(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-06
(45)【発行日】2024-08-15
(54)【発明の名称】同種組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/28 20150101AFI20240807BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240807BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240807BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240807BHJP
A61P 21/02 20060101ALI20240807BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240807BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240807BHJP
C12N 5/0775 20100101ALN20240807BHJP
【ＦＩ】
A61K35/28
A61P1/04
A61P3/10
A61P19/02
A61P21/02
A61P29/00
A61P37/06
C12N5/0775
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2022149351
(22)【出願日】2022-09-20
(62)【分割の表示】P 2020543858の分割
【原出願日】2019-02-15
(65)【公開番号】P2022180506
(43)【公開日】2022-12-06
【審査請求日】2022-09-20
(31)【優先権主張番号】18157070.6
(32)【優先日】2018-02-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】520306727
【氏名又は名称】ネクストセル ファーマ エービー
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】スバーン，マティアス ヨースタ
【審査官】西澤 龍彦
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／１３１６１８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５２２０２９（ＪＰ，Ａ）
【文献】NEKANTI, U et al.，Optimization and scale-up of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells for clinical applications，Stem Cell Research，2010年，Vol. 5，pp. 244-254
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも３の個体ドナーに由来する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を含む医薬組成物であって、いずれか１のドナー由来の細胞の数が、総細胞数の５０％を超えず、前記ＭＳＣは最大８つの継代に供されており、前記ＭＳＣ集団は、－前記少なくとも３より多い個体ドナー由来のＭＳＣを培養または提供して、少なくとも３より多い個体ドナー由来のＭＳＣ集団を得る工程と、
－少なくとも３つのアッセイを使用して各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイし、前記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団についての少なくとも３つのアッセイ結果を得る工程であって、前記少なくとも３つのアッセイは、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団の免疫抑制能力を測定する少なくとも１つのアッセイを含む、工程と、
－各アッセイについて、前記アッセイ結果に基づいて個体のランク付けスコア値を前記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当て、したがって、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団について少なくとも３つの個体ランク付けスコア値を得る工程であって、より高いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示すか、またはより低いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す、工程と、
－前記少なくとも３つの個体ランク付けスコア値に基づいて、合計スコア値を各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てる工程であって、より高いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より高い合計スコア値がより望ましい集団特性を示し、またはより低いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より低い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す、工程と、
－それらの合計スコア値に基づいて、望ましい集団特性を有する個体ドナー由来のＭＳＣ集団のサブセットを選択する工程と、
－前記選択された個体ドナー由来のＭＳＣ集団をプールして、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得る工程と、を含む方法により得られ、
前記プールされた同種ＭＳＣ集団は、前記プール工程後にさらに培養されず、
前記少なくとも３つのアッセイは、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）活性を測定する１つのアッセイ、前記ＭＳＣによって分泌されたプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖に対する前記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイを含み、前記集団が、統計的に有意なバッチ間の変動を示さず、
前記バッチ間の変動を、前記個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイするために用いられた前記少なくとも３つのアッセイの１つまたはいくつかからの結果を比較することによって定量し、
バッチ内の総合評価の変動は、アッセイされたすべての個体ドナー由来ＭＳＣ集団のアッセイ結果と、個体ドナー由来ＭＳＣ集団の選択されたサブセットのアッセイ結果と、を比較した場合、少なくとも３０％低減され、
前記医薬組成物は、前記プール工程後に、前記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団をさらに培養することなく、患者に直接投与するためのものであり、かつ
前記医薬組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤または担体を含む、
医薬組成物。
【請求項2】
前記統計的に有意なバッチ間の変動を示さないことは、２つの連続して生成されたバッチ間のことである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記統計的に有意なバッチ間の変動を示さないことは、生成されたバッチと参照バッチとの間のことであり、前記参照バッチは、前記方法により以前に生成された単離されプールされた同種ＭＳＣ集団である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
バッチ内の総合評価の変動は、アッセイされたすべての個体ドナー由来ＭＳＣ集団のアッセイ結果と、個体ドナー由来ＭＳＣ集団の選択されたサブセットのアッセイ結果と、を比較した場合、少なくとも３５％低減される、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
薬剤として使用するための、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
炎症性疾患または状態、自己免疫疾患、および移植拒絶からなる群から選択される疾患または状態の処置および／または予防に使用するための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記自己免疫疾患が、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、および関節炎からなる群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記自己免疫疾患が、１型糖尿病または成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）である、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記集団を投与される患者が、１型糖尿病またはＬＡＤＡと３年以内に診断された、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記集団を投与される患者が、Ｃ－ペプチドを発現する、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記患者が、空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度≧０．０１ｎｍｏｌ／Ｌを示す、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記使用が、患者に、少なくとも３ｘ１０６個の細胞の用量を投与することを含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記使用が、前記患者に、少なくとも３ｘ１０６個の細胞の用量を投与することを含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の投与が、患者において、抗ＨＬＡ抗体力価を誘発しないか、もしくは低い抗ＨＬＡ抗体力価を誘発する、請求項５～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の投与が、前記患者において、抗ＨＬＡ抗体力価を誘発しないか、もしくは低い抗ＨＬＡ抗体力価を誘発する、請求項９～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、間葉系幹／間質細胞の同種集団および関連する組成物であって、複数のドナーからプールされた細胞を含む集団および組成物、ならびに１型糖尿病などの疾患の処置および／または予防におけるそれらの使用に関する。本開示はまた、上記組成物を得るための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、ＣＤ１４、ＣＤ３４、およびＣＤ４５の発現を欠きながら、表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現する非造血細胞である。ポリクローナル培養として増殖させた場合、それらは自己複製および間葉の様々な形態への分化を保持する能力を有する不均一な細胞集団である（Ｄｏｍｉｎｉｃｉ，ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ８：３１５－３１７）。インビトロでは、ＭＳＣは、標準的な組織培養条件下でプラスチックに接着し、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞に分化する能力を有する必要がある。ＭＳＣは、最初に発見された骨髄だけでなく、ウォートンゼリーおよび胎盤などのほぼすべての他の形態の組織にも見出すことができる。
【0003】
ＭＳＣは、生存、血管新生、および組織修復を促進し、自然免疫および適応免疫細胞による応答を調節する能力がある（Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，（２０１０）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５９：２５５８－２５６８）。したがって、ＭＳＣの移植は、例えば自己免疫疾患、炎症性疾患および移植拒絶の分野において魅力的な治療選択肢を提供する。
【0004】
１型糖尿病（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ｔｙｐｅ １）（１型糖尿病（ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ）、Ｔ１Ｄとも称される）は、不十分なインスリンが産生される糖尿病の一種である。根本的なメカニズムには、膵臓におけるインスリン産生β細胞の自己免疫破壊が含まれる。Ｔ１Ｄの発症時に、β細胞の量は、正常レベルと比較して定期的に２０～４０％に減少している。残留インスリン分泌の維持は、ＨｂＡ１ｃの低下、より少ない血糖変動、およびケトアシドーシスのリスクの低下に寄与する上で重要である（Ｍａｄｓｂａｄ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｂｒ Ｍｅｄ Ｊ；２（６２００）：１２５７－９；Ｓｔｅｆｆｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ；２６（３）：８３２－６）。これは、重度の低血糖イベントおよび後期合併症のリスクも大幅に軽減する。同定されている成功的介入は、疾患を予防するために使用されるだけでなく、明白な高血糖となる前に進行中の疾患を有する患者にも適用され、それによって疾患の発症を予防する手段を提供する。
【0005】
残留β細胞を保全するための異なる介入戦略が試験されているが、内因性インスリン産生はせいぜい一時的にしか維持されていない。
【0006】
培養で増殖させたＭＳＣの移植を使用した最初の臨床試験が１９９５年に発表された（Ｌａｚａｒｕｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １６：５５７－５６４）。それ以来、様々な疾患の処置のためのＭＳＣを使用した多くの臨床試験が発表され、多くが進行中である。
【0007】
しかしながら、移植におけるＭＳＣの使用を制限する要因は、望ましい特性を有する細胞の大規模なバッチを得ることが難しいことである。さらに、あるドナー由来の細胞の増殖は、一般には単一のバッチの生産に使用され、次のバッチは、典型的には、別のドナー由来の細胞を使用する。したがって、バッチ間の変動は、安全性および有効性の両方にとって大きな懸念事項である。
【0008】
これらの課題により、細胞療法業界は、広範囲の試験を伴う厄介な製造プロセスを経るようになり、過剰増殖の結果として、細胞はその能力を失い、および／または高い遺伝的不安定性リスクを示し得る。さらに、細胞増殖が個別の場合に応じて行われる場合、レシピエント患者に対するＭＳＣの最適な投与量を保証することが困難であり、「何とか増殖した細胞数を患者に与える」ことが一般的な手法である。これにより、処置の結果および潜在的な有害な副作用について非常に予測不可能になる。さらに、好適なドナーを見つけるプロセスは時間がかかり、面倒であり、好適なドナーが見つかるかどうかに関して不確実となり得る。さらに、患者が、移植されたＭＳＣに対する抗体を作るリスクがある。特に、投与されたＭＳＣとＭＳＣに対する患者が作る抗体との間の用量反応関係が予想される。この効果は、複数の投与によって甚大になり得る。
【0009】
したがって、自己免疫疾患、炎症性疾患、および移植拒絶の処置および／または予防に好適なＭＳＣ集団を提供することが当該技術分野で大いに必要であり、ＭＳＣ集団はそれを必要とする患者への好適な投与量の細胞の投与を可能にする。生産は、バッチ間の変動がほとんどない堅牢な製造プロセスを保証する必要があり、すべてのバッチが複数の用量を生成する必要がある。細胞は効力があることが証明されている必要があり、同種感作および／またはドナー特異的抗体のリスクを最小限に抑えるように製剤化する必要がある。上記集団は、ドナー－レシピエント適合を必要とせずに患者にとって即時に利用可能であることがさらに望ましい。
【発明の概要】
【0010】
本開示の目的は、先行技術の欠点を克服する、炎症性疾患または状態、自己免疫疾患、および移植拒絶のための方法、薬剤、および処置を提供することである。本明細書に記載される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団による処置は、興味深い治療選択肢であることが企図される。
【0011】
したがって、本開示は、移植に好適なＭＳＣ集団をそれを必要とする患者に提供することを目的とし、その集団は、効力がある細胞を含み、統計的に有意なバッチ間の変動が低いかまたは全くなく、処置患者において低い同種免疫または同種感作をもたらす。本目的は、本明細書に記載の選択アルゴリズムを使用する開示された方法によって得られる、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団によって達成される。
【0012】
本明細書で使用する場合、「選択アルゴリズム」という用語は、以下に定義される方法の工程２～５を指し、言い換えれば、培養または提供工程およびプール工程を除いて、開示されるすべての方法工程を指す。本開示の範囲を逸脱することなく、さらなる工程が選択アルゴリズムに追加されてもよいことが理解されよう。
【0013】
したがって、本開示の第１の態様では、少なくとも３の個体ドナーに由来する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法であって、いずれか１のドナー由来の細胞の数が、総細胞数の５０％を超えず、ＭＳＣは最大８つの継代に供されており、
－少なくとも３より多い個体ドナー由来のＭＳＣを培養して、少なくとも３より多い個体ドナー由来のＭＳＣ集団を得る工程と、
－少なくとも３つのアッセイを使用して各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイし、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団についての少なくとも３つのアッセイ結果を得る工程であって、上記少なくとも３つのアッセイは、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団の免疫抑制能力を測定する少なくとも１つのアッセイを含む、工程と、
－各アッセイについて、アッセイ結果に基づいて個体のランク付けスコア値を各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当て、したがって、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団について少なくとも３つの個体ランク付けスコア値を得る工程であって、より高いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示すか、またはより低いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す、工程と、
－少なくとも３つの個体ランク付けスコア値に基づいて、合計スコア値を各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てる工程であって、より高いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より高い合計スコア値がより望ましい集団特性を示し、またはより低いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より低い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す、工程と、
－それらの合計スコア値に基づいて、望ましい集団特性を有する個体ドナー由来のＭＳＣ集団のサブセットを選択する工程と、
－上記選択された個体ドナー由来のＭＳＣ集団をプールして、単離されプールされたＭＳＣ集団を得る工程と、を含み、
上記プールされた同種ＭＳＣ集団は、プール工程の後にさらに培養されず、上記少なくとも３つのアッセイは、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）活性を測定する１つのアッセイ、上記ＭＳＣによって分泌されたプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖に対する上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイを含む、方法が提供される。
－少なくとも３より多い個体ドナー由来のＭＳＣを培養して、少なくとも３より多い個体ドナー由来のＭＳＣ集団を得る工程と、
－少なくとも３つのアッセイを使用して各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイし、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団についての少なくとも３つのアッセイ結果を得る工程であって、上記少なくとも３つのアッセイは、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団の免疫抑制能力を測定する少なくとも１つのアッセイを含む、工程と、
－各アッセイについて、アッセイ結果に基づいて個体のランク付けスコア値を各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当て、したがって、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団について少なくとも３つの個体ランク付けスコア値を得る工程であって、より高いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示すか、またはより低いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す、工程と、
－少なくとも３つの個体ランク付けスコア値に基づいて、合計スコア値を各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てる工程であって、より高いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より高い合計スコア値がより望ましい集団特性を示し、またはより低いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より低い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す、工程と、
－それらの合計スコア値に基づいて、望ましい集団特性を有する個体ドナー由来のＭＳＣ集団のサブセットを選択する工程と、
－上記選択された個体ドナー由来のＭＳＣ集団をプールして、単離されプールされたＭＳＣ集団を得る工程と、を含み、
上記プールされた同種ＭＳＣ集団は、プール工程の後にさらに培養されず、上記少なくとも３つのアッセイは、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）活性を測定する１つのアッセイ、上記ＭＳＣによって分泌されたプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖に対する上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイを含む、方法が提供される。
【0014】
本開示は、少なくとも３の個体ドナー由来の細胞を含む、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得る方法を提供し、いずれか１のドナー由来の細胞の数は総細胞数の５０％を超えず、したがって、集団が各ドナーに由来するかなりの数の細胞を含み、いずれか１のドナー由来の細胞が集団において支配的ではないことが保証される。集団が同様の数または同じ範囲の数の異なる個体ドナーに由来する細胞を含むことが有益であると考えられる。本発明者らは、本方法に従って得られた単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が低い免疫原性特性を示すと予想する。本明細書では、所望の機能を有する細胞を選択するために選択アルゴリズムを使用する。さらに、選択アルゴリズムの基準を満たす複数のドナー由来の細胞をプールすることにより、バッチ間の変動が低下する。方法はまた、選択アルゴリズムが望ましい特性を有する細胞を選択するように機能することにより、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が効力がある細胞を含むことを保証する。さらに、本明細書に記載の方法は、プール工程に起因して、細胞の大きなバッチを得ることを可能にする。特に、少ない数の継代に供された細胞の大きなバッチを得てもよい。さらに、大きなバッチにより、製造コストの削減も可能になる。対照的に、細胞がプールされない場合、特に、細胞が少ない数の継代に供される場合、細胞の大きなバッチを得ることは困難である。さらに、少ない継代数はＭＳＣの効力が高いことと関連するので、細胞が過剰な数の継代に供されないことが望ましい。明確にするために、継代培養とは、以前の培養から新鮮な増殖培地に一部またはすべての細胞を移すことによって作成された新しい細胞または微生物培養である。この作用は、細胞の継代培養または継代と称される。細胞が培養において行ったおおよその分裂数を記録するために、継代数を記録してもよい。本明細書で使用する場合、「継代」という用語は、以前の培養物から新鮮な増殖培地に細胞を移すことを指す。
【0015】
したがって、一実施形態では、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団中の上記ＭＳＣが、最大７つの継代、例えば最大６つの継代、例えば最大５つの継代、例えば最大４つの継代、例えば最大３つの継代、例えば１つ、２つ、または３つの継代、例えば２つまたは３つの継代に供されている、本明細書に開示される方法が提供される。継代数は、培養物に存在する細胞数に関連することを理解されたい。したがって、望ましい特性を有する十分な数の細胞を得るために、細胞数と効力の維持との間のバランスを保持することは有益であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、上記ＭＳＣは、２つ～６つ、例えば２つ～５つ、例えば２つ～４つ、例えば２つ～３つの継代に供されている。
【0016】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、ＣＤ１４、ＣＤ３４、およびＣＤ４５の発現なしに、表面マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現する非造血細胞である。インビトロでは、ＭＳＣは標準的な組織培養条件下でプラスチックに接着し、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞に分化する能力を有する必要がある。本明細書で使用する場合、「ＭＳＣ」、「間葉系幹細胞」、「間葉系間質細胞」、および「骨髄間質細胞」という用語は、上記の特性を有する細胞を指す。本開示は、国際細胞療法学会（ＩＳＣＴ）の基準に従ったＭＳＣの定義に準拠している。ＭＳＣは、骨髄、末梢血、脂肪組織、歯組織、胎盤、臍帯、羊水、臍帯血、ウォートンゼリー、脱落膜、軟骨膜、および羊膜に由来し得る。
【0017】
したがって、一実施形態では、上記ＭＳＣが、骨髄由来ＭＳＣ、末梢血由来ＭＳＣ、脂肪組織由来ＭＳＣ、歯組織由来ＭＳＣ、胎盤由来ＭＳＣ、臍帯由来ＭＳＣ、羊水由来ＭＳＣ、臍帯血由来ＭＳＣ、ウォートンゼリー由来ＭＳＣ、脱落膜由来ＭＳＣ、軟骨膜由来ＭＳＣ、および羊膜由来ＭＳＣからなる群から選択される、本明細書に開示される方法が提供される。特定の実施形態では、上記ＭＳＣは、胎盤由来ＭＳＣ、臍帯由来ＭＳＣ、羊水由来ＭＳＣ、臍帯血由来ＭＳＣ、ウォートンゼリー由来ＭＳＣ、脱落膜由来ＭＳＣ、軟骨膜由来ＭＳＣ、歯髄および羊膜由来ＭＳＣ、例えば、胎盤由来ＭＳＣ、臍帯由来ＭＳＣ、羊水由来ＭＳＣ、臍帯血由来ＭＳＣ、ウォートンゼリー由来ＭＳＣ、脱落膜由来ＭＳＣ、歯髄由来ＭＳＣ、および羊膜由来ＭＳＣ、例えば、胎盤由来ＭＳＣ、臍帯由来ＭＳＣ、羊水由来ＭＳＣ、臍帯血由来ＭＳＣ、ウォートンゼリー由来ＭＳＣ、歯髄由来ＭＳＣ、例えば、胎盤由来のＭＳＣ、臍帯由来のＭＳＣ、臍帯血由来のＭＳＣ、およびウォートンゼリー由来ＭＳＣ、例えば、臍帯由来のＭＳＣ、臍帯血由来のＭＳＣ、およびウォートンゼリー由来ＭＳＣからなる群から選択される。一実施形態では、上記ＭＳＣは、臍帯由来ＭＳＣまたはウォートンゼリー由来ＭＳＣ、例えば、ウォートンゼリー由来ＭＳＣである。
【0018】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、任意の同種ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の濃度が、単一のドナー由来の細胞または少数のドナー由来の細胞を使用した場合よりも低くなることを保証するために、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が、３より多いドナーに由来するＭＳＣを含むことが有益であり得る。これにより、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を投与された患者における抗ＨＬＡ抗体（すなわち、ドナー特異的抗体、ＤＳＡ）の生成のリスクが低下することが企図される。本発明者らは、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団における、低濃度の任意の特定のＨＬＡ対立遺伝子が、上記細胞の単回および複数回投与に関連する悪影響のリスクを低減すると予想する。さらに、複数のドナー由来の細胞を使用することにより、低いバッチ変動を得ることができる。製造に適格であり、かつ、大規模な臨床グレードの薬品への展開におけるすべてのＧＭＰ品質基準に合格しているドナー間におけるドナー間の変動は、すべてのドナーの結果をプールについて選択したドナーからの結果と比較した場合、最大４０％またはそれより低下する。特定のアッセイについての変動の低下は、実施例１２に示され、該実施例では、選択アルゴリズムに基づき、選択されたドナーと特定のバッチについて評価されたすべてのドナーと間において、最大４０％またはそれより多い変動の総合評価による低下が生じる。
【0019】
ＭＳＣのＧＭＰ生産により、ドナーの変動が劇的に低減し、選択アルゴリズムにより、最大４０％またはそれより多く、変動がさらに低減し、統計的有意差のないバッチ間の変動をもたらす。
【0020】
したがって、一実施形態では、上記集団は、少なくとも４の個体ドナー、例えば少なくとも５の個体ドナー、例えば少なくとも６の個体ドナー、例えば少なくとも７の個体ドナー、例えば少なくとも８の個体ドナー、例えば少なくとも９の個体ドナー、例えば少なくとも１０の個体ドナーに由来するＭＳＣを含む。別の実施形態では、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団は、３～２０の個体ドナー、例えば３～１５の個体ドナー、例えば３～１０の個体ドナー、例えば４～８の個体ドナー、例えば５～７の個体ドナー、例えば５、６、または７の個体ドナーに由来するＭＳＣを含む。特定の一実施形態では、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイする上記工程は、プール工程でプールされた個体ドナー由来のＭＳＣ集団の数よりも、少なくとも１より多く、例えば少なくとも２より多く、例えば少なくとも３より多く、例えば少なくとも４より多く、例えば少なくとも５より多く、例えば少なくとも６より多く、例えば少なくとも７より多く、例えば少なくとも８より多く、例えば少なくとも９より多く、例えば少なくとも１０より多くの個体ドナーに由来するＭＳＣ集団をアッセイすることを含む。特定の一実施形態において、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイする上記工程は、プール工程でプールされた個体ドナー由来のＭＳＣ集団の数と同じ数の個体ドナー由来のＭＳＣ集団の少なくとも１～４倍、例えば２～４倍、例えば２～３倍または３～４倍アッセイすることを含む。したがって、例えば、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が３の個体ドナー由来のＭＳＣ集団に由来するＭＳＣを含む場合、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイする工程は、３～１２、例えば、６～１２、例えば６～９、または９～１２の個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイすることを含む。この例では、３の個体ドナー由来のＭＳＣ集団のみがプールのために選択され、残りの個体ドナー由来ＭＳＣ集団は破棄される。
