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特許7535102ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）の従属栄養培養によってアスタキサンチンを産生する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-06
(45)【発行日】2024-08-15
(54)【発明の名称】ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）の従属栄養培養によってアスタキサンチンを産生する方法
(51)【国際特許分類】
C12P 23/00 20060101AFI20240807BHJP
C12N 1/12 20060101ALI20240807BHJP
【ＦＩ】
C12P23/00
C12N1/12 B
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2022516374
(86)(22)【出願日】2020-09-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-16
(86)【国際出願番号】 CN2020116777
(87)【国際公開番号】W WO2021057711
(87)【国際公開日】2021-04-01
【審査請求日】2022-03-11
(31)【優先権主張番号】201910901712.3
(32)【優先日】2019-09-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【微生物の受託番号】CCTCC CCTCC M 2018809
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】522098895
【氏名又は名称】バイオアルゴ（ダブリュエフ）カンパニー，リミテッド
(73)【特許権者】
【識別番号】522098909
【氏名又は名称】バイオアルゴ（シーワイ）カンパニー，リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，ユービン
(72)【発明者】
【氏名】リウ，シューアイシューアイ
(72)【発明者】
【氏名】カオ，ペイシン
(72)【発明者】
【氏名】ダイ，ユンファ
(72)【発明者】
【氏名】シエ，シーイー
【審査官】松村 真里
(56)【参考文献】
【文献】特開２００４－１２９５０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】欧州特許出願公開第０１２２９１２６（ＥＰ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／００６０６８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２５２３９１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０７３６５８２６（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第２００５／０８５４６５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】東亜ディーケーケー株式会社，溶存酸素（ＤＯ）のはなし：溶存酸素について，オンライン検索日２０２３年２月１０日、＜ＵＲＬ：https://www.toadkk.co.jp/support/useful/useful041.html＞
【文献】JOURNAL OF FERMENTATION AND BIOENGINEERING，1992年，Vol. 74, No. 1，pp.17-20
【文献】Bioresource Technology，1999年，Vol.68，pp.197-199
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アスタキサンチンを産生する方法であって、(a')アスタキサンチン産生ヘマトコッカス・プルビアリスシード溶液を得る、活性化ステップであって、シード溶液中の緑色栄養細胞の割合が少なくとも約90％であるか、及び/又は、シード溶液中の細胞の密度が少なくとも細胞約50×10 4 個/mLである、前記ステップ；
(a)ステップ(a')で得られたヘマトコッカス・プルビアリスシード溶液を、基本培養培地に接種し、且つ、培養の間、拡大供給培地を供給し、該アスタキサンチン産生ヘマトコッカス・プルビアリスを、藻類細胞の少なくとも約50％が不動性栄養細胞になるまで、従属栄養的に培養し、培養溶液を得るステップであって、該培養溶液中の酢酸塩の濃度が約100～900mg/Lであり、且つ、ステップ(b)における酢酸塩の濃度より低いものであり、並びに、該培養溶液中の溶存酸素の濃度が約0.1～4.0mg/Lであり、且つ、ステップ(b)の溶存酸素の濃度よりも低く、
前記基本培養培地が、0.1～2.0g/Lの酢酸ナトリウム、0.1～3.0g/Lの硝酸ナトリウム、50～500mg/Lのリン酸二水素カリウム、20～200mg/Lのリン酸水素二カリウム、50～500mg/Lの硫酸マグネシウム、1～50mg/Lの塩化カルシウム、0.5～5mg/Lのエデト酸二ナトリウム、0.1～5mg/Lのホウ酸、100～500μg/Lの塩化第二鉄、1～100μg/Lの塩化マンガン、1～100μg/Lの硫酸亜鉛、1～100μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、0.1～10μg/Lの塩化コバルト、1～100μg/Lの硫酸銅、0～1μg/LのビタミンB12、0～1μg/Lのビオチン、及び0～20μg/LのビタミンB1を含み、且つ、
前記拡大供給培地が、30～600g/Lの酢酸、2～70g/Lの硝酸ナトリウム、0.2～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0.05～10g/Lの硫酸マグネシウム、1～40mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～35mg/Lのホウ酸、150～4000μg/Lの塩化第二鉄、30～1000μg/Lの塩化マンガン、15～600μg/Lの硫酸亜鉛、15～500μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～100μg/Lの塩化コバルト、20～700μg/Lの硫酸銅、0～10μg/LのビタミンB12、0～10μg/Lのビオチン、及び0～1000μg/LのビタミンB1を含む、
前記ステップ；
(b)ステップ(a)で得られたヘマトコッカス・プルビアリス細胞を、酢酸塩及び溶存酸素の濃度を上げた条件下で、従属栄養的に培養するステップであって、酢酸塩の濃度が少なくとも約600～6000mg/Lであり、且つ、溶存酸素の濃度が少なくとも約2～8mg/Lであり、誘導供給培地を供給することによって、酢酸塩の濃度が維持され、
該誘導供給培地が、30～600g/Lの酢酸、0～70g/Lの硝酸ナトリウム、0～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0～1.0g/Lの硫酸マグネシウム、1～40mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～35mg/Lのホウ酸、150～4000μg/Lの塩化第二鉄、30～1000μg/Lの塩化マンガン、15～600μg/Lの硫酸亜鉛、15～500μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～100μg/Lの塩化コバルト、及び20～700μg/Lの硫酸銅を含む、
前記ステップ；並びに
(c)ステップ(b)におけるヘマトコッカス・プルビアリス細胞を収集するか、及び/又はアスタキサンチンを回収するステップ
を含む、前記方法。
【請求項2】
ステップ(a)において、アスタキサンチン産生ヘマトコッカス・プルビアリスを、培養後の藻類細胞の数が少なくとも細胞約10 6 個/mLになるまで従属栄養的に培養するか；及び/又は
アスタキサンチン産生ヘマトコッカス・プルビアリスを、細胞の密度が少なくとも約1.0g/Lになるまで従属栄養的に培養するか；及び/又は
培養溶液のpHが約6.0～9.0であるか；及び/又は
培養温度が約15～25℃であるか；及び/又は
酢酸塩の濃度が約300～900mg/Lであるか；及び/又は
硝酸塩の濃度が約100～2000mg/Lであるか；及び/又は
リン酸塩の濃度が約50～500mg/Lであるか；及び/又は
ヘマトコッカス・プルビアリス細胞の初期密度が少なくとも細胞約10 4 個/mLである、
請求項１記載の方法。
【請求項3】
アスタキサンチン産生ヘマトコッカス・プルビアリスを、培養後の藻類細胞の数が少なくとも細胞約2×10
6
個/mLになるまで従属栄養的に培養するか；及び/又は
アスタキサンチン産生ヘマトコッカス・プルビアリスを、細胞の密度が少なくとも約2.0g/Lになるまで従属栄養的に培養するか；及び/又は
培養溶液のpHが約7.0～8.0であるか；及び/又は
培養温度が約20～25℃であるか；及び/又は
硝酸塩の濃度が約100～1500mg/Lであるか；及び/又は
リン酸塩の濃度が約50～300mg/Lであるか；及び/又は
ヘマトコッカス・プルビアリス細胞の初期密度が少なくとも細胞約5×10 4 個/mLである、
請求項１又は２記載の方法。
【請求項4】
硝酸塩の濃度が約100～900mg/Lであるか；及び/又は
リン酸塩の濃度が約50～250mg/Lである、
請求項３記載の方法。
【請求項5】
ステップ(b)において、ヘマトコッカス・プルビアリス細胞を、アスタキサンチンの収量が増えなくなるまで従属栄養的に培養するか；及び/又は
培養溶液のpHが約6.0～11.0であるか；及び/又は
培養温度が約20～35℃であるか；及び/又は
酢酸塩の濃度が約1800～6000mg/Lであるか；及び/又は
溶存酸素の濃度が約4～8mg/Lである、
請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
【請求項6】
培養溶液のpHが約7.0～9.0であるか；及び/又は
培養温度が約20～25℃であるか；及び/又は
酢酸塩の濃度が約3000～5000mg/Lである、
請求項５記載の方法。
【請求項7】
活性化ステップにおいて、pHが約6.0～9.0であるか；及び/又は
培養温度が約15～25℃である、
請求項１記載の方法。
【請求項8】
活性化ステップにおいて、
pHが約7.0～8.0であるか；及び/又は
培養温度が約20～25℃である、
請求項７記載の方法。
【請求項9】
ステップ(a)が、シード溶液を従属栄養的に培養して培養溶液を得ることを含み、シード溶液の初期接種量が細胞約1～50×104個/mLであるか；及び/又は得られた培養溶液中の藻類細胞の数が、少なくとも細胞約1、2、3、4、5又は6×10
6
個/mLであるか；及び/又は藻類細胞の密度が少なくとも約2.0g/Lである、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
【請求項10】
得られた培養溶液中の藻類細胞の数が、少なくとも細胞約1～10×10
6
個/mLであるか；及び/又は藻類細胞の密度が少なくとも約3.0～10.0g/Lである、請求項９記載の方法。
【請求項11】
活性化ステップが、トリス(トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン))を含む培養培地中で、ヘマトコッカス・プルビアリスを培養して、シード溶液を得るステップを含む、請求項１～１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項12】
培養培地中のトリス(トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン))の濃度が、約0.1～1.0g/Lである、請求項１１記載の方法。
【請求項13】
培養培地中のトリス(トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン))の濃度が、約0.5～0.7g/Lである、請求項１１記載の方法。
【請求項14】
活性化ステップにおいて、ヘマトコッカス・プルビアリスが基本培養培地中で培養され、基本培養培地が、0.1～2.0g/Lの酢酸ナトリウム、0.1～3.0g/Lの硝酸ナトリウム、50～500mg/Lのリン酸二水素カリウム、20～200mg/Lのリン酸水素二カリウム、50～500mg/Lの硫酸マグネシウム、1～50mg/Lの塩化カルシウム、0.5～5mg/Lのエデト酸二ナトリウム、0.1～5mg/Lのホウ酸、100～500μg/Lの塩化第二鉄、1～100μg/Lの塩化マンガン、1～100μg/Lの硫酸亜鉛、1～100μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、0.1～10μg/Lの塩化コバルト、1～100μg/Lの硫酸銅、0～1μg/LのビタミンB12、0～1μg/Lのビオチン、及び0～20μg/LのビタミンB1を含む、請求項１～１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項15】
ヘマトコッカス・プルビアリスが、ヘマトコッカス・プルビアリス CCTCC M2018809、AC136、AC143、AC587、AC588、ATCC 30453、ATCC 30402、CS-321、G 1002、ETTL 1958/3、TAKACOVAL 1983/1、PRIBYL 2005/4、PRIBYL 2008/3、CCCryo 188-04、CCCryo 189-04、CCCryo 190-04、SCCAP K-0084、IPPAS H-239、NIVA-CHL 9、FWAC 7072、FWAC 7039、CPCC 93、ACOI 816、ACOI 815、ACOI 276、ACOI 255、ACOI 133、ACOI 51、CCAP 34/1D、CCAP 34/1F、CCAP 34/6、CCAP 34/7、CCAP34/8、CCAP 34/12、CCAP 34/13、CCAP 34/14、NIES-144、NIES-2263、NIES-2264、NIES-2265、SAG 192.80、SAG 44.96、SAG 34-1a、SAG 34-1b、SAG 34-1c、CCAC 0055、CCAC 0125、CCAC 0129、CCAC 2072B、UTEX 2505、UTEX 16、UTEX B 294、CWU-MACC20、TISTR 8647、FACHB-712、FACHB-827、FACHB-797、FACHB-955、FACHB-1164及びCCMP 3127からなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項16】
ステップ(c)が、アスタキサンチンを精製することをさらに含む、請求項１～１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項17】
(1)ヘマトコッカス・プルビアリスを0.5～0.6g/Lのトリス(トリスヒドロキシメチルアミノメタン)を含む基本培養培地中で培養して、シード溶液を得るステップであって、培養開始時の培養培地のpHが7.5～8.0であり、且つ、培養温度が約20～25℃であり、且つ、得られたシード溶液中の緑色栄養細胞の割合が少なくとも約90％である、前記ステップ；(2)ステップ(1)のシード溶液を基本培養培地中で従属栄養的に培養して培養溶液を得るステップであって、培養の間、pHが約7.5～8.0に維持され、培養温度が約20～25℃に維持され、培養溶液中の溶存酸素の濃度が約1.0～4.0mg/Lに維持され、酢酸塩の濃度が約300～900mg/Lに維持され、硝酸塩の濃度が約100～900mg/Lに維持され、且つ、リン酸塩の濃度が約50～250mg/Lに維持され、且つ、拡大供給培地が培養の間に供給される、前記ステップ；
(3)酢酸又は酢酸塩をステップ(2)における培養溶液に添加して、酢酸塩の濃度を少なくとも約3000mg/Lにし、且つ、培養の間に誘導供給培地を添加するステップであって、培養の間、pHが約7.5～8.0に維持され、酢酸塩の濃度が少なくとも約3000～5000mg/Lに維持され、培養温度が約20～35℃に維持され、且つ、培養溶液中の溶存酸素の濃度が少なくとも約4.0mg/Lに維持される、前記ステップ；並びに
(4)ステップ(3)で得られた藻類細胞を収集するか、及び/又はアスタキサンチンを回収するステップ；
を含み、
基本培養培地が、0.8～1.0g/Lの酢酸ナトリウム、0.5～1.0g/Lの硝酸ナトリウム、60～200mg/Lのリン酸二水素カリウム、20～100mg/Lのリン酸水素二カリウム、50～200mg/Lの硫酸マグネシウム、1～25mg/Lの塩化カルシウム、1.5～3mg/Lのエデト酸二ナトリウム、0.1～3mg/Lのホウ酸、200～350μg/Lの塩化第二鉄、4～70μg/Lの塩化マンガン、10～35又は12～35μg/Lの硫酸亜鉛、1～30μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～7μg/Lの塩化コバルト、1～50μg/Lの硫酸銅、0～0.1μg/LのビタミンB12、0～0.1μg/Lのビオチン、及び0～10μg/LのビタミンB1を含み、
拡大供給培地が、30～60g/Lの酢酸、5.0～7.0g/Lの硝酸ナトリウム、0.5～1.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0.1～1.0g/Lの硫酸マグネシウム、3～24mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～6mg/Lのホウ酸、350～4000μg/Lの塩化第二鉄、50～300又は70～280μg/Lの塩化マンガン、35～600μg/Lの硫酸亜鉛、30～60μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、5～100又は7～100μg/Lの塩化コバルト、及び50～100μg/Lの硫酸銅を含み、
誘導供給培地が、60～600g/Lの酢酸、0～50g/Lの硝酸ナトリウム、0.5～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0.05～1.0g/Lの硫酸マグネシウム、1～30mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～30mg/Lのホウ酸、150～3500μg/Lの塩化第二鉄、30～700μg/Lの塩化マンガン、15～350μg/Lの硫酸亜鉛、15～300μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～70μg/Lの塩化コバルト、及び20～500μg/Lの硫酸銅を含む、
請求項１～１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項18】
運動性栄養細胞の少なくとも約90％が不動性栄養細胞に変換されるか、及び/又は、得られた培養溶液中の細胞の密度が少なくとも細胞4×10
6
個/mLである場合、ステップ(3)を実施する、請求項１７記載の方法。
【請求項19】
ステップ(3)において、酢酸塩が酢酸ナトリウムであるか；及び/又は培養温度が約20～25℃に維持されるか；及び/又は培養溶液中の溶存酸素の濃度が約4.0～8.0mg/Lに維持される、請求項１７記載の方法。
【請求項20】
ステップ(4)が、アスタキサンチンを精製することをさらに含む、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アスタキサンチンの産生の分野、特にヘマトコッカス・プルビアリスを使用することによりアスタキサンチンを産生する方法、及び本方法で使用される培養培地に関する。
【背景技術】
【0002】
化学名3,3'-ジヒドロキシ-4,4'-ジケト-β-カロテン、分子式C40H52O4、及び分子量596.86のアスタキサンチンは、ケト-カロテノイドである。アスタキサンチン分子には、長い共役二重結合、及びヒドロキシル基、並びに共役二重結合鎖の末端に不飽和ケトンがあり、ヒドロキシル基及びケトン基がα-ヒドロキシケトンを構成している。これらの構造は、比較的活発な電子効果を有し、フリーラジカルに電子を提供するか、又はフリーラジカルの不対電子を誘引し、フリーラジカルとの反応性を高め、フリーラジカルをスカベンジし、それによって抗酸化効果を発揮し得る。その抗酸化力は、β-カロテンの38倍、ビタミンEの500倍高く、それによって、免疫力の向上、目の保護、心血管及び脳血管の保護、抗炎症、関節痛の改善、さまざまな分野、例えば、ヘルスケア製品及び化粧品で幅広く使用される美容・日焼け止めなどの効果を有する。
【0003】
アスタキサンチンは、化学合成又は天然原料からの抽出によって得てもよい。化学合成されたアスタキサンチンには、3つの光異性体が含まれる:laevo-(3S-3'S)、meso-(3R-3'S)、及びdextro-(3R-3'R)光異性体(これらの抗酸化活性及び生物学的安全性は、天然原料、特に藻類に由来する完全なlaevoアスタキサンチンほど良くない)。ヘマトコッカス・プルビアリスは、乾燥細胞重量の1.5～3%までの含有量で、大量のアスタキサンチンを蓄積し得、赤く見える単細胞緑藻類であり、現在、天然のアスタキサンチンの主な供給源である。
