翻訳系と、を備えることを特徴とするタンパク質の製造装置である。

【0020】

上記において、前記翻訳系として再構成型大腸菌系翻訳システムを挙げることができる。

【0021】

この場合において、前記ｍＲＮＡを構成するシチジンモノリン酸及びウリジンモノリン酸のいずれか少なくとも１種類のリン酸基の一部がホスホロチオエート基であることが好ましい。

【0022】

あるいは、本発明は、タンパク質の製造方法であって、上記のいずれかに記載のｍＲＮＡであって、目的タンパク質をコードする配列を前記翻訳領域に有するｍＲＮＡを調製するｍＲＮＡ調製工程と、リボソーム、ＮＴＰ、ｔＲＮＡ、アミノ酸、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を少なくとも含む翻訳系に前記ｍＲＮＡを添加して前記リボソームにより前記目的タンパク質を翻訳する翻訳工程と、を備えることを特徴とするタンパク質の製造方法。

【0023】

上記において、前記翻訳系として再構成型大腸菌系翻訳システムを挙げることができる。

【0024】

この場合において、前記ｍＲＮＡを構成するシチジンモノリン酸及びウリジンモノリン酸のいずれか少なくとも１種類のリン酸基の一部がホスホロチオエート基であることが好ましい。

【発明の効果】

【0025】

本発明によれば、タンパク質の合成に使用され、リボソームによる翻訳効率の高いｍＲＮＡ及びその製造方法を提供することが可能となる。また、本発明の他の目的は、このｍＲＮＡを用いて翻訳効率を高くしたタンパク質の製造装置及びタンパク質の製造方法を提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】本発明のｍＲＮＡのホスホロチオエート修飾を示す図である。

【図2】原核生物系でのｍＲＮＡ翻訳に対するＰＳ修飾の効果を示す図である。

【図3】実施例で使用したＮＴＰαＳｓの逆相ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。

【図4】ＰＵＲＥシステムでのホスホロチオエート化ｍＲＮＡの翻訳のウエスタンブロット分析結果を示す図である。

【図5】図５は、ＰＵＲＥ翻訳混合物中のホスホロチオエート化ｍＲＮＡの安定性を示すグラフである。

【図6】ＰＵＲＥシステムでのＦＬＡＧ－ＥＧＦ－Ｐｒｏ３ ｍＲＮＡの翻訳反応のシングルターンオーバー分析の結果を示す図である。

【図7】ＰＳ修飾ＲＮＡの翻訳活性の位置の差を示す図である。

【図8】異なるＰＳ修飾パターンを含むキメラＲＮＡの合成実験を示す図である。

【図9】ＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｍＲＮＡと混合したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ試薬の蛍光対温度プロットした結果を示す図である。

【図10】ＮＴＰαＳｓを使用したＰＵＲＥシステムでの転写／翻訳の結合反応を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

１．ｍＲＮＡ
以下、本発明のｍＲＮＡについて説明する。本発明のｍＲＮＡは、目的とするタンパク質の合成に使用され、翻訳領域と非翻訳領域と、を含む。翻訳領域は、開始コドンと停止コドンとを含み、目的タンパク質をコードする領域（コーディング領域）である。非翻訳領域は、開始コドンの５’末端側に位置し、タンパク質に翻訳されない領域（非コーディング領域）である。この非翻訳領域には、リボソームが結合する配列（いわゆる「共通配列」）が含まれており、このような配列としては原核生物ではＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（ＳＤ配列）を挙げることができる。なお、本発明の効果を阻害しなければ、停止コドンの３’末端側の下流に別の非翻訳領域を有していてもよい。

【0028】

本発明のｍＲＮＡは、少なくともこの非翻訳領域の５’末端から開始コドンの３’末端側１５ｎｔ（ヌクレオチド：塩基）までの範囲内（以下、「ＰＳ修飾範囲」ということがある）における一部のリン酸基がホスホロチオエート基に置換されている。この１５ｎｔは、開始コドンのトリプレットのうち、５’側のヌクレオチド（例えば、開始コドンが「ＡＵＧ」の場合は「Ａ」）から数えたヌクレオチド数を意味する。ここでいうリン酸基とは、ｍＲＮＡを構成する単位であるヌクレオチドのリン酸基であり、ホスホロチオエート基はこのリン酸基のリンと二重結合する酸素が硫黄に置換された基である。図１の（ａ）は、ＲＮＡの化学構造を示しており、ＸがＯの場合がリン酸基（未修飾ヌクレオチド、すなわち天然型ヌクレオチド）、ＸがＳの場合がホスホロチオエート基（修飾ヌクレオチド）を示している。