【0021】
本開示の一実施形態では、ＭＳＣを培養または提供する上記工程は、少なくとも４の個体ドナー由来のＭＳＣを培養または提供して、上記少なくとも４の個体ドナー由来のＭＳＣ集団、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば少なくとも９、例えば少なくとも１０、例えば少なくとも１１、例えば少なくとも１２、例えば少なくとも１３、例えば少なくとも１４など、少なくとも１５、例えば少なくとも１６、例えば少なくとも１７個、例えば少なくとも１８、例えば少なくとも１９、例えば少なくとも２０の個体ドナー由来のＭＳＣ集団を得ることを含む。例えば、約３～約５０の個体ドナー由来のＭＳＣ集団、例えば約４～約５０、例えば約５～約５０、例えば約６～約５０、例えば約６～約３０、例えば約６～約２０、例えば約６～約１５、例えば約８～約１２の個体ドナー由来のＭＳＣ集団を提供または培養してもよい。
【0022】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、上記個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイする工程は、少なくとも３、例えば少なくとも４，例えば少なくとも５，例えば少なくとも６、例えば少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば少なくとも９、例えば少なくとも１０、例えば少なくとも１１、例えば少なくとも１２、例えば少なくとも１３、例えば少なくとも１４、例えば少なくとも１５、例えば少なくとも１６、例えば少なくとも１７、例えば少なくとも１８、例えば少なくとも１９、例えば少なくとも２０の個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイすることを含む。別の実施形態では、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイする工程は、約３～約５０の個体ドナー由来のＭＳＣ集団、例えば約４～約５０、例えば約５～約５０、例えば約６～約５０、例えば約６～約３０、例えば約６～約２０、例えば約６～約１５、例えば約８～約１２の個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイすることを含む。一実施形態では、約３～約２０の個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイし、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４の個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイしてもよい。本明細書に開示される方法の本工程においてアッセイされる個体ドナー由来のＭＳＣ集団は、本方法による培養工程または提供工程で得られることを理解されたい。
【0023】
いくつかの実施形態では、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団が、各ＭＳＣ集団の特性についてより多くの情報を得るために、少なくとも１つ以上の機能的アッセイを使用してアッセイされることが有益であり得る。したがって、本明細書に開示される方法の一実施形態では、少なくとも３つのアッセイを使用して各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイする工程は、例えば少なくとも１つの機能的アッセイ、例えば少なくとも２つの機能的アッセイ、例えば少なくとも３つの機能的アッセイ、例えば少なくとも４つの機能的アッセイ、例えば少なくとも５つの機能的アッセイを使用することを含む。当業者は、上記アッセイが、ＭＳＣ集団における望ましい特性を反映するように調整されてもよいことを理解するであろう。例えば、ＭＳＣ集団が免疫抑制性であることが望ましい場合、アッセイは目的のこの特性を反映するように選択されてもよい。
【0024】
一実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイは、上記ＭＳＣの免疫抑制能力を測定する少なくとも１つのアッセイを含む。本明細書で使用する場合、「免疫抑制能力」という用語は、免疫系の活性化または効力の低下を誘発する能力を指す。当業者は、免疫抑制能力がアッセイにおいて直接的または間接的に測定され得ることを理解するであろう。
【0025】
一実施形態では、上記ＭＳＣの免疫抑制能力を測定する上記少なくとも１つのアッセイにより、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）活性が測定される。免疫抑制能力は、培養上清中のトリプトファンおよびキヌレニンを測定することにより決定されるＩＤＯ活性の測定値として報告してもよい。ＩＤＯは、ヒトにおいてＩＤＯ１遺伝子によってコードされるヘム含有酵素である。ＩＤＯ酵素は、Ｌートリプトファンを、Ｔ細胞を含む免疫細胞の増殖阻害物質として作用する免疫抑制分子であるＮーホルミルキヌレニン（またはキヌレニン）に変換する。ＩＤＯ活性は、キヌレニン／トリプトファンの比率として表してもよく、例えばＥＬＩＳＡキットを使用して細胞培養上清に存在するトリプトファンおよびキヌレニンの量を計算することにより決定することができる。インターフェロンγ（ＩＦＮγ）で刺激した場合、間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）は、刺激していない場合よりも多くのＩＤＯを分泌する。
【0026】
誘導性ＩＤＯ活性により、細胞が、本発明者らがこの方法で使用されるＭＳＣの重要な品質特性とみなす免疫調節および／または免疫抑制に関連する機能的効力を有することが示される。
【0027】
ＭＳＣが末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖に対して有する免疫抑制効果を定量的に測定することが可能である。ＭＳＣは、Ｔリンパ球の増殖を抑制することが示されている。ＭＳＣとの混合リンパ球反応は、ＭＳＣの免疫抑制活性を示すために頻繁に使用される。一実施形態では、上記ＭＳＣの免疫抑制能力を測定する上記少なくとも１つのアッセイは、Ｔリンパ球などの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖に対する上記ＭＳＣの効果を測定する。例えば、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激Ｔリンパ球の増殖などのＴリンパ球の増殖。ＰＨＡは、Ｔリンパ球の増殖を活性化する分裂促進因子として使用される。したがって、一実施形態では、上記のＰＢＭＣ増殖は、ＰＨＡ刺激Ｔリンパ球の増殖などのＴリンパ球の増殖である。ＭＳＣの免疫抑制活性は、ＰＨＡ刺激Ｔリンパ球の増殖の減少として定量化してもよい。
【0028】
さらに、ＭＳＣをアッセイして、上記ＭＳＣによって分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定してもよい。プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、酵素プロスタグランジンシンセターゼによってアラキドン酸から合成されるプロスタグランジンＨ２から様々な細胞において形成される。ＰＧＥ２には、血管増殖、抗炎症作用および炎症促進作用の両方、睡眠／覚醒サイクルの調節、ならびにヒト免疫不全ウイルス複製の促進を含む、多くの生物学的作用がある。ＰＧＥ２は、炎症、免疫調節、発熱、疼痛知覚、胃粘膜の保護、受胎能および分娩、ならびにナトリウムおよび水分貯留に活性である。ＰＧＥ２はインビボで急速に代謝され、循環系でのＰＧＥ２の半減期は約３０秒で、正常な血漿レベルは３～１２ｐｇ／ｍＬである。ＰＧＥ２は、免疫応答の様々な工程の調節と免疫の様々なエフェクターメカニズムに関与している。ＭＳＣは、ＰＧＥ２を構成的に生成し、その増殖は、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼアイソフォームの差異的活性化を介してこのプロスタグランジンによって調節される。このＰＧＥ２産生は、炎症シグナルによってその誘導が刺激される局所環境に対して感受性がある。免疫細胞との共培養中、ＭＳＣによるＰＧＥ２産生は大幅に増加し、ＭＳＣの免疫調節効果に関与する。さらに、Ｒａｓｍｕｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｒａｓｍｕｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ，３０５（１）（２００５），ｐｐ．３３－４１）によって報告されたように、ＭＳＣ誘発性免疫抑制効果におけるＰＧＥ２の役割はＴ細胞刺激に依存する。ＰＧＥ２は、アロ抗原ではなくＰＨＡによって活性化されるＴ細胞のＭＳＣ阻害に有効である。ＭＳＣは、ＣＯＸ１／ＣＯＸ２の発現および最終的にはＰＧＥ２の産生を調節することにより、リンパ球の活性化を防ぎ、Ｔ細胞の増殖阻害を誘導する。したがって、免疫抑制能力の測定値として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＭＳＣの共培養由来の細胞培養上清に見出されるＰＧＥ２分泌量を使用することができる。一実施形態では、上記ＭＳＣの免疫抑制能力を測定する上記少なくとも１つのアッセイは、上記ＭＳＣによって分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する。一実施形態では、上記ＭＳＣによって分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する上記少なくとも１つのアッセイは、ＰＢＭＣ、例えばＰＨＡ刺激ＰＢＭＣ、例えばＰＨＡ刺激Ｔリンパ球と共培養したときに上記ＭＳＣによって分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定することを含む。
【0029】
さらに別のアッセイでは、ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現を測定してもよい。ＨＬＡ－Ｇは、天然に存在する耐性誘導分子として同定されている。生理的条件下では発現が制限されるが、例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、およびＰＨＡに対する応答において上方制御され得る。ＭＳＣは、低レベルの細胞内ＨＬＡ－Ｇを有し、低レベルの可溶性ＨＬＡ－Ｇ（ｓＨＬＡ－Ｇ）を発現するが、ＩＦＮγまたはＩＬ－１０による刺激はレベルの増加をもたらすと予想される。ＰＨＡまたはＧＡＢＡによる刺激は、可溶性ＨＬＡ－Ｇレベルを増加させることが予想される。胎盤由来細胞株であるＪＥＧ－３は、細胞内および可溶性の両方について高レベルのＨＬＡ－Ｇ発現を有し、アッセイにおいて陽性対照として使用してもよい。範囲は、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析による細胞内ＨＬＡ－Ｇ発現および例えば個体ドナー由来のＭＳＣ集団間のＥＬＩＳＡによるｓＨＬＡ－Ｇの放出の両方を比較することであってもよい。
【0030】
したがって、本明細書に開示される方法の一実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイは、上記ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現を測定する少なくとも１つのアッセイをさらに含み、例えば、上記少なくとも１つのアッセイは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＰＨＡおよび／またはＧＡＢＡに応答して上記ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現を測定し、例えば、上記少なくとも１つのアッセイは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、および／またはＰＨＡに応答して上記ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現を測定する。一実施形態では、上記少なくとも１つのアッセイは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＰＨＡ、およびＧＡＢＡからなる群から選択される１つまたはいくつかに応答して上記ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現を測定する。上記ＨＬＡ－Ｇ発現は、可溶性ＨＬＡ－Ｇの発現であってもよい。
【0031】
さらに、個体ドナー由来のＭＳＣ集団は、所望の特徴を有する集団を選択するために、タンパク質発現および／またはサイトカイン発現に関して評価してもよい。例えば、上記集団におけるインターロイキン、成長因子、インターフェロン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、およびリポタンパク質の発現を評価することは関心があってもよい。したがって、本明細書に開示される方法の一実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイは、上記ＭＳＣによるタンパク質発現および／またはサイトカイン発現、例えば、インターロイキン、成長因子、インターフェロン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、およびリポタンパク質からなる群から選択される１つまたはいくつかのタンパク質またはサイトカインの発現を測定する少なくとも１つのアッセイをさらに含む。別の実施形態では、タンパク質発現および／またはサイトカイン発現を測定する上記少なくとも１つのアッセイは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２／１３、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２９、ＩＬ－３１、ＴＧＦβ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＭ－ＣＦＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、アポＥおよびＴＮＦαからなる群、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２／１３、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２９、ＩＬ－３１、ＴＧＦβ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＭ－ＣＦＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、アポＥおよびＴＮＦαからなる群、例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＴＧＦβからなる群、例えば、少なくともＩＬ－６からなる群から選択される１つまたはいくつかのタンパク質またはサイトカインの発現を測定する少なくとも１つのアッセイをさらに含む。特定の一実施形態では、上記タンパク質および／またはサイトカインのうちの少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば少なくとも５つ、例えば少なくとも６つ、例えば少なくとも７つ、例えば少なくとも８つ、例えば少なくとも９つ、例えば少なくとも１０個、例えば少なくとも１１個、例えば少なくとも１２個、例えば少なくとも１３個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個、例えば少なくとも１６個、例えば少なくとも１７個、例えば少なくとも１８個、例えば１９個すべてが測定される。さらに、当業者は、上記タンパク質および／またはサイトカインの発現が、任意の刺激の非存在下および／または少なくとも１つの刺激の存在下で測定されてもよいことを理解するであろう。一実施形態では、上記タンパク質および／またはサイトカインの発現は、少なくとも１つの刺激またはいくつかの刺激、例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の刺激の存在下で測定される。一実施形態では、上記刺激（単数または複数）は、免疫応答修飾刺激（単数または複数）である。上記免疫応答修飾刺激の非限定的な例には、ＰＢＭＣ、刺激されたＰＢＭＣ（ＰＨＡで刺激されたＰＢＭＣなど）、ＩＬ１０、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）などが含まれる。したがって、一実施形態では、上記免疫応答修飾刺激（単数または複数）は、ＰＢＭＣ、刺激されたＰＢＭＣ、ＰＨＡ、ＩＬ１０、ＧＡＢＡ、およびＩＦＮγで刺激されたＰＢＭＣからなる群から選択される。一実施形態では、上記刺激（単数または複数）は、ＧＡＢＡおよび／またはＩＦＮγである。一実施形態では、刺激（単数または複数）が、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、レシキモド（ｒ８４８）、ＧＡＢＡおよびＩＦＮγからなる群、例えば、ポリＩ：ＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される、本明細書に開示される方法が提供される。一実施形態では、上記刺激は、ＰＢＭＣ、例えば刺激または非刺激ＰＢＭＣ、例えばＰＨＡ刺激ＰＢＭＣ、例えばＰＨＡ刺激Ｔリンパ球である。一実施形態では、刺激／刺激が、ＰＨＡ刺激Ｔリンパ球および／またはＧＡＢＡである、本明細書に開示される方法が提供される。
【0032】
特定の一実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＰＨＡ刺激Ｔリンパ球および／またはＧＡＢＡによる刺激に応答して、上記ＭＳＣにおけるＩＬ－１０発現を測定することを含む。
【0033】
当業者は、アッセイされるＭＳＣ集団（複数可）の望ましい特性に応じて、目的の特定のアッセイの組み合わせを得るために上記アッセイを組み合わせてもよいと理解する。アッセイは、互いに独立して選択してもよい。
【0034】
さらに、本明細書に開示される方法によって得られる単離された同種のプールされたＭＳＣ集団を得るためにプールされる任意のＭＳＣは、正常細胞の細胞形態を有する細胞であることがさらに重要である。ＭＳＣ培養は、通常はフローサイトメトリーによって前方散乱が低く、側方散乱が低いとして同定される、急速に自己再生する小さな丸い細胞の亜集団を含むことが知られている。より高いコロニー形成能を有するドナーから単離されたＭＳＣは、顕著により高い割合のサイズの小さい細胞を有することが知られている。まとめると、高い増殖能を有するとして分類されたドナーＭＳＣは、自己再生能力がより高く、ＣＦＵ－Ｆ効率がより高く、サイズの小さい細胞の比率がより高いことが、データにより示される。細胞は、増殖（培養）中および回収直前にまたは回収に関連して視覚的に試験され、例えば細胞のサイズ、核のサイズ、細胞の形状、および細胞サイズと核サイズとの比率に基づいて評価されてもよい。したがって、本明細書に開示される方法の一実施形態では、上記少なくとも３つのアッセイは、少なくとも１つの形態学的アッセイを含む。一実施形態では、上記形態学的アッセイは、細胞および／または細胞核の形態学的特徴をアッセイする。一実施形態では、細胞および／または細胞核の上記形態学的特徴は、細胞のサイズ、核のサイズ、細胞の形状、および細胞サイズと核サイズとの比からなる群から選択される１つ以上の特徴である。
【0035】
単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が、健康で望ましい形態、別言すると、正常な形態を示す、できるだけ多くの細胞を含むことが重要である。したがって、本明細書に開示される方法の一実施形態では、個体ドナー由来のＭＳＣ集団は、少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の正常な細胞および／または核を示す場合にのみ、プールに適格である。したがって、上記個体ドナー由来のＭＳＣ集団が９０％未満の正常細胞を含む場合、上記集団はプールに適格ではない。
【0036】
少なくとも３つのアッセイを使用して、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイする上記工程は、継代０（ｐ０）～ｐ８のいずれかで行ってもよいことが理解されよう。例えば、上記アッセイは、上記個体ドナー由来のＭＳＣ集団が望ましい特性を関連する時点で示すことを保証するために、上記個体ドナー由来のＭＳＣ集団がそれらがプールされたときと同じ継代にある場合に行ってもよい。アッセイはまた、それらがプールされる継代よりも早い継代で行うことも可能である。各個体ドナー由来のＭＳＣ集団について得られたアッセイ結果を比較し得ることを保証するために、同じ継代で各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に対して特定のアッセイを行うことを条件に、異なる継代で異なるアッセイを行うことも理解される。
【0037】
したがって、本方法の一実施形態では、少なくとも３つのアッセイを使用して各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイする工程は、ＭＳＣ集団が継代０（ｐ０）～継代８（ｐ８）、例えばｐ１～ｐ５、例えばｐ１～ｐ４、例えばｐ２～ｐ４またはｐ１～ｐ４、例えばｐ１、ｐ２、および／またはｐ３、例えばｐ２および／またはｐ３である場合に行われる。一実施形態では、細胞が、プールされたときと同じ継代にある場合に、少なくとも１つのアッセイ、例えば少なくとも２つのアッセイ、例えば少なくとも３つのアッセイ、例えばすべてのアッセイが行われる。別の実施形態では、少なくとも２つのアッセイが異なる継代で行われる。
【0038】
本方法の一実施形態では、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団は、少なくとも１つの形態学的アッセイによってアッセイされる。本方法の一実施形態では、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団は、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）活性を測定する少なくとも１つのアッセイによってアッセイされる。一実施形態では、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団は、ＰＢＳＣの増殖に対する上記ＭＳＣの効果を測定する少なくとも１つのアッセイによってアッセイされる。一実施形態では、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団は、上記ＭＳＣによって分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する少なくとも１つのアッセイによってアッセイされる。
【0039】
上記方法の一実施形態では、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団は、少なくとも１つの形態学的アッセイ、ＩＤＯ活性を測定するアッセイ、およびＰＢＳＣの増殖に対する上記ＭＳＣの効果を測定するアッセイによってアッセイされる。上記方法の一実施形態では、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団は、少なくとも形態学的アッセイ、ＩＤＯ活性を測定するアッセイ、ＰＢＳＣの増殖に対する上記ＭＳＣの効果を測定するアッセイ、および上記ＭＳＣにより分泌されたプロスタグランジンＥ２を測定するアッセイによってアッセイされる。一実施形態では、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団が、上記ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現を測定するアッセイによってさらにアッセイされる、本明細書に開示される方法が提供される。一実施形態では、上記各個体ドナー由来ＭＳＣ集団が、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＦＳ、およびＴＧＦβから選択される少なくとも１つ、例えば２つ、例えば３つ、例えば４つすべての因子（複数可）の発現を測定する、少なくとも１つのアッセイ、例えば少なくとも２つのアッセイ、例えば少なくとも３つのアッセイ、例えば少なくとも４つのアッセイによってさらにアッセイされる方法を提供する。各アッセイは、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＦＳ、およびＴＧＦβのうちの１つの発現を測定してもよいことが理解されるであろう。一実施形態では、上記各個体ドナー由来ＭＳＣ集団が、上記ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現を測定するアッセイ、ならびにＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＦＳ、およびＴＧＦβから選択される少なくとも１つ、例えば２つ、例えば３つ、例えば４つすべての因子（複数可）の発現を測定する、少なくとも１つのアッセイ、例えば少なくとも２つのアッセイ、例えば少なくとも３つのアッセイ、例えば少なくとも４つのアッセイによってさらにアッセイされる方法を提供する。各アッセイは、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＦＳ、およびＴＧＦβのうちの１つの発現を測定してもよいことが理解されるであろう。
【0040】
本方法は、合計スコア値を各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てる工程を含む。この工程では、合計スコア値が、上記少なくとも３の個体のランク付けスコア値に基づいて、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てられる。より高いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より高い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す。あるいは、より低いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より低い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す。当業者は、上記システムが、望ましい特性に関して個体ドナー由来のＭＳＣ集団間の比較を可能にすることを条件に、本開示の範囲から逸脱することなく、ランク付けスコア値システムおよび／または合計スコア値システムが修正されてもよいことを理解するであろう。本明細書に開示される方法の一実施形態では、少なくとも１つのアッセイについての個体ランク付けスコア値は、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団についてのアッセイ結果と、残りの個体ドナー由来のＭＳＣ集団についての結果と、の比較に基づいて、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てられる。したがって、分析された個体ドナー由来のＭＳＣ集団間の比較に基づいて、個体ランク付けスコア値を割り当ててもよい。一実施形態では、少なくとも１つのアッセイについての個体ランク付けスコア値は、上記個体ドナー由来のＭＳＣ集団について得られた絶対アッセイ結果に基づいて、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てられる。したがって、アッセイの所望の閾値が選択されてもよい。一実施形態では、上記絶対結果が少なくとも所定の値または多くても所定の値に対応する場合、アッセイ結果が望ましいとみなされ、得られた望ましいアッセイ結果を反映する個体ランク付けスコア値が割り当てられる。
【0041】
個体ランク付けスコア値を上記少なくとも３つのアッセイのうちの１つ、２つ、３つまたはそれ以上の結果に割り当てる工程は、個体ランク付けスコア値を割り当てることを含み、その個体ランク付けスコア値は非二元的である（ｎｏｎｂｉｎａｒｙ）ことを理解されたい。非二元的スコア値は、少なくとも３つのレベル、別言すれば、少なくとも３つの異なるスコアから選択されるスコア値である。非二元的スコア値の非限定的な例は、１、２、および３；０、１、および２；ならびに１、３、および５である。非二元的ランク付けスコア値は、Ｘ、Ｙ、およびＺが異なる数である、任意の３つの数Ｘ、Ｙ、Ｚによって表してもよいことが理解されよう。非二元的スコア値の割り当てにより、二元的スコア値と比較して、アッセイ結果のランク付けのより高い解析が可能となる。したがって、本明細書に開示される方法の一実施形態では、アッセイ結果に基づいて個体ドナー由来のＭＳＣ集団に個体ランク付けスコア値を割り当てることは、少なくとも３つのランク付けスコア値、例えば少なくとも４つのランク付け、例えば少なくとも５つのランク付けスコア値から選択されるスコア値を割り当てることを含む。例えば、上記個別のランク付けスコア値は、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の可能なスコア値から選択されてもよい。当業者は、ランク付けスコア値が数値であってもよいし、または数値でなくてもよいことを理解するであろう。
【0042】
合計スコア値は、個体ドナー由来のＭＳＣ集団についてのランク付けスコア値を加算することによって得られる加算スコア値であってもよい。あるいは、合計スコア値は、１）各アッセイについてのランク付けスコア値に重みを割り当てること、および２）個体ドナー由来のＭＳＣ集団について重み付けされたランク付けスコア値を加算することによって得られる、重み付けされた合計スコア値であってもよい。このようにして、残りのアッセイ結果と比較して、相対的に高い重み（または重要度）を選択した１つまたはいくつかのアッセイ結果に割り当てることができる。当業者は、１つまたはいくつかのアッセイ結果が重み付けされてもよく、各アッセイ結果に割り当てられた重みが独立して選択されてもよいことを理解するであろう。したがって、一実施形態では、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てられた上記合計スコア値が、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団についてのランク付けスコア値の加算によって得られる加算合計スコア値である、本明細書に開示される方法が提供される。別の実施形態では、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てられた上記合計スコア値は、１）各アッセイについてのランク付けスコア値に重みを割り当てること、および２）個体ドナー由来のＭＳＣ集団についての重み付けされたランク付けスコア値を加算することによって得られる、重み付けされた合計スコア値である。
【0043】
合計スコア値に基づいて、望ましい集団特性を有する個体ドナー由来のＭＳＣ集団のサブセットが選択される。この工程では、少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば少なくとも９、例えば少なくとも１０の個体ドナー由来のＭＳＣ集団が選択されることが企図される。本明細書で使用する場合、「サブセット」という用語は、アッセイされた個体ドナー由来のＭＳＣ集団のすべてまたはすべてより少ないことを指す。
【0044】
本明細書に開示される方法の一実施形態では、望ましい集団特性を有する個体ドナー由来ＭＳＣ集団のサブセットを選択する工程が、より高い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す場合、少なくとも所定の合計スコア値に対応する合計スコア値、またはより低い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す場合、多くても所定の合計スコア値に対応する合計スコア値を有する個体ドナー由来のＭＳＣ集団を選択することを含む。別の実施形態において、望ましい集団特性を有する個体ドナー由来ＭＳＣ集団のサブセットを選択する工程は、所定の数の個体ドナー由来のＭＳＣ集団を選択することを含み、より高い合計スコア値がより望ましい集団を示す場合、上記集団が、残りの個体ドナー由来のＭＳＣ集団と比較してより高い合計スコア値を示すか、またはより低い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す場合、上記集団が、残りの個体ドナー由来のＭＳＣ集団と比較してより低い合計スコア値を示す。