【0004】
ヘマトコッカス・プルビアリスのライフサイクルは、栄養細胞及び厚膜胞子の2つの段階に分けられる。適切な環境及び栄養豊富な条件下で、ヘマトコッカス・プルビアリスは、急速に成長し、分裂し、繁殖し、それによって鞭毛を伴う多数の栄養細胞を産生する。環境条件が不適切になると、運動性細胞は鞭毛を失い、不動性栄養細胞になる。継続的な悪環境条件、例えば、高照度、高塩、栄養飢餓などの刺激下で、栄養細胞はもはや分裂及び繁殖せず、細胞内に大量のアスタキサンチンを蓄積することによってこの悪環境条件と戦い、その結果、赤い厚膜胞子が形成される。
【0005】
現在、高レベルのアスタキサンチンを得るためには、高照度が前提条件であると一般に考えられている。高照度の条件下では、藻類の細胞は光合成によって過剰な活性酸素種(ROS)を産生する。ヘマトコッカス・プルビアリスは、アスタキサンチンを合成して蓄積し、藻類細胞への活性酸素種の酸化的損傷に耐え得る(Liら、2008、Liら、2010)。この研究理論に基づけば、ヘマトコッカス・プルビアリスのアスタキサンチンは、通常、浅いランウェイポンド(液深5～15cm)又は短い光路(3～5cm)のパイプラインフォトバイオリアクターを使用して、次いで、降雨量が少なく光の強度が高い地域、例えば、中国の雲南省及び米国のハワイで、屋外で培養を行うことによって誘導される。大規模培養で得られたヘマトコッカス・プルビアリス細胞は、一般に密度が1～2g/Lに達し、アスタキサンチンの含有量が藻類細胞の乾燥重量の1.5～3.0%(w/w)であり、アスタキサンチンの収量が15～60mg/Lである。しかし、細胞の密度は光の透過に反比例するので、細胞密度、リアクターの光路を減らすか、又は人工光を補うことによってのみ、高収量のアスタキサンチンが得られ得る。しかし、これらの対策は、問題に、例えば、培養量の増加、床面積の増加、設備及び運用のコストの増加、並びにスケールアップの困難性につながる場合がある。また、自然光の持続時間及び強度は、季節及び気象条件によって異なるので、アスタキサンチンの含有量は不安定である。さらに、理由、例えば、構造、パイプラインの設計、リアクターの運用コストに起因して、屋外の大規模培養では、効果的な滅菌が実現できない可能性があり、その結果、培養の間に、侵入種、例えば、原生動物、汚染藻類、真菌、及び細菌による汚染が避けられず、これによって、産生の不安定性及び生成物の品質の変動性がさらに悪化される。
【0006】
二酸化炭素を炭素供給源として使用することによる光合成及び独立栄養成長に加えて、ヘマトコッカス・プルビアリスは、暗所条件下で有機炭素供給源を使用することによって従属栄養的に培養してもよい(Kobayashiら、1992)。光合成独立栄養と比較して、従属栄養培養は、従来の発酵槽を使用してスケールアップすることができ、それによって工業生産を実施し得る。しかし、前述のように、現在のアスタキサンチンの大規模生産では、高い光強度が重要な要因である。高塩分刺激はまた、暗い従属栄養条件下でヘマトコッカス・プルビアリスを刺激してアスタキサンチンを蓄積させ得ることが文献で報告されているが、アスタキサンチンの収量が低すぎる(9mg/L)ため、実用的な価値はない(Kobayashiら、1997)。従属栄養培養の利点を活用し、暗所条件下でアスタキサンチンを効果的に蓄積することが難しいボトルネックの問題を克服するために、近年では、従属栄養-独立栄養のタンデム培養モードを採用することにより、藻類細胞が暗所条件下で従属栄養培養を行うことにより、緑色栄養細胞で増殖し、その後、緑色栄養細胞は、従来の光独立栄養的な方法でアスタキサンチンを蓄積するように誘導され、細胞密度は、最大6g/Lになり、アスタキサンチンの収量は、最大114mg/Lに達し得ることが文献で報告されている(Hataら、2001、Zhangら、2016、Wanら、2015)。本発明の特許出願(PCT/CN2013/084262)は、ヘマトコッカス・プルビアリスを使用することによってアスタキサンチンを産生する方法を開示しており、この方法は、暗い従属栄養培養を最初に通して高密度の緑色栄養細胞を得ること、希釈のために培養培地を供給すること、及び次いで光の下での培養を通してアスタキサンチンを蓄積することを含む。細胞の密度は最大1.92g/Lであり、アスタキサンチンの収量は、最大43.3mg/Lであり得る。これらの方法は、緑色拡大培養の最初のステップで従属栄養培養を採用し、これにより、緑色栄養細胞の生産性がある程度向上するが、第二のステップでの誘導には従来の光合成独立栄養が採用されるため、本質的には従来の培養モードのままになる。光の制限に起因して、ヘマトコッカス・プルビアリス細胞の密度及びアスタキサンチンの収量の両方が非常に低い。
【0007】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Singletonら、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY、第2版、J. Wiley & Sons (New York、NY 1994)、Sambrookら、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor、NY 1989)を参照のこと。
【発明の概要】
【0008】
先行技術の上記の欠点及び欠陥を解決するために、本発明は、ヘマトコッカス・プルビアリスを培養することによってアスタキサンチンを産生する方法であって、
(a)アスタキサンチン産生ヘマトコッカス・プルビアリスを従属栄養的に培養するステップ、
(b)高濃度の酢酸塩及び高濃度の溶存酸素という条件下で、ステップ(a)のヘマトコッカス・プルビアリスを従属栄養的に培養するステップ、並びに
(c)藻類細胞を収集するか、及び/又はアスタキサンチンを回収し、任意選択でアスタキサンチンを分離及び精製するステップ
を含む方法を提供する。
(a)アスタキサンチン産生ヘマトコッカス・プルビアリスを従属栄養的に培養するステップ、
(b)高濃度の酢酸塩及び高濃度の溶存酸素という条件下で、ステップ(a)のヘマトコッカス・プルビアリスを従属栄養的に培養するステップ、並びに
(c)藻類細胞を収集するか、及び/又はアスタキサンチンを回収し、任意選択でアスタキサンチンを分離及び精製するステップ
を含む方法を提供する。
【0009】
本明細書で使用される場合、「従属栄養的に培養すること/従属栄養培養」とは、暗所条件下での成長及び繁殖のために有機炭素供給源を使用する培養モードである。藻類細胞の成長及び繁殖のための従属栄養培養の方法ステップは、当技術分野で、例えば、Shiら、Heterotrophic production of biomass and lutein by Chlorella protothecoides on various nitrogen sources (Enzyme and Microbial Technology 2000, 27: 312-318)において公知である。
【0010】
本明細書で使用される場合、「暗所条件」とは、藻類の独立栄養培養にとって光がないか、又は不十分な光である条件を指す。本明細書で使用される場合、「独立栄養の/独立栄養的に」とは、明所条件下での光合成による成長及び繁殖のために、無機炭素供給源、例えば、二酸化炭素、炭酸塩及び重炭酸塩を使用する培養モードである。
【0011】
本発明で使用され得る「有機炭素供給源」とは、培養される標的微生物が利用し得る有機炭素供給源を指す。当業者は、例えば、酢酸、酢酸塩、プロピオン酸、プロピオン酸塩、酪酸、酪酸塩、乳酸、乳酸塩、脂肪酸、脂肪酸塩、アミノ酸、メタノール、エタノール、グリセリン、クエン酸、クエン酸塩、ピルビン酸、ピルビン酸塩、グルコース、フルクトース、アラビノース、ラクトース、マンノース、ラムノース、リボース又は廃水、加水分解物、これらの有機炭素供給源、好ましくは酢酸及び酢酸塩を含む発酵液を含むがこれらに限定されない、当技術分野の技術的知識に基づいて、どの有機炭素供給源を藻類細胞の培養に使用できるかを決定し得る。有機炭素供給源は、当業者の技術的能力の範囲内である、本分野の従来の知識及び藻類細胞の実際の増殖条件に従って決定される量で添加され得る。一実施形態では、ステップ(a)で使用される有機炭素供給源は、酢酸又は酢酸塩である。
【0012】
本明細書に記載のアスタキサンチン産生ヘマトコッカス・プルビアリスは、例えば、限定するものではないが、ヘマトコッカス・プルビアリス CCTCC M2018809、ヘマトコッカス・プルビアリス AC136、AC143、AC587、AC588 (Algobank-Caen Microalgal Culture Collection of University of Caen Basse-Normandie、France)、ヘマトコッカス・プルビアリス ATCC 30453、ATCC 30402 (American Type Culture Collection、USA)、ヘマトコッカス・プルビアリス CS-321 (Australian National Algae Culture Collection、Australia)、ヘマトコッカス・プルビアリス G 1002 (Culture Collection of Algae of Charles University、Czech Republic)、ヘマトコッカス・プルビアリス ETTL 1958/3、TAKACOVAL 1983/1、PRIBYL 2005/4、PRIBYL 2008/3 (Culture Collection of Autotrophic Organisms、Czech Republic)、ヘマトコッカス・プルビアリス CCCryo 188-04、CCCryo 189-04、CCCryo 190-04 (Culture Collection of Cryophilic Algae、Germany)、ヘマトコッカス・プルビアリス SCCAP K-0084 (Scandinavian Culture Collection of Algae and Protozoa at the University of Copenhagen、Denmark)、ヘマトコッカス・プルビアリス IPPAS H-239 (Culture Collection of Microalgae、Institute of Plant Physiology、Russian Academy of Science、Russia)、ヘマトコッカス・プルビアリス NIVA-CHL 9 (Norwegian Institute for Water Research Culture Collection of Algae、Norway)、ヘマトコッカス・プルビアリス FWAC 7072、FWAC 7039 (Canadian Center for the Culture of Microorganisms、Canada)、ヘマトコッカス・プルビアリス CPCC 93 (Canadian Phycological Culture Centre of University of Waterloo、Canada)、ヘマトコッカス・プルビアリス ACOI 816、ACOI 815、ACOI 276、ACOI 255、ACOI 133、ACOI 51 (Coimbra Culture Collection of Algae、Portugal)、ヘマトコッカス・プルビアリス CCAP 34/1D、CCAP 34/1F、CCAP 34/6、CCAP 34/7、CCAP34/8、CCAP 34/12、CCAP 34/13、CCAP 34/14 (Culture Collection of Algae and Protozoa of the Centre for Hydrology and Ecology、UK)、ヘマトコッカス・プルビアリス NIES-144、NIES-2263、NIES-2264、NIES-2265 (Microbial Culture Collection of National Institute for Environmental Studies、Japan)、ヘマトコッカス・プルビアリス SAG 192.80、SAG 44.96、SAG 34-1a、SAG 34-1b、SAG 34-1c (Culture Collection of Algae at University of Gottingen、Germany)、ヘマトコッカス・プルビアリス CCAC 0055、CCAC 0125、CCAC 0129、CCAC 2072B (Culture Collection of Algae at the University of Cologne、Germany)、ヘマトコッカス・プルビアリス UTEX 2505、UTEX 16、UTEX B 294 (University of Texas Culture Collection of Algae、USA)、ヘマトコッカス・プルビアリス CWU-MACC20 (Herbarium of Kharkov University-MicroAlgae Cultures Collection、Ukraine)、ヘマトコッカス・プルビアリス TISTR 8647 (Thailand Institute of Scientific and Technological Research Culture Collection、Thailand)、ヘマトコッカス・プルビアリス FACHB-712、FACHB-827、FACHB-797、FACHB-955、FACHB-1164 (Freshwater Culture Algae Collection at Institute of Hydrobiology、The Chinese Academy of Sciences、China)、ヘマトコッカス・プルビアリス CCMP 3127 (Provasoli-Guillard National Centre for Marine Algae and Microbiota、USA)を含む、アスタキサンチンを産生し得るヘマトコッカス・プルビアリスの任意の種であり得る。
【0013】
ヘマトコッカス・プルビアリス AQHP0は、2018年11月21日にCCTCC M 2018809というアクセッション番号でChina Center for Type Culture Collection(CCTCC)(Wuhan University、Wuhan、China、430072)に寄託された。
【0014】
一実施形態では、ステップ(a)の従属栄養培養は、約6.0～9.0、例えば、約6.0～8.0、7.0～9.0、7.0～8.5又は7.5～8.0のpHで実施される。一実施形態では、ステップ(a)のpHは約7.0～8.0である。一実施形態では、ステップ(a)のpHは、約6.5、7.0、7.5、8.0、又は8.5である。
【0015】
一実施形態では、ステップ(a)は、約15～25℃、例えば、約20～25℃、特に約15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、又は25℃の培養温度で実施される。好ましい実施形態では、ステップ(a)は、約20℃又は25℃の培養温度で実施される。
【0016】
一実施形態では、ステップ(a)のブロス中の溶存酸素の濃度は、約0.1～4.0mg/L、例えば、約0.5～4.0、1.0～4.0、1.0～2.5、1.0～2.0、1.5～2.5又は2.0～4.0mg/Lである。一実施形態では、ステップ(a)のブロス中の溶存酸素の濃度は、約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0又は3.5mg/Lである。
【0017】
一実施形態では、ステップ(a)のブロス中の酢酸塩の濃度は、約60～1200mg/L、例えば、約100～1200、100～1100、100～1000、100～900、300～1200、300～1100、300～1000、300～900、300～700mg/Lである。一実施形態では、ステップ(a)のブロス中の酢酸塩の濃度は、約60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200mg/Lである。
【0018】
一実施形態では、ステップ(a)のブロス中の硝酸塩の濃度は、約100～2000mg/L、例えば、約100～1500、100～1000、100～900、100～400、300～1500、300～1000、300～900、600～900mg/Lである。一実施形態では、ステップ(a)のブロス中の硝酸塩の濃度は、約2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200又は100mg/Lである。
【0019】
一実施形態では、ステップ(a)のブロス中のリン酸イオンの濃度は、約50～500mg/L、例えば、約50～400、50～300、50～250、50～100、100～250、150～250、100～150mg/Lである。好ましい実施形態では、ステップ(a)のブロス中のリン酸イオンの濃度は、約100～250、100～150、又は150～250mg/Lである。
【0020】
一実施形態では、培養後、得られた藻類細胞の数が、少なくとも細胞約106個/mL(例えば、少なくとも細胞約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6×106個/mL、又は例えば細胞1～10、2～10、3～10、4～10、5～10、6～10×106個/mL)又は細胞密度が少なくとも約1.0g/L(例えば、少なくとも約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0g/L、又は例えば、1.0～10、1.0～8.0、2.0～8.0、3.0～8.0g/L)であるか、或いは運動性栄養細胞の少なくとも約50%(例えば、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、又は100%)が不動性栄養細胞になる場合に、ステップ(a)を停止する。
【0021】
一実施形態では、ステップ(a)において、ヘマトコッカス・プルビアリスを基本培養培地中で培養し、培養の間に拡大供給培地を添加する。本明細書で使用される場合、基本培養培地とは、ヘマトコッカス・プルビアリスを培養して成長及び繁殖させるために使用できる培地を指し、通常、窒素供給源、リン源、硫黄源、マグネシウム源、カルシウム源、微量元素及び/又はビタミンを含む。所与の藻類に適した基本培養培地は、当技術分野で公知である。これについては、BG-11、BBM、C培地、MCM及びその他の培地を参照のこと。
【0022】
本発明による培養培地で使用され得る「窒素供給源」とは、培養藻類によって利用することができる窒素供給源を指し、例えば、これには、限定するものではないが、硝酸、硝酸塩、例えば、硝酸ナトリウム、亜硝酸塩、アンモニア水、アンモニウム塩(例えば、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、重炭酸アンモニウム、及び硫酸アンモニウム)、尿素、アミノ酸、ペプトン、酵母抽出物、タンパク質粉末、コーンスティープリカーが挙げられる。
【0023】
本発明による培養培地で使用され得る「リン源」とは、培養藻類によって利用することができるリン源を指し、例えば、これには、限定するものではないが、リン酸又はリン酸塩、例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、β-グリセロリン酸ナトリウムが挙げられる。
【0024】
本発明による培養培地で使用され得る「硫黄源」とは、培養藻類によって利用することができる硫黄源を指し、例えば、これには、限定するものではないが、硫酸又は硫酸塩、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウムが挙げられる。
【0025】
本発明による培養培地で使用され得る「マグネシウム源」とは、培養藻類によって利用することができるマグネシウム源を指し、例えば、これには、限定するものではないが、マグネシウム塩、例えば、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムが挙げられる。
【0026】
本発明による培養培地で使用され得る「カルシウム源」とは、培養藻類によって利用することができるカルシウム源を指し、例えば、これには、限定するものではないが、カルシウム塩、例えば、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウムが挙げられる。
【0027】
本発明による培養培地で使用され得る「微量元素」とは、培養藻類によって利用することができる微量元素を指し、例えば、これには、限定するものではないが、1つ以上のMn(例えば、塩化マンガン)、Zn(例えば、硫酸亜鉛)、B(例えば、ホウ酸)、Mo(例えば、モリブデン酸ナトリウム)、Cu(例えば、硫酸銅)、Co(例えば、塩化コバルト)、Fe(例えば、塩化第二鉄、硫酸第二鉄など)が挙げられる。微量元素を、この分野の従来の知識に基づいて決定された量で培養培地に添加してもよい。
【0028】
本発明による培養培地で使用され得る「ビタミン」とは、培養藻類によって利用することができるビタミンを指し、例えば、これには、限定するものではないが、ビタミンB12、ビオチン、ビタミンB1が挙げられる。
【0029】