【0029】

図１の（ｂ）は、本発明のｍＲＮＡを使用することによって翻訳効率が高くなるメカニズムを概念的に示す模式図である。図の上段は、ｍＲＮＡにリボソームが結合する前の状態を示している。この図に示すように、ホスホロチオエート基で置換されたｍＲＮＡ（ＰＳ－ｍＲＮＡ）は、ＰＳ修飾範囲の複数個所でＰＳ修飾されている。このｍＲＮＡの非翻訳領域の共通配列（ＳＤ配列など）にリボソームが結合して複合体を形成し、翻訳が開始される。このときに、ＰＳ修飾範囲でＰＳ修飾されたｍＲＮＡ（ＰＳ－ｍＲＮＡ）は、未修飾のｍＲＮＡ（天然型ｍＲＮＡ）よりも翻訳開始速度が速くなり、翻訳効率が向上する。

【0030】

後述する実施例に示すように、翻訳反応中にリボソームを停止させるシングルターンオーバー解析を行った結果、ＰＳ－ｍＲＮＡと天然型ｍＲＮＡのリボソームによるペプチド伸長反応の速度は同じであった。他方、翻訳開始速度（リボソーム複合体形成の速度）は、ＰＳ－ｍＲＮＡの鋳型の方が天然型のそれよりも速いことが明らかとなった。一般的に、翻訳サイクルにおいてその律速段階は翻訳開始段階にあると考えられることから、ＰＳ－ｍＲＮＡの翻訳効率が高いのは、ＰＳ－ｍＲＮＡがリボソームの複合体形成過程を速めるためと考えられる。本結果は非天然型ｍＲＮＡを用いて翻訳能を向上させるための新たな戦略となる。

【0031】

また、後述する実施例に示すように、５’末端から開始コドン付近の翻訳領域（５’末端から３４塩基＝開始コドンから１１塩基）まで部分的にＰＳを導入したｍＲＮＡは、その合成量が２２倍増加した。一方で、この開始コドン付近から３’末端までの２５０塩基にＰＳを導入したｍＲＮＡは、その合成量が２０％低下した。このことから、翻訳効率の観点からは、ＰＳを導入する部位は、ｍＲＮＡのどこでもよいわけではなく、５’末端から開始コドン付近の翻訳領域（開始コドンを基準に２０塩基下流側）に限定される。

【0032】

本発明のｍＲＮＡでは、１か所以上のリン酸基がホスホロチオエート基に置換されているが、２か所以上のリン酸基がホスホロチオエート基であることが好ましい。置換箇所が少ないと、翻訳効率が低くなりやすい。ＰＳの置換箇所は５か所以上であることが好ましく、１０か所以上であることがより好ましい。置換箇所の上限は特にないが、２０か所以下であることが好ましい。

【0033】

また、ＰＳ修飾範囲においては、非翻訳領域の少なくとも一部のリン酸基と、翻訳領域の少なくとも一部のリン酸基の両方がホスホロチオエート基で置換されていることが好ましい。また、本発明では、少なくともＰＳ修飾範囲がＰＳ修飾されていればよく、ＰＳ翻訳領域の３’末端側の翻訳領域や、停止コドンの３’末端側に別の非翻訳領域を有する場合はその非翻訳領域もＰＳ修飾されていてもよい。ただし、後述する実施例に示すように、ＰＳ修飾範囲のみにＰＳ修飾を有している方が、ＰＳ修飾範囲以外にもＰＳ修飾されている場合に比べて、翻訳効率が高いため、ＰＳ修飾範囲のみがＰＳ修飾されていることが好ましい。

【0034】

本発明のｍＲＮＡでは、ｍＲＮＡを構成するアデノシンモノリン酸（ＡＭＰ）、グアノシンモノリン酸（ＧＭＰ）、シチジンモノリン酸（ＣＭＰ）及びウリジンモノリン酸（ＵＭＰ）のいずれか１種類のみがホスホロチオエート基である。あるいは、これらのヌクレオチドのうち、２種類以上のヌクレオチドがホスホロチオエート基であってもよい。これらヌクレオチドのどのヌクレオチドがＰＳ修飾されると翻訳効率が高くなるかについては、ｍＲＮＡの二次構造などに依存するため一概には決めらないため、未修飾領域の配列や翻訳系などに応じて適宜設計するのがよい。

【0035】

２．ｍＲＮＡの製造方法
次に、ｍＲＮＡの製造方法について説明する。ｍＲＮＡの製造方法では、まず、非翻訳領域と翻訳領域とを含むｍＲＮＡに相補的なＤＮＡテンプレートを調製する（ＤＮＡ調製工程）。ＤＮＡテンプレートのうちｍＲＮＡの非翻訳領域に相補的な部分には、プロモータ配列や、上述したＳＤ配列に相補的な配列などを含む。