【0045】
本発明の方法の次の工程では、選択された個体ドナー由来のＭＳＣ集団をプールして、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得る。上記で説明したように、１のドナー由来の細胞が上記プールされた集団において有意に支配的にならないように、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が、同様の数または同じ範囲の数の各個体ドナーに由来する細胞を含むことが有益であると考えられる。したがって、本明細書で開示される方法の一実施形態では、いずれか１のドナー由来の細胞の上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の数が、上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団における総細胞数の４５％を超えず、例えば４０％を超えず，例えば３５％を超えず、上記集団が少なくとも３のドナーに由来するＭＣＳを含み、例えば、上記集団において、いずれか１のドナー由来の細胞の上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の数が、上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団における総細胞数の４０％を超えず、例えば３５％を超えず、例えば３０％を超えず、上記集団が少なくとも４のドナー由来のＭＣＳを含み、例えば、上記集団において、いずれか１のドナー由来の細胞の上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の数が、総細胞数の３５％を超えず、例えば３０％を超えず、例えば２５％を超えず、上記集団が少なくとも５のドナー由来のＭＣＳを含み、例えば、上記集団において、いずれか１のドナー由来の細胞の上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の数が、上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団における総細胞数の３０％を超えず、例えば２５％を超えず、例えば２０％を超えず、上記集団が少なくとも６のドナー由来のＭＣＳを含み、例えば、上記集団において、いずれか１のドナー由来の細胞の上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の数が、上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団における総細胞数の２５％を超えず、例えば２２％を超えず、例えば２０％を超えず、上記集団が少なくとも７のドナー由来のＭＣＳを含み、例えば、上記集団において、いずれか１のドナー由来の細胞の上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の数が、上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団における総細胞数の２０％を超えず、例えば１８％を超えず、例えば１６％を超えず、上記集団が少なくとも８のドナー由来のＭＣＳを含み、例えば、上記集団において、いずれか１のドナー由来の細胞の上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の数が、上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団における総細胞数の１８％を超えず、例えば１５％を超えず、例えば１３％を超えず、上記集団が少なくとも９のドナー由来のＭＣＳを含み、例えば、上記集団において、４５５６６７７６１２２３３４４５５６６７７６１２または細胞の上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の数が、上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団における総細胞数の１６％を超えず、例えば１４％を超えず、例えば１２％を超えず、上記集団が少なくとも１０のドナー由来のＭＣＳを含む。上記方法の特定の一実施形態では、任意の１の個体ドナーに由来するＭＳＣの数は、他の任意のドナー由来の細胞の数の約４倍、例えば約３倍、例えば約２倍を超えない。
【0046】
個体ドナー由来のＭＳＣの所望の分布を維持するために、個体ドナー由来のＭＳＣ集団の選択されたサブセットをプールした後、ＭＣＳのさらなる培養を行わないことが理解されよう。理論に拘束されることなく、プールされた集団における個体ドナーに由来するＭＳＣの分布は、単離されプールされた同種のＭＳＣ集団を投与された患者においてＨＬＡ免疫がないかまたはＨＬＡ免疫が低いことを保証することが予想される、ＨＬＡ不適合を得るために重要であることが企図される。したがって、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団は、本方法に従ってプールした後にさらに培養されない。本態様の一実施形態では、上記集団がプール工程の後にさらに培養されない、本明細書に開示される方法が提供される。
【0047】
上記のように、上記少なくとも３つのアッセイによってアッセイされる所望の要件を満たす個体ドナー由来のＭＳＣ集団のみが、プール工程におけるプールに適格である。したがって、適格でない細胞は廃棄される。個体ドナー由来のＭＳＣ集団について得られたアッセイ結果、したがって上記細胞の特性と、以前に得られた単離されプールされた同種ＭＳＣ集団から得られるアッセイ結果であって、以前の集団が本明細書に開示される方法によって得られる、アッセイ結果と、を比較することが可能である。したがって、以前の集団は、本方法における内部品質対照として機能する。したがって、本方法の一実施形態では、方法は、上記個体ドナー由来のＭＳＣ集団のアッセイ結果が同じ方法で以前に得られたプールされた同種ＭＳＣ集団についての対応するアッセイ結果よりも望ましくない場合、プール工程から個体ドナー由来のＭＳＣ集団を廃棄する工程をさらに含む。
【0048】
重要なことに、本開示による方法は、単離されプールされた同種ＭＣＳ集団の総合評価における変動の低減をもたらす。明確にするために、バッチ内の変動は、すべてのドナーからプールされたＭＳＣを含むバッチと比較して低下する。
【0049】
例えば、評価の変動は次式で計算することができる：
式中、最大値および最小値は、取られた最大および最小アッセイ結果である。
【数1】
【0050】
総合評価は、選択したドナーについてのデルタ選択アルゴリズムスコア（この例では６－３＝３）を評価したすべてのドナーについてのデルタ選択アルゴリズムスコア（この例では６－１＝５）で除算して、計算してもよい。
【数2】
【0051】
したがって、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法の一実施形態では、バッチ内の総合評価の変動は、アッセイされたすべての個体ドナー由来ＭＳＣ集団のアッセイ結果と、個体ドナー由来ＭＳＣ集団の選択されたサブセットのアッセイ結果と、を比較した場合、少なくとも３０％、例えば少なくとも３５％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％低減される。
【0052】
本開示の第２の態様について詳細に説明されるように、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される単離されプールされた同種間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団のバッチを得ることを可能にし、該バッチは統計的に有意なバッチ間の変動を示さない。
【0053】
本開示の第２の態様では、本明細書に開示される方法により得られる単離されプールされた同種ＭＳＣ集団であって、上記集団がプール後にさらに培養されない、同種ＭＳＣ集団が提供される。さらに、一実施形態では、上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団は、統計的に有意なバッチ間の変動を示さない。本方法は、有利な特性を示す単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得ることを可能にする。細胞をプールする工程により、ＭＳＣの大きなバッチが得られることが有利であると考えられ、さらに、これは製造コストの削減を可能にする。個体ドナー由来ＭＳＣ集団をプールすることにより、上記のように細胞を少ない継代数で維持することが可能であり、それによって、得られた単離されプールされた同種ＭＳＣ集団は、高い効力および低い遺伝的不安定性リスクを示す。したがって、高い効力を有する遺伝的に安定な細胞の大きなバッチを得ることができる。さらに、本明細書に開示される方法によって得られる単離されプールされた同種ＭＳＣ集団は、使用される方法工程により、統計的に有意なバッチ間の変動を示さない。
【0054】
本明細書で使用する場合、「バッチ」という用語は、本明細書で開示される方法によって得られる単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を指す。
【0055】
本明細書で使用する場合、「バッチ間の変動」という用語は、本明細書に開示される方法によって得られる単離されプールされた同種ＭＳＣ集団と、本明細書に開示される方法によって得られる別の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団と、の間の特性の違いを指す。
【0056】
上記バッチ間の変動は、個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイするために使用された上記少なくとも３つのアッセイの１つまたはいくつかからの結果を比較することによって定量化してもよい。あるいは、１つまたはいくつかの異なるアッセイを使用してもよい。
【0057】
本明細書で使用する場合、「統計的に有意なバッチ間の変動がない」という用語は、あるバッチからのアッセイ結果と異なるバッチからのアッセイ結果との差が統計的に有意ではない（例えば、Ｐ＞０．０５の確率値を使用する）と解釈される。上記統計的有意性は、バッチ間の変動係数が、アッセイ間および／またはアッセイ内変動係数に等しいかまたはそれ以下である際に正当化され得る。当業者は、好適な統計計算に精通している。
【0058】
したがって、一実施形態では、集団が統計的に有意なバッチ間の変動を示さない、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が提供される。一実施形態において、上記統計的に有意なバッチ間の変動は、２つの連続して生成されたバッチ間ではない。一実施形態では、統計的に有意なバッチ間の変動は、任意の２つのバッチ間である。一実施形態では、上記統計的に有意なバッチ間の変動は、生成されたバッチと参照バッチとの間であり、上記参照バッチは、本明細書に開示される方法によって以前に生成された単離されプールされた同種ＭＳＣ集団である。
【0059】
一実施形態では、上記統計的に有意なバッチ間の変動は、確率値（Ｐ）＞０．０５、例えばＰ＞０．０４、例えばＰ＞０．０３、例えばＰ＞０．０２、例えばＰ＞０．０１、例えばＰ＞０．００５、例えばＰ＞０．００１に関連する。
【0060】
一実施形態では、上記バッチ間の変動は、本明細書に記載のＩＤＯアッセイ、本明細書に記載のＰＧＥ２アッセイ、および本明細書に記載の増殖アッセイからなる群から選択される少なくとも１つのアッセイ、例えば、本明細書に記載のＩＤＯアッセイ、本明細書に記載のＰＧＥ２アッセイ、および本明細書に記載の増殖アッセイからなる群から選択される少なくとも２つのアッセイ、例えば、本明細書に記載のＩＤＯアッセイ、本明細書に記載のＰＧＥ２アッセイ、および本明細書に記載の増殖アッセイからなる群から選択される少なくとも３つのアッセイからのアッセイ結果に基づいて定量化される。任に選択で、バッチ間の変動は、１つ以上の追加のアッセイに基づいて定量化してもよい。
【0061】
本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団は、所望の機能的および形態学的特性、高い効力を示し、統計的に有意なバッチごとの変動を示さず、大規模なバッチでも得ることができる。これにより、上記集団が薬剤として使用される場合、予測可能で、かつ変動が低くなる。したがって、単離されプールされた本同種ＭＳＣ集団は、標準化医療処置手順で使用してもよい。本明細書に開示される方法によって得られる単離されプールされた同種ＭＳＣ集団について、上記集団が特に製剤化および投与計画に関して薬剤として使用される場合、ロジスティクスおよび投与上の両方の利点があることが企図される。ロジスティクスチェーンは、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を極低温保存で維持することであり、これにより、従来技術による「何とか増殖した細胞数を患者に与えること」とは対照的に、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の特性が維持され、患者が薬剤として所定の細胞数を受けることを保証することが重要であると考えられる。したがって、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団は、「既製の（ｏｆｆ ｔｈｅ ｓｈｅｌｆ）」標準化医用製品として好適であり、治療効果および安全性に関する予測可能性を提供する。
【0062】
本明細書に開示される上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団は、炎症性疾患または状態、自己免疫疾患、および移植拒絶からなる群から選択される疾患または状態の処置および／または予防に有用であることが企図される。
【0063】
したがって、本開示の第３の態様では、薬剤として使用するための、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が提供される。
【0064】
理論に拘束されることなく、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団は、自然免疫および適応免疫細胞による応答を調節し、樹状細胞を未熟な状態に保ち、樹状細胞の分化を阻害し、それらの炎症性サイトカイン産生を抑制することが企図される。したがって、本発明の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団は、これにより、炎症性および自己免疫疾患または状態ならびに移植拒絶の処置および／または予防に有用であることが企図される。
【0065】
したがって、本開示の関連する第４の態様では、炎症性疾患または状態、自己免疫疾患、および移植拒絶からなる群から選択される疾患または状態の処置および／または予防に使用するための、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が提供される。
【0066】
一実施形態では、上記使用は、それを必要とする患者への注入としての上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の投与を含む。一実施形態では、上記注入は、静脈内、腹腔内もしくはリンパ内、静脈内、髄腔内、脳内、および／もしくはオンマヤリザーバーにより、動脈内または皮下投与される。一実施形態では、上記注入は、静脈内、腹腔内、またはリンパ内、例えば静脈内に投与される。
【0067】
ＭＳＣの調節特性およびＨＬＡ－ＤＲの低発現は、ＭＳＣの同種移植がドナーおよびレシピエント間のＨＬＡ適合をせずに受け入れられると想定する２つの理由である。上記注入は、患者の治療上の必要性に応じて、繰り返しまたは一度にも行ってもよいことが企図される。理論に拘束されることなく、１回の注入または反復注入による上記投与は、処置される患者において臨床的に関連するレベルの抗ＨＬＡ抗体をもたらさないことが企図される。したがって、上記患者は、本明細書に記載されるいくつかの注入処置に適格であるか、または移植を必要とする場合に移植を受けることに適格であるであろう。したがって、一実施形態では、上記注入は１回のみ行われる。別の実施形態では、上記注入は繰り返し行われる。例えば、上記注入は、２回、３回、４回またはそれ以上行われてもよい。
【0068】
したがって、一実施形態では、上記投与は、上記患者において抗ＨＬＡ抗体力価を誘発しないか、または低い抗ＨＬＡ抗体力価を誘発する。本明細書で使用する場合、「抗ＨＬＡ抗体力価が低いかまたはない」という用語は、臨床的に重要ではないとみなされる力価を指す。固相多重技術による抗体分析により、ＨＬＡ抗体の幅および強さをより正確に定義できることが可能となっている。これらの結果を実際の細胞に基づく交差適合によって得られる結果および最終的な移植結果と相関させることにより、臨床的に関連する抗体をセンター固有の様式で定義することができる（Ｚａｃｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ ｄａｔａ ｆｏｒ ａ ｖｉｒｔｕａｌ ｃｒｏｓｓｍａｔｃｈ．Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００９；７０：５７４－５７９）。当業者は、臨床的に重要ではない抗ＨＬＡ抗体力価が、ドナー特異的抗体についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）が１０００よりも高い、ＤＳＡ ＭＦＩ＞１０００である、ＬＡＢＳｃｒｅｅｎ単一抗原ビーズ試験によって定義されてもよいことを理解するであろう。
【0069】
上記のように、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団は、炎症性疾患または状態、自己免疫疾患、および移植拒絶からなる群から選択される疾患または状態の処置および／または予防に有用であることが企図される。
【0070】
炎症性疾患または状態の非限定的な例には、尋常性座瘡、喘息、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、大腸炎、憩室炎、糸球体腎炎、化膿性汗腺炎、炎症性腸疾患、間質性膀胱炎、骨盤内炎症性疾患、再灌流障害、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植片拒絶、ＩＩ型糖尿病、および血管炎が含まれる。自己免疫疾患または状態の非限定的な例には、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、自閉症、全身性自己免疫疾患、例えば、ＳＬＥ、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、強皮症、関節リウマチ、クリオグロブリン血症性血管炎、および皮膚筋炎；および特定の臓器または組織に影響を与える局所自己免疫疾患／症候群または状態、例えば、内分泌自己免疫疾患または状態、例えば、１型糖尿病、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）、橋本甲状腺炎、およびアジソン病；消化管自己免疫疾患または状態、例えば、セリアック病、クローン病および悪性貧血；皮膚自己免疫疾患または状態、例えば、尋常性天疱瘡および白斑；血液学的自己免疫疾患または状態、例えば、自己免疫性溶血性貧血および特発性血小板減少性紫斑病；ならびに神経学的自己免疫疾患または状態、例えば、多発性硬化症、重症筋無力症、および脳炎が含まれる。単離されプールされた本同種ＭＳＣ集団の投与が有用であり得る移植拒絶疾患または状態の非限定的な例には、移植片対宿主病、臓器移植、造血幹細胞移植、細胞移植、および膵島移植が含まれる。当業者は、単離されプールされた本同種ＭＳＣ集団の投与が、上記の疾患および状態のいずれかに関連する処置および／または予防アプローチとして有用であり得ることを理解するであろう。
【0071】
特定の実施形態では、本明細書に開示される使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が提供され、上記炎症性疾患または状態は自己免疫疾患からなる群から選択される。
【0072】
特定の実施形態では、本明細書に開示される使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が提供され、上記疾患または状態は、移植拒絶、例えば、細胞、組織、器官、または移植片（ｉｍｐｌａｎｔ）を含む任意の種類の移植拒絶である。一実施形態では、上記移植拒絶は、臓器移植拒絶または膵島移植拒絶であってもよい。一実施形態では、上記臓器は、腎臓、肝臓、肺、および心臓からなる群から選択される。一実施形態では、上記移植は、腎臓移植である。一実施形態では、上記移植拒絶は、膵島移植拒絶である。
【0073】
特定の実施形態では、本明細書に開示される使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が提供され、自己免疫疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、および関節炎からなる群から選択される。一実施形態では、上記自己免疫疾患は、ＡＬＳまたは炎症性腸疾患である。特定の一実施形態では、上記自己免疫疾患は、１型糖尿病またはＬＡＤＡである。単離され隔離された本同種ＭＳＣ集団は、ＬＡＤＡ患者、最近診断された１型糖尿病の症例、および少なくともいくつかの残留内因性インスリン産生を有する長年にわたる１型糖尿病患者の予防および処置に特に有用であることが企図される。理論に拘束されることなく、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の免疫抑制特性は、膵臓におけるインスリン産生β細胞の自己免疫破壊を減速させるまたは妨げることが企図される。上記の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を少なくともいくらかの内因性インスリン産生を有する患者に投与することが有益であり得る。
【0074】
したがって、一実施形態では、上記１型糖尿病またはＬＡＤＡが、最近診断された１型糖尿病またはＬＡＤＡ、例えば注入の投与前の３年以内、例えば２年以内、例えば１年以内、例えば注入の投与前の６ヶ月以内、例えば注入の投与前の５、４、３、２、または１ヶ月以内に診断された１型糖尿病またはＬＡＤＡである、本明細書に記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が提供される。最近診断された１型糖尿病患者は、少なくともいくつかの内因性インスリン産生を示し、したがってインスリンのＡ鎖をプロインスリン分子のＢ鎖に結合する短い３１アミノ酸のポリペプチドであるＣペプチドを発現することが予想される。
【0075】
一実施形態では、上記患者は、１型糖尿病またはＬＡＤＡの臨床症状を最近示し始め、例えば上記注入の投与前の３年以内、例えば２年以内、例えば１年以内、例えば注入の投与前の６ヶ月以内、例えば注入の投与前の５、４、３、２、または１ヶ月以内に１型糖尿病またはＬＡＤＡの臨床症状を示し始めた、本明細書に記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が提供される。
【0076】
一実施形態では、上記患者がＣペプチドを発現する、本明細書に開示される使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が提供される。一実施形態では、上記患者は、空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度≧０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ、例えば≧０．０４ｎｍｏｌ／Ｌ、例えば≧０．０８ｎｍｏｌ／Ｌ、例えば≧０．１２ｎｍｏｌ／Ｌを示す。
【0077】
一実施形態では、上記処置および／または予防は、未処置の患者と比較して、処置された患者における血漿Ｃ－ペプチド濃度のより低い減少率をもたらし、例えば、未処置の患者と比較して、処置された患者における、食事負荷試験（ＭＭＴＴ）によって測定される刺激された血漿Ｃ－ペプチドのより低い減少率をもたらす。一実施形態では、注入を受けた患者における血漿Ｃ－ペプチド濃度の上記減少率は、未処置の患者よりも少なくとも１０％より低く、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％より低い。別の実施形態では、上記処置および／または予防は、投与前の空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度と比較して、患者における空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度の増加をもたらす。空腹時または刺激された血漿Ｃ－ペプチド濃度の上記増加は、例えば、処置後３ヶ月、６ヶ月、または１年で測定されてもよい。一実施形態では、ＨｂＡ１ｃレベルを７未満に維持しながら、上記処置および／または予防は、投与前の体重１ｋｇあたりのインスリン必要量と比較して、上記患者の体重１ｋｇあたりのインスリン必要量の減少をもたらす。一実施形態では、上記処置および／または予防は、投与前の体重１ｋｇあたりのインスリン必要量と比較して、上記患者の体重１ｋｇあたりのインスリン必要量の減少をもたらす。例えば、体重１ｋｇあたりのインスリン必要量の上記減少は、処置後３ヶ月、６ヶ月、または１年で測定されてもよい。一実施形態では、上記処置および／または予防は、上記患者におけるインスリン非依存性をもたらし（ＡＤＡ基準に従う）、これは、例えば、処置後３ヶ月、６ヶ月、または１年で測定されてもよい。一実施形態では、上記処置および／または予防は、投与前の毎日のインスリン必要量と比較して、上記患者における毎日のインスリン必要量の減少をもたらす。例えば、上記減少は、例えば処置後３か月、６か月、または１年後に測定した際に、処置された患者において１日あたりインスリン必要量＜０．５０Ｕ／ｋｇ体重、例えば１日あたりインスリン必要量＜０．４０Ｕ／ｋｇ体重、例えば１日あたりインスリン必要量＜０．３０Ｕ／ｋｇ体重、例えば１日あたりインスリン必要量＜０．２５Ｕ体重をもたらし得る。明細書に記載される単離されプールされた本同種ＭＳＣ集団は、治療上有効な用量で投与される。一実施形態では、上記使用が、上記患者に、少なくとも約３ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約２０ｘ１０６個の細胞、少なくとも約２５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約５０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約７５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１００ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１２５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１５０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１７５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約２００ｘ１０６個の細胞の用量を投与することを含む、本明細書に開示される使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が提供される。一実施形態では、上記使用が、上記患者に、少なくとも約０，１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも約０．５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも約１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも約５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも約１０ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量を投与することを含む。１つの実施形態において、上記使用が、上記患者に、約０．１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約１０ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば約０．２５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば約０．２５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば約０．５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば約１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば約１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約３ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば約２ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約３ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、または約１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約２ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量を投与することを含む。
【0078】
上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団は、医薬組成物として有用であることが企図される。
【0079】
したがって、本開示の関連する第５の態様では、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団、および少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤または担体を含む、医薬組成物が提供される。上記医薬組成物は、例えば、炎症性疾患または状態、自己免疫疾患、および移植拒絶からなる群から選択される疾患または状態の処置のための薬剤として有用であり得る。医薬組成物は、簡潔にするために疾患または状態をここで繰り返さないが、本開示の第４の態様に関連して列挙された疾患または状態のうちのいずれか１つの処置および／または予防に有用であり得ることが理解されるであろう。一の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約３ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約２０ｘ１０６個の細胞、少なくとも約２５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約５０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約７５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１００ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１２５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１５０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１７５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約２００ｘ１０６個の細胞を含む。したがって、上記組成物の１回の投与量は、上記に述べた細胞数を含む。
【0080】
一実施形態では、上記医薬組成物は、注入、例えば静脈内注入、腹腔内注入、リンパ内注入、静脈内注入、髄腔内注入、脳内注入、動脈内注入、皮下注入、またはオンマヤリザーバーによる注入用に製剤化される。一実施形態では、上記医薬組成物は、静脈内、腹腔内、またはリンパ内注入用に製剤化される。