本発明は、基本培養培地を提供し、これには、酢酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、エデト酸二ナトリウム、ホウ酸、塩化第二鉄、塩化マンガン、硫酸亜鉛、モリブデン酸ナトリウム、塩化コバルト、硫酸銅、ビタミンB12、ビオチン、及びビタミンB1を含む。一実施形態では、本発明による基本培養培地は、0.1～2.0g/Lの酢酸ナトリウム、0.1～3.0g/Lの硝酸ナトリウム、50～500mg/Lのリン酸二水素カリウム、20～200mg/Lのリン酸水素二カリウム、50～500mg/Lの硫酸マグネシウム、1～50mg/Lの塩化カルシウム、0.5～5mg/Lのエデト酸二ナトリウム、0.1～5mg/Lのホウ酸、100～500μg/Lの塩化第二鉄、1～100μg/Lの塩化マンガン、1～100μg/Lの硫酸亜鉛、1～100μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、0.1～10μg/Lの塩化コバルト、1～100μg/Lの硫酸銅、0～1μg/LのビタミンB12、0～1μg/Lのビオチン、及び0～20μg/LのビタミンB1
の配合を有する。
の配合を有する。
【0030】
上記の配合に従って基本培養培地を調製した後、培養培地のpHを1mol/Lの希硫酸又は水酸化ナトリウム溶液で6.0～9.0、好ましくは7.0～8.0に調整する。調製した基本培養培地を、培養容器、例えば、三角フラスコ又は発酵槽に0.6～0.8の負荷係数で加え、121℃で15～30分間オートクレーブ処理し、15℃～20℃に冷却した後に接種及び培養する。
【0031】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、0.1～2.0g/L、例えば、0.5～1.5g/L又は0.5～1.1g/L、好ましくは0.8～1.0g/Lの酢酸ナトリウムを含む。特に、基本培養培地は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9又は2.0g/Lの酢酸ナトリウムを含む。
【0032】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、0.1～3.0g/L、例えば、0.3～2.0g/L又は0.4～1.5g/L、好ましくは0.4～1.0g/Lの硝酸ナトリウムを含む。特に、基本培養培地は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9又は3.0g/Lの硝酸ナトリウムを含む。
【0033】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、50～500mg/L、例えば、60～300mg/L、好ましくは60～200mg/Lのリン酸二水素カリウムを含む。特に、基本培養培地は、約60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450又は500mg/Lのリン酸二水素カリウムを含む。
【0034】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、20～200mg/L、例えば、20～100mg/Lのリン酸水素二カリウムを含む。特に、基本培養培地は、約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150又は200mg/Lのリン酸水素二カリウムを含む。
【0035】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、50～500mg/L、例えば、50～300mg/L、好ましくは50～200mg/Lの硫酸マグネシウムを含む。特に、基本培養培地は、約50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450又は500mg/Lの硫酸マグネシウムを含む。
【0036】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、1～50mg/L、例えば、1～30mg/L、好ましくは1～25mg/Lの塩化カルシウムを含む。特に、基本培養培地は、約5、10、15、20、25、30、35、40、45又は50mg/Lの塩化カルシウムを含む。
【0037】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、0.5～5mg/L、例えば、1.5～4.0mg/L、好ましくは1.5～3.0mg/Lのエデト酸二ナトリウムを含む。特に、基本培養培地は、約1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5又は5.0mg/Lのエデト酸二ナトリウムを含む。
【0038】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、0.1～5mg/L、例えば、0.1～4.0mg/L、好ましくは0.1～3.0mg/Lのホウ酸を含む。特に、基本培養培地は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5又は5.0mg/Lのホウ酸を含む。
【0039】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、100～500μg/L、例えば、200～500μg/L、好ましくは200～350μg/Lの塩化第二鉄を含む。特に、基本培養培地は、約100、150、200、250、300、350、400、450又は500μg/Lの塩化第二鉄を含む。
【0040】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、1～100μg/L、例えば4～80μg/L、好ましくは1～70又は4～70μg/Lの塩化マンガンを含む。特に、基本培養培地は、約1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100μg/Lの塩化マンガンを含む。
【0041】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、1～100μg/L、例えば、10～50μg/L、好ましくは10～35μg/Lの硫酸亜鉛を含む。特に、基本培養培地は、約1、2、3、4、5、10、11、12、13、14、15、20、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100μg/Lの硫酸亜鉛を含む。
【0042】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、1～100μg/L、例えば、1～40μg/L、好ましくは1～30μg/Lのモリブデン酸ナトリウムを含む。特に、基本培養培地は、約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100μg/Lのモリブデン酸ナトリウムを含む。
【0043】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、0.1～10μg/L、例えば、1～10μg/L、好ましくは3～7μg/Lの塩化コバルトを含む。特に、基本培養培地は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10μg/Lの塩化コバルトを含む。
【0044】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、1～100μg/L、例えば、1～70μg/L、好ましくは1～50μg/Lの硫酸銅を含む。特に、基本培養培地は、約1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100μg/Lの硫酸銅を含む。
【0045】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、0～1μg/L、例えば、0～0.1μg/LのビタミンB12を含む。特に、基本培養培地は、約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9又は1.0μg/LのビタミンB12を含む。
【0046】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、0～1μg/L、例えば、0～0.1μg/Lのビオチンを含む。特に、基本培養培地は、約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9又は1.0μg/Lのビオチンを含む。
【0047】
一実施形態では、本発明による基本培養培地は、0～20μg/L、例えば、0～10μg/LのビタミンB1を含む。特に、基本培養培地は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20μg/LのビタミンB1を含む。
【0048】
本明細書で使用される場合、拡大供給培地は、培養中に消費される成分を補充するため、及び/又は特定の培養条件、例えばpH、特定の成分、例えば酢酸イオンの濃度を維持するための濃縮基本培養培地である。一実施形態では、ブロスのpHは、例えば7.0～8.5で拡大供給培地を供給することによって制御される。一実施形態では、ステップ(a)における酢酸塩の濃度は、拡大供給培地を供給することによって、例えば、300～700mg/Lに制御される。
【0049】
本発明は、酢酸、硝酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、エデト酸二ナトリウム、ホウ酸、塩化第二鉄、塩化マンガン、硫酸亜鉛、モリブデン酸ナトリウム、塩化コバルト、硫酸銅、ビタミンB12、ビオチン及びビタミンB1を含む拡大供給培地を提供する。一実施形態では、本発明による拡大供給培地は、以下の配合を有する:30～600g/Lの酢酸、2～70g/Lの硝酸ナトリウム、0.2～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0.05～10g/Lの硫酸マグネシウム、1～40mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～35mg/Lのホウ酸、150～4000μg/Lの塩化第二鉄、30～1000μg/Lの塩化マンガン、15～600μg/Lの硫酸亜鉛、15～500μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～100μg/Lの塩化コバルト及び20～700μg/Lの硫酸銅、0～10μg/LのビタミンB12、0～10μg/Lのビオチン、及び0～1000μg/LのビタミンB1。
【0050】
拡大供給培地は、以下のように調製され得る:この配合に従って酢酸以外の成分を調製すること、121℃で15～30分間オートクレーブすること、及び室温に冷却した後、30～600g/Lという酢酸の濃度まで、氷酢酸(酢酸の含有量が98%超)を加えること。
【0051】
一実施形態では、本発明による拡大供給培地は、30～600g/L、好ましくは30～60g/Lの酢酸を含む。特に、拡大供給培地は、約30、40、50、100、120、150、200、250、300、350、400、500又は600g/Lの酢酸を含む。
【0052】
一実施形態では、本発明による拡大供給培地は、2～70g/L、例えば、5～50g/L、好ましくは5～10又は5～7g/Lなどの硝酸ナトリウムを含む。特に、拡大供給培地は、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65又は70g/Lの硝酸ナトリウムを含む。
【0053】
一実施形態では、本発明による拡大供給培地は、0.2～5.0g/L、例えば、1.0～5.0g/L、好ましくは0.5～1.0g/Lのリン酸二水素カリウムを含む。特に、拡大供給培地は、約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5又は5.0g/Lのリン酸二水素カリウムを含む。
【0054】
一実施形態では、本発明による拡大供給培地は、0.05～10g/L、例えば、0.1～1.0g/Lの硫酸マグネシウムを含む。特に、拡大供給培地は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0又は10g/Lの硫酸マグネシウムを含む。
【0055】
一実施形態では、本発明による拡大供給培地は、1～40mg/L、例えば、1～30mg/L、好ましくは1～25又は3～24mg/Lのエデト酸二ナトリウムを含む。特に、拡大供給培地は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、24、25、30、35又は40mg/Lのエデト酸二ナトリウムを含む。
【0056】
一実施形態では、本発明による拡大供給培地は、1～35mg/L、例えば、1～30mg/L、好ましくは1～6mg/Lのホウ酸を含む。特に、拡大供給培地は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、30又は35mg/Lのホウ酸を含む。
【0057】
一実施形態では、本発明による拡大供給培地は、150～4000μg/L、例えば、350～4000μg/Lの塩化第二鉄を含む。特に、拡大供給培地は、約150、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1400、1500、1750、1800、1900、2000、2500、3000、3500又は4000μg/Lの塩化第二鉄を含む。
【0058】
一実施形態では、本発明による拡大供給培地は、30～1000μg/L、例えば、70～700μg/L、好ましくは50～300又は70～280μg/Lの塩化マンガンを含む。特に、拡大供給培地は、約30、40、50、60、70、80、90、100、140、150、200、250、280、300、350、400、500、600、700、800、900又は1000μg/Lの塩化マンガンを含む。
【0059】
一実施形態では、本発明による拡大供給培地は、15～600μg/L、例えば、35～600μg/L、好ましくは30～100又は35～70μg/Lの硫酸亜鉛を含む。特に、拡大供給培地は、約15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、140、150、175、200、250、300、350、400、500又は600μg/Lの硫酸亜鉛を含む。
【0060】
一実施形態では、本発明による拡大供給培地は、15～500μg/L、例えば、30～300μg/L、好ましくは30～60μg/Lのモリブデン酸ナトリウムを含む。特に、拡大供給培地は、約15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、300、350、400又は500μg/Lのモリブデン酸ナトリウムを含む。
【0061】
一実施形態では、本発明による拡大供給培地は、3～100μg/L、例えば、5～100μg/L、好ましくは7～100μg/Lの塩化コバルトを含む。特に、拡大供給培地は、約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、35、40、50、60、70、80、90又は100μg/Lの塩化コバルトを含む。
【0062】
一実施形態では、本発明による拡大供給培地は、20～700μg/L、例えば、50～500μg/L、好ましくは50～100μg/Lの硫酸銅を含む。特に、拡大供給培地は、約20、30、40、50、100、200、250、300、400、500、550、600又は700μg/Lの硫酸銅を含む。
【0063】
本発明による方法は、ステップ(a)の前に追加のステップ、例えば、前培養、シード活性化を含み得、これは、本発明による基本培地を使用することによって実施され得る。
【0064】
一実施形態では、本発明による方法は、ヘマトコッカス・プルビアリスシード溶液を得るためのステップ(a)の前の活性化ステップを含む。活性化ステップは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって、例えば、フラスコを立てるか又は振盪してヘマトコッカス・プルビアリスを培養することによって実施され得る。一実施形態では、シード溶液中の緑色栄養細胞の割合は、少なくとも90%、例えば、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%である。一実施形態では、シード溶液中の細胞密度は、少なくとも細胞40×104個/ml、例えば、少なくとも細胞50、55、60、70、80、90、100×104個/mlである。一実施形態では、シード活性化ステップは、トリス(トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン))、例えば、0.1～1g/L、好ましくは0.5～1.0g/L、より好ましくは0.5～0.6g/Lのトリスを含む基本培養培地を使用することによって実施され得る。
【0065】
一実施形態では、本発明の方法は、ステップ(a):培養溶液を得るために本発明によるシード溶液を従属栄養的に培養するステップであって、任意選択で、得られた培養溶液中の藻類細胞の数が、少なくとも細胞約60×104個/mL、例えば、少なくとも細胞約70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900×104個/mL、例えば細胞100～1000、150～900、150～800、150～700、150～600×104個/mLであるか、及び/又は細胞密度が少なくとも約1.0g/L、例えば少なくとも約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0g/L、例えば約1.0～10.0、1.0～9.0、1.0～8.0、1.0～7.0、1.0～6.0g/Lである、ステップを含む。一実施形態では、得られた培養溶液中の運動性栄養細胞の少なくとも50%、例えば、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、又は100%が不動性栄養細胞となる。
【0066】
一実施形態では、ステップ(a)において、シード溶液は、細胞1～50、1～40、1～30、又は1～20×104個/mL、例えば細胞2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45×104個/mLという初期接種量で培養培地に接種する。
【0067】
一実施形態では、活性化ステップは、7.0～8.0、好ましくは7.5～8.0のpHで実施される。
【0068】
一実施形態では、活性化ステップは、15～25℃、好ましくは20～25℃の培養温度で実施される。
【0069】
任意選択で、活性化ステップによってヘマトコッカス・プルビアリスシード溶液を得た後、本方法は、培養培地を除去するか、及び/又は栄養細胞を収集するステップ、並びに任意選択で栄養細胞を濃縮するステップを含み得る。培養培地の除去、栄養細胞の収集及び/又は濃縮は、当技術分野で公知の任意の適切な方法、例えば、沈殿(自然沈降又は遠心分離)又は濾過(フィルター又はフィルター膜を使用)などを介して実施され得る。
【0070】
ステップ(b)では、ヘマトコッカス・プルビアリスを、高酢酸塩及び高溶存酸素の条件で従属栄養的に培養して、アスタキサンチンを産生する。ステップ(a)で得られたヘマトコッカス・プルビアリスは、任意の適切な手段によって、任意選択で分離によって(例えば、遠心分離によって)除去してもよく、次いで、高酢酸塩及び高溶存酸素を有する培養培地に添加してもよい。或いは、高酢酸塩(例えば、酢酸又は酢酸塩、例えば、酢酸ナトリウム)を、ステップ(a)で得られたヘマトコッカス・プルビアリスに直接添加して、高濃度の溶存酸素を維持してもよい。
【0071】
一実施形態では、ステップ(b)は、ステップ(a)で得られたヘマトコッカス・プルビアリスに、酢酸若しくは酢酸塩、例えば、酢酸ナトリウム、及び/又は高濃度の酢酸塩を含む培養培地を添加して、酢酸塩の濃度を増加させることを含む。
【0072】
一実施形態では、ステップ(b)において、培養溶液中の酢酸塩の濃度は、少なくとも約1800mg/L、例えば、少なくとも2000、2500、3000、3500、4000、4500又は5000mg/Lである。一実施形態では、ステップ(b)において、培養溶液中の酢酸塩の濃度は、約1800～6000、2400～4800、2700～4000、3000～5000、3000～4000、3500～4800又は4000～6000mg/Lである。好ましい実施形態では、ステップ(b)において、酢酸塩の濃度は3000～4800mg/Lである。さらに好ましい実施形態では、ステップ(b)において、酢酸塩の濃度は3000～4000mg/Lである。
【0073】
一実施形態では、ステップ(b)において、培養溶液のpHは、6.0～11.0、好ましくは7.0～9.0、例えば、約6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5又は11.0である。一実施形態では、ステップ(b)のpHは7.5～8.0である。
【0074】
一実施形態では、ステップ(b)において、培養温度は、20～35℃、例えば、約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34又は35℃である。一実施形態では、ステップ(b)において、培養温度は約20℃～30℃、例えば約25℃である。
【0075】