【0036】

また、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む（未修飾の）ＮＴＰを準備する。さらに、ＮＴＰのリン酸基がホスホロチオエート基に置換された修飾アデノシン三リン酸（ＡＴＰαＳｓ）、修飾グアノシン三リン酸（ＧＴＰαＳｓ）、修飾シチジン三リン酸（ＣＴＰαＳｓ）及び修飾ウリジン三リン酸（ＵＴＰαＳｓ）を含む修飾ＮＴＰ（ＮＴＰαＳｓ）を準備する。これらＮＴＰとＮＴＰαＳｓを含む試薬を調製する。そして、上記のＤＮＡテンプレートを鋳型とし、試薬に含まれるＮＴＰ及びＮＴＰαＳｓを基質としてＲＮＡポリメラーゼにより転写反応を行う。ＲＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどを挙げることができる。ＮＴＰとＮＴＰαＳｓの比率は、ｍＲＮＡに導入したいＰＳの数にもよるが、１：１００～１００：１の範囲内などで適宜設定することができる。転写反応の反応温度、反応時間も適宜設定することができるが、例えば反応温度は２０～５０℃、反応時間は３０分～６時間とすることができる。

【0037】

次に、ＰＳ修飾範囲のみがＰＳ修飾されたＰＳ－ｍＲＮＡ（ＰＳ修飾範囲以外にＰＳ修飾を有さないｍＲＮＡ）を製造する方法について説明する。

【0038】

まず、上記のＤＮＡテンプレートのうち、非翻訳領域の５’末端から開始コドンの３’末端側１５ｎｔまでの範囲（ＰＳ修飾範囲）に対応する配列内の一か所を切断する。これにより、５’末端側ＤＮＡフラグメントと、３’末端側ＤＮＡフラグメントとが得られる（ＤＮＡ切断工程）。ＤＮＡテンプレートの切断は、制限酵素などを使用する。

【0039】

次に、５’末端側ＤＮＡフラグメントを鋳型とし、ＮＴＰ及びＮＴＰαＳｓの両方を基質として転写反応を行い、５’末端側修飾ｍＲＮＡフラグメントを得る（修飾ｍＲＮＡ調製工程）。また、３’末端側ＤＮＡフラグメントを鋳型とし、ＮＴＰαＳｓのみを基質として転写反応を行い、３’末端側未修飾ｍＲＮＡフラグメントを得る（未修飾ｍＲＮＡ調製工程）。これらｍＲＮＡフラグメントを得る工程では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどを使用し、上記の反応条件を適用して行うことができる。

【0040】

最後に、５’末端側修飾ｍＲＮＡフラグメントと３’末端側未修飾ｍＲＮＡフラグメントとを連結する（連結工程）。この工程では、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼなどの酵素を使用して行うことができる。これにより、５’末端側修飾ｍＲＮＡフラグメントと３’末端側未修飾ｍＲＮＡフラグメントとが結合したキメラｍＲＮＡを製造することができる。

【0041】

３．タンパク質の製造装置及び製造方法
次に、本発明のタンパク質の製造装置及び製造方法について説明する。本発明のｍＲＮＡは、目的とするタンパク質の製造に使用することができる。まず、目的タンパク質をコードする配列を前記翻訳領域に有するｍＲＮＡを調製する（ｍＲＮＡ調製工程）。ｍＲＮＡの調製は、上記のＤＮＡテンプレートに目的とするタンパク質をコードする配列を含むものを使用して行うことができる。

【0042】

次に、このｍＲＮＡを翻訳系に添加して翻訳を行う（翻訳工程）。翻訳系には、リボソーム、ＮＴＰ、ｔＲＮＡ、アミノ酸、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を少なくとも含むものを使用する。翻訳系は、再構成型大腸菌系翻訳システム（いわゆるＰＵＲＥシステム）であることが好ましい。ＰＵＲＥシステムは、大腸菌の翻訳システムを試験官内で再構築したものである。ＰＵＲＥシステムには、開始因子（ＩＦ１、ＩＦ２、ＩＦ３）、伸長因子（ＥＦ－Ｔｕ、ＥＦ－Ｔｓ、ＥＦ－Ｇ）、終結（解離）因子（ＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３）、リボソーム再生因子（ＲＲＦ）、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）、メチオニルｔＲＮＡフォルミル転移酵素、リボソーム、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸、ＮＴＰ、ｔＲＮＡなどが含まれる。これにｍＲＮＡを添加して翻訳することにより、目的タンパク質を得ることができる。反応温度、反応時間は適宜設定することができ、例えば反応温度は２０～５０℃、反応時間は１～２４時間とすることができる。ＰＵＲＥシステムにおいては、基質としてのＡＴＰやＧＴＰは系で分解されやすいため、ＣＴＰαＳｓ及び／又はＵＴＰαＳｓを使用することが好ましい。

【実施例】

【0043】

以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、これらは本発明の目的を限定するものではない。また、以下の実施例において「％」表示は特に規定しない限り質量基準（質量パ－セント）である。