【0081】
関連する第６の態様では、炎症性疾患または状態、自己免疫疾患、および移植拒絶からなる群から選択される疾患または状態の処置および／または予防のための方法であって、治療有効量の、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団または本明細書に開示される医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法が提供される。当業者は、本開示の第４の態様に関連して述べられた任意の実施形態が、本発明の処置および／または予防方法に等しく適用可能であることを理解するであろう。簡潔にするために、上記実施形態をここでは繰り返さないか、または簡単に述べるにとどめる。上記方法の一実施形態では、上記ＭＳＣ集団の投与は、注入、例えば、静脈内注入、腹腔内注入、リンパ内注入、静脈内注入、髄腔内注入、脳内注入、動脈内注入、皮下注入、またはオンマヤリザーバーによる注入による。上記方法の一実施形態では、投与は、静脈内、腹腔内、またはリンパ内注入による。
【0082】
一実施形態では、上記注入は繰り返し行われる。別の実施形態では、上記注入は１回のみ行われる。本明細書に開示される処置および／または予防のための方法の一実施形態では、上記投与は、患者において抗ＨＬＡ抗体力価を誘発しないか、または低い抗ＨＬＡ抗体力価を誘発する。一実施形態では、上記疾患または状態は、移植拒絶、例えば、細胞、組織、器官または移植片を含む任意の種類の移植の拒絶である。一実施形態では、上記移植拒絶は、臓器移植拒絶または膵島移植拒絶であってもよい。一実施形態では、上記器官は、腎臓、肝臓、肺、および心臓からなる群から選択される。一実施形態では、上記移植は、腎臓移植である。一実施形態では、上記移植拒絶は、膵島移植拒絶である。一実施形態では、上記炎症性疾患または状態は、自己免疫疾患からなる群から選択される。別の実施形態では、上記自己免疫疾患は、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、および関節炎、例えば１型糖尿病またはＬＡＤＡからなる群から選択される。一実施形態では、上記自己免疫疾患は、ＡＬＳまたは炎症性腸疾患である。一実施形態では、上記１型糖尿病が、最近診断された１型糖尿病またはＬＡＤＡ、例えば投与前の３年以内、例えば２年以内、例えば１年以内、例えば注入の投与前の６ヶ月以内、例えば注入の投与前の５、４、３、２、または１ヶ月以内に診断された１型糖尿病またはＬＡＤＡである。一実施形態では、上記患者は、Ｃペプチドを発現する。特定の実施形態において、上記患者は、空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度≧約０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ、例えば≧約０．０４ｎｍｏｌ／Ｌ、例えば≧約０．０８ｎｍｏｌ／Ｌ、例えば≧約０．１２ｎｍｏｌ／Ｌを示す。
【0083】
本明細書に開示される方法の一実施形態では、上記患者は、１型糖尿病またはＬＡＤＡの臨床症状を最近示し始め、例えば上記注入の投与前の３年以内、例えば２年以内、例えば１年以内、例えば注入の投与前の６ヶ月以内、例えば注入の投与前の５、４、３、２、または１ヶ月以内に１型糖尿病またはＬＡＤＡの臨床症状を示し始めた。
【0084】
一実施形態において、上記処置および／または予防は、未処置の患者と比較して、注入を受けた患者における血漿Ｃ－ペプチド濃度のより低い減少率をもたらす。一実施形態では、注入を受けた患者における血漿Ｃ－ペプチド濃度の上記減少率は、未処置の患者よりも少なくとも約１０％より低く、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも５０％より低い。別の実施形態では、上記処置および／または予防は、上記投与前の空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度と比較して、患者における空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度の増加をもたらす。例えば、空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度の上記増加は、処置後約３ヶ月、約６ヶ月、または約１年で測定されてもよい。一実施形態では、上記処置および／または予防は、投与前の体重１ｋｇあたりのインスリン必要量と比較して、上記患者の体重１ｋｇあたりのインスリン必要量の減少をもたらす。例えば、体重１ｋｇ当たりのインスリン必要量の上記減少は、処置後約３ヶ月、約６ヶ月、または約１年で測定されてもよい。一実施形態では、上記処置および／または予防は、上記患者におけるインスリン非依存性をもたらし（ＡＤＡ基準に従う）、これは、例えば、処置後３ヶ月、６ヶ月、または１年で測定されてもよい。一実施形態では、上記処置および／または予防は、投与前の毎日のインスリン必要量と比較して、上記患者における毎日のインスリン必要量の減少をもたらす。例えば、上記減少は、例えば処置後３か月、６か月、または１年後に測定した際に、処置された患者において１日あたりインスリン必要量＜約０．５０Ｕ／ｋｇ体重、例えば１日あたりインスリン必要量＜約０．４０Ｕ／ｋｇ体重、例えば１日あたりインスリン必要量＜約０．３０Ｕ／ｋｇ体重、例えば１日あたりインスリン必要量＜約０．２５Ｕ体重をもたらし得る。
【0085】
一実施形態では、上記方法は、上記患者に、少なくとも約３ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約２０ｘ１０６個の細胞、少なくとも約２５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約５０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約７５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１００ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１２５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１５０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１７５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約２００ｘ１０６個の細胞の用量を投与することを含む。一実施形態では、上記方法は、上記患者に、少なくとも約０．１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも約０．５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも約１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも約５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも約１０ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量を上記患者に投与することを含む。一実施形態では、上記方法は、上記患者に、約０．１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約１０ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば約０．２５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば約０．２５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば約０．５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば約１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約４ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば約１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約３ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば約２ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約３ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、または約１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～約２ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量を投与することを含む。
【0086】
本開示のさらに別の態様では、炎症性疾患または状態、自己免疫疾患、および移植拒絶からなる群から選択される疾患または状態の処置のための薬剤の製造における、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の使用が提供される。
【0087】
本開示の別の態様では、ＭＳＣ集団の効力を評価するための方法であって、
ＭＳＣ集団の培養または提供する工程と、
少なくとも３つのアッセイを使用して上記ＭＳＣ集団をアッセイして、少なくとも３つのアッセイ結果を得る工程と、
各アッセイについて、アッセイ結果に基づいて上記ＭＳＣ集団にスコア値を割り当てる工程であって、より高いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示すか、または低いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す、工程と、
各アッセイに割り当てられたスコア値に基づいて、合計スコア値を上記ＭＳＣ集団に割り当てる工程であって、より高いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より高い合計スコア値がより望ましい集団特性を示し、またはより低いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より低い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す、工程と、
より高いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合において、上記合計スコア値が所定の閾値を超える場合にＭＳＣ集団を効力があるとして適格とするか、またはより低いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合において、上記合計スコア値が所定の閾値を下回る場合にＭＳＣ集団を効力があるとして適格とする、工程と、を含む、方法を提供する。上記方法の一実施形態では、方法は、本明細書で定義される少なくとも３つのアッセイを使用する。
ＭＳＣ集団の培養または提供する工程と、
少なくとも３つのアッセイを使用して上記ＭＳＣ集団をアッセイして、少なくとも３つのアッセイ結果を得る工程と、
各アッセイについて、アッセイ結果に基づいて上記ＭＳＣ集団にスコア値を割り当てる工程であって、より高いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示すか、または低いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す、工程と、
各アッセイに割り当てられたスコア値に基づいて、合計スコア値を上記ＭＳＣ集団に割り当てる工程であって、より高いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より高い合計スコア値がより望ましい集団特性を示し、またはより低いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より低い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す、工程と、
より高いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合において、上記合計スコア値が所定の閾値を超える場合にＭＳＣ集団を効力があるとして適格とするか、またはより低いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合において、上記合計スコア値が所定の閾値を下回る場合にＭＳＣ集団を効力があるとして適格とする、工程と、を含む、方法を提供する。上記方法の一実施形態では、方法は、本明細書で定義される少なくとも３つのアッセイを使用する。
【0088】
単離されプールされた同種ＭＳＣ集団は、エクスビボ療法で使用されるための細胞の培養にさらに有用であってもよく、例えば、ＭＳＣ集団は、フィーダー細胞として、または目的の因子もしくはシグナルを提供するために使用されてもよい。したがって、本開示のさらに別の態様では、免疫細胞の共培養のための、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の使用が提供される。例えば、上記ＭＳＣ集団は、例えば、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、リンパ球（Ｂ細胞またはＴ細胞など）、単球およびマスト細胞であるがこれらに限定されない、免疫細胞のエクスビボ増殖および／または刺激のための培養におけるフィーダー細胞として使用されてもよい。上記ＭＳＣ集団は、エキソソーム産生細胞および／またはパラクリン因子産生細胞として、および／または培養でのＭＳＣおよび免疫細胞間の細胞間刺激のために使用されてもよい。一実施形態では、免疫細胞の共培養のためのフィーダー細胞としての、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の使用が提供される。一実施形態では、上記集団と共培養された免疫細胞を刺激するための、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の使用が提供される。本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団と共培養された上記免疫細胞は、治療において有用であることが企図される。
【0089】
本発明を様々な例示的な態様および実施形態を参照して説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行ってもよく、同等物にその要素の代わりに置き換えてもよいことが当業者には理解されよう。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況、ＭＳＣ集団または組成物を本発明の教示に適合させるために、多くの修正を行ってもよい。したがって、本発明は、企図されるいかなる特定の実施形態にも限定されず、本発明は、付随する特許請求の範囲に含まれるすべての実施形態を含むことが意図される。本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【0090】
【図1】本開示による単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の製造プロセスを示すフローチャートである。
【図2】実施例２に記載された増殖アッセイの結果を示す。７２時間のインキュベーション後の末梢血単球におけるＣＦＳＥ蛍光強度のヒストグラム。各ピークは世代（１０＾３においてＧ０）を表す。パネルＡ：ＰＨＡで刺激されたＰＢＭＣ。パネルＢ：ＭＳＣと共培養された、ＰＨＡで刺激されたＰＢＭＣ。パネルＣ：パネルＡおよびＢの重ね合わせ。
【図3A-3B】実施例４によるＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイの結果を示す。個体ドナー由来の細胞が、９６ウェルＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイプレートに播種されている。細胞は、刺激されていないか、または示されているｒ４８４、ポリＩ：Ｃ、ＧＡＢＡ、ＩＦＮγで刺激する。図３Ａ：１番目および２番目の四分円は、それぞれＩＬ－６およびＩＬ－８の発現について分析した番号３のドナー由来の細胞を含む。３番目および４番目の四分円は、それぞれＩＬ－６およびＩＬ－８の発現について分析した番号５のドナー由来の細胞を含む。図３Ｂ：１番目および２番目の四分円は、それぞれＩＬ－１３およびＴＧＦβの発現について分析した番号３のドナー由来の細胞を含む。３番目および４番目の四分円は、それぞれＩＬ－１３およびＴＧＦβの発現について分析した番号５のドナー由来の細胞を含む。
【図4】選択された個体ドナー由来のＭＳＣ集団のＩＤＯ倍数誘導、増殖指数、およびＰＧＥ２アッセイ結果、ならびに本明細書に開示される選択アルゴリズムによる、分析されたすべての細胞のスコアおよび選択されたスコアの総合評価の変動の変動分析図である。標準分布が示され、灰色のボックスは選択されたドナーを示す。パネルに示されているように、特定のアッセイについての分析結果の変動は、最も所望する特性を有するドナーのみを選択することによって低下する。変動の低下は、ＩＤＯ倍数誘導での５３％から増殖指数での１４％の範囲であった。ドナーの変動の低下は、総合評価、すなわち、選択アルゴリズムの結果に反映され、本例では変動が４０％低下する。
【実施例】
【0091】
本非限定的な実施例は、細胞の特徴付け、適切なドナー由来の細胞集団の選択、および上記組成物を得るために上記ドナー由来の細胞集団をプールすることを含む、インビトロ増殖間葉系間質細胞の本発明のプールされた同種間ＭＳＣ組成物の生成について記載する。実施例１～６は、本発明のプールされた同種ＭＳＣ組成物を得るプロセスについて記載する。実施例７～１０は、１型糖尿病の処置および／または予防のため、特に、１型糖尿病と診断された患者における内因性インスリン産生を維持するために、プールされた同種ＭＳＣ組成物を使用する臨床研究について記載する。
【0092】
実施例の項目で使用する場合、以下の用語は以下で説明される意味を有する：
マスターセルストック（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｓｔｏｃｋ）－特定の継代での原薬中間体を定義するために使用される用語。本明細書に示す例では、マスターセルストックは継代１での原薬中間体である。
原薬中間体－産生中、したがって増殖している単一ドナー由来のＭＳＣを定義するために使用される用語。プロセス品質基準を満たしているが、選択アルゴリズムで未だ評価されていない。原薬中間体は、本明細書に開示される個体ドナー由来のＭＳＣ集団であって、プールすることについて未だ選択されていない個体ドナー由来のＭＳＣ集団に対応する。
原薬－製造品質基準を満たし、選択アルゴリズムによって所望の特性を有すると同定された単一ドナー由来のＭＳＣを定義するために使用される用語。したがって、さらなる培養および増殖には供しない。したがって、原薬は、本明細書に開示される個体ドナー由来のＭＳＣ集団であって、プールすることについて選択されている個体ドナー由来のＭＳＣ集団に対応する。
薬品－薬品という用語は、選択アルゴリズムによって所望の特性を有すると同定された複数のドナー由来のエクスビボで増殖されたウォートンゼリー由来間葉系幹細胞（ＷＪＭＳＣ）の細胞懸濁液を指す。薬品は、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団に対応する。
最終製品－「最終製品」という用語は、薬品および少なくとも１つの製薬上許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物を指す。
マスターセルストック（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｓｔｏｃｋ）－特定の継代での原薬中間体を定義するために使用される用語。本明細書に示す例では、マスターセルストックは継代１での原薬中間体である。
原薬中間体－産生中、したがって増殖している単一ドナー由来のＭＳＣを定義するために使用される用語。プロセス品質基準を満たしているが、選択アルゴリズムで未だ評価されていない。原薬中間体は、本明細書に開示される個体ドナー由来のＭＳＣ集団であって、プールすることについて未だ選択されていない個体ドナー由来のＭＳＣ集団に対応する。
原薬－製造品質基準を満たし、選択アルゴリズムによって所望の特性を有すると同定された単一ドナー由来のＭＳＣを定義するために使用される用語。したがって、さらなる培養および増殖には供しない。したがって、原薬は、本明細書に開示される個体ドナー由来のＭＳＣ集団であって、プールすることについて選択されている個体ドナー由来のＭＳＣ集団に対応する。
薬品－薬品という用語は、選択アルゴリズムによって所望の特性を有すると同定された複数のドナー由来のエクスビボで増殖されたウォートンゼリー由来間葉系幹細胞（ＷＪＭＳＣ）の細胞懸濁液を指す。薬品は、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団に対応する。
最終製品－「最終製品」という用語は、薬品および少なくとも１つの製薬上許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物を指す。
【0093】
実施例１
本実施例は、ウォートンゼリー由来ＭＳＣの回収、輸送、エクスビボ増殖、および凍結保存のプロセスについて記載する。さらに、母性血液を感染因子について試験する。さらに、培養条件についても記載する。
本実施例は、ウォートンゼリー由来ＭＳＣの回収、輸送、エクスビボ増殖、および凍結保存のプロセスについて記載する。さらに、母性血液を感染因子について試験する。さらに、培養条件についても記載する。
【0094】
材料および方法
ウォートンゼリー由来ＭＳＣのマスターセルストックの製造は、ドナー適格性およびその後のゼノフリー培養システムにおけるエクスビボ増殖からの継続的プロセスである。
ウォートンゼリー由来ＭＳＣのマスターセルストックの製造は、ドナー適格性およびその後のゼノフリー培養システムにおけるエクスビボ増殖からの継続的プロセスである。
【0095】
臍帯（ＵＣ）試料は、自然分娩後ならびに胎盤娩出および臍帯血採取（感染因子スクリーニングのため）後の帝王切開後に採取される。母体の末梢血試料も採取される。
【0096】
汚染のリスクを最小限に抑えるために、使い捨て可能な無菌ハサミおよび鉗子を使用し、臍帯の断片を、１％抗生物質／抗真菌薬溶液（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５２４０－０６２）を補充した輸送液（９９％塩化ナトリウム（０．９％溶液）（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓカタログ番号ＰＫ０３ＸＥ０５０ＰＬ）で満たした無菌輸送容器に入れる。試料は、保護ボックス内に入れて製造元の研究所に輸送される。輸送状態が監視され、ＵＣ組織が出産後７２時間以内に処理される。ウォートンゼリー組織の単離および細胞単離のための外植片の培養を、ＧＭＰ実験室においてゼノフリー無血清培地および化合物を使用して行う。
【0097】
原材料としてのＵＣ組織の適格性には、医療用アンケートへの完全な回答、および感染因子試験のためのＵＣ採取の７日以内に採取した母体末梢血試料の提出が必要である。ドナーのサンプリング、試験、スクリーニング（医療健康アンケート）は、指令２００６／１７／ＥＣの付録ＩＩに準拠している。すべてのドナー試験キットは、意図する使用について検証される。臍帯適格性の前に行われる感染因子試験を表１に列挙する。採取された試料の約１０～２５％は、さらなる生産の適格がある。
【表1】
【0098】
製造元の研究所に到着したら、ＵＣ断片を輸送容器から取り出し、無菌輸送液中で洗浄する。ＵＣを切片化し、血管を取り出す。ウォートンゼリー組織を、滅菌ランセットを使用して１～２ｍｍ３の細片に細かく切り刻み、一次外植片培養用の接着用溶液（Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１％ＭＳＣ接着用溶液ストック９９％Ｄ－ＰＢＳ）でコーティングされた培養フラスコ中のゼノフリー無血清培地中に入れる。フラスコを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。１～２週間後、接着した線維芽細胞様細胞の存在について培養を調べる。培養中のすべての非接着細胞存在物を洗い流す。細胞培養培地は、９４％ ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ＸＦ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号０５－２００－１Ａ）、５％ ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ＸＦ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号０５－２０１－１Ｕ）、および１％抗生物質／抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５２４０－０６２）を含む。初代由来の接着細胞は、９０％コンフルエンスに達したときに継代され（培養の制御された酵素消化）、ｐ．１培養でのさらなる増殖のために１～１．５ｘ１０５／ｃｍ２で再播種される。２～３週間増殖させた後、マスターセルストック（継代１の接着細胞）を回収し、
（ｉ）液体窒素保存の気相のための凍結保護溶液（７０～８０％ヒト血清アルブミン（５％溶液）（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇカタログ番号Ａｌｂｕｒｅｘ５）および２０～３０％ジメチルスルホキシド（ＷＡＫ Ｃｈｅｍｉｅ，カタログ番号ＷＡＫ－ＤＭＳＯ－５０））の存在下で凍結保存し、
（ｉｉ）さらなる増殖のために直ちに再播種する。
（ｉ）液体窒素保存の気相のための凍結保護溶液（７０～８０％ヒト血清アルブミン（５％溶液）（ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇカタログ番号Ａｌｂｕｒｅｘ５）および２０～３０％ジメチルスルホキシド（ＷＡＫ Ｃｈｅｍｉｅ，カタログ番号ＷＡＫ－ＤＭＳＯ－５０））の存在下で凍結保存し、
（ｉｉ）さらなる増殖のために直ちに再播種する。
【0099】
【0100】
臍帯組織採取からの薬品リリースまでの製造プロセスで使用される動物由来原材料はない。
【0101】
外植片の初代培養中およびマスターセルストックの各細胞継代の製造終了時に、試料を採取して、細菌および真菌汚染、マイコプラズマ、ならびにエンドトキシンの存在を確認する。細胞数および生存率は、マスターセルストックおよび薬品において評価される。微生物培養、マイコプラズマ、およびエンドトキシンは、最終製品から評価される。さらに、薬品の１つの参照試料を解凍し、試験細胞培養を確立する。この試験培養は、製品の安全純度（微生物培養、ならびにマイコプラズマおよびエンドトキシン試験、核型などによる）、効力（細胞数、接着効率、および生存率）、ならびに同一性（サイトメトリー免疫表現型解析）の追加の最終確認のための材料の供給源として機能する。表３に列挙される承認基準を満たす培養物は、処理または凍結保存の次の工程に適格であり、培養物の評価のための分析手順は、実施例２で説明される。
【0102】
結果
製造元により、自然分娩後に得られた臍帯に由来するＷＪＭＳＣの微生物学的安全性が実証された。次の製造工程中での輸送液への抗生物質／抗真菌溶液の添加により、マスターセルストックおよび薬品中に微生物（細菌および真菌）が存在しなくなった。
製造元により、自然分娩後に得られた臍帯に由来するＷＪＭＳＣの微生物学的安全性が実証された。次の製造工程中での輸送液への抗生物質／抗真菌溶液の添加により、マスターセルストックおよび薬品中に微生物（細菌および真菌）が存在しなくなった。
【0103】
表４に言及するように、異なるドナーから得られた細胞の特徴の遡及的分析により、同等の薬品を製造するためにすべてのＭＣＳが満たすべき基準を得ることが可能となる。
【0104】
表６に示される異なるドナーに由来する５つのマスターセルストックの分析結果により、細胞の特徴に高い類似性があることが明らかである。したがって、本手順は、必要な安全基準を満たす非常に均一なＭＳＣ集団を提供する。
【表3】
【表4】
【0105】
実施例２
本実施例は、ＩＳＣＴの基準に従った、形態学、増殖能、およびＭＳＣのマーカーの発現に基づくドナー由来のＭＳＣの特徴について記載する。さらに、細胞をマイコプラズマ、エンドトキシン、細菌汚染物質、真菌汚染物質、ウイルス汚染物質、および／またはエンドトキシンの存在についてスクリーニングし、核型試験を実施する。記載されている特徴により、ＭＳＣがプールするための品質基準を満たす原薬中間体に由来するＭＳＣ集団が同定される。
本実施例は、ＩＳＣＴの基準に従った、形態学、増殖能、およびＭＳＣのマーカーの発現に基づくドナー由来のＭＳＣの特徴について記載する。さらに、細胞をマイコプラズマ、エンドトキシン、細菌汚染物質、真菌汚染物質、ウイルス汚染物質、および／またはエンドトキシンの存在についてスクリーニングし、核型試験を実施する。記載されている特徴により、ＭＳＣがプールするための品質基準を満たす原薬中間体に由来するＭＳＣ集団が同定される。
【0106】
材料および方法：
最初に、標準的な培養条件で維持する場合、ＭＳＣはプラスチック接着性でなければならない。プラスチック接着細胞のみが、以下に記載する分析手順に供される。以下に示す分析手順に従って、培養物をスクリーニングする。
最初に、標準的な培養条件で維持する場合、ＭＳＣはプラスチック接着性でなければならない。プラスチック接着細胞のみが、以下に記載する分析手順に供される。以下に示す分析手順に従って、培養物をスクリーニングする。
【0107】
分析手順
感染因子
サンプリングＷＪ－ＭＳＣ製造の供給源材料（臍帯の胎盤部分）を胎盤娩出から数分後に得る。それが、感染因子伝染の唯一の方法が胎盤を介した母体血液に由来する理由である。ドナー母体末梢血の２つの試料を出産日および供給源組織回収時に採取する。
感染因子
サンプリングＷＪ－ＭＳＣ製造の供給源材料（臍帯の胎盤部分）を胎盤娩出から数分後に得る。それが、感染因子伝染の唯一の方法が胎盤を介した母体血液に由来する理由である。ドナー母体末梢血の２つの試料を出産日および供給源組織回収時に採取する。
【0108】
分析。化学発光イムノアッセイのためのＡＢＢＯＴＴ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ２０００およびＮＡＴアッセイのためのＰｒｏｃｌｅｉｘ ＰＡＮＴＨＥＲシステムを製造元の指示書に従って使用する。化学発光イムノアッセイのためのＡｂｂｏｔｔ ＡＣＨＩＴＥＣＴを使用する以下の試験を、ＨＩＶ Ａｇ／Ａｂ組み合わせ、ＨＢｓＡｇ定性ＩＩ、抗ＨＢｃ ＩＩ、抗ＨＣＶ、ＣＭＶ ＩｇＭ、ＣＭＶ ＩｇＧ、トキソＩｇＭ、トキソＩｇＧ、および梅毒ＴＰで行う。さらに、Ｐｒｏｃｌｅｘ Ｕｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ Ａｓｓａｙを使用して、ＨＩＶ－１ ＲＮＡ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡ、およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡについてのインビトロ核酸増幅をヒトドナー由来の血漿および血清標本において定性的にスクリーニングする。
【0109】
受入規準（ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ）。試験結果は、感染因子について「陰性」、「非反応性」、または「検出されない」でなければならない（ＣＭＶ ＩｇＧを除く：この試験の陽性結果を有する場合、製造元は、リアルタイムＰＣＲ試験により製品中にＣＭＶ ＤＮＡがないことを確認する）。
【0110】
無菌。
サンプリング。酵素的回収後の培養液からの細胞および上清の試料（１０ｍＬ）。
分析。試料は、嫌気性および好気性細菌の増殖ならびに真菌汚染の検出を意図した２つのＢＡＣＴＥＣボトルに播種される。ボトルをＢＡＣＴＥＣ ＦＸ４００微生物分析装置に１４日間入れる。
受入規準。試験結果は、１４日間のインキュベーション後、好気性嫌気性細菌ならびに真菌微生物について「陰性である」または「検出されない」はずである。
サンプリング。酵素的回収後の培養液からの細胞および上清の試料（１０ｍＬ）。
分析。試料は、嫌気性および好気性細菌の増殖ならびに真菌汚染の検出を意図した２つのＢＡＣＴＥＣボトルに播種される。ボトルをＢＡＣＴＥＣ ＦＸ４００微生物分析装置に１４日間入れる。