一実施形態では、ステップ(b)において、培養溶液中の溶存酸素の濃度は、少なくとも約2.0mg/L、例えば、約又は少なくとも3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0mg/Lである。一実施形態では、ステップ(b)において、培養溶液中の溶存酸素の濃度は、2.0mg/L～10mg/L、例えば、2.0～9.0、2.0～8.0、2.0～3.0、4.0～6.0mg/Lである。好ましい実施形態では、ステップ(b)において、培養溶液中の溶存酸素の濃度は、4.0～8.0mg/L又は5.0～8.0mg/Lである。
【0076】
本発明の好ましい実施形態では、ステップ(b)における酢酸塩の濃度及び/又は溶存酸素の濃度は、ステップ(a)における酢酸塩の濃度及び/又は溶存酸素の濃度よりも大きい。
【0077】
一実施形態では、ステップ(b)において、従属栄養培養中に誘導供給培地が供給される。
【0078】
本明細書で使用される場合、誘導供給培地は、濃縮基本培地又は栄養欠損培地であり、ヘマトコッカス・プルビアリス細胞におけるアスタキサンチンの産生を誘導するために特定の培養条件(複数可)を維持するために使用される。
【0079】
一実施形態では、本発明は、以下を含む誘導供給培地を提供する:30～600g/Lの酢酸、0～70g/Lの硝酸ナトリウム、0～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0～1.0g/Lの硫酸マグネシウム、1～40mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～35mg/Lのホウ酸、150～4000μg/Lの塩化第二鉄、30～1000μg/Lの塩化マンガン、15～600μg/Lの硫酸亜鉛、15～500μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～100μg/Lの塩化コバルト及び20～700μg/Lの硫酸銅。
【0080】
一実施形態では、ステップ(b)における酢酸塩の濃度は、誘導供給培地を供給することによって、好ましくは少なくとも600mg/L、好ましくは3000～4800mg/Lになるように制御される。
【0081】
一実施形態では、本発明による誘導供給培地は、30～600g/L、好ましくは60～600g/Lの酢酸を含む。特に、誘導供給培地は、約30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、240、250、300、350、400、500又は600g/Lの酢酸を含む。
【0082】
一実施形態では、本発明による誘導供給培地は、0～70g/L、好ましくは0～50g/Lの硝酸ナトリウムを含む。特に、誘導供給培地は、約1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、55、60、65又は70g/Lの硝酸ナトリウムを含む。
【0083】
一実施形態では、本発明による誘導供給培地は、0～5.0g/L、例えば、0.1～5.0g/L、好ましくは0.5～5.0g/Lのリン酸二水素カリウムを含む。特に、誘導供給培地は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5又は5.0g/Lのリン酸二水素カリウムを含む。
【0084】
一実施形態では、本発明による誘導培養培地は、0～1.0g/L、例えば、0～1.0g/L、好ましくは0.05～1.0g/Lの硫酸マグネシウムを含む。特に、誘導供給培地は、約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9又は1.0g/Lの硫酸マグネシウムを含む。
【0085】
一実施形態では、本発明による誘導供給培地は、1～40mg/L、好ましくは1～30g/Lのエデト酸二ナトリウムを含む。特に、誘導供給培地は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35又は40mg/Lのエデト酸二ナトリウムを含む。
【0086】
一実施形態では、本発明による誘導供給培地は、1～35mg/L、好ましくは1～30mg/Lのホウ酸を含む。特に、誘導供給培地は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30又は35mg/Lのホウ酸を含む。
【0087】
一実施形態では、本発明による誘導供給培地は、150～4000μg/L、例えば、150～3500μg/Lの塩化第二鉄を含む。特に、誘導供給培地は、約150、200、300、350、400、500、1000、1400、1500、1750、2000、2500、3000又は3500μg/Lの塩化第二鉄を含む。
【0088】
一実施形態では、本発明による誘導供給培地は、30～1000μg/L、好ましくは30～700μg/Lの塩化マンガンを含む。特に、誘導供給培地は、約30、50、70、100、150、200、250、280、300、350、400、450、500、600、700、800、900又は1000μg/Lの塩化マンガンを含む。
【0089】
一実施形態では、本発明による誘導供給培地は、15～600μg/L、例えば、15～350μg/Lの硫酸亜鉛を含む。特に、誘導供給培地は、約15、35、50、100、140、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550又は600μg/Lの硫酸亜鉛を含む。
【0090】
一実施形態では、本発明による誘導供給培地は、15～500μg/L、好ましくは15～300μg/Lのモリブデン酸ナトリウムを含む。特に、誘導供給培地は、約15、20、30、50、100、120、150、200、300、350、400、450又は500μg/Lのモリブデン酸ナトリウムを含む。
【0091】
一実施形態では、本発明による誘導供給培地は、3～100μg/L、例えば3～90μg/L、好ましくは3～70μg/Lの塩化コバルトを含む。特に、誘導供給培地は、約3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、35、40、50、60、70、75、80、85、90、95又は100μg/Lの塩化コバルトを含む。
【0092】
一実施形態では、本発明による誘導供給培地は、20～700μg/L、好ましくは20～500μg/Lの硫酸銅を含む。特に、誘導供給培地は、約20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650又は700μg/Lの硫酸銅を含む。
【0093】
一実施形態では、アスタキサンチンの収量がもはや増加しないか、又は全ての不動性栄養細胞が胞子細胞に変換されると、ステップ(b)が停止される。
【0094】
ステップ(c)において、藻類細胞の収集及びアスタキサンチンの回収、並びにアスタキサンチンの精製は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって実施され得る。ステップ(c)での藻類胞子細胞及び/又はアスタキサンチンの回収は、任意の公知の方法(例えば、沈降又は遠心分離)によって藻類胞子細胞を回収すること、及び/又は(機械的、化学的又は酵素的方法によって)細胞壁を破壊すること、並びにアスタキサンチンを回収すること、任意選択でアスタキサンチンを、任意の適切な方法によって分離及び/又は精製することによって行われ得る。
【0095】
好ましい実施形態では、本発明は、アスタキサンチンを産生する方法であって、
(1)ヘマトコッカス・プルビアリスを培養して、シード溶液を得るステップであって、初期pHが7.0～9.0、培養温度が15～25℃である、ステップ、
(2)ステップ(1)で得られたシード溶液を従属栄養的に培養するステップであって、培養が、pH6.0～9.0及び培養温度15～25℃で、0.1mg/L～4.0mg/Lの溶存酸素濃度で実施され、任意選択で、運動性栄養細胞の50%～100%が不動性栄養細胞になった場合、ステップ(3)を実施するステップ、
(3)ステップ(2)で得られた培養溶液を従属栄養的に培養するステップであって、培養が、pH6.0～9.0、酢酸濃度1800～6000mg/L、培養温度20～35℃で、2.0mg/L～10.0mg/Lの溶存酸素の濃度で実施され、ステップ(3)における酢酸塩の濃度及び溶存酸素の濃度は、それぞれ、ステップ(2)における酢酸塩の濃度及び溶存酸素の濃度よりも大きい、ステップ、並びに
(4)藻類細胞を収集するか、及び/又はアスタキサンチンを回収し、任意選択でアスタキサンチンを精製するステップ
を含む方法を提供する。
(1)ヘマトコッカス・プルビアリスを培養して、シード溶液を得るステップであって、初期pHが7.0～9.0、培養温度が15～25℃である、ステップ、
(2)ステップ(1)で得られたシード溶液を従属栄養的に培養するステップであって、培養が、pH6.0～9.0及び培養温度15～25℃で、0.1mg/L～4.0mg/Lの溶存酸素濃度で実施され、任意選択で、運動性栄養細胞の50%～100%が不動性栄養細胞になった場合、ステップ(3)を実施するステップ、
(3)ステップ(2)で得られた培養溶液を従属栄養的に培養するステップであって、培養が、pH6.0～9.0、酢酸濃度1800～6000mg/L、培養温度20～35℃で、2.0mg/L～10.0mg/Lの溶存酸素の濃度で実施され、ステップ(3)における酢酸塩の濃度及び溶存酸素の濃度は、それぞれ、ステップ(2)における酢酸塩の濃度及び溶存酸素の濃度よりも大きい、ステップ、並びに
(4)藻類細胞を収集するか、及び/又はアスタキサンチンを回収し、任意選択でアスタキサンチンを精製するステップ
を含む方法を提供する。
【0096】
さらなる実施形態では、ステップ(1)において、得られたシード溶液中の緑色栄養細胞の割合は、90%以上である。
【0097】
さらなる実施形態では、ステップ(2)において、酢酸塩の濃度は60～1200mg/Lであり、硝酸塩の濃度は100～2000mg/Lであり、リン酸塩の濃度は50～500mg/Lであり、得られた培養培地中の不動性栄養細胞の割合は、50%以上である。
【0098】
さらなる実施形態では、ステップ(1)及び/又はステップ(2)において、ヘマトコッカス・プルビアリスは、本発明による基本培地中で培養される。
【0099】
さらなる実施形態では、ステップ(2)において、培養中に、ヘマトコッカス・プルビアリスに、本発明による拡大供給培地を添加する。
【0100】
好ましい実施形態では、本発明は、以下を含む、アスタキサンチンを産生する方法を提供する:
(1)シードの活性化:例えば、静置又は振盪フラスコで培養することにより、ヘマトコッカス・プルビアリスを培養してシード溶液を得るステップであって、0.1～1g/Lのトリス(トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン))を、基本培養培地に添加し、初期pHは7.0～8.0、培養温度は15～25℃、例えば、20℃に制御し、得られたシード溶液中の緑色栄養細胞の割合は90%以上である、ステップ；
(2)従属栄養拡大:ステップ(1)で得られたシード溶液を、例えば、本発明による基本培地で、例えば、10～20日の間、細胞1～50×104個/mLという初期接種量で、従属栄養的に培養するステップであって、本発明による拡大供給培地を添加することにより、発酵プロセスの間(例えば、0.01～0.5vvmで通気速度を調整し、30～100rpmで攪拌速度を調整することにより)、ブロスのpHを6.0～9.0に維持し、酢酸塩の濃度を60～1200mg/Lに維持し、硝酸塩の濃度を100～2000mg/Lに維持し、リン酸塩の濃度を50～500mg/Lに維持し、培養温度は15～25℃に制御し、溶存酸素の濃度は0.1～4.0mg/Lに制御する、ステップ。任意選択で、藻類細胞の数が細胞100～1000×104個/mLに達する場合、細胞密度は約1.0～10.0g/Lになり、及び/又は運動性栄養細胞の50%～100%が不動性栄養細胞になり、従属栄養誘導の次のステップが実施される；
(3)従属栄養誘導:ステップ(2)の培養物に酢酸又は酢酸塩、例えば、酢酸ナトリウムを供給して、ブロス中の酢酸塩の濃度を1800～6000mg/Lに増やすステップ。培養の間、本発明による誘導供給培地を供給することにより、ブロスのpHを6.0～11.0に維持し、酢酸塩の濃度を1800～6000mg/Lに維持し、培養温度を20～35℃になるように制御する。発酵の間(例えば、通気容量を0.1～2.0vvmに調整し、攪拌速度を60～200rpmに調整することにより)、溶存酸素の濃度を2.0～10.0mg/Lに制御し、例えば、10～30日間培養する。このプロセスの間に、栄養細胞が赤い厚壁の胞子細胞に変換された場合、及び任意選択でアスタキサンチンの産生がもはや増加しなくなった場合、発酵は停止される；
(4)藻類細胞を収集するか、及び/又はアスタキサンチンを回収し、任意選択でアスタキサンチンを精製するステップ。
(1)シードの活性化:例えば、静置又は振盪フラスコで培養することにより、ヘマトコッカス・プルビアリスを培養してシード溶液を得るステップであって、0.1～1g/Lのトリス(トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン))を、基本培養培地に添加し、初期pHは7.0～8.0、培養温度は15～25℃、例えば、20℃に制御し、得られたシード溶液中の緑色栄養細胞の割合は90%以上である、ステップ；
(2)従属栄養拡大:ステップ(1)で得られたシード溶液を、例えば、本発明による基本培地で、例えば、10～20日の間、細胞1～50×104個/mLという初期接種量で、従属栄養的に培養するステップであって、本発明による拡大供給培地を添加することにより、発酵プロセスの間(例えば、0.01～0.5vvmで通気速度を調整し、30～100rpmで攪拌速度を調整することにより)、ブロスのpHを6.0～9.0に維持し、酢酸塩の濃度を60～1200mg/Lに維持し、硝酸塩の濃度を100～2000mg/Lに維持し、リン酸塩の濃度を50～500mg/Lに維持し、培養温度は15～25℃に制御し、溶存酸素の濃度は0.1～4.0mg/Lに制御する、ステップ。任意選択で、藻類細胞の数が細胞100～1000×104個/mLに達する場合、細胞密度は約1.0～10.0g/Lになり、及び/又は運動性栄養細胞の50%～100%が不動性栄養細胞になり、従属栄養誘導の次のステップが実施される；
(3)従属栄養誘導:ステップ(2)の培養物に酢酸又は酢酸塩、例えば、酢酸ナトリウムを供給して、ブロス中の酢酸塩の濃度を1800～6000mg/Lに増やすステップ。培養の間、本発明による誘導供給培地を供給することにより、ブロスのpHを6.0～11.0に維持し、酢酸塩の濃度を1800～6000mg/Lに維持し、培養温度を20～35℃になるように制御する。発酵の間(例えば、通気容量を0.1～2.0vvmに調整し、攪拌速度を60～200rpmに調整することにより)、溶存酸素の濃度を2.0～10.0mg/Lに制御し、例えば、10～30日間培養する。このプロセスの間に、栄養細胞が赤い厚壁の胞子細胞に変換された場合、及び任意選択でアスタキサンチンの産生がもはや増加しなくなった場合、発酵は停止される；
(4)藻類細胞を収集するか、及び/又はアスタキサンチンを回収し、任意選択でアスタキサンチンを精製するステップ。
【0101】
好ましい実施形態では、本発明は、以下を含む、アスタキサンチンを産生する方法を提供する:
(1)トリス(トリスヒドロキシメチルアミノメタン)(例えば、0.1～1g/L)を補充した本発明による基本培養培地でヘマトコッカス・プルビアリスを培養してシード溶液を得るステップであって、この培養培地の初期pHは7.5～8.0であり、この培養温度は20～25℃に制御され、得られたシード溶液中の緑色栄養細胞の割合は、90%以上である、ステップ；
(2)ステップ(1)で得られたシード溶液を、本発明による基本培養培地で従属栄養的に培養するステップであって、初期接種量が、細胞5～20(例えば、5～18)×104個/mLであり、培養の間、本発明による拡大供給培地を供給して、ブロスのpHを7.5～8.0に維持し、酢酸塩の濃度を300～900mg/L(例えば、300～700mg/L)に、硝酸塩の濃度を100～900mg/L(例えば、100～400、300～900又は600～900mg/L)に、リン酸イオンの濃度を50～250mg/L(例えば、100～250、100～150又は150～250mg/L)に維持し、培養温度を20～25℃に制御し、溶存酸素の濃度を1.0～4.0mg/L(例えば、1.0～2.5又は1.0～2.0mg/L)に制御し、任意選択で、藻類細胞の数が細胞400～700(例えば、450又は600)×104個/mLに達する場合、細胞密度は、約3.0～8.5g/L(例えば、3.4、7.8又は8.2g/L)であるか、又は運動性栄養細胞の少なくとも90%(例えば、少なくとも95%又は100%)が不動性栄養細胞に変換される場合、次のステップを実施する、ステップ;
(3)ステップ(2)の培養物に濃酢酸又は酢酸塩、例えば、酢酸ナトリウムを供給して、ブロス中の酢酸塩の濃度を3000～3500mg/Lに増加させ、培養の間、本発明による誘導供給培地を供給して、ブロスのpHを7.5～8.0に、酢酸塩の濃度を3000～5000mg/L(例えば、3000～4000、3000～4800又は3500～4800mg/L)に維持し、培養温度を20～25℃に制御し、溶存酸素の濃度を4.0～8.0mg/L(例えば、5.0～8.0mg/L)に制御するステップ;任意選択で、アスタキサンチンの産生がもはや増加しなくなった場合:
(4)藻類細胞を収集するか、及び/又はアスタキサンチンを回収し、任意選択でアスタキサンチンを精製するステップ。
(1)トリス(トリスヒドロキシメチルアミノメタン)(例えば、0.1～1g/L)を補充した本発明による基本培養培地でヘマトコッカス・プルビアリスを培養してシード溶液を得るステップであって、この培養培地の初期pHは7.5～8.0であり、この培養温度は20～25℃に制御され、得られたシード溶液中の緑色栄養細胞の割合は、90%以上である、ステップ；
(2)ステップ(1)で得られたシード溶液を、本発明による基本培養培地で従属栄養的に培養するステップであって、初期接種量が、細胞5～20(例えば、5～18)×104個/mLであり、培養の間、本発明による拡大供給培地を供給して、ブロスのpHを7.5～8.0に維持し、酢酸塩の濃度を300～900mg/L(例えば、300～700mg/L)に、硝酸塩の濃度を100～900mg/L(例えば、100～400、300～900又は600～900mg/L)に、リン酸イオンの濃度を50～250mg/L(例えば、100～250、100～150又は150～250mg/L)に維持し、培養温度を20～25℃に制御し、溶存酸素の濃度を1.0～4.0mg/L(例えば、1.0～2.5又は1.0～2.0mg/L)に制御し、任意選択で、藻類細胞の数が細胞400～700(例えば、450又は600)×104個/mLに達する場合、細胞密度は、約3.0～8.5g/L(例えば、3.4、7.8又は8.2g/L)であるか、又は運動性栄養細胞の少なくとも90%(例えば、少なくとも95%又は100%)が不動性栄養細胞に変換される場合、次のステップを実施する、ステップ;
(3)ステップ(2)の培養物に濃酢酸又は酢酸塩、例えば、酢酸ナトリウムを供給して、ブロス中の酢酸塩の濃度を3000～3500mg/Lに増加させ、培養の間、本発明による誘導供給培地を供給して、ブロスのpHを7.5～8.0に、酢酸塩の濃度を3000～5000mg/L(例えば、3000～4000、3000～4800又は3500～4800mg/L)に維持し、培養温度を20～25℃に制御し、溶存酸素の濃度を4.0～8.0mg/L(例えば、5.0～8.0mg/L)に制御するステップ;任意選択で、アスタキサンチンの産生がもはや増加しなくなった場合:
(4)藻類細胞を収集するか、及び/又はアスタキサンチンを回収し、任意選択でアスタキサンチンを精製するステップ。
【0102】
本発明において、溶存酸素の濃度は、任意の適切な手段によって、例えば、通気容量及び攪拌速度を調整することによって適切な濃度に制御され得、これらは全て当業者の知識の範囲内である。
【0103】
文脈で明示的に指定されていない限り、「又は」という単語は「及び」を含むものとする。
【0104】
本明細書で使用される場合、「任意選択の」又は「任意選択で」とは、その単語の後に記載される事象又は状況の発生又は非発生を指し、この説明には、この事象又は状況の発生及び非発生が含まれる。例えば、任意選択で含まれるステップとは、ステップの存在又は非存在を示す。
【0105】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の値を含む値の範囲を指し、これは、特定の値と同様であるとして当業者によって合理的に理解され得る。実施形態では、「約」という用語は、当技術分野で一般的に受け入れられている測定値を使用することの標準誤差の範囲内を意味する。実施形態では、「約」とは、指定された値の+/-10%又は5%を指す。
【0106】
本明細書で使用される場合、定義された数値範囲は、定義された数値範囲だけでなく、その範囲内の特定の数値及びサブ範囲も開示していると見なされるべきである。例えば、pH6.0～9.0は、6.0～9.0の範囲、及びその間の特定の値、並びに6.0～8.0、7.0～8.0などのより小さな範囲をカバーする。
【0107】
従来技術と比較して、本発明は以下の利点及び効果を有する。