【0044】

１．実験例１：配列設計とＰＳ－ｍＲＮＡの合成及び大腸菌無細胞翻訳系を用いたタンパク質合成（ＦＬＡＧ－ＥＧＦ）
図２（ａ）の上段は、テンプレートとしての対応するｄｓＤＮＡからのＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｍＲＮＡの転写の概略図を示している。本実験では、最初に、Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列、３つのＦＬＡＧオクタペプチドコード配列、及び上皮成長因子（ＥＧＦ）コード配列を含むｍＲＮＡ ＦＬＡＧ－ＥＧＦをモデル配列として設計した。

【0045】

ＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｍＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びＰＣＲ増幅によって得たｄｓＤＮＡ鋳型を用いた試験管内転写反応によって調製した。ＰＳ－ｍＲＮＡは、１つ又は複数のＮＴＰを対応するＮＴＰαＳで置換することによって調製した。未修飾ＮＴＰとＮＴＰαＳの１６の可能な組み合わせを有するＰＳ－ｍＲＮＡを合成した。

【0046】

図２（ａ）の下段は、ＮＴＰαＳｓを使用したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の変性ＰＡＧＥ分析結果である。１つ以上のＮＴＰが対応するＮＴＰαＳｓに置換されており、図では＋で表している。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ染色でゲルを視覚化した。転写反応を１６種類全ての組み合わせで行い、転写物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析した。ゲルを染色し、転写ＲＮＡの相対量を計算した。

【0047】

その結果、標的のＲＮＡはすべての組み合わせで観察され、置換したＮＴＰ数が増えるにつれてｍＲＮＡの相対収量が減少したことがわかった。

【0048】

次に、異なるＰＳ修飾パターンを有する１６種類のＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｍＲＮＡの翻訳反応を、ＰＵＲＥシステムにおいて同濃度にて比較した。ＰＵＲＥシステムは、理化学研究所 清水義宏博士から供与されたものを使用した。その作成方法は以下に示す論文等に記載されている。
Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ． Ｙ． Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ａ． Ｉｎｏｕｅ， Ｙ． Ｔｏｍａｒｉ， Ｔ． Ｓｕｚｕｋｉ， Ｔ． Ｙｏｋｏｇａｗａ， Ｋ． Ｎｉｓｈｉｋａｗａ， Ｔ． Ｕｅｄａ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００１， １９， ７５１－７５５； ｂ） Ｔｈｅ ＰＵＲＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｙ． Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｙ． Ｋｕｒｕｍａ， Ｔ． Ｋａｎａｍｏｒｉ， Ｔ． Ｕｅｄａ， ｉｎ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｖｏｌ． １１１８ （Ｅｄｓ．： Ｋ． Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ， Ｗ． Ａ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎａｔｕｒｅ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ ＡＧ， ２０１４， ｐｐ． ２７５－２８４．

【0049】

図２（ｂ）は、ＰＵＲＥシステムでＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｍＲＮＡを翻訳し、ウエスタンブロット分析した結果を示す図である。転写後、精製ＲＮＡ（０．２μＭ）をシステム内で３７℃、２時間インキュベートした。転写時のＲＮＡの修飾パターンは、置換されたＮＴＰαＳｓを＋記号で示すことで表した。翻訳産物は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を使用して検出した。ウエスタンブロット法により、ＰＳ－ｍＲＮＡから得られた翻訳産物とＰＯ－ｍＲＮＡから得られた翻訳産物との相対量を計算した。

【0050】

その結果、すべてのＰＳ－ｍＲＮＡは、ＰＯ－ｍＲＮＡよりも高い翻訳量を示した。最も高い相対比は、ＵＴＰαＳ及びＣＴＰαＳの両方が使用されたときの１１倍であり、２番目に高い相対比はＡＴＰαＳのみが使用されたときの８．６倍であった。

【0051】

次に、ＮＴＰαＳに含まれる異性体を分析した。図３は、この実験で使用したＮＴＰαＳｓの逆相ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。ＨＰＬＣ分析の結果、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入したＮＴＰαＳは、Ｒｐ異性体とＳｐ異性体の同等混合物であった。なお、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは基質としてＳｐ型のみを使用しＲｐ型は転写反応を阻害しないことが示されている。

【0052】

２．実験例２：他の配列によるタンパク質合成（ＡｃＧＦＰ、Ｓｐｉｄｅｒ－ＦＬＡＧ）
次に、ＰＳ修飾による翻訳効率の向上に何らかの一般性があるかどうかを決定するために、実験例１のＦＬＡＧ－ＥＧＦとは異なる他の２つの配列（ＡｃＧＦＰ、Ｓｐｉｄｅｒ－ＦＬＡＧ）を用いて検討した。