受入規準。試験結果は、１４日間のインキュベーション後、好気性嫌気性細菌ならびに真菌微生物について「陰性である」または「検出されない」はずである。
【0111】
マイコプラズマ。
サンプリング酵素回収後の培養液からの細胞および上清の試料（０．１ｍＬ）
分析。Ｖｅｎｏｒ（登録商標）ＧｅＭ Ｃｌａｓｓｉｃアッセイ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，カタログ番号ＭＰ００２５）はＰＣＲ増幅に基づき、製造元の指示書に従って使用される。
受入規準。試験結果は、ゲルスロット中の増幅産物について「検出されない」はずである。
サンプリング酵素回収後の培養液からの細胞および上清の試料（０．１ｍＬ）
分析。Ｖｅｎｏｒ（登録商標）ＧｅＭ Ｃｌａｓｓｉｃアッセイ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，カタログ番号ＭＰ００２５）はＰＣＲ増幅に基づき、製造元の指示書に従って使用される。
受入規準。試験結果は、ゲルスロット中の増幅産物について「検出されない」はずである。
【0112】
エンドトキシン。
サンプリング酵素的回収後の培養液からの細胞および上清の試料（０．５ｍＬ）
分析。Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）－ＰＴＳ（商用）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号ＰＴＳ２００５Ｆ）リアルタイムエンドトキシン試験システムを製造元の推奨に従って使用する。
受入規準。試験結果は、「検出されない」はずである。
サンプリング酵素的回収後の培養液からの細胞および上清の試料（０．５ｍＬ）
分析。Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）－ＰＴＳ（商用）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号ＰＴＳ２００５Ｆ）リアルタイムエンドトキシン試験システムを製造元の推奨に従って使用する。
受入規準。試験結果は、「検出されない」はずである。
【0113】
細胞計数。
サンプリング酵素的回収後の培養物からの細胞の試料（０．５ｍＬ）
分析。Ｍａｌａｓｓｅｚチャンバを使用した細胞数の光学顕微鏡分析。
受入規準。必要な細胞数の９８％以上
サンプリング酵素的回収後の培養物からの細胞の試料（０．５ｍＬ）
分析。Ｍａｌａｓｓｅｚチャンバを使用した細胞数の光学顕微鏡分析。
受入規準。必要な細胞数の９８％以上
【0114】
細胞生存率。
サンプリング酵素的回収後の培養物からの細胞の試料（０．５ｍＬ）
分析。７－ＡＡＤ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，カタログ番号５５９９２５）で染色された細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して行われる。
受入規準。生存細胞の８０％以上。
サンプリング酵素的回収後の培養物からの細胞の試料（０．５ｍＬ）
分析。７－ＡＡＤ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，カタログ番号５５９９２５）で染色された細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して行われる。
受入規準。生存細胞の８０％以上。
【0115】
免疫表現型解析。
サンプリング酵素的回収後の培養物からの細胞の試料（０．５ｍＬ）
分析。モノクローナル抗体で以前に標識した細胞のフローサイトメトリー分析は、表４に列挙されたＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター抗原の試験を使用して行われる。
受入規準－７０％以上の細胞でのＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の発現。系統抗原（ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９およびＨＬＡ－ＤＲ表面分子）の発現なし。
サンプリング酵素的回収後の培養物からの細胞の試料（０．５ｍＬ）
分析。モノクローナル抗体で以前に標識した細胞のフローサイトメトリー分析は、表４に列挙されたＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター抗原の試験を使用して行われる。
受入規準－７０％以上の細胞でのＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５の発現。系統抗原（ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９およびＨＬＡ－ＤＲ表面分子）の発現なし。
【0116】
核学。
サンプリングこのアッセイのために特に行われた細胞培養。
分析。培養をコルセミドでブロッキングし、ギムザで染色する。染色体数および構造異常を評価する。
受入規準。４６染色体、ＸＹ；目に見える異常はない
サンプリングこのアッセイのために特に行われた細胞培養。
分析。培養をコルセミドでブロッキングし、ギムザで染色する。染色体数および構造異常を評価する。
受入規準。４６染色体、ＸＹ；目に見える異常はない
【0117】
分化アッセイ
細胞を分化させる。
分析。製造元の指示書に従って、分化アッセイを使用する。複数の間葉系統に分化する能力に基づく、ヒトＭＳＣの同定のために設計されたヒト間葉系幹細胞機能同定キット，カタログ番号ＳＣ００６，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．。このキットは、特別に製剤化された脂肪生成、軟骨形成、および骨形成培地サプリメントを含み、これは、ＭＳＣを脂肪生成、軟骨形成、または骨形成系統に効果的に分化するために使用することができる。抗ｍＦＡＢＰ４、抗ｈアグリカン、および抗ｈオステオカルシンからなる一連の抗体は、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨細胞の成熟した表現型をそれぞれ定義するために含まれている。組織培養容器中での間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の軟骨分化のために開発されたＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，カタログ番号Ａ１００７１０１，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．。このキットは、ＭＳＣによる軟骨形成経路への関与および軟骨細胞の生成を誘導するのに必要なすべての試薬を含む。
受入規準。インビトロで骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞に分化する能力。
細胞を分化させる。
分析。製造元の指示書に従って、分化アッセイを使用する。複数の間葉系統に分化する能力に基づく、ヒトＭＳＣの同定のために設計されたヒト間葉系幹細胞機能同定キット，カタログ番号ＳＣ００６，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．。このキットは、特別に製剤化された脂肪生成、軟骨形成、および骨形成培地サプリメントを含み、これは、ＭＳＣを脂肪生成、軟骨形成、または骨形成系統に効果的に分化するために使用することができる。抗ｍＦＡＢＰ４、抗ｈアグリカン、および抗ｈオステオカルシンからなる一連の抗体は、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨細胞の成熟した表現型をそれぞれ定義するために含まれている。組織培養容器中での間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の軟骨分化のために開発されたＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，カタログ番号Ａ１００７１０１，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．。このキットは、ＭＳＣによる軟骨形成経路への関与および軟骨細胞の生成を誘導するのに必要なすべての試薬を含む。
受入規準。インビトロで骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞に分化する能力。
【0118】
結果
得られたＭＳＣ集団は、標準的培養条件で維持された場合、プラスチック接着性である。ＭＳＣは、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、およびＣＤ９０を発現し、実施例３で示されるようにＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９、およびＨＬＡ－ＤＲ表面分子を発現せず、インビトロで骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞に分化することができる。したがって、プールすることに適格なＭＳＣ集団が同定される。
得られたＭＳＣ集団は、標準的培養条件で維持された場合、プラスチック接着性である。ＭＳＣは、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、およびＣＤ９０を発現し、実施例３で示されるようにＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９、およびＨＬＡ－ＤＲ表面分子を発現せず、インビトロで骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞に分化することができる。したがって、プールすることに適格なＭＳＣ集団が同定される。
【0119】
これらの基準をここでは採用するが、ＩＳＣＴの基準に従ってＭＳＣの定義の変更などをもたらす新しい知識が展開されるにつれて、これらを修正することが必要になり得、本発明者らは、上記の最小の標準的基準セットがＭＳＣのより均一な特徴を培うと考える。本明細書で使用する場合、ＭＳＣはＩＳＣＴの基準に従って定義される。
【0120】
実施例３
本実施例は、プールするＭＳＣ集団を選択するために、形態学的、増殖的、および機能的特徴について原薬中間体に由来する上記ＭＳＣ集団を特徴付けるために使用されるスクリーニングアッセイについて記載する。
本実施例は、プールするＭＳＣ集団を選択するために、形態学的、増殖的、および機能的特徴について原薬中間体に由来する上記ＭＳＣ集団を特徴付けるために使用されるスクリーニングアッセイについて記載する。
【0121】
材料および方法：
以下は、ＭＳＣ集団を特徴付けるために使用される６つのアッセイの記載である。
以下は、ＭＳＣ集団を特徴付けるために使用される６つのアッセイの記載である。
【0122】
アッセイ１－ＩＤＯ：ＩＤＯアッセイは、原薬中間体または原薬、すなわち間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）の免疫抑制能力を分析するために使用される。
ＵＣ－ＭＳＣ免疫調節能力は、培養上清中のトリプトファンおよびキヌレニンを測定することにより決定されるインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）活性の測定値として報告される。インドールアミン－ピロール２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯまたはＩＮＤＯ ＥＣ １．１３．１１．５２）は、ヒトではＩＤＯ１遺伝子によってコードされるヘム含有酵素である。ＩＤＯ酵素は、Ｌ－トリプトファンを、Ｔ細胞を含む免疫細胞増殖の阻害剤として機能する免疫抑制分子であるＮ－ホルミルキヌレニン（またはキヌレニン）に変換する。ＩＤＯ活性は、キヌレニン／トリプトファンの比であり、ＥＬＩＳＡキットを使用して細胞培養上清中に存在するトリプトファンおよびキヌレニンの量を計算することによって決定することができる。インターフェロンγ（ＩＦＮγ）で刺激した場合、間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）は刺激しない場合より多くのＩＤＯを分泌する。
ＵＣ－ＭＳＣ免疫調節能力は、培養上清中のトリプトファンおよびキヌレニンを測定することにより決定されるインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）活性の測定値として報告される。インドールアミン－ピロール２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯまたはＩＮＤＯ ＥＣ １．１３．１１．５２）は、ヒトではＩＤＯ１遺伝子によってコードされるヘム含有酵素である。ＩＤＯ酵素は、Ｌ－トリプトファンを、Ｔ細胞を含む免疫細胞増殖の阻害剤として機能する免疫抑制分子であるＮ－ホルミルキヌレニン（またはキヌレニン）に変換する。ＩＤＯ活性は、キヌレニン／トリプトファンの比であり、ＥＬＩＳＡキットを使用して細胞培養上清中に存在するトリプトファンおよびキヌレニンの量を計算することによって決定することができる。インターフェロンγ（ＩＦＮγ）で刺激した場合、間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）は刺激しない場合より多くのＩＤＯを分泌する。
【0123】
誘導可能なＩＤＯ活性は、放出された細胞が免疫調節に関連する機能的効力を有することを示す。
【0124】
ＭＳＣ培養：１００μｌアッセイ培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号２１８８５０２５）＋１０％ウシ胎児血清、適格性あり、熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号１６１４００７１）中に、４８ウェル細胞培養プレートに１００００ＭＳＣ／ウェルを播種する。ストックからのＩＦＮγを１ｍｇ／ｍｌに希釈する（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号ＰＨＣ４０３３）。ＩＦＮγ／ウェルの最終濃度は１００ｎｇ／ｍｌである。ウェルに１００μｌの２００ｎｇ／ｍｌＩＦＮγを添加する。非刺激細胞に１００μｌのアッセイ培地を添加する（ＩＦＮγなし）。細胞培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートする。各ウェルから上清を除去し、ＥＬＩＳＡ分析のためにさらに処理するまで－２０℃でマイクロチューブに保存する。
【0125】
トリプトファンおよびキヌレニンの測定は、ＥＬＩＳＡキット製造元（Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＡＧ，カタログ番号Ｋ３７３０およびＫ３７２８）によって提供されるマニュアルに従って行う。トリプトファンおよびキヌレニンの両方のＥＬＩＳＡを、別の機会ではなく同じ日に行う。２つのＥＬＩＳＡを製造元の指示書に従って行う。各ＥＬＩＳＡについてのマニュアルを参照のこと。
【0126】
６２０ｎｍでのバックグラウンド減算を伴う４５０ｎｍでの吸収をＳｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ １９０）で測定する。
【0127】
結果の分析：測定された吸光度の量は、試料に存在するアミノ酸の量に反比例し、すなわち、ＯＤ４５０が低いほど、キヌレニンまたはトリプトファンが多くなる。キット製造元が推奨するように、４ＰＬアルゴリズム（４つのパラメーターロジスティクス回帰）を使用して結果を計算する（ソフトウェアＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ７．０．２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。濃度は標準曲線から直接決定される。キットで提供される対照試料を許容性について評価する。キット製造元による許容範囲外の場合、試料を再分析する必要がある。
【0128】
結果
原薬中間体からのＩＦＮγ処理細胞の相対的ＩＤＯ生物活性を、選択アルゴリズムに従って試料をランク付けするために使用する（実施例４）。生物活性の増加が最も高いドナーが最高のランク付けスコアを得る。ランク付けスコア（表５）は、後に、ドナーの最終選択において使用される（実施例４を参照）。
原薬中間体からのＩＦＮγ処理細胞の相対的ＩＤＯ生物活性を、選択アルゴリズムに従って試料をランク付けするために使用する（実施例４）。生物活性の増加が最も高いドナーが最高のランク付けスコアを得る。ランク付けスコア（表５）は、後に、ドナーの最終選択において使用される（実施例４を参照）。
【表5】
【0129】
アッセイ２：増殖アッセイ
この方法は、原薬中間体および／または原薬の免疫抑制効果、すなわち臍帯由来ＭＳＣが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖にして有する免疫抑制効果を定量的に測定するために使用される。ＭＳＣは、Ｔリンパ球増殖を抑制することが示されている。ＭＳＣとの混合リンパ球反応は、ＭＳＣの免疫抑制活性を示すために頻繁に使用される。
この方法は、原薬中間体および／または原薬の免疫抑制効果、すなわち臍帯由来ＭＳＣが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖にして有する免疫抑制効果を定量的に測定するために使用される。ＭＳＣは、Ｔリンパ球増殖を抑制することが示されている。ＭＳＣとの混合リンパ球反応は、ＭＳＣの免疫抑制活性を示すために頻繁に使用される。
【0130】
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）は、Ｔリンパ球の増殖を活性化するマイトジェンとして使用される。原薬中間体および／または原薬の免疫抑制活性をＰＨＡ刺激Ｔリンパ球の増殖の減少として定量化する。
【0131】
培養およびＣＦＳＥプライミング：５００μｌの基礎培地（ｗｏｒｋｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（ＲＰＭＩ１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号１２６３３０１２＋２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号３５０５００６１））＋１００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｓｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号１５１４０１２２）＋１０％ ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号１６１４００７１）ＭＳＣ（２ｘ１０５細胞／ウェル）を１２ウェル細胞培養プレートに播種する。細胞のプラスチック接着のために、プレートを３７℃＋５％ＣＯ２で２時間インキュベートする。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）キットを、製造元の指示書（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０７８０１）に従って、血液中心から収集された末梢血から単核細胞を単離するために使用する。ＰＢＭＣをＲＰＭＩ１６４０、２２ｘ１０６細胞／ｍｌに懸濁する。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号Ｃ３４５５４）を、製造元の指示に従って増殖を分析するために使用する。
【0132】
分析：ＣＦＳＥ陽性細胞をフローサイトメトリー（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ５ＨＴ）で分析する。ＣＦＳＥヒストグラムには３つまたは４つのピークが含まれ、右から１番目の上部は未分化細胞（Ｇ０）を表す。次の上部は、異なる世代（Ｇ１～Ｇ４）を示している。増殖指数（ＰＩ）は、すべての世代の細胞の総数を細胞分裂に入った親細胞の数で割って計算される。
【表6】
【0133】
結果
各原薬中間体についての平均増殖指数をドナーの相対的比較のために使用する。最も低いＰＩを有するドナーが最高のランク付けスコアを得る。ランク付けスコア（表６）は、後に、ドナーの最終選択において使用される（実施例４を参照）。
各原薬中間体についての平均増殖指数をドナーの相対的比較のために使用する。最も低いＰＩを有するドナーが最高のランク付けスコアを得る。ランク付けスコア（表６）は、後に、ドナーの最終選択において使用される（実施例４を参照）。
【0134】
アッセイ３：プロスタグランジンＥ２
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）アッセイは、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で活性化された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共培養した場合のＰＧＥ２の原薬中間体および／または原薬分泌を評価する。
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）アッセイは、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で活性化された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共培養した場合のＰＧＥ２の原薬中間体および／または原薬分泌を評価する。
【0135】
細胞培養：細胞を、アッセイ培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号２１８８５０２５）＋１０％ウシ胎児血清、適格性あり、熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号１６１４００７１））において、共培養細胞比ＭＳＣ－ＰＢＭＣ１／５で、３日間、ＰＨＡ（Ｍｅｒｃｋ，カタログ番号１１０８２１３２００１）の存在下および非存在下で培養する。１２ウェル細胞培養プレートにウェルあたり４００００個のＭＳＣを播種する。細胞培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートして、細胞を接着させる。
【0136】
Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）キットを、製造元の指示書（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０７８０１）に従って、中心血液から収集された末梢血から単核細胞を単離するために使用する。ＰＢＭＣをアッセイ培地に懸濁し、０．５ｘ１０６個の細胞／ｍｌおよび４００μｌをＰＢＭＣを目的としたウェルに播種する。５００μｌのアッセイ培地をＰＢＭＣを含まないウェルに添加する。１００μｌ／ウェルの１００μｇ／ｍｌをＰＨＡからＰＢＭＣを含むウェルに添加し、細胞培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートする。上清を各ウェルから取り出し、５００ｇで５分間遠心して粒子を除去する。上清を凍結し、ＥＬＩＳＡ分析のためにさらに処理するまで－２０℃で保存する。
【0137】
Ｐａｒａｍｅｔｅｒ（商標）Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２イムノアッセイキットを、製造元の指示書（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ，カタログ番号ＫＧＥ００４Ｂ）に従ってＰＧＥ２発現検出のために使用し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ１９０）で分析する。４ＰＬアルゴリズム（４つのパラメーターロジスティクス回帰）を使用して結果を計算する（ソフトウェアＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ７．０．２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
【0138】
結果
各原薬中間体のＰＧＥ２（ｐｇ／ｍｌ）の平均的発現をドナーの相対的比較のために使用する。発現レベルが最も高いドナーが最高のランク付けスコアを得る。ランク付けスコア（表７）は、後に、ドナーの最終選択において使用される（実施例４を参照）。
各原薬中間体のＰＧＥ２（ｐｇ／ｍｌ）の平均的発現をドナーの相対的比較のために使用する。発現レベルが最も高いドナーが最高のランク付けスコアを得る。ランク付けスコア（表７）は、後に、ドナーの最終選択において使用される（実施例４を参照）。
【表7】
【0139】
アッセイ４：ＨＬＡ－Ｇ
ＨＬＡ－Ｇアッセイは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、および／またはＰＨＡに応答して、可溶性および／または細胞内ＨＬＡ－Ｇの原薬中間体および／または原薬の発現を評価する。
ＨＬＡ－Ｇアッセイは、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、および／またはＰＨＡに応答して、可溶性および／または細胞内ＨＬＡ－Ｇの原薬中間体および／または原薬の発現を評価する。
【0140】
細胞培養：５００００個のＭＳＣおよび２５０００個のＪＥＧ－３細胞（陽性対照細胞、ＡＴＣＣ，カタログ番号ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３６（商標））を、１ウェルあたり、１ｍｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号２１８８５０２５）＋１０％ウシ胎児血清、適格性あり、熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号１６１４００７１）での１２ウェル細胞培養プレートに、最終濃度１０～５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，カタログ番号１３０－１０８－９８５）または２５～１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号ＰＨＣ４０３３）と共にまたは刺激なしで播種した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間～７２時間インキュベートする。上清を各ウェルから取り出し、可溶性ＨＬＡ－ＧのＥＬＩＳＡ分析のために－２０℃で保存する。
【0141】
細胞内ＨＬＡ－Ｇ：接着細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号１２６０４０２１）で剥離する。ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）を、製造元の指示書（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，カタログ番号５５４７１４）に従って、細胞の固定および透過処理のために使用する。細胞を、製造元の指示書に従ってＨＬＡ－Ｇ（ＰＥ）抗体（ＥＸＢＩＯ Ｐｒａｈａ，カタログ番号１Ｐ－４３１－Ｃ１００）で染色し、フローサイトメトリー（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ５ＨＴ）で分析する。
【0142】
可溶性ＨＬＡ－Ｇ：上清中のＨＬＡ－Ｇの濃度を、製造元の指示書に従ってｓＨＬＡ－Ｇ ＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号ＡＬＸ－８５０－３０９－ＫＩ０１）で分析する。
【0143】
結果
原薬中間体および／または原薬は、細胞内および可溶性ＨＬＡ－Ｇ発現の両方について分析し、分析した他の試料と比較した相対的発現に基づいてスコアを受け取る。細胞内および可溶性ＨＬＡ－Ｇ発現の合計スコアを纏め、原薬中間体は、ドナーの最終選択に使用される（実施例４を参照）ランク付けスコア（表８）を受け取る。
原薬中間体および／または原薬は、細胞内および可溶性ＨＬＡ－Ｇ発現の両方について分析し、分析した他の試料と比較した相対的発現に基づいてスコアを受け取る。細胞内および可溶性ＨＬＡ－Ｇ発現の合計スコアを纏め、原薬中間体は、ドナーの最終選択に使用される（実施例４を参照）ランク付けスコア（表８）を受け取る。
【表8】
【0144】
アッセイ５：形態
原薬中間体および／または原薬培養物の細胞形態を継続的に監視する。細胞を増殖中および回収前に視覚的に検査し、以下に基づいて評価する：
原薬中間体および／または原薬培養物の細胞形態を継続的に監視する。細胞を増殖中および回収前に視覚的に検査し、以下に基づいて評価する：
【表9】
【0145】
結果
原薬中間細胞を上記基準に基づいて視覚的に評価する。正常細胞が９０％を超える試料のみが許容される。異常細胞の頻度は、原薬中間体のランク付け（表９）に使用される（実施例４を参照）。
原薬中間細胞を上記基準に基づいて視覚的に評価する。正常細胞が９０％を超える試料のみが許容される。異常細胞の頻度は、原薬中間体のランク付け（表９）に使用される（実施例４を参照）。
【表10】
【0146】
アッセイ６：Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔ
原薬中間体および／または原薬を、抗体で事前にコーティングされたＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔ特異的９６ウェルプレートで培養する（ＭａｂＴｅｃｈにより提供されるサービス）。１０００～３０００個の細胞を、１ウェルあたり、１００μｌアッセイ培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号２１８８５０２５）＋１０％ウシ胎児血清、適格性あり、熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号１６１４００７１））で播種し、刺激の不在下または存在下で４８時間インキュベートする。使用する刺激は、ポリＩ：Ｃ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，カタログ番号ｔｌｒｌ－ｐｉｃ）、ｒ８４８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号ｔｌｒｌ－ｒ８４８）、ＧＡＢＡ（Ｄｉａｍｙｄ Ｍｅｄｉｃａｌ）、およびＩＦＮγ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＰＨＣ４０３３）である。ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２／１３、ＩＬ－１７Ａ ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２９、ＩＬ－３１、ＴＧＦβ１、ＧＭ－ＣＦＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、アポＥ、およびＴＮＦαの発現をＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔ（ＭａｂＴｅｃｈ）によって分析する。
原薬中間体および／または原薬を、抗体で事前にコーティングされたＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔ特異的９６ウェルプレートで培養する（ＭａｂＴｅｃｈにより提供されるサービス）。１０００～３０００個の細胞を、１ウェルあたり、１００μｌアッセイ培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号２１８８５０２５）＋１０％ウシ胎児血清、適格性あり、熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号１６１４００７１））で播種し、刺激の不在下または存在下で４８時間インキュベートする。使用する刺激は、ポリＩ：Ｃ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，カタログ番号ｔｌｒｌ－ｐｉｃ）、ｒ８４８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号ｔｌｒｌ－ｒ８４８）、ＧＡＢＡ（Ｄｉａｍｙｄ Ｍｅｄｉｃａｌ）、およびＩＦＮγ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＰＨＣ４０３３）である。ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２／１３、ＩＬ－１７Ａ ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２９、ＩＬ－３１、ＴＧＦβ１、ＧＭ－ＣＦＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、アポＥ、およびＴＮＦαの発現をＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔ（ＭａｂＴｅｃｈ）によって分析する。