(1)本発明において、ヘマトコッカス・プルビアリスは、光透過性と細胞密度との間の反比例関係に起因して高密度培養を達成することができない従来の光培養の技術的ボトルネックを克服する従属栄養様式で培養される。ある実施例では、ヘマトコッカス・プルビアリスにおけるアスタキサンチンの誘導が完了すると、藻類細胞の密度は37.25g/Lに達し、アスタキサンチンの収量は1076.53mg/Lに達し、従来の光培養よりもはるかに高かった。
(2)シードの調製、従属栄養拡大培養から本発明によるアスタキサンチン誘導までの全技術プロセスにおいて光を必要とせず、気候、季節、及び地理に対する従来の光培養の依存性、並びに生成物の品質に対する外部環境条件の変化の影響を完全に取り除く。従属栄養培養は、全天候型の工業化された安定した生産を達成するために、発酵パラメーターの正確な制御を通じて、従来の発酵槽で実施され得る。
(3)従来の光培養と比較して、本発明によって提供される解決策は、培養密度が高く、光を必要としないため、占有面積、水消費量、及び回収コストを大幅に削減し得る。
(4)本発明によって提供される解決策は、効果的な滅菌ができないことに起因する、従来のランウェイポンド又はフォトバイオリアクターにおける原生動物、他の藻類、真菌、及び細菌などの汚染問題を克服する。発酵槽を高温でオートクレーブ処理することにより、細菌による汚染を効果的に回避し、生成物の品質を確保する。
(1)本発明において、ヘマトコッカス・プルビアリスは、光透過性と細胞密度との間の反比例関係に起因して高密度培養を達成することができない従来の光培養の技術的ボトルネックを克服する従属栄養様式で培養される。ある実施例では、ヘマトコッカス・プルビアリスにおけるアスタキサンチンの誘導が完了すると、藻類細胞の密度は37.25g/Lに達し、アスタキサンチンの収量は1076.53mg/Lに達し、従来の光培養よりもはるかに高かった。
(2)シードの調製、従属栄養拡大培養から本発明によるアスタキサンチン誘導までの全技術プロセスにおいて光を必要とせず、気候、季節、及び地理に対する従来の光培養の依存性、並びに生成物の品質に対する外部環境条件の変化の影響を完全に取り除く。従属栄養培養は、全天候型の工業化された安定した生産を達成するために、発酵パラメーターの正確な制御を通じて、従来の発酵槽で実施され得る。
(3)従来の光培養と比較して、本発明によって提供される解決策は、培養密度が高く、光を必要としないため、占有面積、水消費量、及び回収コストを大幅に削減し得る。
(4)本発明によって提供される解決策は、効果的な滅菌ができないことに起因する、従来のランウェイポンド又はフォトバイオリアクターにおける原生動物、他の藻類、真菌、及び細菌などの汚染問題を克服する。発酵槽を高温でオートクレーブ処理することにより、細菌による汚染を効果的に回避し、生成物の品質を確保する。
【図面の簡単な説明】
【0108】
【図1】実施例1におけるヘマトコッカス・プルビアリスの従属栄養誘導中のアスタキサンチンの含有量対収量の変動曲線を示している。
【図2】実施例2におけるヘマトコッカス・プルビアリスの従属栄養誘導中のアスタキサンチンの含有量対収量の変動曲線を示している。
【図3】実施例3におけるヘマトコッカス・プルビアリスの従属栄養誘導中のアスタキサンチンの含有量対収量の変動曲線を示している。
【図4】実施例4におけるヘマトコッカス・プルビアリスの従属栄養誘導中のアスタキサンチンの含有量対収量の変動曲線を示している。
【図5】実施例5におけるヘマトコッカス・プルビアリスの従属栄養誘導中のアスタキサンチンの含有量対収量の変動曲線を示している。
【図6】実施例6におけるヘマトコッカス・プルビアリスの従属栄養誘導中のアスタキサンチンの含有量対収量の変動曲線を示している。
【発明を実施するための形態】
【0109】
以下、本発明の実施形態を示す。
［１］アスタキサンチンを産生する方法であって、
(a)アスタキサンチン産生ヘマトコッカス・プルビアリスを、任意選択で藻類細胞の少なくとも約50%が不動性栄養細胞になるまで、及び/又は任意選択で培養後の藻類細胞の数が少なくとも細胞約10 6 個/mL、好ましくは細胞約2×10 6 個/mLになるか、及び/又は任意選択で細胞の密度が少なくとも約1.0g/L、好ましくは少なくとも約2.0g/Lになるまで従属栄養的に培養するステップ、
(b)ステップ(a)で得られたヘマトコッカス・プルビアリス細胞を、酢酸塩及び溶存酸素の濃度を上げた条件下で、任意選択でアスタキサンチンの収量が増えなくなるまで従属栄養的に培養するステップであって、酢酸塩の濃度が少なくとも約1800mg/Lであり、且つ、溶存酸素の濃度が少なくとも約2mg/Lである、ステップ、並びに
(c)ステップ(b)におけるヘマトコッカス・プルビアリス細胞を収集するか、及び/又はアスタキサンチンを回収し、任意選択でアスタキサンチンを精製するステップ
を含む方法。
［２］ステップ(a)において、
- 培養溶液のpHが約6.0～9.0、好ましくは7.0～8.0であるか、及び/又は
- 培養温度が約15～25℃、好ましくは20～25℃であるか、及び/又は
- 培養溶液中の溶存酸素の濃度が約0.1～4.0mg/Lであり、且つ、ステップ(b)の溶存酸素の濃度よりも低いか、及び/又は
- 酢酸塩の濃度が約60～1200mg/L、好ましくは約100～900mg/L、より好ましくは約300～900mg/Lであるか、及び/又は
- 硝酸塩の濃度が約100～2000mg/L、好ましくは約100～1500mg/L、より好ましくは約100～900mg/Lであるか、及び/又は
- リン酸塩の濃度が約50～500mg/L、好ましくは約50～300mg/L、より好ましくは約50～250mg/Lであるか、及び/又は
- ヘマトコッカス・プルビアリス細胞の初期密度が少なくとも細胞約10 4 個、好ましくは5×10 4 個/mLである、
［1］に記載の方法。
［３］ステップ(b)において、
- 培養溶液のpHが約6.0～11.0、好ましくは7.0～9.0であるか、及び/又は
- 培養温度が約20～35℃、好ましくは20～25℃であるか、及び/又は
- 酢酸塩の濃度が約1800～6000mg/L、好ましくは3000～5000mg/Lであるか、及び/又は
- 溶存酸素の濃度が約2～10mg/L、好ましくは4～8mg/Lである、
［1］又は［2］に記載の方法。
［４］ステップ(a)において、ヘマトコッカス・プルビアリスが基本培養培地中で培養され、且つ、拡大供給培地が培養プロセス中に供給され、
基本培養培地が、0.1～2.0g/Lの酢酸ナトリウム、0.1～3.0g/Lの硝酸ナトリウム、50～500mg/Lのリン酸二水素カリウム、20～200mg/Lのリン酸水素二カリウム、50～500mg/Lの硫酸マグネシウム、1～50mg/Lの塩化カルシウム、0.5～5mg/Lのエデト酸二ナトリウム、0.1～5mg/Lのホウ酸、100～500μg/Lの塩化第二鉄、1～100μg/Lの塩化マンガン、1～100μg/Lの硫酸亜鉛、1～100μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、0.1～10μg/Lの塩化コバルト、1～100μg/Lの硫酸銅、0～1μg/LのビタミンB12、0～1μg/Lのビオチン、及び0～20μg/LのビタミンB1を含み、
拡大供給培地が、30～600g/Lの酢酸、2～70g/Lの硝酸ナトリウム、0.2～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0.05～10g/Lの硫酸マグネシウム、1～40mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～35mg/Lのホウ酸、150～4000μg/Lの塩化第二鉄、30～1000μg/Lの塩化マンガン、15～600μg/Lの硫酸亜鉛、15～500μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～100μg/Lの塩化コバルト、20～700μg/Lの硫酸銅、0～10μg/LのビタミンB12、0～10μg/Lのビオチン、及び0～1000μg/LのビタミンB1を含む、
［1］から［3］のいずれか一に記載の方法。
［５］ステップ(b)において、酢酸又は酢酸塩、例えば、酢酸ナトリウムを添加することによって、及び/又は誘導供給培地を供給することによって、高濃度の酢酸塩が維持され、誘導供給培地が、30～600g/Lの酢酸、0～70g/Lの硝酸ナトリウム、0～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0～1.0g/Lの硫酸マグネシウム、1～40mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～35mg/Lのホウ酸、150～4000μg/Lの塩化第二鉄、30～1000μg/Lの塩化マンガン、15～600μg/Lの硫酸亜鉛、15～500μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～100μg/Lの塩化コバルト、及び20～700μg/Lの硫酸銅を含む、［１］から［4］のいずれか一に記載の方法。
［６］ステップ(a)の前に、ヘマトコッカス・プルビアリスシード溶液を得ることを含む活性化ステップを含み、任意選択で、シード溶液中の緑色栄養細胞の割合が少なくとも約90%であるか、及び/又は任意選択で細胞の密度が少なくとも細胞約50×10 4 個/mLである、［1］から［5］のいずれか一に記載の方法。
［７］活性化ステップにおいて、
- pHが約6.0～9.0、好ましくは7.0～8.0であるか、及び/又は
- 培養温度が約15～25℃、好ましくは約20～25℃である、
［6］に記載の方法。
［８］ステップ(a)が、シード溶液を従属栄養的に培養して培養溶液を得ることを含み、得られた培養溶液中の運動性栄養細胞の少なくとも約50%が不動性栄養細胞に変換され、任意選択で、シード溶液の初期接種量が細胞約1～50×10 4 個/mLであり、任意選択で、得られた培養溶液中の藻類細胞の数が、少なくとも細胞約1、2、3、4、5又は6×10 6 個/mL、好ましくは細胞約1～10×10 6 個/mLであるか、及び/又は任意選択で藻類細胞の密度が少なくとも約2.0g/L、好ましくは約3.0～10.0g/Lである、［6］又は［7］に記載の方法。
［９］活性化ステップが、好ましくは約0.1～1.0g/L、より好ましくは約0.5～0.7g/Lの濃度でトリス(トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン))を含む培養培地中で、ヘマトコッカス・プルビアリスを培養して、シード溶液を得るステップを含む、［6］から［8］のいずれか一に記載の方法。
［１０］活性化ステップにおいて、ヘマトコッカス・プルビアリスが基本培養培地中で培養され、基本培養培地が、0.1～2.0g/Lの酢酸ナトリウム、0.1～3.0g/Lの硝酸ナトリウム、50～500mg/Lのリン酸二水素カリウム、20～200mg/Lのリン酸水素二カリウム、50～500mg/Lの硫酸マグネシウム、1～50mg/Lの塩化カルシウム、0.5～5mg/Lのエデト酸二ナトリウム、0.1～5mg/Lのホウ酸、100～500μg/Lの塩化第二鉄、1～100μg/Lの塩化マンガン、1～100μg/Lの硫酸亜鉛、1～100μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、0.1～10μg/Lの塩化コバルト、1～100μg/Lの硫酸銅、0～1μg/LのビタミンB12、0～1μg/Lのビオチン、及び0～20μg/LのビタミンB1を含む、［6］から［9］のいずれか一に記載の方法。
［１１］ヘマトコッカス・プルビアリスが、ヘマトコッカス・プルビアリス CCTCC M2018809、AC136、AC143、AC587、AC588、ATCC 30453、ATCC 30402、CS-321、G 1002、ETTL 1958/3、TAKACOVAL 1983/1、PRIBYL 2005/4、PRIBYL 2008/3、CCCryo 188-04、CCCryo 189-04、CCCryo 190-04、SCCAP K-0084、IPPAS H-239、NIVA-CHL 9、FWAC 7072、FWAC 7039、CPCC 93、ACOI 816、ACOI 815、ACOI 276、ACOI 255、ACOI 133、ACOI 51、CCAP 34/1D、CCAP 34/1F、CCAP 34/6、CCAP 34/7、CCAP34/8、CCAP 34/12、CCAP 34/13、CCAP 34/14、NIES-144、NIES-2263、NIES-2264、NIES-2265、SAG 192.80、SAG 44.96、SAG 34-1a、SAG 34-1b、SAG 34-1c、CCAC 0055、CCAC 0125、CCAC 0129、CCAC 2072B、UTEX 2505、UTEX 16、UTEX B 294、CWU-MACC20、TISTR 8647、FACHB-712、FACHB-827、FACHB-797、FACHB-955、FACHB-1164及びCCMP 3127からなる群から選択される、［1］から［10］のいずれか一に記載の方法。
［１２］(1)ヘマトコッカス・プルビアリスを0.5～0.6g/Lのトリス(トリスヒドロキシメチルアミノメタン)を含む基本培養培地中で培養して、シード溶液を得るステップであって、培養開始時の培養培地のpHが7.5～8.0であり、且つ、培養温度が約20～25℃であり、且つ、得られたシード溶液中の緑色栄養細胞の割合が少なくとも約90%である、ステップ、
(2)ステップ(1)のシード溶液を基本培養培地中で従属栄養的に培養して培養溶液を得るステップであって、培養の間、pHが約7.5～8.0に維持され、培養温度が約20～25℃に維持され、培養溶液中の溶存酸素の濃度が約1.0～4.0mg/Lに維持され、酢酸塩の濃度が約300～900mg/Lに維持され、硝酸塩の濃度が約100～900mg/Lに維持され、且つ、リン酸塩の濃度が約50～250mg/Lに維持され、且つ、拡大供給培地が培養の間に供給され、運動性栄養細胞の少なくとも約90%が不動性栄養細胞に変換されるか、及び/又は任意選択で、得られた培養溶液中の細胞の密度が少なくとも細胞4×10 6 個/mLである場合、任意選択でステップ(3)を実施する、ステップ、
(3)酢酸又は酢酸塩、例えば、酢酸ナトリウムをステップ(2)における培養溶液に添加して、酢酸塩の濃度を少なくとも約3000mg/Lにし、且つ、培養の間に誘導供給培地を添加するステップであって、培養の間、pHが約7.5～8.0に維持され、酢酸塩の濃度が少なくとも約3000～5000mg/Lに維持され、培養温度が約20～35℃、好ましくは約20～25℃に維持され、且つ、培養溶液中の溶存酸素の濃度が少なくとも約4.0mg/L、例えば、約4.0～8.0mg/Lに維持されるステップ、並びに
(4)ステップ(3)で得られた藻類細胞を収集するか、及び/又はアスタキサンチンを回収し、任意選択でアスタキサンチンを精製するステップ、
を含み、
基本培養培地が、0.8～1.0g/Lの酢酸ナトリウム、0.5～1.0g/Lの硝酸ナトリウム、60～200mg/Lのリン酸二水素カリウム、20～100mg/Lのリン酸水素二カリウム、50～200mg/Lの硫酸マグネシウム、1～25mg/Lの塩化カルシウム、1.5～3mg/Lのエデト酸二ナトリウム、0.1～3mg/Lのホウ酸、200～350μg/Lの塩化第二鉄、4～70μg/Lの塩化マンガン、10～35又は12～35μg/Lの硫酸亜鉛、1～30μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～7μg/Lの塩化コバルト、1～50μg/Lの硫酸銅、0～0.1μg/LのビタミンB12、0～0.1μg/Lのビオチン、及び0～10μg/LのビタミンB1を含み、
拡大供給培地が、30～60g/Lの酢酸、5.0～7.0g/Lの硝酸ナトリウム、0.5～1.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0.1～1.0g/Lの硫酸マグネシウム、3～24mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～6mg/Lのホウ酸、350～4000μg/Lの塩化第二鉄、50～300又は70～280μg/Lの塩化マンガン、35～600μg/Lの硫酸亜鉛、30～60μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、5～100又は7～100μg/Lの塩化コバルト、及び50～100μg/Lの硫酸銅を含み、
誘導供給培地が、60～600g/Lの酢酸、0～50g/Lの硝酸ナトリウム、0.5～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0.05～1.0g/Lの硫酸マグネシウム、1～30mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～30mg/Lのホウ酸、150～3500μg/Lの塩化第二鉄、30～700μg/Lの塩化マンガン、15～350μg/Lの硫酸亜鉛、15～300μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～70μg/Lの塩化コバルト、及び20～500μg/Lの硫酸銅を含む、
［1］から［11］のいずれか一に記載の方法。
［１３］ヘマトコッカス・プルビアリスを培養するための基本培養培地であって、0.1～2.0g/Lの酢酸ナトリウム、0.1～3.0g/Lの硝酸ナトリウム、50～500mg/Lのリン酸二水素カリウム、20～200mg/Lのリン酸水素二カリウム、50～500mg/Lの硫酸マグネシウム、1～50mg/Lの塩化カルシウム、0.5～5mg/Lのエデト酸二ナトリウム、0.1～5mg/Lのホウ酸、100～500μg/Lの塩化第二鉄、1～100μg/Lの塩化マンガン、1～100μg/Lの硫酸亜鉛、1～100μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、0.1～10μg/Lの塩化コバルト、1～100μg/Lの硫酸銅、0～1μg/LのビタミンB12、0～1μg/Lのビオチン、及び0～20μg/LのビタミンB1を含む、基本培養培地。
［１４］ヘマトコッカス・プルビアリスを培養するための拡大供給培地であって、30～600g/Lの酢酸、2～70g/Lの硝酸ナトリウム、0.2～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0.05～10g/Lの硫酸マグネシウム、1～40mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～35mg/Lのホウ酸、150～4000μg/Lの塩化第二鉄、30～1000μg/Lの塩化マンガン、15～600μg/Lの硫酸亜鉛、15～500μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～100μg/Lの塩化コバルト及び20～700μg/Lの硫酸銅、0～10μg/LのビタミンB12、0～10μg/Lのビオチン、及び0～1000μg/LのビタミンB1を含む、拡大供給培地。
［１５］ヘマトコッカス・プルビアリスを誘導してアスタキサンチンを産生するための誘導供給培地であって、30～600g/Lの酢酸、0～70g/Lの硝酸ナトリウム、0～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0～1.0g/Lの硫酸マグネシウム、1～40mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～35mg/Lのホウ酸、150～4000μg/Lの塩化第二鉄、30～1000μg/Lの塩化マンガン、15～600μg/Lの硫酸亜鉛、15～500μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～100μg/Lの塩化コバルト、及び20～700μg/Lの硫酸銅を含む、誘導供給培地。
本発明の技術及び方法は、一般に、当技術分野で周知であり、本明細書で引用された参考文献に記載されている従来の方法に従って実施される。本発明は、実施例と組み合わせてさらに説明される。しかしながら、これらの実施例は、例示のみを目的としており、本発明を限定するためのものではないことを理解されたい。
［１］アスタキサンチンを産生する方法であって、
(a)アスタキサンチン産生ヘマトコッカス・プルビアリスを、任意選択で藻類細胞の少なくとも約50%が不動性栄養細胞になるまで、及び/又は任意選択で培養後の藻類細胞の数が少なくとも細胞約10 6 個/mL、好ましくは細胞約2×10 6 個/mLになるか、及び/又は任意選択で細胞の密度が少なくとも約1.0g/L、好ましくは少なくとも約2.0g/Lになるまで従属栄養的に培養するステップ、
(b)ステップ(a)で得られたヘマトコッカス・プルビアリス細胞を、酢酸塩及び溶存酸素の濃度を上げた条件下で、任意選択でアスタキサンチンの収量が増えなくなるまで従属栄養的に培養するステップであって、酢酸塩の濃度が少なくとも約1800mg/Lであり、且つ、溶存酸素の濃度が少なくとも約2mg/Lである、ステップ、並びに
(c)ステップ(b)におけるヘマトコッカス・プルビアリス細胞を収集するか、及び/又はアスタキサンチンを回収し、任意選択でアスタキサンチンを精製するステップ
を含む方法。
［２］ステップ(a)において、