【0053】

図４は、ＰＵＲＥシステムでのホスホロチオエート化ｍＲＮＡの翻訳のウエスタンブロット分析を示す図である。ＡｃＧＦＰ ｍＲＮＡ（ａ）及びＳｐｉｄｅｒ－ＦＬＡＧ ｍＲＮＡ（ｂ）は、ＡＴＰ又はＧＴＰがそれぞれＡＴＰαＳｓ又はＧＴＰαＳｓで置換されて転写された。転写後、精製ＲＮＡ（０．２μＭ）をＰＵＲＥシステムで３７℃、２時間インキュベートした。翻訳産物は、ＡｃＧＦＰ ｍＲＮＡには抗ＧＦＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ｓｃ－９９９６）、Ｓｐｉｄｅｒ－ＦＬＡＧ ｍＲＮＡには抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ１８０４）を使用して検出した。

【0054】

その結果、Ｓｐｉｄｅｒ－ＦＬＡＧ ｍＲＮＡ及びＡｃＧＦＰ ｍＲＮＡにＡＴＰαＳ又はＧＴＰαＳを導入し、ＰＳ－ｍＲＮＡの翻訳量をＰＯ－ｍＲＮＡと比較した。その結果、いずれのＰＳ－ｍＲＮＡもＰＯ－ｍＲＮＡと比較し翻訳量が向上した。さらに、ＥＧＦ－ＦＬＡＧ ｍＲＮＡのＰＳ導入位置と翻訳量の関係をバイオインフォ―マティクスにより解析したが、その関係性を見出すことはできなかった。置換する塩基の種類ではなく、ｍＲＮＡ中におけるＰＳの分布が翻訳能を左右する要因である可能性がある。

【0055】

３．実験例３：ＰＵＲＥ翻訳混合物中のホスホロチオエート化ｍＲＮＡの安定性
次に、ｍＲＮＡへのＰＳ導入がなぜ翻訳効率を向上させるかを調べた。ひとつはＰＳ－ｍＲＮＡの安定性に起因する可能性がある。ＡＴＰ及びＣＴＰをそれぞれＡＴＰαＳ及びＣＴＰαＳに置換することによって転写されたＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｍＲＮＡであるＰＳ（Ａ，Ｃ）－ｍＲＮＡの安定性を、翻訳液中でインキュベートし、次いでＲＴ－ＰＣＲにより定量することによってＰＯ－ｍＲＮＡの安定性と比較した。

【0056】

図５は、ＰＵＲＥ翻訳混合物中のホスホロチオエート化ｍＲＮＡの安定性［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭグルタミン酸カリウム、２ｍＭスペルミジン、１ｍＭ ＤＴＴ、２０ｍＭクレアチンリン酸ナトリウム、０．１ｍＭ 各２０アミノ酸］を示すグラフである。ＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列のＰＯ－ｍＲＮＡ及びＰＳ（Ａ、Ｃ）－ｍＲＮＡは、０．０５ｐｍｏｌ／μＬの濃度で、３７℃でインキュベートした。１０分及び３０分後、混合物からアリコート（２μＬ）を取り、１４８μＬの水と混合し、－３０℃で保存した。これらの溶液中のＲＮＡの濃度は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって決定された。ｑＲＴ－ＰＣＲは、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＴＢＧｒｅｅｎ（登録商標） ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を使用し、ＣＦＸ ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で実施した。

【0057】

使用したプライマーの配列は、ＦＬＡＧ－ＥＧＦ＿Ｆ：５’－ＣＡＡＴＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡＣＡＣＣＧ－３’、ＦＬＡＧ－ＥＧＦ＿Ｒ：５’－ＧＧＧＡＴＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＴＣＣ－３’。ウミシイタケルシフェラーゼｍＲＮＡ（ＢｉｏＲａｄのｐＲＬ－ＴＫを使用して調製）を、プライマーセット（Ｒｌｕｃ＿Ｆ：５’－ＧＴＴＧＧＡＣＧＡＣＧＡＡＣＴＴＣＡＣＣ－３’ Ｒｌｕｃ＿Ｒ：５’－ＡＴＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＡＴＧＧＣＣＴＧ－３’）を使用し、ｑＲＴ－ＰＣＲの内部コントロールとして使用した。反応条件：４２℃、５分→９５℃、１０秒→（９５℃、５秒→６０℃、３０秒）×４０サイクル。

【0058】

その結果、２つのｍＲＮＡの安定性に差は観察されなかった。ＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍは大腸菌翻訳系を再構成したものであり、ヌクレアーゼを含んでいないため、ＲＮＡの分解反応は起こりにくいものと考えられる。したがって、ＰＳ－ｍＲＮＡの安定性は、その翻訳効率向上の主要因ではないと判断した。