【0147】
プールされた同種ＭＳＣ組成物の以前のバッチ、すなわち薬品を参照として使用する。アッセイは、望ましいおよび望ましくないとみなされるタンパク質およびサイトカインの両方を含む。例えば、細胞がＩＬ－６を発現している場合は陽性とみなし、ＩＦＮγを発現している場合は陰性とみなす。
【表11】
【0148】
結果
結果をＦｌｕｏｒｓｐｏｔリーダーに付属のソフトウェアで分析する。プログラムにより、視覚的出力および数値的出力の両方を生成される（図３を参照）。
結果をＦｌｕｏｒｓｐｏｔリーダーに付属のソフトウェアで分析する。プログラムにより、視覚的出力および数値的出力の両方を生成される（図３を参照）。
【0149】
原薬中間体試料は、参照試料（数値）に関連してスコア付けされる。陽性および陰性の閾値は、各マーカーについて事前に定義されており、原薬中間体は表１２に従ってスコア付けされる。
【表12】
【0150】
原薬中間体の最終ランク付けは、刺激ありおよび／または刺激なしで分析されたすべてのマーカーの纏めスコアに基づく（表１２）。
【表13】
【0151】
原薬中間体のランク付けは、Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイのランク付けスコアを生成するスコアに基づく。ランク付けスコアは、後に、実施例４に記載するドナーの全体的選択のために使用される。最高スコアの原薬中間体試料はまた、最高ランク付けスコアを得る（表１３を参照）。
【表14】
【0152】
さらに、Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔの結果の一部またはすべてを選択アルゴリズムの入力として、すなわち、各分析されたタンパク質からのデータを選択アルゴリズムにおける別々の要素として使用することも可能である。
【0153】
実施例４
本実施例は、本発明のプールされた同種組成物を得るためにプールするための細胞集団のサブセットをもたらす、実施例３に記載の特徴に基づくドナーに由来するＭＳＣ集団の選択プロセスについて記載する。
本実施例は、本発明のプールされた同種組成物を得るためにプールするための細胞集団のサブセットをもたらす、実施例３に記載の特徴に基づくドナーに由来するＭＳＣ集団の選択プロセスについて記載する。
【0154】
材料および方法：
分析およびランク付け：原薬中間体試料を上記のアッセイ（ＩＤＯ、増殖、ＰＧＥ２、ＨＬＡ－Ｇ、形態、およびＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔ）を使用して分析する。試料のランク付けは以下に記載のように行う。
１．上記のＩＤＯアッセイを２組の細胞培養試料で２回行い、各試料をＥＬＩＳＡで３回分析する。以前のバッチでプールされた同種ＭＳＣを参照試料として使用する。ＩＤＯアッセイは対照試料を含み、各実施において分析し、対照試料の分析から生成された結果を、適切な統計的方法を使用して許容性について評価する。２つの対照の許容範囲は、製造元の仕様に従う。許容範囲の例は、キヌレニン（μｍｏｌ／Ｌ）対照１：０．５３～１．３３および対照２：１．７８～４．１５；トリプトファン（μｍｏｌ／Ｌ）対照１：１５．０～３５．０および対照２：３１．２～７２．８である。アッセイに使用される品質基準は、ＩＤＯ対照が特定範囲内であり、およびＩＤＯ活性（参照試料）＞６０倍であり、すなわち、未刺激の参照試料と比較したインターフェロンγ（ＩＦＮγ）参照試料間のＩＤＯ活性の倍数誘導である。
分析およびランク付け：原薬中間体試料を上記のアッセイ（ＩＤＯ、増殖、ＰＧＥ２、ＨＬＡ－Ｇ、形態、およびＦｌｕｏｒｏｓｐｏｔ）を使用して分析する。試料のランク付けは以下に記載のように行う。
１．上記のＩＤＯアッセイを２組の細胞培養試料で２回行い、各試料をＥＬＩＳＡで３回分析する。以前のバッチでプールされた同種ＭＳＣを参照試料として使用する。ＩＤＯアッセイは対照試料を含み、各実施において分析し、対照試料の分析から生成された結果を、適切な統計的方法を使用して許容性について評価する。２つの対照の許容範囲は、製造元の仕様に従う。許容範囲の例は、キヌレニン（μｍｏｌ／Ｌ）対照１：０．５３～１．３３および対照２：１．７８～４．１５；トリプトファン（μｍｏｌ／Ｌ）対照１：１５．０～３５．０および対照２：３１．２～７２．８である。アッセイに使用される品質基準は、ＩＤＯ対照が特定範囲内であり、およびＩＤＯ活性（参照試料）＞６０倍であり、すなわち、未刺激の参照試料と比較したインターフェロンγ（ＩＦＮγ）参照試料間のＩＤＯ活性の倍数誘導である。
【0155】
原薬中間体を相対的ＩＤＯ発現に基づいてランク付けする。
【0156】
２．上記の増殖アッセイを２組の細胞培養試料で２回行い、各試料をＦＡＣＳで３回分析する。ＰＢＭＣの増殖に影響を与える試料を増殖指数ＰＩとして示す。以前のバッチでプールされた同種ＭＳＣを参照試料として使用し、ＭＳＣの非存在下でＰＨＡで刺激されたＰＢＭＣを陽性対照として使用する。アッセイに使用する品質基準は、増殖指数（陽性対照）＞１．５および増殖指数（参照）０．９～１．３である。
【0157】
原薬中間体を相対的増殖指数に基づいてランク付けする。
【0158】
３．ＰＧＥ２アッセイを２組の細胞培養試料で２回行い、各試料をＥＬＩＳＡで３回分析する。キットは、各実験での標準曲線を確立するための標準を含む。以前のバッチでプールされた同種ＭＳＣを参照試料として使用し、ＰＨＡによって活性化されたＰＢＭＣの存在下でのＰＧＥ２発現のレベルに基づいて試料を比較する。アッセイに使用される品質基準は、ＰＧＥ２発現（参照）５～１５ｎｇ／ｍｌおよび標準曲線Ｒ２＞０．９５である。
【0159】
原薬中間体をそれらの相対的ＰＧＥ２発現に基づいてランク付けする。
【0160】
４．ＨＬＡ－Ｇアッセイを２組の細胞培養試料で２回行い、各試料をＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳで３回分析する。以前のバッチでプールされた同種ＭＳＣを参照試料として使用し、ＰＨＡによって活性化されたＰＢＭＣの存在下でのＨＬＡ－Ｇ発現のレベルに基づいて試料を比較する。ＥＬＩＳＡキットは、各実験での標準曲線を確立するための標準を含む。アッセイに使用される品質基準は、可溶性ＨＬＡ－Ｇ発現（参照）＞３ Ｕ／ｍｌ、標準曲線Ｒ２＞０．９５、および細胞内ＨＬＡ－Ｇ発現（参照）＞５％である。原薬中間体を、相対的な細胞内および／または可溶性ＨＬＡ－Ｇ発現に基づいてランク付けする。
【0161】
５．形態評価は、ＭＳＣ培養の長い経験を有する実験室の担当者によって行われる。以前のバッチでプールされた同種ＭＳＣを参照試料として使用し、試料を細胞のサイズ（正常または大きい）、核のサイズ（正常または大きい）、細胞の形状（正常または異常）、および細胞サイズと核サイズとの比（正常または異常）に基づいて評価する。アッセイに使用する品質基準は、４つすべての基準に従い、＞９０％正常細胞である。参照試料は、＞９０％正常細胞を有する。異常細胞を１０％より多く有する原薬中間体は不適格となる。原薬中間体は、異常細胞の発生頻度に基づいてランク付けされる。
【0162】
外れ値および試料の不適格：ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳを各細胞培養ウェルから３組で分析される。３つの３組のうちの１つだけが外れ値とみなし得る。外れ値分析は、ＥＬＩＳＡのデルタ光学密度（ΔＯＤ）ならびにＦＡＣＳの増殖指数およびＨＬＡ－Ｇ陽性率に基づく。変動係数（ＣＶ）＞１０％の場合、細胞培養ウェルからの測定値は異常値について分析される。分析から除いた際に、反復（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）を除外することによりＣＶが＞３％低下する場合、平均値から最も逸れている複製を外れ値とみなす。このような外れ値は、さらなる正当な理由がなければ分析から除外される。
【0163】
外れ値分析を行った後、ＣＶ＞２０％の場合、単一細胞培養ウェルの分析は不適格である。同じ実験で３つ以上の不適格な細胞培養ウェルは、実験を不適格とする。
【0164】
総合評価：原薬中間体の選択は、以下の表１４に示すポイントシステムによるアッセイの総合評価である。各アッセイによりランク付けスコアが生成され、この最終選択では、すべてのアッセイのランク付けスコアが加算によって集約される。実施例３に記載された１０のドナーから５のドナーを選択することは、各アッセイが表１４における合計スコアおよび最終決定に等しく寄与することにより行われる。各アッセイについて、ランク付け値が加算され、加算合計スコアを得る。
【表15】
【0165】
あるいは、１０のドナーのうち５を選択することは、アッセイに重みを割り当てることによって行われ、これにより、分析が多かれ少なかれドナーの選択に影響を与えることが可能となる。例としては、形態に因子２を適用し、ＨＬＡ－Ｇアッセイの重要性を半分に減らすことであろう。重み付けランク付けスコアが加算され、重み付け合計スコアを得る。重み付け合計スコアに基づく実施例３の結果を表１５に示す。
【表16】
【0166】
結果
本明細書に開示されるように、最高の合計スコア（加算／単純または重み付け）を有する５つの原薬中間体（ＤＸ）が、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団、すなわち薬品の製造のために選択される。したがって、単離されプールされた同種集団は、５つの異なるドナーに由来するＭＳＣを含み、該ＭＣＳは、本明細書に開示される機能、形態、および安全性の基準を満たす。
本明細書に開示されるように、最高の合計スコア（加算／単純または重み付け）を有する５つの原薬中間体（ＤＸ）が、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団、すなわち薬品の製造のために選択される。したがって、単離されプールされた同種集団は、５つの異なるドナーに由来するＭＳＣを含み、該ＭＣＳは、本明細書に開示される機能、形態、および安全性の基準を満たす。
【0167】
実施例５
本実施例は、以下に記載される賦形剤を含む単一細胞懸濁液である最終製品を製造するプロセスについて記載する。上記最終製品は、凍結保存に好適な移送バッグに充填され、以下に記載される所定の温度曲線に従って凍結される。
本実施例は、以下に記載される賦形剤を含む単一細胞懸濁液である最終製品を製造するプロセスについて記載する。上記最終製品は、凍結保存に好適な移送バッグに充填され、以下に記載される所定の温度曲線に従って凍結される。
【表17】
【0168】
材料および方法
ドナーのプール
すべての受入規準に合格したドナー試料のみをプール対象とみなす。使用される原薬を実施例３および４に従って選択する。継代３で原薬をプールした直後に、凍結保存を行う。薬品をこのように得る。重要なことに、薬品はさらなる任意の培養および増殖に供しない。
ドナーのプール
すべての受入規準に合格したドナー試料のみをプール対象とみなす。使用される原薬を実施例３および４に従って選択する。継代３で原薬をプールした直後に、凍結保存を行う。薬品をこのように得る。重要なことに、薬品はさらなる任意の培養および増殖に供しない。
【0169】
薬品の製剤化および包装
最終製品は、５ｍＬの細胞懸濁液であり、クリオバッグ中に提供される。薬品を含む凍結保存された最終製品の組成を表１６に示す。
最終製品は、５ｍＬの細胞懸濁液であり、クリオバッグ中に提供される。薬品を含む凍結保存された最終製品の組成を表１６に示す。
【0170】
結果
このようにして、本明細書に開示される結果として得られる最終製品を得る。
このようにして、本明細書に開示される結果として得られる最終製品を得る。
【0171】
実施例６
本実施例は、凍結保存後の最終製品の安定性の評価について記載する。本実施例は、最終製品が解凍後少なくとも２時間安定していることを示す。
本実施例は、凍結保存後の最終製品の安定性の評価について記載する。本実施例は、最終製品が解凍後少なくとも２時間安定していることを示す。
【0172】
材料および方法
本発明の組成物は、液体窒素またはドライアイスにて、最終製品であるバッグあたり１億個の細胞を含む５ｍｌの細胞懸濁液を含むクライオバッグで出荷される。クライオバッグを水浴中（３７℃）で解凍し、通常１００ｍｌの塩化ナトリウム溶液を含む注入バッグに直接移す。次いで、１０５ｍｌの注入液が注入のために準備される。様々な時点で注入バッグから試料を採取することによって、細胞の生存率を分析する。約１ｘ１０６細胞の試料を採取し、９５％ ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ＸＦ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号０５－２００－１Ａ）、５％ ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ＸＦ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号０５－２０１－１Ｕ）において解凍後、５分、１時間、および２時間培養することにより、細胞の機能をさらに分析し、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍを１回だけ使用し、その後、これをアッセイ培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２１８８５０２５）＋１０％ウシ胎児血清、適格性あり、加熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号１６１４００７１））に交換する。細胞のプラスチック接着を視覚的に監視し、適切な時間間隔で顕微鏡写真を撮る。解凍後の細胞の生存率分析を、製造元の指示書に従って、７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，カタログ番号５５９９２５）のフローサイトメトリー（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ５ＨＴ）分析によって行う。ＣＤ９０（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，カタログ番号５６１５５７）およびＨＬＡ－ＤＲ（Ｅｘｂｉｏ，カタログ番号ＩＦ－６９０－Ｔ１００）による表現型の特徴付けを製造元の指示書に従って分析する。
本発明の組成物は、液体窒素またはドライアイスにて、最終製品であるバッグあたり１億個の細胞を含む５ｍｌの細胞懸濁液を含むクライオバッグで出荷される。クライオバッグを水浴中（３７℃）で解凍し、通常１００ｍｌの塩化ナトリウム溶液を含む注入バッグに直接移す。次いで、１０５ｍｌの注入液が注入のために準備される。様々な時点で注入バッグから試料を採取することによって、細胞の生存率を分析する。約１ｘ１０６細胞の試料を採取し、９５％ ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ＸＦ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号０５－２００－１Ａ）、５％ ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ＸＦ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号０５－２０１－１Ｕ）において解凍後、５分、１時間、および２時間培養することにより、細胞の機能をさらに分析し、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍを１回だけ使用し、その後、これをアッセイ培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、ピルビン酸塩（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２１８８５０２５）＋１０％ウシ胎児血清、適格性あり、加熱不活性化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号１６１４００７１））に交換する。細胞のプラスチック接着を視覚的に監視し、適切な時間間隔で顕微鏡写真を撮る。解凍後の細胞の生存率分析を、製造元の指示書に従って、７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，カタログ番号５５９９２５）のフローサイトメトリー（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ５ＨＴ）分析によって行う。ＣＤ９０（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，カタログ番号５６１５５７）およびＨＬＡ－ＤＲ（Ｅｘｂｉｏ，カタログ番号ＩＦ－６９０－Ｔ１００）による表現型の特徴付けを製造元の指示書に従って分析する。
【0173】
結果
生存率：生存率＞８０％である場合、細胞は安定しているとみなし、したがって、表１７に示すように、ＣＢ１は、解凍後２４時間において、室温で保存した場合に安定している。
生存率：生存率＞８０％である場合、細胞は安定しているとみなし、したがって、表１７に示すように、ＣＢ１は、解凍後２４時間において、室温で保存した場合に安定している。
【表18】
【0174】
表現型の特徴付け：ＭＳＣ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ基礎培地およびＤＭＥＭ中で増殖したＣＢ１細胞は、培養開始前の室温時間に関係なく、高い割合のＣＤ９０表面マーカー＞９９％を示した。ＨＬＡ－ＤＲは陰性であることが見出された（表１８を参照）。
【表19】
【0175】
表面接着：ＭＳＣ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ基礎培地で増殖させた場合、１時間の培養後に、細胞はＴ－７５フラスコの表面に既に接着していた。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で増殖した細胞は２４時間の培養後に接着した。
【0176】
結論：本発明の組成物の分析されたバッチは、品質基準を満たし、室温で３時間後に細胞生存率＞９７％であり、室温で２４時間後に細胞生存率＞９２％である。また、解凍後５分間、１時間、および２時間培養した細胞では、ＣＤ９０表面マーカーが陽性であり、ＨＬＡ－ＤＲ染色が陰性である。ＭＳＣ特有の培地（ＭＳＣ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ基礎培地）で培養された細胞では、従来の細胞増殖培地で培養した場合よりも表面接着が速かった。２４時間後、すべての「解凍後」の細胞が接着した。インハウスで試験したすべての基準は良好であり、許容範囲内の結果であるので、このバッチの高品質が実証される。
【0177】
実施例７
本実施例は、１型糖尿病と診断された患者への本発明のプールされた同種ＭＳＣ組成物の注入の臨床研究デザインの要約を提供する。安全性および耐性、ならびにβ細胞機能の変化、代謝制御および糖尿病処置の満足度を調べる。任意の有害事象を報告し、最終製品との潜在的な因果関係を調査する。
本実施例は、１型糖尿病と診断された患者への本発明のプールされた同種ＭＳＣ組成物の注入の臨床研究デザインの要約を提供する。安全性および耐性、ならびにβ細胞機能の変化、代謝制御および糖尿病処置の満足度を調べる。任意の有害事象を報告し、最終製品との潜在的な因果関係を調査する。
【0178】
研究デザイン：フェーズＩおよびフェーズＩＩを組み合わせた研究が行われる。第１パートは、１８～４０歳の９人の男性患者からなる非盲検の用量漸増研究である。第２パートは、本明細書で開示されるプールされた同種ＭＳＣ組成物による処置を１型糖尿病と診断された成人患者のプラセボと比較する、並行デザインでの無作為化二重盲検プラセボ対照第Ｉ／ＩＩ相試験である。安全性、内因性インスリン産生の維持（Ｃペプチド濃度として測定）、ならびに代謝制御、糖尿病処置の満足度、および免疫学的プロファイルが評価される。
【0179】
合計数２４人の患者が研究に登録され（第１パートでは９人の患者、第２パートでは１５人の患者）、最終製品／プラセボ処置後１年間追跡する。組み入れ基準および除外基準は実施例８に記載される。
【0180】
研究の第１パートでは、患者１～３は２，５００万個の細胞の単回投与を受け、患者４～６は１億個の細胞を受け、患者７～９人は２億個の細胞を受ける。研究の第２パートの１５人の患者に、３つの群：Ａ．ＷＪＭＳＣによる同種注入（バッチ１）、すなわち、最終製品バッチ１）、Ｂ．ＷＪＭＳＣによる同種注入（バッチ２）、すなわち、最終製品バッチ２）、およびＣ．プラセボ注入のうちの１つを１：１：１の比で割り当てる。統計分析では、Ａ群およびＢ群をプールし、Ｃ群と比較される。
【0181】
研究の第２パートでは、すべての患者が最終製品の固定単回投与を受ける。予備提案用量は１億個のＭＳＣであるが、パート１のデータを評価して予備提案用量を確認する前に、パート２では投与を行わない。
【0182】
研究は、インフォームドコンセントを得るためのスクリーニング期間、スクリーニング、および研究への組み入れにより始まる。研究への組み入れは、１型糖尿病の診断から２年以内でなければならない。研究全体を通じて、すべての患者はインスリン処置を継続し、インスリンの用量は、臨床診療に従って最適な血糖コントロールを維持するように調整される。１～２４人のすべての患者は、設定訪問スケジュールに従い、各訪問中に、試験および手順のセットが表１９に従って行われる。
【表20】
【0183】
研究の終了は、最後の参加者の最後のフォローアップとして定義される。
【0184】
研究全体を通して、患者の安全は重要である。最終製品に少なくとも関連している可能性のある重大な悪影響（ＳＡＥ）はそれぞれ、調査員によって予期されるまたは予期しないものとして分類され、プロトコルに従ってフォローアップされる。
【0185】
結果
２４人の含まれる患者の医学的状況に対する明確な洞察。これには安全性および有害事象のパラメーターが含まれ、設定された有効性評価項目に対する洞察を得ることが可能となる。
２４人の含まれる患者の医学的状況に対する明確な洞察。これには安全性および有害事象のパラメーターが含まれ、設定された有効性評価項目に対する洞察を得ることが可能となる。
【0186】
移植片対宿主病、心筋梗塞もしくは肝硬変後の組織再生、または骨形成不全症などの多くの疾患の臨床研究では、ＭＳＣ処置の副作用は以前には全く観察されなかったか、または軽微である。患者における腫瘍発生リスクの増加は知られておらず、異所性組織の形成も観察されていない（ｖｏｎ Ｂａｈｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ；１８：５５７－５６４，ｖｏｎ Ｂａｈｒ Ｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ；３０：１５７５－１５７８）。同様に、１型糖尿病について新たに診断された成人患者での最初の研究では、副作用は観察されなかった（Ｈｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）．Ｅｎｄｏｃｒ Ｊ；６０：３４７－３５７，Ｃａｒｌｓｓｏｎ ＰＯ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１５；６４（２）：５８７－９２）。
【0187】
本研究で使用した製造元からのＷＪＭＳＣは、様々な条件についての病院免除規定（ｈｏｓｐｉｔａｌ ｅｘｅｍｐｔｉｏｎ）の手順で以前から使用されており、細胞の安全性プロファイルは一貫しており、製品に関連する軽度かつ一時的な副作用のみが許容される。しかしながら、基礎疾患により引き起こされた重篤な有害事象および死亡が、死期が迫った（ｉｎｓｔａｎｔ）末期ＡＬＳ患者および治療を受けているグレード４のＧＶＨＤに罹患している患者について報告されている。本研究では、予想される有害事象は、軽度な一過性のインフルエンザ様症状である。
【0188】
薬品を含む最終製品による本発明の処置は、複数のドナー由来の細胞の同種移植であり、ＨＬＡ不適合が保証される。高齢期のＴ１ＤＭ患者が腎移植を必要としている場合、深刻なものになり得る患者のＨＬＡ免疫付与の理論的リスクがある。
【0189】
臨床的に重要ではない外来ＨＬＡに対する抗体は、患者の最大２０％におけると予想される。
【0190】
介入の成功は、対象患者にとって非常に有益であり、より低いＨｂＡ１ｃ、変動が少ない血中グルコース、およびケトアシドーシスのリスク低下を提供する可能性が高いであろう。また、重度の低血糖事象および晩期合併症のリスクも大幅に減少するであろう。処置前および処置後１２ヶ月のＣ－ペプチド濃度の低下は、プラセボ（対照）を受けた患者と比較して、本発明の最終製品を受けた患者の方が少ないと予想される。
【0191】
実施例８
本実施例は、研究集団の選択基準につて記載する。研究に登録された各患者は、すべての組み入れ基準を満たさなければならず、除外基準を満たす必要はない。
本実施例は、研究集団の選択基準につて記載する。研究に登録された各患者は、すべての組み入れ基準を満たさなければならず、除外基準を満たす必要はない。
【0192】
組み入れ基準および除外基準：対象は、新たに診断された１型糖尿病患者の集団から動員される。
【0193】
この研究に組み入れられる資格のある患者は、以下の基準を満たさなければならない：１．研究への参加について書面によるインフォームドコンセントが与えられた場合；２．登録前２年未満に診断された１型糖尿病に適合する病歴；３．試験の第１パートでは、患者１～９には、１８～４０歳の男性患者のみが含まれる。研究の第２パートでは、１８歳～４０歳（両端を含む）の男性および女性の両方の患者である１０～２４人の患者が含まれる；４．空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度＞０．１２ｎｍｏｌ／Ｌ；および５．妊娠していない女性、および承認された避妊／禁欲方法を使用していること。
【0194】
スクリーニングで以下の基準のいずれかを満たす患者は、本研究における組み入れに適格ではない：１．インフォームドコンセントを提供できない；２．ボディマスインデックス（ＢＭＩ）＞３０または体重＞１００ｋｇの患者；３．体重＜５０ｋｇの患者；４．ＮＹＨＡクラスＩＩＩ／ＩＶもしくは狭心症の症状を含む不安定な心血管状態、管理不良高血圧（≧１６０／１０５ｍｍＨｇ）、進行中の活動性感染症、結核、または結核もしくは真菌症のリスクがある、ＨＩＶ、梅毒トレポネーマ、Ｂ型肝炎抗原もしくはＣ型肝炎、脱髄疾患、増殖性網膜症、および以前もしくは既知の悪性腫瘍を有する患者；５．免疫抑制処置を受けている患者；６．妊娠中または授乳中の女性；７．経口抗糖尿病療法またはインスリン以外のグルコース調節を妨害し得る任意の他の併用薬の服用；８．ＧＦＲ＜８０ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２体表面を有する患者；９．任意の賦形剤、すなわちジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に対する過敏性が既知である患者。
【0195】
結果
上記の基準に基づいて、２４人の研究集団を選択する。
上記の基準に基づいて、２４人の研究集団を選択する。
【0196】
実施例９
本実施例は、臨床研究がどのように行われるかについて記載する。本明細書では、本発明のプールされた同種ＭＳＣ組成物を薬品と称し、医薬組成物を最終製品と称する。
本実施例は、臨床研究がどのように行われるかについて記載する。本明細書では、本発明のプールされた同種ＭＳＣ組成物を薬品と称し、医薬組成物を最終製品と称する。
【0197】
材料および方法
最終製品は、寄付された臍帯組織由来ウォートンゼリーから生成され、実施例１～５に記載されるように約４～５週間（最大３継代）にわたって接着培養で増殖した、ＭＳＣを含む細胞懸濁液であった。処置は、同種であり、５～１０人の異なるドナー由来のプールされた増殖ＭＳＣからなる。注入の最低７２時間前に、調査員は最終製品の配達のために製造元に要求書を送った。注入日に、該当する最終製品が製造元によって調査サイトに輸送された。最終製品は、液体窒素輸送キャニスターにおけるクライオバッグ中に保管された。最終製品を滅菌生理食塩水を含む水浴中のベッドサイドで解凍し、１００ｍｌ生理食塩水で希釈して、注入量を１０５ｍｌとした。最終製品を、調製後３０分以内に患者に投与した。
最終製品は、寄付された臍帯組織由来ウォートンゼリーから生成され、実施例１～５に記載されるように約４～５週間（最大３継代）にわたって接着培養で増殖した、ＭＳＣを含む細胞懸濁液であった。処置は、同種であり、５～１０人の異なるドナー由来のプールされた増殖ＭＳＣからなる。注入の最低７２時間前に、調査員は最終製品の配達のために製造元に要求書を送った。注入日に、該当する最終製品が製造元によって調査サイトに輸送された。最終製品は、液体窒素輸送キャニスターにおけるクライオバッグ中に保管された。最終製品を滅菌生理食塩水を含む水浴中のベッドサイドで解凍し、１００ｍｌ生理食塩水で希釈して、注入量を１０５ｍｌとした。最終製品を、調製後３０分以内に患者に投与した。
【0198】
対象および研究担当者の両方が対象の処置について盲検であった。プラセボを、最終製品と同じ組織バッグ（ｔｉｓｓｕｅ ｂａｇｓ）に提供した。対象、調査員、研究現場担当者、ならびにデータのレビューおよび分析に関与するスポンサー担当者は、データベースがクリーンかつロックされるまで研究全体を通して盲検のまま研究した。
【0199】
すべての患者は、皮下に標準的なインスリン処置を受けた。インスリン処置を処方し、臨床日常的診療ごとに薬局から患者によって採取した。インスリン処置または他の免疫抑制処置以外のグルコース調節を妨げ得る併用薬を受けた研究患者は、研究、例えば経口抗糖尿病療法ＧＬＰ－１ ＲＡを中止した。対象は、グルコース調節を妨げない他の薬を服用することは許された。患者が試験薬による処置を開始した後に投与されたすべての薬物療法および重要な非薬物療法（理学療法および輸血を含む）が報告された。
【0200】
研究のパートＩでは、男性患者１～３は２５×１０６個の細胞受け、患者４～６は１００×１０６個の細胞受け、患者７～１０は２００×１０６個の細胞を受けた。各用量コホート間で安全性評価を行い、試験を継続、修正、または中止することを勧告した。
【0201】
研究のパートＩＩでは、男性および女性の患者に、以下の３つの処置群のうちの１つを１：１：１の比で割り当てる；最終製品バッチ１、バッチ２、またはプラセボ注入による注入のいずれか。主要評価項目を１：２の比率で評価し、最終製品（バッチ１および２）で処置した患者をプラセボで処置した患者と比較する。患者は、最終製品を、実施例５で定義されている５％ＨＳＡおよび１０％ＤＭＳＯを含む等張塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液に２０ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で１回の注入として受ける。プラセボ注入は、５％ＨＳＡおよび１０％ＤＭＳＯを含むが細胞を含まない等張ＮａＣｌ溶液からなり、容量は対応している（５ｍｌ）。すべての注入は約２０分にわたって行われる。注入後３時間の任意の急性反応について、患者を観察する。研究の第２部において、２００ｘ１０６個の細胞の固定用量は２～４ｘ１０６個の細胞／ｋｇに相当し、これは確立された用量の範囲内である。したがって、用量調整を行わない。
【0202】
研究は、最終製品またはプラセボの注入後、１年のフォローアップで完了する。その後、患者は標準的なインスリン処置を継続する。
【0203】
最終製品バッチ１を受けた患者のサブグループ分析は、最終製品バッチ２を受けた患者と比較される。安全性および有効性の両方がバッチ間で比較する。
【0204】
結果
上記の手法により、製品の適切な適用が保証され、製品の安全性および有効性を研究することが可能となる。
上記の手法により、製品の適切な適用が保証され、製品の安全性および有効性を研究することが可能となる。
【0205】
Ｐｒｏｔｒａｎｓ研究パート１（９人の処置患者）では、試験薬に関連する主要な有害事象は観察されていない（表１４）。
【表21】
【表22】
【表23】
【0206】
実施例１０
本実施例は、臨床研究で調査されたパラメーターについて記載する。
本実施例は、臨床研究で調査されたパラメーターについて記載する。
【0207】
材料および方法
以下の試験を本臨床試験の評価に使用する。