- 培養溶液のpHが約6.0～9.0、好ましくは7.0～8.0であるか、及び/又は
- 培養温度が約15～25℃、好ましくは20～25℃であるか、及び/又は
- 培養溶液中の溶存酸素の濃度が約0.1～4.0mg/Lであり、且つ、ステップ(b)の溶存酸素の濃度よりも低いか、及び/又は
- 酢酸塩の濃度が約60～1200mg/L、好ましくは約100～900mg/L、より好ましくは約300～900mg/Lであるか、及び/又は
- 硝酸塩の濃度が約100～2000mg/L、好ましくは約100～1500mg/L、より好ましくは約100～900mg/Lであるか、及び/又は
- リン酸塩の濃度が約50～500mg/L、好ましくは約50～300mg/L、より好ましくは約50～250mg/Lであるか、及び/又は
- ヘマトコッカス・プルビアリス細胞の初期密度が少なくとも細胞約10 4 個、好ましくは5×10 4 個/mLである、
［1］に記載の方法。
［３］ステップ(b)において、
- 培養溶液のpHが約6.0～11.0、好ましくは7.0～9.0であるか、及び/又は
- 培養温度が約20～35℃、好ましくは20～25℃であるか、及び/又は
- 酢酸塩の濃度が約1800～6000mg/L、好ましくは3000～5000mg/Lであるか、及び/又は
- 溶存酸素の濃度が約2～10mg/L、好ましくは4～8mg/Lである、
［1］又は［2］に記載の方法。
［４］ステップ(a)において、ヘマトコッカス・プルビアリスが基本培養培地中で培養され、且つ、拡大供給培地が培養プロセス中に供給され、
基本培養培地が、0.1～2.0g/Lの酢酸ナトリウム、0.1～3.0g/Lの硝酸ナトリウム、50～500mg/Lのリン酸二水素カリウム、20～200mg/Lのリン酸水素二カリウム、50～500mg/Lの硫酸マグネシウム、1～50mg/Lの塩化カルシウム、0.5～5mg/Lのエデト酸二ナトリウム、0.1～5mg/Lのホウ酸、100～500μg/Lの塩化第二鉄、1～100μg/Lの塩化マンガン、1～100μg/Lの硫酸亜鉛、1～100μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、0.1～10μg/Lの塩化コバルト、1～100μg/Lの硫酸銅、0～1μg/LのビタミンB12、0～1μg/Lのビオチン、及び0～20μg/LのビタミンB1を含み、
拡大供給培地が、30～600g/Lの酢酸、2～70g/Lの硝酸ナトリウム、0.2～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0.05～10g/Lの硫酸マグネシウム、1～40mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～35mg/Lのホウ酸、150～4000μg/Lの塩化第二鉄、30～1000μg/Lの塩化マンガン、15～600μg/Lの硫酸亜鉛、15～500μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～100μg/Lの塩化コバルト、20～700μg/Lの硫酸銅、0～10μg/LのビタミンB12、0～10μg/Lのビオチン、及び0～1000μg/LのビタミンB1を含む、
［1］から［3］のいずれか一に記載の方法。
［５］ステップ(b)において、酢酸又は酢酸塩、例えば、酢酸ナトリウムを添加することによって、及び/又は誘導供給培地を供給することによって、高濃度の酢酸塩が維持され、誘導供給培地が、30～600g/Lの酢酸、0～70g/Lの硝酸ナトリウム、0～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0～1.0g/Lの硫酸マグネシウム、1～40mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～35mg/Lのホウ酸、150～4000μg/Lの塩化第二鉄、30～1000μg/Lの塩化マンガン、15～600μg/Lの硫酸亜鉛、15～500μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～100μg/Lの塩化コバルト、及び20～700μg/Lの硫酸銅を含む、［１］から［4］のいずれか一に記載の方法。
［６］ステップ(a)の前に、ヘマトコッカス・プルビアリスシード溶液を得ることを含む活性化ステップを含み、任意選択で、シード溶液中の緑色栄養細胞の割合が少なくとも約90%であるか、及び/又は任意選択で細胞の密度が少なくとも細胞約50×10 4 個/mLである、［1］から［5］のいずれか一に記載の方法。
［７］活性化ステップにおいて、
- pHが約6.0～9.0、好ましくは7.0～8.0であるか、及び/又は
- 培養温度が約15～25℃、好ましくは約20～25℃である、
［6］に記載の方法。
［８］ステップ(a)が、シード溶液を従属栄養的に培養して培養溶液を得ることを含み、得られた培養溶液中の運動性栄養細胞の少なくとも約50%が不動性栄養細胞に変換され、任意選択で、シード溶液の初期接種量が細胞約1～50×10 4 個/mLであり、任意選択で、得られた培養溶液中の藻類細胞の数が、少なくとも細胞約1、2、3、4、5又は6×10 6 個/mL、好ましくは細胞約1～10×10 6 個/mLであるか、及び/又は任意選択で藻類細胞の密度が少なくとも約2.0g/L、好ましくは約3.0～10.0g/Lである、［6］又は［7］に記載の方法。
［９］活性化ステップが、好ましくは約0.1～1.0g/L、より好ましくは約0.5～0.7g/Lの濃度でトリス(トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン))を含む培養培地中で、ヘマトコッカス・プルビアリスを培養して、シード溶液を得るステップを含む、［6］から［8］のいずれか一に記載の方法。
［１０］活性化ステップにおいて、ヘマトコッカス・プルビアリスが基本培養培地中で培養され、基本培養培地が、0.1～2.0g/Lの酢酸ナトリウム、0.1～3.0g/Lの硝酸ナトリウム、50～500mg/Lのリン酸二水素カリウム、20～200mg/Lのリン酸水素二カリウム、50～500mg/Lの硫酸マグネシウム、1～50mg/Lの塩化カルシウム、0.5～5mg/Lのエデト酸二ナトリウム、0.1～5mg/Lのホウ酸、100～500μg/Lの塩化第二鉄、1～100μg/Lの塩化マンガン、1～100μg/Lの硫酸亜鉛、1～100μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、0.1～10μg/Lの塩化コバルト、1～100μg/Lの硫酸銅、0～1μg/LのビタミンB12、0～1μg/Lのビオチン、及び0～20μg/LのビタミンB1を含む、［6］から［9］のいずれか一に記載の方法。
［１１］ヘマトコッカス・プルビアリスが、ヘマトコッカス・プルビアリス CCTCC M2018809、AC136、AC143、AC587、AC588、ATCC 30453、ATCC 30402、CS-321、G 1002、ETTL 1958/3、TAKACOVAL 1983/1、PRIBYL 2005/4、PRIBYL 2008/3、CCCryo 188-04、CCCryo 189-04、CCCryo 190-04、SCCAP K-0084、IPPAS H-239、NIVA-CHL 9、FWAC 7072、FWAC 7039、CPCC 93、ACOI 816、ACOI 815、ACOI 276、ACOI 255、ACOI 133、ACOI 51、CCAP 34/1D、CCAP 34/1F、CCAP 34/6、CCAP 34/7、CCAP34/8、CCAP 34/12、CCAP 34/13、CCAP 34/14、NIES-144、NIES-2263、NIES-2264、NIES-2265、SAG 192.80、SAG 44.96、SAG 34-1a、SAG 34-1b、SAG 34-1c、CCAC 0055、CCAC 0125、CCAC 0129、CCAC 2072B、UTEX 2505、UTEX 16、UTEX B 294、CWU-MACC20、TISTR 8647、FACHB-712、FACHB-827、FACHB-797、FACHB-955、FACHB-1164及びCCMP 3127からなる群から選択される、［1］から［10］のいずれか一に記載の方法。
［１２］(1)ヘマトコッカス・プルビアリスを0.5～0.6g/Lのトリス(トリスヒドロキシメチルアミノメタン)を含む基本培養培地中で培養して、シード溶液を得るステップであって、培養開始時の培養培地のpHが7.5～8.0であり、且つ、培養温度が約20～25℃であり、且つ、得られたシード溶液中の緑色栄養細胞の割合が少なくとも約90%である、ステップ、
(2)ステップ(1)のシード溶液を基本培養培地中で従属栄養的に培養して培養溶液を得るステップであって、培養の間、pHが約7.5～8.0に維持され、培養温度が約20～25℃に維持され、培養溶液中の溶存酸素の濃度が約1.0～4.0mg/Lに維持され、酢酸塩の濃度が約300～900mg/Lに維持され、硝酸塩の濃度が約100～900mg/Lに維持され、且つ、リン酸塩の濃度が約50～250mg/Lに維持され、且つ、拡大供給培地が培養の間に供給され、運動性栄養細胞の少なくとも約90%が不動性栄養細胞に変換されるか、及び/又は任意選択で、得られた培養溶液中の細胞の密度が少なくとも細胞4×10 6 個/mLである場合、任意選択でステップ(3)を実施する、ステップ、
(3)酢酸又は酢酸塩、例えば、酢酸ナトリウムをステップ(2)における培養溶液に添加して、酢酸塩の濃度を少なくとも約3000mg/Lにし、且つ、培養の間に誘導供給培地を添加するステップであって、培養の間、pHが約7.5～8.0に維持され、酢酸塩の濃度が少なくとも約3000～5000mg/Lに維持され、培養温度が約20～35℃、好ましくは約20～25℃に維持され、且つ、培養溶液中の溶存酸素の濃度が少なくとも約4.0mg/L、例えば、約4.0～8.0mg/Lに維持されるステップ、並びに
(4)ステップ(3)で得られた藻類細胞を収集するか、及び/又はアスタキサンチンを回収し、任意選択でアスタキサンチンを精製するステップ、
を含み、
基本培養培地が、0.8～1.0g/Lの酢酸ナトリウム、0.5～1.0g/Lの硝酸ナトリウム、60～200mg/Lのリン酸二水素カリウム、20～100mg/Lのリン酸水素二カリウム、50～200mg/Lの硫酸マグネシウム、1～25mg/Lの塩化カルシウム、1.5～3mg/Lのエデト酸二ナトリウム、0.1～3mg/Lのホウ酸、200～350μg/Lの塩化第二鉄、4～70μg/Lの塩化マンガン、10～35又は12～35μg/Lの硫酸亜鉛、1～30μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～7μg/Lの塩化コバルト、1～50μg/Lの硫酸銅、0～0.1μg/LのビタミンB12、0～0.1μg/Lのビオチン、及び0～10μg/LのビタミンB1を含み、
拡大供給培地が、30～60g/Lの酢酸、5.0～7.0g/Lの硝酸ナトリウム、0.5～1.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0.1～1.0g/Lの硫酸マグネシウム、3～24mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～6mg/Lのホウ酸、350～4000μg/Lの塩化第二鉄、50～300又は70～280μg/Lの塩化マンガン、35～600μg/Lの硫酸亜鉛、30～60μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、5～100又は7～100μg/Lの塩化コバルト、及び50～100μg/Lの硫酸銅を含み、
誘導供給培地が、60～600g/Lの酢酸、0～50g/Lの硝酸ナトリウム、0.5～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0.05～1.0g/Lの硫酸マグネシウム、1～30mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～30mg/Lのホウ酸、150～3500μg/Lの塩化第二鉄、30～700μg/Lの塩化マンガン、15～350μg/Lの硫酸亜鉛、15～300μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～70μg/Lの塩化コバルト、及び20～500μg/Lの硫酸銅を含む、
［1］から［11］のいずれか一に記載の方法。
［１３］ヘマトコッカス・プルビアリスを培養するための基本培養培地であって、0.1～2.0g/Lの酢酸ナトリウム、0.1～3.0g/Lの硝酸ナトリウム、50～500mg/Lのリン酸二水素カリウム、20～200mg/Lのリン酸水素二カリウム、50～500mg/Lの硫酸マグネシウム、1～50mg/Lの塩化カルシウム、0.5～5mg/Lのエデト酸二ナトリウム、0.1～5mg/Lのホウ酸、100～500μg/Lの塩化第二鉄、1～100μg/Lの塩化マンガン、1～100μg/Lの硫酸亜鉛、1～100μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、0.1～10μg/Lの塩化コバルト、1～100μg/Lの硫酸銅、0～1μg/LのビタミンB12、0～1μg/Lのビオチン、及び0～20μg/LのビタミンB1を含む、基本培養培地。
［１４］ヘマトコッカス・プルビアリスを培養するための拡大供給培地であって、30～600g/Lの酢酸、2～70g/Lの硝酸ナトリウム、0.2～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0.05～10g/Lの硫酸マグネシウム、1～40mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～35mg/Lのホウ酸、150～4000μg/Lの塩化第二鉄、30～1000μg/Lの塩化マンガン、15～600μg/Lの硫酸亜鉛、15～500μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～100μg/Lの塩化コバルト及び20～700μg/Lの硫酸銅、0～10μg/LのビタミンB12、0～10μg/Lのビオチン、及び0～1000μg/LのビタミンB1を含む、拡大供給培地。
［１５］ヘマトコッカス・プルビアリスを誘導してアスタキサンチンを産生するための誘導供給培地であって、30～600g/Lの酢酸、0～70g/Lの硝酸ナトリウム、0～5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0～1.0g/Lの硫酸マグネシウム、1～40mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1～35mg/Lのホウ酸、150～4000μg/Lの塩化第二鉄、30～1000μg/Lの塩化マンガン、15～600μg/Lの硫酸亜鉛、15～500μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3～100μg/Lの塩化コバルト、及び20～700μg/Lの硫酸銅を含む、誘導供給培地。
本発明の技術及び方法は、一般に、当技術分野で周知であり、本明細書で引用された参考文献に記載されている従来の方法に従って実施される。本発明は、実施例と組み合わせてさらに説明される。しかしながら、これらの実施例は、例示のみを目的としており、本発明を限定するためのものではないことを理解されたい。
【0110】
[実施例]
本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。しかし、それらのいかなる例又は組合せも、本発明の範囲又は実施形態を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。本明細書及び本分野における一般的な知識と組み合わせて、当業者は、特許請求の範囲によって定義される範囲を明確に理解し得る。本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、当業者は、本発明の技術的解決策に対して任意の修正又は変更を行い得、そのような修正及び変更もまた、本発明の範囲に含まれる。
本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。しかし、それらのいかなる例又は組合せも、本発明の範囲又は実施形態を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。本明細書及び本分野における一般的な知識と組み合わせて、当業者は、特許請求の範囲によって定義される範囲を明確に理解し得る。本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、当業者は、本発明の技術的解決策に対して任意の修正又は変更を行い得、そのような修正及び変更もまた、本発明の範囲に含まれる。
【0111】
[実施例1]
この実施例の好ましい基本培養培地は、以下の配合を有する:0.82g/Lの酢酸ナトリウム、1.0g/Lの硝酸ナトリウム、152mg/Lのリン酸二水素カリウム、64mg/Lのリン酸水素二カリウム、100mg/Lの硫酸マグネシウム、15mg/Lの塩化カルシウム、3mg/Lのエデト酸二ナトリウム、3mg/Lのホウ酸、350μg/Lの塩化第二鉄、70μg/Lの塩化マンガン、35μg/Lの硫酸亜鉛、30μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、7μg/Lの塩化コバルト、及び50μg/Lの硫酸銅。
この実施例の好ましい基本培養培地は、以下の配合を有する:0.82g/Lの酢酸ナトリウム、1.0g/Lの硝酸ナトリウム、152mg/Lのリン酸二水素カリウム、64mg/Lのリン酸水素二カリウム、100mg/Lの硫酸マグネシウム、15mg/Lの塩化カルシウム、3mg/Lのエデト酸二ナトリウム、3mg/Lのホウ酸、350μg/Lの塩化第二鉄、70μg/Lの塩化マンガン、35μg/Lの硫酸亜鉛、30μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、7μg/Lの塩化コバルト、及び50μg/Lの硫酸銅。
【0112】
この実施例の好ましい拡大供給培地は、以下の配合を有する:7.0g/Lの硝酸ナトリウム、1.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0.3g/Lの硫酸マグネシウム、6mg/Lのエデト酸二ナトリウム、6mg/Lのホウ酸、700μg/Lの塩化第二鉄、140μg/Lの塩化マンガン、70μg/Lの硫酸亜鉛、60μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、14μg/Lの塩化コバルト、及び100μg/Lの硫酸銅。調製の際、これを121℃で21分間オートクレーブ処理し、室温まで冷却した後、無菌操作により氷酢酸(酢酸の含有量が98%超)を添加し、酢酸の濃度を60g/Lにした。
【0113】
この実施例の好ましい誘導供給培地は、以下の配合を有する:50g/Lの硝酸ナトリウム、5.0g/Lのリン酸二水素カリウム、1.0g/Lの硫酸マグネシウム、30mg/Lのエデト酸二ナトリウム、30mg/Lのホウ酸、3500μg/Lの塩化第二鉄、700μg/Lの塩化マンガン、350μg/Lの硫酸亜鉛、300μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、70μg/Lの塩化コバルト、及び500μg/Lの硫酸銅。調製の際、これを121℃で21分間オートクレーブ処理し、室温まで冷却した後、無菌操作により氷酢酸(酢酸の含有量が98%超)を添加し、酢酸の濃度を600g/Lにした。
【0114】
このステップは以下の通りであった:
(1)シードの活性化:斜面培地に保存されたヘマトコッカス・プルビアリス CCTCC M2018809(China Center for Type Culture Collection(CCTCC)に寄託)を、0.5g/Lトリス(トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン))を含む滅菌基本培養培地に初期pHは7.5で接種し、100mLの三角フラスコに50mlの負荷容量で入れ、20℃の培養温度で20日間静置培養(毎日2回手で振盪)し、ここで、藻類細胞の90%は緑色栄養細胞であり、藻類細胞の数は細胞570,000個/mLに達した。
(2)従属栄養拡大培養:調製した基本培養培地を5L発酵槽に負荷係数0.6で加えた。ステップ(1)で得られたシード溶液を、従属栄養培養のために細胞180,000個/mLの初期接種量で発酵槽に接種し、ここで拡大供給培地を供給して、ブロスのpHを8.0に、酢酸塩の濃度を300～900mg/Lに、硝酸塩の濃度を600～900mg/Lに、リン酸イオンの濃度を100～150mg/Lに維持し、培養温度は20℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.1～0.3vvm及び攪拌速度を50～100rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を1.0mg/L～2.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。14日間の培養後、藻類細胞の密度は7.82g/Lに達し、細胞数は細胞450万個/mLに達し、運動性栄養細胞の90%が不動性栄養細胞に変換された。