【0059】

４．実験例４：ＰＵＲＥシステムでのＦＬＡＧ－ＥＧＦ－Ｐｒｏ３ ｍＲＮＡの翻訳反応のシングルターンオーバー分析
次に翻訳反応のメカニズムに注目した。リボソームの翻訳反応は大きく開始、伸長、終結の３段階にわけられる。その中で、開始段階、すなわちリボソームがｍＲＮＡへの結合する段階はもっとも時間がかかり、律速段階であると考えられている。そのため、ｍＲＮＡへのＰＳ導入がリボソームの結合速度を速め、その結果翻訳効率が向上したのではないかとの仮説を立てた。この仮説を検証するために、翻訳反応の初速度を解析した。翻訳反応の初速度をとらえるために、リボソームが解離を起こさないシングルターンオ―バーの実験条件を設定した（図６（ａ））。図６は、ＰＵＲＥシステムでのＦＬＡＧ－ＥＧＦ－Ｐｒｏ３ ｍＲＮＡの翻訳反応のシングルターンオーバー分析の結果を示す図であり、図６（ａ）は実験計画の概要を示している。

【0060】

これまでに、タンパク質配列の末端に３つ以上のプロリン（Ｐｒｏ）リピート配列を導入することで、リボソームが当該部位で乖離せず停止することが報告されている。そこで、ＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｍＲＮＡの末端に３つのＰｒｏ配列を導入したＦＬＡＧ－ＥＧＦ－Ｐｒｏ３ ｍＲＮＡを設計・合成し翻訳反応を行った。先の実験結果で翻訳量が向上したＡＴＰαＳとＣＴＰαＳの組み合わせを用い、転写によりＰＳ（Ａ，Ｃ）－ｍＲＮＡを調製した。翻訳反応を２～７分間行った後、タンパク合成量をウエスタンブロット法により解析した（図６）。

【0061】

図６（ｂ）は、ウエスタンブロッティングにより分析されたホスホロチオエート化ｍＲＮＡ（ＰＳ（Ａ、Ｃ）－ｍＲＮＡ＋Ｐｒｏ３）又は未修飾ｍＲＮＡ（ＰＯ－ｍＲＮＡ＋Ｐｒｏ３）の翻訳反応の時間経過を示している。
ＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｍＲＮＡの翻訳反応では～１５ｋＤａの位置に生成物のバンドが生じたが、ＦＬＡＧ－ＥＧＦ－Ｐｒｏ３ ｍＲＮＡの翻訳反応では３７ｋＤａ付近に生成物のバンドが生じた（図６（ｂ））。これは、Ｐｒｏリピート上でリボソームがペプチド伸長を行なえず、また終結反応が起こらないため、ｔＲＮＡが結合した状態で反応が終結し、翻訳産物として得られたためである。

【0062】

図６（ｃ）は、ＲＮａｓｅ Ａ処理後の翻訳産物のウエスタンブロット分析結果を示している。ｍＲＮＡ（ＰＯ－ｍＲＮＡ＋Ｐｒｏ３）をシステム内で３７℃、２４０分間翻訳した後、ＲＮａｓｅを混合物に加えた。
この結果、実際に翻訳産物をＲＮＡ分解酵素であるＲＮａｓｅ Ａで処理すると、ｔＲＮＡが分解され１５ｋＤａ付近に生成物が観察された。この結果は、本系がリボソームのシングルターンオーバー反応を解析できることを裏付けた。

【0063】

図６（ｄ）は、反応時間変換プロットを示している。２５－ｋＤａマーカーと３７－ｋＤａマーカーの間に現れたバンドのシグナル強度がプロットされた。
この結果、天然型ｍＲＮＡ及びＰＳ－ｍＲＮＡから生じた３７ｋＤａ付近の生成物量の時間変化をプロットしたところ、２本の直線のｘ切片は約１００秒とほぼ同じ値を示した。このことは、天然型ｍＲＮＡ及びＰＳ－ｍＲＮＡの翻訳反応における伸長速度がほぼ同じであることを示す。各グラフの傾きは翻訳反応の初期速度を表し、これはＰＳ－ｍＲＮＡでＰＯ－ｍＲＮＡよりも約４倍速いことが分かった。翻訳反応の律速段階は開始段階（リボソームの結合）であることから、ＰＳ修飾はｍＲＮＡへのリボソームの結合を促進し、そのことがその翻訳活性向上の主要因であることが示された。

【0064】

５．実施例・比較例：ＰＳ修飾導入位置の違いが翻訳反応に与える影響
次に、ＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列に基づいて２つのキメラｍＲＮＡを設計した。５’－ＰＳ－ｍＲＮＡに対しては主にＵＴＲ（非翻訳領域）からなる、５’末端から３４ｎｔ（開始コドンから１１ｎｔ）のＡ及びＣ塩基にＰＳを導入した。３’－ＰＳ－ｍＲＮＡ に対しては３’末端から２５０塩基中のＡ及びＣ塩基にＰＳを導入した（図７，図８）。これらは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２を用いて２本のＲＮＡ鎖を連結することで得た（図８）。