以下の試験を本臨床試験の評価に使用する。
【0208】
混合食事耐性試験：混合食事負荷試験に応答したＣ－ペプチド濃度としての内因性インスリン産生の測定を行う。一晩の絶食期間の後、患者は標準化されたＭＭＴＴを行う。患者は、供給源タンパク質の溶液（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｎｅｓｔｌｅ，６ｍｌ／ｋｇ，最大用量３６０ｍｌ）を飲む。血液試料を０、１５、３０、６０、９０、および１２０分の時点で分析のために採取する。各時点で採取された末梢静脈血漿中のＣ－ペプチド値を測定し、ＡＵＣ Ｃ－ペプチド濃度を試験用に測定する。
【0209】
糖尿病治療の最適化：患者の盲検システムを使用して、持続グルコースモニタリング（ＣＧＭ）を７２時間行う。研究対象は、グルコース試薬ストリップによる血漿グルコースの自身での測定により、研究における訪問前の連続した３日間の７点プロファイルとして血漿グルコース濃度を記録する。
【0210】
インスリン投与量および測定された血漿グルコース値は、対象自身が、毎日、対象の日記に書き留める。インスリンの量、記録された血漿グルコース値、および日時を含むであろう。これは、以下の計算に使用される。
・１８７日目および３７２日目におけるインスリン非依存患者数（ＡＤＡ基準）。
・１８７日目および３７２日目におけるインスリン＜０．２５Ｕ／ｋｇを毎日必要とする患者の数。
・１８７日目および３７２日目におけるインスリン必要量／ｋｇ体重。
・１８７日目および３７２日目におけるインスリン非依存患者数（ＡＤＡ基準）。
・１８７日目および３７２日目におけるインスリン＜０．２５Ｕ／ｋｇを毎日必要とする患者の数。
・１８７日目および３７２日目におけるインスリン必要量／ｋｇ体重。
【0211】
処置満足度および生活の質：研究における糖尿病処置満足度の変化は、糖尿病処置満足度アンケートを使用して測定される。生活の質および処置満足度は、注入後３７２日目における標準化された糖尿病処置満足度アンケートで分析される。処置の有効性は、処置開始前と比較した場合のこのパラメーターのデルタ変化として測定される。
【0212】
臨床安全性評価：試験中および処置前に数回行われる身体検査。身体検査には、一般的な外観、心臓および肺の聴診の試験が含まれる。バイタルサインには、血圧および脈拍測定が含まれる。心電図試験は、研究中のすべての通院で行われる。網膜検査を伴う眼科検査は、訪問１、４、および８で専門の眼科医によって行われる。
【0213】
血液学：ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球数、白血球数、好中球数、リンパ球数、単球数、および血小板数を測定する。
【0214】
臨床化学、血清学：Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、クレアチニン、シスタチンＣ、ＧＦＲ、総ビリルビン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リン、アルブミン、尿酸を研究前に測定する。慢性感染症のスクリーニングは、ＨＩＶ、トレポネーマパリダム（梅毒）、Ｂ型およびＣ型肝炎についての試験によって行われる。ＣＲＰ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ、総ビリルビン、脂質（総コレステロール、ＬＤＬ、ＨＤＬ、トリグリセリド）、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リン、アルブミン、クレアチニン、シスタチンＣ、ＧＦＲ、および尿酸は、処置前に分析され、その後は通院時に繰り返し分析される。研究前および研究中に繰り返し、Ｐ－グルコース、ＨｂＡ１ｃ、Ｃ－ペプチド、ＨＬＡクラスＩ ａｂ、ＧＡＤ ａｂ、およびＩＡ２ ａｂについて測定が行われる。
【0215】
異なるサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５、ＩＦＮ－γ、およびＴＧＦ－β）の循環レベルの測定のために、個別の血液試料が採取され、市販のＥＬＩＳＡ技法（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ，アビンドン，英国）またはＭｅｓｏｓｃａｌｅ技法を使用して血漿試料中で分析される。ＰＢＭＣは、フローサイトメトリーを使用することにより、抗原提示細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、制御性Ｂ細胞、および他の自然免疫細胞などの異なる免疫細胞の比率を決定するためにさらに研究される。ＰＢＭＣは、免疫調節遺伝子の発現およびインビトロアッセイの測定にも使用される。患者由来の末梢血は、進行中のβ細胞死の非メチル化ＩＮＳ ＤＮＡ測定の循環レベルを測定するために使用される。
【0216】
結果
本実施例は、本明細書に開示される選択アルゴリズムを使用して製剤化された最終製品および本明細書に開示される複数の個体ドナーに由来するプールされたＭＳＣによる処置が、以下の結果のうちの１つ以上を示すと予想される：１２ヶ月にわたるプラセボと比較してＣ－ペプチドのより低い減少；最終製品で処置された集団における持続的なＣ－ペプチド；１２ヶ月にわたるＣ－ペプチドの増加；対照と比較してより低いインスリン依存性およびより低いインスリン必要量。本開示に従って処置される患者は、対照群と比較して、より高い処置満足度および患者の生活の質を示すと予想される。
本実施例は、本明細書に開示される選択アルゴリズムを使用して製剤化された最終製品および本明細書に開示される複数の個体ドナーに由来するプールされたＭＳＣによる処置が、以下の結果のうちの１つ以上を示すと予想される：１２ヶ月にわたるプラセボと比較してＣ－ペプチドのより低い減少；最終製品で処置された集団における持続的なＣ－ペプチド；１２ヶ月にわたるＣ－ペプチドの増加；対照と比較してより低いインスリン依存性およびより低いインスリン必要量。本開示に従って処置される患者は、対照群と比較して、より高い処置満足度および患者の生活の質を示すと予想される。
【0217】
さらに、本処置は、任意の新規同種免疫を生成しないことが示されている。４回目の訪問、すなわち処置後１ヶ月で９人の対象から分析された血液試料は、与えられた用量に関係なく、同種免疫を生じなかった。２人の対象は、処置前にＨＬＡ抗体のＨＬＡ力価が低かった。処置後の力価は維持され、さらに重要なことに、プールされたＭＳＣによって誘発されなかった。したがって、処置は、患者において抗ＨＬＡ抗体力価を誘発しないか、またはたとえあっても低い抗ＨＬＡ抗体力価を誘発しただけである。したがって、抗ＨＬＡ抗体の臨床的に関連する誘導は発生しなかった。ＨＬＡ抗体の発生は用量依存的であることが既知である。複数のドナーを有することにより、単一のドナー由来の細胞が使用された場合よりも任意の同種ＨＬＡの濃度が低くなり、ＨＬＡ免疫に関して臨床的に重要ではない抗体力価などの低い同種免疫がもたらされる。ＨＬＡ免疫化に関して臨床的に関連する抗体力価とみなされるものについての普遍的な閾値はない。しかしながら、固相多重技術による抗体分析により、ＨＬＡ抗体の幅および強さをより正確に定義できるようになった。これらの結果を実際の細胞に基づく交差適合によって得られる結果および最終的な移植結果と相関させることにより、臨床的に関連する抗体を中心特異的な方法で定義することができる（Ｚａｃｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ ｄａｔａ ｆｏｒ ａ ｖｉｒｔｕａｌ ｃｒｏｓｓｍａｔｃｈ．Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００９；７０：５７４－５７９）。さらに、本開示による単離されプールされた同種ＭＳＣ集団は、統計的に有意ではないバッチ間の変動および高い許容レベルを示すと予想される。望ましい機能および特徴を有する細胞を選択するため、深刻な有害事象は予想されない。
【0218】
実施例１１
本実施例は、第２の臨床研究がどのように行われるかについて記載する。本明細書では、本発明のプールされた同種ＭＳＣ組成物を薬品と称し、医薬組成物を最終製品と称する。薬品で以前に処置した対象には、実施例９に記載の臨床試験完了後に参加を求められる。試験の目的は、薬品による繰り返し処置の安全性および有効性を調査することである。
本実施例は、第２の臨床研究がどのように行われるかについて記載する。本明細書では、本発明のプールされた同種ＭＳＣ組成物を薬品と称し、医薬組成物を最終製品と称する。薬品で以前に処置した対象には、実施例９に記載の臨床試験完了後に参加を求められる。試験の目的は、薬品による繰り返し処置の安全性および有効性を調査することである。
【0219】
材料および方法
最終製品は、寄付された臍帯組織由来ウォートンゼリーから生成され、実施例１～５に記載されるように約４～５週間（最大３継代）にわたって接着培養で増殖した、ＭＳＣを含む細胞懸濁液である。処置は、同種であり、５～１０人のドナー由来のプールされた増殖ＭＳＣからなる。注入の最低７２時間前に、調査員は最終製品の配達のために製造元に要求を送る。注入日に、該当する最終製品が製造元によって調査サイトに輸送される。最終製品を、液体窒素輸送キャニスターにおけるクライオバッグ中に保管する。最終製品を滅菌生理食塩水を含む水浴中のベッドサイドで解凍し、１００ｍｌの生理食塩水で希釈し、注入量は１０５ｍｌとする。最終製品を、調製後３０分以内に患者に投与する。
最終製品は、寄付された臍帯組織由来ウォートンゼリーから生成され、実施例１～５に記載されるように約４～５週間（最大３継代）にわたって接着培養で増殖した、ＭＳＣを含む細胞懸濁液である。処置は、同種であり、５～１０人のドナー由来のプールされた増殖ＭＳＣからなる。注入の最低７２時間前に、調査員は最終製品の配達のために製造元に要求を送る。注入日に、該当する最終製品が製造元によって調査サイトに輸送される。最終製品を、液体窒素輸送キャニスターにおけるクライオバッグ中に保管する。最終製品を滅菌生理食塩水を含む水浴中のベッドサイドで解凍し、１００ｍｌの生理食塩水で希釈し、注入量は１０５ｍｌとする。最終製品を、調製後３０分以内に患者に投与する。
【0220】
対象および研究担当者の両方が対象の処置について盲検である。プラセボは、最終製品と同じ組織バッグで提供される。対象、調査員、研究現場担当者、ならびにデータのレビューおよび分析に関与するスポンサー担当者は、データベースがクリーンかつロックされるまで研究全体を通して盲検のまま研究する。ＳＡＥなどの緊急の場合にのみ、研究が完了する前に盲検を解除してもよい。
【0221】
すべての患者は、皮下に標準的なインスリン処置を受ける。インスリン処置を処方し、臨床日常的診療ごとに薬局から患者によって採取した。インスリン処置または他の免疫抑制処置以外のグルコース調節を妨げ得る併用薬を受けた研究患者は、研究、例えば経口抗糖尿病療法ＧＬＰ－１ ＲＡを中止する。対象は、グルコース調節を妨げない他の薬を服用することは許される。患者が試験薬による処置を開始した後に投与されたすべての薬物療法および重要な非薬物療法（理学療法および輸血を含む）が報告される。
【0222】
第１の臨床試験の第１パート（用量増加）を完了した患者のみが、以前に受けたのと同じ用量の第２の用量による薬品の処置のために登録され、患者１～３は２５ｘ１０６個の細胞を受け、患者４～６は１００ｘ１０６個の細胞を受け、患者７～１０は２００ｘ１０６個の細胞を受ける。さらに、ベースラインデータが一致する９人の患者は、任意の介入なく対照群として追跡される。
【0223】
実施例１２
本実施例は、バッチ内変動の分析について記載する。本明細書に開示される選択アルゴリズムによってプールのために選択された個体ドナー由来のＭＳＣ集団と、すべての個体ドナー由来のＭＳＣ集団（選択されていない集団を含む）と、のアッセイ結果の間で比較を行う。
本実施例は、バッチ内変動の分析について記載する。本明細書に開示される選択アルゴリズムによってプールのために選択された個体ドナー由来のＭＳＣ集団と、すべての個体ドナー由来のＭＳＣ集団（選択されていない集団を含む）と、のアッセイ結果の間で比較を行う。
【0224】
方法および結果
個体ドナー由来のＭＳＣ集団を、実施例３に記載するＩＤＯアッセイ、増殖アッセイ、およびＰＧＥ２アッセイにより分析した。評価の変動は次式で計算される。
式中、最大値および最小値は、得られた最大および最小アッセイ結果である。
個体ドナー由来のＭＳＣ集団を、実施例３に記載するＩＤＯアッセイ、増殖アッセイ、およびＰＧＥ２アッセイにより分析した。評価の変動は次式で計算される。
【数3】
【0225】
個体ドナー由来細胞からのＩＤＯ倍数誘導の合計範囲は５０～２００倍であり、ドナーは１３０～２００倍の範囲の選択アルゴリズムで最終的に選択された。個体ドナー由来細胞からの増殖指数の合計範囲は１．１４～１．０７であり、ドナーは１．１３～１．０７の範囲の選択アルゴリズムで最終的に選択された。個体ドナー由来細胞によって誘導されたＰＧＥ２発現の合計範囲は０．２９～１．７６であり、ドナーは０．６１～１．４２の範囲の選択アルゴリズムで最終的に選択される。
【0226】
ドナー由来ＭＳＣ集団間の変動を上記の式に従って定量化した。結果は、ＩＤＯアッセイの変動については５３％低下し、増殖アッセイの変動については１４％低下し、ＰＧＥ２アッセイの変動については４５％低下することを示している（図４を参照）。
【0227】
選択アルゴリズムで計算された総合評価の変動は、分析されたすべての細胞のスコアおよび選択された細胞のスコアと比較して、変動を４０％低下させた（図４を参照）。
【0228】
実施例１３
本実施例は、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団間のバッチ間変動の分析について記載する。
本実施例は、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団間のバッチ間変動の分析について記載する。
【0229】
方法および結果
本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団（薬品）を、実施例３に記載されるＩＤＯアッセイ、増殖アッセイ、およびＰＧＥ２アッセイによって分析した。別々のバッチからの薬品のアッセイ結果を比較した。選択アルゴリズムによって選択されたプールされたドナー由来の細胞を用いて、本明細書に開示される方法に従って３つのバッチの薬品を製造した。薬品バッチの命名は、ＴＢ１（技術バッチ番号１、非臨床使用を意図）、ＣＢ１およびＣＢ２（それぞれ、実施例９および１１に記載される臨床試験で使用される臨床バッチ１および２）である。３つのバッチＴＢ１、ＣＢ１、およびＣＢ２からの薬品を分析に供した。
本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団（薬品）を、実施例３に記載されるＩＤＯアッセイ、増殖アッセイ、およびＰＧＥ２アッセイによって分析した。別々のバッチからの薬品のアッセイ結果を比較した。選択アルゴリズムによって選択されたプールされたドナー由来の細胞を用いて、本明細書に開示される方法に従って３つのバッチの薬品を製造した。薬品バッチの命名は、ＴＢ１（技術バッチ番号１、非臨床使用を意図）、ＣＢ１およびＣＢ２（それぞれ、実施例９および１１に記載される臨床試験で使用される臨床バッチ１および２）である。３つのバッチＴＢ１、ＣＢ１、およびＣＢ２からの薬品を分析に供した。
【0230】
各実験を２回行い、すべてのバッチを２つの反復で各実験で分析した。
【0231】
アッセイ内の標準偏差および変動係数は、同じアッセイで、すなわち、２つの反復間の標準偏差に基づき計算され、変動係数は、平均値によって除算した標準偏差として計算された。
【0232】
アッセイ間の標準偏差および変動係数は、２つの実験の平均値間の標準偏差および変動係数として計算された。
【0233】
バッチ間の標準偏差および変動係数は、ＩＤＯ、ＰＧＥ２、およびＰＩについて両方の実験におけるすべての反復の平均値に基づいてそれぞれ計算された。
【0234】
結果を表１５ａ～ｃに示す。
【表24】
【表25】
【表26】
【表27】
【0235】
纏めると、本実施例は、反復間のアッセイ内標準偏差およびアッセイ間標準偏差（別々の分析からの平均値間）が、異なるバッチ間の標準偏差よりも高いことを示している。したがって、バッチ間に差がないこと、したがって、本明細書に開示される単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の異なるバッチ間で統計的に有意なバッチ間の変動がないことが示される。
【0236】
実施形態の項目別リスト
１．少なくとも３の個体ドナーに由来する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法であって、いずれか１のドナー由来の細胞の数が、総細胞数の５０％を超えず、前記ＭＳＣは最大８つの継代に供されており、
－少なくとも３より多い個体ドナー由来のＭＳＣを培養して、少なくとも３より多い個体ドナー由来のＭＳＣ集団を得る工程と、
－少なくとも３つのアッセイを使用して各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイし、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団についての少なくとも３つのアッセイ結果を得る工程であって、上記少なくとも３つのアッセイは、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団の免疫抑制能力を測定する少なくとも１つのアッセイを含む、工程と、
－各アッセイについて、アッセイ結果に基づいて個体のランク付けスコア値を各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当て、したがって、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団について少なくとも３つの個体ランク付けスコア値を得る工程であって、より高いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示すか、またはより低いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す、工程と、
－少なくとも３つの個体ランク付けスコア値に基づいて、合計スコア値を各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てる工程であって、より高いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より高い合計スコア値がより望ましい集団特性を示し、またはより低いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より低い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す、工程と、
－それらの合計スコア値に基づいて、望ましい集団特性を有する個体ドナー由来のＭＳＣ集団のサブセットを選択する工程と、
－上記選択された個体ドナー由来のＭＳＣ集団をプールして、単離されプールされた同種間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団を得る工程と、を含み、
上記プールされた同種ＭＳＣ集団は、上記プール工程後にさらに培養されず、
前記少なくとも３つのアッセイは、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）活性を測定する１つのアッセイ、上記ＭＳＣによって分泌されたプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖に対する上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイを含む、方法。
１．少なくとも３の個体ドナーに由来する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法であって、いずれか１のドナー由来の細胞の数が、総細胞数の５０％を超えず、前記ＭＳＣは最大８つの継代に供されており、
－少なくとも３より多い個体ドナー由来のＭＳＣを培養して、少なくとも３より多い個体ドナー由来のＭＳＣ集団を得る工程と、
－少なくとも３つのアッセイを使用して各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイし、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団についての少なくとも３つのアッセイ結果を得る工程であって、上記少なくとも３つのアッセイは、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団の免疫抑制能力を測定する少なくとも１つのアッセイを含む、工程と、
－各アッセイについて、アッセイ結果に基づいて個体のランク付けスコア値を各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当て、したがって、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団について少なくとも３つの個体ランク付けスコア値を得る工程であって、より高いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示すか、またはより低いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す、工程と、
－少なくとも３つの個体ランク付けスコア値に基づいて、合計スコア値を各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てる工程であって、より高いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より高い合計スコア値がより望ましい集団特性を示し、またはより低いランク付けスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より低い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す、工程と、
－それらの合計スコア値に基づいて、望ましい集団特性を有する個体ドナー由来のＭＳＣ集団のサブセットを選択する工程と、
－上記選択された個体ドナー由来のＭＳＣ集団をプールして、単離されプールされた同種間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団を得る工程と、を含み、
上記プールされた同種ＭＳＣ集団は、上記プール工程後にさらに培養されず、
前記少なくとも３つのアッセイは、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）活性を測定する１つのアッセイ、上記ＭＳＣによって分泌されたプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖に対する上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイを含む、方法。
【0237】
２．少なくとも１つのアッセイについての個体ランク付けスコア値が、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団についてのアッセイ結果と、残りの個体ドナー由来のＭＳＣ集団についての結果と、の比較に基づいて、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てられる、項目１に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0238】
３．少なくとも１つのアッセイについての個体ランク付けスコア値が、上記個体ドナー由来のＭＳＣ集団について得られた絶対アッセイ結果に基づいて、上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てられる、項目１または２に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0239】
４．上記絶対結果が少なくとも所定の値または多くても所定の値に対応する場合に、アッセイ結果が望ましいとみなされ、得られた望ましいアッセイ結果を反映する個体ランク付けスコア値が割り当てられる、項目３に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0240】
５．望ましい集団特性を有する個体ドナー由来ＭＳＣ集団のサブセットを選択する工程が、より高い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す場合、少なくとも所定の値に対応する合計スコア値、またはより低い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す場合、多くても所定の値低い合計スコア値に対応する合計スコア値を有する個体ドナー由来のＭＳＣ集団を選択することを含む、項目１～４のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0241】
６．望ましい集団特性を有する個体ドナー由来ＭＳＣ集団のサブセットを選択する工程が、所定の数の個体ドナー由来のＭＳＣ集団を選択することを含み、より高い合計スコア値がより望ましい集団を示す場合、上記集団が、残りの個体ドナー由来のＭＳＣ集団と比較してより高い合計スコア値を示すか、またはより低い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す場合、上記集団が、残りの個体ドナー由来のＭＳＣ集団と比較してより低い合計スコア値を示す、項目１～４のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0242】
７．上記ＭＳＣが、最大７つの継代、例えば最大６つの継代、例えば最大５つの継代、例えば最大４つの継代、例えば最大３つの継代、例えば最大１つ、２つ、または３つの継代、例えば２つまたは３つの継代に供されている、項目１～６のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0243】
８．上記ＭＳＣが、骨髄由来ＭＳＣ、末梢血由来ＭＳＣ、脂肪組織由来ＭＳＣ、歯組織由来ＭＳＣ、胎盤由来ＭＳＣ、臍帯由来ＭＳＣ、羊水由来ＭＳＣ、臍帯血由来ＭＳＣ、ウォートンゼリー由来ＭＳＣ、脱落膜由来ＭＳＣ、軟骨膜由来ＭＳＣ、および羊膜由来ＭＳＣからなる群、例えば、胎盤由来ＭＳＣ、臍帯由来ＭＳＣ、羊水由来ＭＳＣ、臍帯血由来ＭＳＣ、ウォートンゼリー由来ＭＳＣ、脱落膜由来ＭＳＣ、軟骨膜由来ＭＳＣ、歯髄由来ＭＳＣ、および羊膜由来ＭＳＣからなる群から選択される、項目１～７のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0244】
９．上記ＭＳＣが、臍帯由来ＭＳＣおよびウォートンゼリー由来ＭＳＣからなる群から選択され、例えば、上記ＭＳＣが、ウォートンゼリー由来ＭＳＣである、項目８に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0245】
１０．上記集団が、少なくとも４の個体ドナー、例えば少なくとも５の個体ドナー、例えば少なくとも６の個体ドナー、例えば少なくとも７の個体ドナー、例えば少なくとも８の個体ドナー、例えば少なくとも９の個体ドナー、例えば少なくとも１０の個体ドナー由来のＭＳＣを含む、項目１～９のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0246】
１１．上記集団が、３～２０の個体ドナー、例えば３～１５の個体ドナー、例えば３～１０の個体ドナー、例えば４～８の個体ドナー、例えば５～７の個体ドナー、例えば５、６、または７の個体ドナーに由来するＭＳＣを含む、項目１～９のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0247】
１２．各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイする工程が、プール工程でプールされた個体ドナー由来のＭＳＣ集団の少なくとも１～４倍、例えば２～４倍、例えば２～３倍または３～４倍の個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイすることを含む、項目１～１１のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0248】
１３．各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイする工程が、少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば少なくとも９、例えば少なくとも１０、例えば少なくとも１１、例えば少なくとも１２、例えば少なくとも１３、例えば少なくとも１４、例えば少なくとも１５、例えば少なくとも１６、例えば少なくとも１７、例えば少なくとも１８、例えば少なくとも１９、例えば少なくとも２０の個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイすることを含む、項目１～１２のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0249】
１４．各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイする工程が、３～５０の個体ドナー由来のＭＳＣ集団、例えば４～５０、例えば５～５０、例えば６～５０、例えば６～３０、例えば６～２０、例えば６～１５、例えば８～１２の個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイすることを含む、項目１～１２のいずれか１つに記載のプールされた同種ＭＳＣ集団を得る方法。
【0250】
１５．少なくとも３つのアッセイを使用して各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイする工程が、例えば少なくとも１つの機能的アッセイ、例えば少なくとも２つの機能的アッセイ、例えば少なくとも３つの機能的アッセイ、例えば少なくとも４つの機能的アッセイ、例えば少なくとも５つの機能的アッセイを使用することを含む、項目１～１４のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0251】
１６．上記のＰＢＭＣ増殖が、Ｔリンパ球の増殖、例えば、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激Ｔリンパ球の増殖である、項目１～１５のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0252】
１７．上記ＭＳＣによって分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定する上記少なくとも１つのアッセイが、ＰＢＭＣ、例えばＰＨＡ刺激ＰＢＭＣ、例えばＰＨＡ刺激Ｔリンパ球と共培養したときに上記ＭＳＣによって分泌されるプロスタグランジンＥ２を測定することを含む、項目１～１６のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0253】
１８．上記少なくとも３つのアッセイが、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＰＨＡ、および／またはＧＡＢＡに応答して、例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、および／またはＰＨＡに応答して、上記ＭＳＣにおけるＨＬＡ－Ｇ発現を測定する少なくとも１つのアッセイをさらに含む、項目１～１７のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0254】
１９．上記少なくとも３つのアッセイが、タンパク質発現および／またはサイトカイン発現を測定する少なくとも１つのアッセイをさらに含む、項目１～１８のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0255】
２０．タンパク質発現および／またはサイトカイン発現を測定する上記少なくとも１つのアッセイが、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２／１３、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２９、ＩＬ－３１、ＴＧＦβ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＭ－ＣＦＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、アポＥ、およびＴＮＦαからなる群、例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＴＧＦβからなる群、例えば、少なくともＩＬ－６からなる群から選択される１つまたはいくつかのタンパク質またはサイトカインの発現を測定する、項目１９に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0256】