(3)従属栄養誘導:従属栄養培養を開始する前に、濃縮酢酸ナトリウム母液をステップ(2)で無菌操作により発酵槽に添加し、ブロス中の酢酸の濃度を3000mg/Lに増加させた。培養の間、誘導供給培地を供給して、ブロスのpHを8.0に、酢酸塩の濃度を3000～4000mg/Lに維持し、培養温度を20℃に制御した。発酵の間、通気容量を1.0～1.5vvm及び攪拌速度を100～200rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を4.0mg/L～8.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。20日間培養した後、全ての栄養細胞は赤い胞子細胞に変換され、藻類細胞の密度は37.25g/Lに達した。この時点で、アスタキサンチンの含有量は2.89%に達し、アスタキサンチンの収量は1076.53mg/Lに達した(図1に示す通り)。
(1)シードの活性化:斜面培地に保存されたヘマトコッカス・プルビアリス CCTCC M2018809(China Center for Type Culture Collection(CCTCC)に寄託)を、0.5g/Lトリス(トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン))を含む滅菌基本培養培地に初期pHは7.5で接種し、100mLの三角フラスコに50mlの負荷容量で入れ、20℃の培養温度で20日間静置培養(毎日2回手で振盪)し、ここで、藻類細胞の90%は緑色栄養細胞であり、藻類細胞の数は細胞570,000個/mLに達した。
(2)従属栄養拡大培養:調製した基本培養培地を5L発酵槽に負荷係数0.6で加えた。ステップ(1)で得られたシード溶液を、従属栄養培養のために細胞180,000個/mLの初期接種量で発酵槽に接種し、ここで拡大供給培地を供給して、ブロスのpHを8.0に、酢酸塩の濃度を300～900mg/Lに、硝酸塩の濃度を600～900mg/Lに、リン酸イオンの濃度を100～150mg/Lに維持し、培養温度は20℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.1～0.3vvm及び攪拌速度を50～100rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を1.0mg/L～2.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。14日間の培養後、藻類細胞の密度は7.82g/Lに達し、細胞数は細胞450万個/mLに達し、運動性栄養細胞の90%が不動性栄養細胞に変換された。
(3)従属栄養誘導:従属栄養培養を開始する前に、濃縮酢酸ナトリウム母液をステップ(2)で無菌操作により発酵槽に添加し、ブロス中の酢酸の濃度を3000mg/Lに増加させた。培養の間、誘導供給培地を供給して、ブロスのpHを8.0に、酢酸塩の濃度を3000～4000mg/Lに維持し、培養温度を20℃に制御した。発酵の間、通気容量を1.0～1.5vvm及び攪拌速度を100～200rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を4.0mg/L～8.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。20日間培養した後、全ての栄養細胞は赤い胞子細胞に変換され、藻類細胞の密度は37.25g/Lに達した。この時点で、アスタキサンチンの含有量は2.89%に達し、アスタキサンチンの収量は1076.53mg/Lに達した(図1に示す通り)。
【0115】
[実施例2]
この実施例の好ましい基本培養培地は、以下の配合を有する:0.95g/Lの酢酸ナトリウム、0.4g/Lの硝酸ナトリウム、200mg/Lのリン酸二水素カリウム、100mg/Lのリン酸水素二カリウム、200mg/Lの硫酸マグネシウム、25mg/Lの塩化カルシウム、1.5mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1.5mg/Lのホウ酸、200μg/Lの塩化第二鉄、40μg/Lの塩化マンガン、20μg/Lの硫酸亜鉛、20μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3μg/Lの塩化コバルト、及び20μg/Lの硫酸銅。
この実施例の好ましい基本培養培地は、以下の配合を有する:0.95g/Lの酢酸ナトリウム、0.4g/Lの硝酸ナトリウム、200mg/Lのリン酸二水素カリウム、100mg/Lのリン酸水素二カリウム、200mg/Lの硫酸マグネシウム、25mg/Lの塩化カルシウム、1.5mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1.5mg/Lのホウ酸、200μg/Lの塩化第二鉄、40μg/Lの塩化マンガン、20μg/Lの硫酸亜鉛、20μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3μg/Lの塩化コバルト、及び20μg/Lの硫酸銅。
【0116】
この実施例の好ましい拡大供給培地は、以下の配合を有する:5.0g/Lの硝酸ナトリウム、0.5g/Lのリン酸二水素カリウム、0.1g/Lの硫酸マグネシウム、3mg/Lのエデト酸二ナトリウム、3mg/Lのホウ酸、350μg/Lの塩化第二鉄、70μg/Lの塩化マンガン、35μg/Lの硫酸亜鉛、30μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、7μg/Lの塩化コバルト、及び50μg/Lの硫酸銅。調製の際、これを121℃で21分間オートクレーブ処理し、室温まで冷却した後、無菌操作により氷酢酸(酢酸の含有量が98%超)を添加し、酢酸の濃度を60g/Lにした。
【0117】
この実施例の好ましい誘導供給培地は、以下の配合を有する:5.0g/Lの硝酸ナトリウム、0.5g/Lのリン酸二水素カリウム、0.1g/Lの硫酸マグネシウム、3mg/Lのエデト酸二ナトリウム、3mg/Lのホウ酸、350μg/Lの塩化第二鉄、70μg/Lの塩化マンガン、35μg/Lの硫酸亜鉛、30μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、7μg/Lの塩化コバルト、及び50μg/Lの硫酸銅。調製の際、これを121℃で21分間オートクレーブ処理し、室温まで冷却した後、無菌操作により氷酢酸(酢酸の含有量が98%超)を添加し、酢酸の濃度を300g/Lにした。
【0118】
このステップは以下の通りであった:
(1)シードの活性化:斜面培地に保存されたヘマトコッカス・プルビアリス CCTCC M2018809を、0.6g/Lのトリスを含む滅菌基本培地に初期pH8.0で接種し、100mLの三角フラスコに50mlの負荷容量で入れ、20℃の培養温度で20日間静置培養(毎日2回手で振盪)し、ここで、藻類細胞の95%は緑色栄養細胞であり、細胞の数は細胞57万個/mLに達した。
(2)従属栄養拡大培養:調製した基本培地を5L発酵槽に負荷係数0.6で加えた。ステップ(1)で得られたシード溶液を、従属栄養培養のために細胞50,000個/mLの初期接種量で発酵槽に接種し、ここで拡大供給培地を供給して、ブロスのpHを8.0に、酢酸塩の濃度を300～700mg/Lに、硝酸塩の濃度を100～400mg/Lに、リン酸塩の濃度を150～250mg/Lに、培養温度を20℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.1～0.4vvm及び攪拌速度を60～100rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を1.5mg/L～2.5mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。15日間の培養後、藻類細胞の密度は3.38g/Lに達し、細胞数は細胞408万個/mLに達し、運動性栄養細胞の90%が不動性栄養細胞に変換された。
(3)従属栄養誘導:従属栄養培養を開始する前に、濃縮酢酸ナトリウム母液をステップ(2)で無菌操作により発酵槽に添加して、ブロス中の酢酸の濃度を3500mg/Lに増加させた。培養の間、誘導供給培地を供給し、ブロスのpHを8.0、酢酸塩の濃度を3500～4800mg/Lに維持し、培養温度を20℃に制御した。発酵の間、通気容量を1.2～1.8vvm及び攪拌速度を150～200rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を5.0mg/L～8.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。20日間の培養後、全ての栄養細胞は赤い胞子細胞に変換され、藻類細胞の密度は27.63g/Lに達した。この時点で、アスタキサンチンの含有量は2.55%に達し、アスタキサンチンの収量は704.57mg/Lに達した(図2に示す通り)。
(1)シードの活性化:斜面培地に保存されたヘマトコッカス・プルビアリス CCTCC M2018809を、0.6g/Lのトリスを含む滅菌基本培地に初期pH8.0で接種し、100mLの三角フラスコに50mlの負荷容量で入れ、20℃の培養温度で20日間静置培養(毎日2回手で振盪)し、ここで、藻類細胞の95%は緑色栄養細胞であり、細胞の数は細胞57万個/mLに達した。
(2)従属栄養拡大培養:調製した基本培地を5L発酵槽に負荷係数0.6で加えた。ステップ(1)で得られたシード溶液を、従属栄養培養のために細胞50,000個/mLの初期接種量で発酵槽に接種し、ここで拡大供給培地を供給して、ブロスのpHを8.0に、酢酸塩の濃度を300～700mg/Lに、硝酸塩の濃度を100～400mg/Lに、リン酸塩の濃度を150～250mg/Lに、培養温度を20℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.1～0.4vvm及び攪拌速度を60～100rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を1.5mg/L～2.5mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。15日間の培養後、藻類細胞の密度は3.38g/Lに達し、細胞数は細胞408万個/mLに達し、運動性栄養細胞の90%が不動性栄養細胞に変換された。
(3)従属栄養誘導:従属栄養培養を開始する前に、濃縮酢酸ナトリウム母液をステップ(2)で無菌操作により発酵槽に添加して、ブロス中の酢酸の濃度を3500mg/Lに増加させた。培養の間、誘導供給培地を供給し、ブロスのpHを8.0、酢酸塩の濃度を3500～4800mg/Lに維持し、培養温度を20℃に制御した。発酵の間、通気容量を1.2～1.8vvm及び攪拌速度を150～200rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を5.0mg/L～8.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。20日間の培養後、全ての栄養細胞は赤い胞子細胞に変換され、藻類細胞の密度は27.63g/Lに達した。この時点で、アスタキサンチンの含有量は2.55%に達し、アスタキサンチンの収量は704.57mg/Lに達した(図2に示す通り)。
【0119】
[実施例3]
この実施例の好ましい基本培養培地は、以下の配合を有する:0.82g/Lの酢酸ナトリウム、0.5g/Lの硝酸ナトリウム、60mg/Lのリン酸二水素カリウム、20mg/Lのリン酸水素二カリウム、50mg/Lの硫酸マグネシウム、1mg/Lの塩化カルシウム、3mg/Lのエデト酸二ナトリウム、0.1mg/Lのホウ酸、350μg/Lの塩化第二鉄、4μg/Lの塩化マンガン、12μg/Lの硫酸亜鉛、1μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、7μg/Lの塩化コバルト、1μg/Lの硫酸銅、0.1μg/LのビタミンB12、0.1μg/Lのビオチン、及び10μg/LのビタミンB1。
この実施例の好ましい基本培養培地は、以下の配合を有する:0.82g/Lの酢酸ナトリウム、0.5g/Lの硝酸ナトリウム、60mg/Lのリン酸二水素カリウム、20mg/Lのリン酸水素二カリウム、50mg/Lの硫酸マグネシウム、1mg/Lの塩化カルシウム、3mg/Lのエデト酸二ナトリウム、0.1mg/Lのホウ酸、350μg/Lの塩化第二鉄、4μg/Lの塩化マンガン、12μg/Lの硫酸亜鉛、1μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、7μg/Lの塩化コバルト、1μg/Lの硫酸銅、0.1μg/LのビタミンB12、0.1μg/Lのビオチン、及び10μg/LのビタミンB1。
【0120】
この実施例の好ましい拡大供給培地は、以下の配合を有する:6.0g/Lの硝酸ナトリウム、0.7g/Lのリン酸二水素カリウム、1.0g/Lの硫酸マグネシウム、24mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1mg/Lのホウ酸、4000μg/Lの塩化第二鉄、280μg/Lの塩化マンガン、600μg/Lの硫酸亜鉛、30μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、100μg/Lの塩化コバルト、及び50μg/Lの硫酸銅。調製の際、これを121℃で21分間オートクレーブ処理し、室温まで冷却した後、フィルター滅菌した5μg/LのビタミンB12、5μg/Lのビオチン、500μg/LのビタミンB1、及び氷酢酸(酢酸の含有量が98%超)を無菌操作で添加し、酢酸の濃度を30g/Lにした。
【0121】
この実施例の好ましい誘導供給培地は、以下の配合を有する:0.5g/Lのリン酸二水素カリウム、0.05g/Lの硫酸マグネシウム、1mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1mg/Lのホウ酸、150μg/Lの塩化第二鉄、30μg/Lの塩化マンガン、15μg/Lの硫酸亜鉛、15μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3μg/Lの塩化コバルト、及び20μg/Lの硫酸銅。調製の際、これを121℃で21分間オートクレーブ処理し、室温まで冷却した後、無菌操作により氷酢酸(酢酸の含有量が98%超)を添加し、酢酸の濃度を60g/Lにした。
【0122】
このステップは以下の通りであった:
(1)シードの活性化:斜面培地に保存されたヘマトコッカス・プルビアリス NIES-144(Microbial Culture Collection of National Institute for Environmental Studies、Japan)を、初期pH7.5の0.5g/Lトリスを含む滅菌基本培地に接種し、250mLの三角フラスコに、負荷容量50mlで入れ、30rpm、12日間、25℃の培養温度での振盪培養を行い、ここで、藻類細胞の90%は緑色栄養細胞であり、藻類細胞の数は細胞800,000個/mLに達した。
(2)従属栄養拡大培養:調製した基本培地を5L発酵槽に負荷係数0.6で加えた。ステップ(1)で得られたシード溶液を、従属栄養培養のために細胞50,000個/mLの初期接種量で発酵槽に接種し、ここで拡大供給培地を供給して、ブロスのpHを7.5に、酢酸塩の濃度を300～900mg/Lに、硝酸塩の濃度を300～900mg/Lに、及びリン酸塩の濃度を50～100mg/Lに維持し、培養温度は25℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.1～0.3vvm及び攪拌速度を50～100rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を2.0mg/L～4.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。12日間の培養後、藻類細胞の密度は8.15g/Lに達し、細胞数は細胞616万個/mLに達し、運動性栄養細胞の95%が不動性栄養細胞に変換された。
(3)従属栄養誘導:従属栄養培養を開始する前に、濃縮酢酸ナトリウム母液をステップ(2)で無菌操作により発酵槽に添加し、ブロス中の酢酸の濃度を3000mg/Lに増加させた。培養の間、誘導供給培地を供給して、ブロスのpHを7.5に、酢酸塩の濃度を3000～4000mg/Lに維持し、培養温度を25℃に制御した。温度を10日目に30℃、12日目に35℃に上げた。発酵の間、通気容量を1.0～1.5vvmに及び攪拌速度を毎分100～200に調整することにより、溶存酸素を4.0mg/L～8.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。15日間培養した後、全ての栄養細胞は赤い胞子細胞に変換され、藻類細胞の密度は18.35g/Lに達した。この時点で、アスタキサンチンの含有量は1.33%に達し、アスタキサンチンの収量は244.06mg/Lに達した(図3に示す通り)。
(1)シードの活性化:斜面培地に保存されたヘマトコッカス・プルビアリス NIES-144(Microbial Culture Collection of National Institute for Environmental Studies、Japan)を、初期pH7.5の0.5g/Lトリスを含む滅菌基本培地に接種し、250mLの三角フラスコに、負荷容量50mlで入れ、30rpm、12日間、25℃の培養温度での振盪培養を行い、ここで、藻類細胞の90%は緑色栄養細胞であり、藻類細胞の数は細胞800,000個/mLに達した。
(2)従属栄養拡大培養:調製した基本培地を5L発酵槽に負荷係数0.6で加えた。ステップ(1)で得られたシード溶液を、従属栄養培養のために細胞50,000個/mLの初期接種量で発酵槽に接種し、ここで拡大供給培地を供給して、ブロスのpHを7.5に、酢酸塩の濃度を300～900mg/Lに、硝酸塩の濃度を300～900mg/Lに、及びリン酸塩の濃度を50～100mg/Lに維持し、培養温度は25℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.1～0.3vvm及び攪拌速度を50～100rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を2.0mg/L～4.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。12日間の培養後、藻類細胞の密度は8.15g/Lに達し、細胞数は細胞616万個/mLに達し、運動性栄養細胞の95%が不動性栄養細胞に変換された。
(3)従属栄養誘導:従属栄養培養を開始する前に、濃縮酢酸ナトリウム母液をステップ(2)で無菌操作により発酵槽に添加し、ブロス中の酢酸の濃度を3000mg/Lに増加させた。培養の間、誘導供給培地を供給して、ブロスのpHを7.5に、酢酸塩の濃度を3000～4000mg/Lに維持し、培養温度を25℃に制御した。温度を10日目に30℃、12日目に35℃に上げた。発酵の間、通気容量を1.0～1.5vvmに及び攪拌速度を毎分100～200に調整することにより、溶存酸素を4.0mg/L～8.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。15日間培養した後、全ての栄養細胞は赤い胞子細胞に変換され、藻類細胞の密度は18.35g/Lに達した。この時点で、アスタキサンチンの含有量は1.33%に達し、アスタキサンチンの収量は244.06mg/Lに達した(図3に示す通り)。
【0123】
[実施例4]
この実施例の好ましい基本培養培地は、以下の配合を有する:0.50g/Lの酢酸ナトリウム、1.5g/Lの硝酸ナトリウム、300mg/Lのリン酸二水素カリウム、100mg/Lのリン酸水素二カリウム、300mg/Lの硫酸マグネシウム、30mg/Lの塩化カルシウム、4mg/Lのエデト酸二ナトリウム、4mg/Lのホウ酸、500μg/Lの塩化第二鉄、80μg/Lの塩化マンガン、50μg/Lの硫酸亜鉛、40μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、10μg/Lの塩化コバルト、及び70μg/Lの硫酸銅。
この実施例の好ましい基本培養培地は、以下の配合を有する:0.50g/Lの酢酸ナトリウム、1.5g/Lの硝酸ナトリウム、300mg/Lのリン酸二水素カリウム、100mg/Lのリン酸水素二カリウム、300mg/Lの硫酸マグネシウム、30mg/Lの塩化カルシウム、4mg/Lのエデト酸二ナトリウム、4mg/Lのホウ酸、500μg/Lの塩化第二鉄、80μg/Lの塩化マンガン、50μg/Lの硫酸亜鉛、40μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、10μg/Lの塩化コバルト、及び70μg/Lの硫酸銅。
【0124】
この実施例の好ましい拡大供給培地は、以下の配合を有する:10.0g/Lの硝酸ナトリウム、2.0g/Lのリン酸二水素カリウム、0.6g/Lの硫酸マグネシウム、12mg/Lのエデト酸二ナトリウム、12mg/Lのホウ酸、1400μg/Lの塩化第二鉄、280μg/Lの塩化マンガン、140μg/Lの硫酸亜鉛、120μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、30μg/Lの塩化コバルト、及び200μg/Lの硫酸銅。調製の際、これを121℃で21分間オートクレーブ処理し、室温まで冷却した後、無菌操作により氷酢酸(酢酸の含有量が98%超)を添加し、酢酸の濃度を120g/Lにした。