【0065】

図７は、ＰＳ修飾ＲＮＡの翻訳活性の位置の差を示す図である。図の（ａ）は、異なるＰＳ修飾パターンを持つＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｍＲＮＡの合成スキームを示している。図の（ｂ）は、５’－ＰＳ－ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示している。図の（ｃ）は、ＰＵＲＥシステムにおける４つのｍＲＮＡのウエスタンブロット分析結果を示している。図の（ｄ）は、（ｃ）に示すウエスタンブロットに基づいた４つのＲＮＡからの相対的な発現レベルの定量結果を示している。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を表す。Ｐ値は、対応のないｔ検定に基づいて計算した。

【0066】

図８は、異なるＰＳ修飾パターンを含むキメラＲＮＡの合成実験の結果を示す図である。図の（ａ）は、３４ｎｔ ＲＮＡ ５’－フラグメントのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析結果を示している。メインピークは５’三リン酸化された３４ｎｔ転写物に対応し、マイナーピークは５’ピロリン酸化された転写物に対応する。図の（ｂ）は、キメラＲＮＡを調製するためのライゲーション反応の６％変性ＰＡＧＥ分析結果を示している。図の（ｃ）は、分取ＰＡＧＥによる精製後のＲＮＡの分析結果を示している。ゲルは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ染色によって視覚化された。（ｃ）では、０．５ｐｍｏｌの各ＲＮＡが分析された。

【0067】

これらのキメラｍＲＮＡの翻訳活性を評価した結果、ＰＳ修飾なしのＰＯ－ｍＲＮＡ（比較例１）と比較すると、５’－ＰＳ－ｍＲＮＡ（実施例１）では２２倍となり大幅な増加を示し、３’－ＰＳ－ｍＲＮＡ（比較例２）では０．８倍となり減少を示し、ｍＲＮＡ全体にＰＳ修飾を施したＰＳ（Ａ，Ｃ）－ｍＲＮＡ（実施例２）では５．８倍となり増加を示した（図７（ｃ），図７（ｄ））。この結果は、５’末端から開始コドン付近にＰＳを導入することが、翻訳量を上げる主要な要因になることを意味する。また、ＰＳ（Ａ，Ｃ）－ｍＲＮＡの翻訳量が５’－ＰＳ－ｍＲＮＡよりも低いことを考えると、開始コドン以降３’末端までのＰＳ導入は翻訳量を減ずる効果を持つことが示唆される。ここまで得られた結果から判断すると、５’末端から開始コドン付近へのＰＳ導入は翻訳の開始を促進し翻訳産物量を増やすと判断される。

【0068】

５．実験例５：ＰＯ－ｍＲＮＡ及びＰＳ（Ａ，Ｃ）－ｍＲＮＡの二本鎖形成能及び熱力学的安定性の評価
ｍＲＮＡの二次構造形成が翻訳開始段階におけるリボソーム複合体形成へ影響することが知られている。図６及び図７に示した結果は、ＰＳ修飾導入による５’ＵＴＲ領域周辺の二次構造形成の減少が寄与する可能性を示唆する。５’ＵＴＲから開始コドンまでのｍＲＮＡ配列に二次構造が少ない場合、翻訳開始はより速い。しかし、（Ｒｐ）－ＰＳ－ＲＮＡはＰＯ－ＲＮＡと熱力学的により安定な二本鎖を形成することが報告されている。ＲＮＡ中の二本鎖形成部位で蛍光を発することが知られている、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ試薬を用いて、ＰＯ－ｍＲＮＡ及びＰＳ（Ａ，Ｃ）－ｍＲＮＡの二本鎖形成能及び熱力学的安定性を評価した。

【0069】

図９は、ＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｍＲＮＡと混合したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ試薬の蛍光対温度プロットした結果を示す図である。ＲＮＡ［０．２μＭ； ＰＯ－ｍＲＮＡ又はＰＳ（Ａ、Ｃ）－ｍＲＮＡ］は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ（４００倍希釈、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに、ＰＵＲＥシステムバッファー［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ グルタミン酸カリウム、２ｍＭ スペルミジン、１３ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）_２、１ｍＭ ＤＴＴ、２０ｍＭ クレアチンリン酸ナトリウム、０．１ｍＭ 各２０アミノ酸、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＣＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ］に混合した。温度を９５℃から２５℃に下げることで、溶液（２５μＬ）のＲＮＡをアニーリングした後、温度を２５℃から上げながら、蛍光（Ｅｘ ４５０－４９０ｎｍ、Ｅｍ ５１５－５３０ｎｍ）を、ＣＦＸ ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で２５～９５℃まで５℃ごとに記録した。

【0070】

この結果、ＰＳ（Ａ，Ｃ）－ｍＲＮＡの二次構造はＰＯ－ｍＲＮＡのそれよりわずかに安定であることが分かった。これらｍＲＮＡの物理的性質は、ＲＮＡ高次構造形成の観点では翻訳効率の上昇を説明できない。他のＲＮＡ高次構造形成又は他の因子がリボソーム開始複合体の促進に関与している可能性があり、これは将来解明しなければならない。