２１．上記タンパク質および／またはサイトカインのうちの少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも４つ、例えば少なくとも５つ、例えば少なくとも６つ、例えば少なくとも７つ、例えば少なくとも８つ、例えば少なくとも９つ、例えば少なくとも１０個、例えば少なくとも１１個、例えば少なくとも１２個、例えば少なくとも１３個、例えば少なくとも１４個、例えば少なくとも１５個、例えば少なくとも１６個、例えば少なくとも１７個、例えば少なくとも１８個、例えば１９個すべてが測定される、項目２０に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0257】
２２．上記発現が、少なくとも１つの刺激の非存在下および／または存在下で測定される、項目１９～２１のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0258】
２３．上記刺激が、免疫応答修飾刺激である、項目２２に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0259】
２４．上記免疫応答修飾刺激が、ＰＢＭＣ、刺激されたＰＢＭＣ、例えばＰＨＡで刺激されたＰＢＭＣ、ＩＬ１０、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、およびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）からなる群から選択される、項目２３に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0260】
２５．上記免疫応答修飾刺激が、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）である、項目２４に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0261】
２６．上記刺激が、サイトカイン、例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）である、項目２４に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0262】
２７．刺激が、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、レシキモド（ｒ８４８）、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、およびＩＦＮγからなる群、例えば、ポリＩ：ＣおよびＩＦＮγからなる群から選択される、項目２２～２６のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0263】
２８．刺激が、ＰＢＭＣ、例えば刺激または非刺激ＰＢＭＣ、例えばＰＨＡ刺激ＰＢＭＣ、例えばＰＨＡ刺激Ｔリンパ球である、項目２２または２３に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0264】
２９．上記少なくとも３つのアッセイが、少なくとも１つの形態学的アッセイを含む、項目１～２８のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0265】
３０．上記形態学的アッセイが、細胞および／または細胞核の形態学的特徴をアッセイする、項目２９に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0266】
３１．細胞および／または細胞核の上記形態学的特徴が、細胞のサイズ、核のサイズ、細胞の形状、および細胞サイズと核サイズとの比からなる群から選択される１つ以上の特徴である、項目３０に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0267】
３２．個体ドナー由来のＭＳＣ集団が、少なくとも９０％以上、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の正常な細胞および／または核を示す場合にのみ、プールに適格である、項目２９～３１のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0268】
３３．少なくとも３つのアッセイを使用して各個体ドナー由来のＭＳＣ集団をアッセイする工程が、ＭＳＣ集団が継代０（ｐ０）～継代８（ｐ８）、例えばｐ１～ｐ５、例えばｐ１～ｐ４、例えばｐ２～ｐ４、またはｐ１～ｐ４、例えばｐ１、ｐ２、および／またはｐ３、例えばｐ２、および／またはｐ３である場合に行われる、項目１～３２のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0269】
３４．細胞が、プールされるときと同じ継代にある場合に、少なくとも１つのアッセイ、例えば少なくとも２つのアッセイ、例えば少なくとも３つのアッセイ、例えばすべてのアッセイが行われる、項目１～３３のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0270】
３５．少なくとも２つのアッセイが、異なる継代で行われる、項目１～３３のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0271】
３６．上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てられた上記合計スコア値は、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団についてのランク付けスコア値の加算によって得られる加算合計スコア値である、項目１～３５のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0272】
３７．上記各個体ドナー由来のＭＳＣ集団に割り当てられた上記合計スコア値が、１）各アッセイについてのランク付けスコア値に重みを割り当てること、および２）個体ドナー由来のＭＳＣ集団について重み付けされたランク付けスコア値を加算することによって得られる重み付け合計スコア値である、項目１～３５のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0273】
３８．望ましい集団特性を有する個体ドナー由来ＭＳＣ集団のサブセットを選択する工程が、少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば少なくとも９、例えば少なくとも１０の個体ドナー由来のＭＳＣ集団を選択することを含む、項目１～３７のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0274】
３９．個体１～３８のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法であって、上記集団において、いずれか１のドナー由来の細胞の数が、総細胞数の４５％を超えず、例えば４０％を超えず、例えば３５％を超えず、上記集団が少なくとも３のドナーに由来するＭＣＳを含み、例えば、上記集団において、いずれか１のドナー由来の細胞の数が、総細胞数の４０％を超えず、例えば３５％を超えず、例えば３０％を超えず、上記集団が少なくとも４のドナー由来のＭＣＳを含み、例えば、上記集団において、いずれか１のドナー由来の細胞の数が、総細胞数の３５％を超えず、例えば３０％を超えず、例えば２５％を超えず、上記集団が少なくとも５のドナー由来のＭＣＳを含み、例えば、上記集団において、いずれか１のドナー由来の細胞の数が、総細胞数の３０％を超えず、例えば２５％を超えず、例えば２０％を超えず、上記集団が少なくとも６のドナー由来のＭＣＳを含み、例えば、上記集団において、いずれか１のドナー由来の細胞の数が、総細胞数の２５％を超えず、例えば２２％を超えず、例えば２０％を超えず、上記集団が少なくとも７のドナー由来のＭＣＳを含む、方法。
【0275】
４０．項目１～３９のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法であって、上記集団において、いずれか１のドナー由来のＭＳＣの数が、他のドナーに由来の細胞の数の４倍、例えば３倍、例えば２倍を超えない、方法。
【0276】
４１．上記個体ドナー由来ＭＳＣ集団のアッセイ結果が、項目１～４０のいずれか１つに記載の方法によって以前に得られたプールされた同種ＭＳＣ集団についての対応するアッセイ結果よりも望まくない場合、個体ドナー由来のＭＳＣ集団をプール工程から廃棄する工程をさらに含む、項目１～４０のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を得るための方法。
【0277】
４２．項目１～４１のいずれか１つに記載の方法により得られ、上記集団がプール後にさらに培養されない、単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0278】
４３．上記集団が、統計的に有意なバッチ間の変動を示さない、項目４２に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0279】
４４．薬剤として使用するための、項目４３に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0280】
４５．炎症性疾患または状態、自己免疫疾患、および移植拒絶からなる群から選択される疾患または状態の処置および／または予防に使用するための、項目４４に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0281】
４６．上記使用が、それを必要とする患者への注入として上記ＭＳＣ集団の投与を含む、項目４４または４５に記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0282】
４７．上記注入が、静脈内、腹腔内、リンパ内、静脈内、髄腔内、脳内、動脈内、皮下、またはオンマヤリザーバーにより投与され、例えば、静脈内、腹腔内、リンパ内に投与される、項目４６に記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0283】
４８．上記注入が繰り返し行われる、項目４４～４７のいずれか１つに記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0284】
４９．上記注入が１回のみ行われる、項目４４～４７のいずれか１つに記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0285】
５０．上記投与が、患者において抗ＨＬＡ抗体力価を誘発しないかまたは低い抗ＨＬＡ抗体力価を誘発する、項目４４～４９のいずれか１つに記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0286】
５１．上記炎症性疾患または状態が、自己免疫疾患からなる群から選択される、項目４４～５０のいずれか１つに記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0287】
５２．上記自己免疫疾患が、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、および関節炎からなる群から選択される、項目５１に記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0288】
５３．上記自己免疫疾患が、１型糖尿病または成人潜在性自己免疫糖尿病（ＬＡＤＡ）である、項目５２に記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0289】
５４．上記１型糖尿病またはＬＡＤＡが、１型糖尿病またはＬＡＤＡであると最近診断された、例えば上記注入を投与する前の３年以内、例えば２年以内、例えば１年以内に１型糖尿病またはＬＡＤＡであると診断された、項目５３に記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0290】
５５．上記患者が、Ｃ－ペプチドを発現する、項目５２～５４のいずれか１つに記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0291】
５６．上記患者が、空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度≧０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ、例えば≧０．０４ｎｍｏｌ／Ｌ、例えば≧０．０８ｎｍｏｌ／Ｌ、例えば≧０．１２ｎｍｏｌ／Ｌを示す、項目５５に記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0292】
５７．処置および／または予防が、未処置の患者と比較して、注入を受けた患者における血漿Ｃ－ペプチド濃度のより低い減少率をもたらす、項目５２～５６のいずれか１つに記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0293】
５８．注入を受けた患者における血漿Ｃ－ペプチド濃度の上記減少率が、未処置の患者よりも少なくとも１０％より低く、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％より低い、項目５２～５７のいずれか１つに記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0294】
５９．処置および／または予防が、上記処置前の空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度と比較して、患者における空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度の増加をもたらす、項目５２～５８のいずれか１つに記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0295】
６０．上記疾患または状態が、移植拒絶である、項目４４～５０のいずれか１つに記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0296】
６１．上記使用が、上記患者に、少なくとも３ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも１０ｘ１０６細胞、例えば少なくとも１５ｘ１０６細胞、例えば少なくとも２０ｘ１０６個の細胞、少なくとも２５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約５０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約７５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１００ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１２５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１５０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１７５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約２００ｘ１０６個の細胞の用量を投与することを含む、項目４４～６０のいずれか１つに記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0297】
６２．上記使用が、上記患者に、少なくとも０，１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも０．５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも１０ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量を投与することを含む、項目４４～６０のいずれか１つに記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0298】
６３．上記使用が、上記患者に、約０．１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～１０ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば０．２５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば０．２５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～４ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば０．５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～４ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～４ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～３ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば２ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～３ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、または１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～２ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量を投与することを含む、項目４４～６２のいずれか１つに記載の使用のための単離されプールされた同種ＭＳＣ集団。
【0299】
６４．項目４４～６３のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団、および少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤または担体を含む、医薬組成物。
【0300】
６５．約少なくとも３ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも１０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも１５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも２０ｘ１０６個の細胞、少なくとも２５ｘ１０６個の細胞、例えば約少なくとも５０ｘ１０６個の細胞、例えば約少なくとも７５ｘ１０６個の細胞、例えば約少なくとも１００ｘ１０６個の細胞、例えば約少なくとも１２５ｘ１０６個の細胞、例えば約少なくとも１５０ｘ１０６個の細胞、例えば約少なくとも１７５ｘ１０６個の細胞、例えば約少なくとも２００ｘ１０６個の細胞を含む、項目６４に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を含む医薬組成物。
【0301】
６６．注入、例えば、静脈内注入、腹腔内注入、リンパ内注入、静脈内注入、髄腔内注入、脳内注入、動脈内注入、皮下注入、またはオンマヤリザーバーを介した注入、例えば、静脈内注入、腹腔内注入、またはリンパ内注入用に製剤化された、項目６４または６５に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団を含む医薬組成物。
【0302】
６７．炎症性疾患または状態、自己免疫疾患、および移植拒絶からなる群から選択される疾患または状態の処置および／または予防のための方法であって、治療有効量の、項目４４～６３のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団または項目６４～６６のいずれか１つに記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に、投与することを含む、方法。
【0303】
６８．上記ＭＳＣ集団の上記投与が、注入、例えば、静脈内注入、腹腔内注入、リンパ内注入、静脈内注入、髄腔内注入、脳内注入、動脈内注入、皮下注入、またはオンマヤリザーバーを介した注入、例えば、静脈内注入、腹腔内注入、またはリンパ内注入よる、項目６７に記載の処置および／または予防のための方法。
【0304】
６９．上記注入が繰り返し行われる、項目６７または６８に記載の処置および／または予防のための方法。
【0305】
７０．上記注入が１回のみ行われる、項目６７または６８に記載の処置および／または予防のための方法。
【0306】
７１．上記投与が、患者において抗ＨＬＡ抗体力価を誘発しないかまたは低い抗ＨＬＡ抗体力価を誘発する、項目６７～７０のいずれか１つに記載の処置および／または予防のための方法。
【0307】
７２．上記炎症性疾患または状態が、自己免疫疾患からなる群から選択される、項目６７～７１のいずれか１つに記載の処置および／または予防のための方法。
【0308】
７３．上記自己免疫疾患が、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、および関節炎からなる群から選択される、項目６７～７２のいずれか１つに記載の処置のための方法。
【0309】
７４．上記自己免疫疾患が、１型糖尿病またはＬＡＤＡである、項目７３に記載の処置および／または予防のための方法。
【0310】
７５．上記１型糖尿病またはＬＡＤＡが、１型糖尿病またはＬＡＤＡであると最近診断された、例えば上記注入を投与する前の３年以内、例えば２年以内、例えば１年以内に１型糖尿病またはＬＡＤＡであると診断された、項目７４に記載の処置および／または予防のための方法。
【0311】
７６．上記患者が、Ｃ－ペプチドを発現する、項目７４～７６のいずれか１つに記載の処置および／または予防のための方法。
【0312】
７７．上記患者が、空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度≧０．０１ｎｍｏｌ／Ｌ、例えば、≧０．０４ｎｍｏｌ／Ｌ、例えば、≧０．０８ｎｍｏｌ／Ｌ、例えば、≧０．１２ｎｍｏｌ／Ｌを示す、項目７６に記載の処置および／または予防のための方法。
【0313】
７８．処置および／または予防が、未処置の患者と比較して、注入を受けた患者における血漿Ｃ－ペプチド濃度のより低い減少率をもたらす、項目７３～７７のいずれか１つに記載の処置および／または予防のための方法。
【0314】
７９．注入を受けた患者における血漿Ｃ－ペプチド濃度の上記減少率が、未処置の患者よりも少なくとも１０％より低く、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％より低い、項目７３～７８のいずれか１つに記載の処置および／または予防のための方法。
【0315】
８０．処置および／または予防が、上記注入前の空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度と比較して、患者における空腹時血漿Ｃ－ペプチド濃度の増加をもたらす、項目７３～７９のいずれか１つに記載の処置および／または予防のための方法。
【0316】
８１．上記疾患または状態が、移植拒絶である、項目７１～７６のいずれか１つに記載の処置のための方法。
【0317】
８２．上記方法が、上記患者に、少なくとも３ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも１０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも１５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも２０ｘ１０６の細胞、少なくとも２５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約５０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約７５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１００ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１２５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１５０ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約１７５ｘ１０６個の細胞、例えば少なくとも約２００ｘ１０６個の細胞の用量を投与することを含む、項目６７～８１のいずれか１つに記載の処置および／または予防のための方法。
【0318】
８３．上記方法が、上記患者に、少なくとも０，１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも０，５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば少なくとも１０ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量を投与することを含む、項目６７～８２のいずれか１つに記載の処置および／または予防のための方法。
【0319】
８４．上記方法が、上記患者に、約０．１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～１０ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば０．２５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば０．２５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～４ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば０．５ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～４ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～４ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～３ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、例えば２ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～３ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重、または１ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重～２ｘ１０６個の細胞／ｋｇ体重の用量を投与することを含む、項目６７～８３のいずれか１つに記載の処置および／または予防のための方法。
【0320】
８５．炎症性疾患または状態、自己免疫疾患、および移植拒絶からなる群から選択される疾患または状態の処置のための薬剤の製造における、項目４４～６３のいずれか１つに記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の使用。
【0321】
８６．ＭＳＣ集団の効力を評価するための方法であって、ＭＳＣ集団を培養または提供する工程と、
少なくとも３つのアッセイを使用して上記ＭＳＣ集団をアッセイして、少なくとも３つのアッセイ結果を得る工程であって、上記少なくとも３つのアッセイが、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団の免疫抑制能力を測定する少なくとも１つのアッセイを含む、工程と、
各アッセイについて、アッセイ結果に基づいてスコア値を上記ＭＳＣ集団に割り当てる工程であって、より高いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示すか、または低いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す、工程と、
各アッセイに割り当てられたスコア値に基づいて、合計スコア値を上記ＭＳＣ集団に割り当てる工程であって、より高いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より高い合計スコア値がより望ましい集団特性を示し、またはより低いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より低い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す、工程と、
より高いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合において、上記合計スコア値が所定の閾値を超える場合にＭＳＣ集団を効力があるとして適格とするか、またはより低いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合において、上記合計スコア値が所定の閾値を下回る場合にＭＳＣ集団を効力があるとして適格とする、工程と、を含む、方法。
少なくとも３つのアッセイを使用して上記ＭＳＣ集団をアッセイして、少なくとも３つのアッセイ結果を得る工程であって、上記少なくとも３つのアッセイが、各個体ドナー由来のＭＳＣ集団の免疫抑制能力を測定する少なくとも１つのアッセイを含む、工程と、
各アッセイについて、アッセイ結果に基づいてスコア値を上記ＭＳＣ集団に割り当てる工程であって、より高いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示すか、または低いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す、工程と、
各アッセイに割り当てられたスコア値に基づいて、合計スコア値を上記ＭＳＣ集団に割り当てる工程であって、より高いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より高い合計スコア値がより望ましい集団特性を示し、またはより低いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合、より低い合計スコア値がより望ましい集団特性を示す、工程と、
より高いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合において、上記合計スコア値が所定の閾値を超える場合にＭＳＣ集団を効力があるとして適格とするか、またはより低いスコア値がより望ましいアッセイ結果を示す場合において、上記合計スコア値が所定の閾値を下回る場合にＭＳＣ集団を効力があるとして適格とする、工程と、を含む、方法。
【0322】
８７．上記少なくとも３つのアッセイが、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）活性を測定する１つのアッセイ、上記ＭＳＣによって分泌されたプロスタグランジンＥ２を測定する１つのアッセイ、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖に対する上記ＭＳＣの効果を測定する１つのアッセイを含む、項目８６に記載の方法。
【0323】
８８．上記少なくとも３つのアッセイが、項目１５～３２のいずれか１つに従って定義される、項目８６または８７に記載の方法。
【0324】
８９．免疫細胞の共培養のための、項目４２または４３に記載の単離されプールされた同種ＭＳＣ集団の使用。
【0325】
９０．上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が、免疫細胞の共培養のためのフィーダー細胞として使用される、項目８９に記載の使用。
【0326】
９１．上記単離されプールされた同種ＭＳＣ集団が、上記集団と共培養された免疫細胞の刺激に使用される、項目８９に記載の使用。
【図1】
【図2】
【図3A-1】
【図3A-2】
【図3A-3】
【図3A-4】
【図3B-1】
【図3B-2】
【図3B-3】
【図3B-4】
【図4】