【0125】
この実施例の好ましい誘導供給培地は、以下の配合を有する:0.4g/Lの硫酸マグネシウム、12mg/Lのエデト酸二ナトリウム、12mg/Lのホウ酸、1400μg/Lの塩化第二鉄、280μg/Lの塩化マンガン、140μg/Lの硫酸亜鉛、120μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、30μg/Lの塩化コバルト、及び200μg/Lの硫酸銅。調製の際、これを121℃で21分間オートクレーブ処理し、室温まで冷却した後、無菌操作により氷酢酸(酢酸の含有量が98%超)を添加し、酢酸の濃度を240g/Lにした。
【0126】
このステップは以下の通りであった:
(1)シードの活性化:斜面培地に保存されたヘマトコッカス・プルビアリス CCTCC M2018809を、1.0g/Lのトリスを含む滅菌基本培地に初期pH7.0で接種し、100mLの三角フラスコに負荷容量50mlで入れて、20℃の培養温度で20日間、静置培養(毎日2回手で振盪)し、ここで、藻類細胞の92%は緑色栄養細胞であり、細胞の数は細胞550,000個/mLに達した。
(2)従属栄養拡大培養:調製した基本培地を5L発酵槽に負荷係数0.6で加えた。ステップ(1)で得られたシード溶液を、従属栄養培養のために細胞100,000個/mLの初期接種量で発酵槽に接種し、ここで拡大供給培地を供給して、ブロスのpHを8.0に、酢酸塩の濃度を100～400mg/Lに、硝酸塩の濃度を1000～1500mg/Lに、及びリン酸塩濃度を200～300mg/Lに維持し、培養温度は25℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.05～0.15vvm及び攪拌速度を40～60rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を0.1mg/L～1.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。12日間の培養後、藻類細胞の密度は1.87g/Lに達し、到達した細胞数は細胞190万個/mLに達し、運動性栄養細胞の70%が不動性栄養細胞に変換された。
(3)従属栄養誘導:従属栄養培養を開始する前に、濃縮酢酸ナトリウム母液をステップ(2)で無菌操作により発酵槽に添加し、ブロス中の酢酸の濃度を2700mg/Lに増加させた。培養の間、誘導供給培地を供給して、ブロスのpHを8.0、酢酸塩の濃度を2700～4000mg/Lに維持して、培養温度を30℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.1～0.5vvm及び攪拌速度を60～100rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を2.0mg/L～3.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。10日間培養した後、全ての栄養細胞は赤い胞子細胞に変換され、藻類細胞の密度は7.74g/Lに達した。この時点で、アスタキサンチンの含有量は1.32%に達し、アスタキサンチンの収量は102.17mg/Lに達した(図4に示す通り)。
(1)シードの活性化:斜面培地に保存されたヘマトコッカス・プルビアリス CCTCC M2018809を、1.0g/Lのトリスを含む滅菌基本培地に初期pH7.0で接種し、100mLの三角フラスコに負荷容量50mlで入れて、20℃の培養温度で20日間、静置培養(毎日2回手で振盪)し、ここで、藻類細胞の92%は緑色栄養細胞であり、細胞の数は細胞550,000個/mLに達した。
(2)従属栄養拡大培養:調製した基本培地を5L発酵槽に負荷係数0.6で加えた。ステップ(1)で得られたシード溶液を、従属栄養培養のために細胞100,000個/mLの初期接種量で発酵槽に接種し、ここで拡大供給培地を供給して、ブロスのpHを8.0に、酢酸塩の濃度を100～400mg/Lに、硝酸塩の濃度を1000～1500mg/Lに、及びリン酸塩濃度を200～300mg/Lに維持し、培養温度は25℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.05～0.15vvm及び攪拌速度を40～60rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を0.1mg/L～1.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。12日間の培養後、藻類細胞の密度は1.87g/Lに達し、到達した細胞数は細胞190万個/mLに達し、運動性栄養細胞の70%が不動性栄養細胞に変換された。
(3)従属栄養誘導:従属栄養培養を開始する前に、濃縮酢酸ナトリウム母液をステップ(2)で無菌操作により発酵槽に添加し、ブロス中の酢酸の濃度を2700mg/Lに増加させた。培養の間、誘導供給培地を供給して、ブロスのpHを8.0、酢酸塩の濃度を2700～4000mg/Lに維持して、培養温度を30℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.1～0.5vvm及び攪拌速度を60～100rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を2.0mg/L～3.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。10日間培養した後、全ての栄養細胞は赤い胞子細胞に変換され、藻類細胞の密度は7.74g/Lに達した。この時点で、アスタキサンチンの含有量は1.32%に達し、アスタキサンチンの収量は102.17mg/Lに達した(図4に示す通り)。
【0127】
[実施例5]
この実施例の好ましい基本培養培地は、以下の配合を有する:1.10g/Lの酢酸ナトリウム、0.7g/Lの硝酸ナトリウム、152mg/Lのリン酸二水素カリウム、64mg/Lのリン酸水素二カリウム、100mg/Lの硫酸マグネシウム、15mg/Lの塩化カルシウム、3mg/Lのエデト酸二ナトリウム、3mg/Lのホウ酸、350μg/Lの塩化第二鉄、70μg/Lの塩化マンガン、35μg/Lの硫酸亜鉛、30μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、7μg/Lの塩化コバルト、50μg/Lの硫酸銅、0.05μg/LのビタミンB12、0.05μg/Lのビオチン、及び5μg/LのビタミンB1。
この実施例の好ましい基本培養培地は、以下の配合を有する:1.10g/Lの酢酸ナトリウム、0.7g/Lの硝酸ナトリウム、152mg/Lのリン酸二水素カリウム、64mg/Lのリン酸水素二カリウム、100mg/Lの硫酸マグネシウム、15mg/Lの塩化カルシウム、3mg/Lのエデト酸二ナトリウム、3mg/Lのホウ酸、350μg/Lの塩化第二鉄、70μg/Lの塩化マンガン、35μg/Lの硫酸亜鉛、30μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、7μg/Lの塩化コバルト、50μg/Lの硫酸銅、0.05μg/LのビタミンB12、0.05μg/Lのビオチン、及び5μg/LのビタミンB1。
【0128】
この実施例の好ましい拡大供給培地は、以下の配合を有する:25g/Lの硝酸ナトリウム、2.5g/Lのリン酸二水素カリウム、0.5g/Lの硫酸マグネシウム、15mg/Lのエデト酸二ナトリウム、15mg/Lのホウ酸、1750μg/Lの塩化第二鉄、350μg/Lの塩化マンガン、175μg/Lの硫酸亜鉛、150μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、35μg/Lの塩化コバルト、及び250μg/Lの硫酸銅。調製の際、これを121℃で21分間オートクレーブ処理し、室温まで冷却した後、フィルター滅菌した2μg/LのビタミンB12、2μg/Lのビオチン、200μg/LのビタミンB1、及び氷酢酸(酢酸の含有量が98%超)を無菌操作で添加して、酢酸の濃度を300g/Lにした。
【0129】
この実施例の好ましい誘導供給培地は、以下の配合を有する:2.5g/Lのリン酸二水素カリウム、0.5g/Lの硫酸マグネシウム、15mg/Lのエデト酸二ナトリウム、15mg/Lのホウ酸、1750μg/Lの塩化第二鉄、350μg/Lの塩化マンガン、175μg/Lの硫酸亜鉛、150μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、35μg/Lの塩化コバルト、及び250μg/Lの硫酸銅。調製の際、これを121℃で21分間オートクレーブ処理し、室温まで冷却した後、無菌操作により氷酢酸(酢酸の含有量が98%超)を添加し、酢酸の濃度を300g/Lにした。
【0130】
このステップは以下の通りであった:
(1)シードの活性化:斜面培地に保存されたヘマトコッカス・プルビアリス CCTCC M2018809を、0.5g/Lのトリス(トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン))を含む滅菌基本培地に初期pH7.5で接種し、100mL三角フラスコに、培養温度20℃で20日間の静置培養のために(毎日2回手で振盪)、負荷容量50mlで入れ、ここで、藻類細胞の98%は緑色栄養細胞であり、藻類細胞の数は細胞600,000個/mLに達した。
(2)従属栄養拡大培養:調製した基本培地を5Lの発酵槽に負荷係数0.6で加えた。ステップ(1)で得られたシード溶液を、従属栄養培養のために細胞20,000個/mLの初期接種量で発酵槽に接種し、ここで拡大供給培地を供給して、ブロスのpHを7.0に、酢酸塩の濃度を500～900mg/Lに、硝酸塩の濃度を400～700mg/Lに、及びリン酸塩の濃度を100～150mg/Lに維持し、培養温度は20℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.1～0.2vvm及び攪拌速度を50～70rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を0.5mg/L～1.5mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。10日間の培養後、藻類細胞の密度は1.26g/Lに達し、到達した細胞の数は細胞670,000個/mLに達し、運動性栄養細胞の60%が不動性栄養細胞に変換された。
(3)従属栄養誘導:従属栄養培養を開始する前に、濃縮酢酸ナトリウム母液をステップ(2)で無菌操作により発酵槽に添加し、ブロス中の酢酸の濃度を4800mg/Lに増加させた。培養の間、誘導供給培地を供給して、ブロスのpHを9.0に、酢酸塩の濃度を4000～6000mg/Lに維持して、培養温度を30℃に制御した。発酵の間、通気容量を1.0～1.5vvm及び攪拌速度を100～200rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を4.0mg/L～8.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。14日間培養した後、全ての栄養細胞は赤い胞子細胞に変換され、藻類細胞の密度は6.80g/Lに達した。この時点で、アスタキサンチンの含有量は2.05%に達し、アスタキサンチンの収量は139.40mg/Lに達した(図5に示す通り)。
(1)シードの活性化:斜面培地に保存されたヘマトコッカス・プルビアリス CCTCC M2018809を、0.5g/Lのトリス(トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン))を含む滅菌基本培地に初期pH7.5で接種し、100mL三角フラスコに、培養温度20℃で20日間の静置培養のために(毎日2回手で振盪)、負荷容量50mlで入れ、ここで、藻類細胞の98%は緑色栄養細胞であり、藻類細胞の数は細胞600,000個/mLに達した。
(2)従属栄養拡大培養:調製した基本培地を5Lの発酵槽に負荷係数0.6で加えた。ステップ(1)で得られたシード溶液を、従属栄養培養のために細胞20,000個/mLの初期接種量で発酵槽に接種し、ここで拡大供給培地を供給して、ブロスのpHを7.0に、酢酸塩の濃度を500～900mg/Lに、硝酸塩の濃度を400～700mg/Lに、及びリン酸塩の濃度を100～150mg/Lに維持し、培養温度は20℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.1～0.2vvm及び攪拌速度を50～70rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を0.5mg/L～1.5mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。10日間の培養後、藻類細胞の密度は1.26g/Lに達し、到達した細胞の数は細胞670,000個/mLに達し、運動性栄養細胞の60%が不動性栄養細胞に変換された。
(3)従属栄養誘導:従属栄養培養を開始する前に、濃縮酢酸ナトリウム母液をステップ(2)で無菌操作により発酵槽に添加し、ブロス中の酢酸の濃度を4800mg/Lに増加させた。培養の間、誘導供給培地を供給して、ブロスのpHを9.0に、酢酸塩の濃度を4000～6000mg/Lに維持して、培養温度を30℃に制御した。発酵の間、通気容量を1.0～1.5vvm及び攪拌速度を100～200rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を4.0mg/L～8.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。14日間培養した後、全ての栄養細胞は赤い胞子細胞に変換され、藻類細胞の密度は6.80g/Lに達した。この時点で、アスタキサンチンの含有量は2.05%に達し、アスタキサンチンの収量は139.40mg/Lに達した(図5に示す通り)。
【0131】
[実施例6]
この実施例の好ましい基本培養培地は、以下の配合を有する:0.66g/Lの酢酸ナトリウム、0.8g/Lの硝酸ナトリウム、100mg/Lのリン酸二水素カリウム、40mg/Lのリン酸水素二カリウム、150mg/Lの硫酸マグネシウム、20mg/Lの塩化カルシウム、2mg/Lのエデト酸二ナトリウム、2mg/Lのホウ酸、300μg/Lの塩化第二鉄、50μg/Lの塩化マンガン、30μg/Lの硫酸亜鉛、25μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、5μg/Lの塩化コバルト、及び30μg/Lの硫酸銅。
この実施例の好ましい基本培養培地は、以下の配合を有する:0.66g/Lの酢酸ナトリウム、0.8g/Lの硝酸ナトリウム、100mg/Lのリン酸二水素カリウム、40mg/Lのリン酸水素二カリウム、150mg/Lの硫酸マグネシウム、20mg/Lの塩化カルシウム、2mg/Lのエデト酸二ナトリウム、2mg/Lのホウ酸、300μg/Lの塩化第二鉄、50μg/Lの塩化マンガン、30μg/Lの硫酸亜鉛、25μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、5μg/Lの塩化コバルト、及び30μg/Lの硫酸銅。
【0132】
この実施例の好ましい拡大供給培地は、以下の配合を有する:50g/Lの硝酸ナトリウム、5g/Lのリン酸二水素カリウム、1g/Lの硫酸マグネシウム、30mg/Lのエデト酸二ナトリウム、30mg/Lのホウ酸、3500μg/Lの塩化第二鉄、700μg/Lの塩化マンガン、350μg/Lの硫酸亜鉛、300μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、70μg/Lの塩化コバルト、及び500μg/Lの硫酸銅。調製の際、これを121℃で21分間オートクレーブ処理し、室温まで冷却した後、無菌操作により氷酢酸(酢酸の含有量が98%超)を添加し、酢酸の濃度を600g/Lにした。
【0133】
この実施例の好ましい誘導供給培地は、以下の配合を有する:0.1g/Lのリン酸二水素カリウム、1mg/Lのエデト酸二ナトリウム、1mg/Lのホウ酸、150μg/Lの塩化第二鉄、30μg/Lの塩化マンガン、15μg/Lの硫酸亜鉛、15μg/Lのモリブデン酸ナトリウム、3μg/Lの塩化コバルト、及び20μg/Lの硫酸銅。調製の際、これを121℃で21分間オートクレーブ処理し、室温まで冷却した後、無菌操作により氷酢酸(酢酸の含有量が98%超)を添加し、酢酸の濃度を60g/Lにした。
【0134】
このステップは以下の通りである:
(1)シードの活性化:斜面培地に保存されたヘマトコッカス・プルビアリス CCTCC M2018809を、0.7g/Lのトリスを含む滅菌基本培地に初期pH7.8で接種し、100mLの三角フラスコに、培養温度20℃で20日間の静置培養(毎日2回手で振盪)のために、負荷容量50mlで入れ、ここで、藻類細胞の95%が緑色栄養細胞であり、細胞の数は細胞490,000個/mLに達した。
(2)従属栄養拡大培養:調製した基本培地を5L発酵槽に負荷係数0.6で加えた。ステップ(1)で得られたシード溶液を、従属栄養培養のために細胞60,000個/mLの初期接種量で発酵槽に接種し、ここで拡大供給培地を供給して、ブロスのpHを8.0に、酢酸塩の濃度を200～600mg/Lに、硝酸塩の濃度を300～800mg/Lに、及びリン酸塩の濃度を80～120mg/Lに維持し、培養温度を20℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.1～0.2vvm及び攪拌速度を50～70rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を0.5mg/L～1.5mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。8日間の培養後、藻類細胞の密度は1.19g/Lに達し、到達した細胞数は細胞150万個/mLに達し、運動性栄養細胞の50%が不動性栄養細胞に変換された。
(3)従属栄養誘導:培養の間、誘導供給培地を供給して、ブロスのpHを8.0に、酢酸塩の濃度を600～900mg/Lに維持して、培養温度を25℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.5～1.0vvm及び攪拌速度を150～200rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を4.0mg/L～6.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。15日間培養した後、全ての栄養細胞は赤い胞子細胞に変換され、藻類細胞の密度は9.07g/Lに達した。この時点で、アスタキサンチンの含有量は1.78%に達し、アスタキサンチンの収量は161.45mg/Lに達した(図6に示す通り)。
(1)シードの活性化:斜面培地に保存されたヘマトコッカス・プルビアリス CCTCC M2018809を、0.7g/Lのトリスを含む滅菌基本培地に初期pH7.8で接種し、100mLの三角フラスコに、培養温度20℃で20日間の静置培養(毎日2回手で振盪)のために、負荷容量50mlで入れ、ここで、藻類細胞の95%が緑色栄養細胞であり、細胞の数は細胞490,000個/mLに達した。
(2)従属栄養拡大培養:調製した基本培地を5L発酵槽に負荷係数0.6で加えた。ステップ(1)で得られたシード溶液を、従属栄養培養のために細胞60,000個/mLの初期接種量で発酵槽に接種し、ここで拡大供給培地を供給して、ブロスのpHを8.0に、酢酸塩の濃度を200～600mg/Lに、硝酸塩の濃度を300～800mg/Lに、及びリン酸塩の濃度を80～120mg/Lに維持し、培養温度を20℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.1～0.2vvm及び攪拌速度を50～70rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を0.5mg/L～1.5mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。8日間の培養後、藻類細胞の密度は1.19g/Lに達し、到達した細胞数は細胞150万個/mLに達し、運動性栄養細胞の50%が不動性栄養細胞に変換された。
(3)従属栄養誘導:培養の間、誘導供給培地を供給して、ブロスのpHを8.0に、酢酸塩の濃度を600～900mg/Lに維持して、培養温度を25℃に制御した。発酵の間、通気容量を0.5～1.0vvm及び攪拌速度を150～200rpmに調整することにより、溶存酸素の濃度を4.0mg/L～6.0mg/Lに制御した。観察のために毎日サンプリングを行った。15日間培養した後、全ての栄養細胞は赤い胞子細胞に変換され、藻類細胞の密度は9.07g/Lに達した。この時点で、アスタキサンチンの含有量は1.78%に達し、アスタキサンチンの収量は161.45mg/Lに達した(図6に示す通り)。
【0135】
【受託番号】
【0136】
CCTCC M 2018809
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】