【0071】

６．実験例５：ＮＴＰαＳを用いた転写と翻訳の共役反応
ここまでの実験では、転写したＰＳ－ｍＲＮＡを単離・精製してから翻訳反応に用いたが、実用性を考慮し、転写・翻訳共役系においても系へのＮＴＰαＳ添加が翻訳効率を向上させうるかどうか検討することとした。ただし、ＡＴＰ及びＧＴＰはアミノアシル化反応や、開始因子２及び伸長因子Ｇのような翻訳系で機能するＧＴＰアーゼにとっての基質である。そのため、ＡＴＰαＳ，ＧＴＰαＳによる置換は翻訳反応に影響を及ぼすことが予想された。最初に、図２ａに示した鋳型ＤＮＡを用い、１塩基のＮＴＰをＮＴＰαＳで置換した転写・翻訳共役反応をＰＵＲＥシステムにより行った。得られた翻訳産物はウエスタン法により分析した（図１０（ａ））。

【0072】

図１０は、ＮＴＰαＳｓを使用したＰＵＲＥシステムでの転写／翻訳の結合反応を示す図である。図の（ａ）は、１つのＮＴＰαＳｓが置換されたＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｍＲＮＡをコードするテンプレートＤＮＡを使用した翻訳産物のウエスタンブロット分析を示している。置換されたＮＴＰαＳｓが図に示される。図の（ｂ）の左側は、ＰＵＲＥシステムでＮＴＰαＳｓを使用して翻訳を強化する戦略の図を示している。ＡＴＰαＳｓを除き、１つ以上のＮＴＰが対応するＮＴＰαＳｓに置き換えられた。（ｂ）の右側は、ＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｍＲＮＡをコードするテンプレートＤＮＡを使用した、ＡＴＰαＳｓを除く１つ以上のＮＴＰαＳｓ置換による２時間のインキュベーション後の反応のウエスタンブロット分析を示している。

【0073】

その結果、ＡＴＰαＳ，ＵＴＰαＳ及びＧＴＰαＳで置換した場合、未置換反応よりも高レベルの翻訳産物を与えたが、ＡＴＰαＳで置換すると翻訳産物が生じなかった。ＡＴＰは、ＰＵＲＥシステムにおいてアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によってＡＭＰへと加水分解される。したがって、ＡＴＰαＳでの置換はこれらの酵素反応を抑制し、その結果全翻訳反応を抑制した可能性が考えられた。対照的に、ＧＴＰは翻訳反応においていくつかのＧＴＰアーゼ酵素によってＧＤＰに加水分解されるが、ＧＴＰαＳとの置換は翻訳効率に影響を及ぼさず、ＧＴＰαＳはＧＴＰと同等の役割を果たしたと考えられた。したがって、翻訳効率に対するＡＴＰ及びＧＴＰ置換の異なる効果は、加水分解生成物（ＡＭＰ及びＧＤＰ）の間の差によって引き起こされたかもしれない。

【0074】

我々はまた、ＣＴＰαＳ、ＵＴＰαＳ及びＧＴＰαＳを使用して、２つ以上のＮＴＰαＳによる置換の効果を分析した（図１０ｂ）。未修飾ＮＴＰを用いた結果と比較した場合、全ての置換の組み合わせでより多量の翻訳産物を与えた。特に、ＵＴＰαＳ又はＣＴＰαＳによる置換が最も効果的であり、これらにおいては約３倍量の翻訳産物を与えた。ＮＴＰαＳを用いる手法は、無細胞タンパク質翻訳系においてＮＴＰと置換するだけで翻訳量を上げることができるため、有用な技術となる。

【0075】

以上、本実施例で、ＰＳのｍＲＮＡへの導入が大腸菌無細胞翻訳系のタンパク質合成量を最大２２倍まで向上させることを示した。ＰＳの導入は翻訳反応の開始段階にあたるリボソームの結合速度を速くさせることが示唆された。さらに、５’末端から開始コドン付近にＰＳを導入したｍＲＮＡが最適な分子デザインであり、開始段階を早めるのに重要であることが明らかとなった。また、ＮＴＰαＳを用いた転写・翻訳の同時反応を行った結果、未修飾ＮＴＰを用いた場合に比較し、より高い翻訳量を与えることが明らかとなった。本手法は、大腸菌無細胞翻訳系における有用な技術となりえる。

【0076】

本発明のｍＲＮＡは、原核生物の翻訳系だけでなく、真核生物の翻訳系にも適用でき、目的のタンパク質の翻訳効率を高くすることができる。また、本発明のｍＲＮＡは、目的とするタンパク質を効率的に翻訳することができるため、タンパク質の工業的な生産のみならず、ｍＲＮＡ医薬などにも有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】